ES2893103T3 - Determinación de la edad de un individuo humano - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar la edad biológica de la piel humana, que comprende: a) determinar un nivel de metilación de al menos dos dinucleótidos CpG de al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 201 como se muestra en las Figuras 1 a 34 de células de piel humana; y b) determinar la edad biológica de dichas células cutáneas comparando cada nivel de metilación determinado con datos determinados empíricamente que representan una correlación entre el nivel de metilación de dicho nucleótido CpG y la edad cronológica de al menos un individuo humano.
Description
DESCRIPCIÓN
Determinación de la edad de un individuo humano
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para determinar la edad biológica de la piel humana mediante el análisis del patrón epigenético de sitios particulares del ADN. Los niveles de metilación en sitios CpG seleccionados de una muestra de piel se evalúan para determinar con precisión la edad biológica de la piel humana. La edad biológica medida se correlaciona luego con la edad cronológica con un error absoluto medio de menos de 5,05 años. La presente invención también se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico para determinar las edades biológicas de la piel humana según el método de la invención, y un medio legible por ordenador para determinar la edad biológica de la piel humana.
Antecedentes de la invención
Se sabe que los cambios epigenéticos del ADN se dan con el tiempo y se han reconocido como indicadores del alcance del proceso de envejecimiento en los seres humanos.
En particular, se ha identificado que el grado de metilación de los dinucleótidos CpG está relacionado con la edad. Se conocen métodos de determinación de la edad biológica mediante el análisis de varios dinucleótidos CpG. En Weidner et al, Genome Biology, 2014 15R24, por ejemplo, se han identificado 102 sitios CpG en sangre relacionados con la edad como adecuados para estimar la edad biológica de un individuo. El método descrito utiliza datos de 3 sitios CpG para lograr una desviación absoluta media de la edad cronológica de menos de 5 años. El documento EP 2711431 también analiza las células sanguíneas y predice la edad cronológica del sujeto basándose en 6 de los 102 sitios CpG relacionados con la edad identificados. Se descubrió que la predicción basada en 6 sitios CpG para determinar la edad biológica difiere de la edad cronológica en aproximadamente 4,53 años hasta 10,30 años. En otro estudio, Horvath descubrió una diferencia de ± 3,6 años entre la edad cronológica y la edad biológica, Genome Biology 2013, 14:R115 caracterizando 353 sitios CpG de células sanguíneas.
El uso de muestras de sangre en el análisis del cambio epigenético no es óptimo debido a los diversos tipos de células que se encuentran en la sangre y que tienen diferentes patrones de metilación del ADN. Además, las infecciones bacterianas y víricas pueden alterar significativamente la composición celular en sangre, que puede cambiar el patrón de metilación.
La piel humana también se ha utilizado como modelo para el análisis de los cambios epigenéticos relacionados con la edad y se ha correlacionado con la edad cronológica de un individuo. El predictor conocido según Horvath, Genome Biology 2013, 14:R115 se utilizó en la epidermis humana en Bormann et al, Aging Cell, 2016, 15, página 563 a 571 y se descubrió que el error de predicción absoluto promedio era de 14,5 años. Esto muestra que el predictor publicado subestima la edad cronológica de las muestras de epidermis. En Bormann et al, Aging Cell, 2016, 15, página 563 a 571, se desarrolló un predictor adicional utilizando la metilación de 450.000 dinucleótidos CpG, que fueron analizados simultáneamente mediante un enfoque basado en matrices. La edad biológica determinada con el método en el mismo estuvo dentro de un error de menos de 5,25 años de la edad cronológica. Sin embargo, el inconveniente de este método es la gran cantidad de sitios que deben analizarse, que consume mucho tiempo y es costoso.
Por tanto, es deseable proporcionar métodos mejorados y/o alternativos para determinar la edad biológica de un individuo. Preferentemente, se desea proporcionar un método que utilice un número reducido de sitios CpG.
Sumario de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con un primer aspecto, se proporciona un método para determinar la edad biológica de la piel humana que comprende:
a) determinar un nivel de metilación de al menos dos dinucleótidos CpG de al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 201 como se muestra en las Figuras 1 a 34 de células de piel humana; y
b) determinar la edad biológica de dichas células cutáneas comparando cada nivel de metilación determinado con datos determinados empíricamente que representan una correlación entre el nivel de metilación de dicho nucleótido CpG y la edad cronológica de al menos un individuo humano.
En el presente documento se desvela un método de prueba de un principio activo que comprende el método de acuerdo con el primer aspecto, que comprende además las etapas de:
c) poner en contacto las células de la piel de la etapa a) con un principio activo in vitro;
d) determinar la edad biológica de las células cutáneas de la etapa c) según el método del primer aspecto; y e) comparar la edad biológica determinada en las etapas a) a b) con la edad biológica determinada en la etapa d).
De acuerdo con un segundo aspecto, se proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico para determinar la edad biológica de la piel humana de acuerdo con el método del primer aspecto, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
a) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 201 como se muestra en las Figuras 1 a 34;
b) una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de nucleótidos de a) por sustitución de como máximo el 10% de los nucleótidos, preferentemente como máximo 5 de los nucleótidos, pero para dicho dinucleótido CpG;
c) una secuencia de nucleótidos que se corresponde con la hebra complementaria de la secuencia de nucleótidos a) o b).
De acuerdo con un tercer aspecto, se proporciona un medio legible por ordenador que tiene instrucciones ejecutables por ordenador almacenadas para hacer que un ordenador realice un método para determinar la edad biológica de la piel humana que comprende:
a) ingresar al menos dos valores de un nivel de metilación determinado de al menos dos dinucleótidos CpG de al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO:1 al SEQ ID NO: 201 tal como se muestra en las Figuras 1 a 34 de células de piel humana;
b) comparar dicho valor del nivel de metilación determinado con los datos almacenados que representan una correlación entre el nivel de metilación de dicho dinucleótido CpG y la edad cronológica de al menos un individuo humano; y
c) mostrar la edad biológica.
En el presente documento se desvela, pero no forma parte de la invención, un kit para determinar la edad biológica de la piel humana según el método del primer aspecto, que comprende al menos un cebador oligonucleotídico para amplificar y/o secuenciar al menos dos nucleótidos CpG de al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID nO: 201.
Ciertas realizaciones de la presente invención pueden proporcionar una o más de las siguientes ventajas:
la facilidad deseada para la recolección de muestras del individuo;
velocidad deseada de obtención de datos bioinformáticos;
la facilidad deseada para obtener datos bioinformáticos;
recopilación de datos rentable deseada;
precisión deseada de la predicción de la edad.
Breve descripción de los dibujos
La invención se ilustrará además con referencia a las siguientes figuras:
Fig 1 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 1 a 6;
Fig 2 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 7 a 12;
Fig 3 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 13 a 18;
Fig 4 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 19 a 24;
Fig 5 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 25 a 30;
Fig 6 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 31 a 36;
Fig 7 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 37 a 42;
Fig 8 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 43 a 48;
Fig 9 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 49 a 54;
Fig 10 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 55 a 60;
Fig 11 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 61 a 66;
Fig 12 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 67 a 72;
Fig 13 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 73 a 78;
Fig 14 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 79 a 84;
Fig 15 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 85 a 90;
Fig 16 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 91 a 96;
Fig 17 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 97 a 102;
Fig 18 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 103 a 108;
Fig 19 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 109 a 114;
Fig. 20 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 115 a 120
Fig. 21 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 121 a 126
Fig. 22 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 127 a 132
Fig. 23 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 133 a 138
Fig. 24 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 139 a 144
Fig. 25 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 145 a 150
Fig. 26 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 151 a 156
Fig. 27 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 157 a 162
Fig. 28 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 163 a 168
Fig. 29 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 169 a 174
Fig. 30 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 175 a 180
Fig. 31 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 181 a 186
Fig. 32 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 187 a 192
Fig. 33 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 193 a 198
Fig. 34 tabla de sitios CpG y secuencias de nucleótidos para las SEQ ID No: 199 a 201
Fig. 35 gráfico que representa el cambio en la mutilación con la edad para dos marcadores CpG ilustrativos: cg06335867y cg13848598;
Fig. 36 gráfico que representa una correlación de la edad cronológica con la edad biológica utilizando los marcadores cg06335867 y cg13848598, usando la fórmula: 70,002 8,992*cg06335867 12,998*cg13848598
Se entiende que la siguiente descripción y referencias a las figuras se refieren a realizaciones ilustrativas de la presente invención y no limitarán el alcance de las reivindicaciones.
Descripción detallada
La presente invención se basa en el descubrimiento de que el nivel de metilación de nucleótidos CpG seleccionados puede determinar la edad biológica de la piel humana.
Un aumento de la edad (envejecimiento) es el proceso de envejecimiento. La edad se puede ver de varias formas, como la edad cronológica y la edad biológica.
Tal como se usa en el presente documento, el término "edad cronológica" se refiere a la cantidad de tiempo que ha transcurrido desde el nacimiento de un individuo. El término "individuo" como se usa en el presente documento se refiere a un individuo humano.
Tal como se usa en el presente documento, la "edad biológica" se refiere a los cambios físicos en un individuo, como el alcance de los cambios epigenéticos del ADN. El alcance de los cambios epigenéticos del ADN se determina en muestras de piel. La edad biológica se determina a partir de muestras de piel y se correlaciona con la edad biológica del individuo. La edad biológica como se describe en el presente documento se determina usando el método del primer aspecto de la presente invención. En particular, el nivel de metilación de dinucleótidos CpG específicos se evalúa como parte de la presente invención. Se puede determinar el nivel de metilación, por ejemplo mediante PCR específica de metilación, análisis de secuencia de ADN tratado con bisulfito, secuenciación de CHIP (tecnología Illumina Methylation BeadChip), ensayo de sonda de inversión molecular, secuenciación de metil-CAP, secuenciación de última generación, Ensayo COBRA, patrones de restricción específicos de metilación o ensayo MassARRAY.
En determinadas formas de realización, la edad biológica de la piel humana es igual a la edad biológica del individuo.
La edad biológica puede verse influenciada por muchos parámetros, como antecedentes genéticos, enfermedad y estilo de vida.
La edad biológica puede diferir de la edad cronológica. La edad biológica puede proporcionar una indicación de la salud del individuo en comparación con la edad cronológica. Si, por ejemplo, la edad biológica es menor que la edad cronológica, se puede concluir que a nivel biológico los signos del envejecimiento son menos predominantes de lo esperado. Esto puede indicar que el individuo goza de buena salud. Como alternativa, si la edad biológica es mayor que la edad cronológica, puede tomarse como una señal de que el individuo tiene mala salud.
En determinadas realizaciones, las células de piel humana se obtienen recolectando toda la muestra de piel requerida del individuo. En determinadas realizaciones, la piel humana se obtiene cultivando las células de la piel utilizando un método in vitro.
La recolección de una muestra del individuo puede llevarse a cabo utilizando ampollas por succión, biopsia por punción, biopsia de afeitado o durante cualquier procedimiento quirúrgico como cirugía plástica, levantamiento, injertos o similares.
Las muestras de piel se pueden tomar de la epidermis o la dermis.
Las células de la piel humana se pueden cultivar a partir de una pequeña muestra de células de la piel recolectadas de un individuo. Las células de piel humana recolectadas se cultivan in vitro en un recipiente como una placa de Petri en un medio o sustrato que suministre nutrientes esenciales.
Las células de piel humana utilizadas pueden ser una mezcla de células recolectadas y células cultivadas.
En determinadas realizaciones, la región específica del cromosoma que comprende dinucleótidos CpG puede ser regiones codificantes o regiones no codificantes. En determinadas realizaciones, los dinucleótidos CpG pueden estar presentes en una región codificante y/o una región no codificante. Los dinucleótidos CpG se pueden encontrar en una única región específica o en diferentes regiones específicas.
En la presente invención, la región específica del cromosoma comprende al menos una secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO. 1 al SEQ ID NO. 201 como se muestra en las Figuras 1 a 34. La correlación de cada SEQ ID con el dinucleótido CpG según la invención se muestra en las Figuras 1 a 34.
En determinadas realizaciones, el método del primer aspecto comprende además la etapa de estimar la edad cronológica de los individuos humanos. La correlación entre la edad biológica y la edad cronológica es alta utilizando el método según la invención, donde la diferencia entre la edad biológica y la edad cronológica, el error absoluto medio (EAM) determinado por el método descrito en el presente documento, no es más de aproximadamente 7 años, no más de aproximadamente 6 años, no más de aproximadamente 5,5 años, no más de aproximadamente 5 años, no más de aproximadamente 4,5 años, no más de aproximadamente 4 años, no más de aproximadamente 3,5 años, no más de aproximadamente 3 años, no más de aproximadamente 2 años, no más de aproximadamente 1,5 años, no más de aproximadamente 1 año, no más de aproximadamente 0,5 años, no más de 0 años.
La diferencia en la edad biológica y la edad cronológica se puede determinar para un solo individuo. La desviación de un solo punto de datos de la línea de mejor ajuste superpuesta a los puntos de datos de todos los individuos puede variar desde aproximadamente 0 años hasta aproximadamente 15 años. Por ejemplo, la desviación de un solo punto de datos de la línea de mejor ajuste sería de aproximadamente 0 años, aproximadamente 1 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 6 años, aproximadamente 7 años, aproximadamente 8 años, aproximadamente 9 años, aproximadamente 10 años, aproximadamente 11 años, aproximadamente 12 años, aproximadamente 13 años, aproximadamente 14 años, aproximadamente 15 años. Ésta es una indicación del estado de salud del individuo humano y de la piel humana.
En determinadas realizaciones, la edad biológica de un individuo desconocido se determina como se describió anteriormente. Desde esta edad biológica, la edad cronológica del individuo se estima aplicando el EAM esperado para los puntos de datos de CpG utilizados.
En determinadas realizaciones, la edad biológica y la edad cronológica se utilizan para calcular un valor h, que es indicativo de la salud de un individuo humano y de la piel humana. En determinadas realizaciones, el valor h se calcula según la fórmula (I)
h = edad biológica - edad cronológica (I)
Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se considera que si el valor h obtenido de la fórmula (I) es positivo, el individuo humano tiene mala salud. En este caso, un número h más grande indica que la salud del individuo humano es peor que un número h más pequeño. Si el valor h obtenido de la fórmula (I) es negativo, se puede suponer que el individuo goza de buena salud.
Si el valor h es positivo, se puede desear una reducción de este valor, mejorando así la salud del individuo. El valor h puede reducirse por varios medios, como hacer ejercicio, comer de manera saludable, dormir la cantidad correcta, beber suficiente agua y/o evitar el estrés.
El valor h también se puede reducir aplicando principios activos sobre las células de la piel en forma de agentes farmacéuticos y/o cosméticos. El principio activo puede entrar en contacto con las células de la piel in vitro o in vivo. Utilizando el método in vitro, el principio activo se añade al medio de cultivo de células cutáneas. Utilizando el método in vivo, las células de la piel de un individuo humano pueden ponerse en contacto con el principio activo usando la administración tópica, subcutánea o intradérmica.
Un "principio activo" como se usa en el presente documento es cualquier agente que tenga un efecto terapéutico y/o efecto cosmético en el individuo. Un efecto terapéutico es el tratamiento y/o prevención de una enfermedad. Un efecto cosmético es la mejora del aspecto, tal como tratar y/o prevenir los signos del envejecimiento molecular. Los signos de envejecimiento molecular son, por ejemplo, agotamiento de las células madre, comunicación intercelular alterada, inestabilidad genómica, desgaste de los telómeros, alteraciones epigenéticas, pérdida de proteostasis,
detección de nutrientes desregulada, disfunción mitocondrial, senescencia celular y capacidad proliferativa alterada. En determinadas formas de realización, el principio activo es un agente cosmético. Un agente cosmético cuando se aplica a un individuo puede promover el atractivo, alterar la apariencia, embellecer y/o limpiar. El agente cosmético también puede prevenir y/o tratar los signos del envejecimiento fenotípico de la piel humana como, por ejemplo, la formación de arrugas, la palidez, la reducción de la capacidad de cicatrización de heridas, la pérdida de elasticidad y tirantez.
En determinadas realizaciones, la edad biológica se determina antes y después de poner en contacto las células de la piel con un principio activo. Por ejemplo, se determina la edad biológica, las células de la piel se ponen en contacto con un principio activo, seguido de la determinación de la edad biológica. Se compara la edad biológica antes y después del contacto de las células de la piel con un principio activo. Una reducción de la edad biológica después del tratamiento indica un efecto terapéutico y/o cosmético del principio activo. El tiempo entre el contacto de las células cutáneas con un principio activo y la determinación de la edad biológica puede variar. Las etapas de poner en contacto las células de la piel con un principio activo y determinar la edad biológica pueden repetirse para proporcionar información sobre el efecto del principio activo sobre las células de la piel a lo largo del tiempo. Este método puede tener la ventaja de ser una forma rápida y rentable de identificar compuestos y/o extractos cosméticos y/o farmacéuticos activos.
En determinadas realizaciones, el método según la invención puede tener uno o más de los siguientes efectos: mayor precisión de la estimación de la edad cronológica a partir de la edad biológica;
mayor fiabilidad de la correlación entre la edad cronológica y la edad biológica;
coste reducido de determinar la edad biológica;
tiempo reducido necesario para determinar la edad biológica;
método eficaz para determinar el efecto de agentes farmacéuticos o cosméticos sobre la edad biológica.
La descripción anterior está dirigida a realizaciones particulares de la presente invención con el propósito de ilustrarla. Será evidente, sin embargo, para un experto en la materia, que son posibles muchas modificaciones y variaciones de las realizaciones descritas en el presente documento y que el alcance de la presente invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Muestras de piel y grupo de pacientes
Se recolectaron datos de 108 muestras epidérmicas (Bormann, Aging Cell 2016) de matrices de metilación de ADN (Illumina 450k Bead-Chip). Para obtener los sitios CpG asociados a la edad, se calculó el coeficiente de correlación (r) entre la edad cronológica de las muestras y los valores beta correspondientes para cada sitio CpG. Después del prefiltrado, se seleccionaron 225 sitios CpG asociados a la edad (r> 0,8 o r <-0,8). Se entrenó un modelo lineal multivariable utilizando el conjunto completo de 225 sitios CpG.
Para encontrar combinaciones adecuadas de CpG, el conjunto de muestra completo se dividió en conjunto de entrenamiento y conjunto de prueba. Se eligieron CpG individuales o combinaciones de CpG de al menos dos CpG debido a su precisión de predicción.
En la Figura 2 se muestra una correlación del cambio de metilación dependiente de la edad para dos marcadores de CpG: cg06335867 y cg13848598.
Se recolectaron muestras de piel de voluntarios sanos de entre 23 y 54 años utilizando ampollas por succión. Para muestras de epidermis completa, las partes epidérmicas de la piel se separaron de las partes dérmicas mediante separación por calor. Para aislar queratinocitos, la epidermis se separó de la dermis mediante digestión con dispasa II (Roche 04942078001) y se aislaron los queratinocitos después del tratamiento con tripsina (Life Technologies N.° 25200056).
Aislamiento del ADN y conversión con bisulfito
El ADN se aisló usando el kit de investigación de ADN QIAmp (Qiagen N.° 56504). La conversión de bisulfito de 500 ng de ADN se llevó a cabo utilizando queratinocitos humanos cultivados in vitro y muestras ex vivo de epidermis humana con un kit de bisulfito EpiTect (Qiagen N.° 59104). El ADN se convirtió siguiendo el protocolo del fabricante, pero en el que se utilizó un tiempo de incubación de 4 h 55 min en lugar de 2 h 55 min.
Secuenciación y PCR de amplicones
Para analizar los CpG, los amplicones se generaron mediante PCR. La PCR se llevó a cabo utilizando el ADN convertido con bisulfito y el kit PyroMark PCR (Qiagen N.° 978703). La composición de PCR se muestra en la Tabla 1. La PCR se realizó con una temperatura de hibridación de 55 °C.
Tabla 1: Com osición de PCR
Los fragmentos de PCR se desenredaron en un agrosegel al 1 % en solución tampón TAE y se cortaron del gel. Los amplicones se purificaron usando un kit de extracción en gel Qiaquick (Qiagen N.° 28706).
La secuenciación del ADN se llevó a cabo utilizando un método de secuenciación 454 (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
El grado de metilación se determinó a partir de la proporción de lecturas metiladas y no metiladas.
Cálculo de la edad biológica
Para calcular la edad biológica, se determinó la proporción de metilación en un locus de CpG, para proporcionar el valor beta. Se calculó el valor beta medio (p) para cada locus CpG y cada muestra. Luego se convirtió al valor m (m) usando la fórmula (1):
m = log2(p/1-p) (1)
El valor m puede usarse entonces en, por ejemplo, en una de las ecuaciones establecidas (2) a (4) para cg06335867 y cg13848598:
Edad biológica = 70,002 8,992*cg06335867 12,998*cg13848598 (2)
Edad biológica = 68,785
8598 (3)
Edad biológica = 60,372 6,923*cg06335867 12,904*cg13848598 (4)
Ejemplo 1
Se recolectaron muestras de piel de 6 individuos y se analizaron de acuerdo con los métodos proporcionados anteriormente. Los nucleótidos de CpG analizados fueron cg06335867 y cg13848598. El siguiente cálculo de la edad biológica se realizó mediante la ecuación (2) y se comparó con la edad cronológica.
Sujeto 1
Edad cronológica: 30 años de edad 12
Marcador cg06335867:
Valor de p medido (cg06335867): 0,1702
Valor m calculado (cg06335867) = log2 (0,1702/1-0,1702) = -2,2855326
Marcador cg13848598:
Valor de p medido (cg13848598): 0,25
Valor m calculado (cg13848598) = log2 (0,25/1-0,25) = -1,5849625
Edad biológica:
70.002 8,992 x (-2,2855326) 12,998 x (-1,5849625) = 28,85 años de edad Diferencia entre edad cronológica y biológica: 1,15 años.
Sujeto 2
Edad cronológica: 35 años de edad
Marcador cg06335867:
Valor de p medido (cg06335867): 0,2286
Valor m calculado (cg06335867) = log2 (0,2286/1-0,2286) = -1,7546537
Marcador cg13848598:
Valor de p medido (cg13848598): 0,3775
Valor m calculado (cg13848598) = log2 (0,3775/1-0,3775) = -0,7215972
Edad biológica:
70.002 8,992 x (-1,7546537) 12,998 x (-0,7215972) = 44,84 años de edad Diferencia entre edad cronológica y biológica: 9,84 años.
Sujeto 3
Edad cronológica: 57 años de edad
Marcador cg06335867:
Valor de p medido (cg06335867): 0,1681
Valor m calculado (cg06335867) = log2 (0,1681/1-0,1681) = -2,3070904 Marcador cg13848598:
Valor de p medido (cg13848598): 0,5514
Valor m calculado (cg13848598) = log2 (0,5514/1-0,5514) = 0,2976696
Edad biológica:
70.002 8,992 x (-2,3070904) 12,998 x (0,2976696) = 53,13 años de retención Diferencia entre edad cronológica y biológica: 3,87 años.
Sujeto 4
Edad cronológica: 72 años de edad
Marcador cg06335867:
Valor de p medido (cg06335867): 0,3262
Valor m calculado (cg06335867) = log2 (0,3262/1-0,3262) = -1,0465636
Marcador cg13848598:
Valor de p medido (cg13848598): 0,6071
Valor m calculado (cg13848598) = log2 (0,6071/1-0,6071) = 0,62777201
Edad biológica:
70.002 8,992 x (-1,0465636) 12,998 x (0,62777201) = 68,75 años de retención Diferencia entre edad cronológica y biológica: 3,25 años.
La edad biológica calculada se representó frente a la edad cronológica de cada uno de los seis individuos, como se ve en la Figura 36. El error absoluto medio en estos puntos de datos fue de 5,05 años, lo que demuestra un alto
Claims (11)
1. Un método para determinar la edad biológica de la piel humana, que comprende:
a) determinar un nivel de metilación de al menos dos dinucleótidos CpG de al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 201 como se muestra en las Figuras 1 a 34 de células de piel humana; y
b) determinar la edad biológica de dichas células cutáneas comparando cada nivel de metilación determinado con datos determinados empíricamente que representan una correlación entre el nivel de metilación de dicho nucleótido CpG y la edad cronológica de al menos un individuo humano.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la al menos una secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 51 y el SEQ ID NO: 110.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichos datos comprenden al menos una ecuación de regresión lineal, preferentemente una ecuación que comprende al menos dos regresiones lineales.
4. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la etapa de calcular un valor h indicativo de la salud de un individuo humano, en donde h se calcula en función de la edad biológica y la edad cronológica.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde h se calcula basándose en la diferencia entre la edad biológica y la edad cronológica.
6. Un método de prueba de un principio activo, que comprende el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y que comprende además las etapas de:
c) poner en contacto in vitro las células de la piel humana con un principio activo;
d) determinar la edad biológica de las células cutáneas de la etapa c) según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y
e) comparar la edad biológica determinada en las etapas a) a b) con la edad biológica determinada en la etapa d).
7. El método de la reivindicación 6, en donde el principio activo es un agente cosmético y/o un agente terapéutico.
8. Un método de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7 para identificar un principio activo que impide y/o trata los signos del envejecimiento fenotípico de la piel humana.
9. Uso de una molécula de ácido nucleico para determinar la edad biológica de la piel humana según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
a) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 201 como se muestra en las Figuras 1 a 34;
b) una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de nucleótidos de a) por sustitución de como máximo el 10% de los nucleótidos, preferentemente como máximo 5 de los nucleótidos, pero con la excepción de dicho dinucleótido CpG;
c) una secuencia de nucleótidos que se corresponde con la hebra complementaria de la secuencia de nucleótidos a) o b).
10. Medio legible por ordenador que tiene instrucciones ejecutables por ordenador almacenadas para hacer que un ordenador realice un método para determinar la edad biológica de la piel humana, que comprende:
a) ingresar al menos dos valores de un nivel de metilación determinado de al menos dos dinucleótidos CpG de al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 201 tal como se muestra en las Figuras 1 a 34 de células de piel humana;
b) comparar cada valor del nivel de metilación determinado con los datos almacenados que representan una correlación entre el nivel de metilación de dicho dinucleótido CpG y la edad cronológica de al menos un individuo humano; y
c) mostrar la edad biológica.
11. Medio legible por ordenador de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dichos datos almacenados comprenden al menos una ecuación de regresión lineal, preferentemente una ecuación que comprenda al menos dos regresiones lineales.
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