ES2895224T3 - Procedimiento de construcción de biblioteca de péptidos - Google Patents
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Abstract
Procedimiento integrado para construir una biblioteca de péptidos parcial o completa con péptidos cíclicos, comprendiendo el procedimiento: (i) diseñar y producir una serie de péptidos cíclicos, presentando cada péptido cíclico una matriz de péptidos distintos de diferentes tamaños, y una o más etiquetas de afinidad, conteniendo cada péptido una matriz de secuencias de péptidos cortas, comprendiendo el péptido un péptido cíclico de 50 aminoácidos que presenta 50 tripéptidos consecutivos distintos, 50 tetrapéptidos consecutivos distintos, 50 pentapéptidos consecutivos distintos, 50 hexapéptidos consecutivos distintos, 50 heptapéptidos consecutivos distintos, 50 péptidos consecutivos distintos de 48 meros, 50 péptidos consecutivos distintos de 49 meros, y 50 péptidos de 50 meros, que constituye 2400 péptidos con tamaños que oscilan entre 3 y 50 aminoácidos; formándose los péptidos cíclicos por ayuste de inteína usando inteínas divididas, y estando los péptidos lineales correspondientes fusionados entre un motivo de inteína C-terminal y un motivo de inteína N-terminal; (ii) construir una serie de vectores de expresión, expresando cada vector un único péptido cíclico de este tipo; (iii) expresar y purificar los péptidos cíclicos uniendo la etiqueta de afinidad a un ligando específico inmovilizado en una fase sólida; (iv) eluir los péptidos cíclicos de las fases sólidas y usar la biblioteca para el cribado; y (v) opcionalmente usar los péptidos cíclicos inmovilizados directamente para el cribado sin ser eluidos de las fases sólidas, para construir así una biblioteca de péptidos parcial o completa con un número significativamente reducido de péptidos cíclicos.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de construcción de biblioteca de péptidos
Campo de la invención
La invención se refiere a un procedimiento para construir una biblioteca de péptidos parcial o completa con péptidos cíclicos que pueden presentar una matriz de péptidos cortos necesarios para una biblioteca de péptidos parcial o completa, tal como una biblioteca de tetrapéptidos, una biblioteca de pentapéptidos, una biblioteca de hexapéptidos, una biblioteca de heptapéptidos, o una biblioteca de octapéptidos, etc. El procedimiento incluye la construcción de un vector de expresión para la expresión de los péptidos cíclicos etiquetados. Cada péptido cíclico etiquetado presenta una matriz de péptidos de diferentes tamaños, y el número de péptidos cíclicos necesarios para construir una biblioteca de péptidos parcial o completa puede reducirse drásticamente con respecto a la síntesis química convencional de péptidos. Además, las bibliotecas se pueden reproducir fácilmente. Los péptidos cíclicos también se pueden sintetizar química y enzimáticamente para construir una biblioteca de péptidos parcial o completa. El procedimiento de preparación de la biblioteca de péptidos mejorado se puede usar particularmente, por ejemplo, para construir una biblioteca completa de pentapéptidos o hexapéptidos.
Antecedentes de la invención
Las bibliotecas de péptidos, que contienen una gran cantidad de péptidos que tienen una combinación sistemática de aminoácidos, se aplican ampliamente como una herramienta poderosa para cribar un gran número de péptidos en la búsqueda de péptidos bioactivos críticos en investigación biológica, estudios relacionados con proteínas, y en el desarrollo de fármacos. Se sabe que los péptidos de bajo peso molecular son menos alergénicos, y los diversos papeles fisiológicos de los péptidos los convierten en candidatos idóneos para el desarrollo de agentes terapéuticos (Host A, Halken S. Hypoallergenic formulas -when, to whom and how long: after more than 15 years we know the right indication! Allergy 2004, 59 (Suppl. 78):45-52; Lax R. The future of peptide development in the pharmaceutical industry. Phar Manufacturing: Int Pept Rev 2010; Agyei D, Danquah MK. Industrial scale manufacturing of pharmaceutical grade bioactive peptides. Biotechnol Adv 2011,29 (3): 272-7). Por lo tanto, los péptidos bioactivos son candidatos adecuados para una nueva era de productos farmacéuticos, especialmente con crecientes preocupaciones por los efectos secundarios de los medicamentos de molécula pequeña y la mayor atención a los alimentos y nutracéuticos más frescos y “más verdes” que poseen propiedades que previenen problemas de salud o promueven la salud (Danquah MK, Agyei D. Pharmaceutical applications of bioactive peptides. OA Biotechnology 2012, 1(2):5).
Se han encontrado muchos tipos de péptidos bioactivos, que incluyen péptidos antimicrobianos, anticancerosos, antioxidantes, antihipertensivos, antitrombóticos, opioides, antivirales, citomoduladores e inmunomoduladores, etc. (Sharma S, Singh R, Rana S. Bioactive peptide: A Review. Int. J. BioAUTOMATION 2011, 15(4):223-250; Danquah MK, Agyei D. Pharmaceutical applications of bioactive peptides. OA Biotechnology 2012, 1(2):5). Por lo tanto, el desarrollo de fármacos peptídicos es uno de los campos más prometedores en el desarrollo de nuevos fármacos.
Dado que una biblioteca de péptidos puede proporcionar una herramienta poderosa para el desarrollo de fármacos, interacciones proteína-proteína, y otras aplicaciones bioquímicas y farmacéuticas, se han desarrollado varios procedimientos para construir bibliotecas de péptidos. Los procedimientos de construcción de bibliotecas de péptidos se dividen en dos categorías: procedimientos que implican química sintética, y procedimientos que implican enfoques biotecnológicos.
Introducida en 1985 por George P. Smith, la tecnología de presentación de fagos permite el cribado de una gran cantidad de péptidos diferentes (Smith, G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228:1315-1317). Se encontró que el éxito de los péptidos derivados de fagos depende esencialmente de la calidad de la biblioteca cribada (Lindner T, Kolmar H, Haberkorn U y Mier W. DNA Libraries for the Construction of Phage Libraries: Statistical and Structural Requirements and Synthetic Methods. Molecules 2011, 16:1625-1641); sin embargo, no existe un procedimiento práctico para monitorizar o garantizar la calidad de la biblioteca de presentación de fagos. De hecho, hasta ahora, solo unos pocos de los péptidos seleccionados por presentación de fagos han entrado en aplicaciones clínicas (Lindner T, Kolmar H, Haberkorn U y Mier W. DNA Libraries for the Construction of Phage Libraries: Statistical and Structural Requirements and Synthetic Methods. Molecules 2011, 16:1625-1641).
En base a la síntesis en fase sólida desarrollada por Merrifield, para la construcción de bibliotecas de péptidos se desarrolló el procedimiento combinatorio de “síntesis de mezcla dividida” (Á. Furka, F. Sebestyen, M. Asgedom, G. Dibo, General method for rapid synthesis of multicomponent peptide mixtures. Int. J. Peptide Protein Res., 1991, 37:487-493). Teóricamente, se puede sintetizar una gran cantidad de péptidos de esta manera para obtener una gran biblioteca; sin embargo, en la práctica, el número y la cantidad de los péptidos sintetizados de esta manera están limitados, debido al alto coste y los bajos rendimientos de producción de sintetizar la biblioteca.
Los péptidos también se pueden producir mediante enfoques recombinantes. Los péptidos cortos generalmente se fusionan con una proteína, y después se expresan y purifican a partir de un hospedante de expresión, tal como E. coli. (S. Hara, M. Yamakawa, Production in Escherichia coli of moricin, a novel type antibacterial peptide from the silkworm, Bombyx mori. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 224:877-878. H. K. Kim, D. S. Chun, J. S. Kim, C. H. Yun, J. H. Lee, S. K. Hong, D. K. Kang, Expression of the cationic antimicrobial peptide lactoferricin fused with the anionic peptide in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 72:330-338). Sin embargo, en la práctica, el número y la cantidad de los péptidos producidos de esta manera también están limitados, debido al largo procedimiento y al alto coste, y la capacidad de la biblioteca de péptidos construida de esta manera es muy baja.
En comparación con sus homólogos lineales, los péptidos cíclicos suelen mostrar una mejor actividad biológica debido a la rigidez conformacional y a una mayor resistencia a la hidrólisis por exopeptidasas debido a la falta de ambos extremos amino y carboxilo (Sang Hoon Joo, Cyclic Peptides as Therapeutic Agents and Biochemical Tools. Biomol Ther. 2012, 20 (1):19-26), que hacen que los péptidos cíclicos sean mejores candidatos para el cribado de fármacos. Los péptidos cíclicos también se pueden producir mediante química sintética o enfoques recombinantes basados en inteínas divididas (Sang Hoon Joo, Cyclic Peptides as Therapeutic Agents and Biochemical Tools. Biomol Ther. 2012, 20 (1):19-26. Manfredi Miraula, Charmaine Enculescu, Gerhard Schenk, Natasa Mitic, Inteins -A Focus on the Biotechnological Applications of Splicing-Promoting Proteins. American Journal of Molecular Biology 2015, 5:42-56). Al igual que los péptidos lineales producidos por enfoques de recombinación, el número y la cantidad de péptidos cíclicos producidos de esta manera también están limitados debido al largo procedimiento y al alto coste, y la capacidad de la biblioteca de péptidos construida de esta manera es baja.
Una biblioteca de péptidos se puede construir sintetizando un gran número de péptidos distintos. Dado que no hay una buena manera de predecir qué péptido será un buen candidato a fármaco, se desea construir una biblioteca de péptidos completa, que contenga todas las combinaciones posibles de los aminoácidos, para una alta probabilidad de encontrar buenos candidatos a fármaco durante el cribado de péptidos. Hay 20 aminoácidos de origen natural, por lo que es necesario sintetizar 8,000 tripéptidos distintos para construir una biblioteca de tripéptidos completa. De manera similar, es necesario sintetizar 160,000 tetrapéptidos para construir una biblioteca de tetrapéptidos completa, es necesario sintetizar 3,200,000 pentapéptidos para construir una biblioteca de pentapéptidos completa, y es necesario sintetizar 64,000,000 de hexapéptidos para construir una biblioteca de hexapéptidos completa. Debido al alto costo y los bajos rendimientos de producción para sintetizar la gran cantidad de péptidos, hasta ahora, solo se sintetizó una biblioteca virtual de tripéptidos completa (8,000 péptidos) que contiene todas las combinaciones posibles de los 20 aminoácidos naturales usando un procedimiento químico para desarrollar una nueva clase de inhibidores de COX-2 (Ermelinda V, et al., Design, Synthesis, and Evaluation of New Tripeptides as COX-2 Inhibitors for developing a new class of COX-2 inhibitors. Journal of Amino Acids. 2013, 2013:1-7); una biblioteca de tetrapéptidos completa, que debería contener 160,000 tetrapéptidos, ni siquiera está disponible actualmente en el mercado, sin mencionar una biblioteca de pentapéptidos o hexapéptidos completa, etc.
Así, todavía existe la necesidad de un procedimiento altamente productivo para construir bibliotecas de péptidos virtuales con grandes capacidades. Se describió previamente un procedimiento de presentación de proteínas (PEPTIDE LIBRARY CONSTRUCTING METHOD AND RELATED VECTORS, documento PCT/CN2015/083260) para construir bibliotecas de péptidos virtuales con grandes capacidades, con las que se muestra una matriz de péptidos cortos al final de una proteína etiqueta, tal como GST, para reducir el número de péptidos necesarios para construir una biblioteca completa de tetrapéptidos, pentapéptidos o hexapéptidos, etc. Sin embargo, con el procedimiento de presentación de proteínas, cada péptido lineal etiquetado, que puede mostrar muchos péptidos cortos, presenta péptidos mucho menos largos. Por ejemplo, un péptido lineal de 50 meros etiquetado puede presentar 47 tetrapéptidos, 46 pentapéptidos o 45 hexapéptidos, pero solo dos péptidos de 49 meros y solo un péptido de 50 meros, lo que limita la capacidad de la biblioteca. Por lo tanto, sería deseable tener un procedimiento para construir bibliotecas de péptidos virtuales con capacidades incluso grandes.
La memoria descriptiva de la patente de EE.UU. n° US 7,105,341 B2 describe composiciones que se refieren a vectores retrovíricos que codifican polipéptidos que contienen inteínas.
La solicitud de patente PCT n° WO 2017/004745 A1 describe un procedimiento de preparación de bibliotecas de péptidos para construir bibliotecas de péptidos completas.
La publicación científica titulada “Split-intein mediated circular ligation used in the synthesis of cyclic peptide libraries in E. coli” (Tavassoli et al., Nature protocols, 2007, vol. 2, n° 5, página 1126) describe la producción de bibliotecas de péptidos cíclicos de entre 107y 108 transformantes.
La publicación científica titulada “ Intein-mediated cyclization of randomized peptides in the periplasm of Escherichia coli and their extracellular secretion” (Deschuyteneer et al., ACS Chemical Biology, 2010, vol. 5, n° 7, 691 - 700) describe el ayuste mediado por cisteína llevado a cabo en el entorno oxidativo del periplasma de Escherichia coli.
Breve sumario de la invención
Es un objetivo de esta invención proporcionar unos procedimientos mejorados para construir bibliotecas de péptidos con altas capacidades. En lugar de presentar péptidos al final de una etiqueta de proteína, un péptido lineal se cicla para formar un péptido cíclico para presentar más péptidos, aumentando así la capacidad de la biblioteca. Por ejemplo, con un diseño razonable, un péptido cíclico de 50 aminoácidos puede presentar en realidad 50 tripéptidos consecutivos distintos, 50 tetrapéptidos consecutivos distintos, 50 pentapéptidos consecutivos distintos, 50 hexapéptidos consecutivos distintos, 50 heptapéptidos consecutivos distintos, etc., incluso 50 péptidos de 48 meros consecutivos distintos, 50 péptidos de 49 meros consecutivos distintos, y 50 péptidos de 50 meros, que constituyen 2400 péptidos diferentes con tamaños que oscilan entre 3 y 50 aminoácidos.
Otro objetivo de esta invención es proporcionar un procedimiento mejorado para construir una biblioteca de tetrapéptidos completa. Con un diseño razonable, un péptido cíclico de 50 aminoácidos puede presentar en realidad 50 tetrapéptidos consecutivos distintos, solo se necesitan 3,200 péptidos cíclicos de 50 meros en lugar de 160,000 tetrapéptidos sintéticos para construir una biblioteca de tetrapéptidos completa mediante este procedimiento de presentación de proteínas. De manera similar, solo se necesitan 2,000 péptidos cíclicos de 80 meros para construir una biblioteca de tetrapéptidos completa. El número de péptidos cíclicos más grandes se puede reducir aún más para construir una biblioteca de tetrapéptidos completa.
Aún otro objetivo de esta invención es proporcionar un procedimiento mejorado para construir una biblioteca de pentapéptidos completa. Con un diseño razonable, un péptido cíclico de 50 aminoácidos puede presentar en realidad 50 pentapéptidos consecutivos distintos, solo se necesitan 64,000 péptidos cíclicos de 50 meros en lugar de 3,200,000 pentapéptidos sintéticos para construir una biblioteca de pentapéptidos completa mediante este procedimiento de presentación de proteínas. De forma similar, solo se necesitan 40,000 péptidos cíclicos de 80 meros para construir una biblioteca de pentapéptidos completa. El número de péptidos cíclicos más grandes se puede reducir aún más para construir una biblioteca de pentapéptidos completa.
Aún otro objetivo de esta invención es proporcionar un procedimiento mejorado para construir una biblioteca de hexapéptidos completa. Con un diseño razonable, un péptido cíclico de 50 aminoácidos puede presentar en realidad 50 hexapéptidos consecutivos distintos, solo se necesitan 1,280,000 péptidos cíclicos de 50 meros en lugar de 64,000,000 de hexapéptidos sintéticos para construir una biblioteca de hexapéptidos completa mediante este procedimiento de presentación de proteínas. De forma similar, solo se necesitan 800,000 péptidos cíclicos de 80 meros para construir una biblioteca de hexapéptidos completa. El número de péptidos cíclicos más grandes se puede reducir aún más para construir una biblioteca de hexapéptidos completa.
Aún otro objetivo de esta invención es proporcionar un procedimiento mejorado para construir una biblioteca de péptidos con gran capacidad usando un enfoque de síntesis química, comprendiendo el procedimiento: (i) diseñar una serie de péptidos cíclicos, presentando cada péptido cíclico una matriz de péptidos cortos; (ii) sintetizar los péptidos lineales con las correspondientes secuencias de péptidos cíclicos con procedimientos químicos, con o sin purificación; (iii) ciclar los péptidos lineales para obtener los péptidos cíclicos con procedimientos químicos o procedimientos enzimáticos; (iv) purificar los péptidos cíclicos, y usar la biblioteca para el cribado.
Aún otro objetivo de esta invención es proporcionar un procedimiento mejorado para construir una biblioteca de péptidos cíclicos con gran capacidad, comprendiendo el procedimiento: (i) diseñar una serie de péptidos cíclicos, conteniendo cada péptido cíclico una matriz de péptidos cortos y una o más etiquetas de afinidad; (ii) construir una serie de vectores de expresión, expresando cada vector un único péptido cíclico; (iii) expresar y purificar los péptidos cíclicos uniendo la etiqueta de afinidad a un ligando específico inmovilizado en una fase sólida; (iv) eluir los péptidos cíclicos de las fases sólidas y usar la biblioteca para el cribado; y (v) opcionalmente usar los péptidos cíclicos inmovilizados directamente para el cribado sin eluirlos de las fases sólidas
Aún otro objetivo de esta invención es proporcionar un procedimiento para construir una biblioteca de péptidos parcial o incompleta con un número significativamente reducido de péptidos cíclicos. Para péptidos más largos, tales como heptapéptidos, octapéptidos, decapéptidos, o incluso péptidos más largos tales como péptidos de 15 o 20 meros, las bibliotecas completas contendrán un gran número de todos los péptidos posibles, que son 1,28 x 109, 2,56 x 1010, 1,024 x 1013, 3,277 x 1019, 1,049 x 1026, respectivamente. Por lo tanto, no es práctico sintetizar químicamente tantos péptidos para obtener una biblioteca de péptidos completa. Sin embargo, todavía es deseable construir una biblioteca parcial, ya que algunos péptidos compartirán una gran similitud de secuencia. Mediante un diseño racional, el número de péptidos para construir una biblioteca de péptidos parcial eficaz puede reducirse en gran medida. Este procedimiento de la invención reducirá aún más el número de péptidos en una biblioteca de péptidos parcial, para hacer así práctica la construcción de una biblioteca de péptidos eficaz.
Otro objetivo adicional de esta invención es proporcionar un procedimiento alternativo para construir una biblioteca de péptidos completa. La secuencia de ADN de cada péptido cíclico se clonará en un vector de expresión para la expresión y purificación del péptido cíclico etiquetado. El vector se puede almacenar, y el péptido se puede expresar o reproducir a partir del vector fácilmente en cualquier momento. A diferencia de la síntesis de péptidos, cada péptido debe resintetizarse desde cero.
Es un objetivo de esta invención proporcionar un procedimiento para construir vectores de expresión para la expresión y purificación de los péptidos cíclicos etiquetados para la construcción de la biblioteca de péptidos.
Objetos adicionales de la invención se reflejan en las reivindicaciones originales. Los detalles de las formas de realización de la exposición se establecen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otras características, objetivos y ventajas resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.
Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos
El breve resumen anterior, así como la siguiente descripción detallada de la invención, se comprenderán mejor cuando se lean junto con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar la invención, en los dibujos se muestran formas de realización que son actualmente preferidas. Deberá entenderse, sin embargo, que la invención no está limitada por los dibujos presentados.
En los dibujos:
La figura 1 ilustra esquemáticamente que un péptido cíclico puede mostrar muchos péptidos más cortos, y como ejemplo, se muestra un pentapéptido, d Ec AF (Asp-Glu-Cys-Ala-Phe);
la figura 2 ilustra esquemáticamente la alta capacidad de los péptidos cíclicos para presentar péptidos cortos según una forma de realización de la invención;
la figura 3 ilustra esquemáticamente un ejemplo típico de 80 pentapéptidos diferentes presentados por un único péptido cíclico de 80 meros;
la figura 4 ilustra esquemáticamente el mapa de un vector para la expresión de péptidos cíclicos a base de inteína dividida;
la figura 5 ilustra esquemáticamente la expresión y purificación del péptido cíclico de 80 meros;
Descripción detallada de la invención
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece esta invención.
Las formas de realización de la presente invención se refieren a unos procedimientos útiles para construir una biblioteca de péptidos. En un aspecto, la invención se refiere a una mejora significativa de la construcción de una biblioteca de péptidos mediante síntesis química convencional. Por ejemplo, la presente invención proporciona un procedimiento mejorado para la construcción de una biblioteca de péptidos completa mediante el cual los péptidos cíclicos se expresan y purifican y el número de péptidos cíclicos necesarios para formar una biblioteca completa se reduce significativamente.
Según formas de realización de la presente invención, las secuencias de aminoácidos de los péptidos cíclicos se diseñan racionalmente de modo que cada péptido cíclico pueda presentar una matriz de péptidos distintos de diferentes tamaños, aumentando así la capacidad de la biblioteca de manera significativa. Dependiendo de los tamaños de los péptidos cíclicos, cada péptido cíclico puede presentar entre 10 y 100, o incluso 200 de péptidos distintos de un tamaño específico. Por lo tanto, los procedimientos según las formas de realización de la presente invención reducen en gran medida el número de péptidos en una biblioteca de péptidos, por lo que la construcción y el cribado de una biblioteca de péptidos se realizarán a costes significativamente reducidos.
Como se usa en la presente memoria, los términos un “péptido”, una “biblioteca”, una “etiqueta”, una “proteína”, un “vector”, “capacidad”, “cíclico”, “completa”, y una “matriz”, deben ser tomados en su contexto más amplio.
En un aspecto general, la presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para construir bibliotecas de péptidos completas con números reducidos de péptidos en comparación con el procedimiento de síntesis de péptidos convencional. Por ejemplo, como se ilustra en las figuras 1 y 2, un péptido cíclico puede presentar muchos péptidos más cortos. En otras palabras, muchos péptidos cortos pueden ser presentados por un solo péptido cíclico, a saber, “presentación de proteínas”. En lugar de sintetizar 80 pentapéptidos diferentes, por ejemplo, un péptido cíclico de 80 meros puede presentar 80 pentapéptidos diferentes, reduciendo así significativamente el número de péptidos necesarios para construir una biblioteca de pentapéptidos completa, y aumentando al mismo tiempo la eficiencia del cribado. En comparación con la expresión de proteínas, la síntesis química de un péptido de 80 meros tardará varios días en la síntesis química y la ciclación cabeza a cola del péptido, mientras que el péptido cíclico similar se puede expresar fácilmente en una bacteria hospedante durante la noche. El rendimiento
global de péptido cíclico de 80 meros sintetizado químicamente será bajo, mientras que el péptido similar se puede expresar fácilmente en un hospedante de expresión a cualquier escala. Por el contrario, una forma de realización de la presente invención proporciona un procedimiento mediante el cual se puede construir una biblioteca de péptidos completa con un número significativamente reducido de péptidos, estos péptidos se pueden expresar y purificar fácilmente, y estos péptidos también se pueden reproducir fácilmente en cualquier momento usando los genes clonados. El procedimiento según la forma de realización de la presente invención puede reducir enormemente el tiempo y el coste necesarios para la construcción y el cribado de la biblioteca de péptidos.
Las formas de realización de la invención se refieren a etiquetas de proteína útiles para expresar y purificar péptidos cíclicos. Una de las etiquetas de proteína es GST (glutationa S-transferasa), que se usa normalmente para purificar una proteína diana fusionada con GST. GST puede ayudar a la expresión de la proteína o péptido diana. Otra etiqueta habitual es His Tag, que contiene una cadena de restos de histidina para la purificación de péptidos etiquetados.
En una forma de realización de la invención, la etiqueta de proteína comprende una de las etiquetas seleccionadas de entre, pero sin limitarse a, por ejemplo, GST, His Tag, Trx, SUMO, CBD, FLAG, HA, AviTag, Myc-Tag, SBP, Strep-Tag, Fc-Tag, Halo-Tag, V5, VSV, MBP, etc.
En una forma de realización de la invención, la etiqueta de proteína comprende una combinación de las etiquetas seleccionadas de entre, pero sin limitarse a, por ejemplo, GST, His Tag, Trx, SUMO, CBD, FLAG, HA, AviTag, Myc-Tag, SBP, Strep-Tag, Fc-Tag, Halo-Tag, V5, VSV, MBP, etc.
En aún otra forma de realización de la invención, las etiquetas se pueden añadir en cualquier posición del péptido cícli
También se puede añadir una secuencia de reconocimiento de proteasa entre la etiqueta y el péptido, de modo que el péptido se pueda escindir de la etiqueta usando una proteasa si es necesario.
Es evidente para los expertos en la materia que la presente invención incluye modificaciones a las formas de realización mencionadas anteriormente para mejorar aún más la construcción de la biblioteca. Estas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, añadir una o múltiples secuencias de péptidos a la forma de realización anterior. Por ejemplo, se pueden añadir algunos aminoácidos específicos en las secuencias de péptidos para facilitar el ayuste de inteína.
Puede usarse una variedad de procedimientos para diseñar las secuencias de péptidos para preparar una biblioteca de péptidos eficaz en vista de la presente exposición. Por ejemplo, para facilitar la expresión soluble del péptido etiquetado, deben evitarse las secuencias de péptidos que contienen tramos largos de aminoácidos hidrófobos.
Es evidente para los expertos en la materia que se pueden usar muchos sistemas de inteína de ayuste en trans diferentes para producir péptidos cíclicos. Por ejemplo, para producir péptidos cíclicos, se puede utilizar la inteína dividida Npu DnaE (Hideo Iwai, Sara Züger, Jennifer Jin, Pui-Hang Tam, Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Letters. 2006, 580:1853-1858), la inteína dividida Ssp GyrB, la inteína dividida Ssp DnaB, la inteína dividida Ssp DnaE, la inteína dividida Mxe GyrA, la inteína dividida Mtu RecA, etc.
También es evidente para los expertos en la materia que el péptido cíclico puede diseñarse de tal manera que el péptido cíclico pueda presentar tantos péptidos cortos distintos como sea posible para aumentar así la capacidad de la biblioteca de péptidos.
Según las formas de realización ilustradas en la figura 3, un péptido cíclico expresado de 80 aminoácidos puede presentar en realidad 80 tetrapéptidos consecutivos distintos, 80 pentapéptidos consecutivos distintos, 80 hexapéptidos consecutivos distintos, 80 heptapéptidos consecutivos distintos, ........, 80 péptidos consecutivos distintos de 78 meros, 80 péptidos consecutivos distintos de 79 meros, y 80 péptidos de 80 meros, que constituyen 6160 péptidos con tamaños que oscilan entre 4 y 80 aminoácidos.
En las formas de realizacion mencionadas anteriormente, los expertos en la materia sabrán que el péptido cíclico puede contener incluso hasta 200 o más aminoácidos, aunque el tamaño óptimo estará entre 10 y 100. Los péptidos más largos tendrán mayores posibilidades de formar estructuras terciarias en las que algunas secuencias de péptidos no se expondrán para el cribado.
En las formas de realización mencionadas anteriormente, los expertos en la materia sabrán que, en lugar de sintetizar químicamente 160,000 tetrapéptidos, 3,200 o más péptidos cíclicos de 50 meros expresados pueden
constituir o presentar una biblioteca de tetrapéptidos completa, o 2,000 o más péptidos cíclicos de 80 meros expresados pueden constituir o presentar una biblioteca de tetrapéptidos completa.
En las formas de realización mencionadas anteriormente, los expertos en la materia sabrán que, en lugar de sintetizar químicamente 3,200,000 pentapéptidos, 64,000 o más péptidos cíclicos de 50 meros expresados pueden constituir o presentar una biblioteca de pentapéptidos completa, o 40,000 o más péptidos cíclicos de 80 meros expresados pueden constituir o presentar una biblioteca de pentapéptidos completa.
En las formas de realización mencionadas anteriormente, los expertos en la materia sabrán que algunos péptidos en una biblioteca de péptidos compartirán una alta similitud de secuencia, y el número de péptidos para construir una biblioteca de péptidos eficaz puede reducirse enormemente mediante un diseño racional. Por lo tanto, un número menor que 3,200 de péptidos cíclicos de 50 meros expresados puede constituir una biblioteca de tetrapéptidos eficaz. De forma similar, un número menor que 64,000 de péptidos cíclicos de 50 meros expresados puede constituir una biblioteca de pentapéptidos eficaz.
En las formas de realización mencionadas anteriormente, los expertos en la materia sabrán que el péptido cíclico puede contener más de 80 aminoácidos, para reducir así aún más el número de los péptidos cíclicos expresados. Por lo tanto, un número aún menor de péptidos expresados puede constituir una biblioteca de tetrapéptidos, pentapéptidos o incluso hexapéptidos eficaz.
En las formas de realización mencionadas anteriormente, los expertos en la técnica sabrán que algunos péptidos en una biblioteca de péptidos compartirán una alta similitud de secuencia y similitud de estructura, y el número de péptidos para construir una biblioteca de péptidos eficaz puede reducirse aún más mediante un diseño racional. Por lo tanto, un número práctico de péptidos cíclicos expresados puede constituir una biblioteca de polipéptidos eficaz, tal como una biblioteca de octapéptidos, una biblioteca de decapéptidos, o incluso bibliotecas de péptidos más largos, tal como una biblioteca de péptidos de 15 meros, una biblioteca de péptidos de 20 meros, o incluso una biblioteca de péptidos de 30 meros.
En una forma de realización preferida, se pueden diseñar 2,000 o más péptidos cíclicos expresados de 80 meros etiquetados con His, clonarse en un vector de expresión, expresarse, y purificarse para constituir una biblioteca de tetrapéptidos completa.
En una forma de realización preferida adicional, se pueden diseñar 40,000 o más péptidos cíclicos de 80 meros etiquetados con His, clonarse en un vector de expresión, expresarse, y purificarse para constituir una biblioteca de pentapéptidos completa, que también constituye una biblioteca de tetrapéptidos completa.
En las formas de realización mencionadas anteriormente, los expertos en la materia sabrán que también se puede usar otra etiqueta o etiquetas en lugar de His Tag; las etiquetas se pueden seleccionar de entre, pero no se limitan a, GST, Trx, SUMO, CBD, FLAG, HA, AviTag, Myc-Tag, SBP, Strep-Tag, Fc-Tag, Halo-Tag, V5, VSV, MBP, etc.
En las formas de realización mencionadas anteriormente, los expertos en la materia sabrán que el péptido cíclico etiquetado puede contener más de o menos de 80 aminoácidos, para así reducir o aumentar aún más el número de los péptidos cíclicos etiquetados expresados para constituir una biblioteca de péptidos completa.
Según las formas de realización ilustradas en la figura 4, se puede construir un vector de expresión de péptidos cíclicos etiquetados para que contenga opcionalmente una o más secuencias de ADN de etiquetas de afinidad, secuencias de ADN para los dos fragmentos complementarios de una inteína dividida (motivo de inteína C-terminal Npu DnaEo y un motivo de inteína N-terminal Npu DnaEN), una secuencia de ADN de expresión de péptidos, y opcionalmente un sitio de reconocimiento de proteasa que puede usarse para linealizar el péptido cíclico si es necesario.
En las formas de realización mencionadas anteriormente, los expertos en la materia sabrán que el vector de expresión se puede construir basándose en, pero sin limitarse a, un vector de expresión de bacteria, un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insecto, un vector de expresión fúngico, un vector de expresión de mamífero, y un vector de expresión vegetal.
En otra forma de realización de la presente invención, los péptidos cíclicos etiquetados pueden expresarse en y purificarse a partir de un hospedante de expresión. El hospedante de expresión se selecciona de entre el grupo que consiste en, pero no se limita a, una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula fúngica, una célula de mamífero, y una célula vegetal.
Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que, en general, también se pueden aplicar procedimientos similares para construir una biblioteca de péptidos cíclicos. Los péptidos cíclicos diseñados se expresan, se purifican usando una etiqueta de afinidad inmovilizada en una superficie sólida, y después se usan para el cribado con los péptidos todavía unidos a la superficie sólida. Los péptidos cíclicos diseñados también pueden eluirse de la superficie sólida y usarse después para el cribado.
Se han descrito ahora diversas formas de realización de la invención. Sin embargo, cabe señalar que esta descripción de estas formas de realización específicas es meramente ilustrativa de los principios subyacentes al concepto inventivo.
Los siguientes ejemplos específicos son más ilustrativos de la naturaleza de la invención, debe entenderse que la invención no se limita a ellos.
Ejemplo de presentación de proteínas
La figura 3A muestra la estructura cíclica y la secuencia de aminoácidos de un péptido cíclico de 80 meros; la figura 3B muestra que el péptido cíclico de 80 meros puede presentar 80 pentapéptidos distintos.
La secuencia de ADN, como se muestra a continuación, que incluye los dos motivos de inteína dividida Npu DnaE para la expresión del péptido cíclico de 80 meros, se clonó en el vector pET28a como se muestra en la figura 4. La secuencia de ADN:
ATGATCAAGATTGCTACGCGCAAATACTTGGGAAAACAGAACGTTTATGATATCGGAGTGGAA CGTGA CCA CAATTTTGCTCTGAAAAACGGATTCATCGCAAGTAATTGCT'GGGAAAGTGGG AAGATGACCGGTATCGTGAAGTGGTTTAACGCTGACAAGGGGTTTGGTTTCATTA CTCCAGATGACGGTTCTAAGGATGTTTTCGTTCACTTTTCCGCGATTCAAAACGA CGGGTACAAATCCTTGGATGAGGGCCAAAAAGTCTCATTTACGATTGAATCCGGG GCCAAGGGTCCCGCAGCAGGAAACGTAACTAGCTTATCCAAAACTCACCACCATC ATCACTGTTTGTCCTACGAGACCGAGATCCTTACAGTAGAATATGGTTTGTTACCCATT GGAAAGATCGTGGAGAAGCGTATCGAATGCACAGTGTACAGCGTTGATAACAACGGTA ACATTTATACCCAACCCGTGGCTCAGTGGCATGACCGTGGCGAACAAGAGGTCTTCGA GTATTGCCTTGAGGACGGGTCTCTGATCCGCGCTACAAAAGATCATAAGTTTATGACCG TTGACGGACAGATGCTGCCTATTGACGAAATTTTTGAGCGTGAACTTGACTTAATGCGT GTCGATAACCTGCCTAATTAA en \a qUe e| motivo C-terminal de Npu DnaE (Npu DnaEC) se muestra en cursiva, el péptido cíclico de 80 meros en negrita, y el motivo N-terminal de Npu DnaE (Npu DnaEN) en fuente normal.
La secuencia de la proteína correspondiente:
MÍKIA TRKYLGKQNVYDIG VER DHNFA LKNGFIA 5WC WESGKMTGIVK WFNAD KGFGFITPDDGSKDVFVHFSAIQNDGYKSLDEGQKVSFTIESGAKGPAAG NVTSLSKTHHHHHCLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIY TQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFEREL D L M R V D N L P N en la que el motivo C-terminal de Npu DnaE (Npu DnaEc) se muestra en cursiva, el péptido cíclico de 80 meros en negrita, y el motivo N-terminal de Npu DnaE (Npu DnaEN) en fuente normal. El péptido cíclico de 80 meros se expresó en una cepa de E. coli usando IPTG como inductor, siguiendo el procedimiento estándar de expresión génica. La figura 5A muestra que el péptido cíclico de 80 meros se expresó en una forma soluble, en la que la Fila 1 es un marcador de proteína con el peso molecular indicado a la izquierda, la Fila 2 es el lisado de células completas sin inducción, y la Fila 3 es el lisado de células completas con inducción con IPTG 1 mM; el péptido cíclico de 80 meros se indica con una flecha.
El péptido cíclico de 80 meros se purificó usando una columna de Ni-IDA. El péptido cíclico de 80 meros se unió a la columna de Ni-IDA y se eluyó de la columna con imidazol. La figura 5B muestra que el péptido cíclico de 80 meros se purificó, en la que la Fila 1 es un marcador de proteína con el peso molecular indicado a la izquierda, la
Fila 2 es el lisado de células completas con inducción con IPTG, la Fila 3 es el flujo de la muestra de lisado de células completas, y la Fila 4 es el péptido cíclico de 80 meros purificado, que se indica con una flecha.
Aunque la invención se ha descrito con relación a formas de realización específicas, debe entenderse que la invención, tal como se reivindica, no debe estar limitada más de lo razonable a estas formas de realización. De hecho, para los expertos en la técnica son obvias diversas modificaciones para llevar a cabo la invención, y se pretende que estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Claims (10)
1. Procedimiento integrado para construir una biblioteca de péptidos parcial o completa con péptidos cíclicos, comprendiendo el procedimiento:
(i) diseñar y producir una serie de péptidos cíclicos, presentando cada péptido cíclico una matriz de péptidos distintos de diferentes tamaños, y una o más etiquetas de afinidad, conteniendo cada péptido una matriz de secuencias de péptidos cortas, comprendiendo el péptido un péptido cíclico de 50 aminoácidos que presenta 50 tripéptidos consecutivos distintos, 50 tetrapéptidos consecutivos distintos, 50 pentapéptidos consecutivos distintos, 50 hexapéptidos consecutivos distintos, 50 heptapéptidos consecutivos distintos, 50 péptidos consecutivos distintos de 48 meros, 50 péptidos consecutivos distintos de 49 meros, y 50 péptidos de 50 meros, que constituye 2400 péptidos con tamaños que oscilan entre 3 y 50 aminoácidos; formándose los péptidos cíclicos por ayuste de inteína usando inteínas divididas, y estando los péptidos lineales correspondientes fusionados entre un motivo de inteína C-terminal y un motivo de inteína N-terminal;
(ii) construir una serie de vectores de expresión, expresando cada vector un único péptido cíclico de este tipo;
(iii) expresar y purificar los péptidos cíclicos uniendo la etiqueta de afinidad a un ligando específico inmovilizado en una fase sólida;
(iv) eluir los péptidos cíclicos de las fases sólidas y usar la biblioteca para el cribado; y
(v) opcionalmente usar los péptidos cíclicos inmovilizados directamente para el cribado sin ser eluidos de las fases sólidas, para construir así una biblioteca de péptidos parcial o completa con un número significativamente reducido de péptidos cíclicos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la biblioteca de péptidos cíclicos es una biblioteca de péptidos incompleta que contiene algunos de los péptidos posibles para un tamaño específico.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las etiquetas de afinidad se seleccionan de entre el grupo que consiste en GST, His Tag, Trx, SUMO, CBD, FLAG, HA, AviTag, Myc-Tag, SBP, Strep-Tag, Fc-Tag, Halo-Tag, V5, VSV, y MBP.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el hospedante de expresión se selecciona de entre el grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula fúngica, una célula de mamífero, y una célula vegetal.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el vector de expresión se selecciona de entre el grupo que consiste en un vector de expresión de bacteria, un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insecto, un vector de expresión fúngico, un vector de expresión de mamífero, y un vector de expresión vegetal.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los péptidos cíclicos se expresan en forma soluble o cuerpos de inclusión insolubles, o tanto en forma soluble como en cuerpos de inclusión insolubles en una célula bacteriana tal como E. coli.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se construye una serie de vectores de expresión, expresando cada vector un único péptido cíclico, comprendiendo el vector: una estructura de vector; una secuencia de motivo de inteína C-terminal; opcionalmente, una o más secuencias de ADN de etiquetas de afinidad; una secuencia de ADN peptídico; una secuencia de motivo de inteína N-terminal; y opcionalmente uno o más sitios de reconocimiento de proteasa.
8. Construcción de vector según la reivindicación 7, en la que la una o más etiquetas de purificación se colocan en cualquier lugar entre el motivo de inteína C-terminal y el motivo de inteína N-terminal.
9. Construcción de vector según la reivindicación 8, en la que las dos o más etiquetas de purificación están unidas entre sí o están separadas.
10. Procedimiento para construir una biblioteca de péptidos parcial o completa con péptidos cíclicos, comprendiendo el procedimiento: (i) diseñar una serie de péptidos cíclicos, presentando cada péptido cíclico una matriz de péptidos distintos de diferentes tamaños, conteniendo cada péptido una matriz de secuencias de péptidos cortas, comprendiendo el péptido un péptido cíclico de 50 aminoácidos que contiene 50 tripéptidos distintos, 50 tetrapéptidos consecutivos distintos, 50 pentapéptidos consecutivos distintos, 50 hexapéptidos consecutivos distintos, 50 heptapéptidos consecutivos distintos, 50 péptidos consecutivos distintos de 48 meros, 50 péptidos consecutivos distintos de 49 meros, y 50 péptidos de 50 meros, que constituye 2400 péptidos con tamaños que oscilan entre 3 y 50 aminoácidos; (ii) sintetizar los péptidos lineales con las correspondientes secuencias de péptidos cíclicos con procedimientos químicos con o sin purificación; (iii) ciclar los péptidos lineales para obtener
los péptidos cíclicos con procedimientos químicos o procedimientos enzimáticos; (iv) purificar los péptidos cíclicos y usar la biblioteca para el cribado.
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