ES2890777T3

ES2890777T3 - Agonistas de TLR7 y/o TLR8 para el tratamiento de infecciones bacterianas en pacientes que padecen cirrosis

Info

Publication number: ES2890777T3
Application number: ES16738073T
Authority: ES
Inventors: Axel Perianin; Loïc Rolas
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique; Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale; Universite de Paris
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique; Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale; Université Paris Cité
Priority date: 2015-05-12
Filing date: 2016-05-12
Publication date: 2022-01-24
Anticipated expiration: 2036-05-12
Also published as: JP6785248B2; JP2018515516A; EP3294295B1; US20180140597A1; US10201536B2; WO2016180945A1; EP3294295A1

Abstract

Agonista de TLR7/8 para su uso en el tratamiento de infección bacteriana en un paciente que padece cirrosis.

Description

DESCRIPCIÓN

Agonistas de TLR7 y/o TLR8 para el tratamiento de infecciones bacterianas en pacientes que padecen cirrosis Campo

La presente divulgación se encuentra en el ámbito de la medicina, en particular de la hepatología y la bacteriología.

Antecedentes

La cirrosis es una enfermedad crónica del hígado cuya prevalencia aumentará drásticamente durante la próxima década. La cirrosis puede ser el resultado de varias hepatopatías crónicas, tales como hepatopatía alcohólica, hepatitis viral crónica, esteatohepatitis no alcohólica, enfermedades autoinmunitarias del hígado (cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria y hepatitis autoinmunitaria). La cirrosis progresa a lo largo de varios años. La aparición de complicaciones indica la transición a la fase denominada “descompensada” (aproximadamente 100.000 pacientes al año en Francia); estas complicaciones incluyen ascitis (30.000 pacientes al año en Francia), hemorragias gastrointestinales (10.000 episodios/año en Francia), insuficiencia renal e infecciones bacterianas, que son muy frecuentes y, a menudo, se deben a la translocación de bacterias intestinales Gram-negativas.

Las especies reactivas del oxígeno (ROS) producidas por los leucocitos polimorfonucleares (PMN), los monocitos o los macrófagos, denominadas estallido respiratorio (RB) o estrés oxidativo (OS), desempeñan un papel fundamental en los sistemas antimicrobianos de defensa del huésped. La enzima responsable del RB fagocítico, la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa 2 (NOX2), es un complejo multiproteico de membrana cuya activación requiere la fosforilación y translocación a la membrana de componentes citosólicos, entre los cuales la p47phox (phox: fagocito oxidasa) desempeña un papel importante. Una producción deficiente de ROS favorece la susceptibilidad de los pacientes a las infecciones microbianas. La cirrosis es un ejemplo típico en el que la producción inadecuada de ROS induce tanto daño tisular como susceptibilidad del paciente a las infecciones. Una complicación habitual de la cirrosis es, de hecho, el desarrollo de septicemia, una de las principales causas de muerte, que se asocia con el deterioro del RB de los PMN, la actividad microbicida y la fagocitosis. Anteriormente se demostró que los neutrófilos de pacientes que padecen cirrosis alcohólica avanzada mostraban una grave deficiencia en la producción de superóxido inducida por el péptido bacteriano f-Met-Leu-Phe (fMLP), que se asociaba con un deterioro de la señalización intracelular (Rolas L et al, Hepatology, 2013). Más concretamente, se dio a conocer recientemente que los neutrófilos de los pacientes también eran deficientes en la expresión de Gp91phox determinada mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western (Rolas et al., 1 st Meeting of the Neutrophil Club, 10 de abril de 2015, París). Estos datos pueden explicar, en parte, la mayor susceptibilidad de los pacientes a las infecciones bacterianas y, por tanto, no hacen creíble el uso de agonistas de TLR7/8 para el tratamiento de las infecciones bacterianas en pacientes que padecen cirrosis, a pesar de que tales compuestos inducen la hiperactivación de la NADPH oxidasa mediante la estimulación de la fosforilación de p47phox en sitios selectivos en neutrófilos humanos sanos (Makni-Maalej et al. J. Immunol. 2012).

El documento US20120128715 da a conocer un método para vacunar a un recién nacido, que comprende seleccionar un recién nacido y administrar, a dicho recién nacido, una cantidad eficaz de un compuesto o agente que es un agonista del receptor tipo Toll 8 (TLR8) y un antígeno vacunal, en el que dicho agonista potencia la respuesta inmunitaria del recién nacido a dicho antígeno vacunal.

El documento WO2015011254 da a conocer un agonista del receptor tipo Toll (TLR) para su uso en un método para el tratamiento de una infección bacteriana en un sujeto que lo necesita, en el que el agonista de TLR se administra al sujeto en combinación con al menos un antibiótico.

Jalan, Rajiv, et al. informan de una revisión exhaustiva y una declaración de postura sobre las infecciones bacterianas en la cirrosis (Jalan, Rajiv, et al. “Bacterial infections in cirrhosis: a position statement based on the EASL Special Conference 2013”. Journal of hepatology 60.6 (2014): 1310-1324).

Sumario de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones. En particular, la presente invención se refiere a un agonista de TLR7/8 para su uso en el tratamiento de infección bacteriana en un paciente que padece cirrosis. Descripción detallada

Los inventores demuestran sorprendentemente que el tratamiento de los neutrófilos de los pacientes con un agonista permeable a las células de los receptores tipo Toll 7/8 (TLR7/8) aumentó el nivel de ARNm de Gp91phox y restableció la expresión de la enzima. Más sorprendentemente, los inventores demuestran que la producción de ROS inducida por dichos compuestos se eleva a un nivel similar al de los neutrófilos de un donante sano. Por consiguiente, a pesar de las observaciones de que se demostró que los agonistas de TLR7/8 inducen la hiperactivación de la NADPH oxidasa en los neutrófilos humanos (Makni-Maalej et al, J. Immunol.

2012), los efectos supresores observados con dichos compuestos en neutrófilos de pacientes que padecen cirrosis no pudieron fluir de manera evidente a partir del estado de la técnica, especialmente en el contexto en el que se dio a conocer que la expresión de la enzima seleccionada como diana era deficiente (Rolas et al, 1 st Meeting of the Neutrophil Club, 10 de abril de 2015, París).

Los inventores también demostraron que el agotamiento de NOX2 por proteólisis se producía en neutrófilos sanos tratados con elastasa, o estimulados con el formilpéptido fMet-Leu-Phe, de manera dependiente de la elastasa. Además, el plasma de los pacientes, pero no el de los controles, disminuyó la expresión y la actividad de NOX2 de los neutrófilos de manera dependiente de la elastasa. La NOX2 es ampliamente degradada por la elastasa extracelular y sus rutas de síntesis deficientes en los neutrófilos de pacientes cirróticos contribuyen a su agotamiento, lo que puede aumentar la susceptibilidad de los pacientes a las infecciones.

Por consiguiente, el primer objeto dado a conocer en el presente documento se refiere a un método de tratamiento de infección bacteriana en un paciente que padece cirrosis, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de TLR7/8.

En particular, los pacientes que padecen cirrosis incluyen normalmente pacientes que padecen cirrosis hepática alcohólica o cirrosis vírica o metabólica. La cirrosis puede ser el resultado de varias hepatopatías crónicas, tales como hepatopatía alcohólica, hepatitis viral crónica, esteatohepatitis no alcohólica, enfermedades autoinmunitarias del hígado (cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria y hepatitis autoinmunitaria). Los pacientes que padecen cirrosis hepática, preferiblemente en la fase de inicio o desarrollo de la cirrosis descompensada, están especialmente interesados en el método dado a conocer en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “tratamiento” o “tratar” se refieren tanto al tratamiento profiláctico o preventivo como al tratamiento curativo o modificador de la enfermedad, incluyendo el tratamiento de sujetos con riesgo de contraer la enfermedad o que se sospecha que la han contraído, así como de sujetos que están enfermos o a los que se les ha diagnosticado una enfermedad o un estado médico, e incluye la supresión de la recaída clínica. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que padezca un trastorno médico o que, en última instancia, pueda adquirirlo, con el fin de prevenir, curar, retrasar la aparición, reducir la gravedad o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o un trastorno recurrente, o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento. Por “pauta terapéutica” se entiende el patrón de tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, el patrón de dosificación usado durante la terapia. Una pauta terapéutica puede incluir una pauta de inducción y una pauta de mantenimiento. La expresión “pauta de inducción” o “periodo de inducción” se refiere a una pauta terapéutica (o la parte de una pauta terapéutica) que se usa para el tratamiento inicial de una enfermedad. El objetivo general de una pauta de inducción es proporcionar un alto nivel de fármaco a un sujeto durante el periodo inicial de una pauta de tratamiento. Una pauta de inducción puede emplear (en parte o en su totalidad) una “pauta de carga”, que puede incluir la administración de una dosis mayor del fármaco que la que un médico emplearía durante una pauta de mantenimiento, la administración de un fármaco con mayor frecuencia que la que un médico administraría durante una pauta de mantenimiento, o ambas. La expresión “pauta de mantenimiento” o “periodo de mantenimiento” se refiere a una pauta terapéutica (o la parte de una pauta terapéutica) que se usa para el mantenimiento de un sujeto durante el tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, para mantener al sujeto en remisión durante largos periodos de tiempo (meses o años). Una pauta de mantenimiento puede emplear una terapia continua (por ejemplo, la administración de un fármaco a intervalos regulares, por ejemplo, semanales, mensuales, anuales, etc.) o una terapia intermitente (por ejemplo, un tratamiento interrumpido, un tratamiento intermitente, un tratamiento en caso de recaída o un tratamiento al alcanzar un criterio predeterminado particular [por ejemplo, la manifestación de la enfermedad, etc.]).

En particular, el método dado a conocer en el presente documento es particularmente adecuado para el tratamiento de peritonitis bacteriana en un paciente que padece cirrosis.

Tal como se usa en el presente documento, el término “peritonitis bacteriana” tiene su significado general en la técnica y se refiere a una inflamación de la membrana peritoneal provocada por una infección bacteriana. La peritonitis bacteriana puede clasificarse como primaria, secundaria o terciaria. En la peritonitis primaria (también denominada peritonitis bacteriana espontánea), el origen de la infección no procede del tracto gastrointestinal y no existe una alteración anatómica identificable de las vísceras intraabdominales. La peritonitis primaria suele estar provocada por una hepatopatía crónica, tal como cirrosis. En cambio, la peritonitis secundaria se debe a una infección de las vísceras abdominales y puede surgir como consecuencia de una perforación, necrosis isquémica o una lesión penetrante. La peritonitis terciaria se define como una peritonitis que persiste o reaparece después de más de un procedimiento fallido de control de la fuente, y es muy frecuente en pacientes que requieren ingreso en la unidad de cuidados intensivos por infecciones abdominales graves.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones “agonista de TLR7” y “agonista de TLR8” se refieren a compuestos que se unen a TLR7 o TLR8 y los activan, respectivamente. Los términos “activación” y “estimulación” se usan de manera intercambiable. “Agonista de TLR7 y/o TLR8” o “agonista de TLR7/8” se refiere a una molécula que es agonista de TLR7 solamente, de TLR8 solamente o tanto de TLR7 como de TLR8.

Los agonistas de TLR7 y/o TLR8 son bien conocidos en la técnica (Waleed M Hussein, Tzu-Yu Liu, Mariusz Skwarczynski, Istvan Toth. Toll-like receptor agonists: a patent review (2011 - 2013) Expert Opinion on Therapeutic Patents; abril de 2014, vol. 24, n.° 4, páginas 453-470: 453-470). Además, los métodos para identificar agonistas de TRL7 o agonistas de TLR8 son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO2004/075865 (3M Innovative Properties Company).

Se han identificado agonistas naturales de TLR7 y TLR8 tales como ARNmc ricos en guanosina y uridina (Diebold, Science 2004, Heil Science, 2004).

Normalmente, los agonistas de TLR7 incluyen, pero no se limitan a: moléculas similares a la imidazoquinolina, imiquimod, resiquimod, gardiquimod, S-27609; y análogos de guanosina tales como loxoribina (7-alil-7,8-dihidro-8-oxo-guanosina), 7-tia-8-oxoguanosina y 7-desazaguanosina, UC-1V150, ANA975 (Anadys Pharmaceuticals), SM-360320 (Sumimoto), 3M-01 y 3M-03 (3M Pharmaceuticals) (véanse, por ejemplo, Gorden et al., J Immunology, 2005; Schon, Oncogene, 2008; Wu et al., PNAS 2007). Los agonistas de TLR7 incluyen compuestos de imidazoquinolina; análogos de guanosina; compuestos de pirimidinona tales como bropirimina y análogos de bropirimina; y similares. Los compuestos de imidazoquinolina que actúan como ligandos de TLR7 incluyen, pero no se limitan a, imiquimod (también conocido como Aldara, R-837, S-26308) y R-848 (también conocido como resiquimod, S-28463; que tiene la estructura química 4-amino-2-etoximetil-a ,a-dimetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-etanol). Los agentes de imidazoquinolina adecuados incluyen aminas de imidazoquinolina, aminas de imidazopiridina, aminas de cicloalquilimidazopiridina fusionadas en 6,7 y aminas de imidazoquinolina en puente en 1,2. Estos compuestos se han descrito en las patentes estadounidenses 4.689.338, 4.929.624, 5.238.944, 5.266.575, 5.268.376, 5.346.905, 5.352.784, 5.389.640, 5.395.937, 5.494.916, 5.482.936, 5.525.612, 6.039.969 y 6.110.929. Las especies particulares de agentes de imidazoquinolina que son adecuados para su uso en un método objeto incluyen R-848 (S-28463); 4-amino-2-etoximetil-a,a-dimetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-s-i-etanol; y 1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (R-837 o imiquimod). También es adecuado el compuesto 4-amino-2-(etoximetil)-a ,a-dimetil-6,7,8,9-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-etanol hidratado (véase, por ejemplo, BM-003 en Gorden et al. (2005). Los análogos de guanosina que actúan como ligandos de TLR7 incluyen determinados ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos de guanina sustituidos en C8 y sustituidos en N7,C8, incluyendo, pero sin limitarse a, loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina), 7-tia-8-oxo-guanosina (TOG), 7-desazaguanosina y 7-desazadesoxiguanosina (Lee et al, 2003). La bropirimina (PNU-54461), una 5-halo-6-fenil-pirimidinona, y los análogos de bropirimina se describen en la bibliografía y también son adecuados para su uso. Véase, por ejemplo, Vroegop et al. (1999). Los ejemplos adicionales de guanosinas sustituidas en C8 adecuadas incluyen, pero no se limitan, a 8-mercaptoguanosina, 8-bromoguanosina, 8-metilguanosina, 8-oxo-7,8-dihidroguanosina, C8-arilamino-2'-desoxiguanosina, C8-propinilguanosina, ribonucleósidos de guanina sustituida en C8 y N7, tales como 7-alil-8-oxoguanosina (loxoribina) y 7-metil-8-oxoguanosina, 8-aminoguanosina, 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina y 8-hidroxiguanosina. Los agonistas selectivos de TLR7 también incluyen los mostrados en la publicación de patente estadounidense 2004/0171086. Los agonistas adicionales de TLR7 adecuados incluyen, pero no se limitan a, 2-(etoximetil)-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (patente estadounidense 5.389.640); 2-metil-1-[2-(3-piridin-3-ilpropoxi)etil]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (documento WO 02/46193); N-(2-{2-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etoxi}etil-etil-N-metilciclohexanocarboxamida (publicación de patente estadounidense 2004/0171086); 1-[2-(benciloxi)etil]-2-metil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (documento WO 02/46189); N-{8-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]octil}-N-fenilurea (publicación de patente estadounidense 2004/0171086 (IRM5)); 2-butil-1-[5-(metilsulfonil)pentil]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (documento WO 02/46192); N-{3-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]propil}-4-metilbencenosulfonamida (patente estadounidense 6.331.539); y N-[4-(4-amino-2-etil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il)butil]ciclohexanocarboxamidacarboxamida (publicación de patente estadounidense 2004/0171086 (IRM8)). También es adecuado para su uso el agonista selectivo de TLR7 N-[4-(4-amino-2-etil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il)butil-]metanosulfonamida.

Por ejemplo, los agonistas de TLR8 incluyen, pero no se limitan a, los compuestos mostrados en la publicación de patente estadounidense n.° 2004/0171086, que incluyen N-{4-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]butil}quinolin-3-carboxamida, N-{4-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]butil}quinoxolin-2-carboxamida y N-[4-(4-amino-2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il)butil]morfolin-4-carboxamida. Otros agonistas selectivos de TLR8 adecuados incluyen, pero no se limitan a, 2-propiltiazolo[4,5-c]quinolin-4-amina (patente estadounidense 6.110.929); N1-[2-(4-amino-2-butil-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridin-1-il)etil]-2-amino-4-metilpentanamida (patente estadounidense 6.194.425); N1-[4-(4-amino-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il)butil]-2-fenoxi-benzamida (patente estadounidense 6.451.810); N1-[2-(4-amino-2-butil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il)etil]-1-propanosulfonamida (patente estadounidense 6.331.539); N-{2-[2-(4-amino-2-etil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-1 -il)etoxi]etil}-N'-fenilurea (publicación de patente estadounidense 2004/0171086); 1-{4-[3,5-diclorofenil)tio]butil}-2-etil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (publicación de patente estadounidense 2004/0171086); N-{2-[4-amino-2-(etoximetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etil}-N'-(3-cianofenil)urea (documento WO 00/76518 y publicación de patente estadounidense n.° 2004/0171086); y 4-amino-a ,a-dimetil-2-metoxietil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-etanol (patente estadounidense 5.389.640). Se incluyen para su uso como agonistas selectivos de TLR8 los compuestos de la publicación de patente estadounidense n.° 2004/0171086. También es adecuado para su uso el compuesto 2-propiltiazolo-[4,5-c]quinolin-4-amina.

Los ejemplos específicos de agonistas de TLR7/8 dados a conocer en el presente documentos incluyen:

En particular, el agonista de TLR7/8 dado a conocer en el presente documento es R848. Por “R848” se entiende un compuesto de imidazoquinolina con la estructura anteriormente descrita.

En particular, el agonista de TLR7/8 dado a conocer en el presente documento se incorpora en una partícula apropiada para la ingestión por los neutrófilos. Por consiguiente, las dimensiones de la partícula (por ejemplo, el diámetro) se seleccionan para fomentar la fagocitosis de las partículas por los neutrófilos. En particular, la presente divulgación proporciona una población de partículas en las que se incorpora el agonista de TLR7/8 dado a conocer en el presente documento y en las que al menos el 50% de las partículas tienen un tamaño apropiado para la ingestión por los neutrófilos. En particular, el tamaño deseado oscila entre ±10%, ±20%, ±30%, ±40% o ±50% de un valor dado. El valor puede ser, por ejemplo, de 20 nm, 100 nm, 500 nm, 1, 5, 10, 20, 50 micrómetros, etc. Las partículas dadas a conocer en el presente documento pueden resultar de cualquier composición. Normalmente, las partículas comprenden proteínas desnaturalizadas (por ejemplo, albúmina sérica humana (Benacerraf et al., 1957 Brit. J. Exp. Path, 38:35)), materiales insolubles (por ejemplo, negro de carbón, sílice, dióxido de silicio, poliestireno, látex), óxidos metálicos (por ejemplo, óxidos de titanio, óxidos de hierro) y tinta china (es decir, suspensión de partículas de carbono coloidales) (descrita en Reichard y Filkins, 1984, The Reticuloendothelial System; A Comprehensive Treatise, págs. 73-101 (Plenum Press), y referencias en la misma), hidrogeles, (por ejemplo, tal como se describe en la publicación de patente estadounidense n.° 20050191361), perlas de Sepharose o agarosa o micropartículas. En particular, las partículas se forman a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(a-hidroxiácido) tal como poli(lactida-co-glicolida), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.). Las partículas dadas a conocer en el presente documento pueden comprender glóbulos rojos (RBC) que se han purgado del citoplasma, conocidos como RBC “fantasma”, bacterias (ya que las bacterias son eliminadas por el RES; véase, por ejemplo Benacerraf y Miescher, 1960, Ann NY Acad Sci, 88:184-195), fragmentos celulares, liposomas, bacteriófagos, fragmentos de bacteriófagos y cápsides virales desprovistas de los ácidos nucleicos virales (por ejemplo, partículas de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B), etc.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico (por ejemplo, tratar una infección bacteriana). En el contexto de las aplicaciones terapéuticas o profilácticas, la cantidad de una composición administrada al sujeto dependerá del tipo y de la gravedad de la enfermedad y de las características del individuo, tales como la salud general, la edad, el sexo, el peso corporal y la tolerancia a los fármacos. También dependerá del grado, de la gravedad y del tipo de enfermedad. El experto podrá determinar las dosificaciones adecuadas dependiendo de estos y otros factores. En particular, una cantidad eficaz de agonista de TLR7/8 para lograr un efecto terapéutico o profiláctico oscila entre aproximadamente 0,000001 mg por kilogramo de peso corporal al día y aproximadamente 10.000 mg por kilogramo de peso corporal al día. Normalmente, los intervalos de dosificación van desde aproximadamente 0,0001 mg por kilogramo de peso corporal al día hasta aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal al día. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal cada día, cada dos días o cada tres días, o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg cada semana, cada dos semanas o cada tres semanas. En particular, una dosificación única de péptido oscila entre 0,1-10.000 microgramos por kg de peso corporal. En particular, las concentraciones de péptidos catiónicos aromáticos en un portador oscilan entre 0,2 y 2000 microgramos por mililitro administrado.

Normalmente, el agonista de TLR7/8 dado a conocer en el presente documento se combina con excipientes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, con matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones farmacéuticas. “Farmacéuticamente” o “farmacéuticamente aceptable” se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o de otro tipo cuando se administran a un mamífero, especialmente a un ser humano, según sea apropiado. Un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a una carga sólida, semisólida o líquida no tóxica, un diluyente, un material de encapsulación o una sustancia auxiliar de formulación de cualquier tipo. La composición farmacéutica es compatible con cualquier vía de administración (oral, inyección...). Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos, que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que puede inyectarse. Puede tratarse, en particular, de soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato de monosodio o disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares, o mezclas de tales sales), o de composiciones secas, especialmente liofilizadas, que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o de solución salina fisiológica, permiten la constitución de disoluciones inyectables. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de tener una fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Las disoluciones inyectables estériles se preparan incorporando el agonista de TLR7 y/o TLR8 en la cantidad requerida en el disolvente adecuado con varios de los otros componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los demás componentes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado a vacío y de liofilización que producen un polvo del principio activo más cualquier componente adicional deseado a partir de una disolución previamente filtrada del mismo.

En particular, el agonista de TLR7/8 dado a conocer en el presente documento se administra simultáneamente con un antibiótico. En particular, el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en aminoglicósidos, betalactámicos, quinolonas o fluoroquinolonas, macrólidos, sulfonamidas, sulfametaxozoles, tetraciclinas, estreptograminas, oxazolidinonas (tales como linezolid), rifamicinas, glicopéptidos, polimixinas, antibióticos lipopeptídicos. Normalmente, los betalactámicos incluyen 2-(3-alanil)clavam, 2-hidroximetilclavam, 7-metoxicefalosporina, epi-tienamicina, acetil-tienamicina, amoxicilina, apalcilina, aspoxicilina, azidocilina, azlocilina, aztreonam, bacampicilina, blapenem, carbenicilina, carfecilina, carindacilina, carpetimicina A y B, cefacetril, cefaclor, cefadroxil, cefalexina, cefaloglicina, cefaloridina, cefalotina, cefamandol, cefapirina, cefatrizina, cefazedona, cefazolina, cefbuperazona, cefcapeno, cefdinir, cefditoreno, cefepima, cefetamet, cefixima, cefinenoxima, cefinetazol, cefminox, cefmolexina, cefodizima, cefonicid, cefoperazona, ceforamida, cefoselis, cefotaxima, cefotetán, cefotiam, cefoxitina, cefozoprán, cefpiramida, cefpiroma, cefpodoxima, cefprozil, cefquinoma, cefradina, cefroxadina, cefsulodina, ceftazidima, cefteram, ceftezol, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefuroxima, cefalosporina C, cefamicina A, cefamicina C, cefalotina, quitinovorina A, quitinovorina B, quitinovorina C, ciclacilina, clometocilina, cloxacilina, cicloserina, desoxipluracidomicina B y C, dicloxacilina, dihidropluracidomicina C, epicilina, epitienamicina D, E y F, ertapenem, faropenem, flomoxef, flucloxacilina, hetacilina, imipenem, lenampicilina, loracarbef, mecilinam, meropenem, metampicilina, meticilina (también denominada meticilina), mezlocilina, moxalactam, nafcilina, nortienamicina, oxacilina, panipenem, penamecilina, penicilina G, N y V, feneticilina, piperacilina, povampicilina, pivcefalexina, povmecilinam, pivmecilinam, pluracidomicina B, C y D, propicilina, sarmoxicilina, sulbactam, sultamicilina, talampicilina, temocilina, terconazol, tienamicina y ticarcilina. Normalmente, las quinolonas incluyen ácido nalidíxico, cinoxacina, ácido oxolínico, flumequina, ácido pipemídico, rosoxacina, norfloxacina, lomefloxacina, ofloxacina, enrofloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, amifloxacina, fleroxacina, gatifloxacina, gemifloxacina, clinafloxacina, sitafloxacina, pefloxacina, rufloxacina, esparfloxacina, temafloxacina, tosufloxacina, grepafloxacina, levofloxacina, moxifloxacina y trovafloxacina.

En un aspecto adicional, el método dado a conocer en el presente documento comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del agonista de TLR7/8 en combinación con un inhibidor de elastasa. Tal como se usa en el presente documento, el término “elastasa” tiene su significado general en la técnica y se refiere a la elastasa de neutrófilos, una serina proteasa producida por los neutrófilos (Distelhorst et al., 1987; Edwards y Bernstein, 1994; Groutas et al., 2011; Aikawa y Kawasaki, 2014).

Tal como se usa en el presente documento, el término “inhibidor de elastasa” tiene su significado general en la técnica y se refiere a cualquier compuesto que puede inhibir la actividad de la elastasa y que bloquea o inactiva selectivamente la elastasa. Tal como se usa en el presente documento, el término “bloquea o inactiva selectivamente” se refiere a un compuesto que se une preferiblemente a la elastasa y la bloquea o inactiva con una mayor afinidad y potencia, respectivamente, que su interacción con los otros subtipos o isoformas de la familia de las serina proteasas. Se contemplan compuestos que prefieren la elastasa, pero que también pueden bloquear o inactivar otros subtipos de serina proteasas, como inhibidores parciales o totales. El “inhibidor de la actividad de la elastasa” se refiere a los compuestos que bloquean la interacción de la elastasa con sus proteínas diana. El término “inhibidor de elastasa” también se refiere a un compuesto que inhibe la expresión de la elastasa. Normalmente, un compuesto inhibidor de elastasa es una molécula orgánica pequeña, un polipéptido, un aptámero, un anticuerpo, un intraanticuerpo, un oligonucleótido o una ribozima.

Las pruebas y los ensayos para determinar si un compuesto es un inhibidor de elastasa son bien conocidos por el experto en la técnica, tales como los descritos en Edwards y Bernstein, 1994; documentos EP 0.643.075; US 2005/0265946.

Los inhibidores de elastasa son bien conocidos en la técnica, tal como ilustran Edwards y Bernstein, 1994; Groutas et al., 2011; Aikawa y Kawasaki, 2014; Alam et al., 2012; documentos EP 0.643.075; y US 2005/0265946.

En particular, los inhibidores de elastasa incluyen, pero no se limitan a, inhibidor de elastasa de neutrófilos MeOSuc-AAPV-CMK (NEI); sivelestat; elafina; a1-antitripsina (a1-PI); inhibidor de proteasa leucocitaria secretora (SLPI); depelstat (DX-890); y ONO-6818.

En particular, los inhibidores de elastasa incluyen, pero no se limitan a, inhibidores basados en péptidos (inhibidores peptídicos no basados en mecanismos, inhibidores de isósteros de aminoácidos de PI, derivados carbonílicos electrófilos, ácidos borónicos y monohalometil cetonas); inhibidores heterocíclicos, tales como los inhibidores heterocíclicos activados por enzimas (halo enol lactonas, inenol lactonas, isocumarinas, p-lactamas, succinimidas), y agentes de acilación heterocíclicos (pironas, benzoxazinonas y heterociclos relacionados, y benzoisotiazolinas); agentes acilantes/alquilantes no heterocíclicos (agentes organofosforados y organosulfurados, isocianatos y agentes acilantes de ésteres) tal como los descritos en Edwards y Bernstein, 1994.

En particular, los inhibidores de elastasa incluyen, pero no se limitan a:

Inhibidores del estado de transición, tales como:

Inhibidores de sustrato alternativos, tales como:

Agentes carbamilantes; inhibidores basados en el mecanismo; inhibidores competitivos reversibles, tales como: 1,4-diarilpirimidopiridazinildionas;

4-(4-cianofenil)-1-(3-trifluorometilfenil)-3,4,6,7-tetrahidro-1 H-pirrolo[3,4-d]pirimidin-2,5-dionas; y los compuestos descritos en Groutas et al., 2011, tales como:

En particular, el agonista de TLR7/8 se administra de manera secuencia o simultánea con el inhibidor de elastasa.

La presente divulgación se ilustrará mediante las siguientes figuras y los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y estas figuras no deben interpretarse en modo alguno como una limitación del alcance de la presente divulgación.

Figuras

Figura 1: los neutrófilos de pacientes que padecen cirrosis alcohólica avanzada mostraron una producción y señalización de ROS inducida por fMLP alteradas. Panel A: los PMN de voluntarios sanos (control) y de pacientes cirróticos se estimularon con el péptido bacteriano fMet-Leu-Phe (fMLP) a diversas concentraciones (25-1000 nM) y se cuantificó la producción de superóxido y se expresó en nmoles/106 células (n=16, *: P<0,05). Panel B: los PMN se estimularon con fMLP (1 ^M) durante 75 s. La forma fosforilada activa de p38 MAPK y p47phox(S345) se detectó mediante experimentos de inmunotransferencia de tipo Western y se expresó como porcentaje de los valores de control obtenidos con fMLP (n=4). Panel C: los PMN (106 células/ml) se trataron en ausencia o en presencia de rapamicina 10 nM durante 15 min antes de la estimulación con fMLP (1 ^M). Los datos representan la media de la producción de superóxido ± EEM (n=8, *: P<0,05) (Datos publicados en Rolas L. et al, Hepatology 2013).

Figura 2. Expresión deficiente de la NADPH oxidasa generadora de superóxido Gp91phox en neutrófilos de pacientes que padecen cirrosis alcohólica avanzada. La expresión de Gp91phox de los neutrófilos de donantes sanos (control) y de pacientes que padecen cirrosis alcohólica avanzada se determinó mediante experimentos de inmunotransferencia de tipo Western (panel A) y a nivel de ARNm (panel C). Se cuantificó la expresión de la proteína y el ARNm (panel B, C) y se expresó como porcentaje ± EEM de los valores de control (n=12 en cada grupo, *: P<0,05, prueba estadística de Mann-Whitney).

Figura 3. El agonista de TLR7/8 CL097 estimuló la producción y síntesis de ARN de Gp91phox en neutrófilos de pacientes que padecen cirrosis alcohólica avanzada. Los neutrófilos de pacientes cirróticos se trataron en ausencia (tampón) o en presencia de CL097 (2,5 ^g/ml) durante 30 min a 37°C y se cuantificó la cantidad de ARNm de Gp91phox y se expresó como porcentaje del control (tampón) (panel A, n=6, *: P<0,05). La expresión de Gp91phox se determinó mediante ensayos de inmunotransferencia de tipo Western y se expresó como porcentaje ± EEM de la de los neutrófilos de donantes sanos (panel B, n=4, *: P<0,05).

Figura 4. El agonista de TLR7/8 CL097 restableció la producción de superóxido en neutrófilos de pacientes que padecen cirrosis alcohólica avanzada. Los neutrófilos de donantes sanos y de pacientes que padecen cirrosis alcohólica avanzada se trataron durante 15 min con el agonista de TLR7/8 (2,5 |ig/ml) y después con PBS o fMLP 1 |iM. Los resultados representan la media de la producción de superóxido ± EEM expresada en nmoles/106 células (n=8, *: P<0,05).

Figura 5. El agonista de TLR7/8 CL097 restableció la producción de especies reactivas del oxígeno por parte de neutrófilos purificados y en sangre completa de los pacientes. La producción de ROS se midió mediante el ensayo de quimioluminiscencia potenciado con luminol, de alta sensibilidad, con neutrófilos purificados (0,5x106 células/450 |il de solución salina equilibrada de Hanks, panel A) y con sangre completa (20 |il en 450 |il de PBS que contiene calcio 0,120 mM, panel B) de pacientes que padecen cirrosis alcohólica avanzada. Las células se trataron durante 15 min con el agonista de TLR7/8 solo (tampón) y luego con fMLP 1 |iM (panel A). Los resultados representan el pico de respuesta de quimioluminiscencia expresada en cpm (media ± EEM de 8 experimentos).

Figura 6. El agonista de TLR7/8 R848 es más potente que CL097 en mejorar la producción de ROS en sangre completa de donantes sanos y de pacientes cirróticos. La sangre completa (20 |il) de donantes sanos (panel A) y de pacientes cirróticos (panel B) se trató en 450 |il de PBS que contenía calcio 0,120 mM), en ausencia (control) y en presencia de R848 o CL097 (0,25-5 |ig /ml) durante 15 min. A continuación, se estimularon las células con fMLP 1 |iM. Los resultados representan el pico de respuesta de quimioluminiscencia inducida por fMLP y se expresan en cpm (media ± EEM de 4-6, *: P<0,05).

Figura. 7. Deterioro de la actividad bactericida de los neutrófilos de pacientes cirróticos y efectos beneficiosos del agonista de TLR7/8 CL097. (A) Los neutrófilos de voluntarios sanos (control) y de pacientes cirróticos se incubaron con E. coli durante 5 min, luego se trataron o no (tampón) con fMLP (1 |iM) durante 25 min. (B, C): los neutrófilos incubados con bacterias se trataron sin (PBS) y con CL097 (1 |ig/ml) durante 2 min antes de la estimulación con fMLP durante 23 min. Las células se lisaron y se determinó el número de colonias bacterianas y se expresó como porcentaje del de las células en reposo de control (A, n=6), o % del de las células en reposo (PBS) en ambas poblaciones celulares (B, C, n=6); *P<0,05 (Datos publicados en Boussif A et al, J Hepatol.

201664:1041-8. doi: 10.1016/j.jhep. 2015.12.005. Epub, 21 de diciembre de 2015).

Figura 8. La elastasa induce la degradación de gp91phox y p22phox en PMN sanos. (A y B) Análisis de inmunotransferencia de tipo Western y cuantificación densitométrica de gp91phox y p22phox en PMN sanos tratados en ausencia o en presencia de elastasa a 0,1 y 0,5 unidades durante 1 hora. (C y D) Cuantificación densitométrica por análisis de inmunotransferencia de tipo Western de gp91phox y p21phox en PMN sanos tratados en ausencia o en presencia de inhibidor de elastasa (NEI) a 100 |iM durante 15 min antes de la estimulación con fMLP (1 |iM) durante 45 min. (E) Cuantificación densitométrica por análisis de inmunotransferencia de tipo Western de gp91phox en PMN sanos tratados previamente en ausencia o en presencia de inhibidor de elastasa (NEI) a 100 |iM durante 15 min antes de la incubación durante 45 min con un sobrenadante de desgranulación libre de células obtenido a partir de PMN estimulados con fMLP (1 |iM, 2 min). Las transferencias son representativas de 4 experimentos y los análisis densitométricos son acumulativos y se expresan como porcentaje del nivel de actina. Una diferencia significativa entre los valores medios ± EEM se indica por *P<0,05 y **P<0,01. (F) Sensogramas de la unión y disociación específicas de los PMN para el anticuerpo anti-gp91phox (7D5) recubierto en el chip de sensor CM3, analizados con Biacore X100, en función del tiempo. Se inyectaron tres grupos de PMN (103 células en 150 |il de PBS); PMN de control y PMN tratados con elastasa (0,5 unidades) o con un sobrenadante de desgranulación libre de células. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes y se expresan como unidad de resonancia (UR). (G) Cuantificación por citometría de flujo de la expresión de Gp91phox en la superficie de PMN tratados o no (control) con 0,5 unidades de elastasa a 4°C. Los datos representan el índice de fluorescencia medio (IFM) expresado como porcentaje ± EEM de los valores de control (n=3).

Figura 9. El plasma de pacientes cirróticos reduce la expresión de gp91phox en la superficie de los PMN sanos y la producción de ROS de manera sensible a NEI. Los PMN se trataron previamente durante 12 h a 37°C con RPMI (control) o con plasma de voluntarios sanos o de pacientes cirróticos (25% de plasma en 1 ml de RPMI que contenía 5x106 PMN) o bien en ausencia o bien en presencia de inhibidor de elastasa NEI (100 |iM). Los PMN se marcaron con el anticuerpo anti-gp91phox acoplado a FITC. (A) Cuantificación del número de células positivas marcadas con el anticuerpo anti-gp91phox acoplado a FITC (7D5) mediante citometría de flujo, expresado como porcentaje de los valores de control. (B) El panel derecho muestra los valores de IFM (media ± EEM) expresados como porcentaje de los valores de control (n=5 experimentos independientes). (C, D) Transcurso temporal de la producción de superóxido inducida por PMA por PMN sanos que se trataron previamente durante 12 h en ausencia (tampón/RPMI) o en presencia de plasma de voluntarios sanos y de pacientes cirróticos, o bien con o bien sin NEI 100 |iM. (E) Producción de superóxido expresada como porcentaje de los valores de control (media ± EEM, n=5). Una diferencia significativa entre los valores medios se indica por * P<0,05 y **P<0,01.

Figura 10. El plasma de pacientes que padecen cirrosis hepática alcohólica contiene una mayor cantidad de elastasa que los controles. (A) Se desnaturalizaron alícuotas de 5 |il de plasma (equivalente a 10 |ig de proteínas) en 450 |il de tampón Laemmli IX. Se realizaron SDS-PAGE con 100 |il de muestra. (B) Análisis densitométrico y cuantificación de la elastasa, y expresión en relación con 80 |ig de elastasa porcina que se sometió a inmunotransferencia de tipo Western en los mismos geles, como referencia (no mostrado). Las barras representan la media ± EEM obtenida con el plasma de 10 pacientes. Una diferencia significativa entre los grupos de valores medios se indica por **P<0,01. La ausencia de señal de p47phox indica que la elastasa presente en el plasma no procede de neutrófilos intactos o necróticos (datos no mostrados).

Figura 11. El tratamiento in vivo de ratas cirróticas con R848 revierte la producción deficiente de ROS en sangre completa. Se ligó el conducto biliar común (BDL) de ratas hembra Wistar bajo anestesia general (10 mg de Avertin, i.p.) cerca del hilio del hígado, inmediatamente por debajo de la bifurcación, tal como se describió previamente (Mohammadi et al, Liver Int. 2009, 29(5):692-700). Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en condiciones estériles. La sangre se recogió en tubos Eppendorf (aproximadamente 0,5 ml en EDTA 10 mM) con una aguja hipodérmica de 1 pulgada insertada en el vaso en la superficie ventral media de la cola. Los glóbulos blancos se contaron con un contador analizador MS9-5V (Melet Schloesing Laboratories). En el día 21, las ratas cirróticas BDL se trataron con R848 (2,2 mg/kg) tal como se informó (McCluskie MJ et al, Antiviral Res. 69:77-85, 2006). Las ratas de control no se trataron. Se midió la producción de especies reactivas del oxígeno en sangre completa en el día indicado. Brevemente, la producción de ROS se registró de manera continua en un bioluminómetro termostático (Berthold LB940) usando 3 volúmenes de sangre (0,9, 1,8 y 3,75 |il) incubados a 37°C en 0,5 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) que contenía luminol 10 |iM. Las células se trataron con citocalasina B (0,25 |ig/ml) durante 5-10 min, luego se estimularon con el péptido bacteriano fMet-Leu-he (fMLP, 1 |iM). La producción de ROS representa el pico de la respuesta de quimioluminiscencia en la sangre completa. Se proporciona una respuesta de perfil típica de ratas representativas para el día indicado (media de determinaciones por triplicado ± EEM) expresada en cpm por equivalente de 2000 PMN de sangre. Se obtuvieron respuestas de perfil similares con un total de 6 ratas BDL y 5 ratas de control no tratadas (simulación).

Ejemplos

EJEMPLO 1: utilidad de los agonistas de TLR7/8 CL097 y R848 para restablecer la actividad de la NADPH oxidasa de los neutrófilos de pacientes inmunodeprimidos que padecen cirrosis alcohólica avanzada

El citocromo b de la NADPH oxidasa (Gp91phox) de los fagocitos humanos es un importante efector terminal de la membrana plasmática del sistema microbicida generador de superóxido. Anteriormente se demostró que los neutrófilos de pacientes que padecen cirrosis alcohólica avanzada mostraban una producción deficiente grave de superóxido inducida por el péptido bacteriano f-Met-Leu-Phe (fMLP) que se asociaba con una señalización deteriorada (Rolas L et al, Hepatology, 2013). Estos datos pueden explicar, en parte, la mayor susceptibilidad de los pacientes a las infecciones bacterianas.

En este caso se demostró que los neutrófilos de los pacientes también presentaban una expresión deficiente de Gp91phox, determinada mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western (figura 2A y B), mientras que el nivel de ARNm de Gp91phox no estaba significativamente alterado (figura 2C). Curiosamente, el tratamiento de los neutrófilos de los pacientes con un agonista permeable a las células de los receptores tipo Toll 7/8 (TLR7/8), CL097 (2,5 |ig/ml, 30 min), aumentó el nivel de ARNm de Gp91phox (figura 3A) y restableció la expresión de Gp91phox (figura 3B). Para determinar si este tratamiento mejora la actividad de la NADPH oxidasa, se midió la producción de superóxido (02-°) mediante el ensayo de reducción específica del citocromo C, después de la estimulación celular con el péptido bacteriano fMLP. Sorprendentemente, en los neutrófilos de los pacientes (figura 4), CL097 potenció la producción de superóxido inducida por fMLP hasta un nivel similar al de los neutrófilos de donantes sanos (figura 4), mientras que CL097 aumentó adicionalmente la producción óptima de superóxido de los neutrófilos sanos (figura 4). Con una técnica más sensible para cuantificar las especies reactivas del oxígeno (ROS), tal como el ensayo de biloluminiscencia amplificada con luminol, se encontró que CL097 por sí solo estimulaba una débil producción de ROS y se confirmó su capacidad para potenciar fuertemente la producción de ROS inducida por fMLP por los neutrófilos de los pacientes (figura 5A). De manera prometedora, estas propiedades originales de CL097 también se observaron en un modelo de producción de ROS en sangre completa de pacientes (figura 5B). Por último, entre otros agonistas de TLR7/8 de la misma familia, R848 fue más potente que CL097 en mejorar la producción de ROS en sangre completa de pacientes cirróticos (figura 6B) y de donantes sanos (figura 6A).

En conclusión, el agonista de TLR7/8 CL097 estimula la síntesis de Gp91phox en los neutrófilos y potencia la producción de ROS inducida por el péptido bacteriano fMLP, proporcionando protección contra la producción deficiente grave de ROS mediada por la cirrosis alcohólica avanzada. Por tanto, los agonistas de TLR7/8, tales como CL097 y R848, pueden ser útiles para mejorar las respuestas antimicrobianas de defensa del huésped de los pacientes inmunodeprimidos.

Los estudios se desarrollan con un modelo de rata de cirrosis inducida por la ligadura del conducto biliar (BDL) (Mohammadi et al, 2009) tratada con un análogo de CL097, R848, ampliamente usado en los ensayos clínicos. Los inventores proporcionaron la primera indicación de que la administración parenteral de R848 también revirtió la producción deficiente de ROS en sangre completa inducida por la cirrosis (figura 11).

EJEMPLO 2: deterioro de la actividad bactericida de los neutrófilos de los pacientes y efectos beneficiosos de CL097.

Los neutrófilos de control incubados con E. coli indujeron una destrucción bacteriana significativa (25-30%) tras la estimulación con fMLP, a diferencia de los neutrófilos de los pacientes que no respondieron al tratamiento (figura 7A). Curiosamente, CL097 por sí solo indujo una destrucción bacteriana significativa por los neutrófilos tanto de los controles como de los pacientes cirróticos (figuras 7B y C). CL097 también potenció fuertemente la destrucción bacteriana inducida por fMLP por los neutrófilos de los pacientes mientras que se observó un aumento no significativo con los neutrófilos de control (datos publicados por Boussif A et al, J Hepatol. 2016 64:1041-8. doi: 10.1016/j.jhep.2015.12.005. Epub, 21 de diciembre de 2015, y comentado por Louvet A., J. Hepatol, 64:1006-7, 2016). Así, la activación de TLR7/8 puede proporcionar efectos beneficiosos sobre las actividades de defensa del huésped de los neutrófilos en pacientes que padecen cirrosis.

EJEMPLO 3:

Un papel importante de la elastasa en la mediación de la degradación de NOX2 en los PMN.

Para identificar las proteasas potencialmente implicadas en la degradación de NOX2, la secuencia de gp91phox se sometió a un análisis in silico usando la base de datos MEROPS (Rawlings et al. 2014) y herramientas informáticas para predecir las proteasas que pueden escindir sustratos seleccionados (Venkatraman et al. 2009). Entre los cinco candidatos detectados, la elastasa fue la única proteasa de neutrófilos identificada. Para examinar su posible contribución en la degradación de gp91phox, se usó un primer enfoque incubando PMN sanos durante 1 h a 37°C con elastasa purificada a 0,1 y 0,5 unidades que proporcionó una actividad proteolítica similar a la encontrada en el sobrenadante de desgranulación (datos no mostrados). Este tratamiento provocó la degradación de gp91phox en aproximadamente un 50% (figura 8A) con un aumento simultáneo de los fragmentos inmunorreactivos de gp91phox (datos no mostrados). Se observó una degradación de p22phox con la elastasa a 0,5 unidades (figura 8B). Así, la elastasa de neutrófilos parece desempeñar un papel crucial en la degradación de gp91phox y p22phox inducida por fMLP. Esto se ve respaldado por la observación de que el inhibidor de elastasa de neutrófilos MeOSuc-AAPV-CMK (comúnmente denominado NEI) impidió el agotamiento de ambos componentes inducido por fMLP (figuras 8C y D). Para determinar adicionalmente si el proceso de degradación de gp91phox en los PMN se inicia extracelularmente, se incubó un sobrenadante libre de células de PMN en desgranulación con un nuevo lote de PMN en reposo. Este tratamiento también agotó la gp91phox, aumentando la cantidad de fragmentos de gp91phox (figura 8E). La observación de que el tratamiento previo de los PMN con NEI bloquea la degradación de gp91phox respalda el papel de la elastasa en este efecto.

Para conocer mejor las porciones externas de gp91phox potencialmente implicadas en el proceso de degradación, se aprovechó el anticuerpo 7D5 contra gp91phox (Nakamura, 1987), que reconoce los epítopos externos de gp91phox (bucle 2 y 3), y la tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) de Biacore para examinar la interacción en tiempo real entre los PMN intactos y el anticuerpo 7D5 recubierto en el chip sensor. Tal como se muestra en la figura 8F, la inyección de PMN no tratados (control) dio lugar a una interacción específica lineal y dependiente del tiempo con el anticuerpo 7D5. Por el contrario, esta unión se redujo notablemente en cuanto a tiempo e intensidad cuando los PMN se trataron previamente con elastasa durante 1 h a 37°C y se lavaron. También se detectó una interacción reducida con los PMN tratados previamente con un sobrenadante desgranulante. Estos datos son coherentes con las alteraciones de los epítopos externos y la expresión de gp91phox en la superficie de los PMN. Para examinar adicionalmente si la elastasa se une a la superficie de gp91phox, se trataron los PMN con elastasa a 4°C durante 1 h y luego se marcaron a la misma temperatura con el anticuerpo 7D5. Este tratamiento inhibió fuertemente la unión del anticuerpo evaluada mediante análisis de barrido por FACS (figura 8G), lo que es coherente con un efecto de interferencia de la elastasa.

El plasma de pacientes que padecen cirrosis alcohólica regula por disminución la producción de ROS de los neutrófilos y la expresión de NOX2.

La elastasa granulocítica se libera durante los procesos infecciosos y se ha propuesto que es útil para el diagnóstico de pacientes con peritonitis bacteriana espontánea (Casafon et al., 1999), una de las principales complicaciones de la cirrosis hepática alcohólica. Sin embargo, se desconoce la relevancia de la elastasa plasmática en la regulación de la actividad de NOX2 de los neutrófilos. La cantidad de elastasa de neutrófilos presente en el plasma de los pacientes cirróticos estudiados en este caso fue significativamente mayor que la de los sujetos sanos (figura 10), de acuerdo con otros trabajos (Stanley et al., 1996). Para examinar si la elastasa plasmática regula la expresión y la actividad de gp91phox, se trataron los PMN sanos en ausencia o en presencia de plasma de pacientes o de donantes sanos (control) y se lavaron. Este tratamiento revela que los plasmas de los pacientes, pero no los de control, disminuyeron la cantidad de células positivas para gp91phox marcadas con el anticuerpo 7D5 (figura 9A) y la expresión superficial de gp91phox (figuras 9A y B). Además, esta disminución se evitó por el inhibidor de elastasa NEI (figura 9B), lo que sugiere fuertemente una contribución de la elastasa de los pacientes en el agotamiento de gp91phox. Coherente con esta observación, los plasmas de los pacientes inhibieron la actividad de NOX2 de los PMN medida mediante el ensayo de citocromo C (figuras 9C-E) y quimioluminiscencia. Además, el tratamiento previo del plasma y de los PMN con NEI impidió los efectos inhibidores del plasma de los pacientes (figuras 9A, B y D).

Referencias

A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica a la que pertenece esta divulgación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Agonista de TLR7/8 para su uso en el tratamiento de infección bacteriana en un paciente que padece cirrosis.

2. Agonista de TLR7/8 para su uso según la reivindicación 1, en el que el paciente padece cirrosis hepática alcohólica, cirrosis metabólica o cirrosis viral.

3. Agonista de TLR7/8 para su uso según la reivindicación 1, en el que el paciente padece cirrosis descompensada.

4. Agonista de TLR7/8 para su uso según la reivindicación 1, en el que la infección bacteriana es una peritonitis bacteriana en un paciente que padece cirrosis.

5. Agonista de TLR7/8 para su uso según la reivindicación 1, en el que el agonista de TLR7/8 se selecciona de compuestos de imidazoquinolina.

6. Agonista de TLR7/8 para su uso según la reivindicación 1, en el que el agonista de TLR7/8 es R848.

7. Agonista de TLR7/8 para su uso según la reivindicación 1, en el que el agonista de TLR7/8 está incorporado en una partícula apropiada para la ingestión por los neutrófilos.

8. Agonista de TLR7/8 para su uso según la reivindicación 1, en el que el agonista de TLR7/8 se administra simultáneamente con un antibiótico.

9. Agonista de TLR7/8 para su uso según la reivindicación 8, en el que el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en aminoglicósidos, betalactámicos, quinolonas o fluoroquinolonas, macrólidos, sulfonamidas, sulfametaxozoles, tetraciclinas, estreptograminas, oxazolidinonas (tales como linezolid), rifamicinas, glicopéptidos, polimixinas y antibióticos lipopeptídicos.

10. Agonista de TLR7/8 para su uso según la reivindicación 1, en el que el agonista de TLR7/8 se administra en combinación con un inhibidor de elastasa.