ES2893861T3 - Formulaciones de anticuerpo estables, acuosas - Google Patents

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Abstract

Una formulación de anticuerpo estable, acuosa que no se ha sometido a temperaturas de congelación que comprende: a. 30 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 2; y b. un 0.006% de polisorbato-20; y c. histidina/histidina HCl 20 mM; y d. trehalosa 250 mM, donde la formulación tiene pH 6.0.

Description

DESCRIPCIÓN
Formulaciones de anticuerpo estables, acuosas
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a formulaciones de anticuerpo estables, acuosas. En algunas realizaciones de referencia, las formulaciones estables, acuosas comprenden de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, y de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20. También se proporcionan métodos para preparar y métodos para utilizar tales formulaciones de anticuerpo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los anticuerpos han sido utilizados en el tratamiento de varias enfermedades y afecciones debido a su especificidad a la hora de reconocer la diana, con lo cual generan unos resultados muy selectivos tras su administración sistémica. Con el fin de que los anticuerpos sigan siendo eficaces, deben mantener su actividad biológica durante su producción, purificación, transporte y almacenamiento. Se han desarrollado nuevas técnicas de producción y purificación para conseguir que se puedan producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales altamente purificados. Sin embargo, siguen existiendo dificultades a la hora de estabilizar estos anticuerpos para su transporte y almacenamiento, e incluso existen todavía más dificultades para proporcionar los anticuerpos en una forma de dosificación que sea adecuada para la administración.
La desnaturalización, agregación, contaminación y formación de partículas pueden ser obstáculos significativos en la formulación y el almacenamiento de anticuerpos. Debido a la amplia variedad de los anticuerpos, no hay condiciones o formulaciones universales adecuadas para el almacenamiento de todos los anticuerpos. Las condiciones y formulaciones óptimas adecuadas para el almacenamiento de un anticuerpo a menudo son específicas para ese anticuerpo. Por tanto, las formulaciones y los métodos de almacenamiento de anticuerpos son a menudo una parte significativa del proceso de investigación y desarrollo para un anticuerpo comercial.
Se han propuesto varios métodos para resolver las dificultades asociadas con la estabilidad de anticuerpos. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo a menudo se liofiliza, y luego se reconstituye poco antes de su administración. Sin embargo, generalmente la reconstitución no es ideal, ya que añade una etapa adicional en el proceso de administración y podría introducir contaminantes en la formulación. Además, incluso los anticuerpos reconstituidos pueden presentar problemas de agregación y formación de partículas. Por tanto, existe la necesidad de proporcionar formulaciones de anticuerpo estables, acuosas que puedan superar las dificultades asociadas con el transporte y almacenamiento.
BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una formulación de anticuerpo estable, acuosa que no se ha sometido a temperaturas de congelación que comprende: 30 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 2, y un 0.006% de polisorbato-20; e histidina/histidina HCl 20 mM; y trehalosa 250 mM, donde la formulación tiene pH 6.0.
La formulación de anticuerpos de la invención puede ser una formulación inyectable, opcionalmente donde la formulación es adecuada para la administración intravenosa, subcutánea o intramuscular.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un recipiente sellado que contiene la formulación de anticuerpo de la invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una forma farmacéutica de dosificación unitaria adecuada para la administración parenteral a un ser humano que comprende la formulación de anticuerpo de la invención en un recipiente adecuado, opcionalmente donde el recipiente adecuado es una jeringa precargada.
La presente divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo estable, acuosa que comprende: (a) de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, y (b) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20.
En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo comprende además un excipiente sin carga. En algunas realizaciones de referencia, el excipiente sin carga es trehalosa. En algunas realizaciones de referencia, la concentración de excipiente sin carga es de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 80 mM. En algunas realizaciones de referencia, la concentración de excipiente sin carga es de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 400 mM.
El anticuerpo puede estar presente en diversas concentraciones. En algunas realizaciones de referencia, la formulación comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/ml del anticuerpo. En algunas realizaciones de referencia, la formulación comprende de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo. En una realización, la formulación comprende 30 mg/ml del anticuerpo.
La formulación puede comprender además arginina. En algunas realizaciones de referencia, la arginina es L-arginina. En algunas realizaciones de referencia, la formulación comprende de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 200 mM de L-arginina. En algunas realizaciones de referencia, la formulación comprende de aproximadamente 120 mM a aproximadamente 140 mM de L-arginina, y de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM de excipiente sin carga. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 125 mM de L-arginina. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 130 mM de L-arginina.
En algunas realizaciones de referencia, la formulación comprende además histidina. En algunas realizaciones de referencia, la concentración de histidina es de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 30 mM. En una realización, la concentración de histidina es de aproximadamente 20 mM.
En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo no se sometió a liofilización.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo estable, acuosa que comprende de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, donde dicha formulación es estable tras almacenamiento a aproximadamente 40 °C durante al menos 1 mes. En algunas realizaciones de referencia, la formulación es estable tras almacenamiento a aproximadamente 25 °C durante al menos 3 meses. En algunas realizaciones de referencia, la formulación es estable tras almacenamiento a aproximadamente 5 °C durante al menos 18 meses. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo almacenado a aproximadamente 40 °C durante al menos 1 mes conserva al menos un 80% de la capacidad de unión a un polipéptido de IL-5R en comparación con un anticuerpo de referencia que no se ha almacenado. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo almacenado a aproximadamente 5 °C durante al menos 6 meses conserva al menos un 80% de la capacidad de unión a un polipéptido de IL-5R en comparación con un anticuerpo de referencia que no se ha almacenado. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo almacenado a aproximadamente 40 °C durante al menos 1 mes conserva al menos un 95% de la capacidad de unión a un polipéptido de IL-5R en comparación con un anticuerpo de referencia que no se ha almacenado. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo almacenado a aproximadamente 5 °C durante al menos 6 meses conserva al menos un 95% de la capacidad de unión a un polipéptido de IL-5R en comparación con un anticuerpo de referencia que no se ha almacenado. En algunas realizaciones de referencia, menos de un 2% del anticuerpo forma un agregado tras almacenamiento a aproximadamente 40 °C durante al menos 1 mes tal como se determina mediante HPSEC. En algunas realizaciones de referencia, menos de un 2% del anticuerpo forma un agregado tras almacenamiento a aproximadamente 5 °C durante al menos 12 meses tal como se determina mediante HPSEC.
En algunas realizaciones de referencia, la formulación está sustancialmente exenta de partículas tras almacenamiento a aproximadamente 40 °C durante al menos 1 mes tal como se determina mediante inspección visual. En algunas realizaciones de referencia, la formulación está sustancialmente exenta de partículas tras almacenamiento a aproximadamente 5 °C durante al menos 12 meses tal como se determina mediante inspección visual.
En algunas realizaciones de referencia, la formulación es una formulación inyectable. En algunas realizaciones de referencia, la formulación es adecuada para administración intravenosa, subcutánea o intramuscular.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un recipiente sellado que contiene una formulación de anticuerpo tal como se describe en la presente. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a una forma de dosificación unitaria farmacéutica adecuada para administración parenteral a un ser humano que comprende una formulación de anticuerpo tal como se describe en la presente en un recipiente adecuado. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo se administra por vía intravenosa, por vía subcutánea, o por vía intramuscular. En algunas realizaciones de referencia, el recipiente adecuado es una jeringa precargada. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada comprende una aguja. En algunas realizaciones de referencia, la aguja es una aguja de pared delgada 29G. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada es una jeringa de plástico o una jeringa de vidrio. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada está hecha de materiales que están sustancialmente exentos de tungsteno.
En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada está recubierta con silicona. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada comprende un émbolo que tiene un disco de resina de fluoropolímero. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada comprende (a) de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, y (b) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada comprende además: (c) de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM de trehalosa, y (d) de aproximadamente 110 mM a aproximadamente 150 mM de L-arginina. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a una jeringa precargada que comprende: (a) de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de c DR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, y (b) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20. En algunas realizaciones de referencia, la formulación comprende además: (c) de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 300 mM de trehalosa.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un kit que comprende la formulación descrita en la presente, el recipiente descrito en la presente, las formas de dosificación unitaria descritas en la presente, o las jeringas precargadas descritas en la presente.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo estable, acuosa que comprende: (a) de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, (b) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20, (c) de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM de trehalosa, (d) de aproximadamente 110 mM a aproximadamente 150 mM de L-arginina, y (e) de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 mM de histidina. En una realización, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo estable, acuosa que comprende: (a) de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, (b) aproximadamente un 0.006% de polisorbato 20, (c) aproximadamente 50 mM de trehalosa, (d) aproximadamente 130 mM de L-arginina y (e) aproximadamente 20 mM de histidina.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo estable, acuosa que comprende: (a) de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, (b) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20, (c) de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 300 mM de trehalosa y (d) de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 mM de histidina. En una realización, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo estable, acuosa que comprende: (a) de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, (b) aproximadamente un 0.006% de polisorbato 20, (c) aproximadamente 250 mM de trehalosa y (d) aproximadamente 20 mM de histidina. En otra realización, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo estable, acuosa que comprende: (a) aproximadamente 30 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, (b) aproximadamente un 0.006% de polisorbato 20, (c) aproximadamente 250 mM de trehalosa y (d) aproximadamente 20 mM de histidina.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de producción de una formulación de anticuerpo estable, acuosa, comprendiendo el método: (a) purificar un anticuerpo hasta de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 400 mg/ml, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10; (b) colocar el anticuerpo aislado en una formulación de estabilización para formar la formulación de anticuerpo estable, acuosa, donde la formulación de anticuerpo estable, acuosa resultante comprende: (i) de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo, y (ii) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de preparación de una formulación de anticuerpo estable, acuosa, comprendiendo el método: (a) purificar un anticuerpo hasta de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 400 mg/ml, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10; (b) diluir el anticuerpo hasta de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml del anticuerpo en una disolución que comprende: (i) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20, (ii) de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM de trehalosa, y (iii) de aproximadamente 110 mM a aproximadamente 150 mM de L-arginina.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de preparación de una formulación de anticuerpo estable, acuosa, comprendiendo el método: (a) purificar un anticuerpo hasta de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 400 mg/ml, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10; (b) diluir el anticuerpo hasta de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo en una disolución que comprende: (i) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20, y (ii) de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 300 mM de trehalosa.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de producción de una formulación de anticuerpo reconstituida que comprende un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, comprendiendo el método: (a) purificar el anticuerpo a partir de un cultivo celular; (b) liofilizar el anticuerpo aislado; (c) añadir el anticuerpo liofilizado a una disolución acuosa para formar una formulación de anticuerpo reconstituida, donde la formulación de anticuerpo reconstituida comprende: (i) de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo, y (ii) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo que comprende un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de c DR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, donde la formulación de anticuerpo está esencialmente exenta de partículas. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo comprende un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, donde la formulación de anticuerpo está esencialmente exenta de glutatión S-transferasa (GST) activa. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo está esencialmente exenta de GST. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo está esencialmente exenta de partículas durante al menos 1 mes cuando se almacena a 38-42 °C. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo está esencialmente exenta de partículas durante al menos 6 meses cuando se almacena a 2-6 °C. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo está esencialmente exenta de partículas durante al menos 18 meses cuando se almacena a 2-6 °C.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de purificación de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, comprendiendo el método: (a) obtener un cultivo celular que comprende el anticuerpo, (b) realizar cromatografía de afinidad con el anticuerpo, (c) realizar intercambio catiónico con el anticuerpo, (d) realizar cromatografía de modo mixto con el anticuerpo. En algunas realizaciones de referencia, el método comprende además un proceso de inactivación de virus y/o un proceso de diafiltración.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno pulmonar en un sujeto, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de las formulaciones de anticuerpo descritas en la presente, los recipientes descritos en la presente, las formas de dosificación unitaria descritas en la presente, o las jeringas precargadas descritas en la presente. En algunas realizaciones de referencia, la enfermedad o trastorno pulmonar es una enfermedad o trastorno eosinofílico. En algunas realizaciones de referencia, la enfermedad o trastorno pulmonar es asma, EPOC, asma eosinofílica, asma eosinofílica y neutrofílica combinadas, asma sensible a aspirina, aspergilosis broncopulmonar alérgica, bronquitis eosinofílica aguda y crónica, neumonía eosinofílica aguda y crónica, síndrome de Churg-Strauss, síndrome hipereosinofílico, eosinofilia pulmonar inducida por fármacos, compuestos irritantes y radiación, eosinofilia pulmonar inducida por infección (hongos, tuberculosis, parásitos), eosinofilia pulmonar relacionada con autoinmunidad, esofagitis eosinofílica, enfermedad de Crohn o combinación de los mismos. En algunas realizaciones de referencia, la enfermedad o trastorno pulmonar es asma. En algunas realizaciones de referencia, la enfermedad o trastorno pulmonar es enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Secuencias de aminoácidos de anticuerpo anti-IL5R.
La figura 2 representa el efecto de polisorbato 20 sobre la fracción de monómero en disolución. Se requiere una concentración de polisorbato por encima de un 0.005% para mantener completamente el nivel de monómero.
La figura 3 representa el efecto de polisorbato 20 sobre los recuentos de partículas subvisibles en disoluciones de 2 g/l. No se muestran datos para partículas > 2 |jm pero presentan un patrón similar a las partículas más grandes. Los datos indican que los niveles de partículas subvisibles en disoluciones de 2 g/l no se controlan por ningún nivel de polisorbato.
La figura 4 representa el efecto de polisorbato 20 sobre los recuentos de partículas subvisibles en disoluciones de 100 g/l. No se muestran datos para partículas > 2 jm pero presentan un patrón similar a las partículas más grandes. Los datos indican que niveles de polisorbato por encima de un 0.003% controlan los niveles de partículas subvisibles en disoluciones de 100 g/l.
Figura 5. Resultados de monómero (%) y otros resultados (%) mediante HPLC en función del pH de la disolución y la concentración de proteína. La pérdida de monómero se minimiza en el intervalo de pH de 5.5-6.5.
Figura 6. Formación de partículas incluyendo partículas subvisibles > 10 jm medidas mediante MFI y partículas visibles evaluadas mediante comparación con patrones en función del pH de la disolución y la concentración de proteína. Los recuentos de partículas subvisibles dependen de la concentración de proteína pero no muestran una tendencia clara con el pH. Se observan más partículas visibles en las disoluciones de concentración de proteína inferior en el intervalo de pH de 5.5-6.5.
Figura 7. Recuentos de partículas subvisibles > 10 jm, relación de aspecto filtrada para eliminar gotitas de aceite de silicona. Los datos comparan los recuentos de sVp justo después del envío con los de después de 1 mes de almacenamiento a 25 °C. Se observan recuentos altos para concentraciones de proteína bajas, independientemente de PS-20.
Figura 8. Recuentos de partículas >10 jm mediante MFI tras transporte simulado para formulaciones y concentraciones de proteína variables. Las formulaciones de fuerza iónica superior son más estables, como lo son las formulaciones de trehalosa con > 10 g/l.
Figura 9. Recuentos de partículas >10 jm mediante MFI tras transporte simulado para formulaciones variables y 2 g/l de proteína. La concentración de arginina debe ser > 50 mM y la concentración de NaCl debe ser > 75 mM. Figura 10. Recuentos de partículas >10 jm mediante MFI tras transporte simulado para formulaciones variables y 2 g/l de proteína. Cualquier concentración de excipiente en este intervalo es aceptable.
Figura 11. Recuentos de partículas >10 jm mediante MFI tras transporte simulado para formulaciones variables y 2 g/l de proteína.
Figura 12. Se muestra la pérdida de monómero para las formulaciones de 2 mg/ml, 20 mg/ml y 100 mg/ml en viales y jeringas precargadas. Todas las PFS muestran una pérdida similar con respecto a los viales y entre sí.
Figura 13. Se muestra una representación gráfica de la estrategia de obtención de intervalos. El color azul indica las formulaciones que contienen arginina o NaCl. El color verde indica la formulación de trehalosa. Los puntos de datos son muestras preparadas y las líneas indican las opciones de intervalo disponibles para lograr dosis intermedias. Figura 14. El plan de pruebas para el estudio de estabilidad n.° 2. Todas las pruebas marcadas se realizarán con la formulación de anticuerpo. El sombreado en color amarillo indica que la prueba se realizará con el placebo. La notación “ABC” indica sometimiento a las siguientes pruebas: potencia (bioensayo), RP-HPLC, cIEF, bioanalizador no reducido y bioanalizador reducido.
La figura 15 es un gráfico que muestra muestras preparadas para definir el espacio de diseño en función de las concentraciones de proteína y polisorbato 20 (“PS-20”) para ambos intervalos de formulación.
La figura 16 es un gráfico de partículas subvisibles mediante MFI a tiempo 0, tras el envío. Los resultados muestran que se forman partículas si no está presente PS-20, pero un 0.002% de PS-20 es suficiente para inhibir la formación de partículas tras el envío.
Figura 17(A-D). Se puntúan las observaciones de partículas visibles frente a patrones de aspecto y se muestran en este caso en el punto de tiempo de 9 meses. Las observaciones se realizaron muy próximas a la luz. Las muestras mostradas incluyen jeringas precargadas (“PFS”) que contienen la formulación de trehalosa (figura 3A), viales que contienen la formulación de trehalosa (figura 3B), PFS que contienen la formulación de arginina (figura 3C) y viales que contienen la formulación de arginina (figura 3D). Los datos apoyan un objetivo de un 0.006% de PS-20 y un intervalo aceptable de un 0.002 - 0.01% de PS-20 en PFS. Se muestran los viales como comparación del peor caso posible.
La figura 18 compara diversos métodos de SVP para captar un aumento con el tiempo de muestra, que se correlaciona con las partículas visibles. La citometría de flujo y los recuentos de partículas pequeñas (>1 y >2 |jm) mediante MFI pueden captar correctamente la tendencia.
La figura 19 es una comparación de las puntuaciones de patrones de aspecto y los resultados de MFI (partículas > 1 jm ) para formulaciones de trehalosa en PFS (figura 5A) y viales (figura 5B). Se observa un buen acuerdo para los dos métodos, ambos de los cuales indican que el intervalo aceptable de PS-20 es de un 0.002 - 0.01%.
La figura 20 representa un diseño de obtención de intervalos tal como se explica resumidamente en el ejemplo 3 y el estudio de estabilidad de lote líder realizado en ABC. La zona sombreada de color naranja indica la formulación de arginina y la zona sombreada de color azul indica la formulación de trehalosa, todas con un 0.006% de PS-20. La figura 21 representa un ejemplo esquemático de un proceso de purificación de anticuerpos.
La figura 22 representa el análisis en gel bidimensional de la fracción no retenida de una columna de proteína A utilizada en la purificación de anticuerpo anti-I L5R.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se debe apreciar que las implementaciones particulares que se muestran y describen en la presente son ejemplos y no se pretende que limiten de ningún modo el alcance de la solicitud. También se debe apreciar que cada una de las realizaciones de referencia y características de la divulgación que se describen en la presente se pueden combinar de cualquier modo.
Las formas del singular “un”, “uno/a” y “el/la”, tal como se utilizan en esta memoria descriptiva, también engloban específicamente las formas en plural de los términos a los cuales hacen referencia, a menos que el contenido indique claramente lo contrario.
A lo largo de la presente divulgación, todas las expresiones de porcentaje, relación y similares son “en peso”, a menos que se indique lo contrario. La expresión “en peso”, tal como se utiliza en la presente, es sinónima de la expresión “en masa” e indica que una relación o porcentaje definido en la presente se obtiene de acuerdo con el peso en lugar del volumen, espesor o cualquier otra medida.
El término “aproximadamente” se utiliza en la presente para referirse a de forma aproximada, en la región de, más o menos, o alrededor de. Cuando el término “aproximadamente” se utiliza conjuntamente con un intervalo numérico, este modifica al intervalo extendiendo sus límites por encima y por debajo de los valores numéricos expuestos. En general, el término “aproximadamente” se utiliza en la presente para modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor indicado con una varianza de un 10%.
Los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el significado que interpreta habitualmente un experto en la técnica a la cual pertenece la presente solicitud, a menos que se defina de otro modo. En la presente se hace referencia a varias metodologías y materiales conocidos por los expertos en la técnica. Las obras de referencia estándar que exponen los principios generales de la tecnología de a Dn recombinante incluyen Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989); Kaufman et al., Eds., “Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine”, CRC Press, Boca Raton (1995); y McPherson, Ed., “Directed Mutagenesis: A Practical Approach”, IRL Press, Oxford (1991).
La presente divulgación se refiere a formulaciones de anticuerpo estables, acuosas. La expresión “formulación de anticuerpo”, tal como se describe en la presente, se refiere a una composición que comprende una o más moléculas de anticuerpo. El término “anticuerpo” no está particularmente limitado en la presente divulgación. Para mayor claridad, se considera un “anticuerpo” en su sentido más amplio y este incluye cualquier inmunoglobulina (Ig), variantes activas o deseadas de esta, y fragmentos activos o deseables de esta (p. ej., fragmentos Fab, anticuerpos camélidos (anticuerpos monocatenarios) y nanocuerpos). El término “anticuerpo” también se puede referir a dímeros o multímeros. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal y puede ser de origen natural o producirse de forma recombinante. De este modo, en el término “anticuerpo” se incluyen todos los anticuerpos humanos, no humanos, humanizados y quiméricos. Normalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de una de las siguientes clases: IgG, IgE, IgM, IgD e IgA; y más habitualmente es una IgG o IgA.
Un anticuerpo de la divulgación puede ser de cualquier origen animal, incluidos los mamíferos y las aves. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo de los métodos de la divulgación es humano, murino (p. ej., de ratón y de rata), de asno, de oveja, de conejo, de cabra, de conejillo de Indias, de camello, de caballo o de gallina. Los anticuerpos “humanos”, tal como se utilizan en la presente, incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados a partir de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas. Véase, p. ej., a la patente de los EE. UU. n.° 5,939,598 de Kucherlapati et al.
Un anticuerpo de la divulgación puede incluir, p. ej., anticuerpos nativos, anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos de anticuerpos que reconocen y/o se unen a uno o más antígenos), anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos (Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); patentes de los EE. UU. n.os 5,591,669 y 5,545,807), anticuerpos y fragmentos de anticuerpos aislados a partir de bibliotecas de fagos para anticuerpos (McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993)). Un anticuerpo purificado mediante el método de la divulgación se puede fusionar de forma recombinante con un polipéptido heterólogo en el extremo N o C o se puede conjugar químicamente (incluidas las conjugaciones covalentes y no covalentes) con polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, un anticuerpo purificado mediante el método de la presente divulgación se puede fusionar o conjugar de forma recombinante con moléculas útiles como marcadores en ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos o toxinas. Véanse, p. ej., a las publicaciones de PCT WO 92/08495, WO 91/14438, WO 89/12624; la patente de los EE. UU. n.° 5,314,995; y el documento EP 396,387.
En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo de la presente divulgación comprende un anticuerpo anti-receptor de IL5 (anti-IL5R). Los anticuerpos de la presente divulgación se unen específicamente a un antígeno de interés o un fragmento de este, y no se unen específicamente a otros antígenos o fragmentos de estos. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IL5R se unirá inmunoespecíficamente a un polipéptido de receptor de interleucina 5 y no se une específicamente a otros polipéptidos. Preferentemente, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de IL-5 presentan una afinidad más elevada por un receptor de IL-5 o un fragmento de un polipéptido de receptor de IL-5 en comparación con la afinidad por otros polipéptidos o fragmentos de otros polipéptidos. La afinidad de un anticuerpo es una medida de su unión con un antígeno específico en un único sitio antígeno-anticuerpo y en esencia es la suma de todas las fuerzas de atracción y repulsión presentes en la interacción entre el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo y un epítopo particular. La afinidad de un anticuerpo por un antígeno particular (p. ej., un polipéptido de IL-5 o un fragmento de un polipéptido de IL-5) se puede expresar mediante la constante de equilibrio K, definida por la ecuación K = [Ag Ac]/[Ag][Ac], que es la afinidad del sitio de combinación del anticuerpo, donde [Ag] es la concentración de antígeno libre, [Ac] es la concentración de anticuerpo libre y [Ag Ac] es la concentración del complejo antígeno-anticuerpo. Cuando el antígeno y el anticuerpo reaccionan intensamente entre sí, habrá muy poco antígeno libre o anticuerpo libre y, por lo tanto, la constante de equilibrio o afinidad del anticuerpo será elevada. Se encuentran anticuerpos de alta afinidad cuando hay un buen ajuste entre el antígeno y el anticuerpo (para una discusión referente a la afinidad de anticuerpos, véanse Sigal and Ron ed., 1994, Immunology and Inflammation - Basic Mechanisms and Clinical Consequences, McGraw-Hill, Inc. Nueva York en las páginas 56-57; y Seymour et al, 1995, Immunology - An Introduction for the Health Sciences, McGraw-Hill Book Company, Australia en las páginas 31-32). Preferentemente, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido de IL-5 o un fragmento de este no presentan reactividad cruzada con otros antígenos. Es decir, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido de IL-5 o un fragmento de este con una energía más elevada que a otros polipéptidos o fragmentos de otros polipéptidos (véase, p. ej., Paul ed., 1989, Fundamental Immunology, 2a ed., Raven Press, Nueva York en las páginas 332-336 para una discusión sobre la especificidad de los anticuerpos). Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido de IL-5 se pueden identificar, por ejemplo, mediante inmunoensayos tales como radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y ensayos BIAcore u otras técnicas conocidas por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Seymour et al., 1995, Immunology - An Introduction for the Health Sciences, McGraw-Hill Book Company, Australia en las páginas 33-41 para una discusión sobre varios ensayos para determinar interacciones anticuerpo-antígeno in vivo). Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido de IL-5 o un fragmento de este sólo antagonizan un polipéptido de IL-5 y no antagonizan significativamente otras actividades.
En una realización, un polipéptido de IL-5R es IL-5R humano, un análogo, derivado o fragmento de este. La secuencia de nucleótidos de IL-5R humano puede encontrarse en la base de datos de GenBank (véase, p. ej., el n.° de registro M96652.1). La secuencia de aminoácidos de IL-5R humano puede encontrarse en la base de datos de GenBank (véase, p. ej., el n.° de registro Q01344).
En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo comprende un anticuerpo anti-IL5R, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL5R humano. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo anti-IL5R comprende una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 2 y una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones de referencia adicionales, el anticuerpo anti-IL5R comprende una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 3. En una realización adicional, el anticuerpo anti-IL5R comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10. Los expertos en la técnica podrán identificar con facilidad las CDR de acuerdo con los sistemas de numeración de Chothia, Abm u otros.
En una realización, el anticuerpo anti-IL5R es benralizumab. Puede encontrarse información relativa a benralizumab (o fragmentos de este) para su uso en los métodos proporcionados en la presente en la publicación de solicitud de patente de los EE. UU. n.° US 2010/0291073 A1.
El término “análogo” o la expresión “análogo de anticuerpo”, tal como se utilizan en la presente, en el contexto de un anticuerpo se refieren a un segundo anticuerpo, es decir, un análogo de anticuerpo, que posee funciones similares o idénticas a las del anticuerpo, pero que no comprende necesariamente una secuencia de aminoácidos similar o idéntica a la del anticuerpo, ni posee una estructura similar o idéntica a la del anticuerpo. Un anticuerpo que presenta una secuencia de aminoácidos similar se refiere a un análogo de anticuerpo que satisface al menos uno de los siguientes criterios: (a) un análogo de anticuerpo que presenta una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99% respecto a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo; (b) un análogo de anticuerpo codificado por una secuencia de nucleótidos que se híbrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de al menos 5 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 10 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 15 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 20 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 25 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 40 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 50 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 60 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 70 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 80 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 90 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 100 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 125 residuos aminoacídicos contiguos o al menos 150 residuos aminoacídicos contiguos; y (c) un análogo de anticuerpo codificado por una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99% respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo. Un análogo de anticuerpo con una estructura similar a la del anticuerpo se refiere a un agente proteináceo que presenta una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria similar a la del anticuerpo. La estructura de un anticuerpo o de un análogo de anticuerpo se puede determinar utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, sin carácter limitante, la secuenciación de péptidos, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear, dicroísmo circular y microscopía electrónica cristalográfica.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean con el fin de realizar una comparación óptima (p. ej., se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). A continuación, se comparan los residuos aminoacídicos o los nucleótidos de las posiciones aminoacídicas o posiciones nucleotídicas correspondientes. Cuando una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo aminoacídico o el mismo nucleótido que la posición correspondiente de la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones superpuestas idénticas/número total de posiciones x 100%). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud.
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias también se puede llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877. Un algoritmo de este tipo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403. Se pueden realizar búsquedas de nucleótidos en BLAST con los parámetros del programa de nucleótidos NBLAST fijados, p. ej., para una puntuación = 100 y una longitud de palabra = 12 con el fin de obtener secuencias de nucleótidos homólogas respecto a una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación. Se pueden realizar búsquedas de proteínas en BLAST con los parámetros del programa XBLAST fijados, p. ej., para una puntuación = 50 y una longitud de palabra = 3 con el fin de obtener secuencias de aminoácidos homólogas respecto a una molécula proteica de la presente divulgación. Con el fin de obtener alineaciones con huecos para fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST según se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Como alternativa, se puede utilizar PSI-BLAST para realizar una búsqueda iterada que detecte correlaciones distantes entre moléculas (Id). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los programas respectivos (p. ej., de XBLAST y NBLAST) (véase, p. ej., la página web del NCBI). Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, 1988, CABIOS 4:11-17. Un algoritmo de este tipo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de residuos ponderales PAM120, una penalización por la longitud del hueco de 12 y una penalización por el hueco de 4.
En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo de la formulación de anticuerpo se purifica antes de añadirlo a la formulación de anticuerpo. Los términos “aislar” y “purificar” se refieren a separar el anticuerpo de una impureza u otros contaminantes en la composición donde reside el anticuerpo, p. ej., una composición que comprende proteínas de la célula huésped. En algunas realizaciones de referencia, se purifica al menos un 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% o 99.9% (p/p) de una impureza del anticuerpo. Por ejemplo, en algunas realizaciones de referencia, la purificación de un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo anti-IL5R, comprenderá separar del anticuerpo de un 99% (p/p) de las proteínas de la célula huésped presentes originariamente en la composición.
En algunas realizaciones de referencia, los términos “aislar” y “purificar” se refieren a separar un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo anti-IL5R, de una impureza u otros contaminantes en la composición hasta un grado conforme con las directrices de una organización gubernamental, p. ej., la Organización Mundial de la Salud o la Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos.
Los expertos en la técnica conocen métodos de purificación de un anticuerpo. Las técnicas adecuadas para llevar a cabo la purificación incluyen diversos tipos de cromatografía, tales como cromatografía de afinidad, interacción hidrófoba, intercambio iónico (tal como cromatografía de intercambio catiónico o cromatografía de modo mixto), y filtración.
La cromatografía de afinidad se refiere a un método de separación mediante el cual un anticuerpo, gracias a sus propiedades de unión específica, se une a un ligando de afinidad para el anticuerpo. El ligando de afinidad funcional se puede inmovilizar sobre un soporte sólido o semisólido, de manera que cuando se hace pasar una composición que comprende el anticuerpo sobre el ligando y el soporte sólido, el anticuerpo que presenta una afinidad de unión específica por el ligando se adsorbe al ligando, y una o más de otras impurezas no se adsorben (o se unen con una afinidad menor) y se separan del anticuerpo. Los ejemplos de impurezas que no se unen normalmente (o no se unen bien) incluyen impurezas relacionadas con el proceso (por ejemplo, proteínas de la célula huésped, ADN, componentes del medio) y algunas impurezas relacionadas con el producto (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo). En algunas realizaciones de referencia, el soporte sólido que comprende el ligando se lava una o más veces con un tampón para eliminar impurezas adicionales antes de que el anticuerpo adsorbido se desprenda del ligando y el soporte. Después de que se hayan eliminado una o más impurezas, el anticuerpo adsorbido se puede desprender (eluirse) del ligando y el soporte, lo cual da como resultado el aislamiento del anticuerpo a partir de la composición original. Los métodos para desprender el anticuerpo del ligando y el soporte dependen del ligando y los conocen los expertos en la técnica y pueden incluir, p. ej., cambios en el entorno, p. ej., el pH, la adición de agentes caotrópicos o desnaturalizantes, o la adición de tampones de elución comercialmente disponibles. En algunas realizaciones de referencia, se puede emplear más de un proceso de purificación por afinidad en una composición de anticuerpo. En la técnica se conocen diversos ligandos de afinidad, incluyendo proteína A y proteína G (y combinaciones de las mismas). Están disponibles comercialmente ligandos inmovilizados. Por ejemplo, los sistemas de afinidad de proteína A incluyen MabSelect, MabSelect SuRe, MabSelect Xtra, MabSelect SuRe LX, Sepaharose CL-4B, ProSep vA, ProSep vA Ultra y Ceramic HyperD.
La cromatografía de intercambio iónico incluye cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía mixta. La cromatografía de intercambio catiónico se refiere a cualquier método mediante el cual pueden separarse un anticuerpo y alguna impureza o impurezas basándose en diferencias de carga utilizando una matriz de intercambio catiónico. Una matriz de intercambio catiónico comprende por lo general grupos cargados negativamente unidos de forma covalente. Se pueden emplear resinas de intercambio catiónico fuerte o débil. Habitualmente, las resinas de intercambio catiónico fuerte comprenden grupos orgánicos soportados que comprenden grupos sulfonato o de ácido sulfónico, dependiendo del pH. Las resinas de intercambio catiónico débil comprenden habitualmente grupos orgánicos soportados que comprenden grupos carboxilato o de ácido carboxílico, dependiendo del pH. En ciertas realizaciones de referencia, se pueden utilizar resinas de intercambio catiónico multimodales, las cuales incorporan mecanismos de unión así como también interacciones iónicas adicionales, por ejemplo, una o más de entre interacciones de puentes de hidrógeno e interacciones hidrófobas. Los ejemplos de resinas de intercambio catiónico adecuadas son muy conocidos en la técnica y pueden incluir, sin carácter limitante, una matriz de Fractogel, carboximetilo (CM), sulfoetilo (SE), sulfopropilo (Sp), fosfato (P) y sulfonato (S), PROPAC WCX-10TM (Dionex), Capto S, S-Sepharose FF, Fractogel EMD SO3M, Toyopearl Megacap II SP 550C, Poros 50 HS y SP-Sepharose. En algunas realizaciones de referencia, se puede emplear más de un proceso de cromatografía de intercambio catiónico en la composición.
Cromatografía de modo mixto se refiere a un método que utiliza más de una forma de interacción entre la fase estacionaria y los analitos con el fin de lograr su separación de las impurezas (por ejemplo, impurezas relacionadas con el proceso, tales como proteínas de la célula huésped, ADN y/o virus endógenos o adventicios). Se conocen en la técnica ejemplos de matrices de intercambio aniónico adecuadas, y pueden incluir, sin carácter limitante, Capto Adhere, Sartobind Q, Natrix Q, Chromasorb Q y Mustang Q.
En algunas realizaciones de referencia, pueden utilizarse etapas de filtración adicionales para eliminar impurezas. Por ejemplo, en algunas realizaciones de referencia se utiliza nanofiltración o ultrafiltración. La nanofiltración comprende hacer pasar la composición a través de una matriz que tiene un tamaño de poro de, por ejemplo, menos de 75 nm, menos de 50 nm e incluso menos de 15 nm, para separar impurezas, por ejemplo, virus, del anticuerpo. Los nanofiltros y ultrafiltros comercialmente disponibles que se pueden emplear se fabrican por diversos proveedores tales como Millipore Corporation (Billerica, Mass., por ejemplo, Viresolve Pro y Viresolve Pro+), Pall Corporation (East Hills, N.Y.), GE Healthcare Sciences (Piscataway, N.J.), y Sartorius Corporation (Goettingen, Alemania).
En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo de la presente divulgación, p. ej., un anticuerpo anti-IL5R que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10 está a de 1 mg/ml a 200 mg/ml, de 2 mg/ml a 100 mg/ml, de 2 mg/ml a 30 mg/ml, de 2 mg/ml a 25 mg/ml, de 2 mg/ml a 20 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml o 20 mg/ml. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo de la presente divulgación, p. ej., anticuerpo anti-IL5R, tiene una concentración de aproximadamente 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 55 mg/ml, 60 mg/ml, 65 mg/ml, 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 85 mg/ml, 90 mg/ml, 95 mg/ml o 100 mg/ml.
La formulación de anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un excipiente sin carga. El término excipiente se refiere a una sustancia farmacológicamente inactiva formulada con el anticuerpo tal como se describe en la presente. En algunas realizaciones de referencia, el excipiente puede ayudar en la prevención de la desnaturalización o ayudar de otra forma a la estabilización del anticuerpo. En la técnica se conocen excipientes adecuados que pueden utilizarse en las composiciones farmacéuticas. Pueden tomarse ejemplos, p. ej., del manual: Gennaro, Alfonso R.: “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990. En algunas realizaciones de referencia, el excipiente es un excipiente “sin carga”, es decir, el excipiente no porta ninguna carga ni positiva “+” ni negativa “-”. En algunas realizaciones de referencia, el excipiente se selecciona del grupo que consiste en fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, lactosa, maltosa, sacarosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrinas, almidón soluble, trehalosa, sorbitol, eritritol, isomaltosa, lactitol, maltitol, xilitol, glicerol, lactitol, hidroxietilalmidón, glucanos solubles en agua.
En algunas realizaciones de referencia, el excipiente sin carga está a de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1 M, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 400 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 300 mM o de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 250 mM en la formulación de anticuerpo. En algunas realizaciones de referencia, el excipiente sin carga está a de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 80 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 70 mM en la formulación de anticuerpo, p. ej., una formulación de anticuerpo que comprende de 2 a 20 mg/ml de anticuerpo. En una realización, el excipiente sin carga está a aproximadamente 50 mM en la formulación de anticuerpo. En algunas realizaciones de referencia, el excipiente sin carga está a de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 800 mM, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 400 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 400 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 300 mM, o aproximadamente 250 mM en la formulación de anticuerpo, p. ej., una formulación de anticuerpo que comprende de 20 a 100 mg/ml de anticuerpo. En una realización, el excipiente sin carga está a aproximadamente 250 mM en la formulación de anticuerpo.
En algunas realizaciones de referencia, el excipiente sin carga es trehalosa, tal como se representa mediante la fórmula:
Figure imgf000012_0001
En algunas realizaciones de referencia, la trehalosa está a de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1 M, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 400 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 300 mM o de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 250 mM en la formulación de anticuerpo. En algunas realizaciones de referencia, la trehalosa está a de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 80 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 70 mM en la formulación de anticuerpo, p. ej., una formulación de anticuerpo que comprende de 2 a 20 mg/ml de anticuerpo. En una realización, la trehalosa está a aproximadamente 50 mM en la formulación de anticuerpo. En algunas realizaciones de referencia, la trehalosa está a de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 800 mM, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 400 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 400 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 300 mM, o aproximadamente 250 mM en la formulación de anticuerpo, p. ej., una formulación de anticuerpo que comprende de 20 a 100 mg/ml de anticuerpo. En una realización, la trehalosa está a aproximadamente 250 mM en la formulación de anticuerpo.
La formulación de anticuerpo de la presente divulgación comprende arginina. La arginina es un aminoácido condicionalmente no esencial que se puede representar mediante la fórmula:
Figure imgf000012_0002
La arginina, tal como se utiliza en la presente, puede incluir la forma de base libre de la arginina, así como también todas y cada una de sus sales. En algunas realizaciones de referencia, la arginina incluye una sal farmacéuticamente aceptable de esta. Por ejemplo, la arginina incluirá el clorhidrato de arginina. La arginina, tal como se utiliza en la presente, también incluye todos sus enantiómeros (p. ej., L-arginina y S-arginina) y cualquier combinación de enantiómeros (p. ej., un 50% de L-arginina y un 50% de S-arginina; un 90%-100% de L-arginina y un 10%-0% de S-arginina, etc.). En algunas realizaciones de referencia, el término “arginina” incluye más de un 99% de L-arginina y menos de un 1% de S-arginina. En algunas realizaciones de referencia, el término “arginina” incluye una L-arginina enantioméricamente pura. En algunas realizaciones de referencia, la arginina es una arginina de calidad farmacéutica.
Puede haber varias concentraciones de arginina presentes en la formulación de anticuerpo. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo comprende más de 50 mM de arginina, más de 75 mM de arginina, más de 100 mM de arginina, más de 125 mM de arginina, más de 130 mM de arginina, más de 150 mM de arginina, más de 175 mM de arginina o más de 200 mM de arginina.
En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo comprende hasta 800 mM de arginina, hasta 600 mM de arginina, hasta 400 mM de arginina, hasta 200 mM de arginina, hasta 150 mM de arginina, hasta 130 mM de arginina, o hasta 125 mM de arginina. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo comprende de 50 mM a 300 mM, de 75 mM a 250 mM, de 100 mM a 200 mM, de 110 mM a 160 mM, de 120 mM a 150 mM, o aproximadamente 125 mM de arginina. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo comprende 125 mM de arginina. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo comprende 130 mM de arginina. En algunas realizaciones de referencia, la arginina se añade en una cantidad suficiente para mantener la osmolaridad de la formulación. En algunas realizaciones de referencia, la arginina se añade en una cantidad suficiente para lograr una disolución hipertónica. Los solicitantes han encontrado que, en algunas realizaciones de referencia, un aumento de la fuerza iónica de las formulaciones de anticuerpo proporciona un aumento de estabilidad y una reducción en la formación de partículas.
Las formulaciones de anticuerpo descritas en la presente pueden presentar varias viscosidades. Los expertos en la técnica conocen métodos para medir la viscosidad de formulaciones de anticuerpo y pueden incluir, p. ej., un reómetro (p. ej., un reómetro Anton Paar MCR301 con un accesorio de placa de 50 mm, 40 mm o 20 mm). En algunas realizaciones de referencia de la presente divulgación, las viscosidades se registran con un límite de cizallamiento elevado de 1000 por segundo para la tasa de cizallamiento. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo presenta una viscosidad inferior a 20 centipoise (cP), inferior a 18 cP, inferior a 15 cP, inferior a 13 cP o inferior a 11 cP. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo presenta una viscosidad inferior a 13 cP. Un experto en la técnica apreciará que la viscosidad depende de la temperatura, por lo tanto, a menos que se especifique de otro modo, las viscosidades proporcionadas en la presente se miden a 25 °C, a menos que se especifique de otro modo.
La expresión “fuerza de inyección” se refiere a la cantidad de presión (en Newtons) necesaria para hacer pasar la formulación de anticuerpo a través de una aguja. La fuerza de inyección se correlaciona con la cantidad de resistencia proporcionada por la formulación de anticuerpo cuando se administra la formulación de anticuerpo a un sujeto. La fuerza de inyección dependerá del calibre de la aguja utilizada para la administración, así como también de la temperatura. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo presenta una fuerza de inyección inferior a 15 N, 12 N, 10 N u 8 N cuando se hace pasar a través de una aguja de PFS de pared delgada de 27 Ga. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo presenta una fuerza de inyección inferior a 15 N, 12 N, 10 N u 8 N cuando se hace pasar a través de una aguja de PFS de pared delgada de 29 Ga. Las formulaciones de anticuerpo pueden presentar diferentes concentraciones de osmolaridad. Los métodos para medir la osmolaridad de formulaciones de anticuerpo son conocidos por los expertos en la técnica y pueden incluir, p. ej., un osmómetro (p. ej., un osmómetro de descenso del punto de congelación Advanced Instrument Inc 2020). En algunas realizaciones de referencia, la formulación presenta una osmolaridad comprendida entre 200 y 600 mosm/kg, entre 260 y 500 mosm/kg, o entre 300 y 450 mosm/kg.
La formulación de anticuerpo de la presente divulgación puede presentar diferentes niveles de pH. En algunas realizaciones de referencia, el pH de la formulación de anticuerpo está comprendido entre 4 y 7, entre 4.5 y 6.5, o entre 5 y 6. En algunas realizaciones de referencia, el pH de la formulación de anticuerpo es de 5.0. En algunas realizaciones de referencia, el pH de la formulación de anticuerpo es de 6.0. En algunas realizaciones de referencia, el pH de la formulación de anticuerpo es >7.0. Se pueden utilizar varios medios para conseguir el nivel de pH deseado, que incluyen, sin carácter limitante, la adición del tampón adecuado.
Se pueden incluir otros componentes diferentes en la formulación de anticuerpo. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo puede comprender un tampón (p. ej., un tampón de histidina acetato, fosfato o citrato), un surfactante (p. ej., polisorbato) y/o un agente estabilizante (p. ej., albúmina humana), etc. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo puede comprender portadores farmacéuticamente aceptables, que incluyen, p. ej., intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas del suero, tales como la albúmina de suero humano, sustancias tamponantes tales como fosfatos, sacarosa, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas constituidas por glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, polímeros en bloque de polietilenopolioxipropileno, y polietilenglicol. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo comprende además un surfactante. En algunas realizaciones de referencia, el surfactante se selecciona del grupo que consiste en polisorbato, dodecilsulfato de sodio y surfactante no iónico.
En algunas realizaciones de referencia, el surfactante es polisorbato 20, es decir, monolaurato de polioxietileno (20)-sorbitano, tal como se representa mediante la fórmula:
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El polisorbato 20 (PS-20) está disponible comercialmente de varios proveedores comerciales, p. ej., Alkest® TW 20 (Oxiteno, Brasil), y Tween® 20 (Pierce, Rockford IL). Los solicitantes han encontrado que controlando cuidadosamente la concentración de PS-20 en la formulación de anticuerpo, el anticuerpo tiene una estabilidad añadida y tiene cantidades reducidas de formación de partículas cuando se almacena durante periodos de tiempo prolongados.
En algunas realizaciones de referencia, PS-20 es de aproximadamente un 0.001% a aproximadamente un 0.02%, de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.015%, de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01%, de aproximadamente un 0.004% a aproximadamente un 0.009%, de aproximadamente un 0.005% a aproximadamente un 0.008%, aproximadamente un 0.007%, o aproximadamente un 0.006% de la formulación de anticuerpo.
En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo comprende además histidina. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo comprende de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 80 mM de histidina, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 60 mM de histidina, de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 50 mM de histidina, de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 30 mM de histidina, o aproximadamente 20 mM histidina.
En algunas realizaciones de referencia, se pueden omitir varios componentes de la formulación de anticuerpo o esta puede estar “sustancialmente exenta” de ese componente. La expresión “sustancialmente exenta”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a una formulación de anticuerpo donde dicha formulación contiene menos de un 0.01%, menos de un 0.001%, menos de un 0.0005%, menos de un 0.0003% o menos de un 0.0001% del componente designado.
En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo está sustancialmente exenta de un sacárido, es decir, la formulación de anticuerpo, dicha formulación contiene menos de un 0.01%, menos de un 0.001%, menos de un 0.0005%, menos de un 0.0003% o menos de un 0.0001% de un sacárido. El término “sacárido”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a una clase de moléculas que son derivados de alcoholes polihídricos. Los sacáridos se denominan habitualmente carbohidratos y pueden contener diferentes cantidades de unidades de azúcar (sacárido), p. ej., monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. En algunas realizaciones de referencia, la formulación está sustancialmente exenta de disacárido. En algunas realizaciones de referencia, la formulación está sustancialmente exenta de un azúcar reductor, un azúcar no reductor o un alcohol de un azúcar. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo está sustancialmente exenta de prolina, glutamato, sorbitol, iones metálicos divalentes y/o succinato.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo estable, acuosa que comprende: (a) de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, (b) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20, (c) de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM de trehalosa y (d) de aproximadamente 110 mM a aproximadamente 150 mM de L-arginina. En algunas realizaciones de referencia, la formulación comprende además aproximadamente 20 mM de histidina. En una realización, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo estable, acuosa que comprende: (a) de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, (b) aproximadamente un 0.006% de polisorbato 20, (c) aproximadamente 50 mM de trehalosa, (d) aproximadamente 130 mM de L-arginina y (e) aproximadamente 20 mM de histidina.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo estable, acuosa que comprende: (a) de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, (b) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20, (c) de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 300 mM de trehalosa y (d) aproximadamente 20 mM de histidina. En una realización, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo estable, acuosa que comprende: (a) de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, (b) aproximadamente un 0.006% de polisorbato 20, (c) aproximadamente 250 mM de trehalosa y (d) aproximadamente 20 mM de histidina. En otra realización, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo estable, acuosa que comprende: (a) aproximadamente 30 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, (b) aproximadamente un 0.006% de polisorbato 20, (c) aproximadamente 250 mM de trehalosa y (d) aproximadamente 20 mM de histidina.
Las formulaciones de anticuerpo de la presente divulgación son una disolución acuosa. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo no se ha sometido a temperaturas de congelación y/o no se ha congelado, es decir, se ha mantenido en un estado líquido. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo en la formulación de anticuerpo no se ha sometido a liofilización.
El término “estabilidad”, tal como se utiliza en la presente, se refiere en general a mantener la integridad o minimizar la degradación, desnaturalización, agregación o desplegamiento de un agente biológicamente activo tal como una proteína, un péptido u otra macromolécula bioactiva. La expresión “estabilidad mejorada”, tal como se utiliza en la presente, se refiere en general a que, en condiciones que se sabe que provocan degradación, desnaturalización, agregación o desplegamiento, la proteína (p. ej., un anticuerpo tal como un anticuerpo anti-IL5R), el péptido u otra macromolécula bioactiva de interés mantiene una estabilidad mayor en comparación con una proteína, péptido u otra macromolécula bioactiva de control.
En algunas realizaciones de referencia, la estabilidad se refiere a una formulación de anticuerpo con unos niveles de bajos a indetectables de formación de partículas. La expresión “unos niveles de bajos a indetectables de formación de partículas” tal como se utiliza en la presente se refiere a muestras que contienen menos de 30 partículas/ml, menos de 20 partículas/ml, menos de 15 partículas/ml, menos de 10 partículas/ml, menos de 5 partículas/ml, menos de 2 partículas/ml o menos de 1 partícula/ml tal como se determina mediante análisis de HIAC o análisis visual. En algunas realizaciones de referencia, no se detectan partículas en la formulación de anticuerpo, ni mediante análisis de HIAC ni mediante análisis visual.
En algunas realizaciones de referencia, estabilidad se refiere a fragmentación reducida del anticuerpo. La expresión “unos niveles de bajos a indetectables de fragmentación”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a muestras que contienen una cantidad equivalente o superior a un 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de la proteína total, por ejemplo, en un único pico tal como se determina mediante HPSEC o en dos picos (p. ej., cadenas ligera y pesada) (o tantos picos como subunidades haya) mediante electroforesis capilar reducida en gel (rCGE), que representan el anticuerpo no degradado o un fragmento no degradado de este, y que no contienen ningún otro pico individual que contenga más de un 5%, más de un 4%, más de un 3%, más de un 2%, más de un 1% o más de un 0.5% de la proteína total en cada uno de ellos. La expresión “electroforesis capilar reducida en gel”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a la electroforesis capilar en gel en condiciones reductoras suficientes para reducir los enlaces disulfuro en un anticuerpo.
Un experto en la técnica apreciará que la estabilidad de una proteína depende de otras características, además de la composición de la formulación. Por ejemplo, la estabilidad se puede ver afectada por la temperatura, presión, humedad, pH y formas externas de radiación. De este modo, a menos que se especifique de otro modo, se considera que la estabilidad a la que se hace referencia en la presente se mide a 5 °C, presión de una atmósfera, humedad relativa de un 50%, pH de 6.0 y unos niveles de radiación de fondo normales. La estabilidad del anticuerpo en la formulación de anticuerpo se puede determinar utilizando varios medios. En algunas realizaciones de referencia, la estabilidad del anticuerpo se determina mediante cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). La SEC separa analitos (p. ej., macromoléculas tales como proteínas y anticuerpos) basándose en una combinación de su tamaño hidrodinámico, coeficiente de difusión y propiedades de superficie. De este modo, por ejemplo, la SEC puede separar anticuerpos en su conformación tridimensional natural de anticuerpos en varios estados de desnaturalización y/o anticuerpos que han sido degradados. En la SEC, la fase estacionaria está compuesta en general por partículas inertes empaquetadas en una matriz tridimensional densa en el interior de una columna de vidrio o acero. La fase móvil puede ser agua pura, un tampón acuoso, un disolvente orgánico, mezclas de estos u otros disolventes. Las partículas de la fase estacionaria tienen unos poros y/o canales pequeños que permitirán que tan sólo especies con un tamaño inferior a un tamaño determinado puedan entrar. Por consiguiente, las partículas grandes quedan excluidas de estos poros y canales, mientras que las partículas más pequeñas se eliminan de la fase móvil en flujo. El tiempo que las partículas pasan inmovilizadas en los poros de la fase estacionaria depende, en parte, de la profundidad a la que hayan podido penetrar en el poro. Su eliminación del flujo de fase móvil provoca que su elución de la columna lleve más tiempo y como resultado se obtiene una separación entre las partículas basada en las diferencias de su tamaño.
En algunas realizaciones de referencia, la SEC se combina con una técnica de identificación para identificar o caracterizar proteínas o fragmentos de estas. La identificación y caracterización de proteínas se puede llevar a cabo utilizando varias técnicas, que incluyen, sin carácter limitante, técnicas cromatográficas, p. ej., cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), inmunoensayos, electroforesis, espectroscopia ultravioleta / visible / infrarroja, espectroscopia Raman, espectroscopia Raman amplificada en superficie, espectroscopia de masas, cromatografía de gases, dispersión estática de luz (SLS), espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier (FTIR), dicroísmo circular (CD), técnicas de desplegamiento de proteínas inducido por urea, fluorescencia intrínseca de triptófano, calorimetría diferencial de barrido y/o unión de proteínas a ANS.
En algunas realizaciones de referencia, la identificación de proteínas se lleva a cabo mediante cromatografía líquida de alta resolución. Los expertos en la técnica conocen varios instrumentos y aparatos para realizar la HPLC. Generalmente, la HPLC implica introducir un disolvente líquido que contiene la proteína de interés en una columna de separación, en la cual tiene lugar la separación. La columna de separación de HPLC se rellena con partículas sólidas (p. ej., sílice, polímeros o sorbentes) y la mezcla de la muestra se separa en compuestos a medida que interacciona con las partículas de la columna. La separación por HPLC se ve afectada por las condiciones del disolvente líquido (p. ej., presión, temperatura), las interacciones químicas entre la mezcla de la muestra y el disolvente líquido (p. ej., hidrofobicidad, protonación, etc.) y las interacciones químicas entre la mezcla de la muestra y las partículas sólidas empaquetadas dentro de la columna de separación (p. ej., afinidad del ligando, intercambio iónico, etc.).
En algunas realizaciones de referencia, la SEC y la identificación de proteínas tienen lugar en el mismo aparato o de forma simultánea. Por ejemplo, la SEC y la HPLC se pueden combinar, lo cual se denomina a menudo SE-HPLC. En algunas realizaciones de referencia, la formulación acuosa comprende de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, donde dicha formulación es estable tras almacenamiento a aproximadamente 40 °C durante al menos 1 mes. En algunas realizaciones de referencia, la formulación es estable tras almacenamiento a aproximadamente 25 °C durante al menos 3 meses. En algunas realizaciones de referencia, la formulación es estable tras almacenamiento a aproximadamente 5 °C durante al menos 6 meses. En algunas realizaciones de referencia, la formulación es estable tras almacenamiento a aproximadamente 5 °C durante al menos 12 meses. En algunas realizaciones de referencia, la formulación es estable tras almacenamiento a aproximadamente 5 °C durante al menos 18 meses. En algunas realizaciones de referencia, la formulación es estable tras almacenamiento a aproximadamente 5 °C durante al menos 24 meses, o 36 meses.
El término “estable” puede ser relativo y no absoluto. Por tanto, en algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo es estable si menos de un 20%, menos de un 15%, menos de un 10%, menos de un 5% o menos de un 2% del anticuerpo se degrada, desnaturaliza, agrega o despliega, tal como se determina mediante SEC HPLC, cuando el anticuerpo se almacena a una temperatura comprendida entre 2 °C y 8 °C durante 6 meses. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo es estable si menos de un 20%, menos de un 15%, menos de un 10%, menos de un 5% o menos de un 2% del anticuerpo se degrada, desnaturaliza, agrega o despliega, tal como se determina mediante SEC HPLC, cuando el anticuerpo se almacena a una temperatura comprendida entre 2 °C y 8 °C durante 12 meses. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo de la formulación de anticuerpo es estable si menos de un 20%, menos de un 15%, menos de un 10%, menos de un 5% o menos de un 2% del anticuerpo se degrada, desnaturaliza, agrega o despliega, tal como se determina mediante SEC HPLC, cuando el anticuerpo se almacena a una temperatura comprendida entre 2 °C y 8 °C durante 18 meses. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo de la formulación de anticuerpo es estable si menos de un 20%, menos de un 15%, menos de un 10%, menos de un 5% o menos de un 2% del anticuerpo se degrada, desnaturaliza, agrega o despliega, tal como se determina mediante SEC HPLC, cuando el anticuerpo se almacena a una temperatura comprendida entre 2 °C y 8 °C durante 24 meses.
En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo es estable si menos de un 20%, menos de un 15%, menos de un 10%, menos de un 5% o menos de un 2% del anticuerpo se degrada, desnaturaliza, agrega o despliega, tal como se determina mediante SEC HPLC, cuando el anticuerpo se almacena a una temperatura comprendida entre 23 °C y 27 °C durante 3 meses. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo es estable si menos de un 20%, menos de un 15%, menos de un 10%, menos de un 5% o menos de un 2% del anticuerpo se degrada, desnaturaliza, agrega o despliega, tal como se determina mediante SEC HPLC, cuando el anticuerpo se almacena a una temperatura comprendida entre 23 °C y 27 °C durante 6 meses. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo es estable si menos de un 20%, menos de un 15%, menos de un 10%, menos de un 5% o menos de un 2% del anticuerpo se degrada, desnaturaliza, agrega o despliega, tal como se determina mediante SEC HPLC, cuando el anticuerpo se almacena a una temperatura comprendida entre 23 °C y 27 °C durante 12 meses. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo es estable si menos de un 20%, menos de un 15%, menos de un 10%, menos de un 5% o menos de un 2% del anticuerpo se degrada, desnaturaliza, agrega o despliega, tal como se determina mediante SEC HPLC, cuando el anticuerpo se almacena a una temperatura comprendida entre 23 °C y 27 °C durante 24 meses.
En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo es estable si menos de un 6%, menos de un 4%, menos de un 3%, menos de un 2% o menos de un 1% del anticuerpo se degrada, desnaturaliza, agrega o despliega por mes, tal como se determina mediante SEC HPLC, cuando el anticuerpo se almacena a 40 °C. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo es estable si menos de un 6%, menos de un 4%, menos de un 3%, menos de un 2% o menos de un 1% del anticuerpo se degrada, desnaturaliza, agrega o despliega por mes, tal como se determina mediante SEC HPLC, cuando el anticuerpo se almacena a 5 °C.
En algunas realizaciones de referencia, se puede considerar que las formulaciones de anticuerpo de la presente divulgación son estables si el anticuerpo exhibe una pérdida muy pequeña o nula de la actividad de unión del anticuerpo (incluidos sus fragmentos de anticuerpo) de la formulación en comparación con un anticuerpo de referencia, tal como se mide mediante ensayos de unión del anticuerpo conocidos por los expertos en la técnica tales como, p. ej., ELISA, etc., durante un periodo de 8 semanas, 4 meses, 6 meses, 9 meses, 12 meses o 24 meses. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo almacenado a aproximadamente 40 °C durante al menos 1 mes conserva al menos un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 98% o al menos aproximadamente un 99% de la capacidad de unión a un polipéptido de receptor de IL-5 en comparación con un anticuerpo de referencia que no se ha almacenado. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo almacenado a aproximadamente 5 °C durante al menos 6 meses conserva al menos un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 98% o al menos aproximadamente un 99% de la capacidad de unión a un polipéptido de receptor de IL-5 en comparación con un anticuerpo de referencia que no se ha almacenado. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo almacenado a aproximadamente 40 °C durante al menos 1 mes conserva al menos un 95% de la capacidad de unión a un polipéptido de receptor de IL-5 en comparación con un anticuerpo de referencia que no se ha almacenado. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo almacenado a aproximadamente 5 °C durante al menos 6 meses conserva al menos un 95% de la capacidad de unión a un polipéptido de receptor de IL-5 en comparación con un anticuerpo de referencia que no se ha almacenado.
Las formulaciones de anticuerpo pueden proporcionar niveles de bajos a indetectables de agregación del anticuerpo. La expresión “unos niveles de bajos a indetectables de agregación” tal como se utiliza en la presente se refiere a muestras que contienen no más de aproximadamente un 5%, no más de aproximadamente un 4%, no más de aproximadamente un 3%, no más de aproximadamente un 2%, no más de aproximadamente un 1% y no más de aproximadamente un 0.5% de agregación en peso de proteína tal como se mide mediante técnicas de cromatografía por exclusión de tamaño de alto rendimiento (HPSEC) o dispersión de luz estática (SLS). En algunas realizaciones de referencia, menos de un 2% del anticuerpo forma un agregado tras almacenamiento a aproximadamente 40 °C durante al menos 4 semanas tal como se determina mediante HPSEC. En algunas realizaciones de referencia, menos de un 2% del anticuerpo forma un agregado tras almacenamiento a aproximadamente 5° durante al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 12 meses, al menos 15 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses o al menos 36 meses tal como se determina mediante HPSEC.
Los solicitantes han encontrado que las formulaciones de anticuerpo proporcionadas en la presente dan como resultado una formación de partículas enormemente reducida tal como se determina mediante inspección visual, obtención de imágenes de microflujo (MFI) o cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). En algunas realizaciones de referencia, la formulación está sustancialmente exenta de partículas tras almacenamiento a aproximadamente 40 °C durante al menos 1 mes tal como se determina mediante inspección visual. En algunas realizaciones de referencia, la formulación está sustancialmente exenta de partículas tras almacenamiento a aproximadamente 5 °C durante al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 12 meses, al menos 15 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses o al menos 36 meses tal como se determina mediante inspección visual.
En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo de la presente divulgación puede utilizarse para fines farmacéuticos. Los anticuerpos utilizados en aplicaciones farmacéuticas deben presentar por lo general un nivel elevado de pureza, especialmente en lo que respecta a contaminantes del cultivo celular, incluidos los contaminantes de proteínas celulares, contaminantes de ADN celular, virus y otros agentes transmisibles. Véase “WHO Requirements for the use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals: Requirements for Biological Substances No. 50” n.° 878, Anexo 1, 1998. Como respuesta a la preocupación por los contaminantes, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció límites en los niveles de varios contaminantes. Por ejemplo, la OMS recomienda un límite de ADN inferior a 10 ng por dosis para productos proteicos. De un modo similar, la Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) fijó un límite de ADN inferior o igual a 0.5 pg/mg de proteína. De este modo, en algunas realizaciones de referencia, la presente divulgación se refiere a formulaciones de anticuerpo que exceden o cumplen con los límites para contaminantes definidos por una o más organizaciones gubernamentales, p. ej., la Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos y/o la Organización Mundial de la Salud.
En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo descrita en la presente es farmacéuticamente aceptable. La expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a una formulación de anticuerpo que es, a criterio médico, adecuada para ponerla en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin provocar excesiva toxicidad u otras complicaciones, con una relación beneficio/riesgo razonable.
La pureza de las formulaciones de anticuerpo puede variar. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo terapéutico de interés, p. ej., el anticuerpo anti-IL5R representa más de un 90% (p/p) de los polipéptidos totales presentes en la formación de anticuerpos. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo terapéutico de interés, p. ej., anti-IL5R, representa más de un 95% (p/p), 98% (p/p), 99% (p/p), 99.5% (p/p) o 99.9% (p/p) del polipéptido total presente en la formación de anticuerpos.
Las formulaciones tal como se proporcionan en la presente pueden ser adecuadas para el tratamiento de un sujeto. El término “sujeto”, tal como se utiliza en la presente, se puede utilizar indistintamente con “paciente” y se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluidos los seres humanos y no humanos tales como, sin carácter limitante, animales de granja y domésticos, animales de zoológico, animales que participan en deportes y mascotas. En algunas realizaciones de referencia, el sujeto se refiere a un ser humano.
Los términos “tratar” y “tratamiento” se refieren tanto a un tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas, de mantenimiento o preventivas, donde el objeto es prevenir o aliviar (atenuar) una afección, trastorno o enfermedad fisiológica indeseada u obtener unos resultados clínicos deseados o beneficiosos. Los términos “tratar”, “tratamiento” y “que trata” se refieren a la reducción o la mejora de la evolución, gravedad y/o duración de tal enfermedad o trastorno (p. ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la actividad y/o expresión aberrante de un polipéptido de IL5, una enfermedad o trastorno caracterizado por la actividad y/o expresión aberrante de un polipéptido de IL5 o una o más subunidades de este, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa o una infección) o la mejora de uno o más de sus síntomas, como resultado de la administración de una o más terapias (que incluyen, sin carácter limitante, la administración de uno o más agentes terapéuticos o profilácticos). En determinadas realizaciones de referencia, tales términos se refieren a la reducción en la inflamación mediada por eosinófilos asociados a inflamación. En otras realizaciones de referencia, tales términos se refieren a la reducción de la liberación de agentes inflamatorios por parte de los mastocitos o a la reducción del efecto biológico de tales agentes inflamatorios. En otras realizaciones de referencia, tales términos se refieren a una reducción del crecimiento, la formación y/o el incremento del número de células hiperproliferativas (p. ej., células cancerosas). En aún otras realizaciones de referencia, tales términos se refieren a la reducción de la inflamación de las vías respiratorias, la piel, el tracto gastrointestinal o combinaciones de los mismos. En aún otras realizaciones de referencia, tales términos se refieren a la reducción en los síntomas asociados con asma. En algunas realizaciones de referencia, tales términos se refieren a la reducción en los síntomas asociados con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).
La formulación de anticuerpo de la presente divulgación pude administrarse a un sujeto a través de diversos medios. En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo es adecuada para administración parenteral, p. ej., por medio de inhalación (p. ej., pulverización de aerosol o polvo), administración transmucosa, intravenosa, subcutánea o intramuscular. En algunas realizaciones de referencia, la formulación es una formulación inyectable. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un recipiente sellado que comprende cualquiera de las formulaciones de anticuerpo tal como se describen en la presente.
En algunos aspectos, la presente divulgación se refiere a diversas formas de dosificación farmacéutica. Podrán aplicarse diversas formas de dosificación a las formulaciones proporcionadas en la presente. Véase, p. ej., Pharmaceutical Dosage Form: Parenteral Medications, volumen 1, 2a edición. En una realización, una dosificación unitaria farmacéutica de la divulgación comprende la formulación de anticuerpo en un recipiente adecuado, por ejemplo un vial o jeringa. En una realización, una dosificación unitaria farmacéutica de la divulgación comprende una formulación de anticuerpo administrada por vía intravenosa, por vía subcutánea o por vía intramuscular. En otra realización, una dosificación unitaria farmacéutica de la divulgación comprende una formulación de anticuerpo administrada por aerosol. En una realización específica, una dosificación unitaria farmacéutica de la divulgación comprende una formulación de anticuerpo administrada por vía subcutánea. En otra realización, una dosificación unitaria farmacéutica de la divulgación comprende una formulación de anticuerpo administrada por aerosol. En una realización adicional, una dosificación unitaria farmacéutica de la divulgación comprende una formulación de anticuerpo administrada por vía intranasal.
Las formulaciones de anticuerpo de la presente divulgación pueden prepararse como formas de dosificación unitaria preparando un vial que contiene una alícuota de la formulación de anticuerpo acuosa para una utilización de una sola vez. Por ejemplo, una dosificación unitaria por vial puede contener 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml o 20 ml de diferentes concentraciones de un anticuerpo que se une específicamente a receptor de IL5 que oscilan entre aproximadamente 0.1 mg/ml y aproximadamente 300 mg/ml. Si es necesario, estas preparaciones pueden ajustarse a una concentración deseada añadiendo un diluyente estéril a cada vial. En una realización específica, las formulaciones de anticuerpo acuosas de la presente divulgación se formulan en viales de una sola dosis como un líquido estéril que contiene de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM de trehalosa y de aproximadamente 110 mM a aproximadamente 150 mM de L-arginina. En otra realización específica, las formulaciones de anticuerpo acuosas de la presente divulgación se formulan en viales de una sola dosis como un líquido estéril que contiene de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20, y de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 300 mM de trehalosa. En una realización, el anticuerpo de la divulgación se suministra a de 2 a 20 mg/ml en viales de color ámbar de borosilicato de tipo I de la USP de 3 cc (n.° de pieza de West Pharmaceutical Services 6800-0675). En otra realización, el anticuerpo de la divulgación se suministra a de 20 a 100 mg/ml en viales de color ámbar de borosilicato de tipo I de la USP de 3 cc. El volumen de llenado objetivo es de 1.2 ml.
Las formulaciones de anticuerpo de la presente divulgación pueden prepararse como formas de dosificación unitaria preparando una jeringa precargada que contiene una alícuota de la formulación de anticuerpo acuosa para una utilización de una sola vez. Por ejemplo, una dosificación unitaria por jeringa precargada puede contener 0.1 ml, 0.2 ml, 0.3 ml, 0.4 ml, 0.5 ml, 0.6 ml, 0.7 ml, 0.8 ml, 0.9 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml o 20 ml de diferentes concentraciones de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de IL-5 que oscilan entre aproximadamente 2 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml. En una realización específica, las formulaciones de anticuerpo acuosas de la presente divulgación se formulan en jeringas precargadas de una sola dosis como un líquido estéril que contiene de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM de trehalosa y de aproximadamente 110 mM a aproximadamente 150 mM de L-arginina. En una realización específica, las formulaciones de anticuerpo acuosas de la presente divulgación se formulan en jeringas precargadas de una sola dosis como un líquido estéril que contiene de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20, y de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 300 mM de trehalosa.
Pueden administrarse diversas cantidades de dosificación en un único uso. Por ejemplo, en algunas realizaciones de referencia pueden administrarse 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1.0 mg, 1.1 mg, 1.2 mg, 1.3 mg, 1.4 mg, 1.5 mg, 1.6 mg, 1.7 mg, 1.8 mg, 1.9 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 12 mg, 14 mg, 16 mg, 18 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 70 mg o 100 mg de anticuerpo en una única dosis.
Pueden utilizarse diversos tipos de jeringas. La jeringa puede cargarse con la formulación de anticuerpo inmediatamente antes de su administración a un sujeto, por ejemplo, menos de 1 semana, 1 día, 6 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, 20 minutos o 10 minutos antes de su administración a un sujeto. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa se carga con la formulación de anticuerpo en el punto de venta al por menor, o por el centro donde se realiza el tratamiento del sujeto. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa está precargada, p. ej., la jeringa se carga con la formulación de anticuerpo más de 1 día, 2 días, 4 días, 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses, 3 años o 4 años antes de su administración a un sujeto. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada comprende una aguja, por ejemplo, una aguja de pared regular 27G, a una aguja de pared fina 27G, una aguja de pared regular 29G o una aguja de pared delgada 29G. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada comprende una aguja de pared delgada 29G.
En algunas realizaciones de referencia, puede utilizarse cualquier jeringa adecuada para la administración al sujeto deseado. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa es una jeringa de plástico o una jeringa de vidrio. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa está hecha de materiales que están sustancialmente exentos de tungsteno. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa está recubierta con silicona. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada comprende un émbolo que tiene un disco de resina de fluoropolímero. Los ejemplos de jeringas pueden incluir, sin carácter limitante, jeringas Hypak™ de Biotech de 1 ml de longitud (Becton Dickinson), con un tapón de émbolo de 1 ml de Hypak de Becton Dickinson 4023 Flurotec Daikyo Si 1000 (n.° de catálogo 47271919), C3Pin (n.° de lote E912701), Hypak™ de Biotech con 0.8 mg de aceite de silicona (Becton Dickinson) y CZ (West, n.° de catálogo 19550807).
Las formulaciones de anticuerpo acuosas de la presente divulgación pueden esterilizarse mediante diversos métodos de esterilización, incluyendo filtración estéril, radiación, etc. En una realización específica, la formulación de anticuerpo diafiltrada se esteriliza por filtración con un filtro de 0.2 micrómetros preesterilizado. Pueden administrarse formulaciones de anticuerpo acuosas esterilizadas de la presente divulgación a un sujeto para prevenir, tratar y/o gestionar una respuesta inmunitaria, por ejemplo una respuesta inflamatoria.
En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada comprende (a) de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, y (b) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada comprende además (c) de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM de trehalosa, y (d) de aproximadamente 110 mM a aproximadamente 150 mM de L-arginina. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada comprende (a) de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, y (b) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20. En algunas realizaciones de referencia, la jeringa precargada comprende además (c) de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 300 mM de trehalosa.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un kit que comprende cualquiera de las formulaciones de anticuerpo descritas en la presente, los recipientes descritos en la presente, las formas de dosificación unitaria descritas en la presente o la jeringa precargada descrita en la presente.
En algunas realizaciones de referencia, la presente divulgación también puede referirse a un método de producción de una formulación de anticuerpo estable, acuosa que comprende un anticuerpo, comprendiendo el método: (a) purificar un anticuerpo hasta de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 400 mg/ml, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10; y (b) colocar el anticuerpo aislado en una formulación de estabilización para formar la formulación de anticuerpo estable, acuosa, donde la formulación de anticuerpo estable, acuosa resultante comprende: (i) de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, y (ii) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de preparación de una formulación de anticuerpo estable, acuosa, comprendiendo el método: (a) purificar un anticuerpo hasta de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 400 mg/ml, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de s Eq ID NO: 8-10; (b) diluir el anticuerpo hasta de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, en una disolución que comprende: (i) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20, (ii) de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM de trehalosa, y (iii) de aproximadamente 110 mM a aproximadamente 150 mM de L-arginina. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de preparación de una formulación de anticuerpo estable, acuosa, comprendiendo el método: (a) purificar un anticuerpo hasta de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 400 mg/ml, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10; (b) diluir el anticuerpo hasta de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, en una disolución que comprende: (i) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20, (ii) de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 300 mM de trehalosa y (iii) aproximadamente 20 mM de histidina.
Aunque muchos aspectos de la divulgación se refieren a formulaciones acuosas, debe indicarse para los fines de equivalentes que los anticuerpos o formulaciones de anticuerpo de la divulgación pueden liofilizarse si se desea. Por tanto, la divulgación engloba formas liofilizadas de las formulaciones de la divulgación, o anticuerpos liofilizados que se reconstituyen posteriormente en una forma acuosa. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de producción de una formulación de anticuerpo reconstituida que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, comprendiendo el método: (a) purificar el anticuerpo a partir de un cultivo celular; (b) liofilizar el anticuerpo aislado; (c) añadir el anticuerpo liofilizado a una disolución acuosa para formar una formulación de anticuerpo reconstituida, donde la formulación de anticuerpo reconstituida comprende: (i) de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, y (ii) de aproximadamente un 0.002% a aproximadamente un 0.01% de polisorbato 20.
En algunas realizaciones de referencia, los inventores han encontrado que formulaciones de anticuerpo anti-IL5R que tienen concentraciones de glutatión S-transferasa (GST) disminuidas dan como resultado una formación de partículas reducida (por ejemplo, no detectable). La eliminación de partículas es importante para evitar la posible inmunogenicidad así como limitar el impacto sobre la calidad del producto. En algunas realizaciones de referencia, las concentraciones de GST se reducen mediante cromatografía de afinidad. En algunas realizaciones de referencia, las concentraciones de GST se reducen utilizando una columna de proteína A. En algunas realizaciones de referencia, la columna de proteína A es MabSelect Sure (GE Healthcare Life Sciences). En algunas realizaciones de referencia, las concentraciones de GST se reducen utilizando cromatografía de modo mixto. En algunas realizaciones de referencia, la columna de modo mixto es Capto™ Adhere (GE Healthcare Life Sciences).
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo que comprende un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de c DR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, donde la formulación de anticuerpo está esencialmente exenta de partículas. En algunas realizaciones de referencia, el término “esencialmente exenta de partículas” se refiere a la ausencia de partículas visibles cuando se observa bajo una caja de iluminación. En algunas realizaciones de referencia, el término “esencialmente exenta de partículas” es sinónimo a la expresión “unos niveles de bajos a indetectables de formación de partículas” tal como se describió anteriormente. En algunas realizaciones de referencia, esencialmente exenta de partículas se refiere a muestras que contienen menos de 30 partículas/ml, menos de 20 partículas/ml, menos de 15 partículas/ml, menos de 10 partículas/ml, menos de 5 partículas/ml, menos de 2 partículas/ml o menos de 1 partícula/ml donde las partículas son mayores de 25 |jm y el recuento de partículas se determina mediante análisis de HIAC o análisis visual. En algunas realizaciones de referencia, esencialmente exenta de partículas se refiere a muestras que contienen de 1 a 50 partículas/ml, de 2 a 40 partículas/ml, 3-30 partículas/ml, de 4 a 25 partículas/ml, o de 5 a 20 partículas/ml donde las partículas son mayores de 25 jm y el recuento de partículas se determina mediante análisis de HIAC o análisis visual. En algunas realizaciones de referencia, el término “partículas visibles” se refiere a partículas mayores de 25 jm.
En algunas realizaciones de referencia, esencialmente exenta de partículas se refiere a muestras que contienen de 1 a 200 partículas/ml, de 10 a 150 partículas/ml, 30-100 partículas/ml o de 40 a 80 partículas/ml donde las partículas son mayores de 5 jm y el recuento de partículas se determina mediante análisis de HIAC o análisis visual. En algunas realizaciones de referencia, el término “partículas visibles” se refiere a partículas mayores de 5 jm. En algunas realizaciones de referencia, no se detectan partículas en la formulación de anticuerpo, ni mediante análisis de HIAC ni mediante análisis visual.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo que comprende un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de c DR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, donde la formulación de anticuerpo está esencialmente exenta de glutatión S-transferasa (GST). A menos que se especifique otra cosa, el término “esencialmente exenta de glutatión S-transferasa” o “esencialmente exenta de GST” englobará una composición que carece de GST activa (pero que podrá contener GST inactiva) así como una composición que no tiene la proteína GST, ni en forma activa ni en forma inactiva. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo que comprende un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, donde la formulación de anticuerpo está esencialmente exenta de GST activa. El término “GST activa” se refiere a GST que puede catalizar la formación del grupo tiol de glutatión (GSH) con un compuesto electrófilo tal como 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) para formar un conjugado de GS-DNB. GST o glutatión S-transferasa se refiere a una familia de enzimas que pueden catalizar numerosas reacciones, pero principalmente la conjugación de un glutatión reducido, por medio de un grupo sulfhidrilo, con centros electrófilos, p. ej., compuestos aromáticos, dobles enlaces, C-Clx, etc. Los monómeros de GST están generalmente en el intervalo de 22-29 kDa, pero pueden producirse como dímeros, trímeros y también heterodímeros (con otras proteínas). En algunas realizaciones de referencia, el término GST se refiere a una proteína que puede catalizar la formación del grupo tiol de glutatión (GSH) con 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) para formar un conjugado de GS-DNB.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo que comprende un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de c DR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, donde la formulación de anticuerpo está esencialmente exenta de partículas durante al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 8 meses, al menos 10 meses, al menos 12 meses o al menos 18 meses cuando se almacena a 38-42 °C. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a una formulación de anticuerpo que comprende un anticuerpo donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, donde la formulación de anticuerpo está esencialmente exenta de partículas durante al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 8 meses, al menos 10 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses, al menos 30 meses, al menos 36 meses o al menos 48 meses cuando se almacena a 2-6 °C.
En algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo está esencialmente exenta de GST. En algunas realizaciones de referencia, el término “esencialmente exenta de GST” se refiere a una formulación de anticuerpo que tiene una actividad de GST de menos de aproximadamente 0.5 unidades/mg de anticuerpo, menos de aproximadamente 0.3 unidades/mg de anticuerpo, menos de aproximadamente 0.1 unidades/mg de anticuerpo, menos de aproximadamente 0.08 unidades/mg de anticuerpo, menos de aproximadamente 0.05 unidades/mg de anticuerpo, menos de aproximadamente 0.03 unidades/mg de anticuerpo, menos de aproximadamente 0.01 unidades/mg de anticuerpo, menos de aproximadamente 0.005 unidades/mg de anticuerpo, menos de aproximadamente 0.001 unidades/mg de anticuerpo, menos de aproximadamente 5 x 10'3 unidades/mg de anticuerpo, menos de aproximadamente 1 x 10'4 unidades/mg de anticuerpo, menos de aproximadamente 1 x 10'5 unidades/mg de anticuerpo o menos de aproximadamente 1 x 10'6 unidades/mg de anticuerpo. En algunas realizaciones de referencia, el término “esencialmente exenta” se refiere a un nivel de GST que no es detectable utilizando técnicas de detección de GST comunes.
Los expertos en la técnica conocen diversos métodos para determinar la actividad de GST. En algunas realizaciones de referencia, la actividad de GST se determina utilizando un kit de ensayo fluorométrico de glutatión (GSH/GSSG/Total) (BioVision, San Francisco CA).
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de purificación de un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, comprendiendo el método (i) obtener un cultivo celular que comprende el anticuerpo, (ii) realizar cromatografía de afinidad con el anticuerpo, (iv) realizar intercambio catiónico con el anticuerpo, (v) realizar cromatografía de modo mixto con el anticuerpo. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de purificación de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 5-7, y donde la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat de SEQ ID NO: 8-10, comprendiendo el método (i) obtener un cultivo celular que comprende el anticuerpo, (ii) unir el anticuerpo a una columna de proteína A, (iii) eluir el anticuerpo de la columna de proteína A, (iv) realizar intercambio catiónico con el anticuerpo, (v) realizar cromatografía de modo mixto con el anticuerpo. En algunas realizaciones de referencia, el método de purificación de un anticuerpo comprende además un proceso de inactivación de virus. En algunas realizaciones de referencia, la etapa de inactivación de virus se realiza disminuyendo el pH hasta menos de 4.0. En algunas realizaciones de referencia, el método comprende además un proceso de diafiltración. En algunas realizaciones de referencia, el método comprende además un proceso de filtración. En algunas realizaciones de referencia, el proceso de filtración es suficiente para eliminar partículas de virus activas.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de tratamiento de un paciente. En algunas realizaciones de referencia, el método comprende administrar las formulaciones de anticuerpo descritas en la presente, los recipientes descritos en la presente, las formas de dosificación unitaria descritas en la presente o la jeringa precargada descrita en la presente a un sujeto que lo necesita.
En algunas realizaciones de referencia, la divulgación es adecuada para el tratamiento de una enfermedad o trastorno pulmonar administrando la formulación de anticuerpo descrita en la presente. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de tratamiento de un paciente con una enfermedad o trastorno eosinofílico mediante la administración de la formulación de anticuerpo descrita en la presente. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno pulmonar en un sujeto, comprendiendo el método administrar las formulaciones de anticuerpo descritas en la presente. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno eosinofílico en un sujeto, comprendiendo el método administrar las formulaciones de anticuerpo descritas en la presente. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere al tratamiento de enfermedades o trastornos pulmonares, p. ej., asma, EPOC, asma eosinofílica, asma eosinofílica y neutrofílica combinadas, asma sensible a aspirina, aspergilosis broncopulmonar alérgica, bronquitis eosinofílica aguda y crónica, neumonía eosinofílica aguda y crónica, síndrome de Churg-Strauss, síndrome hipereosinofílico, eosinofilia pulmonar inducida por fármacos, compuestos irritantes y radiación, eosinofilia pulmonar inducida por infección (hongos, tuberculosis, parásitos), eosinofilia pulmonar relacionada con autoinmunidad, esofagitis eosinofílica o enfermedad de Crohn o combinación de los mismos en un sujeto, comprendiendo el método administrar las formulaciones de anticuerpo descritas en la presente. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere al tratamiento de asma en un sujeto, comprendiendo el método administrar las formulaciones de anticuerpo descritas en la presente. En algunas realizaciones de referencia, la divulgación se refiere al tratamiento de EPOC en un sujeto, comprendiendo el método administrar las formulaciones de anticuerpo descritas en la presente.
En algunas realizaciones de referencia, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de las formulaciones de anticuerpo descritas en la presente para tratar una afección. La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a la cantidad de una terapia (p. ej., un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de receptor de IL5) que es suficiente para reducir la gravedad de una enfermedad o trastorno (p. ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la actividad y/o expresión aberrante de un polipéptido de IL5, una enfermedad o trastorno caracterizado por la actividad y/o expresión aberrante de un receptor de IL5 o una o más subunidades de este, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa o una infección (preferentemente, una infección respiratoria) o uno o más de sus síntomas), reducir la duración de una afección respiratoria, mejorar uno o más síntomas de tal enfermedad o trastorno, prevenir el avance de tal enfermedad o trastorno, provocar la regresión de tal enfermedad o trastorno, o potenciar o mejorar el/los efecto(s) terapéutico(s) de otra terapia. En algunas realizaciones de referencia, la cantidad terapéuticamente eficaz no se puede especificar por adelantado y puede ser determinada por un cuidador, por ejemplo, por un médico u otro profesional sanitario, utilizando varios medios, por ejemplo, la titulación de la dosis. Las cantidades terapéuticamente eficaces adecuadas también se pueden determinar mediante experimentación rutinaria utilizando, por ejemplo, modelos con animales.
Los términos “terapias” y “terapia” se pueden referir a cualquier o cualesquiera protocolos, métodos y/o agentes que se pueden utilizar en la prevención, el tratamiento, la gestión o la mejora de una enfermedad o trastorno (p. ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la actividad y/o expresión aberrante de un polipéptido de IL5, una enfermedad o trastorno caracterizado por la actividad y/o expresión aberrante de un receptor de IL5 o una o más subunidades de este, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa o una infección (preferentemente, una infección respiratoria) o uno o más de sus síntomas). En ciertas realizaciones de referencia, los términos “terapia” y “terapia” se refieren a una terapia biológica, terapia de apoyo y/u otras terapias útiles en el tratamiento, la gestión, la prevención o la mejora de tal enfermedad o trastorno o uno o más síntomas conocidos por el personal médico experto.
La expresión “protocolo terapéutico”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a un régimen para dosificar y programar la administración de una o más terapias (p. ej., agentes terapéuticos) que presenta una eficacia terapéutica.
La vía de administración de la formulación de anticuerpo de la presente divulgación puede ser, por ejemplo, mediante modos de administración oral, parenteral, de inhalación o tópica. El término “parenteral”, tal como se utiliza en la presente, incluye, p. ej., la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. En algunas realizaciones de referencia, el anticuerpo es un anticuerpo anti-IL5R y la vía de administración es inyección intramuscular. Aunque se contempla claramente que todas estas formas de administración se encuentran dentro del alcance de la divulgación, en algunas realizaciones de referencia, la formulación de anticuerpo es adecuada para la administración mediante inyección, en particular para el goteo o la inyección intraarterial o intravenosa.
En algunas realizaciones de referencia, las composiciones y los métodos de la presente divulgación permiten a un fabricante producir una formulación de anticuerpo adecuada para la administración a un ser humano de un modo más eficaz, ya sea reduciendo costos, reduciendo las etapas del método, reduciendo las oportunidades de error, reduciendo las oportunidades para introducir aditivos inadecuados o no seguros, reduciendo desechos, aumentando el tiempo de almacenamiento, etc.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Se realizaron estudios de formulación para desarrollar una formulación de anticuerpo anti-IL5R estable que es apropiada para la administración de una dosis de entre 2-100 mg por medio de administración subcutánea a partir de una jeringa precargada (o un vial de configuración boca abajo). Específicamente, se desarrollaron dos formulaciones de concentración de anticuerpo independientes, una formulación de 2-20 mg/ml y una formulación de 20-100 mg/ml.
1. Materiales y métodos
a. Fuente de anticuerpo anti-IL5R y preparación de formulaciones
Se utilizaron múltiples lotes de anticuerpo anti-IL5R en estos estudios. Se produjeron todos los lotes a diversas escalas por MedImmune y se administraron tras diafiltración y concentración hasta aproximadamente 130 g/l en 20 mM de histidina/histidina HCl a pH 6. Algunos lotes tenían también 250 mM de trehalosa en el tampón de diafiltración.
Se formuló anticuerpo anti-IL5R realizando adiciones conocidas en tampón de adición de excipientes (EAB) para lograr una concentración de anticuerpo anti-IL5R de 100 g/l y concentraciones apropiadas de especies de tampón y excipiente. Se prepararon sustancias farmacológicas de concentración inferior a partir de la formulación de 100 g/l.
2. Métodos de condiciones aceleradas de estrés
a. Almacenamiento a temperatura aumentada
Se almacenaron viales y jeringas en cámaras de estabilidad controlada para mantener una temperatura constante durante el almacenamiento. Se mantuvieron las cámaras a 2-8 °C, 23-27 °C/60% de HR, o 38-42 °C/75% de HR, pero se hará referencia a las mismas por sus temperaturas de punto medio de 5°, 25° o 40 °C de aquí en adelante. Se almacenaron los viales verticales a menos que se indique otra cosa y se almacenaron las jeringas precargadas con la punta hacia abajo.
b. Ciclos de congelación-descongelación
Se utilizaron ciclos de congelación-descongelación tanto controlados como no controlados en estos estudios. Se realizó la congelación-descongelación no controlada congelando los viales en una cámara de -40 °C y descongelándolos a temperatura ambiente.
c. Transporte y agitación
Se usó una variedad de métodos para investigar el efecto del transporte sobre el anticuerpo anti-IL5R. Se realizó la agitación en mesa de trabajo de los viales mediante agitación orbital a 150 rpm durante 24 horas. Se imitó el transporte real enviando el producto a una ubicación externa. El producto realizó dos viajes de ida y vuelta y se somete a transporte por aire y por tierra a lo largo de 4 días. Se usó una combinación de paquetes congelados y fríos para mantener la temperatura del producto a 2-8 °C, y se monitorizó mediante sensores que indican temperaturas por debajo de 0 °C o por encima de 9 °C.
Para estudios de examen, se simuló el transporte utilizando una mesa vibratoria (simulador de transporte). El producto se sometió a transporte “por aire” y “por tierra” en un patrón similar al experimentado durante un envío de viaje de ida y vuelta. El proceso duró 12 horas y de nuevo se controló la temperatura con paquetes fríos para que fuese de 2-8 °C; no se utilizaron sensores. Se eligió la orientación horizontal como la orientación del peor caso posible durante el envío real o simulado debido a la posibilidad de formación de burbujas durante el viaje y la posibilidad de contacto del fármaco con todo el cilindro, la punta de la aguja y el tapón.
3. Métodos experimentales
a. Métodos que siguen o se derivan de un SOP
Se realizaron inspecciones visuales comparando con patrones de partículas y opalescencia. Se monitorizó la agregación y fragmentación mediante SE-HPLC. Para concentraciones de anticuerpo anti-IL5R por debajo de 10 g/l, se usó un volumen de inyección mayor para lograr una masa de proteína total por inyección similar. También se utilizaron algunas muestras para mediciones de cIEF y RP-HPLC para monitorizar la fragmentación.
b. Concentración de proteína
Se midió la concentración de proteína diluyendo la proteína mediante dilución gravimétrica en serie hasta aproximadamente 0.5 g/l y midiendo la absorbancia a 280 nm. Se calculó la concentración a partir del coeficiente de extinción y el factor de dilución, y se corrigió para el efecto de la densidad sobre la dilución gravimétrica para concentraciones iniciales por encima de 50 g/l.
c. Recuento de partículas subvisibles
Se realizaron recuentos de partículas subvisibles utilizando tanto MFI como HIAC. Para la MFI, se ejecutaron 0.9 ml de disolución de manera pura tras ejecutarse la iluminación óptica con agua. Los primeros 0.2 ml se utilizaron para purgar el sistema y no se incluyen en el análisis. Se usó un filtro de relación de aspecto <0.85 para eliminar gotitas de aceite de silicona o burbujas de aire esféricas. Para HIAC, se diluyeron disoluciones con concentraciones > 5 g/l hasta aproximadamente 5 g/l, mientras que se ejecutaron muestras diluidas de manera pura. Se realizó la dilución dentro de una campana de flujo laminar con tampón 20 mM de histidina/histidina HCl, pH 6 que se filtró justo antes de su uso. Se desgasificaron las muestras a vacío durante al menos 30 minutos antes de las pruebas. Se multiplicó el promedio de tres ejecuciones por el factor de dilución para obtener el resultado final. Las gotitas de aceite de silicona no se diferenciaban de las partículas de proteína mediante HIAC.
4. Datos y discusión
a. Examen de la concentración de polisorbato 20
El primer objetivo era optimizar la concentración de PS-20 en la formulación de anticuerpo acuosa. Se incluyó polisorbato en las disoluciones para proteger a la proteína frente a la desnaturalización y agregación en las superficies de contacto, y se esperaba que la concentración requerida fuese diferente en el producto líquido que en el liofilizado. Las tensiones interfaciales principales se encontraron durante la congelación-descongelación y el transporte, de modo que el plan experimental se centró en imitar estos. La experiencia previa indicó que un 0.02% de polisorbato 20 era suficiente para proteger completamente frente a ambos de estos estreses (datos no mostrados). Como verificación, se combinaron estos estreses en serie, en el orden esperado para la producción clínica, y se añadió un periodo de incubación tras el estrés para permitir el crecimiento de cualquier posible partícula. En primer lugar, se sometió la sustancia farmacológica a tres ciclos de congelación-descongelación no controlados y se filtró el material y se cargó en viales. Entonces se agitaron en la mesa de trabajo y se incubaron durante una semana a 40 °C antes de las pruebas mediante SE-HPLC y MFI. Las condiciones sometidas a prueba fueron los extremos del intervalo de concentración, 2 y 100 g/l, formulado en 240 mM de trehalosa, 20 mM de histidina/histidina HCl, pH 6 con niveles variables de PS-20 de un 0-0.03% p/v. Los resultados se encuentran en las figuras 2, 3 y 4. Los datos de fracción de monómeros indicaron que la disolución de 2 g/l permanecía pura independientemente del nivel de polisorbato, pero que bajas cantidades de polisorbato 20, por debajo de aproximadamente un 0.005%, provocaron una pequeña cantidad de agregación a 100 g/l, pero estos resultados no indicaban por sí mismos que estaban “al borde del fracaso”. Los estreses utilizados eran intensos, y el nivel de degradación mínimo, por tanto cualquier nivel de PS-20 sometido a prueba podía ser adecuado desde una perspectiva de agregados por SEC. A 2 g/l, los recuentos de partículas subvisibles eran bastante altos y no se controlaban por polisorbato 20 en el intervalo sometido a prueba. A 100 g/l, los altos recuentos de partículas subvisibles se controlaban por la presencia de un 0.003% o más de PS-20. Conjuntamente, estos datos indicaban que los niveles de PS-20 deben mantenerse a o por encima de un 0.003%.
Se requería un método alternativo de control de las partículas subvisibles para disoluciones de baja concentración, tal como se comenta a continuación.
b. Examen del pH
Se estudió el efecto del pH de la disolución en disoluciones de 2, 20 y 100 g/l con valores de pH de 5 a 7.5. El resto de la formulación era constante e incluía 240 mM de trehalosa, 20 mM de histidina/histidina-HCl y un 0.02% de PS-20. Se prepararon disoluciones y se almacenaron a 40 °C durante un mes antes de las pruebas. Se evaluaron para todas las muestras la pérdida de monómero mediante SE-HPLC, las partículas subvisibles mediante MFI y las partículas visibles mediante inspección visual. Se realizaron pruebas adicionales con las muestras de 100 g/l, incluyendo RP-HPLC y cIEF. Los resultados se proporcionan en las figuras 5 y 6.
Se minimizaron la agregación y fragmentación dentro del intervalo de pH de 5.5-6.5. Los resultados de cIEF no concordaban con el patrón de referencia a pH 7.0 y superior. Los recuentos de partículas subvisibles o bien eran bajos o bien no mostraban ningún patrón con el pH de la disolución. Las puntuaciones de partículas visibles eran superiores a partir del pH 5.5-6.5. Aunque estas puntuaciones son altas, las muestras se inspeccionaron cerca de la luz cuando se observan de manera rutinaria recuentos de partículas superiores. Era posible que el material fuente también contribuyera a los altos niveles de partículas, ya que éste era material que tenía niveles de HCP reducidos por la purificación adicional sobre proteína A. Este estudio indicó que un pH óptimo desde una perspectiva de formación de partículas sería pH 5 o pH >7. Sin embargo, puesto que se entiende que las puntuaciones de partículas visibles se sobreestiman en este caso, el pH no se cambió desde pH 6.0 como resultado de este estudio.
c. Efecto del envío
Era necesario que las formulaciones fuesen robustas para el envío, de modo que se sometieron a prueba a diversas concentraciones de proteína y PS-20 en jeringas precargadas. La formulación entre 2 - 100 g/l de anticuerpo anti-IL5R y un 0-0.05% de PS-20, con las demás condiciones constantes a 240 mM de trehalosa, 20 mM de histidina/histidina HCl, pH 6. Se sometieron a prueba varias otras condiciones a 2 g/l, incluyendo glicina, cloruro de calcio, pH 5.5, pH 6.5 y un 0.02% de polisorbato-80. Ninguna de estas condiciones mostró mejora con respecto a la formulación de trehalosa a pH 6 con polisorbato 20, de modo que no se comentan adicionalmente.
Se cargó un ml de muestra en una PFS de plataforma con 0.4 mg de aceite de silicona. Se enviaron las muestras, almacenadas a 5 °C, 25 °C y 40 °C y se sometieron a prueba a lo largo de dos meses mediante inspección visual, MFI y HIAC. Los resultados se presentan en la figura 7.
El gráfico muestra los recuentos de partículas subvisibles a partir de MFI tras 1 mes de almacenamiento a 25 °C. Los recuentos de partículas subvisibles a partir de HIAC o tras almacenamiento a otras temperaturas mostraron tendencias similares al conjunto de datos mostrado. Las inspecciones visuales no indicaron altos recuentos de partículas visibles para ninguna de las muestras excepto la que contenía cloruro de calcio. Las disoluciones de alta concentración de proteína (> 20 g/l) eran robustas con respecto al envío siempre que estuviera presente cierta cantidad de PS-20. Por tanto, se usó la formulación de trehalosa en estudios de estabilidad a largo plazo para la disolución de 20-100 g/l.
Los datos de envío verificaron que las formulaciones de baja concentración no eran robustas, tal como se observó por los altos recuentos de partículas subvisibles y altamente variables. Los datos también mostraron que el problema no se resolvía mediante polisorbato solo, por tanto era necesario reformular las disoluciones de baja concentración.
d. Reformulación de DS de baja concentración
Los exámenes de reformulación de baja concentración se sometieron a estrés mediante transporte simulado y se sometieron a prueba mediante MFI. Los recuentos de partículas subvisibles mostrados eran partículas >10 |jm, relación de aspecto filtrada; las tendencias eran similares para otros tamaños de partícula.
Durante la fabricación, se producirá y congelará una sustancia farmacológica no formulada (UDS) a alta concentración (> 100 g/l) que contiene trehalosa. Es necesario el almacenamiento de este producto intermedio de alta concentración para permitir la dilución en diversas formulaciones a lo largo del intervalo de formulación de 2-100 mg/ml. La dilución de la UDS dará como resultado cierta cantidad de trehalosa residual; para la uniformidad de la composición, se utilizará una única concentración de trehalosa para todo el intervalo de dosis baja. El tampón y el pH no se cambiaron.
Se usó el primer examen para determinar la concentración de proteína mínima donde la formulación de trehalosa era estable, y para determinar el efecto de la fuerza iónica aumentada formulando en 150 mM de trehalosa con 75 mM de arginina o cloruro de sodio. Los resultados mostrados a continuación indican que concentraciones de proteína > 10 g/l eran estables, pero para la robustez el intervalo de baja concentración se fijó a 2 - 20 g/l. El aumento de la fuerza iónica dio como resultado disoluciones más estables con ambos excipientes. Véase, por ejemplo, la figura 8.
Los siguientes estudios se centraron en la optimización de las concentraciones de arginina o NaCl; se usó una concentración de proteína de 2 g/l como peor caso posible para todos los estudios. Para cada excipiente, se realizaron exámenes de concentración de excipientes amplia y estrecha con un 0.02% de PS-20. Se realizó el examen de arginina inicial con cantidades variables de trehalosa, donde se prepararon disoluciones combinando 270 mM de arginina con 250 mM de trehalosa. El objetivo era mantener la osmolalidad, pero el cálculo se realizó incorrectamente (arginina-HCl es bivalente) de modo que las disoluciones que contenían arginina eran hiperosmóticas. El resto de los exámenes de concentración de excipientes se realizaron con una concentración de trehalosa constante de 40 ó 50 mM, basándose en la trehalosa residual a 20 g/l tras la dilución a partir de la disolución madre de 100 g/l. Los resultados se proporcionan en las figuras 9 y 10.
Los resultados de los exámenes de arginina y NaCl amplias indican que es necesario que la concentración sea mayor de 50 mM de arginina o 75 mM de NaCl para producir una formulación estable. Los exámenes de concentración estrecha de 75-150 mM de arginina o 100-200 mM de NaCl dieron como resultado bajos recuentos de partículas a lo largo de todo el intervalo. Esto indicó que una concentración en el medio de estos intervalos debe producir una formulación robusta; se eligió 130 mM para que fuese isoosmótica en combinación con 50 mM de trehalosa residual.
Se comprobó la optimización de la concentración de PS-20 para las nuevas formulaciones utilizando el mismo método. Estos experimentos se realizaron de manera concurrente con los exámenes de concentración de excipiente estrecha, de modo que se usó una concentración de punto medio. Las condiciones sometidas a prueba fueron un 0.01-0.1% de PS-20, 115 mM de arginina HCl, 40 mM de trehalosa y un 0.01-0.05% de PS-20, 150 mM de NaCl, 50 mM de trehalosa. Se sometió a prueba un par de muestras con un 0.02% de PS-80, pero resultaron recuentos superiores al resultado de PS-20 correspondiente (datos no mostrados). Los recuentos de partículas fueron bajos para todos los niveles de polisorbato sometidos a prueba, lo que indica que no es necesario cambiar el nivel de un 0.02% en las nuevas formulaciones. Véase, por ejemplo, la figura 11.
Los resultados de la reformulación para las concentraciones bajas de anticuerpo anti-IL5R indicaron que o bien arginina o bien NaCl podían estabilizar la formulación a corto plazo. Las formulaciones consideradas fueron 130 mM de arginina HCl o 130 mM de NaCl, con 50 mM de trehalosa, 20 mM de histidina/histidina HCl, un 0.02% de PS-20, pH 6 para concentraciones de proteína de 2 - 20 g/l.
e. Consideraciones para viales y PFS
Las tres formulaciones desarrolladas anteriormente (20-100 mg/ml en trehalosa, 2-20 mg/ml en trehalosa/arginina y 2-20 mg/ml en trehalosa/NaCl) eran apropiadas para las configuraciones tanto de vial como de PFS. La configuración de vial fue un vial Schott de 3 cc con un tapón West 4432/50. El mayor riesgo con respecto a la configuración de vial fue el nivel de aceite de silicona en los tapones, de modo que se realizaron estudios de estabilidad a largo plazo con tapones que tienen un nivel más alto de aceite de silicona (0.039 mg/cm2) que los que se utilizarán de manera general (0.007 - 0.024 mg/cm2).
La jeringa sometida a prueba con la formulación de anticuerpo anti-IL5R era la jeringa de plataforma, una PFS de 1 ml de longitud de BD con una pestaña recortada, una aguja de pared delgada 29G apilada, que contenía 0.4 mg de aceite de Si, y cubierta con una funda de aguja rígida BD260 (n.° de catálogo 47363119).
f. Estudios de estabilidad a largo plazo
Se realizaron dos estudios de estabilidad a largo plazo para verificar las decisiones tomadas a partir de los estudios de examen. El estudio de estabilidad n.° 1 investigó la estabilidad a largo plazo de las formulaciones de trehalosa y arginina/trehalosa en PFS y viales. Adicionalmente, se realizaron comparaciones de PFS que no se comentarán en la presente. Se inició el estudio de estabilidad n.° 2 para proporcionar datos de otro lote de material para las configuraciones examinadas en el estudio n.° 1, y también para investigar el intervalo de formulación de NaCl/trehalosa y el impacto del volumen de llenado de desde ^ ml hasta 1 ml en PFS y viales.
i. Estudio de estabilidad n.° 1: Estabilidad de presentaciones en PFS de anticuerpo anti-IL5R
Se realizaron estudios de estabilidad en jeringas con viales como control. Se sometió a prueba cada uno de los puntos finales de los intervalos de formulación en cada recipiente primario. La jeringa sometida a prueba era la plataforma Hypak™ de Biotech; ésta es una jeringa de vidrio de 1 ml de longitud de BD, prácticamente exenta de tungsteno con una aguja de pared delgada 29G y 0.4 mg de aceite de silicona. Los viales utilizados fueron viales Schott de 3 cc con tapones West 4423/50 y contrasellos.
Las formulaciones cargadas son las siguientes:
• 2 y 20 mg/ml de anticuerpo anti-IL5R, 125 mM de arginina HCl, 50 mM de trehalosa, 20 mM de histidina/ histidina HCl, un 0.02% de PS-20, pH 6; y •
• 20 y 100 mg/ml de anticuerpo anti-IL5R, 250 mM de trehalosa, 20 mM de histidina/histidina HCl, un 0.02% de PS-20, pH 6.
A. Pureza de las presentaciones de jeringa precargada con anticuerpo anti-IL5R
No hubo ningún efecto significativo del recipiente primario sobre la pérdida de monómero para ninguna formulación. Se observó cierto impacto de la concentración de proteína, pero la tasa de pérdida de monómero era sistemáticamente baja. Véase la figura 12A.
B. Análisis de partículas de presentaciones de jeringa precargada con anticuerpo anti-IL5R
Se pensaba que la formación de partículas era la principal ruta de degradación del anticuerpo anti-IL5R de modo que se pensaba que desempeñaba un papel importante en la determinación de una PFS adecuada. La medición de partículas subvisibles mediante HIAC mostró un aumento en el número de partículas en la PFS, probablemente debido a las gotitas de aceite de silicona (véanse las figuras 12B y 12C). Sin embargo, los recuentos de partículas totales permanecen muy por debajo de los límites de la USP de 6000 partículas >10 |jm / ml y 600 partículas >25 |jm / ml para todas las configuraciones. Se usó MFI como método ortogonal y mostró resultados similares, aunque se observó menos diferencia entre recipientes puesto que las gotitas de aceite de silicona pueden eliminarse por filtrado de los resultados en el software de MFI.
ii. Resumen de la estabilidad en Hypak™ para jeringas de Biotech a 5 °C
La TABLA 1 muestra un resumen de los datos de estabilidad (estudio de estabilidad n.° 1) disponibles para anticuerpo anti-IL5R en las jeringas Hypak™ de Biotech a 5 °C hasta 16 meses para formulaciones de arginina y 24 meses para formulación de trehalosa. Se detectaron partículas visualmente lo que condujo a una reducción en la concentración de PS-20 desde un 0.02% hasta un 0.006%. No se identificó ningún otro alto riesgo, aunque los recuentos de partículas subvisibles eran variables.
TABLA 1
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iii. Estudio de estabilidad n.° 2
El estudio de estabilidad n.° 2 era un estudio de estabilidad en intervalos en jeringas precargadas y viales, diseñado para decidir la formulación de dosis baja y el volumen de llenado, y para verificar la estabilidad del placebo.
El estudio de estabilidad previo utilizado para elegir la PFS tenía un volumen de llenado de 1 ml sólo. Sin embargo, había varios posibles beneficios de un volumen de llenado inferior incluyendo dolor reducido en la inyección, un bulto más pequeño bajo la piel, administración más rápida y menos fugas del sitio de administración.
La estrategia de intervalos para la opción de llenado de 1 ml fue dos intervalos de concentración de proteína, 2-20 g/l para la dosis baja y 20-100 g/l para la dosis alta. Los mismos intervalos para un llenado de ^ ml cubrieron el intervalo de dosis de 1-50 mg, y también requirieron un intervalo de volumen de llenado de 100 g/l desde ^ - 1 ml para la dosis de 50-100 mg. Esto se muestra gráficamente en la figura 13 por motivos de claridad. En ambos casos, se estudió el intervalo de dosis más baja en formulaciones tanto a base de arginina como de NaCl.
Las sustancias farmacológicas y los placebos cargados fueron los siguientes:
• Todas las disoluciones: 20 mM de histidina/histidina HCl, un 0.02% de PS-20, pH 6.0
• 2 Arg / 20 Arg: 2 ó 20 g/l de anticuerpo anti-IL5R, 125 mM de arginina HCl, 50 mM de trehalosa
• 2 NaCl / 20 NaCl: 2 ó 20 g/l de anticuerpo anti-IL5R, 130 mM de NaCl, 50 mM de trehalosa
• 20 Tre / 100 Tre: 20 ó 100 g/l de anticuerpo anti-IL5R, 250 mM de trehalosa
• Placebo de Arg: 125 mM de arginina HCl, 50 mM de trehalosa
• Placebo de NaCl: 130 mM de NaCl, 50 mM de trehalosa
• Placebo de Tre: 250 mM de trehalosa
La configuración de volumen de llenado de 1 ml no se sometió a prueba para ninguna de las configuraciones de vial ni el placebo en PFS con el fin de reducir el tamaño total del estudio, puesto que el volumen de llenado de 1/2 ml era la configuración del peor caso posible más probable debido a la mayor relación de área de superficie con respecto a volumen.
Se enviaron todas las muestras y luego se pusieron en estabilidad a 5, 25 y 40 °C. Se almacenaron los viales invertidos durante la estabilidad para maximizar el contacto con el tapón. En el momento en el que se descubrieron las partículas visibles en estudios más antiguos, se habían recogido 6 semanas de datos para este estudio de estabilidad. Adicionalmente, se observaron partículas en la formulación de NaCl entre los puntos de tiempo de 3 y 6 meses de este estudio (datos no mostrados), lo que condujo a que se rechazara la formulación de NaCl en favor de la formulación de arginina.
El trabajo de formulación adicional requerido para mitigar la formación de partículas visibles se describe en los ejemplos que siguen y dieron como resultado una disminución de la concentración de polisorbato 20 desde un 0.02% hasta un 0.006%. No se observaron otros problemas de estabilidad para esta formulación, y no se observó un impacto significativo del recipiente o el volumen de llenado. Se resume un año de datos de estabilidad en la figura 14, que incluyen puntuaciones de partículas visibles, pérdida de pureza por SEC, recuentos de partículas por HIAC y potencia (no todas las configuraciones se sometieron a prueba en todos los puntos de tiempo).
Conclusión del ejemplo 1
Se llevó a cabo el examen de formulación utilizando diversos métodos de estrés incluyendo congelación/descongelación, agitación, adiciones conocidas de aceite de silicona y estabilidad en condiciones aceleradas. Se usó la estabilidad a largo plazo para verificar los resultados de los estudios de examen. La formulación de trehalosa de fase 2b era satisfactoria para líquidos a alta concentración con una concentración de polisorbato aumentada, pero mostró inestabilidad cuando se extendió a líquidos a bajas concentraciones, principalmente a través de la formación de partículas subvisibles. Se reformuló el intervalo de baja concentración aumentando la fuerza iónica con o bien clorhidrato de arginina o bien cloruro de sodio, dando como resultado una disolución estable.
Con el fin de cubrir el amplio intervalo de posibles dosis (2 - 100 mg), los tres posibles intervalos de formulación fueron los siguientes:
• 2-20 g/l, 130 mM de clorhidrato de arginina, 50 mM de trehalosa dihidratada, 20 mM de histidina/clorhidrato de histidina, un 0.02% de polisorbato 20, pH 6.0;
• 2-20 g/l, 130 mM de cloruro de sodio, 50 mM de trehalosa dihidratada, 20 mM de histidina/clorhidrato de histidina, un 0.02% de polisorbato 20, pH 6.0; y
• 20-100 g/l, 250 mM de trehalosa dihidratada, 20 mM de histidina/clorhidrato de histidina, un 0.02% de polisorbato 20, pH 6.0.
El estudio de estabilidad a largo plazo de hasta 24 meses indica que las tres formulaciones eran estables a 2 - 8 °C con respecto a la agitación, relativamente insensibles al aceite de silicona y compatibles con los viales y PFS. Adicionalmente, se observó una degradación mínima a temperaturas elevadas. Las observaciones continuadas de las dos formulaciones de baja concentración eliminaron la opción de NaCl debido al aumento de formación de partículas visibles en comparación con la opción de arginina, dando como resultados dos intervalos de formulación. Los datos indicaron que las jeringas precargadas son un recipiente primario aceptable con un volumen de llenado de o bien 1 ml o bien ^ ml. La formación de partículas visibles siguió siendo un problema con estas formulaciones, tal como se aborda en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 2 - Formación de partículas en formulaciones de anticuerpo anti-IL5R
Se detectaron partículas visibles en formulaciones acuosas de anticuerpo anti-IL5R tanto en viales como en PFS en los estudios de estabilidad a largo plazo previos, con la primera incidencia de detección en el punto de tiempo de 6 meses (datos no mostrados). Se realizó un estudio para mitigar la formación de partículas visibles en una formulación de anticuerpo anti-IL5R que comprendía polisorbato 20 (PS-20) almacenada durante un periodo de tiempo prolongado. El siguiente ejemplo describe un estudio a largo plazo de formulaciones que comprenden diversas concentraciones de PS-20 y proteína para verificar la importancia que tiene la concentración de PS-20 en la mitigación de la formación de partículas. Este estudio dio como resultado un intervalo aceptable de un 0.002 -0.01% de PS-20.
Abreviaturas y definiciones
Figure imgf000030_0001
Estudios preliminares
Se detectó formación de partículas en los estudios de estabilidad a largo plazo descritos en el ejemplo 1. Sin embargo, las partículas eran extremadamente pequeñas y se parecían más a una nube que las partículas individuales. Con el fin de observar las partículas, se inspeccionaron las muestras cerca de la fuente de luz. Puesto que las partículas eran distintas a las de los conjuntos patrón en vial y PFS, se compararon las muestras entre sí como con los patrones en cada punto de tiempo.
Se detectaron por primera vez partículas en el punto de tiempo de 6 meses en viales de 100 g/l de Tre con un 0.02% de PS-20.
Se compararon muestras de seis meses y 11 meses en (1) viales y (2) jeringas precargada (PFS). Ambos estudios mostraron que la formación de partículas era más intensa en los viales que en las PFS, aunque no estaban disponibles patrones de PFS en ese momento de modo que no está disponible una comparación numérica. Se decantaron las muestras de las PFS y se inyectaron en viales para las pruebas de aspecto. No se observaron más partículas en estos viales, lo que verifica que la diferencia no es un efecto del camino óptico. En formulaciones de trehalosa, esta diferencia de vial con respecto a PFS es más significativa que en formulaciones de arginina.
Se realizó una comparación de las diversas concentraciones de PS-20 (un 0, 0.01, 0.02 y 0.03%) en formulaciones de 100 g/l de Tre tanto en viales como en PFS tras el envío. Las concentraciones de PS-20 inferiores de un 0 y un 0.01% de PS-20 estaban completamente exentas de partículas en el punto de tiempo de 11 meses. Eran visibles partículas tanto en el vial como en la PFS a un 0.02% y un 0.03% de PS-20. A los 20 meses, las PFS con un 0 y un 0.01% de PS-20 y el vial con un 0% de PS-20 permanecieron transparentes pero el vial con un 0.01% tenía un tornado de partículas muy pequeño.
En estudios dirigidos, cuando se mantuvieron cercanas a la fuente de luz, eran claramente visibles partículas en los viales y PFS de 100 g/l de Tre, un 0.02% de PS-20, en algunos casos tan pronto como a los 3-4 meses. En el extremo de baja concentración (20 g/l) del intervalo de Tre, se formaron partículas mucho más lentamente y se observaron sólo en viales a los 21 meses. No se han observado partículas en PFS con 20 g/l de Tre a ninguna concentración de PS-20, con datos disponibles hasta 21 meses. La formación de partículas en formulaciones de arginina era algo más lenta, observándose partículas en el extremo de alta concentración (20 g/l) del intervalo con un 0.02% de PS-20 a los 6-9 meses. Nunca se han observado partículas en la formulación de 2 g/l de Arg a ninguna concentración de PS-20 en ningún recipiente, con datos disponibles hasta 16 meses.
Los estudios de temperatura con estrés y en condiciones aceleradas no proporcionaron ningún conocimiento sobre la formación de partículas. A 40 °C, no se formaron partículas en absoluto a lo largo del periodo de pruebas de 3 meses. A 25 °C, la formación de partículas era similar o estaba ligeramente reducida en comparación con a 5 °C. Estos datos indicaron que los extremos de alta concentración de proteína del intervalo corrían un alto riesgo de formación de partículas visibles y los extremos bajos corrían potencialmente un riesgo a largo plazo. Se investigó la reducción de la concentración de PS-20 para mitigar la formación de partículas. El recipiente primario siguió siendo la PFS de plataforma, y se utilizaron viales como lectura temprana de la formación de partículas puesto que la formación de partículas en viales era más intensa y más fácil de observar.
Investigación de diversas concentraciones de PS-20
Se diseñó un estudio de estabilidad extenso para investigar la formación de partículas en diversas formulaciones, diversas concentraciones de PS-20 y diversas concentraciones de anticuerpo. Se cargaron todas las muestras tanto en PFS como en viales, se enviaron dos veces a una ubicación separada para simular el proceso de distribución y se colocaron en estabilidad a 5 °C. Se realizaron pruebas de aspecto mensualmente. También se realizaron pruebas de SEC, HIAC y MFI para un subconjunto de muestras a tiempo cero, 3, 6 y 9 meses. La figura 15 muestra las muestras que se prepararon como parte de este estudio.
Sin ninguna cantidad de PS-20, se formaron partículas subvisibles tras el envío tal como se muestra por los datos de MFI en la figura 16 para PFS a tiempo cero. El nivel sometido a prueba más bajo de PS-20 (un 0.002%) o más era suficiente para proteger frente al estrés de envío. Adicionalmente, se verificó que la concentración de PS-20 más baja (un 0.002%) era suficiente para proteger frente al estrés de envío de la DS en un tanque utilizando un modelo de escala reducida (datos no mostrados en la presente).
Los resultados de aspecto para las partículas mostraron que había una formación de partículas significativa en viales por encima de un 0.01% de PS-20, y algunas partículas en PFS a un 0.02% de PS-20 para ambos intervalos de formulación, observándose menos partículas en el extremo de concentración inferior de ambos intervalos. Véase la figura 17. Las primeras observaciones de las partículas fueron a los 3 meses para 100 g/l de Tre y a los 6 meses para 20 g/l de Arg. Las figuras ilustran el impacto de la concentración de proteína y PS-20 sobre la formación de partículas en el último punto de tiempo, 9 meses. Se indica que las observaciones de formación de partículas se realizaron todas cerca de la fuente de luz.
Los datos de aspecto establecen un límite superior en la concentración de PS-20 de un 0.01% y los recuentos de partículas subvisibles establecen un límite inferior de un 0.002% (a partir de los datos disponibles, el límite real puede ser inferior). El punto medio de este intervalo aceptable (un 0.006%) se estableció como la nueva concentración de PS-20.
Se verificó la estabilidad global para PFS para las muestras de extremos de intervalo incluyendo hasta 9 meses de datos para 2 g/l de Arg y 20 g/l de Arg, y hasta 18 meses de datos para 20 g/l de Tre y 100 g/l de Tre. Se sometieron a prueba los siguientes ensayos:
A. Un 0.002, un 0.006 y un 0.01% de PS-20: Aspecto, HIAC, MFI y SEC.
B. Un 0.006% de PS-20 sólo: Instron, Bioensayo, Bioanalizador, RP y cIEF.
Todos los datos indican que la formulación era estable y de bajo riesgo. Se muestra un resumen de los datos en la tabla 2.
TABLA 2
Figure imgf000031_0001
Los datos disponibles del ejemplo 2 indicaron que una reducción de la concentración de PS-20 hasta un 0.006% mitiga la formación de partículas y produjo un producto de formulación de anticuerpo que era estable durante al menos 9 meses (formulación de arginina) o 18 meses (formulación de trehalosa), sin indicaciones de un fallo próximo.
Ejemplo 3
Métodos ortogonales para la detección de partículas
El método primario de detección y cuantificación de partículas eran las pruebas de aspecto mediante inspección visual tal como se ejemplifica en el ejemplo 2. La inspección visual era variable por varios motivos. En general, la inspección visual variaba debido a la variabilidad innata de la percepción humana, lo que conduce a diferentes resultados para diferentes individuos. Debido al tamaño muy pequeño de estas partículas, su visibilidad dependía altamente de la cantidad de luz y eran distintas a los patrones de partículas tanto para viales como para PFS. Estos factores aumentaron la variabilidad de los resultados entre puntos de tiempo y entre analistas.
Se investigaron métodos ortogonales para verificar los resultados de aspecto. Las partículas formadas en las formulaciones de trehalosa eran demasiado pequeñas como para verse individualmente, de modo que se investigaron métodos de partículas subvisibles. Se comparó la muestra del peor caso posible (100 g/l de Tre, un 0.02% de PS-20, vial) de diversos lotes a las 2 semanas, y a los 2, 5 y 9 meses mediante DLS, FC, HIAC y MFI. La DLS se realizó a 100 g/l, conduciendo a una subestimación del pico principal tal como se esperaba y a una falta de fiabilidad de todos los tamaños de pico. Se detectaron picos grandes para las muestras a los 2, 5 y 9 meses que tenían un tamaño de 1.4 - 2.2 |jm. Aunque el tamaño notificado no era fiable, la presencia de los picos se correlacionaba con partículas visibles. Sin embargo, ni el tamaño notificado de las partículas ni la intensidad del pico de partículas se correlacionaba con los resultados del aspecto visual.
Los resultados de HIAC eran similares para todas las muestras; no se detectaron las partículas.
Los recuentos de MFI para partículas >10jm y >25jm eran similares para todas las muestras. Sin embargo, los recuentos de MFI para partículas >1 jm y >2 jm y los recuentos de FC presentan una tendencia con los resultados del aspecto visual y aumentan en función de la antigüedad de la muestra. Los resultados de estas muestras se muestran en la figura 18.
Experimentos adicionales indican que las partículas >1 jm mediante MFI proporcionan tendencias más fiables con los resultados del aspecto visual que recuentos de FC o partículas más grandes (datos no mostrados).
Se realizaron experimentos similares con muestras de 20 g/l de Arg que muestran partículas visibles, pero ninguno de los métodos ortogonales era satisfactorio para detectar estas partículas. Las partículas formadas en formulaciones de arginina parecían mucho más grandes que las formadas en trehalosa y se observaron como partículas individuales, que era probablemente por lo que no se detectaron mediante métodos de partículas subvisibles.
Se usó MFI para verificar el efecto de la concentración de PS-20 en el ejemplo 2. La comparación de MFI y la puntuación de aspecto se muestran en la figura 19 para el ejemplo 2 en el punto de tiempo de 9 meses. Junto con mediciones adicionales (no mostradas), la comparación indicó que eran visibles partículas cuando el recuento de MFI superaba aproximadamente 100,000 partículas >1 jm / ml. Los resultados de MFI proporcionaron un respaldo añadido a la conclusión de que se mitigaba la formación de partículas en un 0.002-0.01% de PS-20, especialmente en PFS. Los datos de viales se consideraron el peor caso posible y también eran estables a la concentración objetivo de un 0.006% de PS-20.
Ejemplo 4
Estudio de estabilidad
Se realizó un estudio de estabilidad adicional para investigar todas las configuraciones de los estudios previos con la nueva concentración de PS-20 objetivo de un 0.006%, y para añadir confianza a que estas formulaciones son estables. El intervalo incluyó un intervalo de concentración de proteína así como un intervalo de volumen de llenado y se muestra gráficamente en la figura 20.
La adición del intervalo de volumen de llenado aumentó el intervalo de dosis que se cubrían por la formulación de trehalosa. Estas configuraciones adicionales redujeron el riesgo asociado con la formulación de arginina, que tenía un mayor riesgo porque las partículas se forman más lentamente y no pueden detectarse mediante métodos ortogonales. Las muestras incluidas en este estudio de estabilidad fueron:
• 0, 2 y 20 g/l, llenado de 1 ml, formulación de arginina, un 0.006% de PS-20;
• 0 y 2 g/l, llenado de 0.3 ml, formulación de arginina, un 0.006% de PS-20;
• 0, 20, 50 y 100 g/l, llenado de 1 ml, formulación de trehalosa, un 0.006% de PS-20; y
• 0 y 20 g/l, llenado de 0.3 ml, formulación de trehalosa, un 0.006% de PS-20.
Se enviaron las muestras a una ubicación externa dos veces para simular el proceso de distribución y luego se colocaron en estabilidad a 5 °C, 25 °C y 40 °C.
Se recogieron datos de nueve meses para las formulaciones de arginina y se han recogido datos de doce meses para las formulaciones de trehalosa. Los resultados concordaban con los datos históricos y no se observaron partículas en estas muestras hasta este punto. Además, no se han observado tendencias en partículas subvisibles a lo largo del tiempo, aunque se han producido unos cuantos resultados atípicos moderadamente altos. El intervalo de resultados para todos los ensayos se muestra en la tabla 3.
TABLA 3
Figure imgf000033_0001
Los datos respaldaban la recomendación de este intervalo de formulación para el intervalo de dosis completo. El intervalo de trehalosa tenía menos riesgo que el intervalo de arginina y se recomendó para dosis de tan sólo 6 mg. Conclusión de los ejemplos 2-4
Las observaciones de partículas en estudios de estabilidad a largo plazo previos condujeron a una investigación sobre variables de la formulación que podrían alterarse para mejorar la estabilidad. Se analizaron y sometieron a prueba las variables clave, concentración de proteína y polisorbato. Basándose en los datos presentados anteriormente, se determinó que un intervalo permisible de polisorbato desde un 0.002% hasta un 0.01% y un objetivo de un 0.006% eran formulaciones óptimas para la formulación de anticuerpo anti-IL5R. Esta observación estaba respaldada por dos estudios de estabilidad con 18 y 12 meses de datos disponibles, principalmente mediante pruebas del aspecto visual.
También se observó que podía utilizarse la formulación de trehalosa en vez de la formulación de arginina en el intervalo de 6-20 mg utilizando un intervalo de volumen de 0.3-1.0 ml a 20 mg/ml. Se encontró que la formulación de trehalosa era más predecible que la formulación de arginina debido al conjunto de datos más grande y a una mejor detección.
Ejemplo 5
Se emprendió un desarrollo de purificación adicional centrado en la reducción de la proteína de célula huésped (HCP) para determinar el efecto de HCP sobre la formación de partículas. Se purificó anticuerpo anti-IL5R tal como se expone en la figura 21
El análisis en gel 2D de la fracción no retenida de la columna de proteína A indicó que estaban presentes varias especies de proteína. Véase, por ejemplo, la figura 22. Las impurezas principales, tal como se determinan mediante espectroscopía de masas de fase inversa (RP-EM) incluían aproximadamente un 60% de fragmento Fab, aproximadamente un 5% de cadena ligera (LC) y fragmentos, y aproximadamente un 40% de proteínas de células huésped (HCP) no relacionadas con el anticuerpo anti-IL5R. Las HCP no relacionadas con anticuerpo anti-IL5R incluían glutatión S-transferasa (GST), fructosa-bifosfato aldolasa y transaldolasa.
Se hizo pasar adicionalmente la fracción no retenida de la columna de proteína A a través de una columna de proteína L para separar adicionalmente (1) los fragmentos Fab de (2) las HCP no relacionadas con el anticuerpo anti-IL5R. Se encontró que cierta cantidad de material en las HCP no relacionadas con el anticuerpo anti-IL5R era responsable de la formación de partículas, y no los fragmentos Fab (datos no mostrados).
Para determinar cuál de las HCP principales era responsable de la formación de partículas, se investigó en primer lugar GST. Se investigó el papel de GST en la formación de partículas mediante (1) retirada selectiva de GST para determinar el efecto sobre la formación de partículas, (2) análisis de sedimentos de partículas para determinar la presencia de GST en el sedimento y (3) adición de GST a formulaciones de anticuerpo anti-IL5R para determinar el efecto sobre la formación de partículas.
Evidencias preliminares de la retirada específica de GST utilizando una matriz de afinidad compuesta por un conjugado de glutatión-Sepharose sugirieron que la retirada de GST daba como resultado una reducción de la formación de partículas (datos no mostrados). El análisis de sedimentos formados a partir de la fracción no retenida de proteína A indicó altas concentraciones de GST en los sedimentos (datos no mostrados).
Se añadió GST (es decir, adiciones conocidas) a formulaciones de anticuerpo anti-IL5R purificadas que carecían de partículas para determinar el efecto de GST sobre formulaciones de partículas. Se obtuvo GST de una fuente comercial (Prospec). Se añadió GST a una formulación que comprendía 50 mg/ml de anticuerpo anti-IL5R, tampón 20 mM de histidina-HCl, un 9% (p/v) de trehalosa, un 0.02% de PS-20, pH 6.0, dando como resultado concentraciones de GST de 3.8 |jg/mg y 7.6 |jg/mg. Se incubaron las muestras a 38-42 °C. Se observaron partículas colocando las muestras en una caja de iluminación. El tiempo de incubación requerido para observar formación de partículas dependía del nivel de GST presente. Para las muestras de GST de adiciones conocidas tanto de 3.8 jg/mg como de 7.6 jg/mg, se observaron partículas tras 24 horas a 38-42 °C (datos no mostrados).
Estos resultados sugirieron que las adiciones conocidas de GST a formulaciones de anticuerpo anti-IL5R provocan formación de partículas en la formulación de anticuerpo anti-I L5R.
Ejemplo 6
Se investigó la actividad de GST en diversas formulaciones de anticuerpo anti-IL5R purificadas mediante diversos medios. Como cuestión preliminar, se usó un ensayo de actividad de GST (BioVision) para determinar las concentraciones de GST para formar una curva patrón. GST cataliza la formación del grupo tiol de glutatión (GSH) con compuestos electrófilos tales como 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) para formar un conjugado de GS-DNB que se detecta a 340 nM. Por tanto, el aumento en la absorción a 340 nM es directamente proporcional a la actividad de GST. Utilizando este ensayo, se determinó la concentración de GST para diversas formulaciones de anticuerpo anti-IL5R (muestras A-J) purificadas utilizando diversos procedimientos. Se observó la correlación entre la concentración de GST y la formación de partículas. Los resultados se proporcionan en la tabla 4.
Tabla 4
Figure imgf000034_0001
Estas evidencias confirman que la presencia de GST se correlaciona con la formación de partículas.
Ejemplo 7
Se investigaron diversas columnas de purificación para identificar el método más eficaz de reducción de la concentración de GST en una formulación de anticuerpo anti-IL5R. Véase la tabla 5. Se determinó la concentración de GST tal como se expone en el ejemplo 7.
Tabla 5
Figure imgf000035_0001
* Se determinaron las concentraciones de GST de dos lotes independientes de anticuerpos anti-IL5R. La tabla 5 sugiere que tanto la columna de proteína A (MabSelect Sure) como la columna de cromatografía de modo mixto (CaptoAdhere) eran satisfactorias en la reducción de la concentración de GST por debajo de un nivel detectable durante la purificación del anticuerpo anti-I L5R.
Ejemplo 8
Se investigó la presencia de GST en otras preparaciones de anticuerpo. También se investigó la presencia de partículas en esas preparaciones de anticuerpo. Los resultados se presentan en la tabla 6, con comentarios.
Tabla 6
Figure imgf000035_0002
Todas las diferentes realizaciones u opciones descritas en la presente se pueden combinar en todas y cada una de sus variaciones. Sin embargo, el alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Una formulación de anticuerpo estable, acuosa que no se ha sometido a temperaturas de congelación que comprende:
a. 30 mg/ml de un anticuerpo, donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 2; y
b. un 0.006% de polisorbato-20; y
c. histidina/histidina HCl 20 mM; y
d. trehalosa 250 mM, donde la formulación tiene pH 6.0.
2. La formulación de anticuerpo según la reivindicación 1, donde la formulación es una formulación inyectable, opcionalmente donde la formulación es adecuada para administración intravenosa, subcutánea o intramuscular.
3. Un recipiente sellado que contiene la formulación de anticuerpo según la reivindicación 1 o 2.
4. Una forma farmacéutica de dosificación unitaria adecuada para administración parenteral a un ser humano que comprende la formulación de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en un recipiente adecuado, opcionalmente donde el recipiente adecuado es una jeringa precargada.
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