ES2883837T3 - Composiciones y métodos para inmunomodulación de anti-LYST - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para uso en un método para reducir infiltración de macrófagos, formación de cicatrices, o estenosis en un sitio de implante de injerto en un sujeto que comprende: a) uno o más inhibidores del regulador del tráfico lisosomal (LYST) en una cantidad eficaz para reducir infiltración de macrófagos, activación de linfocitos citolíticos naturales, y/o activación plaquetaria en el sujeto, y b) un vehículo fisiológicamente aceptable, en donde la composición se administra al sujeto antes de una cirugía, en el momento de una cirugía, y/o en los días posteriores a una cirugía, y en donde la cantidad de uno o más inhibidores de LYST está entre 0,1 y 1000 mg/kg de peso corporal de un ser humano y no previene la curación de heridas.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para inmunomodulación de anti-LYST

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIAS CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de la invención se refiere generalmente a composiciones, dispositivos y métodos para mejorar la regeneración del tejido vascular, así como para reducir la morbilidad y la mortalidad asociadas a hiperplasia de la capa neoíntima y enfermedad fibroproliferativa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La reparación tisular es un proceso complejo y gradual que facilita la retirada ordenada y el reemplazo de las células muertas o dañadas como respuesta a la señalización de citoquinas estimuladoras de células proinflamatorias locales en el sitio de la lesión (Wynn y Baron, Semin Liver Dis., 30(3): 245-257 (2010); Wynn, Clin. Invest. 117: 524-529 (2007)). Sin embargo, cuando las respuestas de la reparación tisular son inapropiadas o persisten durante un periodo de tiempo prolongado, por ejemplo, como respuesta a una enfermedad crónica o una lesión repetida, los mecanismos regenerativos normales pueden dar lugar a estados patológicos que resultan de un crecimiento excesivo de neotejido y acumulación de componentes de la matriz extracelular (ECM) en el sitio de la lesión.

Se cree que la activación excesiva o repetida de los mecanismos inflamatorios y procoagulantes en el sitio de la lesión vascular contribuye de forma significativa al desarrollo de la hiperplasia de la capa íntima. En condiciones patológicas, la lesión vascular provoca la denudación de la capa endotelial y desencadena una serie de respuestas inflamatorias agudas y crónicas caracterizadas por la producción de diversos factores de crecimiento y citoquinas inflamatorias (Murakami, et al., Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol., 272: L197-L202 (1997); Cotran, et al., J Am Soc Nephrol., 1: 225-235 (1990)). La hiperplasia de la capa íntima que se produce después de procedimientos quirúrgicos tales como angioplastia y colocación de endoprótesis cardiovasculares, revascularizaciones quirúrgicas o endarterectomía por enfermedad arterial coronaria y/o periférica puede causar la reestenosis de los vasos sanguíneos hasta en un 80 % de los pacientes (Seedial, et al., J Vasc Surg., 57(5): 1403-1414 (2013); Glagov, Circulation, 89: 2888-2891 (1994)). Se ha mostrado que la formación de la capa neoíntima se puede acelerar por la presencia de material extraño, tal como prótesis dentro de los vasos sanguíneos, y la hiperplasia de la capa neoíntima no controlada es un obstáculo importante que limita la eficacia clínica a largo plazo de la intervención cardiovascular (Frank, et al., Curr. Opin. Lipidol., 15: 523 (2004)). Además, la formación de la capa neoíntima está asociada al desarrollo y la progresión de varias enfermedades cardiovasculares proliferativas, que incluyen aterosclerosis, hipertensión y complicaciones vasculares diabéticas.

La regeneración de la capa endotelial inhibe el desarrollo de la capa neoíntima y facilita la reparación vascular (Bauters, et al., Prog. Cardiovasc. Dis., 40: 107-116 (1997); Kinlay, et al., Curr. Opin. Lipidol., 12: 383 (2001)). Sin embargo, los fármacos anti-capa neoíntima disponibles en la actualidad bloquean indiscriminadamente la proliferación tanto de células endoteliales (EC) como de células del músculo liso (SMC), dando como resultado una alteración de la reendotelización y una prolongación del proceso de curación de la herida. Sigue existiendo la necesidad de desarrollar una estrategia antiproliferación que sea sensible a las SMC.

Las respuestas inflamatorias no reguladas al daño tisular repetido también pueden dar lugar a fibrosis patológica de tejidos y órganos tales como la piel, el hígado, el corazón y los pulmones (Huang y Ogawa, Connect Tissue Res., 53 (3): 187-196 (2012)). El daño crónico y la inflamación del tejido hepático conducen a la acumulación de proteínas ECM que causan una formación excesiva de cicatrices y distorsionan la arquitectura hepática, lo que a su vez conduce a cirrosis e insuficiencia hepática (Battler y Brenner, J Clin Invest., 115: 209-218 (2005)). Del mismo modo, la deposición excesiva de tejido fibrótico dentro del pulmón da lugar a una cicatrización progresiva y una destrucción irreversible de la arquitectura pulmonar que, por último, conduce al mal funcionamiento de los órganos, la interrupción del intercambio de gases y la muerte por insuficiencia respiratoria.

Las plaquetas activadas aumentan la adherencia leucocitaria al endotelio dañado y promueven la activación leucocitaria mediante la deposición de quimioquinas en el endotelio. Esto permite que los leucocitos se adhieran firmemente a la pared del vaso y transmigren al tejido subendotelial. Sin embargo, también se sabe que las quimioquinas obtenidas a partir de plaquetas desempeñan un papel en la proliferación de la capa neoíntima, la reestenosis después de una lesión arterial y la aterosclerosis (Chandrasekar, et al., JAm College Cardiology, Vol. 35, N.° 3, págs. 555-562 (2000)). Ciertos grupos de pacientes que tienen una función plaquetaria anómala, incluyendo los que tienen enfermedad renal, diabetes mellitus e hiperlipidemia, también tienen un mayor riesgo de reestenosis. Los trastornos fibroproliferativos son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en Estados Unidos (Bitterman y Henke, Chest, 99(3): s81-s84 (1991)). En particular, las enfermedades fibróticas hepáticas y pulmonares son generalmente resistentes al tratamiento y conllevan una tasa de mortalidad elevada. La cirrosis hepática establecida tiene una tasa de mortalidad a 10 años de un 34-66 % y es responsable de aproximadamente 27.000 muertes cada año solo en Estados Unidos. Se calcula que la prevalencia de la fibrosis pulmonar idiopática (IPF) está entre 14 y 42,7 por 100.000, y esta cifra ha ido aumentando década tras década durante los últimos 30 años (Olson, et al., Am JRespir Crit Care Med. 176: 277-2843 (2007); Gribbin, et al., Thorax, 61: 980-985 (2006)). En la actualidad, el tratamiento más eficaz para la fibrosis hepática o pulmonar es el trasplante de órganos.

Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar composiciones, dispositivos, injertos, y métodos de uso de los mismos para modular procesos inmunitarios para reducir o prevenir la formación de la capa neoíntima, estenosis, reestenosis o una combinación de los mismos en un sujeto.

También es un objeto de la invención proporcionar composiciones, dispositivos, injertos y métodos de uso de los mismos para reducir o prevenir la activación plaquetaria inapropiada o perjudicial en un sujeto.

También es un objeto de la invención proporcionar composiciones, métodos y dispositivos para reducir o prevenir la respuesta inmunitaria a una prótesis implantable en un sujeto.

Otro objeto de la invención es proporcionar composiciones, métodos y dispositivos para promover la curación e inhibir la formación de cicatrices, adherencias y enfermedades fibroproliferativas en un sujeto.

El documento WO 99/51741 desvela complejos de la proteína LYST o LYST-2 con proteínas que se identifica que interactúan con LYST o LYST-2 (proteína 14-3-3, proteína HS1, Hrs, BMK1, K^b07, Efs, XAP-4, OS9, caseína quinasa II beta SU, calmodulina, troponina I, importina beta, Fte-1, hERR1, imogen 38, atrofina-1, norbina, HBF-G2, DGS-I, GBDR1, proteína que contiene OPA, proteína M4, LIP1, LIP2, LIP3, LIP4, LIP5, LIP6, LIP7, LIP8, LIP9 y LIP10, y derivados, fragmentos y análogos de los mismos). El documento WO 99/51741 también desvela ácidos nucleicos que codifican las proteínas LIP1, LIP2, LIP3, LIP4, LIP5, LIP6, LIP7, LIP8, LIP9, y LIP10, o derivados, fragmentos y análogos de los mismos. En el mismo también se desvelan métodos de cribado de los complejos o proteínas para determinar su eficacia en el tratamiento y/o la prevención de ciertas enfermedades y trastornos, en particular enfermedades atópicas, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades neurodegenerativas, cáncer, trastornos de pigmentación, disfunción plaquetaria y enfermedades virales.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Se ha establecido que la inhibición de la proteína reguladora del tráfico lisosomal ("LYST") está asociada a respuestas inflamatorias reducidas en el sitio del daño tisular. Se describen composiciones y métodos para inhibir la expresión y la función de la proteína LYST. Las composiciones y métodos pueden ser útiles para la modulación de procesos inmunitarios que contribuyen a la formación de la capa neoíntima y trastornos fibroproliferativos mediante la alteración de la función de macrófagos, plaquetas y linfocitos citolíticos naturales para crear una respuesta inmunitaria prorregenerativa.

Por lo tanto, la invención se refiere a una composición farmacéutica para uso en un método para reducir infiltración de macrófagos, formación de cicatrices, o estenosis en el sitio de implante del injerto en un sujeto que comprende: a) uno o más inhibidores de LYST en una cantidad eficaz para

reducir infiltración de macrófagos, activación de linfocitos citolíticos naturales, y/o activación plaquetaria en el sujeto, y

b) un vehículo fisiológicamente aceptable,

en donde la composición se administra al sujeto antes de una cirugía, en el momento de una cirugía, y/o en los días posteriores a una cirugía, y en donde los uno o más inhibidores de LYST están en una cantidad entre 0,1­ 1000 mg/kg de peso corporal de un ser humano y no previene la curación de heridas.

Además algunas realizaciones particulares de la invención se definen en las reivindicaciones adjuntas.

En una realización, uno o más inhibidores de LYST son un anticuerpo.

En otra realización, uno o más inhibidores de LYST son un ácido nucleico funcional. Algunos ácidos nucleicos funcionales a modo de ejemplo incluyen una molécula antisentido, ARNsi, miARN, aptámeros, ribozimas, moléculas formadoras de tríplex, ARNi, y secuencias guía externas. Los uno o más ácidos nucleicos funcionales se pueden expresar a partir de un vector de expresión.

En algunas realizaciones, las composiciones de uno o más inhibidores de LYST incluyen un vehículo de administración. Algunos vehículos de administración a modo de ejemplo incluyen nanopartículas, micropartículas, micelas, emulsiones, partículas de lipoproteínas sintéticas, liposomas, nanotubos de carbono, geles, y recubrimientos. Las composiciones desveladas también pueden incluir uno o más agentes terapéuticos adicionales. Se desvelan injertos vasculares y dispositivos médicos que incluyen uno o más inhibidores de LYST. En algunas realizaciones, la composición de uno o más inhibidores de LYST está recubierta sobre o está incorporada en el injerto o dispositivo. Algunos dispositivos médicos a modo de ejemplo incluyen endoprótesis vasculares, implantes, agujas, cánulas, catéteres, derivaciones, globos, y válvulas. El dispositivo médico puede ser una endoprótesis vascular, tal como una endoprótesis vascular que libera fármaco que eluye la composición de uno o más inhibidores de LYST. Algunos injertos vasculares a modo de ejemplo incluyen injertos autólogos, autólogos protegidos, alogénicos, xenogénicos o sintéticos.

También se proporciona una composición farmacéutica, tal como se define en la reivindicación 1, para uso en un método para reducir la formación de tejido cicatricial en un sujeto, mediante la administración de dicha composición, a un sujeto que lo necesite, que incluye uno o más inhibidores de LYST. También se proporciona una composición farmacéutica, tal como se define en la reivindicación 1, para uso en métodos para reducir la activación plaquetaria y la trombosis venosa o la trombosis arterial en un sujeto que incluyen administrar, a un sujeto que lo necesite, la composición que incluye uno o más inhibidores de LYST. En algunas realizaciones, el sujeto tiene riesgo de desarrollar, o ha desarrollado, reestenosis u otros trastornos de proliferación vascular. En realizaciones adicionales, el sujeto ha sufrido, está sufriendo o va a sufrir traumatismo vascular, angioplastia, cirugía vascular, o arteriopatía de trasplante. El uso de la composición farmacéutica en dichos métodos puede promover la curación, reducir el desarrollo de cicatrización hipertrófica, queloides o adherencias, reducir la fibrosis del hígado, fibrosis de los pulmones, fibrosis del corazón o fibrosis de los riñones, reduce la formación de la capa neoíntima, estenosis o reestenosis, o cualquier combinación de los mismos en el sujeto con respecto a un sujeto de control sin tratar. El uso de la composición farmacéutica en dichos métodos puede promover la integración pero bloquear la encapsulación de uno o más dispositivos protésicos tales como marcapasos, estimuladores nerviosos, cables de marcapasos, válvulas cardiacas de reemplazo y articulaciones artificiales o componentes c de los mismos. El uso de la composición farmacéutica en dichos métodos puede ser eficaz para tratar o prevenir la formación de la capa neoíntima en el sitio de implante de un implante vascular, un sitio de lesión vascular, o un sitio de cirugía en el sujeto, con respecto a un sujeto de control sin tratar. Los métodos pueden ser eficaces para reducir o prevenir la expresión del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor beta de crecimiento transformante, o cualquier combinación de los mismos en un sujeto con respecto a un sujeto de control sin tratar.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es un histograma que muestra el diámetro (mm) del conducto dentro de injertos de conductos biodegradables dos semanas después del implante en ratones de color beige (bg; gráfico de color negro) y ratones de tipo silvestre (WT; gráfico de color gris). N = 10 y N = 25 para ratones de color beige y ratones WT, respectivamente.

La Figura 2 es un histograma que muestra el número de células de macrófagos (célula/HPF) dentro de injertos de conductos biodegradables explantados de ratones de color beige (Bg; gráfico de color gris) y ratones de tipo silvestre (WT; gráfico de color negro), respectivamente, dos semanas después del implante. P = 0,0048.

La Figura 3 es un esquema que muestra la diferencia entre las secuencias de nucleótidos (en la parte superior) de los ratones de tipo silvestre (WT) y de color beige (Bg) en el gen LYST en el exón 52. En un alineamiento de secuencias de aminoácidos (en la parte media) también se muestran diferencias correspondientes entre las secuencias de aminoácidos de la proteína LYST de ratones WT y Bg. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos (en la parte inferior) muestra la conservación entre las secuencias de aminoácidos de polipéptidos LYST del ser humano, ratón y rata. La posición de la deleción dentro de LYST de ratones de color beige (Bg) está indicada con *. Los ácidos nucleicos y los aminoácidos se representan usando los respectivos códigos estándar de una sola letra.

La Figura 4 es un histograma que muestra el nivel relativo de ARNm correspondiente al producto del gen LYST, amplificado usando cada uno de 5 cebadores oligonucleotídicos diferentes (LYST-1, LYST-3, LYST-4, LYST-5 y LYST-6), en células obtenidas de ratones de tipo silvestre (WT-1 (1); WT-2 (2)), ratones de color beige (Beige-1 (3); Beige-2 (4)) o una línea celular estándar "sin tratar" (5) , respectivamente.

La Figura 5 es un histograma que muestra la incidencia de estenosis (%) en ratones C57BL/6 (tipo silvestre) y ratones con genes inactivados C57BL/6 Lysttmlb, respectivamente, (n = 5) después del implante de 2 semanas. ***p = 0,0001.

La Figura 6 es un histograma que muestra la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) secretado a partir de PRP (pg/ml) en ratones en reposo (control) y C57BL/6 (tipo silvestre) activada por trombina, así como ratones C57BL/6 de color beige (Bg), respectivamente. Las concentraciones totales de PDGF secretado de cada grupo (n = 7) se compararon con los controles no activados, en reposo (n = 5).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. Definiciones

El término "estenosis" se refiere a un estrechamiento anómalo de un vaso sanguíneo que se produce después de una lesión en la pared del vaso (endotelio). En algunas realizaciones, la estenosis implica una reducción de la circunferencia de un lumen de un 50 % o más. El término "reestenosis" se refiere a la estenosis en un sitio previamente estenótico o al estrechamiento del lumen de un vaso sanguíneo o injerto sintético después de un procedimiento de intervención. La reestenosis, como se usa en el presente documento, incluye la oclusión. Algunas lesiones a modo de ejemplo que dan como resultado estenosis o reestenosis incluyen traumatismo para una lesión aterosclerótica (tal como se observa con angioplastia o endoprótesis vascular), una resección de una lesión (tal como se observa con endarterectomía), un traumatismo externo (por ejemplo, una lesión por pinzamiento cruzado), o una anastomosis quirúrgica.

La expresión "estenosis de la capa neoíntima" se refiere al estrechamiento anómalo de un vaso sanguíneo como resultado de la formación de la capa neoíntima.

La expresión "capa neoíntima" se refiere a una capa renovada o engrosada de la capa íntima (revestimiento interno) formada en un vaso sanguíneo como respuesta a las señales de células endoteliales lesionadas.

Las expresiones "tejido cicatricial" y "cicatrización" se refieren al tejido fibroso que se produce para reemplazar el tejido dañado después de una lesión.

Las expresiones "trastornos fibroproliferativos", "FPD" y "enfermedades fibróticas" se usan indistintamente e incluyen enfermedades o afecciones benignas y malignas que resultan de la deposición anómala y excesiva de tejido conjuntivo.

La expresión "activación plaquetaria" es el proceso fisiológico gradual que da lugar a la adherencia y la agregación de plaquetas circulantes como respuesta a una lesión tisular, tal como daño o interrupción del endotelio. La activación plaquetaria da lugar a la expresión y la secreción de agentes quimiotácticos tales como factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor beta de crecimiento transformante (TGFp).

"Vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua y emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua o de agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes.

"Inhibir", u otras formas del término tales como "que inhibe" o "inhibición", se refiere a obstaculizar o impedir una característica particular. Se entiende que esto se produce generalmente con respecto a algún valor estándar o esperado, es decir, es relativo, pero no siempre es necesario para el valor estándar o relativo al que se refiere. Por ejemplo, "inhibe LYST" se refiere a obstaculizar, interferir o impedir la actividad del gen LYST con respecto a un estándar o un control. "Inhibe LYST" también puede hacer referencia a obstaculizar o impedir la síntesis, expresión o función de la proteína LYST con respecto a un estándar o control.

"Tratamiento" o "tratar" se refiere a administrar una composición a un sujeto o un sistema con una afección no deseada (por ejemplo, reestenosis o un trastorno fibroproliferativo). La afección puede incluir una enfermedad. "Prevención" o "prevenir" se refieren a administrar una composición a un sujeto o un sistema en riesgo de padecer la afección. La afección puede ser una predisposición a una enfermedad. El efecto de la administración de la composición al sujeto (ya sea tratar y/o prevenir) puede ser, pero no se limita a, el cese de un síntoma particular de una afección, una reducción o prevención de los síntomas de una afección, una reducción de la gravedad de la afección, la ablación completa de la afección, una estabilización o retraso del desarrollo o progresión de un suceso o característica particular, o minimización de las posibilidades de que ocurra un suceso o característica particular. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio a menos que se indique claramente de otro modo. Por lo tanto, un "anticuerpo" puede ser de origen natural o artificial, tal como los anticuerpos monoclonales producidos mediante la tecnología convencional de hibridoma. Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, así como fragmentos que contienen el dominio de unión a antígeno y/o una o más regiones determinantes de la complementariedad de estos anticuerpos. "Anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo e incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo.

II. Composiciones

Se ha establecido que los procesos de reparación tisular pueden estar mediados por la manipulación de la expresión y función del gen LYST. Específicamente, la pérdida de función del producto del gen LYST da lugar a una función anómala en ciertas células inmunitarias, dando como resultado una disfunción inmunitaria y una reducción asociada en los trastornos proliferativos. Las células inmunitarias que se pueden ver influidas por la modulación del gen LYST o la proteína LYST incluyen células inmunitarias innatas, macrófagos y plaquetas.

Células inmunitarias innatas

Los procesos inmunitarios innatos, incluyendo inflamación, retirada de células dañadas y residuos, así como el desarrollo de neotejido y otros mecanismos de reparación de heridas, son un componente importante de las respuestas fisiológicas a las lesiones. La reparación tisular tiene cuatro etapas distintas, que incluyen: a) trombosis/coagulación; b) inflamación; c) migración/proliferación de fibroblastos; y d) una fase de remodelación final en la que se restaura la arquitectura de tejido normal. En las primeras etapas después del daño tisular, las células epiteliales y/o las células endoteliales liberan mediadores inflamatorios que inician una cascada de coagulación antifibrinolítica que desencadena la coagulación y el desarrollo de una matriz extracelular provisional (ECM). La agregación y la desgranulación posterior de las plaquetas promueven la dilatación de los vasos sanguíneos y el aumento de la permeabilidad, lo que permite el reclutamiento eficaz de células inflamatorias tales como neutrófilos, macrófagos, linfocitos y eosinófilos en el tejido dañado. Los neutrófilos son la célula inflamatoria más abundante en las primeras etapas de la curación de heridas, pero son reemplazados rápidamente por macrófagos después de la desgranulación de los neutrófilos. Los macrófagos y los neutrófilos activados desbridan la herida, eliminan cualquier organismo invasor y producen una diversidad de citoquinas y quimioquinas que amplifican la respuesta inflamatoria y desencadenan la proliferación y el reclutamiento de fibroblastos. Tras la activación, los fibroblastos se transforman en miofibroblastos que secretan componentes de actina del músculo liso a y ECM. Por último, en la fase de remodelación, las células epiteliales/endoteliales se dividen y migran sobre la matriz temporal para regenerar el tejido dañado. Por lo tanto, la curación y la generación de tejido es un proceso finamente regulado que equilibra la necesidad de regenerar tejido y engrosar las paredes de los vasos sanguíneos, sin engrosamiento excesivo, estenosis o fibrosis.

Macrófagos

Se ha mostrado que la presencia de monocitos circulantes y macrófagos infiltrantes es fundamental para la curación de heridas y el desarrollo de neotejido (Arras, et al., J Clin Invest, 101(1): 40-50 (1998)). Sin embargo, la extensión de la infiltración de macrófagos en un sitio de daño tisular también se ha correlacionado con la disregulación proliferativa y la formación de la capa neoíntima (Hibino, et al., FASEB J. 25(12): 4253-63 (2011)). Además, numerosos estudios han indicado que los macrófagos y los fibroblastos son las principales células efectoras implicadas en la patogénesis de la fibrosis (revisado en Wynn, Nat Rev Immunol. 4(8): 583-94 (2004)).

Después del daño vascular, las células monocitarias inflamatorias (CD16-hi, CD64-hi y CD14-hi en seres humanos; CD115+, CD11b+ y Ly6c-hi en ratones) se reclutan en el tejido dañado y se diferencian en macrófagos activados (Emr1-hi en seres humanos; F4/80-hi en ratones) tras la exposición a factores de crecimiento locales, citoquinas proinflamatorias y compuestos microbianos (Geissmann et al., Science 327: 656-661 (2010)). La infiltración excesiva de macrófagos da como resultado estenosis, mientras que la inhibición completa de la infiltración de macrófagos previene la formación de neotejido (Hibino, et al., FASEB J. 25(12): 4253-63 (2011).

Se han definido dos estados distintos de activación polarizada para macrófagos: el fenotipo de macrófago clásicamente activado (M1) y el fenotipo de macrófago activado alternativamente (M2) (Gordon y Taylor, Nat. Rev. Immunol. 5: 953-964 (2005); Mantovani et al., Trends Immunol. 23: 549-555 (2002)). El papel del macrófago clásicamente activado (M1) es una célula efectora en las respuestas inmunitarias celulares TH1, mientras que el macrófago activado alternativamente (M2) parece estar implicado en la inmunosupresión y la curación de heridas/reparación de tejidos. Los macrófagos M1 y M2 tienen perfiles de quimioquinas y receptores de quimioquinas distintos, donde M1 secreta las quimioquinas CXCL9 y CXCL10 atractoras de células TH1, y los macrófagos M2 expresan las quimioquinas CCL17, CCL22 y CCL24.

La presencia de macrófagos M2 se ha asociado con el desarrollo de la capa neoíntima y estenosis (Hibino, et al., FASEB J. 25(12): 4253-63 (2011)). La correlación entre la extensión de la infiltración de macrófagos, formación de neotejido y estenosis en ciertos puntos de tiempo después del implante del injerto tisular proporciona medios para prevenir la estenosis mediante la modulación de la actividad de macrófagos.

Además, los macrófagos se encuentran generalmente cerca de células de miofibroblastos productoras de colágeno, y se ha demostrado que los macrófagos derivados de monocitos perpetúan de forma fundamental las respuestas inflamatorias después de una lesión como requisito previo para la fibrosis (Wynn y Barron, Semin Liver Dis., 30(3): 245-257 (2010)). Los macrófagos producen mediadores profibróticos que activan los fibroblastos, fluyendo el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un potente agente quimiotáctico, y el factor beta de crecimiento transformante (TGF-B). De forma específica, un aumento marcado del subconjunto no clásico M2 (CD14+, CD16+) de macrófagos se ha correlacionado con citoquinas proinflamatorias y progresión clínica en pacientes que padecen enfermedad hepática crónica. Durante la progresión de la fibrosis, los macrófagos derivados de monocitos liberan citoquinas que perpetúan la inflamación crónica y activa directamente las células estrelladas hepáticas (HSC), lo que da como resultado su proliferación y transdiferenciación en miofibroblastos productores de colágeno (Zimmermann, et al., PLOS One, 5(6): e11049 (2010)).

Plaquetas

Las plaquetas agregadas ayudan a la reparación de los vasos sanguíneos al secretar sustancias químicas que atraen a los fibroblastos del tejido conjuntivo circundante al área de la herida para curar la herida o, en el caso de respuestas inflamatorias disreguladas, forman tejido cicatricial. Como respuesta a la lesión tisular, las plaquetas se activan y liberan una multitud de factores de crecimiento que estimulan la deposición de matriz extracelular, tal como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un potente agente quimiotáctico, así como el factor beta de crecimiento transformante (TGF-p). Se ha mostrado que ambos factores de crecimiento desempeñan un papel significativo en la reparación y en la regeneración de tejidos conectivos. El PDGF funciona como un mitógeno primario y un quimioatractor que aumenta significativamente la afluencia de fibroblastos y células inflamatorias, además de estimular la proliferación celular y la expresión génica. El PDGF permite que los leucocitos se adhieran firmemente a la pared del vaso y por último transmigren al tejido subendotelial. Sin embargo, también se sabe que las quimioquinas derivadas de plaquetas inducen la proliferación de células de músculo liso (SMC) y desempeñan un papel en la proliferación de la capa neoíntima y en la fibrosis orgánica (Chandrasekar, et al., JAm College Cardiology, Vol 35, N.° 3, pp. 555-562 (2000)). El aumento de la expresión de PDGF y sus receptores está asociado a tejido pulmonar y cutáneo de la esclerodermia. Específicamente, existe evidencia de un bucle de señalización autocrino mediado por receptores del PDGF en fibroblastos pulmonares y cutáneos de la esclerodermia, que implican las rutas de TGF-p y PDGF en la fibrosis crónica en la esclerodermia (Trojanowska, Rheumatology; 47: v2-v4 (2008)). Además, la desregulación de la señalización de PDGF está asociada a afecciones cardiovasculares tales como hipertensión pulmonar y aterosclerosis.

La proliferación y la migración de células de músculo liso de la capa media (SMC) como respuesta al PDGF inducido por lesión son sucesos esenciales que contribuyen al engrosamiento de la capa neoíntima (Fingerle, et al., Proc Natl Acad Sci., 86: 8412 (1989); Clowes, et al., Circ. Res., 56: 139-145 (1985)) que con el tiempo conduce a estrechamiento y estenosis de los vasos sanguíneos.

Otros factores de crecimiento asociados a la curación liberados por las plaquetas incluyen el factor de crecimiento de fibroblastos básico, el factor 1 de crecimiento de tipo insulínico, el factor de crecimiento epidérmico derivado de plaquetas y el factor de crecimiento endotelial vascular.

Por lo tanto, los inhibidores del gen LYST y la proteína LYST pueden crear un entorno inmunitario prorregenerativo que mejora la curación de heridas y que previene trastornos proliferativos tales como hiperplasia de la íntima, desarrollo de tejido cicatricial excesivo y enfermedad fibrótica. La modulación de LYST también puede modular la actividad y la función plaquetaria. Por lo tanto, los inhibidores del gen LYST y/o la proteína LYST se pueden usar para reducir las funciones biológicas de las plaquetas, tales como la agregación plaquetaria y la producción/expresión del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF).

Se desvelan composiciones para promover la regeneración tisular y para prevenir o reducir enfermedades caracterizadas por la formación de tejido cicatricial excesivo por bloqueo de la expresión y/o función de la proteína LYST.

A. LYST

El producto del gen regulador del tráfico lisosomal (LYST) es una proteína ubicua asociada con el transporte de material intracelular al lisosoma. Se ha establecido que las mutaciones que reducen o inhiben la función de la proteína LYST interfieren con las funciones normales de los macrófagos y también tienen impacto en las actividades biológicas de los linfocitos citolíticos naturales (NK) y las plaquetas. Se cree que la modulación de la proteína LYST proporciona un medio para modular los procesos inmunitarios que dan lugar a trastornos proliferativos vasculares, formación de neoíntima, fibrosis y cicatrización excesiva.

1. El gen LYST

El gen LYST humano está ubicado en el cromosoma 1, (segmento 1q42.1-q42.2; de 235.661.030 a 235.883.707 pares de bases) (Barrat, et al., Am. J. Hum. Genet, 59: 625-632 (1996)). En la técnica se conocen secuencias de ácidos nucleicos para el producto del gen LYST. Véase, por ejemplo, la secuencia de referencia del NCBI: NM_000081.3, regulador del tráfico lisosomal (LYST) de Homo sapiens, variante 1 del transcrito, ARNm, que proporciona la secuencia de ácidos nucleicos:

1 GTGCGCGGCG GCGGCGGCAG CGGCGTCGGC TCGGGGTTCT CCGGGAGAGG GGGAGTGCGC 61 GGCGGCCGCA GCTGCCACAA ACCAGGTGAA GCTTTGTTCT AAGAATATTT GTTTCATCTA 1 21 GTTTATGAGT CCAAATGATA TAGACTGTAA ATGTCACAGC AGTGGTGAAA GACTGCTCGG 1 81 TCATGAGCAC CGACAGTAAC TCACTGGCAC GTGAATTTCT GACCGATGTC AACCGGCTTT 24 1 GCAATGCAGT GGTCCAGAGG GTGGAGGCCA GGGAGGAAGA AGAGGAGGAG ACGCACATGG 30 1 CAACCCTTGG ACAGTACCTT GTCCATGGTC GAGGATTTCT ATTACTTACC AAGCTAAATT 36 1 CTATAATTGA TCAGGCATTG ACATGTAGAG AAGAACTCCT GACTCTTCTT CTGTCTCTCC 4 21 TTCCACTGGT ATGGAAGATA CCTGTCCAAG AAGAAAAGGC AACAGATTTT AACCTACCGC 4 81 TCTCAGCAGA TATAATCCTG ACCAAAGAAA AGAACTCAAG TTCACAAAGA TCCACTCAGG 54 1 AAAAATTACA TTTAGAAGGA AGTGCCCTGT CTAGTCAGGT TTCTGCAAAA GTAAATGTTT 6 01 TTCGAAAAAG CAGACGACAG CGTAAAATTA CCCATCGCTA TTCTGTAAGA GATGCAAGAA 66 1 AGACACAGCT CTCCACCTCA GATTCAGAAG CCAATTCAGA TGAAAAAGGC ATAGCAATGA 72 1 ATAAGCATAG AAGGCCCCAT CTGCTGCATC ATTTTTTAAC ATCGTTTCCT AAACAAGACC 78 1 ACCCCAAAGC TAAACTTGAC CGCTTAGCAA CCAAAGAACA GACTCCTCCA GATGCTATGG 84 1 CTTTGGAAAA TTCCAGAGAG ATTATTCCAA GACAGGGGTC AAACACTGAC ATTTTAAGTG 9 01 AGCCAGCTGC CTTGTCTGTT ATCAGTAACA TGAACAATTC TCCATTTGAC TTATGTCATG 9 61 TTTTGTTATC TTTATTAGAA AAAGTTTGTA AGTTTGACGT TACCTTGAAT CATAATTCTC 1 021 CTTTAGCAGC CAGTGTAGTG CCCACACTAA CTGAATTCCT AGCAGGCTTT GGGGACTGCT 1 081 GCAGTCTGAG CGACAACTTG GAGAGTCGAG TAGTTTCTGC AGGTTGGACC GAAGAACCGG 1 141 TGGCTTTGAT TCAAAGGATG CTCTTTCGAA CAGTGTTGCA TCTTCTGTCA GTAGATGTTA 1 201 GTACTGCAGA GATGATGCCA GAAAATCTTA GGAAAAATTT AACTGAATTG CTTAGAGCAG 1 261 CTTTAAAAAT TAGAATATGC CTAGAAAAGC AGCCTGACCC TTTTGCACCA AGACAAAAGA 1 321 AAACACTGCA GGAGGTTCAG GAAGATTTTG TGTTTTCAAA GTATCGTCAT AGAGCCCTTC 1 381 TTTTACCTGA GCTTTTGGAA GGAGTTCTTC AGATTCTGAT CTGTTGTCTT CAAAGTGCAG 1 441 CTTCAAATCC CTTCTACTTC AGTCAAGCCA TGGATTTGGT TCAAGAATTC ATTCAGCATC 1 501 ATGGATTTAA TTTATTTGAA ACAGCAGTTC TTCAAATGGA ATGGCTGGTT TTAAGAGATG 1 561 GAGTTCCTCC CGAGGCCTCA GAGCATTTGA AAGCCCTAAT AAATAGTGTG ATGAAAATAA 1 621 TGAGCACTGT CAAAAAAGTG AAATCAGAGC AACTTCATCA TTCGATGTGT ACAAGAAAAA 1 681 GGCACAGACG ATGTGAATAT TCTCATTTTA TGCATCATCA CCGAGATCTC TCAGGTCTTC 1 741 TGGTTTCGGC TTTTAAAAAC CAGGTTTCCA AAAACCCATT TGAAGAGACT GCAGATGGAG 1 801 ATGTTTATTA TCCTGAGCGG TGCTGTTGCA TTGCAGTGTG TGCCCATCAG TGCTTGCGCT 1 861 TACTACAGCA GGCTTCCTTG AGCAGCACTT GTGTCCAGAT CCTATCGGGT GTTCATAACA 1 921 TTGGAATATG CTGTTGTATG GATCCCAAAT CTGTAATCAT TCCTTTGCTC CATGCTTTTA 1 981 AATTGCCAGC ACTGAAAAAT TTTCAGCAGC ATATATTGAA TATCCTTAAC AAACTTATTT 2 041 TGGATCAGTT AGGAGGAGCA GAGATATCAC CAAAAATTAA AAAAGCAGCT TGTAATATTT 21 01 GTACTGTTGA CTCTGACCAA CTAGCCCAAT TAGAAGAGAC ACTGCAGGGA AACTTATGTG 21 61 ATGCTGAACT CTCCTCAAGT TTATCCAGTC CTTCTTACAG ATTTCAAGGG ATCCTGCCCA 2 221 GCAGTGGATC TGAAGATTTG TTGTGGAAAT GGGATGCTTT AAAGGCTTAT CAGAACTTTG 2 281 TTTTTGAAGA AGACAGATTA CATAGTATAC AGATTGCAAA TCACATTTGC AATTTAATCC 2 341 AGAAAGGCAA TATAGTTGTT CAGTGGAAAT TATATAATTA CATATTTAAT CCTGTGCTCC 2 401 AAAGAGGAGT TGAATTAGCA CATCATTGTC AACACCTAAG CGTTACTTCA GCTCAAAGTC 2 461 ATGTATGTAG CCATCATAAC CAGTGCTTGC CTCAGGACGT GCTTCAGATT TATGTAAAAA 2 521 CTCTGCCTAT CCTGCTTAAA TCCAGGGTAA TAAGAGATTT GTTTTTGAGT TGTAATGGAG 2 581 TAAGTCAAAT AATCGAATTA AATTGCTTAA ATGGTATTCG AAGTCATTCT CTAAAAGCAT 2 641 TTGAAACTCT GATAATCAGC CTAGGGGAGC AACAGAAAGA TGCCTCAGTT CCAGATATTG 27 01 ATGGGATAGA CATTGAACAG AAGGAGTTGT CCTCTGTACA TGTGGGTACT TCTTTTCATC 27 61 ATCAGCAAGC TTATTCAGAT TCTCCTCAGA GTCTCAGCAA ATTTTATGCT GGCCTCAAAG 2 821 AAGCTTATCC AAAGAGACGG AAGACTGTTA ACCAAGATGT TCATATCAAC ACAATAAACC 2 881 TATTCCTCTG TGTGGCTTTT TTATGCGTAA GTAAAGAAGC AGAGTCTGAC AGGGAGTCGG 2 941 CCAATGACTC AGAAGATACT TCTGGCTATG ACAGCACAGC CAGCGAGCCT TTAAGTCATA 3 001 TGCTGCCATG TATATCTCTC GAGAGCCTTG TCTTGCCTTC TCCTGAACAT ATGCACCAAG 3 061 CAGCAGACAT TTGGTCTATG TGTCGTTGGA TCTACATGTT GAGTTCAGTG TTCCAGAAAC 3 121 AGTTTTATAG GCTTGGTGGT TTCCGAGTAT GCCATAAGTT AATATTTATG ATAATACAGA 3 181 AACTGTTCAG AAGTCACAAA GAGGAGCAAG GAAAAAAGGA GGGAGATACA AGTGTAAATG 3 241 AAAACCAGGA TTTAAACAGA ATTTCTCAAC CTAAGAGAAC TATGAAGGAA GATTTATTAT 3 301 CTTTGGCTAT AAAAAGTGAC CCCATACCAT CAGAACTAGG TAGTCTAAAA AAGAGTGCTG 3 361 ACAGTTTAGG TAAATTAGAG TTACAGCATA TTTCTTCCAT AAATGTGGAA GAAGTTTCAG 3 421 CTACTGAAGC CGCTCCCGAG GAAGCAAAGC TATTTACAAG TCAAGAAAGT GAGACCTCAC 3 481 TTCAAAGTAT ACGACTTTTG GAAGCCCTTC TGGCCATTTG TCTTCATGGT GCCAGAACTA 3 541 GTCAACAGAA GATGGAATTG GAGTTACCTA ATCAGAACTT GTCTGTGGAA AGTATATTAT 3 601 TTGAAATGAG GGACCATCTT TCCCAGTCAA AGGTGATTGA AACACAACTA GCAAAGCCTT 3 661 TATTTGATGC CCTGCTTCGA GTTGCCCTCG GGAATTATTC AGCAGATTTT GAACATAATG 37 21 ATGCTATGAC TGAGAAGAGT CATCAATCTG CAGAAGAATT GTCATCCCAG CCTGGTGATT 37 81 TTTCAGAAGA AGCTGAGGAT TCTCAGTGTT GTAGTTTTAA ACTTTTAGTT GAAGAAGAAG 38 41 GTTACGAAGC AGATAGTGAA AGCAATCCTG AAGATGGCGA AACC CAGGAT GATGGGGTAG 39 01 ACTTAAAGTC TGAAACAGAA GGTTTCAGTG CATCAAGCAG TCCAAATGAC TTACTCGAAA 39 61 ACCTCACTCA AGG GGAAATA ATTTATCCTG AGATTTGTAT GCTGGAATTA AATTTGCTTT 4 021 CTGCTAGTAA AGCCAAACTT GATGTGCTTG CCCATGTATT TGAGAGTTTT TTGAAAATTA 4 081 TTAGGCAGAA AGAAAAGAAT GTTTTTCTGC TCATGCAACA GGGAACTGTG AAAAA'TCTTT 4 141 TAGGAGGGTT CTTGAGTATT TTAACACAGG ATGATTC TGA TTTTCAAGCA TGCCAGAGAG 4 201 TATTGGTGGA TCTTTTGGTA TCTTTGATGA GTTCAAGAAC ATGTTCAGAA GAGCTAACCC 4 261 TTCTTTTGAG AATATTTCTG GAGAAATCTC CTTGTACAAA AATTCTTCTT CTGGGTATTC 4 321 TGAAAATTAT TGAAAGTGAT ACTACTATGA g c c c t t c a c a GTATCTAACC TTCCCTTTAC 4 381 TGCACGCTCC AAATTTAAGC AACGGTGTTT CATCACAAAA GTATCCTGGG ATTTTAAACA 4 441 GTAAGGCCAT GGGTTTATTG AGAAGAGCAC GAGTTTCACG GAGCAAGAAA GAGGC TGATA 4 501 GAGAGAGTTT TCCCCATCGG CTGCTTTCAT CTTGGCACAT a g c c c c a g t c CACCTGCCGT 4 561 TGCTGGGGCA AAACTGCTGG CCACACCTAT CAGAAGGTTT CAGTGTTTCC CTGTGGTTTA 4 621 ATGTGGAGTG TATCCATGAA GCTGAGAGTA CTACAGAAAA AGGAAAGAAG ATAAAGAAAA 4 681 GAAACAAATC ATTAATTTTA CCAGATAGCA GTTTTGATGG TACAGAGAGC GACAGACCAG 4 741 AAGGTGCAGA GTACATAAAT CCTGGTGAAA GACTCATAGA AGAAGGATGT ATTCATATAA 4 801 TTTCACTGGG ATCCAAAGCG TTGATGATCC AAGTGTGGGC TGATCCCCAC AATGCCACTC 4 861 TTATCTTTCG TGTGTGCATG GATTCAAATG ATGACATGAA AGCTGTTTTA CTAGCACAGG 4 921 TTGAATCACA GGAGAATATT TTCCTCCCAA GCAAATGGCA ACATTTAGTA CTCACCTACT 4 981 TACAGCAGCC CCAAGGGAAA AGGAGGATTC ATGGGAAAAT CTCCATATGG GTCTCTGGAC 50 41 AGAGGAAGCC TGATGTTACT TTGGATTTTA TGCTTCCAAG AAAAACAAGT TTGTCATC TG 51 01 ATAGCAATAA AACATTTTGC ATGATTGGCC ATTGTTTATC ATCCCAAGAA GAGTTTTTGC 51 61 AGTTGGCTGG AAAATGGGAC CTGGGAAATT TGCTTCTCTT CAACGGAGCT a a g g t t g g t t 52 21 CACAAGAGGC c t t t t a t c t g TATGCTTGTG GACCCAACCA TACATCTGTA ATGCCATGTA 52 81 AGTATGGCAA GCCAGTCAAT GACTACTCCA AATATATTAA TAAAGAAATT TTGCGATGTG 53 41 AACAAATCAG AGAACTTTTT ATGACCAAGA AAGATGTGGA TATTGGTCTC TTAATTGAAA 54 01 GTCTTTCAGT TGTTTATACA ACTTACTGTC CTGCTCAGTA TACCATCTAT GAACCAGTGA 54 61 TTAGACTTAA AGGTCAAATG AAAACCCAAC TCTCTCAAAG ACCCTTCAGC TCAAAAGAAG 55 21 TTCAGAGCAT CTTATTAGAA CCTCATCATC TAAAGAA TC T CCAACCTACT GAATATAAAA 55 81 CTATTCAAGG CATTCTGCAC GAAATTGGTG GAACTGGCAT ATTTGTTTTT CTCTTTGCCA 56 41 GGGTTGTTGA ACTCAGTAGC TGTGAAGAAA CTCAAGCATT AGCACTGCGA GTTATACTCT 57 01 CATTAATTAA ATACAACCAA CAAAGAGTAC ATGAATTAGA AAATTGTAAT GGACTTTCTA 57 61 TGATTCATCA GGTGTTGATC AAACAAAAAT GCATTGTTGG GTTTTACATT TTGAAGACCC 58 21 TTCTTGAAGG ATGCTGTGGT GAAGATATTA TTTATATGAA TGAGAATGGA GAGTTTAAGT 58 81 TGGATGTAGA CTC TAATGC T ATAATCCAAG ATGTTAAGCT GTTAGAGGAA CTATTGCTTG 59 41 ACTGGAAGAT ATGGAGTAAA GCAGAGCAAG GTGTTTGGGA AACTTTGCTA GCAGCTCTAG 6 001 AAGTCCTCAT CAGAGCAGAT CACCACCAGC AGATGTTTAA TATTAAGCAG TTATTGAAAG 6 061 CTCAAGTGGT TCATCACTTT CTACTGACTT GTCAGGTTTT GCAGGAATAC AAAGAGGGGC 6 121 AACTCACACC CATGCCCCGA GAGGTTTGTA GATCATTTGT GAAAATTATA GCAGAAGTCC 6 181 TTGGATCTCC TCCAGATTTG GAATTATTGA CAATTATCTT CAATTTCCTT TTAGCAGTTC 6 241 ACCCTCCTAC TAATACTTAC GTTTGTCACA ATCCCACGAA CTTCTACTTT TCTTTGCACA 6 301 TAGATGGCAA GATCTTTCAG GAGAAAGTGC GGTCAATCAT GTACCTGAGG CATTC CAGCA 6 361 GTGGAGGAAG GTCCCTTATG AGCCCTGGAT TTATGGTAAT AAGCCCATCT GGTTTTACTG 6 421 CTTCACCATA TGAAGGAGAG AATTCCTCTA ATATTATTCC ACAACAGATG GCCGCCCATA 6 481 TGCTGCGTTC TAGAAGCCTA CCAGCATTCC CTACTTCTTC ACTACTAACG CAATCACAAA 6 541 AACTGACTGG AAGTTTGGGT TGTAGTATCG ACAGGTTACA AAATATTGCA GATACTTATG 6 601 TTGCCACCCA ATCAAAGAAA CAAAATTCTT TGGGGAGTTC CGACACACTG AAAAAAGGCA 6 661 AAGAGGACGC ATTCATCAGT AGCTGTGAGT CTGCAAAAAC TGTTTGTGAA ATGGAAGCTG 6 721 TCCTCTCAGC CCAGGTCTCT GTCAGTGATG TCCCAAAGGG AGTGCTGGGA TTTCCAGTGG 6 781 TCAAAGCAGA TCATAAACAG TTGGGAGCAG AACCCAGGTC AGAAGATGAC AGTCCTGGGG 6 841 ATGAGTCCTG CCCACGCCGA CCTGATTACC TAAAGGGATT GGCCTCCTTC CAGCGAAGCC 6 901 ACAGCACTAT TGCAAGCCTT GGGCTAGCTT TTCCTTCACA GAACGGATCT GCAGCTGTTG 6 961 GCCGTTGGCC AAGTCTTGTT GATAGAAACA CTGATGATTG GGAAAACTTT GCCTATTCTC 70 21 TTGGTTATGA GCCAAATTAC AACCGAACTG CAAGTGCTCA CAGTGTAACT GAAGACTGTT 70 81 TGGTACCTAT ATGCTGTGGA TTATATGAAC TCCTAAGTGG GGTTCTTCTT ATCCTGCCTG 71 41 ATGTTTTGCT TGAAGATGTG ATGGACAAGC TTATTCAAGC AGATACACTT TTGGTCCTCG 72 01 TTAACCACCC ATCACCAGCT ATACAACAAG GTGTTATTAA ACTATTAGAT GCATATTTTG 72 61 CTAGAGCATC TAAGGAACAA AAAGATAAAT TTCTGAAGAA TCGTGGATTT TCCTTGCTAG 73 21 CCAACCAGTT GTATCTTCAT CGAGGAACTC AAGAATTGTT AGAATGCTTC ATCGAAATGT 73 81 TCTTTGGTCG ACATATTGGC CTTGATGAAG AATTTGATCT GGAAGATGTG AGAAACATGG 74 41 GATTGTTTCA GAAGTGGTCT GTCATTCCTA TTCTGGGACT AATAGAGACC TCTCTATATG 7 501 ACAACATACT CTTGCATAAT GCTCTTTTAC TTCTTCTCCA AATTTTAAAT TCTTGTTCTA 75 61 AGGTAGCAGA TATGTTGCTG GATAATGGTC TACTCTATGT GTTATGTAAT ACAGTAGCAG 76 21 CCCTGAATGG ATTAGAAAAG AACATTCCCA TGAGTGAATA TAAATTGCTT GCTTGTGATA 76 81 TACAGCAACT TTTCATAGCA GTTACAATTC ATGCTTGCAG TTCCTCAGGC TCACAATATT 77 41 TTAGGGTTAT TGAAGACCTT ATTGTAATGC TTGGATATCT TCAAAATAGC AAAAACAAGA 78 01 GGACACAAAA TATGGCTGTT GCACTACAGC TTAGAGTTCT CCAGGCTGCT ATGGAATTTA 78 61 TAAGGACCAC CGCAAATCAT GACTCTGAAA ACCTCACAGA TTCACTCCAG TCACCTTCTG 79 21 CTCCCCATCA TGCAGTAGTT CAAAAGCGGA AAAGCATTGC TGGTCCTCGA AAATTTCCCC 79 81 TTGCTCAAAC TGAATCGCTT CTGATGAAAA TGCGTTCAGT GGCAAATGAT GAGCTTCATG 80 41 TGATGATGCA ACGGAGAATG AGCCAAGAGA ACCCTAGCCA AGCAACTGAA ACGGAACTTG 8 101 CGCAGAGACT ACAGAGGCTC ACTGTTTTAG CAGTCAACAG GATTATTTAT CAAGAATTTA 81 61 ATTCAGACAT TATTGACATT TTGAGAACTC CAGAAAATGT AACTCAAAGC AAGACCTCAG 82 21 TTTTCCAGAC CGAAATTTCT GAGGAAAATA TTCATCATGA ACAGTCTTCT GTTTTCAATC 82 81 CATTTCAGAA AGAAATTTTT ACATATCTGG TAGAAGGATT CAAAGTATCT ATTGGTTCAA 83 41 GTAAAGCCAG TGGTTCCAAG CAGCAATGGA CTAAAATTCT GTGGTCTTGT AAGGAGACCT 8 401 TCCGAATGCA GCTTGGGAGA CTACTAGTGC ATATTTTGTC GCCAGCCCAC GCTGCACAAG 84 61 AGAGAAAGCA AATTTTTGAA ATAGTTCATG AACCAAATCA TCAGGAAATA CTACGAGACT 85 21 GTCTCAGCCC ATCCCTACAA CATGGAGCCA AGTTAGTTTT GTATTTGTCA GAGTTGATAC 85 81 ATAATCACCA AGGTGAATTG ACTGAAGAAG AGCTAGGCAC AGCAGAACTG CTTATGAATG 86 41 CTTTGAAGTT ATGTGGTCAC AAGTGCATCC CTCCCAGTGC ATCAACAAAA GCAGACCTTA 87 01 TTAAAATGAT CAAAGAGGAA CAAAAGAAAT ATGAAACTGA AGAAGGAGTG AATAAAGCTG 8 761 CTTGGCAGAA AACAGTTAAC AATAATCAAC AAAGTCTCTT TCAGCGTCTG GATTCAAAAT 88 21 CAAAGGATAT ATCTAAAATA GCTGCAGATA TCACCCAGGC AGTGTCTCTC TCCCAAGGAA 88 81 ATGAGAGAAA AAAGGTGATC CAGCATATTA GAGGAATGTA TAAAGTAGAT TTGAGTGCCA 89 41 GCAGACATTG GCAGGAACTT ATTCAGCAGC TGACACATGA TAGAGCAGTA TGGTATGACC 90 01 CCATCTACTA TCCAACCTCA TGGCAGTTGG ATC CAACAGA AGGGCCAAAT CGAGAGAGGA 90 61 GACGTTTACA GAGATGTTAT TTAACTATTC CAAATAAGTA TCTCCTTAGG GATAGACAGA 91 21 AATCAGAAGA TGTTGTCAAA CCAC CACTCT CTTACCTGTT TGAAGACAAA ACTCATTCTT 91 81 CTTTCTCTTC TACTGTCAAA GACAAAGCTG CAAGTGAATC TATAAGAGTG AATCGAAGAT 92 41 GCATCAGTGT TGCACCATCT AGAGAGACAG CTGGTGAATT GTTACTAGGT AAATGTGGAA 93 01 TGTATTTTGT GGAAGATAAT GCTTCTGATA CAGTTGAAAG TTCGAGCCTT CAGGGAGAGT 93 61 TGGAACCAGC ATCATTTTCC TGGACATATG AAGAAATTAA AGAAGTTCAC AAGCGTTGGT 94 21 GGCAATTGAG AGATAATGCT GTAGAAATCT TTCTAACAAA TG GCAGAACA CTCCTGTTGG 94 81 CATTTGATAA CACCAAGGTT CGTGATGATG TATACCACAA TATACTCACA AATAACCTCC 95 41 CTAATCTTCT GGAATATGGT AACATCACCG CTCTGACAAA TTTATGGTAT ACTGGGCAAA 96 01 TTACTAATTT TGAATATTTG ACTCACTTAA ACAAACATGC TGGCCGATCC TTCAATGATC 96 61 TCATGCAGTA TCCTGTGTTC CCATTTATAC TTGCTGACTA CGTTAGTGAG ACACTTGACC 97 21 TCAATGATCT GTTGATATAC AGAAATCTCT CTAAACCTAT AGCTGTTCAG TATAAAGAAA 97 81 AAGAAGATCG TTATGTGGAC ACATACAAGT ACTTGGAGGA AGAGTACCGC AAAGGAGCCA 98 41 GAGAAGATGA CCCCATGCCT CCCGTGCAGC CCTATCACTA t g g c t c c c a c TATTCCAATA 99 01 GCGGCACTGT GCTTCACTTC CTGGTCAGGA TGCCTCCTTT CACTAAAATG TTTTTAGCCT 99 61 ATCAAGATCA AAGTTTTGAC ATTCCAGACA GAACTTTTCA TTCTACAAAT ACAACTTGGC 10 021 GACTCTCATC TTTTGAATCT ATGACTGATG TGAAAGAACT TATCCCAGAG TTTTTCTATC 10 081 TTCCAGAGTT CCTAGTTAAC CGTGAAGGTT TTGATTTTGG TGTGCGTCAG AATGGTGAAC 10 141 GGGTTAATCA CGTCAACCTT CCCCCTTGGG CGCGTAATGA TCCTCGTCTT TTTATCCTCA 10 201 TCCATCGGCA GGCTCTAGAG TCTGACTACG TGTCGCAGAA CATCTGTCAG TGGATTGACT 10 261 TGGTGTTTGG GTATAAGCAA AAGGGGAAGG CTTCTGTTCA AGCGATCAAT GTTTTTCATC 10 321 CTGCTACATA TTTTGGAATG GATGTCTCTG CAGTTGAAGA TC CAGTTCAG AGACGAGCGC 10 381 TAGAAACCAT GATAAAAACC TACGGGCAGA CTCCCCGTCA GCTGTTCCAC ATGGCCCATG 10 441 TGAGCAGACC TGGAGCCAAG CTCAATATTG AAGGAGAGCT TCCAGCTGCT GTGGGGTTGC 10 501 TAGTGCAGTT TGCTTTCAGG GAGACCCGAG AACAGGTCAA AGAAATCACC TATCCGAGTC 10 561 CTTTGTCATG GATAAAAGGC TT GAAATGGG GGGAATACGT GGGTTCCCCC AGTGCTCCAG 10 621 TACCTGTGGT CTGCTTCAGC CAGCCCCACG GAGAAAGATT TGGCTCTCTC CAGGCTCTGC 10 681 CCACCAGAGC AATCTGTGGT TTGTCACGGA ATTTCTGTCT TCTGATGACA TATAGCAAGG 10 741 AACAAGGTGT GAGAAGCATG AACAGTACGG ACATTCAGTG GTCAGCCATC CTGAGCTGGG 10 801 GATATGCTGA TAATATTTTA AGGTTGAAGA GTAAACAAAG TGAGCCTCCA GTAAACTTTA 10 861 TTCAAAGTTC ACAACAGTAC CAGGTGACTA GTTGTGCTTG GGTGCCTGAC AGTTGCCAGC 10 921 TGTTTACTGG AAGCAAATGC GGTGTCATCA CAGCCTACAC AAACAGATTT ACAAGCAGCA 10 981 CGCCATCAGA AATAGAAATG GAGACTCAAA TACATCTCTA TGGTCACACA GAAGAGATAA 11 041 CCAGCTTATT TGTTTGCAAA CCATACAGTA TAC TGATAAG TGTGAGCAGA GAC GGAACCT 11 101 GCATCATATG GGATTTAAAC AGGTTATGCT ATGTACAAAG TCTGGCGGGA CACAAAAGCC 11 161 CTGTCACAGC TGTCTCTGCC AGTGAAACCT CAGGTGATAT TGCTACTGTG TGTGATTCAG 11 221 CTGGCGGAGG CAGTGACCTC AGACTCTGGA CGGTGAACGG GGATCTCGTT GGACATGTCC 11 281 ACTGCAGGGA GATCATCTGT TCCGTGGCTT TCTCCAACCA GCCTGAGGGA GTATCTATCA 11 341 ATGTAATCGC TGGGGGATTA GAAAATGGAA TTGTAAGGTT ATGGAGCACA TGGGACTTAA 11 401 AGCCTGTGAG AGAAATTACA TTTCCCAAAT CAAATAAGCC CATCATCAGC CTTACATTTT 11 461 CTTGTGATGG CCACCATTTG TACACAGCAA ACAGTGATGG GACCGTGATT GCCTGGTGTC 11 521 GGAAGGAC CA GCAGCGCTTG AAACAGCCAA TGTTCTATTC CTTCCTTAGC AGCTATGCAG 11 581 CCGGGTGAAT GCGAATGAAC TTCACGTTCT CCAAAGCACT TTAAC TC CAA ACTAGATTTG

1164 1 TTGACTTCAC CAGTTTTAGG AGGTTGAACC TAAAGAAATG GATGACTGGA CAAACCATCC

1 170 1 AAATAATGAT AAAGTCTATT CATC TGCACA AAATTCTGAA GAGTCACATG ATC CTAAGAG

1176 1 GAAAGTTCTG TTCTATTTTA GTGATAATCT GGAAGATTGT GTCAATATGC ACTAGCCAAC

1 182 1 AAGTTTTAAG CCTCGCATGG TACATTAAAA TGATATTCTT AAAATTTTTT CCCACCAAGG

1 18 B 1 TATTCCAAAG AAAATATTAA GGTCTCCCCT TTTTCTATGA TTC CAAAAGG ACCAGTAGAA

1194 1 TTTAAATTGG TTGGTTGATT GTTTATATAA AACACACTAA AATTATATTT TAAAAGTTTA

1200 1 CTGCCATGAA ATACTCCTCC CACCACACAC ACATGCTCCA AAAGAGGAAA GAAAAAAAGA

1206 1 TAATTTTTAG GACTTGATAA TTGCTTTCTT TGAGAAGCAA ATTATTCAGT AGGTGCCTCT

1212 1 GTAC CAAATA TTTTATGGAA TATCTAAATA CTAAAATAAA CTATGAATGA ATC TCAAAAT

1 21 B 1 TAGGCAGTTT TTGCCAGTTG CTTTCTTAGC TCAAAGGAGA ACCAGAATTT TTTTGACAGC

1224 1 CACAAACAAG AATACAGGTA TCTTGGATTT CAGACACATT CTGTTTCTTC ATAAAAATTT

1 230 1 TACTTAAAAT CTGTAACGCT AGATATTGAC TATCCTTAGT TGAGTCACTG AGGTTTAAAC

1236 1 ACAATGGTAA GTCTTAAAGT CTGCTATTTA CAGAGCATTG AATCTGTACC AATTTGCAAT

1242 1 AGAAAGCCTT CAGTATGCAA GAAGTTTGCA TGGGTATTAA GAACACAGCC TAAATAAGGC

1 24 B 1 ATTTGATCTA ATCTGCAGGA AGAATTTTCT TCCCCAAAAC AGAATTATAA AAGCTTACTT

1254 1 TAAACAGGAG GCAGAATAAT TCTTTTAGGA AACCATTTCA TTCTGTTTCT ACTAACCTAT

1 260 1 ACCATCTGAG AATTCTAGGA AGAATAATAA AATCTCGTGT ATTCCACAGC AAACTTACAT

1266 1 ACCATAAAGA CAGAATTCCT AAACATCTTG GAGCCGTCTG TCTCTCCCAT ATGATGGCTG

1 272 1 TCTGTATATT TTTACTTGGG GTGCTGCTTT ATTGGCTTTG AAAACACTGT CAGATAAGCT

1 27 B 1 CAGTAATATG TTACCATGGG ATAAAAATAT GTATCCCTGC CTAAGAATAA CTTGTGCATT

1 284 1 TGTTATGGAA ATTTAATTCA TATGGTGTTT ACAGTAC TAC TTTTGTAACT TCCAGACTTT

1290 1 CTAAAACATT CTGCTTAAAA ACCATATAAA ATATAATTC C AAAGTCTCTG CTGTCAAGAT

1296 1 AGATTCGAGA GAAAGCACGT GGCCATGTAT GCTTTAACCT TAAACTGCAT ACACATGTAG

1302 1 TGATACCTAG GCTGCATTTA GATCACCGTG TGCTCAGGCC AGGTGTGAAT CCTGAGGTCC

1 308 1 ATGGAGGTGC AGAGATGAGA TTACTCCTAT TCACGTTGAA GTGATTTGCT TTGTTAACAA

1314 1 AAAATTGCAG CTATTGTCTA GCTTTCATTT TTTTACTGAG AACTTTAAAT TAGTCCCCTA

1 320 1 TTAGAATAGG GTTGCTACTO ATCTTTTTTT AAAAACCGAA TTTCATCATT TATCTAAAGA

1 326 1 GAAAATATGC AGAATAACTG GTCTTGTTAA GAGTGCAATA TTATATTTTT ATGTAAAAAT

1 332 1 AAAAATTAAT TTGGGGGGAT TATTTATTCA GCATGAAACC TAATATGTAT ATGTTTGAAA

1 33 B 1 TACTTCATAA TGTGCATGTT GTAGCAAACA TTTCTGTAAA TTATCACAAG CTCTGTTACC

1344 1 TTTATATACA CTGCCTCTTC AATTTGGAAA TAAATTTCAT AAAAATAGAT GTAAACAAAA

1350 1 AAA

(SEQ ID NO: 1). También se desvelan secuencias de nucleótidos que tienen al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 1.

2. La proteína LYST

El polipéptido LYST es una proteína citoplasmática de 3.801 aminoácidos (también conocido como regulador del tráfico lisosomal, proteína CHS, CHS1 o proteína LYST) con un peso molecular de aproximadamente 429 kDa (Barbosa, et al., Nature, 382(6588): 262-265 (1996)).

La proteína LYST existe como una de tres isoformas y se predice que adopta una estructura helicoidal (Barbosa, et al., Nature, 382(6588): 262-265 (1996)).

La proteína LYST está altamente conservada a través de especies de mamíferos y está expresada a niveles bajos en todos los tipos celulares, pero está expresada abundantemente en el timo de adulto y fetal, leucocitos de sangre periférica, médula ósea y varias regiones del cerebro del adulto (véase la revisión de Dotta, et al., Orphanet Journal of Rare Diseases, 8: 168 (2013), y referencias en la misma).

En la técnica se conocen secuencias de aminoácidos de la proteína LYST humana. Véase, por ejemplo, el N.° U67615 de acceso en GenBank:

MSTDSNSLAR EFLTDVNRLC NAWQRVEAR EEEEEE THMA TLGQYLVHGR GFLLLTKLNS 60

IID Q A LTCRE ELLTLLLSLL PLVWKIPVQE EKATDFNLPL SA D IIL TK EK NSSSQRSTQE 120

KLHLEGSALS SQVSAKVNVF RKSRRQRKIT HRY SVRDARK TQLSTSDSEA NSDEKGIAMN 130

KH5RPH LLHH FLTSFPKQDH PKAK LDRLAT KEQTPPDAMA L E N S R E IIP R QG SNTDILSE 240

PAALSVISNM NNSPFDLCHV LLSLLEKVCK FDVTLNHNSP L A A SW PTL T EFLAGFGDCC 300

SLSDNLESRV V SAGWTEEPV ALIQRMLFRT VLHLLSVDVS TAEMMPENLR KNLTELLRAA 360

LK IR IC LEK Q PDPFAPRQKK TLQEVQEDFV FSKYRHRALL LPELLEGVLO IL IC C LQ SA A 420

SNPFYFSQAM DLVQEFIQHH GFNLFETAVL QMEWLVLRDG VPPEASEHLK ALINSVMKIM 480

STVKKVKSEQ LHHSMCTRKR HRRCEYSHFM HHHRDLSGLL VSAFKNQVSK NPFEETADGD 540

VYYPERCCCI AVCAHQCLRL LQQASLSSTC VQILSGVHNI GICCCMDPKS V IIP L L H A FK 600

LPALKNFQQH IL N IL N K L IL DQLGGAEISP KIKKAACNIC t v d s d q l a q l EETLQGNLCD 660

A E L SSSL SSP SY RFQ G ILPS SGSEDLLWXW DALKAYQNFV FEEDRLHSIQ IA N H IC N L IQ 720

KGNIWQWKL YNYIFNPVLQ RGVELAHHCQ HLSVTSAQSH VCSHHNQCLP QDVLQIYVXT 780

L PIL L K S R V I RDLFLSCNGV SQ IIEL N C L N GIRSHSLKAF E T L IIS L G E Q QKDASVPDID 840

G ID IEQ K ELS SVHVGTS FHH QQAYSDSPQS LSKFYAGLKE AYPKRRKTVN QDVHINTINL 900

FLCVAFLCVS KEAESDRESA NDSEDTSGYD STASEPLSHM L P C IS L E S L V LPSPEHMHQA 960

ADIWSMCRWI YMLSSVFQKQ FYRLGGFRVC H K L IFM IIQ K LFRS HKEEQG KKEGDTSVNE 1020

NQDLNRISQP KRTMKEDLL S L A IK S D P IP S ELGSLKKSAD SLGKLELQHI SSINVEEVSA 1080

TEAAPEEAKL FTSQ ESETSL Q SIR LLEA LL AICLHGARTS QQKMELELPN Q N LSV ESILF 1140

EMRDHLSQSK VIETQLAKPL FDAL LRVALG NYSADFEHND AMTEKSHQSA EELSSQPGDF 1200

SEEAEDSQCC S FKLLVEEEG YEADSESNPE DGETQDDGVD LKSETEGFSA SSSPNDLLEN 1260

L T Q G E IIY PE ICMLELNLLS ASKAKLDVLA H V F E S F L K II RQKEKNVFLL MQQGTVKNLL 1320

GGFLSILTQD DSDFQACQRV LVDLLVSLMS SRTCSEELTL L L R IF L E K S P C T K IL L L G IL 1380

K IIE SD TT M S PSQYLTFPLL HAPNLSNGVS SQKYPGILNS KAMGLLRRAR VSRSKKEADR 1440

ESFPH R LLSS WHIAPVHLPL LGQNCWPHLS EGFSVSLWFN V EC1HEAEST TEKGKKIKKR 1500

N K SL ILPD SS FDGTESDRPE GAEYINPGER L IE E G C 1H II SLGSKALMIQ VWADPHNATL 1560

IFRVCMDSND DMKAVLLAQV E SQ E N IF L P S KWQHLVLTYL QQPQGKRR1H GKISIW VSGQ 1620

RKPDVTLDFM LPRKTSLSSD SNKTFCMIGH CLSSQEEFLQ LAGKWDLGNL LLFNGAKVGS 1680

QEAFYLYACG PNHTSVMPCK Y GKPVNDY SK Y IN K EILR C E QIRELFMTKK D V D IG LLIES 1740

LSW Y TTY C P A Q Y TIY EPV I RLKGQMKTQL SQRPFSSKEV Q SILLEPH H L KNLQPTEYKT 1800

IQ G IL H E IG G TG IFV FLFA R W E L S S C E E T QALALRVILS LIKYNQQRVH ELENCNGLSM 1860

1HQVLIKQKC IV G FY IL K T L LEG CCGEDII YMNENGEFKL DVDSNAIIQD VKLLEELLLD 1920

WKIWSKAEQG VWETLLAALE VLIRADHHQQ MFNIKQLLKA QW HHFLLTC QVLQEYKEGQ 1980

LTPMPREVCR SFV K IIA EV L GSPPDLELLT IIFN FL LA V H PPTNTYVCHN PTN FY FSLH I 2040

DGKIFQEKVR SIM YLRHSSS GGRSLMSPGF M VISPSGFTA SPYEGENSSN IIPQQMAAHM 2100

LRSRSLPAFP TSSLLTQSQK LTGSLGCSID RLQNIADTYV ATQSKKQNSL GSSDTLKKGK 2160

ED A FISSC ES AKTVCEMEAV LSAQVSVSDV PK GVLGFPW KADHKQLGAE PRSEDDSPGD 2220

ESCPRRPDYL KGLASFQRSH STIASLG LA F PSQNGSAAVG RWPSLVDRNT d d w e n f a y s l 2280

SYEPNYNRTA SAHSVTEDCL VPICCGLYEL LSGV LLILPD VLLEDVMDKL IQADTLLVLV 2340

NHPSPAIQQG VIKLLDAYFA RASKEQKDKF LKNRGFSLLA NQLYLHRGTQ ELLECFIEM F 2400

FGRHIGLDEE FDLEDVRNMG LFQKW SVIPI LGLIETSLYD NILLHNALLL LLQILNSCSK 2460

VADMLLDNGL LYVLCNTVAA LNGLEKNIPM SEYKLLACDI Q Q LFIA V T1H ACSSSGSQYF 2520

RVIEDLIVM L GYLQNSKNKR TQNMAVALQL RVLQAAMEFI RTTANHDSEN LTDSLQSPSA 2580

PHHAWQKRK SIA G PR K FPL a q t e s l l m k m RSVANDELHV MMQRRMSQEN PSQATETELA 2640

QRLQRLTVLA V N RIIYQEFN S D IID IL R T P ENVTQSKTSV F Q T E IS E E N I HHEQSSVFNP 2700

FQKEIFTYLV EG FK V SIG SS KASGSKQQWT KILW SCKETF RMQLGRLLVH ILSPAHAAQE 2760

R K Q IFEIV H E PNHQEILRDC LSPSLQHGAK LVLYLSEL1H NHQGELTEEE LGTAELLMNA 2820

LKLCGHKCIP PSASTKADLI KMIKEEQKKY ETEEGVNKAA WQKTVNNNQQ SLFQRLDSKS 2880

K D ISK IA A D I TQAVSLSQGN ERKKVIQHIR GMYKVDLSAS RHMQELIQQL THDRAVWYD P 2940

IYYPTSWQLD PTEGPNRERR RLQRCYLTIP NKYLLRDRQK SE D W K PPL S YLFEDKTHSS 3000

FS STVKDKAA SESIRVNRRC ISV A PSRETA GELLLGKCGM YFVEDNASDT VESSSLQGEL 3060

EPASFSWTYE EIKEVHKRWW QLRDNAVEIF LTNGRTLLLA FDNTKVRDDV YHNILTNNLP 3120

NLLEYGNITA LTNLWYTGQI TNFEYLTHLN KHAGRSFNDL M QYPVFPFIL ADYVSETLDL 31 B 0

NDLLIYRNLS KPIAVQYKEK EDRYVDTYKY LEEEYRKGAR EDDPMPPVQP YHYGSHYSNS 32 40

GTVLHFLVRM PPFTKMFLAY QDQSFDIPDR TFHSTNTTWR LSSFESMTDV K E L IPE FFY L 3300

PEFLVNREGF DFGVRQNGER VNHVNLPPWA R N D PR L FIL I HRQALESDYV SQNICQW IDL 3360

VFGYKQKGKA SVQAINVFHP ATYFGMDV SA VEDPVQRRAL ETMIKTYGQT PRQLFHMAHV 3420

SRPGAKLNIE GELPAAVGLL VQFAFRETRE Q V KEITY PSP LSWIKGLKWG EYVGSPSAPV 3480

FW C FSQ PH G ERFGSLQALP TRAICGLSRN FCLLMTY SKE QGVRSMNSTD IQWSAILSWG 3540

YADNILRLKS KQ SEPPVNFI QSSQQYQVTS CAWVPDSCQL FTGSKCGVIT AYTNRFTSST 3600

PSEIE M E T Q I HLYGHTEEIT SLFVCKPY S I LISVSRDGTC IIWDLNRLCY VQSLAGHKSP 3660

VTAVSASETS GDIATVCDSA GGGSDLRLWT VNGDLVGHVH C R E IIC SV A F SNQPEGVSIN 3720

VIAGGLENGI VRLWSTWDLK PV R EIT FPK S N K P IIS L T F S CDGHHLYTAN SDGTVIAWCR 37 BO

KDQQRLKQPM FYSFLSSYAA G 38 01

Se desvelan polipéptidos LYST que tienen al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2.

Aunque la proteína LYST se ha asociado con muchas actividades celulares diversas, en particular en el tráfico de proteínas intracelulares en endosomas y lisosomas, la función biológica de la proteína LYST ha permanecido en gran parte desconocida.

La expresión y función anómalas del producto del gen LYST se ha implicado en numerosos trastornos patológicos, que incluyen enfermedades autoinmunitarias, trastornos hiperproliferativos y disfunción plaquetaria. Específicamente, las mutaciones en el gen LYST están asociadas a la enfermedad humana, síndrome de Chediak-Higashi (CHS) (Barrat, et al., Am. J. Hum. Genet, 59: 625-632 (1996)). En el paciente con CHS, el gen LYST contiene una mutación de desplazamiento de marco en los nucleótidos 117-118 del dominio codificante.

El CHS es un trastorno raro de almacenamiento lisosomal que se caracteriza por hipopigmentación, deficiencia inmunitaria grave, tendencia al sangrado, anomalías neurológicas, transporte intracelular anómalo hacia y desde el lisosoma y los cuerpos de inclusión gigantes en una diversidad de tipos celulares. En personas con el síndrome de Chediak-Higashi se han identificado al menos 30 mutaciones en el gen LYST. Estas mutaciones alteran la función normal de la proteína reguladora del tráfico lisosomal, que altera el tamaño, la estructura y la función de los lisosomas y las estructuras relacionadas dentro de las células. Las personas con mutaciones en LYST tienen lisosomas anómalamente grandes y estructuras relacionadas en las células de todo el organismo. Estas estructuras agrandadas interfieren con las funciones celulares normales. Los lisosomas agrandados en las células del sistema inmunitario, tales como macrófagos, evitan que estas células respondan adecuadamente a las bacterias y otros invasores extraños; los lisosomas perinucleares grandes están dispuestos en forma tubular dentro de las células de macrófagos de las personas con CHS. Los neutrófilos y monocitos afectados tienen una capacidad quimiotáctica y migratoria que es aproximadamente un 40 % de la de las células normales. Los pacientes afectados también tienen tendencia a sangrar debido a la disfunción plaquetaria. Como resultado de la disminución de la capacidad de respuesta a los estímulos quimiotácticos, el sistema inmunitario que funciona mal no puede proteger al organismo de infecciones graves y recurrentes. El CHS a menudo es mortal porque los pacientes están inmunodeprimidos y son incapaces de aumentar una respuesta inmunitaria eficaz a la infección.

En la cepa de ratón de color beige (Bg), el homólogo de LYST ("Lyst') de ratón se interrumpe por una deleción que impide la expresión de la proteína Lyst funcional. Se encontró que los ratones Bg exhibían una reducción de las enfermedades proliferativas, incluyendo una tasa menor de estenosis después del implante de injertos tisulares vascular, en comparación con los ratones de tipo silvestre. El efecto de la proteína Lyst disfuncional en ratones Bg es altamente específico de macrófagos, tal como se determina mediante experimentos de trasplante de médula ósea (véanse los Ejemplos).

C. Inhibidores de LYST

Se ha establecido que el bloqueo de la proteína LYST puede reducir o prevenir los procesos inmunitarios que dan lugar a trastornos proliferativos vasculares, enfermedad fibroproliferativa y tejido cicatricial excesivo después de una lesión. Se desvelan agentes inmunomoduladores que inhiben o reducen la transcripción, traducción o función de la proteína LYST.

Los inhibidores de LYST se pueden unir al gen LYST o a la proteína LYST y bloquear directa o indirectamente la función biológica de la proteína LYST. Los inhibidores también pueden bloquear la función biológica de una o más rutas de señalización que constituyen la función biológica corriente abajo de LYST. En algunas realizaciones, los inhibidores de LYST actúan impidiendo que los ligandos endógenos de la proteína LYST interactúen o se unan directamente a la proteína LYST. Los inhibidores pueden bloquear las interacciones proteína-proteína que implican a la proteína LYST, o pueden prevenir o reducir la actividad funcional de un complejo de la proteína LYST y un ligando. Los inhibidores que se unen directamente a la proteína LYST pueden actuar por oclusión directa de un sitio activo en la proteína LYST, o por oclusión indirecta, tal como por bloqueo esteárico de interacciones de LYST. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el inhibidor obstruye u ocluye la función de un dominio de interacción de proteína, tal como el dominio de proteína solenoide formado por copias en tándem del motivo de repetición WD40. En otras realizaciones, los inhibidores se unen a una ubicación que es espacialmente distinta de un sitio activo.

Los inhibidores que se unen a la proteína LYST pueden prevenir la función de LYST mediante mecanismos que incluyen, pero no se limitan a, la inducción de dimerización, la inducción de oligomerización, la inducción de cambios conformacionales, la prevención de funciones catalíticas, la inducción de degradación, la inducción de captación por células inmunitarias, la prevención de captación por células diana, la prevención de unión a ligando, que previene la fosforilación, induce la desnaturalización, previene una o más modificaciones postraduccionales o altera de otro modo la estructura terciaria nativa de la proteína LYST.

Se entiende que el inicio o la transducción de las rutas de señalización celular por LYST puede requerir la unión de un ligando a la proteína LYST. Por lo tanto, las proteínas, los anticuerpos o las moléculas pequeñas que bloquean las rutas de transducción de señales que implican a LYST y que opcionalmente previenen el coligamiento de LYST y sus receptores son agentes inmunomoduladores útiles. Las clases de inhibidores de LYST que se discuten a continuación incluyen anticuerpos y ácidos nucleicos funcionales.

1. Anticuerpos

Se desvelan anticuerpos que inhiben la función de LYST uniéndose directamente a la proteína LYST, sus ligandos o sus moléculas suplementarias. En los métodos y composiciones que se proporcionan en el presente documento se puede usar cualquier anticuerpo específico. Los anticuerpos pueden incluir un sitio de unión a antígeno que se une a un epítopo de la proteína LYST. La unión de un anticuerpo a LYST puede inhibir o reducir la función de la proteína LYST mediante uno o más mecanismos distintos.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo dentro de la proteína codificada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. El epítopo puede ser un epítopo lineal y puede incluir uno o más aminoácidos consecutivos de la secuencia primaria de SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir a un epítopo conformacional que incluye una característica de superficie 3-D, forma o estructura terciaria de la proteína LYST. En algunas realizaciones, una característica de superficie 3-D puede incluir cualquier número de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o los restos correspondientes en un homólogo, ortólogo, parálogo o variante del mismo.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a un epítopo dentro de la proteína codificada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 solo se puede unir si la proteína codificada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 no está unida por un ligando o molécula pequeña.

En las composiciones y métodos desvelados se pueden usar diversos tipos de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, que incluyen inmunoglobulina completa de cualquier clase, fragmentos de la misma y proteínas sintéticas que contienen al menos el dominio variable de unión a antígeno de un anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo IgG, tal como IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4. Un anticuerpo puede estar en forma de un fragmento de unión a antígeno que incluye un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, una región variable de cadena sencilla y similares. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales (mAb). Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la cadena o las cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que se unan específicamente al antígeno diana y/o exhibe la actividad biológica deseada (documento de Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567; y Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos desvelados también se pueden modificar por medios recombinantes, por ejemplo, mediante deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos, para aumentar la eficacia del anticuerpo en la mediación de la función deseada. Las sustituciones pueden ser sustituciones conservativas. Por ejemplo, al menos un aminoácido en la región constante del anticuerpo se puede reemplazar con un resto diferente (véase, por ejemplo, el documento de patente de Estados Unidos N.° 5.624.821; el documento de patente de Estados Unidos N.° 6.194.551; el documento WO 9958572; y Angal, et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993)). En algunos casos, se realizan cambios para reducir actividades no deseadas, por ejemplo, citotoxicidad dependiente del complemento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico que tiene especificidades de unión para al menos dos epítopos antigénicos diferentes. En una realización, los epítopos son del mismo antígeno. En otra realización, los epítopos son de dos antígenos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden incluir fragmentos de anticuerpo biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 6444­ 48 (1993); Gruber, et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)).

Una diversidad de anticuerpos que se unen a la proteína LYST humana están disponibles en el mercado a partir de múltiples fuentes, por ejemplo, Santa Cruz Biotechnology, CA, EE. UU., N.° de Cat. sc-136746). Los anticuerpos se pueden generar mediante cualquier medio conocido en la técnica. Los medios de descripciones a modo de ejemplo para la generación y la producción de anticuerpos incluyen Delves, Antibody Production: Essential Techniques (Wiley, 1997); Shephard, et al., Monoclonal Antibodies (Oxford University Press, 2000); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles And Practice (Academic Press, 1993); y Current Protocols In Immunology (John Wiley & Sons, la edición más reciente). Se pueden generar fragmentos de moléculas de Ig intactas usando métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo digestión enzimática y medios recombinantes.

2. Ácidos nucleicos funcionales

Se desvelan ácidos nucleicos funcionales que inhiben la transcripción, traducción o función de los productos del gen LYST. Los ácidos nucleicos funcionales son moléculas de ácidos nucleicos que tienen una función específica, tal como unirse a una molécula diana o catalizar una reacción específica. Como se discute con más detalle a continuación, las moléculas de ácidos nucleicos funcionales se pueden dividir en las siguientes categorías no limitantes: moléculas antisentido, ARNsi, miARN, aptámeros, ribozimas, moléculas formadoras de tríplex, ARNi, y secuencias guía externas. Las moléculas de ácidos nucleicos funcionales pueden actuar como efectores, inhibidores, moduladores y estimuladores de una actividad específica poseída por una molécula diana, o las moléculas de ácidos nucleicos funcionales pueden poseer una actividad de novo independiente de cualquier otra molécula.

Las moléculas de ácidos nucleicos funcionales pueden interactuar con cualquier macromolécula, tal como ADN, ARN, polipéptidos o cadenas de carbohidratos. Por lo tanto, los ácidos nucleicos funcionales pueden interactuar con el ARNm o el ADN genómico del polipéptido LYST o pueden interactuar con el propio polipéptido LYST. Los ácidos nucleicos funcionales se diseñan a menudo para interactuar con otros ácidos nucleicos basándose en la homología de secuencia entre la molécula diana y la molécula de ácido nucleico funcional. En otras situaciones, el reconocimiento específico entre la molécula de ácido nucleico funcional y la molécula diana no se basa en la homología de secuencia entre la molécula de ácido nucleico funcional y la molécula diana, sino que se basa en la formación de una estructura terciaria que permite que se lleve a cabo un reconocimiento específico. Por lo tanto, las composiciones desveladas pueden incluir uno o más ácidos nucleicos funcionales diseñados para reducir la expresión o función de la proteína LYST.

En algunas realizaciones, la composición incluye un ácido nucleico funcional o polipéptido diseñado para dirigirse y reducir o inhibir la expresión o traducción de ARNm de LYST; o para reducir o inhibir la expresión, reducir la actividad o aumentar la degradación de la proteína LYST. En algunas realizaciones, la composición incluye un vector adecuado para la expresión in vivo del ácido nucleico funcional.

En algunas realizaciones, se diseña un ácido nucleico funcional o polipéptido para que se dirija a un segmento del ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ⁱD NO: 2, o el complemento de la misma, o variantes de la misma que tienen una secuencia de ácidos nucleicos idéntica en un 65 %, un 70 %, un 71 %, un 72 %, un 73 %, un 74 %, un 75 %, un 76 %, un 77 %, un 78 %, un 79 %, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % a un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

En otras realizaciones, se diseña un ácido nucleico funcional o polipéptido para que se dirija a un segmento de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1, o el complemento de la misma, o variantes de la misma que tienen una secuencia de ácidos nucleicos idéntica en al menos un 65 %, un 70 %, un 71 %, un 72 %, un 73 %, un 74 %, un 86 %, un

98 %, un En algunas realizaciones, el ácido nucleico funcional se hibrida con el ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, o un complemento del mismo, por ejemplo, en condiciones rigurosas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico funcional se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma, por ejemplo, en condiciones rigurosas.

En la técnica se conocen algunos métodos de preparación y uso de vectores para la expresión in vivo de los ácidos nucleicos funcionales desvelados tales como oligonucleótidos antisentido, ARNsi, ARNsh, miARN, EGS, ribozimas y aptámeros.

i. Moléculas antisentido

Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser moléculas antisentido. Las moléculas antisentido están diseñadas para interactuar con una molécula de ácido nucleico diana mediante emparejamiento de bases canónicas o no canónicas. La interacción de la molécula antisentido y la molécula diana está diseñada para promover la destrucción de la molécula diana mediante, por ejemplo, degradación del híbrido ARN-ADN mediada por ARNasa H. Alternativamente, la molécula antisentido está diseñada para interrumpir una función de procesamiento que normalmente se podría producir en la molécula diana, tal como transcripción o replicación. Se pueden diseñar moléculas antisentido basándose en la secuencia de la molécula diana. Existen numerosos métodos para optimizar la eficacia antisentido encontrando las regiones más accesibles de la molécula diana. Algunos métodos a modo de ejemplo incluyen experimentos de selección in vitro y estudios de modificación de ADN usando DMS y DEPC. Es preferente que las moléculas antisentido se unan a la molécula diana LYST con una constante de disociación (Kd) menor o igual que 10-6, 10-8, 10--I0, o 10-12.

ii. Aptámeros

Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser aptámeros. Los aptámeros son moléculas que interactúan con una molécula diana, preferentemente de una manera específica. Por lo general, los aptámeros son ácidos nucleicos pequeños que tienen una longitud que varía de 15-50 bases que se pliegan en estructuras secundarias y terciarias definidas, tales como tallo-bucles o cuartetos de G. Los aptámeros se pueden unir a moléculas pequeñas, tales como ATP y teofilina, así como a moléculas grandes, tales como transcriptasa inversa y trombina. Los aptámeros se pueden unir muy estrechamente con las Kd de la molécula diana menores que 10-12 M. Es preferente que los aptámeros se unan a la molécula diana LYST con una Kd menor que 10-6, 10-8, 10-10, o 10-12. Los aptámeros se pueden unir a la molécula diana con un grado de especificidad muy alto. Por ejemplo, se han aislado aptámeros que tienen una diferencia mayor que 10.000 veces en las afinidades de unión entre la molécula diana y otra molécula que difieren en una sola posición de la molécula. Es preferente que el aptámero tenga una Kd con la molécula diana LYST al menos 10, 100, 1000, 10.000 o 100.000 veces menor que la Kd con una molécula de unión de fondo. Cuando se hace la comparación para una molécula tal como un polipéptido, es preferente que la molécula de fondo sea un polipéptido diferente.

iii. Ribozimas

Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ácido nucleico que son capaces de catalizar una reacción química, ya sea por vía intramolecular o por vía intermolecular. Es preferente que las ribozimas catalicen reacciones intermoleculares. Se desvelan diferentes tipos de ribozimas que catalizan reacciones de tipo nucleasa o ácido nucleico polimerasa que se basan en ribozimas que se encuentran en sistemas naturales, tales como ribozimas de cabeza de martillo. También se desvelan ribozimas que no se encuentran en sistemas naturales, pero que han sido diseñadas para catalizar reacciones específicas de novo. Las ribozimas preferentes escinden sustratos de ARN o ADN y, más preferiblemente, escinden sustratos de ARN. Las ribozimas escinden generalmente sustratos de ácidos nucleicos mediante el reconocimiento y la unión del sustrato diana con escisión posterior. Este reconocimiento a menudo se basa principalmente en interacciones de pares de bases canónicas o no canónicas. Esta propiedad hace que las ribozimas sean candidatas particularmente buenas para dirigirse a la escisión específica de ácidos nucleicos porque el reconocimiento del sustrato diana se basa en la secuencia de sustratos diana.

iv. Oligonucleótidos formadores de triplex

Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser moléculas de oligonucleótidos que forman tríplex. Las moléculas de ácido nucleico funcionales que forman tríplex son moléculas que pueden interactuar con ácido nucleico bicatenario o monocatenario. Cuando las moléculas tríplex interactúan con una región diana, se forma una estructura denominada tríplex en la que hay tres hebras de ADN que forman un complejo dependiente del emparejamiento de bases de Watson-Crick y Hoogsteen. Las moléculas tríplex son preferentes porque se pueden unir a regiones diana con afinidad y especificidad altas. Es preferente que las moléculas formadoras de tríplex se unan a la molécula diana con una Kd menor que 10-6, 10-8, 10-10, o 10-12.

v. Secuencias guía externas

Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser secuencias guía externas. Las secuencias guía externas (EGS) son moléculas que se unen a una molécula de ácido nucleico diana formando un complejo, que es reconocido por la RNasa P, que a continuación escinde la molécula diana. Las EGS se pueden diseñar para que se dirijan específicamente a una molécula de ARN de elección. La ARNasa P ayuda a procesar el ARN de transferencia (ARNt) dentro de una célula. Se puede reclutar ARNasa P bacteriana para escindir prácticamente cualquier secuencia de ARN usando una EGS que hace que el complejo ARN:EGS diana imite al sustrato de ARNt natural. Del mismo modo, la escisión dirigida por EGS/ARNasa P eucariota del ARN se puede usar para escindir las dianas deseadas dentro de las células eucariotas. En la técnica se conocen algunos ejemplos representativos de cómo preparar y usar moléculas de EGS para facilitar la escisión de una diversidad de moléculas diana diferentes.

vi. ARN de interferencia

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos funcionales inducen el silenciamiento génico mediante ARN de interferencia (ARNsi). La expresión del gen LYST se puede silenciar de forma eficaz de una manera muy específica mediante ARN de interferencia.

El silenciamiento génico se observó originalmente con la adición de ARN bicatenario (ARNds) (Fire, et al. (1998) Nature, 391: 806-11; Napoli, et al. (1990) Plant Cell 2: 279-89; Hannon, (2002) Nature, 418: 244-51). Una vez que el ARNds entra en una célula, es escindido por una enzima similar a la RNasa III denominada Dicer, en ARN de interferencia pequeños bicatenarios (ARNsi) de 21-23 nucleótidos de longitud que contienen 2 salientes nucleotídicos en los extremos 3' (Elbashir, et al., Genes Dev., 15: 188-200 (2001); Bernstein, et al., Nature, 409: 363­ 6 (2001); Hammond, et al., Nature, 404: 293-6 (2000); Nykanen, et al., Cell, 107: 309-21 (2001); Martinez, et al., Cell, 110: 563-74 (2002)). El efecto de ARNi o ARNsi o su uso no se limita a ningún tipo de mecanismo.

En una realización, un ARNsi desencadena la degradación específica de moléculas de ARN de LYST homólogas, tales como los ARNm de LYST, dentro de la región de identidad de secuencia tanto entre el ARNsi como el ARN de LYST diana.

El silenciamiento génico específico de secuencia se puede lograr en células de mamíferos usando ARN sintéticos bicatenarios cortos que imitan a los ARNsi producidos por la enzima dicer (Elbashir, et al., Nature, 411: 494-498 (2001)) (Ui-Tei, et al., FEBS Lett, 479: 79-82 (2000)).

El ARNsi se puede sintetizar por vía química o in vitro o puede ser el resultado de los ARN horquillados bicatenarios cortos (ARNsh) que se procesan en los ARNsi dentro de la célula. Por ejemplo, el documento WO 02/44321 desvela ARNsi capaces de degradación específica de secuencia de los ARNm diana cuando se emparejan bases con extremos salientes en 3', y describe el método para preparar estos ARNsi. Los ARNsi sintéticos generalmente se diseñan usando algoritmos y un sintetizador de ADN/ARN convencional. Algunos proveedores incluyen Ambion (Austin, Texas), ChemGenes (Ashland, Massachusetts), Dharmacon (Lafayette, Colorado), Glen Research (Sterling, Virginia), MWB Biotech (Esbersberg, Alemania), Proligo (Boulder, Colorado), y Qiagen (Vento, Países Bajos). El ARNsi también se puede sintetizar in vitro usando kits tal como el kit de construcción de ARNsi SILENCE^r® de Ambion. En algunas realizaciones, la composición incluye un vector que expresa el ácido nucleico funcional. La producción de ARNsi a partir de un vector se realiza más comúnmente mediante la transcripción de una ARNasa horquillada corta (ARNsh). Hay disponibles kits para la producción de vectores que incluyen ARNsh, tales como, por ejemplo, los kits de construcción GENESUPPRESSOR™ de Imgenex y vectores de plásmido y lentivirus de a Rní inducible BLOCK-IT™ de Invitrogen. En algunas realizaciones, el ácido nucleico funcional es ARNsi, ARNsh o miARN.

B. Excipientes, vehículos y dispositivos de administración

Los inhibidores de LYST se pueden administrar y captar en las células de un sujeto con o sin la ayuda de un vehículo de administración. En la técnica se conocen algunos vehículos de administración apropiados para los inhibidores desvelados y se pueden seleccionar para que se adapten al inhibidor particular. En una realización preferente, el inhibidor se administra mediante inyección por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía intraperitoneal o por vía local. Algunos vehículos habituales son solución salina, solución salina tamponada con fosfato y otros vehículos inyectables.

Se desvelan formulaciones que incluyen uno o más inhibidores de LYST con o sin vehículos de administración. Los inhibidores de LYST desvelados se pueden formular en composiciones farmacéuticas que incluyen uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para diferentes mecanismos de administración, de acuerdo con el inhibidor y el uso pretendido. Se desvelan algunas composiciones farmacéuticas formuladas para administración por vía parenteral (inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea), tópica o transdérmica (ya sea de forma pasiva o usando iontoforesis o electroporación) o usando insertos bioerosionables.

1. Administración parenteral

En algunas realizaciones, uno o más inhibidores de LYST y opcionalmente un vehículo de administración se formulan para su administración en solución acuosa, mediante inyección parenteral. La formulación también se puede presentar en forma de suspensión o emulsión. En general, se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen cantidades eficaces de un agente activo, resto de direccionamiento y un vehículo de administración opcional e incluyen opcionalmente diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen los diluyentes agua estéril, solución salina tamponada de contenido de tampón diverso (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica y, opcionalmente, aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, TWE^e N® 20, TWEEN® 80 también denominados polisorbato 20 u 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito sódico) y conservantes (por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico) y sustancias de carga (por ejemplo, lactosa, manitol). Algunos ejemplos de disolventes o vehículos no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Las formulaciones se pueden liofilizar y volver a disolver/resuspender inmediatamente antes de su uso. La formulación se puede esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, incorporando agentes esterilizantes en las composiciones, irradiando las composiciones o calentando las composiciones.

2. Administración pulmonar y mucosal

En otras realizaciones, uno o más inhibidores de LYST y opcionalmente un vehículo de administración se formulan para su administración a la mucosa, tal como la boca, ojos, pulmones, mucosa nasal, oral (sublingual, bucal), vaginal o rectal.

Las formulaciones para su administración a la mucosa serán generalmente partículas de fármaco secadas por pulverización, que se pueden incorporar en un comprimido, gel, cápsula, suspensión o emulsión. Los excipientes farmacéuticos estándar están disponibles en cualquier formulador.

En una realización, los compuestos se formulan para administración pulmonar, tal como administración intranasal o inhalación oral. El tracto respiratorio es la estructura implicada en el intercambio de gases entre la atmósfera y el torrente sanguíneo. Las vías respiratorias superiores e inferiores se denominan vías respiratorias conductoras. Los bronquiolos terminales se dividen en bronquiolos respiratorios, que a continuación conducen a la zona respiratoria final, los alvéolos o pulmón profundo. El pulmón profundo, o alvéolos, es el objetivo principal de los aerosoles terapéuticos inhalados para la administración sistémica de fármacos. Los agentes terapéuticos que son activos en los pulmones se pueden administrar de formar sistémica y dirigirse a través de la absorción pulmonar. El término aerosol, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier preparación de una fina niebla de partículas, que puede estar en solución o suspensión, tanto si se produce, o no, usando un propulsor. Los aerosoles se pueden producir usando técnicas estándar, tales como tratamiento con ultrasonidos o tratamiento a alta presión.

Algunos vehículos para formulaciones pulmonares se pueden dividir en aquellos para formulaciones en polvo seco y para administración como soluciones. En la técnica se conocen aerosoles para el suministro de agentes terapéuticos al tracto respiratorio. Para la administración a través del tracto respiratorio superior, la formulación se puede formular en una solución, por ejemplo, agua o solución salina isotónica, tamponada o no tamponada, o como suspensión, para administración intranasal como gotas o como pulverización. Preferentemente, tales soluciones o suspensiones son isotónicas con respecto a las secreciones nasales y de aproximadamente el mismo pH, variando, por ejemplo, de aproximadamente un pH de 4,0 a aproximadamente un pH de 7,4 o de un pH de 6,0 a un pH de 7,0. Los tampones deberían ser fisiológicamente compatibles e incluir, simplemente a modo de ejemplo, tampones fosfato. Un experto en la materia puede determinar fácilmente un contenido de solución salina y un pH adecuados para una solución acuosa inocua para administración nasal y/o respiratoria superior.

Las composiciones se pueden administrar a los pulmones mientras se inhalan y atravesar el revestimiento epitelial del pulmón hasta el torrente sanguíneo cuando se administran como un aerosol o partículas secadas por pulverización que tienen un diámetro aerodinámico menor que aproximadamente 5 micrómetros.

Las formulaciones en polvo seco ("DPF") con partículas de gran tamaño tienen características mejoradas de fluidez, tales como menos agregación, aerosolización más fácil y potencialmente menos fagocitosis. Algunos aerosoles de polvo seco para terapia de inhalación se producen generalmente con diámetros medios principalmente en un intervalo de menos de 5 micrómetros, aunque un intervalo preferente está entre uno y diez micrómetros de diámetro aerodinámico. Se han coadministrado partículas de "vehículo" grandes (que no contienen fármaco) con aerosoles terapéuticos para ayudar a lograr una aerosolización eficaz, entre otros posibles beneficios. Algunas formulaciones para administración pulmonar incluyen vesículas de fosfolípidos unilaminares, liposomas o partículas de lipoproteínas. Alguien con experiencia en la materia conoce bien algunas formulaciones y métodos para preparar tales formulaciones que contienen ácido nucleico. Se puede usar una amplia gama de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo, pero sin limitarse a, nebulizadores, inhaladores de dosis medidas e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para los expertos en la materia.

3. Administración tópica y transdérmica

El agente activo y el vehículo de administración opcional se pueden aplicar por vía tópica. La administración tópica puede incluir la aplicación directamente a la vasculatura o a tejidos o prótesis, por ejemplo, durante la cirugía, o mediante administración directa a la piel.

También se pueden preparar formulaciones transdérmicas. Estas serán generalmente pomadas, lociones, aerosoles o parches, todos los cuales se pueden preparar usando tecnología estándar. Algunas formulaciones transdérmicas pueden incluir potenciadores de la penetración. Algunos excipientes farmacéuticos estándar para administración tópica o transdérmica están disponibles en cualquier formulador.

4. Matrices de administración controlada

Algunos dispositivos poliméricos de liberación controlada se pueden preparar para una liberación a largo plazo de formar sistémica después del implante de un dispositivo polimérico (varilla, cilindro, película, disco) o inyección (micropartículas). La matriz puede estar en forma de micropartículas, tales como microesferas, donde los inhibidores de LYST están dispersos dentro de una matriz polimérica sólida o microcápsulas, donde el núcleo es de un material diferente al de la cubierta polimérica y uno o más inhibidores de LYST están dispersos. o suspendidos en el núcleo, que puede ser de naturaleza líquida o sólida. A menos que se defina específicamente en el presente documento, micropartículas, microesferas y microcápsulas se usan indistintamente. Alternativamente, el polímero se puede moldear como una placa o película delgada, que varía de nanómetros a cuatro centímetros, un polvo producido mediante trituración u otras técnicas estándar, o incluso un gel tal como un hidrogel.

Para la administración de los inhibidores de LYST desvelados se pueden usar matrices no biodegradables o biodegradables, aunque son preferentes las matrices biodegradables. Estas pueden ser polímeros naturales o sintéticos, aunque son preferentes los polímeros sintéticos debido a la mejor caracterización de los perfiles de degradación y liberación. El polímero se selecciona basándose en el periodo de tiempo durante el cual se desea la liberación. En algunos casos, la liberación lineal puede ser la más útil, aunque en otros una liberación por impulsó dos o "liberación masiva" puede proporcionar resultados más eficaces. El polímero puede estar en forma de hidrogel (que generalmente absorbe hasta aproximadamente un 90 % en peso de agua) y, opcionalmente, puede estar reticulado con iones o polímeros polivalentes.

Las matrices se pueden formar mediante evaporación de disolvente, secado por pulverización, extracción con disolvente y otros métodos conocidos por los expertos en la materia. Algunas microesferas bioerosionables se pueden preparar usando cualquiera de los métodos desarrollados para fabricar microesferas para la administración de fármacos, por ejemplo, como describen Mathiowitz y Langer, J. Controlled Release 5: 13-22 (1987); Mathiowitz, et al., Reactive Polymers 6: 275-283 (1987); y Mathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci. 35: 755-774 (1988). Los dispositivos se pueden formular para liberación local para tratar el área del implante o para inyección, que generalmente administrará una dosis que es mucho menor que la dosis para el tratamiento de todo el organismo. Los dispositivos también se pueden formular para administración local o sistémica.

En la técnica se conocen micropartículas y nanopartículas diseñadas para administrar cargas tales como fármacos y anticuerpos a la vasculatura, a células del músculo liso vascular, o sitios o coágulos o trombosis. Véanse, por ejemplo, Wickline, et al., Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 26: 435-441 (2006), publicado en línea (diciembre de 2005), y las solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas con los N.os 2002/0168320, 2003/0086867, 2003/0129136, 2004/0058951, 2004/0115192, 2006/0147380, 2006/0239919, 2007/0140965, 2007/0202040, 2007/0258908, 2008/0175792, 2008/0247943, y 2013/0064765.

Por ejemplo, se han desarrollado nanopartículas de perfluorocarbono, consideradas anteriormente como sustitutos de la sangre artificial, con una tecnología de plataforma para la obtención de imágenes moleculares y la administración de fármacos dirigida, es decir, una tecnología denominada "teranóstica". Estas partículas encapsuladas en lípidos, que tienen nominalmente 250 nm de diámetro, se pueden administrar por vía intravenosa y generalmente están limitadas por tamaño a la vasculatura intacta.

En algunas realizaciones, el vehículo de administración es un liposoma. Si el inhibidor de LYST es un anticuerpo, proteína o molécula pequeña, el vehículo de administración preferente puede ser un liposoma. Se desvelan liposomas para la administración de los inhibidores de LYST desvelados directamente a un cierto tipo de células, por ejemplo, células de macrófagos. Las células de macrófagos pueden internalizar los liposomas, lo que conduce a la administración de uno o más inhibidores a los compartimentos intracelulares de los macrófagos. En la técnica se conocen métodos, materiales y lípidos adecuados para preparar liposomas. Algunos vehículos de administración de liposomas están disponibles en el mercado a partir de múltiples fuentes. Algunos liposomas se pueden formar a partir de una única bicapa lipídica (es decir, el liposoma puede ser unilaminar) o varias bicapas lipídicas concéntricas (es decir, el liposoma puede ser multilaminar). El liposoma se puede formar a partir de un solo lípido; sin embargo, en algunas realizaciones, el liposoma se forma a partir de una combinación de más de un lípido. Los lípidos pueden ser neutros, aniónicos o catiónicos a pH fisiológico.

Algunos lípidos neutros y aniónicos adecuados incluyen esteroles y lípidos tales como colesterol, fosfolípidos, lisolípidos, lisofosfolípidos y esfingolípidos. Algunos lípidos neutros y aniónicos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilcolina (PC) (tal como PC de huevo, PC de soja), incluyendo 1,2-diacil-glicero-3-fosfocolinas; fosfatidilserina (PS), fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol (PI); glicolípidos; esfingofosfolípidos, tales como esfingomielina, esfingoglicolípidos (también conocidos como 1-ceramidil glucósidos), tales como ceramida galactopiranósido, gangliósidos y cerebrósidos; ácidos grasos, esteroles que contienen un grupo ácido carboxílico tales como colesterol o derivados del mismo; y 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminas, que incluyen 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina o 1,2-dioleolilgliceril fosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-dihexadecilfosfoetanolamina (DHPE), 1,2-diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), 1,2-dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y 1,2-dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC). Sales de trimetilamonio, también denominadas lípidos TAP, por ejemplo como sal de metilsulfato. Algunos lípidos TAP adecuados incluyen, pero no se limitan a, DOTAP (dioleoil-), DMTAP (dimiristoil-), DPTAP (dipalmitoil-) y DSTAP (diestearoil-). Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDAb ), 1,2-diaciloxi-3-trimetilamonio propanos, W-[1-(2,3-dioloiloxi)propil]-W,W-dimetilamina (DODAP), Otros lípidos adecuados incluyen derivados PEGilados de los lípidos neutros, aniónicos y catiónicos descritos anteriormente. La incorporación de uno o más derivados de lípidos PEGilados puede dar como resultado un liposoma que presenta cadenas de polietilenglicol en su superficie. Los liposomas resultantes pueden poseer un aumento de la estabilidad y tiempo de circulación in vivo en comparación con los liposomas que carecen de cadenas de PEG en sus superficies.

Si el inhibidor de LYST es un ácido nucleico o un vector, el vehículo de administración puede ser un vector viral, por ejemplo, una preparación disponible en el mercado, tal como un vector de adenovirus (Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Quebec, Canadá). La administración del vector puede ser mediante un sistema viral, tal como un sistema de vector retroviral que puede empaquetar un genoma retroviral recombinante (véanse, por ejemplo, Pastan et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 4486; Miller et al., (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 2895). A continuación el retrovirus recombinante se puede usar para infectar y, por lo tanto, administrar a las células infectadas el ácido nucleico que codifica el inhibidor de LYST. El método exacto de introducción del ácido nucleico alterado en células de mamíferos, por supuesto, no se limita al uso de vectores retrovirales. Para este procedimiento hay una amplia diversidad de otras técnicas, que incluyen el uso de vectores adenovirales (Mitani et al., Hum. Gene Ther. 5: 941-948 (1994)), vectores virales adenoasociados (AAV) (Goodman et al., Blood 84: 1492-1500 (1994)), vectores lentivirales (Naidini et al., Science 272: 263-267 (1996)), vectores retrovirales pseudotipados (Agrawal et al., Exper. Hematol.

24: 738-747 (1996)).

También se pueden usar técnicas de transducción física, tales como liberación de liposomas y mecanismos de endocitosis mediados por receptores y otros (véase, por ejemplo, Schwartzenberger et al., Blood 87: 472-478 (1996)). Se conocen bien algunas preparaciones de liposomas disponibles en el mercado tales como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, Md.), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wis.), así como otros liposomas desarrollados de acuerdo con procedimientos estándar en la técnica. Además, el vector o ácido nucleico desvelado se puede administrar in vivo mediante electroporación, cuya tecnología está disponible en Genetronics, Inc. (San Diego, Calif.), así como mediante una máquina de sonoporación o ultrasonidos (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, Ariz.). Las composiciones y métodos desvelados se pueden usar junto con cualquiera de estos u otros métodos de transferencia génica usados comúnmente.

5. Injertos y dispositivos médicos

Las composiciones desveladas para inmunomodulación mediante inhibición de LYST se pueden recubrir o se pueden incorporar a dispositivos médicos, o se pueden usar para tratar previamente injertos vasculares implantables ex vivo.

Injertos

Los inhibidores de LYST se pueden usar para tratar previamente injertos vasculares ex vivo antes de su implante en un sujeto. Las composiciones que incluyen uno o más inhibidores de LYST y opcionalmente un vehículo de administración se pueden aplicar al tejido mediante métodos para asegurar que se adhieran y se distribuyan por todo el tejido o injerto en ubicaciones óptimas para el tratamiento farmacológico. En algunas realizaciones, uno o más inhibidores de LYST se administran usando nanopartículas, micropartículas, liposomas, micelas, emulsiones, geles o recubrimientos que están diseñados para que se adhieran a las regiones de interés, para llevar suficiente carga de fármaco para proporcionar tratamiento local durante períodos de tiempo prolongados, para liberar los inhibidores de LYST a una tasa o programa deseados, para penetrar en el tejido o injerto hasta un alcance óptimo, o una combinación de los mismos.

Para su uso en cirugía también se pueden formar injertos sembrando células ex vivo en un armazón biodegradable. Los injertos pueden ser autólogos, por ejemplo, vena safena o arteria radial; autólogos conservados, por ejemplo, vena crioconservada; alogénicos xenogénicos o sintéticos, por ejemplo, poliéster tejido, poliuretano (LYCRA®), politetrafluoroetileno (PTFE), GORE-TEX® o tereftalato de polietileno (DACRON®). Los homoinjertos arteriales que usan arterias mamarias internas, radiales o hipogástricas son ejemplos de conductos vasculares útiles y duraderos. A continuación se discuten injertos a modo de ejemplo.

Injerto vascular formado por ingeniería tisular

Se desvelan injertos vasculares formados por ingeniería tisular (TEVG) que incluyen uno o más inhibidores de LYST. Los injertos vasculares formados por ingeniería tisular (TEVG) son muy prometedores para avanzar en el campo de la cirugía cardiaca congénita, donde su capacidad de crecimiento se puede usar en su máximo potencial. Por ejemplo, los TEVG se pueden diseñar para su uso como un conducto vascular que conecta la vena cava inferior con la arteria pulmonar en pacientes que se someten a una cirugía de Fontan modificada. Los resultados a largo plazo (>10 años) de un estudio piloto que evaluó el uso del TEVG en 25 pacientes con anomalías cardiacas de un solo ventrículo no demostraron muertes relacionadas con el injerto ni fallos del mismo. También confirmó la capacidad de crecimiento del TEVG convirtiéndolo en el primer injerto artificial con capacidad de crecimiento. La principal complicación relacionada con el injerto fue la estenosis, que afectó aproximadamente a un 30 % de los pacientes con un 16 % (4/25) requiriendo angioplastia para tratar la estenosis crítica.

En una realización, un TEVG se forma a partir de un armazón tubular biodegradable fabricado a partir de un tubo de fibra de ácido poliglicólico. El tubo se puede recubrir con un copolímero tal como ácido poliláctico (PLA) y policaprolactona en una proporción de 50:50. El armazón se puede sembrar con células antes de su implante en un sujeto. En algunas realizaciones, las células son células autólogas del receptor previsto.

Se ha establecido que la infiltración excesiva de macrófagos a los injertos vasculares formados por ingeniería tisular (TEVG) promueve la cicatrización, dando como resultado engrosamiento, oclusión y estenosis de los vasos. Por lo tanto, las composiciones y métodos que se describen en el presente documento se pueden usar para administrar uno o más inhibidores de LYST de forma local y de manera controlada a un TEVg para prevenir o inhibir la infiltración por macrófagos.

Injerto de derivación

Se desvelan injertos de derivación que incluyen uno o más inhibidores de LYST. Una forma común de revascularización quirúrgica consiste en resecar la vena safena de la pierna para realizar un autotrasplante en la arteria coronaria. En un número de casos significativo estos injertos fallan, en gran parte debido a la reestenosis causada por la hiperplasia de la capa neoíntima. Las composiciones y métodos que se describen en el presente documento se pueden usar para administrar uno o más inhibidores de LYST de forma local y de manera controlada al injerto autólogo. El inhibidor se puede administrar antes, en el momento y/o inmediatamente después de la cirugía. Después de la resección de la vena safena, el tejido se puede suspender (y con frecuencia) durante horas en solución salina durante la apertura del tórax y la preparación para el implante del injerto. Las composiciones que incluyen uno o más inhibidores de LYST y opcionalmente una señal de direccionamiento, vehículo de administración o una combinación de los mismos se pueden incubar con la vena safena durante este periodo de tiempo.

Injerto arteriovenoso

Se desvelan injertos arteriovenosos que incluyen uno o más inhibidores de LYST. La enfermedad renal en estadio terminal está aumentando en Estados Unidos. La morbilidad del acceso a la hemodiálisis sigue siendo un problema importante de calidad de vida para los pacientes; también representa un coste significativo para la sociedad. Una fístula arteriovenosa nativa (AVF) sigue siendo el conducto de elección para proporcionar acceso a la hemodiálisis y proporciona resultados superiores en comparación con otras opciones, tal como una AVG protésica. Desafortunadamente, cada individuo tiene limitado el número de AVF nativas que se pueden crear debido al número limitado de sitios y vasos adecuados. Los sitios de acceso son limitados ya que los pacientes con enfermedad renal en estadio terminal normalmente tienen una comorbilidad grave, que requiere una punción venosa amplia para el diagnóstico y la terapia de por vida. En los pacientes que han agotado todas las opciones para la AVF primaria, los nuevos sitios de acceso deben usar injertos de AV. Estos injertos son susceptibles de reestenosis por hiperplasia de la capa neoíntima limitando su eficacia. La incubación de una composición que incluye uno o más inhibidores de LYST y, opcionalmente, que incluye una señal de direccionamiento, un vehículo de administración o una combinación de los mismos sobre el injerto, se puede realizar en el momento de la cirugía.

Dispositivos médicos

En algunas realizaciones, la composición que incluye uno o más inhibidores de LYST se recubre o se incorpora a un dispositivo médico o componente del mismo (tal como en depósitos poliméricos en endoprótesis vasculares) para reducir o inhibir trastornos de la proliferación vascular tales como formación de la capa neoíntima en un sujeto. El dispositivo puede ser un dispositivo que se inserta en el sujeto de forma transitoria o un dispositivo que se implanta de forma permanente. En algunas realizaciones, el dispositivo es un dispositivo quirúrgico.

Algunos ejemplos de dispositivos médicos incluyen, pero no se limitan a, agujas, cánulas, catéteres, derivaciones, globos e implantes tales como endoprótesis vasculares y válvulas.

En algunas realizaciones, el inhibidor de LYST o composición farmacéutica se puede formular para permitir su incorporación al dispositivo médico, que puede aplicar el inhibidor directamente en el sitio para prevenir o tratar afecciones tales como reestenosis u otros trastornos de proliferación vascular. El inhibidor de LYST o composición farmacéutica del mismo se puede formular incluyéndolo dentro de un recubrimiento del dispositivo médico. Existen diversos recubrimientos que se pueden usar tales como, por ejemplo, recubrimientos poliméricos que pueden liberar el inhibidor durante un periodo de tiempo prescrito. El inhibidor, o una composición farmacéutica del mismo, se puede incrustar directamente dentro del dispositivo médico. En algunas realizaciones, el inhibidor de LYST se recubre sobre o dentro del dispositivo en un vehículo de administración como una micropartícula o liposoma que facilita su liberación y administración.

Endoprótesis vasculares

En algunas realizaciones, el dispositivo médico es un implante vascular tal como una endoprótesis vascular. Las endoprótesis vasculares se usan en medicina para prevenir o eliminar las restricciones vasculares. Las endoprótesis vasculares se pueden insertar en un vaso restringido de modo que el vaso restringido se ensanche. La experiencia con tales implantes vasculares indica que el crecimiento excesivo de las células adyacentes da como resultado de nuevo una restricción del vaso, en particular en los extremos de los implantes, dando como resultado una eficacia reducida de los implantes. Si se inserta una endoprótesis vascular en una arteria humana para la eliminación de una estenosis arterioesclerótica, puede ocurrir hiperplasia de la capa íntima dentro de un año en los extremos del implante vascular y da como resultado una nueva estenosis.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, las endoprótesis vasculares se recubren o se cargan con una composición que incluye un inhibidor de LYST y opcionalmente un vehículo de administración.

Muchas endoprótesis vasculares están disponibles en el mercado o se conocen en la técnica. Las endoprótesis vasculares se pueden formar, es decir, se pueden grabar o se pueden cortar, a partir de un tubo delgado de material adecuado, o de una placa delgada de material adecuado y se pueden enrollar en un tubo.

Algunos materiales adecuados para la endoprótesis vascular incluyen, pero no se limitan a, acero inoxidable, iridio, platino, oro, tungsteno, tántalo, paladio, plata, niobio, circonio, aluminio, cobre, indio, rutenio, molibdeno, niobio, estaño, cobalto, níquel, cinc, hierro, galio, manganeso, cromo, titanio, aluminio, vanadio y carbono, así como combinaciones, aleaciones y/o laminaciones de los mismos. Por ejemplo, la endoprótesis vascular se puede formar a partir de una aleación de cobalto, tal como L605 o MP35N®, Nitinol (aleación con memoria de forma de níqueltitanio), ABI (aleación de paladio-plata), Elgiloy® (aleación de cobalto-cromo-níquel), etc. También se contempla que la endoprótesis vascular se pueda formar a partir de dos o más materiales que se laminan entre sí, tales como tántalo que se lamina con MP35N®. Las endoprótesis vasculares también se pueden formar a partir de alambres que tienen capas concéntricas de diferentes metales, aleaciones u otros materiales. Las realizaciones de la endoprótesis vascular también se pueden formar a partir de tubos huecos, o tubos que se han llenado con otros materiales. Se pretende que los materiales y laminados mencionados anteriormente sean ejemplos y no se pretende que sean limitantes de ninguna manera.

Las endoprótesis vasculares pueden ser endoprótesis vasculares liberadoras de fármacos. En la técnica se conocen diversas endoprótesis vasculares liberadoras de fármacos que administran simultáneamente una sustancia terapéutica al sitio de tratamiento mientras que proporcionan soporte radial artificial al tejido de la pared. Los dispositivos endoluminales que incluyen endoprótesis vasculares se pueden recubrir en sus superficies externas con una sustancia tal como un agente liberador de fármacos, factor de crecimiento, anticuerpo o similar. También se han desarrollado endoprótesis vasculares que tienen una estructura tubular hueca con orificios o puertos cortados a través de la pared lateral para permitir la elución del fármaco desde un lumen central. Aunque la naturaleza hueca de la endoprótesis vascular permite que el lumen central se cargue con una solución de fármaco que se administra a través de los puertos u orificios en la pared lateral de la endoprótesis vascular, la estructura tubular hueca puede no tener la resistencia mecánica adecuada para proporcionar un armazón adecuado en el vaso.

Se desvelan endoprótesis vasculares que eluyen inhibidores de LYST. En algunas realizaciones, los dispositivos también están recubiertos o impregnados con un inhibidor de LYST y uno o más agentes terapéuticos adicionales, que incluyen, pero no se limitan a, agentes antiplaquetarios, agentes anticoagulantes, agentes antimicrobianos y agentes antimetabólicos.

Algunas endoprótesis vasculares a modo de ejemplo que se pueden usar con las composiciones y métodos que se desvelan en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, las que se describen en los documentos de Patente de Estados Unidos N.os 5.891.108, 6.918.929, 6.923.828, 6.945.992, 6.986.785, 7.060.090, 7.144.419, 7.163.555, 7.323.008, 7.651.527, 7.655.034, 7.678.141, 7.744.645, 7.942.917, 8.001.925, 8.001.925, 8.034.099, 8.048.149, 8.066.760, 8.100.960, 8.157.855, 8.172.893, 8.182.524, 8.187.284, 8.187.322, 8.197.528, 8.206.432, 8.221.490, 8.231.669, 8.236.044, 8.252.048, 8.252.065, 8.257.425, 8.257.431, 8.292.945, 8.298.278, 8.298.280, 8.348.991, 8.348.992, 8.348.993, 8.353.952, 8.359.998, 8.361.140, 8.372.134, 8.372.138, 8.377.112, 8.388.676, 8.398.695, 8.414.637, 8.414.639, y 8.414.656.

Bioprótesis

Otros múltiples dispositivos protésicos pueden incluir uno o más inhibidores de LYST, que incluyen, pero no se limitan a, válvulas cardiacas, articulaciones artificiales, marcapasos, catéteres permanentes e implantes cosméticos. Se cree que los inhibidores de LYST desvelados pueden reducir o prevenir las respuestas inflamatorias y los trastornos fibroproliferativos asociados a la presencia de una bioprótesis. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las bioprótesis se recubren o se cargan con una composición que incluye un inhibidor de LYST y opcionalmente un vehículo de administración.

IV. Usos

Se proporcionan usos de los inhibidores de LYST desvelados. Los usos pueden comprender el uso de dichos inhibidores de LYST en métodos que incluyen administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que incluye uno o más inhibidores de LYST para reducir o inhibir la expresión o la función de LYST en el sujeto; tratar previamente un dispositivo médico o injerto vascular con una cantidad eficaz de una composición que incluye un inhibidor de LYST para reducir o inhibir la formación de la capa neoíntima después de la inserción o el implante del dispositivo o injerto en el sujeto; o una combinación de los mismos.

A. Trastornos y enfermedades a tratar

Los inhibidores de LYST se pueden usar para alterar funciones inmunitarias, que incluyen, pero no se limitan a, función de macrófagos, plaquetas y linfocitos citolíticos naturales, creando un entorno inmunológico prorregenerativo. Se pueden usar métodos de uso de inhibidores de LYST que incluyen, pero no se limitan a, métodos diseñados para inhibir o bloquear la transcripción, traducción o función de la proteína LYST para modular la respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, los métodos promueven la formación de tejido vascular, inhiben la formación de la capa neoíntima y mejoran la permeabilidad vascular, por ejemplo, después de una cirugía vascular. Se proporcionan métodos de uso de inhibidores de LYST para prevenir la hiperplasia de la capa íntima y la capa neoíntima en conductos vasculares tanto biológicos como sintéticos. Los métodos pueden reducir o prevenir la estenosis de TEVG y mejorar la función de TEVG.

Adicionalmente, los inhibidores de LYST pueden tener implicaciones más amplias para promover la regeneración tisular, mejorar la curación de heridas y modular la respuesta a cuerpos extraños. Por lo tanto, también se describen métodos para usar inhibidores de LYST como complemento para aplicaciones de medicina regenerativa. En algunas realizaciones, los métodos de uso de inhibidores de LYST pueden promover la curación y reducir la formación de cicatrices, por ejemplo, favoreciendo la curación y reduciendo las adherencias después de una cirugía abdominal. Los métodos pueden modular la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) producido como resultado de una lesión tisular. Por lo tanto, los métodos pueden tratar enfermedades asociadas a una expresión excesiva o indeseable de PDGF.

Los métodos también pueden reducir o tratar enfermedades que resultan de una fibrosis excesiva, por ejemplo, enfermedades fibróticas del hígado, pulmón o corazón. Por último, los métodos de terapia anti-LYST pueden da como resultado una inmunomodulación que altera la reacción de cuerpo extraño y promueve la integración pero bloquea la encapsulación de bioprótesis, mejorando de ese modo la función y la longevidad de dispositivos tales como marcapasos o estimuladores nerviosos o integración de válvulas cardiacas de reemplazo o articulaciones artificiales.

En realizaciones preferentes, uno o más inhibidores de LYST son eficaces para reducir, inhibir o retrasar uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto. Los inhibidores de LYST desvelados tienen una amplia diversidad de usos terapéuticos y profilácticos, por ejemplo, se pueden usar para tratar o reducir trastornos proliferativos vasculares después de lesiones o diversos procedimientos quirúrgicos, cicatrices y enfermedades fibróticas. Se describen métodos para usar uno o más inhibidores de LYST para tratar una enfermedad caracterizada por la presencia de una cicatriz o tejido fibrótico excesivos. También se proporcionan métodos para usar uno o más inhibidores de LYST para terapia antiplaquetaria, por ejemplo, para tratar enfermedades que resultan de una actividad plaquetaria anómala, excesiva o indeseable de otro modo o señalización de PDGF.

Trastornos proliferativos vasculares

En algunas realizaciones, los inhibidores de LYST desvelados se pueden usar para tratar o reducir trastornos proliferativos vasculares. Algunos ejemplos de tales trastornos incluyen, pero no se limitan a, proliferación vascular implicada en aterosclerosis, proliferación vascular tras el implante de un dispositivo intravascular, proliferación vascular en el sitio de la anastomosis vascular como ocurre generalmente tras un procedimiento de revascularización o una desviación A-V, proliferación vascular tras endarterectomía carotídea y vasculopatía por trasplante.

Se proporcionan métodos para tratar o reducir trastornos proliferativos vasculares mediante la administración de uno o más inhibidores de LYST. Los métodos generalmente reducen o inhiben la infiltración de células de macrófagos, o la conversión de células de macrófagos de fenotipo M1 a M2, o ambos, en comparación con un control. En algunas realizaciones, los métodos reducen o inhiben la proliferación de células de macrófagos sin reducir o inhibir el desarrollo de neotejido vascular. Un sujeto puede tener estenosis, reestenosis u otros trastornos de proliferación vascular, o ser identificado como en riesgo de reestenosis u otros trastornos de proliferación vascular, por ejemplo sujetos que han sufrido, están sufriendo o sufrirán un traumatismo vascular, angioplastia, cirugía, o arteriopatía de trasplante, etc. Las enfermedades, trastornos y afecciones que se pueden tratar con las composiciones desveladas se discuten con más detalle a continuación.

Lesión vascular

En algunas realizaciones, la composición que comprende uno o más inhibidores de LYST se puede aplicar antes, en el momento o después de un traumatismo vascular.

La lesión vascular desencadena una cascada de sucesos que incluyen denudación o disfunción endotelial, inflamación, así como activación y proliferación de las células del músculo liso vascular (VSMC). Las células endoteliales disfuncionales, las células inflamatorias, las plaquetas y las VSMC liberan múltiples factores de crecimiento y citoquinas. Estos factores de crecimiento y citoquinas median la quimioatracción, la migración celular, la proliferación, la apoptosis y la modulación de la matriz, y están implicados en diversos trastornos proliferativos vasculares.

Las enfermedades y los trastornos proliferativos vasculares se pueden iniciar por lesión mecánica, bioquímica o inmunológica de las paredes de los vasos sanguíneos. El traumatismo vascular habitual incluye aquellos asociados a lesiones tanto por contusión como penetrantes que incluyen, pero no se limitan a, laceraciones, heridas por punción, lesiones por aplastamiento, heridas por arma de fuego, heridas por arma blanca, lesiones ocupacionales, caídas y accidentes con vehículos a motor, así como intervenciones médicas, tales como cirugía o angioplastia. En algunas realizaciones, el sujeto se ha sometido, se está sometiendo o se va a someter a una cirugía. Algunas cirugías pueden incluir cirugía invasiva, mínimamente invasiva o percutánea. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sujeto se somete a cirugía para tratar o reparar aneurisma aórtico abdominal, estenosis carotídea, venas varicosas, enfermedad oclusiva arterial periférica, isquemia aguda de extremidades o disección aórtica. Algunas cirugías vasculares comunes incluyen, pero no se limitan a, reparación abierta de aneurisma aórtico abdominal, reparación de aneurisma endovascular (EVAR), endarterectomía carotídea, implante de endoprótesis vascular carotídea, extracción de venas, escleroterapia y escleroterapia con espuma, tratamiento con láser endovenoso, ablación de venas por radiofrecuencia, tratamiento ambulatorio de flebectomía, angioplastia con/sin implante de endoprótesis vascular, revascularización quirúrgica endarterectomía aterectomía, embolectomía con balón, trombectomía, revascularización quirúrgica, reparación abierta, reparación de aneurisma endovascular torácico (TEVAR). Un cirujano puede aplicar una composición que comprende uno o más inhibidores de LYST al sitio quirúrgico en el momento de la cirugía, antes de la cirugía o después de la cirugía, para mejorar el proceso de curación de heridas o para reducir el desarrollo de trastornos proliferativos vasculares, tales como los que dan lugar a estenosis o reestenosis.

Hiperplasia de la capa íntima

La hiperplasia de la capa íntima es una respuesta de curación fisiológica a la lesión del endotelio de los vasos sanguíneos. La lesión de la capa endotelial desencadena una serie de respuestas inflamatorias agudas y crónicas que desencadenan la agregación plaquetaria, el depósito de fibrina y atraen leucocitos al área (Murakami, et al., Am J Physiol., 272: L197-L202 (1997); Cotran, et al., JAm Soc Nephrol., 1: 225-235 (1990)). Por lo tanto, parece que los procesos regenerativos que dan lugar a la formación de neovasos y a hiperplasia de la capa íntima son fenómenos mediados por el sistema inmunitario, similar al papel propuesto para los monocitos-macrófagos en otros procesos biológicos vasculares humanos, tales como la adaptación del injerto venoso (Ratliff y Myles, Arch. Pathol. Lab. Med.

113: 772-776 (1989); Motwani y Topol, Circulation 97: 916-931 (1998)).

Estenosis

La hiperplasia de la capa íntima puede provocar un engrasamiento de la túnica íntima de un vaso sanguíneo, conduciendo a una complicación de estenosis del vaso sanguíneo. Se cree que la activación de los mecanismos inflamatorios y procoagulantes contribuye significativamente al inicio y desarrollo de estenosis. Durante un periodo de tiempo que varía de unas pocas semanas a meses, las células del músculo liso de la región medial de un vaso sanguíneo lesionado se trasladan a la región de la capa íntima. Estas células proliferan y depositan matriz extracelular para formar una capa neoíntima en el sitio de la lesión en un proceso análogo a la formación de cicatrices (Fingerle, et al., Proc Natl Acad Sci., 86: 8412 (1989); Clowes, et al., Circ. Res., 56: 139-145 (1985)). Por lo tanto, una respuesta de curación robusta conduce a un engrosamiento interno de la pared del vaso (hiperplasia de la capa íntima) y con el tiempo reduce el lumen del vaso, provocando estenosis. La formación de hiperplasia de la capa íntima se puede acelerar por la presencia de material extraño, tal como prótesis dentro del vaso, y puede resultar de una intervención endovascular que incluye angioplastia, derivación y arteriopatía de trasplante, etc., (Glagov, Circulation, 89: 2888-2891 (1994)).

Por lo tanto, se proporcionan métodos de uso de los inhibidores de LYST desvelados para reducir la hiperplasia de la capa íntima y la estenosis.

Reestenosis

Se proporcionan métodos para reducir la reestenosis de la vasculatura coronaria o del sistema circulatorio periférico. La reestenosis de los vasos sanguíneos se debe generalmente a una hiperplasia de la capa íntima. Se puede insertar un dispositivo quirúrgico, tal como una endoprótesis vascular, para abrir el vaso estenosado, sin embargo, esto también es problemático porque la endoprótesis vascular en sí misma puede estimular más hiperplasia de la capa íntima. Además, el tejido de la capa íntima hiperplásico puede crecer a través de los intersticios de una endoprótesis vascular desnuda y producir la reestenosis del vaso. Aunque las endoprótesis vasculares cubiertas pueden evitar que esto suceda, la hiperplasia de la capa íntima todavía puede ocurrir en los extremos de la endoprótesis vascular donde hay mayor irritación de la pared del vaso. Los pacientes con reestenosis en endoprótesis vascular corren el riesgo de sufrir complicaciones graves, ya que la estenosis por hiperplasia de la capa íntima suele ser difícil de tratar. A diferencia de las placas ateromatosas blandas, estas estenosis son firmes y requieren altas presiones de inflado prolongadas para dilatarse con un globo. Las estenosis a menudo se repiten y la dilatación repetida del vaso conduce a lesiones repetidas de la capa íntima y perpetúa la respuesta de curación de la capa íntima.

Por lo tanto, las composiciones, dispositivos o injertos desvelados se pueden administrar a un sujeto para reducir o inhibir la proliferación de células de músculo liso, migración y una combinación de las mismas en una cantidad eficaz para reducir o inhibir la formación de capa neoíntima y de ese modo tratar o prevenir la reestenosis y otros trastornos de proliferación vascular en el sujeto. En algunas realizaciones, la permeabilidad de los injertos y dispositivos se puede aumentar usando una composición que contenga un inhibidor de LYST. Por lo tanto, se proporcionan métodos para administrar una composición que contiene un inhibidor de LYST a dispositivos e injertos o al sujeto antes o después del implante.

Aterosclerosis

La aterosclerosis implica múltiples procesos, que incluyen inflamación, proliferación vascular y alteración de la matriz (revisado en Dzau, et al., Nat Med,. 8(11) (2002)). En la aterosclerosis, las VSMC dan lugar a inflamación, retención de lipoproteínas de la sangre, así como al desarrollo de un depósito fibroso que constituye una placa. Se ha mostrado que la inflamación media en todas las etapas de la aterosclerosis: en el desarrollo de una placa de ateroma, las VSMC producen mediadores proinflamatorios, tales como proteínas quimioatractoras de monocitos, y sintetizan moléculas de la matriz que dan lugar a la retención de lipoproteínas de la sangre; y tras el desarrollo de una placa, el medio inflamatorio local puede inducir la expresión de colagenasa e inhibir la expresión de inhibidores proteolíticos, haciendo que la capa fibrosa sea débil y susceptible de rotura. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los inhibidores de LYST desvelados se usan para tratar, reducir o inhibir trastornos de proliferación vascular en un sujeto.

Angioplastia

En algunas realizaciones, el sujeto se ha sometido, se está sometiendo o se va a someter a una angioplastia. La angioplastia es la técnica para ensanchar mecánicamente arterias estrechas u obstruidas, tales como las obstruidas como resultado de aterosclerosis. Generalmente, la angioplastia incluye la inserción, en la vasculatura de un sujeto, un globo vacío y colapsado en un alambre guía, conocido como catéter de globo, que se pasa a las ubicaciones estrechas y a continuación se infla hasta un tamaño fijo. El globo fuerza la expansión de los depósitos de glóbulos blancos internos/ placa de coágulos y la pared muscular circundante, abriendo el vaso sanguíneo para mejorar el flujo, y a continuación el globo se desinfla y se retira. Una endoprótesis vascular se puede insertar o no en el momento de inflado del globo para asegurar que el vaso permanezca abierto. La angioplastia incluye angioplastia periférica (es decir, vasos sanguíneos fuera de las arterias coronarias, tal como en el abdomen o las piernas), angioplastia coronaria, angioplastia de arteria renal, angioplastia de carótida y angioplastia de arterias cerebrales. En algunas realizaciones, el sujeto se ha sometido, se está sometiendo o se va a someter a una angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA). El uso de PTCA ha reducido en gran medida el número de muertes en pacientes que sufren infarto de miocardio (Fischman, et al., N Engl JMed., 331: 496-501 (1994); Elezi, et al., Circulation 98: 1875-1880 (1998); Bennett y O'Sullivan, Pharmacol Ther., 91: 149-166 (2001)). Durante la PTCA, las paredes arteriales se expanden varias veces su diámetro original en un intento de aumentar el diámetro del lumen y mejorar el flujo. Desafortunadamente, esta técnica está plagada de una alta incidencia de estrechamiento o reestenosis de los vasos, que se produce en un 30-40 % de los pacientes dentro de los 6 meses posteriores al procedimiento (Anderson et al., J Interv. Cardiol., 6: 187-202 (1993); Fischman et al., N Engl J Med, 331: 496-501 (1994); Elezi et al., Circulation 98: 1875-1880 (1998); Bennett y O'Sullivan, Pharmacol Ther, 91: 149-166 (2001); Heckenkamp et al., J Cardiovasc. Surg. (Torino), 43: 349-357 (2002)).

La prevención de la reestenosis después de una PTCA exitosa sigue siendo una de las tareas más desafiantes en el tratamiento de la enfermedad arterial coronaria obstructiva. Los intentos de mejorar esta respuesta proliferativa implican el uso de endoprótesis vasculares coronarias, que han mejorado significativamente el resultado tanto a corto como a largo plazo después de procedimientos de revascularización coronaria intervencionistas. A pesar de una reducción en la tasa de reestenosis con el despliegue de endoprótesis vascular, la reestenosis todavía se produce en un 15-30 % de los pacientes dentro de los 6 meses (Fischman et al., N Engl J Med, 331: 496-501 (1994); Elezi et al., Circulation, 98: 1875-1880 (1998)). Se espera que esta incidencia de reestenosis en endoprótesis vascular aumente a medida que las endoprótesis vasculares coronarias sean cada vez más frecuentes y se usan en lesiones menos ideales. Los inhibidores de LYST desvelados se pueden usar para tratar o reducir la reestenosis, adherencias abdominales y cicatrización después de una angioplastia.

Arteriopatía de trasplante

En algunas realizaciones, el sujeto se ha sometido, se está sometiendo o se va a someter a un trasplante. La arteriopatía de trasplante crónica (CTA) es una causa importante de pérdida tardía del aloinjerto después del trasplante de corazón o riñón (Taylor, et al., J. Heart Lung Transplant., 24: 945-955 (2005), Burke, et al., Transplantation, 60: 1413-1417 (1995); Cornell y Colvin, Curr. Opin. Nephro1Hypertens., 14: 229-234 (2005)). Por lo tanto, en algunas realizaciones, los inhibidores de LYST desvelados se usan para reducir o inhibir la arteriopatía de trasplante en un receptor de trasplante.

Cicatrización excesiva

Los inhibidores de LYST desvelados se pueden usar para tratar, retrasar o reducir la cicatrización, incluyendo la formación de queloides y adherencias abdominales, por ejemplo, después de una lesión, enfermedad o procedimientos quirúrgicos.

Se proporcionan métodos para usar uno o más inhibidores de LYST para disminuir la cantidad de crecimiento de vasos sanguíneos en el sitio de una lesión o cirugía. En algunas realizaciones, los métodos disminuyen la formación de tejido celular y conectivo de alta densidad que dan lugar a cicatrices, queloides o adherencias. La cantidad de uno o más inhibidores de LYST no previene la curación de heridas.

Cicatrización hipertrófica

En algunas realizaciones, los inhibidores de LYST desvelados se usan para tratar, reducir o inhibir el desarrollo de cicatrices hipertróficas. La cicatrización excesiva puede ocurrir cuando la respuesta del tejido es desproporcionada con la cantidad de tejido cicatricial necesaria para la reparación y curación normales. Cuando una herida profunda implica una pérdida significativa de dermis, se puede depositar tejido cicatricial hipertrófico en el sitio de la herida. El tejido cicatricial contiene una alta densidad de células, un mayor volumen de tejido conjuntivo y un mayor suministro vascular como resultado del aumento del número de vasos sanguíneos. Como resultado de defectos en la fase de remodelación de la reparación tisular se pueden producir cicatrices hipertróficas (Ehrlich y Kelley, Plast Reconstr Surg., 90: 993-998 (1992)).

Los inhibidores de LYST desvelados se pueden usar para disminuir el desarrollo de vasos sanguíneos en el área de una herida para reducir o retrasar el desarrollo de cicatrización hipertrófica.

Queloides

En algunas realizaciones, los inhibidores de LYST desvelados se usan para tratar, reducir o inhibir el desarrollo de cicatrices queloides. Una cicatriz queloide es una cicatriz elevada o engrosada que supera el límite de la lesión y puede continuar desarrollándose y agrandándose durante un periodo de tiempo prolongado. Durante el desarrollo de un crecimiento queloide, el colágeno, usado en la reparación de heridas, crece en exceso y produce un bulto muchas veces más grande que el de la cicatriz original.

Los inhibidores de LYST se pueden usar para reducir el desarrollo de queloides asociados a lesiones cutáneas, por ejemplo, perforación de orejas, laceración, quemaduras, vacunación o procesos inflamatorios. Los inhibidores de LYST se pueden aplicar por vía local o tópica según sea necesario.

Adherencias

Las adherencias son bandas fibrosas que se forman entre los tejidos y los órganos, a menudo como resultado de una lesión durante la cirugía. Se pueden considerar tejidos cicatriciales internos que conectan tejidos que normalmente no están conectados, generalmente a través de un espacio virtual tal como la cavidad peritoneal. Después de una cirugía o un traumatismo abdominal, la producción o la actividad de las enzimas fibrinolíticas se pueden ver comprometidas debido a la lesión y se desarrolla una adherencia fibrinosa. Si se permite que esto suceda, las células de reparación tisular tales como macrófagos, fibroblastos y otras células de los vasos sanguíneos penetran en la adherencia fibrinosa para depositar colágeno y otras sustancias de la matriz para formar una adherencia fibrosa permanente.

Las adherencias a modo de ejemplo que se pueden tratar o reducir con los inhibidores de LYST desvelados incluyen adherencias abdominales, adherencias pélvicas, incluyendo adherencias pélvicas que resultan de endometriosis, adherencias pericárdicas, adherencias peridurales y adherencias peritendinosas. Los síntomas de adherencias pueden incluir dolor abdominal, obstrucciones, dolor pélvico crónico, calambres, náuseas, flexibilidad limitada e inflamación o hinchazón en el sitio de la adherencia.

Otras enfermedades fibroproliferativas

En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden uno o más inhibidores de LYST se pueden aplicar para tratar una enfermedad fibroproliferativa.

La fibrosis es el depósito de tejido conjuntivo fibroso en exceso en un órgano o tejido como respuesta a inflamación y/o daño (Wynn, Nat Rev Immunol., 4(8): 583-594 (2004)). La reparación de los tejidos dañados implica la producción de componentes de la matriz extracelular en el sitio de la lesión tisular. Los macrófagos y los tejidos dañados liberan citoquinas y TGF beta que estimulan a las células a depositar tejido conjuntivo, incluyendo colágeno y glicosaminoglicanos. Sin embargo, la disregulación de este proceso puede conducir a una deposición excesiva de este tejido conjuntivo, lo que puede destruir la estructura y función de los órganos subyacentes, dando lugar a la patología de la enfermedad fibrótica. La fibrosis puede ocurrir en muchos tejidos del organismo, incluyendo el hígado, los pulmones, el corazón y los riñones. Se proporcionan métodos para tratar la fibrosis de órganos principales y trastornos fibroproliferativos.

Cirrosis hepática

La fibrosis del hígado conduce a daño hepático ya que los hepatocitos son reemplazados por tejido cicatricial no funcional en un proceso conocido como cirrosis (Masuoka, et al. Ann NY Acad. Sci., 1281: 106-122 (2013)). La fibrosis hepática y la cirrosis resultante representan la vía común final de prácticamente todas las enfermedades hepáticas crónicas y pueden provocar insuficiencia hepática, cáncer de hígado y muerte relacionada con el hígado. La cirrosis hepática ocurre cuando el tejido cicatricial reemplaza al parénquima normal. Después de una lesión hepática aguda (por ejemplo, hepatitis vírica), las células parenquimatosas se regeneran y reemplazan a las células necróticas o apoptóticas en un proceso asociado a una respuesta inflamatoria. Si la lesión hepática persiste, el proceso de regeneración hepática falla finalmente y los hepatocitos se sustituyen por abundante matriz extracelular, incluyendo colágeno fibrilar. La fibrosis avanzada se caracteriza por una acumulación de proteínas de la matriz extracelular ricas en colágenos fibrilares (predominantemente colágeno I y colágeno III) (revisado en Iredale, J Clin Invest., 117(3): 529-548 (2007); Bataller y Brenner, J Clin Invest, 115(2): 209-218 (2005)). Las células inflamatorias que activan las células estrelladas hepáticas (HSC) para secretar colágeno son un factor importante en la enfermedad fibrótica del hígado. El aumento del número de monocitos se ha asociado con la progresión de la enfermedad, específicamente con la progresión de enfermedad no cirrótica a cirrótica.

Se desvelan métodos para tratar la fibrosis hepática en un sujeto, incluyendo la administración al sujeto de una cantidad eficaz de uno o más inhibidores de LYST para reducir, disminuir, limitar o prevenir uno o más síntomas de enfermedad hepática con respecto a un sujeto de control sin tratar. Algunos síntomas habituales de las enfermedades hepáticas incluyen, pero no se limitan a, aumento de la masa abdominal, fatiga, dolor abdominal, caquexia, ictericia, síndromes obstructivos que incluyen bloqueo linfático y acumulación de ascitis, anemia y dolor de espalda (Sun, et al., Clin J. Oncol. Nurs., 12: 759-766 (2008)). En algunas divulgaciones, uno o más inhibidores de LYST mejoran la función hepática, reducen la inflamación, reducen la fibrosis o una combinación de los mismos en un sujeto con enfermedad hepática con respecto a un sujeto de control sin tratar.

Fibrosis pulmonar

La fibrosis pulmonar se caracteriza por el depósito de exceso de tejido fibroso en los pulmones que causa una distorsión arquitectónica notable y pérdida de los espacios alveolares, conduciendo a insuficiencia orgánica y, por último, a la muerte por insuficiencia respiratoria. La fibrosis pulmonar implica el intercambio gradual del parénquima pulmonar normal con tejido fibrótico, provocando una disminución irreversible de la capacidad de difusión de oxígeno.

La fibrosis pulmonar (también conocida como alveolitis fibrosante criptogénica) está asociada a enfermedades pulmonares intersticiales (ILD) tales como enfermedades del tejido conjuntivo o enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo, artritis reumatoide), infecciones, enfermedad pulmonar idiopática y neoplasias malignas. La exposición ambiental a toxinas inhaladas, medicamentos y radioterapia también se ha asociado a la fibrosis pulmonar.

Se proporcionan métodos para tratar la fibrosis pulmonar en un sujeto, que incluyen la administración al sujeto de una cantidad eficaz de uno o más inhibidores de LYST para reducir, disminuir o limitar uno o más síntomas de fibrosis pulmonar con respecto a un sujeto de control sin tratar. Los síntomas habituales incluyen tos seca crónica, dificultad para respirar, fatiga y debilidad, malestar en el pecho, pérdida de apetito y pérdida de peso. En algunas realizaciones, la composición que comprende uno o más inhibidores de LYST mejora la función respiratoria, reduce la inflamación, reduce la fibrosis o una combinación de los mismos en un sujeto con fibrosis pulmonar con respecto a un sujeto de control sin tratar.

Otras enfermedades fibróticas

Se proporcionan métodos para tratar enfermedades caracterizadas por fibrosis excesiva en un sujeto, incluyen la administración al sujeto de una cantidad eficaz de uno o más inhibidores de LYST para reducir, disminuir o limitar uno o más síntomas de fibrosis excesiva con respecto a un sujeto de control sin tratar. Las enfermedades y trastornos a modo de ejemplo que se pueden tratar con los métodos desvelados incluyen nefroesclerosis, esclerodermia, síndrome de Sharp, neurofibromatosis, mielofibrosis, esclerosis sistémica, contractura de Dupuytren y degeneración macular. Además, se proporcionan métodos para tratar cicatrices y fibrosis asociadas a complicaciones quirúrgicas, fibrosis quimioterapéutica u otra fibrosis inducida por fármacos, fibrosis inducida por radiación, fibrosis resultante de lesiones y quemaduras.

Enfermedades asociadas a la función plaquetaria

Se proporcionan métodos para tratar de enfermedades caracterizadas por activación plaquetaria excesiva o perjudicial y/o señalización mediada por el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). Dado que las plaquetas desempeñan un papel fundamental en el proceso de coagulación sanguínea, las terapias dirigidas contra las plaquetas son algunas de las más importantes en la batalla contra las enfermedades vasculares del corazón y el cerebro. La activación inapropiada o excesiva de las plaquetas puede dar lugar a la formación de coágulos dentro de un vaso intacto (trombosis). Un coágulo que se desprende y comienza a viajar por el cuerpo (tromboembolismo) puede causar obstrucción u oclusión de los vasos, estasis sanguínea, isquemia, apoplejía y/o muerte.

Se ha establecido que una reducción de LYST conduce a una reducción de la activación plaquetaria y a una reducción de la expresión de PDGF (véase el Ejemplo 7). Por lo tanto, los inhibidores de LYST se pueden usar como fármacos antiplaquetarios para reducir la agregación plaquetaria perjudicial y la formación de trombos. Se proporcionan métodos para tratar enfermedades caracterizadas por una activación plaquetaria perjudicial o excesiva en un sujeto, que incluyen la administración al sujeto de una cantidad eficaz de uno o más inhibidores de LYST para reducir, disminuir o limitar uno o más síntomas de agregación plaquetaria perjudicial o excesiva con respecto a un sujeto de control sin tratar. Por lo tanto, los inhibidores de LYST se pueden usar para tratar enfermedades o trastornos asociados a la función plaquetaria indeseable o perjudicial. Algunos ejemplos de trastornos que resultan de la activación inapropiada/perjudicial de las plaquetas incluyen hiperagregación plaquetaria o aumento del volumen medio plaquetario (MPV) y trombosis arterial de trombocitosis; trombosis venosa (síndrome de Budd-Chiari; trombosis del seno cavernoso; trombosis del seno venoso cerebral; trombosis venosa profunda; enfermedad de Paget-Schroetter; trombosis de la vena porta; trombosis de la vena yugular; trombosis de la vena renal); y trombosis microcirculatoria. La trombosis arterial puede obstruir parcial o completamente el flujo de sangre y causar isquemia corriente abajo, accidente cerebrovascular o infarto de miocardio.

La sobreexpresión aumentada o descontrolada del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y la señalización incontrolada de PDGF se ha relacionado con el crecimiento, la angiogénesis y la metástasis de las células cancerosas, así como con enfermedades asociadas al desarrollo, la supervivencia y la metástasis de tumores (revisado en Andrae, et al., Genes Dev., 22: páginas 1276-1312 (2008)). Se ha mostrado que la inhibición de PDGF reduce el crecimiento de células de glioma. Varios inhibidores de la señalización mediada por PDGFR, tales como imatinib, han entrado en ensayos clínicos para el tratamiento de diversas neoplasias malignas. Por lo tanto, uno o más inhibidores de LYST se pueden usar para tratar cualquier enfermedad asociada a una expresión aumentada o regulada por incremento de PDGF y/o señalización de PDGF no controlada. Algunas enfermedades a modo de ejemplo incluyen cánceres tales como glioblastomas (por ejemplo, oligodendrogliomas anaplásicos) y sarcomas (por ejemplo, sarcoma dérmico; sarcomas de células escamosas esofágicas), así como enfermedad vascular retiniana (por ejemplo, retinopatías isquémicas).

B. Tratamientos

La inhibición de LYST se puede usar como mecanismo terapéutico mediante administración local o sistémica. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por vía sistémica. Los vehículos de administración se pueden seleccionar y se pueden usar para dirigir los inhibidores a una ubicación o tipo de célula en particular. En otras realizaciones, los inhibidores se administran directamente a la vasculatura usando un dispositivo o injerto, tales como los discutidos anteriormente. En realizaciones adicionales, la vía de administración dirige los inhibidores directamente a un órgano específico o al sitio local de la lesión.

Se ha establecido que los procesos de proliferación vascular e inflamación están relacionados. Se cree que LYST modera los procesos inmunitarios que contribuyen a trastornos proliferativos, tal como el proceso de reestenosis. La intervención farmacológica precoz puede excluir la terapia crónica y cualquier efecto secundario potencialmente adverso asociado a la terapia crónica. Por ejemplo, las composiciones desveladas en el presente documento pueden reducir la formación de la capa neoíntima, pero permiten que se produzca el crecimiento del tejido. A continuación se discuten con más detalle algunos métodos para tratar enfermedades y trastornos que usan los inhibidores de LYST desvelados que incluyen opcionalmente un vehículo de administración.

Controles

El efecto de un inhibidor de LYST se puede comparar con un control. En la técnica se conocen algunos controles adecuados e incluyen, por ejemplo, células no tratadas o un sujeto sin tratar. En algunas realizaciones, el control es tejido sin tratar del sujeto que se trata, o de un sujeto sin tratar. Preferentemente, las células o el tejido del control se derivan del mismo tejido que las células o el tejido tratado. En algunas realizaciones, un sujeto de control sin tratar sufre la misma enfermedad o afección que el sujeto tratado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, uno o más de los marcadores o rutas farmacológicos o fisiológicos afectados por el tratamiento anti-LYST se compara con el mismo marcador o ruta farmacológicos o fisiológicos en células de control no tratadas o sujetos de control sin tratar. Por ejemplo, los sujetos tratados con anti-LYST se pueden comparar con los sujetos tratados con otros inhibidores de formación de la capa neoíntima, tales como rapamicina. Los sujetos tratados con otros inhibidores de formación de la capa neoíntima pueden tener una mayor incidencia de estenosis postoperatoria o una formación reducida de tejido neovascular que los sujetos tratados con inhibidores de LYST.

Las composiciones farmacéuticas que incluyen uno o más inhibidores de LYST se pueden administrar de diversas formas, dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y dependiendo del área a tratar. Por ejemplo, las composiciones desveladas se pueden administrar por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía intracavitaria o por vía transdérmica. Las composiciones se pueden administrar por vía parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa), por inyección intramuscular, por inyección intraperitoneal, por vía transdérmica, por vía extracorpórea, por vía tópica o similares, incluyendo la administración intranasal tópica o la administración mediante inhalación.

La administración parenteral de la composición, si se usara, se caracteriza generalmente por inyección. Las formulaciones inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. También se discute la administración que implica el uso de un sistema de liberación lenta o sostenida, de modo que se mantenga una dosificación constante.

En ciertas realizaciones, las composiciones se administran por vía local, por ejemplo, mediante inyección directamente en un sitio a tratar. La administración local de fármacos puede reducir los efectos secundarios o la toxicidad asociados a la administración sistémica y puede dar como resultado un mejor resultado del tratamiento debido a un aumento de la dosis localizada.

Se proporcionan métodos para administrar los inhibidores de LYST desvelados por vía local (es decir, mediante administración local de fármacos, LDD). En ciertas realizaciones, los inhibidores de LYST se pueden administrar directamente a un tejido tratado, tal como una arteria o una vena, sin generar efectos sistémicos adversos. En otras realizaciones, las composiciones se inyectan o se administran de otro modo directamente a uno o más sitios quirúrgicos. Generalmente, la inyección local provoca un aumento de la concentración localizada de las composiciones que es mayor que la que se puede lograr mediante la administración sistémica. En realizaciones preferentes, las composiciones se administran directamente a tejido, prótesis, injertos o dispositivos médicos mediante inyección local o administración tópica. En algunas realizaciones, los inhibidores de LYST administrados por vía local dan como resultado concentraciones que son dos veces, 10 veces, 100 veces, 500 veces, 1000 veces o más de 1000 veces mayores que las logradas mediante la administración sistémica del mismo compuesto. En algunas realizaciones, los inhibidores de LYST administrados por vía local se liberan de manera constante en el sitio de administración a un ritmo constante durante un periodo de tiempo. Preferentemente, la liberación constante mantiene una concentración deseada del inhibidor de LYST en el sitio de administración.

Los inhibidores de LYST desvelados se pueden administrar durante un periodo de tiempo antes, durante o después del inicio de los síntomas de la enfermedad, o cualquier combinación de periodos antes, durante o después del inicio de uno o más síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, al sujeto se le puede administrar una o más dosis de la composición cada 1, 2, 3, 4, 5, 67, 14, 21, 28, 35, o 48 días antes del inicio de los síntomas de la enfermedad. Al sujeto se le pueden administrar una o más dosis de la composición cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28, 35, o 48 días después del inicio de los síntomas de la enfermedad. En algunas realizaciones, las múltiples dosis de las composiciones se administran antes de que sea evidente una mejora en el estado de la enfermedad. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sujeto recibe 1, 2, 3, 4, 5, 67, 14, 21, 28, 35, o 48, durante un periodo de 1, 2, 3, 4, 5, 6 7, 14, 21,28, 35, o 48 días o semanas antes de que sea evidente una mejoría en la enfermedad o afección.

Por lo tanto, las composiciones desveladas que incluyen uno o más inhibidores de LYST se pueden administrar en diferentes momentos en relación a un diagnóstico, pronóstico, cirugía o lesión dependiendo de la enfermedad o trastorno a tratar. El momento de inicio de la terapia anti-LYST se debería determinar en función de las necesidades del sujeto, y puede variar desde en el momento de la cirugía o lesión, hasta uno o más días, semanas o meses después de la cirugía o lesión. Se proporcionan métodos para usar formulaciones para la liberación retardada de inhibidores de LYST. En algunas realizaciones, la terapia con inhibidores de LYST se puede suspender una vez que se haya producido el crecimiento de neotejido vascular.

En algunas realizaciones, se administra una dosis única de uno o más inhibidores de LYST a un sujeto como una o más dosis de bolo para elevar la concentración en sangre de uno o más inhibidores hasta un nivel deseado. El bolo se puede administrar mediante cualquier medio, tal como mediante inyección. La colocación de la dosis de bolo se puede variar dependiendo del efecto deseado y del órgano o tejido diana a tratar. En una realización particular, se administra un bolo antes de la administración de otras formas de dosificación, tales como formas de dosificación de liberación pulsátil. Por lo tanto, la concentración sanguínea deseada de uno o más inhibidores de LYST se puede mantener durante un periodo de tiempo deseado usando una combinación de formulaciones para liberación inmediata, retardada o pulsátil.

En el caso de adherencias, el depósito de tejido conjuntivo entre estructuras anatómicas normales es innecesario y, por lo tanto, la prevención del desarrollo de tejido vascular no es perjudicial. Por lo tanto, para la reducción de adherencias, los inhibidores de LYST se podrían aplicar generalmente en el momento de la cirugía o poco después, por ejemplo, en una semana. En el caso de procedimientos quirúrgicos con riesgo de formación de capa neoíntima, por ejemplo, estenosis o reestenosis de injertos tisulares o endoprótesis vasculares, se pueden administrar uno o más inhibidores de LYST en el momento de la cirugía. En el caso de una lesión o cirugía que afecte a la piel, los inhibidores de LYST se pueden aplicar después de la reepitelización de la superficie de la piel.

Recubrimiento sobre injertos y dispositivos

Uno o más inhibidores de LYST se pueden administrar por vía local incorporando el uno o más inhibidores en un dispositivo médico tales como una endoprótesis vascular u otra prótesis, cargando el inhibidor o inhibidores en o sobre un material estructural o de sellado del dispositivo. La tasa de liberación del inhibidor o de los inhibidores se puede controlar mediante diversos métodos que incluyen variar uno o más de la proporción del material absorbible con respecto al agente, el peso molecular de: el material absorbible, la composición del inhibidor o inhibidores, la composición del polímero absorbible, el grosor del recubrimiento, el número de capas de recubrimiento y sus grosores relativos, la concentración de inhibidor y/o la unión o enlace físicos o químicos del inhibidor o inhibidores al dispositivo o material de sellado. También se pueden aplicar capas superiores de polímeros y otros materiales, incluyendo polímeros absorbibles, para controlar la tasa de liberación de uno o más inhibidores.

En algunas realizaciones, la cantidad de inhibidor de LYST presente en un dispositivo o tejido de injerto se puede ajustar cambiando el vehículo de administración. También se puede ajustar la penetración del inhibidor en todo el tejido. De esta forma, la cantidad de fármaco liberada por vía local en el sitio de implante se puede controlar de forma cuidadosa. Generalmente, el inhibidor de LYST o un vehículo de administración que lleva el inhibidor se pone en contacto con un dispositivo o material de injerto ex vivo. El contacto se puede producir en ausencia o presencia de agitación suave u otros métodos conocidos en la técnica para asegurar que el inhibidor se adhiera o penetre en el dispositivo o en el tejido del injerto. La agitación se puede lograr, por ejemplo, mediante incubación en un agitador orbital o mediante rotación vertical, tal como mediante incubación en un carrusel vertical de un horno de hibridación. El protocolo de incubación se puede variar para que influya en la ubicación de las partículas en el dispositivo o injerto. La cantidad y ubicación de unión de vehículos de administración tales como partículas al dispositivo o injerto también se puede variar haciendo variar el tipo y densidad de ligandos de unión y diana, tales como los descritos, presentados en el vehículo. Las composiciones y métodos a modo de ejemplo para administrar fármacos a injertos vasculares ex vivo se discuten en las solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas Con los N.os 2006/0002971,2010/0151436 y en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.534.448.

Las composiciones y métodos se pueden usar para administrar inhibidores de LYST por vía local a injertos con o sin el requisito de procedimientos invasivos adicionales, tales como colocación de un injerto vascular o endoprótesis vascular.

C. Dosificaciones y cantidades eficaces

De acuerdo con la presente invención, las composiciones de inhibidores de LYST se administran a un sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz que se encuentra entre 0,1 y 1000 mg/kg de peso corporal de un ser humano y no previene la curación de heridas. Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una dosificación suficiente para tratar, inhibir o aliviar uno o más síntomas del trastorno que se está tratando o para proporcionar de otro modo un efecto farmacológico y/o fisiológico deseados. La dosificación precisa variará de acuerdo con una diversidad de factores tales como variables dependientes del sujeto (por ejemplo, edad, estado del sistema inmunitario, etc.), la enfermedad o trastorno y el tratamiento que se esté realizando.

Para todos los compuestos desvelados, a medida que se realicen más estudios, surgirá información con respecto a los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de diversas afecciones en diversos pacientes y el trabajador con experiencia habitual, teniendo en cuenta el contexto terapéutico, la edad y la salud general del receptor, podrá determinar la dosis adecuada. La dosificación seleccionada depende del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración y de la duración del tratamiento deseado. Generalmente se administran niveles de dosificación de entre 0,001 y 100 mg/kg de peso corporal al día a mamíferos, lo más preferentemente, seres humanos. Generalmente, para inyección o infusión intravenosa, la dosificación puede ser menor. Preferentemente, las composiciones se formulan para lograr un nivel sérico de inhibidor de LYST entre aproximadamente 1 y aproximadamente 1000 pM en el sitio donde se desea el tratamiento.

En algunas realizaciones, los inhibidores de LYST son eficaces para prevenir las actividades biológicas normales de las células inmunitarias, tales como macrófagos, plaquetas y linfocitos NK. Por ejemplo, uno o más inhibidores pueden estar en una cantidad eficaz para reducir la actividad migratoria o quimiotáctica de los macrófagos.

En una realización, los uno o más inhibidores de LYST están en una cantidad eficaz para reducir la formación de capa neoíntima en un sujeto. La cantidad de uno o más inhibidores de LYST no previene la curación de heridas. Preferentemente, la cantidad de uno o más inhibidores de LYST no evita la formación de tejido en el sitio de implante del injerto en un sujeto en comparación con un control sin tratar. Preferentemente, la cantidad de uno o más inhibidores de LYST es eficaz para reducir la formación de capa neoíntima y mejorar la curación de heridas en un sujeto en comparación con un control sin tratar.

En otra realización, los uno o más inhibidores de LYST están en una cantidad eficaz para disminuir la cantidad de crecimiento de vasos sanguíneos en el sitio de una lesión o cirugía, para disminuir la formación de tejido celular y conjuntivo de alta densidad que dan lugar a fibrosis, cicatrices, queloides o adherencias. La cantidad de uno o más inhibidores de LYST no previene la curación de heridas.

En otra realización, uno o más inhibidores de LYST están en una cantidad eficaz para disminuir o inhibir la activación plaquetaria. Por ejemplo, los inhibidores de LYST pueden estar en una cantidad eficaz para inhibir la agregación plaquetaria inapropiada y la secreción de quimioquinas en el sitio de una lesión o cirugía. En una realización adicional, los uno o más inhibidores de LYST están en una cantidad eficaz para disminuir la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y/o factor beta de crecimiento transformante (TGFp) producido o secretado por las células como respuesta a la activación por trombina en el sitio de una lesión o cirugía. Uno o más inhibidores de LYST pueden ser eficaces para reducir la producción o secreción de PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, o PDGF-D. Por lo tanto, uno o más inhibidores de LYST pueden ser eficaces para reducir la cantidad de PDGF biológicamente activo en el suero. Por ejemplo, la cantidad de PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD o PGDF-AB se puede reducir con respecto a la cantidad en un control sin tratar. Por lo tanto, uno o más inhibidores de LYST pueden ser eficaces para reducir o prevenir una o más actividades biológicas que se producen como resultado de PDGF, o como resultado de sucesos de señalización descendente controlados por PDGF. Por ejemplo, uno o más inhibidores de LYST pueden ser eficaces para reducir o prevenir la activación de uno o más receptores de tirosina quinasa, tales como el receptor a de PDGF (PDGFRa); receptor p de PDGF (PDGFRp); y/o receptor ap de PDGF (PDGFap). Al reducir o prevenir la actividad de uno o más PDGF, los inhibidores de LYST pueden reducir o prevenir la inducción mediada por PDGF de varias rutas de señalización que controlan las actividades celulares, que incluyen proliferación celular, quimiotaxis y reorganización de actina.

En otra realización, los uno o más inhibidores de LYST están en una cantidad eficaz para disminuir la formación de tejido celular y conjuntivo de alta densidad que dan lugar a fibrosis, cicatrices, queloides o adherencias. La cantidad de uno o más inhibidores de LYST no previene la curación de heridas.

D. Terapias de combinación

Las composiciones, dispositivos e injertos desvelados que incluyen inhibidores de LYST se pueden administrar solos o en combinación con uno o más agentes activos adicionales, como parte de un régimen de tratamiento terapéutico o profiláctico. Por ejemplo, la composición se puede administrar el primer, el segundo, el tercer o el cuarto día, o combinaciones de los mismos. La composición se puede administrar el mismo día o un día diferente al del segundo agente activo.

El término "combinación" o "combinado" se usa para hacer referencia a la administración concomitante, simultánea o secuencial de dos o más agentes. Por lo tanto, las combinaciones se pueden administrar de forma concomitante (por ejemplo, como una mezcla), por separado pero de forma simultánea (por ejemplo, mediante líneas intravenosas separadas en el mismo sujeto), o de forma secuencial (por ejemplo, uno de los compuestos o agentes se administra primero seguido del segundo).

Los agentes terapéuticos adicionales pueden ser otros agentes anti-capa neoíntima, agentes quimioterapéuticos, anticuerpos, antibióticos, antivirales, antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, agentes inmunoterapéuticos convencionales, inmunosupresores, citoquinas, quimioquinas y/o factores de crecimiento, antiproliferativos o agentes antimigración diseñados para tratar o prevenir la formación o reestenosis de la capa neoíntima, agentes que influyen en la migración y la producción de matriz extracelular, agentes que influyen en la deposición de plaquetas o formación de trombos, y agentes que promueven la curación vascular y la reendotelización, descritos en Tanguay et al. Current Status of Biodegradable Stents, Cardiology Clinics, 12: 699-713 (1994), J. E. Sousa, P. W. Serruys y M. A. Costa, Circulation 107 (2003) 2274 (Parte I), 2283 (Parte II), K. J. Salu, J. M. Bosmans, H. Bult y C. J. Vrints, Acta Cardiol 59 (2004) 51.

Los agentes antitrombina a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, heparina (incluyendo heparina de bajo peso molecular), R-Hirudina, Hirulog, Argatrobán, Efegatrán, péptido anticoagulante Tick y Ppack.

Los agentes antiproliferativos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel (Taxol), QP-2 vincristina, metotrexato, angiopeptina, mitomicina, BCP 678, c-myc antisentido, ABT 578, actinomicina-D, RestenASE, 1 - Clordesoxiadenosina, ribozima PCNA y celecoxib.

Los agentes que modulan la replicación/proliferación celular a modo de ejemplo incluyen dianas de inhibidores de rapamicina (TOR) (incluyendo sirolimus, everolimus y ABT-578), paclitaxel y agentes antineoplásicos, incluyendo agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida, mecloretamina, clorambucilo, melfalán, carmustina, lomustina, ifosfamida, procarbazina, dacarbazina, temozolomida, altretamina, cisplatino, carboplatino y oxaliplatino), antibióticos antitumorales (por ejemplo, bleomicina, actinomicina D, mitramicina, mitomicina C, etopósido, tenipósido, amsacrina, topotecan, irinotecán, doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, epirrubicina, mitoxantrona y mitoxantrona), antimetabolitos (por ejemplo, desoxicoformicina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2-clorodesoxiadenosina, hidroxiurea, metotrexato, 5-fluorouracilo, capecitabina, arabinósido de citosina, azacitidina, gemcitabina, fosfato de fludarabina y aspariginasa), agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, docetaxel, estramustina) y agentes dirigidos por vía molecular (por ejemplo, imatinib, tretinoína, bexaroteno, bevacizumab, gemtuzumab ogomicina y denileucina diftitox).

Los agentes anti-reestenosis a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, inmunomoduladores tales como Sirolimus (Rapamicina), Tacrolimus, Biorest, Mizorribina, Ciclosporina, Interferón .gamma. 1b, Leflunomida, Tranilast, Corticosteroide, Ácido micofenólico y Bifosfonato.

Los agentes antimigratorios y los moduladores de la matriz extracelular a modo de ejemplo, incluyen, pero no se limitan a, halofuginona, inhibidores de propil-hidroxilasa, inhibidores de proteinasa C, inhibidores de MMP, Batimastat, Probucol. Algunos ejemplos de agentes antiplaquetarios incluyen, pero no se limitan a, heparina.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es W-3,4-trihidroxibenzamida o una sal o éster farmacéuticamente aceptable de la misma, didox, imidato o hidroxiurea como se describe en el documento de patente de Estados Unidos N.° 8.029.815.

Los agentes terapéuticos adicionales se pueden administrar por vía local o por vía sistémica al sujeto, o se pueden recubrirse o se pueden incorporar sobre o dentro de un dispositivo o injerto. Los reactivos terapéuticos adicionales se pueden administrar mediante la misma vía o mediante diferentes vías y mediante diferentes medios. Por ejemplo, uno o más inhibidores de LYST se pueden administrar por vía local combinados con uno o más de paclitaxel, taxotere y otros compuestos taxoides, metotrexato, antraciclinas tales como doxorrubicina, everolimus, serolimus, rapamicina o derivados de rapamicina administrados mediante diferentes medios, tal como por vía sistémica.

En realizaciones adicionales, uno o más inhibidores de LYST se puede usar para reducir los efectos secundarios no deseados asociados al uso de uno o más agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, uno o más inhibidores de LYST se puede usar con el agente antineoplásico bleomicina, para reducir la fibrosis pulmonar asociada a bleomicina.

La presente invención se entenderá mejor por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: la mutación beige reduce la estenosis en injertos tisulares

Métodos y materiales

Los injertos vasculares formados por ingeniería tisular (TEVG) se desarrollaron sembrando células mononucleares autólogas obtenidas a partir de médula ósea en un armazón tubular biodegradable fabricado a partir de un tubo de fibra de ácido poliglicólico recubierto con un copolímero de ácido poliláctico y policaprolactona a 50:50.

Se desarrolló un modelo murino para evaluar la función de TEVG en un esfuerzo por dilucidar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la formación de TEVG. El modelo de injerto de interposición de vena cava inferior (IVC) es un modelo validado para investigar el uso de injertos vasculares en un sistema circulatorio de flujo alto y baja presión similar a la circulación de Fontan. Este modelo se usó ampliamente para estudiar la formación de tejido en el TEVG.

Un injerto de conducto biodegradable formado por PGA-PCL/LA se implantó en la vena cava inferior de ratones de tipo silvestre y ratones mutantes de color beige, respectivamente, sin siembra de células. Los injertos se explantaron 2 semanas después de la cirugía, se seccionaron y se midió el diámetro del vaso y se evaluó la permeabilidad. Resultados

Se observó una variación significativa en las tasas de estenosis cuando se implantaron TEVG como injertos de interposición IVC, dependiendo de la cepa del ratón. Específicamente, se observó que el TEVG implantado en ratones con una mutación beige tenía tasas de estenosis excepcionalmente bajas. La permeabilidad y el diámetro luminal de TEVG implantado como injertos de interposición de IVC se compararon tanto en C57B6 (ratones de tipo silvestre) (N = 25) como en mutantes de color beige (N = 10) (Tabla 1). Los ratones de tipo silvestre exhibieron una estenosis de un 80 % con diámetros luminales de 0,33 mm, mientras que los ratones de color beige exhibieron una tasa de estenosis de un 10 % con diámetros luminales que medían 0,71 mm (ensayo de T < 0,001 y Chi-cuadrado 0,0002) (Figura 1).

Tabla 1: Diferencias en la permeabilidad y los diámetros luminales de TEVG explantado de ratones de color bei e B de ti o silvestre Wt.

Ejemplo 2: la mutación beige reduce la infiltración de macrófagos en injertos tisulares

Métodos y materiales

Usando el modelo murino, se ha demostrado previamente que la formación de neotejido vascular surge de células obtenidas a partir del hospedador y que el proceso de formación de tejido vascular está dirigido por el sistema inmunitario, específicamente macrófagos obtenidos a partir del hospedador. La infiltración excesiva de macrófagos conduce a estenosis, mientras que la inhibición de la infiltración de macrófagos previene la formación de neotejido. Se midió el número de macrófagos en los injertos explantados descritos anteriormente en el Ejemplo 1 para ratones tanto de color beige como de tipo silvestre. Para caracterizar el número y la morfología de las células endoteliales en cada grupo se llevó a cabo inmunohistoquímica en secciones de tejido de cada injerto, usando un anticuerpo específico para el marcador de células CD31.

Resultados

El TEVG implantado en los ratones de color beige exhibió significativamente menos infiltración de macrófagos que el TEVG implantado en los ratones de tipo silvestre 2 semanas después de la cirugía. Véase la Figura 2. Notablemente, la inmunohistoquímica para células endoteliales (usando un anticuerpo específico para CD 31) no mostró ninguna diferencia entre las secciones de injerto de ratones de tipo silvestre y de color beige, indicando que la formación de neotejido fue similar en ambos grupos.

Ejemplo 3: el fenotipo beige surge de una mutación en el gen LYST

Métodos y materiales

La mutación beige surge de una mutación espontánea del gen LYST (Figura 3). Para el análisis de la expresión de proteínas, se diseñaron 6 cebadores diferentes, denominados LYST1, LYST3, LYST4, LYST5 y LYST6, respectivamente, para cubrir la región del gen LYST completa. El cebador LYST-5 cubría el área del exón 52 que incluía la mutación de aminoácidos identificada en el genotipo de ratón de color beige. Se usaron células sin tratar como estándar para calcular los niveles relativos de ARNm.

Resultados

Se identificó la mutación específica responsable del fenotipo beige en ratones de color beige. El gen LYST de longitud completa codifica un polipéptido de 3801 aminoácidos. La mutación de LYST se produjo en el exón 52 dando como resultado la deleción del aminoácido isoleucina (ile3741 del) (Figura 3).

Los análisis moleculares demostraron que no hubo diferencias significativas en la expresión de ARNm entre ambos grupos. A pesar de los niveles equivalentes de transcripción de las proteínas de tipo silvestre y mutantes, no hubo traducción de la proteína mutante.

Además, la expresión de la proteína LYST se redujo en el ratón mutante de color beige mediante inmunohistoquímica y transferencia de Western (Figura 4). Estos resultados indicaron que la mutación del gen LYST en el ratón de color beige influye en el nivel de modificación de la proteína después de la traducción del gen.

Ejemplo 4: la mutación beige en el gen LYST altera los procesos inmunitarios

Métodos y materiales

Se sometió a ensayo la hipótesis de que la mutación beige inhibe la formación de estenosis de TEVG modulando el sistema inmunitario. Se trasplantó médula ósea de ratones C57B6 (tipo silvestre) a ratones mutantes de color beige y viceversa. Para determinar el porcentaje de monocitos LYST en ratones de color beige y de tipo silvestre se llevaron a cabo análisis FACS. Además, la capacidad de activación plaquetaria tras la estimulación con fibrina se redujo en ratones mutantes de color beige en comparación con los de tipo silvestre.

Resultados

Se demostró una inhibición significativa de la estenosis de TEVG en ratones de tipo silvestre trasplantados con médula ósea de los ratones de color beige. De manera similar, cuando se implantaron TEVG en ratones de color beige trasplantados con la médula ósea de ratones de tipo silvestre, exhibieron altas tasas de estenosis de TEVG. Estos hallazgos indicaron que la mutación beige inhibe la estenosis de TEVG mediante su efecto en el sistema inmunitario. El análisis FACS de monocitos y macrófagos de ratones Wt y de color beige, respectivamente, demostró diferencias en la población fenotípica. Una serie de diagramas de puntos de dispersión que muestran resultados representativos de la citometría de flujo analítica muestran la proporción de células de monocitos teñidas para CD115 (eje Y) y CD11b (eje X) de ratones WT3, WT4, bg3 y bg4, respectivamente. También se determinó la distribución de células teñidas para LYC6 y F4/80 de ratones WT3, WT4, bg3 y bg4, respectivamente. Se calculó el porcentaje de células designadas como LYC6 "Altos" y LYC6 "Bajos". Los resultados son representativos de macrófagos peritoneales 3 días después de la estimulación con tioglicolato, seleccionados para excluir las células muertas y los residuos.

Los gráficos de puntos de dispersión mostraron resultados representativos de citometría de flujo analítica, representando células teñidas para PE-A (eje Y) frente a fluorescencia FITC-A (eje X) de ratones WT y ratones de color beige, respectivamente. Las células se seleccionaron para excluir las células muertas y los residuos tras la activación plaquetaria tras la estimulación con fibrina. El número de monocitos LY6C "altos" fue mayor en el grupo de tipo silvestre (WT3, WT4), mientras que el número de monocitos Ly6C "bajos" fue mayor en el grupo de color beige (bg 3, bg) en macrófagos peritoneales 3 días después de la estimulación con tioglicolato.

El análisis FACS también demostró que la capacidad de activación plaquetaria tras la estimulación de células con fibrina se redujo en ratones mutantes de color beige, en comparación con ratones de tipo silvestre.

Ejemplo 5: la inmunomodulación mediada por LYST se puede lograr usando un anticuerpo para la proteína LYST

Métodos y materiales

Los efectos del bloqueo de la proteína LYST se investigaron usando un anticuerpo anti-LYST. Los ratones C57B6 se trataron con el anticuerpo anti-LYST y a continuación se implantaron con TEVG. Se inyectó anticuerpo anti-LYST en el peritoneo de ratón de tipo silvestre en cada uno de los tres grupos de tratamiento diferentes (0 mg/kg (control), 10 mg/kg, o 50 mg/kg) 1 día antes de la cirugía, así como 1 semana después de cirugía. Se sacrificaron los ratones y se explantaron el injerto y el bazo 2 semanas después de la cirugía. La histología se realizó mediante tinción con hematoxilina y eosina (tinción HE) del injerto. El tejido del bazo se analizó mediante transferencia de Western usando un anticuerpo específico para la proteína LYST para determinar la cantidad relativa eficaz de proteína LYST en cada grupo de tratamiento.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para uso en un método para reducir infiltración de macrófagos, formación de cicatrices, o estenosis en un sitio de implante de injerto en un sujeto que comprende:

a) uno o más inhibidores del regulador del tráfico lisosomal (LYST) en una cantidad eficaz para reducir infiltración de macrófagos, activación de linfocitos citolíticos naturales, y/o activación plaquetaria en el sujeto, y

b) un vehículo fisiológicamente aceptable,

en donde la composición se administra al sujeto antes de una cirugía, en el momento de una cirugía, y/o en los días posteriores a una cirugía, y

en donde la cantidad de uno o más inhibidores de LYST está entre 0,1 y 1000 mg/kg de peso corporal de un ser humano y no previene la curación de heridas.

2. La composición farmacéutica para uso en un método de la reivindicación 1, en donde la composición se administra antes de una cirugía.

3. La composición farmacéutica para uso en un método de la reivindicación 1 o 2, en donde la cantidad de uno o más inhibidores de LYST no previene la formación de neotejido vascular en el sitio de implante del injerto en el sujeto.

4. La composición farmacéutica para uso en un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la composición se usa para reducir la expresión del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor beta de crecimiento transformante, o cualquier combinación de los mismos en un sujeto con respecto a un sujeto de control sin tratar.

5. La composición farmacéutica para uso en un método de la reivindicación 1 en una dosificación eficaz para reducir la infiltración de macrófagos.

6. La composición farmacéutica para uso en un método de la reivindicación 1 en una dosificación eficaz para reducir la activación plaquetaria.

7. La composición farmacéutica para uso en un método de la reivindicación 1 en donde uno o más inhibidores de LYST son anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, o proteínas que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo anti-LYST.

8. La composición farmacéutica para uso en un método de la reivindicación 1 en donde uno o más inhibidores de LYST son un ácido nucleico funcional seleccionado entre el grupo que consiste en una molécula antisentido, ARNsi, miARN, aptámeros, ribozimas, moléculas formadoras de tríplex, ARNi, y secuencias guía externas.

9. La composición farmacéutica para uso en un método de la reivindicación 8 en donde uno o más ácidos nucleicos funcionales se expresan a partir de un vector de expresión.

10. La composición farmacéutica para uso en un método de la reivindicación 1 que comprende además un vehículo de administración seleccionado entre el grupo que consiste en nanopartículas, micropartículas, micelas, emulsiones, partículas de lipoproteínas sintéticas, liposomas, nanotubos de carbono, geles, y recubrimientos.

11. La composición farmacéutica para uso en un método de la reivindicación 1 que comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados entre el grupo que consiste en otros agentes anti-capa neoíntima, agentes quimioterapéuticos, antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, agentes inmunoterapéuticos convencionales, inmunosupresores, citoquinas, quimioquinas, y factores de crecimiento.

12. Una composición farmacéutica para uso en un método para reducir la activación plaquetaria y la trombosis arterial o venosa en un sujeto con un injerto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 antes y después del implante del injerto.

13. La composición farmacéutica para uso en un método de la reivindicación 12, en donde la composición se usa para reducir la expresión del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor beta de crecimiento transformante, o cualquier combinación de los mismos en un sujeto con respecto a un sujeto de control sin tratar.