ES2885226T3

ES2885226T3 - Método para la medición directa de interacciones moleculares mediante detección de la luz reflejada a partir de materiales dieléctricos funcionalizados multicapa

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Publication number: ES2885226T3
Application number: ES10784438T
Authority: ES
Inventors: Fabio Giavazzi; Matteo Salina
Original assignee: PROXENTIA Srl
Current assignee: PROXENTIA Srl
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2021-12-13
Anticipated expiration: 2030-10-29
Also published as: JP2013509569A; IT1396382B1; WO2011050968A1; EP2494358A1; US8932880B2; US20120244554A1; EP2494358B1; ITMI20091893A1

Abstract

Método para detectar y/o cuantificar la unión de ligando-receptor entre un ligando en disolución y un receptor para dicho ligando inmovilizado sobre una superficie sólida, que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar un sustrato de un material amorfo o cristalino sólido con una superficie plana lisa que forma dicha superficie sólida; b) recubrir dicha superficie sólida con una o más capas dieléctricas de grosor de entre 50 nm y 500 nm, e índice de refracción seleccionado de modo que la reflectividad de dicha superficie recubierta, cuando está en contacto con una disolución acuosa, es menor del 0,01%; c) inmovilizar moléculas de receptor sobre dicha superficie sólida; d) poner en contacto dicha superficie sólida que porta receptores inmovilizados con una disolución que contiene moléculas de ligandos; e) iluminar dicha superficie con luz de una fuente de luz; f) usar un detector que mide la intensidad de la luz reflejada a partir de la superficie de contacto entre la disolución y dicha superficie sólida que porta receptores inmovilizados en función del tiempo, y convertir los valores de la intensidad de la luz reflejada en valores de masa por unidad de superficie de moléculas de ligando unidas a los receptores utilizando las fórmulas de Fresnel para la reflexión de capa fina.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la medición directa de interacciones moleculares mediante detección de la luz reflejada a partir de materiales dieléctricos funcionalizados multicapa

Sumario

En el presente documento se proporciona un método para la determinación cuantitativa de interacciones moleculares entre ligandos en disolución y receptores inmovilizados en la superficie de un material transparente sólido recubierto por una o más capas dieléctricas antirreflectantes, con grosores e índices de refracción tales como para reducir la reflectividad óptica de la superficie, a través de la medición directa de la luz reflejada por la superficie de contacto entre dicha superficie y dicha disolución, sin la necesidad de restos de marcaje. La invención proporciona también un dispositivo para la implementación del método.

Técnica anterior

En la técnica conocida se han propuesto varios métodos para la determinación de interacciones entre ligandos y receptores, es decir, las afinidades de unión y la cinética de sistemas de ligando-receptor reversibles de interés químico, bioquímico o biológico. Se notifica una lista de los principales en “Biosensors and BioDetection”, John M. Walquer, Humana Press, 2009. Los métodos conocidos incluyen habitualmente la inmovilización del receptor sobre una superficie plana adecuada y la medición directa o indirecta de la variación de alguna de las propiedades de la superficie, propiedades ópticas por ejemplo, después de que la disolución que contiene los ligandos se haya puesto en contacto con la superficie. Dichas variaciones se inducen mediante la formación de complejos de ligandoreceptor.

Una clase de métodos requiere el marcaje del ligando en disolución, es decir, la modificación covalente del ligando con especies fluorescentes, luminiscentes o radiactivas (véase, por ejemplo, la solicitud de patente US 2004/0014060 A1). No obstante, debe observarse que la modificación del ligando normalmente es una operación larga y compleja y puede representar un factor limitante, por ejemplo en ensayos de cribado, donde se usa una variedad de ligandos notable. Otra desventaja del marcaje es que la interacción ligando-receptor puede verse influida por la modificación química del ligando.

Otra clase de métodos que imitan más eficazmente las interacciones receptor-ligando (tales como las que se producen en la superficie de una membrana celular) se aprovecha de los cambios en las propiedades físicas inducidos por la formación de una unión de receptor-ligando en la superficie, sin modificar el ligando con sustancias de marcaje. Esta clase de métodos se denomina generalmente “sin marcador”. Un ejemplo de estos métodos lo proporciona el biosensor BIAcore, comercializado por GE Healthcare (Uppsala, Suecia), descrito por ejemplo en la patente USP 5.313.264 y USP 5.374.563. En este biosensor, basándose en el principio de resonancia de plasmón superficial (Surface Plasmon Resonance, SPR) (véase el artículo de Jiri Homola, Sinclair S. Yee, Gunter Gauglitz, “Surface plasmon resonance sensors: review”, Sensors and Actuators B, vol. 54 (1999), páginas 3-15), se acopla una onda evanescente óptica con el plasmón superficial en capas finas (50 nm) de materiales conductores tales como plata u oro, y genera un fenómeno de resonancia en ángulos específicos. Esto permite determinar el índice de refracción de la capa de material inmovilizado sobre el metal, tal como un par de ligandoreceptor, midiendo el ángulo de reflexión mínima. En un uso común, a partir de la variación del índice de refracción frente al tiempo, se obtienen las constantes de unión entre el ligando y el receptor.

Este método, aunque ampliamente usado en la práctica, es bastante complejo y caro y no siempre preciso en la determinación de la constante de unión. Véase, por ejemplo, la publicación “Use of surface plasmon resonance to probe the equilibrium and dynamic interactions Between Aspects of biological macromolecules”, Peter Schuck, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1997, 26, págs. 541-66. Los problemas asociados con el uso del método de BIAcore para la determinación de constantes de unión dependen en gran medida de la complejidad del método, porque la señal medida depende de las propiedades físicas de cinco materiales a través de una compleja dependencia funcional que incluye parámetros no conocidos a priori. Los cinco materiales mencionados son: sustrato de vidrio o materiales similares, película conductora fina, capa de polímero biocompatible, receptor, moléculas que se adhieren por la interacción y disolución acuosa.

Dichos problemas producen:

1) el desacuerdo entre los valores de la constante de afinidad determinada a través de la cinética de unión y los obtenidos en el equilibrio termodinámico;

2) la imposibilidad de predecir la intensidad de la señal generada cuando se forman parejas de ligando/receptor en la superficie, puesto que la señal depende de parámetros que no se conocen previamente.

Otra familia de métodos sin marcador (denominados comúnmente espectroscopía de interferencia reflectométrica) se basa en la medida del desplazamiento espectral de la luz reflejada por un sustrato transparente tal como vidrio o cuarzo, que presenta una superficie recubierta con una capa fina (con un grosor comprendido entre una fracción de un micrómetro y unas pocas decenas de micrómetros) de material dieléctrico tal como dióxido de silicio o poliestireno. El sustrato puede adoptar la forma de una placa plana, como en el caso de los denominados biosensores basados en interferómetro de Fabry-Perot de microcubeta (véase, por ejemplo, la publicación de A. Brecht, J. Ingenhoff, G. Gauglitz, “Direct monitoring of antigen-antibody interactions by spectral interferometry”, Sensors and actuators B: Chemical, vol. 6, págs. 96-100 (1992)), o puede conformarse en forma de fibra, con un extremo plano y liso (véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente U.S. 5.804.453 y U.S. 7.319.525). Dicha superficie, sobre la que se inmovilizan mediante diversas técnicas moléculas con la función de receptor, se coloca en contacto con la disolución donde están presentes los analitos de interés. La superficie se ilumina con luz policromática y la luz reflejada se recoge y se envía a un espectrómetro. El grosor de la capa dieléctrica sirve para introducir una modulación en el espectro de la luz reflejada, con varios máximos y mínimos de interferencia. La posición de los máximos y mínimos de interferencia se determina exclusivamente por el grosor de la capa dieléctrica y su índice de refracción. La adhesión de moléculas de ligando en la superficie cambia el espectro de luz reflejada y, en particular, produce un desplazamiento en la posición de los máximos y mínimos de interferencia. Midiendo estos cambios en el espectro de luz reflejada, es posible determinar el grosor de la capa molecular en la superficie. Como ejemplo de instrumento basado en este principio, se cita el Octect comercializado por Fortebio (Menlo Park, CA 94025 EE. UU.).

Se comenta una variante del método descrito basado en la medida de los cambios del espectro de luz reflejada en la reciente publicación de E. Ozkumur, J. W. Needham, D. A. Bergstein, R. Gonzalez, M. Cabodi, J. M. Gershon, B. B. Goldberg, M. S. Unlu., “Label-free and dynamic detection of Biomolecular interactions for high-throughput microarray applications”, PNAS, vol. 105, págs. 7988-7992 (2008). En este caso, en la superficie del sensor, que consiste en una placa plana de silicio recubierta con una capa fina de dióxido de silicio, se inmovilizan diferentes receptores en diferentes regiones circulares y la medición de los cambios introducidos en el espectro de luz reflejada por la adhesión de moléculas de ligando en la superficie se produce de un modo resuelto espacialmente. La superficie se ilumina secuencialmente con una serie de haces de luz monocromática (a partir de un láser sintonizable), con longitudes de onda espaciadas uniformemente y, para cada condición de iluminación, una cámara digital registra una imagen de reflexión de la superficie. La secuencia de los valores de intensidad registrados por cada elemento (píxel) de la cámara permite la reconstrucción de una porción del espectro de luz reflejada a partir de la correspondiente región en la superficie del sensor. De este modo, pueden medirse por separado los cambios espectrales provocados por la adhesión de los ligandos para cada una de las regiones en las que está dividida la superficie.

Los métodos de esta familia, basados en la medida del espectro de luz reflejada, aunque se basan en principios físicos diferentes a los métodos basados en el principio de SPR, como este último, son bastante complejos y costosos de implementar, requiriendo el uso de un espectrómetro o una fuente de luz monocromática de longitud de onda variable (tal como un láser sintonizable). En las patentes estadounidenses 2008/006815 y 7.692.798, se describe un método de detección diferente basado en el uso de un sustrato formado por una capa de dióxido de silicio u oblea de silicio. En este método, la detección de la cantidad de moléculas de ligando que interaccionan con los receptores inmovilizados en la superficie se basa en la medida de la intensidad de la luz reflejada. Aunque este enfoque es en principio más simple que los métodos anteriores porque no requiere el uso de un espectrómetro, su uso está limitado por algunos problemas debido a la especificidad del silicio. Debido a su alto índice de refracción, la medida no tiene lugar en un entorno acuoso y la detección está limitada a un ángulo de reflexión muy estrecho, aumentando así la complejidad del instrumento y limitando su uso con muestras de fluido. Además, dado que el sustrato de silicio no es transparente a la luz visible, este método no es adecuado para combinarse con otros métodos que requieran sustratos transparentes.

Otra clase de métodos para la medida de las interacciones ligando-receptor se basa en el uso de nanopartículas suspendidas con superficie funcionalizada. Entre esta clase, se ha propuesto recientemente un método sin marcadores basado en el uso de nanopartículas en suspensión hechas de polímero perfluorado amorfo que tiene un índice de refracción próximo al del agua (documento EP1792183 y las publicaciones de Davide Prosperi, Carlo Morasso, Francesco Mantegazza, Marco Buscaglia, Loren Hough, Tommaso Bellini, “Phantom Nanoparticles as Probes of Biomolecular Interactions”, Small, vol. 2, págs. 1060-1067 (2006) y Davide Prosperi, Carlo Morasso, Paolo Tortora, Diego Monti y Tommaso Bellini, “Avidin Decorated Core-Shell Nanoparticles for Biorecognition Studies by Elastic Light Scattering”, ChemBioChem, vol. 8, tema 9, págs. 1021-1028 (2007)). En dicho método, la detección de la interacción entre ligandos en disolución y receptores inmovilizados en la superficie de las nanopartículas suspendidas se basa en el cambio de la intensidad de la luz dispersada en todas direcciones cuando tiene lugar la interacción. Dicho método supera algunas de las limitaciones de otros métodos sin marcadores, facilitando la medición en equilibrio termodinámico, que se alcanza en muy poco tiempo debido a la libre difusión de las nanopartículas en disolución. No obstante, dicho método no permite la medida de muchas interacciones comunes, en las que los ligandos son multivalentes, ya que, en este caso, la interacción con el receptor inmovilizado en la superficie de las nanopartículas puede inducir su agregación, afectando así a la medida de la intensidad de la luz dispersada y complicando la interpretación de la señal detectada en cuanto a interacción ligando-receptor.

Un método alternativo propuesto recientemente para la determinación de interacciones entre ligandos y receptores sin la necesidad de mareaje y que permite el uso de ligandos multivalentes se basa en la medición de la luz reflejada a partir de una superficie de contacto entre un fluido acuoso y un material sólido extendido hecho de perfluoropolímeros con un índice de refracción muy próximo al mismo (patente PCT/IB2007/000618). En este método, la cantidad de moléculas en disolución que se adhieren a la superficie de contacto, donde están inmovilizadas las moléculas con función de receptor, se deriva directamente del aumento de la intensidad de la luz que experimenta reflexión especular a partir de la superficie plana funcionalizada.

Aunque este método puede implementarse usando detectores y fuentes de luz de bajo coste (por ejemplo, LED y fotodiodo), las principales desventajas del método se deben al alto coste del polímero perfluorado usado como sustrato y la ausencia de un proceso conocido para la inmovilización del receptor por unión química a la superficie de ese material, caracterizada por una reactividad muy baja, como muchos compuestos fluorados.

Por tanto, se percibió la necesidad de disponer de un método simple para la determinación de interacciones entre ligandos y receptores aprovechando directamente las variaciones inducidas por la interacción ligando-receptor en una superficie, evitando las operaciones de marcaje del ligando, permitiendo la determinación de los valores de la constante de afinidad en condiciones de equilibrio termodinámico, evitando así los inconvenientes de los métodos indirectos, tales como, por ejemplo, BIAcore, y permitiendo el uso del método también en el estudio de ligandos multivalentes, ya que la mayoría de los ligandos de interés biológico y farmacológico tienen múltiples sitios de unión. En particular, se percibió la necesidad de un método de alta sensibilidad, cuya señal fuera detectable por medio de instrumentación sencilla de construir, y fuera cuantitativamente interpretable a través de parámetros previamente conocidos, superando de este modo los inconvenientes de la técnica anterior.

Descripción de la invención

La presente invención permite el logro de estos objetivos, evitando las desventajas mencionadas anteriormente que se encuentran con las técnicas conocidas, a través de un método óptico tal como se define en la reivindicación 1. El método permite la detección cuantitativa de un analito en disolución y su concentración mediante el procedimiento descrito a continuación.

Se sabe que la reflectividad asociada con la superficie de contacto entre dos medios diferentes puede reducirse en gran medida por la presencia, en la superficie de uno de los dos medios (sustrato), de una o más capas dieléctricas, cada una con un grosor de decenas o centenares de nanómetros, superpuestas entre sí. Estas capas forman un denominado recubrimiento antirreflectante.

Se encuentra ahora que, usando un sustrato recubierto por capas dieléctricas de manera que la reflectividad de la superficie sea menor del 0,01%, preferiblemente menor del 0,001%, cuando se pone en contacto con un medio acuoso, estando inmovilizadas en la superficie de dicho sustrato moléculas con la función de receptor, y un aparato para medir la intensidad de la luz reflejada desde la superficie de contacto entre la superficie multicapa y una disolución acuosa, cuando en la superficie de contacto se acumulan moléculas formando agregados o capas moleculares, es posible determinar la masa total de las moléculas unidas en la superficie de contacto con la disolución acuosa midiendo la intensidad de la luz reflejada.

Por tanto, un objeto de la presente invención es un método para determinar la presencia de un ligando en disolución, su cantidad, concentración, afinidad de unión, constantes cinéticas de asociación y/o disociación del propio ligando con su receptor, usando mediciones de intensidad de la luz reflejada, que comprende las siguientes etapas:

a) preparar un sustrato de un material amorfo o cristalino sólido con una superficie plana lisa cubierta por una o más capas dieléctricas de grosor comprendido entre 50 nm y 500 nm, de modo que la reflectividad de esa superficie, en contacto con una disolución acuosa, es menor del 0,01%;

b) inmovilizar las moléculas de receptor sobre dicha superficie;

c) poner en contacto dicha superficie recubierta por moléculas de receptor con la disolución que contiene el ligando;

d) medir la intensidad de la luz reflejada a partir de la superficie de contacto entre la disolución y la superficie recubierta por moléculas de receptor en función del tiempo, convirtiendo los valores de la intensidad de la luz reflejada en masa por área unitaria de moléculas de ligando que interaccionan con los receptores inmovilizados usando las fórmulas de Fresnel.

Preferiblemente, el sustrato de material sólido y dichas capas dieléctricas tienen un índice de refracción, respectivamente, de entre 1,4 y 1,7 y entre 1,35 y 1,65. Además, el sustrato está hecho preferiblemente de vidrio silíceo.

En una realización, el valor de la intensidad de la luz reflejada o el valor de la masa por área unitaria de moléculas de ligando que interaccionan con los receptores inmovilizados, tal como se mide en la etapa d), se convierten en la concentración o cantidad total de moléculas de ligando presentes en disolución.

En una implementación adicional, el valor de la intensidad de la luz reflejada o el valor de la masa por área unitaria de moléculas de ligando que interaccionan con los receptores inmovilizados, tal como se mide en la etapa d), se convierten en la constante de afinidad de la pareja de ligando-receptor.

En una implementación adicional, los valores de la intensidad de la luz reflejada en función del tiempo medidos en la etapa d) se convierten en las constantes cinéticas de asociación y/o disociación de la pareja de ligando-receptor. En una implementación adicional, la superficie de baja reflectividad obtenida a través de las etapas a) y b) está dividida en diferentes regiones, posiblemente dispuestas en una matriz. En diferentes regiones se adsorben o se inmovilizan diferentes receptores y la intensidad de la luz reflejada a partir de diferentes se mide simultáneamente a través de un sistema de obtención de imágenes.

En la superficie recubierta por receptores, pueden inmovilizarse otras moléculas (espaciadores) que no tienen la función del receptor. Además, la superficie de baja reflexión puede incluirse o bien en una celda para mediciones en ausencia de flujo, en una celda de flujo, o bien en una sonda de inmersión.

Según la presente invención, los receptores y ligandos se seleccionan de proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, glicoproteínas, hidratos de carbono, hormonas, lípidos, células o componentes celulares, virus o moléculas de interés farmacológico. Pueden inmovilizarse receptores en la superficie a través de:

unión química;

adsorción;

adsorción sobre moléculas o polímeros a su vez inmovilizados en la superficie;

radiación electromagnética;

tratamiento con plasma.

La disolución que contiene los ligandos y que se pone en contacto con la superficie del material puede ser una disolución acuosa o puede contener disolventes orgánicos, posiblemente mezclados con agua.

El ángulo de incidencia, la polarización, la divergencia angular y las propiedades espectrales de la luz incidente se seleccionan con el fin de optimizar la razón entre la señal de luz reflejada en presencia de interacción receptorligando y el ruido de fondo debido a dispersión y reflexión parásitas.

Además, la invención se refiere a un dispositivo para la implementación del método descrito en el presente documento, que se define en la reivindicación 15.

En una realización preferida, la fuente de luz del dispositivo es una fuente de luz LED y el detector es un detector CCD (dispositivo de carga acoplada) o CMOS (semiconductor de óxido de metal complementario).

Descripción detallada de la invención

A través del método de la invención, es posible la medición de la intensidad de la luz reflejada para determinar la masa total de las moléculas presentes en la superficie de contacto con la disolución, tal como se describe a continuación.

A partir de los valores de la intensidad de la luz reflejada, se obtienen los correspondientes valores de masa de moléculas con la función de ligando con las que se han recubierto las diferentes regiones de la superficie mediante la fórmula:

donde:

lo representa la intensidad de la luz incidente sobre la superficie de contacto

I ^b es la intensidad de la luz medida por el detector en ausencia de la superficie de contacto

R es el coeficiente de reflexión (es decir, la reflectividad) obtenido a partir de las fórmulas de Fresnel para medios dieléctricos estratificados, dependiendo de la cantidad de ligando en contacto en cualquier momento dado con los receptores inmovilizados en la superficie. Las fórmulas de Fresnel para medios dieléctricos estratificados pueden ser, por ejemplo, las notificadas en Max Born y Emil Wolf, Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido, 1999, páginas 59-70.

Como ejemplo, se considera el caso de un sustrato de índice de refracción no recubierto por una sola capa dieléctrica de índice de refracción ni, comprendido entre no y el índice de refracción m de la disolución en contacto con la capa dieléctrica. En esta condición, se sabe que la propia capa puede tener función antirreflectante, disminuyendo la reflectividad de la superficie de contacto sustrato-disolución. En el caso de iluminación con luz colimada, monocromática con longitud de onda 2, incidente sobre la superficie, la disminución de la reflectividad es más pronunciada a medida que el grosor h de la capa dieléctrica está próximo al valor 2/(4ni) y cuando más próxima esté la combinación non3/ni2 a 1. Por ejemplo, para los siguientes valores de parámetros:

2 = 632,8 nm (láser de He-Ne)

no = 1,587 ± 0005 (vidrio Schott N-SK5)

n i = 1,457 ± 0005 (SiO²amorfo)

n³ = 1,334 ± 0005 (disolución acuosa diluida)

h = 109 ± 1 nm (próximo a 24ni)

el coeficiente de reflexión Ro de la superficie de contacto en ausencia de ligandos y receptores, es decir, cuando hay solo la capa dieléctrica de SiO²fina entre el sustrato y la disolución, es menor de 5^10-6, en este caso Ro está notablemente disminuido en comparación con el caso donde no está presente la capa dieléctrica. De hecho, en esta última, el coeficiente de reflexión de la superficie de contacto sustrato-disolución es de aproximadamente 8^10-3.

Suponiendo que el grosor de la capa molecular de receptores adsorbidos o inmovilizados y ligandos de interacción es menor de 10 nanómetros y los índices de refracción de las moléculas de receptor y ligando son iguales, y tienen el valor n², el coeficiente de reflexión R de la superficie puede expresarse usando la siguiente fórmula aproximada, con un error menor del 1% a partir de la expresión exacta:

Donde:

Ro, 2, n² y n3 son tal como se definieron anteriormente,

Ri es el coeficiente de reflexión (o reflectividad) de la superficie de contacto medido siguiendo el procedimiento de inmovilización del receptor (una fase),

M y p son la masa y densidad del ligando,

A es el área de superficie del material sólido sobre la que tiene lugar la adhesión del receptor y el ligando.

Puesto que las otras cantidades físicas que aparecen en las ecuaciones (1) y (2) se conocen generalmente o pueden medirse independientemente, a partir de la medida de la intensidad reflejada es posible extraer la masa M de ligandos que interaccionan con el receptor por medio de las fórmulas anteriores.

Por ejemplo, para los siguientes valores de parámetros:

R⁰= 5 • 10-6

R¹= 7 • 10-6

p = 1,15 g/cm3 (biomolécula, valor representativo)

n² = 1,42 (biomolécula, valor representativo)

el cambio fraccional del coeficiente de reflexión, y por tanto la intensidad de la luz reflejada, debido a la interacción entre ligando y receptor es mayor del 30% para MIA = 1 ng/mm2 y es de aproximadamente el 3% para M/A = 100 pg/mm2.

Debe indicarse que la ecuación (2), que predice un aumento en la reflectividad cuando la cantidad de ligando presente en la superficie de contacto aumenta, es válida bajo la suposición de que la longitud de onda X de la luz es muy próxima al valor 4hni, donde, tal como se definió anteriormente, h y ni son el grosor y el índice de refracción de la capa dieléctrica, respectivamente. De lo contrario, si el valor de X es mayor de 4hni, en particular si X>4(hni +dn²), donde d y n² son el grosor y el índice de refracción de la capa de funcionalización que incluye las moléculas de receptor, respectivamente, la interacción entre ligandos y receptores puede conducir a una disminución de la reflectividad. También en este caso, la medida de la variación de la reflectividad permite la detección de la interacción entre ligandos y receptores, según la presente invención. De manera similar al ejemplo anterior, dicha disminución de la reflectividad está directamente relacionada con la masa de ligandos que interaccionan con receptores y la cantidad de ligandos de interacción puede calcularse a través de las fórmulas de Fresnel de capa fina a partir de la disminución medida de la reflectividad.

La medición de la masa de moléculas con la función de ligando que interaccionan con receptores inmovilizados en la superficie, llevada a cabo tal como se describió anteriormente, puede determinar a su vez la presencia de moléculas de ligando en disolución y, posiblemente, su cantidad o su concentración, permitiendo por tanto la determinación de la constante de afinidad K, también conocida como constante de unión entre ligando y receptor, o las constantes de velocidad de asociación y disociación.

En particular, la cantidad de ligando unido al receptor en el equilibrio se expresa mediante una fórmula conocida como “isoterma de Langmuir”, que depende de la cantidad de receptores y la constante de afinidad K. Para la isoterma de Langmuir véase, por ejemplo, PC Hiemenez y R. Rajaglopalan, “Principles of Colloid and Surface Chemistry, Marcel Dekker, Nueva York, 1997, páginas 287-298. Si la constante de afinidad K del par de ligandoreceptor específico se conoce, la medición del balance de masa de ligandos inmovilizados en la superficie permite deducir la concentración de ligando en disolución. De lo contrario, si la concentración de ligando en disolución se conoce, la medición del balance de masa de ligandos inmovilizados en la superficie permite deducir el valor de la constante de afinidad K entre receptor y ligando.

Alternativamente, el diagrama en función del tiempo de la cantidad de ligando inmovilizado en la superficie puede usarse para deducir las constantes de velocidad de asociación y disociación, cuya razón proporciona la constante de afinidad K del par de ligando-receptor. Este procedimiento, comúnmente usado en diferentes métodos sin marcador tales como, por ejemplo, los basados en SPR, se describe, por ejemplo, en el libro de Rebecca L. Rich y David G. Myszka, “Extracting kinetic rate constants from binding responses”, en “Label-free biosensors, techniques and applications”, editado por Matthew A. Cooper, Cambridge University Press, 2009, páginas 85-109.

El método de la presente invención puede aplicarse a disoluciones transparentes, así como turbias y/o absorbentes, de acuerdo con la relación expresada en la ecuación (1). De hecho, la señal de luz detectada procede exclusivamente de la reflexión especular que se produce en la superficie de contacto entre la disolución y el sustrato, y no se ve afectada por la absorción o dispersión de luz que se produce cuando pasa luz a través de la disolución. Además, el método de la presente invención puede aplicarse en cualquier ángulo de incidencia, cualquier estado de polarización, cualquier grado de colimación y composición espectral de la luz incidente, puesto que para cada una de estas variantes los grosores y los índices de refracción de las capas antirreflectantes dieléctricas se seleccionan con el fin de obtener una reflectividad menor del 0,01%.

El material dieléctrico que constituye la capa o capas antirreflectantes puede ser, por ejemplo, dióxido de silicio (SiO²) depositado por evaporación a vacío (por ejemplo, “pulverización catódica”). La superficie, funcionalizada tal como se describe en la etapa a), puede incluirse en una celda para mediciones en ausencia de flujo, o puede incluirse en una celda de medición que tiene la capacidad de hacer fluir la disolución, o puede incluirse en una sonda de inmersión.

Las moléculas o complejos moleculares con la función de receptor que se usan pueden adsorberse o inmovilizarse a través de diferentes mecanismos. La adsorción puede deberse a interacciones electrostáticas o hidrófobas entre las moléculas de receptor, posiblemente modificadas, y la superficie sólida, o entre moléculas y una capa de moléculas de receptor previamente adsorbidas o inmovilizadas en la superficie. La inmovilización puede deberse a adsorción directa de moléculas de receptor, o a la formación de enlaces químicos covalentes con material dieléctrico que constituye la última capa de recubrimiento reflectante (por ejemplo, usando tratamientos con alcoxisilanos y sus derivados) o la formación de enlaces con moléculas o polímeros (por ejemplo poli-lisina) previamente adsorbidos sobre el material dieléctrico. Las moléculas o complejos moleculares con la función de receptores pueden inmovilizarse y/o alterarse químicamente mediante métodos de la técnica anterior tales como métodos químicos, o métodos de radiación electromagnética, o métodos de tratamiento con plasma.

Las moléculas o complejos moleculares con la función de ligando, tras inmovilizarse en la superficie debido a interacción con receptores, pueden actuar ellos mismos como receptor para otras moléculas o complejos moleculares con los que interaccionan.

Las moléculas de receptor, tal como se mencionó, pueden usarse en combinación con moléculas sin la función de receptores (espaciadores). Estas moléculas pueden elegirse por ejemplo entre tensioactivos, hidratos de carbono, proteínas y polímeros sintéticos u otras moléculas que tienen una interacción limitada con los ligandos en disolución. Esta interacción limitada puede verificarse realizando la etapa (a) según el método de la invención usando solo las moléculas espadadoras sin receptores y comprobando que, en la etapa (b), no se observa ningún cambio significativo en la intensidad de la luz reflejada.

La pareja de ligando-receptor se define como una pareja de moléculas, por ejemplo proteínas, ácidos nucleicos, glicoproteínas, hidratos de carbono, hormonas que tienen una afinidad capaz de formar un enlace más o menos estable. En particular, pueden mencionarse parejas de anticuerpo/antígeno, enzima/inhibidor, hidrato de carbono/hidrato de carbono, proteína/ADN, ADN/ADN, péptido/péptido.

En las etapas (a) y (b) del método según la invención, las mediciones de las intensidades de la luz reflejada se llevan a cabo detectando la intensidad de la luz reflejada, a intervalos de tiempo más o menos regulares, por ejemplo de 10 milisegundos o más, hasta alcanzar un valor constante.

El cambio en la intensidad de la luz reflejada puede estar provocado por diferentes fenómenos físicos. Por ejemplo, la unión de ligandos a receptores puede provocar un cambio en la longitud de la trayectoria óptica asociada con las capas dieléctricas. Alternativamente, la unión puede provocar un cambio en el índice de refracción o en las propiedades de absorción de luz del material que constituye una de las capas dieléctricas. Dicha unión puede provocar también un hinchamiento de la capa de moléculas de receptor, o de una por debajo, dando como resultado un cambio en la reflectividad.

El método de la presente invención puede detectar simultáneamente diferentes tipos de interacciones receptorligando con un límite de detección de aproximadamente 10 picogramos de ligando en una superficie de 1 mm2, usando componentes de bajo coste tales como fuentes de luz LED y detectores CCD o CMOS, y sin límites intrínsecos en la concentración mínima en disolución. La concentración de ligando detectable mínima depende directamente de la constante de unión de la pareja de receptor-ligando específica. Dicho límite de detección es comparable con el de las técnicas más sensibles de la técnica anterior.

La superficie de medición se define como la superficie sobre la que se une o se inmoviliza el receptor. El área de esta región puede reducirse hasta un valor de unos pocos cientos de micrómetros cuadrados (correspondiente, por ejemplo, al área de una región circular con un diámetro de unas pocas decenas de micrómetros), permitiendo por tanto la detección de fracciones de un picogramo de ligando. La superficie de detección de la medición puede presentar varias superficies de medición pequeñas, donde diferentes receptores están adsorbidos o inmovilizados. En este caso, el método de la presente invención puede usarse para identificar y medir simultáneamente, con medidas de la intensidad de la luz reflejada, la interacción de ligandos en disolución con diferentes receptores en diferentes ubicaciones de la superficie de baja reflectividad. En particular, es posible inmovilizar diferentes moléculas con la función de receptor en diferentes áreas (manchas) dispuestas en una matriz en la superficie. La intensidad de la luz reflejada a partir de la superficie de contacto puede entonces detectarse mediante un sistema de obtención de imágenes (por ejemplo, por medio de una cámara digital), permitiendo la medición simultánea de la intensidad reflejada a partir de diferentes manchas y la intensidad reflejada a partir de regiones sin receptores, fuera de la mancha, que puede usarse como referencia para la señal de reflectividad.

El método de la presente invención se basa en la adhesión o inmovilización sobre una superficie, cuya reflectividad se reduce mediante una o más capas dieléctricas antirreflectantes, de moléculas (receptores) que exponen a una disolución acuosa un grupo químico capaz de unirse a otras moléculas en disolución (ligandos). La medida del aumento o la cantidad de ligandos que interaccionan con los receptores en respuesta al flujo en la superficie de diversas disoluciones moleculares es un método para:

- detectar la presencia dentro del fluido de moléculas (ligandos) que se unen a las moléculas de la primera capa;

- cribar moléculas de ligando mezcladas con otras sustancias químicas;

- la medida de la cantidad de ligandos unidos en función de la concentración de ligandos en disolución, y a través de la misma,

- la medida de la constante de afinidad de la interacción ligando-receptor;

- la medida de la cantidad de ligandos unidos en función del tiempo, y a través de la misma,

- la medida de las constantes de asociación y disociación.

Es sorprendente que la reflexión de la luz a partir de una superficie recubierta con una o más capas dieléctricas antirreflectantes resultó ser eficaz en la identificación y medición directas, a través de la medición de la intensidad de la luz reflejada, de las interacciones entre receptores y ligandos según el método de la presente invención.

Siguen algunos ejemplos con fines ilustrativos pero no limitativos de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Detección simultánea de la interacción entre anticuerpos en disolución y proteínas inmovilizadas en diferentes áreas usando un sistema de adquisición de imágenes

Se depositó una capa de 109 nm de óxido de silicio (SiO²) mediante pulverización catódica en un lado de un prisma hecho de vidrio Schott N-SK5, formando un ángulo de 5° con el lado opuesto. El grosor de la capa dieléctrica y el sustrato se eligen para reducir en gran medida la reflectividad de la superficie cuando está en contacto con un medio acuoso, en condiciones de incidencia normal de luz monocromática de longitud de onda de 632,8 nm.

El prisma se inserta en una celda de flujo de modo que la superficie tratada (a continuación en el presente documento denominada “superficie de detección”) está en contacto con la disolución acuosa. La figura 1 muestra un dibujo esquemático de una sección de la celda ensamblada. La celda se construye de tal manera que no presente ninguna superficie plana paralela a la superficie de detección. Esto se hace con el fin de facilitar la selección, según la dirección de propagación, de la luz reflejada a partir de la superficie de detección.

En la figura 2 se representa esquemáticamente, no en escala, el sistema de iluminación y el sistema de recogida usados para la ejecución del experimento. La luz de un LED rojo con longitud de onda pico de 636 nm se colima y se conforma mediante un sistema de diafragmas y lentes (según el esquema de iluminación de Kohler) para proporcionar sobre el plano de la superficie de detección una iluminación uniforme, con divergencia angular limitada. Con la ayuda de un espejo semirreflectante (divisor de haz), la luz reflejada a partir del área de detección se recoge mediante una lente que forma una imagen de la superficie de detección sobre el plano del sensor de una cámara CCD conectada a un ordenador.

Un diafragma colocado en el plano focal posterior de la lente de recogida permite seleccionar solo la luz reflejada a partir de la superficie de contacto de interés, bloqueando la mayoría de los rayos de luz reflejados por otras superficies de la celda. De este modo, la luz que contribuye a la formación de la imagen de la superficie de detección procede casi exclusivamente de la reflexión especular a partir de la propia superficie de detección y la intensidad medida por cada elemento del sensor CCD está vinculada directamente con la densidad de superficie de masa adsorbida en la correspondiente región de la superficie de detección según la ecuación (1).

En la superficie de detección del prisma se depositan con una pipeta dos gotitas, de aproximadamente 0,1 microlitros de volumen, separadas aproximadamente 2 milímetros. La primera gota consiste en una disolución acuosa que contienen tampón fosfato de sodio pH 7,4 NaCl 150 milimolar (a continuación en el presente documento denominado “tampón fosfato”) y proteína avidina (comercializada por Sigma-Aldrich, n.° de prod. A9275) a una concentración de 3 micromolar. La segunda gota se compone de una disolución que contiene tampón fosfato, concentración de proteína de 3 micromolar de avidina y biotina a una concentración de 6 micromolar. Esta segunda disolución se preparó 30 minutos antes de la deposición de las gotas. Según la alta constante de unión de la avidina-biotina y la razón molar de los dos reactivos, se espera que, en el momento de la deposición de las gotitas, aproximadamente la mitad de los sitios de unión de las moléculas de avidina estén libres.

Después de aproximadamente 10 minutos desde la deposición, se inserta el prisma en la celda de flujo y se retiran las gotas de la superficie haciendo fluir a través de la celda durante aproximadamente 30 minutos una disolución de tampón fosfato a una velocidad de flujo de 10 microlitros por minuto.

Este procedimiento está destinado a producir en la superficie de detección dos regiones (“manchas”) recubiertas con una capa de proteína avidina.

En la mancha (1), creada por la primera gota, hay proteína avidina, en la mancha (2), creada en la segunda gota, hay proteína avidina con aproximadamente la mitad de sus sitios de unión libres. Durante el experimento, se hacen fluir al interior de la celda con una velocidad de flujo constante de 10 microlitros/minuto las siguientes disoluciones:

a) tampón fosfato para un volumen total de 300 microlitros;

b) tampón fosfato que contiene proteína albúmina sérica bovina, BSA, conjugada con biotina (comercializada por Sigma-Aldrich, n.° de prod. A8549) a una concentración de 0,5 micromolar para un volumen total de 100 microlitros;

c) tampón fosfato para un volumen total de 300 microlitros;

d) anticuerpo anti-BSA (comercializado por Sigma-Aldrich, n.° de prod. B 1520) a una concentración de 0,1 micromolar para un volumen total de 100 microlitros;

e) tampón fosfato para un volumen total de 300 microlitros.

Durante toda la duración del experimento, cada 5 segundos se adquiere una imagen digital de la superficie de detección a través de la cámara y la imagen se guarda en el disco duro del ordenador conectado a la cámara.

La figura 3 muestra una imagen adquirida durante la medición. Están marcadas con círculos discontinuos las regiones donde se han depositado las dos gotitas. Para cada imagen, se calcula el nivel de gris promedio (brillo promedio) de la porción de la imagen correspondiente a cada mancha. El brillo de cada mancha frente al tiempo se muestra en la porción superior de la figura 4 (puntos negros: mancha 1, puntos gris claro: mancha 2).

Se observa que, durante la etapa (b) del experimento, el brillo de la mancha 1 disminuyó más notablemente que la mancha 2. Este cambio en el brillo se atribuye a la formación de enlaces avidina-biotina entre las moléculas inmovilizadas y la BSA conjugada con moléculas de biotina presentes en disolución. Se observa el mismo comportamiento durante la etapa (d) donde el cambio en el brillo se atribuye a la formación de enlaces entre la BSA en la superficie y el anticuerpo específico presente en disolución. Se observa que la adhesión molecular en la superficie conduce a una disminución en la intensidad de la luz reflejada. Esto se debe al hecho de que la luz de la lámpara LED tiene una longitud de onda pico mayor de 633 nanómetros, que es la longitud de onda que minimiza la reflectividad de la superficie.

La porción inferior de la figura 4 muestra la evolución temporal de la diferencia entre la densidad de superficie de la masa en las dos manchas, calculada usando la ecuación (2). Esto reduce la deriva parásita de la señal que puede observarse en particular durante las etapas a) y c).

Ejemplo 2

Detección de la interacción entre anticuerpos y proteínas inmovilizadas en disolución usando una fuente de láser

Se depositó una capa de óxido de silicio (SiO²) mediante pulverización catódica en un lado de un prisma de vidrio, tal como se describió en el ejemplo 1. El prisma se coloca en una celda de flujo de modo que la superficie recubierta esté en contacto con la disolución acuosa. Se envía un haz de luz de un láser de He-Ne de 5 milivatios a la superficie de contacto entre la disolución acuosa y el prisma y la luz reflejada se detecta mediante un fotodiodo que convierte la intensidad de la luz en una señal eléctrica. A través de la celda se promueve un flujo de 10 microlitros/minuto de una disolución acuosa que contiene tampón fosfato de sodio pH 7,4 NaCl 150 milimolar (a continuación en el presente documento denominado “tampón fosfato”) en el siguiente orden:

a) tampón fosfato

b) proteína avidina (comercializada por Sigma-Aldrich, n.° de prod. A9275) a una concentración de 3 micromolar;

c) tampón fosfato;

d) proteína albúmina sérica bovina, BSA (comercializada por Sigma-Aldrich, n.° de prod. A6003) a una concentración de 0,4 micromolar;

e) tampón fosfato;

f) proteína BSA conjugada con biotina (comercializada por Sigma-Aldrich, n.° de prod. A8549) a una concentración de 0,5 micromolar;

g) tampón fosfato;

h) anticuerpo anti-BSA (comercializado por Sigma-Aldrich, n.° de prod. B 1520) a una concentración de 0,1 micromolar;

i) tampón fosfato.

En la figura 5, se notifica la intensidad reflejada medida en función del tiempo. El valor de la intensidad de la luz reflejada medida antes de la etapa a) corresponde a una reflectividad de 3,2^10'6 Tras el aumento en la intensidad reflejada debido a la adsorción de proteína avidina en la superficie activa (a), no se observa variación adicional cuando se hace fluir en la celda la disolución que contiene proteína BSA (c), mientras que se observa un aumento cuando se hace fluir la disolución que contiene proteína BSA conjugada con biotina (e). Esto muestra que la medida de la intensidad reflejada es indicativa de la interacción específica entre biotina y avidina. En correspondencia con la disolución que contiene anticuerpo anti-BSA (g), se observa un aumento adicional en la intensidad de la señal reflejada que indica una interacción entre el anticuerpo y la BSA inmovilizada. A diferencia del ejemplo 1, en este caso, las moléculas de adhesión en la superficie provocan un aumento en la intensidad de la luz reflejada. Esto se debe al hecho de que la radiación láser usada tiene una longitud de onda de 632,8 nanómetros, que es precisamente la longitud de onda para la que hay una reflectividad mínima de la superficie.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Método para detectar y/o cuantificar la unión de ligando-receptor entre un ligando en disolución y un receptor para dicho ligando inmovilizado sobre una superficie sólida, que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar un sustrato de un material amorfo o cristalino sólido con una superficie plana lisa que forma dicha superficie sólida;

b) recubrir dicha superficie sólida con una o más capas dieléctricas de grosor de entre 50 nm y 500 nm, e índice de refracción seleccionado de modo que la reflectividad de dicha superficie recubierta, cuando está en contacto con una disolución acuosa, es menor del 0,01%;

c) inmovilizar moléculas de receptor sobre dicha superficie sólida;

d) poner en contacto dicha superficie sólida que porta receptores inmovilizados con una disolución que contiene moléculas de ligandos;

e) iluminar dicha superficie con luz de una fuente de luz;

f) usar un detector que mide la intensidad de la luz reflejada a partir de la superficie de contacto entre la disolución y dicha superficie sólida que porta receptores inmovilizados en función del tiempo, y convertir los valores de la intensidad de la luz reflejada en valores de masa por unidad de superficie de moléculas de ligando unidas a los receptores utilizando las fórmulas de Fresnel para la reflexión de capa fina.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el valor de la intensidad de la luz reflejada o el valor de masa por superficie unitaria de moléculas de ligando unidas a los receptores, tal como se mide en la etapa d), se convierten en concentración o cantidad total de moléculas de ligando en disolución.
3. Método según la reivindicación 1, en el que el valor de la intensidad de la luz reflejada o el valor de masa por superficie unitaria de moléculas de ligando unidas a los receptores, tal como se mide en la etapa d), se convierten en la constante de afinidad de ligando-receptor.
4. Método según la reivindicación 1, en el que los valores de la intensidad de la luz reflejada en función del tiempo, tal como se mide en la etapa f), se convierten en constantes cinéticas de asociación y/o disociación del par de ligando-receptor.
5. Método según las reivindicaciones 1-4, en el que dicho sustrato de un material amorfo o cristalino sólido tiene un índice de refracción de entre 1,4 y 1,7.
6. Método según la reivindicación 5, en el que dicho material es de vidrio silíceo.
7. Método según las reivindicaciones 1-6, en el que las capas dieléctricas tienen un índice de refracción mayor de 1,35.
8. Método según las reivindicaciones 1-7, en el que dicha superficie con baja reflectividad obtenida a través de las etapas a) y b) está dividida en diferentes áreas, opcionalmente dispuestas como una matriz, en el que diferentes receptores están adsorbidos o inmovilizados en diferentes áreas y en el que la intensidad de la luz reflejada a partir de diferentes áreas se mide simultáneamente mediante un sistema de obtención de imágenes.
9. Método según las reivindicaciones 1-8, en el que otras moléculas sin la función de receptores están también inmovilizadas sobre dicha superficie en combinación con los receptores.
10. Método según las reivindicaciones 1-9, en el que el par de ligando-receptor se selecciona de proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, glicoproteínas, hidratos de carbono, hormonas, lípidos, células, componentes celulares, virus o moléculas de interés farmacológico.
11. Método según las reivindicaciones 1-10, en el que los receptores se inmovilizan sobre la superficie a través de:

a. unión química;

b. adsorción;

c. adsorción sobre moléculas o polímeros previamente inmovilizados en la superficie;

d. irradiación electromagnética;

e. tratamiento con plasma.
12. Método según las reivindicaciones 1-11, en el que la disolución que contiene los ligandos y en contacto con dicha superficie que porta receptores inmovilizados no es una disolución acuosa.
13. Método según las reivindicaciones 1-12, en el que el ángulo de incidencia, el estado de polarización, la divergencia angular y las propiedades espectrales de luz de iluminación se seleccionan con el fin de maximizar la razón entre la señal de luz reflejada en presencia de unión de ligando-receptor y la señal de fondo debida a dispersión y reflexión parásitas.
14. Método según las reivindicaciones 1-13, en el que dicha superficie con receptores inmovilizados se realiza en una celda sin flujo, o en una celda de flujo, o en una sonda de inmersión.
15. Aparato configurado para llevar a cabo el método según las reivindicaciones 1-14, que comprende al menos una celda adaptada para contener una disolución con el ligando y para permitir que tenga lugar la unión de ligando-receptor, medios configurados para depositar mediante pulverización catódica una o más capas dieléctricas de grosor de entre 50 nm y 500 nm sobre un sustrato de un material amorfo o cristalino sólido con una superficie plana lisa que forma dicha superficie sólida de modo que la reflectividad de la superficie recubierta, cuando está en contacto con una disolución acuosa, es menor del 0,01%, medios para inmovilizar moléculas de receptor sobre dicha superficie sólida, medios para hacer fluir la disolución al interior de la celda y lejos de la celda, una fuente de luz configurada para iluminar la superficie recubierta y un detector de luz configurado para medir la intensidad de la luz incidente sobre y reflejada a partir de una superficie de contacto entre la disolución y la superficie sólida que porta receptores inmovilizados, respectivamente, y opcionalmente uno o más espejos, lentes y diafragmas.
16. Aparato según la reivindicación 15, en el que dicha fuente de luz es una fuente de LED y dicho detector es un detector CCD o CMOS.