ES2882355T3 - Composiciones para su uso en el tratamiento de afecciones neurodegenerativas y neuroinflamatorias - Google Patents

Composiciones para su uso en el tratamiento de afecciones neurodegenerativas y neuroinflamatorias Download PDF

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Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto que lo necesita que comprende una cantidad eficaz de una composición que comprende IL-33 y memantina, en la que el tratamiento comprende aumentar la transcripción de un receptor Ab en el sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones para su uso en el tratamiento de afecciones neurodegenerativas y neuroinflamatorias
Campo técnico
La presente tecnología se refiere en general a métodos y composiciones para diagnosticar y tratar afecciones neurodegenerativas y neuroinflamatorias, y métodos para identificar moduladores de afecciones neurodegenerativas o neuroinflamatorias para su uso en métodos de tratamiento y prevención.
Antecedentes
Las enfermedades cerebrales tales como enfermedades neurodegenerativas y trastornos neuroinflamatorios son afecciones devastadoras que afectan a un gran subconjunto de la población. Muchas son actualmente incurables, altamente debilitantes, y a menudo dan como resultado un deterioro progresivo de la estructura y función del cerebro a lo largo del tiempo. La prevalencia de la enfermedad también está aumentando rápidamente debido al creciente envejecimiento de las poblaciones en todo el mundo, ya que los ancianos tienen un alto riesgo de desarrollar estas afecciones. Actualmente, muchas enfermedades neurodegenerativas y trastornos neuroinflamatorios son difíciles de diagnosticar debido a la comprensión limitada de la fisiopatología de estas enfermedades. Mientras tanto, los tratamientos actuales son ineficaces y no satisfacen la demanda del mercado; demanda que está aumentando significativamente cada año debido al envejecimiento de las poblaciones. Por ejemplo: la enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por una disminución gradual pero progresiva en el aprendizaje y la memoria, y una de las principales causas de mortalidad en los ancianos. Actualmente, se estima que 35 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas por la enfermedad, pero se espera que esta cifra aumente significativamente a 100 millones para 2050 debido a esperanzas de vida más largas. No existe cura; y la fisiopatología de la enfermedad sigue siendo relativamente desconocida. Hay solo cuatro fármacos aprobados por la FDA disponibles para pacientes con EA, pero estos solo alivian los síntomas en lugar de alterar la patología de la enfermedad (no pueden revertir la afección o evitar un deterioro adicional) y son ineficaces en afecciones graves. Por lo tanto, la intervención terapéutica temprana es crítica en el tratamiento de la EA. La investigación ha confirmado que la EA afecta al cerebro mucho antes de que los síntomas reales de pérdida de memoria o deterioro cognitivo se manifiestan realmente. Sin embargo, no hay herramientas de diagnóstico para la detección temprana y en el momento en el que se diagnostica a un paciente con EA usando métodos actuales, que implica la evaluación clínica subjetiva, los síntomas patológicos ya están en un estado avanzado. El deterioro cognitivo leve (DCL) se considera la etapa prodrómica de la EA. Herramientas de diagnóstico para identificar individuos con DCL son, por lo tanto, esenciales para el tratamiento de la EA.
La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más prevalente del mundo después de la EA. La EP es un trastorno neurodegenerativo que afecta principalmente al sistema motor. Los síntomas motores de la enfermedad son el resultado de la muerte de las células generadoras de dopamina en la sustancia negra, una región del mesencéfalo. Los síntomas más obvios de la enfermedad están relacionados con el movimiento, que incluyen agitación, rigidez, lentitud del movimiento, y dificultad con la marcha y forma de caminar. A medida que la enfermedad progresa, el pensamiento y el comportamiento se ven afectados, con demencia que se da comúnmente en las etapas avanzadas de la enfermedad. La depresión es el síntoma psiquiátrico más común asociado con la enfermedad. El rasgo patológico principal de la enfermedad es la acumulación de a-sinucleína en inclusiones llamadas cuerpos de Lewy en las neuronas, y la muerte de células generadoras de dopamina en la sustancia negra. Actualmente, la Ep se diagnostica a través de síntomas clínicos, que incluyen temblores, bradiquinesia, rigidez, y desequilibrio postural, ya que las pruebas de diagnóstico fiables o los marcadores para la EP aún no están disponibles. En todo el mundo, se estima que ~ 7 millones de personas tienen EP. Además, se proyecta que el número de casos crezca significativamente debido al envejecimiento de las poblaciones. En EE.u U., se predice que el número de pacientes con EP sea casi el doble; pero el mayor crecimiento se producirá en los países en vías de desarrollo en Asia, como China, que se predice que tendrá un estimado de 5 millones de casos para 2030. Sin embargo, la prevalencia real de la EP es difícil de evaluar porque la enfermedad normalmente no se diagnostica hasta que la enfermedad ha progresado a un estado avanzado debido a limitaciones en los métodos de diagnóstico.
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad degenerativa inflamatoria donde el sistema inmunitario ataca y daña la vaina de mielina que protege las células nerviosas en el cerebro y la médula espinal del sistema nervioso central (SNC), evitando de ese modo la comunicación de las células nerviosas dentro del s Nc . La enfermedad se caracteriza por diversos síntomas que pueden incluir visión borrosa, pérdida de equilibrio, coordinación deficiente, habla discontinua, temblores, entumecimiento, fatiga extrema, problemas con la memoria y la concentración, parálisis y ceguera. No existe cura conocida para la EM, a pesar de que las intervenciones clínicas tienen como objetivo mejorar la función después de un ataque y prevenir nuevos ataques. Sin embargo, los fármacos actuales, son moderadamente eficaces y tienen efectos secundarios adversos. En todo el mundo, se estima que ~2,3 millones de personas se ven afectadas por la EM. Sin embargo, la EM generalmente se diagnostica basándose en signos y síntomas, e incluso en combinación con el soporte de obtención de imágenes médicas y pruebas de laboratorio, el diagnóstico es difícil. Esto es especialmente cierto en las primeras etapas cuando los síntomas son invisibles o similares a otras afecciones médicas.
Otras afecciones neurodegenerativas y neuroinflamatorias incluyen depresión, accidente cerebrovascular, demencia con cuerpos de Lewy, esclerosis lateral amiotrófica, demencia frontotemporal, enfermedad de Huntington, enfermedades degenerativas de retina tales como glaucoma, degeneración macular relacionada con la edad y retinopatía diabética, pérdida de audición debido a degeneración nerviosa, lesión cerebral traumática y lesión de médula espinal, y otras afecciones neuroinflamatorias tales como encefalomielitis diseminada aguda, neuritis óptica, mielitis transversa, síndrome pospoliomietílico, neuropatía motora multifocal y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica. Con el aumento de la prevalencia de enfermedades y trastornos neurodegenerativos y neuroinflamatorios, y su impacto significativo en la salud humana, especialmente en ancianos, sigue existiendo una necesidad urgente de desarrollar estrategias nuevas y eficaces para el diagnóstico, gestión, y tratamiento de enfermedades cerebrales.
La presente tecnología aborda esta necesidad aprovechando la citocina interleucina-33 (IL-33) y su regulador negativo, ST2 soluble (sST2). IL-33 es un miembro de la familia de IL-1, que incluye IL-1a, IL-1 p y IL-18. Las interleucinas son componentes importantes del sistema inmunitario y desempeñan papeles críticos en las respuestas inmunitarias. El ARNm de IL-33 se expresa en diversos órganos (por ejemplo, el sistema nervioso central, pulmones y piel) y tipos de células (por ejemplo, fibroblastos, macrófagos y células gliales) en humanos y ratones (Liew, F. Y., Pitman, N. I., & McInnes, I. B. Nature Reviews Immunology 10, 103-110 (2010)). La IL-33 de longitud completa es biológicamente activa, pero se localiza en el núcleo donde ejerce regulación transcripcional (Moussion, C., Ortega, N. & Girard, J.P. PLoS One 3, e3331 (2008)), mientras que puede actuar como una citocina tradicional al liberarse en los espacios extracelulares al recibir estímulos dolorosos (Cayrol, C. & Girard, J. P. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 9021-9026 (2009) ). En el núcleo, IL-33 modula la arquitectura de la cromatina uniéndose al complejo de histonas H2A-H2B de nucleosomas (Roussel, L., Erard, M., Cayrol, C. & Girard, J. P. EMBO Rep 9, 1006-1012 (2008)), o se asocia con el factor transcripcional NF-kB para suprimir su actividad transcripcional. IL-33 se escinde por caspasa-1 en presencia de otras proteasas. Además de caspasa-1, caspasa-7 y caspasa-3, la calpaína media la escisión de IL-33. Sin embargo, los productos de escisión de IL-33 son biológicamente inactivos (Lüthi AU, Cullen SP, McNeela EA, Duriez PJ, Afonina IS, Sheridan C, Brumatti G, Taylor RC, Kersse K, Vandenabeele P, Lavelle EC, Martin SJ. Inmmunity 3, 84-98 (2009)). Tras una lesión tisular o necrosis, se libera IL-33 desde los núcleos celulares para desencadenar la respuesta inflamatoria en otras células (Liew, F. Y., Pitman, N. I., & McInnes, I.B. Nature Reviews Immunology 10, 103-110 (2010)).
El receptor específico para la IL-33 liberada es ST2 (también conocido como IL-1RL1). Tras la unión al receptor ST2, IL-33 induce el reclutamiento de proteína accesoria del receptor de interleucina-1 (IL-1RAcP) (Chackerian, A. A., et al. J Immunol 179, 2551-2555 (2007)) al receptor ST2 y forma un heterodímero, para iniciar una cascada de señalización aguas abajo. Se identifican varias rutas de señalización aguas abajo, por ejemplo, rutas MyD88/IRAK/TRAF6 , PI3K/Akt/mTOR, Syk/PLCy o JAK/STAT. La activación de la(s) ruta(s) de señalización depende de los tipos de células y las condiciones inflamatorias (Martin, M. U.. Semin Immunol 25, 449-457 (2013)). ST2 determina la especificidad de señalización de IL-33. El gen ST2 codifica diferentes isoformas mediante corte y empalme alternativo: una forma de longitud completa (ST2L), forma soluble secretada (sST2), y forma variante (ST2V) (Miller, A. M., J Inflamm (Lond) 8, 22 (2011)). sST2 actúa como un receptor señuelo para IL-33 para inhibir la activación de la señalización de IL-33/ST2 (Hayakawa, H., Hayakawa, M., Kume, A. & Tominaga, S. J Biol Chem 282, 26369-26380 (2007)). Tras la unión al complejo receptor, IL-33 recluta la proteína 88 de respuesta primaria de diferenciación mieloide, cinasa 1 asociada al receptor de IL-1 (IRAK1), y al complejo IRAK4 para estimular la señalización de cinasas de proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) y el factor nuclear-KB de factor de transcripción (NF-kB). Estas dos rutas median la producción de diferentes citocinas y quimiocinas en los tipos celulares correspondientes (Liew, F. Y., Pitman, N. I., & McInnes, I. B, Nature Reviews Immunology 10, 103-110 (2010)).
La IL-33 desempeña un doble papel en las enfermedades. En primer lugar, tiene una función protectora importante contra la infección. Ratones infectados con el virus de la gripe exhiben inflamación pulmonar reducida y patología después del tratamiento con IL-33 (Liew, F.Y., Pitman, N.I., & McInnes. I.B. Nature Reviews Immunology 10, 103-110 (2010) ). Los niveles de ARNm de IL-33 son elevados en el colon de ratones resistentes a Trichuris muris (Humphreys et al. Journal of immunology 180, 2443-2449 (2008)). Por el contrario, IL-33 promueve la patogénesis de enfermedades relacionadas con linfocitos T cooperadores 2 (Th2) incluyendo asma, dermatitis atópica y anafilaxia induciendo la producción de citocinas en células Th2 y otras células inmunitarias innatas (Kakkar, R. & Lee, R.T. Nature reviews Drug discovery 7, 827-840 (2008)). Por ejemplo, los pacientes con asma tienen mayores niveles de expresión de IL-33; de manera concordante, la administración de iL-33 exacerba la patología del asma en modelos de asma en ratones. De manera sorprendente, tres polimorfismos de nucleótido único (SNP) de IL-33 están asociados con EA en poblaciones caucásicas (Chapuis et al. Mol Psychiatry 14, 1004-1016 (2009)). Uno de los SNP, rs1179633, está fuertemente asociado con el inicio tardío de la enfermedad de Alzheimer en poblaciones chinas (Yu et al., 2009. Neurobiology of aging 33, 1014 e1011-1014 (2012)). La evidencia adicional de la implicación de IL-33 en la EA proviene del hallazgo de que la expresión de ARNm de IL-33 está disminuida en cerebros humanos con EA (Chapuis et al. Mol Psychiatry 14, 1004-1016 (2009)). También hay evidencia de que las células positivas para IL-33 y ST2 están significativamente aumentadas en la corteza entorrinal de pacientes con EA, aunque esto sigue siendo discutido. Además, IL-33 y ST2 se localizan conjuntamente con placas amiloides y ovillos neurofibrilares en los cerebros de pacientes con EA. En los agregados, a pesar de una discrepancia entre el ARNm y la expresión de proteínas en cerebros con EA, estos hallazgos sugieren que la regulación de la señalización de IL-33/ST2 es importante en la patología de la EA. Además, El documento US 2013/012462 A1 da a conocer compuestos y composiciones terapéuticamente activos como antagonistas de receptor NMDA y MC, que son útiles en la prevención y el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central mediante la inhibición de la sobreactivación de receptores de NMDA y/o MC. El documento US 2014/186357 A1 da a conocer un método de tratamiento para trastornos cerebrales degenerativos usando una dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de SUMO1 (modificador 1 pequeño de tipo ubiquitina) y BACE1 (&bgr; -secretasa), o se proporciona el inhibidor de la expresión o activación de SUMO1. El documento de Cherry et al. 2014 da a conocer que los múltiples posibles estados de activación de microglía pueden polarizarse a, y una descripción detallada de la polarización microglial y la relevancia funcional de este proceso en modelos de enfermedades del SNC tanto agudas como crónicas descritos en la bibliografía. Se presta especial atención al uso de la polarización microglial de M2 como una opción terapéutica potencial en el tratamiento de enfermedades. El documento WO 2014/128254 A1 da a conocer interleucina-33 (IL-33), un fragmento de la misma, un polinucleótido que codifica la IL-33 o un fragmento de la misma para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa que implica inflamación en un sujeto y con respecto un método para tratar o prevenir una enfermedad neurodegenerativa que implica neuroinflamación en un sujeto. El documento de Xiong Z et al., 2014 da a conocer una evidencia de expresión aumentada de interleucina-33 y su receptor ST2 en el cerebro de individuos con enfermedad de Alzheimer.
Sumario
Según un aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto que lo necesita, que comprende una cantidad eficaz de una composición que comprende IL-33 y memantina, en la que el tratamiento comprende aumentar la transcripción de un receptor Ap en el sujeto.
El sujeto puede padecer o estar en riesgo de padecer deterioro cognitivo leve, enfermedad de Parkinson o esclerosis múltiple. En algunas realizaciones, la composición se administra por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía intracerebroventricular, por vía intratecal, por vía oral, mediante inhalación, por vía transdérmica, o por vía transmucosa.
La composición puede administrarse conjuntamente con uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales. El uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales pueden seleccionarse del grupo que consiste en donepezilo, rivastigmina, galantamina, memantina, aducanumab, rosiglitazona, bexaroteno, losartán y rincofilina.
En algunas realizaciones, la IL-33 es una proteína IL-33 recombinante. En algunas realizaciones, la proteína recombinante IL-33 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, un polipéptido que tiene al menos el 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, y un polipéptido que tiene al menos el 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 2.
La presente divulgación se refiere a un método para determinar el riesgo de neurodegeneración en un sujeto, que comprende: (a) determinar el nivel de ST2 soluble secretada (sST2) en una muestra biológica tomada del sujeto; (b) comparar el nivel de sST2 con un control estándar; y (c) determinar que el sujeto tiene un mayor riesgo de neurodegeneración cuando el nivel de sST2 obtenido en la etapa (a) es mayor que el control estándar. La muestra biológica puede ser una muestra de sangre, suero, plasma o líquido cefalorraquídeo (LCR). La etapa (a) puede comprender un ensayo inmunológico usando un anticuerpo contra sST2.
La presente divulgación se refiere a un método para identificar un modulador de neurodegeneración, que comprende: (a) poner en contacto un agente candidato con IL-33 y ST2 de longitud completa (ST2L) o sST2 en condiciones permisibles para la unión de IL-33/ST2L o la unión de IL-33/sST2; (b) detectar el nivel de unión de IL-33/ST2L o IL-33/sST2; y (c) identificar el agente candidato como un modulador de neurodegeneración cuando el nivel de unión de IL-33/ST2L o IL-33/sST2 obtenido en la etapa (b) es mayor o menor que el nivel de unión de IL-33/ST2L o IL-33/sST2 en las mismas condiciones pero en ausencia del agente candidato. La etapa (a) puede comprender un ensayo de unión a proteínas in vitro. La etapa (a) puede comprender un ensayo de unión a proteínas en la superficie de una célula que expresa ST2L.
La presente divulgación se refiere a un medicamento para tratar o inhibir la neurodegeneración en un sujeto, que comprende: una cantidad eficaz de IL-33 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
El medicamento puede comprender además uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales. El uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales pueden seleccionarse del grupo que consiste en donepezilo, rivastigmina, galantamina, memantina, aducanumab, rosiglitazona, bexaroteno, losartán y rincofilina.
El medicamento puede formularse para administración subcutánea, transdérmica, intradérmica, transmucosa, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intracraneal, intracerebroventricular, intratecal, tópica u oral. El medicamento puede formularse para administración subcutánea.
La presente divulgación se refiere a un kit para determinar el riesgo de neurodegeneración en un sujeto, que comprende (1) un agente para determinar el nivel de sST2 en una muestra biológica tomada del sujeto; y (2) un control estándar que indica el nivel de sST2 en el mismo tipo de muestra biológica tomada de un sujeto que no padece y que no está en riesgo de padecer neurodegeneración. La muestra biológica puede ser una muestra de sangre, suero, plasma o LCR. El agente puede ser un anticuerpo específico para sST2. El kit puede comprender además un manual de instrucciones para determinar el riesgo de neurodegeneración.
La presente divulgación se refiere a un método para detectar ST2 soluble secretada (sST2) en un sujeto, que comprende: (a) detectar un nivel de sST2 en una muestra biológica tomada del sujeto poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo anti-ST2 y detectar la unión entre el sST2 y el anticuerpo; y (b) comparar el nivel de sST2 con un control estándar. La muestra biológica puede ser una muestra de sangre, suero, plasma, o líquido cefalorraquídeo (LCR). La etapa (a) puede comprender un ensayo inmunológico usando un anticuerpo contra sST2.
La presente descripción se refiere a un método para aumentar la transcripción de un receptor Ap en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende IL-33. El receptor Ap puede comprender un receptor seleccionado del grupo que consiste en receptor 2 de tipo Toll (TLR2), receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR), y receptor 1 depurador de macrófagos (MSR1). El sujeto puede padecer o estar en riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo leve, enfermedad de Parkinson o esclerosis múltiple. La composición puede administrarse por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía intracerebroventricular, por vía intratecal, por vía oral, mediante inhalación, por vía transdérmica o por vía transmucosa.
La composición puede administrarse conjuntamente con uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales. El uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales pueden seleccionarse del grupo que consiste en donepezilo, rivastigmina, galantamina, memantina, aducanumab, rosiglitazona, bexaroteno, losartán y rincofilina.
La IL-33 puede ser una proteína IL-33 recombinante. La proteína recombinante IL-33 puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, un polipéptido que tiene al menos el 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, y un polipéptido que tiene al menos el 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 2.
La presente divulgación puede proporcionar un método para determinar el riesgo de neurodegeneración en un sujeto, que comprende: (a) determinar el nivel de ST2 soluble secretada (sST2) en una muestra biológica tomada del sujeto; (b) comparar el nivel de sST2 con un control estándar; (c) determinar que el sujeto tiene un mayor riesgo de neurodegeneración cuando el nivel de sST2 obtenido en la etapa (a) es mayor que el control estándar; (d) determinar las variantes genéticas de ST2 y combinar los datos con los niveles de sST2 en una muestra biológica tomada del sujeto; (e) comparar el nivel de sST2 con los controles estándar dentro de la cohorte; y (f) determinar que el sujeto tiene un mayor riesgo de neurodegeneración cuando el nivel de sST2 obtenido en la etapa (d) es mayor que el control estándar.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A-1B muestran que IL-33 rescata el deterioro de LTP en ratones mutantes APP/PS1. A ratones WT y APP/PS1 de ~7,5 meses de edad se les administró IL-33 de ratón (IL-33; 200 ng) o vehículo de control (Con) mediante inyección intraperitoneal (i.p.) durante 2 días. La figura 1A muestra pendientes promediadas de potencial postsináptico excitador de campo normalizado de valor de referencia (fEPSP; media ± EEM). Se muestran los registros de trazas 5 min antes (1) y 55 min después (2) de la inducción de LTP (flecha). Las trazas insertadas son ejemplos de fEPSP registrados antes (gris) y después (negro) de estimulación de alta frecuencia (HFS). La figura 1b muestra la cuantificación de las pendientes de fEPSP medio durante los últimos 10 minutos del registro después de la inducción de LTP. WT, control (Con) = 8 cerebros, 16 cortes; WT, IL-33 = 8 cerebros, 17 cortes; APP/PS1, Con = 8 cerebros, 18 cortes; APP/PS1, IL-33 = 8 cerebros, 18 cortes. ***p < 0,001, ANOVA bidireccional seguido de la prueba a posteriori de Bonferroni.
Las figuras 2A-2C muestran que IL-33 mejora los déficits conductuales en ratones APP/PS1. La figura 2A es un diagrama esquemático que muestra el cronograma de administración (i.p.) de IL-33 y experimentos conductuales que incluyen las pruebas de campo abierto (OF) y de construcción de nido (NB). La figura 2B muestra que ratones APP/PS1 tratados con IL-33 (~14 meses de edad) mostraron una habituación mejorada en la prueba de OF. Se permitió que los ratones a los que se administró IL-33 o vehículo de control (Con) exploraran un escenario novedoso programado como en la figura 2A; cada sesión de entrenamiento duró 15 minutos. La figura 2B muestra la distancia total recorrida dentro de cada sesión de entrenamiento. n = 7 ratones por grupo experimental, excepto n = 6 ratones para Con en APP/PS1. *p < 0,05 en el día 3, ANOVA bidireccional repetidas seguido por la prueba a posteriori de Bonferroni. La figura 2C muestra que los ratones APP/PS1 tratados con IL-33 exhibieron un mejor rendimiento de construcción de nidos que ratones APP/PS1 Con. Se evaluó y puntuó la actividad de construcción de nido. n = 4.
Las figuras 3A-3B muestran que sST2 atenúa la reducción de la deposición de placa amiloide por IL-33. La figura 3A son imágenes representativas de tinción con DAB de deposición de placa amiloide en ratones APP/PS1 infundidos con sST2 después de la administración con IL-33 (i.p.) durante 2 días (de 10 meses de edad). La deposición de Ap en la corteza de ratones APP/PS1 después de la inyección de IL-33 o DPBS (Con) se sometieron a inmunotinción mediante anticuerpo anti-Ap (4G8) usando el kit de DAB. Barra de escala = 250 |im. La figura 3B muestra la cuantificación del número de placas en la corteza. Los datos se presentan como media ± EEM (n = 6 ratones/condición; *p<0.05, prueba de la t de Student).
Las figuras 4A-4B muestran que IL-33 reduce el contenido de Ap soluble en ratones APP/PS1. Se administró (i.p.) IL-33 a ratones APP/PS1 de ~10 meses de edad durante 2 días. Análisis cuantitativo de niveles de APx-40 y APx-42 en fracciones solubles (figura 4A, extraída con DEA) e insoluble (figura 4B, fracciones extraída con ácido fórmico) de homogeneizados corticales mediante ELISA [factor de cambio en comparación con Con; n = 4 ratones, **p < 0,01, prueba de la t de Student].
Las figuras 5A-5C muestran que IL-33 potencia la colocalización Ap y microglía. Ratones APP/PS1 se trataron con IL-33 a través de inyección i.p. durante 2 días. La figura 5A muestra imágenes confocales proyectadas representativas que muestran marcaje con Hoechst Iba1, y Ap, en la corteza de ratones APP/PS1 tratados con vehículo de control (Con) o IL-33. La figura 5B muestra una reconstrucción tridimensional usando el software de análisis de imágenes Imaris que muestra la interacción detallada entre las placas Ap y la microglía. Se construyó un canal de colocalización (mostrado en blanco), desde donde los volúmenes de placa de Ap y microglía (Iba1) se colocalizan en cada pila confocal. La figura 5C muestra una cuantificación del porcentaje estimado del volumen de placa Ap colocalizado con microglía. El volumen total del canal de colocalización se dividió por el de las placas Ap en cada pila confocal. n = 16 imágenes tomadas en la corteza de 4 ratones individuales en cada condición; p < 0,001, prueba de la t de Student. Barras de escala = 10 |im.
Las figuras 6A-6F muestran que IL-33 potencia la absorción de Ap de células microgliales residentes. Los gráficos de dispersión representativos muestran las poblaciones de células mononucleares (figura 6A), CD11b+CD45baja (figura 6C), y CD11b+CD45alta (figura 6E) en ratones APP/PS1 tratados con IL-33. Se trataron ratones APP/PS1 con IL-33 a través de inyección i.p. durante 2 días. Los cuadrantes superiores (rojo y azul) en la figura 6A se identificaron como poblaciones de células mieloides, mientras que los cuadrantes superiores derechos en la figura 6A, y regiones en las figuras 6C y 6E, representan poblaciones de células que fagocitaron Ap (MeX04+). Las proporciones medias de células MeX04+ en las poblaciones CD11b+ (figura 6B), CD11b+CD45baja (figura 6D), y CD11b+CD45alta (figura 6F) se compararon entre los grupos de control y tratados con IL-33. Con: n = 5 ratones, grupo tratado con IL-33: n = 6 ratones de 3 experimentos independientes, *p < 0,05, **p < 0,01 prueba de la t de Student.
La figura 7 muestra que la señalización de IL-33/ST2 media la actividad fagocítica microglial. La microglía deficiente en ST2 suprimió la absorción de Ap estimulada por IL-33. Las diferencias en la cantidad de absorción de FAM-Ap-M2 se compararon entre los cultivos de control (Con) y ST2+/+ y ST2'/_ tratados con IL-33. n = 6 ratones en 3 experimentos independientes por condición, *p < 0,05, ANOVA bidireccional seguido por la prueba a posteriori de Bonferroni.
Las figuras 8A-8C muestran que la administración de IL-33 restaura la expresión reducida de neprilisina (NEP) en ratones APP/PS1. Se administró (i.p.) IL-33 o vehículo de control (Con) a ratones WT o APP/PS1 (~12 meses de edad) durante 2 días. Se aislaron cortezas para el análisis de inmunotransferencia de tipo Western. La figura 8A muestra análisis de inmunotransferencia representativos que muestran la expresión de NEP y enzima de degradación de insulina (IDE). APP y actina indican genotipado de ratón y carga igual, respectivamente. La figura 8B muestra un análisis cuantitativo de expresión de NEP y la figura 8C muestra un análisis cuantitativo de la expresión de IDE (factor de cambio frente a WT, Con). n = 4 cerebros, **p < 0,01, ANOVA unidireccional seguido por la prueba a posteriori de Bonferroni.
La figura 9 muestra que el tratamiento combinado de IL-33 y memantina rescata el deterioro de LTP inducido por Ap. Se administró a ratones C57 conjuntamente 1 mg/kg/día de memantina mediante administración oral y 50 ng/día de IL-33 (una dosificación que no rescata el deterioro de LTP en ratones APP/PS1) mediante i.p. Los cortes de hipocampo de los ratones con diferentes paradigmas de administración se sometieron luego a tratamiento con Ap y se midió la LTP inducida por HFS (Con: 3 cerebros, 4 cortes; Con Ap: 3 cerebros, 6 cortes; IL-33 Ap: 1 cerebro, 2 cortes; Memantina Ap: 3 cerebros, 6 cortes; IL-33 Memantina Ap: 4 cerebros, 8 cortes).
Las figuras 10A-10R muestran que IL-33 altera la expresión del gen microglial en ratones APP/PS1. Se inyecto i.p. a ratones APP/PS1 con IL-33 durante 2 días. Las figuras 10A-10C muestran que IL-33 altera la firma de transcriptoma de microglía en ratones APP/PS1. La figura 10A que muestra un gráfico de mapa de calor de genes 2007 (que muestra p < 0,05 en ANOVA unidireccional) se dividió en grupos mediante el método de agrupamiento de K-medias frente al valor de FPKM normalizado. Los niveles de expresión de genes individuales en diferentes muestras se normalizaron según una media de 0 y una desviación estándar de 1 dentro del intervalo [-2, 2]; los niveles por encima y por debajo de la media se muestran en amarillo y azul, respectivamente. Se obtuvieron diferentes agrupamientos de genes del método de agrupamiento de K-medias frente a los niveles de expresión normalizados e indicados por marcadores C1-C6 o barras laterales con diferentes colores. Se enumeran términos de ontología génica enriquecidos sugeridos por la base de datos DAVID en cada agrupamiento (Benjamini-Hochberg ajustados p < 0,05). La figura 10B muestra firmas de transcriptoma que representan patrones de niveles de expresión génica normalizados en diferentes agrupamientos indicados por colores correspondientes, con el marcaje del número de genes en cada agrupamiento. La figura 10C proporciona una lista de genes representativos en ratones APP/PS1 a los que se administró vehículo de control (Con) o IL-33 con ago lpamiento de genes regulada positivamente, C4, C5 y C6. Las redes correspondientes de genes regulados positivamente en cada conjunto de genes se clasifican según la base de datos STRING (figuras 10D-10O). Se muestran las seis redes principales en respuesta a IL-33 en microglía de ratones APP/PS1: homeostasis de colesterol (figuras 10D, 10G), señalización de IL-6/JAK/STAT3 (figuras 10E, 10H), respuesta de IFN-a (figuras 10F, 10I); respuesta de IFN-y (figuras 10J, 10M); fase G2M del ciclo celular (figuras 10K, 10N); y respuesta de TNF-a (figuras 10L, 10O). Paneles superiores (figuras 10D, 10E, 10F, 10J, 10K, 10L) muestran conjuntos de genes de ratones APP/PS1 regulados por IL-33 sugeridos por GSEA. Paneles inferiores (figuras 10G, 10H, 10I, 10M, 10N, 10O) muestran redes STRING donde los nodos representan genes, y los bordes sugieren conexiones entre genes. Los nodos más grandes indican bordes más conectados, y los bordes con colores más oscuros indican una asociación más fuerte entre nodos. Los factores de cambio de genes después del tratamiento con IL-33 se calcularon en el intervalo de log2 de [-1,5 a 1,5]; los colores correspondientes en cada nodo indican los valores mostrados en azul y rojo. Las figuras 10P-10R muestran que IL-33 aumenta la transcripción de receptores Ap, receptor 2 de tipo Toll (figura 10P, TLR2), receptor de lipoproteínas de baja densidad (figura 10Q, LDLR), y receptor 1 depurador de macrófagos (figura 10R, MSR1) en microglía de ratones APP/PS1. n = 2.
La figura 11 es un diagrama de cajas que muestra niveles de ST2 soluble (sST2) en pacientes con DCL y EA normales. La concentración de ST2 soluble en suero humano se examinó mediante ELISA. Con: n = 137; DCL: n = 24; EA: n = 30; valor de ***p de la prueba de la t de dos muestras < 0,005.
La figura 12 muestra que la expresión de ARNm de sST2 y ST2L aumenta en ratones APP/PS1. La expresión de transcripción de la forma soluble (sST2) y la forma anclada a membrana (ST2L) en la corteza de ratones de tipo silvestre (WT) y APP/PS1 (de 12 meses de edad) se examinaron por PCR cuantitativa en tiempo real. La expresión de ARNm se normalizó usando WT. Los datos se presentan como media ± EEM (n = 3 ratones/condición; **p<0,01, prueba de la t de Student).
La figura 13 muestra que los ratones APP/PS1 tratados con IL-33 (14 meses de edad; inyectada i.p.) exhiben una habituación mejorada en la prueba exploratoria de campo abierto (OF). El panel superior muestra el cronograma de administración de IL-33 y la prueba de OF. El panel inferior muestra el cambio porcentual en distancia recorrida con respecto a la distancia recorrida el primer día de entrenamiento (n = 11-13 ratones/grupo. Los datos son la media ± EEM. *p < 0,05; ***p < 0,001, ANOVA bidireccional de medidas repetidas).
Las figuras 14A-14D muestran que el tratamiento con IL-33 revierte los déficits de memoria contextual en ratones APP-PS1. La figura 14A muestra un cronograma de administración de IL-33 (i.p.) y prueba de condicionamiento por miedo contextual (FC). S, descarga eléctrica; T, pruebas de congelación. La figura 14B muestra el porcentaje de tiempo de congelación inmediatamente después de la descarga eléctrica de la prueba FC. La figura 14C muestra el porcentaje de tiempo de congelación 1 día después de la administración de descarga eléctrica. La figura 14D muestra el porcentaje de congelación después de 7 días después de la administración de descarga eléctrica. Los datos son media ± EEM. n = 11-13 ratones/grupo. *p < 0,05; **p <0,01, ANOVA bidireccional con prueba a posteriori de Bonferroni.
Las figuras 15A-15B muestran que a los dos días después del tratamiento con IL-33, se reducen significativamente placas amiloides marcadas con 4G8 en las cortezas de ratones APP/PS1 de 12 meses de edad. La figura 15A muestra imágenes representativas y la figura 15B muestra la cuantificación de placas amiloides teñidas con 4G8 en las cortezas de ratones APP/PS1 (12 meses de edad) después de la administración (i.p.) de IL-33 con o sin infusión de sST2. n = 7 ratones/grupo. *p < 0,05, ANOVA unidireccional y prueba a posteriori de Bonferroni. Todos los datos son media ± EEM. (Barras de escala: parte superior, 500 |im; parte inferior, 100 |im).
Las figuras 16A-16B muestran que IL-33 aumenta la expresión de CD68 en placas Ap. Se trató a ratones APP/PS1 con IL-33 a través de inyección i.p. durante 2 días. Las imágenes confocales proyectadas representativas muestran la distribución de células CD68+ Iba1+ alrededor de las placas Ap en las cortezas de ratones APP/PS1 tratados con vehículo (Con; figura 16A) o tratados con IL-33 (figura 16B).
Las figuras 17A-17B muestran que IL-33 impulsa la microglía a un estado de activación alternativo en ratones APP/PS1. Se inyectó i.p. a ratones APP/PS1 con IL-33 durante 2 días. Se muestra el análisis cuantitativo por ddPCR de niveles de ARNm de Fizz1 (figura 17A) y arginasa 1 (Arg1, figura 17B) en microglía aislada de cerebros de ratón APP/PS1 administrados con IL-33. WT/Con, n = 5 ratones; WT/IL-33, n = 4 ratones; APP/PS1/Con, n = 7 ratones; APP/PS1/IL-33, n = 6 ratones. *p < 0,05; **p < 0,01, ANOVA bidireccional con prueba a posteriori de Bonferroni.
Las figuras 18A-18C muestran que IL-33 suprime genes proinflamatorios en ratones APP/PS1. Se inyectó i.p. a ratones APP/PS1 con IL-33 durante 2 días. Se muestra el análisis cuantitativo de ddPCR de NLRP3 (figura 18A), IL-1 p (figura 18B) y IL-6 (figura 18C) en las cortezas de ratones APP/PS1 de 12 meses de edad. WT/Con, n = 5 ratones; Wt / iL-33, n = 3 ratones; APP/PS1/Con, n = 5 ratones; APP/PS1/IL-33, n = 4 ratones. *p < 0,05; **p < 0.01; ***p < 0,001, ANOVA bidireccional con prueba a posteriori de Bonferroni. Todos los datos son media ± EEM.
Las figuras 19A-19B muestran niveles aumentados de IL-33 en las cortezas de ratones APP/PS1 después de administración i.p. de IL-33. Se inyectó i.p. a ratones APP/PS1 (11 meses de edad) con IL-33 (200 ng) durante 30 min.
Los niveles de IL-33 en las cortezas (figura 19A) y plasma (figura 19B) se midieron mediante ELISA. Los datos son media ± EEM, n = 4-5 ratones/grupo. **p <0,01; prueba de la t de Student.
La figura 20 muestra que IL-33 no afecta al nivel de histamina en plasma en ratones APP/PS1 o de tipo silvestre. Se inyectó i.p. a ratones de tipo silvestre (WT) y APP/PS1 (8 meses de edad) con IL-33 (200 ng) o control de vehículo (Con, DPBS) durante 2 días. Los niveles plasmáticos de histamina se determinaron mediante ELISA. n = 4 ratones por grupo. Los datos son media ± EEM. Se obtuvieron resultados similares para ratones BALB/c WT (datos no mostrados).
La figura 21 muestra que IL-33 reduce el contenido de Ap soluble en ratones APP/PS1. Se inyectó i.p. a ratones APP/PS1 (25 meses de edad) con IL-33 (200 ng) 3 veces durante 7 días. La figura 21 es una inmunotransferencia de tipo Western representativa de Ap soluble e insoluble en homogeneizados corticales de ratones APP/PS1. Cada carril representa un ratón APP/PS1 individual. Con, n = 2 ratones; IL-33, n = 3 ratones.
Las figuras 22A-22B muestran que IL-33 reduce las placas Ap teñidas con 4G8 en las cortezas de ratones 5XFAD. Se administró (i.p.) a ratones 5XFAD (10 meses de edad) con IL-33 (200 ng) o control DPBS (Con) durante dos días consecutivos. Imágenes representativas (figura 22A) y cuantificación (figura 22B) de placas Ap teñidas con anticuerpo 4G8 en las cortezas. Los datos son media ± EEM. Con, n = 6; IL-33, n = 5. (**p < 0,01; prueba de la t de Student). Barra de escala = 500 |im.
Las figuras 23A-23C muestran una distribución de poblaciones de células mieloides CD11b+ en los cerebros de ratones de tipo silvestre. Se inyectó i.p. a ratones C57BL/6 adultos con metoxi-X04 y se sacrificaron 3 h después. Suspensiones de células mononucleares de las cortezas cerebrales se purificaron y analizaron por citometría de flujo. Diagramas de dispersión representativos muestran las poblaciones de células CD11b+ (figura 23A), CD11b+CD45baja (figura 23B) y CD11b+CD45alta (figura 23C) con Ap marcado mediante metoxi-X04. El cuadrante superior izquierdo en la figura 23A (mostrado en azul) se identificó como poblaciones de células mieloides sin absorción de Ap, mientras que el cuadrante superior derecho en la figura 23A, así como las regiones en las figuras 23B y 23C representan poblaciones de células que fagocitaron Ap (MeX04+), si lo hubiera. Los datos son representativos de dos experimentos.
Las figuras 24A-24D muestran que IL-33 no aumenta la infiltración de monocitos periféricos en los cerebros de ratones APP/PS1. Se inyectó i.p. a ratones WT y APP/PS1 (17 meses de edad) con IL-33 (200 ng) o DPBS (Con) durante dos días. Se aislaron células mononucleares en las cortezas cerebrales y se analizaron por citometría de flujo. Las figuras 24A-24D muestran distribuciones de poblaciones de células CD11b+CD45baja y CD11b+CD45alta. Gráficos de contorno representativos que muestran la distribución de poblaciones de células CD11b+CD45baja y CD11b+CD45alta en ratones WT (figura 24A), ratones APP/PS1 a los que se administró DPBS (figura 24B) o ratones APP/PS1 inyectados con IL-33 (figura 24C). La figura 24D muestra la cuantificación de células CD45alta en la población de células CD11b+ de ratones APP/PS1 a los que se administró IL-33 o Con. APP/PS1/Con, n = 5 ratones; APP/PS1/IL-33, n = 6 ratones. Todos los datos son media ± EEM. (ns = no estadísticamente significativo; prueba de la t de Student).
Las figuras 25A-25C muestran que IL-33 estimula absorción de Ap en células mieloides CD11b+ de ratón primarias. Se aislaron células mieloides CD11b+ primarias de cerebros de ratón C57BL/6 WT y se cultivaron durante 6-7 días in vitro. Las células se estimularon luego con una concentración gradual de IL-33 durante 20 h seguido de fluoresceína-Ap-i-42 durante 1 h. Las células se fijaron entonces y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia de campo amplio. La figura 25A muestra imágenes fluorescentes que muestran la actividad fagocítica de células mieloides CD11 b+. Barra de escala = 50 |im. Los límites de las células mieloides CD11b+ se determinaron mediante la intensidad de marcado de Iba1 y la cantidad de fluoresceína-Ap fagocitada estimada para cada célula Iba1+ (figura 25B). La figura 25C muestra la cuantificación de fagocitosis. Los resultados son el factor de cambio del área de fluoresceína-Ap fagocitada en las células sobre el área celular total y los datos se normalizaron con respecto al control. n = 75-490 células de 3 experimentos independientes. **p < 0,01; ***p < 0,001; ANOVA unidireccional con prueba a posteriori de Bonferroni.
Las figuras 26A-26D muestran señalización de IL-33/ST2 en microglía. Los niveles de ST2 en las células mieloides cerebrales permanecen relativamente sin cambios en ratones WT y APP/PS1 durante el envejecimiento (figura 26A). Se aislaron células mieloides CD11b+ de cerebros de ratón WT y ApP/PS1. Se realizó un análisis RT-PCR cuantitativo en tiempo real para ST2 y se normalizó con respecto a transcritos de CD11b. 5 meses de edad: WT, n = 4 ratones; APP/PS1, n = 4 ratones; 9 meses de edad: WT, n = 3 ratones; APP/PS1, n = 3 ratones. Las figuras 26B-26D muestran que IL-33 estimula la activación de p38 y ERK1/2 en células mieloides CD11b+ primarias. Se cultivaron células mieloides CD11b+ de ratones C57BL/6 adultos durante 7 días in vitro y luego se trataron con IL-33 (100 ng/ml) durante los tiempos indicados. La inmunotransferencia de tipo Western representativa (figura 26B) y factor de cambio de p38 fosforilada (figura 26C) y ERK1/2 fosforilada (figura 26D) normalizado con respecto a sus proteínas totales. n = 3-4 experimentos. *p < 0,05; **p < 0,01 en comparación con 0 min; ANOVA unidireccional con prueba a posteriori de Bonferroni.
La figura 27A es un gráfico de caja que muestra los niveles de ST2 soluble (sST2) en el suero de sujetos sanos (NC, n = 17) y pacientes con deterioro cognitivo leve (DCL, n = 18). (*p < 0,05; prueba de la t de dos muestras). La figura 27B es una tabla que muestra las características demográficas de los sujetos humanos para la determinación de sST2 en suero. Las estadísticas de resumen se presentan como media [mín - máx] o recuento ( %). NC = control sano; DCL = deterioro cognitivo leve.
Las figuras 28A-28B muestran que la administración subcutánea (s.c.) de IL-33 redujo los niveles de Ap soluble en las cortezas cerebrales de ratones APP/PS1. Se muestran inmunotransferencias de tipo Western representativas de Ap soluble e insoluble en homogeneizados corticales de ratones APP/PS1 con inyección s.c. (figura 28A) e inyección i.p. (figura 28B).
Las figuras 29A-29B muestran que la administración s.c. de IL-33 revirtió la deterioro de LTP en ratones APP/PS1. A ratones de tipo silvestre (WT) y APP/PS1 se les administró s.c. (figuras 29A-29B) IL-33 junto con control de vehículo (Con) durante dos días consecutivos. Se indujo LTP mediante HFS en la región CA1 de hipocampo . La figura 29A muestra pendientes promediadas de potencial postsináptico excitador de campo normalizado de valor de referencia (fEPSP; media ± EEM). La figura 29B muestra la cuantificación de pendientes de fEPSP medio durante los últimos 10 minutos del registro después de inducción de LTP; n = 4 cortes de cerebro de 2 ratones. (**p < 0,01; ANOVA bidireccional con prueba a posteriori de Bonferroni).
La figura 30 es un cronograma de administración de IL-33 y pruebas conductuales, cuyos resultados se muestran en las figuras 31-33. Se administró inyección (i.p.) de IL-33 como se representa y se detuvo el día 21, y se permitió a los ratones descansar durante 10 días. Los ratones se sacrificaron luego para análisis inmunohistoquímico y análisis de expresión de genes inflamatorios.
Las figuras 31A-31B demuestran que los ratones APP/PS1 tratados con IL-33 (i.p.) mostró una tendencia de rendimiento conductual mejorado en pruebas de OF y NB. Los ratones APP/PS1 tratados con IL-33 exhibieron una tendencia a mejorar la habituación en la prueba de OF (figura 31A). La administración de IL-33 exhibió una tendencia de aumento de actividades de construcción de nidos en ratones APP/PS1 (figura 31B). (n = 5-6 ratones por cada grupo experimental).
Las figuras 32A-32B muestran que la administración (i.p.) de IL-33 a largo plazo mejoraron las placas Ap en ratones APP/PS1. Imágenes representativas (figura 32A) y cuantificación (figura 32B) de placas amiloides teñidas con 4G8 en las cortezas de ratones APP/PS1 después de la administración de IL-33.
Las figuras 33A-33C muestran que el tratamiento (i.p.) de IL-33 a largo plazo moduló respuestas inflamatorias en ratones APP/PS1. IL-33 suprimió la expresión de varios genes inflamatorios en las cortezas de ratones APP/PS1. Se realizó análisis RT-PCR cuantitativo en tiempo real de SPP1 (figura 33A), CD11c (figura 33B), y Lilrb4 (figura 33C) y se normalizó a transcritos de p-actina. (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ANOVA bidireccional con prueba a posteriori de Bonferroni). Todos los datos son media ± EEM.
Las figuras 34A-34B muestran que IL-33 humana (hIL-33) revirtió el deterioro de LTP en ratones APP/PS1. A ratones de tipo silvestre (WT) y APP/PS1 se les administró i.p. hIL-33 o control de vehículo (Con) durante dos días consecutivos. Se indujo LTP mediante HFS en la región CA1 de hipocampo. La figura 34A muestra las pendientes promedio de fEPSP normalizado de valor de referencia (media ± EEM). La figura 34B muestra la cuantificación de pendientes de fEPSP medio durante los últimos 10 minutos del registro después de la inducción de LTP; n = 3-4 cortes de 2 ratones. (*p < 0,05; ANOVA bidireccional con prueba a posteriori de Bonferroni).
Las figuras 35A-35B muestran que el tratamiento de combinación de IL-33 y memantina rescata el deterioro de LTP inducido por Ap. A ratones C57 se les administró conjuntamente 1 mg/kg/día de memantina (Mem) mediante administración oral y 50 ng/día de IL-33 (una dosificación que no rescata el deterioro de LTP en ratones APP/PS1) mediante inyección i.p.. Cortes de hipocampo de los ratones con diferentes paradigmas de administración se sometieron luego a tratamiento con Ap, y se midió la LTP inducida por HFS. La figura 35A muestra pendientes promediadas de potencial postsináptico excitador de campo normalizado de valor de referencia (fEPSP; media ± EEM). La figura 35B muestra la cuantificación de pendientes de fEPSP medio durante los últimos 10 minutos del registro después de la inducción de LTP. (Con: 4 cerebros, 6 cortes; Con Ap: 4 cerebros, 8 cortes; IL-33 Ap: 4 cerebros, 8 cortes; Mem Ap: 3 cerebros, 6 cortes; IL-33 Mem Ap: 5 cerebros, 10 cortes; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ANOVA unidireccional seguido de la prueba a posteriori de Bonferroni).
Descripción detallada
I. Introducción
La presente tecnología se refiere al descubrimiento de que IL-33 es un agente neuroprotector eficaz para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Según un aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica útil para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto que lo necesita que comprende una cantidad eficaz de una composición que comprende IL-33 y memantina, en la que el tratamiento comprende aumentar la transcripción de un receptor Ap en el sujeto. Las composiciones terapéuticas pueden comprender IL-33 y memantina en combinación con uno o más ingredientes farmacéuticamente activos adicionales, para el tratamiento eficaz de trastornos neurodegenerativos y neuroinflamatorios tales como la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), o deterioro cognitivo leve (DCL).
La divulgación también se refiere al descubrimiento de que niveles elevados de una forma soluble del receptor de IL-33, sST2, se correlaciona con la presencia de trastornos neurodegenerativos y neuroinflamatorios, por ejemplo, DCL o EA. Por lo tanto, la divulgación se refiere a un método de diagnóstico para la detección temprana o la evaluación del riesgo de trastornos neurodegenerativos y neuroinflamatorios tales como DCL o EA.
Pueden identificarse moduladores de un trastorno neurodegenerativo y neuroinflamatorio mediante la modulación de la interacción de IL-33 y ST2 primero en un ensayo de unión a proteínas y luego verificarse mediante pruebas adicionales tales como en un modelo animal para el trastorno neurodegenerativo y neuroinflamatorio. Moduladores, especialmente moléculas pequeñas que se ha identificado que regulan los niveles de unión de IL-33/ST2, representan nuevos agentes terapéuticos potencialmente eficaces en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos y neuroinflamatorios.
Por lo tanto, la divulgación se refiere a un método para tratar o reducir el riesgo de neurodegeneración o neuroinflamación en un sujeto. El método puede comprender la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de IL-33. La presente divulgación se refiere a un método para aumentar la expresión de receptores Ap en un sujeto que lo necesita en relación con un control, que comprende administrar una cantidad eficaz de IL-33. La presente divulgación se refiere a un método para aumentar la expresión de un receptor Ap seleccionado del grupo que consiste en receptor 2 de tipo Toll (TLR2), receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR), y receptor 1 depurador de macrófagos (MSR1), que comprende administrar una cantidad eficaz de IL-33. El sujeto puede padecer o estar en riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer (EA), deterioro cognitivo leve (DCL), enfermedad de Parkinson (EP), o esclerosis múltiple (EM). La IL-33 puede usarse en el método puede ser una proteína IL-33 (por ejemplo, una proteína IL-33 producida de manera recombinante) o un ácido nucleico que codifica una proteína IL-33. La administración puede comprender administración intraperitoneal (i.p.) de IL-33, tales como administración i.p. durante un período de tiempo de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 1 semana, 10 días o hasta 2 semanas. En algunas realizaciones, el período de administración de IL-33 es de 2 días.
La administración puede comprender la administración de manera conjunta de IL-33 y un segundo agente terapéuticamente activo. Por ejemplo, el segundo agente terapéuticamente activo es donepezilo, rivastigmina, galantamina, memantina, aducanumab, rosiglitazona, bexaroteno, losartán, o rincofilina. La cantidad del segundo agente activo que se administra puede oscilar de 0,1-1000 mg/día, 1-500 mg/día, 1-100 mg/día, 2-50 mg/día o 5-20 mg/día, tal como 10, 15 o 20 mg/día. La cantidad de proteína IL-33 que se administra, o bien sola o bien junto con un segundo agente terapéuticamente activo, puede oscilar de 0,01-3000 mg/día, 0,1-500 mg/día, 0,1-300 mg/día, 0,2­ 100 mg/día, 0,5-100 mg/día, 2-100 mg/día, 5-50 mg/día, o 10, 15, 20, 25, 30 y 50 mg/día.
Cualquier método o agente convencional conocido por su eficacia en el tratamiento de neurodegeneración o neuroinflamación se usa en combinación con IL-33 en la práctica de la presente tecnología. Por ejemplo, puede administrarse un agente antiepiléptico en combinación con IL-33 (véase, por ejemplo, el documento de Sánchez et al., Proc Natl Acad Sci USA. 16 de octubre de 2012;109(42):E2895-903. doi: 10.1073/pnas.1121081109. Epub 6 de agosto de 2012). Además, un anticuerpo contra EphA4, tales como los descritos en la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/031.793, puede administrarse en combinación con IL-33. Una terapia conocida tal como un método de entrenamiento cognitivo basado en ordenador (véase, por ejemplo, el documento de Hofmann et al., J Psychiatr Res. 1996 Nov-Dec;30(6):493-501) en combinación con la administración de IL-33.
La presente tecnología puede proporcionar un método para determinar el riesgo de un sujeto de afecciones neurodegenerativas o neuroinflamatorias tales como enfermedad de Alzheimer o deterioro cognitivo leve. El método puede comprender: (a) determinar el nivel de ST2 soluble secretada (sST2) en una muestra biológica tomada del sujeto; (b) comparar el nivel de sST2 con un control estándar; y (c) determinar que el sujeto tiene un mayor riesgo de neurodegeneración cuando el nivel de sST2 obtenido en la etapa (a) es mayor que el control estándar. La muestra biológica puede ser una muestra de sangre, suero, plasma, o líquido cefalorraquídeo (LCR). La etapa (a) puede comprender un ensayo inmunológico usando un anticuerpo contra sST2. Cuando se determina que un paciente tiene un trastorno neurodegenerativo o neuroinflamatorio tal como enfermedad de Alzheimer o deterioro cognitivo leve o que tiene un mayor riesgo de desarrollar el trastorno en un momento posterior, el paciente puede recibir intervención médica según lo considere apropiado un médico. La intervención médica puede ser de naturaleza terapéutica o profiláctica e implica cualquier método actualmente disponible y agentes activos aprobados para tratar el trastorno. Además, la monitorización a largo plazo del paciente en cuanto a la progresión de la enfermedad puede ser apropiada para pacientes que han recibido un diagnóstico positivo de presencia de un trastorno neurodegenerativo o neuroinflamatorio o un mayor riesgo de desarrollar uno.
La presente tecnología se refiere a un método para identificar un modulador de neurodegeneración o neuroinflamación. El método puede comprender: (a) poner en contacto un agente candidato con IL-33 y ST2 de longitud completa (ST2L) o sST2 en condiciones permisibles para la unión de IL-33/ST2L o la unión de IL-33/sST2; (b) detectar el nivel de unión de IL-33/ST2L o IL-33/sST2; y (c) identificar el agente candidato como un modulador de neurodegeneración cuando el nivel de unión de IL-33/ST2L o IL-33/sST2 obtenido en la etapa (b) es mayor o menor que el nivel de unión de IL-33/ST2L o IL-33/sST2 en las mismas condiciones pero en ausencia del agente candidato. La etapa (a) puede comprender un ensayo de unión a proteínas in vitro. La etapa (a) puede comprender un ensayo de unión a proteínas en la superficie de una célula que expresa ST2L. Opcionalmente, se toman medidas adicionales para verificar adicionalmente la actividad del modulador identificado por el método, por ejemplo, en un experimento con animales descrito en el presente documento.
La presente tecnología se refiere a un medicamento para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto. El medicamento puede comprender: (1) una cantidad eficaz de IL-33 y (2) un excipiente farmacéuticamente aceptable. La IL-33 puede ser una proteína IL-33. La IL-33 puede ser un ácido nucleico que codifica una proteína IL-33, tal como un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de IL-33. El medicamento puede incluir un segundo agente terapéuticamente activo, tales como donepezilo, rivastigmina, galantamina, memantina, aducanumab, rosiglitazona, bexaroteno, losartán, o rincofilina. Otros agentes terapéuticamente activos conocidos que son útiles para tratar neurodegeneración o neuroinflamación pueden incluirse en el medicamento: por ejemplo, un agente antiepiléptico o un anticuerpo contra EphA4. El medicamento puede formularse para administración parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea), intracraneal, intracerebroventricular, intratecal, oral, respiratoria (por ejemplo, mediante inhalación), transdérmica (tópica), y transmucosa. El medicamento puede formularse para administración intraperitoneal. El medicamento puede formularse para administración subcutánea. El medicamento puede formularse para administración intratecal. Los medicamentos pueden estar en forma de una disolución acuosa o en forma liofilizada.
La presente tecnología se refiere a un kit para determinar el riesgo de neurodegeneración o neuroinflamación en un sujeto. El kit comprende: (1) un agente para determinar el nivel de sST2 en una muestra biológica tomada del sujeto; y (2) un control estándar que indica el nivel de sST2 en el mismo tipo de muestra biológica tomada de un sujeto que no padece y no está en riesgo de padecer neurodegeneración o neuroinflamación. Normalmente, estos componentes se mantienen en recipientes separados del kit. La muestra biológica puede ser una muestra de sangre, suero, plasma o LCR. El agente puede ser un anticuerpo específico para sST2, que también puede reconocer específicamente ST2L o puede no reconocer específicamente ST2L. El kit puede comprender además un manual de instrucciones para determinar el riesgo de neurodegeneración o neuroinflamación.
La composición puede comprender IL-33 en combinación con uno o más de una variedad de compuestos activos terapéuticos, incluyendo una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y se proporcionan uno o más excipientes para el tratamiento de afecciones neurodegenerativas y neuroinflamatorias. También se proporcionan métodos de administración de las composiciones.
La divulgación de la presente tecnología también se refiere al uso de proteína ST2 soluble (sST2) como biomarcador para enfermedades neurodegenerativas tales como deterioro cognitivo leve (DCL), enfermedad de Alzheimer temprana (EA), así como otra neurodegeneración relacionada con neuroinflamatorios, y da a conocer métodos para diagnosticar sujetos humanos con estas afecciones, evaluar el riesgo de desarrollar estas afecciones, o evaluar la eficacia terapéutica en pacientes en respuesta al tratamiento de estas afecciones. La divulgación de la presente tecnología también se refiere a métodos para tratar afecciones neurodegenerativas o neuroinflamatorias en sujetos humanos, manipulando/activando la ruta de ST2; regulando la transcripción y expresión de ST2 e IL-33; o modulando la interacción de IL-33 y ST2.
Por lo tanto, la presente divulgación se refiere a nuevas intervenciones preventivas y terapéuticas para diversas afecciones neurodegenerativas y neuroinflamatorias, incluyendo demencia, deterioro cognitivo leve (DCL), enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis múltiple (EM), depresión, accidente cerebrovascular, demencia con cuerpos de Lewy, esclerosis lateral amiotrófica, demencia frontotemporal, enfermedad de Huntington (EH), enfermedades degenerativas retinianas tales como glaucoma, degeneración macular relacionada con la edad y retinopatía diabética, pérdida de audición debido a degeneración nerviosa, lesión cerebral traumática, y lesión de médula espinal, y otras afecciones neuroinflamatorias tales como encefalomielitis diseminada aguda, neuritis óptica, mielitis transversa, síndrome pospoliomietílico, neuropatía motora multifocal y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica.
II. Definiciones
El término “tratar” o “que trata", como”, como se usa en esta solicitud, describe un acto que conduce a la eliminación, reducción, alivio, inversión, prevención y/o retraso del inicio o recidiva de cualquier síntoma de una afección médica predeterminada. En otras palabras, "que tratar” una afección abarca tanto la intervención terapéutica como la intervención profiláctica contra el empeoramiento de la afección. Un sujeto se trata con éxito para una afección particular donde después de recibir una cantidad eficaz de un agente terapéutico, el sujeto muestra una reducción observable y/o medible en o ausencia de uno o más signos y síntomas de la afección. Un sujeto puede tratarse con éxito en cuanto a una afección neurodegenerativa o neuroinflamatoria cuando, después de recibir una cantidad eficaz de IL-33 según los métodos descritos en el presente documento, el sujeto muestra una reducción observable y/o medible en o ausencia de uno o más signos y síntomas de la afección neurodegenerativa o neuroinflamatoria.
El término “cantidad eficaz”, como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad que produce efectos terapéuticos para los que se administra una sustancia. Los efectos incluyen la prevención, corrección o inhibición de la progresión de los síntomas de una enfermedad/afección y complicaciones relacionadas en cualquier grado detectable. La cantidad exacta dependerá del propósito del tratamiento, y será determinable por un experto en la técnica usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (volúmenes 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); y Pickar, Dosage Calculations (1999)).
El término “control estándar”, como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra que comprende un analito de una cantidad predeterminada para indicar la cantidad o concentración de este analito presente en este tipo de muestra tomada de un sujeto sano promedio que no padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o afección predeterminada (por ejemplo, una afección neurodegenerativa o neuroinflamatoria tal como enfermedad de Alzheimer o deterioro cognitivo leve).
El término “promedio”, como se usa en el contexto de la descripción de un sujeto sano que no padece y no está en riesgo de desarrollar ningún trastorno neurodegenerativo, se refiere a ciertas características, tal como el nivel de sST2 en la sangre de la persona, que son representativos de un grupo seleccionado aleatoriamente de seres humanos sanos que no padecen y no están en riesgo de desarrollar ninguna afección neurodegenerativa o neuroinflamatoria. Este grupo seleccionado debe comprender un número suficiente de sujetos humanos de manera que la cantidad o concentración promedio del analito de interés entre estos individuos refleje, con una precisión razonable, el perfil correspondiente en la población general de personas sanas. Opcionalmente, el grupo seleccionado de sujetos puede elegirse para tener unos antecedentes similares al de una persona que se analiza para indicación o riesgo de un trastorno neurodegenerativo o neuroinflamatorio, por ejemplo, edad, sexo, etniay antecedentes médicos comparables o coincidentes, etc.
El término “ inhibir” o “inhibición", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier efecto negativo detectable en un proceso biológico diana. Normalmente, una inhibición se refleja en una disminución de al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % en uno o más parámetros indicativos del proceso biológico o su efecto aguas abajo, en comparación con un control donde no está presente tal inhibición. El término “potenciar” o “potenciación” se define de manera similar, excepto por indicar un efecto positivo, es decir, el cambio positivo es al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 80 %, 100 %, 200 %, 300 % o incluso más en comparación con un control. Los términos “inhibidor” y “potenciador” se usan para describir un agente que exhibe efectos inhibidores o potenciadores como se describió anteriormente, respectivamente. También se usan de manera similar en esta divulgación los términos “aumentar”, “disminuir”, “más” y “menos” que se pretende que indiquen cambios positivos en uno o más parámetros predeterminados en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 80 %, 100 %, 200 %, 300 % o incluso más, o cambios negativos de al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 80 % o incluso más en uno o más parámetros predeterminados.
El término “ácido nucleico” o “polinucleótido” se refiere a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y polímeros de los mismos en forma o bien monocatenaria o bien bicatenaria. A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a nucleótidos de origen natural. A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de manera conservativa de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, SNP, y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, sustituciones de codones degenerados pueden lograrse generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al. J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al. Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). El término ácido nucleico se usa indistintamente con gen, ADNc y ARNm codificado por un gen.
El término “gen” significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica. Puede incluir regiones que preceden y siguen a la región de codificación (líder y remolque), así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos de codificación individuales (exones).
El término “aminoácido” se refiere a aminoácidos que se producen de manera natural y sintéticos, así como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos que se producen de manera natural. Los aminoácidos que se producen de manera natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce de manera natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce de manera natural. “Miméticos de aminoácidos” se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de una manera similar a un aminoácido que se produce de manera natural.
Existen diversos métodos conocidos en la técnica que permiten la incorporación de un derivado o análogo de aminoácido no natural en una cadena polipeptídica de una manera específica de sitio, véase, por ejemplo, el documento WO 02/086075.
Puede hacerse referencia a aminoácidos en el presente documento mediante los símbolos de tres letras comúnmente conocidos o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Del mismo modo, puede hacerse referencia a nucleótidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
“Polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los tres términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido que se produce de manera natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos que se producen de manera natural y polímeros de aminoácidos que se producen de manera no natural. Como se usa en el presente documento, los términos abarcan cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa, en las que los residuos de aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos covalentes.
Un “casete de expresión” es una construcción de ácido nucleico, generada de manera recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de una secuencia polinucleotídica particular en una célula huésped. Un casete de expresión puede ser parte de un plásmido, genoma vírico o fragmento de ácido nucleico. Normalmente, un casete de expresión incluye un polinucleótido que va a transcribirse (por ejemplo, uno que codifica IL-33), unido de manera operativa a un promotor.
Como se usa en el presente documento, “IL-33” se refiere a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1-4, o fragmentos funcionales o variantes de la misma, o una secuencia de ácido nucleico que codifica la misma. IL-33 puede comprender SEQ ID NO: 1, 2, 3, o 4. IL-33 puede comprender una IL-33 de longitud completa correspondiente a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1 o 3. IL-33 puede comprender un fragmento funcional de SEQ ID NO: 1, 2, 3, o 4. IL-33 puede comprender un fragmento de extremo terminal C funcional correspondiente a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o 4. IL-33 puede comprender una variante de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4. La longitud completa, fragmento funcional o variante de IL-33 puede producirse de manera recombinante.
111. Descripción general de la presente tecnología
La divulgación se refiere a composiciones y métodos para prevenir y tratar enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias. El ingrediente activo en la composición es IL-33. La composición puede incluir uno o más agentes terapéuticamente activos además de IL-33. Por ejemplo, las composiciones pueden comprender las siguientes combinaciones: una combinación de IL-33 y un inhibidor de acetilcolinesterasa, tales como donepezilo, rivastigmina, o galantamina; una combinación que incluye IL-33 y un antagonista del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR), tales como memantina; una combinación que incluye IL-33 y aducanumab; una combinación que incluye IL-33 y un heterodímero de diferentes restos químicos, véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.605.265; una combinación que incluye IL-33 y rosiglitazona; una combinación que incluye IL-33 y bexaroteno, una combinación que incluye IL-33 y un bloqueador de receptor 2 de angiotensina, tales como losartán; una combinación que incluye IL-33 y DA001 o sus derivados, véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 8.642.567 y la patente estadounidense n.° 9.029.414; una combinación que incluye IL-33 y un extracto o compuesto de producto natural, tales como rincofilina; una combinación que incluye IL-33 y derivados de Rhy de molécula pequeña, tales como Rhy-37, véase, por ejemplo, PCT/CN2014/082386. Una cantidad eficaz del/de los ingrediente(s) activo(s) junto con una sal farmacéuticamente aceptable, y uno o más excipientes, puede administrarse a sujetos humanos para el tratamiento o prevención de una enfermedad/trastorno neurodegenerativo o neuroinflamatorio. Una cantidad eficaz del/de los ingrediente(s) activo(s) junto con una sal farmacéuticamente aceptable, y uno o más excipientes, también puede administrarse a sujetos humanos en un método para aumentar la expresión de receptores Ap. El receptor Ap puede comprender un receptor seleccionado del grupo que consiste en receptor 2 de tipo Toll (TLR2), receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR), y receptor 1 depurador de macrófagos (MSR1). Condiciones adecuadas para tal tratamiento o prevención incluyen DCL y EA temprana, EA, EP, EM, depresión, accidente cerebrovascular, demencia con cuerpos de Lewy, esclerosis lateral amiotrófica, demencia frontotemporal, enfermedad de Huntington, enfermedades degenerativas retinianas tales como glaucoma, degeneración macular relacionada con la edad y retinopatía diabética, pérdida de audición debido a degeneración nerviosa, lesión cerebral traumática, y lesión de médula espinal, y otras afecciones neuroinflamatorias tales como encefalomielitis diseminada aguda, neuritis óptica, mielitis transversa, síndrome pospoliomietílico, neuropatía motora multifocal y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica.
IL-33 promueve la respuesta inmunitaria de tipo Th2 a través de la señalización a través de su receptor ST2. El ST2 soluble actúa como receptor señuelo. Se une a IL-33 y hace que no esté disponible para el receptor ST2, obstruyendo de ese modo los eventos aguas abajo de esta interacción receptor/ligando. En el presente documento, los inventores han identificado una correlación previamente no dada a conocer entre los niveles de sST2 en plasma sanguíneo de sujetos humanos y la aparición de deterioro cognitivo leve (DCL), la etapa prodrómica de EA. Niveles elevados indican la presencia o aumento del riesgo de una enfermedad neurodegenerativa y neuroinflamatoria en el sujeto humano, e identificar sST2 es un biomarcador fiable para enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias tales como DCL. Este es un enfoque importante ya que actualmente no existe una herramienta de diagnóstico para la detección de DCL y EA temprana. Por lo tanto, la presente tecnología da a conocer métodos novedosos para diagnosticar (o detectar un mayor riesgo de desarrollar) DCL y EA temprana en sujetos humanos, y proporciona un kit que permite que se midan los niveles de sST2 en el plasma sanguíneo de sujetos humanos. El kit puede formularse para administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, tópica, intranasal u oral.
Se sabía previamente que ST2 desempeñaba un papel en la progresión de una enfermedad cardíaca, y se correlacionaron niveles de sST2 con la enfermedad cardiovascular (CVD). Adicionalmente, sST2 se ha identificado como biomarcador para CVD, para la activación neurohormonal en pacientes con insuficiencia cardíaca, y como indicador de mortalidad en estos pacientes. Por lo tanto, se postula que sST2 tiene un papel en la CVD en el contexto diagnóstico y/o terapéutico. Además, se ha descrito el uso de IL-33 en el tratamiento y diagnóstico de enfermedades y trastornos cardíacos, tal como hipertrofia cardíaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, arteriosclerosis e insuficiencia cardíaca. Sin embargo, los presentes inventores son los primeros en: (i) ilustrar la correlación entre niveles elevados de sST2 soluble y enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias tales como deterioro cognitivo leve (DCL) y enfermedad de Alzheimer (EA); (ii) dar a conocer el método de medición de sST2 en plasma sanguíneo en un sujeto humano; y (iii) dar a conocer el método de manipulación de rutas aguas abajo de la señalización de ST2/IL-33 como una estrategia terapéutica para tratar afecciones neurodegenerativas o neuroinflamatorias.
IV. Agentes terapéuticos de la presente tecnología
La divulgación se refiere a agentes terapéuticos que pueden usarse para tratar o reducir el riesgo de desarrollar trastornos neurodegenerativos o neuroinflamatorios tales como enfermedad de Alzheimer (EA), deterioro cognitivo leve (DCL), y enfermedad de Parkinson (EP). Composiciones farmacéuticas o fisiológicas, adecuadas tanto en aplicaciones profilácticas como terapéuticas, normalmente incluyen el componente activo más uno o más excipientes 0 portadores farmacéutica o fisiológicamente aceptables.
Pueden formularse composiciones que comprenden IL-33 con fines profilácticos y terapéuticos. IL-33 puede estar en forma de una proteína, por ejemplo, una proteína producida de manera recombinante. Opcionalmente, la proteína puede contener modificaciones tales como la sustitución de residuo(s) de aminoácidos que se produce(n) de manera natural con uno o más aminoácidos diferentes o uno o más aminoácidos artificiales, incluyendo D-aminoácidos.
Se proporciona a continuación una proteína IL-33 humana de longitud completa ilustrativa (hIL-33), dada por el n.° de registro de UniProt O95760 (SEQ ID NO. 1). La parte subrayada de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1 (aminoácidos 112-270) representa un fragmento de extremo terminal C de hIL-33 y corresponde a SEQ ID NO: 2.
1 mkpkmkystn kistakwknt askalcfklg ksqqkakevc pmyfmklrsg lmikkeacyf 61 rrettkrpsl ktgrkhkrhl vlaacqqqst vecfafgisg vqkytralhd ssitgispit 121 eylaslstyn dqsitfaled esyeiyvedl kkdekkdkvl lsyyesqhps nesgdgvdgk 181 mlmvtlsptk dfwlhannke hsvelhkcek plpdqaffvl hnmhsncvsf ecktdpgvfi 241 gvkdnhlali kvdssenlct enilfklset
Se proporciona a continuación una proteína IL-33 de ratón de longitud completa ilustrativa (mIL-33), dada por el n.° de registro UniProt Q8BVZ5 (SEQ ID No .3). La parte subrayada de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 (aminoácidos 109-266) representa un fragmento de extremo terminal C de mIL-33 y corresponde a SEQ ID NO: 4.
1 mrprmkysns kispakfsst agealvppck irrsqqktke fchvycmrlr sgltirkets 61 yfrkeptkry slksgtkhee nfsayprdsr krsllgsiqa faasvdtlsi qgtslltqsp 121 aslstyndqs vsfvlengcy vinvddsgkd qeqdqvllry yespcpasqs gdgvdgkklm 181 vnmspikdtd iwlhandkdy svelqrgdvs ppeqaffvlh kkssdfvsfe cknlpgtyig 241 vkdnqlalve ekdescnnim fklski
La homología entre los fragmentos de extremo terminal C es humana (hIL-33) y de ratón (mIL-33) (SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente) es 57 %.
Pueden sintetizarse péptidos de la presente divulgación mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica. Métodos adecuados para sintetizar químicamente la proteína incluyen, por ejemplo, los descritos por Young en Solid Phase Peptide Synthesis, segunda edición, Pierce Chemical Company (1984), y en Methods Enzymol. 289, Academic Press, Inc, Nueva York (1997).
Una proteína IL-33 de la presente tecnología puede ser una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 1-4, o un fragmento funcional o variante de la misma. IL-33 puede comprender una proteína IL-33 de longitud completa correspondiente a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1 o 3. La proteína IL-33 puede comprender un fragmento funcional de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4. La proteína IL-33 puede comprender un fragmento de extremo terminal C funcional correspondiente a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o 4. La proteína IL-33 puede comprender una variante de la secuencia de aminoácidos establecida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4 que tiene una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. La variante puede tener al menos el 99 %, al menos el 95 %, al menos el 85 %, al menos el 80 %, al menos el 75 %, al menos el 70 %, al menos el 65 %, al menos el 60 %, al menos el 55 %, o al menos el 50 % de homología con una secuencia de aminoácidos establecida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4. El fragmento funcional de longitud completa, o la variante de IL-33 puede producirse de manera recombinante.
También son posibles modificaciones químicas tales como glicosilación, PEGilación, etc., siempre que la IL-33 resultante conserve las actividades biológicas normales de IL-33 nativa. IL-33 puede estar en forma de un ácido nucleico que codifica una proteína IL-33, por ejemplo, un casete de expresión capaz de dirigir la transcripción de la secuencia codificante de iL-33 y finalmente la traducción de la proteína IL-33. Opcionalmente, puede usarse IL-33 en combinación con un segundo o más ingredientes activos para potenciar los efectos terapéuticos deseados. Posibles ingredientes activos incluyen, pero no se limitan a donepezilo, rivastigmina, galantamina, memantina, aducanumab, rosiglitazona, bexaroteno, losartán, y rincofilina, incluyendo un heterodímero de diferentes restos químicos nombrados en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.605.265, DA001 o sus derivados nombrados en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 8.642.567 y 9.029.414, así como derivados de Rhy nombrados en, por ejemplo, el documento PCT/CN2014/082386.
Además, la divulgación se refiere a un método para identificar un modulador de una afección. La divulgación se refiere a un método para identificar un modulador o una afección neurodegenerativa o neuroinflamatoria. Este método se basa en el descubrimiento de que la interacción entre IL-33 y su receptor ST2 es esencial en efectos neuroprotectores mediados por IL-33. Como tal, el método de cribado incluye estas etapas: (a) poner en contacto un agente candidato con la proteína IL-33 y una proteína ST2 (que puede ser sST2 o ST2L) en condiciones permisibles para la unión de IL-33/ST2; (b) detectar el nivel de unión de IL-33/ST2; y (c) identificar el agente candidato como modulador de neurodegeneración cuando el nivel de unión a IL-33/ST2 obtenido en la etapa (b) es mayor o menor que el nivel de unión a IL-33/ST2 en las mismas condiciones pero en ausencia del agente candidato.
Puede usarse un ensayo in vitro para detectar moduladores potenciales de señalización de IL-33 basándose en el efecto de un compuesto candidato sobre la unión entre IL-33 y ST2. En general, un ensayo de este tipo puede realizarse en presencia de IL-33 y una proteína ST2 o un fragmento de la misma, por ejemplo, una proteína ST2L producida de manera recombinante o sST2, en condiciones que permitan la unión de IL-33 a su receptor. En algunos casos, los ensayos de unión pueden realizarse en un entorno libre de células; mientras que en otros casos, los ensayos de unión pueden realizarse dentro de una célula o en la superficie celular, por ejemplo, usando células que expresan de manera recombinante o endógena un polipéptido ST2L apropiado.
Una vez que se identifica un compuesto en el ensayo de unión como un modulador potencial de neurodegeneración, pueden realizarse pruebas adicionales para confirmar su actividad. El método de cribado puede comprender además cualquier prueba adicional necesaria para determinar si el modulador promueve o inhibe la neurodegeneración usando métodos y modelos experimentales conocidos en el campo o como se describe en esta solicitud, por ejemplo, en los ejemplos.
Una composición farmacéutica hecha para el uso según la presente tecnología normalmente comprende un agente activo (opcionalmente con un agente activo adicional) como el componente terapéuticamente eficaz y un excipiente o portador farmacéuticamente/fisiológicamente aceptable. Tal composición puede formularse específicamente para la ruta de administración prevista a los pacientes, por ejemplo, mediante administración intraperitoneal o inyección. Los agentes terapéuticos de esta tecnología también son útiles para el propósito de fabricar medicamentos para el tratamiento de enfermedades y afecciones relevantes como se describe en esta solicitud.
V. Terapias de combinación
Pueden incorporarse compuestos de IL-33 en composiciones farmacéuticas para administración, individual o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, a un sujeto para el tratamiento o prevención de una afección particular. La afección puede ser una enfermedad neurodegenerativa o trastorno neuroinflamatorio. La afección puede ser enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP) o deterioro cognitivo leve (DCL).
Puede administrarse un agente terapéutico adicional a un sujeto en combinación con al menos un compuesto de IL-33 de la presente tecnología de manera que se produzca un efecto terapéutico sinérgico.
Se administran múltiples agentes terapéuticos (incluyendo compuestos de IL-33) en cualquier orden o incluso simultáneamente. Si simultáneamente, los múltiples agentes terapéuticos se proporcionan en una sola forma unificada, o en múltiples formas (solamente a modo de ejemplo, o bien como una sola píldora o bien como dos píldoras separadas). Uno de los agentes terapéuticos puede administrarse en múltiples dosis, o ambos pueden administrarse como dosis múltiples. Además, los métodos de combinación, composiciones y formulaciones no deben limitarse al uso de solo dos agentes.
Específicamente, ejemplos no limitantes de posibles terapias de combinación incluyen el uso de uno o más de los compuestos de IL-33 en combinación con un agente activo específico para una enfermedad o trastorno particular. El agente activo puede seleccionarse del grupo que consiste en un inhibidor de acetilcolinesterasa, un antagonista de receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR), aducanumab, un heterodímero de diferentes restos químicos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.605.265), rosiglitazona, bexaroteno, un bloqueador de receptor 2 de angiotensina, DA001 o sus derivados (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 8.642.567 y la patente estadounidense n.° 9.029.414), rincofilina, y derivados de Rhy. En algunas realizaciones, el inhibidor de acetilcolinesterasa se selecciona del grupo que consiste en donepezilo, rivastigmina y galantamina. En algunas realizaciones, el NMDAR es memantina. El bloqueador del receptor 2 de angiotensina puede ser losartán. El derivado de Rhy puede ser Rhy-37 (véase, por ejemplo, el documento PCT/CN2014/082386).
VI. Composiciones farmacéuticas y modos de administración
Según un aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto que lo necesita que comprende una cantidad eficaz de una composición que comprende IL-33 y memantina, en la que el tratamiento comprende aumentar la transcripción de un receptor Ap en el sujeto. Por lo tanto, la composición proporciona los beneficios previstos tanto en aplicaciones profilácticas como terapéuticas. Una composición farmacéutica de este tipo también incluye uno o más excipientes o portadores farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Composiciones farmacéuticas de la presente tecnología son adecuadas para su uso en una variedad de sistemas de administración de fármacos. Formulaciones adecuadas para su uso en la presente tecnología se encuentran en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadelfia, PA, 17a ed. (1985). Para una breve revisión de los métodos para la administración de fármacos, véase, Langer, Science 249: 1527-1533 (1990).
Métodos descritos en el presente documento pueden comprender poner en contacto una célula, órgano o tejido con composiciones y/o agentes descritos en el presente documento, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica, incluyendo métodos in vitro, in vivo y ex vivo. Métodos in vitro incluyen normalmente el uso de muestras cultivadas. Por ejemplo, una célula puede colocarse en un depósito (por ejemplo, placa de cultivo tisular), e incubarse con un agente en condiciones apropiadas adecuadas para obtener el resultado deseado. Pueden determinarse fácilmente condiciones de incubación adecuadas usando métodos conocidos en la técnica. Métodos ex vivo normalmente incluyen células, órganos o tejidos extraídos de un mamífero, tal como un ser humano. Las células contactadas, órganos o tejidos normalmente se devuelven al donante, colocado en un recipiente, o almacenados para uso futuro. Métodos in vivo incluyen normalmente la administración de un agente, tales como los descritos en el presente documento, a un sujeto tal como un ser humano. Cuando se usa in vivo para terapia, un agente de la presente tecnología se administra a un mamífero en cantidades eficaces para el resultado deseado y por una ruta de administración adecuada para el resultado deseado.
Agentes y composiciones dados a conocer en el presente documento pueden formularse como una sal farmacéuticamente aceptable. El término “sal farmacéuticamente aceptable” significa una sal preparada a partir de una base o un ácido que es aceptable para la administración a un paciente, tal como un mamífero (por ejemplo, sales que tienen seguridad aceptable para mamíferos para un régimen de dosificación dado).
Composiciones farmacéuticas se formulan normalmente para ser compatibles con la ruta de administración prevista. Las composiciones farmacéuticas de la presente tecnología pueden administrarse por diversas rutas que incluyen, por ejemplo, administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea), intracraneal, intracerebroventricular, intratecal, oral, respiratoria (por ejemplo, mediante inhalación), transdérmica (tópica), iontoforético, y transmucosa.
Por ejemplo, rutas de administración de las composiciones farmacéuticas son la administración local a un órgano o tejido que padece una afección causada o exacerbada por la pérdida o daño a células neuronales a dosis diarias de aproximadamente 0,01-2500 mg de un agente activo para un ser humano adulto de 70 kg por día. La dosis diaria puede ser de aproximadamente 2,5-500 mg de un agente activo para un ser humano adulto de 70 kg por día. La dosis apropiada puede administrarse en una dosis diaria única o como dosis divididas presentadas a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más subdosis por día. La dosis puede administrarse por inyección intraperitoneal durante un período de tiempo de 2 días.
Agentes dados a conocer en el presente documento pueden administrarse por vía intravenosa. Por ejemplo, agentes de la presente tecnología pueden administrarse mediante inyección rápida en bolo intravenoso. Pueden administrarse agentes como una infusión intravenosa a velocidad constante.
Pueden administrarse sistémicamente agentes, por vía intracerebroventricular, por vía intratecal, por vía tópica, por vía intranasal, por vía subcutánea, o utilizar por vía transdérmica portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticos convencionales, etc., tales como los conocidos en la técnica para administrar los agentes de la presente tecnología. Por ejemplo, las composiciones dadas a conocer en el presente documento pueden comprender además uno o más de los siguientes: un estabilizador, un tensioactivo, tal como un tensioactivo no iónico, y opcionalmente una sal y/o un agente de tamponamiento. También pueden incorporarse compuestos activos suplementarios en las composiciones.
El portador farmacéutico puede estar en forma sólida o líquida. Preparaciones en forma sólida incluyen, por ejemplo, polvos, comprimidos, gránulos dispersables, cápsulas, obleas y supositorios. Un portador sólido puede ser una o más sustancias que también pueden actuar como diluyentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes o agentes disgregantes de comprimidos; también puede ser un material de encapsulación.
Para polvos, el portador puede ser generalmente un sólido finamente dividido que está en una mezcla con el componente o componentes activos finamente divididos. En algunas realizaciones, para comprimidos, el ingrediente activo se mezcla con el portador que tiene las propiedades de unión necesarias en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamaño deseados.
Para preparar composiciones farmacéuticas en forma de supositorios, primero se funde una cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos y manteca de cacao, y el ingrediente activo se dispersa en la misma, por ejemplo, agitando. La mezcla homogénea fundida se vierte luego en moldes de tamaño conveniente y se deja enfriar y solidificar.
Polvos y comprimidos contienen entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 70 % en peso del ingrediente activo de un agente activo de la presente tecnología. Portadores adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, lactosa, azúcar, pectina, dextrina, almidón, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao, y similares.
Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento pueden incluir la formulación del compuesto activo de un agente activo con material de encapsulación como portador que proporciona una cápsula en la que el agente activo (con o sin otros portadores) está rodeado por el portador, de manera que el portador está, por tanto, en asociación con el compuesto. De manera similar, también pueden incluirse obleas. Comprimidos, polvos, obleas y cápsulas pueden usarse como formas de dosificación sólidas adecuadas para la administración oral.
Composiciones farmacéuticas líquidas incluyen, por ejemplo, disoluciones adecuadas para administración oral o parenteral, suspensiones y emulsiones adecuadas para administración oral. Disoluciones de agua estéril del componente activo (por ejemplo, un agente activo tal como IL-33, opcionalmente en combinación con un agente activo adicional) o disoluciones estériles del componente activo en disolventes que comprenden agua, agua tamponada, solución salina, PBS, etanol o propilenglicol son ejemplos de composiciones líquidas adecuadas para administración parenteral. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste de pH y tamponamiento, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes, detergentes, y similares.
Disoluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea, incluyendo composiciones dadas a conocer en el presente documento adecuadas para uso inyectable, pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua (cuando es soluble en agua) para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. Composiciones formuladas para administración intravenosa pueden comprender un portador que incluye solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, N.J., EE.UU.), o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, una composición para administración parenteral debe ser estéril y debe formularse para facilitar la inyectabilidad. La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe estar protegida de la contaminación por microorganismos tales como bacterias y hongos. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación puede contenerse en ampollas, jeringas desechables o viales multidosis hechos de vidrio o plástico. Por conveniencia del paciente o médico tratante, la formulación de dosificación puede proporcionarse en un kit que contiene todos los equipos necesarios (por ejemplo, viales de fármaco, viales de diluyente, jeringas y agujas) para un curso de tratamiento.
El estabilizador puede comprender un aminoácido, tal como, por ejemplo, glicina; un oligosacárido, tales como, sacarosa, tetralosa, lactosa; o un dextrano. Alternativamente, el estabilizador puede comprender un alditol, tal como, manitol. El estabilizador o combinación de estabilizadores puede constituir de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 10 % en peso para el peso de la composición formulada.
El tensioactivo puede comprender un tensioactivo no iónico (tal como un polisorbato), un tensioactivo aniónico (tal como dioctil sulfosuccinato de sodio), un tensioactivo catiónico (tal como cloruro de cetilpiridinio), o una combinación de los mismos. Ejemplos de tensioactivos no iónicos adecuados incluyen ésteres de sorbitano polioxietilenado (por ejemplo, Tween-20 y Tween-80), p-t-octil fenol polioxietilenos (por ejemplo, Tritón X-45, Tritón X-100, Tritón X-114 y Tritón X-305), un polietilenglicol o un polioxietilenpolioxipropilenglicol, tal como Pluronic F-68, nonilfenoxipoloxietilenos (por ejemplo, serie Igepal CO), y éteres de polioxietileno (por ejemplo, Brij 36T, Brij 52, Brij 56, Brij 76, Brij 96, Texaphor A6, Texaphor A14 y Texaphor A60), a partir de aproximadamente un 0,001 % (p/v) a aproximadamente un 10 % (p/v).
La sal o agente de tamponamiento puede comprender cualquier sal o agente de tamponamiento, tales como, por ejemplo, cloruro de sodio, o fosfato de sodio/potasio, respectivamente. El agente de tamponamiento puede mantener el pH de la composición farmacéutica en el intervalo de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5. La sal y/o agente de tamponamiento también es útil para mantener la osmolalidad a un nivel adecuado para la administración a un ser humano o un animal. La sal o agente de tamponamiento puede estar presente a una concentración aproximadamente isotónica de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 300 mM.
VII. Dosificación
Los intervalos y regímenes de dosificación descritos en el presente documento son a modo de ejemplo y no se pretende que sean limitantes.
Dosificación, toxicidad y eficacia terapéutica de los agentes de la presente tecnología puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Se prefieren compuestos que exhiben altos índices terapéuticos. Si bien pueden usarse compuestos que exhiben efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado de diseñar un sistema de administración que dirija tales compuestos al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a células no afectadas, y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier agente de la presente tecnología usado en los métodos descritos en el presente documento, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición semimáxima de síntomas) como se determina en el cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse los niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.
Las composiciones farmacéuticas que contienen uno o más agentes activos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. Las composiciones pueden administrarse a un paciente que ya padece una afección como aplicación terapéutica en una cantidad suficiente para prevenir, curar, invertir, o al menos ralentizar o detener parcialmente los síntomas de la afección y sus complicaciones. Las composiciones pueden administrarse a un paciente que padece una afección que puede mejorarse por neurogénesis tal como el inicio, progresión, y empeoramiento de EA, DCL o EP. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una “dosis terapéuticamente eficaz”. Cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad o afección y el peso y el estado general del paciente.
Las composiciones farmacéuticas que contienen uno o más agentes activos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. Las composiciones pueden administrarse a un paciente que ya padece una afección como aplicación terapéutica en una cantidad suficiente para prevenir, curar, invertir, o al menos ralentizar o detener parcialmente los síntomas de la afección y sus complicaciones. Las composiciones pueden administrarse a un paciente que padece una afección que puede mejorarse por neurogénesis tal como el inicio, progresión, y empeoramiento de EA, DCL o EP. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una “dosis terapéuticamente eficaz”. Cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad o afección y el peso y el estado general del paciente. Una dosis terapéuticamente eficaz puede oscilar de aproximadamente 0,000001 mg a aproximadamente 10.000 mg por kilogramo de peso corporal por día. La dosis terapéuticamente eficaz puede oscilar de aproximadamente 0,000001 mg a aproximadamente 0,0001 mg, aproximadamente 0,001 mg, aproximadamente 0,01 mg, aproximadamente 0,05 mg, aproximadamente 0,1 mg, aproximadamente 0,5 mg, aproximadamente 1,0 mg, aproximadamente 5,0 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 400 mg, aproximadamente 500 mg, aproximadamente 600 mg, aproximadamente 700 mg, aproximadamente 800 mg, aproximadamente 900 mg, aproximadamente 1.000 mg, aproximadamente 1.500 mg, aproximadamente 2.000 mg, aproximadamente 3.000 mg, aproximadamente 4.000 mg, aproximadamente 5.000 mg, aproximadamente 6.000 mg, aproximadamente 7.000 mg, aproximadamente 8.000 mg, aproximadamente 9.000 mg, o aproximadamente 10.000 mg por kilogramo de peso corporal por día.
Por ejemplo, la dosificación puede oscilar de aproximadamente 0,0001 mg a aproximadamente 2.500 mg del/de los agente(s) activo(s) por día para un paciente de 70 kg. La dosificación puede oscilar de aproximadamente 0,0002 mg a aproximadamente 2.500 mg del/de los agente(s) activo(s) por día para un paciente de 70 kg. La dosificación puede oscilar de aproximadamente 0,0005 mg a aproximadamente 2.500 mg del/de los agente(s) activo(s) por día para un paciente de 70 kg. La dosificación puede oscilar de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 2.500 mg del/de los agente(s) activo(s) por día para un paciente de 70 kg. La dosificación puede oscilar de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 2.500 mg del/de los agente(s) activo(s) por día para un paciente de 70 kg. La dosificación puede oscilar de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 2.500 mg del/de los agente(s) activo(s) por día para un paciente de 70 kg. La dosificación puede oscilar de aproximadamente 2,5 mg a aproximadamente 500 mg del/de los agente(s) activo(s) por día para un paciente de 70 kg.
Las concentraciones de IL-33 en un portador o diluyente pueden variar de aproximadamente 0,01 |ig a aproximadamente 0,1 |ig, aproximadamente 0,5 |ig, aproximadamente 1,0 |ig, aproximadamente 5 |ig, aproximadamente 10 |ig, aproximadamente 20 |ig, aproximadamente 30 |ig, aproximadamente 40 |ig, aproximadamente 50 |ig, aproximadamente 100 |ig, aproximadamente 200 |ig, aproximadamente 300 |ig, aproximadamente 400 |ig, aproximadamente 500 |ig, aproximadamente 600 |ig, aproximadamente 700 |ig, aproximadamente 800 |ig, aproximadamente 900 |ig, aproximadamente 1000 |ig, aproximadamente 1500 |ig, aproximadamente 2000 |ig por mililitro suministrado.
Una dosis terapéuticamente eficaz o una dosis profilácticamente eficaz de las composiciones puede definirse como una concentración del compuesto de IL-33 en el tejido diana de 10-11 a 10-6 molar, por ejemplo, aproximadamente 10­ 7 molar. El régimen de dosificación está optimizado para mantener la concentración terapéutica en el tejido diana, tal como mediante administración diaria o semanal única, pero también incluyendo administración continua.
Pueden llevarse a cabo administraciones únicas o múltiples de las composiciones con niveles de dosis y patrón que se seleccionan por el médico tratante. La dosis apropiada puede administrarse en una dosis diaria única o como dosis divididas presentadas a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más subdosis por día.
Regímenes para el tratamiento o la prevención de una afección neurodegenerativa o neuroinflamatoria pueden comprender la administración de una o más composiciones de la presente tecnología a intervalos especificados. Las composiciones pueden administrarse más de una vez al día. Las composiciones pueden administrarse una vez cada 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días. Las composiciones pueden administrarse una vez cada 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6, semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas o 10 semanas. Las composiciones pueden administrarse una vez cada 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 12 meses. Las composiciones pueden administrarse una vez cada 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años o más tiempo (es decir, menos de una vez cada cinco años).
Regímenes para el tratamiento o la prevención de una afección neurodegenerativa o neuroinflamatoria pueden comprender la administración de una o más composiciones de la presente tecnología seguida de un intervalo de descanso antes de la administración adicional de la composición. El régimen de tratamiento puede comprender múltiples administraciones de una composición, cada una de los cuales está seguido por un período de descanso. La composición puede administrarse como una dosis única seguida de un periodo de descanso de hasta 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 12 meses antes de la administración de composiciones adicionales.
Regímenes de tratamiento pueden comprender múltiples administraciones de composición, cada uno de los cuales está seguido por un período de descanso. Los períodos de descanso dentro de un régimen de tratamiento pueden ser variables. Por ejemplo, un régimen de tratamiento puede comprender un primer periodo de descanso de 1 semana, un segundo período de descanso de dos semanas, y un tercer periodo de descanso de tres semanas. Del mismo modo, el régimen de tratamiento puede incluir un primer período de descanso de 1 año, un segundo período de descanso de dos años, y un tercer período de descanso de tres años. Intervalos adecuados para el descanso y la administración de composición pueden determinarse de manera individual usando métodos clínicos conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, midiendo marcadores de enfermedad durante el curso de tratamiento.
Por ejemplo, una dosis completa (por ejemplo, como una dosis diaria única o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados) puede administrarse al sujeto seguido de un período de descanso de 1 día, después de lo cual se administra una segunda dosis completa al sujeto. Una dosis completa (por ejemplo, como una dosis diaria única o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados) puede administrarse al sujeto el día 1 seguido de un período de descanso de 1 día, después de lo cual se administra una segunda dosis completa al sujeto, seguido de un período de descanso de dos días, después de lo cual se administra una tercera dosis completa al sujeto, seguido de un período de descanso de 1 día, después de lo cual se administra una cuarta dosis completa al sujeto, seguido de un período de descanso de 1 día, después de lo cual se administra una quinta dosis completa al sujeto. Puede usarse un régimen de tratamiento de 21 días. En este régimen, una dosis completa (por ejemplo, como una dosis diaria única o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados) se administra al sujeto el día 1 seguido de un período de descanso de 1 día, después de lo cual se administra una segunda dosis completa al sujeto el día 2, seguido de un período de descanso de dos días, después de lo cual se administra una tercera dosis completa al sujeto el día 5, seguido de un período de descanso de 1 día, después de lo cual se administra una cuarta dosis completa al sujeto el día 7, seguido de un período de descanso de 1 día, después de lo cual se administra una quinta dosis completa al sujeto el día 9, seguido de un período de descanso de 3 días, después de lo cual se administra una sexta dosis completa al sujeto el día 13, seguido de un período de descanso un día, después de lo cual se administra una séptima dosis completa al sujeto el día 15, seguido de un período de descanso de un día, después de lo cual se administra una octava dosis completa al sujeto el día 17, seguido de un período de descanso de un día, después de lo cual se administra una novena dosis completa al sujeto el día 19, seguido de un período de descanso de un día, después de lo cual se administra una décima dosis completa al sujeto el día 21.
Una terapia conocida tal como un método de entrenamiento cognitivo basado en ordenador (véase, por ejemplo, Hofmann et al., J Psychiatr Res. 1996 Nov-Dec;30(6):493-501) puede usarse en combinación con la administración de al menos uno de los compuestos de IL-33 en los regímenes de tratamiento descritos anteriormente.
Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica midiendo los niveles sanguíneos de glucosa o insulina en el sujeto y ajustando la dosificación o administración en consecuencia. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración deseada de glucosa en ayunas o insulina en ayunas. En cualquier caso, las formulaciones farmacéuticas deben proporcionar una cantidad de un agente activo (opcionalmente en combinación con un segundo agente activo) suficiente para suprimir eficazmente, inhibir, o incluso revertir el inicio o la progresión de la neurodegeneración o neuroinflamación en el paciente, o bien terapéutica o bien profilácticamente.
VIII. Método de diagnóstico
La presente tecnología también se refiere a un método novedoso para detectar la presencia de un trastorno en un paciente o para evaluar el riesgo de que un individuo desarrolle un trastorno en el futuro, aunque de lo contrario no haya indicios de tal enfermedad en la actualidad. La presente tecnología también se refiere a un método novedoso para detectar la presencia de un trastorno neurodegenerativo o neuroinflamatorio en un paciente o para evaluar el riesgo de que un individuo desarrolle un trastorno neurodegenerativo o neuroinflamatorio en el futuro, aunque de lo contrario no haya indicios de tal enfermedad en la actualidad. El método implica determinar el nivel de sST2 en una muestra biológica del paciente y detectar cualquier aumento con respecto a un control estándar, que puede indicar la presencia de, o un riesgo elevado de desarrollar, un trastorno neurodegenerativo o neuroinflamatorio en el paciente.
Para poner en práctica este método, normalmente se analiza la cantidad de sST2, o bien en forma de proteína o bien en forma de ARNm, encontrada en una muestra tomada de una persona que se está sometiéndose a prueba, por ejemplo, una muestra de sangre. La recogida de sangre de un individuo se realiza según el protocolo estándar que generalmente siguen los hospitales o clínicas. Una cantidad apropiada de sangre periférica, por ejemplo, normalmente entre 5-50 ml, se recoge y puede almacenarse según el procedimiento estándar antes de la preparación adicional.
El análisis de la proteína sST2 o ARNm encontrado en una muestra de paciente según la presente tecnología puede realizarse usando, por ejemplo, la sangre completa, o más a menudo en una muestra acelular tal como suero, o plasma. Pueden usarse métodos estándar conocidos en el campo de investigación para aislar y analizar el nivel de proteína o ARN de sST2 en la muestra. (Véase, por ejemplo, Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed., 2001).
Con el fin de establecer un control estándar para poner en práctica el método de la presente tecnología, primero se selecciona un grupo de personas sanas libres de cualquier trastorno neurodegenerativo o neuroinflamatorio y no se conoce que estén en riesgo de desarrollar tales trastornos. Estos individuos están dentro de los parámetros apropiados, si corresponde, con el propósito de analizar y/o evaluar el riesgo futuro de tales trastornos usando los métodos de la presente tecnología. Opcionalmente, los individuos son de género, edad, origen étnico, e historial médico igual o comparable. El estado saludable de los individuos seleccionados se confirma mediante un estado bien establecido, métodos empleados rutinariamente que incluyen, pero no se limitan a, examen físico general de los individuos y revisión general de sus registros médicos.
Además, el grupo seleccionado de individuos sanos debe ser de un tamaño razonable, de manera que la cantidad/concentración promedio de sST2 en las muestras obtenidas del grupo puede considerarse razonablemente como representativa del nivel normal o promedio entre la población general de personas sanas sin y fuera de riesgo de desarrollar un trastorno neurodegenerativo o neuroinflamatorio. Preferiblemente, el grupo seleccionado comprende al menos 10 sujetos humanos.
Una vez que se establece un valor promedio para la proteína sST2 o ARNm basándose en los valores individuales encontrados en cada sujeto del grupo de control sano seleccionado, este valor o perfil promedio o de mediana o representativo se considera un control estándar. También se determina una desviación estándar durante el mismo proceso. En algunos casos, pueden establecerse controles estándar independientes para grupos definidos por separado que tienen características distintas tales como edad, sexo, origen étnico, o cualquier evento pasado distinto en el historial médico.
IX. Kits
La presente tecnología se refiere a un kit para diagnosticar o determinar el riesgo de enfermedad neurodegeneración/neuroinflamatoria en un sujeto. El kit comprende normalmente (1) un recipiente que contiene un agente para determinar el nivel de sST2 en una muestra biológica tomada del sujeto, tal como un anticuerpo que reconoce específicamente sST2 (que también puede o no reconocer específicamente ST2L, dado que sST2 se secreta y puede encontrarse en partes acelulares de las muestras, mientras que ST2L está unido a la membrana y, por lo tanto, permanece con las células en las muestras, haciendo que los dos tipos de proteínas ST2 sean fácilmente distinguibles incluso usando anticuerpos que reconocen ambos) o una sonda polinucleotídica que se une específicamente a una secuencia codificante para sST2 pero no para ST2L (por ejemplo, ARNm de sST2 pero no ARNm de ST2L); y (2) un recipiente que contiene un control estándar que indica el nivel de sST2 (que puede ser proteína o ARNm) en el mismo tipo de muestra biológica tomada de un sujeto sano promedio que no padece y que no está en riesgo de padecer neurodegeneración. A menudo, se incluye un manual de instrucciones en el kit para dirigir a los usuarios para que realicen correctamente el método de diagnóstico.
La presente tecnología también se refiere a un kit para inhibir o tratar afecciones de neurodegeneración o neuroinflamatorias para la terapia o prevención de las enfermedades y afecciones pertinentes según el método de esta divulgación. Los kits normalmente incluyen un recipiente que contiene (1) una composición farmacéutica que tiene una cantidad eficaz de un agente activo (por ejemplo, IL-33, opcionalmente en combinación con un segundo o más ingredientes activos) y (2) material informativo que contiene instrucciones sobre cómo dispensar la composición farmacéutica, incluyendo la descripción del tipo de pacientes que pueden tratarse (por ejemplo, pacientes que padecen EA, DCL, EP, depresión, accidente cerebrovascular o lesión cerebral traumática), el programa (por ejemplo, dosis y frecuencia) y ruta de administración, y similares.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan solo a modo de ilustración y no a modo de limitación. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para producir esencialmente los mismos resultados o resultados similares. Los ejemplos no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente tecnología, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Materiales y métodos para los ejemplos 1-12
Productos químicos y anticuerpos. Anticuerpos específicos para IL-33 (clon Nessy-1) y APP se adquirieron de Biolegend y Abcam, respectivamente; el anticuerpo de Iba1 fue de Wako; el anticuerpo conjugado con APC contra CD11b de ratón (clon M1/70) y el anticuerpo conjugado con FITC contra CD45 (clon 30-F11) fueron de eBioscience; el anticuerpo AP17-24 (clon 4G8) fue de Covance; el anticuerpo enzimático de degradación de insulina (IDE) fue de Calbiochem; el anticuerpo de neprilisina (NEP) fue de Santa Cruz; el anticuerpo de actina fue de Sigma-Aldrich. La proteína recombinante ST2 soluble (sST2)-Fc se adquirió de R&D Systems; el monómero (FAM)-Ap-M2 conjugado con fluoresceína fue de rPeptide; metoxi-X04 (MeX04) se adquirió de Tocris Bioscience; Hoechst 34580, kits de ELISA comerciales de APx-40 y APx-42 humanos y anticuerpos secundarios Alexa Fluor se adquirieron de Life Technologies.
Manipulación de animales. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Animal Care Committee de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong. Los ratones doble transgénicos APP/PS1 se generaron incorporando una construcción de APP de humano/ratón que portaba la mutación doble sueca y la mutación PSEN1 de exón 9 eliminado (APPswe PSEN1/dE9). Todos los análisis in vivo se realizaron en grupos emparejados por sexo y edad; se usaron ratones de ambos sexos para experimentos, excepto tareas conductuales, para lo cual solo se usaron ratones macho. Los ratones transgénicos APP/PS1 y sus controles de tipo silvestre (WT) se asignaron aleatoriamente a cada condición experimental. El genotipo se confirmó mediante análisis por PCR de biopsias de cola. Se alojaron de cuatro a cinco ratones del mismo sexo por jaula con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con comida y agua ad libitum. Los tamaños de muestra se eligieron principalmente en base a la experiencia con tipos similares de experimentos.
Se inyectó IL-33 recombinante de ratón (200 ng por ratón) por vía intraperitoneal (i.p.) en ratones APP/PS1 (de 7-17 meses de edad) diariamente. El sistema de administración de IL-33 difirió para cada experimento. A ratones usados para estudiar la carga de placa amiloide, fagocitosis microglial de Ap, y la potenciación a largo plazo (LTP) se les administró IL-33 diariamente durante 2 días. Para pruebas conductuales animal, se inyectó i.p. IL-33 a ratones una vez al día durante 2 días consecutivos antes de comenzar la prueba de campo abierto y luego en días alternos durante el transcurso de los experimentos conductuales.
Se administró sST2 en ratones APP/PS1 de 10-11 meses de edad a través de minibombas osmóticas a 0,11 |il/h (modelo 1004; Alzert). Las bombas se cargaron con proteína sST2 recombinante de ratón (240 ng por bomba; 10 |ig/ml) o disolvente vehículo en líquido cefalorraquídeo artificial (aLCR). Después de 2 días de administración de sST2, se administró i.p. IL-33 a ratones durante 2 días más. Al final del tratamiento, los ratones se perfundieron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) y se fijaron con paraformaldehído al 4 %.
Immunohistoquímica. Para examinar la carga de placa amiloide, los cerebros de ratón perfundidos se crioseccionaron coronalmente (20 |im) para inmunohistoquímica. Brevemente, la recuperación de antígeno se realizó calentando con microondas los cortes de cerebro en tampón de citrato de sodio (citrato trisódico 10 mM, Tween-20 al 0,5 % en H2O [pH 6,0]) durante 10 minutos seguido de incubación con H2O2al 3 % en H2O durante 20 minutos para inhibir la actividad de peroxidasa endógena. Las secciones se bloquearon con suero de cabra al 2 % en solución salina tamponada con Tris (TBS) durante 20 min y posteriormente se marcaron con anticuerpo AP17-24 (dilución 1:1000) en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C. Las secciones de cerebro de ratón se marcaron posteriormente con un anticuerpo de IgG de anti-ratón de cabra ligado a HRP de Dako durante 50 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se desarrollaron usando un kit de cromógeno DAB de Dako según las instrucciones del fabricante. La obtención de imágenes se realizó usando un sistema de microscopio compuesto vertical totalmente automatizado Leica DM6000 B en combinación con una lente de objetivo Leica HC Pl FLUOTAR 10x/0.30. Para determinar el número y la densidad de placas Ap en la corteza y el hipocampo de las secciones de cerebro, las imágenes combinadas de secciones de cerebro completo se analizaron mediante un método de recuento estereológico de células usando el software Stereo Investigator (mbf Bioscience). El marco de recuento y la rejilla de muestreo fueron 180 x 180 |im y 400 x 400 |im, respectivamente. Los coeficientes de error de las imágenes analizadas fueron todos menores de 0,1 para garantizar una toma de muestras aleatoria no sesgada y, por lo tanto, estimaciones precisas.
Para examinar la colocalización de placas amiloides y microglía, los cerebros de ratón perfundidos se bloquearon con albúmina de suero bovino al 1 %, suero de cabra al 4 %, y Triton X-100 al 2,5 % en DPBS durante 30 min a temperatura ambiente y posteriormente se incubó con anticuerpos de Iba1 (dilución 1:500) y Ap17-24 (dilución 1:1000) en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C. Los cortes de cerebro se marcaron luego con anticuerpos secundarios Alexa Fluor (dilución 1:1000). Para marcar los núcleos, se incubaron cortes con Hoechst 34580 (5 |ig/ml). La obtención de imágenes se realizó usando un sistema confocal Leica TCS SP8 en combinación con lente de objetivo Leica HC PL APO 63x/1.40 OIL CS2.
ELISA para A p y ST2 humana. Se extrajo secuencialmente Ap de las fracciones solubles e insolubles de la corteza o el hipocampo de ratón. Brevemente, la corteza de ratón se homogeneizó en tampón que contenía sacarosa 250 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), EDTA 1mM, EGTA 1 mM, y cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich). Se extrajo secuencialmente Ap mediante dietilamina (DEA; soluble) seguido de ácido fórmico (FA; insoluble). Se analizaron Apx-40 y Apx-42 mediante ELISA (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El plasma de pacientes de control, de DCL y de EA se recogió y se sometió a ELISA de ST2.
Preparación de FAM-Apl-42. Se disolvió Ap1-42 monomérico en DMSO seco y se diluyó en un medio F-12 sin rojo fenol enfriado con hielo para producir una concentración final de 100 |iM. La disolución de FAM-Ap1-42 se incubó durante 24 h a 4 ° C y después se centrifugó a 14.000 x g durante 10 min. El sobrenadante se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -20 °C durante hasta 1 mes.
Aislamiento de microglía de ratón. Se aisló microglía de ratones adultos. Brevemente, los ratones se anestesiaron y se perfundieron con DPBS enfriado con hielo. Las cortezas aisladas se cortaron en trozos más pequeños y posteriormente se disociaron enzimática y mecánicamente usando un kit de disociación neural basado en papaína con sistema disociador gentleMACS™ (Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante. Se usó gradiente de Percoll al 30 % (Sigma-Aldrich) para retirar mielina. Las suspensiones de células mononucleares resultantes se usaron para análisis de citometría de flujo o configuración de cultivos de microglía.
Citometría de flujo. Ratones APP/PS1 de siete meses de edad se inyectaron i.p. con IL-33 en o bien DPBS o bien DPBS solo una vez al día durante 2 días consecutivos. Al día siguiente, los ratones se inyectaron i.p. con 10 mg/kg de MeX04. También se inyectaron dos ratones C57 WT con MeX04 como controles. Tres horas después de la inyección de MeX04, los ratones se sacrificaron. Entonces, se incubaron suspensiones de células mononucleares aisladas de la corteza cerebral de ratón con un reactivo de bloqueo de FcR de ratón (Miltenyi Biotec) y se marcaron con un anticuerpos de CD11b de ratón conjugado con APC (dilución 1:100) y CD45 conjugado con FITC (dilución 1:100). Las poblaciones de células en las suspensiones se analizaron mediante un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSAria IIIu. Según los parámetros de dispersión frontal y lateral, los restos celulares se discriminaron para permitir el análisis de células mononucleares en las suspensiones. Se identificaron células mieloides (es decir, células CD11b+) en base a una mayor intensidad de fluorescencia de APC. Además, entre la población de CD11b+, el nivel de expresión de CD45 se distinguió adicionalmente según la intensidad de fluorescencia de FITC, en la que las poblaciones de CD11b+CD45baja y CD11b+CD45alta se identificaron como microglía y macrófagos, respectivamente.
Ensayo de fagocitosis microglial in vitro. Células de microglía aisladas preparadas a partir de ratones ST2+/+ o ST2'/_ de 1,5-2 meses de edad se incubaron con microperlas conjugadas con anticuerpo de CD11b (clon M1/70) (dilución 1:20) y se separaron por columnas MS (Miltenyi Biotec) unidas a un soporte magnético. Se eluyeron células CD11b+ (microglía) y se sembraron en portaobjetos de cámara de 8 pocillos (30.000 células por pocillo; SPL Life Sciences) con medio DMEM/F12 (Life Technologies) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen) y L-glutamina 2 mM (Life Technologies). A los 6-7 días in vitro, se trató previamente microglía con IL-33 durante 20 h seguido de FAMApi-42 2 |iM durante 1 h. Las células se fijaron luego con paraformaldehído y se sometieron a inmunotinción con anticuerpo de Iba1 y Hoechst 34580. La microscopía de fluorescencia de campo amplio se realizó usando un sistema IN Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare). Se adquirieron imágenes en 16 posiciones correspondientes asignadas por el software en cada pocillo. La segmentación de intensidad se aplicó a cada canal usando los mismos criterios de umbral en diferentes muestras. Los límites de la microglía se determinaron según la intensidad de marcado de Iba1+, y se cuantificó FAM-AP1-42 en cada célula Iba1+. Las cantidades de FAM-AP1-42 fagocitado se compararon entre los grupos de tratamiento. El área de FAM-AP1-42 fagocitado se dividió por el área celular correspondiente para obtener el área relativa de FAM-AP1-42 en una célula dada. Los datos se normalizaron posteriormente con respecto al control.
PCR en tiempo real, PCR cuantitativa y PCR digital. El ARN total de células de la microglía se transcribió inversamente a ADNc usando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena de transcriptor (Roche), mientras que el ARN total de la corteza se transcribió inversamente usando el kit de reactivo PrimeScript RT (Takara). Mientras tanto, sST2 y ST2 anclado a membrana (ST2L) se examinaron por PCR cuantitativa en tiempo real (Life Technologies) y PCR digital (Biorad) usando los siguientes cebadores específicos: sST2 directo, 5'-TCG AAA t Ga AAG TTC CAG CA-3' (SEQ ID NO: 5); sST2 inverso, 5'-TGT GTG AGG GAC ACT CCT TAC-3' (SEQ ID NO: 6); ST2L directo, 5'-CAT GGC ATG ATA AGG CAC AC-3' (SEQ ID NO: 7); ST2L inverso, 5'-GTA GAG CTT GCC ATC GTT CC-3' (SEQ ID NO: 8). Las secuencias de ARN de genes candidatos determinadas por PCR cuantitativa en tiempo real se validaron usando el sistema Universal ProbeLibrary System (Roche).
Análisis del transcriptoma de microglía. Para la secuenciación de ARN para el análisis del transcriptoma, se recogió microglía aislada (es decir, células CD11b+) de las cortezas de ratones WT y APP/PS1 de 12 meses de edad a los que se administró IL-33 o vehículo de control (i.p.) durante 2 días (n = 2 por grupo). Se aisló posteriormente microglía de cerebro completo/corteza para la extracción de ARN. El ARN total se extrajo mediante un NucleoSpin® RNA XS (Macherey-Nagel) según el protocolo del fabricante, y se usó un bioanalizador Agilent 2100 para evaluar la integridad de ARN. Se procesaron adicionalmente muestras con RIN > 8 para construir la biblioteca, con 1 ng de ARN total escalado mediante un fluoroespectrómetro NanoDrop 3300 como materiales de partida. El ADNc de longitud completa amplificado se obtuvo del kit SMARTer® Ultra™ Low RNA (Clontech) según el protocolo del fabricante y se escaló adicionalmente a 1 ng con el kit Input Library Prep (Clontech) para la construcción de la biblioteca. La secuenciación se realizó en illumina NextSeq 500 para una secuenciación de alto rendimiento de 2 x 150 pb (300 ciclos).
Para analizar los datos de secuenciación, se alinearon 8 muestras (n = 2 por grupo) con ~18 Gb/muestra de datos con el ensamblaje de genoma mm10 (UCSC) con el conducto de paso STAR-2nd. Los archivos BAM alineados se procesaron adicionalmente a través del kit de Cufflinks para ensamblaje de transcriptoma y análisis de expresión diferencial. Los valores que faltan en cuanto a expresión génica se establecieron en 0,001, con una media de 0,5 FPKM como punto de corte para eliminar los genes de baja abundancia en la microglía.
El análisis estadístico aguas abajo se realizó usando el paquete estadístico R, que incluye ANOVA unidireccional, prueba de la t, agrupamiento de K-medias, y cálculos de medias y factores de cambio, junto con DAVID para anotar ontología génica, GSEA para análisis de enriquecimiento, y STRINGdb para clasificar la red de proteínas. Todas las gráficas se construyeron usando el R-script.
Análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se lisaron tejidos cerebrales congelados en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (Triton X-100 al 1 %, desoxicolato de sodio al 1%, SDS al 0,1 %, NaCl 150 mM, fosfato de sodio 10 mM, EDTA2 mM, y vanadato de sodio al 0,2 %) con diversos inhibidores de proteasa. Se realizó un análisis de inmunotransferencia de tipo Western. La cuantificación densitométrica de intensidad de la banda de proteína del análisis de inmunotransferencia de tipo Western se realizó usando el programa NIH ImageJ.
Potenciación a largo plazo. En pocas palabras, se sacrificaron ratones, y los cerebros completos se resecaron inmediatamente y se sumergieron en aLCR enfriado con hielo suplementado con el 95 % de O2/5 % de CO2. Se prepararon cortes de cerebro (300 |im de grosor) usando un vibratomo (HM650V, Thermo) y se sumergió en tampón oxigenado durante 2 h a 32 °C. Los cortes de hipocampo de ratón se colocaron en una polietilenimina recubierta previamente (Sigma-Aldrich) en una sonda MED-P210A (Panasonic International Inc.) fabricada con matrices de electrodos de 8 x 8 (20 x 20 |im, óxido de indio y estaño y negro de platino) con una distancia entre electrodos de 100 |im. Se colocaron manualmente electrodos en la región CA3-CA1 bajo un microscopio (MIC-D, Olympus, Tokio, Japón). Cada corte se sumergió y se sobrefundió con aLCR oxigenado a 1,3-1,5 ml/min. Se registraron fEPSP a partir de la capa dendrítica de neuronas CA1 seleccionando un electrodo en la ruta colateral de Schaffer como el electrodo de estimulación. En base a la curva de estímulo-respuesta, se seleccionó una intensidad de estimulación que suscitó un 30-40 % de fEPSP de la respuesta máxima. La LTP se indujo por 3 trenes de estimulación de alta frecuencia (100 Hz durante 1 s administrados separados 30 s). La respuesta de potencial de campo después del tétanos se registró durante 60 min. La magnitud de LTP se cuantificó como el cambio porcentual en la pendiente promedio del fEPSP durante 60 minutos después de la inducción de LTP.
Prueba de campo abierto. La actividad motora de los ratones en la prueba de campo abierto se registró y se rastreó usando el sistema de actividad de haz de fotones y el software de San Diego Instruments. En resumen, los ratones experimentales se colocaron en el centro de una cámara superior abierta (16 x 16 x 15 pulgadas) con una matriz de haces de fotones alrededor de la periferia. Se permitió a los ratones explorar la cámara durante 15 minutos cada día durante 3 días consecutivos. La actividad locomotora en los 3 ensayos de entrenamiento se registró por los haces de fotones, y la distancia movida se determinó posteriormente. La cámara se limpió con etanol al 70 % después de cada prueba.
Análisis estadístico. Los investigadores que realizaron la electrofisiología, inmunohistoquímica, citometría de flujo, y las pruebas conductuales los realizaron a ciegas con respecto a los genotipos de los ratones y las condiciones de tratamiento. Todos los datos se expresan como media aritmética EEM. Se realizaron análisis estadísticos usando GraphPad Prism v5.0. La significación de diferencias se evaluó mediante la prueba de la t de Student, o ANOVA unidireccional o bidireccional seguido de pruebas a posteriori de Bonferroni como se indica. El nivel de significación se estableció en p < 0,05.
Ejemplo 1: IL-33 mejora el deterioro sináptico en ratones APP/PS1.
Se administró intraperitonealmente (i.p.) IL-33 a ratones APP/PS1 y WT (~7,5 meses de edad) durante 2 días y la función sináptica se examinó mediante potenciación a largo plazo (LTP). Datos presentados en las figuras 1A-1B muestran que una inyección i.p. de IL-33 recombinante (200 ng) durante dos días revirtió drásticamente el deterioro de LTP de ratones APP/PS1.
Ejemplo 2: IL-33 mejora los déficits conductuales en ratones APP/PS1.
Se administró i.p. IL-33 a ratones APP/PS1 (14 meses de edad) y se evaluaron los cambios en su rendimiento conductual mediante la prueba exploratoria de campo abierto (OF) y la prueba de construcción de nido (NB). Los resultados se presentan en las figuras 2A-2C. En la prueba exploratoria de campo abierto (OF), los ratones WT inyectados con vehículo e inyectados con IL-33 exhibieron capacidad de habituación similar en entornos de prueba novedosos durante el curso de entrenamiento (figura 2B). Los ratones APP/PS1 exhibieron habituación más lenta al entorno de prueba que los ratones WT; sin embargo, los ratones APP/PS1 tratados con IL-33 mostraron habituación mejorada al entorno de prueba en relación con los controles no tratados (figura 2B). Los ratones APP/PS1 tratados con IL-33 también mostraron puntuaciones mejoradas de construcción de nido en relación con controles no tratados (figura 2C).
Ejemplo 3: La administración de IL-33 disminuye la carga de placas AB de ratones APP/PS1. La infusión de ST2 soluble en el cerebro de ratones APP/PS1 suprime la acción de IL-33.
Se infundieron por vía intracerebroventricular ratones APP/PS1 (10 meses de edad) con receptor ST2 soluble mediante bomba osmótica y se administró i.p. IL-33 durante 2 días. Los cerebros de ratón se perfundieron luego con PFA y se seccionaron. Secciones de cerebro se sometieron a inmunotinción con anticuerpo anti-Ap (4G8) usando el kit d Ab . Las densidades de placa se examinaron en un microscopio. Los resultados se presentan en las figuras 3A-3B. A los 2 días después del tratamiento con IL-33, las placas amiloides marcadas con 4G8 se redujeron en las cortezas de ratones APP/PS1 de 10 meses de edad (figura 3A panel superior derecho; figura 3B). Sin embargo, la administración intracerebroventricular de sST2 suprimió la reducción mediada por IL-33 de placas amiloides teñidas con 4G8 en los ratones APP/PS1 (figura 3A panel inferior derecho; figura 3B).
Ejemplo 4: La administración de IL-33 disminuye niveles de AB soluble en ratones APP/PS1.
Se administró i.p. IL-33 a ratones APP/PS1 (10 meses de edad) durante 2 días. Luego se recogieron y fraccionaron los cerebros de ratón. Las proteínas Ap se determinaron mediante el kit de ELISA de Ap (Life Technologies). Los resultados se presentan en las figuras 4A-4B. La inyección de IL-33 redujo las cantidades de especies solubles APx-40 y APx .42 en las cortezas de ratones APP/PS1 de 10 meses de edad (figura 4A).
Ejemplo 5: IL-33 potencia la absorción de AB de microglía.
Debido a que la actividad fagocítica de Ap de microglía impacta directamente en el aclaramiento de Ap, se examinaron alteraciones en la fagocitosis de Ap y la degradación por microglía residente/monocitos infiltrantes en cerebros de ratón APP/PS1 después de la administración de IL-33. Se administró i.p. IL-33 a ratones APP/PS1 (10 meses de edad) durante 2 días. Los cerebros de ratón se perfundieron luego con p Fa y se seccionaron. Secciones de cerebro se sometieron a inmunotinción con anticuerpos anti-Ap e Iba1 (marcador de microglía). Las secciones de cerebro se examinaron en un microscopio. Los resultados se presentan en las figuras 5A-5C.
Se encontraron agrupamientos de células mieloides Iba1 adyacentes a las placas amiloides en las cortezas de ratones APP/PS1 (figura 5A). La inyección de IL-33 potenció el reclutamiento de células mieloides Iba1 a placas amiloides en estas cortezas (figura 5A panel inferior derecho). Un análisis 3D confirmó el aumento de la colocalización de células mieloides y placas amiloides en cerebros de ratón APP/PSA1 tratados con IL-33 (figuras 5B-5C), respaldando la noción de que IL-33 potencia la proximidad entre células mieloides y placas amiloides.
Ejemplo 6: IL-33 potencia la absorción fagocítica microglial de AB en ratones APP/PS1.
Para demostrar que IL-33 promueve la fagocitosis de Ap por células mieloides, se administró i.p. IL-33 a ratones APP/PS1 (17 meses de edad) durante 2 días y se marcó la absorción de Ap por microglía con metoxi-X04 (MeX04), un colorante fluorescente que cruza la barrera hematoencefálica y se une específicamente a Ap, mediante inyección i.p.. Se aislaron microglías y se marcaron con anticuerpos CD11b y CD45. Se realizó un análisis de citometría de flujo para determinar la actividad fagocítica de Ap de las células de microglía.
Datos presentados en las figuras 6A-6F muestran que IL-33 potencia la absorción de Ap de células microgliales residentes. El análisis de citometría de flujo detectó Ap marcado con MeX04 en un ~33 % de las células mieloides CD11b+ de las cortezas de los ratones a Pp /PS1 (figuras 6A-6B), pero no los de ratones WT (figuras 23A-23C). La inyección de IL-33 aumentó aún más la proporción de células CD11b+ que exhiben fluorescencia MeX04 (~47 %; figuras 6A-6B).
Se sugiere que tanto la microglía residente como los monocitos infiltrantes desempeñan papeles fagocíticos en la aclaramiento de materiales no deseados en la neurodegeneración y la lesión cerebral. Se examinaron subconjuntos de células mieloides CD11b+ que mostraron una mayor actividad fagocítica de Ap en cerebros de ratón APP/PS1 tratados con IL-33. Datos presentados en las figuras 24A-24G muestran que IL-33 no aumenta la infiltración de actividad fagocítica de monocitos periféricos en los cerebros de ratones APP/PS1. Pueden diferenciarse microglía residente y monocitos infiltrados por una expresión baja (CD45baja) y alta (CD45alta) de CD45, respectivamente. La mayoría de células mieloides CD11b+ en los ratones WT eran microglías residentes, caracterizadas por la baja expresión de CD45 (>90 % de CD45baja; figura 24A). Los ratones APP/PS1 exhibieron ~3,6 veces más monocitos infiltrantes (células mieloides CD11b+ CD45alta) en comparación con los ratones WT (figuras 24A-24D). En los ratones APP/PS1, ~10 % de Ap fagocitado de microglía residente CD11b+ CD45baja (figuras 6C-6D), y ~80 % de monocitos infiltrantes CD11b+ CD45alta absorbieron Ap marcado con MeX04 (figuras 6E-6F). La administración de IL-33 aumentó significativamente la absorción fagocítica de Ap por la microglía residente en ~80 % mientras que el porcentaje de monocitos infiltrantes que contienen Ap permaneció relativamente estable (figuras 6C-6F).
Ejemplo 7: La señalización de IL-33/ST2 media la actividad fagocítica microglial.
El cultivo primario de la microglía se generó aislando células de microglía de cerebros de ratón adultos de tipo silvestre ST2 y deficientes en ST2. Los cultivos se incubaron previamente con IL-33 seguido de exposición a tratamiento con Ap marcado con fluorescencia. La capacidad de la microglía para absorber el Ap se evaluó cuantificando la fluorescencia dentro de las células. Las células se fijaron luego con paraformaldehído y se sometieron a inmunotinción con anticuerpo de Iba1 y Hoechst 34580. Se realizó microscopía de fluorescencia de campo amplio usando un sistema IN Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare) para examinar la absorción de Ap. Las diferencias en la cantidad de absorción de FAM-Ap-i-42 se compararon entre los cultivos de control (Con) y ST2+/+ y ST2'/_ tratados con IL-33.
Datos presentados en la figura 7 muestra que la microglía deficiente en ST2 suprimió la absorción de Ap estimulada por IL-33; sin embargo, IL-33 potenció la absorción de Ap-i-42 oligomérico marcado con fluorescencia en células microgliales cultivadas en ratones WT de una manera dependiente de la dosis (figura 25C). Concordante con la expresión prominente de ST2 en microglía (figura 26A), las moléculas de señalización aguas abajo (p38 y MAPK ERK1/2) de receptores ST2 se activaron en microglía cultivada en tratamiento con IL-33 (figuras 26B-26D). Estos resultados indican que la señalización de ST2 en microglía media la potenciación asociada a IL-33 de fagocitosis de Ap en el cerebro de ratones APP/PS1.
Ejemplo 8: IL-33 potencia la actividad de degradación de Ap en ratones APP/PS1.
Puede degradarse Ap soluble por enzimas que degradan Ap, incluyendo neprilisina y enzima de degradación de insulina. Se administró i.p. IL-33 a ratones APP/PS1 (10 meses de edad) durante 2 días. Se recogieron las cortezas para análisis de inmunotransferencia de tipo Western para determinar la expresión de neprilisina (NEP) y enzima de degradación de insulina (IDE).
Datos presentados en las figuras 8A-8C muestran que mientras que se observó una expresión reducida de neprilisina en los cerebros de ratones APP/PS1 (figura 8A), la administración de IL-33 aumentó la expresión de la proteína neprilisina (NEP) (figura 8B), pero no la expresión de enzimas de degradación de insulina (IDS) (figura 8C), en ratones APP/PS1. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la administración de IL-33 mitiga la patología de placa amiloide en ratones APP/PS1 a través de la potenciación del aclaramiento de Ap, probablemente aumentando los niveles de neprilisina.
Ejemplo 9: El tratamiento combinatorio de IL-33 y la memantina en ratón atenúa el deterioro sináptico mediado con Ap de corte de hipocampo fino.
Para investigar si el tratamiento conjunto de IL-33 y memantina ejerce efectos sinérgicos para aliviar el deterioro sináptico durante la progresión de EA, se administró conjuntamente 1 mg/kg/día de memantina (mediante administración oral) y 50 ng/día de IL-33 a través de (administración i.p.) a ratones C57. Anteriormente, se determinó que se requería administrar una dosis de IL-33 de al menos 200 ng/día para rescatar el deterioro de LTP en ratones APP/PS1.
Después de 2 días de tratamiento conjunto, se prepararon cortes de hipocampo a partir del cerebro de ratón tratado y se sometieron a análisis de LTP. Específicamente, los cortes de hipocampo aislados se rejuvenecieron en tampón oxigenado durante 2 h y después se incubaron con Ap 500 nM durante 2 h antes de la estimulación con LTP. Los resultados se presentan en la figura 9 y las figuras 35A-35B indican que el tratamiento de combinación de IL-33 y memantina tuvo un efecto sinérgico en el rescate del deterioro de LTP en comparación con el tratamiento con memantina sola.
Ejemplo 10: IL-33 modula la firma de transcriptoma de microglía en ratones APP/PS1.
Se inyectó i.p. IL-33 o vehículo de control (Con) a ratones WT y APP/PS1 (12 meses de edad) durante 2 días (n = 2 por grupo). El ARN total de microglía de la corteza de ratón se extrajo y se sometió a secuenciación de ARN de baja entrada para identificar firmas de transcriptoma.
Las figuras 10A-10C muestran que IL-33 altera la firma de transcriptoma de microglía en ratones APP/PS1. Las redes correspondientes de genes regulados positivamente en cada conjunto de genes se clasificaron según la base de datos STRING. Los resultados se indican en las figuras 10D-10O. Se muestran las seis redes principales en respuesta a IL-33 en microglía de ratones APP/PS1: homeostasis de colesterol (figuras 10D y 10G); señalización de IL-6/JAK/STAT3 (figuras 10E y 10H); respuesta de IFN-a (figuras 10F y 10I); respuesta de IFN-y (figuras 10J y 10M); fase G2M del ciclo celular (figuras 10K y 10N); y respuesta de TNF-a (figuras 10L y 10O). El análisis también mostró que IL-33 aumenta la transcripción de receptores de Ap, específicamente, receptor 2 de tipo Toll (TLR2) (figura 10P), receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR) (figura 10Q), y receptor 1 depurador de macrófagos (MSR1) (figura 10R).
Ejemplo 11: La concentración de ST2 soluble aumenta en sueros de pacientes con DCL.
Los niveles de ST2 soluble (sST2) (ng/ml) se midieron en suero obtenido de pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA) y deterioro cognitivo leve (DCL), así como controles sanos, usando el kit de ELISA de ST2 humana (R&D systems). Los resultados presentados en la figura 11 y figura 27A muestran niveles aumentados de sST2 en sueros de pacientes con DCL en comparación con los sueros de pacientes con EA y controles.
Ejemplo 12: ST2 soluble y expresión de ARNm de ST2 anclado a membrana aumentan en cortezas de ratones APP/PS1.
La expresión de ARNm de sST2 y la forma anclada a membrana de ST2 (ST2L) en la corteza de ratón de ratones APP/PS1 de tipo silvestre (12 meses de edad) se examinaron por PCR cuantitativa. Los datos presentados en la figura 12 muestran que tanto sST2 como ST2L se elevaron en las cortezas de ratones APP/PS1.
Materiales y métodos para los ejemplos 13-21
Reactivos. La IL-33 recombinante de ratón (mIL-33) (n.° 580506) se obtuvo de BioLegend. La IL-33 recombinante humana (hIL-33) (n.° 581802) se obtuvo de BioLegend. La proteína recombinante sST2-Fc (1004-MR-050) y el kit de ELISA Quantikine de ST2/IL-1 R4 (DST200) se adquirieron de R&D Systems. Anticuerpos específicos para iL-33 (clon Nessy-1, ab54385) y APP (clon DE2B4, ab11132) se adquirieron de Abcam; anticuerpo de Iba1 (019-19741) fue de Wako; anticuerpo conjugado con APC contra CD11b (clon M1/70) y anticuerpo conjugado con FITC contra CD45 (clon 30-F11) fueron de eBioscience; anticuerpo de CD68 (FA-11) fue de AbD Serotec; anticuerpo 4G8 monoclonal (reconoce AP17-24; SIG-39220) para inmunohistoquímica y anticuerpo 6E10 (reconoce AP1-16, SIG-39320) para el análisis de inmunotransferencia de tipo Western fueron de Covance; P-p38 (n.° 4511), p38 (n.° 9212), P-ERK1/2 (n.° 4377), y anticuerpos ERK1/2 (n.° 9102) fueron de Cell Signaling Technology; anticuerpo contra actina (clon AC-40; A4700) fue de Sigma-Aldrich. La fluoresceína-beta-amiloide (1-42) (A-1119-1) fue de rPeptide; metoxi-x04 (n.° 4920) fue de Tocris Bioscience; DAB fue de DAKO, Hoechst 34580 (H21486), APx-40 humano (KHB3481), y kits de ELISA comerciales de APx-42 (KHB3441) (ENZ-KIT140-0001), y los anticuerpos secundarios Alexa Fluor fueron de Life Technologies; y el kit de ELISA de histamina se obtuvo de Enzo.
Preparación de fluorescema-Aft-42 oligomérica. Se disolvió AP1-42 monomérico en DMSO seco y se diluyó en medio F-12 sin rojo fenol enfriado con hielo hasta una concentración final de 100 |iM. La disolución de fluoresceína-Ap1-42 se incubó a 4 °C durante 24 h y después se centrifugó a 14.000 x g durante 10 min. El sobrenadante se congeló en nitrógeno líquido como alícuotas y se almacenó a -20 °C durante hasta 1 mes.
Sujetos humanos. Todos los casos incluyeron pacientes chinos Han. El diagnóstico clínico se estableció según los criterios del Instuto Nacional de Trastornos Neurológicos y Comunicativos y Accidentes Cerebrovasculares/Asociación de Trastornos Relacionados y Enfermedad de Alzheimer. Los casos de deterioro cognitivo leve (DCL) humano se obtuvieron de clínicas ambulatorias o de hospitalización en el departamento de neurología, segundo hospital afiliado de la Universidad de Medicina de Zhejiang, y el grupo de control sin demencia se seleccionó del centro de examen médico desde 2014-2015.
También se registraron datos sobre edad, sexo, educación, historial médico y antecedentes familiares (figura 27). Se recogieron los sueros de 17 controles sanos (NC) y 18 pacientes con DCL de sexo mixto. Los pacientes con NC y DCL seleccionados eran > 60 años de edad. Se excluyeron pacientes con otros trastornos neurológicos o psiquiátricos o afecciones médicas clínicamente significativas. Ningún paciente tuvo antecedentes de traumatismo craneal, abuso de alcohol o drogas. Este estudio fue aprobado por los Comités de ética institucional del segundo hospital afiliado de la Universidad de Medicina de Zhejiang y la Universidad de ciencia y tecnología de Hong Kong. El consentimiento informado para la participación en este estudio se obtuvo directamente o de un tutor legal.
Ratones. Los ratones doble transgénicos APP/PS1, que se generaron incorporando una construcción de APP humana/de ratón que portaba la mutación doble sueca y la mutación PSEN1 de exón 9 eliminado (APPswe PSEN1/dE9), se obtuvieron del Jackson Laboratory (B6C3-Tg[APPswe, PSEN1dE9]85Dbo/J). La generación de ratones 5XFAD que sobreexpresan las mutaciones K670N/M671L (Sueca), I716V (Florida), y V717I (Londres) en APP humana (695), así como las mutaciones M146L y L286V en PS1 humana se han descrito previamente (Oakley, H. et al. J. Neurosci. 26(40): 10129-10140 (2006)). Los ratones 5XFAD fueron amablemente proporcionados por el Dr. Sookja Kim Chung (Universidad de Hong Kong). Se obtuvieron ratones St2'/_ del Dr. Andrew McKenzie (Xu, D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(31):10913-10918 (2008)). Se confirmaron genotipos mediante análisis por PCR de biopsias de cola u orejas. Se obtuvieron ratones C57BL/6 de tipo silvestre de Jackson Laboratory.
Todos los ratones se alojaron en las instalaciones de cuidado de animales y plantas de la Universidad de ciencia y tecnología de Hong Kong (HKUST). Todos los experimentos con animales se aprobaron por el Comité de ética animal de la HKUST. Se alojaron ratones del mismo sexo 4 por jaula con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y comida y agua ad libitum. Todos los experimentos in vivo se realizaron en grupos emparejados por sexo y edad. Se usaron ratones de ambos géneros para experimentos. Los ratones se asignaron aleatoriamente a las condiciones experimentales. Se eligieron principalmente tamaños de muestra en base a la experiencia con tipos similares de experimentos. Todos los experimentos con animales se realizaron en la fase de luz.
Experimentos in vivo. Se inyectó i.p. IL-33 recombinante de ratón (200 ng por ratón) en ratones de 6-25 meses de edad. Para estudios de carga de placa amiloide, fagocitosis microglial de Ap, expresión de ARNm y LTP, se inyectó IL-33 a los ratones durante 2 días consecutivos. Los potenciales postsinápticos excitadores de campo se registraron usando un sistema de registro multicanal MED64 (Panasonic International Inc.). Para pruebas conductuales, se inyectó i.p. IL-33 a los ratones como se indica en la figura 13 y la figura 14A. La prueba de campo abierto y condicionamiento por miedo contextual se realizaron como se describió anteriormente (Sananbenesi, F. et al., Nat. Neurosci. 10(8):1012-1019 (2007); Ip, FC. et al. Neuropsychopharmacology 40(8):1877-1887 (2015)). Se suministró ST2 soluble (sST2) a ratones APP/PS1 a través de minibombas osmóticas (modelo 1004, Alzet) a 0,11 |il/h. Las minibombas osmóticas se ajustaron por vía intracerebroventricular en el hemisferio derecho. Las bombas se cargaron con proteína sST2 recombinante de ratón (240 ng por bomba; 10 |ig/ml) o con vehículo en líquido cefalorraquídeo artificial (aLCR; NaCl 119 mM, KCl 2,5 mM, C a C h ^ O 2,5 mM, NaH2PO4'2H2O 1 mM, M g C h ^ O 1,3 mM, NaHCOa26,2 mM, d-glucosa 11 mM). Después de 2 días de administración de sST2, se administró i.p. IL-33 a ratones durante 2 días más. Al final del tratamiento, los ratones se sacrificaron y los cerebros se fijaron con paraformaldehído al 4 %.
LTP. En resumen, se sacrificaron ratones, y se resecaron inmediatamente cerebros completos y se sumergieron en aLCR enfriado con hielo suplementado con el 95 % de O2/5 % de CO2. A continuación, se prepararon cortes de cerebro (300 |im) usando un vibratomo (HM650V, Thermo) y se sumergió en aLCR oxigenado durante 2 h a 32 °C. Los cortes de hipocampo de ratón se colocaron en una polietilenimina previamente recubierta (Sigma-Aldrich) en una sonda MED-P210A (Panasonic International Inc.) fabricadas con matrices de electrodos 8 x 8 (20 x 20 |im, óxido de indio y estaño y negro de platino) con una distancia entre electrodos de 100 |im. Se colocaron manualmente electrodos en la región CA3-CA1 bajo un microscopio (MIC-D, Olympus). Cada corte se sumergió y se sobrefundió con aLCR oxigenado a 1,3-1,5 ml/min. Se registraron potenciales postsinápticos excitadores de campo (fEPSP) a partir de la capa dendrítica de neuronas CA1 seleccionando un electrodo en la ruta colateral de Schaffer como electrodo de estimulación. En base a la curva de estímulo-respuesta, se seleccionó una intensidad de estimulación que suscitó un 30-40 % de fEPSP de la respuesta máxima. Se indujo LTP por 3 trenes de estimulación de alta frecuencia (100 Hz durante 1 s administrados separados 30 s). La respuesta de potencial de campo después del tétanos se registró durante 60 min. La magnitud de LTP se cuantificó como el cambio porcentual en la pendiente promedio del fEPSP durante 60 minutos después de la inducción de LTP.
Prueba de campo abierto. La actividad locomotora de los ratones en la prueba de campo abierto se registró y se rastreó usando el sistema y software de actividad de haz de fotones (San Diego Instruments). En resumen, se colocaron ratones experimentales en el centro de una cámara superior abierta (16 x 16 x 15 pulgadas) con una matriz de haces de fotones alrededor de la periferia. Se permitió a los ratones explorar la cámara durante 15 minutos cada día durante 3 días consecutivos. La actividad locomotora en los 3 ensayos de entrenamiento se registró por los haces de fotones, y la distancia movida se determinó posteriormente. La cámara se limpió con etanol al 70 % después de cada prueba.
Condicionamiento por miedo contextual. El día del entrenamiento, se permitió a los ratones explorar en una cámara de entrenamiento cerrada con suelo cableado a un generador de descarga eléctrica durante 180 s. Los ratones se expusieron luego a un tono puro durante 30 s, seguido de una descarga de 2 s en las patas (0,8 mA). 60 s después de llevarse a cabo la segunda descarga, los ratones se devolvieron a sus jaulas de alojamiento. La respuesta al miedo (congelación) se evaluó 1 y 7 días después de la descarga eléctrica. Los ratones volvieron a exponerse en la cámara original durante 5 min y el tiempo de congelación se midió mediante el sistema Contextual NIR Video Fear Conditioning System (Med Associates Inc.).
Inmunohistoquímica. Se usaron criosecciones coronales (20 |im) de cerebros de ratón perfundidos para inmunohistoquímica. Para inmunotinción 4G8, se realizó recuperación de antígeno calentando con microondas las secciones en tampón de citrato de sodio (citrato trisódico 10 mM, Tween-20 al 0,5 % en H2O, pH 6,0) durante 10 min seguido de incubación con H2O2 al 3 % en H2O durante 5 min para inhibir la actividad de peroxidasa endógena. Las secciones se bloquearon con suero de cabra al 2 % en solución salina tamponada con Tris durante 20 minutos y luego se marcaron con anticuerpo 4G8 (dilución 1:500) en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C. Las secciones se marcaron luego con un anticuerpo de IgG de conejo/anti-ratón de cabra ligado a HRP de Dako durante 50 minutos a temperatura ambiente y se desarrollaron con un kit de cromógeno DAB de Dako. Se realizó obtención de imágenes usando un sistema de microscopio compuesto Leica DM6000 B. El área de placas Ap en la corteza de las secciones de cerebro se analizó mediante la función “Analizar partículas” de Image J (Institutos Nacionales de Salud). La región de la corteza usada para el análisis de placa amiloide estaba por encima del hipocampo. Se analizaron tres secciones de cerebro por ratón (-200-300 |im de separación), y se calculó el porcentaje promedio de área cortical ocupada por placas amiloides.
Para examinar la colocalización de placas amiloides y microglía, las secciones de cerebro se bloquearon con albúmina de suero bovino al 1 %, suero de cabra al 4 % y Triton X-100 al 0,4 % en DPBS durante 30 min a temperatura ambiente y después se incubó con anticuerpos de Iba1 (dilución de 1:500) y 4G8 (dilución de 1:1000) durante la noche a 4 °C. Se realizó obtención de imágenes usando un sistema confocal Leica TCS SP8.
Para determinar la penetrabilidad de barrera hematoencefálica de IL-33, se inyectó i.p. IL-33 (200 ng) en DPBS o DPBS solo a ratones APP/PS1 de 11 meses de edad. Se recogieron cortezas y sueros de ratón para ELISA de IL-33.
Extracción de Ap, análisis de inmunotransferencia de tipo Western y ELISA. Se extrajo secuencialmente Ap de las fracciones solubles e insolubles de la corteza de ratón. Se lisaron tejidos cerebrales congelados en tampones de lisis indicados con diversos inhibidores de proteasa. Brevemente, la corteza de ratón se homogeneizó en tampón que contenía sacarosa 250 mM, Tris-HCl 20mM (pH 7,4), EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, y cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich) o en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación. Se realizó cuantificación densitométrica de intensidad de banda de proteína del análisis de inmunotransferencia de tipo Western usando el programa NIH ImageJ. Se extrajo Ap soluble secuencialmente por dietilamina (soluble) seguido de ácido fórmico (insoluble). Se determinaron niveles de Ap soluble e insoluble usando análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se analizaron APx-40 y APx-42 solubles mediante ELISA.
Aislamiento de microglía de ratón. Se anestesiaron ratones adultos y se perfundieron con DPBS enfriado con hielo. Las cortezas aisladas se cortaron en trozos pequeños y se disociaron enzimática y mecánicamente usando un kit de disociación neural basado en papaína (130-092-634, Miltenyi Biotec) con un sistema disociador de MACS suave (Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante. Se usó gradiente de Percoll (30 %, Sigma-Aldrich) para retirar la mielina. Las suspensiones de células mononucleares resultantes se usaron para el análisis de citometría de flujo o la configuración de cultivos de microglía. La pureza del aislamiento de microglía/monocitos infiltrantes fue rutinariamente >90 % según lo determinado por tinción de fluorescencia para CD11b y análisis de citometría de flujo.
Análisis de fagocitosis microglial de Ap. Para análisis in vivo, el experimento se realizó como se describe (Zhang, GX, et al., Exp. Mol. Pathol. 73(1):35-45 (2002)). Se inyectó i.p. IL-33 a ratones APP/PS1 o WT (17 meses de edad) en PBS o PBS solo diariamente durante 2 días consecutivos. Al día siguiente, se inyectó i.p. metoxi-X04 (10 mg/kg) a ratones. Los ratones se anestesiaron profundamente 3 h después de la inyección de metoxi-X04 y se perfundieron en el ventrículo izquierdo con PBS enfriado con hielo. Se incubaron entonces suspensiones de células mononucleares aisladas de la corteza cerebral de ratón con un reactivo de bloqueo de FcR de ratón (Miltenyi Biotec) y se marcaron con anticuerpos de CD11b de ratón conjugado con APC (dilución 1:100) y CD45 conjugado con FITC (dilución 1:100) y se analizaron mediante un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSAria IIIu. Se identificaron células mieloides como células CD11b+ y se clasificaron además como microglía o monocitos infiltrantes por expresión baja (CD11b+CD45baja) y alta (CD11b+CD45alta) de CD45, respectivamente.
Para el ensayo de fagocitosis microglial in vitro, se prepararon células de microglía a partir de ratones St2+/+ o St2'/_ (1,5-2 meses de edad) y se cultivaron durante 6-7 días in vitro. Las células se pretrataron luego con IL-33 durante 20 h seguido de fluoresceína-Ap1-42 (2 |iM) durante 1 h. Las células se fijaron luego con paraformaldehído y se sometieron a inmunotinción con anticuerpo de Iba1 y Hoechst 34580. Se realizó microscopía de fluorescencia de campo amplio usando un sistema IN Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare). Se adquirieron imágenes en 16 posiciones correspondientes asignadas por el software en cada pocillo. Se aplicó segmentación de intensidad a cada canal usando los mismos criterios de umbral en diferentes muestras. Los límites de microglía se determinaron según la intensidad de marcaje Iba1+, y se cuantificó fluoresceína-AP1-42 en cada célula Iba1+. El área de fluoresceína-AP1-42 fagocitada se dividió por el área celular correspondiente para obtener el área relativa de fluoresceína-AP1-42 en una célula dada.
PCR digital de gotas (ddPCR) y RT-qPCR. Para ddPCR, se extrajo ARN de cortezas de ratón usando TRIzol (Invitrogen) y el kit RNeasy Mini (Qiagen) y se cuantificó usando un espectrofotómetro de microvolumen BioDrop |iLITE (BioDrop), y se transcribieron inversamente cantidades equivalentes de ARN usando un kit PrimeScript RT-PCR (TaKaRa). Se realizó ddPCR según el protocolo del fabricante (Bio-Rad). Los números de copias para muestras se promediaron entre duplicados. Los números de copias de genes diana se normalizaron a los de GAPDH o p-actina. Para RT-qPCR, se amplificó previamente ADNc después de RT usando TaqMan PreAmp Master Mix (Invitrogen). La amplificación por PCR y la detección en tiempo real de productos de PCR se realizaron usando el ensayo de expresión génica TaqMan (Applied Biosystems) y el ensayo de qPCR Premix Ex Taq (TaKaRa). Se realizaron PCR en un volumen total de 20 |il que contenía 2 |il de producto amplificado previamente. Los valores de expresión de ARNm se normalizaron al nivel de CD11b. Se usaron las siguientes sondas TaqMan: NLRP3 (Mm00840904_m1), IL-1 p (Mm01336189_m1), IL-6 (Mm00446190_m1), IL-13 (Mm00434204_m1), TGFp (Mm01178820_m1), GAPDH (Mm99999915_g1), p-actina (Mm02619580_g1), ST2 total (Mm00516117_m1), Fizz1 (Mm00445109_m1), Arg1 (Mm00475988_m1) y CD11b (Mm00434455_m1).
Análisis estadístico. Los investigadores que realizaron la expresión de ARN, electrofisiología, inmunohistoquímica y análisis de citometría de flujo y las pruebas conductuales fueron ciegas en cuanto a los genotipos de los ratones y las condiciones de tratamiento. Todos los datos se expresan como media aritmética EEM, excepto el nivel sérico de sST2 humana. Se realizaron análisis estadísticos usando GraphPad Prism versión 6.0. La significación de diferencias se evaluó mediante prueba de la t de Student independiente, o ANOVA unidireccional o bidireccional por la prueba a posteriori de Bonferroni como se indica. El nivel de significación se estableció en p < 0,05. Se registraron niveles de ST2 solubles para sujetos NC y pacientes con DCL, con análisis de datos realizados usando R (versión 3.2.2). La prueba de Shapiro-Wilk se usó para evaluar la normalidad de las mediciones continuas. Comparaciones estadísticas de los niveles de ST2 se compararon en los dos grupos de sujetos usando una prueba de la t de dos muestras.
Ejemplo 13: Ratones APP/PS1 tratados con IL-33 exhiben una habituación mejorada en la prueba exploratoria de campo abierto (OF) de 3 días.
En la prueba exploratoria de campo abierto (OF), los ratones WT inyectados con vehículo e inyectados con IL-33 exhibieron una capacidad de habituación similar en entornos de prueba novedosos durante el curso de entrenamiento de 3 días. Datos presentados en la figura 13 muestra que los ratones APP/PS1 exhibieron una habituación más lenta al entorno de prueba que los ratones WT; sin embargo, los ratones APP/PS1 tratados con IL-33 mostraron una habituación significativamente mejorada al entorno de pruebas.
Ejemplo 14: El tratamiento con IL-33 revierte déficits de memoria contextual en ratones APP/PS1.
La formación de memoria y las capacidades de recuperación de ratones APP/PS1 tratados con IL-33 se evaluaron usando la prueba de condicionamiento por miedo contextual (FC) evaluando la respuesta de congelación de los ratones 1 día y 7 días después de la administración de descarga eléctrica (figuras 14A-14D). Los ratones de diferentes grupos experimentales no exhibieron ninguna diferencia significativa en la respuesta de congelación inmediatamente después de la descarga eléctrica (figura 14B). En comparación con los ratones WT, los ratones APP/PS1 exhibieron un comportamiento de congelación reducido en 1 día y 7 días después de la descarga eléctrica, lo que indica una recuperación contextual deteriorada de la memoria por miedo (figuras 14C-14D). Mientras que los ratones APP/PS1 tratados con IL-33 no exhibieron una mejora en el rendimiento de congelación 1 día después de la descarga eléctrica (figura 14C), el tratamiento con IL-33 fue capaz de restaurar la respuesta de congelación alterada de los ratones APP/PS1 a los 7 días después de la descarga eléctrica (figura 14D).
Ejemplo 15: El tratamiento con IL-33 mejoró la patología de placa amiloide en ratones APP/PS1.
Dos días después del tratamiento con IL-33, las placas amiloides marcadas con 4G8 se redujeron significativamente en las cortezas de ratones APP/PS1 de 12 meses de edad (figura 15A-15B). De manera importante, la administración intracerebroventricular de sST2 suprimió la reducción mediada por IL-33 de placas amiloides teñidas con 4G8 en los ratones APP/PS1 (figuras 15A-15B), demostrando la especificidad de la activación central de las células mieloides de señalización de IL-33/ST2 para mejorar la patología amiloide cerebral. La administración de IL-33 durante dos días también redujo las placas amiloides teñidas con 4G8 en ratones 5XFAD, otro modelo de ratón transgénico (figuras 22A-22B).
Ejemplo 16: IL-33 aumenta la expresión de CD68 en placas AB.
CD68, una glicoproteína transmembrana de la familia de glicoproteínas de membrana asociadas a lisosoma/endosoma, actúa como un receptor depurador para la aclaramiento de residuos. En ratones APP/PS1, las agolpamientos de células mieloides Iba1 que rodeaban placas amiloides exhibieron distribución difusa de CD68 (figura 16A). La administración de IL-33 aumentó la expresión de CD68 en células mieloides Iba1 que estaban en contacto estrecho con placas amiloides (figura 16B). Estos hallazgos sugieren que la administración de IL-33 aumenta la absorción de Ap fagocítica por células mieloides.
Ejemplo 17: IL-33 impulsa la microglía a un estado de activación alternativo en ratones APP/PS1.
Las respuestas inflamatorias en el cerebro desempeñan un papel importante en la patología de EA. La polarización microglial se asocia con la respuesta inmunitaria en el SNC. La expresión de ARNm de Arg1 y Fizzl, que están asociados con la acción antiinflamatoria, se aumentó significativamente en células mieloides CD11b+ aisladas de cerebros de ratón WT y APP/PS1 después de la administración de IL-33 (figuras 17A-17B). Estos resultados sugieren que IL-33 impulsa microglía/macrófagos en los cerebros de ratón APP/PS1 hacia un fenotipo de activación alternativo, lo que puede contribuir a funciones neuroprotectoras.
Ejemplo 18: IL-33 suprime genes proinflamatorios en ratones APP/PS1.
IL-33 puede mejorar la inflamación global en las cortezas cerebrales de ratones APP/PS1. En los ratones APP/PS1, genes proinflamatorios que incluyen IL-1 p, IL-6 y NLRP3 (familia de receptores tipo NOD, que contiene l dominio de pirina 3, un componente clave en la cascada de inflamasoma) estaban significativamente en la corteza cerebral (figuras 18A-18C). La administración de IL-33 suprimió el aumento de la expresión de estos genes proinflamatorios (figuras 18A-18C). Estos resultados sugieren que IL-33 regula respuestas inflamatorias en el cerebro de ratón APP/PS1. Ejemplo 19: IL-33 alcanza el cerebro 30 minutos después de la inyección intraperitoneal en ratones APP/PS1.
Se inyectó i.p. IL-33 (200 ng) a ratones APP/PS1 (11 meses de edad) durante 30 minutos. Los niveles de IL-33 en las cortezas (figura 19A) y plasma (figura 19B) se midieron mediante ELISA. IL-33 alcanzó el cerebro 30 minutos después de inyección i.p. (figura 19A), coherente con hallazgos anteriores de una barrera hematoencefálica comprometida tanto en ratones APP/PS1 como en pacientes con EA.
Ejemplo 20: IL-33 no afecta a los niveles de histamina en plasma en ratones APP/PS1.
Se inyectó i.p. IL-33 de ratón (200 ng) o control de vehículo a ratones WT y APP/PS1 (8 meses de edad) durante dos días consecutivos. El nivel de histamina en plasma se determinó mediante ELISA. A la concentración usada (200 ng i.p. diariamente durante 2 días), IL-33 no afectó los niveles plasmáticos de histamina en ratones o bien WT o bien APP/PS1 (figura 20).
Ejemplo 21: IL-33 reduce el contenido de AB soluble en ratones APP/PS1.
Se inyectó i.p. IL-33 (200 ng) a ratones APP/PS1 (25 meses de edad) tres veces durante 7 días. Resultados de un análisis de inmunotransferencia de tipo Western, mostrados en la figura 21, demuestran que la inyección de IL-33 redujo las cantidades de Ap soluble en las cortezas de ratones APP/PS1 de 25 meses de edad.
Ejemplo 22: Ruta de administración de mIL-33 en ratones APP/PS1.
Materiales y métodos. Se inyectó IL-33 a ratones APP/PS1 (8-9,5 meses de edad) (200 ng en 300 |il/ratón/día) a través o bien de inyección i.p. o bien de inyección subcutánea (s.c.; 200 ng en 500 |il/ratón/día). Para potenciar la eficiencia de absorción de IL-33 a través de inyección s.c., se administró IL-33 en 3 sitios para cada inyección (la parte lumbar y los dos lados del hombro). Después de dos días consecutivos de inyección, la mitad del cerebro de ratón se sometió a análisis de potenciación a largo plazo (LTP) en sinapsis de CA1 colateral de Schaffer en el hipocampo. En resumen, los cortes de hipocampo de ratón se colocaron en una sonda MED-P210A (Panasonic International Inc.) fabricadas con matrices de electrodos de 8 x 8. Se colocaron manualmente electrodos en la región CA3-CA1, y se registraron potenciales postsinápticos excitadores de campo (fEPSP) a partir de la capa dendrítica de neuronas CA1. Se indujo la LTP por 3 trenes de estimulación de alta frecuencia (100 Hz durante 1 s administrados separados 30 s). La respuesta de potencial de campo después del tétanos se registró durante 60 min. La otra mitad de la corteza de ratón se usó para examinar los niveles de Ap. Se extrajo secuencialmente Ap de las fracciones solubles e insolubles de la corteza de ratón usando dietilamina y ácido fórmico, respectivamente.
Resultados. Los datos muestran que la administración s.c. de IL-33 mejoró la patología amiloide (figuras 28A-28B) y rescató la deterioro sináptico en ratones APP/PS1 (figuras 29A-29B).
Ejemplo 23: Durabilidad de IL-33 en ratones APP/PS1.
Materiales y métodos. Para estudiar el potencial terapéutico de IL-33 en EA, se realizó un tratamiento de 3 semanas de IL-33 (200 ng; administración i.p.) en ratones WT y APP/PS1 (13 meses de edad). El paradigma de tratamiento de IL-33 se muestra en la figura 30. Durante el curso de tratamiento, se evaluaron los efectos beneficiosos de IL-33 sobre los déficits conductuales en ratones APP/PS1 usando pruebas conductuales que incluyen la prueba exploratoria de campo abierto (OF) y la prueba de construcción de nido (NB) (figura 30). Después de las pruebas, los ratones se sacrificaron para análisis inmunohistoquímico o análisis de expresión de genes inflamatorios.
Para la prueba de OF, la actividad locomotora de los ratones se registró y se rastreó usando el sistema y software de actividad de haz de fotones (San Diego Instruments). Se colocaron ratones experimentales en el centro de una cámara superior abierta y se les permitió explorar la cámara durante 15 minutos cada día durante 3 días consecutivos. La actividad locomotora en los 3 ensayos de entrenamiento se registró por los haces de fotones, y la distancia movida se determinó posteriormente. Para la prueba de NB, los ratones se alojaron individualmente en nuevas jaulas de plástico con aproximadamente 1 cm de lecho de mazorca de maíz que recubría el suelo. Antes del inicio de la fase de oscuridad del ciclo de iluminación, a cada ratón se le suministró un cuadrado de algodón prensado anidado (~3 g cada uno). La construcción de nido anidada se puntuó el día 1 usando una escala de 5 puntos (1 indica un >90 % de anidado intacto, y 5 indica un anidado rasgado >90 % y un cráter de nido limpio). Todas las pruebas se realizaron durante la fase de luz.
Para examinar la carga de placa amiloide, se seccionaron criosecciones coronales de 20 |im de grosor de cerebros de ratones perfundidos y se sometieron a inmunotinción 4G8 (anticuerpo de Ap). La recuperación de antígeno se realizó calentando con microondas las secciones en tampón de citrato de sodio seguido de incubación con H2O2 al 3 % en H2O durante 5 minutos para inhibir la actividad de peroxidasa endógena. Las secciones se marcaron luego con anticuerpo 4G8 (dilución 1:500) seguido de un anticuerpo de IgG anti-ratón de cabra ligado a Dako HRP y desarrollado con un kit de cromógeno DAB de Dako. Se realizó obtención de imágenes usando un sistema de microscopio compuesto Leica DM6000 B. El área de placas Ap en la corteza de las secciones de cerebro se analizó mediante la función “Analizar partículas” de Image J (Institutos Nacionales de Salud). El área de la corteza usada para el análisis de placa amiloide fue la región por encima del hipocampo. Se sometieron a análisis tres secciones de cerebro por ratón (con ~200-300 |im de separación), y se calculó el porcentaje promedio de área cortical ocupada por placas amiloides.
Para el análisis de qPCR en tiempo real, se amplificó previamente ADNc después de la RT usando TaqMan PreAmp Master Mix (Invitrogen). La amplificación por p Cr y la detección en tiempo real de productos de PCR se realizaron usando el ensayo de expresión génica TaqMan (Applied Biosystems) y el ensayo de qPCR Premix Ex Taq (TaKaRa). Se realizaron PCR en un volumen total de 20 |il que contenía 2 |il de producto amplificado previamente. Los valores de expresión de ARNm se normalizaron al nivel de p-actina.
Resultados. Los ratones APP/PS1 mostraron un mejor rendimiento en las pruebas conductuales después de la inyección de IL-33 (figuras 31A- 31B). Los ratones APP/PS1 administrados con IL-33 mostraron una tendencia a un rendimiento mejorado en las dos pruebas conductuales (es decir, pruebas de OF y NB) en comparación con ratones APP/PS1 tratados con DPBS (Con) (figuras 31A-31B). El tratamiento crónico de IL-33 también mejoró la carga de placa amiloide en ratones APP/PS1 (figuras 32A-32B). Además, IL-33 moduló la inflamación global reduciendo la expresión de genes inflamatorios en las cortezas cerebrales de ratones APP/PS1 (figuras 33A-33C).
Ejemplo 24: Eficacia de IL-33 humana en ratones APP/PS1.
Materiales y métodos. Para examinar si la IL-33 humana (hIL-33) ejerce un efecto beneficioso similar al de la IL-33 de ratón en eA, se usaron ratones APP/PS1 de 8-9,5 meses de edad. En particular, la hIL-33 recombinante obtenida de BioLegend (581802) se administró en ratones WT o APP/PS1 a través de inyección i.p. (200 ng en 300 |il/ratón/día) durante dos días consecutivos. Se diseccionaron hipocampos y se sometieron a análisis de LTP en sinapsis de CA1 colateral de Schaffer en el hipocampo. La LTP se indujo por 3 trenes de estimulación de alta frecuencia (100 Hz durante 1 s administrados separados 30 s).
Resultados. Los datos presentados en las figuras 34A-34B muestran que la hIL-33 mostró bioactividad de mejora del déficit sináptico en ratones APP/PS1.
Conclusión
Los hallazgos dados a conocer en el presente documento ilustran que los métodos y composiciones dados a conocer en el presente documento son eficaces para el tratamiento o prevención de enfermedades o afecciones resultantes de, causadas por, o asociadas de otro modo con neurodegeneración y/o neuroinflamación.
Equivalentes
La presente tecnología no debe limitarse en términos de las realizaciones particulares descritas en esta solicitud, que pretenden ser ilustraciones únicas de aspectos individuales de la presente tecnología. Tales modificaciones y variaciones están destinadas a encontrarse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. La presente tecnología

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto que lo necesita que comprende una cantidad eficaz de una composición que comprende IL-33 y memantina, en la que el tratamiento comprende aumentar la transcripción de un receptor Ap en el sujeto.
  2. 2. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que la IL-33 es una proteína IL-33 recombinante.
  3. 3. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que la proteína recombinante IL-33 comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 85 % de identidad con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.
  4. 4. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que la proteína recombinante IL-33 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, un polipéptido que tiene al menos el 85 % de identidad con s Eq ID NO: 1, y un polipéptido que tiene al menos el 85 % de identidad con SEQ ID NO: 2.
  5. 5. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que la dosificación terapéuticamente eficaz de IL-33 en la composición es de 0,000001 mg a 0,001 mg por kilogramo de peso corporal por día.
  6. 6. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que el receptor Ap comprende un receptor 2 de tipo Toll (TLR2), un receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR) o un receptor 1 depurador de macrófagos (MSR1).
  7. 7. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía intracerebroventricular, por vía intratecal, por vía oral, mediante inhalación, por vía transdérmica o por vía transmucosa.
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