ES2890240T3 - Adaptador de células que expresan los receptores de antígenos quiméricos para dirigirse a múltiples antígenos - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende a) un receptor de antígeno quimérico de epítopo anti-enlazador/marcador (anti-LLE CAR) que comprende I) un dominio de unión extracelular al epítopo enlazador/marcador (LLE) extracelular, II) un dominio transmembrana, y III) un dominio de transducción de señales, en donde dicho dominio de unión a LLE extracelular se une a una molécula de unión a células diana (TCBM), b) en donde dicha molécula de unión a células diana (TCBM) comprende i) un resto de unión a antígeno (ABM), en el que dicho ABM se une específicamente a un antígeno expresado en una célula diana, ii) un resto marcador (LaM), en el que dicho LaM es una molécula de origen natural en un sujeto o su derivado, en donde dicha molécula de origen natural está en el sistema circulatorio de dicho sujeto, iii) un resto enlazador (LiM) que conjuga dicho ABM y dicho LaM, formando así un epítopo enlazador/marcador (LLE), en el que dicho LiM se selecciona del grupo que consiste en péptidos, cadenas de alquilo, ácidos alcanoicos, ácidos carboxílicos, farnesilos, polietilenglicoles, o un derivado de estos, en donde dicho dominio de unión a LLE extracelular se une a dicho LLE con una preferencia mayor que dicha molécula de origen natural, en donde dicho dominio de unión a LLE extracelular se une con una afinidad al menos 10 veces mayor por dicho LLE que a dicha molécula de origen natural.

Description

DESCRIPCIÓN

Adaptador de células que expresan los receptores de antígenos quiméricos para dirigirse a múltiples antígenos Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de los receptores de antígenos quiméricos (CAR) expresados en células inmunes para el tratamiento del cáncer, en particular a un CAR que es adaptable a diferentes antígenos de células diana.

Antecedentes de la invención

La redirección de células T a antígenos tumorales mediante la expresión de receptores de antígenos quiméricos transgénicos aprovecha los potentes mecanismos efectores celulares mediante el reconocimiento independiente del antígeno leucocitario humano (HLA). El potencial de este planteamiento se ha demostrado recientemente en ensayos clínicos, en los que se infundieron células T que expresan CAR en pacientes adultos y pediátricos con neoplasias malignas de células B, neuroblastoma y sarcoma. Los CAR son receptores recombinantes que normalmente se dirigen a moléculas de superficie. Los CAR se componen típicamente de un resto de reconocimiento de antígeno extracelular que está unido, mediante dominios espaciador/bisagra y transmembrana, a un dominio de señalización intracelular que puede incluir dominios coestimuladores y restos de activación de células T. Los CAR reconocen los antígenos no procesados independientemente de su expresión de los principales antígenos de histocompatibilidad, a diferencia de los receptores fisiológicos de células T (TCR). Por lo tanto, las células T con CAR pueden eludir algunos de los principales mecanismos mediante los cuales los tumores evitan el reconocimiento de células T restringidas por la clase de histocompatibilidad mayor (MHC), como la reducción de la expresión de HLA o el procesamiento de antígenos proteasomales, dos mecanismos que contribuyen al escape tumoral de la inmunidad mediada por TCR. Otra característica de los CAR es su capacidad para unirse no solo a proteínas, sino también a carbohidratos, gangliósidos, proteoglicanos y proteínas muy glicosiladas, ampliando así el rango de dianas potenciales. Los CAR se involucran con la diana a través del resto de reconocimiento de antígeno, a menudo un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de anticuerpos o un fragmento Fab (revisado, por ejemplo, en Dai et al., 2016, J Natl Cancer Inst 108 (7): djv439).

Los sistemas CAR "universales" permiten abordar diferentes antígenos utilizando el mismo CAR.

En el documento WO2015058018A1 el motivo de unión a CAR expresado en la superficie celular se une a una molécula de unión a la diana deseada de una manera no específica, donde el motivo de unión del CAR es CD16, que es un receptor Fc de baja afinidad que se une de forma inespecífica a anticuerpos de inmunoglobulina G. Es una desventaja de este sistema que los anticuerpos in vivo actúan como competidores naturales del anticuerpo de interés administrado que se supone permite la lisis de la diana tumoral específica tras la unión de las células CAR T. En el documento WO2012082841A2 se describe un sistema universal, aunque adaptable, del receptor de antígeno quimérico anti-etiqueta (AT-CAR) que proporciona a las células T la capacidad y especificidad para reconocer y destruir células diana, tales como células tumorales, que han sido marcadas por anticuerpos etiquetados, p. ej., anticuerpos marcados con FITC o biotina. Aquí, la desventaja es que los marcadores son, para el sujeto a tratar, o bien sea moléculas exógenas, p. ej., FITC y, por lo tanto, inmunogénicas, o los marcadores son idénticos a las moléculas endógenas, p. ej., biotina, lo que da como resultado el bloqueo del motivo de unión a CAR por la molécula endógena que prohíbe que el CAR se una a su anticuerpo marcado con la molécula pretendida, p. ej., anticuerpo biotinilado. El mismo sistema universal CAR se describe en el documento WO2013044225A1 que enfrenta las mismas desventajas.

En el documento WO2014100615A1 se describe un sistema CAR que utiliza CAR que se dirigen a un resto que no es producido o expresado por las células del sujeto que está siendo tratado. Por tanto, este sistema CAR permite dirigir los linfocitos citotóxicos hacia las células diana, como las células cancerosas. El resto diana es parte de una pequeña molécula conjugada (SCM) que también comprende un ligando de un receptor de células tumorales. Debido a que las moléculas orgánicas pequeñas se usan típicamente como el resto diana, la eliminación de la SCM del torrente sanguíneo se puede lograr en aproximadamente 20 minutos. Mediante la administración de una SCM junto con los linfocitos citotóxicos que expresan CAR, la respuesta de los linfocitos puede dirigirse solo a las células que expresan el receptor del tumor, reduciendo así la toxicidad fuera de la diana, y la activación de los linfocitos puede controlarse más fácilmente debido al rápido aclaramiento de la SCM. Los linfocitos que expresan CAR también pueden usarse como una célula citotóxica "universal" para dirigirse a una amplia variedad de tumores sin la necesidad de preparar construcciones CAR separadas. Como los restos diana pueden ser, p. ej., FITC o biotina, este sistema se enfrenta a las mismas desventajas que los documentos WO2012082841A2 y/o WO2013044225A1. En el documento WO2015057852A1 se describen cambios para regular la actividad de células efectoras de los receptores de antígenos quiméricos (CAR-EC). Los cambios generalmente comprenden un dominio de interacción con el receptor de antígeno quimérico (CAR-ID) y un dominio de interacción con la diana (TID). El CAR-ID puede ser, por ejemplo, FITC o biotina.

Nuevamente, este sistema enfrenta las mismas desventajas que los documentos WO2012082841A2 y/o WO2013044225A1.

El documento WO2016168769A1 describe un cambio de células CAR T, por lo que el TCBM comprende un anticuerpo (anti-Her2) unido a un dominio que interactúa con CAR a través de un enlazador. La etiqueta del TCBM utilizada es FITC, y se sugiere biotina como alternativa. Nuevamente, este sistema enfrenta las mismas desventajas que los documentos WO2012082841A2 y/o WO2013044225A1.

En el documento WO2015057834A1 se describe un cambio de células efectoras-receptoras de antígenos quiméricos que comprende: a) un antígeno peptídico que se une a un receptor de antígeno quimérico en una célula efectora; yb) un resto de direccionamiento que se une a una molécula de la superficie celular en una célula diana. El antígeno peptídico se basa o deriva de un péptido de origen natural o de un péptido de origen no natural.

La desventaja de este sistema es que existe un alto riesgo de autoinmunidad por las etiquetas derivadas de una proteína nuclear humana.

En el documento WO2016030414A1 se describe un receptor de antígeno quimérico universal, en el que el receptor comprende tres dominios, en donde el primer dominio es un dominio de unión a una etiqueta, el segundo dominio es una cadena de péptido de unión que incluye una bisagra extracelular y un dominio transmembrana, y el tercer dominio es un dominio de transducción de señales, en el que el dominio de unión a la etiqueta se une a una etiqueta derivada de cualquier proteína nuclear humana. En particular, las etiquetas adecuadas son secuencias de péptidos de antígenos nucleares, a las que no se puede acceder ni unir por el dominio de unión a la etiqueta correspondiente en el contexto de la proteína nativa en condiciones fisiológicas. Una desventaja de este sistema es que la etiqueta solo se puede añadir de manera co-traducción, excluyendo así el uso de anticuerpos monoclonales establecidos como moléculas de unión a antígeno marcadas sin un rediseño previo del gen que codifica dicha molécula de unión al antígeno. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de un sistema CAR universal (adaptable) mejorado o alternativo.

Sumario de la invención

La presente invención describe un planteamiento para controlar las funciones de una célula que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR), por ejemplo, las funciones citotóxicas y/o inmunorreguladoras de una célula inmune que expresa un receptor de antígeno quimérico. El sistema CAR adaptable como se describe en el presente documento comprende un CAR que comprende un dominio de unión extracelular capaz de discriminar entre una molécula de origen natural en un sujeto, en donde dicha molécula de origen natural está en el sistema circulatorio de dicho sujeto, y una molécula de unión a células diana (TCBM) que comprende una molécula de unión a antígeno (ABM), un resto marcador (LaM) y un resto enlazador (LiM), en donde dicho LiM conjuga dicha ABM y dicho LaM (véase la Figura 1B). Dicho LiM se selecciona del grupo que consiste en péptidos, cadenas de alquilo, ácidos alcanoicos, ácidos carboxílicos, farnesilos, polietilenglicoles o un derivado de los mismos. El resto marcador (LaM) es dicha molécula de origen natural en un sujeto o su derivado. El resto enlazador (LiM) está acoplado al resto marcador (LaM). El receptor de antígeno quimérico se une a las TCBM con LaM y un cierto LiM con mayor afinidad, es decir, una afinidad al menos 10 veces mayor que el resto marcador endógeno sin resto enlazador. De ese modo, se mejora el reconocimiento/unión de las TCBM en condiciones fisiológicas en las que podría estar presente el LaM endógeno.

El beneficio de este planteamiento es que el LaM que permite un sistema CAR adaptable no es inmunogénico, ya que es una molécula natural endógena al sujeto. El LaM es un autoantígeno, el LaM acoplado al LiM es un autoantígeno modificado, que construye un nuevo epítopo, el epítopo enlazador/marcador (LLE), y el LLE está mejor unido por el dominio de unión a LLE del CAR como se describe en este documento que la molécula de origen natural en el sujeto.

El uso de un autoantígeno puro como LaM conlleva un mayor riesgo de una autoinmunidad desencadenada por la célula inmunitaria que expresa un CAR que tiene un dominio de unión al antígeno contra el LaM que es un autoantígeno, que el uso de un autoantígeno modificado, el LLE descrito en este documento. El riesgo de autoinmunidad se reduce en el sistema CAR como se describe en este documento, ya que el CAR se une con una preferencia menor, p. ej., con menor afinidad, hacia el autoantígeno que hacia el autoantígeno modificado.

El sistema CAR descrito en este documento todavía permite el reclutamiento eficiente de las células inmunes CAR a la TCBM que se une específicamente a un antígeno expresado en una célula diana, p. ej., una célula cancerosa. La molécula de origen natural es una molécula presente en el sistema circulatorio de un sujeto, pero está unida con una afinidad menor que la TCBM por el CAR, como se describe en el presente documento. Preferiblemente, la molécula de origen natural en un sujeto puede ser una molécula extracelular o una molécula con estructura extracelular parcial. Por lo tanto, la presente invención mejora la eficacia de la terapia mientras minimiza los riesgos mencionados anteriormente de usar LaM/LiM inmunogénico.

Un ejemplo del sistema CAR descrito en este documento se muestra con una biotina como resto marcador que es una molécula de origen natural en un sujeto, con un resto enlazador 6-(6-aminohexanamido) hexanoílo (LiM) y con un epítopo anti-enlazador/marcador. (anti-LLE) CAR que se une con una preferencia al menos 10 veces mayor al resto 6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo que a la biotina endógena. La ABM de la TCBM puede ser cualquier ABM que pueda unirse a un antígeno de interés en una célula diana, p. ej., un antígeno asociado a un tumor. Pero no se pretende restringir la invención a este ejemplo, ya que el concepto puede transferirse a otros CAR anti-LLE que se unen con una preferencia al menos 10 veces mayor a otro resto marcador de origen natural acoplado con un resto de enlazador que a la molécula de origen natural (resto marcador) que no está acoplada a dicho resto enlazador, en donde dicha molécula de origen natural está en el sistema circulatorio de dicho sujeto, y en donde dicho LiM se selecciona del grupo que consiste en péptidos, cadenas de alquilo, ácidos alcanoicos, ácidos carboxílicos, farnesilos, polietilenglicoles, o un derivado de los mismos.

La presente invención describe una composición que comprende dicha TCBM y dicho CAR anti-LLE.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1: (A) Concepto de adaptador de CAR (B) Representación de TCBM compuesta por un resto de unión a antígeno (ABM), un resto enlazador (LiM) y un resto marcador (LaM). (C) Ejemplo de (B) que comprende el resto enlazador 6-(6-aminohexanamido) hexanoílo (LiM) y el resto marcador de biotina (LaM) y una ABM no definida. FIG 2: Representación esquemática de los diferentes formatos de CAR ensayados (SEQ ID NO: 11-20). La secuencia líder "L" deriva de CD8 humano, los scFv se derivan de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, la bisagra y los espaciadores "H" y "CH1", "CH2", "CH3" y "CD8" derivan de IgG4 humana o CD8 humano, respectivamente. El dominio transmembrana "TM" es de CD8 humano, mientras que los dominios coestimuladores y de señalización son de 4-1 BB y CD3z. Todos los CAR se expresan junto con el gen marcador LNGFR unido por un elemento 2A.

Figura 3: Expresión del transgén de LNGFR en células T primarias el día 8 después de la transferencia génica del vector lentivírico de las diferentes construcciones de CAR (SEQ ID NO: 17, 15, 19, 11 y 13).

FIG 4: Ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa de células T no transducidas (Simuladas), CD19 CAR transducidas y LLE-CAR transducidas (SEQ ID NO: 17, 15, 19, 11 y 13) en presencia o ausencia de 10 ng/ml de anticuerpo anti-CD 19-biotina (4G7-biotina). La relación entre las células efectoras a diana fue 1: 1 en todos los casos. Se muestra la lisis específica después de 24 h de cocultivo, n = 4.

Figura 5: Ensayo de citotoxicidad en tiempo real basado en impedancia (RTCA xCELLigence). Se ensayaron células T no transducidas (simuladas) (A) y células T transducidas CAR anti-LLE (B) (SEQ ID NO: 17, 15, 19, 11 y 13) frente a células LS en presencia de 10 ng/ml anti-GD2-mAB-biotina. Se ensayaron células T no transducidas (simuladas) (C) y células T transducidas con CAR anti-LLE (D) (SEQ ID NO: 17, 15, 19, 11 y 13) frente a células MCF7-tCD19 en presencia de 10 ng/ml de anticuerpo anti-CD19-biotina. Todos los experimentos se realizaron con una relación de células efectoras: diana de 1: 1, con n = 3

Figura 6: La activación y lisis de CAR anti-LLE (SEQ ID NO: 11) es dependiente de la dosis de anticuerpo. (A) Ensayo de citotoxicidad en tiempo real basado en impedancia (RTCA xCELLigence) con CAR anti-LLE frente a LS utilizando diferentes concentraciones de anti-GD2-mAB-biotina en una relación célula efectora: diana de 1: 1, n = 3. (B) Ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa con CAR anti-LLE (SEQ ID NO: 11) frente a NALM6 con diferentes concentraciones de anti-CD 19-mAB-biotina.

Figura 7: La activación y lisis de CAR anti-LLE es dependiente de la relación de células efectoras: diana. (A) Ensayo de citotoxicidad en tiempo real basado en impedancia (RTCA xCELLigence) con CAR anti-LLE (SEQ ID NO: 11) frente a LS en presencia de 10 ng/ml de anticuerpo anti-GD2-mAB-biotina en diferentes relaciones de células efectoras: diana, n = 3. (B) Ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa (12 h) con CAR anti-LLE (SEQ ID NO: 11) frente a NALM6 a 10 ng/ml de anticuerpo anti-CD19-mAB-biotina en diferentes relaciones de células efectoras: diana, n = 5.

FIG 8: La activación de CAR anti-LLE (SEQ ID NO: 11) y la lisis celular diana es específica de antígenos y biotina: ensayo de citotoxicidad en tiempo real basado en impedancia (RTCA xCELLigence) con CAR anti-LLE frente a LS en presencia y ausencia de 10 ng/ml de anti-GD2-biotina (ch14.18-biotina), anti-GD2 (ch14.18) o anti-CD19-biotina (4G7-biotina) irrelevante para la célula diana con una relación de células efectoras: diana de 1: 1, n = 3.

FIG 9: Lisis específica de células diana NALM6 por células CAR T anti-LLE (SEQ ID NO: 11) en presencia de anti-CD19-biotina (4G7-Biotina), anti-CD19 (4G7), o en presencia de - anti-GD2-biotina irrelevante para las células diana (ch14.18-biotina) en una relación de células efectoras: diana de 1: 1, medida mediante un ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa después de 24 h, n = 4.

FIG 10: Las concentraciones suprafisiológicas de biotina no interfieren con la activación de CAR anti-LLE: ensayo de citotoxicidad en tiempo real basado en impedancia (RTCA xCELLigence) de células T CAR anti-LLE (SEQ ID NO: 11) frente a LS en presencia (mAB) o ausencia (sin mAB) de 10 ng/ml de anticuerpo anti-GD2-biotina (ch14.18-biotina) y a diferentes concentraciones de biotina libre (como se indica).

Figura 11: Lisis específica de células NALM6 medida después de 12 h en presencia de células T CAR anti-LLE y en presencia y ausencia de anticuerpo anti-CD19-biotina (4G7-biotina) y concentraciones variables de biotina libre o suero AB humano.

FIG 12: (A) Análisis de citometría de flujo (anti-TCRa/p-FITC, Miltenyi Biotec) de células T CAR anti-LLE y células T CAR anti-LLE desactivadas para TcRap generadas por tecnología CRISPR/Cas9. (B) La desactivación de TcRap fue confirmada por TIDE. (C) Ensayo de citotoxicidad en tiempo real basado en impedancia (RTCA xCELLigence) de células T CAR anti-LLE (S^eQ ID 11 ) y células T CAR anti-LLE desactivadas para TcRap (S^eQ ID NO: 11 ) frente a LS en presencia (mAB) y ausencia (mAB) de 10 ng/ml de anticuerpo anti-GD2-biotina (ch14.18-biotina). (D) Lisis específica de células diana MOLT14 por células T CAR anti-LLE (SEQ ID 11) y células T CAR anti-LLE inactivadas para TcRap (SEQ ID NO: 11) en presencia y ausencia de 10 ng/ml anti-TcRYÓ-biotina mAB, a una relación de células efectoras: diana de 1: 1, medida mediante un ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa después de 48 h, n = 1,4 réplicas técnicas. (E) Supervivencia relativa de las células diana JURKAT incubadas con células T CAR anti­ LLE (SEQ ID NO: 11) y células CAR T anti-LLE inactivadas para TcRap (SEQ ID NO: 11) en presencia y ausencia de 10 ng/ml anti-TcRap-biotina mAB, a una relación de células efectoras: diana de 1: 1, medida por citometría de flujo después de 48 h, n = 1,4 réplicas técnicas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención da a conocer un sistema CAR adaptable para dirigirse a antígenos diferentes y variables en células diana, en donde el CAR se une con mayor preferencia a un autoantígeno modificado que al autoantígeno en un sujeto, minimizando el riesgo de autoinmunidad en un sujeto en el que el sistema CAR se utiliza como se describe en este documento.

En un primer aspecto, la invención da a conocer un receptor de antígeno quimérico de epítopo antienlazador/marcador (anti-LLE CAR) que comprende

I) un dominio de unión de epítopo enlazador/marcador (LLE) extracelular,

II) un dominio transmembrana, y

III) un dominio de transducción de señales,

en donde dicho dominio de unión a LLE extracelular se une a una molécula de unión a células diana (TCBM) que comprende

i) un resto de unión a antígeno (ABM), en el que dicho ABM se une específicamente a un antígeno expresado en una célula diana,

ii) un resto marcador (LaM), en el que dicho LaM es una molécula de origen natural o un derivado de la misma en un sujeto,

iii) un resto enlazador (LiM) que conjuga dicho ABM y dicho LaM, formando así un epítopo enlazador/marcador (LLE), en donde dicho dominio de unión a LLE extracelular se une a dicho LLE con una preferencia mayor que dicha molécula de origen natural.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho dominio de unión a LLE extracelular se une con una afinidad al menos dos veces mayor a dicho LLE que a dicha molécula de origen natural.

Dicho CAR anti-LLE, en el que el valor k (off) para la unión entre dicho dominio de unión LLE extracelular es mayor para un LLE monomérico y dicha molécula de origen natural que para un LLE multimérico.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicha molécula de origen natural es una molécula extracelular o una molécula con estructura extracelular parcial.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicha molécula de origen natural es una molécula del sistema circulatorio de dicho sujeto.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho LLE se genera de forma específica del sitio, formando así un epítopo que comprende una parte de dicho LaM y una parte de dicho LiM.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho LaM puede ser un autoantígeno de dicho sujeto.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho LaM puede seleccionarse del grupo que consiste en aminoácidos, péptidos, proteínas, creatinina, biotina, biocitina, lípidos, hormonas, vitaminas, carbohidratos o derivados de estos. Dichos lípidos pueden ser lípidos esteroides como el colesterol.

Dichos carbohidratos pueden ser, p. ej., glucosa, galactosa o fucosa. Un LaM especialmente preferido puede ser biotina o un derivado de esta.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho LiM es una molécula capaz de generar dicho LLE.

Dicho CAR anti-LLE, donde dicho LiM puede seleccionarse del grupo que consiste en péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, polihidroxialcanoatos, cadenas de alquilo, ácidos alcanoicos, ácidos carboxílicos, farnesilos, polietilenglicoles, lípidos o sus derivados. Dichos ácidos carboxílicos pueden ser, p. ej., ácido £-aminocaproico (ácido 6-aminohexanoico) o ácido 6-(6-aminohexanamido) hexanoico).

Un LiM especialmente preferido puede ser un resto 6-(6-aminohexanamido) hexanoílo, p. ej., derivado de ácido 6-(6-aminohexanamido) hexanoico o éster activo 6-(6-aminohexanamido) hexanoico, o un resto 6-aminohexanoílo, p. ej., derivado de ácido 6-aminohexanoico o éster activo 6-aminohexanoico.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho LaM es biotina y dicho LiM es un resto enlazador 6- (6-aminohexanamido) hexanoílo o un resto enlazador 6-aminohexanoílo.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho dominio de unión a LLE extracelular comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, uniéndose de ese modo a un resto 6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho antígeno que está unido por dicho ABM se expresa en una célula cancerosa. Dicho CAR anti-LLE, donde dicho antígeno puede seleccionarse del grupo que consiste en CD33 (Siglec-3), CD123 (IL3RA), CD135 (FLT-3), CD44 (HCAM), CD44V6, CD47, CD184 (CXCR4), CLEC12A (CLL1), LeY, FRp, MICA/B, CD305 (LAIR-1), CD366 (TIM-3), CD96 (TACTILE), CD133, CD56, CD29 (ITGB1), CD44 (HCAM), CD47 (IAP), CD66 (CEA), CD112 (Nectin2), CD117 (c-Kit), CD133, CD146 (MCAM), CD155 (PVR), CD171 (L1CAM), CD221 (IGF1), CD227 (MUC1), CD243 (MRD1), CD246 (ALK), CD271 (LNGFR), CD19, CD20, GD2 y EGFR.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho ABM puede ser un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho CAR anti-LLE comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16, uniéndose de ese modo a un resto 6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo. Preferiblemente, dicho CAR anti-LLE comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho CAR anti-LLE se expresa en una célula eucariota.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho CAR anti-LLE se expresa en una célula inmunitaria.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho CAR anti-LLE se expresa en una célula T, célula NK, célula NKT, célula T gamma/delta o célula Treg.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho CAR anti-LLE se expresa en una célula madre, célula progenitora multilinaje o célula madre pluripotente inducida que luego se diferenciará en una célula inmunitaria, p. ej., una célula T que expresará el CAR anti-LLE.

En otro aspecto, la invención da a conocer un polinucleótido o polinucleótidos aislados que codifican el CAR anti­ LLE que se describe en el presente documento.

En un aspecto adicional, la invención da a conocer un vector que comprende el polinucleótido o los vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican el CAR anti-LLE que se describe en el presente documento.

Dicho vector, en el que dicho polinucleótido está operativamente unido a al menos un elemento regulador de la expresión de dicho CAR anti-LLE codificado por dicho polipéptido.

Dicho vector o vectores, en donde dicho vector o vectores son víricos.

Dicho vector o vectores, en donde dicho vector o vectores víricos son vectores retrovíricos o lentivíricos.

La molécula(s) de ácido nucleico puede construirse de modo que codifique al menos todas las realizaciones de los CAR descritos en el presente documento. Puede haber una molécula de ácido nucleico contigua cuando todos los dominios del CAR codificado por dicha molécula están dentro de un polipéptido.

Alternativamente, puede haber dos o más moléculas de ácido nucleico, p. ej., cuando algunos dominios del CAR codificados por dichas moléculas están en polipéptidos separados.

En un aspecto adicional, la invención da a conocer una célula aislada que comprende el CAR anti-LLE que se describe en el presente documento.

Dicha célula aislada puede ser una célula eucariota.

Dicha célula aislada puede ser una célula inmunitaria como p. ej., una célula T, célula NK, célula NKT, célula T gamma/delta o célula Treg.

Dicha célula aislada puede ser una célula madre, una célula progenitora multilinaje o una célula madre pluripotente inducida que luego se diferenciará en una célula inmunitaria, p. ej., una célula T que expresará el CAR anti-LLE.

Dicha célula aislada puede ser una célula T, en donde opcionalmente dicha célula T no expresa TcRap, PD1, CD3 ni CD96 (por ejemplo, mediante la desactivación de uno de estos genes).

Dicha célula aislada puede ser una célula inmune, donde opcionalmente dicha célula no expresa moléculas accesorias que pueden ser receptores de señalización asociados a puntos de control, agotamiento o apoptosis así como ligandos como PD-1, LAG-3, TIGIT, CTLA-4, FAS-L y FAS-R, (por ejemplo, mediante la desactivación de uno de estos genes).

En un aspecto adicional, la invención da a conocer una célula aislada que comprende el polinucleótido o los polinucleótidos que codifican el CAR anti-LLE que se describe en el presente documento.

En un aspecto adicional, la invención da a conocer una célula aislada que comprende el vector o los vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican el CAR anti-LLE que se describe en el presente documento.

En un aspecto, la invención da a conocer una composición que comprende

a) una molécula de unión a células diana (TCBM) que comprende

i) un resto de unión a antígeno (ABM), en el que dicho ABM se une específicamente a un antígeno expresado en una célula diana,

ii) un resto marcador (LaM), en donde dicho LaM es una molécula de origen natural en un sujeto o su derivado, en el que dicha molécula de origen natural está en el sistema circulatorio de dicho sujeto,

iii) un resto enlazador (LiM) que conjuga dicho ABM y dicho LaM, formando así un epítopo enlazador/marcador (LLE), en el que dicho LiM se selecciona del grupo que consiste en péptidos, cadenas de alquilo, ácidos alcanoicos, ácidos carboxílicos, farnesilos, polietileno glicoles o un derivado de los mismos; y

b) un receptor de antígeno quimérico (CAR) de epítopo anti-enlazador/marcador (anti-LLE), en donde dicho CAR anti-LLE comprende

I) un dominio de unión al epítopo enlazador/marcador (LLE) extracelular,

II) un dominio transmembrana, y

III) un dominio de transducción de señales,

en el que dicho dominio de unión LLE extracelular se une a dicho LLE con una preferencia mayor que dicha molécula de origen natural, en donde dicho dominio de unión a LLE extracelular se une con una afinidad al menos 10 veces mayor a dicho LLE que a dicha molécula de origen natural.

Todas las características de la TCBM y del CAR anti-LLE descritas anteriormente también pueden aplicarse en dicha composición.

En otro aspecto, la invención da a conocer un método para tratar un trastorno en un sujeto, que comprende a) administrar una o más formulaciones de una molécula de unión a células diana (TCBM) a un sujeto que necesita tratamiento, en donde dicha TCBM comprende

i) un resto de unión a antígeno (ABM), en el que dicho ABM se une específicamente a un antígeno expresado en una célula diana,

ii) un resto marcador (LaM), en el que dicho LaM es una molécula de origen natural en un sujeto o su derivado, iii) un resto enlazador (LiM) que conjuga dicho ABM y dicho LaM, formando así un epítopo del resto enlazador/marcador (LLE), y

b) administrar al sujeto una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células que expresan CAR anti-LLE, en donde dicho CAR anti-LLE comprende

I) un dominio de unión al epítopo enlazador/marcador (LLE) extracelular,

II) un dominio transmembrana, y

III) un dominio de transducción de señales,

en donde dicho dominio de unión a LLE extracelular se une a dicho LLE con una preferencia mayor que dicha molécula de origen natural, induciendo así la muerte celular de dicha célula diana.

Todas las características de la TCBM y del CAR anti-LLE descritas anteriormente también pueden aplicarse en dicho método para tratar un trastorno en un sujeto.

Dicho método, en el que dicho tratamiento de un trastorno es cáncer y en el que dicha célula diana es una célula cancerosa.

Dicho método, en el que dichas más formulaciones de TCBM son formulaciones iguales o diferentes de TCBM. Dicho método, en el que dichas poblaciones más terapéuticamente eficaces de células que expresan CAR anti-LLE CAR poblaciones iguales o diferentes de células que expresan CAR anti-LLE.

Dicho método, en el que dicho CAR anti-LLE de dichas poblaciones más terapéuticamente eficaces son los mismos o diferentes CAR anti-LLE.

Dicho método, en el que dicha administración de dichas más formulaciones de una molécula de unión a células diana (TCBM) a un sujeto que necesita tratamiento se administra simultáneamente o posteriormente.

Dicho método, en el que dicha administración de dichas poblaciones más terapéuticamente eficaces de células que expresan CAR anti-LLE se administra simultáneamente o posteriormente.

La presente descripción se refiere a un sistema CAR para su uso en el tratamiento de sujetos que padecen un trastorno como el cáncer. El sistema CAR de la presente invención (p. ej., células inmunes como las células T que expresan los CAR que comprenden un dominio de unión a LLE y las moléculas de unión a células diana correspondientes (TCBM)) hace uso de CAR que se dirigen a un epítopo que no ocurre en el sujeto que está siendo tratado, es decir, el autoantígeno modificado. Dado que el resto marcador utilizado en este sistema es una molécula de origen natural en el sujeto, es decir, un autoantígeno, no es inmunogénico. El epítopo que no se produce naturalmente en el sujeto se genera mediante el acoplamiento del resto marcador con un resto enlazador creando una nueva interfaz y/o entorno en el enlace del resto marcador y el resto enlazador de modo que se pueda generar una nueva molécula de reconocimiento de epítopo que puede usarse como un dominio de unión al epítopo marcador/enlazador de un CAR del sistema que se describe en el presente documento.

Este sistema CAR, tal como se describe en el presente documento, permite, por tanto, el direccionamiento focalizado de las células, como las células inmunes, hacia las células diana que expresan un antígeno, como las células cancerosas.

El resto enlazador y el resto marcador son parte de la molécula de unión a células diana (TCBM) que también comprende un resto de unión a antígeno (ABM), en el que el resto enlazador conjuga LaM y ABM. Generalmente, dicho ABM se dirige contra un antígeno expresado en la superficie de una célula diana.

Mediante la administración de TCBM junto con las células inmunes que expresan CAR, la respuesta de las células inmunes puede dirigirse únicamente a aquellas células que expresan el antígeno en la superficie de las células diana, reduciendo así la toxicidad fuera de la diana. Las células inmunes que expresan CAR pueden usarse como células inmunes "universales" para dirigirse a una amplia variedad de células diana, p. ej., una amplia variedad de tumores sin la necesidad de preparar construcciones CAR separadas. El epítopo marcador/enlazador de la TCBM reconocido por el CAR también puede permanecer constante. Es solo el ABM de la TCBM el que debe modificarse para permitir que el sistema se dirija a las células diana de diferente identidad.

A continuación se ilustra a modo de ejemplo el sistema CAR que se describe en el presente documento:

La biotina es una molécula de origen natural en el sistema circulatorio de un sujeto, p. ej., un ser humano.

Por tanto, la biotina no es inmunogénica para dicho sujeto.

Se prepara una TCBM que comprende biotina como un resto marcador acoplado (conjugado) al resto enlazador 6-(6-aminohexanamido) hexanoílo dando como resultado un resto 6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo.

La TCBM comprende también un ABM, p. ej., un anticuerpo o scFv específico para un antígeno en la superficie de una célula diana, como GD-2 o CD19 que son antígenos expresados en células cancerosas, en donde el resto enlazador 6-(6-aminohexanamido) hexanoílo une la biotina y el ABM. Las células inmunes se transducen para expresar un CAR que comprende un dominio de unión al resto 6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo como dominio de unión a LLE. Por lo tanto, este CAR se dirige a las TCBM antes mencionadas.

Los dos componentes, es decir, la TCBM y las células inmunes que expresan el CAR, se administran a un sujeto que padece un trastorno como el cáncer. La TCBM está unida por las células diana, p. ej., las células cancerosas (mediante la unión de la porción ABM de la TCBM a antígenos de células diana afines como GD-2 o CD19). El resto 6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo de la TCBM es luego reconocido y unido por el resto CAR anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo expresado por las células inmunes. Tras la unión del conjugado 6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo-ABM, se activan las células inmunes que expresan CAR anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo, y la célula diana, p. ej., la célula cancerosa puede morir. El resto CAR anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo se une con mayor preferencia a los conjugados de 6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo que a la biotina circulante en el sujeto.

Las células inmunes que expresan CAR que se describen en el presente documento no pueden destruir células mediante la unión directa a una célula diana, como una célula cancerosa. La TCBM actúa así como un puente entre las células inmunes que expresan CAR y las células diana. Siempre que el resto marcador/enlazador que genera el epítopo enlazador/marcador de la TCBM sea un resto que no se encuentra naturalmente en el sujeto y el dominio de unión a LLE extracelular del CAR se una a dicho LLE con una preferencia mayor que dicha molécula de origen natural, la actividad de las células inmunes que expresan CAR puede limitarse a las células diana. Además, la activación de las células inmunes que expresan CAR puede regularse limitando la cantidad de TCBM administrada a un sujeto, por ejemplo, manipulando la infusión de la TCBM si se detecta un efecto secundario.

El sistema CAR de la presente invención utiliza TCBM como puente entre las células inmunes que expresan el CAR y las células diana que expresan el antígeno. La TCBM comprende un resto marcador (LaM) en un extremo de la molécula y un resto de unión a antígeno (ABM) en el otro extremo, conectados por un resto enlazador. El único requisito para la identidad del rmarcador es que debe ser una molécula de origen natural en un sujeto (un autoantígeno) y que su variante conjugada del resto enlazador pueda ser reconocida y unida por un CAR expresado por una célula inmune con mayor afinidad a la variante conjugada de su resto enlazador (el autoantígeno modificado) que a la variante de origen natural conjugada del resto no enlazador.

El ABM puede comprender una sola especificidad de antígeno (monoespecífica), dos o más especificidades de antígeno (bi y multiespecífica). Un ejemplo de ABM biespecífico es un ABM que se une a los antígenos CD19 y CD20. El ABM también puede comprender unión monovalente así como un sitio de unión bi y multivalente. Un ejemplo de ABM bivalente es un ABM que comprende dos scFv que reconocen diferentes epítopos de un antígeno.

El ABM puede ser una inmunoglobulina contra la diana derivada de la inmunización de un hospedante (por ejemplo, un ratón). Además, también puede derivarse de un diseño racional y expresión recombinante. En otra realización, el ABM también puede derivarse de métodos tales como evolución dirigida y técnicas de cribado tales como presentación de fagos y presentación de ribosomas.

El resto marcador y el resto de unión al antígeno pueden conjugarse covalentemente mediante un resto enlazador, por ejemplo, el acoplamiento químico de biotina y el resto 6-(6-aminohexanamido) hexanoílo.

Alternativamente, el resto marcador y el resto de unión al antígeno pueden conjugarse de forma no covalente mediante un resto enlazador. Además, alternativamente, la TCBM puede comprender restos o dominios adicionales entre ABM y LiM. El único requisito es que LiM esté conjugado (o acoplado) a LaM de tal manera que permita la generación del epítopo enlazador/marcador como se describe en el presente documento.

El resto enlazador se puede conjugar con el resto marcador dando como resultado un resto que comprende LLE. El LiM, acoplado al LaM, se puede acoplar aleatoriamente, p. ej., dirigiendo lisinas en una proteína ABM usando, p. ej., un derivado de éster succinimidílico amino reactivo del LiM.

Alternativamente, el resto enlazador se puede conjugar con el sitio ABM específicamente, p. ej., incorporando un aminoácido no natural en una proteína ABM expresada de manera recombinante usando, p. ej., un ARNt supresor antisentido que libera dicho aminoácido no natural en un codón de terminación diseñado en la secuencia codificante de dicho ABM.

Cada molécula que podría ser capaz de generar un LLE como se describe en este documento puede usarse como un resto enlazador. El único requisito para la identidad de un resto enlazador es que el resto enlazador pueda conjugarse químicamente (o acoplarse) a un resto marcador o codificarse genéticamente (recombinantemente), y debe ser capaz de generar un nuevo epítopo en el contexto, la interfaz y/o el entorno del resto enlazador y el resto marcador descritos en el presente documento. El LiM puede ser preferentemente una molécula que no evoca o no tiende a provocar una reacción ej., inmune en el sujeto, p. el LiM es un autoantígeno. En este caso, la interfaz de LaM y LiM genera un epítopo novedoso, el LLE.

El LiM puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, polihidroxialcanoatos, cadenas de alquilo, ácidos alcanoicos, ácidos carboxílicos (por ejemplo, ácido £-aminocaproico (ácido 6-aminohexanoico) o 6-(6-aminohexanamido) ácido hexanoico) farnesilos, polietilenglicoles, lípidos y derivados de los mismos.

Un LiM especialmente preferido puede ser un resto 6-(6-aminohexanamido) hexanoílo, p. ej., derivado de ácido 6-(6-aminohexanamido) hexanoico o éster activo 6-(6-aminohexanamido) hexanoico, o un resto 6-aminohexanoílo, p. ej., derivado de ácido 6-aminohexanoico o éster activo 6-aminohexanoico.

Dicho CAR anti-LLE, en el que dicho LaM es biotina y dicho LiM es un resto enlazador 6-(6-aminohexanamido) hexanoílo o un resto enlazador 6-aminohexanoílo.

El experto en la técnica comprenderá y reconocerá que se pueden usar varios medios para preparar las TCBM que comprenden un resto marcador, un resto enlazador y un resto de unión a antígeno.

Antes de administrarse a un sujeto, las TCBM se pueden preparar en una formulación farmacéuticamente aceptable. Tales formulaciones pueden contener un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La afinidad a la que el ABM se une al antígeno en la célula diana puede variar, pero generalmente la afinidad de unión puede ser al menos aproximadamente 100 pM, 1 nM, 10 nM o 100 nM, preferiblemente al menos aproximadamente 1 pM o 10 pM, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 100 pM.

Es un requisito que el dominio de unión a LLE extracelular del CAR que se describe en el presente documento se una al LLE de la TCBM con una preferencia mayor que la correspondiente molécula de origen natural.

Dicho dominio de unión a LLE extracelular del CAR puede producirse usando anticuerpos disponibles comercialmente o sus fragmentos de unión a antígeno.

Alternativamente, los anticuerpos o moléculas de reconocimiento de antígenos para un LLE seleccionado pueden producirse de nuevo mediante métodos bien conocidos por los expertos.

La afinidad a la que el dominio de unión a LLE del CAR se une al LLE de la TCBM puede variar, pero generalmente la afinidad de unión puede estar en el intervalo de 0,01 nM a 1 pM, preferentemente en el intervalo de 0,1 -100 nM, o más preferentemente en el intervalo de 1-30 nM. El único requisito es que la afinidad en la que el dominio de unión a LLE del CAR se una al LLE de la TCBM debe ser mayor que la afinidad en la que el dominio de unión al LLE del CAR se una a la molécula de origen natural (es decir, sin resto enlazador) en el sujeto. Preferiblemente, el dominio de unión a LLE extracelular se une con al menos dos veces, preferiblemente al menos 5 veces, más preferiblemente al menos 10 veces, lo más preferiblemente al menos 20 veces mayor afinidad hacia dicho LLE que hacia dicha molécula de origen natural.

La construcción o construcciones de ADN o ARN (molécula(s) de ácido nucleico) que codifican el CAR de la invención se pueden transfectar o transducir en una célula hospedante mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, sistemas basados en virus que incluyen retrovirus y lentivirus, métodos físicos que incluyen electroporación, métodos biológicos, métodos químicos). Independientemente de los métodos utilizados para integrar, preferentemente integrar de forma estable, el ADN que codifica el CAR de la invención, en la célula hospedante, como resultado, la célula hospedante expresa un CAR como se describe en el presente documento. Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico pueden producirse sintéticamente.

Una célula modificada genéticamente que expresa un CAR como se describe en el presente documento puede aislarse (enriquecerse o separarse) después del proceso de transfección/transducción para generar dicha célula CAR modificada genéticamente a partir de células no transfectadas/transducidas mediante métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., tecnologías de separación basadas en fluorescencia, como FACS® o métodos para separación magnética de células como MACS® (Miltenyi Biotec GmbH).

Generalmente, las células tales como células inmunes, preferentemente células T para generar células modificadas genéticamente que expresan el CAR de la invención pueden obtenerse de un sujeto. Pueden obtenerse células tales como células inmunes, preferentemente células T, de una variedad de fuentes tales como células mononucleares de sangre periférica (PMBC), médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical o tejido del timo. Para el enriquecimiento de estas células, se pueden utilizar métodos bien conocidos en la técnica como centrifugación a través de un gradiente Ficoll™ o PERCOLL™, o técnicas de selección positiva/negativa como clasificación fluorescente (por ejemplo, FCASsort) o clasificación magnética (por ejemplo, MACS®). Preferiblemente, la población celular enriquecida comprende al menos aproximadamente el 90% del tipo celular seleccionado. En aspectos particulares, la población celular comprende al menos alrededor del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso 100% del tipo celular seleccionado.

A modo de ejemplo, las células T de una muestra de sangre de un sujeto se marcan magnéticamente, por ejemplo, con una perla magnética acoplada a anticuerpos específicos para CD4, se lavan, se enriquecen magnéticamente y se recogen. Entonces, estas células T pueden modificarse por ingeniería genética para expresar el CAR descrito en el presente documento en su superficie celular.

En una realización de la invención, la célula modificada genéticamente aislada/enriquecida, como las células inmunes, preferentemente las células T que expresan el CAR que se describe en el presente documento, pueden activarse antes o después de la modificación genética y expandirse para aumentar el número de células modificadas genéticamente (T) usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, estimulación policlonal de células T con el reactivo de células T TransAct (Miltenyi Biotec; WO2014048920A1) que consiste en una nanomatriz coloidal conjugada con agonistas de CD3 y CD28 humanizados. Preferiblemente, dicho número de células modificadas genéticamente tales como células inmunes, p. ej., células T, puede aumentarse hasta una cantidad terapéuticamente eficaz.

Una célula que expresa el CAR como se describe en el presente documento puede diseñarse mediante un ARN que codifica el CAR de la invención. El ARN se puede transfectar o transducir en una célula hospedante mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, sistemas basados en virus, métodos físicos, métodos biológicos, métodos químicos). Independientemente de los métodos utilizados para transferir el ARN que codifica el CAR de la invención a la célula hospedante, como resultado, la célula hospedante expresa un CAR como se describe en el presente documento. Las "células modificadas genéticamente con ARN" expresan el CAR durante un tiempo limitado (expresión transitoria).

Las células genéticamente modificadas (inmunes) que expresan el CAR como se describe en el presente documento, preferentemente células T, pueden generarse en un proceso automatizado en un sistema cerrado. Un proceso para la generación de células modificadas genéticamente, preferentemente células T, puede comprender, p. ej., los siguientes pasos:

a) proporcionar una muestra de células que comprenda células (inmunes)

b) preparación de la muestra celular por centrifugación

c) separación magnética de las células (inmunes), preferentemente células T,

d) activación de las células enriquecidas (inmunes), preferentemente células T, utilizando agentes moduladores e) modificación genética de las células (inmunes), preferentemente células T, para expresar el CAR de la invención f) expansión de las células genéticamente modificadas (inmunes), preferentemente células T, en una cámara de cultivo g) lavado de las células cultivadas (inmunes), preferentemente células T.

Todos estos pasos se pueden realizar de forma automática en un sistema cerrado, preferentemente en un sistema cerrado y estéril.

El proceso es especialmente adecuado para preparar células modificadas genéticamente tales como células inmunes, preferentemente células T, en las que las células enriquecidas (inmunes), preferentemente células T, se modifican genéticamente mediante el uso de vectores víricos y/o no víricos.

Cualquiera de estos pasos se puede multiplicar, omitir o puede ocurrir en un orden diferente.

Los agentes moduladores pueden seleccionarse entre anticuerpos y/o citocinas agonistas.

Las células genéticamente modificadas (inmunes), preferentemente las células T, pueden enriquecerse mediante el etiquetado magnético de las células (inmunes) y separación magnética antes o después del cultivo para obtener una mayor frecuencia de células genéticamente modificadas (inmunes), preferentemente células T, en el producto celular final.

Como sistema cerrado y estéril para la modificación de células, se puede utilizar el dispositivo de procesamiento de células totalmente automatizado CliniMACS Prodigy® y los conjuntos de tubos asociados (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania) (WO2009/072003). Este sistema cerrado cumple con los requisitos de procesamiento de grado GMP de casi cualquier tipo de productos celulares, y puede permitir reducir los requisitos de sala limpia, mejorar la transferencia de tecnología y armonizar los procesos de fabricación de células.

El sistema CAR como se describe en el presente documento puede usarse para el tratamiento en un sujeto que tiene una enfermedad, un trastorno o una afección asociada con un antígeno que puede unirse específicamente por el resto de unión al antígeno del TCBM como se describe en el presente documento.

En particular, el sistema CAR que se describe en este documento puede usarse en el tratamiento en un sujeto que padece cáncer. Las células tales como células inmunes, p. ej., las células T de un sujeto, pueden aislarse o pueden usarse líneas de células inmunes establecidas. El sujeto puede padecer dicho cáncer (un paciente) o puede ser un sujeto sano. Estas células inmunes están modificadas genéticamente. in vitro para expresar el CAR como se describe en este documento. Estas células genéticamente modificadas pueden activarse y expandirse in vitro a una población terapéuticamente eficaz de células que expresan CAR anti-LLE. En terapia celular, estas células genéticamente manipuladas pueden infundirse a un receptor que las necesite como una composición farmacéutica (o una formulación de una población terapéuticamente eficaz de células que expresan CAR anti-LLE), además de una segunda composición farmacéutica, una formulación de TCBM. Las células infundidas en el receptor pueden destruir (o al menos detener el crecimiento) las células cancerosas que expresan el antígeno que es reconocido por el sistema CAR como se describe en el presente documento. El receptor puede ser el mismo sujeto del que se obtuvieron las células (terapia celular autóloga) o puede ser otro sujeto de la misma especie (terapia celular alogénica).

La población terapéuticamente eficaz de células que expresan CAR anti-LLE se puede administrar al paciente antes de la administración de la formulación de TCBm al sujeto. Alternativamente, la formulación de TCBM puede administrarse al sujeto antes o al mismo tiempo que la administración de la población terapéuticamente eficaz de células que expresan CAR anti-LLE al sujeto. Una variación adicional incluye cultivar in vitro la población terapéuticamente eficaz de células que expresan CAR anti-LLE con la TBCM de la formulación de TCBM antes de la administración al sujeto.

Pueden formularse poblaciones de células (inmunes) que expresan CAR anti-LLE- para su administración a un sujeto usando técnicas conocidas por el experto en la materia.

Las formulaciones que comprenden una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células CAR que expresan anti-LLE pueden incluir uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables (vehículo o diluyentes). Los excipientes incluidos en las formulaciones tendrán diferentes propósitos dependiendo, por ejemplo, de la naturaleza del dominio de unión a LLE del CAR anti-LLE, la (sub)población de células inmunes utilizadas y el modo de administración. Los ejemplos de excipientes usados generalmente incluyen, sin limitación: disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa, agua para inyección, glicerol, etanol y combinaciones de estos, agentes estabilizantes, agentes solubilizantes y tensioactivos, tampones y conservantes, agentes de tonicidad, agentes de carga y agentes lubricantes.

Una formulación de una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células CAR que expresan anti-LLE puede incluir una población de células (inmunes) que expresan anti-LLE-CAR, o más de una población de células que expresan CAR anti-LLE (inmunes). Las diferentes poblaciones de células CAR anti-LLE (inmunes) pueden variar en función de la identidad del dominio de unión a LLE, la identidad del dominio de activación, la identidad de la (sub)población de células inmunes o una combinación de las mismas.

Las formulaciones que comprenden una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células CAR que expresan anti-LLE pueden administrarse a un sujeto usando modos y técnicas conocidos por el experto en la materia. Los modos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, inyección intravenosa. Otros modos incluyen, sin limitación, inyección intratumoral, intradérmica, subcutánea (sc, sq, sub-Q, Hypo), intramuscular (im), intraperitoneal (ip), intraarterial, intramedular, intracardíaca, intraarticular (articulación), intrasinovial (área de líquido articular), intracraneal, intraespinal e intratecal (líquido cefalorraquídeo).

Las formulaciones que comprenden una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células CAR que expresan anti-LLE que se administran a un sujeto comprenden varias células que expresan CAR anti-LLE- tales como células inmunes que son eficaces para el tratamiento de la indicación o trastorno específico. En general, se pueden administrar formulaciones que comprendan entre aproximadamente 1 x 104 y alrededor de 1 x 1010 células que expresan CAR anti-LLE, como las células inmunes. En la mayoría de los casos, la formulación puede comprender entre aproximadamente 1 x 105 y alrededor de 1 x 109 células que expresan CAR anti-LLE, como células inmunes, de aproximadamente 5 x 105 a aproximadamente 5 x 108 células que expresan CAR anti-LLE como células inmunes, o de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 107 células que expresan CAR anti-LLE como células inmunes. Sin embargo, el número de células que expresan CAR anti-LLE, como células inmunes administradas a un sujeto puede variar entre amplios límites, dependiendo de la ubicación, origen, identidad, extensión y gravedad del trastorno, la edad y el estado del individuo. a tratar, etc. Un médico puede determinar en última instancia las dosis apropiadas que se utilizarán.

Las TCBM se pueden formular para su administración a un sujeto usando técnicas conocidas por el experto en la materia. Las formulaciones de los TCBM pueden incluir excipientes (vehículos o diluyentes) farmacéuticamente aceptables. Los excipientes incluidos en las formulaciones tendrán diferentes propósitos dependiendo, por ejemplo, de la naturaleza del resto marcador, el resto enlazador, el ABM y el modo de administración. Los ejemplos de excipientes usados generalmente incluyen, sin limitación: disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa, agua para inyección, glicerol, etanol y combinaciones de estos, agentes estabilizantes, agentes solubilizantes y tensioactivos, tampones y conservantes, agentes de tonicidad, agentes de carga y agentes lubricantes.

Una formulación de TCBM puede incluir un tipo de TCBM o más de un tipo de TCBM. Los diferentes tipos de TBCM pueden variar en función de la identidad del resto marcador, el resto enlazador, el resto de unión a antígeno o una combinación de los mismos.

Las TCBM se pueden administrar a un sujeto usando modos y técnicas conocidos por el experto en la materia. Los modos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, inyección intravenosa, intraperitoneal e intratumoral. Otros modos incluyen, sin limitación, intradérmico, subcutáneo (sc, sq, sub-Q, Hypo), intramuscular (im), intraarterial, intramedular, intracardíaco, intraarticular (articulación), intrasinovial (área de líquido articular), intracraneal, intraespinal e intratecal (líquido cefalorraquídeo).

Las formulaciones que comprenden TCBM se administran a un sujeto en una cantidad que es eficaz para tratar la indicación o trastorno específico. En general, las formulaciones que comprenden al menos aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de la TCBM pueden administrarse a un sujeto que necesite tratamiento. En la mayoría de los casos, la dosis puede ser de aproximadamente 100 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal de la TCBM diariamente, teniendo en cuenta las vías de administración, los síntomas, etc. Como se muestra en la FIG 6, sorprendentemente, es posible usar las TCBM en concentraciones tan bajas como 1 ng/ml (correspondiente a 1 pg/kg de peso corporal) usando el sistema CAR como se describe en el presente documento. Sin embargo, la cantidad de TCBM en las formulaciones administradas a un sujeto puede variar entre amplios límites, dependiendo de la ubicación, fuente, identidad, extensión y gravedad del trastorno, la edad y el estado del individuo a tratar, etc. Un médico puede en última instancia, determinar las dosis apropiadas que se utilizarán.

El tiempo entre la administración de la formulación de células que expresan CAR y la formulación de TCBM puede variar ampliamente dependiendo de factores que incluyen el tipo de células (inmunes) que se utilizan, la especificidad de unión del CAR, la identidad del resto marcador, el resto enlazador y resto de unión a antígeno, la identidad de la célula diana, p. ej., célula cancerosa a tratar, la ubicación de la célula diana en el sujeto, los medios usados para administrar las formulaciones al sujeto, y la salud, edad y peso del sujeto que está siendo tratado. De hecho, la formulación de TCBM puede administrarse antes, simultáneamente con o después de la formulación de células (inmunes) modificadas por ingeniería genética.

Dependiendo del trastorno que se esté tratando, el paso de administrar la formulación de células que expresan CAR, o el paso de administrar la formulación de TCBM, o ambos, pueden repetirse una o más veces. Cuando se pueden aplicar dos o más formulaciones de TCBM a un sujeto, las formulaciones aplicadas pueden comprender las mismas o diferentes TCBM. Cuando se aplican a un sujeto dos o más formulaciones de células modificadas genéticamente tales como células inmunes que expresan el CAR de la invención, las células modificadas genéticamente pueden ser del mismo tipo celular o de diferentes tipos celulares. Una formulación de células tales como células inmunes también puede comprender más de un tipo de célula, cada una de las cuales expresa el CAR de la invención.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En general, un CAR puede comprender un dominio extracelular (parte extracelular) que comprende el dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. El dominio extracelular se puede unir al dominio transmembrana mediante un enlazador. El dominio extracelular también puede comprender un péptido de señalización. La parte extracelular del CAR de la presente invención comprende un dominio de unión al epítopo enlazador/marcador (LLE) como se describe en el presente documento. Específicamente, el CAR descrito en el presente documento tiene un dominio de unión a LLE extracelular como dominio de unión a antígeno.

Un "péptido de señalización" se refiere a una secuencia de péptidos que dirige el transporte y la localización de la proteína dentro de una célula, p. ej., a un determinado orgánulo celular (como el retículo endoplásmico) y/o la superficie celular.

Generalmente, un "dominio de unión a antígeno" se refiere a la región del CAR que se une específicamente a un antígeno (y por lo tanto es capaz de dirigirse a una célula que contiene el antígeno). Los CAR de la invención pueden comprender uno o más dominios de unión a antígeno. Generalmente, las regiones de direccionamiento en el CAR son extracelulares. El dominio de unión a antígeno puede comprender un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El dominio de unión al antígeno puede comprender, por ejemplo, cadena pesada de longitud completa, fragmentos Fab, fragmentos Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios divalentes o diacuerpos. Cualquier molécula que se una específicamente a un antígeno dado, como affibodies o dominios de unión a ligandos de receptores de origen natural, puede usarse como dominio de unión a antígeno. A menudo, el dominio de unión al antígeno es un scFv. Normalmente, en un scFv, las regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera de inmunoglobulina se condensan mediante un enlazador flexible para formar un scFv. Dicho enlazador puede ser, por ejemplo, el "(G4/S1)3-enlazador ".

En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión a antígeno derive de la misma especie en la que se usará el CAR. Por ejemplo, cuando se planea usarlo terapéuticamente en seres humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión al antígeno del CAR para comprender un anticuerpo humano o humanizado o su un fragmento de unión a antígeno. Pueden prepararse anticuerpos humanos o humanizados o sus fragmentos de unión a antígeno mediante una variedad de métodos bien conocidos en la técnica. El CAR que se describe en el presente documento tiene un dominio de unión al epítopo marcador/enlazador extracelular como dominio de unión a antígeno que permite unirse indirectamente a través de una molécula de unión de células diana como se describe en este documento a un antígeno expresado en una célula diana.

"Espaciador" o "bisagra", como se usa en el presente documento, se refiere a la región hidrófila que se encuentra entre el dominio de unión a antígeno y el dominio transmembrana. Los CAR de la invención pueden comprender un dominio espaciador extracelular, pero también es posible omitir dicho espaciador. El espaciador puede incluir, p. ej., fragmentos Fc de anticuerpos o sus fragmentos, regiones bisagra de anticuerpos o sus fragmentos, regiones CH2 o CH3 de anticuerpos, proteínas accesorias, secuencias espaciadoras artificiales o combinaciones de las mismas. Un ejemplo destacado de un espaciador es la bisagra CD8alfa.

El dominio transmembrana del CAR puede derivar de cualquier fuente natural o sintética deseada para dicho dominio. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivar de cualquier proteína transmembrana o unida a membrana. El dominio transmembrana puede derivar, por ejemplo, de CD8alfa o CD28. Cuando los módulos (dominios) de señalización y reconocimiento de antígenos clave están en dos (o incluso más) polipéptidos, entonces el CAR puede tener dos (o más) dominios transmembrana. Los módulos de reconocimiento de antígenos y señalización clave de división permiten un control reversible, titulable y dependiente de moléculas pequeñas sobre la expresión de las células CAR (Wu et al, 2015, Science 350: 293-303) debido a dominios heterodimerizantes dependientes de moléculas pequeñas en cada polipéptido del CAR.

El dominio citoplasmático (o el dominio de señalización intracelular) del CAR es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmune en la que se expresa el CAR. "Función efectora" significa una función especializada de una célula, p. ej., en una célula T, una función efectora puede ser la actividad citolítica o la actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas. El dominio de señalización intracelular se refiere a la parte de una proteína que transduce la señal de la función efectora y dirige la célula que expresa el CAR para que realice una función especializada. El dominio de señalización intracelular puede incluir cualquier parte completa, mutada o truncada del dominio de señalización intracelular de una proteína dada suficiente para transducir una señal que inicia o bloquea las funciones efectoras de las células inmunes.

Ejemplos destacados de dominios de señalización intracelular para su uso en los CAR incluyen las secuencias de señalización citoplásmicas del receptor de células T (TCR) y los correceptores que inician la transducción de señales después de la activación del receptor de antígeno.

En general, la activación de las células T puede estar mediada por dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmática, en primer lugar, aquellas que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través de las TCR (secuencias de señalización citoplasmática primarias) y, en segundo lugar, aquellas que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplásmicas secundarias, dominio de señalización coestimuladora). Por tanto, un dominio de señalización intracelular de un CAR puede comprender uno o más dominios de señalización citoplásmicos primarios y/o uno o más dominios de señalización citoplásmicos secundarios.

Las secuencias de señalización citoplásmicas primarias que actúan de manera estimulante pueden contener ITAM (motivos de señalización de motivos de activación inmunorreceptores basados en tirosina).

Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplásmicas primarias que se utilizan a menudo en los CAR son los derivados de TCR zeta (CD3 zeta), FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. La más destacada es la secuencia derivada de CD3 zeta.

El dominio citoplásmico del CAR puede diseñarse para que comprenda el dominio de señalización CD3-zeta por sí mismo o combinado con cualquier otro dominio citoplásmico deseado. El dominio citoplásmico del CAR puede comprender una parte de la cadena CD3 zeta y una región de señalización coestimuladora. La región de señalización coestimuladora se refiere a una parte del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta eficaz de los linfocitos a un antígeno. Los ejemplos de una molécula coestimuladora son CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a la función de los linfocitos - 1 (LFA-1 ), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3.

Las secuencias de señalización citoplasmática dentro de la parte de señalización citoplásmica del CAR se pueden unir entre sí con o sin un enlazador en un orden aleatorio o especificado. Un enlazador oligo o polipéptido corto, que preferiblemente tiene entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace. Un enlazador prominente es el doblete de glicina-serina.

Como ejemplo, el dominio citoplásmico puede comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En otro ejemplo, el dominio citoplásmico puede comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD27. En un ejemplo adicional, el dominio citoplásmico puede comprender el dominio de señalización de CD3-zeta, el dominio de señalización de CD28 y el dominio de señalización de CD27.

Como se mencionó anteriormente, la parte extracelular o el dominio transmembrana o el dominio citoplásmico de un CAR también pueden comprender un dominio heterodimerizante con el objetivo de dividir los módulos clave de señalización y reconocimiento de antígenos del CAR.

El CAR que se describe en este documento, es decir el CAR que comprende un dominio de unión a LLE, puede diseñarse para comprender cualquier porción o parte de los dominios mencionados anteriormente como se describe en el presente documento en cualquier orden y/o combinación que dé como resultado un CAR funcional.

El término "anticuerpo", tal como se emplea, en este documento, se usa en el sentido más amplio para cubrir las diversas formas de estructuras de anticuerpos que incluyen, entre otros, anticuerpos monoclonales y policlonales (incluidos anticuerpos de longitud completa), anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpos, es decir, fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, inmunoadhesinas y quimeras anticuerpo-inmunoadhesina, que reconocen específicamente (es decir, se unen) un antígeno diana. Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, preferiblemente el dominio variable del mismo, o al menos el sitio de unión a antígeno del mismo ("un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo"). Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab (fragmento de unión a antígeno), scFv (fragmento variable de cadena sencilla), anticuerpos de dominio único, diacuerpos, dsFv, Fab ', diacuerpos, moléculas de anticuerpo monocatenarios y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Como se usa en el presente documento, el término "antígeno" pretende incluir sustancias que se unen o provocan la producción de uno o más anticuerpos y pueden comprender, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, polipéptidos, oligopéptidos, lípidos, carbohidratos y combinaciones de estos, por ejemplo, una proteína glicosilada o un glicolípido. El término "antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a una entidad molecular que puede expresarse en una célula diana y que puede ser reconocida por medio del sistema inmunológico adaptativo que incluye, entre otros, anticuerpos o TCR, o moléculas genomanipuladas que incluyen, entre otras, TCR, CAR, scFv transgénicos o multímeros de los mismos, fragmentos Fab o multímeros de los mismos, anticuerpos o multímeros de los mismos, anticuerpos monocatenarios o multímeros de los mismos, o cualquier otra molécula que pueda ejecutar la unión a una estructura con gran afinidad.

La expresión "CAR del resto anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo", como se usa en este documento, se refiere a un CAR que se une a una TCBM que tiene biotina como LaM, tiene un resto enlazador de 6-(6-aminohexanamido) hexanoílo como derivado de LiM, p. ej., de ácido 6-(6-aminohexanamido) hexanoico o éster activo 6-(6-aminohexanamido) hexanoico, y tiene un ABM contra un antígeno de una célula diana.

La parte de interfaz, linaje y/o interacción del resto de enlazador 6-(6-aminohexanamido) hexanoílo y el resto marcador de biotina crea el epítopo enlazador/marcador (LLE), el resto 6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo. Por ejemplo, el acoplamiento Biotina-LC-LC-NHS (ThermoFisher Scientific, pm 567,70 g/mol, Cat. No. 21343, No CAS. 89889-52-1) a un ABM como se describe en el presente documento da como resultado una TCBM como se describe en este documento que puede unirse mediante dicho CAR anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo como se describe en el presente documento.

El resto enlazador 6-(6-aminohexanamido) hexanoílo como se muestra, p. en la Figura 1C puede tener cualquier grupo químico funcional tal como un grupo carboxilo, un éster activo, una acetamida o maleimida capaz de acoplarse a un ABM como se describe en este documento, por ejemplo, un anticuerpo o su fragmento usando grupos NH2 o SH para acoplarse al mismo.

La expresión "células diana", como se usa en este documento, se refiere a células que expresan el antígeno en su superficie celular que debe ser reconocida (unida) por el resto de unión al antígeno de una molécula de unión a la célula diana como se describe en este documento. La célula diana puede ser una célula cancerosa o cualquier otra célula enferma.

El término "trastorno" significa una anomalía o alteración funcional en un sujeto, tal como un cáncer, un trastorno autoinmunitario o una infección por virus, bacterias, parásitos u otros.

Los CAR que se describen en el presente documento (polipéptido(s)), la molécula(s) de ácido nucleico que codifica los CAR, los vectores de expresión recombinantes, las células que expresan los CAR y las poblaciones de células que expresan los CAR pueden aislarse y/o purificarse. El término "aislado" significa alterado o eliminado del estado natural. Por ejemplo, una población aislada de células significa un enriquecimiento de dichas células y la separación de otras células que normalmente están asociadas en su estado natural con dichas células aisladas. Una población aislada de células significa una población de células sustancialmente purificadas que son una población de células más homogénea que la que se encuentra en la naturaleza. Preferiblemente, la población celular enriquecida comprende al menos aproximadamente el 90% del tipo celular seleccionado. En aspectos particulares, la población celular comprende al menos alrededor del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso 100% del tipo celular seleccionado. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado". También puede existir un ácido nucleico o una proteína aislados en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, en una célula hospedante.

Como se usa en este documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero tal como un ratón, rata, vaca, cerdo, cabra, perro pollo, mono o humano. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano. El sujeto puede ser un sujeto que padece un trastorno como cáncer (un paciente), pero el sujeto también puede ser un sujeto sano.

El término "autólogo", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier material derivado del mismo sujeto al que se reintroduce posteriormente.

El término "alogénico", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier material derivado de un sujeto diferente de la misma especie que el sujeto al que se reintroduce el material.

Las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz" o "población terapéuticamente eficaz" significan una cantidad de una población celular que proporciona un beneficio terapéutico en un sujeto.

Las expresiones "se une específicamente" o "específico para" con respecto a un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, de un fragmento de unión a antígeno del mismo, como se usa, p. ej., en la TCBM que se describe en el presente documento, o de un CAR se refieren a un dominio de unión a antígeno que reconoce y se une a un antígeno específico, pero no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra. Un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno de una especie puede unirse también a ese antígeno de otra especie. Esta reactividad entre especies es típica de muchos anticuerpos y, por lo tanto, no es contraria a la definición de ese dominio de unión a antígeno como específico. Un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno puede unirse también a diferentes formas alélicas del antígeno (variantes alélicas, variantes de empalme, isoformas, etc.) o variantes homólogas de este antígeno de la misma familia de genes. Esta reactividad cruzada es típica de muchos anticuerpos y, por lo tanto, no es contraria a la definición de ese dominio de unión a antígeno como específico.

Las expresiones "célula modificada por ingeniería genética" y "célula modificada genéticamente" como se usan en este documento se pueden usar indistintamente. Los términos significan contener y/o expresar un gen exógeno o secuencia de ácido nucleico que a su vez modifica el genotipo o fenotipo de la célula o su progenie. Especialmente, los términos se refieren al hecho de que las células, preferentemente células inmunes, pueden manipularse mediante métodos recombinantes bien conocidos en la técnica para expresar péptidos o proteínas de forma estable o transitoria que no se expresan en estas células en el estado natural. Por ejemplo, las células inmunes se modifican para expresar una construcción artificial como un receptor de antígeno quimérico en su superficie celular. Por ejemplo, las secuencias CAR se pueden administrar a las células usando un vector retrovírico o lentivírico.

Las expresiones "célula inmune" o "célula efectora inmune" se refieren a una célula que puede ser parte del sistema inmunológico y ejecuta una función efectora particular, como células T alfa-beta, células NK, células NKT, células B, células linfoides innatas (ILC), células citolíticas naturales inducidas por citocinas (CIK), linfocitos citolíticos naturales activados por linfocinas (LAK), células T gamma-delta, células madre mesenquimales o células estromales mesenquimales (MSC), monocitos o macrófagos. Las células inmunes preferidas son células con función efectora citotóxica tales como células T alfa-beta, células NK, células NKT, células ILC, células CIK, células LAK o células T gamma-delta. "Función efectora" significa una función especializada de una célula, p. ej., en una célula T, una función efectora puede ser la actividad citolítica o la actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas.

El término "tratar" (tratamiento de) un trastorno, como se usa en este documento, significa reducir la frecuencia o gravedad de al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno experimentado por un sujeto.

El término "expresión", como se usa en el presente documento, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular impulsada por su promotor en una célula.

El término "epítopo" significa la parte de un antígeno que puede ser reconocida por el sistema inmunológico, específicamente por anticuerpos, células B o células T. Por ejemplo, el epítopo es la pieza específica del antígeno al que se une un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno.

Las expresiones "epítopo enlazador/marcador" (LLE) o "epítopo marcador/enlazador", como se utilizan en el presente documento, se pueden utilizar indistintamente y se refieren a un epítopo formado por el contexto, la interfaz y/o el entorno del resto enlazador conjugado y el resto marcador TCBM como se describe en este documento. El epítopo generado por el acoplamiento del resto marcador con un resto enlazador no se produce de forma natural en un sujeto. El epítopo generado comprende una parte de dicho LaM y una parte de dicho LiM. Preferiblemente, el LLE no provoca o no tiende a provocar una reacción inmune en un sujeto destinado a ser tratado con células que expresan el CAR que se describe en el presente documento. El único requisito para el LLE es que sea un epítopo con respecto al CAR que comprende el dominio de unión a LLE. Un dominio de unión a LLE extracelular de un CAR como se describe en este documento que deriva de una molécula de reconocimiento de epítopo, como un anticuerpo que reconoce el epítopo marcador/enlazador, se une con una preferencia mayor al epítopo recién creado, es decir, el epítopo marcador/enlazador (el autoantígeno modificado), que al resto marcador endógeno sin resto enlazador, es decir, la molécula de origen natural en el sujeto (el autoantígeno).

Dicho dominio de unión a LLE extracelular de dicho CAR se une con al menos dos veces, preferentemente al menos 5 veces, más preferentemente al menos 10 veces mayor afinidad hacia dicho LLE que hacia dicha molécula de origen natural.

Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 20, como se indica en el protocolo de listado de secuencias, son en su mayoría secuencias parciales o completas de CAR como se describe en el presente documento. Dichas secuencias de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 20 también pueden comprender variantes de estas secuencias, respectivamente, que tienen algunos aminoácidos suprimidos, añadidos o reemplazados mientras aún conservan la función pretendida como se describe en el presente documento. Por lo tanto, en esta definición se incluyen variantes de las secuencias de aminoácidos en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 20, respectivamente, tales como secuencias de aminoácidos esencialmente similares a SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 20, respectivamente, que tienen una identidad de secuencia de al menos 70%, o al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% a nivel de secuencia de aminoácidos. En general, todas las variaciones de aminoácidos que no conducen a cambios intencionales de la función pretendida de las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 20, respectivamente, se incluyen en esta definición. En el contexto de la presente invención, la "identidad de secuencia" puede determinarse usando alineaciones por pares que emplean programas de alineación para secuencias de aminoácidos bien conocidos en la técnica.

El "sistema circulatorio" es un sistema de órganos de un sujeto que permite que la sangre circule y transporte nutrientes (como aminoácidos y electrolitos), oxígeno, dióxido de carbono, hormonas y células sanguíneas hacia y desde las células del cuerpo para proporcionar nutrición y ayudar a combatir enfermedades, estabilizar la temperatura y el pH, y mantener la homeostasis. El sistema circulatorio comprende dos sistemas separados: el sistema cardiovascular, que distribuye la sangre, y el sistema linfático, que hace circular la linfa.

La expresión "molécula de origen natural en un sujeto o su derivado ", como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas o sustancias en un sujeto, preferentemente dichas moléculas están ubicadas extracelularmente o tienen al menos una parte extracelular, por ejemplo, una proteína que atraviesa la transmembrana. La molécula de origen natural puede existir en forma libre o unida covalente o no covalentemente a otra molécula, por ejemplo, unida a una proteína Por ejemplo, la biotina existe en forma libre circulando en el sistema sanguíneo, pero también unida a, por ejemplo, proteína plasmática.

Debido a este requisito, estas moléculas no son inmunogénicas ya que son moléculas endógenas (autoantígenos) del sujeto. Por ejemplo, la biotina es una molécula de origen natural en un sujeto, ya que es una molécula circulatoria en el sistema sanguíneo (sistema circulatorio) de un sujeto. La expresión "derivado del mismo" significa en este contexto que dicha molécula de origen natural en un sujeto puede sufrir algunas modificaciones menores sin cambiar la naturaleza de dicha molécula. Dichas modificaciones no son idénticas a la conjugación del resto enlazador con dicha molécula.

Realizaciones

Además de las aplicaciones descritas anteriormente del sistema CAR descrito en este documento, a continuación se describen realizaciones adicionales de la invención sin intención de limitarse a estas realizaciones.

En una realización de la invención, el CAR anti-LLE es un resto CAR anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo, en el que dicho dominio de unión a LLE extracelular comprende las secuencias de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y la TCBM comprende un resto 6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo y un ABM que se une específicamente a un antígeno de una célula cancerosa, p. ej., anti-GD2 o CD19.

Los resultados presentados aquí muestran que el sistema CAR del resto CAR anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo y la TCBM que comprende un resto 6-[6(biotinamido) hexanamido] hexanoílo funcionan bien independientemente del ABM elegido.

Se han generado varias versiones de estructuras CAR de resto anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo con orientaciones variables de cadena-ligera pesada (HL y LH) de un scFV que comprende SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y secuencias espaciadoras extracelulares variables (Figura 2) y estas secuencias se han clonado en un esqueleto de vector lentivírico policistrónico capaz de codificar las moléculas CAR así como un marcador (LNGFR).

La Figura 3 muestra que la producción del vector vírico y la expresión de LNGFR es posible con todas las construcciones ensayadas.

Las células T se enriquecieron a partir de PBMC, se activaron y transdujeron in vitro usando los vectores lentivíricos que codifican las construcciones indicadas en la Figura 2. Las diferentes células T CAR del resto anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo se cultivaron conjuntamente con células tumorales LS en una relación de 1 a 1. El anticuerpo anti-CD19 conjugado con el resto 6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo se añadió al cultivo en una dosis determinada o no se añadió (control negativo). A continuación, se midió la citotoxicidad causada por las células T CAR del resto anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo. La SEQ ID NO: 11 demostró ser la construcción más eficaz (Figura 4).

Los resultados se confirmaron usando una línea de células tumorales diferente y un anticuerpo diferente (MCF7 y anti-CD19 respectivamente) como se presenta en la Figura 5A-D.

Una titulación de la dosis de los anticuerpos anti-GD2 o anti-CD19 mostró que las células T CAR del resto anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo eran eficaces para inactivar su diana tumoral específicamente en dosis de tan solo 1 ng/ml (FIG 6A y B). Esta dosis es considerablemente más baja que las dosis requeridas para las funciones antitumorales in vivo. Además, la citotoxicidad varió con diferentes relaciones de células efectoras a diana (Figura 7A y B). Las células T CAR del resto anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo pueden no ser citotóxicas contra una diana tumoral en ausencia de anticuerpos marcados (p. ej., biotinilados) o en presencia de anticuerpos no marcados específicos del tumor o en presencia de anticuerpos marcados no específicos del tumor. Este es el caso que se muestra en la FIG 8 y la FIG 9 utilizando 2 modelos diferentes. La función CAR del resto anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo no debe verse afectada por ligandos de reacción potencialmente cruzada presentes en la sangre, como la biotina circulante. La biotina está presente en el suero humano en intervalos de dosis de 60 a 370 pmol/l (Mock et al., 1995, J of Nutrition). Se demostró que la función del CAR del resto anti-6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo no se ve afectada en presencia de dosis de biotina de hasta 30 pmol/l (muy por encima de los niveles fisiológicos de biotina) o hasta 50% de suero AB humano. Véanse la FIG 10 y la FIG 11.

En otra realización de la invención, el CAR anti-LLE que se describe en el presente documento se expresa en células T de un donante (alogénico) o un paciente (autólogo). Estas células se activan y modifican genéticamente (utilizando vectores víricos o no víricos) para expresar el CAR anti-LLE. Estas células T genéticamente modificadas se infunden en un paciente como una población terapéuticamente eficaz de células que expresan CAR anti-LLE. Se infunde al paciente una dosis definida de una formulación de TCBM que comprende un ABM dirigido contra una célula diana que expresa el antígeno reconocido por la TCBM.

Las TCBM se pueden administrar al receptor antes, durante y/o después de la infusión de la infusión de células T CAR anti-LLE.

Las células T CAR anti-LLE reconocerán entonces las TCBM unidas a su diana específica. A su vez, el reconocimiento de la TCBM unido por la célula T CAR anti-LLE induce a las células T modificadas infundidas a cumplir su función pretendida, principalmente la de expresar citocinas y/o ser citotóxicas (FIG 1).

Por ejemplo, las TCBM pueden apuntar a antígenos en la superficie de las células malignas, lo que permite que las células T CAR anti-LLE destruyan las células tumorales. En otra aplicación, las TCBM infundieron antígenos diana expresados por células infectadas con patógenos específicos y permiten que las células T medien en la destrucción de las células infectadas o en la liberación de citocinas inflamatorias por las células T modificadas genéticamente. En otro caso, las TCBM se unen a antígenos de superficie celular o moléculas expresadas en sitios de inflamación para inducir una respuesta reguladora de las células T.

La diferencia en la respuesta de las células T se puede controlar por el tipo de células T utilizadas (por ejemplo, células T CD8 citotóxicas o células T CD4 reguladoras) y el tipo de dominios de señalización intracelular utilizados para crear el CAR anti LLE (por ejemplo, CD3zeta y 4-1BB para inducir respuestas proinflamatorias o CD3zeta y PD-1 para inducir respuestas antiinflamatorias).

Con el fin de proporcionar un mayor control y seguridad, se pueden usar una o combinaciones de formulaciones de TCBM de una manera dependiente de la dosis, espacial y temporal.

Se puede realizar una respuesta a la dosis de las TCBM, mediante la cual el paciente recibe las células T CAR anti­ LLE y una dosis muy baja de TCBM seguida de dosis en aumento consecutivas de TCBM hasta que se observa la respuesta deseada o hasta que se alcanza la toxicidad limitante de la dosis. Se pueden infundir varias TCBM para dirigirse a más de un antígeno diana expresado en una o más células diana, creando efectivamente una respuesta policlonal.

Se pueden administrar TCBM con diferentes ABM una detrás de la otra.

Tras la secesión de la administración de TCBM, las células T CAR anti-LLE ya no son capaces de efectuar su función efectora deseada. Pero esta función se puede reanudar tras la reinfusión de la TCBM.

El sistema CAR como se describe en este documento también se puede usar de la siguiente manera: La primera ola de TCBM infundida en las células inmunomoduladoras diana del paciente (por ejemplo, Treg, M2, TAM, MDSC, células derivadas de mieloides, monocitos). Y las olas consecutivas de TCBM se dirigen al tumor que se va a destruir. Este planteamiento tiene como primer objetivo destruir las barreras inmunes que impiden que las células T ataquen eficientemente al tumor solo en una ventana de tiempo temporalmente restringida.

En otra realización de la invención, el CAR anti-LLE se expresa en células NK y/o células NKT que son muy eficaces pero de corta duración in vivo. Esta elección de células como células efectoras modificadas genéticamente está destinada a tratamientos en los que la presencia de células modificadas genéticamente in vivo solo se requiere durante un período de tiempo definido (por ejemplo, menos de 6 meses o incluso menos de 2 meses).

El CAR anti-LLE que se describe en el presente documento también puede expresarse en células T gamma/delta con el fin de beneficiarse de su efector y capacidad de autodirección. Este caso es especialmente aplicable en entornos de transferencia alogénica de un donante a un receptor para evitar la EICH.

En una realización de la invención, la TCBM que se une al CAR anti-LLE como se describe en este documento puede comprender dos sitios de reconocimiento de antígenos diferentes en el ABM (denominados en el presente documento "biespecíficos", en lugar de ser bivalentes para el mismo antígeno) donde cada sitio de reconocimiento de la TCBM es de baja afinidad y/o alto Koff, por tanto, una diana debe expresar ambos antígenos para que la TCBM "divalente" se una con una avidez adecuada. Las células que expresan solo una diana no permitirán que la TCBM "divalente" se una lo suficientemente bien como para que las células T CAR anti-LLE proporcionen su función efectora.

En otro planteamiento, la TCBM se dirige a los complejos MCH peptídicos.

El CAR anti-LLE que se describe en el presente documento también puede expresarse en células madre y/o progenitores de múltiples linajes y/o células madre pluripotentes inducidas que preferiblemente son dirigidas por su propio promotor, y preferiblemente un promotor específico de linaje activo solo en células T. Luego las células se diferenciarán de las células madre modificadas genéticamente y/o de los progenitores de múltiples linajes y darán lugar a células T que expresarán el CAR anti-LLE así como su propio receptor de células T. Esta estrategia se utiliza preferiblemente en los casos en que los pacientes se someterían a un alotrasplante de células madre. Una vez que las células madre y/o los progenitores de múltiples linajes han dado lugar a células T, la respuesta inmune puede dirigirse hacia la enfermedad diana mediante la infusión de TCBM específica.

Alternativamente, las células T de un paciente se modifican directamente in vivo utilizando un vector vírico modificado capaz de dirigirse específicamente a un subconjunto del sistema inmunitario adaptativo, como células T CD8 y/o CD 4, células T NK, NK y/o células T gamma delta

El CAR anti-LLE que se describe en el presente documento también puede expresarse en células T totales, células T CD8 positivas o células T CD4 positivas y usarse en combinación con una biblioteca de anticuerpos y/o Fab que se conjugan con un resto marcador/enlazador como se describe en este documento, por ejemplo el resto 6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo para descubrir qué combinación de motivos diana (por ejemplo, anticuerpos) debe usarse para desactivar una célula diana determinada. Luego se puede usar la combinación apropiada para tratar la enfermedad de un paciente dado (es decir, terapia de CAR de combinación guiada).

En otra realización de la invención, las células T que expresan el CAR anti-LLE como se describe en el presente documento y no expresan TcRap se generan para crear células T CAR "universales-universales" (U2). Por ejemplo, las células madre que se diferenciarán en células T pueden modificarse genéticamente de esta manera, lo que da como resultado un conjunto completo de células T modificadas en el paciente. Las células T modificadas se pueden administrar a un paciente en forma de alotrasplante. El planteamiento de CAR anti-LLE U2 cumple con los criterios para la focalización universal, ya que la especificidad de la activación de células T CAR anti-LLE está absolutamente determinada por la especificidad predefinida de la TCBM. Además, la desactivación de la cadena TcRap o CD3 con falla de expresión consecutiva del complejo receptor de células T facilita la focalización universal en términos de universalidad del donante con ausencia de GvHD garantizada, y además facilita la focalización de células TcRap.+ y CD3+ positivas sin autodestrucción a través de la focalización de CAR.

En otra realización de la invención, las células inmunes expresan el CAR anti-LLE que se describe en este documento y, además, suprimen o han sido eliminadas de moléculas accesorias que pueden ser receptores de señalización asociados con puntos de control, agotamiento o apoptosis, así como ligandos como PD-1, LAG-3, TIGIT, CTLA-4, FAS-L y F^a S-R, además, la desactivación de C^d4 o CD8 en células CAR anti-LLE permitiría la focalización transitoria de células CD4 o CD8 que podrían ser una opción atractiva para el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como enfermedad de injerto contra hospedante, rechazo de órganos sólidos, enfermedad autoinmune primaria: autoinmunidad asociada a células T y B (artritis reumatoide, enfermedades intestinales inflamatorias crónicas, esclerosis múltiple, miastenia grave y otras).

Como se mencionó anteriormente, el CAR anti-LLE que se describe en el presente documento puede expresarse en una célula, como una célula inmune, para dirigirse a un antígeno de una célula cancerosa para tratar el cáncer. Los tipos de cáncer que pueden tratarse incluyen tumores que no están vascularizados, o que aún no están sustancialmente vascularizados, así como tumores vascularizados. Los tipos de cáncer pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, por ejemplo, leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores sólidos. Los tipos de cáncer que se van a tratar con el sistema CAR como se describe en este documento incluyen, entre otros, carcinoma, blastoma y sarcoma, y ciertas leucemias o neoplasias linfoides, tumores benignos y malignos, y neoplasias, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. También se incluyen los tumores/cánceres de adultos y los tumores/cánceres pediátricos.

Los ejemplos de cánceres hematológicos incluyen leucemias, incluidas leucemias agudas (como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblastos, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (como leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia mieloide crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.

Los tumores sólidos son masas anormales de tejido que generalmente no contienen quistes ni áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Los diferentes tipos de tumores sólidos reciben el nombre del tipo de células que los forman (como sarcomas, carcinomas y linfomas). Los ejemplos de tumores sólidos, como sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, neoplasia maligna linfoide, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitomas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga, melanoma y tumores del SNC (como un glioma (como glioma del tronco encefálico y gliomas mixtos), glioblastoma (también glioblastoma multiforme) astrocitoma, linfoma del SNC, germinoma, meduloblastoma, craneofaringioma schwannoma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neurinoma del acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebrales).

El CAR anti-LLE que se describe en el presente documento puede expresarse en una célula inmune para dirigirse a un antígeno asociado con un virus, bacteria, parásito u otra infección con el fin de tratar la infección.

El CAR anti-LLE CAR que se describe en el presente documento puede expresarse en una célula, como una célula inmune, para dirigirse a un autoantígeno para tratar un trastorno autoinmunitario.

Sin embargo, el sistema CAR como se describe en este documento no debe interpretarse como limitado únicamente a las dianas de antígenos y enfermedades descritas en este documento. Más bien, debe interpretarse que incluye cualquier diana antigénica que esté asociada con un trastorno en el que un sistema CAR descrito en el presente documento pueda usarse para tratar el trastorno.

Ejemplos

Ejemplo 1. Generación de células T CAR anti-LLE

1.1 Generación de una biblioteca de construcciones de vectores de transferencia lentivíricos que codifican diferentes variantes espaciadoras del CAR anti-LLE

Con el fin de generar CAR anti-LLE que reconocen biotina, así como partes del resto enlazador que conecta la biotina con el anticuerpo que reconoce el epítopo de la célula diana, se diseñó un scFv (fragmento variable monocatenario) basado en cadenas variable pesada (VH) y variable ligera. (VL) del anticuerpo anti-bioMB (SEQ ID NO: 1 y 2) en orientación VH-VL y VL-VH. Las cadenas variables estaban conectadas por un enlazador flexible (G4S)3 (SEQ ID NO: 4), y la secuencia líder de CD8 humana (SEQ ID NO: 3) se colocó N-terminal del scFv. Las secuencias se optimizaron para la expresión en células hospedantes humanas y se sintetizaron mediante ADN2.0 con sitios de corte BamHI y NheI flanqueando 5 'y 3' de la secuencia scFv, respectivamente. Estos scFv se subclonaron en plásmidos de vector de transferencia que contenían diferentes variantes espaciadoras basadas en IgG4 humana (HC) y tallo de CD8 humano, un elemento 2A así como un marcador de expresión (LNGFR) (Figura 2). El ADN plasmídico se amplificó en E. coli NEB5alfa y se preparó usando el kit Qiagen EndoFree Plasmid Maxi de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todas las secuencias se verificaron mediante secuenciación de Sanger (GATC).

1.2 Generación de partículas de LV

Para la producción de partículas lentivíricas, se sembraron 0,5 x 105/cm2 células HEK293T en un matraz de cultivo celular T175 (175 cm2) usando 25 ml de medio (DMEM, 10% (v/v) FCS, L-glutamina 2 mM) y se incubó durante la noche a 37 ° C, 5% CO2. Al día siguiente, las células adherentes mostraron típicamente una confluencia del 75 al 90%. El medio se cambió a DMEM con L-glutamina 2 mM, sin FCS y se prepararon mezclas de ADN de transfección (usando Lipofectamine 3000, protocolo de reactivo ThermoFisher). Para esto, se usó una cantidad total de ADN de 0,2 gg/cm2 (35 gg para un matraz T175) y se prepararon dos mezclas separadas A (ADN) y B (Lipofectamine). Para la mezcla A: plásmido de vector de transferencia 0,073 gg/cm2 (12,7 gg), plásmido auxiliar 1 (VSVg) 0,018 gg/cm2 (3,18 gg), plásmido auxiliar 2 (gag/rev/pol) 0,109 gg/cm2 (19,09 gg), reactivo potenciador P3000 2 gl/gg de ADN total y Opti-MEM 0,033 ml/cm2 se mezclaron mediante una breve agitación con vórtice. Para la mezcla B: Lipofectamine 3000 0,75 gl/cm2 se resuspendió en Opti-MEM 0,033 ml/cm2. Las mezclas A y B se incubaron por separado durante 5 minutos, luego las mezclas A y B se mezclaron juntas suavemente y se incubaron 20 minutos a TA. A continuación, se añadieron gota a gota los complejos de lípido/ADN a las células en placa y se incubaron a 37°C durante aproximadamente 12 horas. Después de esto, el medio se reemplazó con 0,133 ml/cm2 medio fresco (DMEM, FCS al 10%, L-glutamina 2 mM) y se incubó a 37 ° C, 5% CO2 durante 24 horas. Las partículas lentivíricas ensambladas se recolectaron eliminando cuidadosamente el sobrenadante del cultivo celular con pipeta. Los restos celulares se eliminaron del sobrenadante mediante centrifugación durante 10 min a 5000xg. El sobrenadante que contenía LV se usó luego directamente para la transducción de células T, se almacenó durante la noche a 4 ° C o se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 ° C. Para una segunda ronda de producción de partículas lentivíricas se añadió 0,133 ml/cm2 medio fresco (DMEM, FCS al 10%, L-glutamina 2 mM) a las células HEK293T transfectadas y se continuó la incubación durante otras 24 horas a 37 ° C, 5% CO2. Después de 24 h, se recogió el sobrenadante como se describió anteriormente.

1.3 Análisis de transducción, expansión y expresión de células T CAR anti-LLE

Se extrajeron muestras de sangre de donantes sanos y se generaron PBMC mediante separación en Biocoll (Biochrom). Se seleccionaron células T CD4+ y se seleccionaron utilizando tecnología MACS (Miltenyi Biotec). Para la activación y expansión de células T, se utilizó el kit de activación/expansión de células T, humano (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células T se sembraron en placas de 24 pocillos con 2 ml de suspensión de células T por pocillo a una concentración de 1x106 células/ml en medio TexMACS que contiene suero AB humano (10% (v/v) GemCell), IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (5 ng/ml).

La transducción se realizó el día 2 después de la activación. Para ello, se añadió sobrenadante de LV a las células T a una MOI de 3, y las células se resuspendieron cuidadosamente con pipeta. El día 8 después de la activación, las células que expresan LNGFR se separaron mediante MACS utilizando microperlas anti-LNGFR en una columna LS (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células seleccionadas se reactivaron utilizando el kit de activación/expansión de células T, humano (Miltenyi Biotec) y se sembraron en una placa de 24 pocillos a una concentración de 1x106 células/ml (2 ml por pocillo). A continuación, las células se expandieron continuamente y se determinó la eficiencia de transducción el día 14 después de su primera activación mediante análisis FACS. Para esto, se extrajo una alícuota y se tiñó para la expresión de LNGFR usando APC anti-LNGFR (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (FIG 3).

Ejemplo 2. Generación de TCBM

La modificación de anticuerpos mediante etiquetado aleatorio por ésteres de succinimidilo en grupos amino se realizó de acuerdo con protocolos conocidos en la técnica. Para la modificación, los anticuerpos se volvieron a tamponar en tampón PEB pasando sobre una columna Sephadex G25 equilibrada en tampón. Las fracciones recolectadas se ensayaron para determinar el contenido de proteínas usando el ensayo de Bradford. Se combinaron las fracciones que contenían proteínas y se determinó el volumen total. La concentración de proteína final se midió mediante absorción a 280 nm. Posteriormente, la cantidad correspondiente de Biotina-LC-LC-NHS (ThermoFisher Scientific, pm 567,70 g/mol, Cat. No. 21343, CAS No. 89889-52-1) se disolvió en DMSO. El anticuerpo y la mezcla de DMSO/marcador se incubó a temperatura ambiente (21°C) durante 1 hora y luego se pasó por una columna Sephadex G25. De nuevo se recogieron las fracciones, se ensayó la concentración de proteína y se combinaron las fracciones que contenían proteína. La concentración de proteína final se midió mediante absorción a 280 nm. El éxito de la biotinilación se confirmó mediante la incubación de la línea celular de anticuerpos que expresa el anticuerpo diana y la tinción secundaria con un anticuerpo anti-biotina conjugado con fluorocromo, seguido de análisis FACS. Además, se utilizó el ensayo HABA para la determinación del número de moléculas de biotina por anticuerpo.

Ejemplo 3. Generación de líneas celulares diana para análisis de citotoxicidad

3.1 Generación de líneas celulares que expresan luciferasa establemente transducidas

La generación de partículas de LV fue similar según 1.2. El protocolo de transducción de células tumorales fue similar al descrito para las células T (descritas en 1.3). El plásmido de vector de transferencia utilizado pCDH-EF-eFFly-T2A-mCherry y pCDH-EF-eFFly-T2A-GFP fue proporcionado generosamente por Helmholtz Zentrum München (Centro Alemán de Investigación para la Salud Ambiental, por el departamento de vectores genéticos, Dr. Binje Vick y PD Dra. Med. Irmela Jeremias). Después de la transducción, las células tumorales se ampliaron y la eficiencia de la transducción se evaluó mediante citometría de flujo (láser de 488 nm de excitación de GFP, filtro de paso de banda 525/50 nm; láser de 561 nm de excitación de mCherry, filtro de paso de banda 615/20 nm). Las células se enriquecieron mediante clasificación de células FACS para la población media-alta (GFP/mCherry), se descartaron los subconjuntos de células negativas, positivas bajas y positivas altas. Las líneas de células tumorales medio-altas (GFP/mCherry) se volvieron a ampliar, se evaluaron para determinar la fluorescencia (GFP/mCherry), se criopreservaron y se utilizaron para análisis funcionales. Las siguientes líneas celulares se transdujeron de manera estable con pCDH-EF-eFFly-T2A-mCherry y/o pCDH-EF-eFFly-T2A-GFP: NALM-6 y NALM-16, que son líneas celulares de leucemia precursoras de células B, MOLT14 positivas para T^cP^yó y JURKAT positivas para TcRap, que son ambas líneas celulares de leucemia linfoblástica aguda de células T, así como LS y LAN-1 que son ambas líneas celulares de neuroblastoma.

3.2 Generación de transfectante MCF-7 que expresa CD19 truncado

La línea celular de carcinoma mamario adherente MCF-7 (Michigan Cancer Foundation - 7) se transfectó de manera estable mediante electroporación en medio IMDM (medio de Dulbecco modificado de Iscove, ThermoFisher Scientific) en hielo mediante la transfección de construcciones de ADN CD19 truncadas linealizadas. La electroporación se realizó a un voltaje de 200 V y 975 pF con una constante de tiempo entre 40 y 80. Para la selección, se utilizó el antibiótico G418 (Geneticin, InvivoGen) a 1 mg/ml. A través de la clasificación de células basada en FACS que expresan de manera homogénea MCF-7 con expresión de tCD19 media-alta, se aislaron y ampliaron para criopreservación y análisis funcional.

Ejemplo 4. Ensayo de destrucción basado en un dispositivo con análisis de células en tiempo real (RTCA) xCELLigence

4.1 Cultivo de LS para xCELLigence

• 3 días de cultivo (óptimo)

• 5866 células/cm2 -> frasco de cultivo celular medio (75 cm2) ajustado a 0,44x10e6 células en 15 ml de medio ml o frasco de cultivo celular grande (175 cm2) ajustado a 1x10e6/ml en 35 ml de medio.

• Se utilizan células solo en una confluencia del 60 y el 80%

Cosecha y siembra:

a) Se desecha el medio de cultivo (RPMI 1640, FCS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, L-glutamina al 5%) b) Se añaden 3 ml de tripsina/EDTA por cm2 de un matraz T175 y se incuba durante 2 minutos

c) Se añaden 8 ml para el medio completo, se dispensan cuidadosamente las células y se centrifuga a 300 g durante 5 minutos

d) Se recogen las células en 10 ml de medio fresco y se cuentan con una disolución de azul tripán.

e) Se siembran las células según el protocolo xCELLigence

4.2 Protocolo de ensayo de destrucción xCELLigence

Día 0:

• ExpNotes: ponga nombre al experimento y guárdelo bajo el administrador de designación (directorio de datos) • Diseño: ponga nombre a los pocillos

• Programación: agregue el paso 1 (una vez) para la calibración (ajuste automático), agregue el paso 2 (intervalo 30 min (15 minutos), tiempo de medición completo 48 h (100 h)

Calibración del dispositivo RTCA:

• Llene el medio 50 pl/pocillo, coloque la placa en el dispositivo de medición y presione el botón de inicio para comenzar la calibración. Retire la placa cuando termine la medición ("Listo para el siguiente paso") Objetivos:

• Ajuste LS (cultivado durante tres días antes) a 0,15 x 10E6/ml

• siembre células tumorales a 15000 células/pocillo en 100 pl

• añada 100 pl de medio/pocillo

• Vuelva a colocar la placa en el dispositivo de medición y presionar el botón de inicio

• Anote la hora de inicio

Día 1:

Después de 24 horas, el índice celular está entre 1-3. Presione el botón de parada y retire la placa del dispositivo de medición para continuar el experimento. Si el índice celular es inferior a 1, deseche el experimento.

Pipetee en 30 minutos:

a) Extraiga con cuidado 100 pl de medio (el volumen restante es 100 pl)

b) Agregue células efectoras en un volumen de 50 pl

c) Agregue mAb en un volumen de 50 pl

d) Volumen total en todos los pocillos: 200 pl (llenar con medio en condición sin mAb)

Coloque la placa en el dispositivo de medición y continúe con la adquisición de datos.

Controles obligatorios:

• Fondo: medio solamente por 4 pocillos /- mAb

• Diana solamente por 4 pocillos /- mAb

Ejemplo 5. Ensayo de destrucción basado en luciferasa

5.1 Fondo

La D-luciferina es el sustrato de la reacción de bioluminiscencia de luciferasa de luciérnaga. Se correlaciona linealmente con la viabilidad e inversamente con la muerte de la célula diana.

5.2 Preparación de alícuotas de D-Luciferina

a) Disuelva 10 mg de D-Luciferina (sintética, Sigma Aldrich, No de catálogo: L9504 10MG) en 1 ml de DMSO, para alcanzar la concentración de 10 mg/ml.

b) Añada 24 ml de DMSO ^ concentración de 0,4 mg/ml

c) Prepare alícuotas de 55 pl (10% de volumen extra)

d) Almacene a -20 ° C

5.2.1 Uso

a) Tome 50 pl de una alícuota de 55 pl y agregue 5 ml de medio usado en el experimento (CAVE: para experimentos con plasma humano use solo RPMI, sin FCS) ^ Dilución 1: 100 ^ concentración de 0,004 pg/pl = 4 pg/ml b) si el volumen de pipeteo es 50 pl y el volumen final en cada pocillo es 200 pl

^ dilución 1: 4, la concentración final es 1 pg/ml

5.3 Materiales, células, reactivos e instrumentos

a) Líneas celulares diana positivas para luciferasa de luciérnaga transducidas de forma estable

b) Células efectoras

c) Medio RPMI, Merck-Millipore, No de catálogo: F1215-500 ml

d) Placas blancas de fondo plano, Greiner bio one, No de catálogo: 655083

e) D-luciferina sintética, No de catálogo: L9504, Sigma Aldrich

f) ADVIA 120 Siemens Bayer (recuento de células)

g) Lector de microplacas Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2 (lector de placas)

5.4 Procedimiento

a) Preparación de las células diana: (cálculos para una placa)

Las células diana se cuentan con ADVIA para el ensayo. Se toman células 10E06 del stock celular, se centrifugan a 300 g durante 10 minutos, se retira el sobrenadante por completo y se ajusta el número de células a 0,1*10Células E6/50 pl.

Para garantizar una baja desviación pocillo por pocillo, las columnas 1 y 12 se utilizan como control al 100%, solo células tumorales. Además, la valoración de bioluminiscencia del 100%, 75%, 50%, 25%, 10% y 0% de las células diana se utiliza para calcular la fórmula de lisis en Excel mediante el cálculo de la línea de tendencia lineal.

b) Preparación de células efectoras

Las células efectoras se cuentan con ADVIA y se añaden en 50 pl de medio.

c) El anticuerpo se agrega en las condiciones correspondientes a concentraciones predefinidas en 50 pl de medio. d) Se añade D-luciferina de acuerdo con la "Preparación de las alícuotas de D-luciferina"

e) Se colocan las placas en la incubadora a 37 ° C, 5% CO2.

f) Se mide la bioluminiscencia a las 6, 12, 24 y 48 horas.

g) Configuración del instrumento: adquisición de bioluminiscencia, 37 ° C, lector VICTOR Wallac

Ejemplo 6. Tinción de citocinas intracelulares (ICS)

6.1 Tampón/reactivos

• PBS-EDTA: 500 ml de PBS, EDTA 2 mM (2 ml cuando tiene una concentración de 5 M)

• Tampón FACS: 500 ml de PBS, 2% FCS (10 ml), EDTA 2 mM (2 ml cuando tiene una concentración de 5 M), 0,02% de NaAzid (1 ml cuando tiene una concentración del 10%)

PermWash: 500 ml de PBS, 0,1% de saponina-S7900 (0,5 g), 0,05% de BSA A-3059 (2,5 g), 0,02% de NaAzid (1 ml cuando tiene una concentración del 10%)

Brefeldin A Sigma (1: 125) Y/O Monensin, por ejemplo GolgiStop

Se sugiere brefeldin para tinción de citocinas intracelulares, Monensin para CD107a

Coloración viva/muerta: Invitrogen

Cytofix/Cytoperm: BD

Anticuerpos de interés

placa de fondo redondo de 96 pocillos

.2 Procedimiento

Utilice cada segundo pocillo para evitar la contaminación durante el procedimiento de lavado

Volumen total de incubación 200 gl

Tiempo de incubación 16 horas.

Inicio del experimento: Agregue 50 gl de Brefeldin A en cada pocillo.

Necesario para la compensación: Células sin teñir (exactamente las mismas que se usaron en el experimento). Se tratan de la misma forma durante el ensayo, pero no se tiñen.

Tinción 1-3

Preparación 30 minutos antes de comenzar:

• Enfriar la centrífuga a 4 ° C

• Preparar tampones

• Obtener hielo para almacenar las placas en hielo

• Producir la disolución de tinción viva/muerta: 50 gl/pocillo, Aqua 1:400

Después del tiempo de incubación

• placa de centrífuga (1800 rpm, 2 min, 4 ° C)

• lavar con 200 gl de PBSE (1800 rpm, 2 min, 4 ° C)

• lavar con 200 gl de PBSE (1800 rpm, 2 min, 4 ° C)

a) Agregue 50 gl/pocillo de disolución viva/muerta y resuspenda las células (condición sin teñir) Tiempo de incubación 20 minutos a 4 ° C (oscuridad)

Durante este tiempo: produzca la mezcla maestra extracelular (en tampón FACS), todo junto en un solo falcon Después del tiempo de incubación de la disolución L/D:

■ Añada 150 gl de tampón FACS (1800 rpm, 2 min, 4 ° C)

■ Lave con 200 gl de tampón FACS (1800 rpm, 2 min, 4 ° C)

b) Agregue 50 gl/pocillo de mezcla maestra extracelular y resuspenda las células (ni sin teñir ni en condición de isotipo)

Tiempo de incubación 20 minutos a 4 ° C (oscuridad)

Después del tiempo de incubación:

■ Agregue 150 gL de tampón FACS (1800 rpm, 2 min, 4 ° C)

■ Lavado con 200 gL de tampón FACS (1800 rpm, 2 min, 4 ° C)

■ Agregue 100 gL/pocillo de Cytofix/Cytoperm y resuspenda

Tiempo de incubación 20 minutos a 4 ° C (oscuridad)

Durante este tiempo: produzca la mezcla maestra intracelular (en PermWash), todo junto en un solo falcon Después del tiempo de incubación (Cytofix/Cytoperm):

■ Agregue 100 gl/pocillo PermWash (1800 rpm, 2 min, 4 ° C)

■ Lavado con 200 gl PermWash (1800 rpm, 2 min, 4 ° C)

c) Agregue 50 gl/pocillo de Mastermix intracelular y resuspenda (no sin teñir)

Tiempo de incubación 20 minutos a 4 ° C (oscuridad)

Durante este tiempo: produzca una disolución de PFA (siempre una nueva, no la guarde), tampón FACS paraformaldehído al 1%, concentración de stock 37%, 200 gl/pocillo

Después del tiempo de incubación (IZ):

■ Agregue 150 gl de PermWash (1800 rpm, 4 ° C, 2 min)

■ Lavado con 200 gl de PermWash (1800 rpm, 2 min, 4 ° C)

■ Lavado con 200 gl de PermWash (1800 rpm, 2 min, 4 ° C)

■ Agregue 200 gl/pocillo de PFA y resuspenda

Almacenar a 4-8 ° C hasta el análisis FACS

Ejemplo 7. Generación de células CAR anti-LLE TcRap- que utilizan tecnología CRISPR/Cas9

Se generaron células CAR+ anti-LLE+ TcRap a partir de células CART anti-LLE (SEQ ID NO: 11), de acuerdo con el protocolo presentado anteriormente. La desactivación de la cadena TcRap se logró mediante tecnología CRISPR/Cas9 basada en ARNm utilizando el sistema de transfección Neon® (electroporación). Las células CART anti-LLE altamente purificadas se enriquecieron con la tecnología MACS para la generación de células CART anti-LLE U2.

7.1 Electroporación de células CAR T usando el sistema de transfección Neon®

Materiales/Tecnología:

a) Se generaron células CART anti-LLE (SEQ ID NO: 11) como se presenta en 1.3.

b) Medios de cultivo de células CART (TexMACS, suero humano al 10%, 10 ng/ml IL7, 5 ng/ml IL15)

c) DPBS - Disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco

d) ARNg modificado personalizado (las secuencias de ARN guía para la desactivación de TCR se han descrito en la bibliografía y deben ser accesibles para los expertos en la técnica)

e) El ARNm de Cas9 se adquirió de tebu-bio, No de catálogo: L-6125-100

f) Kit de 10 gl del sistema de transfección Neon®, ThermoFisher Scientific, n.o de catálogo: MPK1025

• Tampón electrolítico E

• Tampón de resuspensión T

• 10 gl puntas Neon®

• Tubos de electroporación Neon®

Concentración de stock por 1E06 células cantidad utilizada

ARNm de Cas9 1000 ng/gl 5 gg

ARNgs 5000 ng/gl 25 gg

Procedimiento:

a) Transferir células T CAR 2E06 (SEQ ID NO: 11) en tubos de microcentrífuga

b) Lavar las células T CAR (SEQ ID NO: 11) 3 veces con 1 ml de tampón PBS en microcentrífuga a 800 g, 5 min y eliminar el sobrenadante cautelosamente

Utilizar los reactivos enumerados:

Control sin ARNgs con ARNgs

Tampón T 100 gl 90 gl

ARNm de Cas9 10 gl 10 gl

ARNgs 0 gl 10 gl

Volumen total 110 gl 110 gl

a) Llene el tubo de electroporación con tampón E (3 ml)

b) Cargue el programa

c) Utilice una punta de electroporación de 100 gl y tome 100 gl de la muestra correspondiente para cada electroporación.

d) Calibre el dispositivo de electroporación Neon con 100 gl de tampón T

e) Continúe con la electroporación de la muestra si se aprueba la autocomprobación OK (Correcta), sin errores Ajustes de electroporación: voltaje 1.400, pulso con 10, pulso número 3, tipo de punta 100 gl

f) Para cada electroporación, coloque la pipeta de electroporación en el tubo de electroporación

g) Inicie el proceso de electroporación

h) Después de la electroporación, retire inmediatamente la pipeta Neon® y transfiera las muestras de la punta Neon® de 10 gl a un medio de cultivo de células T CAR precalentado de 900 gl.

La detección de la desactivación exitosa se realiza mediante citometría de flujo y prueba T7 (Ejemplo 8).

Ejemplo 8. Análisis funcional de células T modificadas con CAR anti-LLE

Las células T se enriquecieron a partir de PBMC, se activaron y se transdujeron in vitro utilizando los vectores lentivíricos que codifican las construcciones indicadas. Las diferentes células T CAR anti-LLE se cocultivaron luego con células tumorales (NALM6) en una relación de 1 a 1. El anticuerpo anti-CD19 biotinilado se agregó al cultivo en una dosis determinada o no se agregó (control negativo). A continuación, se midió la citotoxicidad causada por las células T CAR anti-LLE y las células T CAR CD19. (FIG 4). Las células T CAR que expresan el CAR codificado por SEQ ID NO: 11 mostraron el mayor efecto citotóxico, comparable a las células T CAR anti-CD19 (control positivo). Los resultados representan la media de cuatro experimentos independientes realizados por triplicado de cuatro donantes diferentes. Los resultados se confirmaron mediante un ensayo de citotoxicidad en tiempo real (RTCA xCELLigence) y diferentes líneas de células tumorales. Las células T CAR anti-LLE exhibieron citotoxicidad contra las células LS en presencia de anticuerpo anti-GD2 biotinilado (FIG 5B) de nuevo con el CAR codificado por SEQ ID NO: 11 dando la respuesta citotóxica más potente. Además, las células T CAR anti-LLE exhibieron citotoxicidad contra células MCF-tCD19 en presencia de anticuerpo anti-CD 19 biotinilado (FIG 5D). La titulación de mAb para diferentes antígenos asociados a tumores, p. ej., CD19 y GD2 demostró una actividad de TCAR anti-LLE favorable en el intervalo de concentración de mAb marcado específico de diana de 100 pg/ml-10 gg/ml (FIG 6A y B). Esta dosis es considerablemente más baja que las dosis de anticuerpos necesarias para una aplicación terapéutica eficaz in vivo. En el ensayo clínico "CH14.18 1021 Antibody and IL2 After Haplo SCT in Children with Relapsed Neuroblastoma " registrado en clinicaltrials.gov (NCT02258815), el mAb anti-GD2 CH14.18 se administra con 20 mg/m2 en cinco días consecutivos, lo que da como resultado concentraciones séricas de mAb elevadas por encima de 20 gg/ml (datos no publicados, reclutamiento del estudio). En consecuencia, se están observando altas concentraciones de mAb en nuestro uso compasivo individual de pacientes con el tratamiento con mAb anti-CD19 quimérico optimizado con Fc (4G7SDIE) en pacientes con LLA de precursores de linaje B de alto riesgo. 4G7SDIE se aplica con 20 mg/m2 cada 2 semanas. De hecho, después de la infusión de anticuerpos anti-CD19 in vivo, se ha descrito que se pueden detectar niveles de 60-90 gg/ml en la sangre (MolTher.2016, PMID: 27380762). Una titulación de efector a diana mostró una correlación lineal (FIG 7A y B).

Además, las células T CAR anti-LLE exhibieron una baja citotoxicidad contra las células diana tumorales en

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende

a) un receptor de antígeno quimérico de epítopo anti-enlazador/marcador (anti-LLE CAR) que comprende

I) un dominio de unión extracelular al epítopo enlazador/marcador (LLE) extracelular,

II) un dominio transmembrana, y

III) un dominio de transducción de señales,

en donde dicho dominio de unión a LLE extracelular se une a una molécula de unión a células diana (TCBM), b) en donde dicha molécula de unión a células diana (TCBM) comprende

i) un resto de unión a antígeno (ABM), en el que dicho ABM se une específicamente a un antígeno expresado en una célula diana,

ii) un resto marcador (LaM), en el que dicho LaM es una molécula de origen natural en un sujeto o su derivado, en donde dicha molécula de origen natural está en el sistema circulatorio de dicho sujeto,

iii) un resto enlazador (LiM) que conjuga dicho ABM y dicho LaM, formando así un epítopo enlazador/marcador (LLE), en el que dicho LiM se selecciona del grupo que consiste en péptidos, cadenas de alquilo, ácidos alcanoicos, ácidos carboxílicos, farnesilos, polietilenglicoles, o un derivado de estos,

en donde dicho dominio de unión a LLE extracelular se une a dicho LLE con una preferencia mayor que dicha molécula de origen natural, en donde dicho dominio de unión a LLE extracelular se une con una afinidad al menos 10 veces mayor por dicho LLE que a dicha molécula de origen natural.

2. La composición según la reivindicación 1, en la que el valor k(off) para la unión entre dicho dominio de unión a LLE extracelular es mayor para un LLE monomérico y dicha molécula de origen natural que para un LLE multimérico.

3. La composición según la reivindicación 1 o 2, en la que dicho LLE se genera de forma específica del sitio, formando así un epítopo que comprende una parte de dicho LaM y una parte de dicho LiM.

4. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho LaM se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos, péptidos, creatinina, biotina, biocitina, hormonas, vitaminas o sus un derivado de estos.

5. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho LiM es una molécula capaz de generar dicho LLE.

6. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho LaM es biotina o su derivado y dicho LiM es un resto 6-(6-aminohexanamido) hexanoílo o un resto 6-aminohexanoílo.

7. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho dominio de unión a LLE extracelular comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

8. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho antígeno que está unido por dicho ABM se expresa en la superficie de una célula cancerosa.

9. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicho antígeno se selecciona del grupo que consiste en CD33 (Siglec-3), CD123 (IL3RA), CD135 (FLT-3), CD44 (HCAM), CD44V6, CD47, CD184 (CXCR4), CLEC12A (CLL1), LeY, FRp, MICA/B, CD305 (LAIR-1), CD366 (TIM-3), CD96 (TACTILE), CD133, CD56, CD29 (ITGB1), CD44 (HCAM), CD47 (IAP), CD66 (CEA), CD112 (Nectina2), CD117 (c-Kit), CD133, CD146 (MCAM), CD155 (PVR), CD171 (L1CAM), CD221 (IGF1), CD227 (MUC1), CD243 (MRD1), CD246 (ALK), CD271 (LNGFR), CD19, CD20, GD2 y EGFR.

10. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicho ABM es un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno.

11. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicho CAR anti-LLE comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11, y en la que dicho dominio de unión a LLE extracelular se une a un resto 6-[6-(biotinamido) hexanamido] hexanoílo.

12. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicho CAR anti-LLE se expresa en una célula T, célula NK, célula NKT, célula T gamma/delta, célula Treg o célula madre.