ES2894633T3 - Métodos de establecimiento bancos de células de alta densidad - Google Patents

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Abstract

Un método no centrífugo para producir un banco de células congeladas de alta densidad, comprendiendo el método: a) cultivar células en un biorreactor de perfusión hasta una primera densidad celular eliminando de manera continua medio de crecimiento de un cultivo y remplazándolo por medio de crecimiento nuevo, agitándose el biorreactor para un mezclado y un intercambio de gases eficientes, estando acoplado el biorreactor a un sistema de retención celular que comprende un sistema de filtración de flujo tangencial alternante (ATF) que incluye un filtro; b) concentrar de manera no centrífuga las células cultivadas en el biorreactor de perfusión acoplado al sistema de retención celular, concentrándose las células hasta una segunda densidad celular mayor que la primera densidad celular eliminando el medio de crecimiento del cultivo usando el filtro y reduciendo de ese modo el volumen del medio de crecimiento para producir una población de células concentrada de aproximadamente 1×108 células/ml; y c) criopreservar la población de células concentrada para producir un banco de células congeladas de alta densidad, en el que el banco de células de mamífero congeladas de alta densidad tiene una viabilidad tras la descongelación de al menos el 90%, en el que el pH y el oxígeno disuelto (OD) del cultivo se controlan mediante métodos no automatizados, y en el que el biorreactor se bascula a entre 6 rpm y 22 rpm.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de establecimiento de bancos de células de alta densidad
ANTECEDENTES
El establecimiento de bancos de células convencional se usa ampliamente para mantener reservas de células caracterizadas, congeladas, que pueden descongelarse para su uso en varias aplicaciones, incluyendo la producción de proteínas terapéuticamente relevantes. Normalmente, las reservas criopreservadas se mantienen a densidades menores o se centrifugan para crear alícuotas de densidad mayor para su almacenamiento. Las reservas de densidad menor no permiten una inoculación eficiente de cultivos de gran volumen, mientras que los métodos de concentración basados en centrifugación pueden ser muy dañinos para las células (que se volverán incluso más frágiles durante el proceso de criopreservación). Por consiguiente, hay una necesidad de métodos de establecimiento de bancos de células mejorados. El documento WO 2013/006461 da a conocer métodos para el crecimiento y el establecimiento de bancos de alta densidad celular de células usando un biorreactor un medio de cultivo que se perfunde.
SUMARIO
La presente divulgación proporciona métodos mejorados para la creación de un banco de células. El proceso de establecimiento de bancos de células de la invención según las reivindicaciones 1 y 17 emplea técnicas de cultivo por perfusión y concentración no centrífuga de células para permitir la criopreservación a densidades celulares inesperadamente altas al tiempo que conservan una viabilidad celular excelente para su uso posterior en cultivo celular de producción.
Por consiguiente, la invención proporciona un método no centrífugo para producir un banco de células congeladas de alta densidad, comprendiendo el método: a) cultivar células en un biorreactor de perfusión hasta una primera densidad celular eliminando de manera continua medio de crecimiento de un cultivo y remplazándolo por medio de crecimiento nuevo, agitándose el biorreactor para un mezclado y un intercambio de gases eficientes, estando acoplado el biorreactor a un sistema de retención celular que comprende un sistema de filtración de flujo tangencial alternante (ATF) que incluye un filtro; b) concentrar de manera no centrífuga las células cultivadas en el biorreactor de perfusión acoplado al sistema de retención celular, concentrándose las células hasta una segunda densidad celular mayor que la primera densidad celular eliminando el medio de crecimiento del cultivo usando el filtro y reduciendo de ese modo el volumen del medio de crecimiento para producir una población de células concentrada de aproximadamente 1x108 células/ml; y c) criopreservar la población de células concentrada para producir un banco de células congeladas de alta densidad, teniendo el banco de células de mamífero congeladas de alta densidad una viabilidad tras la descongelación de al menos el 90%, controlándose el pH y el oxígeno disuelto (OD) del cultivo mediante métodos no automatizados, y basculándose el biorreactor a entre 5 rpm y 22 rpm.
El sistema de retención celular comprende un sistema de filtración de flujo tangencial alternante que comprende un filtro. En otra realización, el filtro tiene un área superficial de al menos 0,3 m2. En otra realización, el filtro tiene un área superficial de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,0 m2. En otra realización, el filtro tiene un área superficial de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 0,8 m2. En otra realización, el filtro tiene un área superficial de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 3,0 m2. En otra realización, el filtro tiene un área superficial de aproximadamente 4 a aproximadamente 5 m2.
En una realización, el filtro tiene un tamaño de poro de aproximadamente 0,2 |um.
La población de células concentrada tiene una densidad celular de al menos aproximadamente 1 x 108 células/ml.
La criopreservación comprende añadir DMSO a la población de células concentrada a una concentración final de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10%, vol./vol. En otra realización, la criopreservación comprende congelar al menos una porción de la población de células concentrada en un recipiente apropiado para su almacenamiento en condiciones de criopreservación.
En una realización, el recipiente es un vial. En una realización, el recipiente tiene un volumen de al menos 2 ml. En una realización, el recipiente tiene un volumen de aproximadamente 5 ml.
En una realización, el banco de células congeladas de alta densidad comprende aproximadamente 4,5 x 108 células.
En una realización, el recipiente es una bolsa de criopreservación. En otra realización, la bolsa de criopreservación tiene un volumen de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 ml.
En una realización, el banco de células congeladas de alta densidad tiene una densidad celular de aproximadamente 1 x 108 células/ml.
En una realización, la tasa de perfusión en el biorreactor de perfusión es de al menos aproximadamente 0,2 nl/célula/día.
En una realización, el cultivo celular de biorreactor de perfusión tiene un pH de aproximadamente 7 y una concentración de oxígeno disuelto de al menos aproximadamente el 40%.
En una realización, el El biorreactor según la reivindicación 17 un biorreactor de bolsa flexible. En otra realización, el biorreactor de bolsa flexible tiene un volumen de 10 l. En otra realización, el biorreactor de bolsa flexible tiene un volumen de al menos 20 l. En otra realización, el biorreactor de bolsa flexible comprende además al menos un tubo de inmersión.
El banco de células congeladas de alta densidad tiene una viabilidad tras la descongelación de al menos el 90%. En otra realización, el banco de células congeladas de alta densidad tiene una viabilidad tras la descongelación de al menos el 95%.
En una realización, las células son células de mamífero. En otra realización, las células de mamífero se seleccionan del grupo que consiste en: CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, células HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4 y células de hibridoma.
En una realización, las células son células transfectadas.
En un aspecto, la invención proporciona según la reivindicación 17 un método no centrífugo para producir un banco de células congeladas de alta densidad, comprendiendo el método: a) cultivar células en un biorreactor de perfusión acoplado a un sistema de filtración de flujo tangencial alternante, comprendiendo el biorreactor un biorreactor de bolsa flexible, y teniendo el filtro un área superficial de filtro de al menos 0,3 m2 y un filtro con un tamaño MWCO de al menos 50 kDa. El pH y el OD del cultivo se controlan mediante métodos no automatizados. En otra realización, el pH y el OD se controlan a través de uno cualquiera o más de los siguientes: ajuste de la mezcla de gases que se introducen en el cultivo, ajuste de la tasa de basculación del biorreactor o ajuste del ángulo de basculación del biorreactor. El biorreactor se bascula a entre 6 y 22 rpm.
En una realización, el biorreactor se bascula a 15 rpm con un ángulo de basculación de 8°.
En una realización, el filtro tiene un tamaño de poro de aproximadamente 0,2 pm.
En una realización, la población de células concentrada tiene una densidad celular de al menos aproximadamente 1,1 x 108 células/ml.
En una realización, la población de células concentrada tiene una densidad celular de aproximadamente 1,1 x 108 células/ml.
La criopreservación comprende añadir DMSO a la población de células concentrada a una concentración final de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10%, vol./vol. En otra realización, la criopreservación comprende congelar al menos una porción de la población de células concentrada en un recipiente apropiado para su almacenamiento en condiciones de criopreservación.
En una realización, el recipiente es un vial. En una realización, el recipiente tiene un volumen de al menos 2 ml. En una realización, el recipiente tiene un volumen de aproximadamente 5 ml.
En una realización, el banco de células congeladas de alta densidad comprende aproximadamente 4,5 x 108 células.
En una realización, el recipiente es una bolsa de criopreservación. En otra realización, la bolsa de criopreservación tiene un volumen de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 ml.
En una realización, el banco de células congeladas de alta densidad tiene una densidad celular de aproximadamente 1 x 108 células/ml.
En una realización, la tasa de perfusión en el biorreactor de perfusión es de al menos aproximadamente 0,2 nl/célula/día.
En una realización, el cultivo celular de biorreactor de perfusión tiene un pH de aproximadamente 7 y una concentración de oxígeno disuelto de al menos aproximadamente el 40%.
En una realización, el biorreactor es un biorreactor de bolsa flexible. En otra realización, el biorreactor de bolsa flexible tiene un volumen de 10 l. En otra realización, el biorreactor de bolsa flexible tiene un volumen de al menos 20 l. En otra realización, el biorreactor de bolsa flexible comprende además al menos un tubo de inmersión.
El banco de células congeladas de alta densidad tiene una viabilidad tras la descongelación de al menos el 90%. En otra realización, el banco de células congeladas de alta densidad tiene una viabilidad tras la descongelación de al menos el 95%.
En una realización, las células son células de mamífero. En otra realización, las células de mamífero se seleccionan del grupo que consiste en: CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, células HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4 y células de hibridoma.
En una realización, las células son células transfectadas.
El pH y el OD del cultivo se controlan mediante métodos automatizados.
En una realización, el pH y el OD del cultivo se controlan mediante métodos no automatizados. En otra realización, el pH y el OD se controlan a través de uno cualquiera o más de los siguientes: ajuste de la mezcla de gases que se introducen en el cultivo, ajuste de la tasa de basculación del biorreactor o ajuste del ángulo de basculación del biorreactor.
En una realización, el biorreactor se bascula a 15 rpm con un ángulo de basculación de 8°.
La invención proporciona un método no centrífugo según la reivindicación 1 para producir un banco de células congeladas de alta densidad, comprendiendo el método: a) cultivar células en un biorreactor de perfusión, agitándose dicho biorreactor para un mezclado y un intercambio de gases eficientes, estando acoplado dicho biorreactor a un sistema de retención celular; b) concentrar de manera no centrífuga dichas células para producir una población de células concentrada; y c) criopreservar la población de células concentrada para producir un banco de células congeladas de alta densidad.
El sistema de retención celular comprende un sistema de filtración de flujo tangencial alternante que comprende un filtro. En otra realización, el filtro tiene un área superficial de al menos 0,3 m2. En otra realización, el filtro tiene un área superficial de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,0 m2. En otra realización, el filtro tiene un área superficial de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 0,8 m2. En otra realización, el filtro tiene un área superficial de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 3,0 m2. En otra realización, el filtro tiene un área superficial de aproximadamente 4 a aproximadamente 5 m2.
En una realización, el filtro tiene un tamaño de poro seleccionado del grupo que consiste en 0,2 gm, 0,4 gm y 0,65 gm. La población de células concentrada tiene una densidad celular seleccionada del grupo que consiste en 1,0 x 108 células/ml, 1,1 x 108 células/ml, 1,2 x 108 células/ml, 1,3 x 108 células/ml, 1,5 x 108 células/ml, 1,7 x 108 células/ml y 2,0 x 108 células/ml.
La criopreservación comprende añadir DMSO a la población de células concentrada a una concentración final de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10%, vol./vol. En otra realización, la criopreservación comprende congelar al menos una porción de la población de células concentrada en un recipiente apropiado para su almacenamiento en condiciones de criopreservación.
En una realización, el recipiente es un vial. En una realización, el recipiente tiene un volumen de al menos 2 ml. En una realización, el recipiente tiene un volumen de aproximadamente 5 ml.
En una realización, el banco de células congeladas de alta densidad comprende aproximadamente 4,5 x 108 células. En una realización, el recipiente es una bolsa de criopreservación. En otra realización, la bolsa de criopreservación tiene un volumen de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 ml.
En una realización, el banco de células congeladas de alta densidad tiene una densidad celular de aproximadamente 1 x 108 células/ml.
En una realización, la tasa de perfusión en el biorreactor de perfusión es de entre aproximadamente 0,02 nl/célula/día y aproximadamente 0,5 nl/célula/día.
En una realización, el cultivo celular de biorreactor de perfusión tiene un pH de entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,2.
En una realización, el cultivo celular de biorreactor de perfusión tiene una concentración de oxígeno disuelto de al menos aproximadamente el 30%.
En una realización, el biorreactor es un biorreactor de bolsa flexible. En otra realización, el biorreactor de bolsa flexible tiene un volumen de 10 l. En otra realización, el biorreactor de bolsa flexible tiene un volumen de al menos 20 l. En otra realización, el biorreactor de bolsa flexible comprende además al menos un tubo de inmersión.
El banco de células congeladas de alta densidad tiene una viabilidad tras la descongelación de al menos el 90%. En otra realización, el banco de células congeladas de alta densidad tiene una viabilidad tras la descongelación de al menos el 95%.
En una realización, las células son células de mamífero. En otra realización, las células de mamífero se seleccionan del grupo que consiste en: CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, células HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4 y células de hibridoma.
En una realización, las células son células transfectadas.
La invención según la reivindicación 1 proporciona un método no centrífugo para producir un banco de células congeladas de alta densidad, comprendiendo el método: a) cultivar células en un biorreactor de perfusión acoplado a un sistema de filtración de flujo tangencial alternante, comprendiendo el biorreactor un biorreactor de bolsa flexible, y teniendo el filtro un área superficial de filtro de al menos 0,3 m2 y un filtro con un tamaño MWCO de al menos 50 kDa; b) concentrar de manera no centrífuga las células usando el sistema de filtración de flujo tangencial alternante para producir una población de células concentrada que tiene una densidad de más de aproximadamente 1,0 x 108 células/ml; c) criopreservar la población de células concentrada para producir un banco de células congeladas de alta densidad, comprendiendo la criopreservación añadir DMSO a la población de células concentrada hasta una concentración final de aproximadamente el 5% aproximadamente el 10%, vol./vol.; y teniendo el banco de células congeladas de alta densidad una densidad celular de aproximadamente 108 células/ml.
El pH y el OD del cultivo se controlan mediante métodos no automatizados. En otra realización, el pH y el OD se controlan a través de uno cualquiera o más de los siguientes: ajuste de la mezcla de gases que se introducen en el cultivo, ajuste de la tasa de basculación del biorreactor o ajuste del ángulo de basculación del biorreactor.
En una realización, el biorreactor se bascula al menos a una velocidad de 15 rpm con al menos un ángulo de basculación de 8°.
En una realización, el biorreactor se bascula a una velocidad de 15 rpm con un ángulo de basculación de 8°.
En una realización, el biorreactor se bascula a 22 rpm con un ángulo de basculación de 10°.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1: es un dibujo de un proceso de establecimiento criogénico de bancos de células de alta densidad.
Figura 2: es un diagrama que representa perfiles de crecimiento celular de cultivos por perfusión WAVE® usando diferentes métodos de retención celular.
Figura 3: es un gráfico del rendimiento tras el establecimiento de bancos (densidad celular viable (Xv), viabilidad) de minibancos elaborados usando cultivos recogidos en múltiples puntos de tiempo durante el crecimiento.
Figura 4: es un gráfico del rendimiento tras el establecimiento de bancos (apoptosis tardía) de minibancos elaborados usando cultivos recogidos en múltiples puntos de tiempo durante el crecimiento.
Figura 5: es un diagrama que muestra el crecimiento celular con y sin controles de realimentación de pH y OD automatizados.
Figura 6: es un diagrama que muestra perfiles de pH y OD con y sin controles de realimentación de pH y OD automatizados.
Figura 7A-B: es un diagrama de la densidad celular viable (A) y la apoptosis tardía (B) de células en diferentes fases: previa a la concentración, posterior a la concentración y después de 0 a 120 min de exposición a DMSO.
Figura 8A-B: es un diagrama del rendimiento posterior al establecimiento de bancos (A) y la apoptosis tardía (B) del banco de alta densidad de la línea celular 1 de rCHO en comparación con un banco de densidad normal.
Figura 9A-B: es un diagrama del rendimiento posterior al establecimiento de bancos (A) y la apoptosis tardía (B) del banco de alta densidad de la línea celular 2 de rCHO en comparación con un banco de densidad normal.
Figura 10A-B: es un diagrama del rendimiento posterior al establecimiento de bancos (A) y la apoptosis tardía (B) del banco de alta densidad de la línea celular 3 de rCHO en comparación con un banco de densidad normal.
Figura 11: es un diagrama que indica la concentración de cultivos a lo largo del tiempo usando diferentes sistemas de retención celular.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente divulgación proporciona un método según las reivindicaciones 1 y 17 de establecimiento criogénico de bancos de células de alta densidad que comprende el uso de un sistema de cultivo por perfusión vinculado a un dispositivo de retención celular no centrífugo.
I. Definiciones
Tal como se usa en el presente documento, el término “cultivo por lotes” se refiere a una técnica de cultivo celular en la que una cantidad de medio de cultivo nuevo se inocula con células que entran rápidamente en una fase de crecimiento logarítmico y en la que el medio de crecimiento del cultivo no se retira ni se sustituye de manera continua con medio nuevo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “cultivo por lotes con alimentación” se refiere a una técnica de cultivo celular en la que una cantidad de medio de cultivo nuevo se inocula con células inicialmente, y se alimentan nutrientes de cultivo adicionales (de manera continua o en incrementos discretos) al cultivo durante el proceso de cultivo, con o sin recogida de células y/o producto periódica antes de la terminación de cultivo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “cultivo por perfusión” se refiere a una técnica de cultivo celular en la que una cantidad de medio nuevo se inocula con células que entran rápidamente en una fase de crecimiento logarítmico (tal como anteriormente) y en la que el medio de crecimiento se retira de manera continua de un cultivo y se remplazada por medio nuevo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “biorreactor” hará referencia a un receptáculo para cultivar células.
En una realización, el biorreactor es un “biorreactor de bolsa flexible”. Un “biorreactor de bolsa flexible” es una cámara estéril capaz de recibir un medio líquido y que comprende adicionalmente conectores, puertos, adaptadores y tubos flexibles. En una realización, la cámara está hecha de plástico. En una realización específica, la cámara está hecha de plástico transparente laminado de múltiples capas. En una realización específica adicional, la cámara está hecha de plástico transparente laminado de múltiples capas y tiene una capa de contacto fluida hecha de copolímero de acetato de etilenvinilo/polietileno de baja densidad de clase VI USP, mientras que la capa externa está hecha de polietileno de baja densidad.
Adicionalmente, los conectores, puertos y adaptadores pueden estar hechos de cualquier tipo de plástico incluyendo, pero sin limitarse a: polietileno, polipropileno y policarbonato, mientras que los tubos pueden estar construidos de cualquier tipo de plástico incluyendo, pero sin limitarse a: elastómero termoplástico o silicona (por ejemplo, silicona curada con platino).
Cámaras “de biorreactor de bolsa flexible” apropiadas pueden encontrarse comúnmente en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, las descritas en la patente estadounidense n.° 6.544.788.
La cámara “de biorreactor de bolsa flexible” puede llenarse parcialmente con medios de cultivo y entonces inflarse hasta la rigidez. Entonces puede colocarse sobre una plataforma de basculación (tal como una unidad de basculación BASE20/50EHT de GE Healthcare Life Sciences) que se mueve en vaivén a través de un ángulo de basculación fijado previamente y una tasa de basculación fijada previamente. Este movimiento de basculación induce movimientos de tipo ondulado en los medios de cultivo, promoviendo la agitación y la transferencia de oxígeno con el fin de mejorar el rendimiento del cultivo celular. El ángulo de basculación fijado previamente puede ser de al menos aproximadamente 4 grados, por ejemplo, aproximadamente 4 grados, 5 grados, 6 grados, 7 grados, 8 grados, 9 grados, 10 grados, 11 grados o 12 grados. Además, la tasa de basculación fijada previamente puede fijarse a una tasa de basculación por minuto (rpm) que sea de al menos aproximadamente 6 rpm, por ejemplo, aproximadamente 7 rpm, 8 rpm, 9 rpm, 10 rpm, 11 rpm, 12 rpm, 13 rpm, 14 rpm, 15 rpm, 16 rpm, 17 rpm, 18 rpm, 19 rpm, 20 rpm, 21 rpm, 22 rpm, 23 rpm, 24 rpm, 25 rpm, 26 rpm, 27 rpm, 28 rpm, 29 rpm, 30 rpm, 31 rpm, 32 rpm, 33 rpm, 34 rpm, 35 rpm, 36 rpm, 37 rpm, 38 rpm, 39 rpm, o 40 rpm. rpm.
En una realización específica, la tasa de basculación por minuto es de aproximadamente 8 rpm. En una realización específica, la tasa de basculación por minuto es de aproximadamente 15 rpm. En otra realización específica, la tasa de basculación por minuto es de aproximadamente 22 rpm.
Tal como se usa en el presente documento, el término “sistema de retención celular” se refiere a todos los dispositivos con la capacidad de separar células del medio y los productos residuales en el mismo mediante el uso de un filtro. Los filtros pueden incluir filtros de membrana, cerámicos o metálicos en cualquier forma incluyendo enrollada en espiral, tubular o laminar. Los filtros pueden ser de diferentes áreas superficiales. Por ejemplo, el área superficial de filtro puede ser de aproximadamente 0,3 m2 a aproximadamente 5 m2, por ejemplo, de aproximadamente 0,3 m2, 0,4 m2, 0,5 m2, 0,6 m2, 0,7 m2, 0,77 m2, 0,8 m2, 0,9 m2, 1,0 m2, 1,1 m2, 1,2 m2, 1,3 m2, 1,4 m2, 1,5 m2, 1,6 m2, 1,7 m2, 1,8 m2, 1.9 m2, 2,0 m2, 2,1 m2, 2,2 m2, 2,3 m2, 2,4 m2, 2,5 m2, 2,6 m2, 2,7 m2, 2,8 m2, 2,9 m2, 3,0 m2, 3,1 m2, 3,2 m2, 3,3 m2, 3,4 m2, 3,5 m2, 3,6 m2, 3,7 m2, 3,8 m2, 3,9 m2, 4,0 m2, 4,1 m2, 4,2 m2, 4,3 m2, 4,4 m2, 4,5 m2, 4,6 m2, 4,7 m2, 4,8 m2, 4.9 m2 o aproximadamente 5 m2. En determinadas realizaciones, el módulo de filtro tiene un tamaño de límite de masa molecular (MWCO, molecular weight cut off) de aproximadamente 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa o 100 kDa. En otras realizaciones, el módulo de filtro tiene un tamaño de malla o de poro de desde aproximadamente 0,1 pm hasta aproximadamente 3 pm, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 pm, 0,2 pm, 0,3 pm, 0,4 pm, 0,5 pm, 0,6 pm, 0,65 pm, 0,7 pm, 0,8 pm, 0,9 pm, 1,0 pm, 1,1 pm, 1,2 pm, 1,3 pm, 1,4 pm, 1,5 pm, 1,6 pm, 1,7 pm, 1,8 pm, 1,9 pm, 2,0 pm, 2,1 pm, 2,2 pm, 2,3 pm, 2,4 pm, 2,5 pm, 2,6 pm, 2,7 pm, 2,8 pm, 2,9 pm o aproximadamente 3,0 pm.
Tal como se usa en el presente documento, el término “criopreservación” se refiere a un proceso mediante el que células, tejidos o cualquier otra sustancia susceptible a daño provocado por el tiempo o por actividad enzimática o química se preservan enfriándolos y almacenándolos hasta temperaturas bajo cero.
Tal como se usa en el presente documento, el término “establecimiento criogénico de bancos” se refiere a una técnica mediante la que se mezclan células con un crioprotector (por ejemplo, DMSO con o sin hidroxietilalmidón (HES)) y placed en un recipiente apropiado para su almacenamiento en condiciones de criopreservación. Estos recipientes se congelan entonces usando técnicas ampliamente conocidas en la técnica y se almacenan a bajas temperaturas, normalmente entre aproximadamente -130°C y aproximadamente -195°C. La colección de células obtenida mediante el proceso es un banco de células.
El banco de células es un banco de células de alta densidad. Tal como se usa en el presente documento, el término “banco de células de alta densidad” hará referencia a alícuotas de establecimiento criogénico de bancos de células que se han congelado a una densidad alta, siendo la densidad de al menos 1 x 108 células viables/ml, 2 x 108 células viables/ml o 3 x 108 células viables/ml. Las células pueden congelarse según cualquier método disponible en la técnica y en cualquier recipiente apropiado para su almacenamiento en condiciones de criopreservación.
En otra realización, el banco de células es un banco de células maestras. Tal como se usa en el presente documento, el término “banco de células maestras” hará referencia a un cultivo de células (por ejemplo, células completamente caracterizadas) que se han hecho crecer a partir de un único clon, se dispensan a recipientes de almacenamiento (por ejemplo, se dispensan a los recipientes en una única operación) y se almacenan en condiciones de criopreservación tal como se describió anteriormente. En determinadas realizaciones, las células son adecuadas para su uso posterior en un cultivo celular de producción y una recogida adicional de las proteínas terapéuticamente relevantes producidas de ese modo.
En otra realización, el banco de células es un minibanco de células. Tal como se usa en el presente documento, el término “minibanco” hará referencia a alícuotas de células que se han criopreservado según procedimientos de “establecimiento criogénico de bancos” (tal como se describió anteriormente) pero están compuestos por menos muestras que las que se usarían normalmente para crear un banco de células. Este tipo de banco puede usarse generalmente para optimizar las condiciones que estén considerándose para la criopreservación de una línea celular antes de crear bancos de células tales como un “banco de células maestras”. Como ejemplo, se usa un “minibanco” para determinar la densidad celular óptima para el procedimiento de establecimiento de bancos de células de alta densidad descrito en esta divulgación.
Tal como se usa en el presente documento, el término “recipiente apropiado para su almacenamiento en condiciones de criopreservación” incluye cualquier recipiente que pueda usarse en condiciones apropiadas para el almacenamiento celular entre aproximadamente -Í302C y aproximadamente -195°C. Estos recipientes incluyen, pero no se limitan a, viales que están hechos de materiales adecuados para la criopreservación. Estos materiales incluyen polímeros (por ejemplo, politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno o polipropileno). Además, pueden aplicarse tratamientos superficiales a una superficie del vial de criopreservación con el fin de mejorar las condiciones de criopreservación (por ejemplo, recubrimientos hidrófilos que reducen la adsorción y desnaturalización). En realizaciones a modo de ejemplo, el vial puede tener un volumen de más de aproximadamente 0,1 ml, por ejemplo, el vial puede tener un volumen de aproximadamente 0,1 ml, aproximadamente 0,5 ml, aproximadamente 0,75 ml, aproximadamente 1 ml, aproximadamente 2 ml, aproximadamente 2,5 ml, aproximadamente 5 ml, aproximadamente 10 ml, aproximadamente 15 ml, aproximadamente 20 ml, aproximadamente 25 ml o aproximadamente 50 ml. El recipiente también puede ser una bolsa de criopreservación.
Tal como se usa en el presente documento, el término “bolsa de criopreservación” es una cámara estéril que es capaz de recibir un medio líquido, es apropiada para el almacenamiento celular entre aproximadamente -130°C y aproximadamente -195°C, y puede comprender adicionalmente conectores, puertos, adaptadores y tubos flexibles. La bolsa de criopreservación puede estar construida de cualquier material apropiado incluyendo, pero sin limitarse a, polímeros tales como politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno, polipropileno, etileno-propileno fluorado (FEP) y acetato de etilenvinilo (EVA). Las bolsas de criopreservación a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: bolsas de criopreservación KryoSure®, bolsas PermaLife™ (OriGen Biomedical), bolsas de congelación CryoStore, biorrecipientes Freeze-Pak™.
Tal como se usa en el presente documento, el término “matraz de agitación” hará referencia a un receptáculo usado como matraz de cultivo en el que el medio se agita constantemente durante la incubación.
Tal como se usa en el presente documento, el término “tren de siembra de matraz de agitación” hará referencia a un método de expansión celular en el que una alícuota de células se cultiva en primer lugar (se siembra) en un matraz de agitación y se hace crecer en el mismo. Las células se cultivan según su tasa de crecimiento y se dividen habitualmente en receptáculos más grandes y/o múltiples durante su crecimiento hasta que la biomasa haya alcanzado un nivel suficiente para inocular un biorreactor.
Tal como se usa en el presente documento, el término “densidad de siembra” hará referencia a la densidad celular inicial a la que se inocula un matraz o biorreactor.
Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína terapéuticamente relevante” hará referencia a cualquier proteína que puede para crear un tratamiento para una enfermedad o trastorno o para tratar una enfermedad o trastorno en un animal, incluyendo mamíferos tales como ratones, ratas, monos, simios, y seres humanos. Estas proteínas pueden incluir, pero no se limitan a, polipéptidos de unión tales como anticuerpos monoclonales, proteínas de fusión Fc, anticoagulantes, factores sanguíneos, proteínas capaces de inducir hueso, andamiajes proteicos modificados mediante ingeniería, enzimas, factores de crecimiento, hormonas, interferones, interleucinas y trombolíticos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido de unión” o “polipéptido de unión” hará referencia a un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que contiene al menos un sitio de unión que es responsable de la unión selectiva a un antígeno diana de interés (por ejemplo, un antígeno humano). Los sitios de unión a modo de ejemplo incluyen un dominio variable de anticuerpo, un sitio de unión un ligando de un receptor, o un sitio de unión a receptor de un ligando. En ciertos aspectos, los polipéptidos de unión de la invención comprenden múltiples (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) sitios de unión.
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a aquellos conjuntos (por ejemplo, moléculas de anticuerpo intactas, fragmentos de anticuerpo, o variantes de los mismos) que tienen una actividad inmunorreactiva específica conocida significativa frente a un antígeno de interés (por ejemplo, un antígeno asociado a tumor). Los anticuerpos y las inmunoglobulinas comprenden cadenas ligeras y pesadas, con o sin un enlace covalente intercatenario entre las mismas. Las estructuras de inmunoglobulina básicas en sistemas vertebrados se entienden relativamente bien.
El término genérico “anticuerpo” comprende cinco clases distintas de anticuerpo que pueden distinguirse bioquímicamente. Las cinco clases de anticuerpos están claramente dentro del alcance de la presente divulgación, la siguiente discusión se referirá generalmente a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, las inmunoglobulinas comprenden dos cadenas ligeras idénticas de peso molecular aproximadamente 23.000 Daltons, y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular 53.000-70.000. Las cuatro cadenas están unidas mediante enlaces disulfuro en una configuración “Y” en la que las cadenas ligeras soportan las cadenas pesadas empezando en la boca de la “Y” y continuando a través de la región variable.
II. Cultivo celular por perfusión
El cultivo celular tradicional implica un proceso de cultivo “por lotes”. En este tipo de cultivo, una cantidad de medio nuevo se inocula con células que entran rápidamente en una fase de crecimiento logarítmico. A medida que estas células crecen y se dividen, consumen nutrientes disponibles del medio y excretan productos residuales nocivos. Con el tiempo, el cultivo entrará en una fase de crecimiento estacionaria, y finalmente en una fase de decrecimiento. Aunque modificaciones al proceso de cultivo “por lotes” lo han hecho más eficiente con el tiempo, los protocolos de cultivo por lotes modificados resultados todavía dan como resultado ciclos de crecimiento y decrecimiento rápidos. Además, el proceso de cultivo “por lotes” tiene una capacidad limitada para alcanzar los niveles de densidad celular que se requieren para permitir establecimiento de bancos de células de alta densidad.
El proceso de cultivo “por lotes con alimentación” se refiere a una mejora adicional en la técnica de cultivo celular con respecto a las técnicas de cultivo “por lotes” tradicionales. Aunque este proceso permite un crecimiento de densidad celular mayor, todavía está limitado en su capacidad para permitir un crecimiento eficiente de cultivos celulares de alta densidad y, por tanto, para generar de manera eficiente células para el establecimiento de bancos de células de alta densidad.
En realizaciones preferidas, la invención emplea un proceso de cultivo por perfusión. El cultivo por perfusión es un método para hacer crecer células en el que una cantidad de medio nuevo se inocula con células que entran rápidamente en una fase de crecimiento logarítmico (tal como anteriormente) y en el que el medio de crecimiento se retira de manera continua de un cultivo y se remplaza por medio nuevo. De esta manera, el cultivo recibe constantemente medio nuevo con altos niveles de nutrientes, al tiempo que se retira medio que contiene productos residuales y con niveles menores de nutrientes. Este tipo de cultivo permite el mantenimiento del crecimiento logarítmico de células en el que se intercambia al menos un volumen de cultivo por día y las concentraciones celulares pueden ser mucho mayores que las conseguidas en el cultivo por lotes tradicional o modificado (un aumento de entre 2 y más de 10 veces). En una realización de la presente invención, la tasa de perfusión específica de célula (CSPR, cellspecific perfusión rate) puede ser de entre aproximadamente 0,02 nl célula-1día-1 y aproximadamente 0,5 nl célula-1día-1, por ejemplo, puede ser de aproximadamente 0,02 nl célula-1día-1, 0,05 nl célula-1día-1, 0,1 nl célula-1día-1, 0,2 nl célula-1día-1, 0,3 nl célula-1día-1, 0,4 nl célula-1día-1 o 0,5 nl célula-1día-1. En una realización específica, el cultivo por perfusión puede llevarse a cabo en un biorreactor con un mínimo de un tubo de inmersión.
En determinadas realizaciones, el pH, la temperatura, la concentración de oxígeno disuelto (OD) y la osmolaridad del cultivo pueden ajustarse para maximizar la salud y la productividad del cultivo. Un método de control del OD y pH de los cultivos es a través de un controlador de realimentación automatizado. Este tipo de controlador automatizado opera usando ordenadores basados en microprocesador para monitorizar y ajustar el pH y el OD del cultivo y mantener de ese modo condiciones óptimas para el crecimiento celular. Sin embargo, estos sistemas de control de realimentación automatizados son costosos. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, puede emplearse un método no automatizado de control de estos parámetros. En una realización a modo de ejemplo, cualquiera de: ajuste de la mezcla de gas que fluye sobre el cultivo, ajuste de la tasa de basculación WAVE®, o ajuste del ángulo de basculación del cultivo puede usarse para controlar parámetros seleccionados (por ejemplo, pH u OD).
En una realización, el nivel de partida de gas de dióxido de carbono está a aproximadamente el 10% y el nivel de partida de oxígeno gas está a aproximadamente el 20% con una tasa de flujo de aire de aproximadamente 0,2 litros por minuto (lpm). Si el pH no es más de aproximadamente 6,9, el punto de referencia de CO2 puede reducirse desde el 10% hasta el 5%. Si el pH es todavía de no más de aproximadamente 6,9 en un punto de tiempo posterior, el punto de referencia de CO2 puede reducirse adicionalmente desde el 5% hasta el 0%. Si el pH es todavía de no más de aproximadamente 6,9, puede aumentarse la tasa de perfusión. Si el OD no es más de aproximadamente el 45%, el punto de referencia de O2 debe elevarse desde el 20% hasta el 30%. Si el OD no es más de aproximadamente el 45% en un punto de tiempo posterior, el nivel de O2 debe elevarse desde el 30% hasta el 40%, la velocidad de basculación debe aumentarse hasta aproximadamente 25 rpm y el ángulo de basculación debe cambiarse a aproximadamente 12°.
En una realización, la tasa de basculación del cultivo también puede ajustarse durante la etapa de concentración final para evitar la inclusión de aire en el sistema de retención celular.
i. Medios de cultivo celular
Cualquier tipo de medio de cultivo celular adecuado para el cultivo de células puede usarse en los métodos de la presente invención. Las directrices para elegir un medio celular apropiado se conocen ampliamente en la técnica y se proporcionan en, por ejemplo, los capítulos 8 y 9 de Freshney, R. I. Culture of Animal Cells (a manual of basic techniques), 4a edición 2000, Wiley-Liss; y en Doyle, A., Griffiths, J.B., Newell, D.G. Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons. Hay métodos adicionales en la técnica para la preparación y el mantenimiento de cultivos celulares en condiciones libres de proteínas y libres de componentes derivados de animales (incluyendo métodos relativos a células CHO) tal como los observados en las solicitudes de patente internacionales n° WO97/05240, n.° WO 96/26266 y n.° WO 00/11102, la patente estadounidense n o 6.100.061, n o 6.475.725 y 8.084.252. En una realización de la presente invención, puede usarse medio libre de componentes derivados de animales (ADC, animal-derived component). Los medios mínimos sintéticos convencionales pueden contener sales inorgánicas, aminoácidos, vitaminas, una fuente de carbohidratos y agua. En una realización específica de la presente invención, el medio que puede usarse es CD-CHO (GIBCO, Invitrogen Corp.; un medio libre de origen animal que está definido químicamente y no contiene proteínas, hidrolizados o componentes de origen desconocido). Adicionalmente, el medio puede tener componentes adicionales incluyendo glutamina y/o metotrexato u otros factores que pueden ayudar al crecimiento o la adherencia. En una realización específica, el componente adicional puede ser GLUTAMAX-1 o L-glutamina añadida a entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 8 mM, por ejemplo, a aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM o aproximadamente 8 mM.
ii. Células huésped y vectores de expresión
En determinadas realizaciones, las células empleadas en el proceso de establecimiento de bancos de células de la invención son células huésped que albergan una construcción de expresión para la expresión de una proteína terapéuticamente relevante u otro polipéptido de interés. Cualquier célula que pueda usarse para expresar un polipéptido de interés (por ejemplo, un polipéptido de unión) puede usarse según los métodos descritos en el presente documento. Las células pueden contener opcionalmente secuencias de ácido nucleico que se producen de manera natural o recombinantes, por ejemplo, un vector de expresión que contiene un polipéptido de interés. El vector de expresión puede contener opcionalmente controles de transcripción y de traducción apropiados y puede construirse usando tecnología de ADN recombinante conocida en la técnica. Los vectores de expresión pueden transferirse a cualquier célula huésped mediante técnicas conocidas en la técnica, y las células transformadas pueden cultivarse entonces según el método de la presente invención para crear un banco de células de alta densidad. Además, el banco de células de alta densidad puede entonces descongelarse y cultivarse según técnicas conocidas en la técnica con el fin de producir la proteína codificada de interés y, cuando se desee, esta proteína puede purificarse posteriormente.
En determinadas realizaciones, pueden usarse una variedad de sistemas de expresión huésped para producir proteínas terapéuticamente relevantes. Además, el sistema de expresión huésped puede ser un sistema de célula de mamífero (por ejemplo, CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, células HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4 y células de hibridoma) que alberga constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero. También pueden utilizarse sistemas de expresión de base viral conjuntamente con células de mamífero (véase, por ejemplo, Logan et al, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:355-359. La eficiencia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos que incluyen (pero no se limitan a) elementos potenciadores de la transcripción y terminados de transcripción apropiados (véase, por ejemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544.
En otras realizaciones, puede elegirse una cepa de células huésped que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto génico en el modo específico deseado. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccionales de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos del polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de unión) expresado. Tales células incluyen, por ejemplo, líneas celulares de mamífero y células de animales establecidas, así como líneas celulares de insecto, células fúngicas y células de levadura.
iii. Biorreactores
Cualquier biorreactor según la reivindicación 1 y un biorreactor de bolsa flexible según la reivindicación 17 adecuado para cultivar células en condiciones de cultivo por perfusión condiciones puede emplearse en los métodos de la invención. El biorreactor puede inocularse usando una alícuota de células a una densidad de siembra apropiada (tal como un vial de células o células de un cultivo iniciador, por ejemplo, un matraz de agitación o un tren de siembra de matraz de agitación que se han cultivo hasta esa densidad). La densidad de siembra apropiada para un cultivo depende de varios factores incluyendo el tipo de células usado y el biorreactor que está inoculándose. La densidad de siembra apropiada puede determinarse usando métodos disponibles en la técnica.
En determinadas realizaciones, el biorreactor puede ser de naturaleza desechable, por ejemplo, el biorreactor puede ser una bolsa flexible o un matraz de plástico que está conectado al dispositivo de retención celular por medio de tubos flexibles. Puede tener un volumen de aproximadamente 1 l, 2 l, 5 l, 10 l, aproximadamente 20 l, 50 l, 75 l, 85 l, 100 l, 150 l o aproximadamente 400 l. En una realización específica de la invención, el biorreactor es una bolsa flexible de 10 l que se ha personalizado con dos tubos de inmersión es decir tubos que se usan para retirar medio o producto. Biorreactores desechables a modo de ejemplo son biorreactores WAVE® Cellbag (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) tal como el biorreactor WAVE® de 20 l. Estos son los sistemas de biorreactor de perfusión descritos en, entre otros documentos: Singh ,1999, Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation, Cytotechnology, págs.149-158.
El volumen de trabajo del reactor es el volumen ocupado por el cultivo. El volumen de trabajo puede ser, por ejemplo, del 10%, del 20%, del 30%, del 40%, del 50%, del 60%, del 70% o más del cultivo, pero preferiblemente no más de 75%.
Alternativamente, el biorreactor puede ser de naturaleza no desechable. Por ejemplo, el biorreactor puede estar hecho de acero inoxidable o vidrio. Los biorreactores alternativos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a: matraces de agitación, receptáculos de tanque con agitación, receptáculos con agitación por aire, y bolsas desechables que pueden mezclarse mediante basculación, sacudida o agitación.
En una realización, el biorreactor puede estar acoplado a un sistema de retención celular, incluyendo, pero sin limitarse a, filtros incorporados, sistemas TFF con cesta de centrifugación y sistemas ATF.
II. Concentración no centrífuga
El cultivo por perfusión depende de la capacidad de eliminación de medios agotados en nutrientes y que contienen productos residuales del cultivo al tiempo que minimiza el daño a las células. Los métodos iniciales de retención celular, en los que el medio agotado se separa de células cultivadas, dañaban frecuentemente las células a través de problemas inherentes tal como la creación de fuerzas de cizalladura. Esto da eventualmente como resultado la obstrucción de los filtros y el fallo de los dispositivos de perfusión, muchos de los cuales eran internos al sistema de cultivo. Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un método que hace uso de un “sistema de retención celular” que permite el intercambio de medios y entonces se usa para concentrar adicionalmente el cultivo celular para el establecimiento criogénico de bancos.
En una realización, el tipo de sistema de retención celular usado es un filtro de tipo “incorporado”, en el que el filtro está dispuesto en la cámara del biorreactor y es libre para moverse dentro de la cámara. El filtro puede estar acoplado a uno de los tubos que conducen fuera de la cámara, permitiendo de ese modo extraer medio filtrado del cultivo. Un ejemplo de un filtro de tipo “incorporado” puede encontrarse en la patente estadounidense n.° 6.544.788.
En otra realización, el sistema de retención celular usado es un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF). En un sistema TFF, el medio de cultivo se hace circular desde un receptáculo de cultivo a través de un módulo de filtración, y entonces de vuelta al receptáculo de cultivo por medio de una bomba unida a los tubos entre el módulo de filtración y el receptáculo de cultivo, produciendo un flujo tangencial por el módulo de filtro. Una segunda bomba está situada en el lado de filtrado del módulo de filtro y se usa para controlar la tasa a la que se retira el filtrado. El uso de filtros de membrana de fibras huecas se prefiere en este sistema ya que son más fáciles de esterilizar y permiten el mantenimiento de un flujo uniforme por el módulo de filtro. Sin embargo, cuando se emplean filtros de fibras huecas en este sistema, tienden a obstruirse ya que el flujo monodireccional conduce a la agregación de materia particulada en la entrada de la luz.
El tipo de sistema de retención celular usado es un sistema de flujo tangencial alternante (ATF). En el tipo ATF de sistema de retención celular, un compartimento de filtración está conectado a un receptáculo de almacenamiento en un extremo y una bomba de diafragma en el otro. La bomba mueve en primer lugar medio desde el receptáculo a través del elemento de filtro hasta la bomba y entonces se invierte para enviar el medio desde la bomba a través del filtro y de vuelta al receptáculo, creando un flujo bidireccional o alternante. Esto se denomina flujo tangencial alternante (ATF) ya que hay flujo tangencial alternante en el módulo de filtro, es decir hay un flujo en la misma dirección a las superficies de membrana del módulo de filtro (tangencial a esa superficie), y que hay otro flujo que es sustancialmente perpendicular a esas superficies. Este tipo de filtración ha existido en la bibliografía desde el 2000 y da como resultado un flujo rápido, de baja cizalladura, uniforme. La filtración ATF puede obtenerse mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describen en la patente estadounidense número 6.544.424.
Además, sistemas de flujo tangencial alternante están disponibles comercialmente de fabricantes tales como Refine Technology e incluyen diversos modelos tales como los sistemas ATF2, ATF4, ATF6, ATF8 y ATF10.
En otra realización específica de la invención, el filtro es un filtro de membrana tubular, y además puede ser un filtro de fibras huecas.
El método no centrífugo usado para concentrar adicionalmente el cultivo puede hacer uso de cualquier sistema de retención celular conocido en la técnica (por ejemplo, un filtro de tipo “incorporado”, un sistema TFF o un sistema ATF incluyendo los descritos anteriormente).
III. Criopreservación y establecimiento de bancos de células
La criopreservación se refiere a un proceso mediante el que células, tejidos o cualquier otra sustancia susceptible a daño provocado por el tiempo o por actividad enzimática o química se preservan enfriándolos y almacenándolos hasta temperaturas bajo cero. La importancia de la criopreservación de líneas celulares importantes no puede subestimarse, as (entre otras ventajas importantes) esto permite el mantenimiento de estas líneas sin mantenerlas en cultivo constante, disminuye el riesgo de contaminación, y reduce el riesgo de deriva genética.
Cuando se usan métodos de criopreservación, es vital alcanzar y permanecer a estas bajas temperaturas sin provocar un daño adicional a través de la formación de hielo durante el proceso de congelación. Los métodos en la técnica usan tradicionalmente sustancias que disminuyen el daño por congelación a células denominadas crioprotectores. Los crioprotectores pueden añadirse al medio de cultivos celulares antes del proceso de congelación. En una realización específica, el crioprotector usado puede ser uno o más de: glicerol o dimetilsulfóxido (DMSO). Adicionalmente, el crioprotector puede añadirse con o sin hidroxietilalmidón (HES). En una realización específica adicional, puede añadirse DMSO a una concentración de al menos el 5%, por ejemplo, puede añadirse a aproximadamente el 5%, aproximadamente el 6%, aproximadamente el 7%, aproximadamente el 8%, aproximadamente el 9%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 11%, aproximadamente el 12%, aproximadamente el 13%, aproximadamente el 14%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 16%, aproximadamente el 17%, a aproximadamente el 18%, aproximadamente el 19% o a aproximadamente el 20%.
El cultivo con crioprotector añadido puede dispensarse entonces a recipientes apropiados para su almacenamiento en condiciones de criopreservación. En una realización, este recipiente puede ser un vial hecho de un material que puede incluir (pero no se limita a) polímeros tales como politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno o polipropileno. En una realización específica, el vial puede tener un tratamiento superficial adicional con el fin de mejorar las condiciones de criopreservación (por ejemplo, recubrimientos hidrófilos que reducen la adsorción y desnaturalización). En realizaciones a modo de ejemplo, el vial puede tener un volumen de más de aproximadamente 0,1 ml, por ejemplo, el vial puede tener un volumen de aproximadamente 0,1 ml, aproximadamente 0,5 ml, aproximadamente 0,75 ml, aproximadamente 1 ml, aproximadamente 2 ml, aproximadamente 2,5 ml, aproximadamente 5 ml, aproximadamente 10 ml, aproximadamente 15 ml, aproximadamente 20 ml, aproximadamente 25 ml o aproximadamente 50 ml. En otra realización, el recipiente también puede ser una bolsa de criopreservación. La bolsa de criopreservación puede estar construida de cualquier material apropiado incluyendo, pero sin limitarse a, polímeros tales como politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno, polipropileno, etileno-propileno fluorado (FEP) y acetato de etilenvinilo (EVA). Los biorreactores desechables a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: bolsas de criopreservación KryoSure®, bolsas PermaLife™ (OriGen Biomedical), bolsas de congelación CryoStore, biorrecipientes Freeze-Pak™.
Estos recipientes se congelan entonces usando técnicas y dispositivos ampliamente conocidos en la técnica antes de almacenarse a bajas temperaturas, normalmente entre aproximadamente -130°C y aproximadamente -195°C. En una realización, la técnica de congelación usada puede ser congelación de tasa controlada y lenta (también denominada congelación programable lenta o SPF). La colección de células obtenida mediante el proceso es un banco de células.
En una realización, el banco de células puede ser, pero no se limita a, un banco de células de alta densidad, un banco de células maestras, o a mini banco.
IV. Determinación de la viabilidad celular
Tal como se indicó anteriormente, los métodos de la invención permiten el establecimiento de bancos de células a altas densidades al tiempo que conservan una viabilidad celular excelente para su uso posterior. Tal como se usa en el presente documento, el término “viabilidad celular” puede definirse como el número o porcentaje de células sanas en una muestra dada. La viabilidad de células puede determinarse usando cualquier método disponible en la técnica en cualquier punto en el proceso de establecimiento de bancos de células de alta densidad descrito. Los métodos usados comúnmente para la determinación de la viabilidad celular se basan en gran medida en el principio de que las células vivas presentan membranas celulares intactas que excluyen ciertos colorantes, tales como azul de tripano (un colorante diazoico), eosina o propidio, mientras que las células muertas no.
En una realización, puede usarse azul de tripano para teñir una cantidad de células e indicar de ese modo la presencia de células con membranas intactas (no coloreadas) y la presencia de células con membranas alteradas (azules). Estas células pueden contarse entonces para determinar los números de células tanto vivas como muertas en el cultivo, y presentarse como porcentaje para indicar la salud relativa del cultivo.
En una realización específica, la viabilidad celular puede determinarse usando un cultivo que se ha concentrado, pero que aún no se ha congelado (es decir un cultivo previo a la congelación). En una realización específica, la viabilidad celular puede determinarse usando un cultivo que se ha concentrado, congelado y entonces descongelado (es decir un cultivo posterior a la descongelación).
La viabilidad tras la descongelación de las células es de más del 90%, o del 95% incluyendo hasta el 100%.
La apoptosis es la muerte celular programada y es una ruta de regulación activa del crecimiento y la proliferación celulares. Las células responden a señales de inducción específicas danto como resultado cambios fisiológicos característicos. Entre estos está la externalización de fosfatidilserina (PS) a la superficie externa de la célula durante la ruta apoptótica temprana. El ensayo Guava Nexin® utiliza anexina V-PE (una proteína de unión a fosfolípido dependiente del calcio con alta afinidad para PS) para detectar PS sobre la membrana externa de células apoptóticas. El colorante impermeante celular, 7-AAD, también se usa como indicador de la integridad estructural de la membrana celular. 7-AAD se excluye de células sanas, vivas, así como de células apoptóticas tempranas. Pueden distinguirse tres poblaciones de células en este ensayo:
1) Células no apoptóticas (o células sanas):
2) Anexina V(-) y 7-AAD(-).
3) Células apoptóticas tempranas: anexina V(+) y 7-AAD(-)
4) Células apoptóticas de fase tardía y muertas: anexina V(+) y 7-AAD(+)
La cantidad de células apoptóticas tardías es otra medida de la salud de cultivos tras la descongelación y puede monitorizarse tal como se muestra en las Figuras 4 y 7B. En una realización específica, las células apoptóticas tardías tras la descongelación deben ser menos del 30% de la población de células viables. En otra realización, las células apoptóticas tardías tras la descongelación deben ser menos del 20% de la población de células viables. En otra realización, las células apoptóticas tardías tras la descongelación deben ser menos del 10% de la población de células viables.
V. Proteínas terapéuticamente relevantes
Células derivadas del método de establecimiento criogénico de bancos de células de alta densidad de la invención pueden emplearse en una fase de producción posterior para la fabricación de una proteína. Por ejemplo, las células propagadas en el biorreactor y congeladas en alícuotas de banco de alta densidad según los métodos de la presente invención pueden usarse para la producción de sustancias biológicas incluyendo proteínas terapéuticamente relevantes. Estas sustancias biológicas pueden incluir, pero no se limitan a: virus (véase, por ejemplo, el documento WO200138362), polipéptidos de unión tales como anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, y fragmentos de los mismos, por ejemplo, fragmentos fab; proteínas de fusión Fc, anticoagulantes, factores sanguíneos, proteínas capaces de inducir hueso, andamiajes proteicos modificados mediante ingeniería, enzimas, factores de crecimiento, hormonas, interferones, interleucinas y trombolíticos. Estas sustancias biológicas pueden recogerse usando cualquier método disponible en la técnica. En una realización, la invención proporciona un método de producción de una sustancia biológica, comprendiendo el método: cultivar células capaces de expresar una sustancia biológica en condiciones adecuadas para la producción de una sustancia biológica, obteniéndose las células a partir de un banco de células congeladas de alta densidad producido usando métodos de cultivo por perfusión y de concentración no centrífuga. La sustancia biológica puede ser (pero no se limita a) una proteína (por ejemplo, cualquier proteína terapéuticamente relevante).
EJEMPLOS
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como que limitan adicionalmente. Los contenidos de las figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud se incorporan expresamente al presente documento mediante referencia en su totalidad.
Ejemplo 1: (técnica anterior) Diseño e implementación de un protocolo de establecimiento de bancos de células de alta densidad
Este protocolo de establecimiento criogénico de bancos de células de alta densidad empieza con un vial de banco de células maestras de 2 ml de células (volumen de trabajo 1,5 ml) a una densidad apropiada de 2,0-2,4 x 107 células viables/ml (condición de criopreservación de células normal). Las células se hacen crecer entonces en cultivo por perfusión y se concentran por medio de flujo tangencial alternante. Tras la adición de DMSO al cultivo celular concentrado, este cultivo celular de alta densidad se dispensa a aproximadamente 200 viales de 5 ml independientes (aproximadamente 4,5 ml de volumen de trabajo) para su almacenamiento como banco de células de alta densidad (aproximadamente 10 x 107 células/ml).
Ejemplo 2: Determinación de métodos de retención celular óptimos para el soporte de un crecimiento celular y una velocidad de concentración rápidos.
Con el fin de determinar el método de retención celular óptimo para su uso en la creación de un sistema de establecimiento de bancos de cultivo celular de alta densidad (Fig. 1), el filtro flotante incorporado en el biorreactor de perfusión GE estándar, TFF (filtración de flujo tangencial), ATF2 y ATF4 se evaluaron para su capacidad de soportar un crecimiento celular y una densidad celular viable aumentados bajo parámetros definidos (tabla 1).
Tabla 1: Parámetros experimentales usados para la comparación de métodos de retención celular
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0002
El sistema de flujo tangencial alternante ATF4 soportaba el crecimiento celular más rápido conseguido usando estos parámetros junto con una concentración de cultivo de 4 veces final rápida (30 min) sin ensuciamiento del filtro. Otros métodos bajo examen dieron como resultado menores concentraciones de células viables por ml, demostraron una menor eficiencia de concentración y/o dieron como resultado ensuciamiento durante el cultivo y/o la concentración. Estos resultados pueden verse en la Figura 2, la Figura 11 y la tabla 2.
Tabla 2: Resultados de la comparación de diferentes métodos de retención celular
Figure imgf000014_0001
Ejemplo 3: Determinación del tiempo óptimo para recoger células cultivadas para la concentración y el establecimiento de bancos de alta densidad.
Para determinar el momento de recogida de células óptimo para la concentración final y el establecimiento criogénico de bancos de células de alta densidad posteriores, se hicieron crecer cultivos de línea celular 1 de rCHO en un biorreactor Cellbag WAVE® (GE Healthcare Life Sciences) de 10 l personalizado en condiciones de cultivo por perfusión que usaba un sistema de flujo tangencial alternante. Se recogieron células a diferentes densidades celulares (14x106, 33x106, 56x106/ml) en múltiples puntos de tiempo durante el cultivo por perfusión para elaborar minibancos (Fig. 1).
Estos bancos se evaluaron comparando la calidad tras la descongelación de las células en términos de tasa de crecimiento, viabilidad y muerte celular (apoptosis). Los parámetros bajo los que se hicieron crecer estas células durante el cultivo inicial y en la evaluación tras el establecimiento de bancos se muestran en la tabla 3.
Tabla 3: Parámetros experimentales usados para la determinación
del momento para la recogida de células óptima
Figure imgf000014_0003
Figure imgf000015_0001
El rendimiento celular tras la descongelación de los minibancos elaborados a diferentes densidades celulares a partir de estos cultivos era comparable en términos de su tasa de crecimiento celular, viabilidad (Fig. 3) y tasa de apoptosis (Fig. 4). Estos datos indican que las células están sanas y listas para la recogida hasta aproximadamente 60 x 106 células/ml.
Se seleccionaron densidades de recogida de aproximadamente (30-40) x 106 células/ml con el fin de acortar el periodo de cultivo y hacer el proceso más practicable. Estos cultivos se concentraron entonces adicionalmente hasta >11 x 107 células/ml en 30 minutos usando un sistema de flujo tangencial alternante.
Ejemplo 4: Determinación de parámetros de WAVE® óptimos durante el cultivo de células de alta densidad.
Para hacer este proceso de cultivo y de establecimiento de bancos de células de alta densidad más robusto e implementable en GMP, se estudiaron y definieron parámetros de funcionamiento WAVE® con el fin de establecer un sistema en el que este cultivo pudiera mantenerse en ausencia de controles de pH y OD automáticos.
Estos parámetros de funcionamiento WAVE® se sometieron a prueba en un sistema de cultivo por perfusión combinado con un sistema de flujo tangencial alternante definido usando los parámetros observados en la tabla 4.
Tabla 4: Parámetros experimentales usados
para la determinación de parámetros de funcionamiento WAVE®.
Figure imgf000015_0002
Un estudio de transferencia de masa de oxígeno (kLa) muestra que la tasa y el ángulo de basculación WAVE® son parámetros clave que afectan a la transferencia de oxígeno. Además, la concentración de espacio de cabeza tanto de oxígeno como de dióxido de carbono pueden afectar significativamente al OD y pH.
Una condición de funcionamiento de biorreactor simplificada que incluye un ajuste de basculación y de gasificación de WAVE® (tabla 5) combinada con una alta tasa de perfusión se aplicaron para conseguir los niveles de OD y pH objetivo sin control automático.
Tabla 5: Parámetros de funcionamiento WAVE®
durante el crecimiento sin control de pH y OD
Figure imgf000016_0003
Cuando el pH fuera de línea medido mediante un analizador de gases sanguíneos (BGA, Blood Gas Analyzer) era < 6,9, el punto de referencia de CO2 se redujo desde el 10% hasta el 5%. Si el pH fuera de línea medido era < 6,9 de nuevo, el punto de referencia de CO2 se redujo desde el 5% hasta el 0%. Si el pH fuera de línea era todavía < 6,9, se aumentó la tasa de perfusión. Cuanto el OD se midió a < 45%, el punto de referencia de O2 se elevó desde el 20% hasta el 30%. Si el OD medido era < 45% de nuevo, la velocidad de basculación se aumentó hasta 25 rpm y el ángulo de basculación se cambió a 12°. Adicionalmente, el nivel de O2 se elevó desde el 30% hasta el 40%.
Este método se refinó adicionalmente ajustando la tasa de basculación (tabla 6) durante la etapa de concentración final para evitar la inclusión de aire en el sistema ATF4.
Tabla 6. Parámetros de funcionamiento WAVE® durante la concentración
Figure imgf000016_0001
Un conjunto simplificado de condiciones de funcionamiento de biorreactor que incluye ajuste de basculación y de gasificación WAVE® dio como resultado un rendimiento de crecimiento celular comparable sin basarse en controles de realimentación de pH y OD automatizados, Figs. 5 y 6. El ajuste de basculación también dio como resultado una inclusión de aire mínima durante la etapa de concentración ATF4.
Ejemplo 5: Determinación del efecto de la etapa de concentración ATF y la exposición a DMSO sobre la salud de la célula.
Con el fin de determinar el efecto de la etapa de concentración ATF4 y la exposición a DMSO antes de la congelación sobre la calidad de la célula, se inocularon matraces de agitación con células vivas recogidas en diferentes fases en el procedimiento de establecimiento de bancos de células de alta densidad para la evaluación del crecimiento. Las muestras recogidas y examinadas en las condiciones mostradas en la tabla 7 eran: previas a la concentración, posteriores a la concentración y con una duración de exposición a DMSO de 0 a 120 min.
Tabla 7: Parámetros experimentales usados
para la determinación de parámetros de funcionamiento WAVE®.
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000017_0002
El crecimiento celular (Fig. 7A) y la tasa de apoptosis (Fig. 7B) de células previas a la concentración y células posteriores a la concentración eran comparables, como lo eran las tasas de crecimiento celular y de apoptosis de células con diferentes duraciones de exposición a DMSO. Esto sugiere que la concentración ATF4 de 30 min en recipiente y la dispensación a escala completa de más de 200 viales en 90 min al tiempo que se mantenía la calidad de la célula antes de la congelación es factible.
Ejemplo 6: Determinación de la calidad de la célula tras el establecimiento de bancos y la aplicabilidad de la plataforma a múltiples líneas celulares
Para determinar la calidad de la célula tras el establecimiento de bancos de los bancos de células de alta densidad, se cultivaron células tras la descongelación y se examinaron para determinar sus tasas de crecimiento celular relativas, viabilidad y niveles de apoptosis. Además, se emplearon tres líneas celulares diferentes (líneas celulares 1, 2 y 3 de rCHO) con el fin de garantizar que esta plataforma podía aplicarse fácilmente a otras líneas celulares. Las condiciones experimentales en las cuales se hacían crecer estas células antes y después del establecimiento de bancos se detallan en la tabla 8.
Tabla 8: Parámetros experimentales usados para la calidad de la célula
tras el establecimiento de bancos de los bancos h D para múltiples líneas celulares.
Figure imgf000017_0001
Se evaluaron el crecimiento celular, la viabilidad y los niveles de apoptosis tras la descongelación para la línea celular 1 de rCHO (Fig. 8A-B), la línea celular 2 de rCHO (Fig. 9A-B) y la línea celular 3 de rCHO (Fig. 10A-B) en muestras para las que se han establecido bancos tanto de alta densidad (10 x 107 células/ml) como de densidad normal (2,0­ 2,4 x 106 células viables/ml). Las células mostraron buenas tasas de crecimiento y viabilidad con bajos niveles de apoptosis. Las tasas de recuperación variaban dependiendo de las líneas celulares examinadas.

Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Un método no centrífugo para producir un banco de células congeladas de alta densidad, comprendiendo el método:
    a) cultivar células en un biorreactor de perfusión hasta una primera densidad celular eliminando de manera continua medio de crecimiento de un cultivo y remplazándolo por medio de crecimiento nuevo, agitándose el biorreactor para un mezclado y un intercambio de gases eficientes, estando acoplado el biorreactor a un sistema de retención celular que comprende un sistema de filtración de flujo tangencial alternante (ATF) que incluye un filtro;
    b) concentrar de manera no centrífuga las células cultivadas en el biorreactor de perfusión acoplado al sistema de retención celular, concentrándose las células hasta una segunda densidad celular mayor que la primera densidad celular eliminando el medio de crecimiento del cultivo usando el filtro y reduciendo de ese modo el volumen del medio de crecimiento para producir una población de células concentrada de aproximadamente 1x108 células/ml; y
    c) criopreservar la población de células concentrada para producir un banco de células congeladas de alta densidad,
    en el que el banco de células de mamífero congeladas de alta densidad tiene una viabilidad tras la descongelación de al menos el 90%,
    en el que el pH y el oxígeno disuelto (OD) del cultivo se controlan mediante métodos no automatizados, y en el que el biorreactor se bascula a entre 6 rpm y 22 rpm.
  2. 2. - El método según la reivindicación 2, en el que el filtro tiene un área superficial de al menos 0,3 m2, preferiblemente de aproximadamente 0,3 m2 a aproximadamente 0,5 m2, de aproximadamente 0,5 m2 a aproximadamente 1,0 m2, de aproximadamente 0,7 m2 a aproximadamente 0,8 m2, de aproximadamente 1,0 m2 a aproximadamente 2,0 m2, de aproximadamente 2,0 m2 a aproximadamente 3,0 m2, de aproximadamente 3,0 m2 a aproximadamente 4,0 m2 o de aproximadamente 4,0 m2 a aproximadamente 5,0 m2.
  3. 3. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el filtro tiene un tamaño de poro seleccionado del grupo que consiste en 0,2 gm, 0,4 gm y 0,65 gm.
  4. 4. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la población de células concentrada tiene una densidad celular seleccionada del grupo que consiste en 1,0 x 108 células/ml, 1,1 x 108 células/ml, 1,2 x 108 células/ml, 1,3 x 108 células/ml, 1,5 x 108 células/ml, 1,7 x 108 células/ml y 2,0 x 108 células/ml.
  5. 5. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la criopreservación comprende añadir DMSO a la población de células concentrada a una concentración final de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10%, vol./vol.
  6. 6. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la criopreservación comprende congelar al menos una porción de la población de células concentrada en un recipiente apropiado para su almacenamiento en condiciones de criopreservación.
  7. 7. - El método según la reivindicación 6, en el que el recipiente es un vial.
  8. 8. - El método según la reivindicación 6, en el que el recipiente es una bolsa de criopreservación.
  9. 9. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el banco de células congeladas de alta densidad tiene una densidad celular de aproximadamente 1 x 108 células/ml.
  10. 10. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la tasa de perfusión en el biorreactor de perfusión es de entre aproximadamente 0,02 nl/célula/día y aproximadamente 0,5 nl/célula/día.
  11. 11. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo celular de biorreactor de perfusión tiene un pH de entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,2.
  12. 12. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo celular de biorreactor de perfusión tiene una concentración de oxígeno disuelto de al menos aproximadamente el 30%.
  13. 13. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el biorreactor es un biorreactor de bolsa flexible.
  14. 14. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el banco de células congeladas de alta densidad tiene una viabilidad tras la descongelación de al menos aproximadamente el 95%.
  15. 15. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células son células de mamífero.
  16. 16. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células son células transfectadas.
  17. 17. - Un método no centrífugo para producir un banco de células congeladas de alta densidad, comprendiendo el método:
    a) cultivar células hasta una densidad celular de menos de 1x108 células/ml en un biorreactor de perfusión acoplado a un sistema de filtración de flujo tangencial alternante eliminando de manera continua medio de crecimiento de un cultivo y remplazándolo por medio nuevo, comprendiendo el biorreactor un biorreactor de bolsa flexible, y teniendo el filtro un área superficial de filtro de al menos 0,3 m2 y un filtro con un tamaño MWCO de al menos 50 kDa;
    b) concentrar de manera no centrífuga las células cultivadas en el biorreactor de perfusión acoplado al sistema de retención celular, concentrándose las células eliminando medio de crecimiento del cultivo y reduciendo el volumen del medio de crecimiento usando el sistema de filtración de flujo tangencial alternante para producir una población de células concentrada que tiene una densidad de más de aproximadamente 1,0 x 108 células/ml; y
    c) criopreservar la población de células concentrada para producir un banco de células congeladas de alta densidad, comprendiendo la criopreservación añadir DMSO a la población de células concentrada hasta una concentración final de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10%, vol./vol., teniendo el banco de células congeladas de alta densidad una densidad celular de aproximadamente 108 células/ml.
    en el que el banco de células de mamífero congeladas de alta densidad tiene una viabilidad tras la descongelación de al menos el 90%,
    en el que el pH y el OD del cultivo se controlan mediante métodos no automatizados, y
    en el que el biorreactor se bascula a entre 6 rpm y 22 rpm.
  18. 18. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el biorreactor se bascula con un ángulo de basculación de entre 5° y 10°.
  19. 19. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que si el OD del cultivo durante la etapa a) es de <45%, entonces el biorreactor se bascula a 25 rpm con un ángulo de basculación de 12°, y en el que el biorreactor se bascula a entre 5 rpm y 15 rpm con un ángulo de basculación de entre 5° y 8° durante la etapa de concentración b).
  20. 20. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera densidad celular se concentra hasta la segunda densidad celular en 30 minutos o menos, y la primera densidad celular se concentra 4 veces para conseguir la segunda densidad celular.
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