ES2895628T3 - Inhibidores de GSK3B en el tratamiento de trastornos de hipopigmentación - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de GSK3B para su uso en el tratamiento del vitíligo en un sujeto que presenta lesión de vitíligo despigmentada resistente a fototerapia.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de GSK3B en el tratamiento de trastornos de hipopigmentación

Sector de la técnica

La presente divulgación se refiere a la identificación de la glucógeno sintasa cinasa 3 beta (GSK3B o GSK-3p) como diana terapéutica de trastornos de pigmentación, generalmente de trastornos de hipopigmentación y como biomarcador del estado de la pigmentación. Además, se refiere a las correspondientes aplicaciones diagnósticas y terapéuticas, así como a aplicaciones de gestión de enfermedades. La divulgación se refiere, en particular, a productos y métodos para tratar un trastorno de pigmentación, generalmente un trastorno de hipopigmentación tal como vitíligo. La divulgación también se refiere a productos y a métodos para detectar, diagnosticar, estadificar o hacer un seguimiento de la evolución del trastorno de pigmentación, generalmente un trastorno de hipopigmentación tal como vitíligo, y es particularmente adecuada para sujetos humanos. La divulgación también se refiere a reactivos de unión específicos de GSK3B, a composiciones y dispositivos que la contienen, así como a sus usos para la detección, el diagnóstico, la estadificación, el seguimiento, la obtención de imágenes o el tratamiento de trastornos de pigmentación, y también al desarrollo de fármacos. La presente divulgación se refiere más específicamente a la evaluación de un trastorno de pigmentación, generalmente un trastorno de hipopigmentación, utilizando como biomarcador el ADN o el ARNm que codifica la GSK3B o la proteína GSK3B.

Estado de la técnica

Los trastornos de pigmentación son alteraciones del color de la piel humana, ya sea pérdida o reducción (despigmentación o hipopigmentación) que pueden relacionarse con la pérdida de melanocitos o con la incapacidad de estos para producir melanina o transportar melanosomas correctamente, o un aumento (hiperpigmentación) causado por una producción excesiva de melanina por los melanocitos. Los melanocitos se encuentran en la capa inferior (el estrato basal) de la epidermis de la piel, en la capa media del ojo (la úvea), en el oído interno, en las meninges, en los huesos y en el corazón.

El vitíligo es una despigmentación adquirida de la piel que induce una marcada alteración de la calidad de vida de los sujetos afectados. Esta enfermedad se caracteriza por la destrucción de los melanocitos que se produce principalmente en la piel y da como resultado la aparición de máculas blancas bien delimitadas. Existen dos tipos de vitíligo, es decir, vitíligo segmentario, localizado unilateralmente en una zona del rostro, en la parte superior del cuerpo, en las piernas o brazos, que en general no cambia; y vitíligo generalizado, que presenta con mayor o menor frecuencia manchas bilaterales simétricas en zonas de roce o presión repetida y que puede ser cada vez más importante con el paso de los años. El mecanismo fisiopatológico exacto que conduce a la destrucción de los melanocitos sigue siendo impreciso e implica autoinmunidad (Passeron T; Ortonne JP 2005; Spritz 2007).

El vitíligo es común y afecta del 1 % al 2 % de la población general. Para muchos pacientes con vitíligo, la desfiguración provocada por la enfermedad tiene un gran impacto en su calidad de vida (Ongenae K et al. 2006).

Detener la progresión de la enfermedad y repigmentar la piel lesional, representan las dos caras del desafío terapéutico en el vitíligo. Hasta ahora, ninguno de ellas se ha abordado con éxito. El estrés oxidativo y el sistema inmunitario en sujetos genéticamente predispuestos, participan en la compleja fisiopatología del vitíligo.

En la actualidad, existen varias modalidades terapéuticas que se pueden proponer para el tratamiento del vitíligo. Tratamientos tales como UVB de banda estrecha (Nb-UVB, del inglés narrow-band UVB), luz excimer, esteroides tópicos, tacrolimus o pimecrolimus tópicos y las estrategias combinadas (con fototerapia y esteroides tópicos o inhibidores de la calcineurina), pueden proporcionar una repigmentación cosméticamente aceptable (>75 %) [Lepe, 2003; Ostovari, 2004; Passeron, 2004; Taieb, 2013]. Lamentablemente, la repigmentación, que consiste en la diferenciación y proliferación de nuevos melanocitos en la piel con vitíligo, sigue siendo difícil de lograr en la mayoría de los casos. Algunas localizaciones, como las manos y los pies, son casi imposibles de repigmentar completamente con las estrategias actuales. Además, sigue siendo muy difícil comparar la eficacia de las diferentes modalidades de tratamiento y de los resultados de diferentes estudios sobre el mismo tratamiento porque: (i) la mayoría de los estudios publicados no están controlados; y (ii) no existe una herramienta biométrica generalmente aceptada para evaluar la gravedad de la enfermedad y la respuesta al tratamiento. Recientemente, los modelos animales que utilizan linfocitos T reactivos contra antígenos melanocíticos proporcionaron datos interesantes sobre la reacción inmunitaria posiblemente implicada en la despigmentación de la piel con vitíligo, pero este modelo no está adaptado para estudiar los mecanismos de diferenciación y repigmentación de los melanocitos en la piel con vitíligo [Mosenson, 2013] [Rashighi, 2014].

Ante la limitación de las terapias y la falta de información sobre la fisiopatología de los trastornos de hipopigmentación como el vitíligo, existe una clara necesidad de identificar nuevos marcadores farmacológicos que permitan su correcto y temprano diagnóstico, así como su adecuada gestión, y de nuevas dianas terapéuticas que permitan su prevención, atenuación o tratamiento.

Objeto de la invención

Sorprendentemente, los inventores demuestran en el presente documento, por primera vez, que la inhibición de la glucógeno sintasa cinasa 3 beta (GSK3B o GSK-3p) permite la repigmentación de las lesiones cutáneas despigmentadas, en particular de las lesiones de vitÍligo.

La invención se define en las reivindicaciones.

Por tanto, un primer objeto de la invención se refiere a un inhibidor de GSK3B para su uso en el tratamiento de una lesión de vitÍligo resistente a la fototerapia.

Descripción detallada de la invención

Un desafío en el tratamiento de los trastornos de la pigmentación, es la falta de moléculas eficaces que permitan una diferenciación y proliferación eficaces de nuevos melanocitos en la zona de la piel (incluidas las manos y los pies) despigmentada, generalmente en lesiones de vitÍligo, de un sujeto.

Otro desafío es la falta de detección precoz y presintomática ya que los síntomas visibles de los trastornos suelen presentarse en estadios avanzados.

En el presente documento, los inventores describen una nueva diana terapéutica, la glucógeno sintasa cinasa 3 beta (GSK3B o GSK-3p), para su uso en el tratamiento de un trastorno de hipopigmentación como el vitÍligo. La GSKB3 también puede utilizarse como biomarcador, ya que permite la detección y estadificación específica, fiable y sensible de trastornos de pigmentación, en particular en sujetos humanos (también identificados en el presente documento como individuos humanos o pacientes humanos).

La enzima GSK3 actúa como mediadora en la adición de moléculas de fosfato a los restos de aminoácido serina y treonina. Descubierta por primera vez en 1980 como cinasa reguladora por su homónima, la glucógeno sintasa, la GSK-3 se ha identificado desde entonces como una cinasa para más de cuarenta proteínas diferentes en una variedad de vías diferentes. En los mamíferos, la GSK-3 está codificada por dos genes conocidos, GSK-3 alfa (GSK3A) y GSK-3 beta (GSK3B). La GSK-3 ha sido recientemente objeto de muchas investigaciones porque ha estado implicada en diversas enfermedades, incluida la diabetes de tipo II (diabetes mellitus de tipo 2), enfermedad de Alzheimer, inflamación, cáncer y trastorno bipolar.

Para los fines de la presente divulgación, el término "marcador" o "biomarcador" designa un marcador biológico asociado a la ausencia, presencia o estadio de un estado patológico o fisiológico particular. Los marcadores biológicos son en particular proteínas, ARNm o ADN.

A menos que se especifique de otro modo, GSK3B designa el gen GSK3B, el ARNm de GSK3B o la proteína GSK3B así como cualquier fragmento de los mismos. Como ejemplos específicos de proteína GSK3B según la divulgación se incluyen la proteína GSK3B de longitud completa y cualquier fragmento de la misma.

Los inventores realizaron un análisis transcriptómico y proteómico en piel lesional, perilesional y no despigmentada de pacientes con vitíligo en comparación con controles de piel correspondientes de sujetos sanos. Sus resultados muestran que la vía WNT/p-catenina, implicada en la diferenciación de los melanocitos, se altera en la piel con vitíligo. Demostraron que el estrés oxidativo disminuye la expresión/activación de WNT en queratinocitos y melanocitos. Desarrollaron un modelo de piel ex vivo que permanece funcional hasta 15 días y, gracias a dicho modelo, confirmaron la disminución de la activación de la vía WNT en piel humana sometida a estrés oxidativo. Por último, utilizando agentes farmacológicos que activan la vía WNT y agentes farmacológicos que inhiben GSK3B, trataron pieles despigmentadas ex vivo de pacientes con vitíligo e indujeron con éxito la diferenciación de las células madre residentes en premelanocitos, lo que permitió la repigmentación de las lesiones de vitíligo, incluso en zonas como manos y pies.

La divulgación proporciona ahora una nueva diana terapéutica, así como un biomarcador, GSK3B, para aplicaciones clínicas, generalmente para evaluar el estado de pigmentación, en particular, para la detección, el diagnóstico, el tratamiento, el seguimiento y la gestión de pacientes con trastorno de hipopigmentación.

En el presente documento se describe un inhibidor (antagonista) de GSK3B para su uso en el tratamiento de un trastorno de hipopigmentación, en particular vitíligo, en un sujeto. Este inhibidor se usa generalmente para repigmentar una lesión de hipopigmentación, en particular una lesión de vitíligo, por ejemplo, una lesión de vitíligo localizada en zonas como manos y pies.

También se describe el uso de un inhibidor de GSK3B para la preparación de una composición para el tratamiento de un trastorno de hipopigmentación como el vitíligo, incluso en zonas como manos y pies.

Dicho inhibidor (antagonista) de GSK3B puede seleccionarse de cloruro de litio (LiCl), CHIR99021, SKL9001, SB216763, SB415286 y (2'Z,3'E)-6-bromoindirrubin-3-oxima (BIO), preferentemente de LiCl y CHIR99021. Un inhibidor de GSK3B preferido es LiCl.

En el presente documento también se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un inhibidor de GSK3B como se describe en el presente documento. Dicha composición puede formularse en una forma de dosificación adecuada utilizando tecnología bien conocida por los expertos en la técnica. La composición farmacéutica puede comprender un excipiente, vehículo o transportador farmacéuticamente aceptable como los que se emplean generalmente en la técnica de la fabricación de fármacos. Por ejemplo, el transportador farmacéuticamente aceptable puede incluir uno o más de los siguientes agentes: disolventes tales como aceite de oliva, aceite de oliva refinado, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de semilla de girasol, aceite de cacahuete, aceite de germen de trigo, aceite de soja, aceite de jojoba, aceite de onagra, aceite de coco, aceite de palma, aceite de almendras dulces, aceite de aloe, aceite de hueso de albaricoque, aceite de aguacate, aceite de borraja, aceite de semilla de cáñamo, aceite de nuez de macadamia, aceite de rosa mosqueta, aceite de pacana, aceite de avellanas, aceite de sasanqua, aceite de salvado de arroz, manteca de karité, aceite de maíz, aceite de camelia, aceite de semilla de uva, aceite de canola, aceite de ricino, y combinaciones de los mismos, preferentemente aceite de oliva refinado, emulsionantes, agentes de suspensión, descomponedores, agentes aglutinantes, excipientes, agentes estabilizantes, agentes quelantes, diluyentes, agentes gelificantes, agentes espesantes tales como cera de abejas y/o vaselina, conservantes, lubricantes, agentes retardantes de la absorción, liposomas, antioxidantes tales como butilhidroxitolueno o butilhidroxianisol y similares. Preferentemente, la composición farmacéutica se formula en una formulación tópica que se puede aplicar directamente a la piel, por ejemplo, una piel con vitíligo. La formulación tópica adecuada para la composición farmacéutica puede ser una emulsión, un gel, una pomada, una crema, un parche, un linimento, un aerosol, una pulverización, una loción, un suero, una pasta, una espuma o una gota. En una realización de esta solicitud, la composición farmacéutica se formula en una preparación externa mezclando el extracto de acuerdo con la presente solicitud con una base tal como las que se conocen bien y se usan comúnmente en la técnica.

En algunos aspectos, la dosificación y la frecuencia de administración de la composición farmacéutica de acuerdo con la solicitud descrita en el presente documento pueden variar dependiendo de los siguientes factores: la gravedad de la enfermedad a tratar, el peso, la edad, el estado físico y la respuesta del sujeto a tratar. En aspectos ulteriores o adicionales, la cantidad de principio(s) activo(s), normalmente inhibidor(es) de GSK3B, en la composición farmacéutica, está en el intervalo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal/día, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 500, 300 o 100 mg/kg de peso corporal/día.

Dentro del contexto de la divulgación, el uso de GSK3B para la detección, el diagnóstico, la estadificación o la gestión (generalmente el seguimiento de la evolución del trastorno de pigmentación) de trastornos de pigmentación, incluye, sin limitación, el uso de la proteína (en cualquier forma, soluble o no, de longitud completa o no), o de cualquier ácido nucleico codificante, como biomarcador. Esto incluye, por ejemplo, el uso de cualquier reactivo para detectar o cuantificar (i) la proteína o cualquier variante o mutante de la misma, tales como variantes de corte y empalme o polimorfismos, y/o (ii) cualquier ácido nucleico que codifique dichas proteínas, tal como ADN o ARN, estando correlacionados dichos niveles de proteína y/o ácido nucleico con el trastorno de pigmentación. El término también incluye cualquier medida del nivel de expresión de la proteína citada y una comparación del nivel medido con un valor medio o de referencia. La cantidad o nivel o información medidos proporciona una indicación con respecto al trastorno de pigmentación especificado en el sujeto.

Un objeto específico de la divulgación se refiere a un método para la detección, el diagnóstico o la estadificación in vitro o ex vivo de un trastorno de hipopigmentación en un sujeto que se sospecha que padece un trastorno de hipopigmentación, que comprende analizar la expresión de GSK3B en una muestra biológica del sujeto, proporcionando dicho análisis información sobre la presencia o estadio de un trastorno de hipopigmentación en el sujeto.

Otro objeto de la divulgación se refiere a un método para la detección o diagnóstico in vitro o ex vivo de un trastorno de hipopigmentación, que comprende las siguientes etapas de:

a) analizar la expresión de GSK3B en una muestra biológica de un sujeto que se sospecha que padece un trastorno de hipopigmentación,

b) analizar la expresión de GSK3B en una muestra biológica de un sujeto sano,

c) comparar las expresiones de GSK3B analizadas en las etapas a) y b),

siendo una expresión de GSK3B en la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece un trastorno de pigmentación superior a la expresión de GSK3B en la muestra biológica del sujeto sano, un indicador de la presencia de un trastorno de hipopigmentación en el sujeto que se sospecha que padece un trastorno de hipopigmentación, detectando o diagnosticando así el trastorno de pigmentación.

En el contexto de la divulgación, el sujeto es un animal, generalmente un mamífero, preferentemente un ser humano cualquiera que sea su edad o sexo. La muestra biológica suele ser una muestra de tejido, preferentemente una muestra de piel, tal como una biopsia, tomada de un sujeto. El tamaño de la biopsia puede variar y preferentemente tiene un diámetro de 1 a 6 mm.

Según un aspecto particular y preferido, la muestra es una muestra de piel extraída con tira adhesiva, tal como D-Squames, según el método descrito en Wong R et al., "Analysis of RNA recovery and gene expression in the epidermis using non-invasive tape stripping"; J Dermatol Sci.2006 Nov; 44(2):81-92; o en Benson NR, et al., "An analysis of select pathogenic messages in lesional and non-lesional psoriatic skin using non-invasive tape harvesting". J Invest Dermatol. Octubre de 2006; 126(10): 2234-41; o bien en Wong R et al., "Use of RT-PCR and DNA microarrays to characterize RNA recovered by non-invasive tape harvesting of normal and inflamed skin". J Invest Dermatol. Julio de 2004; 123(1):159-67. De acuerdo con el principio de extracción con tira adhesiva, el producto utilizado comprende un soporte polimérico translúcido flexible y un adhesivo. El producto se aplica repetidamente a la piel del paciente, preferentemente hasta perder la adherencia. La muestra obtenida se refiere únicamente al contenido de las capas más externas de la epidermis.

El análisis generalmente comprende determinar la presencia, la ausencia o la cantidad de GSK3B, siendo ausencia de GSK3B o una expresión de la misma inferior a una cantidad de referencia, indicativa de la presencia o del estadio de un trastorno de hipopigmentación en el sujeto.

El análisis o la detección de la expresión puede realizarse mediante cualquiera de los métodos adecuados, conocidos por los expertos en la técnica, tales como transferencia Western, IHQ, espectrometría de masas (análisis Maldi-TOF y LC/MS), radioinmunoensayo (RIA), ELISA o cualquier otro método conocido por los expertos en la técnica o también analizando el ARNm de acuerdo con los métodos habitualmente conocidos por los expertos en la materia. Las técnicas basadas en la hibridación de ARNm con sondas de nucleótidos específicas son las más habituales [hibridación in situ, FISH (forma siglada de fluorescence in situ hybridization, hibridación fluorescente in situ), transferencia Northern, RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa), RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR), protección con RNasa].

En la solicitud de patente WO2009/068825 (Galderma R&D) se describe un método para analizar un contenido de proteína obtenido en particular de acuerdo con el método de muestreo descrito anteriormente en el presente documento. Dado que este método es rápido, no invasivo y relativamente económico, es particularmente preferido. La cuantificación se realiza en la muestra de piel obtenida en el soporte flexible y adhesivo para detectar la proteína GSK3B cuya presencia, ausencia o variación de la cantidad o de la concentración con respecto a un valor estándar se asocia a la presencia, a la progresión o a la ausencia del trastorno de pigmentación (posiblemente sospechoso).

En un aspecto particular, analizar GSK3B comprende poner en contacto una muestra biológica, o una parte alícuota de la misma, con un reactivo de unión específico que se une a un ácido nucleico o a una proteína de GSK3B y determinar la presencia o la cantidad de ácido nucleico o de proteína de GSK3B unida a dicho reactivo de unión.

La unión selectiva o específica indica que la unión a otra molécula puede discriminarse de (por ejemplo, se produce con mayor afinidad o avidez que) la unión específica al biomarcador diana. Los reactivos preferidos no se unen, en condiciones selectivas, a ninguna otra proteína de la sangre humana no relacionada, sino a la proteína de referencia. La unión de un reactivo a una molécula de referencia, puede analizarse de acuerdo con métodos bien conocidos por el experto.

El reactivo de unión es generalmente un ligando específico seleccionado de un ácido nucleico complementario, un anticuerpo, un aptámero y un fragmento o derivado de los mismos.

En un aspecto particular, el reactivo de unión es un anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal, más preferentemente monoclonal. Puede ser de varias clases (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, etc.). El anticuerpo puede ser de origen animal variado, o humano o sintético o recombinante. Además, el término anticuerpo también incluye fragmentos y sus derivados, en particular fragmentos y derivados de dichos anticuerpos monoclonales o policlonales que tienen sustancialmente la misma especificidad antigénica. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, por ejemplo, Fab, Fab'2, las CDR, etc. Los derivados incluyen anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos polifuncionales, anticuerpos monocatenarios (scFv, single chain antibodies), etc. Estos pueden producirse de acuerdo con métodos convencionales, incluyendo la inmunización de un animal y la recogida de suero (policlonal) o de esplenocitos (para producir hibridomas por fusión con líneas celulares apropiadas). El experto conoce bien métodos de producción de anticuerpos policlonales de varias especies. incluyendo ratones, roedores, primates, caballos, cerdos, conejos, aves de corral, etc. En resumen, el antígeno se combina con un adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freud) y se administra a un animal, generalmente mediante inyección subcutánea. Se pueden realizar inyecciones repetidas. Se extraen muestras de sangre y se separan las inmunoglobulinas o el suero.

Se pueden encontrar métodos para producir anticuerpos monoclonales de varias especies como se enumeran anteriormente, por ejemplo, en Harlow et al. (Anticuerpos: A laboratory Manual, CSH Press, 1988) o en Kohler et al. (Nature 256 (1975) 495). En resumen, estos métodos comprenden inmunizar a un animal con el antígeno, seguido de la recuperación de esplenocitos que después se fusionan con células inmortalizadas, tales como células de mieloma. Los hibridomas resultantes producen los anticuerpos monoclonales y pueden seleccionarse mediante diluciones limitantes para aislar clones individuales. Los anticuerpos también pueden producirse seleccionando bibliotecas combinatorias de inmunoglobulinas, como se desvela, por ejemplo, en Ward et al. (Nature 341 (1989) 544).

Los anticuerpos recombinantes, o sus fragmentos o derivados, pueden producirse mediante métodos de por sí conocidos en la técnica, por ejemplo, por recombinación en una célula hospedadora, transformada con uno o más vectores que permiten la expresión y/o secreción de las secuencias de nucleótidos que codifican la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo. El vector generalmente contiene un promotor, señales de inicio y terminación de la traducción, y regiones reguladoras transcripcionales adecuadas. Se mantiene estable en la célula hospedadora y, opcionalmente, puede poseer señales específicas para la secreción de la proteína traducida. Estos diferentes componentes son seleccionados y optimizados por un experto en la técnica de acuerdo con la célula hospedadora utilizada.

En un aspecto, el anticuerpo anti GSK3B, fragmento o derivado del mismo, es un anticuerpo, fragmento o derivado del mismo, que se une a la GSK3B humana o a un fragmento de la misma (tal como un péptido o epítopo). Los anticuerpos monoclonales son ejemplos particulares de dichos anticuerpos.

Pueden encontrarse o generarse anticuerpos contra una proteína GSK3B y usarse en la presente divulgación. Sin embargo, cabe señalar que se prefiere particularmente el uso de anticuerpos que se unen a un epítopo de GSK3B en donde dicha unión está al menos parcialmente desplazada por una proteína GSK3B humana, así como un fragmento o derivado de dicho anticuerpo que tiene la misma especificidad antigénica.

Para su uso en la divulgación, los anticuerpos pueden acoplarse a restos heterólogos, tales como marcadores, etiquetas, enlazadores, etc., generalmente a un resto detectable.

La divulgación también se refiere a kits o dispositivos adecuados para implementar los métodos anteriores.

Un dispositivo clásico comprende al menos un reactivo específico, generalmente al menos un ácido nucleico complementario, un anticuerpo, fragmento o derivado de los mismos, que se une a un ácido nucleico o a una proteína GSK3B, estando dicho reactivo específico inmovilizado en un soporte. Preferentemente, el soporte es una membrana, un portaobjetos, una micromatriz, un chip o una microperla.

Un kit particular comprende un dispositivo como se describe en el presente documento y al menos un reactivo para realizar, detectar o cuantificar una reacción inmunitaria, en particular, un complejo de anticuerpo-antígeno.

Otro objeto de la divulgación se refiere a un método de seguimiento in vitro o ex vivo de la evolución de un trastorno de hipopigmentación que afecta a un sujeto, en donde el método comprende una etapa de comparar la expresión de GSK3B en una primera muestra biológica tomada de un sujeto en t0 con la expresión de GSK3B en una segunda muestra biológica tomada de dicho sujeto en t1, siendo t1 posterior a t0, un aumento de la expresión de GSK3B en la muestra tomada en t1 es un indicador de la progresión del trastorno de hipopigmentación en dicho sujeto y una disminución de la expresión de GSK3B en la muestra tomada en t1 es un indicador de la regresión del trastorno de hipopigmentación en dicho tema.

Otro objeto de la divulgación se refiere a un método de seguimiento in vitro o ex vivo de la eficacia de un fármaco o de una composición para tratar un trastorno de hipopigmentación, que comprende comparar la expresión de GSK3B en una primera muestra biológica de un sujeto identificado como que tiene uno o más de los síntomas de un trastorno de hipopigmentación antes de cualquier tratamiento del trastorno de hipopigmentación, con la expresión de GSK3B en una segunda muestra biológica del mismo sujeto que se ha expuesto a un fármaco o a una composición para tratar un trastorno de pigmentación, siendo una disminución en la expresión de GSK3B en la segunda muestra biológica, un indicador de la eficacia del fármaco o de la composición para tratar el trastorno de hipopigmentación, y siendo un aumento o una ausencia de modulación en la expresión de GSK3B en la segunda muestra biológica, un indicador de ineficacia del fármaco o de la composición para tratar el trastorno de hipopigmentación.

En el presente documento también se describe un método de exploración in vitro o ex vivo de un modulador de GSK3B, que comprende determinar la capacidad de un posible fármaco para disminuir o suprimir, o por el contrario para activar o estimular, la expresión de GSK3B y/o la función biológica de GSK3B, y, si se confirma la capacidad, la identificación del posible fármaco como inhibidor (antagonista) de GSK3B o, por el contrario, como activador (agonista) de GSK3B.

Otro método de exploración in vitro o ex vivo de moduladores de GSK3B, preferentemente inhibidores, comprende las siguientes etapas de:

a) poner en contacto una muestra biológica que presente una lesión de trastorno de hipopigmentación, una muestra biológica que presente el estado de salud, o una mezcla de dichas muestras, con uno o más posibles fármacos que se van a analizar;

b) detectar la expresión y/o función biológica de GSK3B en las muestras biológicas o en la mezcla de muestras de la etapa a) y comparar dicha expresión o función biológica con la expresión o función biológica de GSK3B en una muestra que no se haya puesto en contacto con el uno o más posibles fármacos;

c) seleccionar, como moduladores de GSK3B, posibles fármacos que disminuyan o supriman (inhibidores), o por el contrario, que activen o estimulen (activadores), la expresión y/o función biológica de GSK3B medida en las muestras o mezclas obtenidas al final de la etapa a).

El modulador identificado influirá en la función biológica de GSK3B o en un proceso biológico modulado por este marcador. Con fines de exploración, las muestras biológicas consisten ventajosamente en células transfectadas que contienen genes indicadores que operan bajo el control de un promotor que controla (total o parcialmente) la expresión del gen GSK3B. Como alternativa, el promotor puede, al menos en parte, ensamblarse sintéticamente y contener elementos que respondan a GSK3B. La capacidad de un compuesto para modular la función de GSK3B, se evalúa analizando la expresión del gen indicador.

Las células transfectadas pueden además modificarse por ingeniería genética para expresar la proteína GSK3B. El gen indicador puede codificar una enzima que, con su correspondiente sustrato, proporcione uno o más productos con color, tales como CAT (cloranfenicol acetiltransferasa), GAL (beta galactosidasa) o GUS (beta glucuronidasa). Puede ser luciferasa o GFP (Green Fluorescent Protein, proteína verde fluorescente). La dosis de proteína del gen indicador o su actividad se evalúa generalmente mediante métodos colorimétricos, fluorométricos o quimioluminiscentes.

El modulador seleccionado, preferentemente inhibidor o antagonista, puede ser un polipéptido, un ADN, un ARN o un PNA ("ácido peptidonucleico", es decir, una estructura similar al ADN con una cadena polipeptídica sustituida por bases de purina y pirimidina). Ventajosamente, el modulador se administra a un paciente en una cantidad suficiente para medir una concentración plasmática que es de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, preferentemente de aproximadamente 1 |jg/ml a aproximadamente 5 |jg/ml.

Otras características y ventajas de la divulgación se indican más adelante en el siguiente apartado experimental (con referencia a las figuras 1-11), que debe considerarse ilustrativo y no limitativo del alcance de la presente solicitud.

Descripción de las figuras

Figura 1. El análisis transcriptómico de pacientes con vitÍligo pone de manifiesto la desaparición de los melanocitos y la implicación de la vía de señalización WNT sin indicios de activación del sistema inmunitario.

(A) Histograma de genes diferencialmente expresados que muestra que el 95 % de los transcritos regulados al alza en la piel lesional con vitíligo, tiene una diferencia inferior al doble en la expresión génica en comparación con la piel sana.

(B) Vías canónicas basadas en Ingenuity enriquecidas en piel lesional con vitíligo.

(C) Análisis de grupos de datos de micromatriz de piel sana (PS), no lesional (NLS), perilesional (PLS) y lesional (LS) de sujetos con vitíligo. En este análisis se incluyeron todos los genes modulados significativamente (|FC| < 1,5 P <0,05).

Figura 2. Análisis basado en IPA (Ingenuity Patway Análisis) de la implicación de las rutas WNT y MITF en piel lesional con vitíligo. Una red transcripcional que relaciona las vías de señalización de Wnt y de la melanogénesis. La piel lesional con vitíligo se caracteriza tanto por una expresión regulada a la baja del transductor clave de la vía de señalización de Wnt (por ejemplo, LEF1), como por la regulación al alza de reguladores negativos de la vía de señalización de Wnt, tales como p53 y TLE4 (miembro de la familia groucho) y ZBTB33/Kaiso (implicado en la represión transcripcional de genes wnt diana)

LEF1/bCatenina regula la melanogénesis a través de la inducción transcripcional SOX10 que a su vez regula la expresión de EDNRB, PCSK2 y PLP1. LEF1/bCatenina también dirige la transcripción de MITF que regula la melanogénesis a nivel transcripcional. LEF1/bCatenina también está relacionado con la melanogénesis a través del gen que codifica IRF4. Se ha demostrado que este factor de transcripción, cuya función aún no está clara en los melanocitos, coopera con MITF.

Figura 3. Validación mediante qRT-PCR de la pérdida de expresión génica melanocítica: la piel lesional con vitíligo muestra una pérdida completa de expresión de genes implicados en la diferenciación terminal de melanocitos y en la expresión residual de factores de transcripción melanogénicos clave o genes que codifican moléculas de adhesión (A).

La expresión génica se midió mediante qRT-PCR y se calculó para el análisis de grupos, es decir, el grupo NLS (piel no lesional) o PLS (piel perilesional) o LS (piel lesional) en comparación con el grupo PS (piel sana) utilizando un modelo lineal T-TEST sin emparejamiento. Los genes modulados se consideraron significativamente modulados si el factor de cambio era > 1,8 y el valor de FDR era <0,05.

El eje y muestra el factor de cambio de expresión en relación con el grupo de piel sana. Los datos se normalizaron en relación con HPRT, ACTB y GAPDH. Las barras de error muestran el error estándar de tres repeticiones. * = p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001; **** = p<0,0001; ***** = p<0,00001. El conjunto de validación de t Ld A (Targeted Taqman Low DensityArray, matrices Taqman de baja densidad) abarcó tanto genes relacionados con marcadores de diferenciación terminal (PMEL, MLANA, TYRP1, DCT) como factores de transcripción implicados en la melanogénesis (MITF, FOXD3, KIT, NANOG) y moléculas de adhesión (PLXNC1, PCDH11X, CDH2 y L1CAM).

Validación del ARNm de LEF1 (B) y del ARNm de CXCL10 (C) mediante qRT-PCR: El ARNm de LEF1 se reduce de forma selectiva en muestras de piel lesional mientras que el de CXCL10 se regula al alza en biopsias de piel no lesional y perilesional en comparación con la piel sana.

La expresión génica se midió mediante qRT-PCR y se calculó para el análisis de grupos, es decir, grupo NLS o PLS o LS en comparación con el grupo PS (piel sana) utilizando un modelo lineal T-TEST sin emparejamiento. Los genes modulados se consideraron significativamente modulados si el factor de cambio era > 1,8 y el valor de FDR era <0,05. El eje y muestra el factor de cambio de expresión en relación con el grupo de piel sana. Los datos se normalizaron en relación con HPRT, ACTB y GAPDH. Las barras de error muestran el error estándar de tres repeticiones. * = p <0,05 ** = p<0,005

Figura 4: El estrés oxidativo disminuye la vía WNT en la piel.

MHN(A) y QHN (B) y piel entera en cultivo ex vivo (C), se estimularon durante 24 horas con 25 a 100 jM de H²O². Después de la extracción de ARNm, se realizó una transcripción inversa y se analizó la expresión génica relativa de LEF1 con qPCR.

Figura 5: Desarrollo de un modelo de piel ex vivo para estudiar piel con vitíligo.

(A) Se obtuvieron biopsias de piel de 6 mm de cirugía de abdominoplastia y se colocaron en una cámara transwell para permitir un entorno de cultivo semilíquido. La piel se estimuló con 20 jM a 1 mM de forskolina añadida en el medio de cultivo cada dos días durante 4 a 15 días. Después de 4, 11 y 15 días, la morfología de la piel se observó al microscopio con una tinción de Hematoxilina y Eosina (X20).

(B) La capacidad de la piel para responder a los estímulos melanogénicos se evaluó utilizando tratamiento con forskolina. El ARNm se extrajo de biopsias y se analizó mediante RT-qPCR (PCR cuantitativa en tiempo real) para cuantificar la expresión de los genes melanogénicos: MITF, DCT y tirosinasa.

(C) Después de 11 o 15 días de estimulación con forskolina, se realizó una inmunohistotinción para estudiar la expresión de las proteínas MITF, DCT y tirosinasa.

Figura 6: Los activadores farmacológicos de la vía WNT aumentan la vía WNT en piel con vitÍligo ex vivo e inducen la regulación al alza de los marcadores de melanoblastos.

A los pacientes con vitíligo (n=9) se les realizó una biopsia en la zona de piel lesional. Las biopsias se estimularon en cultivo ex vivo durante 14 días con inhibidor de GSK3p: CHIR99021 (3 j M) o LiCl (20 j M) o con agonista de WNT: SKL2001 (40 j M) cada dos días. Se extrajo ARNm y se realizó una RT-qPCR para cuantificar la expresión relativa de LEF (A) y de los marcadores de premelanocitos PAX3 (B), Brn2 (C) MITF (D) y DCT (E).

Figura 7: El tratamiento de pieles despigmentadas ex vivo de pacientes con vitíligo con activadores farmacológicos de la vía WNT, induce la diferenciación de células madre residentes en premelanocitos. La piel despigmentada de pacientes con vitíligo [A (medio de cultivo de control)], se estimuló en cultivo ex vivo con agonista de WNT SKL2001 (40 j M) (B), inhibidor de GSK3p CHIR99021 (3 j M) (C) o inhibidor de GSK3p LiCl 20 j M (D) cada dos días para activar la vía WNT. Después de 14 días, la respuesta de la piel se analizó mediante inmunohistotinción con marcadores de premelanocitos: una tinción con DCT (color verde) y tinción con PAX3 (color rojo). La colocalización (color amarillo) observada en las imágenes combinadas muestra melanoblastos en diferenciación dentro de la dermis.

Figura 8. Representación esquemática de factores implicados en la patogenia del vitíligo en comparación con piel sana.

En piel sana, la estimulación de la vía WNT por queratinocitos y melanocitos induce la diferenciación y la proliferación de células madre de melanocitos permitiendo el recambio constante de las reservas de melanocitos epidérmicos. En piel con vitíligo, el estrés oxidativo puede desencadenar la reacción inmunitaria en un sujeto genéticamente predispuesto. La destrucción de los melanocitos por parte del sistema inmunitario libera antígenos melanocíticos que estimulan la respuesta autoinmunitaria y, en última instancia, conduce a la desaparición completa de los melanocitos de la epidermis (y, a veces, de los folículos pilosos). Al mismo tiempo, el estrés oxidativo disminuye la actividad de la vía WNT en melanocitos y queratinocitos. Esto induce una diferenciación alterada de las células madre de melanocitos y, por tanto, altera la capacidad de renovación de los mismos. Dependiendo del paciente y de la evolución de la enfermedad, estos dos mecanismos están diferencialmente implicados lo que conduce a la despigmentación activa de la piel y a la resistencia a las estrategias de repigmentación, respectivamente.

Figura 9:

(A) Representación esquemática de una muestra de piel de un paciente con vitíligo: Se tomaron biopsias y extracciones con tira adhesiva de las zonas lesional, perilesional y no lesional. Se obtuvieron muestras correspondientes de una zona del cuerpo similar de voluntarios sanos.

(B) Características de la población estudiada.

Figura 10:

(A) MHN, (B) QHN y (C) piel entera en cultivo ex vivo, se estimularon durante 24 horas con 25 a 100 j M de H²O². Después de la extracción de ARNm, se realizó una transcripción inversa y se analizó la expresión génica relativa de la familia WNT con qPCR.

Figura 11:

A los pacientes con vitíligo (n=9) se les realizó una biopsia en la zona de piel lesional. Las biopsias se estimularon en cultivo ex vivo durante 14 días con inhibidor de GSK3p: CHIR99021 (3 j M) o LiCl (20 j M) o con agonista de WNT: SKL2001 (40 j M) cada dos días. Se extrajo el ARNm y se realizó una RT-qPCR para cuantificar la expresión relativa de la familia WNT.

PARTE EXPERIMENTAL

El vitíligo es una despigmentación adquirida de la piel y, a veces, del folículo piloso, que afecta del 0,5 % al 1 % de la población mundial. Está claramente demostrado que el vitíligo perjudica en gran medida la calidad de vida de las personas afectadas y existe una fuerte demanda terapéutica [Radtke, 2009] [Silverberg, 2013]. La fisiopatología es compleja e implica a muchos actores celulares. Existen pruebas convincentes del papel que desempeñan tanto el estrés oxidativo como el sistema inmunitario en individuos genéticamente predispuestos [Passeron, 2012] [Spritz, 2012; Jin, 2012] [Bellei, 2013] [Schallreuter, 2013]. Uno de los principales problemas del estudio del vitíligo es que las células afectadas, los melanocitos, ya no están presentes en la piel lesional. Además, el aumento de los datos pone en relieve la complejidad de la fisiopatología del vitíligo, con muchos actores celulares implicados, como los queratinocitos, fibroblastos, células madre, junto con varios tipos de células inmunitarias. Por tanto, los cultivos celulares pueden aportar información interesante, pero no pueden tener en cuenta las complejas interacciones que se producen en la piel con vitÍligo. Recientemente, los modelos animales que utilizan linfocitos T reactivos contra antígenos melanocíticos proporcionaron datos muy interesantes sobre la reacción inmunitaria posiblemente implicada en la despigmentación de la piel con vitíligo, pero este modelo no está adaptado para estudiar los mecanismos de diferenciación y repigmentación de los melanocitos en la piel con vitíligo [Mosenson, 2013] [Rashighi, 2014]. Hasta la fecha, no hay ningún tratamiento definitivo para el vitíligo.

Cabe destacar que, en la práctica actual se observa con frecuencia que algunos vitíligos muy activos pueden responder al tratamiento con una repigmentación significativa mientras que la piel circundante continúa despigmentándose. Por el contrario, algunos pacientes con vitíligo muy estable que no han tenido una nueva despigmentación durante años no pueden lograr ninguna repigmentación ni siquiera utilizando estrategias terapéuticas combinadas. Esto sugiere firmemente que algunos mecanismos están implicados en la despigmentación de la piel (y a la luz de los datos actuales, el sistema inmunitario parece desempeñar un papel clave en este proceso) mientras que otros podrían estar implicados para prevenir o inhibir la repigmentación de la piel lesional con vitíligo. Esta hipótesis también está respaldada por la marcada diferencia en la respuesta al tratamiento según las localizaciones. De hecho, las manos, los pies y el rostro, son las zonas afectadas más comunes en el vitíligo y también suelen ser las primeras en despigmentarse. Sin embargo, aunque el rostro suele mostrar una alta tasa de respuesta al tratamiento, las manos y los pies siguen siendo casi imposibles de repigmentar [Ostovari, 2004; Passeron, 2004].

Para caracterizar los mecanismos fisiopatológicos implicados en la piel humana con vitíligo, los inventores realizaron un análisis transcriptómico y proteómico en piel lesional, perilesional y no despigmentada de pacientes con vitíligo en comparación con controles de piel correspondientes de sujetos sanos. Al comparar pieles lesionales con vitíligo con las de controles sanos, se descubrió que 152 genes estaban regulados al alza y que 181 lo estaban a la baja. Sus resultados muestran que la reacción inmunitaria se produce a un nivel muy bajo, pero confirman el posible papel del CXCL10 en la despigmentación de la piel con vitíligo, con un aumento significativo en la piel no despigmentada y perilesional con vitíligo en comparación con la de controles sanos. Sin embargo, ni el CXCL10 ni otros factores inmunitarios se encontraron desregulados en la piel con vitíligo ya despigmentada. Cabe destacar que, la vía WNT, implicada en la diferenciación de los melanocitos, se encontró alterada en piel despigmentada con lesiones pero también en piel no lesional. Los inventores demostraron después, in vitro, que el estrés oxidativo disminuía la expresión/activación de WNT en los queratinocitos y en los melanocitos. Desarrollaron un modelo de piel ex vivo que sigue siendo funcional hasta 15 días. A continuación, confirmaron la disminución de la activación de la vía WNT en piel humana sometida a estrés oxidativo. Por último, utilizando agentes farmacológicos que activan la vía WNT y agentes farmacológicos que inhiben GSK3B, trataron las pieles despigmentadas ex vivo de pacientes con vitíligo y el éxito indujo plenamente la diferenciación de células madre residentes en premelanocitos. Sus resultados arrojan luz sobre el papel, hasta ahora no reconocido, de la disminución de la activación de WNT en la piel despigmentada con vitíligo, impidiendo la diferenciación de los melanocitos y confirman una mayor exploración de los agonistas de WNT para repigmentar las lesiones de vitíligo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes para análisis transcriptómico

Diez pacientes con vitíligo no segmentario activo, definidos por la aparición o el empeoramiento de lesiones despigmentadas en los 3 últimos meses, se incluyeron en el estudio después de obtener su consentimiento por escrito. El estudio fue aprobado por el comité de ética local. Se tomó una biopsia de piel de 4 mm de diámetro de cada paciente en el centro de una mancha de vitíligo, en la zona perilesional (definida por 5 mm fuera del borde de la lesión) y en piel no lesional situada en la misma zona pero a 3 cm mínimo de una lesión despigmentada. También se tomó una biopsia de 4 mm y sirvió como control en 10 pacientes sanos del mismo sexo, edad y localización. En las Figuras 9A y 9B se describe un esquema explicativo de cómo se tomaron las muestras y las características de la población.

Análisis transcriptómico

Cuantificación de citocinas por Luminex en el estrato córneo.

Se recogió estrato córneo con tira adhesiva utilizando Dsquames®, (0 2,2 cm, D100, Monaderm, Mónaco, Francia) como se indica en la Figura 9A. En tubos Eppendorf de 2 ml, se extrajeron proteínas del estrato córneo no lesional, lesional y perilesional de la siguiente manera: se agruparon cinco Dsquames® y se incubaron durante la noche en 200 |jl de PBS helado que contenía Triton X100 al 0,2 % e inhibidores de proteasa (completo, Mini, sin EDTA de Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) a 4 °C con agitación a 1400 rpm en un termomezclador (Eppendorf, Hanbourg Alemania). Para eliminar el material insoluble, los extractos proteicos se pasaron a través de filtros de 0,22 jm mediante centrifugación (PVDF ultra libre de MC, Millipore, Billerica, MA). Las concentraciones proteicas se determinaron utilizando un ensayo de proteínas Dc (Kit DC, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y seroalbúmina como patrón. Los extractos se mantuvieron a -80 °C hasta su uso. Las citocinas se cuantificaron por duplicado utilizando los siguientes ensayos Luminex (Life Technologies, Carlsbad, CA): citocina humana, 62 Plex premezclado, ref PC1062M, kit de inmunoensayo Procarta de Affymetrix (Santa Clara, CA, Estados Unidos). Se realizaron controles de calidad de todas las curvas de calibración. Las citocinas se normalizaron a la concentración total de proteína. Para la cuantificación de las citocinas, no se conservó ningún extracto proteico con una concentración inferior a 0,15 mg/ml de proteína total. Se calcularon y se consideraron los límites de cuantificación de cada proteína. Para las citocinas con valores por debajo del límite de cuantificación, estos valores no se conservaron para la normalización (es decir, el cálculo de los niveles de citocinas en pg/mg de proteína total). Se calcularon los factores de cambio y se realizó un análisis estadístico utilizando un estudio de micromatriz, modelo lineal T-TEST, con una tasa de descubrimiento falso: 0,05.

Cultivo celular

Se obtuvieron NHM (melanocitos humanos normales) y QHN (queratinocitos humanos normales) de prepucio de niños, fototipo IV, como se describió anteriormente. En resumen, las células epidérmicas se obtienen por digestión de la piel durante la noche en una solución de dispasa (Roche) a 4 °C, seguido de la digestión de la epidermis en una solución de tripsina/EDTA durante 20 minutos a 37 °C. Los MHN se aíslan en medio MCDB 153 (Sigma Aldrich) complementado con FBS al 2 % (Perbio), insulina 5 pg/ml (Sigma Aldrich), hidrocortisona 0,5 pg/ml (Sigma Aldrich), TPA 16 nM (Sigma Aldrich), FGF 1 ng/ml (Promega), extracto de hipófisis de bovino 15 pg/ml (Invitrogen) y forskolina 10 pM (Sigma Aldrich) y geneticina 20 pg/ml (Invitrogen) durante 2 semanas.

Los QNH se aíslan en medio KGM 2 (Promocell).

Todas las células se conservan a 37 °C en una atmósfera con CO² al 5 %.

Cultivo de piel ex vivo

Para desarrollar el modelo de cultivo de piel ex vivo, se utilizó piel de cirugía de abdominoplastia. Se eliminó la grasa subcutánea y se realizaron biopsias de 6 mm en la piel compuesta por dermis y epidermis.

Para las biopsias de piel con vitíligo, después de verificar la ausencia de melanocitos con la lámpara de Wood, se tomaron dos o tres biopsias de 6 mm compuestas por dermis y epidermis en piel lesional de pacientes con vitíligo (n=9). Las biopsias se colocaron rápidamente en una cámara transwell de 0,4 pm (Becton Dickinson) y se conservaron en condiciones de cultivo semilíquido en "medio de cultivo de piel prolongado" (Biopredic). La piel se conservó a 37 °C en una atmósfera húmeda de CO² al 5 %.

El medio de cultivo complementado con forskolina (Sigma Aldrich), LiCl (Sigma Aldrich), CHIR99021 (Calbiochem) o SKL2001 (Calbiochem), se cambió todos los días durante 14 días.

Extracción y análisis de ARNm

El ARNm de los melanocitos y queratinocitos se extrajo con el kit RNeasy (Qiagen). Las biopsias se cortaron y se fraccionaron con un fraccionador tisular (Qiagen) y el ARNm se extrajo con el kit RNeasy (Qiagen). El ADNc se sintetizó a partir de 300 ng a 1 pg de ARNm con el Sistema de Transcripción Inversa (Promega). La cuantificación relativa de la expresión génica se midió mediante qPCR en tiempo real con reactivo verde Sybr (Life technology) en el sistema Step one.

Infección de MHN y QHN y ensayo de luciferasa

Se coinfectaron QHN y MHN con los lentivirus TCF/LEF Luciferasa Indicadora y Renilla Indicadora de Control de Cignal Lenti (Qiagen) y las células infectadas se seleccionaron con Puromicina durante 14 días. Los MHN y QHN seleccionados se estimularon durante 24 h con SKL2001 y H²O². y la actividad TCF/LEF se midió con el sistema de ensayo indicador de luciferasa doble (Promega).

Tinción con hematoxilina y eosina

Las biopsias se congelaron en Tissu Tek OCT (por las siglas de inglés optimum cutting temperature, temperatura óptima de corte) (Sakura)), se cortaron con un criostato en secciones de 7 pM y se colocaron en portaobjetos superforst plus (Thermoscientific). En resumen, después de la fijación con paraformaldehído al 4 % (EMS), el portaobjetos se tiñó con hematoxilina de Harry (Sigma Aldrich), se aclaró con cloruro de alcohol y carbonato de litio (Sigma Aldrich) y se tiñó con eritrosina (Sigma Aldrich). Después de varios aclarados, los portaobjetos se deshidrataron con etanol y xileno y se fijaron con medio de montaje.

Inmunohistofluorescencia

Las biopsias se fijaron con formol al 4 %, se embebieron en parafina, se cortaron con un microtomo en secciones de 7 pM y se fijaron en portaobjetos y superfrost (Thermoscientific). Después de la desparafinización mediante sucesivas incubaciones con xileno y etanol, las secciones se hidrataron con agua destilada, se permeabilizó durante 10 minutos con Triton al 0,3 % y se calentaron en un microondas durante 12 minutos en tampón citrato (Vector Laboratory) para revelar el antígeno. Las secciones se bloquearon durante 30 minutos en suero de cabra al 10 % y se incubaron en anticuerpos primarios MITF (Abcam), Tirosinasa (aPEP7h), DCT (Novus) durante la noche a 4 °C. Después de aclarar con PBS y Tween al 0,05 %, las secciones se incubaron durante 1 hora con los anticuerpos secundarios Alexa 488 o Alexa 594 (Invitrogen) y Hoechst (Invitrogen). Después de aclarar, los portaobjetos se fijaron con medio de montaje.

RESULTADOS

El análisis transcriptómico muestra que la reacción inmunitaria solo se produce a bajo nivel y se limita a piel no despigmentada y perilesional con vitíligo y revela una menor activación de la vía WNT junto con la ausencia de la firma de reacción inmunitaria en la piel ya despigmentada

Cuando se compararon pieles lesiónales con vitÍligo con las de controles sanos (Figura 1A), se descubrió que un total de 152 genes estaban regulados al alza y que 181 lo estaban a la baja. Cuando se compararon pieles perilesionales y no despigmentadas con vitíligo, con las de controles sanos, se descubrió que los genes X, Y estaban regulados al alza y que los genes W, Z lo estaban a la baja, respectivamente. Cabe destacar que, el análisis de vías canónicas Ingenuity, reveló, junto con el desarrollo de melanocitos y la señalización de la pigmentación, que la señalización circadiana y la vía WNT/beta-catenina se desregulaban significativamente en las lesiones de vitíligo en comparación con el control (Figura 1B). El análisis de grupos de datos de micromatriz de los principales genes de piel sana (PS), no lesional (NLS), perilesional (PLS) y lesional (LS) de sujetos con vitíligo, mostró, como era de esperar, en su mayoría genes melanocíticos (Figura 1C). Los inventores analizaron específicamente la expresión de los genes relacionados con la reacción inmunitaria. Observaron muy pocas variaciones entre las diversas condiciones y ninguna alcanza el nivel de significación estadística (véase la Tabla 1).

Tabla 1

Cabe destacar que, se observó una red transcripcional que relacionaba las vías de señalización de WNT y de melanogénesis utilizando vías de análisis Ingenuity (Figura 2). La piel lesional con vitÍligo se caracteriza tanto por una expresión regulada a la baja del transductor clave de la vía de señalización de WNT (por ejemplo, LEF1), como por la regulación al alza de reguladores negativos de la vía de señalización de WNT, DVL1 y p53 (miembros de WNT implicados en la transducción de señales) y TLE4 miembro de la familia groucho) y ZBTB33/Kaiso (implicado en la represión transcripcional de genes WNT diana).

Se descubrió que en el análisis transcripcional de los inventores, los genes circadianos estaban modulados. Debido al papel demostrado de la variación de estos genes durante el día, los inventores investigaron si esta modulación se debía al tiempo en que se realizaban las biopsias de piel o si se estaba relacionada con la patogenia del vitíligo. De este modo analizaron la expresión de los genes circadianos clave (ARNTL (Bmall), CLOCK, PERI, NR1D1) de acuerdo con la hora en que se tomaron las muestras. Se descubrió una fuerte correlación entre las horas de las muestras y la expresión de todos estos genes, mostrando que la modulación de la expresión génica circadiana no estaba relacionada con el vitíligo sino con el momento en que se tomaron las muestras. Los resultados del análisis transcripcional se controlaron después utilizando TLDA (matrices Taqman de baja densidad). La marcada disminución de todos los genes melanocíticos en la piel con vitíligo en comparación con un control, confirma la pérdida de melanocitos en la piel con vitíligo afectada (Figura 3A). A continuación, los inventores analizaron el nivel de expresión de LEF1 como un marcador clave de la activación de la vía WNT. De conformidad con los resultados del análisis transcripcional, se descubrió que, en piel lesional con vitíligo, la expresión de LEF1 estaba regulada a la baja (Figura 3B). Como control adicional y para investigar si la expresión de LEF1 podría estar modulada por el ciclo circadiano, sincronizaron melanocitos y siguieron la expresión relativa de ARNTL y LEF1. Los resultados mostraron que la expresión de LEF1 no se correlaciona con la expresión de ANRTL, un marcador del ciclo circadiano. Reprodujeron este experimento siguiendo la expresión de varios ARNm de WNT durante el ciclo circadiano y no observaron correlación (datos no mostrados). Por tanto, las modulaciones de la vía WNT observadas en los análisis transcriptómico y TLDA, están relacionadas con la patogenia del vitíligo. Por último, teniendo en cuenta los resultados que sugerían el papel de CXCL10 en el modelo de vitíligo en ratón, también analizaron su expresión en las muestras de piel mediante TLDA. Cabe destacar que, observaron un aumento significativo en la expresión de ARNm de CXCL10 en piel perilesional, pero también en piel no despigmentada de pacientes con vitíligo en comparación la de controles sanos. Sin embargo, el nivel de expresión de CXCL10 no fue diferente al de la piel sana en las lesiones de vitíligo despigmentadas (Figura 3C).

En conjunto, estos resultados obtenidos de pacientes con vitíligo, en comparación con sujetos sanos, no muestran una modulación significativa de los genes implicados en la reacción inmunitaria, excepto en el caso de CXCL10 que se descubrió que estaba regulado al alza en piel perilesional aunque también en piel no despigmentada de pacientes con vitíligo. También muestran que no se observa más reacción inmunitaria en la piel lesional desprovista de melanocitos. Cabe destacar que, sobre todo revelan una regulación a la baja de la vía WNT/beta-catenina en la piel con vitíligo.

El análisis de citocinas del estrato córneo no muestra una desregulación significativa en piel con vitÍligo

Las concentraciones de 62 citocinas se midieron en el estrato córneo de sujetos con vitíligo y de voluntarios sanos utilizando tira adhesiva, un método mínimamente invasivo. Se detectaron y cuantificaron doce citocinas de extractos de estrato córneo con un intervalo de concentración de proteína de 1 a 7000 pg/mg (véase la Tabla 2 a continuación).

Tabla 2: Cantidad de citocinas en el estrato córneo

continuación

Cantidad (pg/mg) de citocina en el estrato córneo (valores medios normalizados). sFAS TNFRSF6, GM-CSF CSF-2, MCP-3 CCL7, IL-15, TNF-alfa, sE-Selectina CD62E ELAM1, MPO Mieloperoxidasa, VEGF-A, IL-22 IL-TIF, MIP1-Beta CCL4, IL-3, IL-27, IL-4, ENA-78 CXCL5, SDF-1 CXCL12, Trail TNFSF10, IL-5, IL-20, FRACTALQUINA CX3CL1, GRANZIMA B, IFNomega IFNW1, IL-8 CXCL8, MIP-3alfa CCL20, IL-10 CSIF, IFNalfa2, BLC CXCL13 BCA-1, IL-7, PDGFBB, I-TAC CXCL11, IL-17F ML-1, IL-17A CTLA8, IL-6, Ligando sCD40 TNFSF5 CD40LG, TNF-Beta TNFSF1 LTA, IL-13, IL-23 p19, IFNg, IL-12 p70, IL-21, IL-2, IL-9, TNFRI TNFRSF1A, TNFR II TNFRSF1B, RANTES CCL5, TGFalfa, IL-2RA CD25, IFNbeta, FGF BÁSICO, IL-12 IL-23 p40, MIP-1alfa CCL3 se encontraron por debajo del límite de cuantificación.

No se observaron diferencias significativas en el perfil de citocinas entre las muestras patológicas y las no patológicas (Tabla 3).

Tabla 3: Factor de cambio de piel lesional, perilesional y no lesional frente a piel sana. No se observó modulación significativa. Además, no se descubrió ninguna modulación significativa en la siguiente comparación: lesional frente a no lesional, lesional frente a perilesional y perilesional frente a no lesional (datos no mostrados).

La concentración de la proteína CXCL10 en el estrato córneo se comparó con la expresión de ARNm obtenido con las biopsias de piel. Mientras que a nivel de ARNm, se descubrió que la proteína CXCL10 estaba significativamente regulada al alza en pieles no lesionales y perilesionales con vitíligo en comparación con los controles, no se observó ninguna modulación significativa a nivel de proteínas en el estrato córneo (véase la Tabla 4 a continuación).

Tabla 4: Comparación de la expresión de CXCL10 en todos los sujetos a nivel de ARNm y de proteínas

Estos resultados muestran que, en el vitíligo, la reacción inmunitaria se produce a un nivel muy bajo.

El estrés oxidativo disminuye la vía WNT en la piel

Dado que la vía WNT, implicada en la diferenciación de los melanocitos, parece verse afectada en la piel con vitíligo, los inventores intentaron determinar el elemento - que se sabía que estaba implicado en el vitíligo - responsable de esta desregulación. Se informó que el estrés oxidativo inhibe la vía WNT/beta-catenina en las células renales [Shin, 2004]. Los inventores estudiaron el impacto del estrés oxidativo sobre la activación de WNT/beta-catenina en la piel. Indujeron un estrés oxidativo con H²O². en melanocitos y queratinocitos y analizaron la expresión de la familia lEf y WNT. Después de 24 horas en presencia de H²O², la expresión de LEF y de la mayor parte de WNT, disminuyó tanto en melanocitos (Figura 4A y Figura 10A) como en queratinocitos (Figura 4B y Figura 10B). Se observó el mismo resultado en piel entera, ya que la estimulación de biopsias de piel en un modelo ex vivo (validado en la Figura 4) con H²O², indujo una disminución de la expresión de LEF y de la mayor parte de la familia WNT (Figura 4C y Figura 10C). Por último, los inventores estudiaron la actividad del promotor LEF bajo estrés oxidativo. Utilizaron un indicador de luciferasa TCF/LEF en melanocitos y queratinocitos. En consonancia con la disminución de la expresión de varios WNT bajo estrés oxidativo, la actividad del promotor TCF/LEF también disminuyó de una manera sensible a la dosis bajo estrés oxidativo.

En conjunto, estos resultados mostraron que el estrés oxidativo mantiene una baja activación de la vía WNT/betacatenina.

Desarrollo de un modelo ex vivo para estudiar la piel con vitíligo

La dificultad para estudiar la enfermedad del vitíligo se debe concretamente a la ausencia de un modelo que imite las condiciones in vivo y que además contenga células madre a las que se pueda dirigir para inducir la repigmentación. Los inventores desarrollaron un modelo de piel ex vivo viable durante un período de tiempo lo suficientemente largo como para permitir la inducción de la diferenciación de células madre de melanocitos en piel con vitíligo. En la práctica clínica, las lesiones de vitíligo suelen tardar meses en alcanzar la repigmentación (si hay). Sin embargo, en el mejor de los casos, la aparición de la pigmentación puede observarse a veces después de 15 días de tratamiento. El objetivo de los inventores era obtener una piel morfológicamente apropiada y capaz de responder a un inductor de la pigmentación, como la forskolina, después de 15 días de cultivo ex vivo. A partir de piel de cirugía de abdominoplastia, los inventores determinaron las condiciones necesarias para satisfacer estas condiciones. Utilizaron biopsias de 6 mm compuestas por dermis y epidermis, las colocaron en una cámara transwell para poner la piel en condiciones de cultivo semilíquido. Después de 15 días en cultivo ex vivo, la morfología de la piel se consideró aceptable. Observaron solo una disminución de las papilas dérmicas en comparación con las condiciones iniciales, que podría deberse a una diferencia de tensión en la piel (Figura 5A). A continuación, se analizó la capacidad de la piel para responder a la forskolina mediante qPCR e inmunohistofluorescencia estudiando la expresión de los genes melanogénicos MITF, DCT y tirosinasa. Se realizó una respuesta a la dosis de forskolina con una estimulación de forskolina en condiciones sistémicas cada dos días. Como se esperaba, después de 11 días de estimulación, la primera respuesta fue la regulación al alza del ARNm (Figura 5B) y de la proteína (Figura 5 C) de MITF. Este fenómeno es transitorio, pero después de 15 días persiste una alta expresión a baja concentración de forskolina (Figura 5B). A los 15 días, observaron un fuerte aumento a nivel de ARNm y proteína de las enzimas melanogénicas DCT y tirosinasa (Figuras 5B y 5C). Para concluir, los inventores obtuvieron un modelo de cultivo de piel ex vivo viable y funcional hasta los 15 días de cultivo.

Los activadores farmacológicos de la vía WNT inducen un aumento de la expresión de WNT en piel con vitíligo ex vivo.

La vía WNT está implicada en la diferenciación de melanocitos y los inventores demostraron que está alterada en la piel con vitíligo. Para inducir la diferenciación de las células madre de melanocitos, activaron farmacológicamente la vía WNT en piel con vitíligo cultivada ex vivo como se mostró anteriormente. Utilizaron dos métodos para activar la vía WNT: un agonista de WNT (SKL2001) y dos inhibidores de GSK3p: cloruro de litio (LiCl) y un inhibidor comercial específico (CHIR99021). Realizaron una biopsia de 9 sujetos con vitíligo (sacabocados de 6 mm) en diversos lugares del cuerpo (4 en el codo, 2 en el torso, 2 en la pierna, 1 en el brazo y 1 en la axila) y trataron el modelo de cultivo ex vivo durante 14 días con una estimulación sistémica cada dos días con los activadores de WNT.

Evaluaron la activación de la vía WNT a través del nivel de ARNm de las WNT (TCF/LEF1 y la vía de melanogénesis a través del nivel de ARNm de MITF, DCT, PAX3 y BRn2) en la piel. Los tratamientos con LiCl, CHIR99021 y SKL2001 indujeron un aumento de todas las WNT y LEF después de 14 días de estimulación (Figura 6A y Figura 11). En su modelo, el LiCl fue particularmente eficaz para regular al alza la expresión de WNT.

El tratamiento de pieles despigmentadas ex vivo de pacientes con vitÍligo induce la diferenciación de células madre residentes en premelanocitos.

Dado que los inventores lograron aumentar la vía WNT en pieles con vitíligo ex vivo, analizaron la expresión de marcadores de melanoblastos en tratamiento. El nivel de ARNm de marcadores de melanoblastos tempranos, como PAX3 y Brn2, se regulo al alza en biopsias estimuladas con CHIR99021, SKL2001 y LiCl (Figuras 6B y 6C). Este resultado sugiere un inicio de la diferenciación de los melanocitos. El nivel de MITF se incrementó solo en la piel tratada con SKL2001 pero su expresión es transitoria después de la estimulación, por lo que supusieron que el tiempo de respuesta era diferente entre los tratamientos (Figura 6D). El marcador de premelanocitos DCT aumentó en respuesta a todos los tratamientos, pero el efecto fue más fuerte en respuesta a LiCl (Figura 6E).

Dado que observaron la regulación al alza del nivel de ARNm de los marcadores de melanoblastos en la piel tratada con activadores de la vía WNT, investigaron si estos tratamientos habían permitido la diferenciación de células madre de melanocitos en premelanocitos de la piel estudiando la coexpresión de DCT y PAX3 con inmunofluorescencia. En pieles con vitíligo cultivadas en condiciones de control, observan que no hay células aisladas que expresen PAX3 y DCT, o caso de haberlas, son pocas (Figura 7A). En condiciones estimuladas (Figuras 7B, 7C, 7D), los inventores descubrieron, en la dermis y en los folículos pilosos, muchos grupos de células que expresaban los dos marcadores que representaban los melanocitos en diferenciación. En conjunto, estos resultados mostraron que el direccionamiento de la vía WNT deficiente de la piel con vitíligo utilizando agonistas de WNT o inhibidores de GSK3B, permite la diferenciación de células madre de melanocitos en premelanocitos.

ANÁLISIS

Los resultados de los inventores ponen en relieve la complejidad de la fisiopatología del vitíligo. Si bien confirman el papel del sistema inmunitario y especialmente de CXCL10 en la despigmentación de la piel de los pacientes con vitíligo, también muestran que ni CXCL10 ni otros factores inmunitarios están desregulados en la piel con vitíligo ya despigmentada. Recientemente, el papel de CXCL10 y de la vía de IFNy se demostró en el modelo de ratones con vitíligo [Harris, 2012] [Rashighi, 2014]. También se descubrió que el aumento de la expresión de CXCL10 estaba regulado al alza en la piel con vitíligo. Cabe destacar que, las muestras de piel analizadas se seleccionaron para que aún tuvieran un infiltrado inmunitario [Rashighi, 2014]. Los resultados de los inventores son coherentes con estos datos ya que muestran un aumento en la expresión de CXCL10 en piel perilesional en comparación con la expresión de CXCL10 en la de controles sanos. Sin embargo, también descubrieron que la expresión de CXCL10 aumentaba significativamente en piel no afectada de pacientes con vitíligo en comparación con la de controles sanos, lo que sugiere que incluso la piel no despigmentada en pacientes con vitíligo tiene una activación inmunitaria de bajo nivel que culmina en la expresión de CXCL10. Por el contrario, no observaron ningún aumento de expresión de CXCL10 en lesiones despigmentadas carentes de melanocitos, lo que sugiere que la activación inmunitaria de bajo nivel en la piel con vitíligo depende de los melanocitos. Otros datos confirman el hecho de que la reacción inmunitaria en el vitíligo se limita a melanocitos diferenciados [Mosenson, 2013] [Chatterjee, 2014]. El único otro análisis transcriptómico realizado en la piel con vitíligo, no mostró ninguna activación fuerte del sistema inmunitario y solo informó de una activación de algunos factores implicados en la inmunidad innata (en particular en linfocitos citolíticos naturales) que los inventores no pudieron encontrar en su análisis [Yu, 2012]. Este primer estudio transcriptómico se realizó en piel no afectada y en zonas lesionales despigmentadas y se comparó con un control correspondiente. Cabe destacar que, los autores también descubrieron una activación de linfocitos citolíticos naturales en la piel con vitíligo no afectada, lo que confirma una activación inmunitaria de bajo nivel en piel no despigmentada. Además, realizaron un análisis proteómico de citocinas del estrato córneo. Los niveles de citocinas en el estrato córneo utilizando inmunoensayos nunca se había realizado antes en la piel con vitíligo, pero sí se habían investigado en varias enfermedades de la piel, como por ejemplo, la psoriasis [Gearing, 1990] y la dermatitis atópica [Kezic, 2012] y también en pieles expuestas a UVB [Janssens, 2009] o a un agente químico tal como lauril sulfato de sodio [de Jongh, 2007]. Los inventores no encontraron ninguna modulación significativa de las citocinas entre piel lesional, perilesional y no afectada por vitíligo en comparación con la de control. Esto se explica probablemente por el proceso de inflamación de bajo grado que se produce en el vitíligo en comparación con otras dermatitis tales como la psoriasis o la dermatitis atópica. Cabe destacar que, los inventores demostraron recientemente en un estudio prospectivo aleatorizado controlado con placebo, que la aplicación dos veces por semana de pomada de tacrolimus al 0,1 % disminuye significativamente la tasa de recidiva de las lesiones de vitíligo que se repigmentaron satisfactoriamente (Cavalié, J Invest Derm in Press). La eficacia de esta terapia de mantenimiento, demostrada anteriormente también en la dermatitis atópica [Schmitt, 2011], sugiere firmemente, de acuerdo con los datos recopilados en el presente estudio transcripcional, que se produjo una reacción inmunitaria de bajo nivel en la piel pigmentada de pacientes con vitíligo. En resumen, estos datos demuestran, en piel humana, el papel de una reacción inmunitaria limitada a melanocitos diferenciados y que se produce a bajo nivel en las lesiones de vitíligo activas, pero también en la piel con vitíligo no despigmentada, con un papel fundamental de CXCL10. Por el contrario, la reacción inmunitaria ya no está presente en las lesiones de vitíligo desprovistas de melanocitos diferenciados.

Sin embargo, algunas lesiones de vitÍligo despigmentado responderán rápidamente al tratamiento, mientras que otras se resistirán a todas las estrategias actuales, incluida la fototerapia. La fototerapia es uno de los tratamientos clave contra el vitíligo [Taieb, 2013]. Su mecanismo de acción sobre el vitíligo aún se conoce poco, pero más que su acción sobre la reacción inmunitaria, la fototerapia es principalmente activa a través de la estimulación de la diferenciación de las células madre de los melanocitos. Cabe destacar que, datos recientes mostraron que la vía WNT/beta-catenina desempeña un papel clave en la diferenciación de células madre de melanocitos inducida por UVB [Yamada, 2013]. En la piel, la secreción de WNT, principalmente por queratinocitos, contribuye a la diferenciación de células madre en melanocitos. El análisis transcripcional de los inventores revela una alteración de la vía WNT/beta-catenina en piel con vitíligo con una disminución significativa de la expresión de LEF/TCF que se confirmó utilizando TLDA. Además, demostraron que el estrés oxidativo inhibía la activación de WNT/beta catenina en melanocitos y queratinocitos. Los inventores confirmaron esta acción en modelos de piel ex vivo. Recientemente, se descubrió una primera relación que conecta el estrés oxidativo y la activación de la respuesta inmunitaria [Toosi, 2012] [Passeron, 2012]. Nuestros datos subrayan que el estrés oxidativo también tiene un impacto negativo en la diferenciación de las células madre de melanocitos al inhibir la vía WNT/beta-catenina. Cabe destacar que, varios estudios informaron del papel beneficioso de los antioxidantes orales o tópicos para el tratamiento del vitíligo [Schallreuter, 1995][Dell'Anna, 2007][Schallreuter, 2013]. Sin embargo, existen algunos resultados contradictorios sobre la eficacia de los antioxidantes para tratar el vitíligo [Bakis-Petsoglou, 2009]. Por tanto, los inventores también decidieron abordar directamente la diferenciación defectuosa de células madre de melanocitos estimulando la vía WNT/beta-catenina que, según demostraron, está inhibida en las lesiones de vitíligo. Para ello, desarrollaron un modelo de piel ex vivo que se demuestra que es ventajosamente viable y funcional hasta 15 días. Utilizando este modelo ex vivo en pieles despigmentadas de pacientes con vitíligo demostraron que los tratamientos con agonistas de WNT o inhibidores de GSK3B inducen un fuerte aumento de marcadores de melanocitos. En definitiva, demostraron que dichos tratamientos inducen la diferenciación de células madre de melanocitos residentes en premelanocitos que expresan PAX3 y DCT. Cabe destacar que, los inventores observaron premelanocitos en los folículos pilosos, pero también en la dermis, lo que sugiere que esta estrategia podría ser útil para diferenciar las células madre dérmicas de piel glabra que habitualmente no se estimulan de manera eficaz con fototerapia ya que, en la mayoría de los casos, se observa una pigmentación perifolicular. Esto permite una repigmentación de zonas habitualmente resistentes como la piel glabra de las manos o de los pies. Los resultados de los inventores muestran la utilidad del modelo ex vivo de pieles con vitíligo para estudiar los mecanismos implicados en la diferenciación de los melanocitos pero también para analizar nuevos tratamientos. Más allá del desarrollo de un nuevo modelo para estudiar el vitíligo, estos resultados ponen en relieve el interés de activar la vía WNT/beta-catenina para inducir la diferenciación de células madre de melanocitos y, por tanto, una repigmentación en lesiones de vitíligo. La implicación previamente no reconocida de una disminución de la activación de WNT/beta-catenina en las lesiones de vitíligo, aporta nuevas pistas para comprender la discrepancia entre las respuestas terapéuticas entre localizaciones tales como el rostro en comparación con las manos o los pies. De hecho, los factores secretados por los fibroblastos, tales como DKK1, disminuyen la pigmentación en palmas de las manos y plantas de los pies al inhibir la vía WNT/beta-catenina [Yamaguchi, 2008; Yamaguchi, 2007]. Cada vez hay más pruebas de que las características de los fibroblastos dérmicos definen diferencias regionales en la piel [Thangapazham, 2014]. A la luz de los datos de los inventores, se puede plantear la hipótesis de que los factores regionales que disminuyen la vía WNT-beta-catenina, tales como DKK1, inhiben además la activación ya defectuosa de esta vía en la piel con vitíligo y, por tanto, impiden la repigmentación en estas zonas. Por tanto, el uso de agentes tópicos, agonistas de WNT, representa una estrategia poderosa para inducir la repigmentación en la piel con vitíligo, que también podría ser eficaz en zonas difíciles de tratar tales como las manos y los pies. Para repigmentar las lesiones de vitíligo, una estrategia tópica sería suficiente y segura. Agentes tópicos que activan la vía WNT-beta-catenina, tales como el litio, ya se utilizan en la práctica dermatológica [Kastarinen, 2014]. En el presente documento, los inventores revelan que una formulación adaptada que permite una concentración eficaz de litio en las capas inferiores de la epidermis, pero también en la dermis, es una estrategia eficaz para estimular la diferenciación de melanocitos obtenidos en el modelo ex vivo utilizando tratamiento con litio como se describe en el presente documento.

En conjunto, los resultados de los inventores muestran que la reacción inmunitaria en el vitíligo se produce solo a un nivel muy bajo, en particular con un aumento de la expresión de CXCL10 en la piel no despigmentada y en la piel perilesional, mientras que la reacción inmunitaria ya no es detectable en la lesión de vitíligo sin restos de melanocitos.

También arrojan luz sobre el defecto previamente no reconocido en la activación de WNT/beta-catenina desencadenado por el estrés oxidativo que impide la diferenciación de las células madre de melanocitos (Figura 8). Además de la mejor comprensión de la compleja fisiopatología del vitíligo, estos resultados aportan nuevas opciones terapéuticas que deben confirmarse en ensayos clínicos.

REFERENCIAS

Bakis-Petsoglou, 2009

Bellei, 2013

Benson NR, et al., "An analysis of select pathogenic messages in lesional and non-lesional psoriatic skin using noninvasive tape harvesting". J Invest Dermatol. Octubre de 2006; 126(10): 2234-41

Cavalié, J Invest Derm in Press

Chatterjee, 2014

De Jongh, 2007

Dell'Anna, 2007

Gearing, 1990

Harlow et al. (Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988)

Harris, 2012

Janssens, 2009

Jin, 2012

Kastarinen, 2014

Kezic, 2012

Kohler et al. (Nature 256 (1975) 495)

Lepe, 2003

Mosenson, 2013

Ongenae K et al. 2006)

Ortonne JP 2005

Ostovari, 2004

Passeron, 2004

Passeron, 2012

Radtke, 2009

Rashighi, 2014

Schallreuter, 1995

Schallreuter, 2013

Shin, 2004

Silverberg, 2013

Schmitt, 2011

Spritz 2007

Spritz, 2012

Taieb, 2013

Thangapazham, 2014

Toosi, 2012

Ward et al. (Nature 341 (1989) 544)

Wong R et al., "Use of RT-PCR and DNA microarrays to characterize RNA recovered by non-invasive tape harvesting of normal and inflamed skin". J Invest Dermatol. Julio de 2004; 123(1): 159-67

Wong R et al., "Analysis of RNA recovery and gene expression in the epidermis using non-invasive tape stripping"; J Dermatol Sci.2006 Nov; 44(2):81-92

Yamada, 2013

Yamaguchi, 2007

Yamaguchi, 2008

Yu, 2012

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de GSK3B para su uso en el tratamiento del vitÍligo en un sujeto que presenta lesión de vitÍligo despigmentada resistente a fototerapia.

2. El inhibidor para su uso según la reivindicación 1, en donde dichas lesiones resistentes se localizan en piel glabra.

3. El inhibidor para su uso según la reivindicación 2, en donde dicha piel glabra está en las manos o en los pies.

4. El inhibidor para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el inhibidor se selecciona de cloruro de litio (LiCl) y CHIR99021.

5. El inhibidor para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho inhibidor se formula en una formulación tópica.