ES2884357T3 - Modulación de la actividad de las citocinas gamma-c - Google Patents

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Abstract

Un péptido compuesto que comprende las secuencias de aminoácidos de al menos dos regiones en hélice D de la proteína gamma-c de la interleucina (IL), en donde el péptido compuesto comprende la secuencia de aminoácidos P- K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S (SEQ ID NO: 3) o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 3, y en donde el péptido compuesto inhibe selectivamente la función de la IL-21 y una o más de las IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15.

Description

DESCRIPCIÓN
Modulación de la actividad de las citocinas gamma-c
Prioridad y referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos n.° 62/239.761, presentada el 9 de octubre de 2015.
Campo
Algunas realizaciones se refieren a antagonistas peptídicos de citocinas de la familia yc, un grupo de citocinas de mamíferos que son producidas principalmente por células epiteliales, estromales e inmunitarias y controlan la activación normal y patológica de varios linfocitos. Algunas realizaciones también se refieren a los usos terapéuticos de dichos péptidos para el tratamiento de ciertas enfermedades humanas. Las presentes realizaciones también se refieren a las aplicaciones cosmecéuticas de dichos péptidos. Se divulga la descripción de las enfermedades objetivo, las aplicaciones cosmecéuticas, así como los métodos de administración, producción y comercialización de los péptidos.
Antecedentes
Las citocinas son un grupo diverso de factores solubles que participan en varias funciones celulares, tales como, crecimiento, diferenciación funcional y promoción o prevención de la muerte celular programada (muerte celular apoptótica). Las citocinas, a diferencia de las hormonas, no son producidas por tejidos glandulares especializados, pero pueden ser producidas por una amplia variedad de tipos celulares, tales como células epiteliales, estromales o inmunitarias.
Las citocinas de la familia yc son un grupo de citocinas de mamíferos que son producidas principalmente por células epiteliales, estromales e inmunitarias, y controlan la activación normal y patológica de diversos linfocitos. Estas citocinas son muy necesarias para el desarrollo temprano de los linfocitos T en el timo, así como para su homeostasis en la periferia.
El documento US 2013/217858 divulga un péptido de secuencia consenso basado en regiones en hélice D capaz de influir en la actividad de varias interleucinas.
Sumario
En algunas realizaciones, se proporciona un péptido compuesto. En algunas realizaciones, el péptido compuesto comprende secuencias de aminoácidos de al menos dos regiones en hélice D de la secuencia de la proteína gammac de la interleucina (IL), en donde el péptido compuesto comprende la secuencia de aminoácidos P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S (SEQ ID NO: 3) o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 3,
y en donde el péptido compuesto inhibe selectivamente la función de la IL-21 y una o más de las IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15.
En algunas realizaciones, el péptido compuesto inhibe la actividad de al menos la IL-15 y la IL-21.
En algunas realizaciones, el péptido compuesto comprende además un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido compuesto está además conjugado con una o más fracciones adicionales en el extremo amínico, el extremo carboxílico o un resto lateral del péptido compuesto. En algunas realizaciones del péptido compuesto, la una o más fracciones adicionales se seleccionan del grupo que consiste en seroalbúmina bovina (SAB), albúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH), la región FC de la IgG, una proteína biológica que funciona como armazón, un anticuerpo contra un antígeno específico celular, un receptor, un ligando, un ion metálico y polietilenglicol (PEG).
En algunas realizaciones, el péptido compuesto consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica. De acuerdo con la invención, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado peptídico; y
un vehículo, diluyente, excipiente o combinación farmacéuticamente aceptable de los mismos;
en donde el conjugado peptídico inhibe la función de la IL-21 y una o más citocinas yc seleccionadas del grupo que consiste en las IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15;
en donde el conjugado peptídico comprende la secuencia de aminoácidos P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S (SEQ ID NO: 3) o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones de la composición farmacéutica, el conjugado peptídico o el derivado del mismo comprende además un conjugado adicional en los residuos aminoterminales, carboxiterminales o laterales del mismo. En algunas realizaciones de la composición farmacéutica, el conjugado peptídico o el derivado del mismo comprende además un péptido señal.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además una proteína que estabiliza la estructura del conjugado peptídico o el derivado del mismo y mejora su actividad biológica, en donde la proteína es selecciona del grupo que consiste en seroalbúmina bovina (SAB), albúmina, la región Fc de la inmunoglobulina G (IgG), proteínas biológicas que funcionan como armazón, polietilenglicol (PEG) y los derivados de los mismos.
En algunas realizaciones de la composición farmacéutica, el derivado la misma comprende una secuencia peptídica que comparte al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para bloquear la señalización por dos o más miembros de la familia de las citocinas yc. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto una célula con un péptido compuesto y/o una composición farmacéutica proporcionados en el presente documento.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para inhibir la unión de las citocinas yc a una subunidad yc. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto una subunidad yc de una célula con un péptido compuesto y/o una composición farmacéutica proporcionados en el presente documento.
En algunas enseñanzas, se divulga un método para tratar una enfermedad mediada por citocinas yc. En algunas enseñanzas, el método comprende la administración de un péptido compuesto y/o de una composición farmacéutica proporcionados en el presente documento a un sujeto que lo necesite, en donde la enfermedad mediada por citocinas Yc se selecciona del grupo que consiste en leucemia de CD4, leucemia de CD8, leucemia de LGL, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, granulomatosis de Wegener, enfermedad celíaca, tiroiditis de Hashimoto, artritis reumatoide, diabetes sacarina, psoriasis, esclerosis múltiple, uveítis, inflamación del ojo y enfermedad del injerto contra el hospedador (EICH).
En algunas enseñanzas, se divulga un método para tratar una enfermedad asociada a la mielopatía asociada a1HTLV-1 (HAM)/paraparesia espástica tropical (TSP). En algunas enseñanzas, el método que comprende la administración de un péptido compuesto y/o de una composición farmacéutica proporcionados en el presente documento a un sujeto que lo necesite, en donde la enfermedad asociada a HAM/TSP se selecciona del grupo que consiste en leucemia de linfocitos T del adulto (ATL), mielopatía asociada al HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) y otras enfermedades inflamatorias no neoplásicas asociadas al HTLV tales como uveítis (HU), artropatía, neumopatía, dermatitis, exocrinopatía y miositis.
En algunas enseñanzas, se divulga un método para tratar una enfermedad respiratoria inflamatoria. En algunas enseñanzas, el método que comprende la administración de un péptido compuesto y/o de una composición farmacéutica proporcionados en el presente documento a un sujeto que lo necesite, en donde la enfermedad respiratoria inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en asma, sinusitis, rinoconjuntivitis alérgica, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), rinitis alérgica, otitis aguda y crónica, y fibrosis pulmonar.
En algunas enseñanzas, se divulga un método para tratar una afección cosmética. En algunas enseñanzas, el método que comprende la administración de un péptido compuesto y/o de una composición farmacéutica proporcionados en el presente documento a un sujeto que lo necesite, en donde la enfermedad cosmética se selecciona del grupo que consiste en acné, alopecia, eritema solar, cuidado de las uñas y aparición de envejecimiento.
En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica para usar en el tratamiento de una afección en un paciente. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado peptídico, o de un derivado del mismo, y un vehículo, diluyente, excipiente o combinación farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el conjugado peptídico o el derivado del mismo inhibe la función de la IL-21 y una o más citocinas yc seleccionadas del grupo que consiste en las IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15.
En algunas realizaciones de la composición farmacéutica, el derivado la misma comprende una secuencia peptídica que comparte al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica para usar en el tratamiento de una enfermedad mediada por citocinas yc, en donde la enfermedad mediada por citocinas yc se selecciona del grupo que consiste en leucemia de CD4, leucemia de CD8, leucemia de LGL, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, granulomatosis de Wegener, enfermedad celíaca, tiroiditis de Hashimoto, artritis reumatoide, diabetes sacarina, psoriasis, esclerosis múltiple, uveítis, inflamación del ojo y enfermedad del injerto contra el hospedador (EICH).
En algunas realizaciones, se proporciona para usar en el tratamiento de una enfermedad asociada a la mielopatía asociada al HTLV-1 (HAM)/paraparesia espástica tropical (TSP), en donde la enfermedad asociada a HAM/TSP se selecciona del grupo que consiste en leucemia de linfocitos T del adulto (ATL), mielopatía asociada al HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) y otras enfermedades inflamatorias no neoplásicas asociadas al HTLV tales como uveítis (HU), artropatía, neumopatía, dermatitis, exocrinopatía y miositis.
En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica para usar en el tratamiento de una enfermedad respiratoria inflamatoria, en donde la enfermedad respiratoria inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en asma, sinusitis, rinoconjuntivitis alérgica, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), rinitis alérgica, otitis aguda y crónica, y fibrosis pulmonar.
En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica para usar en el tratamiento de una afección cosmética, en donde la enfermedad cosmética se selecciona del grupo que consiste en acné, alopecia, eritema solar, cuidado de las uñas y aparición de envejecimiento.
En algunas realizaciones, se proporciona un kit para tratar una afección en un paciente. En algunas realizaciones del kit, la afección es una enfermedad mediada por citocinas yc, una enfermedad asociada a la mielopatía asociada al HTLV-1 (HAM)/paraparesia espástica tropical (TSP, una enfermedad respiratoria inflamatoria, una afección cosmética o una combinación de las mismas, comprendiendo el kit una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento.
En algunas realizaciones del kit, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado peptídico, o de un derivado del mismo, y un vehículo, diluyente, excipiente o combinación farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el conjugado peptídico o el derivado del mismo inhibe la función de la IL-21 y una o más citocinas yc seleccionadas del grupo que consiste en las IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15.
En algunas realizaciones del kit, el derivado la misma comprende una secuencia peptídica que comparte al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos del s Eq ID NO: 3.
En algunas realizaciones del kit, la afección es una o más de leucemia de CD4, leucemia de CD8, leucemia de LGL, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren de Sjogren, granulomatosis de Wegener, enfermedad celíaca, tiroiditis de Hashimoto, artritis reumatoide, diabetes sacarina, psoriasis, esclerosis múltiple, uveítis, inflamación del ojo, enfermedad del injerto contra el hospedador (EICH), leucemia de linfocitos T del adulto (ATL), mielopatía asociada al HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) y otras enfermedades inflamatorias no neoplásicas asociadas al HTLV tales como uveítis (HU), artropatía, neumopatía, dermatitis, exocrinopatía, miositis, asma, sinusitis, rinoconjuntivitis alérgica, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), rinitis alérgica, otitis aguda y crónica, y fibrosis pulmonar, acné, alopecia, eritema solar, cuidado de las uñas o aparición de envejecimiento.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A muestra una alineación de la región de la hélice D de los miembros de la familia de las citocinas yc humanas.
La figura 1B representa los motivos de la secuencia de yc (SEQ ID NO: 10) y de la secuencia de las IL-2/IL-15 (SEQ ID NO: 11) que dan lugar a la secuencia de consenso alrededor de la región de la hélice D de las citocinas yc.
La figura 2 representa una representación en diagrama de las propiedades bioquímicas de los aminoácidos. La figura 3A muestra la inhibición de la actividad de la IL-15 y la IL-9 por parte del BNZ-y en un ensayo de proliferación PT-18.
La figura 3B muestra un ensayo de proliferación de células CTTL2 cultivadas en presencia de IL-2 o IL-15 y 0, 0,1, 1 o 10 uM de BNZ-y.
La figura 3C muestra la inhibición de la fosforilación de la tirosina mediada por la IL-15 de la STAT5 por parte del BNZ-y.
La figura 4A muestra un ensayo de proliferación de linfocitos T ex vivo con sangre periférica HAM/TSP. La proliferación de linfocitos T se inhibe por la adición de BNZ-y.
La figura 4B muestra que la población de linfocitos CD4+CD25+ en un ensayo de proliferación de linfocitos T ex vivo con sangre periférica HAM/TSP disminuye después de añadir BNZ-y al cultivo.
La figura 4C muestra que la población de linfocitos CD4+Ki67 en un ensayo de proliferación de linfocitos T ex vivo con sangre periférica HAM/TSP se reduce después de añadir BNZ-y al cultivo.
La figura 4D muestra que el porcentaje de células vivas por tinción de Guava en un ensayo de proliferación de linfocitos T ex vivo con sangre periférica HAM/TSP no se ve afectado después de añadir BNZ-y al cultivo.
La figura 5 muestra la alineación de la secuencia del SEQ ID NO: 3 con las regiones de la hélice D de diferentes miembros de la familia de las citocinas yc humanas. Las áreas sombreadas representan las secuencias de aminoácidos de los miembros de la familia de las citocinas yc humanas que son idénticas a sus aminoácidos correspondientes en la secuencia del SEQ ID NO: 3.
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Visión general
Hasta ahora se han identificado más de 100 citocinas y se considera que han sido desarrolladas mediante duplicaciones génicas a partir de un conjunto de genes primordiales (véase Bazan, J.F. 1990, Immunol. Today 11: 350-354). En apoyo de esta opinión, es común que un grupo de citocinas comparta un componente en su sistema receptor multisubunidad. La subunidad de citocinas compartida mejor documentada en los linfocitos T es la subunidad Y común (subunidad yc).
La subunidad yc es compartida por 6 citocinas conocidas (interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 (IL-7), interleucina-9 (IL-9), interleucina-15 (IL-15) e interleucina-21 (IL-21), denominadas en conjunto "citocinas yc" o "citocinas de la familia yc"), y desempeña un papel indispensable en la transducción de señales de activación celular para todas estas citocinas. De manera adicional, para cada una de las citocinas yc, hay una o dos subunidades receptoras específicas de citocinas propias que cuando se complejan con la subunidad yc, dan lugar a un receptor completamente funcional. (Véase Shields et al., 2009, Nat Rev Immunol. 9: 480-90.)
Las citocinas de la familia yc son un grupo de citocinas de mamíferos que son producidas principalmente por células epiteliales, estromales e inmunitarias, y controlan la activación normal y patológica de diversos linfocitos. Estas citocinas son muy necesarias para el desarrollo temprano de los linfocitos T en el timo, así como para su homeostasis en la periferia. Por ejemplo, en ausencia de la subunidad yc, los linfocitos T, B y NK no se desarrollan en ratones. (Véase Sugamura et al., 1996, Annu. Rev. Immunol. 14: 179-205).
Las citocinas yc son actores importantes en el desarrollo de las células linfoides que constituyen el sistema inmunitario, en particular, los linfocitos T, B y citolíticos naturales (NK). Además, las citocinas yc han sido implicadas en varias enfermedades humanas. Por lo tanto, los factores que inhiben la actividad de las citocinas yc proporcionarían herramientas útiles para esclarecer el mecanismo de desarrollo de los subconjuntos de linfocitos y para tratar los trastornos inmunitarios y las enfermedades mediadas por las citocinas yc.
Se sabe que el agotamiento de la estirpe germinal de los genes que codifican la subunidad yc en ratones o las mutaciones de la subunidad yc en seres humanos causan inmunodeficiencia combinada grave (SCID) al alterar el aspecto o la función normales de los linfocitos NK, T y B. La importancia de la subunidad yc en la transducción de señales de las citocinas yc, IL-2, -4, -7, -9, 15, -21, se señala en estudios que demuestran la respuesta de los linfocitos de estos ratones y de pacientes humanos a las citocinas yc (revisado en Sugamura et al., 1995 Adv. Immunol. 59: 225-277). Esto indica que la alteración de la interacción entre la subunidad Yc y una citocina Yc bloquearía eficazmente los eventos de señalización intracelular por los miembros de la familia de citocinas yc. Por lo tanto, se espera que los péptidos antagonistas de acuerdo con las presentes realizaciones bloqueen eficazmente los cambios patógenos en los seres humanos que padecen enfermedades mediadas por la regulación incorrecta de los miembros de la familia de citocinas Yc.
Como alternativa a las estrategias mediadas por anticuerpos para modular la actividad de las citocinas yc individuales, los Solicitantes han ideado novedosos compuestos de bajo peso molecular denominados en el presente documento "Simul-Block", que suprimen la actividad de múltiples citocinas yc. Estos compuestos de bajo peso molecular, que incluyen tanto sustancias químicas como péptidos, son menos inmunógenos que los anticuerpos. Estas propiedades distinguen a Simul-Block como una estrategia más eficaz para mediar la actividad de las citocinas yc en intervenciones clínicas.
Patologías asociadas a las citocinas yc
Algunos estudios recientes han indicado que la desregulación de la expresión y la disfunción de las citocinas yc podría dar lugar a una amplia variedad de enfermedades inmunológicas y hematopoyéticas humanas.
IL-2
Aunque la IL-2 fue considerada históricamente un prototipo de factor de crecimiento de los linfocitos T, la generación de un ratón genoinactivado que carecía de expresión de la IL-2 reveló que la IL-2 no es crítica para el crecimiento o el desarrollo de los linfocitos T convencionales in vivo. La sobreexpresión de la IL-2, sin embargo, da lugar a una expansión preferente de un subconjunto de linfocitos T; los linfocitos T reguladores (T-regs). (Véase Antony et al., 2006, J. Immunol. 176: 5255-66.) Los T-regs suprimen las respuestas inmunitarias de otras células y, por lo tanto, actúan para mantener la tolerancia periférica (revisado en Sakaguchi et al., 2008, Cell 133: 775-87). Se cree que la ruptura de la tolerancia periférica causa enfermedades autoinmunitarias en los seres humanos.
Por lo tanto, se cree que la función inmunosupresora de los T-regs previene el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias (Véase Sakaguchi et al., 2008, Cell 133: 775-87). Los T-regs también han sido implicados en el cáncer, donde los tumores sólidos y las neoplasias malignas hematológicas se han asociado con unas cifras elevadas de T-regs (Véase De Rezende et al., 2010, Arch. Immunol. Ther. Exp. 58: 179-190).
IL-4
La IL-4 es una citocina no redundante implicada en la diferenciación de los linfocitos T colaboradores en el subconjunto de los Th2 (T colaboradores de tipo 2), que promueve la diferenciación de los linfocitos B prematuros en células plasmáticas productoras de IgE. Los niveles de IgE están elevados en el asma alérgica. Por lo tanto, La IL-4 está implicada en el desarrollo del asma alérgica. Los anticuerpos dirigidos contra la IL-4 pueden usarse para tratar o incluso prevenir la aparición del asma alérgica. (Véase Le Buanec et al., 2007, Vaccine 25: 7206-16.)
IL-7
La IL-7 es esencial para el desarrollo de los linfocitos B y el desarrollo temprano de los linfocitos T en el timo. En ratones, la expresión anormal de la IL-7 causa una leucemia asociada a linfocitos T. (Véase Fisher et al., 1993, Leukemia 2: S66-68.) Sin embargo, en los seres humanos, la regulación incorrecta de la IL-7 no parece causar una leucemia asociada a los linfocitos T. En los seres humanos, la regulación por aumento de la IL-7 sola o en combinación con otro miembro de la familia de las citocinas yc, IL-15, se ha implicado en la leucemia de linfocitos granulares grandes (LGL).
IL-9
El papel de la IL-9 todavía poco caracterizado en comparación con otros miembros de la familia de las citocinas yc. Los ratones con el gen de la IL-9 disminuido parecen normales y no carecen de ningún subconjunto de células en los compartimientos linfoides y hematopoyéticos. Algunos estudios recientes, sin embargo, revelan un papel in vivo para la IL-9 en la generación de células Th17 (T colaboradores inducidos por la interleucina-17) (Véase Littman et al., 2010, Cell 140 (6): 845-58; y Nowak et al., 2009, J. Exp. Med. 206: 1653-60).
IL-15
La IL-15 está críticamente implicada en el desarrollo de los linfocitos NK, los linfocitos NK-T, algunos subconjuntos de linfocitos intraepiteliales (IEL), linfocitos y§-T y linfocitos T de memoria del fenotipo CD8 (Véase Waldmann, 2007, J. Clin. Immunol. 27: 1-18; y Tagaya et al., 1996, EMBO J. 15: 4928-39). La sobreexpresión de la IL-15 en ratones da lugar al desarrollo de leucemia de linfocitos NK-T y de linfocitos T de tipo CD8 (Véase Fehniger et al., 2001, J. Exp. Med. 193: 219-31; Sato et al. 2011 Blood, en prensa). Estas leucemias inducidas experimentalmente parecen similares a la leucemia de LGL (linfocitos granulares grandes) en los seres humanos, dado que en ambos casos las células leucémicas expresan el antígeno CD8.
También se sospecha que los mecanismos autocrinos mediados por la IL-15 pueden estar involucrados en la transformación leucémica de los linfocitos T CD4. (Véase Azimi et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 2452-7; Azimi et al., 1999, J. Immunol. 163: 4064-72; Azimi et al., 2000, AIDS Res. Hum. Retroviruses 16: 1717-22; y Azimi et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 14559-64). Por ejemplo, el HTLV-I con tropismo por los CD4, que causa la leucemia de linfocitos T del adulto en los seres humanos, induce el crecimiento autocrino de linfocitos T transformados por el virus a través de la producción de IL-15 e IL-15Ra (Azimi et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 2452-7).
Además de la transformación leucémica, algunos estudios recientes implican a la IL-15 en el desarrollo patológico de la enfermedad celíaca (EC), una enfermedad autoinmunitaria. Se sabe que la IL-15 estimula la diferenciación de los linfocitos NK, CD8 y los intraepiteliales intestinales (IEL) en linfocitos citotóxicos activados por linfocina (LAK) al inducir la expresión de enzimas citolíticas (es decir, granzima y perforina), así como interferón-Y. La enfermedad celíaca (denominada EC desde el presente documento) es una enteropatía mediada por el sistema inmunitario que se desencadena por el consumo de alimentos que contienen gluten en individuos que expresan los alelos específicos HLA-DQ.
La prevalencia de esta enfermedad es del 1 % en la población occidental. El único tratamiento actual para la EC es la eliminación completa del gluten de la dieta del paciente. La patología de la EC está causada principalmente por un amplio daño en la mucosa intestinal, que está causada por los linfocitos T CD8 activados que se han infiltrado a la lámina propia intestinal. Estos linfocitos T CD8 parecen ser activados a través de mecanismos que involucran a la IL-15. Una publicación reciente demostró en ratones que la sobreexpresión ectópica de la IL-15 por enterocitos da lugar al desarrollo de enteropatía, que se asemeja mucho a las lesiones de los pacientes con EC. La neutralización de la actividad de la IL-15 disminuyó drásticamente los cambios patológicos. Por lo tanto, una intervención que bloquee la activación de los linfocitos T CD8 por parte de la IL-15 parece proporcionar una estrategia alternativa en el manejo de la EC con respecto a la dieta convencional sin gluten.
IL-21
La IL-21 es el miembro más recientemente descubierto de la familia yc. A diferencia de otros miembros de la familia, la IL-21 no parece tener potentes efectos que promuevan el crecimiento. En cambio, se cree que la IL-21 funciona más como un factor de diferenciación que como un factor de control de la proliferación celular (véase Tagaya, 2010, J. Leuk. Biol. 87: 13-15).
Estrategias actuales para el tratamiento de trastornos mediados por las citocinas vc
Debido a que se cree que las citocinas yc están involucradas en numerosas enfermedades humanas, se han propuesto diversos métodos para tratar enfermedades relacionadas con las citocinas yc mediante la inhibición de las actividades de la familia de las citocinas yc. Estos métodos incluyen el uso de anticuerpos monoclonales específicos de las citocinas para neutralizar in vivo la actividad de la citocina objetivo; el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos a las subunidades receptoras específicas de citocinas propias (subunidades distintas de la subunidad yc compartida) para inhibir selectivamente la actividad de la citocina; y el uso de inhibidores químicos que bloquean la vía de transducción de señales anterógrada de las citocinas intracelulares.
Aunque los anticuerpos específicos de citocinas son a menudo la primera opción en el diseño de productos terapéuticos, las citocinas que comparten componentes receptores muestran funciones superpuestas (véase Paul, W.E., 1989, Cell 57: 521-24), y puede cooperar más de una citocina para causar una enfermedad (véase el ejemplo descrito a continuación). Por lo tanto, los enfoques que implican la neutralización de una sola citocina pueden no ser eficaces en el tratamiento de enfermedades humanas relacionadas con citocinas.
También se han propuesto estrategias para diseñar productos terapéuticos que inhiban la función de múltiples citocinas a través de anticuerpos que reconozcan un componente receptor compartido. Sin embargo, la naturaleza multisubunidad de los sistemas receptores de citocinas y el hecho de que los receptores funcionales para una sola citocina pueden asumir diferentes configuraciones, dificultan este enfoque.
Por ejemplo, un receptor funcional de la IL-15 puede ser IL-15Kp/yc o IL-15Ra/p/yc. (Véase Dubois et al., 2002, Immunity 17: 537-47). Un anticuerpo contra el receptor IIL-15Rp (TMp1) es un inhibidor eficaz de la función de la IL-15, pero solo cuando la molécula del IL-15Ra está ausente del complejo receptor. (Véase Tanaka et al., 1991, J. Immunol. 147: 2222-28.) Por lo tanto, la eficacia de un anticuerpo monoclonal anti-receptor, tanto si se ha creado contra una subunidad compartida como propia, puede depender del contexto y es impredecible in vivo.
Aunque el uso clínico de anticuerpos monoclonales contra factores biológicamente activos o receptores asociados con la patogenia de enfermedades es una práctica establecida, hay pocas pruebas de resultados satisfactorios. Además, el establecimiento de un tratamiento con anticuerpos monoclonales clínicamente adecuados es un proceso largo y difícil, siendo la generación satisfactoria de un anticuerpo neutralizante en gran parte una cuestión de suerte. Por ejemplo, debido a la importancia crítica de la subunidad yc para mediar la señalización por citocinas de la familia yc, se han realizado muchos intentos para generar anticuerpos policlonales y monoclonales contra la subunidad yc, y existen muchos anticuerpos comerciales que reconocen la subunidad yc en ratones y en seres humanos. Curiosamente, sin embargo, ninguno de estos anticuerpos anti-subunidad-yc bloquea la función de las citocinas yc.
Otro problema del uso terapéutico de anticuerpos monoclonales es que los anticuerpos monoclonales se generan habitualmente inmunizando roedores con proteínas humanas, por lo que el anticuerpo generado es una proteína extraña y, por lo tanto, altamente inmunógena. Para evitar este problema, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal se modifica de forma molecular para que la molécula del anticuerpo sea reconocida como una inmunoglobulina humana (un proceso denominado humanización), pero este proceso requiere tiempo y gastos.
Direccionamiento a la JAK3 como ejemplo alternativo existente para la inhibición de múltiples citocinas vc
La interacción entre la subunidad yc y una citocina yc da lugar a la activación de una proteína tirosina cinasa intracelular llamada janocinasa 3 (Jak3). La Jak3, a su vez, fosforila múltiples moléculas señalizadoras, incluyendo la STAT5 y la cinasa PI3. La interacción entre la subunidad yc y la Jak3 es muy específica. De hecho, no hay ninguna otra molécula receptora que reclute la Jak3 para la transducción de señales. (Véase O'Shea, 2004, Ann. Rheum. Dis. 63: (supl. II): ii67-7). Por lo tanto, la inhibición de la señalización de citocinas a través de la subunidad yc puede lograrse bloqueando la actividad de la cinasa Jak3. Por consiguiente, se han introducido en el mercado múltiples inhibidores químicos que se dirigen a la actividad cinasa de la Jak3. (Véase Pesu et al., 2008, Immunol. Rev. 223: 132-142.) Uno de estos ejemplos es el CP690.550.
El principal inconveniente de estos inhibidores de proteína cinasa es la ausencia de especificidad para la cinasa Jak3. Estos fármacos interceptan la unión de las moléculas de ATP (trifosfato de adenosina) a la cinasa Jak3, una reacción bioquímica común para muchas proteínas cinasas, y por lo tanto tienden a bloquear la acción de múltiples proteínas cinasas intracelulares que no están relacionadas con la cinasa Jak3 cuyas acciones son críticamente necesarias para el bienestar de las células normales en diversos tejidos. Por lo tanto, se necesitan inhibidores más específicos de la señalización a través de la subunidad yc.
Por lo tanto, existe una gran necesidad de una estrategia alternativa para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con las citocinas yc.
Descubrimiento de la secuencia de vc
El extremo carboxílico (la hélice D) de las citocinas yc contiene el sitio propuesto para interactuar con la subunidad yc común de los receptores de citocinas multiunidad. (Bernard et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 24313-21.) La comparación de las propiedades bioquímicas de los aminoácidos de todas las citocinas yc identificadas en ratones y en seres humanos reveló que la naturaleza química de los aminoácidos, por ejemplo, hidrofobia, hidrofilia, naturaleza básica/ácida, se conservan, si no idénticas, en muchas posiciones de la hélice D en los miembros de la familia de citocinas yc.
Por el contrario, la secuencia de la IL-13, que está relacionada con la citocina yc, IL-4, pero no se une a la subunidad Yc, no presenta una homología significativa en la región de la hélice D con respecto a las citocinas yc, lo que sugiere que la homología de secuencia en la región de la hélice D está correlacionada con la unión a la subunidad yc. Como se muestra en la figura 1A, la alineación de las secuencias de aminoácidos de la región de la hélice D de los miembros de la familia de citocinas yc en seres humanos revela un motivo de homología de secuencia moderada en estas citocinas denominado en el presente documento "secuencia de yc".
La secuencia de yc (SEQ ID NO: 10) comprende 19 aminoácidos donde, de las 19 posiciones, las posiciones 4, 5 y 13 están completamente conservadas como fenilalanina, leucina y glutamina, respectivamente. Se observa menos conservación en las posiciones 6, 7 y 11 de la secuencia de yc donde el aminoácido es uno de dos o tres aminoácidos relacionados que comparten propiedades fisicoquímicas: la posición 6 puede estar ocupada por los aminoácidos polares glutamato, asparagina o glutamina; los aminoácidos no polares serina o arginina pueden ocupar la posición 7; y la posición 11 está ocupada por cualquiera de los aminoácidos alifáticos no polares leucina o isoleucina. Las posiciones 9 y 16 pueden estar ocupadas por el aminoácido no polar isoleucina o el aminoácido polar lisina. Véase la figura 1B. Se observan algunas diferencias en la composición de aminoácidos de la secuencia de yc en las posiciones 9 y 16 entre las subfamilias de las citocinas yc. La comparación de las citocinas yc entre especies indica que la isoleucina suele estar presente en las posiciones 9 y 16 en la subfamilia IL-2/15, mientras que los otros miembros de la familia yc a menudo poseen lisina en estas posiciones. Sin desear quedar ligado a teoría concreta alguna, la isoleucina y la lisina son bioquímicamente diferentes y, por lo tanto, pueden impartir diferencias conformacionales específicas entre la subfamilia IL-2/15 y otras citocinas yc.
La conservación del motivo de la secuencia de yc entre las citocinas yc se apoya en los hallazgos de que un resto de glutamina (Gln, Q) situado en la región de la hélice D es crítico para la unión de las citocinas yc a la subunidad yc. (Bernard et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 24313-21.)
Inhibidores peptídicos de la actividad de las citocinas vc
La actividad de las citocinas de la familia yc puede bloquearse alterando la interacción entre la citocina yc y la subunidad yc, por ejemplo, introduciendo un inhibidor competitivo que pueda interactuar con la subunidad yc sin estimular la señalización a través de los receptores de citocinas multisubunidad. Sin pretender quedar ligado a teoría concreta alguna, el motivo conservado de la secuencia de yc, que participa en la unión de las citocinas de la familia Yc a la subunidad yc, presenta una secuencia de aminoácidos de base central que puede utilizarse para diseñar inhibidores peptídicos de la señalización de las citocinas yc.
La secuencia de aminoácidos central de la secuencia de yc comprende: D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q (SEQ ID NO: 2) (donde X representa cualquier aminoácido). Al menos algunas enseñanzas descritas en el presente documento se refieren a derivados peptídicos personalizados de la secuencia de aminoácidos central de la secuencia de yc que pueden inhibir la actividad de una o más citocinas yc. Los derivados peptídicos personalizados incluyen cualquier péptido cuya secuencia parcial de aminoácidos muestra aproximadamente un 50 %, un 50-60 %, un 60-70 %, un 70­ 80 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 99,8 % de identidad con la secuencia de aminoácidos central de la secuencia de yc. Los derivados peptídicos personalizados incluyen además cualquier péptido en donde una secuencia parcial de aminoácidos de ese derivado peptídico comprende aminoácidos con unas propiedades fisicoquímicas similares a los aminoácidos de la secuencia central de yc. Por ejemplo, los aminoácidos con unas propiedades fisicoquímicas similares incluirían fenilalanina, tirosina, triptófano e histidina, que son aminoácidos aromáticos. La figura 2 muestra una representación en diagrama de aminoácidos con unas propiedades fisicoquímicas similares que pueden ser sustituidos por los aminoácidos que componen la secuencia central de yc. Los derivados peptídicos de la secuencia central de yc pueden tener 19, 20, 21, 22, 24, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50 o más de 50 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los derivados peptídicos personalizados pueden conjugarse con los restos aminoterminales, carboxiterminales y/o laterales de las proteínas/péptidos biológicos existentes.
Tomando como base la identificación del motivo de la secuencia de yc conservada en las citocinas que se unen a la subunidad yc, los Solicitantes han ideado un novedoso péptido derivado personalizado de 19-mer que es un péptido compuesto artificial que combina la secuencia de aminoácidos de la IL-2 y la secuencia de yc de la iL-15 humanas. El péptido de 19-mer, denominado en el presente documento BNZ-y, consiste en la secuencia de aminoácidos: I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-l-I-N-T-S (SEQ iD NO: 1), donde los aminoácidos representados por caracteres en negrita están conservados entre la IL-2 y la IL-15, y los aminoácidos subrayados representan posiciones donde las propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos están conservadas.
Los Solicitantes descubrieron que el BNZ-y de 19-mer suprime la proliferación celular inducida por la IL-15 y la IL-9, pero no la proliferación celular inducida por la IL-3 o la IL-4. Véase la figura 3A y el EJEMPLO 2. Los Solicitantes demostraron además que el BNZ-y inhibe la fosforilación mediada por la IL-15 de la molécula de transducción de señales de las citocinas intracelulares, la STAT-5. Véase la figura 3C y el EJEMPLO 5. Estos resultados demuestran que los derivados peptídicos personalizados del motivo de la secuencia de yc conservado pueden inhibir la actividad de múltiples citocinas yc.
La presente divulgación enseña péptidos derivados personalizados de la secuencia de aminoácidos del BNZ-y de 19-mer, I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), que puede inhibir la actividad de una o más citocinas yc. Los derivados peptídicos personalizados de la secuencia de aminoácidos del BNZ-y de 19-mer incluyen cualquier péptido cuya secuencia parcial de aminoácidos muestra aproximadamente un 50 %, un 50-60 %, un 60-70 %, un 70­ 80 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 99,8 % de identidad con la secuencia de aminoácidos: I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1). Los derivados peptídicos personalizados incluyen además cualquier péptido en donde una secuencia parcial de aminoácidos de ese derivado peptídico comprende aminoácidos con unas propiedades fisicoquímicas similares a los aminoácidos de la secuencia: I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ iD NO: 1). En varias enseñanzas, los restos de aminoácidos de los péptidos derivados personalizados conservan unas propiedades fisicoquímicas similares a las de los restos de aminoácidos del BNZ-y, pero presentan una especificidad de inhibición biológica diferente a los 6 miembros de la familia de las citocinas Yc con respecto a la del péptido original de 19-mer. Los derivados peptídicos del BNZ-y pueden tener 19, 20, 21, 22, 24, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50 o más de 50 aminoácidos de longitud. En algunas enseñanzas, los derivados peptídicos personalizados pueden conjugarse con los restos aminoterminales, carboxiterminales y/o laterales de las proteínas/péptidos biológicos existentes.
La presente divulgación enseña derivados peptídicos personalizados de los motivos de la secuencia de yc de las IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 o IL-7, que se representan en la figura 1A. Otras enseñanzas se refieren a péptidos derivados personalizados que son péptidos compuestos artificiales que combinan la secuencia de aminoácidos de dos o más de los motivos de la secuencia de yc de las IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 e IL-7 humanas. Varias enseñanzas se refieren a derivados peptídicos personalizados de los motivos de la secuencia de yc de las IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 o IL-7 que tienen una secuencia parcial de aminoácidos que muestra aproximadamente un 50 %, un 50-60 %, un 60-70 %, un 70-80 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, un 97 %, un 98 %, un 99,8 % o un 99 % de identidad con las secuencias de aminoácidos de los motivos de la secuencia de yc de las IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 o IL-7. Los derivados peptídicos personalizados de los motivos de la secuencia de yc de las IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 o IL-7 incluyen además cualquier péptido en donde una secuencia parcial de aminoácidos de ese derivado peptídico comprende aminoácidos con unas propiedades fisicoquímicas similares a los aminoácidos de la secuencia de los motivos de la secuencia de Yc de las IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 o IL-7.
Varias enseñanzas se refieren a derivados peptídicos personalizados que inhibirían la función de uno, todos o miembros selectivos de las citocinas yc. En algunas realizaciones, los derivados peptídicos personalizados se dirigen selectivamente a los miembros individuales de la familia de las citocinas yc. Por ejemplo, un derivado peptídico personalizado puede inhibir selectivamente la función de las IL-2, IL-4, IL-7, lL-9, IL-15 o lL-21. En otras enseñanzas, un derivado peptídico personalizado puede inhibir 2 o más miembros de la familia de las citocinas yc.
Por ejemplo, los derivados peptídicos personalizados de ciertas enseñanzas pueden inhibir selectivamente la función de la IL-2 en combinación con una o más de las IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21; la IL-4 en combinación con una o más de las IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21; la IL-7 en combinación con una o más de las IL-9, IL-15 e IL-21; la IL-9 en combinación con una o más de las IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 e IL-21; la IL-15 en combinación con una o más de las IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-21; o la IL-21 en combinación con una o más de las IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15. En otras realizaciones, los derivados de péptidos personalizados pueden dirigirse al conjunto de todos los miembros de la familia de las citocinas yc.
Sin desear quedar ligado a teoría concreta alguna, los derivados peptídicos personalizados pueden inhibir la función de todos los miembros o de miembros selectivos de las citocinas yc disminuyendo la unión de las citocinas yc a la subunidad yc, por ejemplo, como un inhibidor competitivo. Dichos derivados peptídicos personalizados pueden usarse en diversas aplicaciones, incluyendo como fármaco clínico.
Varias enseñanzas se refieren a derivados peptídicos personalizados que modularían (incluyendo mejorar o reducir) la función de uno, dos o más de miembros selectivos de las citocinas yc. En algunas enseñanzas, los derivados peptídicos personalizados se dirigen selectivamente a los miembros individuales de la familia de las citocinas yc. Por ejemplo, un derivado peptídico personalizado puede mejorar o inhibir selectivamente la función de las IL-2, IL-4, IL-7, lL-9, IL-15 o IL-21. En otras realizaciones, un derivado peptídico personalizado puede mejorar o inhibir dos o más miembros de la familia de las citocinas yc. En ciertas realizaciones, los derivados peptídicos personalizados pueden comprender: P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S (SEQ ID NO: 3), que puede mejorar o inhibir la actividad de, dos o más de las citocinas yc. En ciertas realizaciones, los derivados peptídicos personalizados pueden comprender: P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S (SEQ ID NO: 3), que puede inhibir la actividad de al menos la IL-15 y la IL-21.
En algunas realizaciones, los derivados peptídicos personalizados pueden incluir cualquier péptido cuya secuencia parcial de aminoácidos muestre aproximadamente un 90 %, un 95 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 99,8 % de identidad con la secuencia de aminoácidos: P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S (SEQ ID NO: 3). Los derivados peptídicos personalizados incluyen además cualquier péptido en donde una secuencia parcial de aminoácidos de ese derivado peptídico comprende aminoácidos con unas propiedades fisicoquímicas similares a los aminoácidos de la secuencia: P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S (SEQ ID NO: 3).
En varias realizaciones, los residuos de aminoácidos de los péptidos derivados personalizados conservan unas propiedades fisicoquímicas similares con respecto a los residuos de aminoácidos de P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S (SEQ ID NO: 3), pero presentan una especificidad de inhibición biológica diferente a los 6 miembros de la familia de citocinas yc (es decir, las IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 o IL-21) con respecto a la del péptido original de P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-1-H-Q-S-L-S (SEQ ID NO: 3). Los derivados peptídicos de la secuencia de P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-1-H-Q-S-L-S (SEQ ID NO: 3) pueden tener 19, 20, 21, 22, 24, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45­ 50 o más de 50 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, los derivados peptídicos personalizados pueden conjugarse con los restos aminoterminales, carboxiterminales y/o laterales de las proteínas/péptidos biológicos existentes. En algunas realizaciones, el péptido compuesto del s Eq ID NO: 3 puede conjugarse con otras fracciones a través de la cadena aminoterminal, carboxiterminal o lateral del péptido compuesto. Las otras fracciones pueden incluir proteínas o péptidos que estabilizan el péptido compuesto u otras fracciones, que incluyen, sin limitación, seroalbúmina bovina (SAB), albúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH), la región FC de la IgG, una proteína biológica que funciona como armazón, un anticuerpo contra un antígeno específico celular, un receptor, un ligando, un ion metálico y polietilenglicol (PEG).
Los términos "oligopéptido", "polipéptido", "péptido" y "proteína" puede usarse indistintamente al referirse a los derivados peptídicos personalizados proporcionados de acuerdo con las presentes realizaciones, y pueden usarse para designar una serie de restos de aminoácidos de cualquier longitud. Los péptidos de acuerdo con las presentes realizaciones también pueden contener aminoácidos no naturales. Los elementos conectores pueden unirse a los péptidos de las presentes realizaciones mediante enlaces peptídicos o a través de enlaces químicos. Los péptidos de las presentes realizaciones pueden ser lineales o cíclicos, y pueden incluir aminoácidos tanto (D) como (L).
Los péptidos de las presentes realizaciones también pueden contener uno o más aminoácidos raros (tales como 4-hidroxiprolina o hidroxilisina), ácidos orgánicos o amidas y/o derivados de aminoácidos comunes, tales como aminoácidos que tienen el carboxilato carboxiterminal esterificado (por ejemplo, bencil, metil o etil éster) o amidados y/o que tienen modificaciones del grupo de aminoácidos aminoterminal (por ejemplo, acetilación o alcoxicarbonilamino), con o sin cualquiera de una amplia variedad de modificaciones y/o sustituciones de la cadena lateral (por ejemplo, metilación, bencilación, f-butilación, tosilación, alcoxicarbonilamino, y similares).
Los residuos que no son aminoácidos comunes que pueden estar presentes incluyen, pero no se limitan a, penicilamina, tetrametilén cisteína, pentametilén cisteína, ácido mercaptopropiónico, ácido pentametilenmercaptopropiónico, 2-mercaptobenceno, 2-mercaptoanilina, 2-mercaptoprolina, ornitina, ácido diaminobutírico, ácido aminoadípico, ácido m-aminometilbenzoico y ácido diaminopropiónico.
Los péptidos de la presente enseñanza se pueden producir y obtener mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, el péptido puede producirse mediante ingeniería genética, tomando como base la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de las presentes realizaciones, o sintetizarse químicamente por medio de una síntesis peptídica en fase sólida y similares, o producirse y obtenerse en su combinación.
Un experto en la materia puede sintetizar los derivados peptídicos personalizados tomando como base la presente divulgación del motivo conservado de la secuencia de yc y el conocimiento de las propiedades bioquímicas de los aminoácidos como se describe en la figura 2. Algunas realizaciones también se refieren a polinucleótidos que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención. "Secuencia de nucleótidos", "polinucleótido" o "ácido nucleico" se pueden usar indistintamente, y se entiende que significan un ADN bicatenario, un ADN monocatenario o los productos de la transcripción de dichos ADN (por ejemplo, moléculas de ARN). Los polinucleótidos se pueden administrar a células o a sujetos y ser expresados por las células o los sujetos, en lugar de administrar los propios péptidos. Varias realizaciones también se refieren a construcciones genéticas que comprenden una secuencia de un polinucleótido que codifica los péptidos de la presente invención. Las construcciones genéticas también pueden contener elementos reguladores adicionales tales como promotores y potenciadores y, opcionalmente, marcadores de selección.
Métodos de tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas yc
Varias enseñanzas se refieren al uso de péptidos antagonistas de yc en el tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas yc. El uso de un derivado peptídico personalizado de acuerdo con las presentes realizaciones permite flexibilidad en el diseño del agente terapéutico (diseño personalizado del péptido) y posibilita unos resultados más completos, lo que no se lograría mediante las estrategias convencionales que emplean anticuerpos anti-citocinas o anti-receptores de citocinas.
En el presente documento se describe un novedoso método para bloquear la acción de las citocinas de la familia yc. Dichas manipulaciones pueden producir métodos eficaces de intervenciones clínicas en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la desregulación o la disfunción de las citocinas yc. Algunos ejemplos de enfermedades que pueden tratarse alterando la interacción entre la citocina yc y la subunidad yc incluyen enfermedades autoinmunitarias tales como lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, granulomatosis de Wegener, enfermedad celíaca, tiroiditis autoinmunitaria o de Hashimoto; enfermedades del colágeno incluyendo artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, diabetes sacarina, enfermedades autoinmunitarias de la piel tales como psoriasis; enfermedades neuronales degenerativas tales como esclerosis múltiple, uveítis o inflamación del ojo y oftalmía simpática, enfermedad del injerto contra el hospedador (EICH) y miastenia grave.
En algunas enseñanzas, los péptidos antagonistas de yc descritos en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de enfermedades asociadas a 1 -linfótropos de tipo I y II (HTLV-I y HTLV-II) de los linfocitos T humanos, incluyendo leucemia de linfocitos T del adulto (ATL), mielopatía asociada a1HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) y otras enfermedades inflamatorias no neoplásicas asociadas al HTLV tales como uveítis (HU), artropatía, neumopatía, dermatitis, exocrinopatía y miositis. En algunas enseñanzas, los péptidos antagonistas de yc descritos en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de otras enfermedades víricas tales como gripe, SIDA, VHB y herpes o enfermedades parasitarias.
En varias enseñanzas, los péptidos antagonistas de yc pueden administrarse antes, durante y o después del trasplante de varios órganos como agente inmunosupresor.
En algunas enseñanzas, los péptidos antagonistas de yc descritos en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de enfermedades inmunitarias tales como asma y otras enfermedades respiratorias inflamatorias, tales como, pero no se limitan a, sinusitis, rinoconjuntivitis alérgica, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), rinitis alérgica, otitis aguda y crónica, fibrosis pulmonar. En algunas enseñanzas, los péptidos antagonistas de yc pueden administrarse para tratar o prevenir reacciones alérgicas debidas a la exposición a alérgenos, agentes químicos u otras causas comunes de enfermedad respiratoria aguda. En algunas enseñanzas, los péptidos antagonistas de yc pueden administrarse para tratar o prevenir las respuestas inflamatorias causadas por virus, bacterias, reactivos químicos y reactivos bioquímicos.
En varias enseñanzas, los péptidos antagonistas de yc pueden administrarse para tratar algunos tipos de neoplasias malignas tales como leucemia de LGL, linfoma intraepitelial y leucemia en la enfermedad celíaca resistente, leucemia/linfoma de NK y leucemia/linfoma de NK-T.
En algunas enseñanzas, los derivados peptídicos personalizados de acuerdo con las enseñanzas descritas en el presente documento pueden usarse con fines cosméticos, tales como el tratamiento del acné, alopecia, eritema solar y cuidado de las uñas, incluyendo un ungüento como componente anti-envejecimiento, debido a su naturaleza antinflamatoria.
Varias enseñanzas se refieren a péptidos antagonistas terapéuticos que inhibirían la función de todos o de miembros selectivos de las citocinas yc. En algunas enseñanzas, los péptidos antagonistas terapéuticos inhiben selectivamente los miembros individuales de la familia de las citocinas yc (péptidos personalizados). En otras enseñanzas, los péptidos antagonistas terapéuticos pueden inhibir el conjunto de todos los miembros de la familia de las citocinas yc (Simul-Block). En algunas enseñanzas, los péptidos antagonistas terapéuticos inhiben selectivamente subconjuntos de las citocinas yc. Sin desear quedar ligado a teoría concreta alguna, los antagonistas peptídicos pueden inhibir la función de todos los miembros o de miembros selectivos de las citocinas yc disminuyendo la unión de las citocinas yc a la subunidad yc, por ejemplo, como un inhibidor competitivo.
Varios miembros de la familia de citocinas yc, IL-2, IL-7 e IL-15, pero no la IL-4, han sido implicados como intervinientes en la enfermedad del injerto contra el hospedador (EICH) en un modelo experimental de ratón. (Miyagawa et al., 2008 J. Immunol. 181: 1109-19.) Una realización se refiere al uso de péptidos antagonistas terapéuticos que inhiben selectivamente la actividad de la IL-2, la IL-7 y la IL-15 para el tratamiento de la EICH en seres humanos, permitiendo la supervivencia de los tejidos injertados o de las células de la médula ósea. Otras enseñanzas se refieren al uso de péptidos antagonistas terapéuticos que inhiben selectivamente una combinación de IL-2 e IL-7, IL-2 e IL-15, o IL-7 e IL-15, para tratar la EICH. Otras enseñanzas se refieren a el uso de una combinación de péptidos antagonistas terapéuticos que inhiben selectivamente las IL-2, IL-7 o IL-15.
Algunas enseñanzas se refieren a el uso de péptidos antagonistas terapéuticos que inhiben selectivamente la función de la IL-2 para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios donde se ha implicado a los T-regs desempeñando un papel. En algunas enseñanzas, la inhibición de los T-regs mediada por péptidos puede mejorar la inmunidad natural contra el cáncer en seres humanos, proporcionando un novedoso medio de terapia contra el cáncer.
Varias enseñanzas se refieren al uso de péptidos antagonistas terapéuticos que inhiben selectivamente la IL-4 para tratar el asma.
Algunas enseñanzas se refieren al uso de péptidos antagonistas terapéuticos que inhiben selectivamente la IL-7 tanto solos como en combinación con péptidos antagonistas terapéuticos que inhiben selectivamente al miembro de la familia de citocinas yc, IL-15, como agente terapéutico para la leucemia de LGL. En algunas enseñanzas se pueden usar péptidos antagonistas terapéuticos que inhiben selectivamente la actividad tanto de la IL-7 como de la IL-15 para tratar la leucemia de LGL. Varias enseñanzas se refieren al uso de BNZ-y para tratar la leucemia de LGL. En algunas enseñanzas, los péptidos antagonistas de yc específicos que selectivamente IL-15 sola o péptidos antagonistas de yc específicos que selectivamente la IL-15 y la IL-7, se usan como un agente terapéutico para la leucemia asociada a linfocitos T CD8/CD4, incluyendo la causada por el HTLV-I.
Varias enseñanzas se refieren al uso de péptidos antagonistas de yc que inhiben selectivamente la actividad de la IL-9, ya sea sola o en combinación con los otros miembros de la familia de las citocinas yc, como agente terapéutico para enfermedades humanas que implican el desarrollo anormal de los linfocitos Th17.
Varias enseñanzas se refieren a el uso de péptidos antagonistas terapéuticos que inhiben selectivamente la actividad de la IL-15 como un agente terapéutico para el tratamiento de la e C. Una publicación reciente sugirió que la IL-21, además de la IL-15, puede desempeñar un papel en la patogenia de la EC. (Véase Bodd et al., 2010, Mucosal Immunol.
3: 594-601.) Esto sugiere que el tratamiento óptimo de la EC mediante anticuerpos anti-citocinas o anti-receptores de citocinas convencionales se beneficiaría de una combinación de al menos dos anticuerpos que reconocen componentes que pertenecen a los sistemas de la IL-15 y de la IL-21. En algunas realizaciones, los péptidos antagonistas derivados personalizados que inhiben selectivamente la actividad tanto de la IL-15 como de la IL-21 se usan como agente terapéutico para el tratamiento de la EC.
Además de tener aplicaciones terapéuticas, los péptidos antagonistas de yc también tienen aplicaciones en productos de consumo. Varias realizaciones se refieren a el uso de péptidos antagonistas de yc en productos para el cuidado de la piel tales como antienvejecimiento, antinflamatorios, antiacneicos y otras aplicaciones relacionadas. Algunas enseñanzas se refieren al uso de péptidos antagonistas de yc en productos capilares como ingrediente antialopécico para tratar la alopecia causada por trastornos autoinmunitarios.
Otra enseñanza se refiere al desarrollo de compuestos químicos (no peptídicos, no proteicos) que tienen una estructura espacial que se asemeja a la secuencia de aminoácidos de 19-mer I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) y que puede encajar en la cavidad de la subunidad yc para obstaculizar estructuralmente el acceso de una citocina yc a la subunidad yc para su unión. Algunas enseñanzas se refieren al uso de compuestos químicos estructuralmente similares como inhibidores de la actividad de las citocinas yc. Dicha estrategia de mimetismo molecular para refinar aún más el desarrollo de compuestos sintéticos que se asemejan en su estructura a péptidos/proteínas biológicos existentes se describen en Orzaez et al., 2009 Chem. Med. Chem. 4: 146-160. Otra realización se refiere a la administración de compuestos químicos (no peptídicos, no proteicos) que tienen una estructura tridimensional similar a la secuencia de aminoácidos de 19-mer I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) para el tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas yc.
Varias enseñanzas se refieren a la administración de un péptido con la secuencia de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) para el tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas yc. Otra realización se refiere a la administración de péptidos derivados de la secuencia de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), en donde la secuencia de aminoácidos del péptido derivado tiene unas propiedades fisicoquímicas similares a las de un péptido con la secuencia de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), pero tiene una actividad biológica distinta, para el tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas yc. Otra realización se refiere a la administración a pacientes de un péptido con la secuencia de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) conjugado en los residuos amino y carboxiterminales o en los laterales de proteínas/péptidos biológicos existentes, para el tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas yc.
Varias enseñanzas se refieren a la administración a pacientes de anticuerpos policlonales y monoclonales creados contra un péptido que comprende de secuencia de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) como inmunógeno para el tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas yc. Otra realización se refiere a la administración a pacientes de anticuerpos policlonales y monoclonales creados contra péptidos derivados de la secuencia de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) en donde la secuencia de aminoácidos del péptido derivado tiene unas propiedades fisicoquímicas similares a las del péptido con la secuencia de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), pero tiene una actividad biológica distinta, como inmunógeno para el tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas yc.
Administración de péptidos antagonistas de vc
Las presentes enseñanzas también engloban el uso de péptidos antagonistas de yc para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad. Las presentes enseñanzas también engloban una composición farmacéutica que incluye péptidos antagonistas de yc en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad no tóxica terapéuticamente eficaz de péptidos antagonistas de yc o de otras composiciones de las presentes enseñanzas.
Las presentes enseñanzas proporcionan métodos de uso de composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de antagonistas de las citocinas yc en un diluyente o vehículo adecuado. Un antagonista de yc de las presentes enseñanzas puede formularse de acuerdo con los métodos conocidos usados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Un antagonista de yc se puede combinar en una mezcla, ya sea como el único material activo o con otros materiales activos conocidos, con diluyentes farmacéuticamente adecuados (por ejemplo, fosfato, acetato, tris-HCl), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), compuestos emulsionantes, solubilizantes, adyuvantes y/o vehículos tales como seroalbúmina bovina.
Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed. 1980 Mack Publishing CO. De manera adicional, dichas composiciones pueden contener un antagonista de yc complejado con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o estar incorporadas en compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o incorporadas en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o multilaminares, eritrocitos fantasma o esferoblastos. Dichas composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de eliminación in vivo de un antagonista de yc. Un antagonista de yc puede conjugarse con anticuerpos contra antígenos específicos celulares, receptores, ligandos, o acoplarse a ligandos de receptores específicos tisulares.
Los métodos de administración de los antagonistas de yc de las presentes enseñanzas pueden seleccionarse según sea apropiado, dependiendo de factores tales como el tipo de enfermedad, la afección de los sujetos y/o el sitio al que se va a dirigir. Los antagonistas de yc pueden administrarse por vía tópica, oral, parenteral, rectal o por inhalación. El término "parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, intraperitoneales, inyección suboccipital o técnicas de infusión. Estas composiciones incluirán normalmente una cantidad eficaz de un antagonista de yc, solo o en combinación con una cantidad eficaz de cualquier otro material activo.
La cantidad del péptido contenido en las composiciones farmacéuticas de las presentes enseñanzas, la forma farmacéutica de las composiciones farmacéuticas, la frecuencia de administración, y similares, pueden seleccionarse según sea apropiado, dependiendo de factores tales como el tipo de enfermedad, la afección de los sujetos y/o el sitio al que se va a dirigir. Dichas dosis y concentraciones deseadas del fármaco contenidas en las composiciones pueden variar afectadas por muchos parámetros, que incluyen el uso previsto, el peso corporal y la edad del paciente, y la vía de administración. Los estudios preliminares se llevarán a cabo en primer lugar usando estudios con animales, y la ampliación de escala para la administración en seres humanos se realizará de acuerdo con la práctica aceptada en la técnica.
En una realización, las células hospedadoras que han sido genomodificadas con un polinucleótido que codifica al menos un péptido antagonista de yc se administran a un sujeto para tratar un trastorno proliferativo y/o para reducir el crecimiento de células malignas. El polinucleótido es expresado por las células hospedadoras, produciendo así los péptidos dentro del sujeto. Preferentemente, las células hospedadoras son alogénicas o autógenas para el sujeto.
En un aspecto adicional, los péptidos antagonistas de yc pueden usarse en combinación con otras terapias, por ejemplo, terapias que inhiben la proliferación y el crecimiento de las células cancerosas. La expresión "terapia combinada" abarca la administración de péptidos antagonistas de yc y de un agente terapéutico adicional como parte de un régimen de tratamiento específico destinado a proporcionar un efecto beneficioso por la acción conjunta de estos agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación se realiza normalmente durante un período de tiempo definido (normalmente minutos, horas, días o semanas, dependiendo de la combinación seleccionada).
Una politerapia pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos de manera secuencial, es decir, en donde cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o de al menos dos de los agentes terapéuticos, de manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, administrando al sujeto una sola cápsula con una proporción fija de cada agente terapéutico, o en múltiples cápsulas individuales para cada uno de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico puede efectuarse por cualquier vía apropiada que incluye, pero no se limita a, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y la absorción directa a través de los tejidos de la membrana mucosa. Los agentes terapéuticos pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes. La secuencia en la que se administran los agentes terapéuticos no es estrictamente crítica.
La politerapia también puede abarcar la administración de los agentes terapéuticos descritos anteriormente en combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos (tales como, pero no se limitan a, un segundo y diferente agente terapéutico) y terapias no farmacológicas (tales como, pero no se limitan a, cirugía o radioterapia). Cuando la politerapia comprende además un tratamiento con radiación, el tratamiento con radiación puede llevarse a cabo en cualquier momento adecuado siempre que se consiga un efecto beneficioso de la acción conjunta de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento con radiación. Por ejemplo, en los casos apropiados, el efecto beneficioso se sigue logrando cuando el tratamiento con radiación se elimina temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, tal vez por días o incluso semanas.
En ciertas enseñanzas, los péptidos antagonistas de yc pueden administrarse en combinación con al menos un agente antiproliferativo seleccionado del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un antimetabolito, y un agente antitumorigénico, y un agente antimitótico, y un agente antivírico, y un agente antineoplásico, un agente inmunoterapéutico, y un agente radioterapéutico.
En ciertas enseñanzas, los péptidos antagonistas de yc pueden administrarse en combinación con al menos un agente antinflamatorio seleccionado del grupo que consiste en esteroides, corticoesteroides y fármacos antinflamatorios no esteroideos.
También se proporcionan kits para realizar cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento. En algunas enseñanzas, los kits pueden incluir uno o más antagonistas de yc de acuerdo con cualquiera de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento. En algunas enseñanzas, los kits pueden incluir instrucciones. Las instrucciones pueden estar escritas o en forma de pictograma, o pueden estar en soportes grabados que incluyen cinta de audio, CD de audio, cinta de vídeo, DVD, CD-ROM o similares. Los kits pueden comprender un envase.
Definiciones
Como se utiliza en el presente documento, el término "paciente" se refiere al receptor de un tratamiento terapéutico e incluye todos los organismos del reino animal. En enseñanzas preferidas, el animal pertenece a la familia de los mamíferos, tales como seres humanos, bovino, ovino, porcino, felino, búfalos, canino, cabra, equino, burro, ciervo, y primates. El animal más preferido es el ser humano.
Como se utiliza en el presente documento, el término "tratar" o cualquier variación del mismo (por ejemplo, , tratamiento, tratando, etc.), se refiere a cualquier tratamiento de un paciente al que se le ha diagnosticado una afección biológica, tal como leucemia de CD4, de CD8 y de LGL, una enfermedad autoinmunitaria, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, granulomatosis de Wegener, enfermedad celíaca, tiroiditis de Hashimoto, una enfermedad del colágeno, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, diabetes sacarina, psoriasis, una enfermedad degenerativa neuronal, esclerosis múltiple, uveítis, inflamación del ojo, enfermedad del injerto contra el hospedador (EICH), miastenia grave, enfermedades asociadas a 1 -linfótropos de tipo I y II (HTLV-I y HTLV-II) de los linfocitos T humanos, leucemia de linfocitos T del adulto (ATL), mielopatía asociada a1 HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP), uveítis (HU), artropatía, neumopatía, dermatitis, exocrinopatía, miositis, gripe, SIDA, VHB, herpes, asma, sinusitis, rinoconjuntivitis alérgica, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), rinitis alérgica, otitis aguda y crónica, fibrosis pulmonar, leucemia/linfoma de NK y leucemia/linfoma de NK-T.
El término tratar, como se utiliza en el presente documento, incluye: (i) prevenir o retrasar la aparición de los síntomas asociados con la afección biológica de interés en un paciente en riesgo que aún no muestra los síntomas asociados con la afección biológica; (ii) mejorar los síntomas asociados a la afección biológica de interés en un paciente al que se le ha diagnosticado una afección biológica; (iii) prevenir, retrasar o mejorar la aparición de los síntomas asociados con las complicaciones, las afecciones o las enfermedades asociadas con la afección biológica de interés en un paciente en riesgo o en un paciente al que se le ha diagnosticado la afección biológica; (iv) ralentizar, retrasar o detener la progresión de la afección biológica; y/o (v) prevenir, retrasar, ralentizar, detener o mejorar los eventos celulares de inflamación.
El término "síntomas", como se utiliza en el presente documento, se refiere a los signos o indicios comunes de que un paciente padece una afección o enfermedad específica.
La expresión "cantidad eficaz", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la cantidad necesaria para desencadenar la respuesta biológica deseada. De acuerdo con las presentes enseñanzas, una cantidad eficaz de un antagonista de yc es la cantidad necesaria para proporcionar un efecto observable en al menos un factor biológico para usar en el tratamiento de una afección biológica.
"Tecnología de ADN recombinante" o "recombinante" se refiere al uso de técnicas y procesos para producir polipéptidos específicos a partir de microorganismos (por ejemplo, bacterias, levaduras), invertebrados (insectos), células de mamíferos u organismos (por ejemplo, animales o plantas transgénicas) que se han transformado o transfectado con secuencias de ADN clonadas o sintéticas para permitir la biosíntesis de péptidos heterólogos. El patrón de glicosilación natural solo se logrará con un sistema de expresión de células de mamífero. Los sistemas de expresión procariotas carecen de la capacidad de añadir glicosilación a las proteínas sintetizadas. Las células de levadura y de insecto proporcionan un patrón de glicosilación único que puede ser diferente del patrón natural.
Una "secuencia de nucleótidos" se refiere a un polinucleótido en forma de fragmento individual o como un componente de una construcción de ADN más grande que se ha derivado a partir del ADN o el ARN aislado al menos una vez en una forma sustancialmente pura, exento de materiales contaminantes endógenos y en una cantidad o concentración que permite la identificación, la manipulación y la recuperación de sus secuencias de nucleótidos componentes mediante métodos convencionales de biología molecular (como se describe en Current Protocols in Molecular Biology).
"Vector de expresión recombinante" se refiere a un plásmido que comprende una unidad transcripcional que contiene un conjunto de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, incluyendo promotores y potenciadores, (2) una estructura o secuencia codificante que codifica el polipéptido de acuerdo con las presentes enseñanzas, y (3) la apropiada transcripción y secuencia de inicio de la traducción y, si se desea, las secuencias terminadoras. Los elementos estructurales destinados para usarse en sistemas de levaduras y de mamíferos incluyen preferentemente una secuencia señalizadora que permite la secreción extracelular de los polipéptidos traducidos por células hospedadoras de levadura o de mamífero.
"Sistema de expresión microbiano recombinante" se refiere a un monocultivo sustancialmente homogéneo de microorganismos hospedadores adecuados, por ejemplo, bacterias tales como E. coli o levaduras tales como S. cerevisiae, que han integrado de forma estable una unidad transcripcional recombinante en el ADN cromosómico o que portan la unidad transcripcional recombinante como un componente de un plásmido residual. En general, las células hospedadoras que constituyen un sistema de expresión microbiano recombinante son la progenie de una única célula transformada ancestral. Los sistemas de expresión microbianos recombinantes expresarán polipéptidos heterólogos tras la inducción de los elementos reguladores unidos a una secuencia estructural de nucleótidos que va a ser expresada.
Como se utiliza en el presente documento, los encabezados de sección tienen fines únicamente organizativos y no deben considerarse como limitantes en modo alguno de la materia objeto descrita. Cuando las definiciones de términos en referencias incorporadas parecen diferir de las definiciones proporcionadas en las presentes enseñanzas, prevalecerá la definición proporcionada en las presentes enseñanzas. Se apreciará que hay un "aproximadamente" implícito antes de las temperaturas, concentraciones, tiempos, etc., considerados en las presentes enseñanzas, de forma que hay unas desviaciones leves e insustanciales dentro del alcance de las presentes enseñanzas del presente documento.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos (que incluyen ejemplos con fines de base) se presentan con fines ilustrativos y no deben considerarse como limitaciones.
EJEMPLO 1 - Método para evaluar la actividad inhibidora del péptido antagonista de vc
La capacidad de cualquier péptido derivado personalizado preparado de acuerdo con las presentes realizaciones para inhibir la acción de un miembro de la familia de citocinas yc se determina mediante ensayos con células de mamífero para medir su respuesta proliferativa frente al miembro de la familia de citocinas yc.
Para cada una de las seis citocinas yc, estirpes celulares indicadoras: CTLL-2, una estirpe de linfocitos T CD8 murinos disponible en la American Type Culture Collection, y PT-18, una estirpe celular de mastocitos murinos y su subclon PT-18p, se transfectaron con el gen de la IL-2Rp humana para hacer que las células respondieran a la lL-2 y la IL-15 (Tagaya et al., 1996, EMBO J. 15: 4928-39), y se usaron para determinar cuantitativamente la actividad promotora del crecimiento de la citocina yc (véase Current protocols in Immunology, de Wiley and Sons, para una referencia metodológica). Las células indicadoras muestran una respuesta semilineal dependiente de la dosis cuando se mide mediante un ensayo colorimétrico WST-1 a lo largo de un intervalo de concentraciones (véase Clontech PT3946-1 y el manual de usuario asociado, incorporado como referencia en el presente documento, para una descripción detallada de los reactivos y métodos).
Una vez determinadas las dosis apropiadas de la citocina que producen el 50 % y el 95 % de la respuesta máxima de la estirpe celular indicadora, a cada pocillo que contiene la citocina y las células indicadoras se añaden varias concentraciones (que varían de 1 pM a 10 j M) del péptido derivado personalizado purificado o sintetizado. La reducción de la absorbancia de la luz a 450 nm se usa como un indicador de inhibición de la proliferación celular estimulada por la citocina. Normalmente, las células son estimuladas por las citocinas, de forma que la absorbancia del pocillo que contiene la estirpe celular indicadora y la citocina está entre 2,0 y 3,0, que se reduce a un intervalo de 0,1 a 0,5 por la adición de péptidos inhibidores.
EJEMPLO 2 - El péptido BNZ-v inhibe específicamente las actividades promotoras del crecimiento de la IL-9 y la IL-15
Usando células PT-18p como se ha descrito anteriormente, se determinó la capacidad del péptido BNZ-y para inhibir específicamente la actividad promotora del crecimiento de citocinas yc seleccionadas (figura 3A). La IL-3, una citocina no yc que apoya el crecimiento de células PT-18p, se usó como control negativo. En resumen, las células PT-18p se incubaron con dos diluciones diferentes del péptido BNZ-y producido por las células HEK293T (dilución de 1:20 o de 1:50 del sobrenadante original de las células HEK293T transfectadas con una construcción de expresión de BNZ-y) o sin péptido BNZ-y en presencia de IL-3, IL-9, IL-15 o IL-4 (1 nM de cada citocina en el cultivo).
Las respuestas de crecimiento de las células se determinaron 2 días después de la introducción del péptido BNZ-y y la citocina mediante el ensayo WST-1. La actividad promotora del crecimiento de la IL-3 (una citocina no yc) no fue inhibida por el BNZ-y. Por el contrario, la actividad de la IL-15 y de la IL-9 se redujo significativamente (p<0,01 prueba de la t de Student) mediante el péptido BNZ-y. La proliferación celular estimulada por la IL-4, otra citocina yc, no se vio afectada por la adición del péptido BNZ-y. Los resultados para las IL-3, IL-9, IL-15 e IL-4 se muestran en la figura 3A.
En un ensayo similar, se usó la estirpe celular murina CTTL2. En este ensayo, las células se cultivaron con 0,5 nM de IL-2 recombinante en suero bovino fetal RPMI al 10 %. Para configurar el ensayo de proliferación, las células se lavaron de las citocinas 3 veces. Las células se sembraron a 1 x 10(5) células por pocillo de una placa de 96 pocillos con una concentración final de 50 pM de IL-2 o IL-15. A cada pocillo se añadieron varias concentraciones del péptido BNZ-y (0,1, 1 y 10 ug/ml). Las células se cultivaron durante 20 horas, y en las últimas 4 horas se añadió 3H-timidina a las placas. Las células se recogieron usando un lector de placas. Los datos se muestran en la figura 3B.
EJEMPLO 3 - Método para medir la actividad inhibidora de la citocina yc mediante el análisis de la incorporación de 3H-timid¡na como marcador de la proliferación celular
La inhibición de la proliferación inducida por la citocina yc de una población de células indicadoras por péptidos derivados personalizados antagonistas se mide mediante el ensayo de incorporación de 3H-timidina. En resumen, se añade la timidina radiomarcada (1 microCi) a 20-50.000 células en proliferación en presencia de citocinas. La radioactividad incorporada en la célula se mide atrapando la radioactividad ligada a la célula en un filtro de fibra de vidrio usando una recolectora convencional (por ejemplo, Filtermate Universa1Harvester de Perkin-Elmer), tras lo cual, la radioactividad se mide con un contador b (por ejemplo, contador de centelleo de microplacas Trilux 1450).
EJEMPLO 4 - Método para medir la actividad inhibidora de la citocina yc mediante el análisis de la incorporación de un colorante de seguimiento celular como marcador de proliferación celular
Las células indicadoras se incuban en presencia de una citocina yc seleccionada o en presencia de una citocina yc seleccionada y un péptido derivado personalizado seleccionado. La población celular se marca entonces in vitro usando un colorante de seguimiento celular, por ejemplo, CMFDA, C2925 de Invitrogen, y se monitoriza la desintegración de la fluorescencia verde celular en cada división celular usando un citómetro de flujo (por ejemplo, Beckton-Dickinson FACScalibur). Normalmente, en respuesta a la estimulación de la citocina yc, aparecerán 7~10 picos diferentes correspondientes al número de divisiones que han experimentado las células en el canal de fluorescencia verde. La incubación de las células con la citocina yc seleccionada y el péptido derivado personalizado antagonista reduce el número de picos a solo de 1 a 3, dependiendo del grado de la inhibición.
EJEMPLO 5 - Inhibición de la señalización intracelular por parte del BNZ-v y sus antagonistas derivados
Además de estimular la proliferación celular, la unión de las citocinas yc a sus receptores causa diversos eventos intracelulares. (Rochman et al. 2009 Nat. Rev. Immunol. 9: 480-90, Pesu et al. 2005 Immunol. Rev. 203: 127-142.) Inmediatamente después de que la citocina se una a su receptor, una tirosina cinasa denominada Jak3 (janocinasa 3) es reclutada al receptor de la membrana plasmática. Esta cinasa fosforila los restos de tirosina de múltiples proteínas, incluyendo la subunidad yc, la STAT5 (transductor de señales y activador de la transcripción 5) y subunidades de la cinasa PI3 (fosfatidilinositol 3). Entre éstas, la fosforilación de la STAT5 se ha implicado en muchos estudios como vinculada a la proliferación de células iniciada por la citocina yc. (Revisado en Hennighausen y Robinson, 2008 Genes Dev. 22: 711-21). De acuerdo con estos datos publicados, se estudió si el péptido BNZ-y inhibe o no la fosforilación de la tirosina de la molécula STAT5 en las células PT-18p estimuladas por la IL-15 (los resultados se muestran en la figura 3C).
Las células PT-18p fueron estimuladas por la IL-15 en presencia o ausencia del péptido BNZ-y. Las proteínas citoplasmáticas se extrajeron de las células según un método convencional descrito en Tagaya et al. 1996 EMBO J.
15: 4928-39. Las proteínas citoplasmáticas extraídas se resolvieron mediante una SDS-PAGE convencional (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico), y el estado de la fosforilación se confirmó con un anticuerpo anti-fosfo-STAT5 (Cell Signaling Technology, n.° de catálogo 9354, Danvers MA) usando una inmunotransferencia (véase la figura 3C, panel superior). Para confirmar que cada carril representaba una carga de proteína total similar, la membrana se extrajo después y se sondeó de nuevo con un anticuerpo anti-STAT5 (Cell Signaling Technology, n.° de catálogo 9358) (véase la figura 3C, panel inferior).
Estos resultados demostraron que la fosforilación de la tirosina de la STAT5, un marcador de la transducción de señales, fue inducida por la IL-15 en las células PT-18p, y la fosforilación de la tirosina de la STAT5 fue notablemente reducida por el péptido BNZ-y.
EJEMPLO 6 - Diseño racional para péptidos antagonistas derivados del BNZ-v
Los péptidos derivados se preparan tomando como base la secuencia central D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q (SEQ iD NO: 2) (donde X representa cualquier aminoácido) sustituyendo los aminoácidos definidos de la secuencia central por aminoácidos con unas propiedades fisicoquímicas idénticas, como se indica en la figura 2.
Como alternativa, los péptidos personalizados o sus péptidos derivados pueden prepararse tomando como base la alineación de secuencia de las regiones de la hélice D de diferentes miembros de la familia de citocinas yc. Por ejemplo, como se muestra en la figura 5, se pueden combinar una o más secuencias conservadas en los miembros de la familia de citocinas yc (SEQ ID NO: 4 - Se Q ID NO: 9) para formar un péptido, tal como el SEQ ID NO: 3.
EJEMPLO 7 - Método de identificación de la especificidad inhibidora de los péptidos derivados personalizados antagonistas
La especificidad inhibidora de las citocinas yc de los péptidos derivados personalizados antagonistas se determina mediante el ensayo de la capacidad de un péptido derivado personalizado para inhibir la respuesta proliferativa de una estirpe celular sensible a las citocinas frente a cada una de las 6 citocinas yc. Por ejemplo, una estirpe celular de ratón, CTLL-2, se usa para determinar si un péptido candidato inhibe la función de la IL-2 y la IL-15. Se usan células PT-18^) para determinar si un péptido candidato inhibe la función de la IL-4 y la IL-9. Se usan células PT-18 (7a) para determinar si un péptido candidato inhibe la función de la IL-7, y se usan las células PT-18(21a) para determinar si un péptido candidato inhibe la función de la IL-21. PT-18(p) representa un subclon de las células PT-18 que expresa exógenamente la IL-2Rp humana por transfección génica (Véase Tagaya et al. 1996), PT-18(7a) representa un subclon que expresa la IL-7Ra humana por transfección génica, y las células PT-18(21Ra) expresan la IL-21Ra humana.
Otra alternativa es usar otras estirpes celulares que respondan a varias citocinas. Un ejemplo de esta estirpe celular es una estirpe celular NK humana, la NK92, que está disponible comercialmente en la ATCC (n.° de catálogo CRL-2407). Esta estirpe celular es una estirpe celular dependiente de la IL-2 que responde a otras citocinas, incluyendo las IL-9, IL-7, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21 (Gong et al. 1994 Leukemia 8: 652-658, Kingemann et al., 1996, Biol Blood Marrow Transplant 2: 68; 75, Hodge DL et al., 2002 J. Immunol. 168: 9090-8)
EJEMPLO 8 - Preparación de péptidos antagonistas de yc
Los péptidos antagonistas de yc derivados personalizados se sintetizan químicamente mediante procesos manuales y automatizados.
Síntesis manual: se emplea la síntesis en fase líquida clásica, que implica el acoplamiento del grupo carboxilo o carboxiterminal de un aminoácido al grupo amino o aminoterminal de otro. Como alternativa, se utiliza una síntesis peptídica en fase sólida (SPPS).
Síntesis automatizada: muchas empresas comerciales proporcionan síntesis de péptidos automatizada a un costo. Estas empresas usan varios sintetizadores peptídicos comerciales, incluyendo los sintetizadores proporcionados por Applied Biosystems (ABI). Los péptidos antagonistas de yc derivados personalizados se sintetizan mediante sintetizadores peptídicos automatizados.
EJEMPLO 9 - Producción biológica de péptidos antagonistas de vc derivados personalizados mediante tecnología recombinante
Los péptidos antagonistas de yc derivados personalizados se sintetizan biológicamente como un propéptido que consiste en un péptido de marcado apropiado, un péptido señal o un péptido derivado de una proteína humana conocida que mejora o estabiliza la estructura del péptido BNZ-y, o un péptido que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 3 o un derivado del mismo, y mejora sus actividades biológicas. Si se desea, se diseñará una secuencia de escisión enzimática apropiada para el aminoterminal del péptido con el fin de eliminar la etiqueta o cualquier parte del péptido de la proteína final.
Se inserta una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido derivado personalizado con un codón de parada en el extremo 3' en un vector comercial con una porción de etiqueta derivada de la tiorredoxina de E. coli y una secuencia peptídica especial que es reconocida y digerida por una enzima proteolítica apropiada (por ejemplo, enterocinasa) interpuesta entre la porción de la etiqueta y la secuencia del nucleótido que codifica el péptido derivado personalizado y el codón de parada. Un ejemplo de un vector adecuado es el plásmido pThioHis disponible en Invitrogen, CA. Se pueden usar otros vectores de expresión.
EJEMPLO 10 - Conjugación de péptidos personalizados y derivados con proteínas portadoras para fines de inmunización, y generación de anticuerpos contra los péptidos personalizados
El BNZ-y y otros péptidos derivados personalizados, tales como un péptido que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 3 o un derivado del mismo, se usan para inmunizar animales para obtener anticuerpos policlonales y monoclonales. Los péptidos se conjugan con el amino o carboxiterminal de proteínas portadoras adecuadas (por ejemplo, seroalbúmina bovina, hemocianina de lapa californiana (KLH), etc.) por métodos convencionales usando glutaraldehído o éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida. Los péptidos conjugados, junto con un adyuvante apropiado, se usan entonces para inmunizar animales tales como conejos, roedores o burros. La especificidad de los anticuerpos resultantes se estudia mediante métodos convencionales. Si los anticuerpos resultantes reaccionan con el péptido inmunógeno, se ensaya después su capacidad de inhibir la actividad individual de las citocinas yc de acuerdo con los ensayos de proliferación celular descritos en los ejemplos 1-3. Debido a la naturaleza compuesta de los péptidos derivados, es posible generar un único anticuerpo que reconozca dos citocinas diferentes simultáneamente, debido a la naturaleza compuesta de estos péptidos.
EJEMPLO 11 - Método para la producción a gran escala de péptidos antagonistas de vc derivados personalizados
Las proteínas recombinantes se producen a gran escala mediante el uso de un sistema acelular, como se describe en otra parte. (Véase Takai et al., 2010 Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (3): 272-8). En resumen, los ADNc que codifican el péptido antagonista de yc y una etiqueta se subclonan en un vector apropiado (véase Takai et al., 2010 Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (3): 272-8), que se somete a una transcripción in vitro, seguida inmediatamente de una traducción in vitro para producir el péptido marcado. A continuación, el propolipéptido se purifica usando un anticuerpo inmovilizado que reconoce el epítopo marcado, se trata con la enzima proteolítica, y se analiza la pureza del eluido (que contiene principalmente el péptido derivado personalizado de interés) mediante una tinción convencional de Tricina-SDS-PAGE (Invitrogen) al 18 % y la comassie convencional. Si no se cumple la pureza deseada del péptido (>98 %), la mezcla se somete a una HPLC convencional (cromatografía de líquidos de gran rendimiento) para una purificación adicional.
EJEMPLO 12 - Uso de péptidos antagonistas de vc derivados personalizados para bloquear la función de citocinas en HAM/TSP
La mielopatía asociada al HTLV-1 (HAM)/paraparesia espástica tropical (TSP) es una mielopatía progresiva crónica que se observa en algunas personas infectadas por el virus linfótropo T humano de tipo I (HTLV-I). La infiltración de linfocitos en la médula espinal está asociada con la respuesta inmunitaria a1HTLV-I, y da como resultado la liberación de ciertas citocinas. Algunas de estas citocinas también pueden dañar los nervios.
Los pacientes con HAM/TSP muestran un estado elevado del sistema inmunitario que es similar al observado en las enfermedades autoinmunitarias (Oh et al. 2008 Neurol Clin. 26: 781-785). Este estado elevado se demuestra por la capacidad de los linfocitos T de los pacientes con HAM/TSP de experimentar una proliferación espontánea en un cultivo ex vivo durante aproximadamente una semana en ausencia de citocinas añadidas exógenamente. La proliferación espontánea de los linfocitos T de los pacientes con HAM/TSP se atribuye, al menos parcialmente, a bucles autocrinos/paracrinos de IL-2, IL-9 e IL-15. Se ha demostrado que la adición de anticuerpos bloqueantes contra los receptores de la IL-2 o de la IL-15 puede inhibir la proliferación espontánea de linfocitos T en un sistema de cultivo ex vivo de HAM/TSP.
Estas observaciones, junto con otros datos derivados de estudios ex vivo, han proporcionado el fundamento para tomar dos anticuerpos monoclonales (un anti-receptor alfa de la IL-2 o anti-Tac y un anti-cadena beta del receptor de la IL-15) en la clínica para el tratamiento de la Ha M/TSP (Azimi et al. 2001 Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 14559-64, Azimi et al., 1999 J. Immunol 163: 4064-72).
Los antagonistas de los receptores de anticitocinas de acuerdo con las realizaciones descritas en el presente documento no solo serían valiosos como un agente inmunomodulador terapéutico para el tratamiento de la hAm /TSP, sino que la modulación de la respuesta inmunitaria en la HAM/TSP por parte de los antagonistas de los receptores anticitocinas de acuerdo con las presentes realizaciones actúa como primeros indicios de eficacia para el uso de los antagonistas de los receptores anticitocinas de acuerdo con las presentes realizaciones en el tratamiento de otras enfermedades autoinmunitarias.
Para demostrar la eficacia de los péptidos antagonistas de yc derivados personalizados de acuerdo con las realizaciones descritas en el presente documento, ensayamos la capacidad del péptido BNZ-y para bloquear la respuesta inmunitaria al HTLV-I en un ensayo de proliferación espontánea de linfocitos T mediante un sistema de cultivo ex vivo de HAM/TSP. Se realizaron ensayos de proliferación en muestras de sangre de pacientes con HAM/TSP con y sin la adición del BNZ-y. Estos ensayos evaluaron la capacidad del BNZ-y para bloquear la función de las citocinas, tales como la IL-2 y la IL-15, presentes en el hemocultivo ex vivo del paciente con HAM/TSP, y para prevenir la proliferación espontánea de linfocitos T en estas muestras.
En un ensayo ex vivo de proliferación espontánea de linfocitos T, se cultivaron las PBMC de un paciente con HAM/TSP a 1 x 10(6) células por pocillo de una placa de 96 pocillos en RFMI-10 % de FCS. Se añadieron concentraciones crecientes del péptido BNZ-y a cada pocillo. Como control, se usó un péptido irrelevante de una forma similar. Las células se incubaron en una estufa de incubación de CO2 a 37 °C durante 3, 4 y 6 días. A las células se añadió la cantidad de 1 uCi de 3H-timidina. Después de unas 6 horas adicionales de incubación, las células se recogieron y se midió su tasa de proliferación. Los datos de un paciente representativo con HAM/TSP se muestran en la figura 4a -figura 4D. Como se indica en la figura 4A - figura 4D, el péptido BNZ-y inhibe la proliferación espontánea de linfocitos T en el cultivo de HAM/TSP a una concentración de aproximadamente 1 ug/ml.
En este ensayo se midieron además otros marcadores inmunológicos. El porcentaje de linfocitos CD8 específicos víricos se midió durante el cultivo ex vivo usando tetrámeros de proteínas víricas. La población de linfocitos CD25+CD4+, un marcador de activación de los linfocitos T, así como la tinción Ki67, un marcador de proliferación de los linfocitos T, se monitorizó en un ensayo de citometría de flujo.
Se pueden usar otras formas del derivado del péptido BNZ-y conjugado o un péptido personalizado que comprenda la secuencia del SEQ ID NO: 3, y un derivado del mismo, en un futuro ensayo similar. Éstas incluyen albúmina, ASB, PEG que puede ser conjugado con el péptido después de la síntesis química. Otras formas biológicas de péptidos personalizados, tales como el conjugado del péptido BNZ-y o un péptido personalizado que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 3, y un derivado del mismo, pueden incluir regiones de entidades proteicas conocidas (incluyendo, pero no se limitan a, la región FC de la IgG humana) que se fusionan con los péptidos personalizados.
EJEMPLO 13 - Método de tratamiento de la leucemia de linfocitos T del adulto (ATL) en un paciente humano mediante la administración de un péptido antagonista de yc derivado personalizado
Se identifica un paciente humano que padece leucemia de linfocitos T del adulto. Una dosis eficaz, según lo determine el médico, del péptido antagonista de yc derivado personalizado, por ejemplo, BNZ-y, un péptido personalizado que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 3, o un derivado del mismo, se administra al paciente durante un período de tiempo determinado por el médico. Se determina que el tratamiento es eficaz si el paciente entra en remisión.
EJEMPLO 14 - Método de tratamiento de la HAM/TSP en un paciente humano mediante la administración de un péptido antagonista de yc derivado personalizado
Se identifica un paciente humano que padece HAM/TSP. Una dosis eficaz, según lo determine el médico, del péptido antagonista de yc derivado personalizado, por ejemplo, BNZ-y, un péptido personalizado que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 3, o un derivado del mismo, se administra al paciente durante un período de tiempo determinado por el médico. Se determina que el tratamiento es eficaz si los síntomas del paciente mejoran o si la progresión de la enfermedad se ha detenido o ralentizado.
EJEMPLO 15 - Uso de péptidos antagonistas de vc derivados personalizados para bloquear la función de citocinas Se identifica un paciente humano que sufre y necesita reducir la función de al menos la IL-15 y la IL-21. Una dosis eficaz, según lo determine el médico, del péptido antagonista de yc derivado personalizado, por ejemplo, un péptido compuesto que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 3, o un derivado del mismo, se administra al paciente durante un período de tiempo determinado por el médico. Se determina que el tratamiento es eficaz si los síntomas del paciente mejoran o si la progresión de la enfermedad se ha detenido o ralentizado.
EJEMPLO 16 - Método de tratamiento de la enfermedad celíaca en un paciente humano mediante la administración de un péptido antagonista de vc derivado personalizado
Se identifica un paciente humano que padece enfermedad celíaca. Una dosis eficaz, según lo determine el médico, del péptido antagonista de yc derivado personalizado, por ejemplo, un péptido compuesto que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 3, o un derivado del mismo, se administra al paciente durante un período de tiempo determinado por el médico. Se determina que el tratamiento es eficaz si los síntomas del paciente mejoran o si la progresión de la enfermedad se ha detenido o ralentizado.
Referencias
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido compuesto que comprende las secuencias de aminoácidos de al menos dos regiones en hélice D de la proteína gamma-c de la interleucina (IL), en donde el péptido compuesto comprende la secuencia de aminoácidos P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S (SEQ ID NO: 3) o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 3,
y en donde el péptido compuesto inhibe selectivamente la función de la IL-21 y una o más de las IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15.
2. Una composición farmacéutica que comprende:
una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado peptídico; y
un vehículo, un diluyente, un excipiente o una combinación farmacéuticamente aceptables de los mismos; en donde el conjugado peptídico inhibe la función de la IL-21 y una o más citocinas yc seleccionadas del grupo que consiste en las IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15;
en donde el conjugado peptídico comprende la secuencia de aminoácidos P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S (SEQ ID NO: 3) o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 3.
3. El péptido compuesto o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende además un péptido señal.
4. El péptido compuesto o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el péptido compuesto o el conjugado peptídico se conjugan adicionalmente con una o más fracciones adicionales en el extremo aminoterminal, el extremo carboxiterminal o un resto lateral del péptido compuesto, opcionalmente en donde la una o más fracciones adicionales se seleccionan del grupo que consiste en seroalbúmina bovina (SAB), albúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH), la región FC de la IgG, una proteína biológica que funciona como armazón, un anticuerpo contra un antígeno específico celular, un receptor, un ligando, un ion metálico y polietilenglicol (PEG).
5. El péptido compuesto o la composición farmacéutica de una cualquiera de reivindicaciones 1-4, en donde el péptido compuesto o el conjugado peptídico consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 3.
6. El péptido compuesto o la composición farmacéutica de una cualquiera de reivindicaciones 1-5, en donde el péptido compuesto o el conjugado peptídico comprende el SEQ ID NO: 3.
7. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, que comprende además una proteína que estabiliza la estructura del conjugado peptídico y mejora su actividad biológica, en donde la proteína es selecciona del grupo que consiste en seroalbúmina bovina (SAB), albúmina, la región Fc de la inmunoglobulina G (IgG), proteínas biológicas que funcionan como armazón, polietilenglicol (PEG) y los derivados de los mismos.
8. El péptido compuesto y/o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para usar en un método de tratamiento de una enfermedad mediada por citocinas yc seleccionada del grupo que consiste en leucemia de CD4, leucemia de CD8, leucemia de LGL, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, granulomatosis de Wegener, enfermedad celíaca, tiroiditis de Hashimoto, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, diabetes sacarina, psoriasis, esclerosis múltiple, uveítis, inflamación del ojo, miastenia grave y enfermedad del injerto contra el hospedador (EICH).
9. El péptido compuesto y/o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para usar en un método de tratamiento de una mielopatía asociada al HTLV-1 (HAM)/enfermedad asociada a la paraparesia espástica tropical (TSP), en donde la enfermedad asociada a la HAM/TSP se selecciona del grupo que consiste en leucemia de linfocitos T del adulto (ATL), mielopatía asociada al HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) y otras enfermedades inflamatorias no neoplásicas asociadas al HTLV tales como uveítis (HU), artropatía, neumopatía, dermatitis, exocrinopatía y miositis.
10. El péptido compuesto y/o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para usar en un método de tratamiento de una enfermedad respiratoria inflamatoria, en donde la enfermedad respiratoria inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en asma, sinusitis, rinoconjuntivitis alérgica, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), rinitis alérgica, otitis aguda y crónica, y fibrosis pulmonar.
11. Un método no terapéutico para tratar una afección cosmética, comprendiendo el método la administración de un péptido compuesto y/o de una composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 a un sujeto que lo necesite, en donde la afección cosmética se selecciona del grupo que consiste en acné, alopecia, eritema solar, cuidado de las uñas y aparición de envejecimiento.
12. El péptido compuesto y/o la composición farmacéutica para usar en el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en donde el péptido compuesto bloquea la señalización por parte de dos o más miembros de la familia de las citocinas yc o inhibe la unión de las citocinas yc a una subunidad yc; comprendiendo el método poner en contacto una célula con el péptido compuesto de las reivindicaciones y/o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
13. Un kit para tratar una afección en un paciente, en donde la afección es una enfermedad mediada por citocinas yc, una enfermedad asociada a la mielopatía asociada al HTLV-1 (HAM)/paraparesia espástica tropical (TSP, una enfermedad respiratoria inflamatoria, una afección cosmética o una combinación de las mismas, comprendiendo el kit una composición farmacéutica de las reivindicaciones 2-7, en donde la composición farmacéutica comprende:
una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado peptídico; y
un vehículo, un diluyente, un excipiente o una combinación farmacéuticamente aceptable de los mismos; en donde el conjugado peptídico inhibe la función de la IL-21 y de una o más citocinas yc seleccionadas del grupo que consiste en las IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15;
en donde el conjugado peptídico comprende la secuencia de aminoácidos P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S (SEQ ID NO: 3) o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 3.
14. El kit de la reivindicación 13, en donde el conjugado peptídico comprende una secuencia peptídica que comparte al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3.
15. El kit de la reivindicación 13, en donde el conjugado peptídico comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3.
16. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde la afección es una o más de leucemia de CD4, leucemia de CD8, leucemia de LGL, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, granulomatosis de Wegener, enfermedad celíaca, tiroiditis de Hashimoto, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, diabetes sacarina, psoriasis, esclerosis múltiple, uveítis, inflamación del ojo, miastenia grave, enfermedad del injerto contra el hospedador (EICH), leucemia de linfocitos T del adulto (ATL), mielopatía asociada al HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) y otras enfermedades inflamatorias no neoplásicas asociadas al HTLV tales como uveítis (HU), artropatía, neumopatía, dermatitis, exocrinopatía, miositis, asma, sinusitis, rinoconjuntivitis alérgica, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), rinitis alérgica, otitis aguda y crónica, y fibrosis pulmonar, acné, alopecia, eritema solar, cuidado de las uñas o aparición de envejecimiento.
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