ES2895275T3 - Enfoque novedoso para el tratamiento de trastornos inflamatorios - Google Patents

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Abstract

Un oligonucleótido que consiste en 15 a 21 nucleótidos, más particularmente desde 15 a 20 nucleótidos, en el que la secuencia de dicho oligionucleótido comprende la secuencia GTGTTC, que es complementaria a las posiciones 146 a 151 de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1, en el que dicho oligionucleótido inhibe la expresión de RORC2, y en el que el oligonucleótido consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en +T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.2), +T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*+A*+C*+T (SEQ ID NO.3), +T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*+G*+A*+C (SEQ ID NO.4), +A*+C*T*+T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.6), +C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.7), +T*+C*A*+A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.8), +G*+T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*+C*T*+G (SEQ ID NO.9), +A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*+G*+A*+C (SEQ ID NO. 10), +T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*A*+T (SEQ ID NO.11), +T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.23), +G*+T*+G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*T*+G*+A*+G (SEQ ID NO.24), +G*+T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.25), +T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.26), +T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.53), +T*+T*+G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.54), +A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.55), +T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*+C*+T*+C (SEQ ID NO.56), +C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*+C*+T*+C (SEQ ID NO.57), +T*+G*+A*G*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.58), +T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.59), +T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*T*+C*+A*+T (SEQ ID NO.60), +T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.61) y +A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*+A*+C*+T (SEQ ID NO.62); particularmente del grupo que consiste en +T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.2), +T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*+A*+C*+T (SEQ ID NO.3), +T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*+G*+A*+C (SEQ ID NO.4), +A*+C*T*+T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.6), +C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.7), +T*+C*A*+A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.8), +G*+T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*+C*T*+G (SEQ ID NO.9), +T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.23), +T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.53), +T*+T*+G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.54), +A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.55), +T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*+C*+T*+C (SEQ ID NO.56), +C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*+C*+T*+C (SEQ ID NO.57), +T*+G*+A*G*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.58), y +T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.59); más particularmente del grupo que consiste en +T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.2), +T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*+A*+C*+T (SEQ ID NO.3), +T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*+G*+A*+C (SEQ ID NO.4), +A*+C*T*+T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.6), +C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.7), +T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.53), +T*+T*+G*T*G*T*T*G*T*G*A*T*G*A*G*+T*+G*+A (SEQ ID NO.54), y +A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.55), en las que + indica una modificación de LNA y * un fosforotioato, en la que opcionalmente uno o más de los fosforotioatos se reemplazan independientemente por un fosfato no modificado o un fosfato modificado distinto de un fosforotioato, particularmente un metilfosfonato.

Description

DESCRIPCIÓN
Enfoque novedoso para el tratamiento de trastornos inflamatorios
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un enfoque novedoso para el tratamiento de trastornos inflamatorios y otras enfermedades, que se basa en dirigirse al ARNm de ROR gamma t. La invención está dirigida a oligonucleótidos que comprenden de 15 a 21 nucleótidos modificados o no modificados complementarios a regiones específicamente seleccionadas del ARNm de la variante de transcripción 2 de RORC (RORC2), que codifica la proteína ROR gamma t.
Antecedentes de la invención
Las células Th17 son un subconjunto de células T auxiliares que se han asociado con varias enfermedades inflamatorias y autoinmunes crónicas. Tras la polarización y activación, las células Th17 producen moléculas altamente proinflamatorias como las citocinas IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22 y las quimiocinas CXCL8 y CCL20. Adicionalmente, las células Th17 producen moléculas efectoras como GM-CSF y ayudan a las células B, inducen la formación de centros germinales y el cambio de clases.
Los mecanismos efectores y las respuestas Th17 exacerbantes están asociados con la patogénesis de enfermedades inflamatorias agudas y crónicas como psoriasis, artritis reumatoide (RA), esclerosis múltiple (MS), lupus eritematoso sistémico (SLE), diversos fenotipos de enfermedades inflamatorias del intestino (IBD), asma y alergia.
En la artritis reumatoide, el papel de Th17 se ha confirmado en varios modelos de ratón, así como en el material del paciente. Se ha encontrado una alta frecuencia de células productoras de IL17 en la membrana sinovial enferma, y la administración intraarticular de IL17 en modelos de artritis inducida por colágeno ha conducido al empeoramiento de los síntomas de RA. Adicionalmente, los ratones deficientes en IL17RA desarrollan solo formas muy leves de RA. Hasta la fecha, se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales anti-IL17A y anti-IL17RA protegen de RA progresiva en humanos y están aprobados como agentes terapéuticos.
En la psoriasis, la artritis psoriásica así como la psoriasis en placas, la activación crónica de las células Th17 y la respuesta proinflamatoria contra los autoantígenos de la piel, así como la microbiota cutánea, es la principal causa de patología. Las biopsias de piel de los respectivos pacientes muestran niveles elevados de IL17, IL23, IL6 e IL12, que representan el fenotipo proinflamatorio mixto Th1/Th17. Adicionalmente, las células Th17 en placas psoriásicas producen CCL20 y reclutan más Th17, mastocitos y neutrófilos para prolongar y elevar la respuesta. Además, Th17 juega un papel en los procedimientos de inflamación que forman parte de varios otros fenotipos de la piel como el acné, la dermatomiositis y la esclerodermia.
Además de las enfermedades de la piel, las células Th17 también juegan un papel importante en otras enfermedades inflamatorias mucocutáneas tales como asma crónica, alérgica y resistente a los esteroides, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y enfermedades inflamatorias del intestino, como la enfermedad de Crohn, enteritis y colitis ulcerosa. Se ha encontrado IL17A en niveles elevados en el esputo de pacientes con asma grave así como en pacientes con COPD. La IL17 se induce de forma potente a través del receptor de aril-hidrocarburo (AhR), un objetivo de los ingredientes del humo del cigarrillo y varios contaminantes.
La patología de la IBD es un campo de estudio intensivo y datos convincentes, a pesar de la diversidad de modelos usados, muestran la importancia de las células Th17. En la enfermedad de Crohn, los pacientes experimentan fases recurrentes de la enfermedad con frecuencias aumentadas de Th17. La fuerte respuesta autoinmune impulsada por Th17 podría estar relacionada con el polimorfismo IL23R, y la defensa excesiva del huésped contra la microbiota intestinal se basa en una multiplicidad de mecanismos mediados por Th17. Sin embargo, la inhibición de IL17 no resultó beneficiosa en la enfermedad de Crohn, lo que refleja la diversidad de fenotipos de IBD en la población de pacientes.
Una de las primeras enfermedades que se demostró que estaba impulsada por Th17 fue la esclerosis múltiple y, aunque la complejidad de la enfermedad aumenta, las células Th17 siguen desempeñando el papel central. Diversos tipos de células de las biopsias cerebrales de pacientes con MS mostraron sobreexpresión de IL17A e infiltración extensa de linfocitos. Adicionalmente, el fenotipo periférico de la MS también parece ser dependiente de Th17, ya que se ha demostrado que estas células proporcionan ayuda a las células B y pueden inducir la producción de autoanticuerpos.
Como en la MS, se ha demostrado una implicación similar de las células Th17 en otro fenotipo autoinmunitario: el lupus eritematoso sistémico ("SLE"). Esta enfermedad compleja y diversa empeora con el aumento del número de células Th17. El efecto principal de Th17 en SLE se observó en la vasculitis progresiva y la disfunción endotelial. Este efecto no solo es característico del SLE, sino también de la enfermedad de Behcet, la uveítis y el síndrome de Sjogren. Se ha descubierto que las células productoras de IL17 se acumulan en las paredes de los vasos de los pacientes con vasculitis autoinmunitaria y reclutan otras células proinflamatorias, como neutrófilos y macrófagos. La IL17 tiene efectos protrombóticos y procoagulantes sobre las células endoteliales humanas.
Concomitantemente con la acumulación de Th17 en la vasculitis, existe una correlación positiva entre la frecuencia de Th17 y la frecuencia de las lesiones aórticas en la aterosclerosis coronaria. Aquí, el aumento de los niveles de Th17 conduce a un aumento del tamaño de las lesiones aórticas y la frecuencia del infarto cardíaco.
Además de la artritis reumatoide, Th17 juega un papel en otra enfermedad inflamatoria crónica de las articulaciones y la columna, espondilitis anquilosante. Aquí, durante la inflamación del tendón en curso, Th17 y los mastocitos producen IL17 en la membrana sinovial e impulsan la formación de hueso ectópico y la rigidez de las articulaciones. La inflamación en curso es bastante tratable con terapia anti-TNF alfa, pero la reforma ósea y las anquilosas pueden ser dependientes de Th17.
Un campo aun parcialmente explorado de las células Th17 es el dolor neuropático. Se están acumulando datos de que el dolor lumbar inespecífico crónico y neuropático diverso se correlaciona con el equilibrio interrumpido entre las células Th17 y las células T reguladoras.
En conjunto, la inhibición del desarrollo y la función de Th17 parece ser claramente un objetivo prometedor para el tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente.
El factor de transcripción maestro de las células Th17 es ROR gamma t. Los receptores huérfanos relacionados con el receptor del ácido retinoico (ROR) son miembros de la familia de receptores nucleares de hormonas esteroides. La subfamilia de factores de transcripción ROR consta de tres miembros: ROR alfa (RORA), ROR beta (RORB) y ROR gamma (RORC). Cada miembro se expresa como gen independiente y se une como monómero a los elementos de respuesta genómica. Mediante el empalme alternativo y el uso de promotores diferenciales, cada miembro de ROR genera variantes que tienen diferentes patrones de expresión tisular y que regulan diferentes dianas. RORC tiene dos isoformas que surgen del uso de promotores diferenciales y que difieren en el primer exón. Estas dos variantes de transcripción se anotan como: NM_005060 para ROR gamma (RORC1) y NM_001001523 para ROR gamma t (RORC2). Mientras que ROR gamma se expresa en una variedad de tejidos ya sea de forma constitutiva o bajo ritmo circadiano, la expresión de ROR gamma t se limita a las células del sistema inmunológico. La expresión más alta de ROR gamma se mostró para el músculo esquelético, riñón e hígado, mientras que la expresión de ROR gamma t alcanza su punto máximo en los timocitos dobles positivos en desarrollo, las células T auxiliares 17 (Th17), las células inductoras de tejido linfoide (LTi) y varias subpoblaciones de células linfoides intraepiteliales (ILC). ROR gamma t tiene un papel crítico en la timopoyesis ya que reduce la expresión de Fas y la dependencia de IL2, rescatando a los timocitos de la muerte celular inducida por activación durante la selección tímica. Además, ROR gamma t es importante para la función de LTi y el desarrollo de tejidos linfoides secundarios.
De este modo, la inhibición del desarrollo y la función de Th17 a través de la inhibición del factor de diferenciación maestro, ROR gamma t, parece ser una opción viable.
Un posible enfoque para inhibir las patologías dirigidas por Th17 es inhibir las funciones efectoras de Th17 ya presente, así como interferir con la nueva diferenciación de células T naive hacia el linaje Th17 bloqueando ROR gamma t. Sin embargo, ROR gamma t es una molécula intracelular y los anticuerpos terapéuticos no pueden alcanzarla. Adicionalmente, los antagonistas de moléculas pequeñas de ROR gamma y gamma t actualmente disponibles se dirigen a los dominios de unión del ligando o ADN que son idénticos entre ambas moléculas. Como se dijo anteriormente, ROR gamma se expresa de forma ubicua y tiene funciones en muchos procedimientos fisiológicos centrales. El papel más estudiado de ROR gamma es la regulación circadiana del metabolismo de lípidos y azúcares en el hígado y el músculo esquelético. La ausencia de ROR gamma conduce a un desequilibrio de la función metabólica del hígado, síndrome metabólico, resistencia a la insulina y obesidad. Adicionalmente, varios estudios han evidenciado un papel importante de ROR gamma en el cáncer. La deficiencia de ROR gamma en ratones conduce a una alta incidencia de linfomas tímicos con metástasis frecuentes en hígado y bazo. De este modo, existe una gran necesidad insatisfecha de inhibidores específicos de ROR gamma t.
Un enfoque alternativo para inhibir las patologías dirigidas por Th17 es derribar la expresión de ROR gamma t en el nivel de ácido nucleico. Tal dirección tiene varias ventajas importantes, ya que en comparación con los agentes terapéuticos de molécula pequeña disponibles, la dirección en el nivel de ácido nucleico puede ajustarse para dirigirse exclusivamente al transcrito ROR gamma t, de este modo no tiene efectos sobre ROR gamma. Las moléculas pequeñas que se encuentran actualmente en desarrollo no tienen este nivel de especificidad, lo que puede dar lugar a efectos secundarios adversos con estos candidatos a fármacos. Sin embargo, el enfoque inicial de usar DNAzimas en base al motivo 10-23, que ya se había aplicado con éxito a la inhibición de GATA-3 (véase, el documento WO 2005/033314) no resultó en una inhibición de la expresión de RORC2 en relación con el control no tratado en células HDLM2 en al menos 50 % (véase, el ejemplo 2).
El documento WO 2006/007486 se basa en examinar la influencia de la expresión de RORC2 sobre la proliferación de células inmunes y reivindica el uso de inhibidores o antagonistas de la expresión de RORC2. Las construcciones antisentido se enumeran como inhibidores potenciales, pero no se muestran ejemplos de trabajo.
El documento WO 2012/129394 se refiere al tratamiento del cáncer mediante el uso de agonistas del receptor de IL-9, en el que los agonistas pueden actuar directamente sobre el receptor o indirectamente regulando la expresión de RORC2. Las construcciones antisentido se enumeran como inhibidores potenciales, pero no se muestran ejemplos de trabajo.
El documento CN 102 732 562 aparentemente describe la inhibición basada en ARNip de, por ejemplo, RORC1, incluyendo construcciones de ARNip según SEQ ID NOs: 7 bis 9. No parece mostrarse ninguna construcción de ARNip contra RORC2.
El documento WO 2011/113015 se refiere al uso de construcciones antisentido contra receptores de hormonas nucleares ("NHR"). Si bien RORC1 se enumera como un ejemplo de tales NHR, RORC2 no se enumera.
Hakemi et al.; Avicenna Journal of Medical Biotechnology 5 (2013) 10-19, se refiere al silenciamiento de genes en base a ARNip de RORC2, mostrando en total tres construcciones de ARNip anti-RORC2 (véase, la tabla 3). Sin embargo, estas construcciones no parecen ser específicas de RORC2 ya que corresponden a regiones de RORC2 que se comparten con RORC1 (posiciones de inicio 872, 1197 y 1303, respectivamente, de SEQ ID NO: 1 mostradas en este documento en la figura 1).
Burgler et al., J. Immunol. 184 (2010) 6161-6169 examina la interacción de RORC2 con el promotor FOXP3, incluido el uso de dos construcciones de ARNip en la eliminación de RORC2 (véase, la tabla complementaria 4). Sin embargo, estas construcciones no parecen ser específicas de RORC2 ya que corresponden a regiones de RORC2 que se comparten con RORC1 (posiciones de inicio 875 y 2473, respectivamente, de SEQ ID NO: 1 mostradas en este documento en la figura 1).
Webering "Zur Rolle des a -Melanozyten-stimulierenden Hormons (a -MSH) und des retinoid-related orphan receptor yt (RORyt) bei der Immunpathogenese des Asthma bronchiale", PhD thesis, Lübeck 2014; Kategorie "Y") se refiere al papel de RORC2 en la patogénesis inmunológica del asma bronquial, incluido el uso de ADNzimas y de tres construcciones de ARNip diferentes para inhibir la expresión de RORyt. Si bien no se pudo demostrar que el uso de ADNzimas tenga ninguna influencia en la expresión de RORyt (véase la sección 3.2.3 y la figura 36), las construcciones de ARNip aparentemente dieron como resultado una reducción de la expresión de RORyt hasta en un 65 % después de 48 h (véase la sección 3.2.4 y la figura 38). Sin embargo, no está claro qué regiones de RORyt fueron el objetivo, ya que las secuencias mostradas en la tabla 5 no coinciden con la secuencia de RORC2 mostrada como SEQ ID NO: 1 en este documento en la figura 1.
El documento WO 2004/024879 se refiere a la interacción de los ROR con la ruta de p21. En total, se muestran secuencias de ADN para 15 ROR diferentes, aparentemente incluyendo RORC2 (SEQ ID NO: 12). Para tres de esos ROR, pero no para RORC2, se muestran experimentos de eliminación basados en ARNip.
Lin et al., Mediators Inflamm. 2015: 290657 y Song et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 452 (2014) 1040-1045, se refieren a la inhibición de RORC2 con moléculas pequeñas y aptámeros-ARNip-quimeras. Aparentemente, no se proporciona información sobre la secuencia.
De este modo, los agentes terapéuticos que pueden inhibir específicamente la expresión de ROR gamma t intracelularmente son esenciales para el tratamiento de enfermedades provocadas por Th17, en particular trastornos inflamatorios de diversos órganos. Por tanto, todavía existe una gran necesidad científica y médica de agentes terapéuticos que reduzcan o inhiban la expresión y/o la actividad de RORC2. En particular, existe una necesidad desde hace mucho tiempo de oligonucleótidos, que interactúen específicamente y, de este modo, reduzcan o inhiban la expresión de RORC2, así como oligonucleótidos, que inhiban específicamente RORC2, sin causar ningún efecto secundario (grave).
Sumario
A pesar de los resultados negativos obtenidos con un enfoque en base a ADNzima, los presentes inventores identificaron sorprendentemente que un enfoque bastante similar de usar determinadas construcciones antisentido fue capaz de lograr la inhibición de la expresión de RORC2 en relación con el control no tratado en células HDLM2 por al menos 50 %, con varios candidatos logrando una inhibición de al menos el 80 %, más particularmente de al menos el 90 %. Este hallazgo fue inesperado y ni enseñado ni sugerido por la técnica anterior.
De este modo, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un oligonucleótido que consiste en 15 a 21 nucleótidos, más particularmente desde 15 a 20 nucleótidos, en el que la secuencia de dicho oligionucleótido comprende la secuencia GTGTTC, que es complementaria a las posiciones 146 a 151 de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1, en el que dicho oligionucleótido inhibe la expresión de RORC2, y en el que el oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste en T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.2), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*+A*+C*+T (SEQ ID NO.3), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*+G*+A*+C (SEQ ID NO.4), A*+C*T*+T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.6), C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.7), T*+C*A*+A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.8), G*+T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*+C*T*+G (SEQ ID NO.9), A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*+G*+A*+C (SEQ ID NO.10), T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*A*+T (SEQ ID NO.11), T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.23), G*+T*+G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*T*+G*+A*+G (SEQ ID NO.24), G*+T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.25), T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.26), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.53), T*+T*+G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.54), A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.55), T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*+C*+T*+C (SEQ ID NO.56), C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*+C*+T*+C (SEQ ID NO.57), T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.58), T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.59), T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*T*+C*+A*+T (SEQ ID NO.60), T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.61) y A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*+A*+C*+T (SEQ ID NO.62); particularmente del grupo que consiste en T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.2), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*+A*+C*+T (SEQ ID NO.3), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*+G*+A*+C (SEQ ID NO.4), A*+C*T*+T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.6), C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.7), T*+C*A*+A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.8), G*+T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*+C*T*+G (SEQ ID NO.9), T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.23) T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.53) T*+T*+G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.54) A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.55) T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*+C*+T*+C (SEQ ID NO.56) C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*+C*+T*+C (SEQ ID NO.57) T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.58), y T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.59); más particularmente del grupo que consiste en T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.2), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*+A*+C*+T (SEQ ID NO.3), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*+G*+A*+C (SEQ ID NO.4), A*+C*T*+T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.6), C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.7), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.53), T*+T*+G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.54), y A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.55), en el que indica una modificación de LNA y * un fosforotioato, en el que opcionalmente uno o más de los fosforotioatos se reemplazan independientemente por un fosfato no modificado o un fosfato modificado distinto de un fosforotioato, particularmente un metilfosfonato. El oligonucleótido inhibe la expresión de RORC2 con respecto al control no tratado en células HDLM2 en al menos un 50 %.
Se describen otros oligonucleótidos que consisten en desde 10 a 22 nucleótidos, particularmente desde 14 a 21 nucleótidos, particularmente desde 15 a 21 nucleótidos, y más particularmente desde 15 a 20 nucleótidos, en los que la secuencia de dicho oligonucleótido corresponde a la hebra antisentido de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1, en la que uno o más nucleótidos del oligonucleótido están opcionalmente modificados, y en la que dicho oligonucleótido inhibe la expresión de RORC2 con respecto al control no tratado en células HDLM2 en al menos un 50 %.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido según la presente invención.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a los oligonucleótidos o la composición farmacéutica según la presente invención para su uso en un método de prevención y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado de la lista de: una enfermedad inflamatoria aguda, una enfermedad inflamatoria crónica, una enfermedad neurodegenerativa, un tumor maligno y un tumor benigno.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el ARNm de la variante de transcripción 2 de RORC completo (NM_001001523.1). En mayúsculas, se da la región exclusiva de RORC2 (ROR gamma t) y no compartida con RORC1. Dado que se requieren al menos 3 apareamientos incorrectos con RORC1, el espacio que se puede usar para oligonucleótidos de 17 meros específicos para solo RORC2 se indica en negrita. El cribado bioinformático se realizó dentro de esta área para preservar la especificidad de los oligonucleótidos solo para RORC2.
La figura 2A muestra el resultado de un primer cribado de oligonucleótidos para la inhibición de ROR gamma t en células HDLM2, como se describe en el ejemplo 2.
La figura 2B muestra la determinación de IC50 para dos oligonucleótidos específicos de RORC2. Los gráficos muestran una expresión de ARNm de RORC2 residual decreciente (ejes y) en dependencia de la concentración de ASO (ejes x).
La figura 2C muestra la expresión de la proteína RORC2 (ejes y) en presencia de cantidades tituladas de dos ejemplos de oligonucleótidos específicos de RORC2 (ejes x).
La figura 2D muestra los efectos sobre ambas isotermas de RORC, RORC1 y RORC2 en presencia de ASO específicos y de control de RORC2.
La figura 2E muestra la eficacia de eliminación de dos oligonucleótidos específicos en células Th17 humanas y la reducción de las principales citocinas características de Th17, IL17A/F e IL22.
La figura 2F muestra la producción de IL17A en células Th17 humanas mediante clasificación celular asociada a la fluorescencia (FACS).
La figura 2G muestra los resultados de la prueba de luminol en el modelo de colitis inducida por TNBS para dos oligonucleótidos específicos de RORC2 y control neg1.
La figura 2H muestra la reducción en la expresión de RORC2 y la puntuación de inflamación del colon de los ratones en el modelo TNBS.
La figura 2I muestra la expresión de la mieloperoxidasa en el colon de los ratones de cada grupo experimental (puntos rojos - mieloperoxidasa; tinción azul - DAPI).
La figura 3 muestra un número de nucleótidos modificados diferentes que se pueden usar en el contexto de la presente invención.
La figura 4 muestra el resultado de un cribado de oligonucleótidos adicional para la inhibición de RORC2 en células HDLM2, como se describe en el ejemplo 3.
Descripción detallada
De este modo, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un oligonucleótido que consiste en 15 a 21 nucleótidos según la reivindicación 1, particularmente desde 15 a 18 nucleótidos, en el que la secuencia de dicho oligonucleótido corresponde a la hebra antisentido de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1, en la que uno o más nucleótidos del oligonucleótido están opcionalmente modificados, y en la que dicho oligonucleótido inhibe la expresión de RORC2 con respecto al control no tratado en células HDLM2 en al menos un 50 %.
Además, se describe un oligonucleótido que consiste en 10 a 22 nucleótidos, particularmente desde 15 a 21 nucleótidos, más particularmente desde 15 a 20 nucleótidos, en el que la secuencia de dicho oligonucleótido corresponde a la hebra antisentido de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1, en la que uno o más nucleótidos del oligonucleótido están opcionalmente modificados, y en la que dicho oligonucleótido inhibe la expresión de RORC2 con respecto al control no tratado en células HDLM2 en al menos un 50 %.
La secuencia de dicho oligonucleótido descrita es complementaria a una secuencia comprendida en la parte 5'-terminal de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1, en la que dicha parte 5'-terminal consiste en los nucleótidos 1 a 166, particularmente los nucleótidos 1 a 163, más particularmente los nucleótidos 1 a 162, siempre que en cada caso al menos tres nucleótidos de dicho oligonucleótido sean complementarios a los nucleótidos comprendidos en las posiciones 1 a 148 de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1.
Además, la secuencia de dicho oligonucleótido es complementaria a una secuencia comprendida en la parte 5'-terminal de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1, en la que dicha parte 5'-terminal consiste en los nucleótidos 131 a 166, particularmente los nucleótidos 131 a 163, más particularmente los nucleótidos 131 a 162, siempre que en cada caso al menos tres nucleótidos de dicho oligonucleótido sean complementarios a los nucleótidos comprendidos en las posiciones 131 a 148 de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1.
La secuencia de dicho oligionucleótido descrita comprende la secuencia GTGTT, que es complementaria a las posiciones 147 a 151 de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1. La secuencia de dicho oligionucleótido de la presente invención comprende la secuencia GTGTTC, que es complementaria a las posiciones 146 a 151 de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1. Además, la secuencia de dicho oligionucleótido descrita comprende la secuencia GTGTTCT, que es complementaria a las posiciones 145 a 151 de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1. Alternativamente, la secuencia de dicho oligionucleótido descrita comprende la secuencia TGTGTTCT, que es complementaria a las posiciones 145 a 152 de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1. En otra alternativa, la secuencia de dicho oligionucleótido descrita comprende la secuencia TTGTGTTCT, que es complementaria a las posiciones 145 a 153 de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1.
En realizaciones particulares de la presente invención, dicho oligonucleótido inhibe la expresión de RORC2 con respecto al control no tratado en células HDLM2 en al menos 75 %, particularmente en al menos 80 %, más particularmente en al menos 85 %, más particularmente en al menos el 90 %.
En determinadas realizaciones, dicho oligonucleótido inhibe la expresión de RORC2 con respecto al control no tratado en células HDLM2 en aproximadamente un 95 %.
En el contexto de la presente invención, la inhibición de la expresión de RORC2 se determina según el método mostrado en el ejemplo 2 o el ejemplo 3 a continuación.
Los nucleótidos en dicho oligonucleótido de la invención están modificados.
Un nucleótido forma el bloque de construcción de un oligonucleótido y está compuesto, por ejemplo, de una nucleobase (base nitrogenada, por ejemplo, purina o pirimidina), un azúcar de cinco carbonos (por ejemplo, ribosa, 2-desoxirribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa o modificaciones estabilizadas de esos azúcares), y uno o más grupos fosfato. Ejemplos de grupos fosfato modificados son fosforotioato o metilfosfonato. Cada compuesto del nucleótido es modificable y se produce de forma natural o no natural. Ejemplos de estos últimos son: ácido nucleico bloqueado (LNA), ácidos nucleicos de etilo restringidos 2', 4' (c-ET), ácido nucleico con puente de etileno 2'-0,4'-C (ENA), óxido de polialquileno (tal como trietilenglicol (TEG)), ácido 2'-fluoro-, 2'-desoxi-2'-fluoro-beta-D-arabinonucleico (FANA), nucleótidos 2'-O-metoxi- y 2'-O-metil- modificados. La figura 3 muestra ejemplos de un número de nucleótidos modificados diferentes que se pueden usar en el contexto de la presente invención.
Un "LNA" es un nucleótido de ARN modificado, en el que la unidad estructural de ribosa se modifica con un puente adicional que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4' (2'-4'-ribonucleósido). El puente bloquea la ribosa en la conformación 3'-endo (norte), que a menudo se encuentra en los dúplex en forma de A. Los nucleósidos y nucleótidos de LNA, respectivamente, comprenden por ejemplo las formas de tio-LNA, oxi-LNA o amino-LNA, en configuración alfa-D- o beta-L, y se pueden mezclar o combinar, respectivamente, con ADN o residuos de ARN en el oligonucleótido.
Un "ácido nucleico en puente" es un nucleótido de ARN modificado, a veces también denominado molécula de ARN restringida o inaccesible, que puede contener una estructura puente de cinco miembros, seis miembros o incluso siete miembros con un C3'-endo azúcar fruncido "fijo". El puente se incorpora sintéticamente en la posición 2', 4' de la ribosa para producir un monómero 2', 4'-BNA. Los ejemplos específicos son nucleótidos "ENA", en los que el puente es un puente de etileno. La figura 3 muestra un número de nucleótidos de BNA que se pueden usar en el contexto de la presente invención.
En una realización particular, se modifican uno o más nucleótido (s) en dicho oligonucleótido, en el que el nucleótido modificado contiene grupos fosfato modificados, seleccionados particularmente entre un fosforotioato y un metilfosfonato, particularmente un fosforotioato. En realizaciones particulares, todos los grupos fosfato del oligonucleótido son grupos fosfato modificados, seleccionados de manera particularmente independiente entre fosforotioatos y metilfosfonatos, particularmente en los que todos los grupos fosfato son fosforotioatos.
En realizaciones particulares, todos los nucleótidos de los oligonucleótidos de la presente invención están unidos por un grupo fosforotioato.
Se modifican uno o más nucleótido (s) en dicho oligonucleótido descrito, en el que el nucleótido modificado es un LNA, un c-ET, un ENA, un óxido de polialquileno-, un 2'-fluoro-, un 2'-O-metoxi-, un FANA y/o un nucleótido modificado con 2'-O-metilo.
En realizaciones particulares, el o los nucleótidos modificados están ubicados en el tramo de 5 nucleótidos en el extremo 5' y/o 3' del oligonucleótido, particularmente en el extremo 5'y/o 3' del oligonucleótido.
Los oligonucleótidos de la presente invención comprenden al menos un nucleótido modificado, que es al menos un LNA en el extremo 5' y/o 3' del oligonucleótido. El oligonucleótido comprende 1, 2, 3 o 4 LNA en el tramo de hasta 5 nucleótidos en el extremo 5', y 1, 2, 3 o 4 LNA en el tramo de hasta 5 nucleótidos en el extremo 3'. El oligonucleótido descrito comprende 1, 2, 3 o 4 LNA, c-ET o ENA en el tramo de 5 nucleótidos en el extremo 5' o en el extremo 3', y un óxido de polialquileno tal como TEG en el tramo de 5 nucleótidos en el extremo 3' o 5'.
Dicho oligonucleótido es un Gapmer que comprende al menos un nucleótido LNA en el tramo de 5 nucleótidos en el extremo 5' de dicho oligonucleótido, y al menos un nucleótido LNA en el tramo de 5 nucleótidos en el extremo 3' de dicho oligonucleótido. En realizaciones particulares, dicho Gapmer comprende 2 o 3 nucleótidos LNA en el tramo de 5 nucleótidos en el extremo 5' de dicho oligonucleótido, y 2 o 3 nucleótidos LNA en el tramo de 5 nucleótidos en el extremo 3' de dicho oligonucleótido.
En el contexto de la presente invención, el término "Gapmer" se refiere a un oligonucleótido antisentido quimérico que contiene un bloque central de monómeros desoxinucleotídicos suficientemente largo para inducir la escisión de RNasa H. El bloque central de un Gapmer está flanqueado por bloques de ribonucleótidos modificados con 2'-O u otros monómeros de ribonucleótidos modificados artificialmente, tal como los ácidos nucleicos en puente (BNA) que protegen el bloque interno de la degradación por nucleasas. En muchos estudios anteriores se investigó la estabilidad de los análogos de ADN modificados en fluidos biológicos. En la mayoría de estos experimentos se usaron análogos de ADN de fosforotioato. Más recientemente, se han investigado varios tipos de monómeros de nucleótidos artificiales, incluidos los monómeros de BNA, por su utilidad en el diseño de Gapmers. Se han usado gapmer para obtener la escisión mediada por RNasa-H de los ARN diana, al tiempo que se reduce el número de enlaces fosforotioato. Los fosforotioatos poseen una mayor resistencia a las nucleasas en comparación con el ADN no modificado. Sin embargo, tienen varias desventajas. Estos incluyen baja capacidad de unión a ácidos nucleicos complementarios y unión no específica a proteínas que causan efectos secundarios tóxicos que limitan sus aplicaciones. La aparición de efectos secundarios tóxicos junto con la unión no específica que provoca efectos fuera del objetivo ha estimulado el diseño de nuevos ácidos nucleicos artificiales para el desarrollo de oligonucleótidos modificados que proporcionan una actividad antisentido específica y eficaz in vivo sin presentar efectos secundarios tóxicos.
Los Gapmer de LNA son herramientas poderosas para estudios de pérdida de función de proteínas, ARNm e IncARN. Estos oligonucleótidos antisentido monocatenarios catalizan la degradación dependiente de RNasa H de dianas de ARN complementarias. Los Gapmer de LNA son por lo general de 12-20 nucleótidos de largo enriquecidos con LNA en las regiones flanqueantes y ADN en una brecha central libre de LNA, de ahí el nombre Gapmer. Las regiones flanqueantes que contienen l Na confieren resistencia a nucleasas al oligo antisentido mientras que al mismo tiempo aumentan la afinidad de unión a la diana independientemente del contenido de GC. La "brecha" de ADN central activa la escisión por RNasa H del ARN diana tras la unión.
En realizaciones particulares de la presente invención, el oligonucleótido consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 a SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 23 a SEQ ID NO.
26, y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 62; particularmente del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, Se Q ID NO. 6 a SEQ ID NO. 9, SEQ ID No .23, y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 59; más particularmente del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 55. Además, el oligonucleótido descrito consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 74; particularmente del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 a SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 31 a SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 74; particularmente del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 a SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 23 a SEQ ID NO. 27, y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 64; más particularmente del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 a SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 23 a SEQ ID NO. 26, y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 62; más particularmente del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 a SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 23, y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 59; y más particularmente del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 55.
En determinadas realizaciones de la presente invención, el oligonucleótido consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3.
En una realización particular, el oligonucleótido es una variante de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 a SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 23 a SEQ ID NO. 26, y SEQ ID NO.
53 a SEQ ID NO. 62; particularmente del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 a SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 23, y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 59; más particularmente del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 55, en el que en tal variante uno o más de los fosforotioatos se reemplazan independientemente por un fosfato no modificado de un fosfato modificado distinto de un fosforotioato, particularmente un metilfosfonato.
En este documento se describe un oligonucleótido que es una variante de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 a SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 23 a SEQ ID NO. 26, y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 62; particularmente del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO.
6 a SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 23, y SEQ ID NO. 53 a Se Q ID NO. 59; más particularmente del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 55, en el que tal variante comprende uno o más apareamientos incorrectos de nucleótidos, particularmente uno o dos apareamientos incorrectos, más particularmente un apareamiento incorrecto, siempre que cualquier variante de este tipo, incluyendo el o los apareamientos incorrectos, cuando se analice con las herramientas bioinformáticas descritas en el ejemplo 1, contenga al menos un apareamiento incorrecto relativo al cribado del genoma completo humano mientras se mantiene la homología con las especies relevantes.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido según la presente invención.
En realizaciones particulares, la composición farmacéutica comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
En realizaciones particulares, la composición farmacéutica comprende además al menos un componente adicional seleccionado de: un compuesto antisentido adicional, un anticuerpo, un compuesto quimioterapéutico, un compuesto antiinflamatorio, un compuesto antivírico, un compuesto inmunomodulador, un agente aglutinante farmacéuticamente aceptable y un adyuvante.
En una realización, el oligonucleótido y la composición farmacéutica, respectivamente, se formulan como unidad de dosificación en forma de cápsulas, comprimidos y píldoras, etc., respectivamente, que contienen, por ejemplo, los siguientes compuestos: celulosa microcristalina, goma o gelatina como aglutinantes; almidón o lactosa como excipientes; estearatos como lubricantes, diversos agentes edulcorantes o aromatizantes. Para las cápsulas, la unidad de dosificación puede contener un portador líquido como aceites grasos. Asimismo, los recubrimientos de azúcar o agentes entéricos pueden formar parte de la unidad de dosificación.
El oligonucleótido y/o la composición farmacéutica se pueden administrar por diferentes vías. Estas vías de administración incluyen, pero no se limitan a, electroporación, epidérmica, impresión en la piel, intraarterial, intraarticular, intracraneal, intradérmica, intralesional, intramuscular, intranasal, intraocular, intratecal, intracameral, intraperitoneal, intraprostática, intrapulmonar, intraespinal, intratraqueal, intratumoral, intravenosa, intravesical, colocación dentro de las cavidades del cuerpo, inhalación nasal, oral, inhalación pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluso por nebulizador), subcutánea, subdérmica, tópica (incluida oftálmica y a las membranas mucosas, incluido el suministro vaginal y rectal) o la administración transdérmica.
Para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica o tópica, el oligonucleótido y/o la composición farmacéutica incluyen, por ejemplo, un diluyente estéril, soluciones reguladoras, reguladores de toxicidad y antibacterianos. En una realización preferida, el oligonucleótido o composición farmacéutica se prepara con portadores que protegen contra la degradación o eliminación inmediata del organismo, incluidos implantes o microcápsulas con propiedades de liberación controlada. Para la administración intravenosa, los portadores preferidos son, por ejemplo, solución salina fisiológica o solución salina regulada con fosfato. Un oligonucleótido y/o una composición farmacéutica que comprende tal oligonucleótido para administración oral incluye, por ejemplo, polvo o gránulo, micropartículas, nanopartículas, suspensión o solución en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, bolsitas, comprimidos o minicomprimidos. Un oligonucleótido y/o una composición farmacéutica que comprende para administración parenteral, intratecal, intracameral o intraventricular incluye, por ejemplo, soluciones acuosas estériles que contienen opcionalmente solución reguladora, diluyente y/u otro aditivo apropiado como potenciador de la penetración, compuesto portador y/u otro portador farmacéuticamente aceptable o excipiente.
Un portador farmacéuticamente aceptable es, por ejemplo, líquido o sólido, y se selecciona teniendo en cuenta la forma de administración planificada para proporcionar el volumen, consistencia, etc. deseados, cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticamente aceptables típicos incluyen, pero no se limitan a, un agente aglutinante (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); relleno (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricante (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegrante (por ejemplo, almidón, almidón glicolato de sodio, etc.); o agente humectante (por ejemplo, lauril sulfato de sodio, etc.). Los sistemas de administración oral de liberación sostenida y/o los recubrimientos entéricos para formas de dosificación administradas por vía oral se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,704,295; 4,556,552; 4,309,406; y 4,309,404. Se incluye un adyuvante bajo estas frases.
Además de usarse en un método de prevención y/o tratamiento de enfermedades humanas, el oligonucleótido y/o la composición farmacéutica según la presente invención también se usa en un método para la prevención y/o tratamiento de otros sujetos, incluidos animales veterinarios, reptiles, aves, animales exóticos y animales de granja, incluidos mamíferos, roedores y similares. Los mamíferos incluyen, por ejemplo, caballos, perros, cerdos, gatos o primates (por ejemplo, un mono, un chimpancé o un lémur). Los roedores incluyen, por ejemplo, ratas, conejos, ratones, ardillas o cobayas.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al oligonucleótido de la presente invención o una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido de la presente invención para su uso en un método de prevención y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado de la lista de: una enfermedad inflamatoria aguda y una enfermedad inflamatoria crónica, una enfermedad neurodegenerativa, un tumor maligno y un tumor benigno.
En realizaciones particulares de la presente invención, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en: psoriasis, artritis reumatoide (RA), espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple (MS), lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedad de Behcet, uveítis, síndrome de Sjogren, una enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), dolor neuropático, dermatitis atópica y alergia.
En otras realizaciones particulares de la presente invención, el tumor se selecciona del grupo que consiste en tumores sólidos, tumores de origen sanguíneo, leucemias, metástasis tumorales, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracoma, granulomas piógenos, psoriasis, astrocitoma, acústico neuroma, blastoma, tumor de Ewing, craneofaringioma, ependimoma, meduloblastoma, glioma, hemangioblastoma, linfoma de Hodgkin, medulablastoma, leucemia, mesotelioma, neuroblastoma, neurofibroma, linfoma no Hodgkin, pinealoma, retinoblastoma, sarcoma, seminoma, tracoma y tumor de Wilms, o se selecciona del grupo de carcinoma de vías biliares, carcinoma de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, carcinoma de riñón, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, carcinoma de coroides, cistadenocarcinoma, carcinoma embrionario, carcinoma epitelial, cáncer de esófago, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, carcinoma de hígado, carcinoma de pulmón, carcinoma medular, cáncer de cuello, carcinoma broncogénico/pulmonar de células no pequeñas, cáncer de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cáncer de próstata, carcinoma de intestino delgado, carcinoma de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales, retinoblastoma, cáncer de piel, carcinoma de pulmón/broncogénico de células pequeñas, carcinoma de células escamosas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma testicular y cáncer de útero.
Ejemplos
Oligonucleótidos que consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 a SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 a SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 23 a SEQ ID NO. 26, y SEQ ID NO. 53 a SEQ ID NO. 62 se refieren a la presente invención.
Ejemplo 1: procedimiento de selección de secuencia y modificación de oligonucleótidos
Al principio, se identificaron secuencias apropiadas que representaban posibles sitios diana usando herramientas bioinformáticas patentadas. En una segunda etapa, se predijeron in silico los efectos de las modificaciones químicas en estas secuencias para optimizar los patrones de modificación.
1. Procedimiento de selección de secuencia por etapas.
Para RORC se conocen dos isoformas que surgen del uso de promotores diferenciales y, de este modo, difieren en su primer exón. Estas dos variantes de transcripción se anotan como: NM_005060 para ROR gamma (RORC1) y NM_001001523 para ROR gamma t (RORC2). La variante RORC2 difiere en la región de codificación y 5' UTR en comparación con la variante RORC1. Por lo tanto, la isoforma RORC2 es más corta y tiene un extremo N distinto en comparación con la isoforma RORC1. Los ARNm de RORC2 (NM_001001523) y r Or C1 (NM_005060) constan de 3054 nucleótidos y 3084 nucleótidos, respectivamente. La alineación de ambas secuencias muestra que solo los primeros 148 nucleótidos ubicados principalmente dentro de la región 5' no traducida (UTR) son exclusivos de RORC2, mientras que los nucleótidos restantes se comparten.
Se analizaron longitudes de secuencia en el intervalo de longitud 13mer a longitud 17mer en esta región (800 secuencias en total) usando herramientas bioinformáticas patentadas.
Se consideraron los siguientes factores para la selección de secuencias antisentido específicas de RORC2:
• Al menos 3 apareamientos incorrectos con el ARNm de RORC1
• Bajo número de ARNm fuera del objetivo potenciales parcialmente homólogos
• Reactividad cruzada con el RORC2 de ratón
2. Análisis de los efectos de las modificaciones químicas
Se evaluaron los efectos de las modificaciones químicas sobre las propiedades fisicoquímicas tales como la temperatura de fusión y la tendencia a formar horquillas o dímeros usando las herramientas de predicción disponibles. Los oligonucleótidos con las propiedades fisicoquímicas pronosticadas más favorables se seleccionaron para síntesis y cribado.
Ejemplo 2: Inhibición de RORC2 con material de oligonucleótidos antisentido o ADNzimas:
Línea celular HDLM2 - DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zelllinien, Braunschweig, Germany/ACC-17)
Tabla 1: Lista de ADNzimas no modificadas:
Figure imgf000010_0002
Tabla 2: Lista de ADNzimas modificadas con LNA (+: modificación de LNA):
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
Tabla 3: Lista de oligonucleótidos antisentido (+: modificación de LNA; *: PTO = fosforotioato) y efectividad de eliminación de RORC2 en células HDLM2:
Figure imgf000011_0002
Figure imgf000012_0001
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Protocolo:
La línea celular HDLM2 se adquirió de DSMZ, se expandió para bancos de células maestras y de trabajo y se cultivó en medio RPMI 1640 complementado (5 % de CO2 y 37 °C) para todos los experimentos adicionales. Los períodos de cultivo de cada lote de células descongeladas del banco de células de trabajo fueron de entre dos y tres semanas. Todos los oligonucleótidos se solicitaron a Exiqon (Vedbaek/Dinamarca) y Biospring (Frankfurt/Alemania). Los oligonucleótidos liofilizados se reconstituyeron con agua tratada con DEPC hasta una concentración de 1 mM. El cribado inicial se realizó en la línea celular HDLM2 a una concentración única de 10 |iM para cada oligonucleótido específico de RORC2 y control negativo (neg1; descrito en el documento WO2014154843A1). Las células se trataron con oligonucleótidos sin ningún reactivo de transfección (administración gimnótica) y se lisaron después de tres días para determinar la eliminación de RORC2.
Resultados:
El cribado inicial de oligonucleótidos antisentido en células HDLM2 dio como resultado varias moléculas muy activas. Los niveles de ARNm de RORC2 y HPRT1 se determinaron mediante el ensayo de ADNb de Quantigene Singleplex. Los niveles de ARNm de RORC2 se normalizaron a los niveles de HPRT1 (gen de mantenimiento) y se relacionaron con el control no tratado (Figura 2A). Los valores medios de la expresión de ARNm de RORC2 después de la normalización se enumeran para cada oligonucleótido en la tabla 3. La mejor eficacia de eliminación se logró con dos oligonucleótidos: A01018HM (94.8 %) y A01010HM (94.2 %).
Para una caracterización adicional de estos dos oligonucleótidos, se realizó un experimento de respuesta a la dosis. Se trataron células HDLM2 con oligonucleótidos diluidos en serie durante tres días y se determinó el ARNm de RORC2 residual mediante el ensayo ADNb de Quantigene Singleplex (Figura 2B). Los valores de IC50 para A01010HM son 290.5 nM (relativo) y 237.2 nM (absoluto; con una eliminación del 99.7 % a la concentración más alta de 10 |iM). Para A01018HM, la IC50 relativa es 277.5 nM y absoluta 200.1 nM (eliminación máxima del 96.2 %).
Eliminación dependiente de la dosis de la proteína RORC2
Para determinar la eficacia de eliminación a nivel de proteína, se transfectó la línea celular de cáncer humano, Hela, con una construcción de plásmido que codifica la proteína RORC2 etiquetada con his en el extremo N y se trataron con cantidades tituladas del oligonucleótido respectivo. La eficacia de eliminación se determinó mediante la cotinción con FACS de RORC2 y la etiqueta his (Figura 2C).
Efectos sobre la isoforma 1 y 2 de RORC
Dos de las isoformas de RORC difieren en sus regiones 5', patrones de expresión y funciones biológicas. Para interferir con los fenotipos autoinmunes impulsados por Th17 y, por lo tanto, por RORC2, el objetivo es apuntar específicamente a RORC2. Se analizaron los efectos de ASO sobre el ARNm tanto de RORC1 como de Ro Rc 2 en células HDLM2 después de tres días de tratamiento y se observó la expresión de ARNm de RORC1 mayoritariamente no afectada, mientras que RORC2 fue anulado de forma dependiente de la dosis (Figura 2D).
Efectos de ASO en células Th17 humanas primarias
La siguiente etapa de la eficacia de eliminación se realizó en células Th17 humanas polarizadas. Las células Th17 se generaron a partir de sangre de donantes humanos según Acosta-Rodriguez et al. (Nat Immunol 2007). Durante el procedimiento de polarización, las células T humanas se trataron con oligonucleótidos. La lectura principal fue la eliminación de RORC2 seguida de sus efectos posteriores: producción de citocinas IL17A/F, IL22.
La presencia de ASO durante la polarización redujo la expresión de ARNm de RORC2 en al menos un 50 %. Además, se observó una reducción de la secreción de citocinas de IL17A/F e IL22 en los grupos tratados con ASO específicos de RORC2 (Figura 2E/F).
ASO específicos de RORC2 en modelo de ratón con colitis inducida por TNBS
Para validar los efectos de la eliminación de RORC2 en un modelo de enfermedad relevante de Th17, se trataron ratones con 1 mg/kg (i.r.) de ASO específicos de RORC2 (A01010HM, A01018HM) o control negativo (neg1). Los ratones fueron tratados dos veces antes y dos veces durante el desafío inductor de colitis y la exacerbación de la enfermedad. Al final del experimento de diez días, se midieron la eliminación de RORC2, la puntuación de inflamación y la expresión de mieloperoxidasa en el colon. Tanto A01010HM como A01018HM reducen la expresión de RORC2 en el colon y la inflamación general (prueba de luminol) (Figura 2G/H). La puntuación de inflamación representa cambios generales en los parámetros del intestino mucocutáneo y se reduce en presencia de ASO específicos de RORC2 (Figura 2H). Además, la expresión de mieloperoxidasa proinflamatoria en todo el colon se reduce con la eliminación de RORC2 (Figura 2I). En conjunto, los ASO presentados tienen una potente eficacia de eliminación in vivo y contrarrestan la inflamación en el modelo de colitis inducida por TNBS.
Ejemplo 3: optimización hit-to-lead de oligonucleótidos antisentido específicos de RORC2
Los oligonucleótidos antisentido identificados inicialmente con la eficacia de desactivación más alta se unen en el sitio de unión exón-exón único generado exclusivamente en la secuencia de ARNm empalmado con RORC2. Los ASO recientemente diseñados y seleccionados también se unen a la secuencia única de RORC2. Esta secuencia única de RORC2 es (5'-3', ARNm):
AAGGCTCAGTCATGAGAACACAAATTGAAGTGATCC
El cribado de dosis única de oligonucleótidos antisentido en células HDLM2 dio como resultado varias moléculas muy activas. Los niveles de ARNm de RORC2 y HPRT1 se determinaron mediante un ensayo de ADNb. Los niveles de ARNm de RORC2 se normalizaron a los niveles de HPRT1 (gen de mantenimiento) y se relacionaron con el control no tratado (Figura 4). Los valores medios de la expresión de ARNm de RORC2 después de la normalización se enumeran para cada oligonucleótido en la tabla 4. Se usó A01018HM (el oligonucleótido antisentido más eficaz de los cribados iniciales) como control interno.
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Tabla 5: Nos ID de la secuencia:
Figure imgf000016_0001
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Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un oligonucleótido que consiste en 15 a 21 nucleótidos, más particularmente desde 15 a 20 nucleótidos, en el que la secuencia de dicho oligionucleótido comprende la secuencia GTGTTC, que es complementaria a las posiciones 146 a 151 de la secuencia codificante del ácido nucleico de RORC2 de SEQ ID NO. 1, en el que dicho oligionucleótido inhibe la expresión de RORC2, y en el que el oligonucleótido consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.2), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*+A*+C*+T (SEQ ID NO.3), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*+G*+A*+C (SEQ ID NO.4), A*+C*T*+T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.6), C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.7), T*+C*A*+A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.8), G*+T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*+C*T*+G (SEQ ID NO.9), A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*+G*+A*+C (SEQ ID NO. 10), T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*A*+T (SEQ ID NO.11), T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.23), G*+T*+G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*T*+G*+A*+G (SEQ ID NO.24), G*+T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.25), T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.26), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.53), T*+T*+G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.54), A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.55), T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*+C*+T*+C (SEQ ID NO.56), C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*+C*+T*+C (SEQ ID NO.57), T*+G*+A*G*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (s EQ ID NO.58), T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.59), T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*T*+C*+A*+T (SEQ ID NO.60), T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.61) y A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*+A*+C*+T (SEQ ID NO.62); particularmente del grupo que consiste en T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.2), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*+A*+C*+T (SEQ ID NO.3), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*+G*+A*+C (SEQ ID NO.4), A*+C*T*+T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.6), C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.7), T*+C*A*+A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.8), G*+T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*+C*T*+G (SEQ ID NO.9), T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*C*+T*+C*+A (SEQ ID NO.23) T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.53) T*+T*+G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.54) A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.55) T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*+C*+T*+C (SEQ ID NO.56) C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*T*+C*+T*+C (SEQ ID NO.57) T*+G*+A*G*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.58), y T*+C*+A*C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.59); más particularmente del grupo que consiste en T*+T*+C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.2), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*+A*+C*+T (SEQ ID NO.3), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*+G*+A*+C (SEQ ID NO.4), A*+C*T*+T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*T*+T*+C*+T (SEQ ID NO.6), C*+A*+C*T*T*C*A*A*T*T*T*G*T*G*+T*+T*+C (SEQ ID NO.7), T*+T*+T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.53), T*+T*+G*T*G*T*T*G*T*G*A*T*G*A*G*+T*+G*+A (SEQ ID NO.54), y A*+T*+T*T*G*T*G*T*T*C*T*C*A*T*G*A*C*+T*+G*+A (SEQ ID NO.55), en las que indica una modificación de LNA y * un fosforotioato, en la que opcionalmente uno o más de los fosforotioatos se reemplazan independientemente por un fosfato no modificado o un fosfato modificado distinto de un fosforotioato, particularmente un metilfosfonato.
2. Composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido según la reivindicación 1.
3. El oligonucleótido según la reivindicación 1 o la composición farmacéutica según la reivindicación 2 para su uso en un método de prevención y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado de la lista de: una enfermedad inflamatoria aguda, una enfermedad inflamatoria crónica, una enfermedad neurodegenerativa, un tumor maligno y un tumor benigno.
4. El oligonucleótido o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, en el que la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en: psoriasis, artritis reumatoide (RA), espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple (MS), lupus eritematoso sistémico (s Le ), enfermedad de Behcet, uveítis, síndrome de Sjogren, una enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), dolor neuropático, dermatitis atópica y alergia.
5. El oligonucleótido o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, en la que el tumor se selecciona del grupo que consiste en tumores sólidos, tumores de origen sanguíneo, leucemias, metástasis tumorales, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, granulomas piógenos, psoriasis, astrocitoma, neuroma acústico, blastoma, tumor de Ewing, craneofaringioma, ependimoma, meduloblastoma, glioma, hemangioblastoma, linfoma de Hodgkin, meduloblastoma, leucemia, mesotelioma, neuroblastoma, neurofibroma, linfoma no Hodgkin, pinealoma, retinoblastoma, sarcoma, seminoma, tracoma, y tumor de Wilms, o se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de vías biliares, carcinoma de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, carcinoma de riñón, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, carcinoma de coroides, cistadenocarcinoma, carcinoma embrionario, carcinoma epitelial, cáncer de esófago, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, carcinoma de hígado, carcinoma de pulmón, carcinoma medular, cáncer de cuello, carcinoma broncogénico de células no pequeñas/de pulmón, cáncer de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cáncer de próstata, carcinoma de intestino delgado, carcinoma de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales, retinoblastoma, cáncer de piel, carcinoma de pulmón/broncogénico de células pequeñas, carcinoma de células escamosas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma testicular, y cáncer de útero.
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