ES2881701T3 - Factor de von Willebrand mutado - Google Patents

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ES2881701T3 ES17735768T ES17735768T ES2881701T3 ES 2881701 T3 ES2881701 T3 ES 2881701T3 ES 17735768 T ES17735768 T ES 17735768T ES 17735768 T ES17735768 T ES 17735768T ES 2881701 T3 ES2881701 T3 ES 2881701T3
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Abstract

Un Factor de Von Willebrand (VWF) modificado que se une al Factor VIII, en el que el VWF modificado comprende una secuencia como la que se muestra en la SEQ ID NO:3 o un fragmento de la misma; en el que el VWF modificado se une al Factor VIII con una tasa de disociación inferior a la de un VWF de referencia que comprende una SEQ ID NO:3 no modificada en la que el VWF modificado comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:5 (S764P/S766W/V1083A), SEQ ID NO:6 (S764G/S766Y/V1083A), SEQ ID NO:7 (S764E/S766Y/V1083A), SEQ ID NO:8 (N1011S/V1083A/K1181E), SEQ ID NO:17 (S766Y/V1083A), SEQ ID NO:11 (V805A/Q1158L), SEQ ID NO:12 (K912E/T1088S), SEQ ID NO:9 (V1083A), SEQ ID NO:10 (S1042T), y SEQ ID NO:13 (L781P).

Description

DESCRIPCIÓN
Factor de von Willebrand mutado
Datos de presentación
La presente solicitud está asociada a la solicitud de patente australiana No 2016900033 presentada el 7 de enero de 2016,
Campo de la invención
La presente invención se refiere a polipéptidos, en particular al Factor de von Willebrand modificado que presenta una afinidad de unión mejorada con el Factor VIII. La invención se refiere además a un complejo que comprende el polipéptido y FVIII, a un polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención y a un procedimiento de producción del polipéptido. Además, la invención se refiere al uso terapéutico o profiláctico del polipéptido o complejo de la invención para tratar trastornos hemorrágicos.
Antecedentes de la invención
Existen varios trastornos hemorrágicos causados por deficiencias de los factores de coagulación de la sangre. Los trastornos más comunes son la hemofilia A y B, resultantes de las deficiencias del factor de coagulación de la sangre VIII y IX, respectivamente. Otro trastorno hemorrágico conocido es la enfermedad de von Willebrand.
En el plasma, FVIII existe predominantemente en un complejo no covalente con el VWF y actúa como cofactor del factor IX activado en el complejo generador del factor X activado unido a la membrana.
Se han hecho varios intentos para prolongar la vida media de FVIII no activado, ya sea reduciendo su interacción con los receptores celulares (Wo 03/093313A2, WO 02/060951A2), uniendo covalentemente polímeros a FVIII (WO 94/15625, WO 97/11957y US 4970300), por encapsulación de fV iII (WO 99/55306), mediante la introducción de nuevos sitios de unión de metales (WO 97/03193), mediante la unión covalente del dominio A2 al dominio A3, ya sea por vía peptídica (WO 97/40145 y WO 03/087355) o por enlace disulfuro (WO 02/103024A2) o mediante la unión covalente del dominio A1 al dominio A2 (WO2006/108590).
Otro enfoque para mejorar la vida media funcional de FVIII o de VWF es la PEGilación de FVIII (WO 2007/126808, WO 2006/053299, WO 2004/075923). La PEGilación de VWF (WO 2006/071801) también se ha intentado en un esfuerzo por aumentar indirectamente la vida media de FVIII presente en el plasma. También se han descrito proteínas de fusión de FVIII (WO 2004/101740, WO2008/077616 y WO 2009/156137).
VWF, que está ausente, que es funcionalmente defectuoso o sólo está disponible en cantidad reducida en diferentes formas de la enfermedad de von Willebrand (VWD), es una glicoproteína adhesiva multimérica presente en el plasma, que tiene múltiples funciones fisiológicas. Durante la hemostasia primaria, VWF actúa como mediador entre los receptores específicos de la superficie de las plaquetas y los componentes de la matriz extracelular, tal como el colágeno. Además, VWF sirve como proteína portadora y estabilizadora de FVIII procoagulante. VWF se sintetiza en las células endoteliales y los megacariocitos como una molécula precursora de 2813 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADNc de VWF de tipo salvaje se divulgan en Collins et al. 1987, Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84:4393-4397. El polipéptido precursor, pre-pro-VWF, está formado por un péptido señal de 22 residuos, un propéptido de 741 residuos y el polipéptido de 2050 residuos que se encuentra en el plasma (Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). Tras la escisión del péptido señal en el retículo endoplásmico, se forma un puente disulfuro C-terminal entre dos monómeros de VWF. Durante el transporte posterior a través de la vía secretora se añaden 12 cadenas laterales de carbohidratos ligadas a N y 10 ligadas a O. Es importante destacar que los dímeros de VWF se multimerizan a través de puentes disulfuro N-terminales y el propéptido de 741 aminoácidos es escindido por la enzima PACE/furina en el aparato de Golgi tardío. El propéptido y los multímeros de alto peso molecular de VWF (VWF-HMWM) se almacenan en los cuerpos de Weibel-Pallade de las células endoteliales o en los a-Gránulos de las plaquetas.
Una vez secretada en el plasma, la proteasa ADAMTS 13 escinde VWF dentro del dominio A1 de VWF. VWF plasmático está formado por una serie de multímeros que van desde dímeros simples de 500 kDa hasta multímeros formados por más de 20 dímeros de un peso molecular superior a 10.000 kDa. Normalmente, los multímeros de alto peso molecular de VWF (VWF-HMWM) tienen la actividad hemostática más fuerte, que puede medirse en la actividad del cofactor de ristocetina (VWF:RCo). Cuanto mayor sea la relación VWF:RCo/VWF antígeno, mayor será la cantidad relativa de multímeros de alto peso molecular.
Los defectos en VWF son la causa de la enfermedad de von Willebrand (VWD), que se caracteriza por un fenotipo hemorrágico más o menos pronunciado. VWD tipo 3 es la forma más grave en la que VWF falta por completo, VWD tipo 1 se refiere a una pérdida cuantitativa de VWF y su fenotipo puede ser muy leve. vWd de tipo 2 está relacionada con defectos cualitativos de VWF y puede ser tan grave como VWD de tipo 3. VWD tipo 2 tiene muchas subformas, algunas de las cuales están asociadas a la pérdida o a la disminución de los multímeros de alto peso molecular. VWD tipo 2a se caracteriza por una pérdida de multímeros intermedios y grandes. VWD tipo 2B se caracteriza por una pérdida de los multímeros de mayor peso molecular.
VWD es el trastorno hemorrágico heredado más frecuente en los seres humanos y puede tratarse mediante una terapia de sustitución con concentrados que contengan VWF de origen plasmático o recombinante. VWF puede prepararse a partir de plasma humano como se describe, por ejemplo, en el documento EP 05503991. El documento EP 0784632 describe un procedimiento para producir y aislar VWF recombinante.
En el plasma, FVIII se une con alta afinidad a VWF, lo que lo protege del catabolismo prematuro y, por lo tanto, desempeña, además de su función en la hemostasia primaria, un papel crucial en la regulación de los niveles plasmáticos de FVIII y, en consecuencia, es también un factor central en el control de la hemostasia secundaria. La vida media de FVIII no activado unido a VWF es de aproximadamente 12 a 14 horas en el plasma. En la enfermedad de von Willebrand de tipo 3, en la que no existe o casi no existe FVIII, la vida media de FVIII es sólo de aproximadamente 6 horas, lo que provoca síntomas de hemofilia A leve a moderada en dichos pacientes debido a la disminución de las concentraciones de FVIII. El efecto estabilizador de VWF sobre FVIII también se ha utilizado para ayudar a la expresión recombinante de FVIII en células CHO (Kaufman et al. 1989, Mol Cell Biol).
Sumario de la invención
En la solicitud internacional de patente co-pendiente del actual solicitante No. PCT/AU2015/050369 se divulga que una serie de modificaciones en el dominio D' de VWF pueden aumentar la unión al Factor VIII. La divulgación de esta solicitud se incluye aquí por referencia cruzada. Los presentes inventores han descubierto ahora que la unión de VWF al Factor VIII puede aumentarse mediante otras modificaciones en D' y, en particular, mediante modificaciones en el dominio D3.
No forma parte de la invención pero se divulga en el presente documento un polipéptido modificado que se une al Factor VIII, en el que el polipéptido modificado comprende una secuencia como la mostrada en SEQ ID NO:3 o un fragmento del mismo en el que la secuencia comprende al menos una modificación en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en L18, V42, K149, N248, S279, V320, T325, Q395 y K418; en el que el polipéptido modificado se une al Factor VIII con una tasa de disociación inferior a la de un polipéptido de referencia que comprende un SEQ ID NO:3 no modificado La invención se describe en las reivindicaciones.
La presente invención también proporciona un complejo que comprende una molécula de Factor VIII y el polipéptido modificado de la presente invención y un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado.
La presente invención también proporciona un procedimiento para tratar un trastorno hemorrágico que comprende la administración a un paciente que lo necesita del polipéptido o complejo modificado de la presente invención.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Muestra de sensorgramas de la detección a pH neutro. Los dos candidatos con mayor afinidad y menor tasa de disociación están marcados con un círculo.
Figura 2: Muestras de sensorgramas que muestran la cinética detallada de CSL627 para dos candidatos mutantes de D'D3-HSA a pH7. a) D'D3-HSA de unión al Factor VIII con mutaciones: V1083A, S764G, S766Y; b) D'D3-HSA de unión al Factor VIII con mutaciones: S764G, S766Y; c) D'D3-HSA de unión al Factor VIII con mutaciones: V1083A, S764P, S766W; d) D'D3-HSA de unión al Factor VIII S764P, S766W.
Figura 3: Muestras de sensorgramas que muestran la cinética detallada del Factor VIII para dos candidatos mutantes de D'D3-HSA a pH5.5 a) D'D3-HSA de unión al Factor VIII con mutaciones: V1083A, S764G, S766Y; b) D'D3-HSA de unión al Factor VIII con mutaciones: S764G, S766Y. c) D'D3-HSA de unión al Factor VIII con mutaciones: V1083A, S764P, S766W d) D'D3-HSA de unión al Factor VIII S764P, S766W.
Figura 4: a) Dímero D'D3-HSA de unión a CSL627 con mutaciones: V1083A, S764E, S766Y a pH neutro; b) Dímero D'D3-HSA de tipo salvaje de unión a CSL627 a pH neutro.
Figura 5: a) Dímero D'D3-HSA de unión a CSL627 con mutaciones: V1083A, S764E, S766Y b) Dímero D'D3-HSA de tipo salvaje de unión a CSL627 a pH5,5.
Descripción detallada
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros indicados, pero no la exclusión de ningún otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.
La referencia en esta memoria descriptiva a cualquier publicación anterior (o información derivada de ella), o a cualquier asunto conocido, no es, ni debe ser tomada como un reconocimiento o admisión o cualquier forma de sugerencia de que la publicación anterior (o información derivada de ella) o el asunto conocido forma parte del conocimiento general común en el campo de esfuerzo al que se refiere esta memoria descriptiva.
Cabe señalar que, como se utiliza en la memoria descriptiva del tema, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen aspectos plurales a menos que el contexto ordene claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un agente" incluye un único agente, así como dos o más agentes; la referencia a "una molécula" incluye una única molécula, así como dos o más moléculas; y así sucesivamente.
VWF
El término "Factor de von Willebrand" o "VWF", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier polipéptido que tenga una actividad biológica de VWF de tipo salvaje, en particular la capacidad de unirse al Factor VIII. El gen que codifica VWF de tipo salvaje se transcribe en un ARNm de 9 kb que se traduce en un prepropolipéptido de 2813 aminoácidos con un peso molecular estimado de 310.000 Da. El prepolipéptido contiene un péptido señal de 22 aminoácidos, un propolipéptido de 741 aminoácidos y la subunidad madura. La escisión del propolipéptido de 741 aminoácidos del N-terminal da lugar a un VWF maduro que consta de 2050 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del prepropolíptido de VWF se muestra en la SEQ ID NO:2. A menos que se indique lo contrario, la numeración de aminoácidos de los residuos de VWF en esta solicitud se refiere a la SEQ ID NO:2, incluso si la molécula de VWF no necesita comprender todos los residuos de la SEQ ID NO:2. La secuencia de aminoácidos de VWF maduro se muestra en la SEQ ID NO:4. El término "VWF", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la forma madura de VWF, a menos que se indique lo contrario.
El propolipéptido de VWF de tipo salvaje comprende múltiples dominios que están dispuestos en el siguiente orden: D1 -D2-D'-D3-A1 -A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK
Los dominios D1 y D2 representan el propéptido que se escinde para producir el VWF maduro. Los dominios D'-D3 abarcan los aminoácidos responsables de la unión al Factor VIII. La secuencia de aminoácidos de al menos una parte de los dominios D'-D3 de VWF de tipo salvaje se muestra en la SEQ ID NO:3. Los 90 residuos carboxiterminales comprenden el dominio "CK" que es homólogo a la superfamilia de proteínas "nudo de cisterna". Estos miembros de la familia tienen tendencia a dimerizarse mediante enlaces disulfuro.
Preferentemente, el VWF de tipo salvaje comprende la secuencia de aminoácidos de VWF maduro como se muestra en la SEQ ID NO:4. También se incluyen adiciones, inserciones, deleciones N-terminales, C-terminales o internas de VWF siempre que se conserve una actividad biológica de VWF, en particular la capacidad de unirse a FVIII. La actividad biológica se conserva en el sentido de la invención si VWF con deleciones conserva al menos el 10%, preferentemente al menos el 25%, más preferentemente al menos el 50%, más preferentemente al menos el 75% de la actividad biológica de VWF de tipo salvaje. La actividad biológica de VWF de tipo salvaje puede ser determinada por el artesano utilizando procedimientos para la actividad del cofactor ristocetina (Federici AB et al. 2004. Haematologica 89:77-85), la unión de VWF a la GP Iba del complejo glicoproteico plaquetario Ib-V-IX (Sucker et al.
2006. Clin Appl Thromb Hemost. 12:305-310), o un ensayo de unión al colágeno (Kallas & Talpsep. 2001. Anales de Hematología 80:466-471). Cuando la actividad biológica de VWF es la capacidad de unirse al FVIII, esto puede medirse de varias maneras, sin embargo, se mide preferentemente como se describe en el Ejemplo 1 del presente documento.
Factor VIII
Los términos "Factor VIII de coagulación sanguínea", "Factor VIII" y "FVIII" se utilizan indistintamente en el presente documento. El "Factor VIII de coagulación sanguínea" incluye el FVIII de coagulación sanguínea de tipo natural, así como los derivados del FVIII de coagulación sanguínea de tipo natural que tienen la actividad procoagulante del FVIII de coagulación sanguínea de tipo natural. Los derivados pueden tener deleciones, inserciones y/o adiciones en comparación con la secuencia de aminoácidos del FVIII de tipo salvaje. El término FVIII incluye formas de FVIII procesadas proteolíticamente, por ejemplo, la forma antes de la activación, que comprende la cadena pesada y la cadena ligera. Se incluye el FVIII derivado del plasma y el recombinante, incluido el FVIII eliminado del dominio B. Algunos ejemplos de productos comerciales son Advate®, Kogenate®, Xyntha®, Loctate® y Novoeight®.
El término "FVIII" incluye cualquier variante o mutante del FVIII que tenga al menos el 25%, más preferentemente al menos el 50%, más preferentemente al menos el 75% de la actividad biológica del factor VIII de tipo salvaje.
Como ejemplos no limitantes, las moléculas de FVIII incluyen mutantes de FVIII que impiden o reducen la escisión de APC (Amano 1998. Tromb. Hemost. 79:557-563), mutantes del FVIII que estabilizan aún más el dominio A2 (WO 97/40145), mutantes del FVIII que tienen una mayor expresión (Swaroop et al. 1997. JBC 272:24121-24124), mutantes del FVIII con inmunogenicidad reducida (Lollar 1999. Tromb. Hemost. 82:505-508), FVIII reconstituido a partir de cadenas pesadas y ligeras expresadas de forma diferente (Oh et al. 1999. Exp. Mol. Med. 31:95-100), mutantes del FVIII que tienen una unión reducida a los receptores que conducen al catabolismo del FVIII como HSPG (proteoglicanos de heparán sulfato) y/o LRP (proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad) (Ananyeva et al. 2001. TCM, 11:251-257), variantes del FVIII estabilizadas por enlaces disulfuro (Gale et al., 2006. J. Thromb. Hemost. 4:1315-1322), mutantes del FVIII con propiedades de secreción mejoradas (Miao et al., 2004. Sangre 103:3412-3419), mutantes del FVIII con mayor actividad específica del cofactor (Wakabayashi et al., 2005. Bioquímica 44:10298-304), mutantes del FVIII con biosíntesis y secreción mejoradas, interacción reducida de la chaperona del RE, transporte mejorado del RE-Golgi, activación aumentada o resistencia a la inactivación y vida media mejorada (resumido por Pipe 2004. Sem. Tromb. Hemost. 30:227-237). Otro ejemplo particularmente preferente es una forma recombinante de FVIII como se describe en Zollner et al 2013, Thrombosis Research, 132:280-287.
Preferentemente, el FVIII comprende la secuencia de longitud completa del FVIII que se muestra en la SEQ ID NO: 14. También se incluyen adiciones, inserciones, sustituciones, deleciones N-terminales, C-terminales o internas del FVIII siempre que se mantenga la actividad biológica del FVIII. La actividad biológica se conserva en el sentido de la invención si el FVIII con modificaciones conserva al menos el 10%, preferentemente al menos el 25%, más preferentemente al menos el 50%, más preferentemente al menos el 75% de la actividad biológica del FVIII de tipo salvaje. La actividad biológica del FVIII puede ser determinada por el artesano como se describe a continuación. Una prueba adecuada para determinar la actividad biológica de FVIII es, por ejemplo, el ensayo de coagulación de una o dos etapas (Rizza et al. 1982. Ensayo de coagulación de FVIII:C y FIXa en Bloom ed. The Hemophilias. NY Churchchill Livingston 1992) o el ensayo de sustrato cromogénico FVIII:C (S. Rosen, 1984. Scand J Haematol 33: 139-145, supletoria).
La secuencia de aminoácidos de la forma madura de tipo salvaje del FVIII de la coagulación de la sangre humana se muestra en la SEQ ID NO: 14. La referencia a la posición de un aminoácido de una secuencia específica indica la posición de dicho aminoácido en la proteína de tipo salvaje de FVIII y no excluye la presencia de mutaciones, por ejemplo, deleciones, inserciones y/o sustituciones en otras posiciones de la secuencia mencionada. Por ejemplo, una mutación en "Glu2004" referida a la SEQ ID NO:14 no excluye que en el homólogo modificado falten uno o más aminoácidos en las posiciones 1 a 2332 de la SEQ ID NO:14.
"FVIII" y/o "VWF" dentro de la definición anterior también incluyen las variaciones alélicas naturales que pueden existir y ocurrir de un individuo a otro. "FVIII" y/o "VWF" dentro de la definición anterior incluye además variantes de FVIII y/o VWF. Estas variantes difieren en uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de tipo salvaje. Ejemplos de tales diferencias pueden incluir sustituciones conservadoras de aminoácidos, es decir, sustituciones dentro de grupos de aminoácidos con características similares, por ejemplo (1) aminoácidos pequeños, (2) aminoácidos ácidos, (3) aminoácidos polares, (4) aminoácidos básicos, (5) aminoácidos hidrofóbicos y (6) aminoácidos aromáticos. En la Tabla 1 se muestran ejemplos de estas sustituciones conservadoras.
Tabla 1
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VWF modificado
El VWF modificado de la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de VWF de tipo salvaje. Según la presente invención, el VWF modificado tiene al menos una sustitución de aminoácidos dentro de los dominios D'-D3, en comparación con la secuencia de aminoácidos de los dominios D'-D3 de VWF de tipo salvaje, como se muestra en la SEQ ID NO:3.
La secuencia de aminoácidos de los dominios D'-D3 de VWF modificado puede tener una o más sustituciones de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO:3. La secuencia de aminoácidos de los dominios D'-D3 de VWF modificado tiene preferentemente una o 2 o 3 sustituciones de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO:3.
Es preferente que el VWF modificado incluya una modificación en la posición 320 de SEQ ID NO:3. También se prefiere que la V en esta posición se sustituya por A. En otras formas preferentes, el VWF modificado, además de la modificación en la posición 320, también se modifica en la posición 1 y/o 3 de la SEQ ID NO:3, preferentemente en ambas posiciones 1 y 3.
Es preferente que S en la posición 1 de SEQ ID NO:3 esté sustituida por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, P, V, E, Y, A y L.
También es preferente que S en la posición 3 de SEQ ID NO:3 esté sustituida por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, I, M, V, F, H, R y W.
Las combinaciones de sustituciones de la invención son S764P/S766W/V1083A, S764G/S766Y/V1083A, S764E/S766Y/V1083A, N1011S/V1083A/K1181E, S766Y/V1083A, V805/Q1158L ,K912E/T1088S, V1083A, S1042T y L781P
Según un aspecto de esta invención, la afinidad de unión del polipéptido de la presente invención al FVIII es mayor que la de un polipéptido de referencia que tiene la misma secuencia de aminoácidos excepto por la modificación en SEQ ID NO:3.
La afinidad de unión de una molécula de VWF a una molécula de Factor VIII puede determinarse mediante un ensayo de unión utilizado en la técnica. Por ejemplo, la molécula de VWF puede inmovilizarse en un soporte sólido, se aplican concentraciones crecientes de Factor VIII, se incuba durante un cierto periodo de tiempo y, tras el lavado, se determina el Factor VIII unido con un ensayo cromogénico. La constante de afinidad o de disociación puede determinarse entonces mediante el análisis de Scatchard u otro procedimiento adecuado. Un procedimiento para determinar la afinidad de unión del Factor VIII humano al Factor von Willebrand se describe en Vlot et al. (1995), Blood, Volumen 85, Número 11, 3150-3157. Sin embargo, preferentemente, la afinidad de VWF al Factor VIII se determina como se describe en el Ejemplo 1 de la presente solicitud.
Cualquier indicación aquí de afinidad, incluyendo las constantes de disociación, se refiere preferentemente a la unión de VWF modificado de la invención, o del polipéptido de la invención al FVIII. La secuencia de aminoácidos de la cadena simple del FVIII se muestra en la SEQ ID NO: 14.
Como la interacción de VWF con el FVIII tiene típicamente una alta tasa de asociación, los cambios en la constante de disociación dependen en gran medida de los cambios en la tasa de disociación. En consecuencia, el principal objetivo para aumentar la asociación de VWF con FVIII implica esfuerzos para disminuir la tasa de disociación entre FVIII y VWF. Preferentemente, la tasa de disociación de VWF y el FVIII modificados en comparación con VWF y FVIII de tipo salvaje es al menos dos veces menor, más preferentemente al menos 5 veces menor, preferentemente al menos 10 veces menor y más preferentemente al menos 20 veces menor.
La constante de disociación del complejo formado por l VWF y FVIII es preferentemente 0,2 nmol/l o menos, más preferentemente 0,175 nmol/l o menos, más preferentemente 0,15 nmol/l o menos, más preferentemente 0,125 nmol/l o menos, más preferentemente 0,1 nmol/l o menos, más preferentemente 0,05 nmol/l o menos, más preferentemente 0,01 nmol/l o menos.
La constante de disociación KD de un complejo del polipéptido de la invención y el Factor VIII de SEQ ID NO:14 es típicamente inferior al 90% de la constante de disociación KD de un complejo del polipéptido de referencia (por ejemplo, el polipéptido de SEQ ID NO:4) y el Factor VIII de SEQ ID NO: 14. La constante de disociación KD de un complejo del polipéptido de la invención y el Factor VIII de SEQ ID NO:14 es preferentemente inferior al 75%, más preferentemente inferior al 50%, más preferentemente inferior al 25%, más preferentemente inferior al 10%, más preferentemente inferior al 5%, de la constante de disociación KD de un complejo del polipéptido de referencia (por ejemplo, el polipéptido de SEQ ID NO:4) y el Factor VIII de SEQ ID NO: 14.
El polipéptido de referencia es un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la del polipéptido de la presente invención excepto por la mutación dentro de los dominios D'-D3 de VWF. Es decir, el polipéptido de referencia tiene preferentemente una secuencia de aminoácidos idéntica a la del polipéptido de la presente invención, con la salvedad de que los dominios D'-D3 en el polipéptido de referencia consisten en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO:3. En otras palabras, la única diferencia de secuencia entre el polipéptido de la invención y el polipéptido de referencia reside en la secuencia de aminoácidos de los dominios D'-D3. El polipéptido de referencia se ha preparado preferentemente en las mismas condiciones que el polipéptido de la invención.
Fracción de extensión de la vida media
El polipéptido de la presente invención puede consistir en el VWF modificado. En otra realización, el polipéptido de la presente invención puede comprender además una fracción de extensión de la vida media. La fracción que prolonga la vida media puede ser una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada con el VWF truncado. Alternativamente, la fracción que prolonga la vida media puede conjugarse químicamente con el polipéptido que comprende el VWF truncado mediante un enlace covalente diferente a un enlace peptídico.
En ciertas realizaciones de la invención, la vida media del polipéptido de la invención se prolonga mediante una modificación química, por ejemplo, la unión de una fracción que prolonga la vida media, tal como el polietilenglicol (PEGilación), el PEG glicosilado, el hidroxietil-almidón (HESilación), los ácidos polisiales, los polipéptidos similares a la elastina, los polímeros de heparosán o el ácido hialurónico. En otra realización, el polipéptido de la invención se conjuga con un HLEP como la albúmina a través de un enlazador químico. El principio de esta tecnología de conjugación ha sido descrito de forma ejemplar por Conjuchem LLC (véase, por ejemplo la Patente Estadounidense No. 7.256.253).
Polipéptidos potenciadores de la vida media (HLEP)
Preferentemente, la fracción que prolonga la vida media es un polipéptido que prolonga la vida media (HLEP), más preferentemente el HLEP se selecciona de la albúmina o fragmentos de la misma, la región constante de la inmunoglobulina y porciones de la misma, por ejemplo el fragmento Fc, cadenas aleatorias solvatadas con gran volumen hidrodinámico (por ejemplo XTEN (Schellenberger et al. 2009; Nature Biotechnol. 27:1186-1190), repeticiones de homo-aminoácidos (HAP) o repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), afamina, alfa-fetoproteína, proteína de unión a la vitamina D, transferrina o variantes de la misma, péptido carboxilo-terminal (CTP) de la subunidad B de la gonadotropina coriónica humana, polipéptidos o lípidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a la albúmina o a la región constante de la inmunoglobulina.
Un "polipéptido potenciador de la vida media", tal como se utiliza en el presente documento, se selecciona preferentemente del grupo formado por la albúmina, un miembro de la familia de la albúmina, la región constante de la inmunoglobulina G y sus fragmentos, la región y los polipéptidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a la albúmina, a los miembros de la familia de la albúmina, así como a porciones de una región constante de la inmunoglobulina. Puede ser una proteína de media vida de longitud completa descrita en el presente documento (por ejemplo, la albúmina, un miembro de la familia de la albúmina o la región constante de la inmunoglobulina G) o uno o más fragmentos de la misma que sean capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica o la actividad biológica del factor de coagulación. Dichos fragmentos pueden tener una longitud de 10 o más aminoácidos o pueden incluir al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, o más aminoácidos contiguos de la secuencia HLEP o pueden incluir parte o todos los dominios específicos del HLEP respectivo, siempre que el fragmento HLEP proporcione una extensión de la vida media funcional de al menos un 25% en comparación con el polipéptido respectivo sin el HLEP.
La porción HLEP del polipéptido de la invención puede ser una variante de un HLEP de tipo salvaje. El término "variantes" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, ya sean conservadoras o no conservadoras, cuando dichos cambios no alteren sustancialmente la actividad de unión al FVIII de VWF truncado.
En particular, los constructos de fusión VWF HLEP propuestos de la invención pueden incluir variantes polimórficas naturales de HLEP y fragmentos de HLEP. HLEP puede derivarse de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mamífero, por ejemplo, ser humano, mono, vaca, oveja o cerdo. Los HLEP no mamíferos incluyen, entre otros, la gallina y el salmón.
En una realización, el polipéptido tiene la siguiente estructura:
mVWF - L1 - H, [fórmula 1]
donde mVWF es el VWF modificado, L1 es un enlace químico o una secuencia de enlace, y H es un HLEP.
L1 puede ser un enlace químico o una secuencia de enlace que consiste en uno o más aminoácidos, por ejemplo de 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5 o 1 a 3 (por ejemplo 1 , 2 o 3) aminoácidos y que pueden ser iguales o diferentes entre sí. Normalmente, las secuencias enlazadoras no están presentes en la posición correspondiente en el VWF de tipo salvaje. Ejemplos de aminoácidos adecuados presentes en L1 incluyen Gly y Ser. El enlazador debe ser no inmunogénico y puede ser un enlazador no escindible o escindible. Los enlazadores no escindibles pueden estar compuestos por residuos de glicina y serina alternados, como se ejemplifica en el documento WO2007/090584. En otra realización de la invención, el enlazador peptídico entre la parte truncada de VWF y la parte de la albúmina consiste en secuencias peptídicas que sirven como enlazadores naturales entre dominios en las proteínas humanas. Preferentemente, estas secuencias peptídicas en su entorno natural se encuentran cerca de la superficie de la proteína y son accesibles al sistema inmunitario, de modo que se puede asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. Se proporcionan ejemplos en el documento WO2007/090584. Las secuencias de enlace escindibles se describen, por ejemplo, en el documento WO 2013/120939 A1.
Las secuencias HLEP preferentes se describen infra. También se incluyen en la invención las fusiones al "aminoácido N-terminal" exacto o al "aminoácido C-terminal" exacto de la HLEP respectiva, o las fusiones a la "parte N-terminal" o a la "parte C-terminal" de la HLEP respectiva, que incluyen deleciones N-terminales de uno o más aminoácidos de la HLEP. El polipéptido puede comprender más de una secuencia HLEP, por ejemplo, dos o tres secuencias HLEP. Estas múltiples secuencias HLEP pueden fusionarse con la parte C-terminal de v Wf en tándem, por ejemplo, como repeticiones sucesivas.
Albúmina como HLEP
Los términos "albúmina de suero humano" (HSA) y "albúmina humana" (HA) y "albúmina" (ALB) se utilizan indistintamente en esta solicitud. Los términos "albúmina" y "albúmina sérica" son más amplios y abarcan la albúmina sérica humana (y sus fragmentos y variantes), así como la albúmina de otras especies (y sus fragmentos y variantes).
Como se utiliza en la presente memoria, "albúmina" se refiere colectivamente al polipéptido de albúmina o a la secuencia de aminoácidos, o a un fragmento o variante de albúmina, que tiene una o más actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de la albúmina. En particular, la "albúmina" se refiere a la albúmina humana o a sus fragmentos, especialmente a la forma madura de la albúmina humana que se muestra en la SEQ ID NO: 16 aquí o albúmina de otros vertebrados o fragmentos de la misma, o análogos o variantes de estas moléculas o fragmentos de las mismas.
En particular, los polipéptidos propuestos de la invención pueden incluir variantes polimórficas naturales y no naturales de la albúmina humana y fragmentos de albúmina humana. En general, un fragmento o variante de albúmina tendrá una longitud de al menos 10, preferentemente de al menos 40, y más preferentemente de más de 70 aminoácidos.
Las realizaciones preferentes de la invención incluyen variantes de albúmina utilizadas como HLEP del polipéptido de la invención con una unión mejorada al receptor FcRn. Dichas variantes de albúmina pueden dar lugar a una vida media plasmática más larga de una proteína de fusión de la variante de albúmina de VWF truncada en comparación con una fusión de VWF truncado con una albúmina de tipo salvaje. Las variantes incluyen las descritas en los documentos WO 2014072481, WO 2012150319, WO 2013135896, WO 2011124718, WO 2011051489 y WO 2012059486,
La porción de albúmina de los polipéptidos de la invención puede comprender al menos un subdominio o dominio de HA o modificaciones conservativas del mismo.
Inmunoglobulinas como HLEP
0058 ] Las regiones constantes (Fc) de la inmunoglobulina G (IgG) son conocidas en la técnica para aumentar la vida media de las proteínas terapéuticas (Dumont J A et al. 2006. BioDrugs 20:151-160). La región constante de la cadena pesada de la IgG consta de 3 dominios (CH1-CH3) y una región bisagra. La secuencia de inmunoglobulina puede proceder de cualquier mamífero o de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, respectivamente. Las IgG y los fragmentos de IgG sin un dominio de unión al antígeno también pueden utilizarse como HLEP. La porción de polipéptido terapéutico está conectada a la IgG o a los fragmentos de IgG preferentemente a través de la región bisagra del anticuerpo o de un enlazador peptídico, que incluso puede ser escindible. Varias patentes y solicitudes de patentes describen la fusión de proteínas terapéuticas con regiones constantes de inmunoglobulina para aumentar la vida media in vivo de la proteína terapéutica. US 2004/0087778 y WO 2005/001025 describen proteínas de fusión de dominios Fc o al menos porciones de regiones constantes de inmunoglobulina con péptidos biológicamente activos que aumentan la vida media del péptido, que de otro modo se eliminaría rápidamente in vivo. Se describieron proteínas de fusión Fc-IFN-p que conseguían una mayor actividad biológica, una vida media circulante prolongada y una mayor solubilidad (WO 2006/000448). Se divulgaron proteínas Fc-EPO con una vida media sérica prolongada y una mayor potencia in vivo (WO 2005/063808), así como fusiones de Fc con G-CSF (WO 2003/076567), el péptido similar al glucagón-1 (WO 2005/000892), factores de coagulación (WO 2004/101740) y la interleucina-10 (Patente Estadounidense No. 6.403.077), todos ellos con propiedades de mejora de la vida media. Varios HLEP que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención se describen en detalle en el documento WO 2013/120939 A1,
Secuencias de enlace
Según la presente invención, la fracción de polipéptido terapéutico puede acoplarse a la fracción de HLEP mediante un enlazador peptídico. El enlazador debe ser no inmunogénico y puede ser un enlazador no escindible o escindible. Los enlazadores no escindibles pueden estar compuestos por residuos de glicina y serina alternados, como se ejemplifica en el documento WO2007/090584.
En otra realización de la invención, el enlazador peptídico entre la fracción de VWF y la fracción de la albúmina consiste en secuencias peptídicas que sirven como enlazadores interdominio naturales en las proteínas humanas. Preferentemente, estas secuencias peptídicas en su entorno natural se encuentran cerca de la superficie de la proteína y son accesibles al sistema inmunitario, de modo que se puede asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. Se proporcionan ejemplos en el documento WO2007/090584.
Los enlazadores escindibles deben ser lo suficientemente flexibles como para permitir la escisión por proteasas. En una realización preferente, la escisión del enlazador procede con una rapidez comparable a la de la activación del FVIII dentro de la proteína de fusión, si ésta es un FVIII modificado.
El enlazador escindible comprende preferentemente una secuencia derivada de
(a) el propio polipéptido terapéutico que se va a administrar si contiene sitios de escisión proteolítica que se escinden proteolíticamente durante la activación del polipéptido terapéutico,
(b) un polipéptido sustrato escindido por una proteasa que se activa o se forma por la participación del polipéptido terapéutico, o
(c) un polipéptido que interviene en la coagulación o la fibrinólisis.
La región enlazadora, en una realización más preferente, comprende una secuencia de VWF, lo que debería dar lugar a un menor riesgo de propiedades neoantigénicas de la proteína de fusión expresada.
Los péptidos enlazadores son preferentemente escindibles por las proteasas del sistema de coagulación, por ejemplo FIIa, FIXa, FXa, FXIa y FVIIa.
Las combinaciones ejemplares de polipéptido terapéutico, enlazador escindible y HLEP incluyen los constructos enumerados en los documentos WO2007/090584 (por ejemplo en la tabla 2 y la figura 4) y WO2007/144173 (por ejemplo, en la tabla 3a y 3b),
En otra realización, la vida media funcional del polipéptido de la invención o del FVIII complejado con el polipéptido de la invención se prolonga en comparación con la de VWF de tipo salvaje o con la del FVIIi complejado con el VWF de tipo salvaje, o con el polipéptido de referencia como se define supra. El aumento puede ser superior al 15%, por ejemplo al 20% o al 50%. De nuevo, dichos valores de vida media funcional pueden medirse in vitro en muestras de sangre tomadas a diferentes intervalos de tiempo de dicho mamífero después de que se haya administrado el VWF modificado o el complejo de FVIII con VWF modificado.
En otra realización de la invención, el polipéptido de la invención o el FVIII complejado con el polipéptido de la invención exhibe una recuperación in vivo mejorada en comparación con el VWF de tipo salvaje o con el FVIII complejado con el VWF de tipo salvaje, o con el polipéptido de referencia definido supra. La recuperación in vivo puede determinarse, por ejemplo, en animales normales o en modelos animales de hemofilia A, como los ratones con FVIII knockout, en los que cabría esperar que se encontrara un mayor porcentaje de FVIII mediante ensayos de antígenos o de actividad en la circulación poco después (de 5 a 10 minutos) de la administración i.v. en comparación con el correspondiente VWF de tipo salvaje, o con el polipéptido de referencia definido anteriormente.
La recuperación in vivo se incrementa preferentemente en al menos un 10%, más preferentemente en al menos un 20%, e incluso más preferentemente en al menos un 40% en comparación con el FVIII complejado con el VWF de tipo salvaje, o con el polipéptido de referencia definido supra.
Polinucleótidos
La invención se refiere además a un polinucleótido que codifica un VWF modificado o un polipéptido que comprende dicho VWF modificado, como se describe en esta solicitud. El término "polinucleótido(s)" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polideoxirribonucleótido que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. El polinucleótido puede ser ADN de una o dos cadenas, ARN de una o dos cadenas. Como se utiliza en la presente memoria, el término "polinucleótido(s)" también incluye ADN o ARN que comprenden una o más bases modificadas y/o bases inusuales, como la inosina. Se apreciará que se pueden hacer una variedad de modificaciones al ADN y al ARN que sirven para muchos propósitos útiles conocidos por los expertos en la materia. El término "polinucleótido(s)", tal y como se emplea aquí, abarca dichas formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente, así como las formas químicas de ADN y ARN características de los virus y las células, incluyendo, por ejemplo, las células simples y complejas.
El experto entenderá que, debido a la degeneración del código genético, un polipéptido dado puede ser codificado por diferentes polinucleótidos. Estas "variantes" están incluidas en esta invención.
Preferentemente, el polinucleótido de la invención es un polinucleótido aislado. El término polinucleótido "aislado" se refiere a un polinucleótido que está sustancialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico, tales como y no limitadas a otro ADN y ARN cromosómico y extracromosómico. Los polinucleótidos aislados pueden ser purificados de una célula huésped. Para la obtención de polinucleótidos aislados pueden utilizarse los procedimientos convencionales de purificación de ácidos nucleicos conocidos por los artesanos. El término también incluye los polinucleótidos recombinantes y los polinucleótidos sintetizados químicamente.
La invención se refiere además a un grupo de polinucleótidos que juntos codifican el VWF modificado de la invención, o el polipéptido de la invención que comprende el VWF modificado. Un primer polinucleótido del grupo puede codificar la parte N-terminal de VWF modificado, y un segundo polinucleótido puede codificar la parte C-terminal de VWF modificado.
Otro aspecto de la invención es un plásmido o vector que comprende un polinucleótido según la invención. Preferentemente, el plásmido o vector es un vector de expresión. En una realización particular, el vector es un vector de transferencia para su uso en terapia génica humana.
La invención también se refiere a un grupo de plásmidos o vectores que comprenden el grupo de polinucleótidos anterior. Un primer plásmido o vector puede contener dicho primer polinucleótido, y un segundo plásmido o vector puede contener dicho segundo polinucleótido. Alternativamente, ambas secuencias codificadoras se clonan en un vector de expresión, ya sea utilizando dos secuencias promotoras separadas o un promotor y un elemento del sitio de entrada del ribosoma interno (IRES), que puede utilizarse, por ejemplo, para dirigir la expresión de la furina con el fin de mejorar la generación del VWF maduro.
Aún otro aspecto de la invención es una célula huésped que comprende un polinucleótido, un plásmido o vector de la invención, o un grupo de polinucleótidos o un grupo de plásmidos o vectores como se describe en el presente documento.
Las células huésped de la invención pueden emplearse en un procedimiento para producir un VWF modificado o un polipéptido que comprenda dicho VWF modificado, que forma parte de esta invención. El procedimiento comprende:
(a) cultivar las células huésped de la invención en condiciones tales que se exprese la proteína modificada deseada; y
(b) opcionalmente, recuperar la proteína modificada deseada de las células huésped o del medio de cultivo. Es preferente purificar el VWF modificado de la presente invención, o el polipéptido que comprende el VWF modificado hasta > 80% de pureza, más preferentemente > 95% de pureza, y particularmente se prefiere un estado farmacéuticamente puro que sea superior al 99,9% de pureza con respecto a macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libre de agentes infecciosos y pirogénicos. Preferentemente, un VWF modificado aislado o purificado de la invención o un polipéptido de la invención está sustancialmente libre de otros polipéptidos no relacionados.
Los diversos productos de la invención son útiles como medicamentos. Por consiguiente, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un VWF modificado o un polipéptido que comprende dicho VWF modificado como se describe en el presente documento, un polinucleótido de la invención, o un plásmido o vector de la invención.
La invención también se refiere a un procedimiento para tratar a un individuo que padece un trastorno de la coagulación de la sangre, tal como hemofilia A o B o VWD. El procedimiento comprende la administración a dicho individuo de una cantidad eficaz de (i) FVIII y de VWF modificado o del polipéptido que comprende el VWF modificado o (ii) del complejo de FVIII con vWf modificado o (iii) del complejo de FVIII con el polipéptido que comprende el VWF modificado como se describe en el presente documento. En otra realización, el procedimiento comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un polinucleótido de la invención o de un plásmido o vector de la invención. Alternativamente, el procedimiento puede comprender la administración al individuo de una cantidad eficaz de las células huésped de la invención aquí descritas.
Expresión de los polipéptidos modificados
La producción de proteínas mutantes recombinantes a altos niveles en células huésped adecuadas requiere el ensamblaje de los polinucleótidos modificados antes mencionados, típicamente ADNc, en unidades transcripcionales eficientes junto con elementos reguladores adecuados en un vector de expresión recombinante que puede propagarse en varios sistemas de expresión según procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Los elementos reguladores transcripcionales eficientes podrían derivarse de los virus que tienen a las células animales como huéspedes naturales o del ADN cromosómico de las células animales. Preferentemente, se pueden utilizar combinaciones promotoras-reforzadoras derivadas del virus Simian 40, adenovirus, virus del polioma BK, citomegalovirus humano o la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, o combinaciones promotorasreforzadoras que incluyan genes fuertemente transcritos de forma constitutiva en células animales como la betaactina o el GRP78. Para conseguir niveles elevados y estables de ARNm transcrito a partir de los ADNc, la unidad transcripcional debe contener en su parte 3'-proximal una región de ADN que codifique una secuencia de terminación-poliadenilación transcripcional. Preferentemente, esta secuencia se deriva de la región transcripcional temprana del virus Simian 40, del gen de la beta-globina de conejo o del gen del activador tisular del plasminógeno humano.
Los ADNc se integran entonces en el genoma de una línea celular huésped adecuada para la expresión de las proteínas FVIII y/o VWF modificadas. Preferentemente, esta línea celular debe ser una línea celular animal de origen vertebrado para garantizar el correcto plegamiento, la formación de enlaces disulfuro, la glicosilación ligada a la asparagina y otras modificaciones postraduccionales, así como la secreción en el medio de cultivo. Ejemplos de otras modificaciones postraduccionales son la O-sulfatación de la tirosina y el procesamiento proteolítico de la cadena polipeptídica naciente. Ejemplos de líneas celulares que pueden utilizarse son las células COS de mono, las células L de ratón, las células C127 de ratón, las células BHK-21 de hámster, las células 293 de riñón embrionario humano y las células CHO de hámster.
El vector de expresión recombinante que codifica los ADNc correspondientes puede introducirse en una línea celular animal de varias maneras. Por ejemplo, se pueden crear vectores de expresión recombinantes a partir de vectores basados en diferentes virus animales. Algunos ejemplos son los vectores basados en baculovirus, virus vaccinia, adenovirus y, preferentemente, el virus del papiloma bovino.
Las unidades de transcripción que codifican los ADN correspondientes también pueden introducirse en células animales junto con otro gen recombinante que puede funcionar como un marcador selectivo dominante en estas células para facilitar el aislamiento de clones celulares específicos que hayan integrado el ADN recombinante en su genoma. Ejemplos de este tipo de genes marcadores dominantes seleccionables son la fosfotransferasa de aminoglicósidos Tn5, que confiere resistencia a la gentamicina (G418), la fosfotransferasa de higromicina, que confiere resistencia a la higromicina, y la acetiltransferasa de puromicina, que confiere resistencia a la puromicina. El vector de expresión recombinante que codifica dicho marcador seleccionable puede residir en el mismo vector que el que codifica el ADNc de la proteína deseada, o bien puede codificarse en un vector separado que se introduce e integra simultáneamente en el genoma de la célula huésped, lo que a menudo da lugar a un estrecho enlace físico entre las diferentes unidades de transcripción.
Otros tipos de genes marcadores seleccionables que pueden utilizarse junto con el ADNc de la proteína deseada se basan en varias unidades de transcripción que codifican la dihidrofolato reductasa (dhfr). Tras la introducción de este tipo de genes en células que carecen de actividad dhfr endógena, preferentemente células CHO (DUKX-B11, DG-44), permitirá que éstas crezcan en medios carentes de nucleósidos. Un ejemplo de este medio es el F12 de Ham sin hipoxantina, timidina y glicina. Estos genes dhfr pueden introducirse junto con las unidades transcripcionales de ADNc del FVIII en células CHO del tipo mencionado, ya sea enlazadas en el mismo vector o en vectores diferentes, creando así líneas celulares dhfr-positivas que producen la proteína recombinante.
Si las líneas celulares anteriores se cultivan en presencia del inhibidor citotóxico de dhfr, metotrexato, surgirán nuevas líneas celulares resistentes al metotrexato. Estas líneas celulares pueden producir la proteína recombinante a un ritmo mayor debido al número amplificado de dhfr enlazado y a las unidades transcripcionales de la proteína deseada. Al propagar estas líneas celulares en concentraciones crecientes de metotrexato (1-10000 nM), se pueden obtener nuevas líneas celulares que producen la proteína deseada a un ritmo muy elevado.
Las líneas celulares anteriores que producen la proteína deseada pueden cultivarse a gran escala, ya sea en cultivo en suspensión o en diversos soportes sólidos. Ejemplos de estos soportes son los microportadores basados en matrices de dextrano o colágeno, o los soportes sólidos en forma de fibras huecas o diversos materiales cerámicos. Cuando se cultivan en cultivo de suspensión celular o en microportadores, el cultivo de las líneas celulares mencionadas puede realizarse como cultivo en baño o como cultivo en perfusión con producción continua de medio condicionado durante largos períodos de tiempo. Por lo tanto, según la presente invención, las líneas celulares anteriores son muy adecuadas para el desarrollo de un proceso industrial para la producción de las proteínas mutantes recombinantes deseadas
Purificación y formulación
La proteína VWF recombinante modificada, que se acumula en el medio de las células secretoras de los tipos mencionados, puede concentrarse y purificarse mediante una variedad de procedimientos bioquímicos y cromatográficos, incluidos los procedimientos que utilizan las diferencias de tamaño, carga, hidrofobicidad, solubilidad, afinidad específica, etc. entre la proteína deseada y otras sustancias en el medio de cultivo celular. Un ejemplo de tal purificación es la adsorción de la proteína mutante recombinante a un anticuerpo monoclonal, dirigido a, por ejemplo, una HLEP, preferentemente albúmina humana, o dirigido al respectivo factor de coagulación, que se inmoviliza sobre un soporte sólido. Tras la adsorción de VWF modificado al soporte, el lavado y la desorción, la proteína puede purificarse aún más mediante diversas técnicas cromatográficas basadas en las propiedades mencionadas.
El orden de las etapas de purificación se elige, por ejemplo, en función de la capacidad y la selectividad de las etapas, la estabilidad del soporte u otros aspectos. Los pasos de purificación preferentes incluyen, entre otros, pasos de cromatografía de intercambio iónico, pasos de cromatografía de afinidad inmune, pasos de cromatografía de afinidad, pasos de cromatografía de interacción hidrofóbica, pasos de cromatografía de colorantes, pasos de cromatografía de hidroxiapatita, pasos de cromatografía multimodal y pasos de cromatografía de exclusión por tamaño.
Para minimizar el riesgo teórico de contaminaciones por virus, se pueden incluir pasos adicionales en el proceso que proporcionen una inactivación o eliminación efectiva de los virus. Estas etapas son, por ejemplo, el tratamiento térmico en estado líquido o sólido, el tratamiento con disolventes y/o detergentes, la radiación en el espectro visible o UV, la radiación gamma o la nanofiltración.
Los polinucleótidos modificados (por ejemplo, ADN) de esta invención también pueden integrarse en un vector de transferencia para su uso en la terapia génica humana.
Las diversas realizaciones descritas en la presente memoria pueden combinarse entre sí. La presente invención se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos de la misma. Esta descripción de realizaciones específicas de la invención se hará en conjunto con las figuras anexas.
El VWF modificado como se describe en esta invención puede formularse en preparaciones farmacéuticas para uso terapéutico. La proteína purificada puede disolverse en soluciones tampón acuosas convencionales fisiológicamente compatibles a las que pueden añadirse, opcionalmente, excipientes farmacéuticos para proporcionar preparados farmacéuticos.
Tales portadores y excipientes farmacéuticos, así como las formulaciones farmacéuticas adecuadas, son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) o "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3a edición, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)). Las técnicas estándar de formulación farmacéutica son bien conocidas por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, 2005 Physicians' Desk Reference®, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004 Remington: La ciencia y la práctica de la farmacia, 20a ed., Gennaro et al., Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Filadelfia, PA, 2000). En particular, la composición farmacéutica que comprende la variante polipeptídica de la invención puede formularse en forma liofilizada o líquida estable. La variante polipeptídica puede ser liofilizada por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Las formulaciones liofilizadas se reconstituyen antes de su uso mediante la adición de uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables, como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estéril.
Las formulaciones de la composición se administran al individuo por cualquier medio de administración farmacéuticamente adecuado. Se conocen varios sistemas de administración que pueden utilizarse para administrar la composición por cualquier vía conveniente. Preferentemente, las composiciones de la invención se administran por vía sistémica. Para el uso sistémico, las proteínas de la invención se formulan para la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intrapulmonar, intranasal o transdérmica) o enteral (por ejemplo, oral, vaginal o rectal) según los procedimientos convencionales. Las vías de administración más preferentes son la intravenosa y la subcutánea. Las formulaciones pueden administrarse de forma continua por infusión o por inyección en bolo. Algunas formulaciones abarcan sistemas de liberación lenta. Las proteínas de la presente invención se administran a los pacientes en una dosis terapéuticamente eficaz, es decir, una dosis que es suficiente para producir los efectos deseados, previniendo o disminuyendo la gravedad o la propagación de la afección o indicación que se está tratando sin alcanzar una dosis que produzca efectos secundarios adversos intolerables. La dosis exacta depende de muchos factores como, por ejemplo, la indicación, la formulación y el modo de administración, y debe determinarse en ensayos preclínicos y clínicos para cada indicación respectiva.
La composición farmacéutica de la invención puede administrarse sola o junto con otros agentes terapéuticos. Estos agentes pueden ser incorporados como parte del mismo producto farmacéutico. Un ejemplo de tal agente es la combinación de VWF modificado con FVIII.
En la Tabla 2 se presenta un resumen de las secuencias mencionadas en el presente documento.
Tabla 2
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EJEMPLOS EJEMPLO 1
Mutantes de VWF con unión mejorada a FVIII
Antecedentes
Como se ha comentado anteriormente y en la Solicitud Internacional de Patente co-pendiente No PCT/AU2015/050369 la mayor parte del FVIII circulante está en complejo con el VWF. En los seres humanos, el FVIII se elimina de la sangre con un t1/2 de aproximadamente 2 horas y 16 horas en ausencia y presencia de VWF, respectivamente. Aunque el VWF imparte un aumento en la vida media del FVIII, también pone un límite superior a la t1/2 que está dictada por su propia vida media. El documento US 8.575.104 divulga una proteína de fusión VWF-albúmina. Esta proteína de fusión tiene una vida media cinco veces más larga que el vWf de tipo salvaje en un modelo de roedores. Un complejo estable entre esta proteína de fusión y el FVIII puede conferir beneficios adicionales a la vida media del FVIII. Aunque la constante de unión de equilibrio para la interacción FVIII/vWF es alta, la cinética de unión es rápida y cualquier FVIII en complejo con la proteína de fusión VWF-albúmina se intercambiará rápidamente con el vWF endógeno durante la infusión. Por consiguiente, si la tasa de disociación del FVIII con la fusión VWF-albúmina es sustancialmente equivalente a la tasa de disociación del FVIII con el VWF nativo, el uso de la fusión VWF-albúmina no proporcionará ningún aumento sustancial de la vida media del FVIII. En consecuencia, para aprovechar la mayor vida media de la fusión VWF-albúmina para extender la vida media del FVIII es necesario disminuir la tasa de disociación del FVIII con la fusión VWF-albúmina. A partir de estudios de modelización que aprovechan las mediciones realizadas en pacientes con la enfermedad de von Willebrand de tipo 2N, en los que el nivel de VWF es normal pero la capacidad de VWF para asociarse con el FVIII está gravemente disminuida, se ha estimado que se requiere una disminución de al menos cinco veces la tasa de disociación para proporcionar una mejora clínicamente relevante en la vida media del FVIII. La relación postulada entre la disminución de la tasa de disociación de la fusión VWF-albúmina de FVIII y el aumento de la vida media del FVIII se establece en la Tabla 3.
Tabla 3
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En un esfuerzo por disminuir la tasa de disociación de la fusión VWF-albúmina de FVIII, se realizaron experimentos para evaluar si la proteína de fusión VWF-albúmina mutante podría proporcionar una tasa de disociación de FVIII significativamente más lenta, proporcionando así una opción viable para extender la vida media de FVIII a través de la asociación estable con la proteína de fusión VWF-albúmina.
En una extensión del trabajo descrito en el documento PCT/AU2015/050369 se investigaron otras mutaciones y combinaciones de mutaciones haciendo hincapié en las modificaciones en el dominio D3. En estos experimentos se utilizó una forma recombinante de FVIII. Este FVIII se describe en Zollner et al 2013, Thrombosis Research, 132:280-287.
Procedimientos
Se obtuvo un ADNc sintético, optimizado por codones, que codifica los dominios D' y D3 del Factor von Willebrand humano (vWF; aminoácidos (aa) 764-1242 (SEQ ID NO:2); en base al número de acceso del GenBank. NP_000543) se obtuvo de GeneART AG (Regensberg, Alemania). Se modificó en el extremo 5' para codificar su propio péptido señal (aa1-22) y en el extremo 3' para codificar una albúmina sérica humana (HAS) a través de un enlazador de glicina-serina. El constructo (Hu-vWF[764-1270]-HSA) se clonó direccionalmente en el vector de expresión para mamíferos pADNc3.1 (Invitrogen, EE.Uu .) con una secuencia consenso de Kozak (GCCACC) antes de la metionina inicial y un doble codón de parada (TGA) en el extremo 3' del marco de lectura abierto, y la secuencia del plásmido se confirmó mediante secuenciación automática. Este plásmido de expresión se utilizó entonces como plantilla para realizar cambios de uno, dos o tres residuos mediante técnicas estándar de PCR y los constructos se clonaron en pADNc3.1 y se secuenciaron como se ha descrito anteriormente. También se sintetizó un segundo ADNc optimizado en codones que codifica los dominios D1 y D2 (aa1-762) de Hu-vWF con una etiqueta FLAG C-terminal (DYKDDDDK), que se obtuvo de GeneArt; se clonó como se ha indicado anteriormente en pADNc3.1 y se secuenció.
Para la expresión transitoria en mamíferos, se cultivaron células en suspensión FreestyleTM 293 (Invitrogen) hasta 1,1 x 106 células/ml en 5ml de medio de expresión Freestyle (Invitrogen). Se preincubaron 7 pl de reactivo de transfección 293Fectin (Invitrogen) durante 5 minutos con 167 pl de medio Opti-MEM I (Invitrogen), y a continuación se añadieron 2,5 pg de ADN de plásmido que codificaba el Hu-vWF[764-1242]-HSA salvaje y 2,5 pg de ADN de plásmido que codificaba el Hu-vWF[1-762]-FLAG, y la mezcla se incubó durante otros 20 minutos. El complejo ADN-293Fectina se añadió a las células, que se cultivaron durante 6 días a 37 °C, 8% de CO2 en una incubadora con agitación a 250 rpm. Los sobrenadantes de los cultivos se recogieron mediante centrifugación a 2.000 rpm durante 5 minutos y se almacenaron a 4°C para su análisis.
El anticuerpo anti-HSA de ratón se inmovilizó en un chip CM5 utilizando la química estándar de acoplamiento NHS/EDC. Normalmente, el nivel de inmovilización era de aproximadamente 14.000 UI. Cada mutante de vWF-HSA se capturó en una sola mancha en cada celda de flujo durante 2 minutos en varias concentraciones que oscilaban entre 0,1 a 1p/ml. Los niveles de captura oscilaron entre 100-200RU. Se utilizó como referencia una mancha adyacente en la que se inmovilizó anti-HSA, pero no se capturó el vWF-HSA. La captura se realizó en cada ciclo, antes del análisis de la unión del FVIII.
Se estableció un experimento inicial a pH neutro para detectar una serie de mutaciones en busca de los mutantes de vWF-HSA mejorados de superior afinidad y tasa de disociación. El factor VIII se inyectó al azar y por duplicado en todas las manchas y en todas las celdas de flujo en uso a 5, 1 y 1,25nM. Los resultados de esta detección se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4: Detección a pH 7: afinidades y tasas cinéticas del Factor VIII para varias proteínas mutantes del dímero D'D3-HSA clasificadas de mayor a menor afinidad.
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EJEMPLO 2
Análisis cinético detallado
Se llevaron a cabo experimentos posteriores utilizando material purificado en los que se estableció un análisis cinético detallado a pH7 para los dos mejores candidatos, incluyendo los controles. Las proteínas vWF-HAS se purificaron utilizando resina de afinidad de albúmina humana Capture Select™ y luego el dímero vWF-HAS se purificó aún más por cromatografía de exclusión por tamaño de preparación. El material purificado se almacenó a continuación a 4°C antes del análisis. La captura del dímero vWF-HAS se realizó como antes y el Factor VIII se inyectó a 1, 0,5, 0,25, 0,125 y 0,06nM. De manera similar, se estableció un análisis cinético detallado sobre los dos primeros candidatos, incluyendo los controles, a pH5,5, donde se inyectó el Factor VIII en varias concentraciones que se adaptaban mejor a la interacción.
A lo largo de todos los experimentos también se inyectaron controles de tampón sobre todas las proteínas capturadas. La asociación y la disociación del Factor VIII se controlaron durante 3 minutos respectivamente durante el experimento de "detección". La asociación de CSL627 se monitorizó durante 5 minutos y la disociación se monitorizó durante 20 y 60 minutos durante los experimentos de "análisis cinético detallado" a pH neutro. A un pH de 5,5, la asociación y la disociación del Factor VIII se controlaron durante varios períodos de tiempo que se adaptaban mejor a la interacción.
Después del periodo de disociación, la superficie fue regenerada con una inyección de 45 segundos de 25mM de Glicina pH2,6. El tampón de corrida fue de lOmM HEPES, 150mM NaCl, lOmM Citrato de Na, 2.5mM CaCh, 0,1% BSA, pH7.3 y pH5,5, mientras que el caudal fue de 30 pl/min. Cada interacción se midió al menos 2 veces (n=2) a 37°C.
Las respuestas para la unión a la mancha de referencia se restaron de las de las manchas capturadas de vWF-HSA. Las respuestas de las inyecciones de control se restaron de las de todas las demás muestras para producir sensorgramas de doble referencia. Los sensorgramas de doble referencia se ajustaron a un modelo cinético 1:1, incluyendo un término para la limitación del transporte de masa. Las tasas de asociación y disociación se ajustaron globalmente y la Rmax se ajustó localmente. Los resultados se muestran en las tablas 5 y 6 y se muestran en las Figuras 1-3.
Tabla 5: Cinética detallada a pH 7: afinidades y tasas cinéticas del Factor VIII para los dímeros mutantes D'D3-HSA.
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Tabla 6: Cinética detallada a pH5,5: afinidades y tasas cinéticas del Factor VIII para los dímeros mutantes D'D3-
HSA
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EJEMPLO 3
Análisis cinético adicional
El procedimiento en pocas palabras:
Se llevaron a cabo experimentos posteriores en los que se estableció un análisis cinético más detallado a pH 7 y pH 5,5 para las principales proteínas candidatas producidas utilizando un único constructo de DNS que codifica la región D1D2D'D3 de Vw F nativo fusionado con HAS (Hu-vWF [1-1242]-HAS). Al igual que antes, este constructo se utilizó como plantilla para realizar cambios de uno, dos o tres residuos. La transfección y la purificación de los dímeros de vWF-HAS se realizaron como antes.
El anticuerpo anti-HSA de ratón se inmovilizó en un chip CM5 utilizando la química estándar de acoplamiento NHS/EDC. Normalmente, el nivel de inmovilización era de aproximadamente 14.000 UI. Cada mutante dímero de D'D3-HSA se capturó en una sola mancha en cada celda de flujo durante 2 minutos en varias concentraciones que oscilaban entre 0,2 a 0,7|jg/ml. Los niveles de captura oscilaron entre 50 y 250RU. Se utilizó como referencia una mancha adyacente en el que se inmovilizó el anti-HSA, pero no se capturó el D'D3-HSA. La captura se realizó cada ciclo, antes del análisis de la unión del FVIII (CSL627).
Se inyectó CSL627 al azar y por duplicado en todas las manchas de todas las celdas de flujo. A pH neutro se inyectó CSL627 a 1, 0,5, 0,25, 0,l25 y 0,06nM. La asociación se controló durante 5 minutos, mientras que la disociación se controló durante 20 minutos, así como durante 1 hora a la concentración de 1nM. También se inyectaron controles de tampón. A pH5,5 se inyectó CSL627 en varias concentraciones y tiempos que se adaptaban mejor a la interacción que tenía lugar.
Después del periodo de disociación, la superficie se regeneró con una inyección de 45 segundos de 25mM de Glicina pH2,6. El tampón de corrida en todo momento fue lOmM HEPES, 150mM NaCl, lOmM Citrato de Na, 2,5mM CaCl2 , 0,1% BSA, pH7,3 y pH5,5, mientras que el caudal fue de 30 jl/min. Cada interacción se midió 4 veces (n=4) a 37°C.
Las respuestas para la unión a la mancha de referencia se restaron de las de las manchas capturadas de vWF-HSA. Las respuestas de las inyecciones de control se restaron de las de todas las demás muestras para producir sensorgramas de doble referencia. Los sensorgramas de doble referencia se ajustaron a un modelo cinético 1:1, incluyendo un término para la limitación del transporte de masa. Las tasas de asociación y disociación se ajustaron globalmente y la Rmax se ajustó localmente.
Los resultados se muestran en las tablas 7 y 8 y en las figuras 4 y 5.
Tabla 7: Cinética detallada a pH 7: afinidades y tasas cinéticas de unión de CSL627 (Factor VIII) a dímeros mutantes de D'D3-HSA.
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Tabla 8: Cinética detallada a pH5.5: afinidades y tasas cinéticas de unión de CSL627 a dímeros mutantes de D'D3-
HSA.
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EJEMPLO 4
Análisis PK e impacto en la vida media del FVIII
Procedimientos
Se generó una línea celular estable derivada de CHO que expresaba la variante Hu vWF D'D3-FP S764E; S766Y utilizando procedimientos experimentales estándar. El material se produjo a partir de la línea celular estable en un biorreactor de 10L y el dímero vWF D'D3-FP S764E; S766Y se purificó como se ha descrito previamente.
Para evaluar el impacto relativo del tipo salvaje y de la variante vWF D'D3-FP S764E; S766Y en los niveles de FVIII, se administró a ratas CD (3 animales/grupo) una combinación de proteínas FVIII recombinante (CSL627 a 200UI/kg) y vWF-FP a las dosis mostradas en la Tabla 9. Se tomaron muestras de plasma a las 0, 3, 8, 24, 48, 56 y 72 horas después de la administración intravenosa y se determinaron los niveles de FVIII mediante un ELISA Asserachrom FVIII:Ag. Estos datos se utilizaron para determinar la vida media de FVIII y los tiempos medios de residencia que figuran en la Tabla 9.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un Factor de Von Willebrand (VWF) modificado que se une al Factor VIII, en el que el VWF modificado comprende una secuencia como la que se muestra en la SEQ ID NO:3 o un fragmento de la misma; en el que el VWF modificado se une al Factor VIII con una tasa de disociación inferior a la de un VWF de referencia que comprende una SEQ ID NO:3 no modificada en la que el VWF modificado comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:5 (S764P/S766W/V1083A), SEQ ID NO:6 (S764G/S766Y/V1083A), SEQ ID NO:7 (S764E/S766Y/V1083A), SEQ ID NO:8 (N1011S/V1083A/K1181E), SEQ ID NO:17 (S766Y/V1083A), SEQ ID NO:11 (V805A/Q1158L), SEQ ID NO:12 (K912E/T1088S), SEQ ID NO:9 (V1083A), SEQ ID NO:10 (S1042T), y SEQ ID NO:13 (L781P).
2. El VWF modificado según lo reivindicado en la reivindicación 1, en el que el VWF modificado se une al Factor VIII con una tasa de disociación al menos 5 veces inferior a la de VWF de referencia, preferentemente con una tasa de disociación al menos 10 veces inferior a la del polipéptido de referencia.
3. El VWF modificado según lo reivindicado en la reivindicación 1, en el que el polipéptido modificado se une al Factor VIII con una KD al menos 5 veces inferior a la del polipéptido de referencia, preferentemente con una tasa de disociación al menos 10 veces inferior a la del polipéptido de referencia.
4. El VWF modificado según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el VWF modificado comprende además una fracción que prolonga la vida media.
5. El VWF modificado según lo reivindicado en la reivindicación 4, en el que la fracción que prolonga la vida media es una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada al VWF truncado, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga comprende o consiste preferentemente en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en regiones constantes de inmunoglobulina y porciones de las mismas, por ejemplo el fragmento Fc, la transferrina y sus fragmentos, el péptido C-terminal de la gonadotropina coriónica humana, las cadenas aleatorias solvatadas con gran volumen hidrodinámico conocidas como XTEN, las repeticiones de homoaminoácidos (HAP), las repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), la albúmina, la afamina, la alfafetoproteína, la proteína de unión a la vitamina D, los polipéptidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a la albúmina o a las regiones constantes de las inmunoglobulinas, y sus combinaciones.
6. El VWF modificado según lo reivindicado en la reivindicación 4, en el que la fracción que prolonga la vida media se conjuga con el VWF modificado, en el que dicha fracción que prolonga la vida media se selecciona preferentemente del grupo que consiste en hidroxietil-almidón (h Es ), polietilenglicol (PEG), ácidos polisiales (PSA), polipéptidos similares a la elastina, polímeros de heparosán, ácido hialurónico y ligandos de unión a la albúmina, por ejemplo, cadenas de ácidos grasos, y combinaciones de los mismos.
7. El VWF modificado según lo reivindicado en la reivindicación 5, en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga comprende albúmina.
8. El VWF modificado según lo reivindicado en la reivindicación 7, en el que el N-terminal de la albúmina se fusiona con el C-terminal de la secuencia de VWF modificado, ya sea directamente o a través de un espaciador, opcionalmente, en el que se han eliminado de 1 a 5 aminoácidos en el C-terminal natural del polipéptido modificado.
9. Un complejo que comprende una molécula de Factor VIII y el VWF modificado de cualquiera de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. El VWF modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o el complejo de la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno hemorrágico.
11. El VWF modificado o complejo para su uso según la reivindicación 10, en el que el trastorno hemorrágico es la enfermedad de von Willebrand (VWD) o hemofilia A.
12. Una composición farmacéutica que comprende el VWF modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o el complejo de la reivindicación 9.
13. Un polinucleótido que codifica el VWF modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
14. Un plásmido o vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 13; dicho plásmido o vector es un vector de expresión.
15. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 13 o el plásmido de la reivindicación 14.
16. Un procedimiento de producción de un polipéptido que comprende un VWF modificado, que comprende: (i) cultivar las células huésped de la reivindicación 15 en condiciones tales que se exprese el polipéptido que comprende un VWF modificado; y
(ii) opcionalmente, recuperar el polipéptido que comprende un VWF modificado de las células huésped o del medio de cultivo.
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