ES2891303T3 - Sistema portátil de análisis de ácidos nucleicos y actuadores de polímeros electroactivos microfluídicos de alto rendimiento - Google Patents

Abstract

Un aparato (10), que incluye una tarjeta microfluídica integrada (40), la tarjeta microfluídica integrada comprende: un ensamble de placa con canales (600); una pluralidad de módulos modulares en conexión microfluídica entre sí y cada uno configurado y dispuesto para detectar ácido nucleico, la pluralidad de módulos modulares incluye: un módulo de reactivos (140) configurado y dispuesto para contener y suministrar reactivos a otro de la pluralidad de módulos modulares; un módulo de lisis (100) configurado y dispuesto para llevar a cabo la lisis en una entrada de muestra a la tarjeta microfluídica integrada; un módulo de purificación (110) configurado y dispuesto para purificar objetivos en la muestra de otro material en la muestra; un módulo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (120) configurado y dispuesto para amplificar y marcar los objetivos; y un módulo de detección (130) configurado y dispuesto para hibridar los objetivos amplificados y marcados para la detección de los objetivos amplificados y marcados; una cámara de entrada (102) configurada y dispuesta para recibir la muestra e introducir la muestra en los canales; una pluralidad de puertos (610) y válvulas (630) configuradas y dispuestas para controlar un flujo de fluido dentro de las cámaras fluídicas de la pluralidad de módulos modulares y los canales, el fluido incluye la muestra y los reactivos; y al menos un respiradero configurado y dispuesto para eliminar las burbujas de los canales.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema portátil de análisis de ácidos nucleicos y actuadores de polímeros electroactivos microfluídicos de alto rendimiento

Introducción

La integración de la preparación de muestras con amplificación y detección en un sistema fácil de usar sigue siendo un desafío importante para el diagnóstico de ácidos nucleicos. [1] La FDA ha aprobado varios sistemas como dispositivos de "complejidad moderada" para su uso en solicitudes cercanas a POC [2], que incluye la plataforma GeneXpert de Cepheid, la plataforma Verigene de Nanosphere, el sistema BD Max de Becton, Dickinson and Company, y el dispositivo desechable "laboratorio en un tubo" de Liat.

La literatura de investigación está repleta de ejemplos de técnicas y dispositivos de detección de patógenos; sin embargo, nadie ha podido desarrollar un sistema multiplex, automatizado e integrado de "muestra a resultado", configurado para aceptar muestras biológicas sin procesar. [3] Un ejemplo antiguo usó la separación electroforética y fluorescencia inducida por láser para detectar la presencia de ADN patógeno extraído y amplificado de la sangre total [4]. Xu y otros, [5] usaron una lectura de fluorescencia en tiempo real durante la amplificación para detectar tan solo 100 copias/pl. Ferguson y otros. [6] detectaron ARN viral electroquímicamente hibridado con sondas de PNA en electrodos nanoestructurados en presencia de un tampón electrocatalítico, mientras que Lam y otros. [7] detectaron la hibridación de ADNbc amplificado con sondas moleculares marcadas con redox depositadas en un electrodo de oro. Ferguson [6] demostró un LOD equivalente a 10 TCID50 (dosis infecciosa de cultivo de tejidos), que fue 4 órdenes de magnitud menor que los valores de título clínico. Lam [7] demostró un LOD de 1 bacteria/pl, aunque se usó una concentración de 100 CFU/pl al realizar el análisis en una muestra de orina enriquecida. Dos grupos usaron un ensayo tipo sándwich de flujo lateral como base para la detección de ácidos nucleicos [8, 9], y una plataforma ivD del Instituto Fraunhofer [10] usó una plataforma modular, documento WO 2007/142692, que describe un aparato de preparación y detección que aloja diferentes módulos.

Durante décadas, el Departamento de defensa (DoD) ha reconocido la necesidad de análisis biológicos portátiles de campo. Inicialmente, la necesidad era identificar amenazas biológicas; sin embargo, con el advenimiento de la medicina personalizada, el Departamento de defensa también ha reconocido el valor del monitoreo rutinario del estado de salud y la disponibilidad de diagnósticos en la atención (POC) además del monitoreo ambiental. De hecho, DARPA tiene numerosos programas destinados a monitorear los sistemas biológicos para permitir una intervención rápida. Sin embargo, a pesar de décadas de inversión, no se dispone de instrumentos comerciales que realicen el procesamiento de ácidos nucleicos en el punto de necesidad. Para llenar este vacío, SRI ha desarrollado y divulgamos aquí un sistema de biodetección portátil, integrado, rápidamente reconfigurable y automatizado que realiza análisis de "entrada de muestra a salida de resultado".

Resumen de la invención

La invención proporciona un aparato de acuerdo con la reivindicación 1 y un método de acuerdo con la reivindicación 14. La invención proporciona dispositivos, sistemas y métodos para la detección paralela de un conjunto de distintas secuencias de ácido nucleico mediante amplificación de múltiples secuencias y lectura de hibridación simultánea.

En un aspecto, la invención proporciona un sistema automatizado de análisis de ácidos nucleicos que comprende módulos de lisis, purificación, PCR y detección de muestras de conexión microfluídica configurados para detectar en paralelo distintas secuencias de ácidos nucleicos mediante amplificación de múltiples secuencias y lectura simultánea de hibridación de micromatrices.

En modalidades, la invención proporciona el sistema en donde:

el módulo de detección comprende una detección óptica de micromatrices que comprende un escáner de micromatrices que emplea excitación de onda evanescente;

el módulo de detección comprende un procesador de hibridación automatizado configurado para proporcionar múltiples rigurosidades a través de la temperatura; y/o

el módulo de PCR se configura para realizar transcripción inversa y PCR en una sola reacción.

En modalidades, la invención proporciona el sistema en donde comprende una tarjeta microfluídica integrada que comprende los módulos y un analizador que comprende un receptáculo configurado para recibir la tarjeta, operadores configurados para operar la tarjeta y un controlador configurado para controlar electrónicamente a los operadores, los operadores que comprenden actuadores de fluidos, termociclador de PCR, procesador de hibridación automatizado y óptica de detección de micromatrices.

La invención proporciona el sistema que comprende además un módulo de reactivos configurado para contener y suministrar reactivos a los módulos de lisis, purificación, PCR y detección.

En modalidades, la invención proporciona el sistema en donde este es:

portátil: menos de 1000 en3 y menos de 10 libras;

rápido: análisis en menos de 120 minutos;

multiplex: análisis simultáneo de más de 50 secuencias objetivo; y/o

automatizado: no requiere la intervención del usuario entre la introducción de la muestra y la visualización de los resultados.

En modalidades, la invención proporciona el sistema en donde:

la muestra comprende los analitos de proteína y el sistema se configura además para marcar los analitos de proteína con etiquetas que comprenden las secuencias de ácido nucleico;

las sondas ancladas definen las secuencias por sus ubicaciones espaciales;

la amplificación se efectúa mediante un número de pares de cebadores menor que el número de secuencias que se analizan;

las distintas secuencias de ácidos nucleicos son de múltiples especies/organismos;

el módulo de PCR comprende una cámara de reacción de PCR metálica (por ejemplo, de aluminio);

la conexión microfluídica comprende una membrana transpirable configurada para la eliminación de burbujas, en donde la membrana transpirable está debajo de la capa del canal, por lo que todo el canal puede estar expuesto a la presión atmosférica (en una modalidad particular, esta membrana atraviesa la tarjeta porque es más fácil de fabricar como una capa que las piezas individuales, aunque solo es funcional debajo de las capas del canal);

la amplificación está completamente contenida en el consumible (sin tubos abiertos, etc); y/o

la detección se basa en conjuntos de sondas en lugar de conjuntos de cebadores (es más fácil construir nuevas pruebas).

En modalidades, la invención proporciona el sistema configurado para:

amplificar en un solo recipiente (sin división de la muestra);

recibir y procesar muestras de analito de sangre, saliva, muestras GI, orina, hisopos de heridas, punción lumbar, hisopos nasales, fuentes veterinarias y agrícolas;

recibir muestras a través de una herramienta de recolección espécimen o un medio de transporte;

procesar volúmenes de muestra entre 1-100 ul;

ser modular (los módulos pueden intercambiarse para soportar diferentes solicitudes);

ser capaz de medir (realizado por las dimensiones del canal y la eliminación de burbujas); y/o

ser unidireccional y autosellante (evita la contaminación cruzada de la muestra).

En modalidades, la invención proporciona el sistema que comprende una tarjeta microfluídica integrada que comprende los módulos y un analizador que comprende una carcasa (caja) y dentro del receptáculo de la carcasa configurado para recibir la tarjeta, en donde el analizador:

activa la tarjeta para realizar la lisis, purificación, PCT (amplificación y marcaje) y detección;

interactúa con la muestra a través de la presión (por ejemplo, transporte de la muestra), campos magnéticos (por ejemplo, mezcla de la muestra), temperatura (por ejemplo, amplificación, rigurosidad, hibridación) y/o luz (por ejemplo, detección de hibridación); y/o

realiza la detección mediante el acoplamiento de una onda evanescente con la muestra para observar hibridaciones en tiempo real y/o determinar la cinética y el posible desajuste de pares de bases que dan como resultado información de secuencia.

En modalidades, la invención proporciona el sistema que comprende una tarjeta microfluídica integrada (cartucho) que comprende los módulos, en donde la tarjeta está configurada:

para ser específica al tipo de enfermedad (por ejemplo, enfermedades respiratorias);

para ser específica para el tipo de paciente (por ejemplo, pediátrico);

para ser específica para el tipo de patógeno (por ejemplo, agentes de guerra biológica);

para ser específica para el individuo (por ejemplo, farmacogenómica);

para contener identificadores únicos para información específica del paciente;

para un solo uso para mantener la esterilidad y minimizar la contaminación cruzada;

para ser producida mediante el uso de etapas de fabricación de rollo a rollo; y/o

desde un chasis de policarbonato, cámaras de PCR de lámina metálica, componentes acrílicos, materiales de membrana transpirable y/o sellos de poliuretano.

En modalidades, la invención proporciona el sistema integrado funcionalmente con un clasificador de partículas microfluídicas, tal como un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), configurado para proporcionar un enfoque hidrodinámico y/o inercial para el alineamiento de partículas o células y que comprende actuadores de polímero electroactivo (EAP) a microescala configurados para la clasificación.

El clasificador p de EAP puede integrarse funcionalmente o incorporarse como módulo de clasificación/concentración de partículas del sistema iMFC, y configurarse para permitir que el sistema aumente la envolvente de operación concentrando una concentración de partículas diluidas en un gran volumen (por ejemplo, bacterias presentes en muestras ambientales a unas pocas células por ml) o clasificando células seleccionadas de un fondo de muchas células (por ejemplo, células T activadas de una población de células mononucleares de sangre periférica. Además, los actuadores de polímero electroactivo a microescala son adecuados para solicitudes alternativas más allá de la clasificación, que incluyen la captura de células, la mezcla de fluidos y el bombeo, y por lo tanto pueden proporcionarse, configurarse y/u operarse independientemente de los sistemas de análisis de ácido nucleico automatizados en cuestión.

La invención también proporciona los métodos para usar los sistemas descritos para detectar en paralelo distintas secuencias de ácidos nucleicos de analitos mediante amplificación de múltiples secuencias y lectura simultánea de hibridación de micromatrices.

En otro aspecto, la invención proporciona un actuador de polímero electroactivo microfluídico de alto rendimiento (pEAP) configurado alrededor de un canal de flujo en donde un pulso de tensión aplicado al actuador induce al actuador a crear a través del canal de flujo un flujo transversal transitorio que desvía las partículas objetivo dentro del canal de flujo sobre una nueva trayectoria, en donde el actuador comprende una cámara de fluido sin salida en la que una o más superficies (por ejemplo, pared, suelo, techo) de la cámara comprende un electrodo cubierto con una capa EAP de elastómero dieléctrico.

Un solo actuador uEAP puede emparejarse con una cámara elástica (es decir, "fuelles") que acepta el chorro de fluido impulsado por el actuador. Esta configuración solo requiere un actuador activo, pero aún permite la generación de un flujo cruzado. La cámara elástica podría ser simplemente uno de los actuadores sin conexión eléctrica, o podría ser una cámara con una geometría diferente, como la que usamos para los clasificadores multicanal/por etapas.

Aunque se ejemplifica principalmente con electrodos sólidos (por ejemplo, electrodo de óxido de indio y estaño (ITO) en un portaobjetos de vidrio), el electrodo podría también o alternativamente comprender un fluido, tal como un fluido conductor en un canal adyacente.

En otro aspecto, la invención proporciona una pluralidad de tales actuadores configurados alrededor del canal de flujo y desfasados entre sí, en donde un pulso de tensión aplicado a los actuadores induce a los actuadores a crear a través del canal de flujo un flujo cruzado transitorio que desvía las partículas objetivo dentro el canal de flujo sobre una nueva trayectoria, en donde cada actuador comprende una cámara de fluido sin salida en la que una superficie de la cámara es un electrodo cubierto con una capa eAp de elastómero dieléctrico.

En otro aspecto, la pluralidad es un par de tales actuadores configurados 180° desfasados entre sí.

En modalidades:

• una pluralidad de superficies de la o las cámaras comprende un electrodo cubierto con una capa EAP de elastómero dieléctrico;

• el canal de flujo se configura para proporcionar una combinación de enfoque hidrodinámico para alineamiento horizontal y enfoque inercial para el alineamiento vertical de las partículas;

la nueva línea de ruta conduce a una salida de clasificación;

el canal de flujo comprende un canal de entrada de muestra y canales de salida clasificados y no clasificados y la nueva línea de ruta conduce al canal de salida clasificado;

el canal de flujo está configurado para la detección de fluorescencia, en donde tras la detección de una partícula objetivo, el pulso de tensión se aplica a los actuadores pEAP;

• la capa de EAP tiene un espesor de 1-50 (o 2-25, o 5-15 pm);

• el elastómero es silicona;

• el o los actuadores están configurados para proporcionar clasificación en paralelo en un dispositivo multicanal;

• el o los actuadores están configurados para proporcionar clasificación en serie de múltiples etapas en múltiples salidas; y/o

• el o los actuadores están integrados funcionalmente en un clasificador de partículas activadas por marcajes. La invención también proporciona los métodos para fabricar y usar los actuadores, tal como que comprende la etapa de aplicar un pulso de tensión para inducir a los actuadores a crear a través del canal de flujo un flujo cruzado transitorio que desvía las partículas objetivo dentro del canal de flujo hacia una nueva ruta.

La invención proporciona específicamente todas las combinaciones de las modalidades enumeradas, como si cada una de ellas se hubiera establecido laboriosamente de forma individual.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Una configuración física de un sistema de diagnóstico molecular.

Figuras 2A y B: Una tarjeta iMGC.

Figura 2C: Un módulo de entrada para un hisopo nasal.

Figura 2D: Los TEC son arreglos.

Figura 2E: Una sección de la tarjeta iMFC alrededor de la PCR y los bloques de procesamiento de detección.

Figura 2F: Un sustrato de vidrio con el pocillo de detección, las rejillas y el cromo.

Figura 2G: Una vista lateral del sustrato de vidrio que ilustra cómo se acopla la luz al sustrato de vidrio.

Figura 2H: Una vista lateral del sustrato de vidrio que ilustra cómo viaja la luz a través de la reflexión interna total dentro del sustrato de vidrio.

Figura 2I: Un arreglo del TEC y el sistema de cámara en relación con la micromatriz.

Figura 3: Mecánica para unir el ácido nucleico a una frita de sílice.

Figura 4: Control de volumen con membrana transpirable.

Figuras 5A y 5B: Mecánica de control de válvula para controlar el flujo.

Figura 6: Una vista de proyección de una tarjeta Imfc

Figura 7: Un sistema neumático.

Figura 8: Un diagrama de bloques funcional del hardware físico del dispositivo 10.

Figura 9: Esquema del microclasificador EAP que muestra la distribución de canales del pEAP FACS.

Figura 10: Imágenes de rayas de partículas fluorescentes verdes de 7 |jm.

Figura 11: Clasificación de una célula B marcada con ficoeritrina.

Figura 12: Integración de múltiples clasificadores en el dispositivo de doble canal.

Figura 13: Integración de múltiples clasificadores en un dispositivo de clasificación por etapas.

Descripción detallada de modalidades particulares y ejemplos de las mismas

Nuestra invención proporciona un sistema de diagnóstico molecular portátil y económico capaz de producir resultados sin intervención humana; la intervención humana solo es necesaria para ingresar la muestra y leer los resultados. Los resultados también se obtienen muy rápidamente debido a las diversas técnicas descritas anteriormente. El sistema incluye un método para interactuar con un miembro desechable, llamado iMFC. Los métodos y los sistemas permiten que la iMFC se configure fácilmente para ejecutar diferentes tipos de pruebas sin la necesidad de modificar el hardware subyacente. Finalmente, la tarjeta en sí es modular, fácilmente modificable para ejecutar diferentes tipos de pruebas.

En un aspecto, la invención proporciona un sistema autónomo que puede tomar una muestra como entrada, realizar etapas de diagnóstico molecular y mostrar el resultado de las pruebas de diagnóstico. Típicamente, las etapas incluyen (i) extracción y purificación, por ejemplo, cuando la muestra de ADN se extrae de la muestra de entrada, que puede ser sangre, tejido, orina, saliva u otro fluido corporal; (ii) amplificación y marcaje, por ejemplo, cuando se amplifica una secuencia específica de la muestra; (iii) hibridación; (iv) lavado de rigurosidad para eliminar moléculas innecesarias que están unidas a la secuencia objetivo y (v) lectura donde se completa la etapa de identificación y se identifican las secuencias específicas. El sistema generalmente comprende un miembro desechable llamado tarjeta microfluídica integrada (iMFC) y una unidad base no desechable. La tarjeta microfluídica integrada puede acoplarse a la unidad base a través de un esquema de interfaz. El flujo de fluido en la iMFC puede lograrse controlando las válvulas que forman parte de la estructura de la tarjeta. Cada tarjeta puede diseñarse para detectar e identificar un determinado conjunto de marcadores biológicos.

En las modalidades, las etapas entre la entrada y la lectura de la muestra se llevan a cabo sin necesidad de intervención humana, el sistema no divide la muestra, el sistema es capaz de identificar al menos 1000 objetivos, el sistema puede identificar más de 50 objetivos por ejecución y/o implementa todas las etapas de prueba en un solo sistema, y/o mediante el uso de la hibridación en tiempo real, el sistema puede predecir los resultados antes de que se complete la hibridación y puede proporcionar información sobre la concentración objetivo.

La figura 1 muestra el sistema general 10. El sistema comprende una unidad base 20, una tapa de la unidad 30 y una tarjeta microfluídica integrada desechable (iMFC) 40. El diseño de la tarjeta es modular, de manera que puede personalizarse para aceptar entradas de muestras en diversas formas que incluyen, pero que no se limitan a, gotas de sangre, hisopos nasales, esputo, etc, o personalizarse para realizar diferentes pruebas. En general, el proceso de prueba comienza al elegir primero una tarjeta adecuada, colocar la muestra en la cámara de entrada de la tarjeta, colocar la tarjeta en la unidad base, cerrar la tapa y elegir el software apropiado para ejecutar. Una vez que comienza el proceso de prueba, no se requiere la intervención humana. Los resultados pueden mostrarse en una pantalla que puede integrarse como parte del sistema o pueden transmitirse a un dispositivo externo, tal como una computadora o un teléfono inteligente. Una vez concluidas las pruebas, puede desecharse la tarjeta y puede elegirse una diferente para la siguiente prueba. El orden de estas etapas puede cambiarse según sea necesario.

Tarjeta microfluídica integrada desechable. La tarjeta generalmente combina múltiples funciones, tales como lisis, purificación, amplificación, marcaje y detección, en una sola tarjeta. En los sistemas típicos del mercado, estas funciones se logran con múltiples instrumentos. Logramos la consolidación de las funciones mediante la integración de numerosas técnicas y características para la eliminación de burbujas y medición precisa, integración del sistema de obtención de imágenes de campo evanescente, elección de reactivos y químicos en diversas etapas y rápida amplificación e hibridación en tiempo real, etc. La consolidación de las múltiples funciones en una sola tarjeta puede permitir la exención de CLIA. La figura 2A ilustra una vista en perspectiva de la tarjeta y la figura 2B ilustra una vista en planta. La figura 2B también ilustra las áreas (mostradas en líneas discontinuas) donde pueden ocurrir diversas funciones dentro de la tarjeta. Por ejemplo, el bloque 100 puede ser el bloque de lisis, el bloque 110 puede ser el bloque de purificación, el bloque 120 puede ser donde ocurre el proceso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el bloque 130 puede ser donde ocurre la detección. El fluido que contiene la muestra de prueba fluye de un bloque a otro bloque en el orden descrito anteriormente a través de los canales que se incorporan dentro de la tarjeta. El flujo de líquidos a través de estos canales de un bloque a otro está controlado por microválvulas que pueden estar abiertas o cerradas en dependencia de la presión impuesta en las válvulas.

Bloque de lisis. La entrada de la muestra también puede ocurrir dentro del bloque de lisis, figuras 2A y 2B, bloque 100. Pueden usarse diversos métodos para ingresar las muestras, tal como usar gotas de sangre e hisopos nasales. En una modalidad, la tarjeta acepta directamente la herramienta usada para recolectar la muestra. Por lo general, en los sistemas en el mercado, la herramienta utilizada para recolectar la muestra no interactúa directamente con el instrumento de prueba. Al permitir la interfaz directa de la herramienta con el instrumento de prueba, puede eliminarse una fuente de contaminación y error del usuario. Dado que la tarjeta es modular, el bloque de lisis puede modificarse para aceptar diversos métodos de entrada. Refiriéndose a las figuras 2A y 2B, el miembro 102 puede ser una cámara de entrada que acepta una muestra tal como una gota de sangre. La figura 2C ilustra una ventaja de la modularidad, en donde el bloque de lisis se configura para aceptar un hisopo nasal 250 como entrada. Para ambos casos de uso de una gota de sangre o un hisopo nasal, el diseño subyacente de la tarjeta 40 puede ser el mismo; solo el módulo de entrada puede ser diferente.

Además de acomodar diversos métodos de entrada, los módulos de lisis pueden configurarse para llevar a cabo diferentes tipos de lisis, tales como mecánicas, químicas o de otro tipo. En referencia a las figuras 2A y 2B, el bloque de lisis se ilustra con un batidor de perlas 104, que comprende una cámara de perlas rellenada con perlas y un pequeño motor montado encima de la cámara de perlas que obliga a las perlas a chocar entre sí. Las células ubicadas entre las perlas en colisión se lisan, liberando su contenido en la solución tampón de lisis, un ejemplo de lisis mecánica. Pueden configurarse otros módulos para realizar otros tipos de lisis, y estos módulos pueden tener cámaras o submódulos diferentes o menos que los mostrados en las figuras 2A y 2B. Por ejemplo, un módulo capaz de realizar lisis química puede tener, en lugar del batidor de microesferas, otra cámara donde puede mezclarse una sustancia química (quizás almacenada en el bloque de reactivos y canalizarse a la cámara en un momento apropiado) con la solución tampón de lisis que contiene la muestra. Por tanto, pueden adaptarse diferentes tipos de lisis con el mismo diseño básico de la tarjeta.

Para iniciar el proceso de lisis, una solución tampón de lisis almacenada en el pocillo 142 del tampón de lisis en el bloque 140 de reactivos se canaliza a la cámara 108. El método para controlar el flujo de fluido dentro de la tarjeta puede lograrse controlando microválvulas. La cámara 108 puede tener un respiradero permeable a los gases en la parte superior, de manera que cuando un líquido toca el respiradero, queda bloqueado por aire debido a la diferencia de presión entre la cámara y la atmósfera, dejando salir el aire de la cámara mientras se llena. Este respiradero puede estar hecho de diversos materiales tal como teflón. Cuando la cámara 108 está llena, puede abrirse una válvula entre ella y la cámara de entrada 102, dejando que la solución tampón se mezcle con la muestra de entrada. Una vez que se mezclan el tampón de lisis y la muestra de entrada, puede abrirse otra válvula entre la cámara de entrada 102 y el batidor de perlas 104 para dejar que la mezcla entre en el batidor de perlas. El motor encima del batidor de perlas se enciende luego durante un período de tiempo específico, después del cual, la válvula entre el batidor de perlas 104 y la cámara 106 se abre y la solución fluye ahora a la cámara 106. La cámara 106 puede llenarse previamente con un reactivo tal como clorhidrato de guanidina donde se mezcla con la solución lisada. Una vez completada la mezcla con el reactivo, la válvula entre la cámara 106 y el bloque de purificación 110 puede abrirse para dirigir esta mezcla al bloque de purificación. El clorhidrato de guanidina permite que el ADN de la muestra se una a una estructura a base de sílice en el bloque de purificación, lo que ayuda en el proceso de purificación.

Las configuraciones para proporcionar capacidad para realizar diferentes tipos de lisis, aceptar diversos métodos de entrada y aceptar la herramienta real para el método de entrada son características ventajosas, que pueden combinarse sinérgicamente en el dispositivo 10.

Bloque de purificación. Cuando se abre la válvula entre la cámara 106 y el bloque de purificación, la solución entra en contacto con una frita de sílice que se coloca dentro del bloque de purificación. La frita y la estructura que sostiene la frita, se enumeran con 112 y 114 respectivamente en las figuras 2A y 2B. El flujo de la solución a través de la frita se ilustra en la figura 3. Esta figura muestra una sección de la tarjeta alrededor de la frita de sílice 112. La frita de sílice puede tener la forma de una malla que se asienta en un canal 410 que puede estar intercalado entre una capa base 400 y una capa superior 430. La capa base, la capa superior forma parte de la estructura 114 que sostiene la frita. Las flechas indican el flujo de fluidos dentro del canal 410. La solución que contiene el ácido nucleico en la solución de la cámara 106 que contiene el clorhidrato de guanidina se unirá a la frita y fluirá en la dirección de las flechas. El flujo de la solución después de pasar por la frita puede dirigirse mediante microválvulas para que fluya a una cámara de residuos o puede dirigirse para su procesamiento posterior. Por tanto, el ADN de la solución se une a la frita, pero otros componentes de la solución, tales como las proteínas y los lípidos, que no se unen a la frita, fluyen más allá de la frita y pueden dirigirse a través de canales a una cámara 144 de recogida de residuos. Después de la etapa de unión al ADN, se realiza una etapa de lavado. El etanol contenido en el depósito de etanol 146 se deja fluir sobre la frita para realizar la etapa de lavado para eliminar los componentes no deseados del lisado que todavía pueden estar unidos al ADN. A continuación, se deja secar el etanol. La siguiente etapa en el proceso de purificación es dejar que el tampón de elución almacenado en el pocillo 148 del tampón de elución se lave sobre la frita. Esta etapa permite que el ácido nucleico se desacople de la frita. Ahora se permite que la solución entre en el bloque 120 del proceso de PCR. En esta etapa, se abre la válvula de la etapa de procesamiento adicional (proceso de PCR), pero se cierra la válvula de la cámara de residuos.

Bloque de PCR. Después del bloque de purificación, puede implementarse la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferentemente con adaptaciones del sistema como se describió más abajo. La PCR se lleva a cabo en el bloque de PCR enumerado por 120, y puede llevarse a cabo en múltiples etapas como se muestra en las figuras 2A y 2B. Una vez completado el lavado de elución de la etapa de purificación, se deja que la solución purificada que contiene el ácido nucleico fluya hacia la cámara 122 con la mezcla de reacción de la PCR. Aquí, la solución purificada se mezcla con enzimas liofilizadas (secas por congelación) que se transportan dentro de la estructura de la cámara de mezcla de reacción. Estas enzimas son necesarias para la etapa de amplificación que ocurre más abajo en la cadena de procesamiento. La cámara de mezcla de reacción puede comprender un pocillo donde puede controlarse el volumen de la solución que llena el pocillo, permitiendo un volumen preciso de la solución y evitando o eliminando burbujas de aire. El volumen preciso en las diversas etapas del procesamiento da como resultado la exactitud de los resultados.

Una vez completada la mezcla con las enzimas, se deja que la solución fluya a la cámara de cebadores de la PCR 124, donde la solución se mezcla con los cebadores liofilizados. La cámara de cebadores también puede ser un pocillo donde el volumen se controla con precisión además de evitar o eliminar las burbujas de aire atrapadas en la solución. La separación de las etapas que implican la mezcla con la mezcla de reacción y los cebadores puede ser ventajosa en algunas situaciones, ya que esto permite el uso de módulos de mezcla de reacción comúnmente disponibles y reduce el costo total del dispositivo. Además, la separación en las dos etapas también permite el despliegue rápido de kits para probar amenazas emergentes, por ejemplo, ya que puede ser posible hacer múltiples tarjetas con diferentes cebadores que pueden usarse para verificar la presencia de diferentes moléculas objetivo. El proceso de liofilización del cebador (oligonucleótidos) es rápido y sencillo y puede realizarse en un laboratorio externo al dispositivo 10. Por lo tanto, al separar las dos etapas de mezcla, la tarjeta puede modificarse para probar diferentes sustancias, aunque el proceso de mezcla también puede realizarse en una etapa si se prefiere.

Una vez que se completa la mezcla con los cebadores, la solución fluye a la cámara de PCR 126. En una desviación de los enfoques tradicionales en el mercado donde una cámara de PCR puede estar hecha de materiales no metálicos, la cámara de PCR en la tarjeta iMFC puede estar hecha de un metal pasivado tal como, pero que no se limita al aluminio. El uso de metal y particularmente de aluminio es ventajoso ya que permite un control rápido de la temperatura de la solución dentro de la cámara de aluminio. Este control rápido se logra al tener la parte superior e inferior de la cámara de aluminio en estrecho contacto con los enfriadores termoeléctricos (TEC). El contacto estrecho entre la cámara de PCR y los TEC se obtiene ubicando dos TEC por encima y por debajo de la cámara de PCR. El TEC sobre la cámara de PCR se coloca en la tapa 30 del dispositivo 10 (figura 1) dentro de una unidad 200 de la carcasa del TEC. La forma de la cara del TEC 210 y la forma de la cámara de PCR 126 se hacen para que coincidan de manera que cuando se cierra la tapa, la cara del TEC puede ubicarse directamente sobre la superficie superior de la cámara de PCR. El TEC más abajo de la cámara de PCR se coloca simplemente dentro de la unidad base 20. La figura 2D ilustra cómo la cámara de PCR puede intercalarse entre dos TEC 220 (con la cara TEC 210) y 230 (con la cara TEC 240 que no es visible en la figura). Por tanto, este arreglo de los TEC y el uso de la cámara de PCR de aluminio permiten ciclos rápidos de temperatura de la mezcla de PCR. Se ha comprobado mediante mediciones que esta combinación permite una rampa de temperatura de >15 °C/s con una exactitud de ± 1 °C. Esta configuración contribuye directamente a acortar el tiempo entre la entrada de la muestra y la salida del resultado. Además de la ventaja obtenida en el control rápido de la temperatura de la solución debido al uso del aluminio pasivado, puede realizarse otra ventaja más en que se necesita una menor cantidad de energía para calentar y enfriar la solución en comparación con lo que se hubiera requerido si se usaran materiales no metálicos para la cámara de PCR. La menor cantidad de energía se traduce directamente en la necesidad de una menor potencia general para hacer funcionar el dispositivo, lo que permite el funcionamiento con batería opcional y la portabilidad en el campo.

Otro aspecto de la cámara de PCR 126 se explica ahora con referencia a la figura 2E, que muestra las secciones de la tarjeta alrededor de la cámara de PCR y el bloque de detección 130. Para preservar las concentraciones de la solución, debe evitarse o minimizarse el aire atrapado dentro de la cámara de PCR mientras ocurre el proceso de PCR. La cámara de PCR de las secciones superior e inferior, como se describió, puede estar hecha de aluminio pasivado; por lo tanto, aquí no puede usarse una membrana transpirable. Por tanto, se proporciona un canal de salida 250 de la cámara de PCR que conduce al depósito 255 que a su vez se abre a la atmósfera a través de otro canal 257. Por tanto, cuando la cámara 126 se llena de solución, el aire se expulsa y se purga a la atmósfera. Puede cerrarse una válvula en el canal 260 mientras se llena la cámara 126. Durante el proceso de llenado, el canal 250 y el depósito 255 también pueden llenarse de solución, lo que evita que el aire regrese a la cámara 126. Además, como la solución es impulsada por una presión constante de 6 psi, no se produce ningún reflujo desde el canal 250 o el depósito 255. Una vez que se llena la cámara, se inicia el proceso de PCR. Al final del proceso de PCR, las secuencias objetivo requeridas se amplifican y marcan para su detección dentro del bloque de detección.

Bloque de detección: descripción general. Una vez finalizado el proceso de PCR, con referencia a la figura 2E, la válvula 262 en el canal 260 puede abrirse y la solución con los componentes amplificados (amplicones) en la cámara de PCR 126 puede fluir a una cámara de mezcla 275. Aquí la solución se mezcla con un tampón de hibridación que puede almacenarse en el pocillo 150 del tampón de hibridación en el bloque de reactivo. La solución del tampón de hibridación se mide antes de permitir que se mezcle con el producto de PCR. Una vez que se completa el proceso de mezcla en la cámara de mezcla 275, se deja que la solución fluya hacia la cámara de detección 325 a través del canal 330. La cámara de detección 325, la cámara de mezcla 275, los canales que transportan soluciones dentro y fuera de las cámaras forman parte del bloque de detección 130 ilustrado en la figura 2B. A continuación, dentro de la cámara de detección, puede permitirse que el producto de PCR mezclado con el tampón de hibridación fluya sobre una micromatriz de ADN. Esto ocurre en el pocilio de detección 317 como se ve en la figura 2F, donde el pocilio contiene la solución y la micromatriz 315 se coloca en la parte inferior del pocillo. Por lo tanto, con esta configuración, las soluciones se ubican en la parte superior de la micromatriz. La figura 2F ilustra el arreglo de la micromatriz de ADN 315 y explica cómo se acopla la luz en la micromatriz ya que esta luz forma parte del sistema óptico que se usa para leer la micromatriz. La micromatriz de ADN puede contener varias sondas dispuestas en un patrón de rejilla sobre un sustrato de vidrio 310. Cada sonda puede contener una hebra de ADN (o ARN) y se usa para detectar la presencia de secuencias de nucleótidos en la solución de muestra que son complementarias a la secuencia en la sonda. Como se indicó, estas sondas están ubicadas en un patrón de rejilla en la parte superior de un sustrato de vidrio 310. La luz se acopla al sustrato de vidrio a través de rejillas 305 que están grabadas dentro del vidrio.

Con referencia a la 2G, las rejillas se ilustran junto con una luz incidente 306. La luz incidente 306 puede tener una longitud de onda específica. Debido a la presencia de las rejillas, la luz incidente puede viajar en múltiples direcciones; algo de luz puede transmitirse directamente como se muestra en 307, algo de luz puede transmitirse en ángulos específicos como se muestra en 308 y 309. La luz puede transmitirse en ángulos adicionales y más pronunciados con respecto a la luz 307, pero se ignoran en esta descripción ya que la intensidad de la luz en los ángulos más pronunciados tiende a ser menor. Los ángulos en los que se transmite la luz (para la luz que no se transmite en línea recta) se determinan mediante la conocida ecuación de rejilla. El ángulo de luz 308 y 309 puede ajustarse al ajustar la longitud de onda de la luz incidente 306 y mediante el patrón de las rejillas. A continuación, para acoplar la luz al sustrato de vidrio, se usa el proceso de reflexión interna total. Este concepto se ilustra en la figura 2H. En esta figura, se ignora la luz 307 que se transmite directamente y la luz 309 que se transmite en ángulo. La luz 308 se ilustra mediante un rayo limitado por el tamaño de las rejillas 305. Así, el rayo de luz 308 se ilustra mediante una línea continua 308L que emana del borde izquierdo de la rejilla y una línea discontinua 308R que emana del borde derecho de la rejilla. La línea continua y la línea discontinua se usan para distinguir los dos bordes de la viga; no se indica ninguna otra diferencia. En dependencia del ángulo del rayo 308 y de los índices de refracción del sustrato de vidrio y del entorno circundante (esencialmente aire), puede establecerse una reflexión interna total en la superficie superior de la región 1 del sustrato de vidrio marcada como R1. Esta luz reflejada puede alcanzar la superficie inferior del sustrato de vidrio y nuevamente puede reflejarse totalmente internamente en la región 2 (marcada como R2). Por tanto, a pesar de la reflexión interna total, la luz puede dirigirse detrás del pocillo de detección 317, más abajo de la micromatriz 315. Como se indicó anteriormente, la micromatriz 315 está ubicado en la parte inferior del pocillo de detección 317. Ahora que la luz se dirige a la localización de la micromatriz, se usa otro fenómeno llamado campos evanescentes para excitar las moléculas sensibles a la luz en la micromatriz de ADN. Es bien sabido en óptica que en los límites donde se produce la reflexión interna total, se establece un campo evanescente al otro lado del límite. Estos campos evanescentes son un fenómeno de campo cercano y la intensidad cae exponencialmente más lejos del límite. Sin embargo, muy cerca del límite, los campos evanescentes pueden excitar las moléculas sensibles a la luz y dado que la solución en el pocillo de detección 317 está ubicada en y cerca del límite, el método de detección mediante el uso de campos evanescentes se hace posible. Volviendo a la figura 2H, se ve que el pocillo de detección está colocado dentro de una capa envolvente 320; esta capa envolvente está hecha de cromo. La capa de cromo también se muestra en la figura 2F, rodeando el pocillo de detección en los cuatro lados. El cromo se incluye como parte del diseño para reducir o eliminar la luz parásita de las cercanías del pocillo de detección. La posibilidad de luz errónea se elimina aún más mediante el acoplamiento de una lámina de plástico negro 327 sobre el pocillo de detección. También pueden usarse materiales distintos al plástico.

El diseño de la rejilla y el posterior ángulo de luz 308, el grosor del sustrato de vidrio, el índice de refracción del sustrato de vidrio, la distancia entre la rejilla y el pocillo de detección son parámetros que hemos optimizado para este dispositivo y proporcionan una funcionalidad sinérgica. Además, el ángulo de luz 308 puede seleccionarse de modo que no solo refleje totalmente internamente desde regiones tales como R1 y R2 (esencialmente desde un límite entre vidrio y aire), sino también desde el límite de la solución de vidrio en el pocillo de detección. El índice de refracción de la solución en el pocillo de detección es aproximadamente 1,33 mientras que el del aire es aproximadamente 1. El paso de la rejilla, el material de la rejilla y el índice del sustrato pueden modificarse para usar una luz láser de diferente longitud de onda. En un ejemplo, se usó una luz de longitud de onda de 633 nm con una rejilla de nitruro de silicio de 150 nm a un paso de 195 nm sobre un sustrato de sílice fundido de 750 micrómetros. La luz se acopla al sustrato con una divergencia de 10°. La distancia entre la rejilla y la micromatriz se elige de manera que la micromatriz se coloque a una distancia correspondiente a un número integral de rebotes de reflectancia interna total. Todos los parámetros especificados anteriormente pueden ajustarse según sea necesario. Por ejemplo, pueden usarse otras longitudes de onda de luz que pueden requerir una separación de rejilla diferente al especificado anteriormente.

Puede colocarse un TEC 365 sobre el pocillo de detección 317 para controlar la temperatura de la solución. Finalmente, puede colocarse una cámara CCD 360 debajo de la micromatriz de modo que pueda formarse una imagen uno a uno de la micromatriz en los detectores de la cámara. El sistema de cámara toma fotografías de la solución a través de la micromatriz. Las fotografías revelan las áreas dentro de la micromatriz que pueden tener fluorescencia. Esta información se usa en el proceso de identificación y detección.

La invención explota combinaciones sinérgicas de las mejoras y adaptaciones descritas para implementar la función de detección.

Bloque de detección - control de calidad. Además de identificar las secuencias objetivo dentro de la muestra, la micromatriz puede usarse para asegurar también que las etapas (lisis, purificación, mezcla con las enzimas y los cebadores, etc) ocurrieron como se desea. Pueden adicionarse marcadores en cada etapa y la presencia o ausencia de los marcadores puede probarse ópticamente dentro de la micromatriz. Por lo tanto, al analizar la presencia o ausencia de marcadores, puede lograrse un control de calidad para identificar si las pruebas no se han realizado correctamente y dónde.

Bloque de detección - Pan-amplificación. El dispositivo 10 puede usarse para evitar la división de la muestra para probar diversas secuencias de ácido nucleico. La división de muestras se usa comúnmente en los sistemas en el mercado; requiere que la muestra se divida en varias muestras, donde cada muestra dividida puede analizarse para una determinada secuencia. Dado que la muestra original se divide en varias muestras, este método reduce el límite de detección en un factor igual al número de divisiones de la muestra. En lugar de usar la división de muestras, implementamos un proceso llamado pan-amplificación, mediante el cual pueden identificarse las variaciones dentro de una especie de bacteria o virus sin dividir la muestra. Este tipo de prueba es posible porque algunas secciones del ADN de las variantes dentro de una especie pueden ser iguales o similares. Sabiendo que ciertas secuencias están presentes, los cebadores pueden diseñarse para identificar las variantes.

Típicamente, la PCR se limita a aproximadamente 20 conjuntos de cebadores diferentes, lo que limita el número de objetivos que pueden detectar los sistemas en el mercado. Nuestro sistema supera la limitación de la panamplificación, en donde el conjunto de cebadores de PCR se dirige a secuencias de ADN que son comunes en muchos organismos, mientras que la región entre los cebadores contiene secuencias de ADN que son muy variables entre organismos. El enfoque de pan-amplificación permite la diferenciación del tipo de muestra en la micromatriz donde es posible una alta multiplexación. Por ejemplo, las regiones conservadas del gen de la polimerasa del coronavirus permiten la amplificación de 6 serotipos de coronavirus diferentes con un solo conjunto de cebadores, mientras que cada serotipo puede distinguirse en la micromatriz analizando la región variable amplificada entre los conjuntos de cebadores.

Una ventaja de la pan-amplificación es que se necesitan menos cebadores que un dispositivo típico en el mercado que realiza PCR. El uso de más de 20 cebadores puede conducir a un fenómeno llamado "dímero de cebador" en donde las moléculas de cebador se hibridan entre sí debido a las cadenas de bases complementarias en los cebadores, mientras que nuestro proceso de pan-amplificación permite el uso de menos cebadores, lo que resulta en una configuración ventajosa.

Bloque de detección - hibridación en tiempo real. En otra configuración ventajosa, se implementa un enfoque de hibridación en tiempo real dentro del dispositivo 10 que resulta en acortar el tiempo entre la entrada de la muestra y la salida de los resultados. En los enfoques típicos en el mercado, se permite que la hibridación continúe hasta que se alcancen concentraciones estables de la muestra o las muestras que se están probando. Por el contrario, en el dispositivo 10, se implementa un enfoque en tiempo real donde la concentración de la muestra o muestras se estima repetidamente durante el tiempo en que la concentración de la muestra o muestras puede estar aumentando poco después del inicio de la hibridación. Esta técnica se basa en la observación de que la fuerza de la señal de la cámara CCD puede estar relacionada con la concentración de acuerdo con la ecuación de la curva cinética, supra. Mediante el uso del modelo cinético, puede monitorearse el aumento de la señal de fluorescencia con respecto al tiempo. Esta señal puede modelarse o ajustarse como una exponencial a partir de la cual puede estimarse una constante de tiempo. Con una estimación de la constante de tiempo, puede estimarse la concentración del analito.

Bloque de detección - uso de control de temperatura de varias etapas. En los procedimientos de hibridación típicos en el mercado, después de que se completa la hibridación, se realiza un lavado riguroso para que las sondas no unidas puedan lavarse. Típicamente, los lavados rigurosos se realizan cambiando la concentración de sal; sin embargo, en el dispositivo 10, puede lograrse un efecto similar cambiando la temperatura de la muestra mediante el uso de los TEC mientras se mantiene una concentración de sal constante. Por lo tanto, una vez que se completa la hibridación y se toma un conjunto inicial de fotografías, la temperatura de los TEC puede aumentarse de modo que puedan eliminarse algunas de las moléculas no unidas. Esto permite una manera ventajosa de realizar una verificación de los resultados, ya que cambiar la temperatura de la solución es más fácil que cambiar las concentraciones de sal del tampón de hibridación.

Control del volumen. El procedimiento de prueba requiere un volumen preciso, que puede verse afectado por las burbujas de aire presentes en una cámara de llenado. En los sistemas típicos del mercado, se usan diversos dispositivos, tal como bombas peristálticas, pero la adición de estos dispositivos aumenta el costo y la complejidad del dispositivo. Nuestro dispositivo proporciona el control de volumen que logra una alta exactitud y precisión (preferentemente un 10 % o menos) y es económico de implementar.

La figura 4 ilustra una cámara de llenado 450 en sección transversal, junto con las estructuras alrededor de la cámara de llenado. La cámara de llenado puede estar ubicada encima de una capa base 490. Los lados de la cámara están indicados por 460. El fluido puede entrar en la cámara a lo largo de la flecha 480. La salida de la cámara de llenado está marcada con una flecha discontinua 495. El miembro 470 puede ser una válvula; si está cerrado, no se produce ningún flujo a lo largo de la flecha discontinuas 495. Puede montarse una membrana 440 transpirable en la parte superior de la cámara de llenado como se ilustra. Con la válvula cerrada, el fluido puede fluir en la dirección de 480, hacia la cámara de llenado 450. La membrana transpirable puede dejar salir el aire atrapado y, a medida que la cámara de llenado se llena, todo el aire se expulsa. La membrana transpirable no deja entrar aire debido al diferencial de presión entre la cámara y la atmósfera; por tanto, con la válvula 470 cerrada, puede recogerse una cantidad precisa de fluido dentro de la cámara de llenado. La exactitud del volumen dentro de la cámara de llenado puede determinarse mediante la exactitud de las dimensiones de la cámara, y las dimensiones de la cámara pueden controlarse mediante el uso de las técnicas bien conocidas tales como, pero que no se limitan a, el mecanizado y el grabado. La membrana transpirable puede estar hecha de materiales tales como, pero que no se limitan a, polipropileno microporoso. Por lo tanto, con una combinación de las cámaras hechas con precisión y las membranas transpirables, puede lograrse un control de volumen exacto y preciso.

Las cámaras de llenado junto con las membranas están ubicadas en diversos lugares dentro de la tarjeta iMFC. Así, por ejemplo, pueden usarse las cámaras de llenado con membrana transpirable para la cámara de mezcla de reacción de la PCR 122 y la cámara de cebadores de la PCR 124. En estas dos ubicaciones en particular, los compuestos liofilizados pueden ubicarse como un gránulo dentro de la cámara; por tanto, el proceso de rehidratación dentro de estas cámaras puede ocurrir en un ambiente de volumen controlado.

Control de válvula. Las figuras 5A y B ilustran cómo pueden controlarse las válvulas y el flujo de fluido dentro de la tarjeta iMFC, que incluye un canal 520 de flujo de fluido y un canal 540 de flujo de aire, y una membrana 530 flexible. La figura 5A muestra dos flechas 550 adicionales para indicar que los fluidos pueden fluir a través del canal 520 de flujo de fluidos. El fluido puede bombearse a través del sistema a una determinada presión, tal como 6 psi. Si la membrana 530 no se deforma como se ilustra en la figura 5A, entonces el canal 520 puede permitir el libre flujo de fluidos. Sin embargo, si se aplica una presión más alta, tal como 18 psi, al canal de flujo de aire, la membrana puede deformarse como se ilustra en la figura 5B, que efectivamente detiene el flujo a través del canal 520. Por tanto, al controlarse la presión a ambos lados de una membrana, puede controlarse el flujo a través de los canales de flujo. El sistema neumático que aplicó la presión diferencial se describe más abajo.

Capas de iMFC. La tarjeta iMFC, como se indicó anteriormente, puede ser desechable y puede estar construida con materiales económicos tales como policarbonato, acrílico y tereftalato de polietileno. Puede pensarse en la tarjeta como una "placa madre" donde pueden acomodarse los diferentes módulos, tal como cuando la tarjeta puede diseñarse para tener diversos tipos diferentes de módulos de entrada para acomodar diferentes métodos de entrada. La tarjeta no solo puede acomodar diversos módulos, sino que la configuración del canal también puede modificarse para adaptarse a diferentes pruebas de diagnóstico o para sumar o restar etapas de una prueba de diagnóstico. Por lo tanto, cada tarjeta puede diseñarse para adaptarse a una prueba específica o un conjunto de pruebas, sin necesidad de realizar cambios en el hardware subyacente. Cada tarjeta puede estar hecha de una o múltiples capas. Una de las principales funciones de la tarjeta es dirigir los fluidos de un lugar a otro en el momento adecuado, a través de un sistema de canales de flujo de fluidos y canales de flujo de aire integrados en la tarjeta. Otras funciones incluyen, pero no se limitan a medir el flujo y probar un ambiente de temperatura controlada.

La figura 6 ilustra una imagen de "proyección" compuesta de todas las capas de una tarjeta iMFC. En general, la tarjeta tiene uno o varios canales, tal como 600, de manera que los fluidos pueden fluir de un lugar a otro en estos canales. Los canales pueden formarse al cortar ranuras en el material de una capa dentro de la tarjeta. Además, la tarjeta también puede tener una o múltiples válvulas, tal como la 630, y uno o varios canales o depósitos, tal como la 620, donde puede medirse el volumen. Algunas capas o secciones de las capas pueden estar compuestas por la membrana transpirable. La tarjeta puede contener varios puertos, tal como el 610. Los puertos pueden formar una interfaz entre el hardware y la tarjeta. Estos puertos se usan para aplicar la presión de impulsión (para impulsar los fluidos) o presión de válvula (para controlar las válvulas). La ubicación de estos puertos puede seguir siendo la misma para las tarjetas, lo que evita cualquier necesidad de modificar el hardware subyacente. Sin embargo, la tarjeta puede diseñarse de cualquier manera conveniente y las funciones de la tarjeta pueden colocarse de cualquier manera conveniente. Este aspecto hace que la tarjeta sea versátil, ya que puede estar diseñada para realizar diversas pruebas sin la necesidad de cambiar el hardware subyacente.

Sistema neumático. El sistema neumático (Figura 7) se encarga de regular el flujo dentro de la tarjeta. El sistema neumático puede tener una bomba que puede estar ubicada dentro de la unidad base. Esta bomba comprime aire en un acumulador a la presión deseada, tal como 16 psi. La figura también indica un circuito de retroalimentación desde el acumulador a la bomba para que la presión dentro del acumulador se mantenga constante. Desde el acumulador, un camino conduce a un regulador donde la presión relativamente alta del acumulador se regula a una presión más baja, tal como 6psi. Esta presión más baja se usa para impulsar los fluidos dentro de todo el sistema. Puede incluirse una válvula solenoide en la salida del regulador, para activar la impulsión de fluido. Otro camino desde el acumulador puede pasar por una o varias válvulas solenoide para controlar la apertura o el cierre de las válvulas. Por lo tanto, la presión relativamente alta (16 psi) del acumulador puede usarse para controlar las válvulas. Como se indica en la figura, cada electroválvula puede controlar una o varias válvulas. Las figuras 5A y 5B representan cómo se controla el flujo de fluido a través del diseño de los canales de fluido y los canales de flujo de aire. En el contexto de la figura 7, los canales de fluido pueden conectarse a la salida "de impulsión" y los canales de flujo de aire pueden conectar a una de las salidas de la "Válvula".

El sistema neumático puede ser parte del hardware; por lo tanto, algunas de las vías para suministrar la presión para el flujo de fluido o para el control de la válvula pueden no modificarse fácilmente. Sin embargo, para lograr la flexibilidad en el diseño de la tarjeta, solo se requiere que los puertos estén en la misma ubicación; estos puertos son la forma en que se suministra la presión a los canales de flujo de aire para controlar la válvula o los canales de impulsión de fluido. Estos puertos se muestran mediante 610 en la figura 6. Por lo tanto, al requerir que las tarjetas tengan los puertos en la misma ubicación, puede usarse la misma unidad de hardware, pero las tarjetas en sí pueden diseñarse para diferentes propósitos.

Hardware. Como se ilustra en la figura 1, el sistema de prueba descrito puede estar integrado en una caja portátil, que incluye una unidad base 20 y una tapa de la unidad 30. Pueden configurarse físicamente diversas funciones y capacidades dentro de la base y la tapa. La figura 8 ilustra un diagrama de bloques funcional del hardware. El hardware puede incluir un procesador y una fuente de energía, tal como una batería. El procesador puede interactuar con los otros miembros, tal como los TEC, los motores, el sistema óptico, el sistema neumático, la pantalla y el sistema de comunicaciones. Con respecto al sistema de visualización, el dispositivo 10 puede tener una pantalla que puede transmitir los mensajes o los resultados. Con respecto al sistema de comunicación, la unidad 10 puede conectarse a un ordenador externo a través de cualquier método de comunicación adecuado, tal como ethernet y bluetooth. Los subsistemas de visualización y comunicación pueden implementarse mediante el uso de técnicas bien conocidas. La figura 8 también ilustra que la tarjeta puede interactuar mecánicamente con algunos de los subsistemas como el TEC, los motores, etc. Estas interfaces se ilustran con líneas discontinuas.

Descripción detallada de las modalidades adicionales y ejemplos de las mismas

Se describe un sistema portátil que puede analizar el contenido de la secuencia de ácido nucleico en una variedad de muestras. El sistema es capaz de tomar una variedad de muestras brutas (de diagnóstico o ambientales) y realizar la extracción de ácido nucleico, purificación, amplificación, marcaje y análisis de secuencia por la micromatriz en una unidad autónoma. El sistema es automatizado y rápido para permitir el análisis de las muestras en el punto del sitio por parte de usuarios que no son técnicos de laboratorio capacitados.

En modalidades: el sistema comprende (1) una plataforma de hardware reutilizable y (2) una tarjeta microfluídica integrada consumible (iMFC) que determina el ensayo a realizar;

el sistema es pequeño (<150, <250 o 400 in3), liviano (<3, 5 o 10 lb), rápido e intuitivo de usar;

el hardware reutilizable controla y proporciona la neumática, la regulación de la presión, el control de la temperatura, el control del láser y la formación de imágenes de la micromatriz final;

la iMFC consumible comprende una tarjeta que realiza la lisis, purificación, PCR y detección de las muestras y aloja todos los reactivos secos necesarios; y/o

la iMFC comprende además un elemento de almacenamiento de reactivos que contiene todos los reactivos líquidos por separado para no comprometer la integridad de los reactivos secos.

En modalidades, el sistema proporciona:

Facilidad de uso: fácil de operar y los resultados simples de interpretar, para uso en el campo por operadores no ^{capacitados; configurado para ser eximido de las Enmiendas de mejora de laboratorio clínico} (CliA); ^{y/o proporciona} capacidad de entrada de muestra a salida de resultado sin intervención del usuario.

Configurabilidad: la iMFC es modular, lo que permite almacenar la iMFC principal y conectar módulos separados, de producción rápida y de menor costo que definen la funcionalidad de ensayo del producto final; dado que la iMFC principal sigue siendo la misma, el sistema proporciona el desarrollo justo a tiempo de nuevos ensayos a medida que surgen nuevas amenazas.

Flexibilidad del ensayo; flexibilidad en el tipo de muestra (desde esporas resistentes hasta células de mamífero que se rompen fácilmente) y/o clase de analito (ADN, ARN y proteína).

Capacidad de fabricación y costo; la iMFC y los componentes modulares pueden fabricarse mediante el uso de moldeo por inyección de bajo costo o un proceso de conversión láser de fabricación avanzada; la conversión láser de alta velocidad y la laminación de precisión permiten la fabricación de una iMFC con características tan pequeñas como 125 |jm y tolerancias de menos de 50 jm a velocidades de producción cercanas a los 50 pies por minuto; la combinación de tecnología de moldeo por inyección más antigua y tecnología de conversión láser avanzada permite la producción de cartuchos desechables complicados por menos de $ 10 por tarjeta en volumen.

En algunas modalidades, nuestro sistema está completamente automatizado desde la entrada de la muestra sin procesar hasta la respuesta, y/o configurable para permitir múltiples tipos de análisis.

En modalidades, nuestro sistema proporciona una plataforma de bioanálisis portátil para detectar ácidos nucleicos, típicamente ADN o ARN, tal como detección microbiana, típicamente bacteriana, viral o fúngica, y control de la salud mediante detección de ARNm y proteínas, y selección y concentración celular. En una modalidad, el sistema consiste en dos elementos: (1) una plataforma de hardware reutilizable y (2) una tarjeta microfluídica integrada consumible (iMFC) que determina el ensayo a realizar.

En modalidades, nuestro sistema puede demostrarse que se adapta a diversas solicitudes:

Detección de agentes bacterianos. Nuestra iMFC de detección de ADN funciona de manera similar al flujo de trabajo de un laboratorio: lisis, purificación de ADN, amplificación y marcaje del ADN e hibridación. Nuestro enfoque técnico microfluídico para cada etapa se destaca más abajo.

La lisis se logra mediante el uso de perlas de sílice y motores desechables de bajo costo para una lisis robusta de tipos de muestras, desde esporas resistentes hasta células de mamíferos.

Purificamos el ADN uniendo el ADN a una frita de sílice, eliminando las impurezas y eluyendo en una solución preparada para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Nuestro módulo y procedimiento de purificación de ADN permiten la elución de una alta concentración de ADN en los primeros 6 pl de ~5 min sin intervención del usuario. Por el contrario, un enfoque de banco de laboratorio para la lisis de esporas y la purificación del ADN tarda 30 minutos en 7 etapas y requiere centrífugas de laboratorio.

Realizamos la amplificación del ADN en una cámara con paredes de aluminio entre dos enfriadores termoeléctricos personalizados (TEC). Los TEC y las cámaras de aluminio permiten una rápida transferencia de calor entre los TEC y la mezcla de PCR. Hemos demostrado el dúplex de PCR de los dos genes (AGG y STX2) asociados con el patógeno de E. coli O104:H4 en 12 min y hemos detectado hasta 10 copias genómicas.

Hibridamos el ADN mediante el uso de un sistema óptico y una micromatriz de ADN personalizada. La luz se acopla a un bloque de vidrio mediante el uso de una rejilla y permanece confinada por la reflectancia interna total. La onda evanescente en la superficie se usa para excitar las secuencias objetivo hibridadas con su complemento en la superficie de la micromatriz. El uso de la onda evanescente nos permite visualizar la hibridación en tiempo real. Un relé óptico personalizado y un CCD se usan para para obtener imágenes de la superficie de la micromatriz.

Podemos verificar la detección multiplex de múltiples agentes potenciales de guerra biológica y establecer las curvas de características del operador del receptor (ROC) para nuestra plataforma de ensayo y hardware.

Detección de ARN viral. Nuestro enfoque técnico para detectar ARN viral es el mismo que nuestro enfoque para la detección de ADN, excepto que usamos una única mezcla de transcripción inversa/PCR. Hemos demostrado una única mezcla de reacción para la transcripción inversa y PCR en menos de 30 minutos para los virus de la influenza H3N2 y H1N1. La capacidad portátil de campo puede aprovechar directamente la información obtenida del programa Prophecy de DARPA y permitir la detección temprana de mutaciones potencialmente pandémicas que causan en poblaciones virales en rebaños o manadas de animales domesticados.

Detección de ARNm. Podemos abordar el análisis de ARNm mediante el uso del mismo hardware, actualizando la iMFC para permitir la captura del ARNm mediante el uso de perlas de poli-T e imágenes de la micromatriz en tiempo real para capturar los datos cinéticos. El uso de medidas cinéticas nos permite determinar la concentración de cada analito mucho antes de que se alcance el equilibrio, reduciendo de esta manera el tiempo de hibridación que típicamente impulsa el análisis de la expresión génica. Nuestra capacidad para analizar una muestra de sangre rápidamente y en el punto de necesidad de ARNm aprovecha la inversión que realizó DARPA en el programa predicción de salud y enfermedad.

Detección de proteínas. Podemos transducir un evento de unión a proteínas en una lectura de ácido nucleico, lo que de esta manera le da a nuestra misma plataforma la capacidad de analizar tanto los ácidos nucleicos como las proteínas. Las concentraciones de proteínas plasmáticas son indicativas del estado de salud o exposición ambiental. Hemos desarrollado un panel de proteínas de respuesta de cuatro huéspedes que indica la exposición a la radiación ionizante; también pueden integrarse en la plataforma paneles similares para otros diagnósticos de exposición ambiental. Usamos el mismo módulo microfluídico de captura de perlas que para la detección de ARNm para capturar analitos de proteínas en una perla. Las perlas se funcionalizan con anticuerpos para analitos de proteínas particulares en lugar de oligonucleótidos poli-T. Un segundo anticuerpo marcado con un oligonucleótido se usa como molécula informadora como en un inmunoensayo tradicional. Una vez que el ensayo sándwich se ha sometido a un lavado riguroso, el oligonucleótido indicador se amplifica, marca e hibrida mediante el uso de los mismos módulos que para la detección de ADN. A este enfoque lo llamamos "PCR inmune a microesferas" (MSiPCR).

Selección y concentración celular. Nuestro módulo delantero permite la selección y concentración de células específicas mediante el uso de un clasificador de células de polímero electroactivo (EAP) microfluídico, análogo a los clasificadores de células activadas por fluorescencia (FACS) a escala de laboratorio. El módulo aumenta la envoltura operativa del sistema ya sea concentrando una concentración celular diluida en un gran volumen (unas pocas células bacterianas por ml) o clasificando células seleccionadas de un fondo de muchas células (solo células T activadas de todas las células mononucleares de sangre periférica). En este módulo alineamos las células mediante el uso de un enfoque hidrodinámico y/o inercial, y luego clasificamos en base a un disparador fluorescente mediante el uso de actuadores EAP. Hemos demostrado el potencial de la tecnología para clasificar a velocidades superiores a 25 000 células/segundo.

Analizador portátil de línea de base

La plataforma de hardware proporciona toda la activación de hardware necesaria para soportar el procesamiento de la iMFC de una muestra de A d N microbiano. El usuario interactúa con la plataforma de hardware a través de un puerto USB de la computadora. Una vez que se inserta la iMFC en el hardware y se cierra la tapa, el usuario selecciona un script de procesamiento específico para el ensayo deseado. Una vez que se inicia la secuencia de comandos, el dispositivo portátil se ejecuta sin la interacción del usuario, hasta que se completa. Durante la ejecución, las imágenes se transfieren desde el dispositivo portátil a la PC principal, donde se analizan. Al finalizar la ejecución, el análisis y los resultados se mostrarán en la pantalla para que el usuario los revise.

El hardware está diseñado para permitir la lisis, purificación, amplificación y detección celular, en un pequeño dispositivo portátil, preferentemente con un volumen total de menos de 1 pie3., preferentemente menos de 200 pulgadas3. En una modalidad, las dimensiones del hardware son 4,75 pulgadas de profundidad x 6,25 pulgadas de ancho x 5 pulgadas de alto para un volumen total de 148 pulgadas3.

En la iMFC, las válvulas de la membrana y el flujo del fluido líquido se controlan mediante presión positiva. El subsistema neumático está centrado en un colector acrílico personalizado que interconecta todos los componentes neumáticos en el analizador portátil (HHA) y enruta esas salidas de los componentes a los puertos de entrada en la iMFC. Este colector contiene un acumulador para contener un volumen de aire a una presión regulada (18 psi) apropiada para la activación de la membrana de la válvula microfluídica en la iMFC. Se usa un solo solenoide para activar la presión de impulsión a la iMFC en cualquier momento durante el procesamiento del ensayo. Este puerto de presión de impulsión se dirige a través de un regulador de presión (montado en el colector integrado), de modo que la presión de impulsión puede ajustarse entre 0-10 psi para cualquier HHA dado.

La tabla 1 muestra los componentes funcionales y sus propósitos e implementación en el sistema de línea de base. El hardware que admite los módulos de amplificación (PCR) y detección se describe en detalle más abajo como parte de la descripción de la iMFC de referencia. La 2da columna enumera el propósito de ese componente funcional y la columna final enumera nuestro enfoque técnico implementado en la plataforma de hardware para lograr la capacidad deseada.

Tabla 1.

Módulos de iMFC e iMFC de línea de base

La iMFC consumible comprende (1) una tarjeta que realiza la lisis, purificación, PCR y detección de la muestra y contiene todos los reactivos secos necesarios y (2) un elemento de almacenamiento de reactivos que contiene todos los reactivos líquidos por separado para no comprometer la integridad de los reactivos secos. Debido a que la iMFC se diseñó de forma modular, es decir, los módulos específicos de la solicitud se ensamblan en una tarjeta genérica, la iMFC para nuevas solicitudes puede desarrollarse fácil y rápidamente simplemente intercambiando los módulos. Esta característica de versatilidad elimina la necesidad de rediseñar, desarrollar y fabricar nuevas tarjetas, el componente más complejo. Una vez fabricadas, las mismas tarjetas pueden usarse para una amplia gama de solicitudes, lo que reduce de esta manera el costo y el tiempo de desarrollo.

Tarjeta microfluídica. La tarjeta utiliza flujo impulsado por presión positiva y consiste en tres capas funcionales que contienen (1) canales de fluido, (2) 22 válvulas de membrana para controlar el flujo de fluido y (3) respiraderos para la eliminación de burbujas de los canales de fluido. Estas capas funcionales juntas se componen de nueve capas laminadas rodeadas por dos piezas moldeadas por inyección. Siete módulos están previamente montados en la tarjeta, cuatro en la superficie superior (módulo de lisis, filtro de purificación, cámara de mezcla de reacción de la p Cr y cámara de cebadores) y tres en la superficie inferior (cámara de PCR, cámara de mezcla de la barra de agitación y cámara de detección). Fijo a la cámara de detección se encuentra el chip de guía de ondas ópticas, que contiene una micromatriz de ADN para detectar los objetivos de interés.

Bloque de reactivos. Cuando el usuario inicia el programa, una vejiga inflable en el hardware de mano presiona el bloque de reactivos sobre los objetos punzantes para perforar los sellos de aluminio, que, a su vez, liberan los reactivos líquidos. Con el flujo impulsado por presión positiva, el aire ingresa a cada cámara en el bloque de reactivos e impulsa los reactivos líquidos a través de las vías de salida y hacia la tarjeta. Las juntas comprimibles de la tarjeta evitan la fuga de fluido o aire en la interfaz bloque de reactivos-tarjeta. La tabla 2 identifica los líquidos que pueden almacenarse en el bloque de reactivos para el análisis de ADN. Las tarjetas diseñadas para diferentes solicitudes (análisis de ARNm o proteínas) tendrán diferentes reactivos. El bloque de reactivos también incluye un depósito de desecho que contiene material absorbente para recoger los reactivos que fluyen a través de la tarjeta. El bloque de reactivos contiene preferentemente todos los reactivos líquidos en un único formato previamente envasado necesario para el análisis de ensayo biológico. La tabla enumera los reactivos usados actualmente para el análisis de ADN. El nombre del tampón se especifica junto con el propósito del tampón y la formulación química exacta. El bloque de reactivos es de uso general y los reactivos necesarios cambiarán en dependencia del ensayo biológico que realice la iMFC. Nuestro enfoque técnico es usar el mismo empaque, pero llenarlo con diferentes reactivos para soportar las nuevas capacidades de ensayo para la detección de virus de ARN, detección de ARNm y detección de proteínas.

Tabla 2.

Lisis. Después de la liberación de los líquidos del bloque de reactivos, la siguiente etapa en el programa automatizado es la lisis. El módulo de lisis, que puede manejar incluso muestras de esporas, consiste en tres cámaras: la cámara de las muestras, la cámara del batido de las perlas (para la lisis de esporas) y la cámara del agente aglutinante. Una vez que el tampón de lisis del bloque de reactivos fluye hacia la cámara de las muestras, se enciende un motor para mezclar el tampón de lisis con la muestra. La muestra mezclada luego fluye hacia la cámara de batido de las perlas, donde un segundo motor funciona durante 3 minutos para agitar las perlas de vidrio y lisar la muestra de esporas mediante el batido de las perlas. La muestra lisada luego ingresa a la cámara del agente aglutinante, donde una mezcla sólida de clorhidrato de guanidinio y bisulfato de sodio (el agente aglutinante) se disuelve en la muestra para facilitar la unión del ADN al filtro de purificación en la siguiente etapa.

Como prueba de concepto para este enfoque, obtuvimos datos de eficiencia de lisis de muestras de esporas lisadas de B. subtilis por el módulo de lisis. Las esporas representan la situación de lisis más desafiadora. Para aplicaciones sin esporas, la cámara de batido de perlas puede intercambiarse con un módulo de cámara sin motor para simplificar el diseño y reducir los costos.

Purificación. Enfrentamos varios desafíos en el desarrollo de un enfoque técnico para la purificación de ADN microfluídico. Por ejemplo, necesitábamos desarrollar un enfoque que replicara un procedimiento de laboratorio que requería 7 etapas y 30 minutos con múltiples etapas de centrifugación para lisar y purificar con éxito una muestra de esporas. Además, necesitábamos eluir el ADN en la primera fracción de 6 pl. En un ensayo de laboratorio, el ADN purificado se eluye típicamente en un volumen mayor (por ejemplo, 20 pl) y luego se usa una alícuota de volumen más pequeño (1-3 pl) para la amplificación por PCR. En esta situación, el ADN se mezcla y, por lo tanto, la velocidad de elución se promedia sobre los 20 pl completos. Un enfoque microfluídico implica poca mezcla ya que la mayor parte del flujo es laminar; por lo tanto, la concentración más alta de ADN eluido debe estar en la primera fracción.

Tabla 3. Realizamos tres réplicas de la lisis de esporas de B. subtilis mediante el uso de nuestro módulo de lisis. Los resultados se muestran más abajo en porcentajes del stock inicial de 107 esporas (en base a un recuento de viabilidad). El control era un dispositivo para batir perlas de Claremount. Nuestros resultados microfluídicos son comparables a los del control mediante el uso de pipetas y tubos de laboratorio.

En la iMFC después de la lisis, la muestra fluye a través del módulo de purificación, el ADN se une al filtro y el contenido de la muestra lisada restante fluye al depósito de desechos. El tampón de lavado del bloque de reactivos fluye a través del filtro para eliminar las impurezas residuales y también se acumula en el depósito de desechos. El aire sopla a través del módulo de purificación para secar el filtro, seguido por el tampón de elución (un aspecto clave para lograr una elución significativa en la primera fracción es el pH del tampón de elución) del bloque de reactivos, que, a medida que fluye, elimina el ADN purificado del filtro en preparación para la PCR. La Tabla 4 presenta los datos de tres réplicas de muestras de E. coli purificadas en la tarjeta microfluídica y compara los resultados con los de un filtro de purificación estándar. En cada caso, está claro que la concentración más alta está saliendo en la primera fracción. Cada fracción representa ~ 6 pl de ADN en el tampón de elución.

Tabla 4. Repetimos tres réplicas de la purificación de la muestra de E. coli mediante el uso de nuestro protocolo de iMFC. Desarrollamos el protocolo para eluir la mayor parte del ADN en la primera fracción, ya que no tendremos la oportunidad de agrupar toda la elución y seleccionar solo una fracción con una pipeta como ocurre con los enfoques típicos de banco de laboratorio. Los resultados indican claramente que la mayor concentración se encuentra en la primera fracción de 6 pl.

Amplificación por PCR y marcaje. Con el ADN purificado del filtro, el tampón de elución llena la cámara de mezcla de reacción de la PCR, que contiene la mezcla de reacción liofilizada. Luego, la mezcla de reacción rehidratada fluye hacia la cámara de cebado y rehidrata los cebadores secos. Hemos separado los cebadores y la mezcla de reacción para permitir la reutilización de módulos genéricos de la mezcla de reacción de la PCR. La liofilización de los oligonucleótidos es rápida y este enfoque nos permite respaldar el despliegue rápido de kits para probar amenazas emergentes. Después de las etapas de rehidratación, la muestra, junto con la mezcla de reacción y los cebadores, ingresa a la cámara de PCR, donde luego se amplifica el ADN de la muestra.

Dos características clave nos permiten lograr una PCR rápida: (1) superficies del módulo de PCR de aluminio y (2) un nuevo ensamble TEC que puede aumentar > 15 °C/s con una exactitud de ± 1 °C.

El módulo de PCR está intercalado entre dos conjuntos TEC. La mezcla de reacción de la PCR se mantiene en una cámara acrílica de 1 mm de altura rodeada por dos paredes de aluminio de 25 pm. Las superficies de aluminio de la cámara de PCR permiten una rápida conductancia de calor hacia y desde el ensamble TEC a la mezcla líquida de PCR. Como comparación, un plástico de 50 pm de espesor reduce la velocidad de rampa en ~3X.

El SRI diseñó y probó un ensamble TEC personalizado. Hemos realizado la transición del diseño a RMTltd para la fabricación. El ensamble SRI personalizado combina un disipador de calor, un TEC, un sensor de retroalimentación (termistor) y un esparcidor térmico de nitruro de aluminio (AlN) que rodea el sensor. Cada sensor termistor está calibrado para permitir que el HHA compense cualquier tolerancia de error de fabricación del sensor.

Como prueba de concepto para nuestro sistema de PCR, creamos un ensayo de PCR dúplex para los genes de fimbrias de adherencia agregativa (AGG) y toxina Shiga (STX2) asociados con el patógeno de E. coli O104:H4 del brote alemán de 2011. El cebador y las sondas se seleccionaron para regiones únicas en base al análisis de secuencia cargado por BGI poco después de que comenzara el brote. Se usó un ensayo de laboratorio con equipamiento de mesa de trabajo para establecer la selección de la sonda y la optimización del cebador para los objetivos AGG y STX2. Una vez establecido, el ensayo se pasó al sistema de PCR microfluídico SRI. Dado que el sistema de PCR SRI aprovecha las cámaras de PCR de aluminio optimizadas para la conducción de calor y la uniformidad de temperatura y el novedoso diseño TEC impulsado por el termistor para ciclos rápidos de temperatura, una formulación de la mezcla de reacción personalizada con adyuvantes usados para pasivar las cámaras de aluminio permitió la amplificación dúplex de los objetivos AGG y STX2 en 16 min.

Los resultados proporcionaron una superposición de 40 ciclos de PCR (etapa de desnaturalización a 95 °C, hibridación a 62 °C y extensión a 73 °C). Cada ciclo dura 21 s durante 40 ciclos, totalizando 14 min de termociclado de PCR. El tiempo restante es para la desnaturalización inicial y el tratamiento con uracil-ADN glicosilasa (UNG). Nuestra mezcla de reacción personalizada contiene dUTP como parte de la amplificación, y la etapa con UNG garantiza que no haya contaminación entre los diferentes usos de la plataforma de hardware. Probamos la PCR de 16 minutos en cinco números de copias de entrada diferentes (10, 50, 100, 500 y 1000) y cuantificamos el factor de amplificación para los genes AGG y STX2. Adicionalmente, probamos una entrada de 500 copias mediante el uso de un protocolo de PCR de 12 minutos y observamos que el tiempo del ciclo se redujo de 21 s por ciclo a 15 s. Nuevamente, se usaron 2 min de tratamiento con UNG y desnaturalización inicial, para un tiempo del ciclo de solo 10 min. La tabla 5 muestra los resultados de la PCR anidada contra estándares de los amplicones para cuantificar los amplicones en cada muestra y determinar los factores de amplificación. En general, tuvimos un intervalo de amplificación de 1,6x109 hasta 3,4x1011 para la PCR modular. Además, los amplicones generados con sistemas de PCR modulares se han detectado con el sistema de hibridación modular SRI.

Tabla 5. Resultados de la cuantificación de las muestras de la PCR modular. Los resultados indican que todas las muestras tendrían >3,4 nM del amplicón en la hibridación, que está por encima del LOD de 1 nM.

Detección. Para detectar la presencia de los objetivos específicos, la muestra amplificada se hibrida con la micromatriz en el chip guía de ondas ópticas. Para facilitar la hibridación, primero se adiciona el tampón SSPE del bloque de reactivos a la muestra amplificada. Se utilizan dos cámaras de medición para lograr la relación óptima de muestra a tampón SSPE.

El SSPE y el producto de PCR se mezclan y luego se empujan a la cámara de detección, que incuba la muestra sobre la micromatriz en el chip guía de ondas ópticas. Después de 5 min de hibridación con control de temperatura mediante el uso de nuestro ensamble TEC personalizado, el tampón SSPE adicional fluye hacia la cámara de detección para lavar la muestra y eliminar los amplicones sin hibridar, seguido de un aumento de temperatura para eliminar la hibridación cruzada o cualquier amplicón que esté unido de forma inespecífica a las sondas incorrectas.

Por último, se obtienen imágenes de la micromatriz de ADN mediante el uso de un bloque óptico personalizado de iluminación, recolección y generación de imágenes. El bloque óptico está diseñado como un subcomponente independiente que incluye todo lo necesario para iluminar con láser y obtener imágenes de la hibridación de micromatrices. El bloque óptico puede alinearse previamente y ajustar antes de la instalación en e1HHA. Una vez que se realiza este alineamiento previo, no es necesario realizar más ajustes en el momento de la instalación.

La óptica de iluminación láser consiste en un módulo de diodo láser generador de línea y un espejo giratorio. El objetivo de la iluminación láser es la rejilla del chip de micromatriz. El diodo láser generador de línea emite un rayo de 10 mW a 635 nm en un patrón rectangular para excitar las moléculas marcadas con Alexa Flúor 647 nm usadas para visualizar la hibridación con la micromatriz. El módulo de diodo generador de línea tiene ópticas de enfoque y generación de línea integradas en un empaque listo para usar (Coherent).

La óptica de formación de imágenes de micromatriz comprende una lente de relé plegada 1:1 y filtros de interferencia. El grupo de lentes de relé de diseño personalizado es rápido (af/1,5) para una máxima capacidad de recolección de luz. Es de tamaño pequeño (12 mm de diámetro y <27 mm de largo). La lente del relé está diseñada para colimar suficientemente la luz en los dos filtros de interferencia (hechos de pilas dieléctricas) que se usan para rechazar la luz de excitación láser y la luz dispersa para que no lleguen a nuestro generador de imágenes CCD monocromo.

El chip CCD y la electrónica están conectados directamente a la óptica de imágenes de la micromatriz para reducir el ruido y minimizar la pérdida de señal. El CCD es capaz de alcanzar velocidades de lectura suficientes para el análisis de la micromatriz (4 marcos/s) y suficiente relación señal-ruido para la obtención de las imágenes de la micromatriz sin necesidad de refrigeración por CCD.

Como prueba de concepto para el sistema óptico, hibridamos los amplicones de PCR generados por las cámaras de PCR de aluminio SRI y los conjuntos de TEC y leímos los resultados mediante el uso del sistema óptico descrito. El protocolo de prueba incluyó sondas manchadas (identificadas por nuestro instrumento de síntesis rápida de ADN), incubación a bordo a 37 °C durante 5 minutos, múltiples lavados rigurosos a temperaturas crecientes de 37 °C a 60 °C, y el empaque óptico para captura de imagen. Hibridamos un control negativo con solo el analito control (A3), el amplicón resultante de 10 copias en PCR y el amplicón de 50 copias en PCR. Los resultados del ensayo han demostrado su selectividad mediante la hibridación de muestras de control negativo y muestras amplificadas a partir de cebadores individuales para AGG y STX2. Las imágenes de la hibridación demostraron que las sondas objetivo son claramente visibles en los casos del molde de 10 y 50 entradas y no están presentes en el caso del control A3.

Fabricación de bajo costo y gran volumen de la iMFC consumible. Desarrollamos un plan de proceso de fabricación para reducir los costos de fabricación de la iMFC para la producción de alto volumen. Debido a que el moldeo por inyección es un método simple y económico para crear partes, moldeamos por inyección las capas superior e inferior de la tarjeta, así como también el módulo de lisis y el bloque de reactivos. Las capas laminadas restantes de la tarjeta se fabrican en un proceso automatizado de rollo a rollo, en el que los rollos de materiales se laminan juntos, se cortan con láser y luego se rebobinan en otro rollo, todo en el mismo sistema de equipo de manera rápida y canalizada. Con altos volúmenes de producción del orden de millones de tarjetas, el costo puede llegar a ser tan bajo como $10 por tarjeta.

Enfoque de detección del ADN. Nuestro sistema tiene la capacidad de sintetizar aliados fotolitográficos de matrices de oligonucleótidos con todas las sondas posibles en un amplicón en menos de 10 horas, por lo que podemos seleccionar las sondas adecuadas y realizar la transición de un ensayo de PCR de banco de laboratorio a nuestra plataforma en aproximadamente 2 semanas. Como se muestra en la presente descripción, hemos demostrado con éxito esta capacidad para desarrollar un ensayo de amplificación, realizar la transición a la PCR en la iMFC y seleccionar sondas para E. coli O104:H4.

Enfoque de detección de ARN viral. La detección del virus de ARN usa los mismos módulos que para la detección de ADN, con un ensayo microfluídico para la transcripción inversa de un genoma del virus de ARN y la amplificación. Hemos demostrado una prueba de concepto de este enfoque mediante el uso de un ensayo que puede distinguir la influenza estacional y la porcina. El enfoque adoptado para desarrollar el ensayo de influenza es generalizable y puede usar el mismo enfoque para virus de ARN de los agentes seleccionados.

Para la identificación de la influenza, nuestra primera etapa fue identificar cebadores que amplificarían selectivamente un segmento del gen de la matriz de la influenza A, así como también porciones del gen de la hemaglutinina que distinguen las cepas H1 (porcina) y H3 (estacional). Nuestro protocolo de RT-PCR implica una etapa de transcripción inversa (RT) de 5 minutos a 42 °C, donde los cebadores inversos se aparean con el ARN objetivo e inician la síntesis de la primera hebra de ADN. Luego, una desactivación de 2 min de la transcriptasa inversa y un "inicio en caliente" de la polimerasaTaq simultánea permiten que los cebadores directos se hibriden con la primera hebra de ADN y sinteticen la segunda hebra de ADN. En este punto, comienzan 40 ciclos de PCR con desnaturalización de 10 s a 95 °C, hibridación de 20 s a 62 °C y una extensión de 5 s a 75 °C. Una vez que se logra una buena amplificación en un instrumento de mesa de laboratorio, pasamos a nuestro sistema de amplificación modular, que simula la amplificación en nuestra iMFC. Debido a la rápida aceleración de la temperatura en este sistema, el protocolo de RT-PCR descrito anteriormente tarda <33 min. Los productos de RT-PCR se evalúan primero mediante el uso de electroforesis en gel y luego en una micromatriz. Se obtuvieron los resultados de la electroforesis en gel para la amplificación modular de la matriz y los genes de hemaglutinina para la cepa de gripe porcina CA 2009 (H1N1) y la cepa estaciona1HK 68 H3N2 (una amplificación triple). El amplicón de 244 pb indica el gen de la matriz de influenza A. El amplicón de hemaglutinina para la cepa HI es de 173 pares de bases, mientras que el amplicón de H3 es de 177 pares de bases. La hibridación para secuenciar sondas específicas en una micromatriz de ADN proporciona una diferenciación inequívoca de las cepas H1 y H3.

La primera etapa para lograr una detección sensible y selectiva en una micromatriz es la preparación de un chip de selección de sonda sintetizado fotolitográficamente que contiene 20-25 sondas mer que cubren todo el amplicón para nuestros objetivos de interés. Nuestra capacidad para sintetizar en menos de un día todas las sondas posibles en un amplicón de interés significa que podemos probar empíricamente sondas sensibles y específicas. A continuación, realizamos experimentos de hibridación en la micromatriz para seleccionar las sondas más sensibles y específicas. Se identificó una selección de sondas que distinguen fácilmente H1 y H3; hay algunas regiones del amplicón que diferencian fácilmente entre los dos amplicones. Las mejores sondas pueden equiparse con una modificación de amina para manchar en portaobjetos de microscopio funcionalizados con epoxi o chips guía de ondas para usar en nuestro dispositivo portátil.

Enfoque de detección de ARNm. El perfil de expresión génica de las células mononucleares periféricas (PBMC) es un método útil para controlar el estado de la enfermedad, la exposición ambiental y el diagnóstico presintomático de la infección. Nuestra iMFC capaz del análisis de la expresión de ARNm usa una versión ligeramente modificada de la plataforma de hardware: un TEC adicional y una mayor uniformidad de iluminación en la micromatriz, y puede realizar: - Selección y lisis de PBMC: mediante el uso de los filtros de exclusión por tamaño comerciales para la purificación de PBMC a partir de sangre total, y el módulo selector de células descrito en la presente descripción.

- Purificación del ARNm: captura el ARNm de las células lisadas mediante el uso de microesferas recubiertas con oligonucleótidos poli-T.

- Amplificación y marcaje de T7 linear: usar la cámara de PCR actual para la amplificación y el marcaje de T7 y los kits disponibles comercialmente.

- Hibridación rápida: usar medidas cinéticas de hibridación para determinar la concentración del analito; reducir el tiempo requerido para las hibridaciones de expresión génica de muchas horas a minutos.

- La amplificación de T7 aprovecha los módulos de PCR de la iMFC existentes y los kits disponibles comercialmente.

Purificación del ARNm. Para la purificación del ARNm, usamos un módulo de purificación microfluídica que puede hibridar ARNm con perlas recubiertas de poliT, eliminar las contenciones y luego liberar el ARNm de las perlas de poliT. Usamos una batidora que mantiene las microesferas de perlas ~5 pm en solución y un nuevo TEC para fundir el ARNm capturado de las perlas después de una etapa de lavado. Hemos probado el dispositivo para verificar que las perlas de 5 ^m se muevan bien entre la cámara de mezcla más abajo y el filtro. También hemos demostrado que el fluido puede calentarse a -80 °C para permitir la desnaturalización del dúplex polyT: ARNm.

Hibridación rápida. Para disminuir el tiempo de hibridación y mejorar la repetibilidad, inferimos la concentración a partir del parámetro de velocidad cinética. En situaciones en las que el número de transcripciones objetivo es superior al número de sondas, el valor de la señal frente al tiempo debe seguir una curva cinética:

Y =C( 1 - ert), r = koff+ [A]kon

En la ecuación, Y es la señal sustraída del fondo; koff y kon son los parámetros cinéticos que dependen de la temperatura, la secuencia de genes y el desplazamiento de la sonda; [A] es la concentración del gen objetivo en solución; y C es un factor de escala que depende de múltiples factores que incluyen la intensidad de la luz, la densidad de la sonda, la concentración del objetivo y los parámetros cinéticos. Nuestra técnica de selección de sondas estima koff y kon ajustando la ecuación a la serie temporal de señales de hibridación en múltiples concentraciones. Estas estimaciones pueden almacenarse y usarse en tiempo real para estimar [A]. Debido a que las variaciones en la intensidad de la luz y la densidad de síntesis de la sonda afectan el parámetro C, pero no las variables dentro de la exponencial, esta técnica cinética mejora significativamente la repetibilidad de la repetición de chip a chip y del mismo chip.

Como prueba de concepto, hemos experimentado con el enfoque de velocidad cinética, comenzando con objetivos oligoméricos sintetizados de 25 pares de bases. En una respuesta cinética de una sonda al oligonucleótido marcado de control A3. Cada línea representa la respuesta a una concentración diferente de A3: 50 nM, 100 nM, 300 nM. Se usa un ajuste por mínimos cuadrados no lineal para estimar los parámetros Cyr para cada serie de tiempo. Luego, los experimentos a múltiples concentraciones [A] revelan la relación afín entre ry [A].

Identificamos condiciones que crean una relación sensible y repetible entre r y [A]. Nuestros datos muestran que la relación puede ocurrir en la dirección correcta, con r= (0,003l, 0,0033 y 0,0058) s-1 para [A] = (50, 100, 300) nM. Un beneficio adicional del ajuste de la curva cinética es que incluso si el valor de equilibrio C resulta ser mejor que la velocidad cinética r, el proceso de ajuste promedia el ruido a corto plazo. También observamos que la capacidad de medir parámetros cinéticos depende del uso de la iMFC de una onda evanescente para excitar solo moléculas fluorescentes que están unidas a la superficie del chip, lo que proporciona una alta relación señal a fondo incluso cuando la solución objetivo está en su lugar.

Enfoque de detección de proteínas. Una forma de expandir las capacidades de detección de la plataforma iMFC para incluir biomarcadores de proteínas es el inmunoensayo de microesferas, que usa anticuerpos marcados con un oligonucleótido para crear ADN objetivo amplificable no lineal cuando el antígeno objetivo está presente, y hemos desarrollado un módulo de inmunoensayo con la plataforma iMFC basada en el ensayo inmuno-PCR de microesferas demostrado por SRI (MSiPCR). Los anticuerpos específicos del objetivo biotinilados se conjugan en perlas de poliestireno de 6 ^m recubiertas con estreptavidina para la captura inicial del antígeno objetivo. Los anticuerpos específicos del objetivo separados se conjugan químicamente con un oligonucleótido para un segundo evento de captura de la proteína objetivo. El lavado extenso entre los dos eventos de captura de proteínas elimina cualquier objetivo no unido, así como también los conjugados libres. La porción restante de la perla se amplifica luego mediante el uso de un conjunto de cebadores marcados específicos junto con una sonda taqman. La señal del ácido nucleico amplificado se hibrida subsecuentemente en una micromatriz para su detección y lectura. Hemos migrado nuestro ensayo de mesa de laboratorio a la plataforma iMFC: nuestro sistema modular de prueba de concepto para la plataforma iMFC incorpora un mezclador de fuelles para las etapas de lavado e incubación, junto con un filtro para atrapar las perlas después de la amplificación del ácido nucleico.

Mejoras del sistema. El bloque óptico puede modificarse para proporcionar un patrón más uniforme en la rejilla de la micromatriz y para usar una excitación de 532 nm para mejorar la relación señal-ruido de detección. El proceso para cambiar de una fuente de luz de excitación de 635 nm a 532 nm es solo una cuestión de cambiar el tono de la rejilla.

Este bloque de ópticas modificadas consiste en ópticas de iluminación de objetivos láser y ópticas de formación de imágenes de micromatriz. La óptica de iluminación del objetivo láser usa un pequeño módulo láser de estado sólido bombeado por diodos (DPSS), ópticas de escaneo y enfoque, y un espejo de sistemas microelectromecánicos de escaneo 2D (MEMS). El módulo láser DPSS puede generar un rayo láser de 40 mW a 532 nm para excitar moléculas marcadas con Cy3. El rayo puede enfocarse en el espejo MEMS mediante el uso de la óptica de enfoque. El espejo 2D MEMS puede escanear el punto sobre un rectángulo y apuntar el rayo a la rejilla. Después de reflejarse en el espejo de escaneo, el rayo golpea la lente de escaneo, que colima el rayo antes de que entre en la rejilla del chip de la micromatriz.

Este sistema escanea el mismo punto de láser en toda la rejilla y, por lo tanto, en toda la micromatriz. Esto elimina la falta de uniformidad de la iluminación de la óptica generadora de líneas, que puede variar hasta en un 25 % en intensidad. La lente de escaneo también nos permite colimar el rayo antes de que entre en la rejilla del chip de la micromatriz. Validamos con una demostración de prueba de concepto del nuevo enfoque técnico de escaneo. La óptica de formación de imágenes de la micromatriz no ha cambiado con respecto al bloque óptico actual, con la excepción de los filtros para las diferentes longitudes de onda de excitación (532 nm) y emisión (570 nm).

Referencias

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Descripción detallada de las modalidades adicionales y ejemplos de las mismas: Clasificación activada por fluorescencia (FACS) de alto rendimiento para solicitudes novedosas en la atención, portátiles y altamente integradas.

Los instrumentos FACS comerciales de alta gama alcanzan velocidades de clasificación de 10 000 a 40 000 clasificaciones/s al desviar electrostáticamente las células contenidas dentro de las gotas cargadas. [1, 2] Pueden aplicarse a una amplia gama de solicitudes, por ejemplo, aislamiento de células T dirigidas al cáncer para inmunoterapia, enriquecimiento de células madre para ingeniería de tejidos y separación de células específicas para manipulación o análisis adicional (por ejemplo, secuenciación de ADN, expresión de ARN e hibridación in situ por fluorescencia). Sin embargo, son instrumentos grandes y costosos que requieren operadores expertos y, por lo tanto, no son adecuados para solicitudes portátiles o de atención. Adicionalmente, su naturaleza monolítica significa que no pueden integrarse fácilmente con otros instrumentos o procesos.

En un intento por abordar estas limitaciones, los investigadores han desarrollado muchas variedades de FACS microfluídicos. Hasta hace poco, estos dispositivos eran lentos (más de un orden de magnitud más lento que los FACS convencionales) y la mayoría eran difíciles de fabricar o de cualquier otra manera inadecuados para la fabricación y la aplicación práctica. Con el desarrollo del clasificador de células activadas por láser pulsado (PLACS), el estado de la técnica microfluídica aumentó a ~ 10000 células/s con alta pureza [3]. En el PLACS, las células se clasifican mediante el uso de un chorro de fluido producido por una burbuja de plasma que se expande y contrae rápidamente. Si bien el dispositivo fluídico es simple, económico y desechable, el sistema requiere un láser pulsado de alta velocidad de repetición, que es caro y grande. Por lo tanto, el PLACS no logra abordar los desafíos de escala y gasto.

Revelamos un enfoque más simple para la actuación de fluidos basado en EAP, que son polímeros que cambian de forma en respuesta a la estimulación eléctrica. Se han usado en dispositivos microfluídicos para cambiar la geometría de la sección transversal de canales, generando pequeñas inyecciones para separaciones electroforéticas [4], modificando la resistencia fluídica de un canal y despejando bloqueos [5]. Hemos desarrollado un nuevo actuador EAP microfluídico de alto rendimiento (pEAP) y lo hemos integrado en un micro-FACS.

Actuación del polímero electroactivo. Nuestro actuador fluídico comprende una cámara de fluido sin salida en la que una o más superficies comprenden un EAP. En una implementación, el piso de la cámara es un electrodo cubierto con una capa delgada de EAP (-12 pm) de elastómero dieléctrico (silicona). Conceptualmente, la silicona actúa como un capacitor flexible. Se distorsiona cuando se aplica una tensión al electrodo, lo que aumenta el volumen de la cámara y extrae el fluido hacia la cámara. Cuando se libera la tensión, la silicona se relaja y empuja el fluido de la cámara.

Los actuadores EAP se fabrican fácilmente mediante el uso de las técnicas de fabricación a microescala probadas. Para crear actuadores, modelamos electrodos en un portaobjetos recubierto de óxido de indio y estaño, que se convierte en el sustrato base. Luego, giramos una capa de silicona sin curar sobre el portaobjetos y lo curamos térmicamente. Para crear la capa de canal, moldeamos canales microfluídicos mediante el uso de litografía suave convencional. Luego completamos los dispositivos alineando y uniendo con plasma la capa del canal al portaobjetos recubierto de silicona. La compatibilidad de los actuadores con la litografía suave significa que pueden integrarse fácilmente en una gran biblioteca existente de dispositivos microfluídicos. También permite la creación rápida de prototipos. Los dispositivos son económicos porque solo requieren una fuente de tensión para su activación, y el enfoque de fabricación es adecuado para una fabricación de bajo costo.

En particular, fabricamos actuadores <1 mm2 que demuestren tiempos de respuesta de 10 ps; sin embargo, el tamaño del actuador también puede ser una escala de micrones (por ejemplo, menos de 1, 10 o 100 pm2) y los tiempos de respuesta pueden ser inferiores a 10, 1, 0,1 ps, que los tiempos de respuesta más cortos. Sus opciones de tamaño los hacen particularmente aptos para solicitudes portátiles e integradas y para que aumente el funcionamiento en paralelo.

La velocidad de respuesta rápida de estos actuadores EAP ejemplificados (<20 ps) también indica que clasifican velocidades de > 25000 células/s. Los dispositivos son económicos porque solo requieren una fuente de tensión para su actuación y se construyen mediante el uso de técnicas de microfabricación de bajo costo. El uso de silicona como polímero permite la integración simple de actuadores EAP con canales microfluídicos mediante litografía suave. Esto permite tanto la creación rápida de prototipos como el potencial de ampliación a cantidades de fabricación. El EAP pFACS ofrece un rendimiento equivalente al FACS de mesa de laboratorio en un formato portátil.

Hemos optimizado el rendimiento del EAP pFACS e incorporado el dispositivo mejorado en un módulo de clasificación/concentración de células que se integra con el sistema iMFC. El módulo permite que el sistema aumente la envolvente de operación ya sea concentrando una concentración celular diluida en un gran volumen (por ejemplo, bacterias presentes en muestras ambientales a unas pocas células por ml) o clasificando células seleccionadas de un fondo de muchas células (por ejemplo, células T activadas de una población de células mononucleares de sangre periférica. Las modalidades del microclasificador se describe en más detalle más abajo.

Diseño de los clasificadores. Los clasificadores realizan tres funciones clave: alineamiento, detección y clasificación. Nuestros diseños (por ejemplo, figura 9) incorporan múltiples innovaciones, que incluye la combinación de enfoque hidrodinámico e inercial para el alineamiento, y el uso de la actuación EAP para una clasificación rápida. En los clasificadores de células convencionales, las partículas o células se enfocan tanto horizontal como verticalmente mediante el uso de un flujo envolvente coaxial que aprieta la corriente de muestra en una línea estrecha. Dado que la mayoría de los dispositivos microfluídicos son planos, solo pueden enfocar partículas en una dirección (es decir, horizontal); los dispositivos multicapa también pueden enfocar partículas vertical o lateralmente, pero son significativamente más complejos de fabricar. Sin el enfoque vertical, las partículas pueden distribuirse a lo largo de la altura del canal, lo que provoca variaciones en la velocidad y superposición. En nuestros diseños, alineamos horizontalmente en la región transversal mediante el enfoque hidrodinámico y verticalmente en el "cuello" largo mediante el enfoque inercial. El enfoque inercial ocurre cuando la velocidad del fluido es lo suficientemente alta como para generar fuerzas de elevación sobre las partículas [6]. La combinación nos permite alinear partículas de manera efectiva en un dispositivo de una sola capa, que conserva nuestro enfoque de fabricación simple.

Para la clasificación, primero detectamos partículas mediante el uso de fluorescencia, donde tras la detección de una partícula objetivo, se aplica un pulso de tensión a uno o más actuadores EAP. Los actuadores crean un flujo transversal transitorio que desvía las partículas objetivo hacia una nueva línea de la trayectoria que conduce a la salida de la clasificación, como se muestra en la figura 9.

La figura 9 representa (a) el esquema del microclasificador EAP que muestra la disposición del canal del pEAP FACS. Las imágenes insertadas ilustran las funciones principales del canal. El alineamiento horizontal se logra mediante el enfoque hidrodinámico (izquierda), mientras que el alineamiento vertical se logra mediante el enfoque inercial (centro). Finalmente, las partículas objetivo se clasifican mediante los actuadores pEAP (derecha). La imagen de exposición extendida muestra rayas de una partícula clasificada y sin clasificar. El régimen de flujo fue de 8 pl/min (107 mm/s) y el pulso de actuación fue de 1 ms a 400 V.

El uso de actuadores emparejados que operan 180° fuera de fase mejora significativamente el rendimiento al duplicar la fuerza aplicada al fluido y reducir la resistencia fluídica, que es proporcional a la longitud del canal. Con dos actuadores, uno "tira" mientras que el otro "empuja" el fluido, y el fluido se desplaza solo a lo largo de la corta distancia entre los actuadores (típicamente ~ 2 mm). Por el contrario, con un solo actuador, el desplazamiento del fluido se produce desde el actuador hasta las salidas del dispositivo (~ 30 mm).

Para probar nuestros dispositivos jFACS, usamos un sistema de detección y control, los cuales consisten de un microscopio epifluorescente, una cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD), tubos fotomultiplicadores, un sistema de adquisición de datos basado en una matriz de compuerta programable en campo (FPGA) y amplificadores de tensión.

Demostración de la separación inicial de partículas. Para demostrar las capacidades de separación del clasificador |jEAP, clasificamos una mezcla de partículas fluorescentes verdes (7 jm ) y rojas (5 jm ) mediante la activación de la señal de fluorescencia verde y la aplicación de un pulso de 620 V y 500 js a los actuadores EAP. El régimen de flujo de fluido fue de 10 jl/min, lo que resultó en una velocidad lineal media de 133 mm/s. Las células no clasificadas siguieron su trayectoria previamente determinada hacia el canal de desecho, mientras que las células clasificadas se desviaron a una línea de ruta que salía a través del canal de clasificación (Figura 10). Capturamos volúmenes de fluido de 10 j l de ambas salidas de canal con la clasificación desactivada y activada. Se obtuvieron imágenes de los volúmenes en citómetros manuales separados. En base a los resultados del citómetro, estimamos una pureza del 100 % y un rendimiento del 93 %.

Optimización del rendimiento del actuador. Después de nuestra prueba de concepto inicial, iniciamos un estudio de diseño de los actuadores fluídicos EAP para mejorar nuestro rendimiento de clasificación. Desarrollamos modelos electromecánicos simplificados de los actuadores mediante el uso de COMSOL Multifísica. Nuestros resultados indicaron que la mayor parte de la actuación se produce en el perímetro de los dispositivos. En base a estos resultados, desarrollamos una gama de diseños de actuadores y probamos empíricamente su rendimiento. Al aumentar la tensión aplicada y modificar la geometría del actuador, pudimos mejorar el rendimiento de los actuadores EAP. Clasificamos partículas con éxito a un régimen de flujo de 30 jl/m in (400 mm/s) con un pulso de 25 js , 800 V, una mejora de 20 veces con respecto al clasificador usado en nuestra demostración inicial de separación de partículas.

Demostración de la clasificación de células. Para demostrar la separación celular dentro del jEAP FACS, preparamos una muestra de linfocitos de ratón con células B marcadas con fluorescencia. Los glóbulos blancos se separaron mediante centrifugación y luego se fijaron antes del marcaje con el anticuerpo B220 conjugado con ficoeritrina. La muestra se ingresó en el FACS. La figura 11 muestra una imagen de una célula B clasificada. La clasificación se realizó con un pulso de 100 js , 800 V, a 11 jl/m in (147 mm/s). Tenga en cuenta que la franja fluorescente es más brillante en el centro. Dado que las células marcadas son significativamente más tenues que las partículas fluorescentes, usamos un láser de diodo de 488 nm para iluminar la célula en la región de detección, mientras que la lámpara de diodo emisor de luz (LED) más tenue proporciona una iluminación de campo de visión completo. Los puntos brillantes a la derecha son células que quedaron atrapadas en la pared por un filamento contaminante.

Integración de clasificadores múltiples. Debido a su sencilla fabricación y compatibilidad con la litografía suave, el clasificador jEAP puede integrarse fácilmente en dispositivos más complejos. Para ilustrar las capacidades de integración de nuestros actuadores EAP, desarrollamos dispositivos adicionales con múltiples clasificadores independientes. La figura 12 muestra la clasificación en paralelo en un dispositivo de dos canales, en donde la exposición prolongada muestra dos partículas clasificadas independientemente en canales paralelos, y la figura 13 muestra la clasificación en serie de dos etapas en múltiples salidas, en donde la exposición prolongada muestra dos partículas clasificadas por dos clasificadores en serie en uno de los tres contenedores - nota: El contenedor 3 era el contenedor previamente determinado (sin clasificar). Análogamente se construyen configuraciones de clasificación en serie de múltiples canales en paralelo y de múltiples etapas de orden superior.

Nuestro clasificador de células microfluídicas activadas por fluorescencia (jFACS) proporciona todas las funciones necesarias para clasificar partículas: alinear las partículas, detectar sus señales fluorescentes, tomar decisiones de clasificación en base a la fluorescencia y luego clasificar adecuadamente. Las capacidades demostradas incluyen: clasificación de partículas con múltiples longitudes de pulso del actuador tan bajas como 20 js ; clasificación con configuraciones de actuador único y múltiple; clasificación en paralelo independiente en un clasificador de canales múltiples; clasificación secuencial en clasificadores de etapas múltiples. Los beneficios de los clasificadores de polímeros microelectroactivos (jEAP) incluyen: (a) La clasificación se activa rápidamente mediante una simple entrada eléctrica (se demuestra la clasificación de 20 jseg); (b) los actuadores jEAP son compatibles con una variedad de técnicas de microfabricación; y (c) los clasificadores jEAP se integran fácilmente, pueden paralelizarse y se adaptan bien a los dispositivos en escala portátil.

Referencias

[1] H. M. Shapiro, Practical Flow Cytometry, John Wiley y Sons, 2003.

[2] M. E. Piyasena y S. W. Graves, "The intersection of flow cytometry with microfluidics and microfabrication," Lab on a Chip, 14, 1044-1059, 2014.

[3] Y. Chen, T.-H. Wu, Y.-C. Kung, M. A. Teitell y P.-Y. Chiou, "3D pulsed laser-triggered high-speed microfluidic fluorescence-activated cell sorter," Analyst, 138, 7308-7315, 2013.

[4] A. K. Price, K. M. Anderson y C. T. Culberson, "Demonstration of an integrated electroactive polymer actuator on a microfluidic electrophoresis device," Lab on a Chip, 9, 2076-2084, 2009.

[5] C. Murray, D. McCoul, E. Sollier, T. Ruggiero, X. Niu, Q. Pei, D. Di Carlo, "Electro-adaptive microfluidics for active tuning of channel geometry using polymer actuators," Microfluidics and Nanofluidics, 14, 345-358, 2013.

[6] D. Di Carlo, D. Irimia, R.G. Tompkins y M. Toner, "Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels," Proceedings of the National Academy of Sciences, 104, 18892-18897, 2007.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   i. Un aparato (10), que incluye una tarjeta microfluídica integrada (40), la tarjeta microfluídica integrada comprende:

   un ensamble de placa con canales (600);

   una pluralidad de módulos modulares en conexión microfluídica entre sí y cada uno configurado y dispuesto para detectar ácido nucleico, la pluralidad de módulos modulares incluye:

   un módulo de reactivos (140) configurado y dispuesto para contener y suministrar reactivos a otro de la pluralidad de módulos modulares;

   un módulo de lisis (100) configurado y dispuesto para llevar a cabo la lisis en una entrada de muestra a la tarjeta microfluídica integrada;

   un módulo de purificación (110) configurado y dispuesto para purificar objetivos en la muestra de otro material en la muestra;

   un módulo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (120) configurado y dispuesto para amplificar y marcar los objetivos; y

   un módulo de detección (130) configurado y dispuesto para hibridar los objetivos amplificados y marcados para la detección de los objetivos amplificados y marcados;

   una cámara de entrada (102) configurada y dispuesta para recibir la muestra e introducir la muestra en los canales;

   una pluralidad de puertos (610) y válvulas (630) configuradas y dispuestas para controlar un flujo de fluido dentro de las cámaras fluídicas de la pluralidad de módulos modulares y los canales, el fluido incluye la muestra y los reactivos; y

   al menos un respiradero configurado y dispuesto para eliminar las burbujas de los canales.
2. 2. El aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el módulo de PCR incluye una cámara que tiene superficies o paredes de aluminio.
3. 3. El aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fluido fluye a través de los canales y entre la pluralidad de módulos modulares a través de la pluralidad de puertos configurados y dispuestos para introducir presión en una o más de la pluralidad de válvulas, y la pluralidad de válvulas se configura y dispone para abrir o cerrar en base a la presión introducida en el mismo.
4. 4. El aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el módulo de detección incluye:

   una cámara de mezcla (275) configurada y dispuesta para mezclar una solución, que incluye los objetivos amplificados y marcados, con un tampón de hibridación; y

   una cámara de detección (325) que incluye un pocillo de detección (317) que tiene una micromatriz (315) configurada y dispuesta para unir objetivos hibridados que tienen cebadores.
5. 5. El aparato de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la cámara de detección incluye además un sustrato de vidrio (310) ubicado dentro del pocillo de detección y en donde la micromatriz está dispuesta sobre el sustrato de vidrio e incluye una pluralidad de sondas dispuestas en un patrón de rejilla.
6. 6. El aparato de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el módulo de detección incluye, además:

   óptica de detección de micromatrices, que incluye una fuente de luz, configurada y dispuesta para acoplar luz a la micromatriz, en donde la cámara de detección incluye además un sustrato de vidrio ubicado dentro del pocillo de detección y en donde la micromatriz está dispuesta sobre el sustrato de vidrio e incluye una pluralidad de sondas dispuestas en un patrón de rejilla, el sustrato de vidrio incluye rejillas (305) en el mismo, y en donde la fuente de luz está configurada

   y dispuesta para transmitir luz a través del sustrato de vidrio hacia la micromatriz, y

   en donde el sustrato de vidrio y las rejillas están configurados y dispuestos para dirigir la luz hacia la micromatriz a través del sustrato de vidrio y excitar moléculas sensibles a la luz en la micromatriz al proporcionar campos evanescentes.
7. 7. El aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el módulo de reactivo incluye una solución tampón de lisis, una solución tampón de elución y una solución tampón de hibridación.
8. 8. El aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el módulo de purificación incluye una frita dentro de un canal, y está configurado y dispuesto para unirse con los objetivos y no unirse con el otro material en la muestra.
9. 9. El aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el módulo de PCR incluye:

   una cámara de mezcla de reacción de la PCR (122) que comprende un pocillo y enzimas y está configurada y dispuesta para mezclar una solución, que incluye los objetivos purificados, con las enzimas;

   una cámara de cebadores de la PCR (124) que comprende un pocillo y cebadores y está configurada y dispuesta para mezclar la solución con los cebadores; y

   una cámara de PCR (126) formada de metal pasivado y configurada y dispuesta para recibir la solución mezclada con las enzimas y los cebadores y para amplificar y marcar los objetivos.
10. 10. El aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:

    el módulo de lisis está configurado y dispuesto para llevar a cabo la lisis en la muestra, la muestra incluye los objetivos de ADN, que entran en la tarjeta microfluídica integrada,

    el módulo de purificación está configurado y dispuesto para purificar los objetivos de ADN en la muestra de otro material en la muestra mediante el uso de una frita,

    el módulo de PCR está configurado y dispuesto para amplificar y marcar los objetivos de ADN, y el módulo de detección, que incluye una micromatriz, está configurado y dispuesto para hibridar los objetivos de ADN amplificados y marcados con una micromatriz para la detección de los objetivos de ADN amplificados y marcados.
11. 11. El aparato de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye además una membrana transpirable (440) configurada y dispuesta para eliminar burbujas de al menos uno de los canales y cámaras del módulo de PCR durante el flujo controlado del fluido dentro de al menos una porción del módulo de PCR.
12. 12. El aparato de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el ensamble de placa incluye una pluralidad de capas con una primera capa que incluye los canales y una segunda capa que incluye la membrana transpirable, y en donde la membrana transpirable está configurada y dispuesta para exponer los canales a la presión atmosférica.
13. 13. El aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el flujo controlado del fluido por la pluralidad de puertos y válvulas incluye el flujo de la muestra desde la cámara de entrada al módulo de lisis, desde el módulo de lisis al módulo de purificación y desde el módulo de purificación al módulo de PCR.
14. 14. Un método que comprende:

    introducir una muestra recibida en una cámara de entrada (102) de una tarjeta microfluídica integrada (40) de un aparato (10) en las cámaras y canales fluídicos de la tarjeta microfluídica integrada en donde la tarjeta microfluídica integrada incluye:

    un ensamble de placa con los canales (600);

    una pluralidad de puertos (610) y válvulas (630),

    al menos un respiradero, y

    una pluralidad de módulos modulares, que incluyen las cámaras fluídicas, en conexión microfluídica entre sí y configurados y dispuestos para la detección de ácidos nucleicos; y

    controlar un flujo de fluido que incluye la muestra dentro de los canales de la tarjeta microfluídica integrada y a través de la pluralidad de módulos modulares mediante el uso de la pluralidad de puertos y válvulas, en donde el flujo controlado incluye realizar la detección de ácido nucleico al:

    hacer fluir la muestra desde la cámara de entrada hasta un módulo de lisis (100) y lisar la muestra mediante el uso del módulo de lisis,

    hacer fluir la muestra lisada desde el módulo de lisis hasta un módulo de purificación (110) y purificar los objetivos en la muestra de otro material en la muestra mediante el uso del módulo de purificación, hacer fluir los objetivos purificados desde el módulo de purificación hasta un módulo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (120) y amplificar y marcar los objetivos mediante el uso del módulo de PCR, y eliminar las burbujas de los canales durante el flujo controlado del fluido mediante el uso de al menos un respiradero.