ES2886919T3 - Partícula para la encapsidación de un sistema de ingeniería del genoma - Google Patents
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Abstract
Partícula retroviral que comprende una proteína derivada de la poliproteína Gag, una proteína de la envoltura, opcionalmente una integrasa y al menos dos ARN no virales encapsidados, comprendiendo los ARN no virales encapsidados una secuencia de ARN de interés unida a una secuencia de encapsidación, estando cada secuencia de encapsidación reconocida por un dominio de unión heterólogo introducido en la proteína derivada de la poliproteína Gag y/o en la integrasa, en la que los al menos dos ARN no virales encapsidados se distinguen por su secuencia de interés: - al menos una de dichas secuencias de interés de ARN no virales encapsidados comprende una parte que codifica una nucleasa seleccionada del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, y - la secuencia de interés del otro ARN no viral encapsidado corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN.
Description
DESCRIPCIÓN
Partícula para la encapsidación de un sistema de ingeniería del genoma
La presente invención se refiere a un sistema retroviral para transferir ARN no viral a células diana y más particularmente a una partícula retroviral capaz de administrar múltiples ARN. La invención también se refiere a composiciones que comprenden estas partículas retrovirales, kits para la producción de las mismas, procedimientos de fabricación de las mismas y usos de las partículas y composiciones.
La introducción de múltiples ARN en una célula diana es un tema importante en la investigación y el desarrollo como en la terapia génica.
El uso de vectores derivados de virus se ha convertido en un método crucial de transferencia de genes. Los vectores virales de hoy se dividen en dos categorías principales:
- vectores integradores, que se integran en el genoma del receptor, y
- vectores no integradores, que suelen formar un elemento genético extracromosómico.
Los vectores integradores tales como los vectores gamma-retrovirales (RV) y los vectores lentivirales (LV) están integrados en forma estable. Los vectores no integradores, como los vectores adenovirales (ADV) y los vectores adenoasociados (AAV), se eliminan rápidamente de las células que se dividen rápidamente. Algunos factores que influyen en la elección de un vector en particular incluyen su capacidad de encapsidación, su gama de células diana o huésped, su perfil de expresión génica, su eficiencia de transducción y su capacidad para inducir una respuesta inmune, que es particularmente importante. Es problemático si se requieren transducciones repetidas.
Ciertas aplicaciones requieren el uso de vectores no integradores, como en terapia génica o en numerosas aplicaciones in vitro, ex vivo e in vivo. A modo de ejemplo, se pueden citar:
• inducción de la reprogramación de células especializadas en células pluripotentes, así como inducción de la diferenciación de células madre o pluripotentes en células especializadas,
• la expresión de antígenos o proteínas (tóxicas o no) simultáneamente en una célula diana,
• la expresión de sistemas de ingeniería del genoma como, por ejemplo, la proteína CRE, los sistemas TALEN, nucleasa con dedos de zinc o CRISPR, o cualquier otro sistema que requiera una expresión de proteína o de ARN.
Un medio para introducir ARN en una célula diana utiliza vectores virales basados en virus pertenecientes a la familia de Retroviridae (también denominada familia de retrovirus o virus de ARN). De hecho, durante su ciclo de replicación, un virus de la familia Retroviridae tiene la capacidad de convertir su genoma, compuesto por ARN, en ADN bicatenario que se integrará en el genoma de la célula diana. Ejemplos particulares de esta familia de retrovirus son los gammaretrovirus y los lentivirus.
El ciclo replicativo de un retrovirus comprende una primera fase de reconocimiento de la célula diana (o huésped) mediante la fijación a un receptor de membrana. Esta fase de reconocimiento conduce, después de la fusión de la membrana, a la entrada del retrovirus en la célula huésped. Luego, el ARN retroviral se copia en ADN bicatenario mediante transcriptasa inversa, codificada por el retrovirus, y luego se integra en el genoma de la célula huésped. Este genoma viral es luego transcrito y traducido por la célula huésped como todos los demás genes de la célula. Este genoma codifica todas las proteínas y secuencias que permiten la producción de otros virus.
Más particularmente, tres genes son comunes a todos los retrovirus: gag, pol y env.
Gag es un gen que codifica una poliproteína, siendo las proteínas obtenidas a partir de esta poliproteína por escisión proteínas estructurales implicadas en el ensamblaje de virus durante la replicación. Estas proteínas estructurales son más específicamente la proteína de matriz (MA), la proteína de cápside (CA) y la proteína de nucleocápside (NC).
Pol es un gen que codifica las enzimas integrasa, transcriptasa inversa y proteasa.
Env es un gen que codifica las glicoproteínas de la envoltura.
Por lo tanto, estos tres genes permiten copiar el ARN retroviral en ADN bicatenario, integrar este ADN en el genoma de la célula huésped y luego generar la estructura de los retrovirus neosintetizados: proteínas de envoltura, de cápside y de nucleocápside. Sin embargo, para que los retrovirus neosintetizados estén completos, es necesario encapsidar en cada una de estas estructuras dos copias del ARN retroviral. Esta encapsidación de dos copias del ARN retroviral en la estructura se lleva a cabo mediante el reconocimiento por parte de la proteína de nucleocápside, de una secuencia de encapsidación denominada Psi (por “Packaging Signal”) transportada por la copia del ARN retroviral.
Cuando se usa un vector viral derivado de un retrovirus con fines de terapia génica, al menos parte de las regiones codificantes de gag, pol y/o env se disocia entre el sistema de encapsidación y el sistema de expresión de la secuencia
de interés. Las secuencias codificantes de gag y pol, por ejemplo, son transportadas por el plásmido de encapsidación que proporciona en trans las proteínas necesarias para la producción de vectores virales. Tanto la secuencia de encapsidación como la secuencia de interés son transportadas por sistemas independientes, con el fin de hacer que el retrovirus no sea replicativo.
Sin embargo, en algunos casos, la integración aleatoria de la secuencia de ARN de interés en el genoma de la célula huésped puede interrumpir un marco abierto de lectura y bloquear la expresión de genes importantes. Además, para determinadas aplicaciones, como la reprogramación de células o la diferenciación de células madre, se recomienda que la expresión de una secuencia de interés se lleve a cabo en forma transitoria.
La solicitud WO2007/072056 describe un sistema de vectorización viral que comprende env, gag, opcionalmente gag/pol, así como una secuencia de ARN que contiene una señal de encapsidación heteróloga que es reconocida por un dominio de unión a ARN correspondiente asociado con gag o gag/pol. Este sistema se describe en la solicitud como no integrador y que permite una expresión transitoria.
Sin embargo, la eficacia de tales sistemas sigue siendo limitada. En particular, para que una célula diana exprese un ARN de interés transmitido por estos sistemas, generalmente es necesario introducir en la célula varias copias de este ARN de interés y, por lo tanto, utilizar altas multiplicidades de infección (“multiplicity of infection” o m O i). La MOI corresponde a la relación entre el número de sistemas de vectorización introducido y el número de células por infectar. De hecho, una fuerte MOI permite introducir en las células varias copias del ARN de interés y, al mismo tiempo, permite que una misma célula sufra varias infecciones. Sin embargo, si permite mejorar el nivel de expresión del ARN de interés transportado, el uso de fuertes MOI, debido a las múltiples infecciones que sufre la célula, también genera cierta toxicidad.
Como se mencionó con anterioridad, este tipo de sistema también es de interés para la ingeniería del genoma, y en particular para aplicaciones en terapia génica.
En la actualidad, la introducción de sistemas de ingeniería del genoma en las células diana sigue siendo compleja y constituye un desafío importante para la implementación exitosa de los sistemas de ingeniería del genoma mencionados con anterioridad.
De hecho, para que un sistema de ingeniería del genoma pueda funcionar, es aconsejable introducir al menos en la célula diana una enzima capaz de escindir el ADN o nucleasa. Las aplicaciones en terapia génica también requieren una especificidad del corte del ADN para apuntar con precisión a un gen determinado, sin generar un corte no deseado. Además, para el uso de los sistemas TALEN, ZnFinger y CRISPR, generalmente es necesario introducir un elemento de reconocimiento en el ADN. En consecuencia, tales sistemas requieren la introducción en las células transducidas de al menos una nucleasa, y preferiblemente de dos elementos constituyentes del sistema de ingeniería en cuestión.
Además, estos sistemas de ingeniería del genoma deben tener en cuenta parámetros tales como la duración e intensidad de la expresión del material genético introducido en la célula diana, para permitir una eficiencia satisfactoria del sistema sin inducir toxicidad.
Los métodos existentes en la actualidad para el suministro de estos sistemas de ingeniería del genoma son principalmente:
- la transfección de ADN,
- la electroporación de ARN, y
- el uso de vectores virales.
Sin embargo, cada uno de estos métodos presenta serios inconvenientes.
De hecho, la transfección de ADN es un proceso que tiene una eficacia muy baja en células primarias o sensibles, debido a una alta toxicidad ligada a la transferencia de ADN, a la presencia de secuencias bacterianas en los plásmidos y/o la integración aleatoria de los plásmidos en el genoma de las células transfectadas.
La electroporación de ARN mensajero, por su parte, es un método preferentemente utilizado ex vivo, en células primarias o sensibles, que tampoco nos permite obtener buenos resultados en términos de eficacia por la alta toxicidad resultante de la desestabilización de las membranas celulares diana.
El uso de vectores virales parece ser el método más prometedor para aumentar la eficiencia de la administración, mientras se minimiza la citotoxicidad. El documento de Williams M. R. et al. (2016) describe la transferencia del sistema CRISPR por vectores virales derivados de MoMuLV o del VIH. Los elementos del sistema CRISPR son transportados por el plásmido de expresión (Figura 1b).
Sin embargo, si los vectores lentivirales son herramientas eficaces, se integran en el genoma de las células diana para una expresión estable del transgén que puede conducir a reacciones incontroladas. Además, los vectores lentivirales deficientes para la integración (IDLV) pueden usarse para limitar la duración de la expresión de la nucleasa, sin
embargo, no garantizan la ausencia total de integración en el genoma de las células diana.
La otra alternativa es el uso de sistemas adenovirales de AAV para aplicaciones in vivo, pero este tipo de herramienta implica el uso de una nucleasa de tamaño reducido debido a una capacidad de encapsidación de los sistemas adenovirales limitada a un tamaño menor a 4,8 kb, incompatibles con los sistemas CRISPR o TALEN (Chen, 2015). El documento de Prel. A. et al. (2015) describieron la introducción de ARN funcionales utilizando partículas de tipo retrovirus-MS2 quiméricas.
Por lo tanto, todavía existe una necesidad de sistemas de vectorización viral más eficaces y menos tóxicos.
El trabajo de los inventores ha hecho posible producir un sistema de vectorización capaz de suministrar varios ARN de interés en la misma célula en una única infección.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a una partícula retroviral que comprende una proteína derivada de la poliproteína Gag, una proteína de la envoltura, opcionalmente una integrasa y al menos dos ARN no virales encapsidados, comprendiendo cada uno de los ARN no virales encapsidados una secuencia de ARN de interés enlazada a una secuencia de encapsidación, donde cada secuencia de encapsidación es reconocida por un dominio de unión heterólogo introducido en la proteína derivada de la poliproteína Gag y/o en la integrasa, en la que al menos los dos ARN no virales encapsidados se distinguen por su secuencia de interés, en al menos una de dichas secuencias de ARN no virales encapsidadas de interés que comprende una parte que codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, y la secuencia de interés del otro ARN no viral encapsidado correspondiente a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN.
La partícula retroviral según la invención permite introducir al menos dos ARN no virales, preferiblemente 3, en una célula mediante una única infección. La introducción de tales partículas en las células puede realizarse mediante un método in vivo, in vitro o ex vivo.
Por “proteína derivada de la poliproteína Gag”, se entiende cualquier proteína resultante de la escisión de la poliproteína Gag. Más particularmente, es una proteína de nucleocápside, una proteína de matriz (por ejemplo, en partículas retrovirales derivadas de virus murinos de tipo MoMuLV) o la proteína p12, específica de gammaretrovirus.
Por “proteína de envoltura”, se entiende cualquier proteína de envoltura, incluida una proteína de envoltura de pseudotipificación. A modo de ejemplo, se pueden citar la proteína de la envoltura Ampho, la proteína de la envoltura ecotrópica, la proteína de la envoltura del virus Moloney de la leucemia murina (MoMuLV), la proteína de la envoltura del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), la proteína de la envoltura del virus del sarcoma murino de Harvey (Ha-MuSV), la proteína de la envoltura del virus del tumor mamario murino (MuMTV), la proteína de la envoltura del virus del sarcoma Rous (RSV), la proteína de la envoltura del virus del sarampión (también MV por measles virus), la proteína de la envoltura del virus de la leucemia de Gibbon (GaIV), la proteína del virus endógeno felino (RD114) o la proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G). Más particularmente, la proteína de la envoltura es la proteína de la envoltura Ampho, la proteína de la envoltura ecotrópica, la proteína de la envoltura del virus Moloney de la leucemia murina (MoMuLV), la proteína de la envoltura del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), la proteína de la envoltura del virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), la proteína de la envoltura del virus del tumor mamario murino (MuMTV), la proteína de la envoltura del virus del sarcoma de Rous (RSV), la proteína de la envoltura del virus del sarampión (también MV por measles virus), la proteína de la envoltura del virus de la leucemia de Gibbon (GalV) o la proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G). Por lo tanto, la proteína de la envoltura puede modificarse para dirigirse a ciertos tipos de células o ciertas aplicaciones (uso de receptores de superficie como proteína de la envoltura).
También es posible modificar la proteína de la envoltura con un anticuerpo, un glicolípido y/o un ligando particular para apuntar a un receptor y/o un tipo celular particular.
Preferiblemente, la proteína de la envoltura es la proteína VSV-G.
Por “integrasa” se entiende la proteína enzimática codificada por el gen pol, que permite la integración del ADN retroviral en el ADN de la célula infectada por el retrovirus durante la replicación de dicho retrovirus.
Por “secuencia de encapsidación”, se designa un motivo de ARN (secuencia y estructura tridimensional) reconocido específicamente por un dominio de unión. Preferiblemente, la secuencia de encapsidación es un motivo de tallo-bucle. Más preferiblemente aún, la secuencia de encapsidación de la partícula retroviral es el motivo de tallo-bucle del ARN del bacteriófago MS2 o del fago PP7 tal como, por ejemplo, el resultante de la secuencia ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID NO: 1) o (ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID NO: 2), respectivamente. El motivo de tallo-bucle y más particularmente el motivo de tallo-bucle del ARN del bacteriófago MS2 o el del ARN del fago PP7, se pueden usar solos o repetidos varias veces, preferiblemente de 2 a 25 veces, más preferiblemente de 2 a 18 veces, por ejemplo, de 6 a 18 veces.
Por “dominio de unión”, se designa toda o parte de una proteína que se une específicamente a la secuencia de encapsidación unida a la secuencia de ARN de interés. Más particularmente, se trata de una proteína mutante o no mutante, definida por una estructura tridimensional, que se une específicamente a la secuencia de encapsidación.
Preferiblemente, el dominio de unión es un dominio heterólogo. Más preferiblemente, el dominio de unión es la proteína Coat del bacteriófago MS2, del fago PP7 o del fago Qp, la proteína nun del profago HK022, la proteína U1A o también la proteína hPum.
Más preferiblemente, el dominio de unión es la proteína Coat del bacteriófago MS2 o del fago PP7.
Más preferiblemente aún, cuando el dominio de unión es la proteína Coat del fago PP7, la secuencia de la misma es deficiente para el autoensamblaje, gracias a una deleción de los aminoácidos 67 a 75 (PCPAFG) (Chao et al. 2008). Preferiblemente, la secuencia de la proteína Coat del fago PP7 tiene codones optimizados para células humanas, es decir, que las bases del ADN se eligen para codificar los aminoácidos presentes preferentemente en la especie humana.
Por “cada secuencia”, se entiende que las secuencias de encapsidación pueden ser idénticas o diferentes, dependiendo de si estas secuencias de encapsidación son reconocidas por un dominio de unión idéntico o diferente. De hecho, la partícula retroviral según la invención puede comprender uno o más dominios de unión. Cuando se introducen varios dominios de unión, se pueden introducir en la poliproteína Gag y/o en la integrasa.
El dominio de unión no solo permite el reconocimiento de la secuencia de encapsidación sino también la encapsidación de los ARN que llevan la secuencia de encapsidación en la partícula (o en el presente caso, de un ARN no viral ligado a una secuencia de encapsidación).
Por “encapsidación” se entiende la encapsidación de un ARN en la cápside viral de una partícula viral. Se observará que, en la presente invención, la encapsidación de los ARN no virales se lleva a cabo mediante el reconocimiento de una señal de encapsidación no viral, en particular distinta de Psi.
Por “secuencia de interés”, se entiende una secuencia que codifica o tiene una función de interés para el usuario. Más particularmente, la secuencia de interés llevada por cada uno de los dos ARN no virales encapsidados puede ser idéntica o diferente.
Usando las partículas según la invención, es posible transferir diferentes ARN no virales a las células diana.
Como los ARN encapsidados no son virales, estos ARN no exhiben los sitios de reconocimiento de las proteínas codificadas por el gen pol.
De hecho, estos ARN no virales no entran en las etapas precoces del ciclo replicativo de los retrovirus, a saber: - La copia del ARN viral monocatenario en ADN bicatenario mediante la transcriptasa inversa;
- Maduración del ADN viral bicatenario mediante reconocimiento de los extremos LTR por la integrasa y maduración del complejo de preintegración citoplasmática en un complejo de preintegración nuclear.
Por lo tanto, estas proteínas virales (transcriptasa inversa, integrasa) codificadas por el gen pol son opcionales en la partícula y, por lo tanto, el gen pol puede estar presente o delecionado parcial o totalmente. De preferencia, el gen pol está presente o parcialmente delecionado.
Se observará que las partículas retrovirales según la invención comprenden un material genético que es tanto viral como no viral:
- el gen gag, que puede ser viral o quimérico. Más particularmente, el gen gag es quimérico cuando el dominio o dominios de unión se introducen en él.
- Opcionalmente, el gen pol, que puede ser viral o quimérico. Dado que el gen pol codifica varias enzimas, las secuencias relacionadas con estas enzimas pueden estar total o parcialmente delecionadas, presentes y no funcionales, o presentes y funcionales. Más particularmente, el gen pol es quimérico cuando el dominio o dominios de unión se introducen en la integrasa.
- Al menos dos ARN no virales, cada uno de los cuales lleva una secuencia de interés y una secuencia de encapsidación. Más particularmente, estos ARN no virales carecen de toda secuencia viral.
Más específicamente, las partículas retrovirales según la divulgación permiten introducir en las células diana ARN capaces de inducir:
• La transferencia de una o más secuencias codificantes endógenas o exógenas de interés desde la célula diana, • La transferencia de uno o más ARN no codificantes, como ARN capaces de inducir un efecto sobre la expresión genética, por ejemplo, mediante shARN, miARN, sgARN, LncARN o circARN.
• La transferencia de ARN celulares, de tipo ARN mensajeros u otros (miARN, etc.), de replicones bajo genómica de virus ARN (VHC, etc.) o de genomas completos de virus ARN,
• la expresión simultánea de secuencias codificantes o no codificantes endógenas o exógenas de la célula diana,
• participar en la modificación del genoma de la célula diana mediante sistemas de ingeniería del genoma, por ejemplo, según la invención, el sistema CRISPR.
Por “nucleasa” se entiende una enzima que tiene la capacidad de escindir una o dos cadenas de ADN, en donde una nucleasa tiene la capacidad de iniciar la escisión de un enlace fosfodiéster de ácidos nucleicos de dos nucleótidos.
Ventajosamente, la nucleasa es una endonucleasa, es decir, que corta la cadena de ADN dentro de esta última.
Además, la nucleasa puede generar extremos cohesivos o extremos no cohesivos. Genera ventajosamente extremos cohesivos.
La nucleasa puede estar en su forma nativa (WT), en una forma mutada, en una forma optimizada, en una forma truncada o en una forma invalidada. De hecho, es posible mutar la nucleasa nativa para invalidar sus capacidades para escindir el enlace fosfodiéster de los ácidos nucleicos.
Al menos una de las secuencias de interés de los ARN no virales encapsidados comprende una parte que codifica una nucleasa, es decir, que esta secuencia de ARN solo puede comprender una secuencia de ARN que codifica una nucleasa, nucleasa o alternativamente una secuencia de ARN que codifica una nucleasa y una o más secuencias de ARN distintas, pudiendo estas otras secuencias de ARN, por ejemplo, codificar al menos una proteína, idéntica o diferente, o una secuencia de ARN no codificante.
Más particularmente, la nucleasa se elige del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR.
El sistema de ingeniería del genoma CRIS-PR/Cas9 se ha convertido en una herramienta de ingeniería genética con un gran potencial. Implica dos tipos de componentes:
- CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) caracterizadas por series de repeticiones directas cortas (de 21 a 37 pares de bases) y regularmente espaciadas por secuencias llamadas “espadadoras”, generalmente únicas, de 20 a 40 pares de bases;
- una de las nucleasas asociadas al sistema CRISPR, preferiblemente la nucleasa Cas9 (CRISPR associated protein 9), es decir, una enzima especializada para cortar el ADN con dos zonas de corte activas, una para cada cadena de la doble hélice. Por ejemplo, S. pyogenes usa la herramienta Cas9 para detectar y vencer el ADN extraño, como el ADN invasor de bacteriófagos o de un ADN plasmídico. Cas9 realiza esta detección desenrollando el ADN extraño y comprobando la complementariedad con la región de espaciamiento de una veintena de pares de bases del ARN guía. Si una secuencia de ADN está relacionada con el ARN guía, Cas9 corta el ADN invasivo.
Este sistema se utiliza para modificar fácil y rápidamente el genoma de células animales y vegetales. Gracias a la especificidad de la diana de Cas9 que proviene de la complementariedad del ARN guía y del ADN y no de modificaciones de la proteína en sí (como TALEN y nucleasas con dedos de zinc), la herramienta Cas9 puede apuntar a ADN nuevo muy fácilmente.
El sistema de ingeniería del genoma TALEN utiliza una nucleasa artificial generada por la fusión de un dominio de unión al ADN, llamado TALE, con un dominio que tiene la capacidad de escindir el ADN, llamado TALENs. La simple relación entre la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN reconocida por el dominio de unión al ADN permite la síntesis de proteínas personalizadas. Estos sistemas pueden diseñarse para unirse a casi cualquier secuencia de ADN diana específica combinando un dominio de reconocimiento de ADN diana TALE con un dominio de escisión del ADN.
Los efectores TAL (TALE) son proteínas secretadas naturalmente por la bacteria Xanthomonas que comprenden un dominio de unión al ADN que consta de repeticiones de 33 o 34 aminoácidos idénticos excepto los aminoácidos 12 y 13 que son muy variables, que confiere el reconocimiento de un nucleótido específico. Esta simple relación entre la secuencia de aminoácidos y el reconocimiento de ADN permite la creación de dominios de unión de ADN específicos de secuencia seleccionando un conjunto de segmentos repetidos que contienen los residuos variables apropiados. Estos dominios de unión a ADN específicos de una secuencia pueden diseñarse rápidamente para unirse a casi cualquier secuencia de ADN deseada.
El dominio de escisión de ADN no específico de la endonucleasa Fok1 puede usarse para construir nucleasas híbridas que se ha demostrado que son efectivas en pruebas en levaduras, en células vegetales y animales. Los primeros estudios sobre TALEN se realizaron con el dominio original de Fok1, o variantes de Fok1 con mayor especificidad o eficiencia de escisión del ADN.
Los dominios Fok1 funcionan en forma de un dímero, lo que requiere dos construcciones con dominios de unión al ADN dirigidos contra sitios del genoma que tienen orientaciones de la cabeza a la cola y un espaciado correcto.
Al combinar un dominio TALE con un dominio de escisión de ADN (que cortará la cadena de ADN), se pueden crear enzimas de restricción específicas para cualquier secuencia de ADN.
El sistema de dedos de Zn utiliza nucleasa de dedos de zinc y consiste en una combinación de dos proteínas, cada una de las cuales comprende tres dedos de zinc de reconocimiento de ADN elegidos específicamente y un dominio catalítico de la endonucleasa Fok I.
La naturaleza de los aminoácidos que forman un dedo de zinc conducirá al reconocimiento de una secuencia de ADN específica de tres nucleótidos. Por lo tanto, al usar dos proteínas que comprenden cada una tres dedos de zinc específicos, el reconocimiento se lleva a cabo en una secuencia específica de dieciocho nucleótidos y conferirá especificidad de reconocimiento al genoma.
La endonucleasa utilizada es el dominio de endonucleasa de la enzima Fok I y actúa en forma dimérica.
Los dominios Fok1 funcionan en forma de un dímero, lo que requiere dos construcciones con dominios de unión al ADN dirigidos contra sitios del genoma que tienen orientaciones de la cabeza a la cola y un espaciado correcto. Ventajosamente, se utilizan dos proteínas que comprenden cada una tres estructuras de dedos de zinc que reconocen secuencias distantes por unos pocos nucleótidos. La unión de las dos proteínas con dedos de zinc en sus respectivas secuencias acerca las dos endonucleasas asociadas con ellas. Esta aproximación permite la dimerización de endonucleasas y posteriormente la escisión de la doble cadena de ADN.
Preferiblemente, la nucleasa es Cas9.
Por “nucleasas asociadas al sistema CRISPR”, se puede mencionar sin limitación la nucleasa Cas9 en su versión de tipo salvaje (Cas9 WT), mutada para uno de sus dos sitios activos (Cas9N o Cas9 Nickasa) o mutada para sus dos sitios activos (dCas9), así como la nucleasa Cpf1.
La nucleasa Cas9 (proteína 9 asociada a CRISPR) es una enzima especializada para cortar ADN con dos zonas de corte activas, una para cada cadena de la doble hélice. Por ejemplo, S. pyogenes usa la herramienta Cas9 para detectar y descomponer ADN extraño, como la invasión del ADN de bacteriófagos o de un ADN plasmídico.
La nucleasa TALEN (Transcription activator-like effector nucleases) se genera mediante la fusión de un dominio de unión al ADN, llamado TALE, y un dominio enzimático que tiene la capacidad de escindir el ADN como, por ejemplo, el dominio catalítico de Fok1, o variantes de Fok1.
Por “variante de Fok1”, se designa cualquier dominio proteico que hace posible cortar la secuencia de ADN 5'-GGATG(N)9-3'.
La nucleasa del sistema Zn Finger (también conocida como nucleasa del sistema de dedos de zinc) es una enzima artificial formada por la fusión de un dominio de unión al ADN, del tipo de dedo de zinc, y un dominio catalítico de escisión del ADN, por ejemplo, el dominio catalítico de Fok1, o variantes de Fok1.
De acuerdo con un primer tipo de partícula retroviral según la divulgación, la secuencia de interés de al menos dos ARN no virales encapsidados puede comprender una parte que codifica una nucleasa.
Estas partículas son de particular interés para los sistemas de ingeniería del genoma TALEN y dedos de Zn, cuyas nucleasas actúan en forma dimérica. También preferiblemente, la secuencia de interés comprende una parte que codifica la nucleasa TALEN o la nucleasa con dedos de zinc, más preferiblemente para el dominio catalítico de Fok1, o variantes de Fok1.
De acuerdo con la invención, los al menos dos ARN no virales encapsidados se distinguen por su secuencia de interés, en donde al menos una de dichas secuencias de interés encapsidadas de ARN no virales comprende una parte que codifica una nucleasa elegida entre el grupo que consiste en las nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, y la secuencia de interés del otro ARN no viral encapsidado correspondiente a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN.
Más particularmente, en un segundo tipo de partícula retroviral según la divulgación:
- la secuencia de interés de al menos un ARN comprende una parte que codifica una nucleasa y una parte que codifica un sistema de reconocimiento de ADN en 3', y
- la secuencia de interés de al menos un ARN comprende una parte que codifica una nucleasa y una parte que codifica un sistema de reconocimiento del ADN en 5'.
La parte que codifica un sistema de reconocimiento de ADN de la secuencia de interés corresponde ventajosamente a un ARN que codifica una proteína capaz de reconocer una secuencia específica del ADN.
Ventajosamente, en una partícula retroviral según este segundo tipo, las secuencias de interés comprenden una parte que codifica el dominio catalítico de la nucleasa FokI, o variantes de la misma.
Este dominio catalítico de la nucleasa FokI se usa ventajosamente para la construcción de las nucleasas
recombinantes TALEN y de la nucleasa con dedos de zinc, respectivamente, para la implementación de los sistemas de ingeniería del genoma TALEN o dedos de Zn.
A modo de ejemplo, la partícula retroviral según la divulgación puede comprender dos ARN no virales encapsidados de secuencias de interés diferentes:
- una primera secuencia de interés que comprende una parte que codifica la nucleasa Fokl y una parte que codifica un TALE 3', y
- una segunda secuencia de interés que comprende una parte que codifica la nucleasa Fokl y una parte que codifica un TALE 5';
o la partícula retroviral según la divulgación puede comprender dos ARN no virales encapsidados con diferentes secuencias de interés:
- una primera secuencia de interés que comprende una parte que codifica la nucleasa Fokl y una parte que codifica tres dedos de zinc para el reconocimiento de una secuencia de ADN en 3', y
- una segunda secuencia de interés que comprende una parte que codifica la nucleasa Fokl y una parte que codifica tres dedos de zinc para reconocer una secuencia de ADN en 5'.
De acuerdo con una realización específica, en la partícula retroviral según la invención, la secuencia de interés de al menos uno de los ARN no virales encapsidados codifica una nucleasa asociada al sistema CRISPR.
Ventajosamente, en esta realización específica, la nucleasa es Cas9.
Más particularmente, en la partícula retroviral según esta realización específica, los al menos dos ARN no virales encapsidados se distinguen por su secuencia de interés y la secuencia de interés del otro ARN no viral encapsidado corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN.
Una guía de ARN corresponde a una secuencia de ARN que generalmente comprende dos elementos de reconocimiento:
- un ARN no codificante que varía de 3 a 40 bases, capaz de hibridar por complementariedad de bases con una secuencia específica de a Dn y
- un ARN no codificante denominado “transactivador” (“scaffold”), que permite fijar la nucleasa en el ADN.
La secuencia de ARN permite apuntar específicamente a un sitio específico de escisión de ADN.
La secuencia de interés puede comprender una o más partes correspondientes a una o más guías de ARN, idénticas o diferentes.
Ventajosamente, la secuencia de interés del segundo ARN no viral encapsidado corresponde a una guía de ARN. La guía de ARN incluye tanto la porción de reconocimiento de ADN como la porción de unión a una nucleasa.
Preferiblemente, la guía de ARN es un sgARN. Aún más preferiblemente, la guía de ARN es un sgARN quimérico que comprende dos repeticiones de la secuencia de encapsidación.
Preferiblemente, la partícula comprende dos ARN de diferentes secuencias de interés:
- una primera secuencia de interés que codifica la nucleasa Cas9, y
- una segunda secuencia de interés correspondiente a una guía de ARN.
Ventajosamente, la partícula retroviral según esta realización específica comprende, además, al menos un tercer ARN no viral encapsidado que tiene una secuencia de interés correspondiente a un segundo elemento de reconocimiento de una guía de ARN o de una guía de ARN adicional.
Ventajosamente, la partícula comprende tres ARN de secuencias de interés diferentes:
- una primera secuencia de interés que codifica la nucleasa Cas9,
- una segunda secuencia de interés correspondiente a una guía de ARN, y
- una tercera secuencia de interés correspondiente a una guía de ARN idéntica o diferente de la segunda secuencia de interés.
Ventajosamente, la partícula retroviral según la invención comprende una proteína de nucleocápside derivada de la poliproteína Gag, una proteína de la envoltura, opcionalmente una integrasa y al menos dos ARN no virales
encapsidados, cada uno de los cuales comprende una secuencia de ARN de interés vinculada a una secuencia de encapsidación, en donde cada secuencia de encapsidación es reconocida por un dominio de unión heterólogo introducido en la proteína de nucleocápside y/o en la integrasa, en la que los al menos dos ARN no virales encapsidados se distinguen por su secuencia de interés:
- al menos una de dichas secuencias de interés de ARN no virales encapsidados que comprende una parte que codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, y
- la secuencia de interés del otro ARN no viral encapsidado correspondiente a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN.
Por “proteína de nucleocápside”, se entiende la proteína de estructura NC codificada por el gen gag. Cuando el dominio de unión se introduce en la proteína de nucleocápside, esta proteína es una proteína quimérica, derivada de un gen gag quimérico.
Cuando el dominio de unión se introduce en la integrasa, entonces la integrasa es una proteína quimérica, derivada de un gen pol quimérico.
Por “proteína quimérica”, se designa una proteína recombinante que comprende varias secuencias proteicas diferentes fusionadas entre sí.
De acuerdo con una primera realización, en la partícula retroviral según la invención, el dominio de unión se introduce en la proteína de nucleocápside y los al menos dos ARN no virales encapsidados se distinguen por su secuencia de ARN.
Esta primera realización permite la expresión precoz y transitoria de los ARN de interés, sin un evento de integración asociado en el genoma de las células diana.
De hecho, cuando una partícula de acuerdo con esta primera realización se pone en contacto con una célula diana, la membrana de la partícula retroviral y la de la célula diana se fusionarán y permitirán la liberación del contenido de la célula diana. Luego, los ARN se liberan en el citoplasma y la maquinaria celular permite que estos ARN se traduzcan directamente en proteína(s), es decir, sin etapas adicionales como la transcripción inversa, la translocación al núcleo o la integración en el genoma de la célula diana.
Más particularmente, los al menos dos ARN no virales exhiben la misma secuencia de encapsidación. En este caso, los al menos dos ARN no virales encapsidados se distinguen por su secuencia de ARN de interés, es decir, las secuencias de ARN de interés comprendidas en los dos ARN no virales encapsidados son diferentes. Por “diferentes” nos referimos a secuencias de interés que no son idénticas o tienen una diferencia que no es el resultado de una mutación espontánea o involuntaria elegida por el manipulador.
Alternativamente, los al menos dos ARN no virales exhiben dos secuencias de encapsidación diferentes. Estas al menos dos secuencias de encapsidación son luego reconocidas por al menos dos dominios de unión diferentes, introduciéndose al menos uno de estos dominios en la proteína de nucleocápside. En este caso, según la divulgación, los al menos dos ARN no virales encapsidados pueden contener secuencias de interés idénticas o diferentes.
Es posible encapsidar al menos dos ARN no virales, preferiblemente tres ARN no virales.
De acuerdo con una realización particular de la primera realización, se introduce un segundo dominio de unión en la proteína de nucleocápside de la partícula retroviral según la invención.
A modo de ejemplo, el segundo dominio de unión puede ser la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 cuando el primer dominio de unión es la proteína “Coat” del fago PP7 o el segundo dominio de unión puede ser la proteína “Coat” del fago PP7 cuando el primer dominio de unión es la proteína “Coat” del bacteriófago MS2.
En este caso, al menos dos ARN no virales encapsidados llevan diferentes secuencias de encapsidación, correspondiendo cada secuencia de encapsidación respectivamente al primer y segundo dominio de unión introducido en la proteína de nucleocápside.
Más particularmente, cuando se encapsidan tres ARN no virales:
- al menos dos de los ARN no virales encapsidados tienen la misma secuencia de encapsidación correspondiente al primer dominio de unión y se distinguen solo por su secuencia de ARN de interés,
- el tercer ARN no viral encapsidado puede llevar una secuencia de encapsidación idéntica o diferente. Cuando la secuencia de encapsidación es diferente, puede corresponder a un segundo dominio de unión introducido en la proteína de nucleocápside.
También se pueden introducir otros dominios de unión en la proteína de nucleocápside.
Además del dominio o de los dominios de unión introducidos en la proteína de nucleocápside, también es posible introducir un dominio de unión en la integrasa.
La integrasa es entonces una proteína quimérica, derivada de un gen pol quimérico.
Preferiblemente, cuando el dominio de unión se introduce en la integrasa, la secuencia de la integrasa se muta al nivel del dominio C-terminal para insertar la secuencia del dominio de unión. Más preferiblemente aún, la secuencia de la integrasa se muta al nivel del dominio C-terminal para introducir la de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 o del fago PP7.
En este caso, los al menos dos ARN no virales encapsidados pueden llevar diferentes secuencias de encapsidación, correspondiendo cada secuencia de encapsidación a los dominios de unión introducidos en la proteína de nucleocápside y en la integrasa, respectivamente.
Más particularmente, cuando se encapsidan tres ARN no virales:
- al menos dos de los ARN no virales encapsidados tienen la misma secuencia de encapsidación correspondiente al primer dominio de unión y se distinguen solo por su secuencia de ARN de interés,
- el tercer ARN no viral encapsidado que lleva una secuencia de encapsidación diferente, correspondiente a un segundo dominio de unión introducido en la integrasa.
También se pueden introducir otros dominios de unión en la integrasa.
Ventajosamente, la partícula retroviral según la invención es una partícula lentiviral.
Preferiblemente, en tal partícula lentiviral:
- el dominio de unión es la proteína “Coat” del bacteriófago MS2,
- la secuencia de encapsidación de ARN no virales es una secuencia de tallo-bucle de MS2,
- la proteína de nucleocápside es la proteína de nucleocápside (NC) del VIH perteneciente a la poliproteína quimérica Gag, estando mutada la secuencia NC a nivel del segundo dedo de zinc para insertar la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2.
Ventajosamente:
- La proteína de la envoltura es la proteína VSV-G que codifica la proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular.
- La secuencia de encapsidación comprende de 2 a 25 repeticiones de la secuencia de tallo-bucle de MS2, preferiblemente de 6 a 18 repeticiones de la secuencia de tallo-bucle, más preferiblemente aún, de 10 a 14, por ejemplo, 12 repeticiones. Preferiblemente, la secuencia de tallo-bucle es la siguiente: ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID NO: 1).
O, preferiblemente, en tal partícula lentiviral:
- el dominio de unión es la proteína “Coat” del fago PP7,
- la secuencia de encapsidación de los ARN no virales es una secuencia de tallo-bucle de PP7,
- la proteína de la nucleocápside es la proteína de la nucleocápside (NC) del VIH perteneciente a la poliproteína quimérica Gag, estando mutada la secuencia NC a nivel del segundo dedo de zinc para insertar la secuencia de la proteína “Coat” del fago PP7.
Ventajosamente:
- La proteína de la envoltura es la proteína VSV-G que codifica la proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular.
- La secuencia de encapsidación comprende de 2 a 25 repeticiones de la secuencia de tallo-bucle de PP7, preferiblemente de 2 a 18 repeticiones de la secuencia de tallo-bucle, más preferiblemente aún, de 2 a 12, por ejemplo, 6 repeticiones. Preferiblemente, la secuencia de tallo-bucle es la siguiente: ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID NO: 2).
Ventajosamente, SEQ ID NO: 2 se puede optimizar para promover el plegado del tallo-bucle. En particular, se encontró que podría ser interesante insertar sucesivamente la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4. Esta alternancia de la SEQ ID NO: 2 y de la SEQ ID NO: 4 (ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag) para promover el plegamiento es particularmente ventajosa en el caso de un ARN codificante. Por otro lado, para un ARN no codificante, cada motivo
de tallo-bucle de PP7 se obtiene de manera ventajosa insertando sucesivamente la secuencia de tallo-bucle SEQ ID NO: 5 (ggagcagacgatatggcgtcgctcc) y la secuencia de tallo-bucle SEQ ID NO: 6 (ccagcagagcatatgggctcgctgg).
Opcionalmente, el segundo dominio de unión introducido en la integrasa puede ser la proteína Coat del fago PP7 si el primer dominio de unión es la proteína Coat del bacteriófago MS2, o el segundo dominio de unión introducido en la integrasa puede ser la proteína Coat del bacteriófago MS2 si el primer dominio de unión es la proteína Coat del fago PP7.
De acuerdo con una segunda realización, la invención se refiere a una partícula retroviral que comprende una proteína derivada de la poliproteína Gag, preferiblemente una proteína de nucleocápside, una proteína de envoltura, una integrasa y al menos dos ARN no virales encapsidados, en donde los ARN virales comprenden cada uno una secuencia de ARN de interés unida a una secuencia de encapsidación, siendo reconocida cada secuencia de encapsidación por un dominio de unión heterólogo introducido en la integrasa y, opcionalmente, por un dominio de unión heterólogo introducido en una proteína derivada de la poliproteína Gag, preferiblemente una proteína de nucleocápside.
Esta segunda realización permite la expresión transitoria de los ARN de interés, sin un evento de integración asociado en el genoma de las células diana.
Preferiblemente, en esta segunda realización, la secuencia de la integrasa se muta al nivel del dominio C-terminal para insertar la secuencia del dominio de unión.
El dominio de unión es un dominio heterólogo. Más particularmente, el dominio de unión es la proteína Coat del bacteriófago MS2, del fago PP7 o del fago Qp, la proteína nun del profago HK022, la proteína U1A o también la proteína hPum.
Preferiblemente, la secuencia de la integrasa se muta al nivel del dominio C-terminal para introducir la de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 o del fago PP7.
Los al menos dos ARN no virales pueden tener o no la misma secuencia de encapsidación.
Asimismo, según la divulgación, los al menos dos ARN no virales encapsidados pueden tener o no la misma secuencia de ARN de interés.
Preferiblemente, los al menos dos ARN no virales encapsidados se distinguen por su secuencia de ARN de interés, es decir, que las secuencias de ARN de interés comprendidas en los dos ARN no virales encapsidados son diferentes.
Más particularmente, los al menos dos ARN no virales exhiben la misma secuencia de encapsidación, siendo esta última reconocida por el dominio de unión introducido en la integrasa.
Es posible encapsidar al menos dos ARN no virales, preferiblemente tres ARN no virales.
De acuerdo con una forma de realización particular de la segunda forma de realización, se introduce un segundo dominio de unión en la integrasa de la partícula retroviral según la invención.
A modo de ejemplo, el segundo dominio de unión puede ser la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 cuando el primer dominio de unión es la proteína “Coat” del fago PP7 o el segundo dominio de unión puede ser la proteína “Coat” del fago PP7 cuando el primer dominio de unión es la proteína “Coat” del bacteriófago MS2.
En este caso, al menos dos ARN no virales encapsidados llevan diferentes secuencias de encapsidación, correspondiendo cada secuencia de encapsidación, respectivamente, al primer y segundo dominio de unión introducido en la integrasa.
Más particularmente, cuando se encapsidan tres ARN no virales:
- al menos dos de los ARN no virales encapsidados tienen la misma secuencia de encapsidación correspondiente al primer dominio de unión, pudiendo posiblemente distinguirse estos dos ARN no virales por su secuencia de ARN de interés,
- el tercer ARN no viral encapsidado puede llevar una secuencia de encapsidación idéntica o diferente. Cuando la secuencia de encapsidación es diferente, puede corresponder a un segundo dominio de unión introducido en la integrasa.
También se pueden introducir otros dominios de unión en la integrasa.
Además del dominio o dominios de unión introducidos en la integrasa, también es posible introducir un dominio de unión en la proteína de nucleocápside.
La proteína de nucleocápside es entonces una proteína quimérica, derivada de un gen gag quimérico.
En este caso, los al menos dos ARN no virales encapsidados pueden llevar diferentes secuencias de encapsidación, correspondiendo cada secuencia de encapsidación a los dominios de unión introducidos en la integrasa y en la proteína de nucleocápside, respectivamente.
Más particularmente, cuando se encapsidan tres ARN no virales:
- al menos dos de los ARN no virales encapsidados tienen la misma secuencia de encapsidación correspondiente al primer dominio de unión introducido en la integrasa, pudiendo posiblemente distinguirse estos ARN no virales por su secuencia de ARN de interés,
- el tercer ARN no viral encapsidado lleva una secuencia de encapsidación diferente, correspondiente a un segundo dominio de unión introducido en la proteína de nucleocápside.
También se pueden introducir otros dominios de unión en la proteína de nucleocápside.
Ventajosamente, en el caso de que la partícula según la invención comprenda una proteína de nucleocápside, el dominio de unión se puede introducir en la proteína de nucleocápside, se puede introducir un segundo dominio de unión en la nucleocápside y/o en la integrasa.
Preferiblemente, la partícula retroviral según la invención comprende entonces una proteína de nucleocápside, una proteína de la envoltura, opcionalmente una integrasa y al menos dos ARN no virales encapsidados, comprendiendo cada uno de los ARN no virales encapsidados una secuencia de ARN de interés vinculada a una secuencia de encapsidación, siendo al menos una secuencia de encapsidación el motivo de tallo-bucle (o secuencia de tallo-bucle) del bacteriófago MS2 repetido 12 veces, siendo este motivo reconocido por la proteína Coat del bacteriófago MS2 introducido en la proteína de nucleocápside, y en la que los al menos dos ARN no virales encapsidados se distinguen por su secuencia de interés: al menos una de dichas secuencias de interés de ARN no virales encapsidados que comprende una parte que codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, y la secuencia de interés del otro ARN no viral encapsidado correspondiente a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN.
El motivo de tallo-bucle es ventajosamente la secuencia SEQ ID NO: 1.
A modo de ejemplo, tal partícula según la invención es la partícula MS2 (NC)-RLP 12X, descrita a continuación en los Ejemplos.
En esta partícula retroviral, el ARN no viral encapsidado que comprende como secuencia de encapsidación el motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2 repetido 12 veces es ventajosamente un ARN que codifica Cas 9, y un segundo ARN no viral encapsidado es un ARN correspondiente a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN o que codifica una guía, comprendiendo dicho ARN no viral encapsidado como secuencia de encapsidación el motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2 repetido 2 veces.
A modo de ejemplo, tal partícula según la invención es la partícula MS2 (NC)-RLP 12X 2X, descrita a continuación en los Ejemplos.
Alternativa o concomitantemente, la partícula retroviral de acuerdo con la invención comprende una proteína de nucleocápside, una proteína de la envoltura, opcionalmente una integrasa y al menos dos ARN no virales encapsidados, en donde cada uno de los ARN no virales encapsidados comprende una secuencia de ARN de interés vinculada a una secuencia de encapsidación, siendo al menos una secuencia de encapsidación el motivo de tallobucle del bacteriófago PP7 repetido 2 veces, siendo este motivo reconocido por la proteína Coat del bacteriófago PP7 introducido en la proteína de nucleocápside, y en la que los al menos dos a Rn no virales encapsidados se distinguen por su secuencia de interés: al menos una de dichas secuencias de interés de los ARN no virales encapsidados que comprenden una parte que codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, y la secuencia de interés del otro ARN no viral encapsidado correspondiente a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN.
Ventajosamente, el motivo de tallo-bucle es la secuencia SEQ ID NO: 2. Alternativamente, el motivo de tallo-bucle es una alternancia de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, en particular para un ARN codificante, o de SEQ ID NO: 5 y de SEQ ID NO: 6, en particular para un ARN no codificante.
A modo de ejemplo, cuando la partícula según la invención comprende únicamente como secuencia de encapsidación el motivo de tallo-bucle del bacteriófago PP7 repetido 2 veces, dicha partícula según la invención es la partícula PP7 (NC)-RLP 2X, descrita a continuación en el Ejemplos.
A modo de ejemplo, cuando la partícula según la invención comprende concomitantemente como secuencias de encapsidación el motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2 repetido 12 veces y el motivo de tallo-bucle del bacteriófago PP7 repetido 2 veces, dicha partícula de acuerdo con la invención es la partícula MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X, descrita de aquí en adelante en los Ejemplos.
Alternativamente, en la partícula retroviral según la invención, el dominio de unión puede introducirse en la integrasa,
pudiendo introducirse un segundo dominio de unión en la nucleocápside y/o en la integrasa.
Ventajosamente, la partícula retroviral según la invención es una partícula lentiviral.
Cuando la partícula retroviral es una partícula lentiviral, es posible expresar transitoriamente ARN de interés, sin un evento de integración asociado en el genoma de las células diana, en particular las células quiescentes.
De hecho, además de su papel en la propia reacción de integración, la integrasa (IN) participa en diferentes etapas del ciclo replicativo de los retrovirus como la morfogénesis de la partícula viral, la transcripción inversa y la importación nuclear del complejo de preintegración (PIC).
Más particularmente, en los lentivirus, la integrasa contiene secuencias de localización nuclear (NLS) que permiten su localización en el núcleo en virtud del PIC. Por lo tanto, cuando la encapsidación de los ARN no virales se lleva a cabo mediante un dominio de unión portado por una integrasa de un lentivirus, los ARN no virales encapsidados se transportarán al núcleo de la célula diana. De hecho, cuando se pone en contacto una partícula lentiviral según esta segunda realización con una célula diana, la membrana de la partícula y la de la célula diana se fusionarán y permitirán la liberación del contenido de la cápside en la célula diana. Luego, los ARN son atendidos por la integrasa que, a través de los PIC, permitirá la importación de los ARN al núcleo. Este soporte es de particular interés para determinadas aplicaciones, como la expresión en células quiescentes. En el caso de partículas retrovirales, distintas de los lentivirus, la integrasa no contiene estos NLS y, por lo tanto, se localiza en el citoplasma. Sin embargo, es posible agregar en este tipo de integración, las secuencias NLS para inducir la localización nuclear de la integrasa y, por lo tanto, de los ARN soportados por esta integrasa.
Este soporte también es particularmente útil para un sistema CRISPR, que utiliza guías de ARN que se hibridan específicamente con el genoma de la célula diana. Una vez hibridadas, estas guías de ARN guían una endonucleasa (Cas9), que permitirá la modificación de un locus específico del genoma de la célula diana. Más particularmente, en una partícula lentiviral de este tipo:
- el dominio de unión es la proteína “Coat” del bacteriófago MS2,
- la secuencia de encapsidación de ARN no virales es una secuencia de tallo-bucle de MS2,
- la integrasa es una proteína enzimática quimérica cuya secuencia se muta a nivel del dominio C-terminal para insertar la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2.
O, más particularmente, en tal partícula lentiviral:
- el dominio de unión es la proteína “Coat” del fago PP7,
- la secuencia de encapsidación de los ARN no virales es una secuencia de tallo-bucle de PP7,
- la integrasa es una proteína enzimática quimérica cuya secuencia se muta a nivel del dominio C-terminal para insertar la secuencia de la proteína “Coat” del fago PP7.
Opcionalmente, el segundo dominio de unión introducido en la nucleocápside puede ser la proteína Coat del fago PP7 si el primer dominio de unión es la proteína Coat del bacteriófago MS2 o el segundo dominio de unión introducido en la integrasa puede ser la proteína Coat del bacteriófago MS2 si el primer dominio de unión es la proteína Coat del fago PP7.
De hecho, la integrasa (IN) se compone de 3 dominios funcionales distintos, cada uno indispensable para asegurar una reacción de integración completa. El dominio N-terminal contiene un motivo similar a un dedo de zinc que estabiliza la estructura plegada del IN y aumenta la actividad catalítica de la enzima. El dominio central de IN contiene el motivo de aminoácidos DDE al que se atribuye la actividad catalítica de la enzima. Este dominio central también participa en el reconocimiento de la secuencia de nucleótidos conservada en cada extremo del ADN retroviral. El dominio C-terminal es el menos conservado entre la familia de retrovirus. Posee actividad de unión al ADN y es indispensable para las reacciones de maduración de los extremos 3' de la transferencia de cadena. Además de su papel en la reacción de integración en sí, IN participa en diferentes etapas del ciclo replicativo de retrovirus como la morfogénesis de la partícula viral, la transcripción inversa y la importación nuclear del complejo de preintegración.
Como describen Petit et al. (1999; J. Virol. P5079-5088), la inserción de una secuencia exógena en el C-terminal del IN no altera las etapas de producción y transducción de las células diana, mientras que la misma inserción en el N-terminal no permite la detección de un evento de transducción.
Por lo tanto, la partícula retroviral se modificó para contener la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 en fusión con la proteína de la integrasa (ver Figura I) o la proteína “Coat” del fago PP7 (ver Figura XXXVII). El plásmido de encapsidación p8.74, que lleva el gen pol que codifica la proteína de la integrasa, se modifica para insertar la secuencia que codifica la proteína Coat en el C-terminal de la integrasa mediante PCR de ensamblaje. El plásmido p8.74 se linealiza por PCR y luego la secuencia Coat, amplificada previamente por PCR, se clona en el nivel C-terminal de la integrasa, ya sea directamente de un extremo a otro o con la adición de un enlazador.
Ventajosamente:
- La proteína de la envoltura es la proteína VSV-G que codifica la proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular.
- La secuencia de encapsidación comprende de 2 a 25 repeticiones de la secuencia de tallo-bucle de MS2 y/o de PP7, dependiendo del dominio de unión introducido, preferiblemente de 2 a 18 repeticiones, más preferiblemente de 2 a 18 repeticiones, tales como 6 a 18 repeticiones de la secuencia de tallo-bucle, más preferiblemente aún para la secuencia de tallo-bucle de MS2, de 10 a 14, por ejemplo 12 repeticiones.
- Preferiblemente, la secuencia de tallo-bucle es la siguiente: ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID NO: 1) cuando el dominio de unión es la proteína Coat de MS2 y/o la secuencia de tallo-bucle es como sigue: ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID NO: 2) cuando el dominio de unión es la proteína Coat de PP7.
Varios ejemplos de partículas lentivirales de acuerdo con la invención se describen a continuación y para algunos con más detalle en los ejemplos que siguen:
- una partícula de MS2RLP o MS2 (NC)-RLP 12X es una partícula lentiviral formada por encapsidación de ARN que llevan el motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2, repetido 12 veces, mediante la inserción de la proteína Coat del bacteriófago MS2 en la nucleocápside,
- una partícula de MS2 (NC)-RLP 2X es una partícula lentiviral formada por encapsidación de ARN que llevan el motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2, repetido 2 veces, mediante la inserción de la proteína Coat del bacteriófago MS2 en la nucleocápside,
- una partícula MS2RLP 12X 2X o MS2 (NC)-RLP 12X 2X es una partícula lentiviral formada por encapsidación de al menos un primer ARN que lleva el motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2, repetido 12 veces y de al menos un segundo ARN que lleva el motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2, repetido 2 veces, mediante la inserción de la proteína Coat del bacteriófago MS2 en la nucleocápside,
- una partícula de MS2 (NC)-RLP 6X es una partícula lentiviral formada por encapsidación de ARN que llevan el motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2, repetido 6 veces, insertando la proteína Coat del bacteriófago MS2 en la nucleocápside,
- una partícula de MS2 (IN)-RLP 2X es una partícula lentiviral formada por encapsidación de ARN que llevan el motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2, repetido 2 veces, mediante la inserción de la proteína Coat del bacteriófago MS2 en la integrasa,
- una partícula de MS2 (IN)-RLP 6X es una partícula lentiviral formada por encapsidación de ARN que llevan el motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2, repetido 6 veces, mediante la inserción de la proteína Coat del bacteriófago MS2 en la integrasa,
- una partícula de MS2 (IN)-RLP 12X es una partícula lentiviral formada por encapsidación de ARN que llevan el motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2, repetido 12 veces, mediante la inserción de la proteína Coat del bacteriófago MS2 en la integrasa,
- una partícula PP7RLP o PP7 (NC)-RLP 2X es una partícula lentiviral formada por la encapsidación de ARN que llevan el motivo de tallo-bucle del fago PP7, repetido 2 veces, insertando la proteína Coat del fago PP7 en la nucleocápside,
- una partícula PP7 (NC)-RLP 6X es una partícula lentiviral formada por encapsidación de ARN que llevan el motivo de tallo-bucle del fago PP7, repetido 6 veces, insertando la proteína Coat del fago PP7 en la nucleocápside,
- una partícula PP7RLP o PP7 (NC)-RLP 12X es una partícula lentiviral formada por encapsidación de ARN que llevan el motivo de tallo-bucle del fago PP7, repetido 12 veces, insertando la proteína Coat del fago PP7 en la nucleocápside,
- una partícula PP7 (IN)-RLP 2X es una partícula lentiviral formada por encapsidación de ARN que llevan el motivo de tallo-bucle del fago PP7, repetido 2 veces, insertando la proteína Coat del fago PP7 en la integrasa,
- una partícula PP7 (IN)-RLP 6X es una partícula lentiviral formada por encapsidación de ARN que llevan el motivo de tallo-bucle del fago PP7, repetido 6 veces, insertando la proteína Coat del fago PP7 en la integrasa,
- una partícula PP7 (IN)-RLP 12X es una partícula lentiviral formada por encapsidación de ARN que llevan el motivo de tallo-bucle del fago PP7, repetido 12 veces, insertando la proteína Coat del fago PP7 en la integrasa.
- una partícula MS2/PP7RLP o MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X es una partícula lentiviral formada por la encapsidación de ARN que llevan el motivo del tallo-bucle del bacteriófago MS2, repetido 12 veces, mediante la inserción de la proteína Coat del bacteriófago MS2 en la nucleocápside, y que lleva el motivo de tallo-bucle del fago PP7, repetido 2 veces, mediante la inserción de la proteína Coat del fago PP7 en la nucleocápside.
Preferiblemente, la partícula lentiviral formada por encapsidación de ARNs lleva un motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2 o del fago PP7, repetido de 2 a 25 veces, más preferiblemente 2, 6 o 12 veces.
Más preferiblemente aún, la partícula de acuerdo con la invención se selecciona de MS2 (NC)-RLP 12X, MS2 (NC)-RLP 12X 2X, PP7 (NC)-RLP 6X, PP7 (NC)-RLP 2X, MS2 (IN)-RLP 12X, PP7 (IN)-RLP 6X y PP7 (IN)-RLP 2X, MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X.
La invención también se refiere a composiciones que comprenden partículas según la invención.
Más particularmente, las composiciones según la invención son composiciones concentradas. Ventajosamente, las composiciones también se purifican. Estas composiciones se pueden concentrar y purificar según el procedimiento descrito en la solicitud WO2013/014537.
Normalmente, las composiciones de acuerdo con la invención comprenden menos del 30% de contaminantes de ADN y menos del 45% de contaminantes de proteínas con respecto al sobrenadante crudo. Más particularmente, las composiciones según la invención comprenden menos del 30% de contaminantes de ADN y menos del 2% de contaminantes de proteínas con respecto al sobrenadante crudo.
Por “sobrenadante crudo”, se entiende el sobrenadante de cultivo(s) celular(es), que comprende partículas retrovirales de acuerdo con la invención, después de la clarificación. Una etapa de clarificación de este tipo se describe más particularmente a continuación en los procesos de fabricación de las partículas según la invención. Cuando la recuperación del sobrenadante se lleva a cabo en varias ocasiones, el sobrenadante crudo corresponde a todos los sobrenadantes recogidos, combinados (o “agrupados”) y luego clarificados.
Opcionalmente, las composiciones según la invención comprenden menos del 1% de contaminantes de ADN y menos del 1% de contaminantes de proteínas con respecto al sobrenadante crudo.
La invención también se refiere a kits para producir partículas según la invención y a los procedimientos de fabricación de estos kits.
Más particularmente, la divulgación se refiere a un kit para producir partículas según la invención, que comprende:
(i) un plásmido de expresión que comprende al menos una secuencia de interés, para la cual se inserta una secuencia de encapsidación aguas arriba, aguas abajo o dentro de esta secuencia,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína derivada de la poliproteína Gag y/o una integrasa quimérica, que comprende un dominio de unión que permite reconocer una secuencia de encapsidación, y
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
Más particularmente, la invención se refiere a un kit para producir partículas según la invención, que comprende:
(i) un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de ARN no virales diferentes, comprendiendo cada secuencia de ARN una secuencia de interés para la cual, aguas arriba, aguas abajo o dentro de esta secuencia, se inserta una secuencia de encapsidación, o alternativamente, un primer y un segundo plásmido de expresión que comprende cada uno una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo de la cual se inserta una secuencia de encapsidación, al menos una de las secuencias de interés que codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, donde la otra secuencia de interés corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína derivada de la poliproteína Gag y/o una integrasa, quimérica, que comprende un dominio de unión heterólogo que permite reconocer una secuencia de encapsidación, y
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
Dicho kit también puede incluir instrucciones para el uso de los plásmidos contenidos en el kit.
Más específicamente, cuando el kit tiene como objetivo producir partículas según la primera realización, este kit comprende:
(i) un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de ARN no virales diferentes, comprendiendo cada secuencia de ARN una secuencia de interés para la cual se inserta una secuencia de encapsidación aguas arriba, aguas abajo o dentro de esta secuencia de interés, o alternativamente un primer y un segundo plásmido de expresión que comprende una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo de la cual se inserta una secuencia de encapsidación, en donde al menos una de las secuencias de interés codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, la otra secuencia de interés corresponde al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína de nucleocápside quimérica que comprende un dominio de unión heterólogo que hace posible reconocer la secuencia de encapsidación, y
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
Las al menos dos secuencias de ARN no virales son diferentes porque las secuencias de interés son diferentes y, opcionalmente, las secuencias de encapsidación son diferentes.
Siendo un plásmido una estructura de ADN, se entiende por “plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de ARN no virales” un plásmido de expresión que codifica al menos dos secuencias de ARN no virales.
De hecho, los plásmidos de expresión de los kits contienen todas las secuencias de ADN necesarias para obtener al menos un ARN no viral por transcripción. El plásmido de expresión contiene al menos un promotor, seguido de una secuencia de ADN de interés (ADNc o ADN que se transcribirá en un ARN no viral) y una secuencia de encapsidación (un ADN que codifica, por ejemplo, para motivos repetidos MS2 o PP7) y opcionalmente una secuencia estabilizadora de ARN.
Preferiblemente, el kit que produce partículas según la primera realización comprende:
(i) un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de ARN no virales diferentes, en donde cada secuencia de ARN comprende una secuencia de interés, para la cual se inserta una secuencia de encapsidación aguas arriba, aguas abajo o dentro de cada una de estas secuencias, o alternativamente un primer y un segundo plásmido de expresión que comprende cada uno una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo de la cual se inserta una secuencia de encapsidación, en donde al menos una de las secuencias de interés codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, la otra secuencia de interés corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
en donde las secuencias de interés son diferentes y las secuencias de encapsidación son idénticas,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína de nucleocápside quimérica que comprende un dominio de unión heterólogo que hace posible reconocer la secuencia de encapsidación, y
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura. Ventajosamente, el kit produce partículas lentivirales. Preferiblemente:
- En el plásmido de expresión, la secuencia de encapsidación comprende de 2 a 25 repeticiones de la secuencia tallobucle de MS2, preferiblemente de 6 a 18 repeticiones de la secuencia tallo-bucle, más preferiblemente aún de 10 a 14, por ejemplo 12 repeticiones. Ventajosamente, la secuencia de tallo-bucle es la siguiente: ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID NO: 1).
- En el plásmido de encapsidación, la proteína de nucleocápside es la proteína de nucleocápside (NC) del VIH perteneciente a la poliproteína Gag, cuya NC se muta a nivel del segundo dedo de zinc para insertar la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2.
- En el plásmido de la envoltura, la proteína de la envoltura es la proteína VSV-G que codifica la proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular.
O, preferiblemente:
- En el plásmido de expresión, la secuencia de encapsidación comprende de 2 a 25 repeticiones de la secuencia de tallo-bucle de PP7, preferiblemente de 2 a 18 repeticiones de la secuencia de tallo-bucle, más preferiblemente todavía de 2 a 12, por ejemplo 6 repeticiones. Ventajosamente, la secuencia de tallo-bucle es la siguiente: ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID NO: 2). Alternativamente, la secuencia de tallo-bucle es una alternancia de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4, en particular para un ARN codificante, o de la SEQ ID NO: 5 y de la SEQ ID NO: 6, en particular para un ARN n codificante.
- En el plásmido de encapsidación, la proteína de nucleocápside es la proteína de nucleocápside (NC) del VIH perteneciente a la poliproteína Gag, cuya NC se muta a nivel del segundo dedo de zinc para insertar la secuencia de la proteína “Coat» del fago PP7.
- En el plásmido de la envoltura, la proteína de la envoltura es la proteína VSV-G que codifica la proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular.
Opcionalmente, el kit comprende un segundo plásmido de encapsidación que codifica una integrasa quimérica que comprende un dominio de unión que permite reconocer una secuencia de encapsidación. El segundo dominio de unión puede ser el mismo o diferente del dominio de unión de la proteína de nucleocápside quimérica.
A modo de ejemplo de diferentes dominios de enlace:
- el dominio de unión introducido en la nucleocápside puede ser la proteína Coat de MS2 y el dominio de unión introducido en la integrasa puede ser la proteína Coat de PP7, o
- el dominio de unión introducido en la nucleocápside puede ser la proteína Coat de PP7 y el dominio de unión introducido en la integrasa puede ser la proteína Coat de MS2
Se pueden introducir varios dominios de unión en cada una de las proteínas quiméricas.
Alternativamente, cuando el kit tiene como objetivo producir partículas de acuerdo con la segunda realización, este kit comprende:
(i) un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de ARN no virales diferentes, comprendiendo cada secuencia de ARN una secuencia de interés para la cual, aguas arriba, aguas abajo o dentro de esta secuencia se inserta una secuencia de encapsidación, o alternativamente, un primer y un segundo plásmido de expresión que comprende cada uno una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo de la cual se inserta una secuencia de encapsidación, en donde al menos una de las secuencias de interés codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, en donde la otra secuencia de interés corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una integrasa quimérica que comprende un dominio de unión heterólogo que hace posible reconocer la secuencia de encapsidación, y
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
Ventajosamente, los promotores utilizados en los plásmidos de expresión de los kits según la invención son EF1, en particular cuando la secuencia de interés es una nucleasa, como Cas 9, y U6, en particular cuando la secuencia de interés es al menos una elemento de reconocimiento de una guía de ARN o una guía de ARN.
Ventajosamente, los kits de producción según la invención también pueden comprender un segundo plásmido de envasado que codifica:
- una proteína derivada de la poliproteína Gag de tipo salvaje, cuando el primer plásmido de encapsidación codifica una proteína derivada de la poliproteína Gag quimérica, y/o
- una integrasa de tipo salvaje, cuando el primer plásmido de encapsidación codifica una integrasa quimérica.
También se proponen procedimientos de fabricación de los kits según la invención. Normalmente, un procedimiento de fabricación de un kit según la invención comprende:
(i) la preparación de un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de ARN no virales diferentes, comprendiendo cada secuencia de ARN una secuencia de interés para la cual se inserta una secuencia de encapsidación aguas arriba, aguas abajo o dentro de esta secuencia, o alternativamente, un primer y un segundo plásmido de expresión que comprende cada uno una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo de la cual se inserta una secuencia de encapsidación, en donde al menos una de las secuencias de interés codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, la otra secuencia de interés corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
(ii) la preparación de un plásmido de encapsidación que codifica una proteína derivada de la poliproteína Gag y/o una integrasa, quimérica, que comprende un dominio de unión heterólogo que permite reconocer una secuencia de encapsidación, y
(iii) preparar un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
Más específicamente, cuando el procedimiento se refiere a un kit que tiene como objetivo producir partículas según la primera realización, comprende:
(i) la preparación de un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de ARN no virales diferentes, comprendiendo cada secuencia de ARN una secuencia de interés para la cual, aguas arriba, aguas abajo o dentro de esta secuencia de interés, se inserta una secuencia de encapsidación, o alternativamente un primer y un segundo plásmido de expresión que comprende cada uno una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo del cual se inserta una secuencia de encapsidación, en donde al menos una de las secuencias de interés codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, la otra secuencia de interés corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
(ii) la preparación de un plásmido de encapsidación que codifica una proteína de nucleocápside quimérica que comprende un dominio de unión heterólogo que hace posible reconocer la secuencia de encapsidación, y
(iii) la preparación de un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
Las al menos dos secuencias de ARN no virales son diferentes porque las secuencias de interés son diferentes y, opcionalmente, las secuencias de encapsidación son diferentes.
Preferiblemente, este procedimiento comprende:
(i) la preparación de un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de interés, para las cuales se inserta una secuencia de encapsidación aguas arriba, aguas abajo o dentro de cada una de estas secuencias, o alternativamente de un primer y segundo plásmido de expresión que comprenden cada uno una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo de la cual se inserta una secuencia de encapsidación, en donde al menos una de las secuencias de interés codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, la otra secuencia de interés corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
en donde las secuencias de interés son diferentes y las secuencias de encapsidación son idénticas,
(ii) la preparación de un plásmido de encapsidación que codifica una proteína de nucleocápside quimérica que comprende un dominio de unión heterólogo que hace posible reconocer la secuencia de encapsidación, y
(iii) la preparación de un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
Alternativamente, cuando el procedimiento se refiere a un kit que tiene como objetivo producir partículas de acuerdo con la segunda realización, este procedimiento comprende:
(i) la preparación de un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de ARN no virales diferentes, comprendiendo cada secuencia de ARN una secuencia de interés para la cual se inserta una secuencia de encapsidación aguas arriba, aguas abajo o dentro de esta secuencia, o alternativamente, un primer y un segundo plásmido de expresión que comprende cada uno una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo de la cual se inserta una secuencia de encapsidación, en donde al menos una de las secuencias de interés codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, la otra secuencia de interés corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
(ii) la preparación de un plásmido de encapsidación que codifica una integrasa quimérica que comprende un dominio de unión heterólogo que permite reconocer la secuencia de encapsidación, y
(iii) la preparación de un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
La invención también se refiere a procedimientos de fabricación de las partículas según la invención.
Un procedimiento de este tipo comprende una etapa de cotransfección de células con:
(i) un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de ARN no virales diferentes, comprendiendo cada secuencia de ARN una secuencia de interés para la cual se inserta una secuencia de encapsidación, o bien, un primer y un segundo plásmido de expresión comprende cada uno una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo de la cual se inserta una secuencia de encapsidación, en donde al menos una de las secuencias de interés codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, la otra secuencia de interés corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína derivada de la poliproteína Gag y/o una integrasa quimérica que comprende un dominio de unión heterólogo que hace posible reconocer una secuencia de encapsidación, y
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura y la recuperación del sobrenadante de las células transfectadas que comprenden las partículas.
Las células utilizadas en los procedimientos de fabricación de partículas según la invención son células productoras, es decir, células que, una vez transfectadas con los plásmidos portadores del material genético necesario para la formación de las partículas retrovirales celulares, permiten la formación de dichas partículas. A modo de ejemplo de células productoras, se puede citar HEK293T.
Por “etapa de cotransfección”, se entiende una etapa de transfección durante la cual la transfección se lleva a cabo poniendo en contacto las células productoras con todos los plásmidos del procedimiento de fabricación de las partículas.
Más específicamente, cuando el procedimiento de fabricación tiene como objetivo producir partículas según la primera realización, comprende una etapa de cotransfección de células con:
(i) un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de ARN no virales diferentes, comprendiendo cada secuencia de ARN una secuencia de interés para la cual se inserta una secuencia de encapsidación aguas arriba, aguas abajo o dentro de esta secuencia de interés, o alternativamente un primer y un segundo plásmido de expresión que comprende cada uno una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo de la cual se inserta una secuencia de encapsidación, en donde al menos una de las secuencias de interés codifica una nucleasa elegida del
grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, la otra secuencia de interés corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína de nucleocápside quimérica que comprende un dominio de unión heterólogo que hace posible reconocer la secuencia de encapsidación, y
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura y que recupera el sobrenadante de las células transfectadas que comprenden las partículas.
Las al menos dos secuencias de ARN no virales son diferentes porque las secuencias de interés son diferentes y, opcionalmente, las secuencias de encapsidación son diferentes.
Preferiblemente, este procedimiento de fabricación de partículas comprende una etapa de cotransfección de células con:
(i) un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de interés, para las cuales se inserta una secuencia de encapsidación aguas arriba, aguas abajo o dentro de cada una de estas secuencias, o alternativamente un primer y un segundo plásmido de expresión que comprenden cada uno una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo de la cual se inserta una secuencia de encapsidación, en donde al menos una de las secuencias de interés codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, la otra secuencia de interés corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
en donde las secuencias de interés son diferentes y las secuencias de encapsidación son idénticas,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína de nucleocápside quimérica que comprende un dominio de unión heterólogo que hace posible reconocer la secuencia de encapsidación, y
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura y que recupera el sobrenadante de las células transfectadas que comprenden las partículas.
Alternativamente, cuando el procedimiento de fabricación tiene como objetivo producir partículas de acuerdo con la segunda realización, este procedimiento comprende una etapa de cotransfección de células con:
(i) un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de ARN no virales diferentes, comprendiendo cada secuencia de ARN una secuencia de interés para la cual se inserta una secuencia de encapsidación, o bien, un primer y un segundo plásmido de expresión que comprende cada uno una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo de la cual se inserta una secuencia de encapsidación, en donde al menos una de las secuencias de interés codifica una nucleasa elegida del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, la otra secuencia de interés corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una integrasa quimérica que comprende un dominio de unión heterólogo que hace posible reconocer la secuencia de encapsidación, y
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura y la recuperación del sobrenadante de las células transfectadas que comprenden las partículas.
Ventajosamente, en el procedimiento de fabricación según la invención, los plásmidos de expresión representan al menos el 50% en número de todos los plásmidos utilizados en la cotransfección.
En el procedimiento de fabricación según la invención, la etapa de cotransfección también se puede realizar con un segundo plásmido de encapsidación que codifica:
- una proteína derivada de la poliproteína Gag de tipo salvaje, cuando el primer plásmido de encapsidación codifica una proteína derivada de la poliproteína Gag quimérica, y/o
- una integrasa de tipo salvaje, cuando el primer plásmido de encapsidación codifica una integrasa quimérica.
Ventajosamente, la relación del segundo plásmido de encapsidación al primer plásmido de encapsidación está en el intervalo que va de [10:90] a [60:40], preferiblemente, en el intervalo que va de [20:80] a [50:50].
Las ventajas asociadas con el uso de un segundo plásmido de encapsidación y más particularmente con las relaciones definidas con anterioridad se describen con más detalle en el Ejemplo 13.
Preferiblemente, todos los procedimientos para fabricar partículas según la invención se llevan a cabo de acuerdo con los procedimientos descritos en la solicitud WO2013/014537.
Más particularmente, estos procedimientos de fabricación de partículas se llevan a cabo en células productoras cultivadas en medio sin suero y no se lleva a cabo inducción de butirato de sodio.
Ventajosamente, el sobrenadante se recoge varias veces, por ejemplo entre 3 y 6 veces, en intervalos de tiempo
específicos, como por ejemplo en intervalos de tiempo del orden de la vida media de las partículas retrovirales. Típicamente, la recuperación del sobrenadante se lleva a cabo en 4 a 5 veces, a intervalos de tiempo del orden de 6 a 18 h, preferiblemente de 8 a 16 h, tal como 8 h, 12 h y/o 16 h. Preferiblemente, esta recolección se realiza después de cambiar el medio de cultivo de las células, realizándose preferiblemente este cambio 24 horas después de la transfección.
Los procedimientos para fabricar partículas según la invención también incluyen una etapa en la que se clarifica el sobrenadante.
Preferiblemente, la clarificación del sobrenadante se lleva a cabo mediante centrifugación.
Más preferiblemente aún, estos procedimientos de fabricación de partículas según la invención comprenden además una etapa en la que el sobrenadante se concentra y/o purifica.
Preferiblemente, la concentración y purificación se realiza mediante ultrafiltración frontal en unidades de centrifugación. Ventajosamente, el sobrenadante se somete a una o más etapas de purificación adicionales. Estas etapas de purificación se llevan a cabo preferiblemente mediante ultrafiltración tangencial y/o diafiltración. Aún más preferiblemente, el sobrenadante se somete a una etapa de ultrafiltración tangencial seguida de una etapa de diafiltración.
La ultrafiltración tangencial se realiza ventajosamente sobre cartuchos de fibras huecas de polisulfona.
Opcionalmente, la composición puede luego someterse a una etapa de cromatografía de intercambio iónico, en particular cromatografía de intercambio aniónico. El eluido resultante de esta etapa de cromatografía se recupera luego y luego se concentra nuevamente por ultrafiltración frontal en unidades centrales de centrifugación. Una composición resultante de tal procedimiento comprende menos del 1% de contaminantes de ADN y menos del 1% de contaminantes de proteínas en relación con el sobrenadante crudo.
La divulgación también se refiere a composiciones que pueden obtenerse mediante cualquiera de los procesos para fabricar partículas según la invención.
Normalmente, estas composiciones contienen menos del 30% de contaminantes de ADN y menos del 45% de contaminantes de proteínas con respecto al sobrenadante crudo. Más particularmente, las composiciones según la invención comprenden menos del 30% de contaminantes de ADN y menos del 2% de contaminantes de proteínas con respecto al sobrenadante crudo.
Opcionalmente, las composiciones según la invención comprenden menos del 1% de contaminantes de ADN y menos del 1% de contaminantes de proteínas con respecto al sobrenadante crudo.
Finalmente, la invención se refiere al uso de una partícula según la invención, o de una composición según la invención para la transducción de células.
El uso de las partículas y de las composiciones según la invención es particularmente ventajoso para la transducción de células primarias y líneas inmortalizadas, con el fin de modificarlas transitoriamente. Las células pueden ser células de mamífero u otras células eucariotas. En particular, la transducción de estas células se puede realizar in vivo, in vitro o ex vivo.
Las células pueden recibir una o dos transducciones sucesivas con las partículas según la invención.
El uso de las partículas según la invención para la transducción de células permite introducir una mutación en el genoma gracias a su capacidad para inducir roturas en la doble cadena de ADN, a las que las células responden mediante mecanismos de reparación del ADN. Por ejemplo, la reparación se puede realizar insertando extremos no homólogos que permitan reconectar dos extremos del ADN resultante de una rotura bicatenaria, de ARN introducidos para tal fin o disponible en la célula.
Estos sistemas de ingeniería del genoma también se pueden utilizar para realizar knockouts de gen, es decir, invalidar la expresión de un gen, o incluso inducir la muerte celular en función de los genes diana.
Las partículas según la invención introducidas en las células, luego pueden usarse para modificar el genoma in vivo, in vitro o ex vivo.
La invención se entenderá mejor a la vista de los ejemplos que siguen, a modo de ilustración, con referencia a las figuras, que representan respectivamente:
- La Figura I es un esquema que ilustra el casete de expresión derivado del plásmido de expresión pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X que comprende una secuencia de ADN que codifica el ARN de la nucleasa Cas9, en su forma salvaje (WT) o en su forma mutada (N);
- La Figura IIa ilustra la estrategia para modificar el plásmido de encapsidación p8.74 que lleva genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol) para la construcción de un p8.74AZF-MS2-Coat;
- La Figura IIb es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de encapsidación p8.74AZF-MS2-Coat que tiene el segundo dedo de zinc sustituido por la proteína “Coat” del bacteriófago MS2, obtenido por la estrategia presentada en la Figura IIa;
- La Figura III es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de envoltura pENV;
- La Figura IV es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de expresión pILV-EF1-Cas9-WPRE que comprende un ADN que codifica la secuencia de ARN de la nucleasa Cas9, en su forma salvaje (WT) o en su forma mutada (N);
- La Figura Va es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de expresión pILV-EF1-GFP-WPRE que comprende un ADN que codifica el ARN de g Fp ;
- La Figura Vb es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de expresión pILV-H1-GuideU3-U6-GuideD1-WPRE que comprende un ADN que codifica dos ARN no codificantes que se dirigen a la secuencia de GFP (sgARN = ARN guía = guía U3 y Guía D1 en este caso);
- La Figura Vc es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de expresión pILV-H1/U6-Guide-WPRE que comprende un ADN que codifica un a Rn no codificante dirigido a la secuencia de GFP (sgARN = ARN guía = Guía);
- La Figura VI es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de encapsidación p8.74 que lleva genes que codifican proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol);
- La Figura VII es un esquema que ilustra el casete de expresión derivado del plásmido de expresión pcDNA-H1-GuideD1-MS2 2X que lleva una secuencia de ADN que codifica un ARN guía no codificante, que comprende el andamio, que se dirige a la secuencia GFP (sgARN = ARN guía), en el que se insertaron 2 repeticiones del motivo de tallo-bucle del ARN de MS2 (SEQ ID NO: 3) dentro del casete de expresión aguas abajo del Ar N guía;
- La Figura VIII es un esquema que ilustra el casete de expresión derivado del plásmido de expresión pcD-NA-H1-GuideD1Chimeric-MS2 2X que lleva una secuencia de ADN que codifica un a Rn guía no codificante dirigido a la secuencia de GFP (sgARN = ARN guía), de un casete de expresión de promotor-secuencia de interés- término, en el que se incluyen 2 repeticiones del motivo de tallo-bucle del ARN de MS2 (SEQ ID NO: 3) en la parte “andamio” de la guía quimérica;
- La Figura IX ilustra la eficacia de una partícula de MS2 (NC)-RLP 12X de acuerdo con la invención en la liberación del ARN que codifica la nucleasa Cas9 Nickasa durante la transducción de células HCT119-GFP;
- La Figura X ilustra el impacto de la posición de los motivos repetidos MS2 para la encapsidación de ARN guías en partículas MS2 (NC)-RLP 12X según la invención, después de la transducción de células HCT119-GFP Cas9;
- La Figura XI ilustra la eficiencia de producción de partículas de MS2RLP que suministran ARN guía dependiendo de si se producen mediante el uso de una cantidad única o doble del plásmido de expresión que lleva el ARN guía para la transducción de células HCT116-GFP-Cas9;
- La Figura XII ilustra la eficacia de una partícula de MS2 (NC)-RLP 12X según la invención en la administración del sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía A r N que codifica Cas 9), en células HCT116-GFP
- La Figura XIIIa es un esquema que ilustra el casete de expresión derivado del plásmido de expresión pcD-NA.EF1.PPRV.TALEN 5'.WPRE MS2 (12X) que comprende una secuencia de ADN que codifica el ARN de la nucleasa TALEN que consiste en nucleasa Fokl fusionada a un dominio de unión al ADN, TALE, que reconoce la cadena 5' de ADN;
- La Figura XIIIb es un esquema que ilustra el casete de expresión derivado del plásmido de expresión pcD-NA.EF1.PPRV.TALEN 3'.WPRE MS2 (12X) que comprende una secuencia de ADN que codifica el ARN de la nucleasa TALEN que consiste en la nucleasa Fokl fusionada a un dominio de unión al ADN, TALE, que reconoce la cadena 3' de ADN;
- La Figura XIVa es un esquema que ilustra el casete de expresión derivado del plásmido de expresión pILV.EFI.TALEN 5' que comprende una secuencia de ADN que codifica el ARN de la nucleasa TALEN que consiste en la nucleasa Fokl fusionada a un dominio de unión al ADN, TALE, que reconoce la cadena 5' de ADN;
- La Figura XIVb es un esquema que ilustra el casete de expresión derivado del plásmido de expresión pILV.EFI.TALEN 3' que comprende una secuencia de ADN que codifica el ARN de la nucleasa TALEN que consiste en la nucleasa Fokl fusionada a un dominio de unión al ADN, TALE, que reconoce la cadena 3' de ADN;
- La Figura XVa es un esquema que ilustra el casete de expresión derivado del plásmido de expresión, pcD-NA.EF1.PPRV.ZFP 5'.WPr E.MS2 (12X), que lleva un dominio de reconocimiento del ADN del tipo de dedo de zinc quimérico de nucleasa Fokl para el reconocimiento de la cadena de ADN 5';
- La Figura XVb es un esquema que ilustra el casete de expresión derivado del plásmido de expresión pcD-NA.EF1.PPRV.ZFP 3'.WPRE.MS2 (12X), que lleva un dominio de reconocimiento de A d N del tipo de dedo de zinc quimérico de nucleasa Fokl para el reconocimiento de la cadena de ADN 3';
- La Figura XVIa es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de expresión pILV.EF1.ZFP 5' que lleva un dominio de reconocimiento de ADN del tipo de dedo de zinc quimérico en la nucleasa Fokl para el reconocimiento de la cadena de ADN 5';
- La Figura XVIb es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de expresión pILV.EF1.ZFP 3' que lleva un dominio de reconocimiento de ADN del tipo de dedo de zinc quimérico en la nucleasa Fokl para el reconocimiento de la cadena de ADN 3';
- La Figura XVII presenta el esquema del casete de expresión derivado del plásmido de expresión que lleva como secuencia de ARN de interés la luciferasa utilizada para la producción de partículas lentivirales PP7(NC)-RLP 12X, que comprende el motivo de tallo-bucle PP7 repetido 12 veces, según la invención;
- La Figura XVIII presenta un esquema de la modificación del plásmido de encapsidación lentiviral p8.74 para insertar un dominio de unión en la secuencia de la integrasa;
- La Figura XIX muestra un esquema del casete de expresión derivado del plásmido de encapsidación utilizado para la producción de partículas lentivirales PP7 (IN)-RLP según la invención, obtenido mediante la modificación del plásmido de encapsidación lentiviral p8.74 mostrado en la Figura VI;
- La Figura XX ilustra la eficacia de una partícula de MS2 (NC)-RLP 12X según la invención en la administración del sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas 9), en células HCT116-GFP;
- La Figura XXI es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de expresión pcDNA-U6-GuideD1Chimeric-MS2 2X-Term que comprende un ARN que codifica un ARN no codificante dirigido a la secuencia de GFP (sgARN = ARN guía = Guía D1 en este caso), dependiente del promotor U6;
- La Figura XXII ilustra la eficiencia de una partícula MS2RLP para administrar el sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas9) en células HCT116-GFP, dependiendo del promotor que permite la transcripción del ARN guía en células de producción;
- La Figura XXIII es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de expresión pcDNA-U6-Guide_antiPD1 Quimérico-MS2 2X-Term que comprende un ARN que codifica un ARN no codificante dirigido al gen PD1 (sgARN = ARN guía = Guía), dependiente en el promotor U6;
- La Figura XXIV ilustra la eficacia de una partícula de MS2RLP en la administración del sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas9) en linfocitos T primarios activados, para la invalidación del gen PD1;
- La Figura XXV muestra la eficacia de una partícula de ILV en la liberación del sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas9) en linfocitos T primarios activados, para la invalidación del gen PD1;
- La Figura XXVI muestra el impacto de las partículas MS2RLP que suministran el sistema CRISPR/Cas9 para la invalidación del gen PD1 (ARN guía ARN que codifica Case9) sobre la viabilidad de los linfocitos T activados;
- La Figura XXVII ilustra el análisis del fenotipo de los linfocitos T activados después de la transducción por las partículas MS2RLP que liberan el sistema CRIS-PR/Cas9 para la invalidación del gen PD1 (ARN guía a Rn que codifica Cas9);
- La Figura XXVIII es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de expresión pcDNA-U6-Guide_antiCXCR4Quimérico- MS22X que comprende un ARN que codifica un ARN no codificante dirigido al gen CXCR4 (sgARN = ARN guía = guía), dependiente del promotor U6;
- La Figura XXIX muestra la eficacia de una partícula de MS2RLP en la administración del sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas 9) en linfocitos T primarios activados, para la invalidación del gen CXCR4;
- La Figura XXX muestra el impacto de las partículas de MS2RLP que administran el sistema CRISPR/Cas9 para la invalidación del gen CXCR4 (ARN guía ARN que codifica Cas 9) sobre la viabilidad de los linfocitos T primarios activados; y
- La Figura XXXI ilustra el análisis del fenotipo de los linfocitos T activados después de la transducción por partículas MS2RLP que liberan el sistema CRIS-PR/Cas9 para la invalidación del gen CXCR4 (ARN guía Ar N que codifica Cas 9).
- La Figura XXXII es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido pILV-H1/U6-GuideantiPDI-WPRE que comprende una secuencia de ADN que codifica un ARN no codificante dirigido al gen PD1 (sgARN = guía ARN = guía);
- La Figura XXXIII muestra el efecto de la dosis de partículas MS2RLP que administran el sistema CRIS-PR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas 9) para la invalidación del gen GFP en células diana HCT116 clon D2;
- La Figura XXXIV es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido pcDNA-EF1-Cas9-PP72X que comprende una secuencia de ADN que codifica el ARN de la nucleasa Cas9;
- La Figura XXXV es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido pcDNA- U6-GuideD1Chimeric-PP72X, que comprende un ADN que codifica un ARN no codificante dirigido a la secuencia de GFP (sgARN = ARN guía), de un casete de expresión de promotor-secuencia de interés-Term (sgARN = ARN guía = guía), dependiente del promotor U6, en el que 2 repeticiones del motivo de tallo-bucle del ARN PP7 (respectivamente SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4) están incluidos en la parte de “andamio” de la guía quimérica);
- La Figura XXXVIa ilustra la estrategia para modificar el plásmido de encapsidación p8.74 que lleva genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol) para la construcción de un plásmido p8.74AZF-Pp7-Coat;
- La Figura XXXVIb es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de encapsidación p8.74AZF-PP7-Coat que tiene el segundo dedo de zinc sustituido por la proteína “Coat” del bacteriófago PP7, obtenido por la estrategia presentada en la Figura XXXVIa;
- La Figura XXXVII ilustra el efecto de la dosis de partículas PP7RLP que administran el sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas9) para la invalidación del gen GFP en células diana HCT116 clon D2;
- La Figura XXXVIII es un esquema que ilustra el casete de expresión derivado del plásmido de expresión pcD-NA.EF1.RporterFluorescent.MS2 12X que comprende una secuencia de ADN que codifica el ARN de un reportero fluorescente, seguido de 12 repeticiones del motivo tallo-bucle del ARN de MS2 (SEQ ID NO: 1);
- La Figura XXXIX es un esquema que ilustra el casete de expresión derivado del plásmido de expresión pcD-NA.EF1.ReporteroFluorescente.PP72X que comprende una secuencia de ADN que codifica el ARN de un reportero fluorescente seguida de 2 repeticiones del motivo de tallo-bucle de ARN de PP7 (SEQ ID NO: 2);
- La Figura XXXX es un esquema de construcción del casete de expresión derivado del plásmido de expresión pILV-EF1-ZsGreenI-WPRE que comprende un ADN que codifica el ARN de ZsGreenI;
- La Figura XXXXI muestra el efecto del precursor de GAG-POL de tipo salvaje para la producción de partículas MS2RLP 12X sobre la transferencia de ARN a células Jurkat a una dosis de 2 pg p24/célula;
- La Figura XXXXII muestra el efecto del precursor de GAG-POL de tipo salvaje para la producción de partículas MS2RLP 12X sobre la transferencia de ARN a células Jurkat a una dosis de 2 pg p24/célula;
- La Figura XXXXIII a y b ilustra el análisis de la maduración de las partículas virales MS2RLP por transferencia Western anti-p24 después de 15 s (XXXXIIIb) y 1 min (XXXXIIIa); y
- La Figura XXXXIV muestra la eficacia de las partículas MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X para la transferencia de ARN encapsidado por las secuencias de encapsidación MS2 y PP7 a las células diana HCT116;
Ejemplo 1: Comparación de la transferencia del ARN que codifica Cas9 tras la transducción de un clon particular de células HCT116 por ILV o partículas de MS2RLP según la invención
I. Materiales y métodos
1. Construcciones de plásmidos
Solo para este ejemplo, la Cas9 usada es la Cas9 Nickasa (en una forma mutada). Los siguientes ejemplos y, a menos que se indique lo contrario, se usa Cas9 en su forma salvaje (WT), permaneciendo el protocolo sin cambios.
1.1 Plásmidos para la producción de partículas lentivirales MS2-(NC)-RLP 12X según la invención
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: el plásmido de expresión lleva un casete de expresión (Figura I) con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARN en las partículas lentivirales, se insertaron 12 repeticiones del motivo de tallo-bucle del ARN de MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID NO: 1) dentro de un casete de expresión aguas abajo de la secuencia de la enzima Cas9. El promotor usado es el de EF1 (Figura I) pero se pueden usar otros promotores. La secuencia de interés del plásmido es un ADN que codifica el ARN de la proteína Cas9 (Fig. I), en su forma salvaje (WT) o en su forma mutada (N), por ejemplo, la Nickasa. • Plásmido de encapsidación: la partícula lentiviral ha sido modificada para contener dentro de la proteína de
nucleocápside, en lugar del segundo dominio de dedo de Zn, la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2. El plásmido de encapsidación p8.74, que lleva los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado para la producción de las partículas MS2RLP se modifica según la estrategia ilustrada en la Figura IIa: este plásmido p8.74 se utiliza para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido que carece del segundo dedo de zinc de la proteína de nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de zinc se sustituye por la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 mediante clonación Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-MS2-Coat. Se obtiene así la construcción ilustrada en la Figura IIb. La secuencia que codifica Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT) o la integrasa (IN) sin alterar la función de las MS2RLP
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser VSV-G que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura III).
Estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales MS2-(NC)-RLP 12X según la invención. Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales MS2RLP-Cas9 12X.
1.2 Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores ILV
1.2.1. Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores de controles ILVCas9
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: el plásmido de expresión lleva un casete de expresión (Figura IV). Este plásmido puede contener otros elementos como la secuencia nativa WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element) o la secuencia cPPT/CTS. La patogenicidad viral se elimina mediante la sustitución de regiones del genoma viral necesarias para la replicación retroviral por el transgén. El promotor utilizado es el de EF1, pero se pueden utilizar otros promotores. La secuencia de interés del plásmido es un ADN que codifica el ARN de la proteína Cas9 (Figura IV), en su forma salvaje (WT) o en su forma mutada (N).
• Plásmido de encapsidación: El plásmido de encapsidación p8.74, que lleva los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), se utiliza para la producción de vectores lentivirales integrativos (Figura VI).
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido es idéntico al plásmido de la envoltura utilizado para la producción de partículas lentivirales MS2RLP (Figura III).
1.2.2. Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores ILV-GFP para la generación de células diana HCT116-GFP Clone D2
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: el plásmido de expresión lleva un casete de expresión (Figura Va). Este plásmido puede contener otros elementos como la secuencia nativa WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Post-transcriptional Regulatory Element) o la secuencia cPPT/CTS. La patogenicidad viral se elimina mediante la sustitución de regiones del genoma viral necesarias para la replicación retroviral por el transgén. El promotor utilizado es el de EF1, pero se pueden utilizar otros promotores. La secuencia de interés es la proteína fluorescente GFP (Figura Va).
• Plásmido de encapsidación: el plásmido de encapsidación p8.74, que lleva los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), se usa para la producción de vectores lentivirales integradores (Figura VI).
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido es idéntico al plásmido de envoltura utilizado para la producción de partículas lentivirales MS2RLP (Figura IiI).
1.2.3. Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores ILV-H1-GuideU3-U6-GuideD1 para la generación de células diana HTC116-GFP Clon D2-H1-GuideU3-U6-GuideD1
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: el plásmido de expresión lleva un casete de expresión como se describe en la Figura Vb. Este plásmido puede contener otros elementos como la secuencia nativa WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Post-transcriptional Regulatory Element) o la secuencia cPPT/CTS. La patogenicidad viral se elimina mediante la sustitución de regiones del genoma viral necesarias para la replicación retroviral por el transgén. Los promotores usados son H1 y U6, pero pueden usarse otros promotores. Las secuencias de interés son dos ARN no codificantes que se dirigen a la secuencia de GFP, en lo sucesivo denominados guía U3 y guía D1 (sgARN = ARN guía) (Figura Vb).
• Plásmido de encapsidación: el plásmido de encapsidación p8.74, que lleva los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), se usa para la producción de vectores lentivirales integradores (Figura VI).
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido es idéntico al plásmido de la envoltura utilizado para la producción de partículas lentivirales MS2RLP (Figura III).
2. Producción de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Después de la transfección de los plásmidos en las células de producción, los sobrenadantes se recogen y se utilizan
crudos o concentrados/purificados de acuerdo con uno de los métodos mencionados a continuación, descritos en la solicitud WO 2013/014537.
2.1 Producción de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las producciones se llevan a cabo en CellSTACK de 10 pisos (6360 cm2, Corning) con células de producción HEK293T (At Cc , CRL-11268), cultivadas en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (Dm EM, Gibco, Paisley, Reino Unido) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina y ultraglutamina al 1% (PAA) a 37 °C en atmósfera húmeda al 5% de CO2. Para cada lote (MS2-(NC)-RLP 12X e ILV), la mezcla de transfección se compone de los tres plásmidos siguientes:
- Uno de los plásmidos de expresión descritos con anterioridad, según se forme una partícula (MS2-(NC)-RLP 12X) o un vector (ILV),
- p8.74AZF Coat (MS2-(NC)-RLP 12X) o p8.74 (ILV)
- pENV que lleva la envoltura VSV-G.
Más particularmente, para el lote MS2RLP-Cas9 12X, la mezcla de transfección está compuesta por los tres plásmidos siguientes:
- el plásmido de expresión pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura I)
- el plásmido p8.74AZF-MS2 Coat (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura IIb)
- el plásmido pENV que lleva la envoltura VSV-G (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura III).
Más particularmente, para los lotes de ILV-GFP, ILV-H1-GuideU3-U6-GuideD1 o ILV-Cas9, la mezcla de transfección se compone de los tres plásmidos siguientes:
- el plásmido de expresión pILV-EF1-GFP-WPRE (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura Va) o pILV-H1-GuideU3-U6-GuideD1-WPRE (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura Vb) o pILV-EF1-Cas9-WpRE (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura IV), respectivamente,
- el plásmido p8.74 (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura VI)
- el plásmido pENV que lleva la envoltura VSV-G (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura III).
Las proporciones respectivas de los plásmidos son las siguientes: 40% del plásmido de expresión, 30% del plásmido p8.74 (o p8.74AZF), 30% del plásmido pENV.
24 horas después de la transfección estándar con fosfato cálcico, el sobrenadante del cultivo se reemplaza por medio DMEM fresco y no se suplementa. Las células de producción se incuban a 37 °C/5% de CO2. Después de cambiar el medio, el sobrenadante se recoge cuatro veces (32 h, 48 h, 56 h y 72 h después de la transfección). Cada recuperación se clarifica mediante centrifugación durante 5 min a 3000 g antes de microfiltrar a través de un filtro de 0,45 pm (Stericup®, Millipore). Luego, todas las recuperaciones se mezclan para componer el sobrenadante crudo.
2.2 Concentración y purificación de vectores lentivirales y partículas lentivirales
Los vectores y partículas se concentran y purifican de acuerdo con uno de los dos procedimientos siguientes:
• El procedimiento P1 tiene como objetivo lograr la ultrafiltración frontal del sobrenadante en unidades centrales de centrifugación.
• El procedimiento P2 tiene como objetivo realizar una ultrafiltración tangencial seguida de una diafiltración del sobrenadante. El sobrenadante crudo se concentra y purifica mediante ultrafiltración tangencial mediante el uso de cartuchos de fibras huecas de polisulfona. El sobrenadante se trata mediante diafiltración durante 20 diavolúmenes en modo continuo frente a tampón DMEM o TSSM. Después de la diafiltración, el retenido se recupera y luego se concentra de nuevo mediante ultrafiltración frontal en unidades centrales de centrifugación.
Para el ejemplo 1, los sobrenadantes se recogen y se utilizan concentrados/purificados de acuerdo con el procedimiento P1.
3. Titulación de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
3.1 Titulación de partículas funcionales por qPCR.
Las células de titulación de HCT116 (ATCC, CCL-247) se inoculan en una placa de 96 pocillos en 100 ml de DMEM suplementado con FCS al 10%, 100 pg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina y 2 mM de L-Gln (L-Glutamina) luego incubados durante 24 horas a 37 °C/5% de CO2. Se realizan seis diluciones en serie para cada vector, así como
para un patrón interno. Las células de titulación se transmiten mediante estas diluciones en serie en presencia de Polybrene® 8 pg/mL (Sigma) y luego se incuban durante tres días a 37 °C/5% de CO2. Para cada serie de muestras, se agrega un pocillo de células no transducidas como control. A continuación, las células de titulación se tripsinizan y el título (Unidad de transducción/ml) se determina mediante qPCR después de la extracción del ADN genómico utilizando el kit de extracción “Nucleospin tissue gDNA extraction kit” (Macherey-Nagel). El título obtenido (TU/mL) por qPCR es normalizado por el estándar interno, cuyo título fue previamente determinado por FACS.
3.2 Cuantificación de partículas físicas mediante prueba ELISA p24.
La proteína de la cápside p24 se detecta directamente en el sobrenadante viral usando y siguiendo las recomendaciones del kit ELISA p24 de VIH-1 (Perkin Elmer). La proteína p24 capturada se compleja con un anticuerpo policlonal biotinilado, luego se detecta mediante una estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP). El complejo resultante se detecta por espectrofotometría después de la incubación con el sustrato de ortofenilendiamina-HCl (OPD) produciendo una coloración amarilla que es directamente proporcional a la cantidad de proteína p24 capturada. La absorbancia de cada pocillo se cuantifica en el lector de placas híbrido Synergy H1 (Biotek) y se calibra frente a la absorbancia de un intervalo estándar de proteína p24. El título viral expresado en partículas físicas por ml se calcula a partir de la concentración de proteína p24 obtenida sabiendo que 1 pg de proteína p24 corresponde a 104 partículas físicas.
4. Generación de células diana y transducción por partículas lentivirales MS2-(NC)-RLP 12X según la invención.
Este ejemplo tiene como objetivo mostrar que es posible transferir el ARN que codifica la nucleasa Cas9 a través de partículas MS2RLP no integradoras, y que al final de esta transferencia de a Rn , generar roturas en el ADN bicatenario permitiendo la invalidación de un gen diana.
4.1 Células diana HCT116-GFP Clone D2
Las células diana HCT116-GFP Clone D2 se obtienen por transducción de células HCT116 (ATCC, CCL 247) a MOI20 en presencia de 8 pg/ml de Polybrene® con un vector lentiviral integrador (ILV) que expresa GFP. La línea monoclonal diana HCT116-GFP Clone D2 que contiene solo una copia del ADN que codifica GFP se obtuvo limitando la dilución de la línea policlonal HCT116-GFP (preparada a partir del plásmido de expresión de la Figura Va) y seleccionando los clones cuantificando el número de copias de la secuencia de GFP por PCR cuantitativa.
4.2 Células diana HCT116-GFP ClonD2-H1-GuideU3-U6-GuideD1 y transducción por partículas lentivirales MS2-(NC)-RLP 12X según la invención
Las células diana HCT 116-GFP Clon D2 se inoculan en una placa de 24 pocillos a 25.000 células/cm2 y se incuban durante 24 horas a 37 °C/5% de CO2. Primero, las células son transducidas por los vectores ILV-H1-GuideU3-U6-GuideDI (preparados a partir del plásmido de expresión de la Figura Vb) a MOI40, en presencia de 8 pg/ml de Polybrene®. El sobrenadante de transducción se retira 4 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo.
Una semana después de la transducción con ILV-H1-GuideU3-U6-GuideD1, las células diana HCT116-GFP cloneD2-H1-GuideU3-U6-GuideD2 son transducidas por los vectores ILV-EF1-Cas9 a MOI40 (preparado a partir del plásmido de expresión de la Figura IV) o las partículas de MS2RLP-Cas9 a una dosis de 10 pg p24/célula, en presencia de 8 pg/ml de Polybrene®. Un inhibidor de los mecanismos de defensa celular, BX795 (Invivogen), se usa a una concentración de 6 pM en el caso de partículas de MS2RLP. El sobrenadante de transducción se retira 4 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo. En la postransducción de J14, las células se recuperan y el porcentaje de células que expresan GFP se cuantifica mediante citometría (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec).
II. Resultados
El objetivo de este experimento es comparar la eficiencia de transferencia de ARN que codifica Cas9 por transducción de células diana HCT116-GFP-CloneD2-H1-GuideU3-U6-GuideD1 con vectores ILV-Cas9 o partículas MS2RLP-Cas9 12X. En primer lugar, los resultados presentados en la Figura IX muestran que las células HCT116 no transducidas (NT) no son fluorescentes (<0,4% de las células positivas para GFP), mientras que el 99% de las células diana HCTl16-GFP-ClonD2-H1-GuideU3-U6-GuideD1 son fluorescentes. Solo el 13% de las células diana HCT116-GFP-CloneD2-H1-GuideU3-U6-GuideD1 transducidas por el vector I LV-Cas9 siguen siendo fluorescentes. Cuando las células diana HCT116-GFP-CloneD2-H1-GuideU3-U6-GuideD1 son transducidas por las partículas MS2RLP 12X-Cas9, se observa una disminución en el número de células fluorescentes del orden del 57%. Esto muestra que el 57% de las células han visto la invalidación de la secuencia de GFP en su genoma. Por lo tanto, las partículas 12X MS2-(NC)-RLP que contienen 12 repeticiones de secuencias de tallo-bucle son eficaces para la transferencia del ARNm que codifica la nucleasa Cas9 y, por lo tanto, para la edición del genoma.
Ejemplo 2: Comparación de la posición de las repeticiones de MS2 para la encapsidación de ARN guías en partículas 2X MS2 (NC)-RLP después de la transducción de un segundo clon particular de células HCT116
I. Materiales y procedimientos
1. Construcciones de plásmidos
1.1 Plásmidos para la producción de partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 2X según la invención
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: el plásmido de expresión lleva un casete de expresión como se describe en las Figuras VII o VIII, con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARN en las partículas lentivirales, 2 repeticiones del motivo de tallo-bucle del ARN de MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID NO: 1 para la guía clásica D1, ggccaacatgaggatcacccatgtctgcagggcc SEQ ID NO: 3 para la guía D1 quimérica) se insertaron en un casete de expresión aguas abajo del ARN guía (guía D1 estándar, Figura VII), o se incluyeron en la parte de andamio de la guía (guía D1 quimérica, Figura VIII). El promotor utilizado es el de H1 pero se pueden utilizar otros promotores como el promotor U6. El uso de un promotor dependiente de ARN pol III, como H1 o U6, requiere la presencia de una señal de terminación de la transcripción (Term). La secuencia de interés es un ARN no codificante que se dirige a la secuencia de GFP (sgARN = ARN guía).
• Plásmido de encapsidación: la partícula lentiviral ha sido modificada para contener dentro de la proteína de nucleocápside, en lugar del segundo dominio de dedo de Zn, la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2. El plásmido de encapsidación p8.74, portador de los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado para la producción de las partículas MS2RLP 2X se modifica según la estrategia ilustrada en la Figura IIa: se utiliza este plásmido p8.74 para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido que carece del segundo dedo de zinc de la proteína de nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de zinc se sustituye por la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 mediante clonación Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-MS2-Coat. Se obtiene así la construcción ilustrada en la Figura IIb. La secuencia que codifica Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT) o la integrasa (IN) sin alterar la función de las MS2RLP 2X.
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser VSV-G que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura III).
Estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales MS2-(NC)-RLP 12X según la invención. Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para la producción de las partículas lentivirales MS2RLP-GuideDI Classic 2X y MS2RLP-GuideD1 Chimeric 2X.
1.2 Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores ILV
1.2.1. Plásmidos para la producción de vectores lentivirales de control integrativo ILV-GuideD1
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: el plásmido de expresión lleva un casete de expresión como se describe en la Figura Vc. Este plásmido puede contener otros elementos como la secuencia nativa WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Post-transcriptional Regulatory Element) o la secuencia cPPT/CTS. La patogenicidad viral se elimina mediante la sustitución de regiones del genoma viral necesarias para la replicación retroviral por el transgén. Los promotores usados son H1 y U6, pero pueden usarse otros promotores. La secuencia de interés es una guía (Figura Vc).
• Plásmido de encapsidación: El plásmido de encapsidación p8.74, que lleva los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), se utiliza para la producción de vectores lentivirales integrativos (Figura VI).
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido es idéntico al plásmido de la envoltura utilizado para la producción de partículas lentivirales MS2RLP (Figura III).
1.2.2. Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores ILV-GFP para la generación de células diana HCT116-GFP Clone D2
Estos plásmidos se preparan según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
1.2.3 Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores ILV-Cas9 para la preparación de células diana HCT116-GFP Clone D2-EF1-Cas9WT
Estos plásmidos se preparan según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
2. Producción de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las partículas lentivirales y los vectores lentivirales se producen como se describe en el Ejemplo 1 y se concentran y purifican de acuerdo con el procedimiento P1 como se describe en el Ejemplo 1.
Más particularmente, para el lote MS2RLP-GuideD1 Classic 2X y MS2RLP-GuideD1 Chimeric 2X, la mezcla de transfección está compuesta por los tres plásmidos siguientes:
- el plásmido de expresión pcDNA-H1-GuideD1-MS2 2X (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura VII) o el plásmido pcDNA-H1-GuideD1Chimeric-MS22X (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura VIII))
- el plásmido p8.74AZF-MS2 Coat (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura IIb)
- el plásmido pENV que lleva la envoltura VSV-G (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura III).
La proporción de plásmidos utilizada es idéntica a la del ejemplo 1.
3. Titulación de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las partículas lentivirales y los vectores lentivirales se valoran como se describe en el Ejemplo 1.
4. Generación de células diana y transducción por partículas lentivirales MS2-(NC)-RLP 2X según la invención.
Este ejemplo tiene como objetivo determinar si la posición de las unidades MS2 de tallo-bucle repetidas para la encapsidación de ARN guía en partículas MS2RLP tiene un impacto en la eficiencia de las partículas para la invalidación de un gen diana.
3.1 Células diana HCT116-GFP cloneD2
Este clon se prepara según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
3.2 Células diana HCT116-GFP cloneD2-Cas9 y transducción por partículas lentivirales MS2-(NC)-RLP 2X de acuerdo con la invención
Las células HCT116-GFP Clone D2 se inoculan en una placa de 24 pocillos a 25.000 células/cm2 y se incuban durante 24 horas a 37 °C/5% de CO2. Primero, las células son transducidas por los vectores ILV-Cas9, en MOI40, en presencia de 8 |jg/mL de Polybrene®. El sobrenadante de transducción se retira 4 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo. Una semana después de la transducción con los vectores ILV-Cas9, las células diana HCT116-GFP cloneD2-Cas9 son transducidas por las partículas MS2 (NC)-RLP 2X entregando los ARN guía anti-GFP (clásico o quimérico) a una dosis de 10 pg p24/célula, o por los vectores ILV-GuideD1 a MOI40, en presencia de 8 jg/m L de Polybrene®. Un inhibidor de los mecanismos de defensa celular, BX795 (Invivogen), se usa a una concentración de 6 jM en el caso de partículas de MS2RLP. El sobrenadante de transducción se retira 4 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo. En la postransducción de J14 mediante MS2RLP-guides-MS2 2X, las células se recuperan y el porcentaje de células que expresan GFP se cuantifica mediante citometría (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec).
II. Resultados
El objetivo de este experimento es comparar la posición de las repeticiones de MS2 para la encapsidación de los ARN guía en las partículas MS2RLP 2X después de la transducción. En primer lugar, los resultados presentados en la Figura X muestran que las células HCT116 no transducidas (NT) no son fluorescentes (<0,16% de células positivas para GFP), mientras que más del 99% de las células HCT116-GFP cloneD2 diana son fluorescentes. Apenas el 13% de las células diana HCT116-GFP cloneD2-Cas9 transducidas por los vectores ILV-GuideD1 siguen siendo fluorescentes. Cuando las células diana HCT116-GFP cloneD2-Cas9 son transducidas por las partículas de la guía MS2RLP 2X, se observa una disminución muy pequeña en el número de células fluorescentes del 2% para la MS2RLP-GuideD1 Classic 2X que lleva las guías clásicas y una disminución mayor en fluorescencia, del orden del 10% para el MS2RLP-GuideD1 Chimeric 2X que transporta las guías quiméricas. Por lo tanto, la posición de las unidades de repetición MS2 tiene un impacto en la eficiencia de las partículas MS2RLP 2X. Si el porcentaje de extinción sigue siendo moderado, los resultados muestran que las partículas MS2RLP 2X permiten la transferencia de ARN guía y, por lo tanto, realizar la edición del genoma.
Ejemplo 3: Impacto de la cantidad simple o doble del plásmido de expresión que lleva el ARN guía en las partículas MS2 (NC)-RLP 2X para la transducción del segundo clon de células HCT116
I. Material y procedimientos
1. Construcciones de plásmidos
1.1 Plásmidos para la producción de vectores lentivirales de ILV integradores
1.1.1 Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores I LV-Cas9 para la preparación de células diana HCT116-GFP Clone D2-EF1-Cas9
Estos plásmidos se preparan según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
1.1.2 Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores de ILV-GFP para la generación de las células diana HCT116-GFP Clone D2
Estos plásmidos se preparan según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
1.1.3 Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores controles ILV para las guías (ILV-GuideD1) Estos plásmidos se preparan según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 2.
1.2 Plásmidos para la producción de partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 2X según la invención.
Estos plásmidos se preparan de acuerdo con un proceso idéntico al del Ejemplo 1. Más particularmente, se usan los plásmidos usados para la producción de partículas lentivirales quiméricas MS2RLP-GuideD1 2X.
2. Producción de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
2.1 Producción de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las producciones se llevan a cabo en etapas CellSTACK 10 (6360 cm2, Corning) con células de producción HEK293T (At Cc , CRL-11268), cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Dm EM, Gibco, Paisley, Reino Unido) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de ultraglutamina (PAA) a 37 °C en atmósfera húmeda al 5% de CO2. Las partículas de MS2RLP 2X se producen por transfección de los tres plásmidos siguientes:
- Uno de los plásmidos de expresión descritos con anterioridad, utilizado en una cantidad simple o doble según se forme una partícula (MS2-(NC)-RLP 2X) o en una sola cantidad para un vector integrativo (ILV),
- p8.74AZF Coat (MS2-(NC)-RLP 2X) o p8.74 (ILV); pENV que lleva la envoltura VSV-G.
Más particularmente, las partículas lentivirales MS2RLP-GuideD1 Chimeric 2X se producen por transfección de los tres plásmidos siguientes:
- el plásmido de expresión pcDNA-H1-GuideD1 Chimeric-MS22X (cuyo casete de expresión se ilustra en la FIG. VIII) utilizado en cantidad simple o doble
- p8.74AZF Coat-MS2 Coat (cuyo casete de expresión se muestra en la Figura IIb)
- pENV que lleva la envoltura VSV-G (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura III).
Las proporciones de los plásmidos son las siguientes: 40% del plásmido de expresión, 30% del plásmido p8.74 o p8.74a Zf , 30% del plásmido pENV, 60% del plásmido de expresión, 20% del plásmido p8.74 o p8.74AZF, 20% del plásmido pENV, para el caso en que la producción comprenda un solo plásmido de expresión, cuya cantidad se duplica.
24 horas después de la transfección estándar con fosfato cálcico, el sobrenadante del cultivo se reemplaza por medio DMEM fresco y no se suplementa. Las células de producción se incuban a 37 °C/5% de CO2. Después de cambiar el medio, el sobrenadante se recoge cuatro veces (32 h, 48 h, 56 h y 72 h después de la transfección). Cada recuperación se clarifica mediante centrifugación durante 5 min a 3000 g antes de microfiltrar a través de un filtro de 0,45 pm (Stericup®, Millipore). Luego, todas las recuperaciones se mezclan para componer el sobrenadante crudo.
Los vectores lentivales ILV-Cas9 se producen como se describe en el Ejemplo 1.
Los vectores lentivirales ILV-GFP se producen como se describe en el Ejemplo 1.
Los vectores lentivirales ILV-GuideD1 se producen como se describe en el Ejemplo 2.
2.2 Concentración y purificación de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Los vectores y partículas se concentran y purifican según el procedimiento P1, descrito en el ejemplo 1.
3. Titulación de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las partículas lentivirales y los vectores lentivirales se valoran como se describe en el Ejemplo 1.
4. Generación de células diana y transducción por partículas lentivirales MS2-(NC)-RLP 2X según la invención. Este ejemplo tiene como objetivo comparar la eficiencia de las partículas MS2 (NC)-RLP 2X para la invalidación de un gen diana con partículas producidas con una cantidad simple o doble del plásmido de expresión que lleva el ARN guía D1 Quimérico, dirigido a la secuencia que codifica la GFP contenidas en las células HCT116-GFP cloneD2-EF1-Cas9 que expresan constitutivamente la enzima Cas9.
4.1 Células diana de HCT116-GFP clone D2
Este clon se prepara según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
4.2 Células diana HCT116-GFP cloneD2-Cas9 y transducción por partículas lentivirales MS2-(NC)-RLP 2X según la invención
Las células HCT116-GFP Clone D2 se inoculan en una placa de 24 pocillos a 25.000 células/cm2 y se incuban durante 24 horas a 37 °C/5% de CO2. Primero, las células son transducidas por los vectores ILV-Cas9 a MOI40, siendo estos vectores como se prepararon en el Ejemplo 2, en presencia de 8 pg/ml de Polybrene®. El sobrenadante de transducción se retira 4 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo. Una semana después de la transducción con ILV-Cas9, las células HCT116-GFP cloneD2-Cas9 son transducidas por las partículas MS2RLP que liberan las guías D1 quiméricas (producidas con una dosis única o doble de plásmido de expresión) o por el vector ILV-GuideD1, a una dosis de 10 pg p24/célula, en presencia de 8 pg/mL de Polybrene®. Un inhibidor de los mecanismos de defensa celular, BX795 (Invivogen), se usa a una concentración de 6 pM en el caso de partículas MS2 (NC)-RLP 2X. El sobrenadante de transducción se retira 4 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo. En la postransducción de J14, las células se recuperan y el porcentaje de células que expresan GFP así como la intensidad de fluorescencia se cuantifican mediante citometría (Macs Quant VYB®, Miltenyi Biotec).
II. Resultados
El objetivo de este experimento es comparar la producción de partículas de MS2RLP que liberan ARN guía producido mediante el uso de una cantidad simple o doble del plásmido de expresión. En primer lugar, los resultados presentados en la Figura XI muestran que las células HCT116 no transducidas (NT) no son fluorescentes (<0,2% de las células positivas para GFP), mientras que más del 99% de las células HCT116-GFP cloneD2 diana son fluorescentes. Menos del 9% de las células diana HCT116-GFP cloneD2-Cas9 transducidas por el vector ILV-GuideD1 siguen siendo fluorescentes. Cuando las células diana HCT116-GFP cloneD2-Cas9 son transducidas por la MS2RLP-GuideD1 Chimeric 2X, se observa una disminución del 6% en el número de células fluorescentes para las partículas MS2RLP 2X que llevan las guías quiméricas producidas en una dosis única del plásmido de expresión. Esta reducción se duplica (13% de células diana HCT116-GFP cloneD2-Cas9 negativas) para las partículas MS2RLP 2X que transportan las guías quiméricas producidas con una dosis doble de plásmido de expresión. Es probable que la doble dosis de plásmido de expresión utilizada para la producción de las partículas MS2RLP 2X mejore, por lo tanto, el nivel de encapsidación de los ARNA guía D1, y por lo tanto, una mejor eficacia en la invalidación de la secuencia de GFP.
Ejemplo 4: Eficiencia de una partícula MS2RLP en la administración del sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas9) en células HCT116-GFP
I. Material y procedimientos
1. Construcciones de plásmidos
1.1 Plásmidos para la producción de partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X según la invención
Plásmidos para la expresión de una secuencia de interés: Los plásmidos de expresión para los que se describe el casete de expresión en el Ejemplo 1 (Figura I, pcD-NA-EF1-Cas9-MS2 12X) y en el Ejemplo 2 (Figura VIII, pcDNA -H1-GuideD1 Chimeric-MS22X) se utilizaron para coencapsidar en la misma partícula MS2RLP12X-2X tanto el ARN que codifica Cas9 como el ARN guía dirigido a la secuencia de GFP integrada en el genoma de las células diana (HCT116-GFP cloneD2).
• Plásmido de encapsidación: la partícula lentiviral ha sido modificada para contener dentro de la proteína de nucleocápside, en lugar del segundo dominio de dedo de Zn, la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2. El plásmido de encapsidación p8.74, portador de los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado para la producción de las partículas MS2RLP 12X-2X se modifica según la estrategia ilustrada en la Figura IIa: este plásmido p8.74 se utiliza para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido que carece del segundo dedo de zinc de la proteína de nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de zinc se sustituye por la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 mediante clonación Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-MS2-Coat. Se obtiene así la construcción ilustrada en la Figura IIb. La secuencia que codifica Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT) o la integrasa (IN) sin alterar la función de las MS2RLP.
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser VSV-G que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura III).
Estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X y 2X (o MS2RLP 12X 2X) según la invención. Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1 Chimeric 2X. Ces plasmides sont utilisés pour la production de particules lentivirales MS2(NC)-RLP 12X et 2X (ou MS2RLP 12X 2X) selon l'invention. Plus particuliérement, ces plasmides sont utilisés pour la production de particules lentivirales MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1 Chimérique 2X.
1.2. Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores ILV-GFP para la generación de células diana HCT116-GFP Clone D2
Estos plásmidos se preparan según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
2. Producción de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Después de la transfección de los plásmidos en las células de producción, los sobrenadantes se recogen y se utilizan crudos o se concentran/purifican de acuerdo con uno de los procedimientos P1 o P2 mencionados con anterioridad, descritos en la solicitud WO 2013/014537.
2.1 Producción de partículas lentivirales
Las producciones se llevan a cabo en CellSTACK de 10 pisos (6360 cm2, Corning) con células de producción HEK293T (At Cc , CRL-11268), cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Dm EM, Gibco, Paisley, Reino Unido) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de ultraglutamina (PAA) a 37 °C en atmósfera húmeda al 5% de CO2.
La producción de partículas MS2 (NC)-RLP 12X-2X se lleva a cabo mediante la transfección de los cuatro plásmidos siguientes:
- Los dos plásmidos de expresión descritos con anterioridad, de los cuales el plásmido pcDNA-H1-GuideD1Chimeric-MS22X (Figura VIII) se utiliza en el doble de cantidad del plásmido pcDNA-EF1-Cas9-Ms212X;
- p8.74AZF-MS2-Coat;
- pENV que lleva la envoltura VSV-G.
Más particularmente, las partículas lentivirales MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1 Chimeric 2X se producen por transfección de los cuatro plásmidos siguientes:
- Los dos plásmidos de expresión descritos con anterioridad, de los cuales el plásmido pcDNA-H1-GuideD1Chimeric-MS2 2X (cuyo casete de expresión se ilustra en la FIG. VIII) se utiliza en doble cantidad del plásmido pcDNA-EF1-Cas9-MS212x (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura I);
- p8.74AZF-MS2-Coat (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura IIb);
- pENV que lleva la envoltura VSV-G (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura III).
24 horas después de la transfección estándar con fosfato cálcico, el sobrenadante del cultivo se reemplaza por medio DMEM fresco y no se suplementa. Las células de producción se incuban a 37 °C/5% de CO2. Después de cambiar el medio, el sobrenadante se recoge cuatro veces (32 h, 48 h, 56 h y 72 h después de la transfección). Cada recuperación se clarifica mediante centrifugación durante 5 min a 3000 g antes de microfiltrar a través de un filtro de 0,45 pm (Stericup®, Millipore). Luego, todas las recuperaciones se mezclan para componer el sobrenadante crudo.
Por lo tanto, esta producción comprende dos plásmidos de expresión, un plásmido de encapsidación y un plásmido de envoltura. La proporción de plásmidos utilizados es:
- 33% del plásmido de expresión que codifica la guía,
- 17% del plásmido de expresión que codifica Cas9 (la cantidad de plásmido de expresión que codifica la guía se duplica en comparación con la del plásmido de expresión que codifica Cas9),
- 25% del plásmido p8.74AZF, y
- 25% del plásmido pENV.
Los vectores lentivirales ILV-GFP se producen como se describe en el Ejemplo 1.
2.2 Concentración y purificación de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las partículas y los vectores se concentran y purifican según el procedimiento P1 descrito en el Ejemplo 1.
3. Titulación de partículas físicas mediante prueba ELISA p24
La proteína de la cápside p24 se detecta directamente en el sobrenadante viral usando y siguiendo las recomendaciones del kit ELISA p24 de VIH-1 (Perkin Elmer). La proteína p24 capturada se compleja con un anticuerpo policlonal biotinilado, luego se detecta mediante una estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP). El complejo resultante se detecta espectrofotométricamente después de la incubación con el sustrato ortofenilendiamina-HCl (OPD) produciendo una coloración amarilla que es directamente proporcional a la cantidad de proteína p24 capturada. La absorbancia de cada pocillo se cuantifica en el lector de placas Synergy H1 Hybrid® (Biotek) y se calibra frente a la absorbancia de un intervalo estándar de proteína p24. El título viral expresado en partículas físicas por ml se calcula a partir de la concentración de proteína p24 obtenida sabiendo que 1 pg de proteína
p24 corresponde a 104 partículas físicas.
Las partículas lentivirales y los vectores lentivirales se valoran como se describe en el Ejemplo 1.
4. Generación de células diana y transducción por partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X según la invención.
Este ejemplo tiene como objetivo mostrar que es posible coencapsidar en la misma partícula MS2RLP 12X-2X tanto el ARN que codifica Cas9 como el ARN guía que se dirige a la secuencia de GFP, integrados en el genoma de las células diana, y luego transferir estos diferentes ARN a través de las partículas MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1 Chimeric 2X en las células diana, HCT116-GFP cloneD2. Al final de esta transferencia de ARN, el sistema CRIS-PR/Cas9 debe ser funcional y generar roturas de ADN bicatenario que permitan la invalidación del gen diana, y así transformar las células GFP+ en células GFP-, utilizando solo una y la misma herramienta para la transferencia de los 2 componentes del sistema CRISPR/Cas9.
4.1 Células diana del HCT116-GFP cloneD2
Este clon se prepara según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
4.2 Transducción de células diana HCT116-GFP cloneD2 por partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X de acuerdo con la invención
Las células HCT116-GFP Clone D2 se inoculan en una placa de 24 pocillos a 25.000 células/cm2y se incuban durante 24 horas a 37 °C/5% de CO2. Las células HCT116-GFP cloneD2 son transducidas por las partículas MS2RLP12X-2X que administran tanto Cas9 como la guía D1 quimérica, a una dosis de 10 pg p24/célula en presencia de 8 pg/ml de Polybrene®. Un inhibidor de los mecanismos de defensa celular, BX795 (Invivogen), se usa a una concentración de 6 pM en el caso de las partículas 12X-2X MS2RLP. El sobrenadante de transducción se retira 4 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo. Se realizó una segunda transducción en las mismas condiciones (Figura XX), 6 días después de la primera transducción. Finalmente, se realizó una tercera transducción en las mismas condiciones 12 días después de la primera transducción (Figura XII). 14 días después de la última transducción, las células se recuperan y el porcentaje de células que expresan GFP se cuantifica mediante citometría (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec).
II. Resultados
El objetivo de este experimento es estudiar la posibilidad de transferir simultáneamente ARN que codifican Cas9 y ARN guía a través de partículas MS2RLP 12X 2X midiendo la funcionalidad del sistema CRISPR/Cas9 en células diana. En primer lugar, los resultados presentados en la Figura XII muestran que las células HCT116 no transducidas (NT) no son fluorescentes (<0,2% de las células GFP+), mientras que las células diana HCT116-GFP cloneD2 son fluorescentes a más del 96%. Cuando las células diana se transducen con las partículas MS2 (NC)-RLP 12X-2X que suministran el sistema CRISPR/Cas9 completo, se observa una disminución del 38% en el número de células fluorescentes 14 días después de la tercera transducción de las células. Por lo tanto, existe una invalidación del gen GFP del orden del 38% con partículas de 12X 2X MS2RLP que administran tanto la nucleasa Cas9 como las guías anti-GFP. La extinción del gen diana por el sistema CRIS-PR/Cas9 es por lo tanto 3 veces más eficiente cuando las células diana son transducidas por un solo lote de partículas MS2RLP que han sido producidas por cotransfección de dos especies de plásmidos de expresión que expresan respectivamente un nucleasa y ARN guía, solo cuando se añaden dos lotes de partículas que llevan respectivamente los ARN de la nucleasa Cas9 y de los ARN guía en el momento de la transducción (Figura XII y Figura XI). Por lo tanto, la eficiencia del sistema CRISPR Cas9 es más eficiente con partículas que transportan múltiples ARN que codifican Cas9 y ARN guía, respectivamente.
Los resultados presentados en la Figura XX muestran que las células HCT116 no transducidas (NT) no son fluorescentes (<0,2% de las células GFP+), mientras que las células diana HCT116-GFP cloneD2 son fluorescentes hasta más del 99%. Cuando las células diana se transducen con las partículas MS2 (NC)-RLP 12X 2X que suministran el sistema CRISPR/Cas9 completo, se observa una disminución del 57% en el número de células fluorescentes 14 días después de la segunda transducción de las células. Por lo tanto, existe una invalidación del gen GFP del orden del 57% con partículas de 12X-2X MS2RLP que entregan los ARN que codifican tanto la nucleasa Cas9 como las guías anti-GFP. Como recordatorio, se observa que el porcentaje de células que expresan GFP disminuye en un 12,8% cuando Cas9 se expresa en forma constitutiva y el ARN guía lo proporcionan las partículas de MS2RLP (Figura XI). Por lo tanto, el porcentaje de células que expresan GFP es cinco veces menor cuando las partículas de MS2RLP suministran tanto el ARN que codifica Cas9 como el ARN guía después de dos transducciones (Figura XX). El análisis de células que aún expresan GFP después de dos transducciones versus tres transducciones por las partículas MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1 Chimeric 2X muestra que el sistema CRISPR parece más eficiente después de dos transducciones (57% de eficiencia, Figura XX) que después de tres transducciones (38% de eficiencia, Figura XII). Esta diferencia se explica por el hecho de que cuando el sistema CRISPR se administra a la célula diana (HCT116-GFP cloneD2), generará una ruptura del ADN bicatenario al nivel de la secuencia diana, es decir, la secuencia que codifica la proteína GFP, pero también en otras secuencias en forma inespecífica. De hecho, el sistema CRISPR exhibe cierto grado de escisión inespecífica, denominada “efecto fuera del objetivo”, que permite la generación de roturas de ADN bicatenario también sometidas al sistema de reparación de ADN (sistema NHEJ, para No Homologous End Joining), ya que se generan específicamente roturas de ADN bicatenario. Cuanto más se suministre el sistema
CRISPR en la célula diana, más exhibirá un “efecto fuera del objetivo”, habrá roturas de ADN bicatenario generadas en la misma célula diana. Este sistema alcanza un límite en el que el sistema NHEJ se satura y el ADN ya no se repara. En este caso, la no reparación del ADN genómico induce la muerte de la célula transducida. Esto es lo que se observa en las células transducidas 3 veces por las partículas MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1 Chimeric 2X. Esto se debe a que las células transducidas tres veces terminan muriendo en el matraz de cultivo. Así, las células no transducidas, por lo tanto no afectadas por el sistema CRISPR que permite la extinción de la proteína GFP, tienen una ventaja proliferativa sobre las células transducidas tres veces, lo que explica que el nivel de células que expresan GFP es mayor después de tres transducciones por las partículas MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1 Chmeric 2X solo después de dos transducciones.
En conclusión, estas partículas MS2RLP 12X 2X se destacan por ser la mejor herramienta para coadministrar el sistema CRISPR/Cas9, con el uso de un solo lote de partículas, después de una o dos transducciones, según la eficiencia de edición de genoma, y también dependiendo del tipo de célula.
Ejemplo 5: Partículas lentivirales según la invención para el sistema TALEN
El uso del sistema TALEN en una estrategia de edición del genoma implica el uso de una primera unión de TALEN aguas arriba del sitio de escisión del ADN bicatenario generado (TALEN 5'), por lo tanto, una segunda unión de TALEN aguas abajo del sitio de se generó la escisión del ADN bicatenario (TALEN 3').
La Figura XIIIa muestra el plásmido de expresión que permite la producción de partículas MS2RLP 12X que expresan una unión a TALEN aguas arriba (lado 5') de la escisión de ADN bicatenario generada.
La Figura XIIIb muestra el plásmido de expresión que permite la producción de partículas MS2RLP 12X que expresan una unión de TALEN aguas abajo (lado 3') de la escisión de ADN bicatenario generada.
La Figura XIVa muestra el plásmido de expresión que permite la producción de partículas de ILV integradoras que expresan una unión de TALEN aguas arriba (lado 5') de la escisión de ADN bicatenario generada.
La Figura XIVb muestra el plásmido de expresión que permite la producción de partículas de ILV integradoras que expresan una unión de TALEN aguas abajo (lado 3') de la escisión de ADN bicatenario generada.
Ejemplo 6: Partículas lentivirales según la invención para el sistema de nucleasa con dedos de Zn
El uso del sistema de nucleasa con dedos de Zn en una estrategia de edición del genoma implica el uso de una primera unión de los dedos de Zn aguas arriba del sitio de escisión del ADN bicatenario generado (ZFP 5'), así como un segundo dedo de Zn que se une aguas abajo del sitio de la escisión del ADN bicatenario generado (ZFP 3').
La Figura XVa muestra el plásmido de expresión que permite la producción de partículas MS2RLP 12X que expresan una unión de dedo de Zn aguas arriba (lado 5') de la escisión de ADN bicatenario generada.
La Figura XVb muestra el plásmido de expresión que permite la producción de partículas MS2RLP 12X que expresan una unión de dedo de Zn aguas abajo (lado 3') de la escisión de ADN bicatenario generada.
La Figura XVIa muestra el plásmido de expresión que permite la producción de partículas de ILV integradoras que expresan una unión de dedo de Zn aguas arriba (lado 5') de la escisión de ADN bicatenario generada.
La Figura XVIb muestra el plásmido de expresión que permite la producción de partículas de ILV integradoras que expresan una unión de dedo de Zn aguas abajo (lado 3') de la escisión de ADN bicatenario generada.
Ejemplo 7: Construcción de partículas lentivirales PP7 (IN)-RLP mediante modificación de la integrasa
I. Material y procedimientos
1. Construcciones de plásmidos
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: el plásmido de expresión lleva un casete de expresión (ver Figura XVII) con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARNm en las partículas lentivirales, se insertaron 12 repeticiones del motivo de tallo-bucle del ARN PP7 (ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID NO: 2) dentro de un casete de expresión aguas abajo del gen informador (Figura XVII).
El promotor usado puede ser el de CMV o EF1 (Figura XVII) pero pueden usarse otros promotores. La secuencia de interés puede ser un ADN que codifica una proteína informadora como luciérnaga luciferasa nativa (Figura XVII), una proteína fluorescente verde (Zs-Greenl), roja (mCherry) o azul (mtBFP), o un ADNc que codifica una proteína, para ejemplo la proteína CRE. La secuencia de interés también puede ser la de un shARN, un miARN, un sgARN, un LncARN o un cir-cARN.
• Plásmido de encapsidación: La partícula lentiviral ha sido modificada para contener, dentro de la integrasa, la
secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago PP7. El plásmido de encapsidación p8.74, que lleva los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado para la producción de las partículas PP7 (IN)-RLP se modifica de acuerdo con la estrategia ilustrada en la Figura XVIII: este plásmido p8.74 se usa para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido en el que la proteína Coat del fago PP7 se fusiona con el dominio C-terminal de la integrasa. Esta fusión, obtenida por clonación Hpal, permite generar el plásmido P8.74-POL-PP7 Coat. Se obtiene así la construcción ilustrada en la Figura XIX. La secuencia que codifica Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT).
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser VSV-G que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura III).
2. Producción, concentración/purificación y titulación de partículas lentivirales
Las partículas lentivirales se producen como se describe en el Ejemplo 1, según el procedimiento P1.
3. Cinética de expresión de luciferasa
Las células HCT116 (ATCC, CCL-247) se inoculan en una placa de 96 pocillos y se incuban durante 24 horas a 37 °C/5% de CO2. La transducción por las partículas PP7 (IN)-RLP-Luc 12X producidas según el procedimiento P1 se realiza a una dosis de 2,8 pg p24/célula, en presencia de 8 pg/ml de Polybrene. El sobrenadante de transducción se retira 4 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo. A las 4, 8, 24, 32 y 48 horas posteriores a la transducción, se recuperan las células y se analiza la expresión de luciferasa utilizando el kit de ensayo de luciferasa OneGlo (Promega) siguiendo las recomendaciones del proveedor y utilizando el lector de placa híbrida Synergy H1 (Biotek). Esta prueba se realiza por triplicado. El control se lleva a cabo mediante células HCT116 no transducidas.
II. Resultados
Es posible transportar ARN en las partículas lentivirales con PP7-Coat en la integrasa. La máxima expresión de luciferasa se alcanza a las 8 en punto. Después de 8 horas, la actividad de la luciferasa disminuye. Por lo tanto, las partículas PP7 (IN)-RLP hacen posible la liberación de ARN.
Ejemplo 8: Eficiencia de una partícula MS2RLP en la liberación del sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas9) en células HCT116-GFP, en función del promotor que permite la transcripción del ARN guía en las células de producción.
I. Material y procedimientos
1. Construcciones de plásmidos
1.1 Plásmidos para la producción de partículas lentivinas MS2 (NC)-RLP 12X y 2X
• Plásmidos de expresión de una secuencia de interés: Los plásmidos de expresión descritos en el Ejemplo 1 (Figura I, pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X) y en la Figura XXI, pcDNA-U6-GuideDl Chimeric-MS2 2X se utilizaron para coencapsidar en la misma partícula 12X-2X MS2RLP tanto el ARN que codifica Cas9 como el ARN guía D1 bajo el control del promotor U6, dirigiéndose a la secuencia de GFP integrada en el genoma de las células diana (HCT116-GFP cloneD2).
• Plásmido de encapsidación: la partícula lentiviral ha sido modificada para contener dentro de la proteína de nucleocápside, en lugar del segundo dominio de dedo de Zn, la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2. El plásmido de encapsidación p8.74, portador de los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado para la producción de las partículas MS2RLP 12X-2X se modifica de acuerdo con la estrategia ilustrada por la Figura IIa: este plásmido p8.74 se utiliza para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido que carece del segundo dedo de zinc de la proteína de nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de zinc se sustituye por la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 mediante clonación Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-MS2-Coat. Se obtiene así la construcción ilustrada en la Figura IIb. La secuencia que codifica Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT) o la integrasa (IN) sin alterar la función de las MS2RLP.
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser VSV-G que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura lll).
Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1 Chimeric 2X.
1.2. Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores ILV-GFP para la generación de células diana HCT116-GFP Clone D2
Estos plásmidos se preparan según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
2. Producción de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Después de la transfección de los plásmidos en las células de producción, los sobrenadantes se recogen y se utilizan crudos o se concentran/purifican de acuerdo con uno de los procedimientos P1 o P2 mencionados con anterioridad, descritos en la solicitud WO 2013/014537.
2.1 Producción de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las producciones se llevan a cabo en etapas CellSTACK 10 (6360 cm2, Corning) con células de producción HEK293T (At Cc , CRL-11268), cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Dm EM, Gibco, Paisley, Reino Unido) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de ultraglutamina (PAA) a 37 °C en atmósfera húmeda al 5% de CO2.
La producción de las partículas MS2 (NC)-RLP 12X 2X se lleva a cabo mediante la transfección de los cuatro plásmidos siguientes:
- Los dos plásmidos de expresión descritos con anterioridad, de los cuales el plásmido pcCDNA-U6-GuideD1Chimeric-MS2 2X (cuyo casete de expresión se ilustra en la FIG. XXI) se utiliza en el doble de cantidad del plásmido pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X (cuyo el casete de expresión se ilustra en la Figura I);
- p8.74AZF-MS2-Coat;
- pENV que lleva la envoltura VSV-G.
24 horas después de la transfección estándar con fosfato cálcico, el sobrenadante del cultivo se reemplaza por medio DMEM fresco y no se suplementa. Las células de producción se incuban a 37 °C/5% de CO2. Después de cambiar el medio, el sobrenadante se recoge cuatro veces (32 h, 48 h, 56 h y 72 h después de la transfección). Cada recuperación se clarifica mediante centrifugación durante 5 min a 3000 g antes de microfiltrar a través de un filtro de 0,45 pm (Stericup®, Millipore). Luego, todas las recuperaciones se mezclan para componer el sobrenadante crudo.
Las partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X se producen como se describe en el Ejemplo 4.
Los vectores lentivirales ILV-GFP se producen como se describe en el Ejemplo 1.
2.2 Concentración y purificación de partículas lentivirales
Las partículas se concentran y purifican según el procedimiento P1 descrito en el Ejemplo 1.
3. Titulación de partículas físicas mediante prueba ELISA p24
La proteína de la cápside p24 se detecta directamente en el sobrenadante viral usando y siguiendo las recomendaciones del kit ELISA p24 de VIH-1 (Perkin Elmer). La proteína p24 capturada se compleja con un anticuerpo policlonal biotinilado, luego se detecta mediante una estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP). El complejo resultante se detecta espectrofotométricamente después de la incubación con el sustrato ortofenilendiamina-HCl (OPD) produciendo una coloración amarilla que es directamente proporcional a la cantidad de proteína p24 capturada. La absorbancia de cada pocillo se cuantifica en el lector de placas Synergy H1 Hybrid® (Biotek) y se calibra frente a la absorbancia de un intervalo estándar de proteína p24. El título viral expresado en partículas físicas por ml se calcula a partir de la concentración de proteína p24 obtenida sabiendo que 1 pg de proteína p24 corresponde a 104 partículas físicas.
Las partículas lentivirales y los vectores lentivirales se valoran como se describe en el Ejemplo 1.
4. Generación de células diana y transducción por partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X según la invención. Este ejemplo tiene como objetivo mostrar que es posible coencapsidar en la misma partícula MS2RLP 12X-2X tanto el ARN que codifica Cas9 como el ARN DI guía que se dirige a la secuencia de GFP integrada en el genoma a través de las partículas MS2 (NC)-RLP 12X-2X en las células diana, HCT116-GFP cloneD2. Al final de esta transferencia de ARN, el sistema CRISPR/Cas9 debe ser funcional y generar roturas de ADN bicatenario que permitan la invalidación del gen diana, y así transformar las células GFP+ en células GFP-, utilizando solo una y la misma herramienta para la transferencia de los 2 componentes del sistema CRISPR/Cas9.
4.1 Células diana del HCT116-GFP cloneD2
Este clon se prepara según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
4.2 Transducción de células diana HCT116-GFP cloneD2 por partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X de acuerdo con la invención
Las células HCT116-GFP Clone D2 se inoculan en una placa de 24 pocillos a 25.000 células/cm2y se incuban durante 24 horas a 37 °C/5% de CO2. Las células HCT116-GFP cloneD2 son transducidas por las partículas 12X 2X MS2RLP
que administran tanto Cas9 como la guía D1, una dosis de 10 pg p24/célula, en presencia de 8 |jg/ml de Polybrene®. Un inhibidor de los mecanismos de defensa celular, BX795 (Invivogen), se utiliza a una concentración de 6 jM en el caso de las partículas 12X 2X MS2RLP. El sobrenadante de transducción se retira 4 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo. En la postransducción de J14, las células se recuperan y el porcentaje de células que expresan GFP se cuantifica mediante citometría (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec).
II. Resultados
El objetivo de este experimento es evaluar el impacto del promotor que permite la expresión del ARN guía para la generación de partículas de MS2RLP entregando simultáneamente a Rn que codifica Cas9 y ARN guía.
En este ejemplo, se prueban dos promotores: H1 y U6.
En primer lugar, los resultados presentados en la Figura XXII muestran que las células HCT116 no transducidas (NT) no son fluorescentes (<0,1% de células GFP+), mientras que las células diana HCT116-GFP cloneD2 son fluorescentes a más de 99%. Cuando las células diana se transducen con las partículas MS2 (NC)-RLP 12X 2X que suministran el sistema CRIS-PR/Cas9 completo, 14 días después de la segunda transducción de las células, se observa una disminución en el número de células fluorescentes del 46,2% en el caso de partículas generadas a partir del plásmido portador del promotor H1 y 81,9% en el caso de partículas generadas a partir del plásmido portador del promotor U6. Por lo tanto, la invalidación más fuerte del gen GFP del orden del 81,9% se observa con partículas de 12X 2X MS2RLP generadas a partir del plásmido que lleva el promotor U6 después de dos transducciones. Por lo tanto, el porcentaje de células que expresan GFP es casi 2 veces menor cuando las partículas se generan a partir del plásmido que lleva el promotor U6 que cuando las partículas se generan a partir del plásmido que lleva el promotor H1. En conclusión, la naturaleza del promotor utilizado para generar los ARN guía que se encapsidarán en las partículas MS2RLP tiene un impacto en la eficiencia de la partícula MS2RLP que suministra el sistema CRISPR/Cas9.
Ejemplo 9: Eficiencia de una partícula MS2RLP en la liberación del sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas9) en linfocitos T primarios activados, para la invalidación del gen PD1.
I. Material y procedimientos
1. Construcciones de plásmidos
1.1 Plásmidos para la producción de partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X según la invención
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: El plásmido de expresión descrito en el Ejemplo 1 (cuyo casete de expresión se ilustra en la FIG. I, pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X) y el plásmido de expresión, cuyo casete de expresión se muestra en la Figura XXIII, pcDNA-U6-Guide_antiPD1Chimeric-MS2 2X se utilizaron para coencapsidar en la misma partícula MS2RLP 12X-2X tanto el ARN que codifica Cas9 como el ARN guía bajo el control del promotor U6, dirigiéndose a la secuencia del Gen PD1 integrado en el genoma de linfocitos T primarios.
• Plásmido de encapsidación: la partícula lentiviral ha sido modificada para contener dentro de la proteína de nucleocápside, en lugar del segundo dominio de dedo de Zn, la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2. El plásmido de encapsidación p8.74, portador de los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado para la producción de las partículas MS2RLP 12X-2X se modifica según la estrategia ilustrada en la Figura IIa: este plásmido p8.74 se utiliza para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido que carece del segundo dedo de zinc de la proteína de nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de zinc se sustituye por la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 mediante clonación Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-MS2-Coat. Se obtiene así la construcción ilustrada en la Figura IIb. La secuencia que codifica Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT) o la integrasa (IN) sin alterar la función de las MS2RLP.
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser VSV-G que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura III).
Estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X según la invención. Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales MS2RLP-Cas9 12X-GuideantiPD1Chimeric 2X.
1.2 Plásmidos para la producción de partículas de control lentivirales MS2-(NC)-RLP 12X según la invención
Estos plásmidos se preparan según un procedimiento idéntico al del Ejemplo I. Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales 12X MS2RLP-Cas9, como se describe en el punto 1.1 del Ejemplo 1.
1.3 Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores controles ILVCas9+guideantiPD1
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: Los plásmidos de expresión usados llevan un casete de expresión como se describe en la Figura IV y un casete de expresión como se describe en la Figura XXXII. Estos
plásmidos pueden contener otros elementos como la secuencia nativa WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element) o la secuencia cPPT/CTS. La patogenicidad viral se elimina mediante la sustitución de regiones del genoma viral necesarias para la replicación retroviral por el transgén. Para el primer plásmido, el promotor utilizado es el de EF1, pero pueden utilizarse otros promotores. La secuencia de interés del plásmido es un ADN que codifica el ARN de la proteína Cas9 (Figura IV), en su forma salvaje (WT) o en su forma mutada (N).
Para el segundo plásmido, los promotores usados son U6 o H1, pero pueden usarse otros promotores. La secuencia de interés es una guía antiPD1 (Figura XXXII).
• Plásmido de encapsidación: el plásmido de encapsidación p8.74, que lleva los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), se usa para la producción de vectores lentivirales integradores (Figura VI).
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido es idéntico al plásmido de la envoltura utilizado para la producción de partículas lentivirales MS2RLP (Figura III).
2. Producción de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Después de la transfección de los plásmidos en las células, los sobrenadantes se recogen y se utilizan en bruto o se concentran/purifican según uno de los procedimientos P1 o P2 mencionados con anterioridad, descritos en la solicitud WO 2013/014537.
2.1 Producción de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las producciones se llevan a cabo en CellSTACK de 10 pisos (6360 cm2, Corning) con células de producción HEK293T (At Cc , CRL-11268), cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Dm EM, Gibco, Paisley, Reino Unido) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de ultraglutamina (PAA) a 37 °C en atmósfera húmeda al 5% de CO2.
La producción de las partículas MS2 (NC)-RLP 12X 2X se lleva a cabo mediante la transfección de los cuatro plásmidos siguientes:
- Los dos plásmidos de expresión descritos con anterioridad, de los cuales el plásmido pcDNA-U6-Guide_antiPD1Chimeric-MS22X (cuyo casete de expresión se ilustra en la FIG. XXIII) se utiliza en doble cantidad del plásmido pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X (cuya expresión el casete se ilustra en la Figura I);
- p8.74AZF-MS2-Coat;
- pENV que lleva la envoltura VSV-G.
Las partículas de MS2 (NC)-RLP 12X 2X se producen de acuerdo con el proceso descrito en el Ejemplo 4.
Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para producir las partículas lentivirales 2X quiméricas MS2RLP-Cas9 12X-GuideantiPD1.
24 horas después de la transfección estándar con fosfato cálcico, el sobrenadante del cultivo se reemplaza con medio DMEM nuevo y sin suplementar. Las células de producción se incuban a 37 °C/5% de CO2. Después de cambiar el medio, el sobrenadante se recoge cuatro veces (32 h, 48 h, 56 h y 72 h después de la transfección). Cada recuperación se clarifica mediante centrifugación durante 5 min a 3000 g antes de microfiltrar a través de un filtro de 0,45 pm (Stericup®, Millipore). Luego, todas las recuperaciones se mezclan para componer el sobrenadante crudo.
Las partículas de control lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X se producen como se describe en el Ejemplo 4.
La producción, purificación y titulación de los vectores lentivirales de control de ILV, que expresan el sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía+Cas9), se llevan a cabo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 1, según el procedimiento P2.
2.2 Concentración y purificación de partículas lentivirales
Las partículas se concentran y purifican según el procedimiento P2 descrito en el Ejemplo 1.
3. Titulación de partículas físicas mediante prueba ELISA p24
La proteína de la cápside p24 se detecta directamente en el sobrenadante viral usando y siguiendo las recomendaciones del kit ELISA p24 de VIH-1 (Perkin Elmer). La proteína p24 capturada se compleja con un anticuerpo policlonal biotinilado, luego se detecta mediante una estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP). El complejo resultante se detecta espectrofotométricamente después de la incubación con el sustrato ortofenilendiamina-HCl (OPD) produciendo una coloración amarilla que es directamente proporcional a la cantidad de proteína p24 capturada. La absorbancia de cada pocillo se cuantifica en el lector de placas Synergy H1 Hybrid® (Biotek) y se calibra frente a la absorbancia de un intervalo estándar de proteína p24. El título viral expresado en partículas físicas por ml se calcula a partir de la concentración de proteína p24 obtenida sabiendo que 1 pg de proteína
p24 corresponde a 104 partículas físicas.
Las partículas lentivirales y los vectores lentivirales se valoran como se describe en el Ejemplo 1.
4. Preparación de células diana y transducción mediante partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X según la invención.
Este ejemplo tiene como objetivo mostrar que es posible coencapsidar en la misma partícula MS2RLP 12X 2X tanto el ARN que codifica Cas9 como el ARN guía que se dirige a la secuencia del gen PD1, y luego transferir estos diferentes ARN a través de las partículas MS2 (NC)-RLP 12X 2X en las células diana, los linfocitos T primarios activados. Al final de esta transferencia de ARN, el sistema CRIS-PR/Cas9 debe ser funcional y generar roturas de ADN bicatenario que permitan la invalidación del gen diana PD1 utilizando solo una y la misma herramienta para la transferencia de los 2 constituyentes del sistema CRISPR/Cas9.
4.1 Preparación de linfocitos T primarios activados por células diana
Las células diana, los linfocitos T, se preparan a partir de una muestra de sangre periférica. Las células mononucleares de sangre periférica se aíslan mediante centrifugación en un gradiente de Ficoll, luego se adhieren durante 2 horas a 37 °C/5% de CO2 en un matraz T75. Las células en suspensión se recuperan y los linfocitos T se purifican mediante selección negativa utilizando perlas magnéticas (kit de aislamiento de células Pan T, Miltenyi Biotec). Los linfocitos T purificados se activan durante 24 horas (Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28, ThermoFisher) a 37 °C/5% de CO2.
4.2 Linfocitos T primarios activados por transducción de células diana
Las células diana de linfocitos T primarios activados se siembran en una placa de 96 pocillos a 1.000.000 de células/ml y se transducen mediante las partículas MS2RLP 12X 2X que suministran tanto Cas9 como la guía, o mediante las partículas MS2RLP 12X que suministran solo Cas9 (control negativo), en presencia de 8 pg/mL de Polybrene®, a diferentes dosis (0,1; 0,5; 1 o 5 pg p24/célula), o por partículas de ILV que liberan tanto Cas9 como guía (control positivo), a diferentes dosis (MOI 5, 10, 25, 50). Un inhibidor de los mecanismos de defensa celular, BX795 (Invivogen), se utiliza a una concentración de 6 pM en el caso de las partículas MS2RLP 12X 2X y MS2RLP 12X.
El sobrenadante de transducción se retira 4 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo. 48 horas después, se realiza una segunda transducción en las mismas condiciones que la primera. Cuatro días después de la segunda transducción, las células se recuperan y el porcentaje de células que expresan PD1 se cuantifica por citometría (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec) después de la inmunotinción de las células con el anticuerpo antiPDI (Miltenyi Biotec).
La viabilidad se analiza añadiendo Viobility™ Fixable Dyes (Miltenyi Biotec) justo antes del análisis de las células con FACS, y el fenotipado de los linfocitos se realiza mediante inmunotinción de las células con los anticuerpos anti-TCR y anticD25 (Miltenyi Biotec).
II. Resultados
El objetivo de este experimento es evaluar la eficacia del sistema CRISPR/Cas9 suministrado por las partículas MS2RLP sobre la invalidación de un gen endógeno de células primarias, por ejemplo, el gen PD1 en linfocitos T primarios activados (Fig. XXIV).
El gen PD1 es objeto de especial atención en el contexto tumoral porque la extinción de la expresión de PD1 permite el reconocimiento de las células tumorales por parte del sistema inmunológico.
Cuando las células se transducen con las partículas MS2 (NC)-RLP 12X 2X que suministran el sistema CRISPR/Cas9 completo, cuatro días después de la segunda transducción, se observa una disminución en el número de células que expresan la proteína PD1 en un 31% en el caso de la primera dosis (0,1 pg p24/célula), en un 60% en el caso de la segunda dosis (0,5 pg p24/célula), en un 75% en el caso de la tercera dosis (1 pg p24/célula) y en un 86% en el caso de la cuarta dosis (5 pg p24/célula). Paralelamente, MS2RLP que expresa Cas9 solo se usa como control negativo para la invalidación del gen PD1. Los resultados muestran que el porcentaje de células que expresan la proteína PD1 es estable, sea cual sea la dosis de partículas MS2RLP 12X 2X que administran el sistema CRIS-PR/Cas9 utilizado.
La Figura XXV muestra la eficiencia de la partícula ILV para administrar el sistema CRISPR/Cas9 para la invalidación del gen PD1 en condiciones comparables a las utilizadas para administrar el sistema CRISPR/Cas9 con el uso de las partículas MS2RLP 12X. A la m O i más alta utilizada (MOI 50), el 42% de las células expresan el gen PD1, mientras que a la dosis más alta de MS2RLP (5 pg p24/célula), solo quedan el 14% de las células que expresan el gen. PD1. La partícula MS2RLP es, por lo tanto, la mejor herramienta para entregar el sistema CR|S-PR/Cas9 y permitir la invalidación eficiente de un objetivo endógeno.
Las Figuras XXIV y XXV se obtuvieron a partir de la transducción de linfocitos T humanos activados, que son células primarias y, por lo tanto, sensibles y delicadas a cualquier manipulación. La Figura XXVI ilustra la medición de la viabilidad de los linfocitos T, después de la primera y la segunda transducción con las partículas 12X-2X MS2RLP que
administran el sistema CRISPR/Cas9. La Figura XXVI permite determinar la dosis óptima de partículas MS2RLP 12X 2X que administran el sistema CRISPR/Cas9, correspondiente a 1 pg p24/célula, para obtener una invalidación efectiva del gen PD1 (Figura XXIV, 75% de invalidación del gen PD1) sin afectar la viabilidad de los linfocitos T activados.
La Figura XXVII ilustra el análisis del fenotipo de linfocitos T, después de la segunda transducción con las partículas 12X-2X MS2RLP que liberan el sistema CRISPR/Cas9, midiendo la expresión del TCR y el marcador de activación CD25. Los resultados muestran que el porcentaje de células que expresan TCR y CD25 es estable, independientemente de la dosis de partículas de MS2RLP utilizada.
En conclusión, las Figuras XXIV, XXVI y XXVII muestran que las partículas de MS2RLP son la mejor herramienta para administrar el sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas9) mientras se conserva la viabilidad y el fenotipo de los linfocitos T transducidos.
Ejemplo 10: Eficiencia de una partícula MS2RLP para administrar el sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas9) en linfocitos T primarios activados, para la invalidación del gen CXCR4.
I. Material y procedimientos
1. Construcciones de plásmidos
1.1 Plásmidos para la producción de partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X según la invención
Plásmidos de expresión de una secuencia de interés: Los plásmidos de expresión descritos en el Ejemplo 1 (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura I, pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12x ) y en la Figura XXVIII, pcDNA-U6-Guide_antiCXCR4Chimeric-MS22X, se utilizaron para coencapsidar en la misma partícula MS2RLP 12X 2X tanto el ARN que codifica Cas9 como el ARN guía bajo el control del promotor U6, dirigido a la secuencia del gen CXCR4 integrada en el genoma de linfocitos T primarios.
• Plásmido de encapsidación: la partícula lentiviral ha sido modificada para contener dentro de la proteína de nucleocápside, en lugar del segundo dominio de dedo de Zn, la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2. El plásmido de encapsidación p8.74, portador de los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado para la producción de las partículas MS2RLP 12X-2X se modifica según la estrategia ilustrada en la Figura IIa: este plásmido p8.74 se utiliza para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido que carece del segundo dedo de zinc de la proteína de nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de zinc se sustituye por la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 mediante clonación Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-MS2-Coat. Se obtiene así la construcción ilustrada en la Figura IIb. La secuencia que codifica Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT) o la integrasa (IN) sin alterar la función de las MS2RLP.
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser VSV-G que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura III).
Estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X según la invención. Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales MS2RLP-Cas9 12X-GuidantiCXCR4Chimeric 2X.
1.2 Plásmidos para la producción de partículas lentivirales controles MS2-(NC)-RLP 12X según la invención
Estos plásmidos se preparan según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1. Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales 12X MS2RLP-Cas9, como se describe en el punto 1.1 del Ejemplo 1.
2. Producción de lotes de partículas lentivirales
Después de la transfección de los plásmidos en las células de producción, los sobrenadantes se recogen y se utilizan crudos o se concentran/purifican de acuerdo con uno de los procedimientos P1 o P2 mencionados con anterioridad, descritos en la solicitud WO 2013/014537.
2.1 Producción de partículas lentivirales
Las producciones se llevan a cabo en CellSTACK de 10 pisos (6360 cm2, Corning) con células de producción HEK293T (At Cc , CRL-11268), cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Dm EM, Gibco, Paisley, Reino Unido) suplementado por 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de ultraglutamina (PAA) a 37 °C en atmósfera húmeda al 5% de CO2.
La producción de las partículas MS2 (NC)-RLP 12X-2X se lleva a cabo mediante la transfección de los cuatro plásmidos siguientes:
- Los dos plásmidos de expresión descritos con anterioridad, incluido el pcDNA-U6-Guide_antiCXCR4Chimeric-MS2 2X (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura XXVIII) se usa en el doble de la cantidad del plásmido pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura I);
- p8.74AZF-MS2-Coat;
- pENV que lleva la envoltura VSV-G.
La proporción de plásmidos utilizada es idéntica a la del ejemplo 4.
Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para producir las partículas lentivirales MS2RLP-Cas9 12X-GuideantiCXCR4Chimeric 2X.
24 horas después de la transfección estándar con fosfato cálcico, el sobrenadante del cultivo se reemplaza por medio DMEM fresco y no se suplementa. Las células de producción se incuban a 37 °C/5% de CO2. Después de cambiar el medio, el sobrenadante se recoge cuatro veces (32 h, 48 h, 56 h y 72 h después de la transfección). Cada recuperación se clarifica mediante centrifugación durante 5 min a 3000 g antes de microfiltrar a través de un filtro de 0,45 pm (Stericup®, Millipore). Luego, todas las recuperaciones se mezclan para componer el sobrenadante crudo.
Las partículas de control lentivirales MS2-(NC) RLP 12X se producen como se describe en el Ejemplo 1.
2.2 Concentración y purificación de partículas lentivirales
Las partículas se concentran y purifican según el procedimiento P2 descrito en el Ejemplo 1.
3. Titulación de partículas físicas mediante prueba ELISA p24
La proteína de la cápside p24 se detecta directamente en el sobrenadante viral usando y siguiendo las recomendaciones del kit ELISA p24 de VIH-1 (Perkin Elmer). La proteína p24 capturada se compleja con un anticuerpo policlonal biotinilado, luego se detecta mediante una estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP). El complejo resultante se detecta espectrofotométricamente después de la incubación con el sustrato ortofenilendiamina-HCl (OPD) produciendo una coloración amarilla que es directamente proporcional a la cantidad de proteína p24 capturada. La absorbancia de cada pocillo se cuantifica en el lector de placas Synergy H1 Hybrid® (Biotek) y se calibra frente a la absorbancia de un intervalo estándar de proteína p24. El título viral expresado en partículas físicas por ml se calcula a partir de la concentración de proteína p24 obtenida sabiendo que 1 pg de proteína p24 corresponde a 104 partículas físicas.
4. Preparación de células diana y transducción mediante partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X según la invención.
Este ejemplo tiene como objetivo mostrar que es posible coencapsidar en la misma partícula MS2RLP 12X-2X tanto el ARN que codifica Cas9 como el ARN guía que se dirige a la secuencia del gen CXCR4, y luego transferir estos diferentes ARN a través de partículas MS2 (NC)-RLP 12X-2X en las células diana de linfocitos T primarios activados. Al final de esta transferencia de ARN, el sistema CRIS-PR/Cas9 debe ser funcional y generar roturas de ADN bicatenario que permitan la invalidación del gen diana CXCR4 utilizando solo una y la misma herramienta para la transferencia. De los 2 constituyentes del sistema CRISPR/Cas9.
4.1 Preparación de linfocitos T primarios activados por células diana
Las células diana de linfocitos T se preparan a partir de una muestra de sangre periférica. Las células mononucleares de sangre periférica se aíslan mediante centrifugación en un gradiente de Ficoll, luego se adhieren durante 2 horas a 37 °C/5% de CO2 en un matraz T75. Las células en suspensión se recuperan y los linfocitos T se purifican mediante selección negativa utilizando perlas magnéticas (kit de aislamiento de células Pan T, Miltenyi Biotec). Los linfocitos T purificados se activan durante 24 horas (Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28, ThermoFisher) a 37 °C/5% de CO2.
4.2 Linfocitos T primarios activados por transducción de células diana
Las células diana de linfocitos T primarios activados se siembran en una placa de 96 pocillos a 1.000.000 células/ml y se transducen con las partículas MS2RLP 12X 2X que administran tanto Cas9 como la guía, o mediante las partículas MS2RLP 12X que administran solo Cas9 (control negativo), en presencia de 8 pg/mL de Polybrene®, a diferentes dosis (0.1; 0.5; 1 o 5 pg p24/célula). Un inhibidor de los mecanismos de defensa celular, BX795 (Invivogen), se utiliza a una concentración de 6 pM en el caso de las partículas MS2RLP 12X 2X y MS2RLP 12X.
El sobrenadante de transducción se retira 4 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo. 48 horas después, se realiza una segunda transducción en las mismas condiciones que la primera. Cuatro días después de la segunda transducción, las células se recuperan y el porcentaje de células que expresan CXCR4 se cuantifica por citometría (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec) después de la inmunotinción de las células con el anticuerpo antiCXCR4 (Miltenyi Biotec).
La viabilidad se analiza mediante la adición de Viobility™ Fixable Dyes (Miltenyi Biotec) justo antes del análisis de las células con FACS, y el fenotipado de los linfocitos se realiza mediante inmunotinción de las células con los anticuerpos anti-TCR y antiCD25 (Miltenyi Biotec).
II. Resultados
El objetivo de este experimento es evaluar la eficacia del sistema CRISPR/Cas9 suministrado por las partículas MS2RLP en la invalidación de un gen endógeno de células primarias, por ejemplo, el gen CXCR4 en linfocitos T primarios activados (Fig. XXIX).
El gen CXCR4 es un objetivo de interés porque la extinción de su expresión en linfocitos T CD4+ permite el bloqueo de la infección por el virus VIH-1.
Cuando las células se transducen con las partículas MS2 (NC)-RLP 12X 2X que suministran el sistema CRISPR/Cas9 completo, se observa una disminución del 92% en el número de células que expresan la proteína CXCR4 cuatro días después de la segunda transducción. En el caso de la primera dosis (0,1 pg p24/célula), un 97% en el caso de la segunda dosis (0,5 pg p24/célula), un 98% en el caso de la tercera dosis (1 pg p24/célula) y un 99% en el caso de la cuarta dosis (5 pg p24/célula).
Paralelamente, MS2RLP que expresa Cas9 solo se usa como control negativo para la invalidación del gen CXCR4. Los resultados muestran que el porcentaje de células que expresan la proteína CXCR4 es estable, sea cual sea la dosis de partículas MS2RLP 12X que administran la proteína Cas9 sola.
Las Figuras XXX y XXXI se obtuvieron a partir de la transducción de linfocitos T humanos activados, que son células primarias y, por lo tanto, sensibles y delicadas a cualquier manipulación. La Figura XXX ilustra la medición de la viabilidad de los linfocitos T, después de la primera y la segunda transducción con las partículas 12X-2X MS2RLP que administran el sistema CRISPR/Cas9. Se observa que la viabilidad de los linfocitos T no se ve alterada por la(s) transducción(es) con las partículas MS2RLP 12X 2X, cualquiera que sea la dosis utilizada.
La dosis óptima de partículas MS2RLP 12X 2X que liberan el sistema CRISPR/Cas9 corresponde a 5 pg p24/célula y permite obtener una invalidación efectiva del gen CXCR4 (Figura XXIX, invalidación del 99% del gen CXCR4) sin que afectan la viabilidad de los linfocitos T activados.
La Figura XXXI ilustra el análisis del fenotipo de los linfocitos T, después de la segunda transducción con las partículas MS2RLP 12X 2X entregando el sistema CRISPR/Cas9 para la invalidación del gen CXCR4, midiendo la expresión del TCR y del marcador de activación CD25. Los resultados muestran que el porcentaje de células que expresan TCR y CD25 es estable, sea cual sea la dosis de partículas de MS2RLP utilizada.
En conclusión, las Figuras XXIX, XXX y XXXI muestran que las partículas de MS2RLP son la mejor herramienta para administrar el sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas9) mientras se conserva la viabilidad y el fenotipo de los linfocitos T transducidos.
Ejemplo 11: Efecto de dosis de una partícula de MS2RLP que administra el sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas9) en células HCT116-GFP
I. Material y procedimientos
1. Construcciones de plásmidos
1.1 Plásmidos para la producción de partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X según la invención
Estos plásmidos se preparan de acuerdo con un proceso idéntico al del Ejemplo 8. Más particularmente, estos plásmidos se usan para la producción de partículas lentivirales MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1 Chimeric 2X.
1.2 Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores de ILV-GFP para la generación de las células diana HCT116-GFP Clone D2
Estos plásmidos se preparan según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
2. Producción de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Después de la transfección de los plásmidos en las células de producción, los sobrenadantes se recogen y se utilizan en bruto o se concentran/purifican de acuerdo con uno de los procedimientos P1 o P2 mencionados con anterioridad y como se describe en la solicitud WO 2013/014537.
2.1 Producción de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las partículas lentivirales MS2RLP 12X 2X se producen de acuerdo con el proceso descrito en el Ejemplo 4.
Los vectores lentivirales ILV-GFP se producen como se describe en el Ejemplo 1.
2.2 Concentración y purificación de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las partículas lentivirales y los vectores lentivirales se concentran y purifican según el procedimiento P1 descrito en el Ejemplo 1.
3. Titulación de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las partículas lentivirales y los vectores lentivirales se valoran de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
4. Generación de células diana y transducción por partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X según la invención.
Este ejemplo tiene como objetivo mostrar que una partícula MS2RLP 12X 2X que administra el sistema CRISPR Cas9 en las células diana tiene un efecto de dosis en la eficiencia de edición del genoma. Al final de esta transferencia de ARN, el sistema CRISPR/Cas9 debe ser funcional y generar roturas de ADN bicatenario que permitan la invalidación del gen diana, y así transformar las células GFP+ en células GFP-, utilizando una única herramienta para la transferencia de los 2 componentes del sistema CRISPR/Cas9.
4.1 Células diana del HCT116-GFP cloneD2
Este clon se prepara según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
4.2 Transducción de las células diana HCT116-GFP cloneD2 por las partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X 2X de acuerdo con la invención
Las células diana HCT116-GFP cloneD2 se siembran en una placa de 24 pocillos a 25.000 células/cm2 y se incuban durante 24 horas a 37 °C/5% de CO2. Las células diana HCT116-GFP cloneD2 se transducen mediante partículas quiméricas 2X MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1, que administran tanto la guía Cas9 como la quimérica D1, en diferentes dosis (0,5; 1; 5 o 10 pg p24/célula) en presencia de 8 pg/ml de Polybrene®. Un inhibidor de los mecanismos de defensa celular, BX795 (Invivogen), se utiliza a una concentración de 6 pM en el caso de las partículas 12X 2X MS2RLP. El sobrenadante de transducción se retira 5 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo. Se realizó una segunda transducción en las mismas condiciones 6 días después de la primera transducción (Figura XXXIII). 7 días después de la última transducción, las células se recuperan y el porcentaje de células que expresan GFP se cuantifica por citometría (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec).
II. Resultados
El objetivo de este experimento es estudiar la capacidad de las partículas MS2RLP 12X 2X según la invención para inducir un efecto de dosis en la edición del genoma, transfiriendo simultáneamente ARN codificantes de Cas9 y ARN guía a diferentes concentraciones y midiendo la extinción de GFP en HCT116-GFP cloneD2, con una primera transducción (Figura XXXIII, % de células positivas para T1) y una segunda transducción (Figura XXXIII, % de células positivas para T2).
En primer lugar, los resultados presentados en la Figura XXXIII muestran que las células diana HCT116-GFP cloneD2 son 100% fluorescentes mientras que las células HCT116 no transducidas (NT) no son fluorescentes. Cuando las células se transducen con las partículas MS2RLP 12X 2X que suministran el sistema CRISPR/Cas9 completo, 7 días después de la segunda transducción de las células (Figura XXXIII, % de células positivas para T2), se observa una disminución en el número de células fluorescentes después efecto de la dosis. Se observa una mayor extinción de GFP después de la segunda transducción que después de la primera transducción independientemente de la dosis de pg p24/célula (0,5, 1, 5 o 10).
Después de la segunda transducción, hay una invalidación del gen GFP del orden del 33% para una dosis de 0,5 pg p24/célula, una invalidación del gen GFP del orden del 39% para 1 pg p24/célula., invalidación del gen GFP del orden del 58% para 5 pg p24/célula y finalmente una invalidación del gen GFP del orden del 65% a 10 pg p24/célula. Por lo tanto, una segunda transducción permite aumentar la eficacia de la invalidación de GFP con respecto a la primera transducción. Cuanto mayor sea la dosis de partículas de MS2RLP 12X 2X, mayor será la invalidación de GFP.
Ejemplo 12: Eficiencia de una partícula PP7RLP en la administración del sistema CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas9) en células HCT116-GFP
I. Material y procedimientos
1. Construcciones de plásmidos
1.1. Plásmidos para la producción de partículas lentividas PP7 (NC)-RLP 2X según la invención
En este ejemplo, las partículas PP7 (NC)-RLP 2X se denominarán PP7 (NC)-RLP 2X 2X porque comprenden dos series de patrones de tallo-bucle de PP7 diferentes (primera serie de patrones: SEQ ID NO: 2 seguido de SEQ ID NO: 4 y segunda serie de motivos: SEQ ID NO: 5 seguido de SEQ ID NO: 6).
• Plásmidos de expresión de una secuencia de interés: el primer plásmido de expresión lleva un casete de expresión como se describe en la Figura XXXIV (pcDNA-EF1-Cas9-PP72X), con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARNm en las partículas lentivirales, se insertaron 2 repeticiones del motivo de tallo-bucle del ARN de PP7 (ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID NO: 2 y ctagaaaccagcagagcatatgggctcgcttrectgcag expresión de SEQ ID NO: 4) la secuencia de la enzima Cas9 (Figura XXXIV). El promotor usado es el de EF1 (Figura XXXIV) pero pueden usarse otros promotores. La secuencia de interés del plásmido es un ADN que codifica el ARN de la proteína Cas9 (Figura XXXIV), en su forma salvaje (WT) o en su forma mutada (N).
El segundo plásmido de expresión lleva un casete de expresión como se describe en la Figura XXXV (pcDNA-U6-GuideD1Chimeric-PP72X), con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARN guía en las partículas lentivirales, se insertaron 2 repeticiones del motivo de tallo-bucle del ARN PP7 (ggagcagacgatatggcgtcgctcc SEQ ID NO: 5 y ccagcagagcatatgggctcgctgg SEQ ID NO: 6) en un casete de expresión en el parte del andamio de la guía (guía quimérica, Figura XXXV). El promotor utilizado es U6 pero se pueden utilizar otros promotores, como el promotor H1. El uso de un promotor de tipo dependiente de ARN pol III, como H1 o U6, requiere la presencia de una señal de terminación de la transcripción (Term). La secuencia de interés es un ARN no codificante que se dirige a la secuencia de GFP (sgARN = ARN guía).
Estos plásmidos de expresión se utilizaron para coencapsidar en la misma partícula PP7RLP 2X tanto el ARN que codifica Cas9 como el ARN guía que se dirige a la secuencia de GFP integrada en el genoma de las células diana (HCT116-GFP cloneD2).
• Plásmido de encapsidación: la partícula lentiviral ha sido modificada para contener dentro de la proteína de nucleocápside, en lugar del segundo dominio de dedo de Zn, la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago PP7. El plásmido de encapsidación p8.74, portador de los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado para la producción de las partículas PP7RLP 2X se modifica según la estrategia ilustrada en la Figura XXXVIa: se utiliza este plásmido p8.74 para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido que carece del segundo dedo zinc de la proteína de nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de zinc se sustituye por la proteína “Coat” del bacteriófago PP7 mediante clonación Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-PP7-Coat. De este modo obtenemos la construcción ilustrada en la Figura XXXVIb. La secuencia que codifica Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT) o la integrasa (IN) sin alterar la función de PP7r Lp 2X 2X.
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser VSV-G que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura III).
Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales PP7RLP Cas9 2X-GuideDI Chimeric 2X.
1.2. Plásmidos para la producción de vectores lentivirales integradores ILV-GFP para la generación de células diana HCT116-GFP Clone D2
Estos plásmidos se preparan según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
2. Producción de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Después de la transfección de los plásmidos en las células de producción, los sobrenadantes se recogen y se utilizan crudos o concentrados/purificados de acuerdo con uno de los procedimientos P1 o P2 mencionados con anterioridad y como se describe en la solicitud WO 2013/014537.
2.1 Producción de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las producciones se llevan a cabo en etapas CellSTACK 10 (6360 cm2, Corning) con células de producción HEK293T (At Cc , CRL-11268), cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Dm EM, Gibco, Paisley, Reino Unido) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de ultraglutamina (PAA) a 37 °C en atmósfera húmeda al 5% de CO2.
La producción de las partículas PP7 (NC)-RLP 2X 2X, preferiblemente PP7RLP-Cas9 2X-GuideD1 Chimeric 2X, se lleva a cabo mediante transfección de los cuatro plásmidos siguientes:
- Los dos plásmidos de expresión descritos con anterioridad, incluido el plásmido pcDNA-U6-GuideD1Chimeric-PP7 2X (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura XXXV) se utiliza en el doble de la cantidad del plásmido pcDN A-EF1-Cas9-PP72X (cuya el casete se ilustra en la Figura x Xx IV);
- p8.74AZF-PP7-Coat (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura XXXVIb);
- pENV que lleva la envoltura VSV-G (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura III).
Las partículas PP7 (NC)-RLP 2X 2X se producen de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4. 24 horas
después de la transfección estándar con fosfato cálcico, el sobrenadante del cultivo se reemplaza por medio DMEM nuevo y sin suplementar. Las células de producción se incuban a 37 °C/5% de CO2. Después de cambiar el medio, el sobrenadante se recoge cuatro veces (32 h, 48 h, 56 h y 72 h después de la transfección). Cada recuperación se clarifica mediante centrifugación durante 5 min a 3000 g antes de microfiltrar a través de un filtro de 0,45 pm (Stericup®, Millipore). Luego, todas las recuperaciones se mezclan para componer el sobrenadante crudo.
Los vectores lentivirales ILV-GFP se producen como se describe en el Ejemplo 1.
2.2 Concentración y purificación de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las partículas lentivirales y los vectores lentivirales se concentran y purifican según el procedimiento P1 descrito en el Ejemplo 1.
3. Titulación de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las partículas lentivirales y los vectores lentivirales se valoran como se describe en el Ejemplo 1.
4. Generación de células diana y transducción por partículas lentivirales PP7 (NC)-RLP 2X 2X según la invención.
Este ejemplo tiene como objetivo mostrar que una partícula PP7RLP que administra el sistema CRISPR Cas9 a las células diana tiene un efecto de dosis sobre la eficacia de la edición del genoma. Al final de esta transferencia de ARN, el sistema CRISPR/Cas9 debe ser funcional y generar roturas de ADN bicatenario que permitan la invalidación del gen diana, y así transformar las células GFP+ en células GFP-, utilizando solo una y la misma herramienta para la transferencia de los 2 componentes del sistema CRISPR/Cas9.
4.1 Células diana del HCT116-GFP cloneD2
Este clon se prepara según un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1.
4.2 Transducción de células diana HCT116-GFP cloneD2 por partículas lentivirales PP7 (NC)-RLP 2X 2X según la invención
Las células diana HCT116-GFP cloneD2 se siembran en una placa de 24 pocillos a 25.000 células/cm2 y se incuban durante 24 horas a 37 °C/5% de CO2. Las células diana HCT116-GFP cloneD2 son transducidas por las partículas PP7RLP 2X 2X que administran tanto Cas9 como la guía quimérica D1 en diferentes dosis (0,5; 1; 5 o 10 pg p24/célula) en presencia de 8 pg/ml de Polybrene®. Un inhibidor de los mecanismos de defensa celular, BX795 (Invivogen), se usa a una concentración de 6 pM en el caso de partículas PP7RLP 2X 2X. El sobrenadante de transducción se retira 17 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo. Se realizó una segunda transducción en las mismas condiciones 6 días después de la primera transducción (Figura XXXVII). 7 días después de la última transducción, las células diana se recuperan y el porcentaje de células que expresan GFP se cuantifica por citometría (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec).
II. Resultados
El objetivo de este experimento es estudiar la capacidad de las partículas PP7RLP para inducir un efecto de dosis en la edición del genoma, transfiriendo simultáneamente un ARN que codifica Cas9 y un ARN guía dirigido a la secuencia codificante de la proteína GFP a diferentes concentraciones y midiendo la extinción de GFP en HCT116-GFP Clone D2 por citometría, con una primera transducción (Figura XXXVII, % de células T1 positivas) y una segunda transducción (Figura XXXVII, % de células T2 positivas).
En primer lugar, los resultados presentados en la Figura XXXVII muestran que las células HCT116 no transducidas (NT) no son fluorescentes, mientras que las células diana HCT116-GFP cloneD2 son 100% fluorescentes. Cuando las células clonD2 HCT116-GFP se transducen con las partículas PP7RLP 2X entregando el sistema CRISPR/Cas9 completo, se observa una disminución 7 días después de la primera y segunda transducción de las células diana (Figura XXXVII,% de células positivas T2) de células fluorescentes después de un efecto de dosis. En cuanto a las partículas MS2RLP, se observa una mayor extinción de la GFP después de la segunda transducción que después de la primera transducción, cualquiera que sea el número de pg p24/célula (0,5, 1, 5 o 10).
Después de la segunda transducción, hay una invalidación del gen GFP del orden del 33% para una dosis de 0,5 pg p24/célula, del orden del 54% para 1 pg p24/célula, del orden del 85% para 5 pg p24/célula y finalmente del orden del 75% a 10 pg p24/célula. Por lo tanto, una segunda transducción permite aumentar la eficacia de la invalidación de GFP con respecto a la primera transducción. Cuanto mayor sea la dosis de partículas de PP7RLP, mayor será la invalidación de GFP, alcanzando la máxima eficiencia de extinción a la dosis de 5 pg p24/célula. Además, las partículas de PP7RLP exhiben un “efecto fuera del objetivo” como se describe en el Ejemplo 4, entre las dosis de partículas de PP7RLP de 5 pg p24/célula y 10 pg p24/célula. Por lo tanto, la dosis y el número de transducciones utilizadas son factores importantes que deben tenerse en cuenta para la eficiencia de las partículas PP7RLP en la administración del sistema CRISPR/Cas9 completo.
Las partículas de PP7RLP permiten obtener un porcentaje mayor de extinción de GFP en las células diana del
HCT116-GFP cloneD2 que las partículas de MS2RLP (Figura XXXVII y Figura XXII, respectivamente). A la dosis óptima de cada partícula, se observa una invalidación del gen GFP del orden del 85% para 5 pg p24/célula de partículas PP7RLP vs. 82% para 10 pg p24/célula de partículas de MS2RLP, es decir, una dosis dos veces mayor que para las partículas de PP7RLP. La eficacia de las partículas PP7RLP permite optimizar la transferencia de ARN CRISPR/Cas9, en particular en células primarias delicadas, que pueden ser sensibles a varias transducciones. En conclusión, estas partículas de PP7RLP se destacan por ser la mejor herramienta para co-entregar el sistema CRISPR/Cas9, con el uso de un solo tipo de partículas.
Ejemplo 13: Impacto del precursor de GAG-POL de tipo salvaje para la producción de las partículas MS2RLP-ZsGreen1 12X con miras a optimizar las partículas efectivas MS2RLP-CRISPR/Cas9 (ARN guía ARN que codifica Cas9)
I. Material y procedimientos
1. Construcciones de plásmidos
1.1 Plásmido para la producción de una partícula lentiviral MS2RLP 12X según la invención
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: el plásmido de expresión lleva un casete de expresión como se describe en la Figura XXXVIII) con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARN en las partículas lentivirales, se insertaron 12 repeticiones del motivo de tallo-bucle del ARN de MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID NO: 1) dentro de un casete de expresión aguas abajo de la secuencia de proteína ZsGreenI. El promotor utilizado es el de EF1 pero se pueden utilizar otros promotores. La secuencia de interés del plásmido es el ADN que codifica el ARN de la proteína ZsGreenI.
• Plásmidos de encapsidación: el primer plásmido de encapsidación es el plásmido p8.74AZF, cuyo casete de expresión se describe en la Figura IIb, obtenido mediante la modificación del plásmido de encapsidación p8.74 para contener dentro de la proteína de nucleocápside, en lugar del segundo dedo de Zn dominio, la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2, según la estrategia ilustrada en la Figura IIa y como se describe en el Ejemplo 1.
El segundo plásmido de encapsidación es el plásmido p8.74, que lleva los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales de tipo salvaje (Gag, Pol), como se muestra en la Figura VI.
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser el VSVG que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura III).
Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales MS2RLP-ZsGreenI12X.
1.2 Plásmido para la producción de vectores lentivirales de control integrativo ILV-ZsGreenI
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: el plásmido de expresión lleva un casete de expresión como se describe en la Figura XXXXI. Este plásmido puede contener otros elementos tales como la secuencia nativa WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Post-transcriptional Regulatory Element) o también la secuencia cPPT/CTS. La patogenicidad viral se elimina mediante la sustitución de regiones del genoma viral necesarias para la replicación retroviral por el transgén. El promotor utilizado es el de EF1, pero se pueden utilizar otros promotores. La secuencia de interés del plásmido es el ADN que codifica el ARN de la proteína ZsGreenI.
• Plásmido de encapsidación: el plásmido de encapsidación p8.74, que lleva genes que codifican proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), se usa para la producción de vectores lentivirales integradores (Figura VI).
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido es idéntico al plásmido de la envoltura utilizado para la producción de partículas lentivirales MS2RLP (Figura III).
2. Producción de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
2.1 Producción de partículas lentivirales
Las producciones se llevan a cabo en CellSTACK de 10 pisos (6360 cm2, Corning) con células de producción HEK293T (At Cc , CRL-11268), cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Dm EM, Gibco, Paisley, Reino Unido) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de ultraglutamina (PAA) a 37 °C en una atmósfera húmeda al 5% de CO2.
La producción de las partículas de MS2RLP 12X se lleva a cabo mediante transfección de los cuatro plásmidos siguientes:
- El plásmido de expresión descrito con anterioridad, cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura XXXVIII;
- p8.74AZF-MS2-Coat (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura IIb) y el plásmido p8.74 (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura VI), utilizando cuatro proporciones diferentes de los dos plásmidos d encapsidación,
respectivamente [100% - 0%]; [90% -10%]; [80% - 20%] y [50% - 50%];
- pENV que lleva la envoltura VSV-G (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura III).
Las partículas lentivirales MS2RLP-ZsGreenl 12X se producen como se describe en el Ejemplo 1, es decir con las proporciones respectivas de los siguientes plásmidos: 40% del plásmido de expresión, 30% del plásmido p8.74 (o p8.74AZF) 30% del plásmido pENV (relación [100% - 0%]).
Más particularmente, las proporciones respectivas de los plásmidos son las siguientes:
- relación [90% -10%]: 40% del plásmido de expresión, 27% del plásmido p8.74AZF, 3% del plásmido p8.74, 30% del plásmido pENV;
- relación [80% - 20%]: 40% del plásmido de expresión, 24% del plásmido p8.74AZF, 6% del plásmido p8.74, 30% del plásmido pENV
- relación [50% - 50%]: 40% del plásmido de expresión, 15% del plásmido p8.74AZF, 15% del plásmido p8.74, 30% del plásmido pENV.
En el caso de la producción de una partícula MS2 (NC)-RLP 12X 2X para la transferencia del sistema CRISPR/Cas9 completo, las partículas se producen mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 8. Más particularmente, las proporciones respectivas de los plásmidos son las siguientes: 33% del plásmido de expresión que codifica la guía, 17% del plásmido de expresión que codifica Cas9 (la cantidad de plásmido de expresión que codifica la guía se duplica en comparación con la del plásmido de expresión que codifica Cas9), 25% del plásmido p8.74AZF, 25% del plásmido pENV (proporción [100% - 0%]).
Más particularmente, las respectivas proporciones de los plásmidos son las siguientes:
- relación [90% -10%]: 40% del plásmido de expresión, 22,5% del plásmido p8.74AZF, 2,5% del plásmido p8.74, 30% del plásmido pENV;
- relación [80% - 20%]: 40% del plásmido de expresión, 20% del plásmido p8.74AZF, 5% del plásmido p8.74, 30% del plásmido pENV
- relación [50% - 50%] 40% del plásmido de expresión, 12,5% del plásmido p8.74AZF, 12,5% del plásmido p8.74, 30% del plásmido pENV
Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para producir las partículas lentivirales MS2RLP-Zs-GreenI 12X. Los vectores lentivirales integradores ILV-ZsGreenI que contienen el casete de expresión EF1-ZsGreenI se producen en el control.
Para los lotes de ILV-ZsGreenI, la mezcla de transfección se compone de los tres plásmidos siguientes:
- el plásmido de expresión cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura XXXX
- el plásmido p8.74 (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura VI)
- el plásmido pENV que lleva la envoltura VSV-G (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura III).
24 horas después de la transfección estándar con fosfato cálcico, el sobrenadante del cultivo se reemplaza por medio DMEM fresco y no se suplementa. Las células de producción se incuban a 37 °C/5% de CO2. Después de cambiar el medio, el sobrenadante se recoge cuatro veces (32 h, 48 h, 56 h y 72 h después de la transfección). Cada recuperación se clarifica mediante centrifugación durante 5 min a 3000 g antes de microfiltrar a través de un filtro de 0,45 pm (Stericup®, Millipore). Luego, todas las recuperaciones se mezclan para componer el sobrenadante crudo.
2.2 Concentración y purificación de partículas lentivirales
Las partículas lentivirales y los vectores lentivirales se concentran y purifican según el procedimiento P1 descrito en el Ejemplo 1.
3. Titulación de lotes de partículas lentivirales y vectores lentivirales
Las partículas lentivirales y los vectores lentivirales se valoran como se describe en el Ejemplo 1.
4. Preparación de células diana y transducción mediante partículas lentivirales MS2RLP 12X según la invención. Las células diana Jurkat (ATCC TIB-152) se siembran a 200.000 células/ml en una placa de 96 pocillos, transducidas por las partículas MS2RLP 12X en dos dosis (2 y 10 pg p24/célula), o mediante vectores lentivirales de control. ILV-ZsGreenI a MOI40, en presencia de 4 mg/mL de Polybrene® y luego se incubó a 37 °C/5% de CO2. Un inhibidor de
los mecanismos de defensa celular, BX795 (Invivogen), se usa a una concentración de 6 pM en el caso de las partículas MS2RLP 12X. El sobrenadante de transducción se retira 5 horas más tarde y se reemplaza con medio de cultivo suplementado nuevo. 24 h después de la transducción, las células diana se recuperan y el porcentaje de células que expresan ZsGreenl se cuantifica mediante citometría (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec).
5. Análisis de la maduración de las partículas virales MS2RLP por transferencia Western anti-p24
48 horas después de la transfección de las células de producción (HEK293T) con los plásmidos de producción de las partículas MS2RLP 12X, los sobrenadantes del cultivo se recuperan y luego se concentran de acuerdo con el procedimiento P1, como se describe en el Ejemplo 1, y se titula por cuantificación de la proteína p24, como se describe en el Ejemplo 1. Se cargan el equivalente de 15 ng de p24 para cada condición de la relación de los plásmidos p8.74AZF-Ms2-Coat/p8.74 en un gel desnaturalizante Sd S-PAGE 4/12% luego se migran durante 1 hora a 200 V en búfer MOPS1X. Después de la transferencia a una membrana de nailon, las proteínas se hibridan con un anticuerpo anti-p24 (clon 39/5.4A, Abcam). La transferencia de western se revela usando el kit de transferencia Western rápido Pierce ™, sustrato ECL (Pierce). Las bandas se visualizan por quimioluminiscencia en una película de autorradiografía.
II. Resultados
Este ejemplo pretende mostrar que es posible mejorar la funcionalidad de las partículas de MS2RLP mejorando la maduración del precursor de GAG durante la producción de las partículas, demostrado por la prueba de concepto sobre la producción de partículas de MS2RLP 12X. El plásmido p8.74AZF-MS2 permite la expresión de un precursor de GAG que comprende la proteína Coat del bacteriófago en lugar del segundo dedo de zinc de la proteína de nucleocápside. Esta proteína Coat es capaz de interrumpir la maduración del precursor GAG, cuando se escinde en tres proteínas: la proteína de la matriz, la proteína de la cápside y la proteína de la nucleocápside. Estas tres proteínas son esenciales para la estructura de las partículas virales.
La contribución del precursor de GAG de tipo salvaje, por el plásmido p8.74 además del plásmido de encapsidación p8.74AZF-MS2-Coat durante la producción de las partículas MS2RLP-ZsGreen1 12X podría hacer posible aumentar la maduración del precursor GAG cuando se expresa a través del plásmido p8.74AZF-MS2 y, por lo tanto, aumenta la funcionalidad de las partículas MS2RLP.
El objetivo de este experimento es evaluar el impacto del plásmido p8.74 cuando se cotransfecta, en las células productoras de las partículas MS2RLP 12X, al mismo tiempo que el plásmido de encapsidación p8.74AZF-MS2-Coat para mejorar el maduración del precursor de GAG y, por lo tanto, hacer que las partículas finales sean más funcionales para la transducción de las células diana.
En este ejemplo, se ensayan cuatro proporciones de plásmidos de encapsidación p8.74AZF-MS2-Coat/p8.74: 100/0; 90/10; 80/20 y 50/50. Un vector integrador de ILV que expresa ZsGreenl se usa como control. Las células se transducen en dos cantidades de p24/ml: 2 pg p24/célula (Figura XXXXI) y 10 pg p24/célula (Figura XXXXII).
En primer lugar, los resultados presentados en la Figura XXXXI muestran que para las células no transducidas, el porcentaje de células fluorescentes es muy cercano a 0, mientras que las células transducidas por las partículas MS2RLP-ZsGreenl 12X son fluorescentes a más del 99% independientemente de la proporción de plásmidos de envasado utilizados. Es importante señalar que la intensidad de fluorescencia de ZsGreenl aumenta con el aumento de la cantidad del plásmido p8.74. Las células transducidas por las partículas MS2RLP-ZsGreenl 12X producidas con el 50% del plásmido de encapsidación p8.74AZF-MS2-Coat y el 50% del plásmido p8.74 muestran una intensidad de fluorescencia de 7.76 mientras que la de las células transducidas por partículas MS2RLP-Zs-Greenl 12X producidas solo con el plásmido de encapsidación p8.74AZF-MS2-Coat es de 3,5.
La Figura XXXXII muestra el mismo resultado en términos del porcentaje de células transducidas. Con respecto a la intensidad de la fluorescencia, cuanto más aumenta la cantidad de plásmido p8.74, más aumenta la intensidad de la fluorescencia, como se muestra en la Figura XXXXI. Las células transducidas por las partículas MS2RLP-ZsGreenl 12X producidas con el 50% del plásmido de encapsidación p8.74AZF-MS2-Coat y el 50% del plásmido p8.74 muestran una intensidad de fluorescencia de 60.67 mientras que la de las células transducidas por las partículas MS2RLP-ZsGreenl 12X producidas solo con el plásmido de envasado p8.74AZF-MS2-Coat es de 11,48.
Esto significa que a dosis de 2 pg y 10 pg p24/célula, la fluorescencia obtenida es respectivamente dos y cinco veces mayor cuando las partículas se producen con el 50% del plásmido de encapsidación p8.74AZF-MS2-Coat y el 50% del plásmido p8.74 que cuando se produce solo con el plásmido p8.74AZF-MS2-Coat.
El uso del plásmido p8.74 durante la producción de partículas de MS2RLP, en cotransfección con el plásmido p8.74AZF-MS2-Coat, proporcionó por lo tanto una ganancia en la mejora de la funcionalidad de las partículas MS2RLP-ZsGreenl 12 X, para la optimización de partículas MS2RLP.
La Figura XXXXIII muestra la maduración bioquímica de las partículas MS2RLP-ZsGreenl 12X mediante el cribado de la proteína p24 en el sobrenadante de producción que contiene las partículas. Corresponde a un análisis de los sobrenadantes virales por transferencia Western anti-p24, según dos tiempos de exposición de la película de autorradiografía, un minuto (Figura XXXXIIIa) y quince segundos (Figura XXXXIIIb).
En el caso de una partícula lentiviral integradora derivada del VIH, producida solo con el plásmido p8.74 como plásmido de encapsidación, la proteína p24 es detectable en cuatro niveles:
- en la proteína precursora p160 (GAG-POL)
- en la proteína precursora p55 (GAG),
- como proteína madura (p24)
- en otros precursores proteicos intermedios durante la maduración (entre p160 y p55, y entre p55 y p24).
Si la maduración tiene lugar con normalidad, la proteína p24 debe detectarse en mayor cantidad en el estado maduro (p24) que en el estado de precursores proteicos (p160, p55) o de precursores proteicos intermedios. De hecho, la maduración de las partículas virales tiene lugar después de la liberación de la partícula por la célula productora. En otras palabras, durante su producción, las partículas brotan en la superficie de la célula de producción y luego se liberan de la célula como partículas inmaduras. Es solo después de la liberación de las partículas en el sobrenadante que las proteínas precursoras GAG-POL y GAG maduran en proteínas finales.
En el caso de una partícula de MS2RLP 12X derivada del VIH, producida solo con el plásmido p8.74AZF-MS2-Coat como plásmido de encapsidación, la proteína p24 es detectable en cuatro niveles:
- en la proteína precursora p172 (GAGAZF-MS2-Coat-POL)
- en la proteína precursora p67 (GAGAZF-MS2-Coat),
- como proteína madura (p24)
- en otros precursores proteicos intermedios durante la maduración (entre p172 y p67 y entre p67 y p24).
En esta partícula 12X MS2RLP-ZsGreenI, cada precursor es 12 kDa más pesado, lo que corresponde al tamaño de la proteína Coat del bacteriófago MS2 insertado en el segundo dedo de zinc de la proteína de nucleocápside.
La Figura XXXXIII muestra, en la pista de ILV, las diferentes formas de precursores de proteínas, p160 (GAG-POL), p55 (GAG) así como la proteína p24 perfectamente madura. Hay una mayoría de proteína p24 madura, en comparación con las formas de proteína precursoras. En la pista 100/0, correspondiente a 12X partículas MS2RLP-Zs-Greenl producidas solo con el plásmido p8.74AZF-MS2-Coat como plásmido de encapsidación, la proporción de precursores/proteína p24 madura aumenta en relación con ILV, lo que demuestra que la inserción de la proteína Coat del bacteriófago MS2 disminuye la maduración de las partículas virales. En las piastas 90/10, 80/20 y 50/50, la proporción de precursores de proteínas p172 y p67 disminuye a favor de los precursores de proteínas p160 y p55, respectivamente, para llegar al mismo nivel de expresión para la pista 50/50. La adición del plásmido p8.74 al plásmido p8.74AZF-MS2-Coat, como plásmido de encapsidación para la producción de partículas, da como resultado el aumento de la proporción de la proteína p24 madura (Figura XXXXIIIb, exposición de 15 segundos). Este resultado muestra que para promover la maduración de los precursores de proteínas en las partículas de MS2RLP, es necesario agregar al menos un 10% del plásmido p8.74 además del plásmido p8.74AZF-MS2-Coat como plásmido de encapsidación para la producción de partículas.
En conclusión, la producción de partículas de MS2RLP utilizando al menos un 10% del plásmido p8.74 además del plásmido p8.74AZF-MS2-Coat como plásmido de encapsidación no solo permite un aumento en la maduración de los precursores en proteínas maduras, sino además permite incrementar la funcionalidad de las partículas después de la transducción de las células diana.
Ejemplo 14: Reclutamiento de ARN no virales dirigidos por dos secuencias de encapsidación diferentes (MS2 y PP7) con el fin de optimizar la transferencia del sistema CRISPR por una partícula de RLP (modulación de los tipos de ARN encapsidados)
I. Materiales y procedimientos
1. Construcciones de plásmidos
1.1 Plásmidos para la producción de partículas lentivirales MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X según la invención
• Plásmidos de expresión de una secuencia de interés: el primer plásmido de expresión lleva un casete de expresión como se describe en la Figura XXXVIII, con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARN en las partículas lentivirales, se insertaron 12 repeticiones del motivo de tallo-bucle del ARN de MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID NO: 1) dentro de un casete de expresión aguas abajo del ARN que codifica una proteína informadora como luciferasa nativa de luciérnaga, una proteína fluorescente verde (Zs-Greenl), roja (mCherry) como se muestra en la Figura XXXVIII, o un ADNc que codifica una proteína, por ejemplo una nucleasa, como la proteína Cas9 en su forma salvaje (WT) o en su forma mutada (N). El promotor usado puede ser el de CMV o EF1 (Figura XXXVIII) pero pueden usarse otros promotores.
El segundo plásmido de expresión lleva un casete de expresión como se describe en la Figura XXXIX, con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transmitir los ARNm en las partículas lentivirales, se insertaron 2 repeticiones del motivo de tallo-bucle del ARN de PP7 (ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID NO: 2 y ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag SEQ ID NO: 4)) en un casete de expresión aguas abajo del ARN que codifica una proteína informadora como luciferasa de luciérnaga nativa, una proteína fluorescente verde (ZsGreenl), roja (mCherry) como se describe en la Figura XXXIX, o un ADNc que codifica una proteína, por ejemplo, una nucleasa, como la proteína Cas9 en su forma salvaje (WT) o en su forma mutada (N). El promotor usado puede ser el de CMV o EF1 (Figura XXXIX) pero pueden usarse otros promotores.
• Plásmidos de encapsidación: la partícula lentiviral ha sido modificada para contener dentro de la proteína de nucleocápside, en lugar del segundo dominio de dedo de Zn, la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 o PP7. El plásmido de encapsidación p8.74, que lleva los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado para la producción de las partículas MS2RLP 12X se modifica según la estrategia ilustrada en la Figura IIa: se utiliza este plásmido p8.74 para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido que carece del segundo dedo de zinc de la proteína de nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de zinc se sustituye por la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 mediante clonación Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-MS2-Coat. Se obtiene así la construcción ilustrada en la Figura IIb. La secuencia que codifica Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT) o la integrasa (IN) sin alterar la función de MS2RLP i 2x .
El plásmido de encapsidación p8.74, portador de los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado para la producción de las partículas PP7RLP 2X se modifica según la estrategia ilustrada en la Figura XXXVIa: este plásmido p8.74 se usa para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido que carece del segundo dedo de zinc de la proteína de nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de zinc se sustituye por la proteína “Coat” del bacteriófago PP7 mediante clonación Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-PP7-Coat. De este modo, se obtiene la construcción ilustrada en la Figura xXxVIb. La secuencia que codifica Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT) o la integrasa (IN) sin alterar la función del PP7RLP 2X.
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser VSV-G que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura III).
Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales MS2/PP7-RLP-mCherry 12X-ZsGreenl 2X.
1.2 Plásmidos para la producción de partículas de control lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X según la invención
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: el plásmido de expresión lleva un casete de expresión como se describe en la Figura XXXVIII con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARN en las partículas lentivirales, se insertaron 12 repeticiones del motivo de tallo-bucle del ARN de MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID NO: 1) dentro de un casete de expresión aguas abajo del ARN una proteína informadora como la nativa luciferasa de luciérnaga, una proteína fluorescente verde (ZsGreenl), roja (mCherry) como se muestra en la Figura XXXVIII, o un ADNc que codifica una proteína, por ejemplo una nucleasa, como la proteína Cas9 en su forma salvaje (WT) o en su forma mutada (NORTE). El promotor usado puede ser el de CMV o EF1 (Figura XXXVIII) pero pueden usarse otros promotores.
• Plásmido de encapsidación: la partícula lentiviral ha sido modificada para contener dentro de la proteína de nucleocápside, en lugar del segundo dominio de dedo de Zn, la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago MS2. El plásmido de encapsidación p8.74, que lleva los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado para la producción de las partículas MS2RLP 12X se modifica según la estrategia ilustrada en la Figura IIa: se utiliza este plásmido p8.74 para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido que carece del segundo dedo de zinc de la proteína de nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de zinc se sustituye por la proteína “Coat” del bacteriófago MS2 mediante clonación Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-MS2-Coat. Se obtiene así la construcción ilustrada en la Figura IIb. La secuencia que codifica Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT) o la integrasa (IN) sin alterar la función de MS2RLP l2x .
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser VSV-G que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura III).
Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales MS2RLP-mCherry 12X.
1.3 Plásmidos para la producción de partículas de control de lentivina PP7 (NC)-RLP 2X según la invención
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: el plásmido de expresión lleva un casete de expresión como se describe en la Figura XXXIX, con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transmitir los ARNm en las partículas lentivirales, se insertaron 2 repeticiones del motivo de tallo-bucle del ARN de PP7 (ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID NO: 2 y ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag SEQ ID NO:
4) en un casete de expresión aguas abajo del ARN que codifica una proteína informadora como luciferasa de luciérnaga nativa, una proteína fluorescente verde (ZsGreenl), roja (mCherry) como se describe en la Figura XXXIX, o un ADNc que codifica una proteína, por ejemplo, una nucleasa, como la proteína Cas9 en su forma salvaje (WT) o en su forma mutada (N). El promotor usado puede ser el de CMV o EF1 (Figura XXXIX) pero pueden usarse otros promotores.
• Plásmido de encapsidación: la partícula lentiviral ha sido modificada para contener dentro de la proteína de nucleocápside, en lugar del segundo dominio de dedo de Zn, la secuencia de la proteína “Coat” del bacteriófago PP7. El plásmido de encapsidación p8.74, que lleva los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), usado para la producción de las partículas PP7RLP 2X se modifica de acuerdo con la estrategia ilustrada en la Figura XXXVIa: este plásmido p8.74 se usa para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido que carece del segundo dedo de zinc de la proteína de nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de zinc se sustituye por la proteína “Coat” del bacteriófago PP7 mediante clonación Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-PP7-Coat. De este modo, se obtiene la construcción ilustrada en la Figura XXXVIb. La secuencia que codifica Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT) o la integrasa (IN) sin alterar la función del PP7RLP 2X.
• Plásmido de la envoltura (pENV): este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser VSV-G que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura III).
Más particularmente, estos plásmidos se utilizan para la producción de partículas lentivirales PP7RLP-ZsGreenl 2X.
2. Producción de lotes de partículas lentivirales
Después de la transfección de los plásmidos en las células de producción, los sobrenadantes se recogen y se utilizan crudos o se concentran/purifican de acuerdo con uno de los métodos P1 o P2 mencionados anteriormente y como se describe en la solicitud W o 2013/014537.
2.1 Producción de partículas lentivirales
Las producciones se llevan a cabo en etapas CellSTACK 10 (6360 cm2, Corning) con células de producción HEK293T (At Cc , CRL-11268), cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Dm EM, Gibco, Paisley, Reino Unido) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de ultraglutamina (PAA) a 37 °C en atmósfera húmeda al 5% de CO2.
La producción de partículas lentivirales MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X, preferiblemente MS2/PP7-RLP-mCherry 12X-ZsGreenl 2X, se lleva a cabo por transfección de los siguientes cinco plásmidos:
- Los dos plásmidos de expresión descritos con anterioridad que incluyen el plásmido pcDNA.EF1.mCherry.MS2 12X (cuyo casete de expresión se ilustra en la FIG. XXXVIII) (50%) y el plásmido pcDNA.EF1.ZsGree-nI. PP7 2X (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura XXXIX) (50%) usados en cantidad simple;
- p8.74AZF-PP7-Coat (50%) cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura XXXVI by p8.74AZF-MS2-Coat (50%) cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura 11b;
- pENV que lleva la envoltura VSV-G, cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura III.
Las partículas lentivirales MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X se producen como se describe en el Ejemplo 1, es decir, con las respectivas proporciones de los siguientes plásmidos: 40% del plásmido de expresión, 30% del plásmido p8.74 (o p8.74AZF), 30% del plásmido pENV. Más particularmente, las proporciones respectivas de los plásmidos son las siguientes: 20% del plásmido de expresión pcDNA.EF1.mCherry.MS2 12X, 20% del plásmido de expresión pcDNA.EF1.ZsGreenI.PP72X, 30% del plásmido p8.74AZF, 30% del plásmido pENV.
En el caso de la producción de una partícula MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X para la transferencia del sistema CRISPR/Cas9 completo, las partículas se producen mediante el proceso descrito en el Ejemplo 8. Más particularmente, las proporciones respectivas de los plásmidos son las siguientes: 33% del plásmido de expresión que codifica la guía, 17% del plásmido de expresión que codifica Cas9 (la cantidad de plásmido de expresión que codifica la guía se duplica en comparación con la del plásmido de expresión que codifica Cas9), 25% del plásmido p8.74AZF y 25% del plásmido pENV.
La producción de las partículas lentivirales de control MS2 (NC)-RLP 12X, preferiblemente MS2-RLP-mCherry 12X, se lleva a cabo mediante transfección de los tres plásmidos siguientes:
- El plásmido de expresión descrito con anterioridad pcD-NA.EF1.mCherry.MS2 12X (cuyo casete de expresión se ilustra en XXXVIII);
- p8.74AZF-MS2-Coat, cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura IIb;
- pENV que lleva la envoltura VSV-G, cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura III.
Las partículas lentivirales MS2 (NC)-RLP 12X se producen como se describe en el Ejemplo 1.
La producción de las partículas de control lentivirales PP7 (NC)-RLP 2X, preferiblemente PP7-RLP-Zs-Greenl 2X, se lleva a cabo mediante transfección de los tres plásmidos siguientes:
- El plásmido de expresión descrito con anterioridad pcD-NA.EF1.ZsGreenI.PP7 2X (cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura XXXIX);
- p8.74AZF-PP7-Coat, cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura XXXVIb;
- pENV que lleva la envoltura VSV-G, cuyo casete de expresión se ilustra en la Figura III.
Las partículas lentivirales PP7 (NC)-RLP 2X se producen como se describe en el Ejemplo 1.
24 horas después de la transfección estándar con fosfato cálcico, el sobrenadante del cultivo se reemplaza por medio DMEM fresco y no se suplementa. Las células de producción se incuban a 37 °C/5% de CO2. Después de cambiar el medio, el sobrenadante se recoge cuatro veces (32 h, 48 h, 56 h y 72 h después de la transfección). Cada recuperación se clarifica mediante centrifugación durante 5 min a 3000 g antes de microfiltrar a través de un filtro de 0,45 pm (Stericup®, Millipore). Luego, todas las recuperaciones se mezclan para componer el sobrenadante crudo.
2.2 Concentración y purificación de partículas lentivirales
Las partículas lentivirales se concentran y purifican según el procedimiento P1 descrito en el Ejemplo 1.
3. Titulación de lotes de partículas lentivirales
Las partículas lentivirales se valoran como se describe en el Ejemplo 1.
4. Transducción por partículas lentivirales MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X según la invención
Este ejemplo se lleva a cabo utilizando partículas MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X que permiten la transferencia de varios tipos de ARN y, por lo tanto, la expresión de varias proteínas diferentes (ZsGreenl mCherry).
Se siembran células diana HCT116 (ATCC, CCL-247) en una placa de 24 pocillos y se incuban durante 24 horas a 37 °C/5% de CO2 y se transdujeron mediante las partículas MS2/PP7 (NC)-r Lp 12X 2x a una dosis de 10 pg p24/célula. Los controles realizados son los siguientes:
- Transducción con partículas lentivirales MS2RLP-mCherry 12X y PP7RLP-ZsGreenl 2X, a una dosis de 10 pg p24/célula cada uno;
- Transducción con partículas lentivirales MS2RLP-mCherry 12X solo, a una dosis de 10 pg p24/célula;
- Transducción con partículas lentivirales PP7RLP-ZsGreenl 2X solo, a una dosis de 10 pg p24/célula.
La transducción por las partículas lentivirales se lleva a cabo en presencia de 8 pg/ml de Polybrene®. Un inhibidor de los mecanismos de defensa celular, BX795 (Invivogen), se utiliza a una concentración de 6 pM en el caso de las partículas MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X, MS2RLP-mCherry 12X y PP7RLP-ZsGreenl 2X. Las células diana se recuperan 48 horas después de la transducción y el porcentaje de células que expresan ZsGreenl y mCherry se cuantifica mediante citometría (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec).
II. Resultados
La Figura XXXXIV ilustra la eficacia de las partículas MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X para la transferencia de ARN encapsidación por las secuencias de encapsidación de los bacteriófagos MS2 y PP7 a las células diana HCT116. La Figura muestra que la proporción de células bifluorescentes es del 97% después de la transducción de las partículas MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2x , a una dosis de 10 pg p24/célula, y del 98% después de la transducción de las partículas MS2RLP-mCherry 12X y PP7RLP-ZsGreenl 2X, a 20 pg p24/célula. Por lo tanto, se observa el mismo orden de eficacia de transducción con las partículas MS2/PP7 (NC)-r Lp 12X 2X, para una dosis de la mitad del tamaño de MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X.
Las células diana transducidas por las partículas MS2RLP-mCherry 12X solas o PP7RLP-ZsGreenl 2X solo exhiben un porcentaje de eficiencia de transducción similar al porcentaje obtenido después de la transducción de las células diana por las partículas MS2/PP7 (NC)-RLP 12X 2X para una única proteína fluorescente. Por lo tanto, los resultados muestran que las partículas de RLP son capaces de transportar y transferir al menos 2 tipos de ARN encapsidados por dos sistemas diferentes (PP7 y MS2) en una sola transducción de las células diana.
La demostración de la capacidad de transferencia de diferentes tipos de ARN dirigidos por dos secuencias de encapsidación diferentes, MS2 y PP7, en una sola transducción del mismo lote de RLP representa una ganancia significativa en la modulación de tipos de ARN encapsidados en particular para transferencia del sistema CRIS
PR/Cas9. Al reemplazar los ARN que codifican los informadores fluorescentes por ARN que codifican la nucleasa Cas9 y por un ARN guía no codificante, esta modulación podría permitir diversificar las aplicaciones de edición del genoma con el sistema CRISPR/Cas9.
Claims (17)
1. Partícula retroviral que comprende una proteína derivada de la poliproteína Gag, una proteína de la envoltura, opcionalmente una integrasa y al menos dos ARN no virales encapsidados, comprendiendo los ARN no virales encapsidados una secuencia de ARN de interés unida a una secuencia de encapsidación, estando cada secuencia de encapsidación reconocida por un dominio de unión heterólogo introducido en la proteína derivada de la poliproteína Gag y/o en la integrasa, en la que los al menos dos ARN no virales encapsidados se distinguen por su secuencia de interés:
- al menos una de dichas secuencias de interés de ARN no virales encapsidados comprende una parte que codifica una nucleasa seleccionada del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, y
- la secuencia de interés del otro ARN no viral encapsidado corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN.
2. Partícula de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la nucleasa es Cas9.
3. Partícula retroviral de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que además comprende al menos un tercer ARN no viral encapsidado que tiene una secuencia de interés correspondiente a un segundo elemento de reconocimiento de una guía de ARN o de una guía de ARN adicional.
4. Partícula retroviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una proteína de nucleocápside derivada de la poliproteína Gag, una proteína de la envoltura, opcionalmente una integrasa y al menos dos ARN no virales encapsidados, comprendiendo cada uno de los ARN no virales encapsidados una secuencia de ARN de interés ligada a una secuencia de encapsidación, estando reconocida cada secuencia de encapsidación por un dominio de unión heterólogo introducido en la proteína de nucleocápside y/o en la integrasa.
5. Partícula retroviral de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el dominio de unión heterólogo se introduce en la proteína de nucleocápside, pudiendo introducirse un segundo dominio de unión heterólogo en la nucleocápside y/o en la integrasa.
6. Partícula retroviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que al menos una secuencia de encapsidación es el motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2 repetido 12 veces, siendo este motivo reconocido por la proteína Coat del bacteriófago MS2 introducida en la proteína de nucleocápside.
7. Partícula retroviral de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el ARN no viral encapsidado que comprende como secuencia de encapsidación el motivo del tallo-bucle del bacteriófago MS2 repetido 12 veces es un ARN que codifica Cas 9, y un segundo ARN no viral encapsidado es un ARN correspondiente a al menos un elemento para reconocer una guía de ARN o codificar una guía, comprendiendo dicho ARN no viral encapsidado como secuencia de encapsidación el motivo de tallo-bucle del bacteriófago MS2 repetido 2 veces.
8. Partícula retroviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que al menos una secuencia de encapsidación es el motivo de tallo-bucle del bacteriófago PP7 repetido 2 veces, siendo este motivo reconocido por la proteína Coat del bacteriófago PP7 introducida en la proteína de nucleocápside.
9. Partícula retroviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el dominio de unión heterólogo se introduce en la integrasa, pudiendo introducirse un segundo dominio de unión heterólogo en la nucleocápside y/o en la integrasa.
10. Partícula retroviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que es una partícula lentiviral.
11. Composición que comprende partículas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Kit de producción de partículas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende:
(i) un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de ARN no virales diferentes, comprendiendo cada secuencia de ARN una secuencia de interés para la cual, aguas arriba, aguas abajo o dentro de esta secuencia, se inserta una secuencia de encapsidación, o alternativamente, un primer y un segundo plásmido de expresión que comprende cada uno una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo de la cual se inserta una secuencia de encapsidación, al menos una de las secuencias de interés codifica una nucleasa seleccionada del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, la otra secuencia de interés corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína derivada de la poliproteína Gag y/o una integrasa, quimérica, que comprende un dominio de unión heterólogo que permite reconocer una secuencia de encapsidación, y,
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
13. Kit de producción de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende además, un segundo plásmido de encapsidación que codifica:
- una proteína derivada de la poliproteína Gag de tipo salvaje, cuando el primer plásmido de encapsidación codifica una proteína derivada de la poliproteína Gag quimérica, y/o
- una integrasa de tipo salvaje, cuando el primer plásmido de encapsidación codifica una integrasa quimérica.
14. Procedimiento de fabricación de las partículas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende una etapa de cotransfección de células con:
(i) un plásmido de expresión que comprende al menos dos secuencias de ARN no virales diferentes, comprendiendo cada secuencia de ARN una secuencia de interés para la cual se inserta una secuencia de encapsidación aguas arriba, aguas abajo o dentro de esta secuencia, o alternativamente, un primer y un segundo plásmido de expresión que comprende cada uno una secuencia de interés aguas arriba o aguas abajo de la cual se inserta una secuencia de encapsidación, en donde al menos una de las secuencias de interés codifica una nucleasa seleccionada del grupo que consiste en nucleasas asociadas con el sistema CRISPR, la otra secuencia de interés corresponde a al menos un elemento de reconocimiento de una guía de ARN,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína derivada de la poliproteína Gag y/o una integrasa quimérica que comprende un dominio de unión heterólogo que hace posible reconocer una secuencia de encapsidación, y
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura y la recuperación del sobrenadante de las células transfectadas que comprenden las partículas.
15. Procedimiento de fabricación de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la etapa de cotransfección se lleva a cabo además, con un segundo plásmido de encapsidación que codifica:
- una proteína derivada de la poliproteína Gag de tipo salvaje, cuando el primer plásmido de encapsidación codifica una proteína derivada de la poliproteína Gag quimérica, y/o
- una integrasa de tipo salvaje, cuando el primer plásmido de encapsidación codifica una integrasa quimérica.
16. Uso de una partícula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o de una composición de acuerdo con la reivindicación 11, para transducir células in vitro o ex vivo.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, para generar en células transducidas una ruptura en la doble cadena de ADN, una mutación puntual, una deleción de secuencia que incluye invalidación de gen, una inserción de secuencia o reemplazo de gen.
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