ES2886480T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento guiado por ARN de una infección por VIH - Google Patents

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Abstract

Una composición para usar en la inactivación del ADN retroviral integrado en el genoma de una célula huésped infectada de forma latente con un retrovirus, comprendiendo la composición: una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa asociada a la repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) y al menos una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica al menos un ARN guía (ARNg) que es complementaria a una secuencia diana en un ADN retroviral integrado en el que el retrovirus es un virus de inmunodeficiencia humana (VIH), en la que dicho al menos un ARNg incluye un primer ARNg que es complementario a una primera secuencia diana en el ADN del VIH, y un segundo ARNg que es complementario a una segunda secuencia diana en el ADN del VIH, y en la que dicha primera secuencia diana está situada en una región de LTR del ADN del VIH, y dicha segunda secuencia diana está situada en una secuencia que codifica proteínas estructurales o proteínas no estructurales del ADN del VIH, en la que la segunda secuencia diana está situada en una secuencia que codifica: precursor de Gag-Pol, Gag, Pol, Pro (proteasa), transcriptasa inversa (RT), integrasa (In) o Env; o, en la que la segunda secuencia diana está situada en una secuencia que codifica: proteínas reguladoras o proteínas accesorias.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para el tratamiento guiado por ARN de una infección por VIH
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones y métodos para escindir específicamente secuencias diana en un virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Las composiciones, que pueden incluir ácidos nucleicos que codifican una endonucleasa asociada a la repetición palindrómica corta agrupada y regularmente interespaciada (CRISPR) y una secuencia de ARN guía complementaria a una secuencia diana en un virus de inmunodeficiencia humana, se pueden administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de contraer una infección por VIH.
Antecedentes
Durante más de tres décadas desde el descubrimiento del VIH-1, el SIDA sigue siendo un importante problema de salud pública que afecta a más de 35,3 millones de personas en todo el mundo. El SIDA sigue siendo incurable debido a la integración permanente del VIH-1 en el genoma del huésped. La terapia actual (terapia antirretroviral altamente activa o HAART) para controlar la infección por VIH-1 e impedir el desarrollo del SIDA reduce profundamente la replicación viral en las células que apoyan la infección por v IH-1 y reduce la viremia plasmática a un nivel mínimo. Pero HAART no suprime la expresión y la replicación del genoma viral de bajo nivel en los tejidos y no se dirige a las células infectadas de forma latente, por ejemplo, células T de memoria en reposo, macrófagos cerebrales, microglía y astrocitos, células linfoides asociadas al intestino, que sirven como reservorio del VIH-1. La infección persistente por VIH-1 también está relacionada con comorbilidades que incluyen enfermedades cardíacas y renales, osteopenia y trastornos neurológicos. Existe una necesidad continua de estrategias terapéuticas curativas que se dirijan a los reservorios virales persistentes.
La terapia actual para controlar la infección por VIH-1 y prevenir la progresión del SIDA ha disminuido drásticamente la replicación viral en células susceptibles a la infección por VIH-1, pero no elimina el bajo nivel de replicación viral en células infectadas de forma latente que contienen copias integradas del ADN proviral del VIH-1. Existe una necesidad urgente de desarrollar estrategias terapéuticas curativas que se dirijan a los reservorios virales persistentes, incluidas estrategias para erradicar el ADN proviral del genoma de la célula huésped.
En los últimos años, se han desarrollado varios sistemas novedosos para erradicar genes endógenos que incluyen endonucleasas de acercamiento (HE), nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras del tipo activadoras de la transcripción (TALEN) y proteínas del sistema 9 asociadas a CRISPR (Cas9).
En el método CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas), se ensamblan complejos de edición de genes, que incluyen una nucleasa Cas9 y un ARN guía (ARNg) complementario a una secuencia diana de ADN viral. El ARNg dirige a la nucleasa Cas9 para que se acople y escinda cadenas de ADN viral que contienen la secuencia diana. El complejo el gen de Cas9/ARNg introduce una o más mutaciones en el ADN viral.
Se ha informado de la viabilidad de alterar genéticamente el provirus del VIH-1 integrado usando HE para direccionar a las secuencias de proteínas virales conservadas. Las ZFN dirigidas al gen CCR5 del correceptor del huésped del VIH-1 han entrado en ensayos clínicos de fase 2 para el tratamiento del VIH/SIDA. Se ha demostrado experimentalmente que TALEN escinde eficazmente c CR5 en el sitio esperado. Los complejos de edición de Cas9/ARNg también se han utilizado para interrumpir los correceptores de entrada del VIH-1 (CCR5, CXCR4) y proteínas estructurales provirales (Manjunath et al., Viruses, 14; 5 (11): 2748-2766 (2013); Stone et al., Curr. Opin. HIV AIDS. 8 (3): 217-223 (2013); Wang et al., PLoS One. 26; 9 (12): e115987 (2014)). Sin embargo, CCR5 no es el único receptor de la infección por VIH-1 y también tiene muchas otras funciones celulares.
W. Hu et al., "RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection," Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 111, no. 31, 21 de julio de 2014, páginas 11461-1146 describe el direccionamiento a las regiones LTR solo de la secuencia del VIH. Kamel Khalili et al., "Genome editing strategies: potential tools for eradicating HIV-1/AIDS," Journal of NeuroVirology, vol. 21, no. 3, 26 de febrero de 2015, páginas 310-321 es un artículo de revisión que describe los desarrollos recientes en la edición del genoma en el VIH-1, incluido el uso del sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), nucleasas de dedos de zinc y nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN). Solo el LTR se describe como objetivo mediante un sistema CRISPR. De manera similar, Hirotaka Ebina et al., "Harnessing the CRISPR/Cas9 system to disrupt latent HIV-1 provirus," Scientific Reports, vol. 3, no. 1, 1 de diciembre de 2013 describe el uso de constructos de ARNg simples para dirigirse a la LTR y no describe el doble direccionamiento. El documento WO 2015/031775 describe la expresión multiplex de Cas9 junto con los ARNg dirigidos a LTR A y LTR B que se encuentran dentro de la LTR U3 para erradicar el genoma del VIH-1.
Resumen
La presente invención proporciona composiciones y métodos relacionados con el tratamiento y la prevención de infecciones retrovirales, especialmente el virus de la inmunodeficiencia humana VIH. Las composiciones y métodos atacan al VIH proviral que se ha integrado en el genoma de las células huésped.
Específicamente, la presente invención proporciona composiciones, composiciones farmacéuticas, métodos in vitro para inactivar un ADN del VIH integrado en una célula de mamífero, kits para el tratamiento o profilaxis de la infección por VIH y vectores de expresión o polinucleótidos para inactivar un ADN retroviral integrado en el genoma de una célula huésped infectada de forma latente con un VIH, de acuerdo con las reivindicaciones.
La invención proporciona composiciones que incluyen una secuencia de ácido nucleico que codifica una endonucleasa asociada a CRISPR y una o más secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican ARNg, en las que cada ARNg es complementario a una secuencia diana en un genoma del VIH. Se incluyen dos ARNg en la composición, y cada ARNg dirige una endonucleasa Cas a un sitio diana diferente en el ADN retroviral integrado del ADN del VIH. El ADN que se extiende entre los sitios de corte se elimina, lo que resulta en la escisión de parte o de todo el genoma del VIH. Las combinaciones más eficaces de ARNg incluyen pares en los que un ARNg se dirige a un sitio en la región de LTR y el otro se dirige a un sitio en un gen estructural tal como gag o pol; y pares que se describen en el presente documento en los que ambos ARNg se dirigen a sitios en la LTR.
En el presente documento se describe un método para inactivar un retrovirus en una célula de mamífero exponiendo la célula a una composición que incluye uno o más ácidos nucleicos aislados que codifican un complejo de edición de genes. El complejo de edición de genes incluye una endonucleasa asociada a CRISPR y uno o más ARNg, en los que cada ARNg es complementario a una secuencia diana en el retrovirus.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica para la inactivación de ADN proviral del VIH integrado en un sujeto mamífero. La composición incluye una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa Cas, y al menos una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica al menos un ARNg complementario a una secuencia diana en un ADN proviral del VIH. Los pares de ARNg se dirigen a diferentes sitios del genoma del VIH. Las secuencias de ácido nucleico aisladas se incluyen en al menos un vector de expresión.
También se describe en el presente documento un método para tratar a un sujeto mamífero infectado con un retrovirus, por ejemplo, VIH. El método incluye las etapas de determinar que un sujeto mamífero está infectado con VIH, administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica indicada anteriormente y tratar al sujeto mamífero para la infección por VIH.
También se describe en el presente documento un método de tratamiento para reducir el riesgo de una infección por retrovirus (por ejemplo, VIH) en un sujeto mamífero con riesgo de infección. El método incluye las etapas de determinar que un sujeto mamífero está en riesgo de infección por VIH, administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica anteriormente indicada y reducir el riesgo de infección por VIH en un sujeto mamífero.
La presente invención proporciona un kit para el tratamiento o profilaxis de la infección por VIH. El kit incluye una cantidad medida de una composición que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa asociada a CRISPR y al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más ARNg, en la que los ARNg son complementarios a los sitios diana en el VIH. Alternativamente, el kit puede incluir uno o más vectores que codifican los ácidos nucleicos. El kit también puede contener material de empaque, un prospecto con instrucciones de uso, un líquido estéril, una jeringa y/o un recipiente estéril.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A muestra un diagrama de Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9), ARN de guía única (ARNgu) y motivo adyacente al protoespaciador (PAM), que muestra el sitio de corte en el tercer nucleótido de ambas cadenas de ADN de PAM NGG o NAG y la secuencia de ARNgu. El ARNgu está compuesto por el ARN de CRISPR (ARNcr) que contiene un espaciador de 20 pb (semilla o secuencia diana) y 12 pb, el bucle de tallo (GAAA) y el ARNc de transactivación (ARNctra);
La Figura 1B muestra un diagrama de mapa para spCas9 que expresa el vector lentiviral (arriba) y el ARNgu que expresa el vector lentiviral (abajo). El vector informador lentiviral (arriba) se adquirió a través de Biosettia, que expresa 3xFlag para inmunodetección, proteína fluorescente roja indicadora (RFP) para titulación fácil y análisis FACs , y péptido T2A para autoescisión para prevenir el efecto potencial de RFP en la función de Cas9. El vector lentiviral que expresa ARNgu se modificó a partir del vector Addgene (n° 50946) que muestra el sitio de clonación de BbsI y el marcador de selección de antibióticos Puromicina y proteína fluorescente azul informadora (BFP) para una titulación fácil y análisis FACS;
La Figura 1C muestra un diagrama del genoma del VIH-1, que muestra ARNg seleccionados que se dirigen a las regiones de LTR del VIH-1, Gag (A-D) y Pol (A, B);
La Figura 1D muestra un diagrama detallado de ARNgu que se dirigen a 400 pb dentro de la región U3 de LTR del VIH-1. Las secuencias de semillas con PAM verde (subrayado en negrita) en la cadena sentido, y PAM rojo (subrayado en negrita) en la cadena antisentido, se marcaron como se indica. La mayoría de ellas también se pueden emparejar para la nickasa Cas9 y la nucleasa FokI guiada por ARN (RFN), que pueden reducir hasta 1500 veces los efectos potenciales fuera del objetivo. La selección de la región de 400 pb se basó en su ausencia en todos los vectores lentivirales utilizados actualmente que se utilizan para el suministro de genes y ARNgu. Tal selección evitará la autoescisión de los vectores lentivirales por Cas9/ARNg;
La Figura 1E muestra un diagrama del vector informador EcoVIH que contiene luciferasa de luciérnaga mejorada (eLuc) derivada del vector VIH-1 nl4-3 humano. El gen eLuc se insertó entre Env y Nef con un péptido 2A autoescindible antes de Nef, mientras que el gp120 del VIH-1 se reemplazó por gp80 del virus ecotrópico de la leucemia murina;
Las Figuras 2A y 2D muestran el cribado de ARNgu único mediante el ensayo informador de EcoVIH-luciferasa. Las células HEK293T se cotransfectaron con el informador de EcoVIH-eLuc, pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP y el vector lentiviral de expresión de ARNgu indicado. Después de 2 días, se midió la actividad de la luciferasa en los lisados celulares con el sistema de ensayo de luciferasa ONE-GLOMR. Los datos representan la media ± EE de 4 transfecciones independientes;
La Figura 2B muestra que los ARNgu emparejados de Gag-D con cualquiera de los ARNgu de LTR redujeron las actividades de luciferasa en un 64-96%. Se cotransfectaron células HEK293T con el informador de EcoVIH-eLuc, pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP y el vector lentiviral de expresión de ARNgu indicado. Después de 2 días, se midió la actividad de la luciferasa en los lisados celulares con el sistema de ensayo de luciferasa ONE-GloMR. Los datos representan la media ± EE de 4 transfecciones independientes;
La Figura 2C muestra que los ARNgu emparejados de LTR-3 con cualquiera de los Gag-ARNgu o Pol-ARNgu redujeron las actividades de luciferasa en un 73-93%. Las células HEK293T se cotransfectaron con el informador de EcoVIH-eLuc, pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP y el vector lentiviral de expresión de ARNgu indicado. Después de 2 días, se midió la actividad de la luciferasa en los lisados celulares con el sistema de ensayo de luciferasa ONE-GloMR. Los datos representan la media ± EE de 4 transfecciones independientes;
La Figura 3A muestra que el genotipado por PCR verificó la erradicación del ADN del VIH-1 entre los sitios de direccionamiento 5'-LTR y el sitio de corte de Gag-D. Panel superior: ubicación de los cebadores de PCR. Panel inferior: ARNgu de GagD emparejado con varios ARNgu que se dirigen a LTR. Las células HEK293T se cotransfectaron con el informador de EcoVIH-eLuc, pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP y los vectores de expresión de ARNg indicados. Después de 2 días, las células se lisaron con NaOH 50 mM a 95 °C durante 10 minutos y se neutralizaron con Tris-HCl 1 M. Los extractos crudos se utilizaron directamente para PCR utilizando mezcla de polimerasas directa para PCR Terra (Clontech) y los cebadores de PCR T361/T458 que cubren 5'-LTR y Gag parcial 5' (1364 pb), que producen un fragmento de 1,35 kb en la muestra de control transfectada con vector de expresión de ARNgu vacío;
La Figura 3B muestra que el genotipado por PCR verificó la erradicación del ADN del VIH-1 entre los sitios de direccionamiento 3'-LTR y el sitio de corte de Gag-D. Panel superior: ubicación de los cebadores de PCR. Panel inferior: ARNgu de GagD emparejado con varios ARNgu que se dirigen a LTR. Las células HEK293T se cotransfectaron con el informador de EcoVIH-eLuc, pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP y los vectores de expresión de ARNg indicados. Después de 2 días, las células se lisaron con NaOH 50 mM a 95 °C durante 10 minutos y se neutralizaron con Tris-HCl 1 M. Los extractos crudos se utilizaron directamente para la PCR utilizando mezcla de polimerasa directa para PCR Terra (Clontech) y los cebadores de PCR T758 (nucleótido 796-817)/T645 (dirigidos a la secuencia del vector después de 3'-LTR ) que cubren 3'-LTR y todo el genoma del VIH-1 excepto por la secuencia parcial Gag 5', que produce el fragmento predicho de 9,5 kb indetectable por la condición de p Cr regular en la muestra de control transfectada con el vector de expresión de ARNgu vacío;
La Figura 3C muestra que el genotipado por PCR verificó la erradicación del ADN del VIH-1 entre el sitio de direccionamiento de LTR 3 y los sitios de direccionamiento de Gag o Pol. Panel superior: ubicación de los cebadores de PCR. Panel inferior: GagD emparejado con ARNgu de LTR-1,2, 3 o LTR 3 emparejado con varios ARNgu dirigidos a Gag o Pol. Las células HEK293T se cotransfectaron con el informador de EcoVIH-eLuc, pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP y los vectores de expresión de ARNg indicados. Después de 2 días, las células se lisaron con NaOH 50 mM a 95 °C durante 10 minutos y se neutralizaron con Tris-HCl 1 M. Los extractos crudos se usaron directamente para PCR usando mezcla de polimerasa directa para PCR (Clontech) y los cebadores de PCR que cubren las secuencias entre 5'-LTR y la secuencia del genoma 5' (panel izquierdo) o la secuencia del genoma 3' y 3'-LTR (panel derecho);
La Figura 3D muestra un diagrama de la ubicación de los cebadores de PCR y los sitios de direccionamiento de ARNg de Gag/Pol usados en la validación de los ARNg efectivos mediante genotipado por PCR;
Las Figuras 3E, 3F son transferencias que muestran los resultados de GagD emparejado con varios LTR-ARNg;
Las Figuras 3G, 3H son transferencias que muestran los resultados de LTR-R emparejados con varios ARNg que se dirigen a Gag y Pol. Se detectó la eliminación de 5'LTR-Gag o Gag-3'LTR. La densidad de banda de tipo silvestre (WT), eliminación e inserción se cuantificó con el programa Image J del NIH. El número debajo del gel indica el cambio de banda de WT (%) relacionado con el control de ARNg vacío después de la normalización con el producto de PCR Cas9 usando cebadores específicos de Cas9 T477/T478, así como también los cambios en las bandas de inserción y eliminación en comparación con la banda de WT. Los cambios dramáticos inducidos por el ARNg correspondientes se destacaron como recuadros. Los recuadros indican las muestras seleccionadas para la clonación de TA y la secuenciación de Sanger;
Las Figuras 3I, 3J muestran la validación adicional de ARNg efectivos mediante genotipado por PCR directa con cebadores de PCR adicionales que cubren la región estructural y la 3' LTR. La Figura 3I muestra el cebador directo (T758) en dirección 5' de los pares de GagD de ARNg con el cebador inverso (T645) en el vector en dirección de la LTR del extremo 3'. La Figura 3J muestra el cebador directo (T758) en dirección 5' de los pares de GagD de ARNg con el cebador inverso (T422) en la región R de la LTR del extremo 3'. Las flechas indican bandas no específicas (ns); La Figura 4 muestra que la clonación de TA representativa y la secuenciación de Sanger confirmaron una eliminación de 296 pb entre LTR-1 y LTR-3 y una inserción adicional de 180 pb entre los dos sitios de corte. La preparación de la muestra y la PCR directa se realizaron como se describe en la Figura 3A. Los fragmentos de PCR después del corte se extrajeron para la clonación de TA y la secuencia de Sanger. Las flechas rojas señalan los sitios de corte previstos en el tercer nucleótido de PAM. El rojo subrayado muestra la secuencia de PAM;
La Figura 5A muestra una representación esquemática del genoma del VIH-1, que incluye una estrategia y el resultado predicho de la dirección exitosa de las secuencias de LTR virales (provirus integrado flanqueante) con complejos Cas9/ARNg;
La Figura 5B muestra una estructura detallada de la LTR;
La Figura 5C muestra la secuencia de sitios diana y su ubicación en la LTR;
La Figura 6A muestra un diagrama de la línea celular indicadora Jurkat 2D10, que incluye una descripción de la secuencia indicadora integrada del VIH-1;
La Figura 6B muestra micrografías de fluorescencia que representan la reactivación inducida por PMA/TSA de secuencias provirales latentes;
La Figura 6C muestra histogramas de citometría de flujo que representan la reactivación inducida por PMA/TSA de secuencias provirales latentes;
La Figura 7A muestra los resultados de un cribado de clonación de una sola célula;
La Figura 7B muestra la confirmación de los mejores clones, de acuerdo con el análisis de citometría de flujo de los clones obtenidos en el cribado de clones de células individuales;
La Figura 7C muestra ejemplos de transferencias Western para FLAG-Cas9 (panel superior) y electroforesis en gel de agarosa de RT-PCR (panel inferior), para la expresión de ARNg;
La Figura 8A muestra la ubicación de los cebadores usados en el análisis de PCR de la erradicación del genoma proviral del VIH-1 del ADN del huésped. Los cebadores eran específicos para el motivo de secuencia del gen Env proviral (RRE), las secuencias genómicas que flanquean el provirus informador integrado (cromosoma 16, gen MSRB1), LTR y el gen de b-actina de control;
La Figura 8B muestra una imagen en gel de agarosa de las reacciones de PCR, con flechas que apuntan a los sitios de las bandas que faltan debido a la erradicación de las secuencias del VIH-1;
La Figura 8C muestra datos de PCR de largo alcance en condiciones optimizadas para productos más cortos, lo que permite la detección de secuencias lariat provirales en el sitio de integración;
La Figura 8D muestra los resultados de la secuenciación de lariat proviral;
La Figura 9A muestra el análisis de fluorescencia de clones de células individuales Jurkat 2D10 que se habían infectado con el virus informador NL-4-3-EGFP-P2A-Nef del VIH-1, con la progresión de la infección monitorizada durante 18 días, en forma de análisis de fluorescencia;
La Figura 9B muestra una transferencia Western que muestra la expresión de Cas9-FLAG en los clones ensayados; La Figura 9C muestra una imagen en gel de agarosa de la PCR de transcripción inversa para la expresión de ARNg en clones seleccionados;
La Figura 10A muestra micrografías de fluorescencia de células Jurkat 2D10 transducidas con lentivirus que expresan los ARNg de RFP-Cas9 y/o LTR A/B';
La Figura 10B muestra el análisis de citometría de flujo de la expresión de los ARNg de RFP-Cas9 y/o LTR A/B' y la reactivación viral después de la inducción con PMA/TSA;
La Figura 11A muestra las secuencias de LTR A y LTR B';
La Figura 11B muestra el análisis del ensayo Surveyor de Inserciones/Eliminaciones fuera del objetivo después de la expresión de Cas9 y LTR A/B';
La Figura 11C muestra los resultados del análisis de secuenciación de Sanger de Inserciones/Eliminaciones fuera del objetivo;
La Figura 11D muestra la ubicación del sitio de integración del informador del VIH-1 en el segundo exón del gen MSRB1 en el cromosoma 16 y genes vecinos;
La Figura 11E muestra los resultados de la comparación de qRT-PCR de la expresión de genes vecinos en células de control y que expresan Cas9/LTR AB';
Las Figuras 12A-12C muestran un diagrama de la clonación de TA y la secuenciación de Sanger de muestras representativas que confirmaron la eliminación de fragmentos predichos entre los correspondientes sitios diana de ARNg (Figuras 12A-12C) y varias inserciones adicionales (Figuras 12B, 12C). Las secuencias de PAM están resaltadas y las tijeras indican el tercer nucleótido de PAM. La flecha señala el sitio de unión después de la escisión y la ligadura;
Las Figuras 13A-13E muestran el establecimiento de la línea celular HEK293T estable a luciferasa de luciérnaga de EcoVIH. El virus EcoVIH-eLuc se recogió 48 h después de la cotransfección de células HEK293T en un pocillo de una placa de 6 pocillos con 3 |jg de plásmido pEcoVIH-eLuc y 1 |jg de plásmido VSV-G. Se añadió el mismo volumen de sobrenadante viral (250 j l) a las células HEK293T (2 x 104/pocillo) en una placa de 12 pocillos. Después de 48 h, la actividad de la luciferasa eLuc medida con el ensayo de luciferasa ONE-Glo (Promega) mostró una actividad 105 veces mayor que aquella de las células HEK293T de control sin tratamiento con virus. Luego, las células individuales se cultivaron en cuatro placas de 96 pocillos a dilución limitante. Después de 2-3 semanas, las colonias de células supervivientes se aislaron y se analizaron para determinar la actividad indicadora de eLuc (Figuras 13A, 13B) mediante el ensayo de luciferasa ONE-Glo y la validación del transgén EcoVIH-eLuc mediante genotipado de PCR directa (Figuras 13C-13E) con cebador T361 (5'-gatctgtggatctaccacacaca-3') y T458 (5'-cccactgtgtttagcatggtatt-3'). La mitad de los 13 clones derivados de células individuales en la primera ronda del experimento (Figura 13A, codificada como 1016) y la mitad de los 20 clones en la segunda ronda (Figura 13B, 1021) mostraron varios grados de actividad constitutiva de eLuc. Solo dos de ellos (1016-11 y 1021-19) respondieron significativamente a la estimulación con TNFa (10 ng/ml) y PMA (10 ng/ml). Todos los clones que expresan eLuc contenían el transgén (Figuras 13C-13E) excepto el clon 1021-6 (cuadrado verde), que puede perder la secuencia de Gag durante la integración pero aún transcribir eLuc mediante corte y empalme alternativo. Dos clones (1016-6 y 1016-9) contenían el transgén pero no mostraron actividad eLuc incluso después del tratamiento con agentes de reversión de la latencia tales como TNFa/PMA y otros (cuadrado rojo en las Figuras 13A y 13D). Por lo tanto, los clones con actividad de eLuc se seleccionaron y se mantuvieron para estudios adicionales. Algunos de estos clones no pueden pasarse probablemente debido a la generación continua de proteínas virales tóxicas y algunos clones fueron resistentes a la transfección, incluso con el kit de transfección de lipofectamina; y,
Las Figuras 14A-14D muestran los resultados del cribado de eficacia de los ARNg utilizando la línea celular HEK293T estable a luciferasa de luciérnaga de EcoVIH. Figuras 14A, 14B: El clon de expresión estable de EcoVIH-eLuc se infectó adicionalmente con pCW-Cas9-lentivirus de puromicina a 10 MOI y se seleccionó con puromicina (1 jg/m l) durante 2 semanas. Las células se transfectaron con los vectores que expresan ARNg indicados. Después de 2 días, se realizó el ensayo de luciferasa ONE-Glo. Figuras 14C, 14D: Las células que expresan de forma estable EcoVIH-eLuc se cotransfectaron con los vectores que expresan ARNg indicados y el vector pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP. La actividad de luciferasa se midió con el ensayo de luciferasa ONE-Glo después de 48 h. Los datos representan la media ± SEM de 4 transfecciones independientes con cambios porcentuales en la actividad de eLuc en comparación con el grupo cero de ARNg vacío.
Descripción detallada
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que el genoma integrado del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) puede eliminarse de las células infectadas por el VIH mediante el uso del sistema de repetición palindrómica corta agrupada y regularmente interespaciada (cRISPR)-nucleasa Cas 9 guiado por ARN (Cas9/ARNg) en configuraciones simples y múltiples.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento pueden usarse en la práctica para probar la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en este documento. Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante.
Se pretende que todos los genes, nombres de genes y productos génicos descritos en el presente documento correspondan a homólogos de cualquier especie para la que sean aplicables las composiciones y los métodos descritos en el presente documento. Se entiende que cuando se divulga un gen o producto génico de una especie particular, esta divulgación pretende ser únicamente a modo de ejemplo y no debe interpretarse como una limitación a menos que el contexto en el que aparece lo indique claramente. Así, por ejemplo, para los genes o productos génicos descritos en este documento, se pretende que abarquen genes y productos génicos homólogos y/u ortólogos de otras especies.
Los artículos "un" y "uno, una" se utilizan en este documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento. Así, la mención de "una célula", por ejemplo, incluye una pluralidad de células del mismo tipo. Además, en la medida en que los términos "que incluye", "incluye", "que tiene", "tiene", "con" o variantes de los mismos se utilizan en la descripción detallada y/o en las reivindicaciones, se pretende que dichos términos sean inclusive de una manera similar al término "que comprende".
Como se usa en este documento, los términos "que comprende", "comprende" o "comprendido" y variaciones de los mismos, en referencia a elementos definidos o descritos de un elemento, composición, aparato, método, proceso, sistema, etc. sean inclusivos o abiertos, permitiendo elementos adicionales, indicando así que el elemento, composición, aparato, método, proceso, sistema, etc. definido o descrito incluye esos elementos especificados o, según corresponda, equivalentes de los mismos, y que otros elementos pueden ser incluidos y aún caigan dentro del alcance/definición del elemento, composición, aparato, método, proceso, sistema definidos, etc.
"Aproximadamente" como se usa en este documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, o ± 0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos descritos. Alternativamente, particularmente con respecto a los sistemas o procesos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud dentro de 5 veces, y también dentro de 2 veces, de un valor. Cuando se describen valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, se debe asumir el significado del término "aproximadamente" dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular.
"Codificación" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, de servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen ya sea un secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de la misma. Por tanto, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y generalmente se proporciona en listados de secuencias, como la cadena no codificante, utilizada como plantilla para la transcripción de un gen o ADNc, puede denominarse codificante de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.
Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto es la cantidad de compuesto que es suficiente para proporcionar un efecto beneficioso al sujeto al que se administra el compuesto. Una "cantidad eficaz" de un vehículo de administración es la cantidad suficiente para unir o administrar eficazmente un compuesto.
El término "erradicación" de virus, por ejemplo, VIH, como se usa en este documento, significa que ese virus no puede replicarse, el genoma está eliminado, fragmentado, degradado, genéticamente inactivado o cualquier otra manifestación física, biológica, química o estructural que impida que el virus sea transmisible o infecte a cualquier otra célula o sujeto que da como resultado la eliminación del virus in vivo. En algunos casos, los fragmentos del genoma viral pueden ser detectables, sin embargo, el virus es incapaz de replicarse o de infectar, etc.
"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos que se va a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos que actúan en cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula huésped o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.
"Homólogo" se refiere a la similitud de secuencia o identidad de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma subunidad de monómero de base o aminoácido, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas X 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden o son homólogas entonces las dos secuencias son homólogas en un 60%. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN ATTGCC y TATGGC comparten un 50% de homología. Generalmente, se hace una comparación cuando dos secuencias se alinean para producir la máxima homología.
"Aislado" significa alterado o eliminado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente naturalmente en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado". Un ácido nucleico o proteína aislado puede existir en forma sustancialmente purificada, o puede existir en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, una célula huésped.
En el contexto de la presente invención, se usan las siguientes abreviaturas para las bases de ácido nucleico que se encuentran comúnmente. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina y "U" se refiere a uridina.
A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede contener en alguna versión un intrón o intrones.
Los términos "paciente", "sujeto", "individuo" y similares se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier animal o células del mismo, ya sea in vitro o in situ, susceptibles de los métodos descritos en el presente documento. El paciente, sujeto o individuo puede ser un ser humano.
La administración "parenteral" de una composición incluye, por ejemplo, inyección subcutánea (sc), intravenosa (iv), intramuscular (im) o intraesternal, o técnicas de infusión.
Como se usa en este documento, los términos "polinucleótido", "secuencia de ácido nucleico" y "gen" se usan indistintamente en toda la memoria descriptiva e incluyen ADN complementario (ADNc), oligómeros lineales o circulares o polímeros de monómeros naturales y/o modificados o enlaces, que incluyen desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, formas sustituidas y alfa-anoméricas de los mismos, ácidos nucleicos peptídicos (ANP), ácidos nucleicos bloqueados (ANB), fosforotioato, metilfosfonato y similares. El término "polinucleótido" como se usa en este documento se define como una cadena de nucleótidos. Además, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Por tanto, los ácidos nucleicos y polinucleótidos como se usan en este documento son intercambiables. Un experto en la técnica tiene conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que pueden hidrolizarse en los "nucleótidos" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos se pueden hidrolizaren nucleósidos. Los polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, todas las secuencias de ácido nucleico que se obtienen por cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, sin limitación, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácido nucleico de una biblioteca recombinante o un genoma celular, usando tecnología de clonación ordinaria y PCRMR, y similares, y por medios sintéticos. Las secuencias de ácido nucleico pueden ser "quiméricas", es decir, compuestas de diferentes regiones. En el contexto de esta invención, los compuestos "quiméricos" son oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicas, por ejemplo, región o regiones de ADN, región o regiones de ARN, región o regiones de ANP, etc. Cada región química está formada por al menos una unidad de monómero, es decir, un nucleótido. Estas secuencias comprenden típicamente al menos una región en la que la secuencia se modifica para exhibir una o más propiedades deseadas.
"Análogos" en referencia a nucleósidos incluye nucleósidos sintéticos que tienen fracciones de base modificadas y/o fracciones de azúcar modificadas, por ejemplo, descritas generalmente por Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, Nueva York, 1980; Freier y Altmann, Nucl. Acid. Res., 1997, 25 (22), 4429-4443, Toulmé, J.J., Nature Biotechnology 19: 17-18 (2001); Manoharan M., Biochemica et Biophysica Acta 1489: 117-139 (1999); Freier SM, Nucleic Acid Research, 25: 4429-4443 (1997), Uhlman, E., Drug Discovery & Development, 3: 203-213 (2000), Herdewin P., Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10: 297 -310 (2000)); bicicloarabinonucleósidos [3.2.0] unidos en 2'-O, 3'-C (véase, por ejemplo, NK Christiensen., et al., J. Am. Chem. Soc., 120: 5458-5463 (1998). Tales análogos incluyen nucleósidos sintéticos diseñados para mejorar las propiedades de unión, por ejemplo, estabilidad del dúplex o tríplex, especificidad o similares.
El término "variante", cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleótidos, puede abarcar una secuencia de polinucleótidos relacionada con un gen de tipo silvestre. Esta definición también puede incluir, por ejemplo, variantes "alélicas", de "empalme", de "especies" o "polimórficas". Una variante de empalme puede tener una identidad significativa con una molécula de referencia, pero generalmente tendrá un número mayor o menor de polinucleótidos debido al empalme alternativo de exones durante el procesamiento del ARNm. El polipéptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o la ausencia de dominios. Las variantes de especies son secuencias de polinucleótidos que varían de una especie a otra. De particular utilidad en la invención son las variantes de productos génicos de tipo silvestre. Las variantes pueden resultar de al menos una mutación en la secuencia de ácido nucleico y pueden resultar en ARNm alterados o en polipéptidos cuya estructura o función puede o no estar alterada. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o muchas formas alélicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se atribuyen generalmente a eliminaciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede ocurrir solo o en combinación con los demás, una o más veces en una secuencia determinada.
A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede contener en alguna versión un intrón o intrones.
Como se usa en el presente documento, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a un compuesto que consta de residuos de aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se impone ninguna limitación al número máximo de aminoácidos que pueden comprender la secuencia de una proteína o péptido. Así, por ejemplo, los términos oligopéptido, proteína y enzima se incluyen dentro de la definición de polipéptido o péptido, ya sea producido usando técnicas recombinantes, síntesis química o enzimática, o de origen natural. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Como se usa en este documento, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, y a cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica proteínas, de las cuales hay muchos tipos. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión. Este término también incluye polipéptidos que han sido modificados o derivatizados, tal como por glicosilación, acetilación, fosforilación y similares entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos.
Como se usa en este documento, "variante" de polipéptidos se refiere a una secuencia de aminoácidos que está alterada por uno o más residuos de aminoácidos. La variante puede tener cambios "conservadores", en los que un aminoácido sustituido tiene propiedades químicas o estructurales similares (por ejemplo, sustitución de leucina por isoleucina). Más raramente, una variante puede tener cambios "no conservadores" (por ejemplo, reemplazo de glicina por triptófano). Las variaciones menores análogas también pueden incluir eliminaciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. La guía para determinar qué residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o eliminarse sin abolir la actividad biológica puede encontrarse utilizando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software LASERGENE (DNASTAR).
Un tratamiento "terapéutico" es un tratamiento administrado a un sujeto que presenta signos de patología, con el fin de disminuir o eliminar esos signos.
La frase "cantidad terapéuticamente efectiva", como se usa en este documento, se refiere a una cantidad que es suficiente o efectiva para prevenir o tratar (retrasar o prevenir el inicio, prevenir la progresión, inhibir, disminuir o revertir) una enfermedad o condición, incluido el alivio de los síntomas de tales enfermedades.
El "tratamiento" es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología o los síntomas de un trastorno. Por consiguiente, "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. El "tratamiento" también puede especificarse como cuidados paliativos. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos en los que se debe prevenir el trastorno. Por consiguiente, "tratar" o "tratamiento" de un estado, trastorno o afección incluye: (1) prevenir o retrasar la aparición de síntomas clínicos del estado, trastorno o afección que se desarrolla en un ser humano u otro mamífero que pueda estar afectado o predispuesto al estado, trastorno o afección, pero aún no experimenta ni muestra síntomas clínicos o subclínicos del estado, trastorno o afección; (2) inhibir el estado, trastorno o afección, es decir, detener, reducir o retrasar el desarrollo de la enfermedad o una recaída de la misma (en caso de tratamiento de mantenimiento) o al menos uno de sus síntomas clínicos o subclínicos; o (3) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión del estado, trastorno o afección o al menos uno de sus síntomas clínicos o subclínicos. El beneficio para un individuo a tratar es estadísticamente significativo o al menos perceptible para el paciente o el médico.
Un "vector" es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que puede usarse para administrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Se conocen numerosos vectores en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por lo tanto, el término "vector" incluye un plásmido o virus que se replica de forma autónoma. El término también debe interpretarse para incluir compuestos no plasmídicos y no virales que facilitan la transferencia de ácido nucleico a las células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas y similares. Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovirales y similares.
Intervalos: a lo largo de esta descripción, se pueden presentar varios aspectos de la invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 tiene subintervalos específicamente descritos como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
Composiciones de nucleasa CRISPR
Se ha demostrado que la aplicación de la tecnología Cas9 para erradicar el reservorio del VIH-1, en particular dirigirse a LTR, es una estrategia prometedora para tratar y posiblemente curar el SIDA. Hu, et al., PNAS 2014, 111: 114616, divulgó que la transfección estable de cultivos de células humanas con plásmidos que expresan Cas9/ARNg dirigidos a sitios en la LTR del VIH-1 erradicó con éxito parte y/o todo el genoma del VIH-1 sin comprometer la función de la célula huésped. Los sitios objetivo se denominaron lTR-A. LTR-B, LTR-C y LTR-D. El direccionamiento de dos sitios diferentes en la LTR fue particularmente eficaz para producir las eliminaciones suficientemente extensas para constituir la escisión de toda o sustancialmente toda la secuencia de ADN proviral. La preexistencia de Cas9/ARNg en las células también previno una nueva infección por VIH-1.
El VIH y otros retrovirus son altamente mutables, por lo que existe la necesidad de un espectro más amplio de reactivos de Cas9/ARNg y métodos para dirigirse al genoma integrado del VIH. De particular utilidad serían los reactivos de Cas9/ARNg que se dirigen eficazmente a los genes estructurales del VIH, tales como gag y pol.
Por consiguiente, los aspectos de la divulgación están dirigidos a composiciones para el tratamiento y erradicación de virus altamente mutables y/o latentes de una célula huésped in vitro o in vivo. Los métodos descritos en este documento pueden usarse para eliminar material genético viral u otro material genético extraño de un organismo huésped, sin interferir con la integridad del material genético del huésped. Puede usarse una nucleasa para dirigirse al ácido nucleico viral, interfiriendo así con la replicación o transcripción viral o incluso escindiendo el material genético viral del genoma del huésped. La nucleasa puede dirigirse específicamente para eliminar solo el ácido nucleico viral sin actuar sobre el material del huésped, ya sea cuando el ácido nucleico viral existe como una partícula dentro de la célula o cuando está integrado en el genoma del huésped. La selección del ácido nucleico viral se puede realizar utilizando una fracción específica de la secuencia, tal como un ARN guía, que se dirige al material genómico viral para su destrucción por la nucleasa y no al genoma de la célula huésped. Se puede utilizar una nucleasa CRISPR/Cas y un ARN guía (ARNg) que, en conjunto, se dirigen y editan o destruyen de forma selectiva el material genómico viral. Las CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) son un elemento natural del sistema inmunológico bacteriano que protege a las bacterias de la infección por fagos. El ARN guía localiza el complejo CRISPR/Cas en una secuencia diana viral. La unión del complejo localiza la endonucleasa Cas en la secuencia diana genómica viral provocando rompimientos en el genoma viral. Se pueden usar otros sistemas de nucleasas que incluyen, por ejemplo, nucleasas de dedos de zinc, nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), meganucleasas o cualquier otro sistema que pueda usarse para degradar o interferir con el ácido nucleico viral sin interferir con la función regular del material genético del huésped.
Las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para dirigirse al ácido nucleico viral en cualquier forma o en cualquier etapa del ciclo de vida viral. El ácido nucleico viral diana puede estar presente en la célula huésped como partículas independientes. En una realización preferida, la infección viral está latente y el ácido nucleico viral está integrado en el genoma del huésped. Cualquier ácido nucleico viral adecuado puede dirigirse para la escisión y la digestión.
Sistemas CRISPR/Cas: el sistema CRISPR-Cas incluye un complejo de edición de genes que comprende una nucleasa asociada a CRISPR, por ejemplo, Cas9, y un ARN guía complementario a una secuencia diana situada en una cadena de ADN, tal como una secuencia diana en ADN proviral integrado en un genoma de mamífero. En la Figura 1A se muestra un ejemplo de un complejo de edición de genes. El complejo de edición de genes puede escindir el ADN dentro de la secuencia objetivo. Esta escisión puede, a su vez, provocar la introducción de diversas mutaciones en el ADN proviral, lo que da como resultado la inactivación del provirus del VIH. El mecanismo por el cual tales mutaciones inactivan el provirus puede variar. Por ejemplo, la mutación puede afectar la replicación proviral y la expresión de genes virales. Las mutaciones pueden estar localizadas en secuencias reguladoras o secuencias de genes estructurales y dar como resultado una producción defectuosa del VIH. La mutación puede comprender una eliminación. El tamaño de la eliminación puede variar desde un único par de bases de nucleótidos hasta aproximadamente 10.000 pares de bases. En algunas realizaciones, la eliminación puede incluir toda o sustancialmente toda la secuencia de ácido nucleico integrada del VIH. En algunas realizaciones, la eliminación puede incluir la secuencia de ácido nucleico integrada completa del VIH. La mutación puede comprender una inserción, es decir, la adición de uno o más pares de bases de nucleótidos a la secuencia pro-viral. El tamaño de la secuencia insertada también puede variar, por ejemplo, desde aproximadamente un par de bases hasta aproximadamente 300 pares de bases de nucleótidos. La mutación puede comprender una mutación puntual, es decir, la sustitución de un solo nucleótido por otro nucleótido. Las mutaciones puntuales útiles son aquellas que tienen consecuencias funcionales, por ejemplo, mutaciones que dan como resultado la conversión de un codón de aminoácido en un codón de terminación o que dan como resultado la producción de una proteína no funcional.
En general, las proteínas CRISPR/Cas comprenden al menos un dominio de reconocimiento de ARN y/o unión de ARN. Los dominios de reconocimiento de ARN y/o unión de ARN interactúan con los ARN guía. Las proteínas CRISPR/Cas también pueden comprender dominios de nucleasa (es decir, dominios DNasa o RNasa), dominios de unión a ADN, dominios de helicasa, dominios de RNasa, dominios de interacción proteína-proteína, dominios de dimerización, así como otros dominios.
En realizaciones, la proteína similar a CRISPR/Cas puede ser una proteína CRISPR/Cas de tipo silvestre, una proteína CRISPR/Cas modificada o un fragmento de una proteína CRISPR/Cas de tipo silvestre o modificada. La proteína similar a CRISPR/Cas se puede modificar para aumentar la afinidad y/o especificidad de unión del ácido nucleico, alterar una actividad enzimática y/o cambiar otra propiedad de la proteína. Por ejemplo, los dominios de nucleasa (es decir, DNasa, RNasa) de la proteína similar a CRISPR/Cas se pueden modificar, eliminar o inactivar. Alternativamente, la proteína similar a CRISPR/Cas se puede truncar para eliminar los dominios que no son esenciales para la función de la proteína de fusión. La proteína similar a CRISPR/Cas también se puede truncar o modificar para optimizar la actividad del dominio efector de la proteína de fusión.
En las realizaciones, el sistema CRISPR/Cas puede ser un sistema de tipo I, de tipo II o de tipo III. Los ejemplos no limitantes de proteínas CRISPR/Cas adecuadas incluyen Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (o CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH , Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (o CasA), Cse2 (o CasB), Cse3 (o CasE), Cse4 (o CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 y Cu1966.
En una realización, la endonucleasa guiada por ARN se deriva de un sistema CRISPR/Cas de tipo II. En otras realizaciones, la endonucleasa guiada por ARN se deriva de una proteína Cas9. La proteína Cas9 puede ser de Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa,Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, o Acaryochloris marina.
En algunas realizaciones, la proteína similar a CRISPR/Cas puede derivarse de una proteína Cas9 de tipo silvestre o un fragmento de la misma. En otras realizaciones, la proteína similar a CRISPR/Cas puede derivarse de la proteína Cas9 modificada. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína Cas9 se puede modificar para alterar una o más propiedades (por ejemplo, actividad de nucleasa, afinidad, estabilidad, etc.) de la proteína. Alternativamente, los dominios de la proteína Cas9 que no participan en la escisión guiada por ARN pueden eliminarse de la proteína de manera que la proteína Cas9 modificada sea más pequeña que la proteína Cas9 de tipo silvestre.
Un ejemplo de endonucleasa asociada a CRISPR y preferida es una nucleasa Cas9. La nucleasa Cas9 puede tener una secuencia de nucleótidos idéntica a la secuencia de Streptococcus pyogenes de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la endonucleasa asociada a CRISPR puede ser una secuencia de otras especies, por ejemplo, otras especies de Streptococcus, tales como thermophilus; Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli u otros genomas de bacterias secuenciados y arqueas, u otros microorganismos procariotas. Alternativamente, se puede modificar la secuencia de Cas9 de Streptococcus pyogenes de tipo silvestre. La secuencia de ácido nucleico puede optimizarse por codones para una expresión eficaz en células de mamífero, es decir, "humanizada". Una secuencia de nucleasa Cas9 humanizada puede ser, por ejemplo, la secuencia de nucleasa Cas9 codificada por cualquiera de los vectores de expresión enumerados en los números de acceso del GenBank KM099231.1 GI: 669193757; KM099232.1 GI: 669193761; o KM099233.1 GI: 669193765. Alternativamente, la secuencia de nucleasa Cas9 puede ser, por ejemplo, la secuencia contenida en un vector disponible comercialmente tal como PX330 o PX260 de Addgene (Cambridge, MA). En algunas realizaciones, la endonucleasa Cas9 puede tener una secuencia de aminoácidos que es una variante o un fragmento de cualquiera de las secuencias de endonucleasa Cas9 de los números de acceso del GenBank KM099231.1 GI: 669193757; KM099232.1 GI: 669193761; o KM099233.1 GI: 669193765 o secuencia de aminoácidos de Cas9 de PX330 o PX260 (Addgene, Cambridge, MA). La secuencia de nucleótidos de Cas9 se puede modificar para codificar variantes biológicamente activas de Cas9, y estas variantes pueden tener o pueden incluir, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que difiere de una Cas9 de tipo silvestre en virtud de contener una o más mutaciones (por ejemplo, una adición, eliminación o sustitución de mutación o una combinación de tales mutaciones). Una o más de las mutaciones de sustitución pueden ser una sustitución (por ejemplo, una sustitución conservadora de aminoácidos). Por ejemplo, una variante biológicamente activa de un polipéptido Cas9 puede tener una secuencia de aminoácidos con al menos o aproximadamente un 50% de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos o aproximadamente un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% , 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia) con un polipéptido Cas9 de tipo silvestre. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen típicamente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina, glutamina, serina y treonina; lisina, histidina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Los residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de Cas9 pueden ser residuos de aminoácidos de origen no natural. Los residuos de aminoácidos de origen natural incluyen los codificados naturalmente por el código genético así como los aminoácidos no estándar (por ejemplo, aminoácidos que tienen la configuración D en lugar de la configuración L). Los presentes péptidos también pueden incluir residuos de aminoácidos que son versiones modificadas de residuos estándar (por ejemplo, se puede usar pirrolisina en lugar de lisina y se puede usar selenocisteína en lugar de cisteína). Los residuos de aminoácidos de origen no natural son aquellos que no se han encontrado en la naturaleza, pero que se ajustan a la fórmula básica de un aminoácido y pueden incorporarse en un péptido. Estos incluyen ácido D-aloisoleucina (2R, 3S)-2-amino-3-metilpentanoico y ácido L-ciclopentilglicina (S)-2-amino-2-ciclopentil acético. Para ver otros ejemplos, se pueden consultar libros de texto o la web mundial (un sitio mantenido actualmente por el Instituto de Tecnología de California muestra estructuras de aminoácidos no naturales que se han incorporado con éxito en proteínas funcionales).
La secuencia de nucleasa Cas9 puede ser una secuencia mutada. Por ejemplo, la nucleasa Cas9 se puede mutar en los dominios HNH y RuvC conservados, que están implicados en la escisión específica de la cadena. Por ejemplo, una mutación de aspartato por alanina (D10A) en el dominio catalítico de RuvC permite que el mutante de la nickasa Cas9 (Cas9n) corte en lugar de escindir el ADN para producir roturas de una sola cadena, y la reparación preferencial posterior a través de HDR puede potencialmente disminuir la frecuencia de mutaciones de inserción/eliminación no deseadas de rompimientos de doble cadena fuera del objetivo.
La presente invención incorpora varios avances sobre el sistema Cas9/ARNg descrito en Hu, et al, PNAS 2014, 111: 114616. En los experimentos descritos en los Ejemplos, se identificaron secuencias diana adicionales altamente específicas tanto dentro del LTR del VIH-1 como dentro de los genes estructurales del VIH-1. Estas secuencias diana (también denominadas "sitios" diana), fueron editadas eficazmente por Cas9/ARNg, provocando la inactivación de la expresión génica viral y la replicación en células de mamíferos infectadas de forma latente. Se descubrió que algunas de estos constructos adicionales de Cas9/ARNg, y combinaciones de los mismas, provocan la escisión de todo o parte del ADN proviral del VIH integrado del genoma de la célula huésped. Los pares de constructos con un miembro dirigido hacia un sitio diana de LTR, y el otro miembro hacia un sitio diana de un gen estructural, fueron particularmente efectivos para producir la escisión o erradicación del genoma del VIH. Esta es la primera demostración de que un ataque combinado en un sitio de LTR y un gen estructural puede producir la escisión del tramo intermedio del ADN del VIH integrado. Por lo tanto, la presente invención amplía enormemente el espectro de composiciones de Cas9/ARNg que están disponibles para dirigir el ADN integrado del VIH en las células huésped.
Por consiguiente, la divulgación presenta composiciones para su uso en la inactivación de un ADN proviral integrado en una célula huésped, que incluye una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa asociada a CRISPR y una o más secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican uno o más ARNg complementarios a una secuencia diana en el VIH u otro retrovirus.
Un ARNg incluye un ARNcr maduro que contiene aproximadamente 20 pares de bases (pb) de secuencia diana única (llamada espaciador) y un ARN pequeño activado en trans (ARNcrtra) que sirve como guía para el procesamiento asistido por ribonucleasa III de pre-ARNcr. El dúplex ARNcr:ARNcrtra dirige a Cas9 al ADN objetivo a través del emparejamiento de bases complementarias entre el espaciador en el ARNcr y la secuencia complementaria (llamada protoespaciador) en el ADN objetivo. Cas9 reconoce un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) de trinucleótidos (NGG) para especificar el sitio de corte (el tercer nucleótido de pA m ). En la presente invención, el ARNcr y ARNcrtra se pueden expresar por separado o modificarse en un ARNg de fusión artificial a través de un bucle de tallo sintético (AGAAAU) para imitar el dúplex de ARNr/ARNcrtra natural. Dicho ARNg se puede sintetizar o transcribir in vitro para la transfección directa de a Rn o se puede expresar a partir del vector de expresión de ARN promovido por U6 o HI.
En las composiciones de la presente divulgación, cada ARNg incluye una secuencia que es complementaria a una secuencia diana en un retrovirus. El ejemplo de retrovirus diana es el VIH, pero las composiciones de la presente invención también son útiles para dirigirse a otros retrovirus, tales como el VIH-2 y el virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS)-1.
Algunos de los ejemplos de ARNg de la presente divulgación son complementarios a las secuencias diana en las regiones de repetición terminal larga (LTR) del VIH. Las LTR se subdividen en regiones U3, R y U5. La configuración de las regiones U1, R, U5 del VIH-1 se muestra en la Figura 3A. Las LTR contienen todas las señales necesarias para la expresión génica y están implicadas en la integración de un provirus en el genoma de una célula huésped. Por ejemplo, el promotor basal o central, un potenciador central y una región moduladora se encuentran dentro de U3 mientras que el elemento de respuesta de transactivación se encuentra dentro de R. En el VIH-1, la región U5 incluye varias subregiones, por ejemplo, TAR o elemento de respuesta que actúa en trans, que está involucrado en la activación transcripcional; Poli A, que participa en la dimerización y el empaquetamiento del genoma; PBS o sitio de unión del cebador; Psi o la señal de empaquetamiento; DIS o sitio de iniciación del dímero. Por consiguiente, en algunas realizaciones una secuencia diana de ARNg comprende una o más secuencias diana en una región de LTR de un ADN proviral del VIH y una o más dianas en un gen estructural y/o gen no estructural del ADN proviral del VIH. En otras realizaciones, una secuencia diana de ARNg comprende una o más secuencias diana en una región de LTR de un ADN proviral del VIH y una o más dianas en un gen estructural. En otra realización, una secuencia diana de ARNg comprende una o más secuencias diana en una región de LTR de un ADN proviral del VIH y una o más dianas en un gen no estructural del ADN proviral del VIH. En los casos descritos en el presente documento, una secuencia diana de ARNg comprende una o más secuencias diana en un gen estructural proviral del VIH y una o más dianas en un gen no estructural del ADN proviral del VIH. En otro caso más descrito en el presente documento, una secuencia diana de ARNg comprende una o más secuencias diana en un gen no codificante proviral del VIH y una o más dianas en un gen codificante del ADN proviral del VIH. En otro caso más descrito en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico diana de ARNg comprende una o más secuencias de ácido nucleico diana en un primer gen y una o más secuencias de ácido nucleico diana en un segundo gen; o, una o más secuencias de ácido nucleico diana en un primer gen y una o más secuencias de ácido nucleico diana en un tercer gen; o, una o más secuencias de ácido nucleico diana en un primer gen y una o más secuencias de ácido nucleico diana en un segundo gen y una o más secuencias de ácido nucleico diana en un tercer gen; o, una o más secuencias de ácido nucleico diana en un segundo gen y una o más secuencias de ácido nucleico diana en un tercer gen o cuarto gen; o cualquier combinación de los mismos. Como puede verse, se puede usar cualquier combinación de secuencias de ácido nucleico diana y sólo están limitadas por la imaginación de un experto en la técnica.
En los resultados experimentales descritos en los Ejemplos, se encontró que ciertas secuencias dentro de las regiones U3, R y U5 de la LTR eran secuencias diana útiles. Los ARNg complementarios a estas secuencias diana se indican en las Figuras 1D y 3A del Ejemplo 2, Figura 11A del Ejemplo 3 y Tabla 1 del Ejemplo 4. Incluyen LTR 1, LTR 2, LTR 3, LTR A, LTR B, LTR B' , LTR C, LTR D, LTR E, LTR F, LTR G, LTR H, LTR I, LTR J, LTR K, LTR L, LTR M, LTR N, LTR O, LTR P, LTR Q, LTR R, LTR S y LTR T. Las secuencias de estos ARNg se muestran en las Figuras 11A, 12A, 12B y 12C. Las composiciones de la presente invención incluyen estos ejemplos de ARNg, pero no se limitan a ellos, y pueden incluir ARNg complementarios a cualquier sitio diana adecuado en las LTR del VIH.
Algunos de los ejemplos de ARNg de la presente invención se dirigen a secuencias en el genoma que codifica la proteína del VIH. Se encontró que las secuencias dentro del gen que codifica la proteína estructural gag son secuencias diana útiles. Los ARNg complementarios a estas secuencias diana incluyen Gag A, Gag B, Gag C y Gag D. Sus sitios diana en el genoma del VIH-1 se indican en la Figura 3A, y sus secuencias de ácido nucleico se muestran en la Tabla 1. Las secuencias diana útiles se encontraron también dentro del gen que codifica la proteína estructural pol. Los ARNg complementarios a estas secuencias diana incluyen Pol A y Pol B. Sus sitios diana en el genoma del VIH-1 se indican en la Figura 3A, y sus secuencias de ácido nucleico se muestran en la Tabla 1. Secuencias para los ARNg complementarios a los sitios diana en la proteína env de la envoltura del VIH-1 también se muestran en la Tabla 1.
Por consiguiente, las composiciones de la presente divulgación incluyen estos ejemplos de ARNg, pero no se limitan a ellos, y pueden incluir ARNg complementarios a cualquier sitio diana adecuado en los genes que codifican proteínas del VIH, incluidos, entre otros, los que codifican la proteína estructural tat, y las proteínas accesorias vif, nef (factor negativo), vpu (proteína viral U), vpr y tev.
Las secuencias de ARN guía de acuerdo con la presente invención pueden ser secuencias sentido o antisentido. La secuencia de ARN guía generalmente incluye un motivo adyacente proto espaciador (PAM). La secuencia de PAM puede variar dependiendo de los requisitos de especificidad de la endonucleasa CRISPR utilizada. En el sistema CRISPR-Cas derivado de S. pyogenes, el ADN diana típicamente precede inmediatamente a un motivo adyacente proto espaciador (PAM) 5'-NGG. Por lo tanto, para Cas9 de S. pyogenes, la secuencia de PAM puede ser AGG, TGG, CGG o GGG. Otros ortólogos de Cas9 pueden tener diferentes especificidades de PAM. Por ejemplo, Cas9 de S. thermophilus requiere 5-NNAGAA para CRISPR 1 y 5-NGGNG para CRISPR3 y Neisseria meningitidis requiere 5'-NNNNGATT. La secuencia específica del ARN guía puede variar, pero, independientemente de la secuencia, las secuencias de ARN guía útiles serán aquellas que minimicen los efectos fuera del objetivo mientras logran una alta eficiencia y ablación completa del retrovirus genómicamente integrado, por ejemplo el VIH. La longitud de la secuencia de ARN guía puede variar de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 o más nucleótidos, por ejemplo aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60 o más nucleótidos. Los métodos de selección útiles identifican regiones que tienen una homología extremadamente baja entre el genoma viral extraño y el genoma celular del huésped, incluido el ADN retroviral endógeno, incluyen el cribado bioinformático utilizando criterios de selección de diana de 12-pb NGG para excluir el transcriptoma humano fuera del objetivo o (incluso en raras ocasiones) sitios genómicos sin traducir; evitar los sitios de unión del factor de transcripción dentro del promotor de LTR del VIH (potencialmente conservado en el genoma del huésped); y WGS, secuenciación de Sanger y ensayo SURVEYOR, para identificar y excluir posibles efectos fuera del objetivo.
La secuencia de ARN guía puede configurarse como una secuencia única o como una combinación de una o más secuencias diferentes, por ejemplo, una configuración multiplex. Las configuraciones multiplex pueden incluir combinaciones de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más ARN guía diferentes.
En los experimentos descritos en los Ejemplos 2 y 3, se encontró que las combinaciones de ARNg eran especialmente efectivas cuando se expresaban de forma multiplex, es decir, simultáneamente en la misma célula. En muchos casos, las combinaciones produjeron la escisión del provirus del VIH que se extendía entre los sitios diana. Las escisiones son atribuibles a eliminaciones de secuencias entre las escisiones inducidas por Cas9 en cada uno de los múltiples sitios diana. Estos pares de combinaciones de ARNg, siendo un miembro complementario a un sitio diana en una LTR del retrovirus, y el otro miembro es complementario a un ARNg complementario a un sitio diana en un gen estructural del retrovirus. Los ejemplos de combinaciones eficaces incluyen Gag D combinado con una de LTR 1, LTR 2, LTR 3, LTR A, LTR B, LTR C, LTR D, LTR E, LTR F, LTR G; LTR H, LTR I, LTR J, LTR K, LTR L, LTR M; LTR N, LTR O, LTR P, LTR Q, LTR R, LTR S o LTR T. Los ejemplos de combinaciones eficaces también incluyen LTR 3 combinada con una de LTR-1, Gag A; Gag B; Gag C, Gag D, Pol A o Pol B.
Las combinaciones de LTR A y LTR B' también provocaron la escisión de segmentos del genoma del VIH-1, como se muestra en el Ejemplo 3. Las composiciones de la presente invención no se limitan a estas combinaciones, sino que incluyen cualquier combinación adecuada de ARNg complementaria a dos o más sitios diana diferentes en el provirus del VIH-1.
En ciertos casos, una secuencia de ácido nucleico diana comprende una o más secuencias de ácido nucleico en secuencias de ácido nucleico codificantes y no codificantes del genoma retroviral. La secuencia de ácido nucleico diana se puede ubicar dentro de una secuencia que codifica proteínas estructurales, proteínas no estructurales o combinaciones de las mismas. Las secuencias que codifican proteínas estructurales comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican: Gag, precursor de Gag-Pol, Pro (proteasa), transcriptasa inversa (RT), integrasa (In), Env o combinaciones de las mismos. Las secuencias que codifican proteínas no estructurales comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican: proteínas reguladoras, por ejemplo, Tat, Rev, proteínas accesorias, por ejemplo, Nef, Vpr, Vpu, Vif o combinaciones de los mismas.
En determinadas realizaciones, una secuencia de ARNg tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico diana complementarias que codifican Gag, precursor de Gag-Pol, Pro, transcriptasa inversa (RT), integrasa (In), Env, Tat, Rev, Nef, Vpr, Vpu, Vif o combinaciones de las mismas.
En determinadas realizaciones, una secuencia de ARNg es complementaria a las secuencias de ácido nucleico diana que codifican Gag, precursor de Gag-Pol, Pro, transcriptasa inversa (RT), integrasa (In), Env, Tat, Rev, Nef, Vpr, Vpu, Vif o combinaciones de los mismas.
En otras realizaciones, las secuencias de ácido nucleico de ARNg tienen al menos un 75% de identidad de secuencia con las secuencias que comprenden: las SEQ ID NOS: 1-52, o cualquier combinación de las mismas. En otras realizaciones, una secuencia de ácido nucleico de ARNg comprende las SEQ ID NOS: 1-52.
En otra realización, una secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con las secuencias que comprenden: las SEQ ID NOS: 1-52, o cualquier combinación de las mismas. En otras realizaciones, una secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia establecida como las SEQ ID NOS: 1-52.
En otras realizaciones, una composición para su uso en la inactivación del ADN retroviral integrado en el genoma de una célula huésped infectada de forma latente con un retrovirus, comprende una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa asociada a la repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) y al menos un ARN guía (ARNg), siendo el ARNg complementario a una secuencia diana en el ADN retroviral integrado, en el que el retrovirus es un virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Al menos un ARNg incluye al menos un primer ARNg que es complementario a una secuencia diana en el ADN retroviral integrado; y un segundo ARNg que es complementario a otra secuencia diana en el ADN retroviral integrado, mediante el cual se eliminan las secuencias intermedias entre los dos ARNg.
Una secuencia de ácido nucleico diana descrita en el presente documento puede comprender una o más secuencias en una región de repetición terminal larga (LTR) de un ADN proviral del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y una o más dianas en un gen estructural y/o no estructural del ADN integrado del VIH; o una o más dianas en un segundo gen; o, una o más dianas en un primer gen y una o más dianas en un segundo gen; o, una o más dianas en un primer gen y una o más dianas en un segundo gen y una o más dianas en un tercer gen; o, una o más dianas en un segundo gen y una o más dianas en un tercer gen o cuarto gen; o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, una composición para erradicar un retrovirus in vitro o in vivo, comprende una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa asociada a la repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) y al menos un ARN guía (ARNg), siendo el ARNg complementario a una secuencia diana en un genoma retroviral, en el que el retrovirus es un virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Al menos un ARNg incluye al menos un primer ARNg que es complementario a una secuencia diana en un genoma del VIH; y un segundo ARNg que es complementario a otra secuencia diana en el genoma del VIH, mediante el cual se eliminan las secuencias intermedias entre los dos ARNg.
En otra realización, una composición comprende una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa asociada con repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) y al menos dos ARN guía (ARNg), siendo cada uno de los ARNg complementario a diferentes secuencias diana en un genoma retroviral, en el que el retrovirus es un virus de inmunodeficiencia humana (VIH). En realizaciones, al menos un ARN guía (ARNg) incluye al menos un primer ARNg que es complementario a una secuencia diana en un genoma del VIH; y un segundo ARNg que es complementario a otra secuencia diana en el genoma del VIH, mediante el cual se eliminan las secuencias intermedias entre los dos ARNg.
En determinadas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico diana comprende una o más secuencias de ácido nucleico en secuencias de ácido nucleico codificantes y no codificantes del genoma retroviral. La secuencia de ácido nucleico diana se puede ubicar dentro de una secuencia que codifica proteínas estructurales, proteínas no estructurales o combinaciones de las mismas. Las secuencias que codifican proteínas estructurales comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican: Gag, precursor de Gag-Pol, Pro (proteasa), transcriptasa inversa (RT), integrasa (In), Env o combinaciones de las mismos. Las secuencias que codifican proteínas no estructurales comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican: proteínas reguladoras, por ejemplo, Tat, Rev, proteínas accesorias, por ejemplo, Nef, Vpr, Vpu, Vif o combinaciones de las mismos.
En determinadas realizaciones, una secuencia de ARNg tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico diana complementarias que codifican Gag, precursor de Gag-Pol, Pro, transcriptasa inversa (RT), integrasa (In), Env, Tat, Rev, Nef, Vpr, Vpu, Vif o combinaciones de las mismas.
En determinadas realizaciones, una secuencia de ARNg es complementaria a las secuencias de ácido nucleico diana que codifican Gag, precursor de Gag-Pol, Pro, transcriptasa inversa (RT), integrasa (In), Env, Tat, Rev, Nef, Vpr, Vpu, Vif o combinaciones de las mismas.
En otras realizaciones, las secuencias de ácido nucleico de ARNg tienen al menos un 75% de identidad de secuencia con las secuencias que comprenden: las SEQ ID NOS: 1-52, o cualquier combinación de las mismas. En otras realizaciones, una secuencia de ácido nucleico de ARNg comprende las SEQ ID NOS: 1-52.
Por consiguiente, la presente invención también incluye un método in vitro para inactivar un ADN proviral integrado en el genoma de una célula huésped infectada de forma latente con un retrovirus, incluyendo el método las etapas de tratar la célula huésped con una composición que comprende una endonucleasa asociada a CRISPR y al menos un ARNg complementario a un sitio diana en el a Dn proviral; expresar un complejo de edición de genes que incluye la endonucleasa asociada a CRISPR y al menos un ARNg; e inactivar el ADN proviral. Se prefieren los ARNg y las endonucleasas Cas9 enumeradas anteriormente. En otra realización preferida, la etapa de tratar la célula huésped in vitro incluye el tratamiento con al menos dos ARNg, en el que cada uno de los al menos dos ARNg son complementarios a una secuencia de ácido nucleico diana diferente en el ADN proviral. Son especialmente preferidas las combinaciones de al menos dos ARNg, incluidas las composiciones en las que al menos un ARNg es complementario a un sitio diana en una LTR del retrovirus, y al menos un ARNg es complementario a un sitio diana en un gen estructural del retrovirus. El VIH es el retrovirus preferido.
En otra realización, una composición para erradicar un retrovirus in vitro o in vivo, comprende una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa asociada a la repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) y al menos un ARN guía (ARNg), siendo el ARNg complementario a una secuencia diana en un genoma retroviral, en el que el retrovirus es un virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y el ARNg incluye al menos un primer ARNg que es complementario a una secuencia diana en un genoma del VIH; y un segundo ARNg que es complementario a otra secuencia diana en el genoma del VIH, mediante el cual se eliminan las secuencias intermedias entre los dos ARNg. Las secuencias de ácidos nucleicos diana comprenden una o más secuencias de ácidos nucleicos en secuencias de ácidos nucleicos codificantes y no codificantes del genoma del VIH. Las secuencias diana comprenden secuencias de ácido nucleico en el genoma del VIH que comprenden: secuencias de ácido nucleico de repetición terminal larga (LTR) y secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas estructurales o proteínas no estructurales. En determinadas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas estructurales comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican: Gag, precursor de Gag-Pol, Pro (proteasa), transcriptasa inversa (RT), integrasa (In), Env o combinaciones de las mismas. En realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas no estructurales comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican: proteínas reguladoras, proteínas accesorias o combinaciones de las mismas. Los ejemplos de proteínas reguladoras incluyen: Tat, Rev o combinaciones de las mismas. Los ejemplos de proteínas accesorias comprenden Nef, Vpr, Vpu, Vif o combinaciones de las mismas. En ciertas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico de ARNg comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos 75% con las SEQ ID NOS: 1-52. En ciertas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico de ARNg comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende las SEQ ID NOS: 1-52 .
En determinadas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una endonucleasa asociada a repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) y al menos un ARN guía (ARNg), siendo el ARNg complementario a una secuencia de ácido nucleico diana en un genoma de retrovirus, por ejemplo VIH.
Cuando las composiciones se administran como un ácido nucleico o están contenidas dentro de un vector de expresión, la endonucleasa CRISPR puede estar codificada por el mismo ácido nucleico o vector que las secuencias de ARN guía. Alternativamente, o además, la endonucleasa CRISPR se puede codificar en un ácido nucleico físicamente separado de las secuencias de ARNg o en un vector separado.
Secuencias de ácido nucleico modificadas o mutadas: en algunas realizaciones, cualquiera de las secuencias de ácido nucleico incorporadas en el presente documento puede modificarse o derivarse de una secuencia de ácido nucleico nativa, por ejemplo, mediante la introducción de mutaciones, eliminaciones, sustituciones, modificación de nucleobases, cadenas principales y similares. Las secuencias de ácido nucleico incluyen los vectores, agentes de edición de genes, ARNg, ARNcrtra, etc. Los ejemplos de algunas secuencias de ácido nucleico modificadas previstas para esta invención incluyen aquellas que comprenden cadenas principales modificadas, por ejemplo, fosforotioatos, fosfotriésteres, metilfosfonatos, enlaces entre azúcares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, o enlaces entre azúcares heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden aquellos con cadenas principales de fosforotioato y aquellos con cadenas principales de heteroátomos, CH2-NH-O-CH2, CH,-N(CH3)-OnCH2 [conocido como una cadena principal de metileno (metilimino) o MMI], cadenas principales de CH2-O-N-(CH3)-CH2 , CH2-N-(CH3)-N-(CH3)-CH2 y O-N-(CH3)-CH2-CH2 , en las que la cadena principal nativa de fosfodiéster se representa como O-P-O-CH,). Las cadenas principales de amida descritas por De Mesmaeker et al., Acc. Chem. Res. 1995, 28: 366-374) también se incorporan en el presente documento. En algunas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que tienen estructuras de cadena principal de morfolino (Summerton y Weller, patente de Estados Unidos No. 5.034.506), cadena principal de ácido nucleico peptídico (ANP) en la que la cadena principal de fosfodiéster del oligonucleótido se reemplaza con una cadena principal de poliamida, estando unidas las nucleobases directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la cadena principal de poliamida (Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497). Las secuencias de ácido nucleico también pueden comprender una o más fracciones de azúcar sustituidas. Las secuencias de ácido nucleico también pueden tener miméticos de azúcar tales como ciclobutilos en lugar del grupo pentofuranosilo.
Las secuencias de ácido nucleico también pueden incluir, adicional o alternativamente, modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo denominadas en la técnica simplemente como "base"). Como se usa en este documento, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen las nucleobases que se encuentran solo con poca frecuencia o de manera transitoria en ácidos nucleicos naturales, por ejemplo, hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me pirimidinas, particularmente 5-metilcitosina (también conocida como 5-metil-2'desoxicitosina y a menudo denominada en la técnica como 5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), glicosil HMC y gentobiosil HMC, así como nucleobases sintéticas, por ejemplo, 2-aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazolilalquil)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina u otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina, 7-deazaguanina, N6 (6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina. Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, páginas. 75-77; Gebeyehu, G. et al., Nucl. Acids Res. 1987, 15: 4513). Puede incluirse una base "universal" conocida en la técnica, por ejemplo, inosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-Me-C aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C. (Sanghvi, Y. S., en Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, páginas 276-278).
Otra modificación de las secuencias de ácido nucleico de la invención implica unir químicamente a las secuencias de ácido nucleico una o más fracciones o conjugados que potencian la actividad o captación celular del oligonucleótido. Dichas fracciones incluyen, pero no se limitan a, fracciones de lípidos tales como una fracción de colesterol, una fracción de colesterilo (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let. 1994, 4, 1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. NY Acad. Sci.
1992, 660, 306; Manoharan y col. Bioorg. Med. Chem Let. 1993, 3, 2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res. 1992, 20, 533), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J. 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett. 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie 1993, 75, 49), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o fosfonato de 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res. 1990, 18, 3777), una cadena de poliamina o de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides 1995, 14, 969), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651).
No es necesario que todas las posiciones en una secuencia de ácido nucleico dada que se modifiquen uniformemente y, de hecho, más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente se pueden incorporar en una sola secuencia de ácido nucleico o incluso dentro de un solo nucleósido dentro de una secuencia de ácido nucleico.
En algunas realizaciones, las moléculas de ARN, por ejemplo, El ARNcr, ARNcrtra, ARNg se diseñan para que comprendan una o más nucleobases modificadas. Por ejemplo, se pueden encontrar modificaciones conocidas de moléculas de ARN, por ejemplo, en Genes VI, Capítulo 9 ("Interpreting the Genetic Code"), Lewis, ed. (1997, Oxford University Press, Nueva York), y Modification and Editing of RNA, Grosjean y Benne, eds. (1998, ASM Press, Washington DC). Los componentes de ARN modificado incluyen los siguientes: 2'-O-metilcitidina; N4-metilcitidina; N4 -2'-O-dimetilcitidina; N4-acetilcitidina; 5-metilcitidina; 5,2'-O-dimetilcitidina; 5-hidroximetilcitidina; 5-formilcitidina; 2'-O-metil-5-formailcitidina; 3-metilcitidina; 2-tiocitidina; lisidina; 2'-O-metiluridina; 2-tiouridina; 2-tio-2'-O-metiluridina; 3,2'-O-dimetiluridina; 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 4-tiouridina; ribosiltimina; 5,2'-O-dimetiluridina; 5-metil-2-tiouridina; 5-hidroxiuridina; 5-metoxiuridina; ácido uridina 5-oxiacético; éster metílico del ácido uridina 5-oxiacético; 5-carboximetiluridina; 5-metoxicarbonilmetiluridina; 5- metoxicarbonilmetil-2'-O-metiluridina; 5-metoxicarbonilmetil-2'-tiouridina; 5-carbamoilmetiluridina; 5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina; 5-(carboxihidroximetil)uridina; Éster 5-(carboxihidroximetil)uridinmetílico; 5-aminometil-2-tiouridina; 5-metilaminometiluridina; 5-metilaminometil-2-tiouridina; 5-metilaminometil-2-selenouridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5-carboximetilaminometil-2'-O-metiluridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; dihidrouridina; dihidroribosiltimina; 2'-metiladenosina; 2-metiladenosina; N6Nmetiladenosina; N6,N6-dimetiladenosina; N6,2'-O-trimetiladenosina; 2-metiltio-N6-n-isopenteniladenosina; N6-(cishidroxiisopentenil)-adenosina; 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil)-adenosina; N6-glicinilcarbamoil)adenosina; N6-treonilcarbamoil-adenosina; N6-metil-N6-treonilcarbamoil-adenosina; 2-metiltio-N6-metil-N6-treonilcarbamoil adenosina; N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina; 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina; 2'-O-ribosiladenosina (fosfato); inosina; 2'-O-metil-inosina; 1-metilinosina; 1,2'-O-dimetil-inosina; 2'-O-metil-guanosina; 1-metil-guanosina; N2-metil-guanosina; N2 ,N2-dimetil-guanosina; N2,2'-O-dimetil-guanosina; N2,N2,2'-O-trimetil guanosina; 2'-O-ribosil-guanosina (fosfato); 7-metil-guanosina; N2,7-dimetilguanosina; N2,N2,7-trimetilguanosina; wyosina; metilwyosina; hidroxibutosina poco modificada; wybutosina; hidroxiwybutosina; peroxiwybutosina; queuosina; epoxiqueuosina; galactosil-queuosina; manosilqueuosina; 7-ciano-7-deazaguanosina; araqueosina [también llamada 7-formamido-7-deazaguanosina]; y 7-aminometil-7-deazaguanosina.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención se pueden producir mediante técnicas estándar. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para obtener un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento. Varios métodos de PCR se describen, por ejemplo, en PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach y Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Generalmente, la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá se emplea para diseñar cebadores de oligonucleótidos que sean idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas del molde que se va a amplificar. También están disponibles varias estrategias de PCR mediante las cuales se pueden introducir modificaciones de la secuencia de nucleótidos específicas del sitio en un ácido nucleico molde.
Los ácidos nucleicos aislados también se pueden sintetizar químicamente, ya sea como una única molécula de ácido nucleico (por ejemplo, usando síntesis de ADN automatizada en la dirección 3' a 5' usando tecnología de fosforamidita) o como una serie de oligonucleótidos. Por ejemplo, se pueden sintetizar uno o más pares de oligonucleótidos largos (por ejemplo, > 50-100 nucleótidos) que contienen la secuencia deseada, y cada par contiene un segmento corto de complementariedad (por ejemplo, aproximadamente 15 nucleótidos) de modo que se forma un dúplex cuando se hibrida el par de oligonucleótidos. La ADN polimerasa se usa para extender los oligonucleótidos, lo que da como resultado una molécula de ácido nucleico bicatenaria sencilla por par de oligonucleótidos, que luego se puede ligar en un vector.
La presente invención también incluye una composición farmacéutica para la inactivación de ADN del VIH proviral integrado en un sujeto mamífero. La composición incluye una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa Cas, y al menos una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica al menos un ARNg complementario a una secuencia diana en un ADN de VIH proviral; estando incluidas las secuencias de ácido nucleico aisladas en al menos un vector de expresión. En la invención, la composición farmacéutica incluye un primer ARNg y un segundo ARNg, con el primer ARNg dirigido a un sitio en la LTR del VIH y el segundo ARNg dirigido a un sitio en un gen estructural del VIH, como se define en las reivindicaciones.
Los ejemplos de vectores de expresión para su inclusión en la composición farmacéutica incluyen vectores plasmídicos y vectores lentivirales, pero la presente invención no se limita a estos vectores. Puede usarse una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión para expresar las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento. Los vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitación, plásmidos y vectores virales derivados de, por ejemplo, bacteriófagos, baculovirus y retrovirus. Numerosos vectores y sistemas de expresión están disponibles comercialmente a través de empresas como Novagen (Madison, WI), Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene (La Jolla, CA) e Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, CA). Un gen marcador puede conferir un fenotipo seleccionable a una célula huésped. Por ejemplo, un marcador puede conferir resistencia a biocidas, tal como resistencia a un antibiótico (por ejemplo, kanamicina, G418, bleomicina o higromicina). Un vector de expresión puede incluir una secuencia de etiqueta diseñada para facilitar la manipulación o detección (por ejemplo, purificación o localización) del polipéptido expresado. Las secuencias de etiqueta, tales como las secuencias de proteína verde fluorescente (GFP), la glutatión S-transferasa (GST), la polihistidina, c-myc, la hemaglutinina o de etiqueta FLAGMR (Kodak, New Haven, CT) se expresan típicamente como una fusión con el polipéptido codificado. Dichas etiquetas se pueden insertar en cualquier lugar dentro del polipéptido, incluso en el extremo carboxilo o amino.
El vector también puede incluir una región reguladora. El término "región reguladora" se refiere a secuencias de nucleótidos que influyen en el inicio y la velocidad de la transcripción o traducción, y la estabilidad y/o movilidad de un producto de transcripción o traducción. Las regiones reguladoras incluyen, sin limitación, secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta, sitios de reconocimiento de proteínas, elementos inducibles, secuencias de unión a proteínas, regiones no traducidas (UTR) 5' y 3', sitios de inicio de la transcripción, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, señales de localización nuclear e intrones.
Si se desea, los polinucleótidos de la invención también pueden usarse con un vehículo de microsuministro, tal como liposomas catiónicos y vectores adenovirales. Para una revisión de los procedimientos para la preparación de liposomas, direccionamiento y suministro de contenidos, véase Mannino y Gould-Fogerite, BioTechniques, 6: 682 (1988). Véase también Felgner y Holm, Bethesda Res. Laboratorio. Focus, 11 (2): 21 (1989) y Maurer, R.A., Bethesda Res. Laboratorio. Focus, 11 (2): 25 (1989).
Las composiciones de la presente invención provocan la supresión de la activación del VIH-1 proviral, o la escisión parcial o total del VIH-1 integrado (Ejemplos 2 y 3), se describe un método para tratar a un sujeto mamífero infectado con un retrovirus, por ejemplo, VIH. El método incluye las etapas de determinar que un sujeto mamífero está infectado con un retrovirus, administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica descrita anteriormente y tratar al sujeto mamífero para la infección por retrovirus.
El método representa una solución al problema del provirus integrado, una solución que es esencial para el tratamiento y la prevención del SIDA y otras enfermedades retrovirales. Durante la fase aguda de la infección por VIH, las partículas virales del VIH entran en las células que expresan las moléculas receptoras de CD4 apropiadas. Una vez que el virus ha entrado en la célula huésped, la transcriptasa inversa codificada por el VIH genera una copia del ADN proviral del ARN del VIH y el ADN proviral se integra en el ADN genómico de la célula huésped. Es este provirus del VIH el que es replicado por la célula huésped, lo que da como resultado la liberación de nuevos viriones del VIH que luego pueden infectar otras células.
La infección primaria por VIH cede en unas pocas semanas a unos pocos meses, y típicamente va seguida de un largo período clínico "latente" que puede durar hasta 10 años. Durante este período de latencia, no puede haber síntomas clínicos o replicación viral detectable en células mononucleares de sangre periférica y poco o ningún virus cultivable en sangre periférica. Sin embargo, el virus del VIH continúa reproduciéndose a niveles muy bajos. En sujetos que han sido tratados con terapias antirretrovirales, este período de latencia puede extenderse por varias décadas o más. La terapia antirretroviral no suprime los niveles bajos de expresión del genoma viral, ni se dirige eficazmente a las células infectadas de forma latente, tal como las células T de memoria en reposo, los macrófagos cerebrales, la microglía, los astrocitos y las células linfoides asociadas al intestino. Debido a que las composiciones de la presente invención pueden inactivar o eliminar el provirus del VIH, los métodos de tratamiento que emplean las composiciones constituyen una nueva vía de ataque contra la infección por VIH.
Las composiciones de la presente invención, cuando se expresan de forma estable en células huésped potenciales, reducen o previenen una nueva infección por retrovirus, por ejemplo, VIH-1 (Ejemplo 3). Por consiguiente, se describe un método de tratamiento para reducir el riesgo de una infección por retrovirus, por ejemplo, infección por VIH en un sujeto mamífero con riesgo de infección. El método incluye las etapas de determinar que un sujeto mamífero tiene riesgo de infección por VIH, administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica descrita anteriormente y reducir el riesgo de infección por VIH en el sujeto mamífero. Preferiblemente, la composición farmacéutica incluye un vector que proporciona una expresión estable y/o inducible de al menos uno de los enumerados anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden preparar de diversas formas conocidas por un experto en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos y los vectores descritos anteriormente se pueden formular en composiciones para su aplicación a células en cultivo de tejidos o para su administración a un paciente o sujeto. Estas composiciones se pueden preparar de una manera bien conocida en la técnica farmacéutica y se pueden administrar mediante una variedad de vías, dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser tópica (incluida la oftálmica y a las membranas mucosas, incluida la administración intranasal, vaginal y rectal), pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluso por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmico y transdérmico), ocular, oral o parenteral. Los métodos para la administración ocular pueden incluir administración tópica (gotas para los ojos), inyección subconjuntival, periocular o intravítrea o introducción mediante catéter de balón o inserciones oftálmicas colocadas quirúrgicamente en el saco conjuntival. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular. La administración parenteral puede ser en forma de una sola dosis en bolo, o puede ser, por ejemplo, mediante una bomba de perfusión continua. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos, polvos y similares. Los vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables.
Esta invención también incluye composiciones farmacéuticas que contienen, como ingrediente activo, ácidos nucleicos y vectores descritos en el presente documento, en combinación con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Como se usa en el presente documento, los términos "farmacéuticamente aceptable" (o "farmacológicamente aceptable") se refieren a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción adversa cuando se administran a un animal o un ser humano, según sea apropiado. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en este documento, incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos, isotónicos y retardadores de la absorción, tampones, excipientes, aglutinantes, lubricantes, geles, tensioactivos y similares que se pueden usar como medio para una sustancia farmacéuticamente aceptable. Al preparar las composiciones de la invención, el ingrediente activo se mezcla típicamente con un excipiente, se diluye con un excipiente o se encierra dentro de dicho vehículo en forma de, por ejemplo, una cápsula, comprimido, bolsita, papel u otro recipiente. Cuando el excipiente sirve como diluyente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido (por ejemplo, solución salina normal), que actúa como vehículo, portador o medio para el ingrediente activo. Así, las composiciones pueden estar en forma de comprimidos, píldoras, polvos, grageas, sobres, sellos, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un medio sólido o líquido), lociones, cremas, ungüentos, geles, cápsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, soluciones inyectables estériles y polvos envasados estériles. Como se conoce en la técnica, el tipo de diluyente puede variar dependiendo de la vía de administración pretendida. Las composiciones resultantes pueden incluir agentes adicionales, tales como conservantes. En algunas realizaciones, el portador puede ser, o puede incluir, un coloide basado en lípidos o polímero. En algunas realizaciones, el material portador puede ser un coloide formulado como un liposoma, un hidrogel, una micropartícula, una nanopartícula o una micela de copolímero de bloque. Como se señaló, el material portador puede formar una cápsula y ese material puede ser un coloide a base de polímero.
Las secuencias de ácido nucleico de la invención se pueden administrar a una célula apropiada de un sujeto. Esto se puede lograr mediante, por ejemplo, el uso de un vehículo de suministro de micropartículas o microcápsulas polimérico biodegradable, dimensionado para optimizar la fagocitosis por células fagocíticas tales como macrófagos. Por ejemplo, se pueden utilizar micropartículas de PLGA (polilacto-co-glicólido) de aproximadamente 1 a 10 pm de diámetro. El polinucleótido se encapsula en estas micropartículas, que son absorbidas por los macrófagos y gradualmente se biodegradan dentro de la célula, liberando así el polinucleótido. Una vez liberado, el ADN se expresa dentro de la célula. Un segundo tipo de micropartícula no está destinado a ser absorbido directamente por las células, sino que más bien sirve principalmente como un depósito de ácido nucleico de liberación lenta que es absorbido por las células solo después de la liberación de la micropartícula a través de la biodegradación. Por lo tanto, estas partículas poliméricas deberían ser lo suficientemente grandes para evitar la fagocitosis (es decir, mayores de 5 pm y preferiblemente mayores de 20 pm). Otra forma de lograr la absorción del ácido nucleico es utilizando liposomas, preparados mediante métodos estándar. Los ácidos nucleicos pueden incorporarse solos en estos vehículos de administración o incorporarse conjuntamente con anticuerpos específicos de tejido, por ejemplo, anticuerpos que se dirigen a tipos de células que son reservorios comunes de infección por VIH infectados de forma latente, por ejemplo, macrófagos cerebrales, microglía, astrocitos células linfoides asociadas al intestino. Alternativamente, se puede preparar un complejo molecular compuesto por un plásmido u otro vector unido a poli-L-lisina por fuerzas electrostáticas o covalentes. La poli-L-lisina se une a un ligando que puede unirse a un receptor en las células diana. La administración de "ADN desnudo" (es decir, sin un vehículo de administración) a un sitio intramuscular, intradérmico o subcutáneo, es otro medio para lograr la expresión in vivo. En los polinucleótidos relevantes (por ejemplo, vectores de expresión), la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica una endonucleasa asociada a CRISPR y un ARN guía está operativamente unida a un promotor o combinación potenciador-promotor. Los promotores y potenciadores se describen más arriba.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se pueden formular como una nanopartícula, por ejemplo, nanopartículas compuestas por un núcleo de polietilenimina lineal de alto peso molecular (LPEI) complejado con ADN y rodeado por una capa de LPEI de bajo peso molecular modificada con polietilenglicol (PEGilada).
Los ácidos nucleicos y los vectores también pueden aplicarse a la superficie de un dispositivo (por ejemplo, un catéter) o estar contenidos dentro de una bomba, parche u otro dispositivo de administración de fármacos. Los ácidos nucleicos y los vectores de la invención se pueden administrar solos o en una mezcla, en presencia de un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, solución salina fisiológica). El excipiente o vehículo se selecciona sobre la base del modo y la vía de administración. Los vehículos farmacéuticos adecuados, así como las necesidades farmacéuticas para su uso en formulaciones farmacéuticas, se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (EW Martin), un texto de referencia muy conocido en este campo, y en la USP/NF (Farmacopea de los Estados Unidos y el Formulario Nacional).
En algunas realizaciones, las composiciones se pueden formular como una nanopartícula que encapsula un ácido nucleico que codifica Cas9 o una variante de Cas9 y al menos una secuencia de ARNg complementaria a un VIH diana; o puede incluir un vector que codifique estos componentes. Alternativamente, las composiciones se pueden formular como una nanopartícula que encapsula la endonucleasa asociada a CRISPR de los polipéptidos codificados por una o más de las composiciones de ácido nucleico de la presente invención.
Independientemente de si las composiciones se administran como ácidos nucleicos o polipéptidos, se formulan de tal manera que promuevan la absorción por la célula de mamífero. Los sistemas y formulaciones de vectores útiles se describieron anteriormente. En algunas realizaciones, el vector puede administrar las composiciones a un tipo de célula específico. Sin embargo, la invención no está tan limitada, y también se contemplan otros métodos de administración de ADN tales como transfección química, usando, por ejemplo, fosfato de calcio, dextrano DEAE, liposomas, lipoplexos, tensioactivos y líquidos perfluoquímicos, al igual que los métodos de administración física, tales como como sistemas de electroporación, microinyección, partículas balísticas y "pistola de genes".
En otras realizaciones, las composiciones comprenden una célula que ha sido transformada o transfectada con uno o más vectores Cas/ARNg. En algunas realizaciones, los métodos de la invención se pueden aplicar ex vivo. Es decir, las células de un sujeto pueden removerse del cuerpo y tratarse con las composiciones en cultivo para cortar, por ejemplo, las secuencias del virus del VIH y las células tratadas se devuelven al cuerpo del sujeto. Las células pueden ser las células del sujeto o pueden tener un haplotipo emparejado o una línea celular. Las células se pueden irradiar para evitar la replicación. En algunas realizaciones, las células son líneas celulares autólogas, emparejadas con antígeno leucocitario humano (HLA), o combinaciones de las mismas. En otras realizaciones, las células pueden ser una célula madre. Por ejemplo, una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente artificial (célula madre pluripotente inducida (célula iPS)). Las células madre embrionarias (células ES) y las células madre pluripotentes artificiales (células madre pluripotentes inducidas, células iPS) se han establecido a partir de muchas especies animales, incluidos los seres humanos. Estos tipos de células madre pluripotentes serían la fuente más útil de células para la medicina regenerativa porque estas células son capaces de diferenciarse en casi todos los órganos mediante la inducción apropiada de su diferenciación, conservando su capacidad de dividirse activamente mientras mantienen su pluripotencia. Las células iPS, en particular, se pueden establecer a partir de células somáticas derivadas de sí mismas y, por lo tanto, no es probable que causen problemas éticos y sociales, en comparación con las células ES que se producen por destrucción de embriones. Además, las células iPS, que son células derivadas de sí mismas, permiten evitar reacciones de rechazo, que son el mayor obstáculo para la medicina regenerativa o la terapia de trasplante.
Los ácidos nucleicos aislados pueden administrarse fácilmente a un sujeto mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, métodos que administran ARNip. En algunos aspectos, Cas puede ser un fragmento en el que se incluyen los dominios activos de la molécula Cas, reduciendo así el tamaño de la molécula. Por lo tanto, las moléculas de Cas9/ARNg se pueden utilizar clínicamente, de forma similar a los enfoques adoptados por la terapia génica actual. En particular, se puede desarrollar una célula madre de expresión estable de Cas9/ARNg multiplex o células iPS para terapia de trasplante celular, así como para vacunación, para uso en sujetos.
Las células transducidas se preparan para reinfusión de acuerdo con métodos establecidos. Después de un período de aproximadamente 2-4 semanas en cultivo, el número de células puede oscilar entre 1 x 106 y 1 x 1010. En este sentido, las características de crecimiento de las células varían de un paciente a otro y de un tipo de célula a otro. Aproximadamente 72 horas antes de la reinfusión de las células transducidas, se toma una alícuota para analizar el fenotipo y el porcentaje de células que expresan el agente terapéutico. Para la administración, las células de la presente invención pueden administrarse a una velocidad determinada por la DL50 del tipo celular y los efectos secundarios del tipo celular a diversas concentraciones, según se aplique a la masa y la salud general del paciente. La administración se puede realizar mediante dosis únicas o divididas. Las células madre adultas también se pueden movilizar usando factores administrados exógenamente que estimulan su producción y salida de tejidos o espacios que pueden incluir, pero no se limitan a, médula ósea o tejidos adiposos.
Métodos de tratamiento descritos en el presente documento
Un método para erradicar un genoma de retrovirus en una célula o un sujeto puede comprender poner en contacto la célula o administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa asociada a una repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) y al menos un ARN guía (ARNg), siendo el ARNg complementario a una secuencia de ácido nucleico diana en un genoma de retrovirus.
Un método para inhibir la replicación de un retrovirus en una célula o un sujeto, puede comprender poner en contacto la célula o administrar al sujeto, una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa asociada a una repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) y al menos un ARN guía (ARNg), siendo el ARNg complementario a una secuencia de ácido nucleico diana en un genoma de retrovirus.
En métodos de tratamiento de una infección por retrovirus, por ejemplo, infección por VIH, se puede identificar un sujeto usando pruebas clínicas estándar, por ejemplo, inmunoensayos para detectar la presencia de anticuerpos de VIH o el polipéptido p24 de VIH en el suero del sujeto, o mediante ensayos de amplificación de ácidos nucleicos de VIH. Una cantidad de dicha composición proporcionada al sujeto que dé como resultado una resolución completa de los síntomas de la infección, una disminución de la gravedad de los síntomas de la infección o una ralentización de la progresión de la infección se considera una cantidad terapéuticamente eficaz. Los presentes métodos también pueden incluir una etapa de seguimiento para ayudar a optimizar la dosificación y la programación, así como para predecir el resultado. En algunos métodos, primero se puede determinar si un paciente tiene una infección por VIH latente y luego hacer una determinación sobre si tratar o no al paciente con una o más de las composiciones descritas en este documento. Los métodos pueden incluir además la etapa de determinar la secuencia de ácido nucleico del VIH particular albergado por el paciente y luego diseñar el ARN guía para que sea complementario a esas secuencias particulares. Por ejemplo, se puede determinar la secuencia de ácido nucleico de la región de LTR U3, R o U5 de un sujeto, o de los genes pol, gag o env, región y luego diseñar o seleccionar uno o más ARNg para que sean precisamente complementarios a las secuencias del paciente. Los nuevos ARNg proporcionados por la presente invención aumentan en gran medida las posibilidades de formular un tratamiento eficaz.
En los métodos para reducir el riesgo de infección por VIH, un sujeto en riesgo de tener una infección por VIH puede ser, por ejemplo, cualquier individuo sexualmente activo que tenga relaciones sexuales sin protección, es decir, que tenga relaciones sexuales sin el uso de condón; una persona sexualmente activa que tiene otra infección de transmisión sexual; un usuario de drogas intravenosas; o un incircunciso. Un sujeto en riesgo de tener una infección por VIH puede ser, por ejemplo, un individuo cuya ocupación puede ponerlo en contacto con poblaciones infectadas por el VIH, por ejemplo, trabajadores de la salud o personal de primera respuesta. Un sujeto en riesgo de tener una infección por VIH puede ser, por ejemplo, un recluso en un entorno correccional o un trabajador sexual, es decir, un individuo que usa la actividad sexual para obtener ingresos laborales o artículos no monetarios como comida, drogas o refugio.
La presente invención también incluye un kit que incluye una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa asociada a CRISPR, por ejemplo, una endonucleasa Cas9, y al menos una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un ARNg complementario a una secuencia diana en un provirus del VIH. Alternativamente, al menos una de las secuencias de ácido nucleico aisladas se puede codificar en un vector, tal como un vector de expresión. Los posibles usos del kit incluyen el tratamiento o la profilaxis de la infección por VIH. Preferiblemente, el kit incluye instrucciones de uso, jeringas, dispositivos de administración, tampones, recipientes y diluyentes estériles, u otros reactivos necesarios para el tratamiento o la profilaxis. El kit también puede incluir un estabilizador adecuado, una molécula portadora, un saborizante o similar, según sea apropiado para el uso pretendido.
Si bien se han descrito anteriormente varias realizaciones de la presente invención, debe entenderse que se han presentado solo a modo de ejemplo, y no de limitación. Se pueden realizar numerosos cambios en las realizaciones descritas de acuerdo con la divulgación en este documento sin apartarse del alcance de la invención. Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente invención no deberían estar limitados por ninguna de las realizaciones descritas anteriormente. La presente invención está de acuerdo con las reivindicaciones.
Al citar varias referencias en este documento, los solicitantes no admiten que ninguna referencia particular sea "técnica anterior" a su invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Materiales y métodos
Clonación de ARNgu en vector lentiviral: utilizando herramientas de diseño bioinformático spCas9-ARNgu para obtener las mejores puntuaciones de alta eficiencia y alta especificidad, se diseñaron 20 sitios diana de ARNgu dentro de la región de LTR-U3 del VIH-1 y 4 ARNgu para Gag, 2 ARNgu para Pol y 2 ARNgu para Env (Tabla 1). Se clonaron todas estas secuencias de semillas de ARNgu en el vector lentiviral pKLV-Wg de expresión ARNgu modificado (Figura 1B) modificado a partir del vector lentiviral ARNgu (Addgene n° 50946). Brevemente, el vector pKLV-Wg se digirió con BbsI y se trató con fosfatasa antártica, y el vector linealizado se purificó con un kit de eliminación nucleótidos Quick (Qiagen). Se mezcló la misma cantidad de guías sentido y antisentido (100 |jM en 1 j l ) con polinucleótido quinasa (PNK, 1 jl), tampón 1x PNK y ATP 1 mM, y se incubaron a 37 °C durante 30 min seguido de hibridación en una máquina de PCR (95 °C durante 5 minutos, -1 °C/ciclo 15 segundos durante 70 ciclos). El oligodúplex fosforilado (10 jM ) se diluyó a 1:100 para obtener una solución de trabajo (100 nM). A continuación, se mezcló 1 j l de oligodúplex (0,1 pmol) con 3,5 j l de vector pKLV-WG digerido con BbsI (0,015 pmol), 5 j l de tampón de reacción de ligasa T72x y 0,5 j l de ADN ligasa T7 (NEB). La mezcla se incubó durante 15-30 minutos a temperatura ambiente, se enfrió en hielo y luego se transformó en células competentes Stabl3. Se escogen de 2 a 4 colonias para PCR con T351 (U6/5') y cebador inverso ARNgu. Se cultivan 2 clones positivos para PCR en medio LB/Amp durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, los ADN plasmídicos miniprep se enviaron a Genewiz Inc. para secuenciarlos con T428 (secuencia hU6/5'/ F). El casete de expresión de ARNgu completo, incluido el promotor U6, el ARNgu y el terminador poli T, se verificó mediante análisis de secuencia utilizando el programa GeneRunner.
Ensayo informador de EcoVIH-luciferasa: se cultivaron células HEK293T (5x10e4/pocillo) en una placa de 96 pocillos en DMEM con alto contenido de glucosa que contenía FBS al 10% y antibióticos (100 U/ml de penicilina y 100 jg/m l de estreptomicina) en un atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 °C. Al día siguiente, las células se cotransfectaron mediante precipitación con fosfato de calcio estándar con el vector informador de EcoVIH-eLuc, el vector pLV-Cas9-RFP y el ARNgu indicado que expresaba los vectores pKLV-Wg. A los 2 días de la transfección, se preparó el lisado celular usando el sistema de ensayo de luciferasa ONE-Glo (Promega) y se midió la luminiscencia en un lector de múltiples etiquetas 2104 EnVision® (PerkinElmer). Los datos representan la media ± EE de 4 transfecciones independientes. Se calcularon los cambios relativos en los ARNgu individuales o emparejados en comparación con el vector de control de ARNgu vacío.
Genotipado por PCR, clonación de TA y secuenciación de Sanger: se cotransfectaron células HEK293T en una placa de 96 pocillos con el informador de EcoVIH-eLuc, pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP y los vectores de expresión de ARNg indicados. Después de 2 días, las células se lisaron con 90 |jl de NaOH 50 mM a 95 °C durante 10 minutos y se neutralizaron con 10 j l de Tris-HCl 1 M. Los extractos crudos se utilizaron directamente para PCR utilizando mezcla de polimerasa directa para PCR Terra (Clontech) y los cebadores de PCR indicados. Se llevaron a cabo dos etapas de PCR estándar durante 35 ciclos con hibridación/extensión a 68 °C durante 1 minuto y 98 °C durante 15 segundos. Los productos se resolvieron en gel de agarosa al 1,5%. Las bandas de interés se purificaron en gel y se clonaron en el vector pCRIl T-A (Invitrogen), y la secuencia de nucleótidos de los clones individuales se determinó mediante secuenciación en Genewiz usando cebadores universales T7 y/o SP6.
Ejemplo 2: Cribado de ARNg del VIH-1 y caracterización funcional para la erradicación del VIH-1 in vitro.
Con el fin de ampliar el espectro de ARNg eficaces para la edición mediada por CRISPR del genoma proviral del VIH, se encontraron ARNg candidatos y se cribaron para determinar su eficacia en la supresión de la expresión del VIH y la capacidad de inducir la eliminación o erradicación del genoma proviral del VIH-1 en células huésped.
Se encontraron ARNg candidatos específicos para sitios diana en el genoma del VIH-1 mediante procedimientos bioinformáticos. Los ARNg candidatos se seleccionaron por su mayor probabilidad de proporcionar una edición genética eficaz, con un potencial mínimo fuera del objetivo, es decir, el potencial de causar daño a sitios en el genoma del huésped. Las secuencias de semillas del sitio diana para los ARNg candidatos dentro de la región reguladora U3 de la LTR se muestran en la Figura 1D. Los ARNg incluyen LTR 1, LTR 2, LTR 3, LTR A, LTR B, LTR C, LTR D, LTR E, LTR F, LTR G, LTR H, LTR I, LTR J, LTR K, LTR L, LTR M, LTR N, LTR O, LTR P, LTR Q, LTR R, LTR S, LTR T. Las secuencias de estos ARNg se muestran en la Tabla 1. La mayoría de estos ARNg candidatos se pueden emparejar para su uso con nickasa Cas9 y nucleasa FokI guiado por ARN, que puede reducir los posibles efectos fuera del objetivo en 1.500 veces. Los sitios de direccionamiento de los ARNg candidatos en los genes estructurales gag y pol se indican mediante flechas en las Figuras 1C y 3A. Estos ARNg incluyen gag A, gag B, gag C, gag D; pol A y pol B. Sus secuencias se muestran en la Tabla 1. Los ARNg candidatos se clonaron en vectores informadores lentivirales como se muestra en la Figura 1B, panel inferior. También se clonó spCas9 en vectores informadores lentivirales, como se muestra en la Figura 1B, panel superior.
Se cotransfectaron células huésped HEK293T con un constructo informador de VIH, EcoVIH-eLuc, un constructo de expresión indicadora para sPCas9 y uno o dos constructos de expresión informadores para ARNg. Las células de control recibieron constructos de control ("LTR O"). Después de 2 días, se midió la actividad de la luciferasa en los lisados celulares con un sistema de ensayo de luciferasa ONE-GLOMR.
La mayoría de los ARNg de LTR candidatos, administrados solos, fueron eficaces para suprimir la expresión del VIH-1 en las células huésped, según se determina mediante la reducción de la expresión de luciferasa (Figura 2A). A continuación, estos ARNg se cotransfectaron en diversas combinaciones con los sitios de direccionamiento de ARNg en los genes gag o pol. Las combinaciones, mostradas en la abscisa de las Figuras 2B y 2C, incluían Gag D combinada con una de LTR 1, LTR 2, LTR 3, LTR A, LTR B, LTR C, LTR D, LTR E, LTR F, LTR G; LTR H, LTR I, LTR J, LTR K, LTR L, LTR M; LTR N, LTR O, LTR P, LTR Q, LTR R, LTR S o LTR T; y LTR 3 combinado con uno de Gag A; Gag B; Gag C, Gag D, Pol A o Pol B.
La mayoría de los ARNg individuales (Figura 2A) inhibieron la actividad de la luciferasa constitutiva, pero algunos mejoraron la actividad informadora o incluso no tuvieron ningún efecto. Los datos sugieren que la edición de un solo sitio dentro de la LTR induce mutaciones de Inserción/Eliminación que pueden afectar la unión de los activadores o represores de la transcripción para las actividades del promotor de la LTR del VIH-1.
Sin embargo, los ARNg emparejados de Gag-D con cualquiera de los ARNg de LTR redujeron las actividades de luciferasa en un 64-96% (Figura 2B). Estos datos sugieren que todos los ARNg diseñados indujeron eficazmente la edición génica de los sitios diana a los niveles del plásmido. La combinación de Gag con cualquier ARNgu de LTR eliminará el promotor central de LTR y, por lo tanto, inducirá la reducción drástica de la actividad del promotor. La actividad de luciferasa indicadora restante puede reflejar la pequeña población de células que expresan el informador EcoVIH que no contienen ni spCas9 ni dos ARNgu. Téngase en cuenta que la eficiencia de reducción requiere la presencia de los 4 plásmidos en las mismas células: EcoVIH-eLuc, spCas9, dos ARNgu.
El ARNg de LTR-3 emparejado con cualquiera de los ARNg de Gag o Pol diseñados también redujo drásticamente las actividades del informador de luciferasa en un 73-93% (Figura 2C). Estos datos sugieren que todos los ARNg diseñados que se dirigen a la región estructural Gag o Pol indujeron eficazmente la edición génica de los sitios diana a los niveles del plásmido. La combinación de LTR-3 con cualquier ARNgu dentro de la región estructural eliminará el promotor central de LTR y el genoma estructural entre los sitios de corte y, por lo tanto, inducirá la reducción drástica de la actividad del promotor. Tal prueba de concepto es aplicable a cualquier ARNgu de LTR, así como a cualquier otro ARNgu que se dirija a regiones estructurales tales como Gag, Pol y Env o cualquier otra región no estructural entre ambos LTR finales. La actividad de luciferasa informadora residual puede reflejar la pequeña población de células que expresan el informador de EcoVIH que no contienen ni spCas9 ni dos vectores ARNgu. Téngase en cuenta que la eficiencia de reducción requiere la presencia de los 4 plásmidos en las mismas células: EcoVIH-eLuc, spCas9, dos ARNgu.
A continuación, se determinó si la supresión de la expresión del VIH-1 reflejaba la eliminación de segmentos del genoma proviral del VIH-1. Las células HEK293T se cotransfectaron con el informador de EcoVIH-eLuc, pLV-EF1aspCas9-T2A-RFP y los vectores de expresión de ARNg. Después de 2 días, las células se lisaron con NaOH 50 mM a 95 °C durante 10 minutos y se neutralizaron con Tris-HCl 1 M. Los extractos crudos se utilizaron directamente para PCR utilizando mezcla de polimerasas directa para PCR Terra (Clontech) y los cebadores de PCR indicados.
Cuando se utilizó un primer conjunto de cebadores (Figura 3A), los fragmentos de PCR después del corte de los sitios de direccionamiento diseñados mostraron el tamaño predicho en 17 de 20 ARNgu de LTR. Solo LTR-F, LTR-G y LTR-K no mostraron erradicación, lo que sugiere que son incapaces o menos eficientes para escindir 5'-LTR. Esto es coherente con el resultado ineficaz o menos eficiente con la transfección de ARNg simple de LTR-F, LTR-G y LTR-K como se muestra en la Figura 2A. Entre los ARNgu efectivos, la eficiencia de corte detectada por la proporción de fragmento cortado sobre el fragmento no cortado correspondiente fue más alta en los ARNgu de LTR. Curiosamente, se observó una banda adicional de mayor tamaño que el fragmento de corte previsto en la mayoría de los pares
Cuando se utilizó un segundo conjunto de cebadores (Figura 3B), se observaron dos bandas débiles en todas las muestras, lo que indica los productos de PCR no específicos. Sin embargo, los fragmentos de PCR únicos después del corte de los sitios de direccionamiento diseñados mostraron el tamaño predicho en 16 de 20 ARNgu de LTR. Entre los ARNgu efectivos, la eficiencia de corte detectada por la intensidad del fragmento de PCR predicho fue más alta en los ARNgu LTR-Q, L, B, S, O, C, I.
A continuación, se examinaron combinaciones adicionales de ARNgu que se dirigen al LTR y varios genes estructurales. Las combinaciones se indican en la Figura 3C. Entre los ARNgu de LTR-1, 2, 3, LTR-1 mostró la mejor eficiencia. Gag-A, C, D y Pol-A, B exhibieron una fuerte eficiencia de erradicación. Gag-B no mostró escisión (confirmado por repetición de PCR, panel derecho). De nuevo, se observó una banda adicional de mayor tamaño que el fragmento de corte predicho en los pares para la escisión de 5'LTR.
También se encontró que los pares de ARNg complementarios a los sitios diana en la región de LTR U3 también producían eliminaciones en el genoma proviral del VIH-1. La preparación de la muestra y la PCR directa se realizaron como se describió anteriormente. Los fragmentos de PCR después del corte se extrajeron para la clonación de TA y la secuencia de Sanger (Figura 4). La clonación de TA representativa y la secuenciación de Sanger confirmaron una eliminación de 296 pb entre LTR-1 y LTR-3 y una inserción adicional de 180 pb entre los dos sitios de corte. La secuenciación de 15 clones mostró un patrón similar de ligación perfecta sin ninguna mutación de inserción/eliminación entre los dos sitios de corte. La secuencia de inserto adicional de 180 pb coincide con la secuencia del vector por NCBI Blast.
Tomados en conjunto, los resultados muestran que la mayoría de los ARNg candidatos son eficaces para erradicar la secuencia del genoma del VIH-1 predicha entre dos sitios seleccionados como diana, y para suprimir la expresión proviral, como muestran las actividades del informador de luciferasa. En particular, una combinación de los ARNg estructurales virales con uno o dos ARNg de LTR proporcionó una mayor eficiencia de erradicación del genoma. Los resultados de estos experimentos amplían el espectro de ARNg que pueden emplearse en un sistema CRISPR para provocar una escisión eficaz del genoma del VIH-1.
Ejemplo 3: Una combinación de ARNg novedosa y un sistema de vector para la erradicación del genoma integrado del VIH-1 a partir de células T infectadas de forma latente, utilizando el sistema de edición de genes CRISPR/Cas9.
Se realizaron experimentos con el objetivo de ampliar aún más el espectro de ARNg efectivos contra VIH-1 y aumentar la flexibilidad de suministro de ARNg y Cas9 a las células huésped.
En primer lugar, se probó una estrategia de tratamiento de combinación. El tratamiento empleó la nueva combinación del ARNg LTR B'junto con LTR A, que se describió previamente en Hu, et al., 2014. Las secuencias de LTR A y LTR B' se muestran en la Figura 11A, y sus posiciones en LTR del el VIH-1 se indican en las Figuras 5A-5D.
La expresión combinada de ARNg de Cas9, LTR A y LTR B' anula la activación del provirus del VIH latente y provoca la escisión de las secuencias provirales: Se llevaron a cabo experimentos en la línea de células T informadoras Jurkat2D10, que se esquematiza en la Figura 6A. Esta línea celular contiene un provirus VIH-1 latente transcripcionalmente integrado con eGFP en lugar de Nef como informador de la activación proviral. La activación se induce mediante el tratamiento con 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) o tricostatina A (TSA). La secuencia informadora integrada del VIH-1 se muestra en la Figura 6A. En la Figura 6B se muestran micrografías de fluorescencia de células 2D10 inducidas (panel derecho) y no inducidas (panel izquierdo). Los análisis de citometría de flujo de células 2D10 inducidas (panel derecho) y no inducidas (panel izquierdo) se muestran en la Figura 6C.
Se sometieron a electroporación células informadoras 2D10 (2 x 106/condición) con 10 |jg de plásmido pX260 de control o plásmidos pX260 LTR-A y pX260 LTR-B', 5 jg cada una (Neon System, Invitrogen, 3 veces 10 ms/impulso de 1350V). Cuarenta y ocho horas más tarde, el medio se reemplazó con medio que contenía puromicina 0,5 jg/ml. Después de una semana de selección, se eliminó la puromicina y se dejó que las células crecieran durante otra semana. Las células también expresaron Cas9 marcado con FLAG.
A continuación, las células se diluyeron a una concentración de 10 células/ml y se sembraron en placas de 96 pocilios, 50 pl/pocillo. Después de 2 semanas, se cribaron clones de células individuales para la reactivación del informador del VIH-1 marcado con GFP (tratamiento 12 h con PMA 25 nM/TSA 250 nM), usando un citómetro de flujo Guava EasyCyte Mini.
Los clones que expresan Cas9, LTR A y LTR B' se compararon con los clones que expresan solo Cas9 (Figuras 7A-7C). Se encontró que solo los clones que expresaban Cas9, LTR A y LTR B' no mostraban la reactivación del informador del VIH-1 después de la inducción de PMA (Figura 7B, panel inferior). Por el contrario, los clones que expresan solo Cas9 mostraron reactivación del informador del VIH-1, como lo demuestra la expresión de EGFP (Figura 7B, panel superior).
A continuación, se determinó si la eliminación de la reactivación del provirus del VIH-1 informador latente era atribuible a la escisión satisfactoria de secuencias provirales del genoma del huésped. El ADN derivado de los clones analizados en el experimento anterior se sometió a PCR para amplificar el motivo de secuencia del gen env proviral RRE, o secuencias genómicas que flanquean el provirus informador integrado (gen MSRB1). La ubicación T de los cebadores se muestra en la Figura 8A.
El análisis de PCR mostró que los clones que expresaban Cas9 y la combinación LTR A/B' no mostraban productos de PCR que incluían RRE y MSRB1, lo que indica la escisión de ADN que incluye esas secuencias. Por el contrario, RRE y MSRB1 se amplificaron y se detectaron fácilmente en clones que expresan solo Cas9 (Figura 8B). El genotipado por PCR de largo alcance confirmó que la expresión de la combinación LTR A/B dio como resultado la escisión de una secuencia de 652 pb que se extiende entre la región 5' U3 y la región 3' U3 (Figura 8C). La escisión se confirmó además secuenciando el lazo de escisión del locus de integración en el cromosoma 16 (Figura 8D). Tomados en conjunto, los resultados confirman que la eliminación de la reactivación del provirus del VIH-1 latente, por la expresión de LTR A/B' y Cas9, fue causada por la escisión de secuencias provirales del genoma del huésped.
También se encontró que la expresión estable de LTR A/B' y Cas9 protegía a los clones 2D10 de una nueva infección por VIH-1. Los clones se caracterizaron por la expresión de Cas9 por transferencia Western (Figura 9B) y por la expresión de LTR B' por análisis de PCR inversa (Figura 9C). Los clones se infectaron con el virus informador del VIH-1 NL4-3-EGFP-P2A-NEF y se monitorizó la progresión de la infección mediante análisis FACS. Sólo los clones que expresaban LTRA/B' y Cas9 resistieron la infección por VIH-1. Esto se muestra por niveles dramáticamente más bajos de expresión de EGFP en relación con los clones que carecen de LTR A/B' (ctrl 7) o Cas 9 (AB 8) (Figura 9A).
La administración lentiviral de Cas9/ARNg permite el direccionamiento eficaz y controlado en el tiempo de secuencias provirales: A continuación se determinó si los vectores lentivirales pueden usarse para la expresión de componentes Cas9/ARNg en células huésped. Los vectores lentivirales proporcionan un medio de expresión versátil y flexible, y están disponibles una variedad de vectores lentivirales inducibles por fármacos. Se transdujeron Jurkat 2D10 con lentivirus que expresan RFP-Cas9 (fluorescencia roja) y/o ARNg lTr A/B' (marcador BFP, fluorescencia azul) con MOI 5 (Figura 10A). Setenta y dos horas más tarde, el virus informador de GFP se reactivó mediante tratamiento con PMA/TSA y se cuantificó mediante citometría de flujo. Los análisis de gráficos de puntos se muestran en la Figura 10B). La activación del VIH es detectable como un desplazamiento hacia arriba (verde) en el gráfico de puntos tras la inducción (por ejemplo, el panel superior izquierdo de la Figura 10B frente al panel inferior izquierdo). Se puede ver que solo las células transducidas con Cas9 y LTR A/B' muestran una fracción celular significativa que no exhibe el cambio hacia arriba del verde (Figura 10B, panel inferior derecho). Los resultados confirman que los componentes de Cas9/ARNg pueden ser suministrados eficazmente por vectores lentivirales.
La expresión de Cas9/LTR A/B' no causa efectos detectables fuera del objetivo y cambios mínimos en la expresión de genes adyacentes: la escisión efectiva del provirus del VIH-1 mediante edición CRISPR es de poca utilidad si se acompaña de mutaciones inducidas en genes del huésped normal que contienen secuencias similares a las secuencias diana. Se examinaron seis sitios fuera del objetivo predichos/posibles para LTR A/B' en clones de Jurkat en los que se había erradicado con éxito un genoma del VIH-1. Las secuencias de LTRA y LTRB' se muestran en la Figura 11A. No se mostraron mutaciones de inserción/eliminación, ya sea por reacciones de ensayo de Surveyor (Figura 11B) o secuenciación de Sanger (Figura 11C). La localización del sitio de integración del informador del VIH-1 en el segundo exón del gen MSRB1 en el cromosoma 16 y los genes vecinos se muestran en la Figura 11D. Los niveles de expresión de genes adyacentes al sitio de integración después de la erradicación de la secuencia del VIH-1 se midieron mediante qRT-PCR y se compararon con los niveles de expresión en las células de control. Los resultados, en la Figura 11E, muestran que el tratamiento eficaz con Cas9 y lTr A/B' no tiene un impacto significativo en la expresión de genes vecinos a las secuencias de VIH escindidas.
Ejemplo 4: Cribado funcional de ARN guía que se dirige al genoma viral del VIH-1 regulador y estructural para una cura del SIDA.
En este estudio, se identificaron los mejores ARNg que se dirigen a la LTR del VIH-1 y la región estructural viral; se optimizó el emparejamiento de ARNg que puede erradicar eficazmente el genoma del VIH-1.
Se diseñaron ARNg altamente específicos usando herramientas bioinformáticas y se evaluó su capacidad de guiar a Cas9 para escindir el ADN proviral del VIH-1 usando un ensayo informador de luciferasa del VIH-1 de alto rendimiento y genotipificación rápida por PCR directa.
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continuación
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Resultados
Cribado bioinformático de ARNgu con alta y baja eficacia fuera del objetivo. La eficiencia y especificidad de los ARNg diana son preocupaciones críticas para la aplicación de Cas9/ARNg en enfermedades infecciosas. Se han desarrollado varios programas informáticos para el diseño y selección de ARNg para el sistema spCas9-ARNg, en los que se utilizaron la secuencia semilla de 20 pb y NRG PAM. Si bien la mayoría de los programas de diseño de ARNg se desarrollaron para predecir efectos fuera del objetivo, muy pocos programas pudieron predecir la eficiencia de escisión. Se diseñaron veinte (20) ARNg que se dirigen a la LTR del VIH-1 con una puntuación alta de eficiencia de escisión y especificidad contra el genoma humano (Tabla 1) utilizando los siguientes criterios: (1) Direccionamiento a la región de -18 a -418 pb del promotor de LTR-U3 para interrumpir la transcripción inicial del VIH-1 (y suprimir la producción de virus), y esta región de 400 pb está excluida en la mayoría de los LV, evitando así la auto-escisión del LV; (2) Evitar los sitios de unión del factor de transcripción que pueden afectar la expresión de los genes celulares del huésped debido a la alta homología (Figura 1C); (3) Hacer coincidir ambos extremos de LTR para permitir la eliminación de todo el ADN proviral entre las LTR; (4) Puntuación fuera del objetivo en más del 50%; y (5) Aplicabilidad a las nickasas dobles spCas9 o nucleasas FokI guiadas por ARN dimérico. Algunos ARNg que se dirigen a la región estructural Gag y Pol (Figura 1C) con la esperanza de obtener la mejor combinación de ARNg para erradicar el genoma completo del VIH-1. La región estructural de Env no se seleccionó debido a una menor conservación en esta secuencia estructural entre diferentes cepas. El sistema de administración de genes de LV se eligió por separado para expresar spCas9 y ARNg (Figura 1B) por las siguientes razones: (1) LV en sí proporciona muchos beneficios para la terapia génica de alta eficiencia en líneas celulares latentes de VIH difíciles de transfectar, estudios en animales y aplicación clínica potencial (LV sin integración; Hu P, et al., Mol Ther Methods Clin Dev 2015,2: 15025; Liu KC, et al., Curr Gene Ther 2014, 14: 352-364); (2) El spCas9 LV separado asegura una buena eficiencia de empaque para el gran tamaño del gen spCas9; (3) Se puede usar LV que expresa ARNg separado para clonar casetes de expresión de ARNg multiplex en un vector para una buena eficiencia de empaquetamiento.
Cribado funcional en células HEK293T para identificar ARNg efectivos. Para un cribado funcional rápido de los mejores objetivos, se realizó un ensayo informador de EcoVIH-eLuc utilizando un lector de múltiples placas Envision de alto rendimiento. El informador EcoVIH-eLuc fue seleccionado porque (1) contiene todos los componentes necesarios para la replicación del VIH-1 excepto el Env del VIH, (2) conveniente para ser manipulado en contenedores de nivel de bioseguridad II debido a la eliminación de Env y (3) la bioluminiscencia es más sensible que la fluorescencia y el informador eLuc se puede utilizar para detectar menos de 10 células individuales (Song J, et al., J Gen Virol 2015,96: 3131-3142). Se eligió la línea celular HEK293T debido a la alta eficiencia de transfección con el método rentable de precipitación con fosfato de calcio. Con la transfección de un solo ARNg, se encontró que la mayoría de los ARNg que se dirigían al promotor LTR y la región estructural solo podían dar como resultado una reducción marginal de la producción del informador proviral EcoVIH, pero algunos aumentaban las actividades del promotor o no tenían ningún efecto (Figuras 2A, 2B). El aumento en la actividad del promotor es consistente con un informe reciente de que el DSB inducido por spCas9/ARNg dentro del promotor de genes de respuesta temprana neuronal estimula su expresión (Madabhushi R, et al., Cell 2015,161: 1592-1605). Se planteó la hipótesis de que un solo ARNg induciría un solo corte de los sitios diana, generando mutaciones de Inserción/Eliminación en las regiones diana y/o la eliminación de todo el ADN proviral entre ambas LTR de los extremos. La mutación en el promotor puede afectar las actividades funcionales de los activadores y/o represores transcripcionales, lo que puede conducir a un aumento o disminución de la actividad transcripcional. La mutación en la región estructural puede dar como resultado el cambio del marco de lectura abierta de las proteínas estructurales del VIH-1 y, por lo tanto, disminuir la expresión del informador eLuc.
Para obtener un cribado más fiable y sensible de los ARNg eficaces para la escisión funcional, los ARNg emparejados se cotransfectaron: cada ARNg de LTR vs. uno de los ARNg que se dirige a la región estructural. Con esta estrategia, se observó una reducción más drástica del virus informador debido a una gran eliminación de fragmentos entre LTR 5' o 3' y la región estructural. Como ejemplo que se muestra en la Figura 2B, todas las combinaciones entre GagD y cualquiera de los ARNg de LTR redujeron significativamente la expresión de eLuc (64-96%), que es más robusta que usar un solo ARNg. La mitad de los ARNg de LTR (10/20) mostró una reducción> 90% en la actividad de eLuc. De manera similar, como otro ejemplo que se muestra en la Figura 2C, el ARNg de LTR-R emparejado con cualquiera de GagA-D o PolA-B redujo significativamente la actividad informadora de luciferasa a un 7-23%. La selección de GagD o LTR-R para el emparejamiento también se basó en su sitio PAM aplicable al sistema Cas9 de Staphylococcus aureus y sus sitios de orientación aplicables a las líneas celulares latentes del VIH-1 (Jadlowsky JK, et al., Mol Cell Biol 2014,34: 1911 -192) y ratones transgénicos Tg26 (Kopp JB et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1577-1581) en los que se suprimieron las secuencias parciales de Gag y de Pol completas. Estos datos proporcionaron evidencia de que una combinación de ARNg de LTR con ARNg estructurales era una estrategia mejor y más fácil para cribar los ARNg efectivos utilizando un ensayo informador eLuc del VIH-1 de alto rendimiento. Todos los ARNg diseñados son funcionales para reducir la expresión del informador EcoVIH-eLuc, lo que es consistente con la alta puntuación de la predicción de eficiencia por el análisis bioinformático.
Identificación de los ARNg efectivos usando genotipificación por PCR directa. Para validar si estos ARNg candidatos son funcionales para escindir las dianas apropiadas según lo diseñado, se realizó un análisis de genotipado de PCR directa utilizando las muestras de ADN con los ARNg emparejados y los cebadores de PCR correspondientes como se indica (Figura 3D). El enfoque de PCR directa no requiere extracción y purificación de ADN y, por lo tanto, es más conveniente para el cribado de genotipos. Cuando uno de los ARNg que se dirigen a las regiones estructurales se usó para emparejarse con los sitios de direccionamiento de LTR, el genotipado de PCR aparentemente generó nuevos fragmentos (denominada Eliminación para una descripción conveniente) derivados de la secuencia de LTR y Gag viral restante (residual) después de la eliminación de fragmentos entre 5' LTR y Gag (Figura 3E, cebador T361/T458). De acuerdo con el ensayo informador eLuc, casi todos los ARNg indujeron varios grados de reducción en la banda de tipo silvestre que puede amplificarse fácilmente mediante la condición de PCR estándar en el 5'-LTR/Gag debido al tamaño (1,3 kb). Después de la escisión, se detectaron varios grados de Eliminación tal como se diseñaron en la mayoría de las combinaciones (Figura 3E). Curiosamente, se observaron fragmentos adicionales (denominados Inserción) más grandes que la Eliminación predicha en la mayoría de las combinaciones en la escisión de 5'-LTR -Gag (Figura 3E). La cuantificación de la intensidad de la banda de tipo silvestre mostró que LTR-O posee la mayor eficacia, seguida de I, C, A como se muestra en el recuadro (Figura 3E). Este patrón de eficiencia de escisión de banda de tipo silvestre no se correlacionó completamente con el patrón de reducción de la actividad informadora de eLuc (Figura 2B), probablemente porque la amplificación del producto de PCR en una población mixta generalmente prefiere el producto de tamaño pequeño. Por otro lado, la reducción débil de la banda de tipo silvestre en algunos pares podría resultar de varios grados de pequeñas mutaciones Inserción/Eliminación (dentro de unos pocos nucleótidos) dentro de los sitios diana de ARNg sin ninguna Eliminación o Inserción fragmentaria. Para evitar la influencia potencial de la amplificación preferencial por PCR, la genotipificación por PCR se realizó utilizando cebadores que cubren 3'-LTR y Gag (Figuras 3E, 3I, 3J), que se predice que generará un producto de PCR de tipo silvestre de 7 kb que es poco probable que sea amplificado por la configuración de PCR utilizada. El patrón de Eliminación fragmentaria entre los ARNg detectados por el producto de PCR único (Figuras 3E, 3I, 3J) fue consistente con el revelado por los cambios de relación relativa (Figura 3E). El par de LTR-K y GagD no exhibió ninguna banda fragmentaria de Eliminación o Inserción en los cuatro conjuntos de reacciones de genotipado de PCR (Figuras 3E, 3F, 3I, 3J), lo que se correlaciona con solo una reducción del 7% en la banda de tipo silvestre (Figura 3E). El par de LTR-F frente a GagD mostró una banda de eliminación débil en un conjunto de reacción de PCR (31), que se correlaciona con una reducción del 17% en la banda de tipo silvestre (Figura 3E). Los pares de LTR-G, P frente a GagD mostraron una reducción de alrededor del 50% en las bandas de tipo silvestre, como resultado de la eliminación en la escisión de 5'-LTR -Gag (Figura 3E) o Gag-3'-LTR (Figura 3F , 3I, 3J). Cuando se usó el LTR-R para emparejarse con cualquiera de GagA-D y PolA-B, el genotipado de PCR con los cebadores correspondientes indicados también generó nuevos fragmentos predichos (Eliminación) (Figura 3G, 3H) e inserciones adicionales en el 5'-LTR/Gag (Figura 3G) en diversos grados en todos los ARNg probados excepto para el ARNg de Gag-B, que exhibió una capacidad de edición muy débil (Figura 3G). Sin embargo, todas estas combinaciones con genotipado débil o sin eliminación todavía mostraron una reducción dramática en la actividad informadora de EcoVIH-eLuc (Figura 2B). Esto podría atribuirse a ninguno o solo a uno de los dos plásmidos de ARNg transfectados en las mismas células en los que el ARNg individual sigue siendo muy eficaz para inducir una pequeña mutación de Inserción/Eliminación. Tomados en conjunto, estos datos evidencian que el genotipado por PCR directo proporciona una herramienta confiable y rápida para validar la presencia de Eliminación y/o Inserción fragmentaria. Sin embargo, la evaluación de la erradicación eficaz del VIH-1 mediante varios ARNg requiere una combinación de reducción funcional mediante el ensayo del informador de virus y escisión del fragmento de ADN proviral mediante la genotipificación por PCR dirigida a 5'-LTR o 3'-LTR.
Validación de la mutación de inserción/eliminación fragmentaria mediante clonación de TA y secuenciación de Sanger. Para validar aún más la eficiencia de escisión de spCas9/ARNg y examinar el patrón de mutación de Eliminación/Inserción después de la escisión, se seleccionaron tres muestras representativas de genotipado de PCR para clonación de TA y secuenciación de Sanger. La expresión emparejada de LTR-R/GagA provocó una Eliminación de un fragmento de 519 pb entre los sitios diana de LTR-R y GagA (Figura 12A). La coexpresión de LTR-L/GagD (Figura 12B) y LTR-M/GagD (Figura 12C) condujo a una Eliminación de un fragmento de 772 pb o 763 pb entre cada par de sitios diana, respectivamente. Además, causaron diversas extensiones o tipos de Inserción/Eliminación pequeñas. En algunos casos, se identificó una gran inserción de secuencias adicionales (por ejemplo, 159-359 pb) (Figuras 3E, 12B, 12C). El análisis Blast del NCBI mostró que estas secuencias adicionales se derivaban de los vectores exógenos en lugar de genes celulares endógenos del huésped. Estos resultados indican que la mayoría de estos ARNg candidatos pueden mediar eficazmente la alteración dirigida del genoma integrado del VIH mediante escisión o inserción/eliminación.
Discusión
Los ARNg multiplex podrían inducir una eliminación de fragmentos grandes entre los sitios diana (Hu W, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2014,111: 11461-11466), lo que proporciona un remedio confiable para evaluar la eficiencia de escisión del ADN de Cas9/ARNg. En este estudio, esta prueba de concepto se validó aún más mediante el cribado de varios múltiplex de 26 ARNg. Se demostró que la mayoría de los ARNg diseñados son muy eficaces para erradicar la secuencia del genoma del VIH-1 predicha entre los dos sitios de direccionamiento seleccionados que conducen a una escisión significativa del virus informador del VIH-1. En particular, una combinación de ARNg estructurales virales con uno o dos ARNg de LTR proporcionó una eficacia mucho mayor de erradicación del genoma y un enfoque más fácil con genotipificación de PCR directa y cribado informador de alto rendimiento. La efectividad y especificidad de los ARNg seleccionados en este estudio para la escisión del ADN proviral del VIH-1 prometen un éxito en los estudios preclínicos en animales y en pacientes clínicos que utilizan tecnología Cas9/ARNg, porque: (1) Estos ARNg pueden servir como una fuente de selección lista para ser usada para desarrollar terapia génica viral y no viral; (2) Para un paciente individual con VIH-1, estos ARNg se pueden utilizar como patrón para cribar nuevos ARNg diseñados específicamente para cualquier aislado del VIH-1 a pesar de la alta tasa de mutación del VIH-1; (3) La clonación fácil de ARNg, el cribado rápido de informadores y el genotipado de PCR directo confiable proporcionan una viabilidad para la aplicación práctica de Cas9/ARNg a la medicina personalizada.
No todos los ARNg diseñados exhiben las actividades necesarias para escindir los sitios diana esperados. Hasta ahora se han desarrollado varios enfoques para evaluar la eficiencia de la edición del genoma inducida por la tecnología Cas9/ARNg. Se han probado programas computacionales de mejora continua para las predicciones de eficiencia utilizando genomas celulares del huésped como objetivo de diseño (Doench JG, et al., Nat Biotechnol 2014, 32: 1262­ 1267; Gagnon JA, et al. PLoS One 2014,9: e98186; Liu H, et al., Bioinformatics 2015) pero puede no ser confiable para aplicar a los genomas exógenos tales como los virus infecciosos. La secuenciación de Sanger de la región objetivo a través de la clonación por PCR proporciona una alta sensibilidad y especificidad para determinar la eficiencia de edición del genoma (Sander Jd , et al. Nat Biotechnol 2011,29: 697-698), sin embargo, es laboriosa para el cribado de alto rendimiento. Ensayo de Surveyor basado en faltas de coincidencia (Qiu P, et al., BioTechniques 2004,36: 702­ 707; Kim JM, et al., Nat Commun 2014,5: 3157; Dahlem TJ, et al., PLoS Genet 2012,8: e1002861) y los análisis de fusión de alta resolución (Bassett AR, Liu JL. J Genet Genomics 2014,41: 7-19) son sensibles para detectar las pequeñas mutaciones de Inserción/Eliminación, pero la escasa especificidad las hace propensas a producir resultados falsos positivos. El ensayo de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) requiere la presencia de un sitio de enzima de restricción con la región diana, que está limitada en la mayoría de los casos (Kim JM, et al., Nat Commun 2014,5: 3157). La secuenciación de próxima generación proporciona una medida confiable y específica, pero es costosa y requiere mucho tiempo (Guell M, et al., Bioinformatics 2014,30: 2968-2970). Recientemente, varios ensayos basados en PCR proporcionan un método fácil y confiable para cuantificar la eficiencia de edición, pero requieren un diseño de cebador robusto, descomposición de trazas o secuenciador capilar (Brinkman EK, et al., Nucleic Acids Res 2014,42: e168; Carrington B, et al., Nucleic Acids Res 2015; Yu C, et al., PLoS One 2014,9: e98282). En el presente documento, se estableció una plataforma de detección rápida, rentable y confiable para identificar ARNg efectivos utilizando un ensayo informador bioluminiscente de alto rendimiento altamente sensible junto con un genotipado rápido de PCR directa. El ensayo informador se basa en la erradicación de grandes fragmentos entre dos sitios diana de ARNg, así como las pequeñas mutaciones de Inserción/Eliminación en cada sitio de ARNg. La erradicación fragmentaria anula la actividad del promotor o la expresión del informador, mientras que las mutaciones de Inserción/Eliminación pueden cambiar la regulación del promotor o inducir un cambio de marco de lectura abierto de proteínas virales. Todos estos hechos afectarán posteriormente a la actividad del informador. El genotipado por PCR se basa en la escisión fragmentaria y una nueva ligación eficaz entre los ADN finales restantes. La presencia de los fragmentos de PCR nuevamente ligados proporciona una evidencia afirmativa de la eficacia de ambos ARNg. La eficacia de la nueva ligadura depende de la división celular, por lo que la genotipificación por PCR puede estar limitada en el caso de células que no se dividen. Además, la condición de PCR para algunos cebadores necesita optimización para lograr la mejor eficiencia de genotipificación.
El objetivo de este estudio fue cribar e identificar los ARNg efectivos mediante el establecimiento de ensayos fiables y sensibles de alto rendimiento. La transfección transitoria del informador EcoVIH-eLuc en células HEK293T se eligió como plataforma de prueba porque una pequeña cantidad del plásmido informador sobre los componentes spCas9/ARNg (1:20) puede asegurar la escisión de la diana en todas las células que expresan el informador y así maximizar la eficacia de detección del ensayo informador de luciferasa y genotipado por PCR. Por el contrario, la línea celular estable EcoVIH-eLuc basada en células HEK293T (Figuras 13A-13E, 14A-14D), que puede estar más cerca de la situación real de latencia del VIH-1, mostró una sensibilidad de detección pobre tanto en el ensayo de informador de luciferasa como en genotipado por PCR. Esto se debe a que las células que expresan EcoVIH-eLuc sin ningún plásmido de ARNg siempre existen después de la transfección y, por lo tanto, el informador eLuc se expresa constantemente, incluso cuando la eficacia de la transfección puede ser tan alta como 80-90%. Las ventajas adicionales de la transfección informadora transitoria incluyen una configuración sencilla, una transfección rentable y una medición de luminiscencia de alto rendimiento. Es importante destacar que los ARNg identificados siguen siendo eficaces en las células o líneas celulares infectadas de forma latente con el VIH real y pueden utilizarse adicionalmente para estudios en animales y aplicaciones clínicas. Aunque el informador EcoVIH-eLuc transfectado transitoriamente (ADN episomal) no refleja el ADN proviral del VIH latente en el genoma del huésped (núcleo), la edición del gen mediada por spCas9/ARNg funciona con una eficiencia similar entre el ADN episómico y nuclear del provirus del VIH (Hu W, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2014,111: 11461-11466) y otros virus (Ramanan V, et al., Sci Rep 2015,5: 10833; Yuen KS, et al., J Gen Virol 2015,96: 626-636). Además, la escisión eficaz del ADN episomal además del ADN proviral del VIH-1 integrado permite un tratamiento preventivo novedoso para una nueva infección del VIH (Hu W, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2014,111: 11461-11466) y otros virus infecciosos (Peng C, Lu M, Yang D. Virol Sin 2015, 30: 317-325).
Algunos factores de confusión pueden afectar la eficacia de la transfección transitoria y la expresión del transgén para el análisis comparativo de diferentes ARNg. Para minimizar esto, se tomaron varias precauciones: 1) Se preparó una mezcla maestra de los plásmidos informador y spCas9 para asegurar la misma cantidad de estos plásmidos compartidos en cada grupo de ARNg; 2) Se utilizó el informador de luciferasa de Renilla (1:100) para la normalización de la eficacia de la transfección; 3) Se realizó una transfección a gran escala en una placa de 96 pocillos para todos los ARNg en 4-6 réplicas al mismo tiempo; y 4) Todos los datos se expresaron como cambios relativos en comparación con el control de ARNg vacío en cada experimento.
Un ARNg que se dirige a la región de LTR puede eliminar todo el ADN proviral debido a la escisión de ambos LTR terminales, pero la eficacia de erradicación no fue aparente, como muestra el ensayo informador de EcoVIH-eLuc. También requiere PCR de largo alcance para verificar la erradicación de todo el ADN proviral del VIH-1 porque la PCR estándar con cebadores que cubren la LTR no puede distinguir 5'-LTR de 3'-LTR después de la eliminación de un fragmento entre dos sitios diana de LTR (Hu W, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2014, 111: 11461-11466). Dos ARNg que se dirigen a la región de LTR indujeron una escisión fragmentaria dentro de cada región de LTR que suprimirá la actividad del promotor de LTR y reducirá la estabilidad del ARN del VIH-1, mejorando así toda la eficiencia de erradicación como se ha demostrado anteriormente (Hu W, et al., 2014). En este estudio, se probó una nueva prueba de principio de que cualquier par de ARNg entre la LTR y las regiones estructurales proporciona un mejor enfoque para evaluar la eficacia de la erradicación del VIH-1. Mediante este método, la dramática reducción funcional en la producción del virus informador del VIH-1 es el resultado de las tres posibles escisiones de 5'LTR Gag, Gag 3'LTR y ambas LTR finales, y se puede controlar fácilmente mediante el ensayo del informador de bioluminiscencia sensible y de alto rendimiento. Estas escisiones pueden detectarse de forma eficaz y fiable mediante el genotipado estándar y rápido por PCR directa utilizando cebadores que cubren la LTR y las regiones estructurales. De manera similar, un cóctel de dos ARNg de LTR más uno o dos ARNg estructurales puede proporcionar un remedio óptimo y económico para erradicar el genoma del VIH-1 en el entorno preclínico y clínico.
El potencial de efectos fuera del objetivo que implican la tecnología Cas9/ARNg ha sido una gran preocupación en el campo de la edición del genoma. Se han desarrollado un diseño riguroso de ARNg, cribado funcional y modificación de la tecnología Cas9 para aumentar la especificidad de la edición del genoma. Se han validado casos muy raros de efectos fuera del objetivo relacionados con spCas9/ARNg en células cultivadas mediante secuenciación del genoma completo (WGS) (Hu W, et al., 2014; Zuckermann M et al., Nat Commun 2015,6: 7391; Smith C, et al., Cell Stem Cell 2014, 15: 12-13; Veres A, et al., Cell Stem Cell 2014, 15: 27-30; Yang L, et al., Nat Commun 2014,5: 5507). Las técnicas de creación de perfiles no sesgadas recientemente desarrolladas validan aún más la alta especificidad de este sistema spCas9-ARNg (Ran FA, et al., Nature 2015,520: 186-191; Tsai SQ, et al. Nat Biotechnol 2015,33: 187­ 197; Frock RL, et al., Nat Biotechnol 2015, 33: 179-186). Se espera que in vivo fuera del objetivo sea mucho menor debido a la protección epigenética. En este estudio, el ADN viral exógeno se analizó frente al genoma del huésped para obtener la mejor puntuación de eficiencia y especificidad. No se observó toxicidad celular durante el cribado de ARNg. Las nickasas dobles spCas9 y las nucleasas FokI guiadas por ARN han demostrado reducir los efectos potenciales fuera del objetivo hasta 1500 veces (Ran FA, et al., Cell 2013,154: 1380-1389; Mali P, et al., Nat Biotechnol 2013, 31: 833-838; Wyvekens N, et al., Hum Gene Ther 2015,26: 425-431; Tsai SQ, et al., Nat Biotechnol 2014,32: 569-576).
En conclusión, la mayoría de los ARNg diseñados son muy eficaces para erradicar la secuencia del genoma del VIH-1 predicha entre dos sitios de direccionamiento seleccionados y afectan las actividades del informador de eLuc. En particular, una combinación de ARNg estructurales virales con uno o dos ARNg de LTR proporcionó una mayor eficiencia de erradicación del genoma y un enfoque más fácil para la genotipificación por PCR. El cribado con el ensayo informador eLuc del VIH-1 y el genotipado por PCR directa proporciona un enfoque fiable, rápido y conveniente para cribar ARNg del VIH-1 eficaces. Esto se puede utilizar para configurar un cribado de biblioteca de ARNg de alto rendimiento para cualquier nuevo aislado del VIH-1 y otros virus infecciosos durante la nueva era de la medicina personalizada/de precisión.
La invención se ha descrito de manera ilustrativa, y debe entenderse que la terminología que se ha utilizado está destinada a ser de naturaleza descriptiva más que de limitación. Obviamente, son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto, debe entenderse que dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención se puede poner en práctica de otra manera que la descrita específicamente.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para usar en la inactivación del ADN retroviral integrado en el genoma de una célula huésped infectada de forma latente con un retrovirus, comprendiendo la composición: una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa asociada a la repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) y al menos una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica al menos un ARN guía (ARNg) que es complementaria a una secuencia diana en un ADN retroviral integrado en el que el retrovirus es un virus de inmunodeficiencia humana (VIH),
en la que dicho al menos un ARNg incluye un primer ARNg que es complementario a una primera secuencia diana en el ADN del VIH, y un segundo ARNg que es complementario a una segunda secuencia diana en el ADN del VIH, y en la que dicha primera secuencia diana está situada en una región de LTR del ADN del VIH, y dicha segunda secuencia diana está situada en una secuencia que codifica proteínas estructurales o proteínas no estructurales del ADN del VIH,
en la que la segunda secuencia diana está situada en una secuencia que codifica: precursor de Gag-Pol, Gag, Pol, Pro (proteasa), transcriptasa inversa (RT), integrasa (In) o Env; o, en la que la segunda secuencia diana está situada en una secuencia que codifica: proteínas reguladoras o proteínas accesorias.
2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la segunda secuencia diana está situada en una secuencia que codifica el precursor de Gag-Pol, Gag o Pol.
3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la segunda secuencia diana se sitúa en una secuencia que codifica: proteínas reguladoras, o proteínas accesorias, preferiblemente en la que:
i) la proteína reguladora codificada es Tat o Rev; o
ii) la proteína accesoria codificada es Nef, Vpr, Vpu o Vif.
4. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que una secuencia de ácido nucleico de ARNg comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos 75% con las SEQ ID NOS: 1-52, preferiblemente en la que una secuencia de ácido nucleico de ARNg comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende las SEQ Id NOS: 1-52.
5. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación anterior para:
inactivación del ADN retroviral integrado en el genoma de una célula huésped infectada de forma latente con un retrovirus; o
erradicación de un retrovirus in vitro o in vivo.
6. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición comprende una o más secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican los ARNg y las secuencias de ácido nucleico aisladas de la endonucleasa y los ARNg están incluidos en al menos un vector de expresión.
7. Una composición farmacéutica que comprende una composición de cualquier reivindicación anterior.
8. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 para su uso en:
tratar a un sujeto mamífero infectado con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH); o
tratar a un sujeto mamífero en riesgo de infección para reducir el riesgo de infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en dicho sujeto mamífero.
9. Un método in vitro para inactivar un ADN retroviral integrado en una célula de mamífero que incluye las etapas de exponer la célula a una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; expresar el complejo de edición de genes; e inactivar el ADN retroviral integrado.
10. Un kit para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que incluye una cantidad medida de una composición que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa asociada a CRISPR y al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más ARN guía (ARNg) en el que cada uno de dichos uno o más ARNg es complementario a un sitio diana en un genoma del VIH; o un vector que codifica uno o más de dichos ácidos nucleicos aislados; y uno o más elementos seleccionados del grupo que consta de material de empaque, un prospecto que comprende instrucciones de uso, un líquido estéril, una jeringa y un recipiente estéril,
en el que dicho uno o más ARNg incluye un primer ARNg que es complementario a una primera secuencia diana en el genoma del VIH, y un segundo ARNg que es complementario a una segunda secuencia diana en el genoma del VIH, en el que dicha primera secuencia diana está situada en una región de LTR del genoma del VIH, y dicha segunda secuencia diana está situada en un gen estructural y/o no estructural de un genoma del VIH.
11. Un vector de expresión o polinucleótido para inactivar un ADN retroviral integrado en el genoma de una célula huésped infectada de forma latente con un retrovirus, en el que el vector de expresión o polinucleótido comprende al menos una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una endonucleasa asociada a una repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) y al menos un ARN guía (ARNg), siendo el ARNg complementario a una secuencia diana en el ADN retroviral,
en el que el retrovirus es un VIH, dicho al menos un ARNg incluye al menos un primer ARNg guía que es complementario a una primera secuencia diana en un ADN del VIH; y un segundo ARNg que es complementario a una segunda secuencia diana en el ADN del VIH, y dicha primera secuencia diana está situada en una región de LTR de un genoma del VIH, y dicha segunda secuencia diana está situada en un gen estructural y/o no estructural del genoma del VIH.
12. El kit de la reivindicación 10, o el vector de expresión o polinucleótido de la reivindicación 11, en el que la segunda secuencia diana está situada en un gen estructural seleccionado entre: Gag, precursor de Gag-Pol, Pol, Pro (proteasa), transcriptasa inversa (RT), integrasa (In), Env o combinaciones de las mismas, preferiblemente en las que el gen estructural es Gag, precursor de Gag-Pol o Pol.
13. El kit de la reivindicación 10 o 12, o el vector de expresión o polinucleótido de la reivindicación 11 o 12, en el que la segunda secuencia diana está situada en un gen no estructural que codifica proteínas reguladoras, proteínas accesorias o combinaciones de las mismas, preferiblemente en el que:
las proteínas reguladoras comprenden: Tat, Rev o combinaciones de las mismas; y/o
las proteínas accesorias comprenden: Nef, Vpr, Vpu, Vif o combinaciones de las mismas.
14. El kit de la reivindicación 10, 12 o 13, o el vector de expresión o polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que una secuencia de ácido nucleico de ARNg comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos 75% con las SEQ ID NOS: 1-52, preferiblemente en el que una secuencia de ácido nucleico de ARNg comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende las SEQ ID NOS: 1-52.
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