ES2896404T3 - Métodos para determinar la capacidad de respuesta a inhibidores de MEK/ERK - Google Patents

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Abstract

Un método para predecir la capacidad de respuesta de una célula cancerosa a un inhibidor de MEK, que comprende: detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12 en la célula cancerosa, poniendo en contacto una muestra de ácido nucleico derivada de la célula cancerosa con por lo menos un oligonucleótido que permite la detección específica de la mutación; en donde la presencia de mutación en ADAM12 es indicativa de una capacidad de respuesta disminuida de la célula cancerosa al inhibidor de MEK.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para determinar la capacidad de respuesta a inhibidores de MEK/ERK
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente china N° 201410135569.9, presentada el 4 de abril de 2014, titulada "Bio-marcador para terapia del cáncer".
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere de manera general a métodos para determinar la capacidad de respuesta de un sujeto al tratamiento con un inhibidor de MEK o ERK.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La cascada de señalización Ras-Raf-MEK-ERK (vía MEK/ERK) es una de las vías clave de pro­ proliferación y pro-supervivencia. Se ha descubierto que las mutaciones en la vía MEK/ERK llevan a un crecimiento descontrolado en muchos cánceres (por ejemplo, melanoma). Los compuestos que inhiben los pasos de la vía MEP/ERK se han usado para tratar el cáncer. Sin embargo, algunos pacientes que albergan mutaciones en la vía MEK/ERK muestran resistencia a los inhibidores de MEK o ERK. La patente de Estados Unidos US2014024539 (A1) divulga entre otras cosas métodos para predecir o diagnosticar una predisposición, existencia, progresión, sensibilidad a quimioterapias y recurrencia de un subtipo de cáncer triple negativo, en particular un subtipo triple negativo de cáncer de mama (TNBC) que también revela implicaciones terapéuticas en sentido descendente como la activación dual de las vías de señalización RAS/RAF/MEK/ERK y PI3K/AKT/mTOR en mTNBC.
Hay una necesidad adicional de un medio eficaz para determinar que pacientes que tienen mutaciones en la vía MEK/ERK resistirán al tratamiento de inhibidores de MEK o ERK y para incorporar tal determinación en un tratamiento eficaz.
BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para predecir la capacidad de respuesta de una célula cancerosa a un inhibidor de MEK. En ciertas realizaciones, el método comprende detectar la presencia de por lo menos una mutación en el gen ADAM12 en la célula cancerosa con por lo menos un oligonucleótido que permite la detección específica de la mutación; en donde la presencia de mutación en ADAM12 es indicativa de una capacidad de respuesta disminuida de la célula cancerosa al inhibidor de MEK.
En ciertas realizaciones, la célula cancerosa se deriva de un paciente con cáncer.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de MEK es Trametinib.
En ciertas realizaciones, la mutación en ADAM12 se selecciona del grupo que consiste de la mutación Q650K, R240L, C440Y, Q228E, H247D, M322I, T97fs, P168L yG308E en ADAM12.
En ciertas realizaciones, el paso de detección comprende amplificar por lo menos una parte del gen con el oligonucleótido como cebador y detectar el producto de amplificación y determinar de este modo la presencia de la mutación en el gen.
En ciertas realizaciones, el paso de detección comprende poner en contacto la muestra de ácido nucleico con el oligonucleótido que hibrida específicamente con la mutación del gen para formar un complejo, y detectar la formación del complejo y determinar de este modo la presencia de la mutación en el gen.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para identificar un probable respondedor o un probable no respondedor a un inhibidor de MEK, que comprende detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12 en una muestra del paciente, poniendo en contacto la muestra con por lo menos un oligonucleótido que permite la detección específica de la mutación; identificar al paciente como un probable no respondedor al inhibidor de MEK si se detecta por lo menos una mutación en ADAM12 en la muestra.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de MEK es Trametinib.
En ciertas realizaciones, la mutación en ADAM12 se selecciona del grupo que consiste de la mutación Q650K, R240L, C440Y, Q228E, H247D, M322I, T97fs, P168L y G308E en ADAM12
En ciertas realizaciones, el método comprende además recomendar al paciente que se ha identificado como un probable no respondedor que no sea tratado con una monoterapia del inhibidor de ERK, o que no sea tratado con un inhibidor de MEK.
En ciertas realizaciones, el método comprende además recomendar al paciente que se ha identificado como un probable no respondedor que sea tratado con un inhibidor de MEK diferente, o que sea tratado con una terapia combinada de un inhibidor de MEK diferente y un agente terapéutico adicional de distinto mecanismo.
En ciertas realizaciones, el método comprende además recomendar que el paciente que se ha identificado como un probable respondedor sea tratado con el inhibidor de MEK.
En ciertas realizaciones, la muestra es una célula cancerosa o tejido derivado del paciente.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para predecir la capacidad de respuesta de una célula cancerosa a un inhibidor de ERK, que comprende detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12 en la célula cancerosa, poniendo en contacto una muestra de ácido nucleico derivada de la célula cancerosa con por lo menos un oligonucleótido que permite la detección específica de la mutación, en donde la presencia de la mutación en ADAM12 es indicativa de una capacidad de respuesta disminuida de la célula cancerosa al inhibidor de ERK.
En ciertas realizaciones, la célula cancerosa se deriva de un paciente con cáncer.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de ERK es SCH772984.
En ciertas realizaciones, la mutación en ADAM12 se selecciona del grupo que consiste de la mutación Q650K, R240L, C440Y, Q228E, H247D, M322I, T97fs, P168L y G308E
En ciertas realizaciones, el paso de detección comprende amplificar por lo menos una parte del gen con el oligonucleótido como cebador y detectar el producto de amplificación y determinar de este modo la presencia de la mutación en el gen.
En ciertas realizaciones, el paso de detección comprende poner en contacto la muestra de ácido nucleico con el oligonucleótido que hibrida específicamente con la mutación del gen para formar un complejo, y detectar la formación del complejo y determinar de este modo la presencia de la mutación en el gen.
En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona un método para identificar un probable respondedor o un probable no respondedor a un inhibidor de ERK, que comprende detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12 en una muestra del paciente, poniendo en contacto la muestra con por lo menos un oligonucleótido que permite la detección específica de la mutación; identificando al paciente como un probable no respondedor al inhibidor de ERK si se detecta por lo menos una mutación en ADAM12 en la muestra.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de ERK es SCH772984.
En ciertas realizaciones, la mutación en ADAM12 se selecciona del grupo que consiste de la mutación Q650K, R240L, C440Y, Q228E, H247D, M322I, T97fs, P168L y G308E.
En ciertas realizaciones, el método comprende además recomendar al paciente que se ha identificado como un probable no respondedor que no sea tratado con una monoterapia del inhibidor de ERK, o que no sea tratado con un inhibidor de ERK.
En ciertas realizaciones, el método comprende además recomendar al paciente que se ha identificado como un probable no respondedor que sea tratado con un inhibidor de ERK diferente, o que sea tratado con una terapia combinada de un inhibidor de ERK diferente y un agente terapéutico adicional de distinto mecanismo.
En ciertas realizaciones, la muestra es una célula cancerosa o tejido derivado del paciente.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de un kit para predecir la capacidad de respuesta de una célula cancerosa a un inhibidor de MEK que comprende por lo menos un oligonucleótido útil para determinar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12.
En ciertas realizaciones, el por lo menos un oligonucleótido comprende un par de cebadores útiles para amplificar por lo menos una parte de la secuencia génica, o comprende una sonda útil para hibridar específicamente con la mutación del gen para formar un complejo.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de por lo menos un oligonucleótido en la fabricación de un kit para predecir la capacidad de respuesta de una célula cancerosa o un paciente con cáncer a un inhibidor de MEK en donde el oligonucleótido es útil para detectar la presencia de por lo menos una mutación en u ADAM12.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de por lo menos un oligonucleótido en la fabricación de un kit para predecir la capacidad de respuesta de una célula cancerosa o un paciente con cáncer a un inhibidor de ERK, en donde el oligonucleótido es útil para detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de un kit como antes, en donde el uso comprende hibridar por lo menos un oligonucleótido con una secuencia de ácidos nucleicos de ADAM12 que codifica por lo menos una mutación seleccionada de Q650K, R240L, C440Y, Q228E, H247D, M322I, T97fs, P168L y G308E BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La FIG. 1 ilustra la sensibilidad aumentada al inhibidor de MEK, Trametinib, en células que albergan mutaciones en el gen ADAM12.
La FIG. 2 ilustra la sensibilidad disminuida al inhibidor de MEK, Trametinib, en células que albergan mutaciones en el gen COL14A1 (no de acuerdo con la invención).
La FIG. 3 ilustra la sensibilidad aumentada al inhibidor de MEK, Trametinib, en células que albergan mutaciones en el gen TNN (no de acuerdo con la invención).
La FIG. 4 ilustra la sensibilidad aumentada al inhibidor de MEK, Trametinib, en células que albergan mutaciones en el gen TP53 (no de acuerdo con la invención).
La FIG. 5 ilustra la sensibilidad aumentada al inhibidor de MEK, Trametinib, en células que albergan múltiples mutaciones en el gen ADAM12, COL14A1, TNN y TP53.
La FIG. 6 ilustra la sensibilidad aumentada al inhibidor de ERK, SCH772984, en células que albergan mutaciones en el gen ADAM12.
La FIG. 7 ilustra la sensibilidad aumentada al inhibidor de ERK, SCH772984, en células que albergan mutaciones en el gen PEX5L (no de acuerdo con la invención).
La FIG. 8 ilustra la sensibilidad aumentada al inhibidor de ERK, SCH772984, en células que albergan mutaciones en el gen TNN (no de acuerdo con la invención).
La FIG. 9 ilustra la sensibilidad aumentada al inhibidor de ERK, SCH772984, en células que albergan mutaciones en el gen TP53 (no de acuerdo con la invención).
La FIG. 10 ilustra la sensibilidad aumentada al inhibidor de ERK, SCH772984, en células que albergan múltiples mutaciones en el gen ADAM12, PEX5L, TNN y TP53.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para predecir la capacidad de respuesta de una célula cancerosa a un inhibidor de MEK. En ciertas realizaciones, el método comprende detectar la presencia de por lo menos una mutación en el gen ADAM12 en la célula cancerosa, poniendo en contacto una muestra de ácido nucleico derivada de la célula cancerosa con por lo menos un oligonucleótido que permite la detección específica de la mutación; en donde la presencia de mutación en ADAM12 es indicativa de una capacidad de respuesta disminuida de la célula cancerosa al inhibidor de ERK.
La cascada de quinasa regulada por señal extracelular activada por mitógenos (MEK)-proteínas quinasas reguladas extracelulares (ERK), también conocida como vía de señalización Ras-Raf-MEK-ERK, es una de las vías de señalización clave implicadas en el crecimiento y la progresión oncogénica tumoral. La vía de la señal comienza cuando una molécula de señalización (por ejemplo, un factor de crecimiento) se une al receptor en la superficie celular. Esto hace que Ras (una GTPasa) debilite su GDP para una GTP. El Ras unido a GTP activa entonces Raf, que activa MEK, que activa ERK. ERK luego activa algunas proteínas, como myc, que controlan la división celular y la supervivencia celular. Cuando una o más proteínas en la vía, como Ras, están mutadas, puede llevar a que la vía de señalización se atasque en el estado activado, que es un paso necesario en el desarrollo de muchos cánceres. Como resultado, se han desarrollado inhibidores de la vía de señalización MEK/ERK para tratar el cáncer. Se ha descubierto que ciertos pacientes son resistentes a los inhibidores de MEK o ERK. Los mecanismos subyacentes a la resistencia a estos inhibidores no están claros.
Múltiples inhibidores de MEK y ERK1/2 se encuentran actualmente en investigación clínica para el tratamiento del cáncer y más agentes dirigidos a MEK o ERK1/2 están en desarrollo preclínico. Ejemplos de inhibidores de MEK incluyen, sin limitación, Trametinib (GSK1120212), Selumetinib, Binimetinib (MEK162), PD-325901, Cobimetinib (GdC-0973, XL518), y CI-1040 (PD035901). Los inhibidores de ERK incluyen, sin limitación, SCH772984, FR180204, GDC-0994.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de MEK es Trametinib. El Trametinib (nombre comercial Mekinist) tiene el nombre químico N-(3-{3-ciclopropil-5-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-6,8-dimetil-2,4,7-trioxo-3,4,6,7-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-1 (2H)-il}fenil)acetamida. La estructura de Trametinib se ilustra a continuación.
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Como se usa en la presente, el término "capacidad de respuesta" se refiere a la probabilidad de que una célula/individuo/paciente/sujeto responda al tratamiento del inhibidor de MEK o de ERK, es decir, que muestre una proliferación/crecimiento disminuidos y/o una muerte celular aumentada después de ser tratado con un inhibidor de MEK o de ERK. En ciertas realizaciones, la capacidad de respuesta puede clasificarse como insensible (es decir, menos probable que responda), sensible (probable que responda) e incierta. En ciertas realizaciones, es menos probable que la célula/individuo/paciente/sujeto responda a un tratamiento del inhibidor de MEK o de ER cuando la célula/individuo/paciente/sujeto muestra una probabilidad disminuida de que se producirá una respuesta patológica completa (pcR), es decir, ausencia de cáncer invasivo. En ciertas realizaciones, la probabilidad disminuida significa aproximadamente el 770%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% de probabilidad de que la pcR se produzca en un paciente de referencia (por ejemplo, un paciente sin mutación en el gen de interés). En ciertas realizaciones, la capacidad de respuesta de una célula puede evaluarse midiendo la CI50 de la célula para un inhibidor de MEK o ERK.
Como se usa en la presente, el término "mutación" se refiere a la desviación de un ADN genómico de una referencia normal (por ejemplo, ADN genómico de tipo salvaje), por ejemplo, adiciones, deleciones, inserciones, reordenamientos, inversiones, transiciones, transversiones, mutaciones de desplazamiento de marco, mutaciones sin sentido, mutaciones de sentido erróneo, translocaciones y polimorfismos de un solo nucleótido.
Los métodos para detectar la presencia de una mutación en un gen se describen en la presente y son conocidos en la técnica (en general, ver, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. By Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Los ejemplos del método incluyen, sin limitación, secuenciación de ácidos nucleicos (por ejemplo, secuenciación di-desoxi de Sanger, métodos de secuenciación de "próxima generación" y secuenciación de una sola molécula), ensayo basado en PCR (reacción en cadena de la polimerasa) (PCR en tiempo real, ensayo PCR-RFLP (ver Cancer Research 59 (1999), 5169-5175), genotipado por espectrometría de masas (por ejemplo MALDI-TOF), HPLC, métodos enzimáticos y SSPC (análisis de polimorfismo de conformación de cadena sencilla (ver Pathol Int (1996) 46, 801-804)), ensayo basado en hibridación (por ejemplo, transferencia Northern, transferencia Southern, 5'-exonucleasa (TaqMan™) sonda, balizas moleculares, sondas de transferencia de energía de fluorescencia, sondas Scorpion).
En ciertas realizaciones, el método puede incluir la amplificación enzimática de fragmentos de ADN o de ADNc del gen que se va a evaluar mediante PCR. Los productos de PCR resultantes pueden someterse a métodos convencionales de secuenciación de didesoxi nucleótidos basados en Sanger o métodos de secuenciación paralela ("secuenciación de próxima generación") como los comercializados por Roche (tecnología 454), Illumina (tecnología Solexa) ABI (tecnología Solid) o Invitrogen (IonTorrent). Las mutaciones pueden identificarse a partir de lecturas de secuencias mediante comparación con bases de datos de secuencias de genes disponibles públicamente. Alternativamente, las mutaciones pueden identificarse mediante la incorporación de sondas específicas de alelos que pueden detectarse o usando reacciones de detección enzimática, fluorescencia, espectrometría de masas u otras.
En ciertas realizaciones, el método puede incluir amplificar fragmentos de ADN o de ADNc del gen de interés usando cebadores que se unen específicamente a una de las secuencias normal y mutada. Como resultado, el producto de amplificación solo se puede encontrar en uno de los genes normales y mutados. Como tal, la presencia de la mutación en el gen se puede determinar detectando la presencia del producto de amplificación.
En ciertas realizaciones, el método puede incluir poner en contacto la muestra de ácido nucleico con una sonda de oligonucleótidos que hibrida específicamente con la mutación del gen para formar un complejo. La sonda de oligonucleótidos puede diseñarse para que no hibride con la secuencia normal del gen. La presencia del complejo de hibridación puede detectarse usando señales informadoras, por ejemplo, fluorescencia. Como resultado, la presencia de la mutación en el gen puede determinarse detectando la formación del complejo.
En ciertas realizaciones, la mutación está presente en un exón del gen. En cierta realización, la presencia de la mutación lleva al cambio de aminoácidos del polipéptido codificado por el gen. La Tabla 3 muestra secuencias de ácidos nucleicos ejemplares de las mutaciones que se van a determinar de acuerdo con la presente invención. Como se usa en la presente, una mutación específica se anota como el cambio de aminoácidos resultante. Por ejemplo, la mutación Q650K se refiere a un codón/triplete que codifica el aminoácido K en la posición 650 del gen, donde el aminoácido G existe en la secuencia de tipo salvaje.
El gen ADAM12 (ID de gen: 8038) codifica un miembro de la familia de proteínas ADAM (una desintegrina y metaloproteasa). Los miembros de la familia ADAM son proteínas ancladas a la membrana estructuralmente relacionadas con las desintegrinas del veneno de serpiente, y se han encontrado implicadas en interacciones célulacélula y célula-matriz. El gen ADAM12 tiene dos transcripciones de corte y empalme alternativas: una forma secretada más corta y una forma unida a miembros más larga.
El gen COL14A1 (ID de gen: 7373) codifica la cadena alfa del colágeno tipo XIV, un miembro de la familia de colágeno FACIT (colágenos asociados a fibrillas con hélices triples interrumpidas). El colágeno tipo XIV interactúa con la superficie de las fibrillas y está implicado en la regulación de la fribrilogénesis.
En ciertas realizaciones, la mutación en ADAM12 se selecciona del grupo que consiste de la mutación Q650K, R240L, C440Y, Q228E, H247D, M322I, T97fs, P168L y G308E en ADAM12, “fs” significa que las mutaciones llevan a un cambio de marco.
La célula cancerosa puede derivarse, por ejemplo, de cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCL), cáncer de pulmón de células bronquioloalviolares, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de glándula tiroidea, cáncer de glándula paratiroidea, cáncer de glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, leucemia crónica o aguda, linfomas linfocíticos, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores del eje espinal, glioma de tronco encefálico, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario, incluyendo las versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriores, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.
En ciertas realizaciones, la célula cancerosa se deriva de un paciente con cáncer.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para identificar un probable respondedor o un probable no respondedor a un inhibidor de MEK, que comprende detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12 en una muestra del paciente, poner en contacto la muestra con por lo menos un oligonucleótido que permite la detección específica de la mutación; identificar al paciente como un probable no respondedor al inhibidor de MEK si se detecta por lo menos una mutación en ADAM12 en la muestra.
Como se usa en la presente, el término "respondedor" puede referirse a un individuo/paciente/sujeto que es más probable que responda a un tratamiento usando un inhibidor de MEK o de ERK.
"Más probable que responda", como se usa en la presente, se refiere a una probabilidad aumentada de que se produzca una respuesta patológica completa en un paciente tratado con un inhibidor de MEK o de ERK. El término "no respondedor" puede referirse a un individuo/paciente/sujeto que es menos probable que responda a un tratamiento que usa un inhibidor de MEK o de ERK. "Menos probable que responda", como se usa en la presente, se refiere a una probabilidad disminuida de que se produzca una respuesta patológica completa en un paciente tratado con un inhibidor de MEK o de ERK.
En ciertas realizaciones, en casos en los que se evalúa que el paciente es un probable "respondedor", se recomienda que dicho paciente sea tratado con un inhibidor de MEK o de ERK.
En los casos en los que se identifica al paciente como un probable no respondedor, se recomienda que dicho paciente no sea tratado con una monoterapia del inhibidor de MEK o de ERK, o que no sea tratado con un inhibidor de MEK o de ERK.
En ciertas realizaciones, en las que el paciente se identifica como un probable no respondedor a un inhibidor de MEK, se recomienda que el paciente sea tratado con un inhibidor de MEK diferente, o que sea tratado con una terapia combinada de un inhibidor de MEK diferente y un agente terapéutico adicional de mecanismo distinto. Ejemplos de un inhibidor de MEK diferente del Trametinib incluyen, sin limitación, Selumetinib, Binimetinib (MEK162), PD-325901, Cobimetinib (GDC-0973, XL518), y CI-1040 (PD035901).
En ciertas realizaciones, el agente terapéutico adicional de mecanismo distinto puede ser un agente dirigido a la vía de señalización de PI3K-Akt-mTOR. Los agentes que se dirigen a la vía de señalización de PI3K-Akt-mTOR son conocidos en la técnica y comprenden, sin limitación, derivados de pirimidina fusionados como se divulga en la US8022205 (B2) o derivados de pirrolopirimidina fusionados como se divulga en la WO2009/099163.
El agente adicional de mecanismo distinto puede incluir inhibidores de c-Met (por ejemplo, ARQ197 (taventinib, desarrollado por Daichi Sankyo y ArQuIe), AMG458 (desarrollado por Amgen), GSK1363089 (también conocido como XL880 o foretinib, desarrollado por GSK), crizotinib (también conocido como PF2341066, desarrollado por Pfizer), PF04217903 (desarrollado por Pfizer), INCB28060 (desarrollado por Incyte), E7050 (desarrollado por Eisai), MK-2461 (desarrollado por Merck), BMS-777607 (desarrollado por BMS), JNJ-38877605 (desarrollado por Johnson & Johnson), XL184 (desarrollado por BMS/Exelixis)).
El agente terapéutico adicional de mecanismo distinto puede ser agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, ciclofosfamida (CTX; por ejemplo cytoxan®), clorambucilo (CHL; por ejemplo leukeran®), cisplatino (CisP; por ejemplo platino®) busulfán (por ejemplo myleran®), melfalán, carmustina (BCNU), estreptozotocina, trietilenmelamina (TEM), mitomicina C)
El agente terapéutico adicional de mecanismo distinto puede ser antimetabolitos, como metotrexato (MTX), etopósido (VP16, por ejemplo vepesid®), 6-mercaptopurina (6MP), 6-tiocguanina (6TG), citarabina (Ara-C), 5-fluorouracilo (5-FU), capecitabina (por ejemplo Xeloda®), dacarbazina (DTIC)).
El agente terapéutico adicional de mecanismo distinto puede ser otros agentes antitumorales, como paclitaxel (por ejemplo taxol®) y derivados de pactitaxel, los agentes citostáticos, glucocorticoides como la dexametasona (DEX, por ejemplo decadron®) y corticosteroides como prednisona, inhibidores de enzimas de nucleósidos como hidroxiurea, enzimas que reducen los aminoácidos como asparaginasa, leucovorina, ácido folínico, raltitrexed, y otros derivados del ácido fólico, y similares, diversos agentes antitumorales.
El agente terapéutico adicional de mecanismo distinto puede ser agentes anti-hormonales (por ejemplo, antagonistas de los receptores de esteroides, anti-estrógenos como tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de la aromatasa, otros inhibidores de la aromatasa, 42-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona y toremifeno (por ejemplo Fareston®); antiandrógenos como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; agonistas y/o antagonistas de hormonas glicoproteicas como la hormona estimulante de folículos (FSH), hormona estimuladora de tiroides (TSH), y hormona luteinizante (LH) y LHRH (hormona liberadora de hormona leuteinizante); el agonista de LHRH acetato de goserelina, disponible comercialmente como Zoladex® (AstraZeneca); el antagonista de LHRH D-alaninamida N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-alanil-4-cloro-D-fenilalanil-3-(3-piridinil)-D-alanil-L-seril-N6-(3-piridinilcarbonil)-L-lisil-N6-(3-piridinilcarbonil)-D-lisil-L-leucil-N6-(1-metiletil)-L-lisil-L-prolina (por ejemplo, Antide®, Ares-Serono); el antagonista de LHRH acetato de ganirelix; los antiandrógenos esteroideos acetato de ciproterona (CPA) y acetato de megestrol, disponibles comercialmente como Megace® (Bristol-Myers Oncology); el antiandrógeno no esteroideo flutamida (2-metil-N-[4,20-nitro-3-(trifluorometil)fenilpropanamida), disponible comercialmente como Eulexin® (Schering Corp.); el antiandrógeno no esteroideo nilutamida, (5,5-dimetil-3-[4-nitro-3-(trifluorometil-4'-nitrofenil)-4,4-dimetil-imidazolidin-diona); y antagonistas de otros receptores no permisivos, como antagonistas de RAR, RXR, TR, VDR y similares).
El agente terapéutico adicional de mecanismo distinto pueden ser inhibidores de la angiogénesis (por ejemplo, inhibidores de VEGFR, como SU-5416 y SU-6668 (Sugen Inc. de South San Francisco, Calif., USA), o como se describe en, por ejemplo, las solicitudes internacionales N° WO 99/24440, WO 99/62890, WO 95/21613, WO 99/61422, WO 98/50356, WO 99/10349, WO 97/32856, WO 97/22596, WO 98/54093, WO 98/02438, WO 99/16755, y WO 98/02437 y las US5883113 (A), US5886020 (A), US5792783 (A), US5834504 (A) and US6235764 (B1); inhibidores de VEGF como IM862 (Cytran Inc. de Kirkland, Wash., USA); angiozima, una ribozima sintética de Ribozima (Boulder, Colo.) y Chiron (Emeryville, Calif.); y anticuerpos contra VEGF, como bevacizumab (por ejemplo, Avastin™, Genentech, South San Francisco, Calif.), un anticuerpo humanizado recombinante contra VEGF, antagonistas del receptor de integrina y antagonistas de integrina, como las integrinas avp3, avps y avp6, y subtipos de las mismas, por ejemplo, cilengitida (EMD 121974), o los anticuerpos anti-integrina, como por ejemplo anticuerpos humanizados específicos de avp3 (por ejemplo Vitaxin®); factores tales como IFN-alfa US4530901 (A), US4503035 (A), y US5231176 (A)); fragmentos de angiostatina y plasminógeno (por ejemplo, kringle 14, kringle 5, kringle 1-3 (O'Reilly, M. S. et al. (1994) Cell 79:315-328; Cao et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 29461-29467; Cao et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:22924-22928); endostatina (O'Reilly, M. S. et al. (1997) Cell 88:277; y Publicación de Patente Internacional N° WO 97/15666), trombospondina (TSP-1, Frazier, (1991) Curr. Opin. Cell Biol. 3:792); factor 4 plaquetario (PF4); inhibidores del activador del plasminógeno/uroquinasa; antagonistas del receptor de uroquinasa; heparinasas; análogos de fumagilina como TNP-4701; suramina y análogos de suramina; esteroides angiostáticos; antagonistas de bFGF; antagonistas de flk-1 y flt-1; agentes anti-angiogénesis como inhibidores de MMP-2 (metaloprotienasa de la matriz 2) e inhibidores de MMP-9 (metaloprotienasa de la matriz 9)).
En ciertas realizaciones, la muestra es una célula cancerosa o tejido derivado del paciente.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para predecir la capacidad de respuesta de una célula cancerosa a un inhibidor de ERK, que comprende detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12 en la célula cancerosa, poniendo en contacto una muestra de ácido nucleico derivada de la célula cancerosa con por lo menos un oligonucleótido que permite la detección específica de la mutación, en donde la presencia de la mutación en ADAM12 es indicativa de una capacidad de respuesta disminuida de la célula cancerosa al inhibidor de ERK.
En ciertas realizaciones, la célula cancerosa se deriva de un paciente con cáncer.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de ERK es SCH772984. SCH772984, con nombre químico (R)-1-(2-oxo-2-(4-(4-(pirimidin-2-il)fenil)piperazin-1 -il)etil)-N-(3-(piridin-4-il)-1 H-indazol-5-il)pirrolidina-3-carboxamida, es un nuevo inhibidor selectivo y competitivo de ATP de ERK1/2 (ver Morris EJ et al., Discovery of a novel ERK inhibitor with activity in models of acquired resistance to BRAF and MEK inhibitors, Cancer Discov. 20133(7): 742-50). La estructura de SCH772984 se ilustra a continuación.
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En ciertas realizaciones, la mutación en ADAM12 se selecciona del grupo que consiste de la mutación Q650K, R240L, C440Y, Q228E, H247D, M322I, T97fs, P168L y G308E en ADAM12.
En ciertas realizaciones, el paso de detección comprende amplificar por lo menos una parte del gen con el oligonucleótido como cebador y detectar el producto de amplificación y determinar de este modo la presencia de la mutación en el gen.
En ciertas realizaciones, el paso de detección comprende poner en contacto la muestra de ácido nucleico con el oligonucleótido que hibrida específicamente con la mutación del gen para formar un complejo, y detectar la formación del complejo y determinar de este modo la presencia de la mutación en el gen.
En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona un método para identificar un probable respondedor o un probable no respondedor a un inhibidor de ERK, que comprende detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12 en una muestra del paciente, poniendo en contacto la muestra con por lo menos un oligonucleótido que permite la detección específica de la mutación; identificar al paciente como un probable no respondedor al inhibidor de ERK si se detecta por lo menos una mutación en ADAM12 en la muestra.
En ciertas realizaciones, el método comprende además recomendar al paciente que se ha identificado como un probable no respondedor que no sea tratado con una monoterapia del inhibidor de ERK, o que no sea tratado con un inhibidor de ERK.
En ciertas realizaciones, el método comprende además recomendar al paciente que se ha identificado como un probable no respondedor que sea tratado con un inhibidor de ERK diferente, o que sea tratado con una terapia combinada de un inhibidor de ERK diferente y un agente terapéutico adicional de distinto mecanismo. Ejemplos de inhibidores de ERK distintos de SCH772984 incluyen FR180204, GDC-0994.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un kit que comprende por lo menos un oligonucleótido útil para determinar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12.
En ciertas realizaciones, el por lo menos un oligonucleótido comprende una pareja de un primer oligonucleótido útil para amplificar por lo menos una parte de la secuencia génica.
En ciertas realizaciones, el por lo menos un oligonucleótido comprende una sonda útil para hibridar específicamente con la mutación del gen para formar un complejo.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de por lo menos un oligonucleótido en la fabricación de un kit para predecir la capacidad de respuesta de una célula cancerosa o un paciente con cáncer a un inhibidor de ERK, en donde el oligonucleótido es útil para detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de por lo menos un oligonucleótido en la fabricación de un kit para predecir la capacidad de respuesta de una célula cancerosa o un paciente con cáncer a un inhibidor de MEK, en donde el oligonucleótido es útil para detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12.
Ejemplo 1
El siguiente es un ejemplo de identificación de genes correlacionados con la sensibilidad a inhibidores de MEK y/o inhibidores de ERK.
Examinamos la actividad antiproliferación de un inhibidor de MEK, trametinib, y un inhibidor de ERK1/2, SCH772984, en un panel de 50 líneas celulares (ver Tabla 1).
Tabla 1. Líneas celulares usadas en la selección
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continuación
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Materiales y métodos
Cultivo celular
Todas las células se cultivarán en el medio suplementado con 10% de FBS excepto las que están marcadas especialmente, a una temperatura de 37° C, 5% de CO2 y 95% de humedad.
Reactivo de viabilidad celular
La viabilidad celular se evalúa usando el kit de ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo® (N° de catálogo: G7572, Promega. Almacenar a -20° C. Para preparar el reactivo CellTiter_Glo, se descongeló el tampón de CellTiter-Glo y se equilibró a temperatura ambiente antes de su uso. Para mayor comodidad, el tampón de CellTiter-Glo puede descongelarse y almacenarse a temperatura ambiente hasta 48 horas antes de su uso. El sustrato de CellTiter-Glo liofilizado se equilibra a temperatura ambiente antes de su uso. El volumen apropiado (100 ml) de tampón de CellTiter-Glo se transfiere a la botella ámbar que contiene sustrato de CellTiter-Glo para reconstituir la mezcla liofilizada de enzima/sustrato, que forma el reactivo CellTiter-Glo. En ciertos casos, puede añadirse todo el volumen de líquido del frasco de tampón de CellTiter-Glo al frasco de sustrato de CellTiter-Glo. Mezclar agitando con vórtice, removiendo o invirtiendo el contenido suavemente para obtener una solución homogénea. El sustrato de CellTiter-Glo debería volverse una solución fácilmente en menos de un minuto.
Inhibidor de MEK y de ERK
El inhibidor de MEK, Trametinib, , se adquirió de Selleckchem (N° de Cat. S2673) y se almacenó a -20° C antes de su uso. El inhibidor de ERK1/2, SCH772984, se adquirió de Selleckchem (N° de Cat. S7101) y se almacenó a -20° C antes de su uso.
Equipo
En los experimentos se usó el siguiente equipo: Lector multi marcador de EnVision 2104-0010A, PerkinElmer (USA), Countstar, Inno-Alliance Biotech (USA), Incubadora de CO2 con camisa de agua Forma Series II, Thermo Scientific (USA), Armario de seguridad biológica, Thermo Scientific, (USA); microscopio invertido, Olympus CKX41SF (Japón).
Citotoxicidad y determinación de IC50
El día antes del experimento (día -1), las células se disociaron durante el período de crecimiento logarítmico con tampón de disociación celular (Gibco 13151-014) y se mezclaron con el medio celular apropiado y se centrifugaron a 1000 rpm durante 3 minutos. Las células se volvieron a suspender y se contaron usando Countstar antes de ajustar las concentraciones de células a la densidad optimizada (es decir, 4,44x104 células/ml) con medio de cultivo respectivo enumerado en la Tabla 1 para el ensayo CTG de 3 días (La densidad celular se optimizó antes del estudio real; la densidad celular usada en la prueba puede variar para diferentes líneas celulares). Se añadieron suspensiones de células de 90 pl a dos placas de 96 pocillos (placas A y B) con una densidad celular final de 4x103 células/pocillo para el ensayo de CTG de 3 días (la densidad celular se optimizó antes del estudio real; la densidad celular usada en la prueba puede variar para diferentes líneas celulares). El grupo de la placa A y B se incubó durante la noche en una incubadora humidificada a 37° C con 5% de CO2.
El día 0, para el grupo de la placa A, se añadieron 10 pl de medio de cultivo a cada pocillo para la lectura de TO. El reactivo CellTiter-Glo® se añadió a un volumen igual de medio de cultivo celular presente en cada pocillo (por ejemplo, añadir 100 pl de reactivo a 100 pl de medio que contiene células para una placa de 96 pocillos). Los contenidos se mezclaron durante 2 minutos en un agitador orbital para facilitar la lisis celular. Se dejó incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la señal luminiscente. Se añadió una pegatina negra de sellado posterior al fondo de cada placa. La luminiscencia se registró usando el lector multi marcador EnVision. Esto formó la base del valor TO.
El día 0, los artículos de prueba y los controles positivos se disolvieron a la concentración indicada en el mapa de dilución de artículos de prueba. Se preparó una solución 100X en PBS y luego se diluyó con el medio de cultivo apropiado (1:10) en soluciones de trabajo 10X. Se dispensaron soluciones de fármaco de 10 pl (10x) en cada pocillo (triplicado para cada concentración de fármaco) del grupo de placa B de acuerdo con el mapa de inoculación de placa. Las placas de prueba se incubaron durante 4 días en la incubadora humidificada a 37° con 5% de CO2.
El día 3, se añadió el reactivo CellTiter-Glo® a un volumen igual de medio de cultivo celular presente en cada pocillo (por ejemplo, añadir 100 pl de reactivo a 100 pl de medio que contiene células para una placa de 96 pocillos). Los contenidos se mezclaron durante 2 minutos en un agitador orbital para inducir la lisis celular. Se dejó incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la señal luminiscente. Se colocó una pegatina negra de sellado posterior en la parte inferior de cada placa. La luminiscencia se registró usando el lector multi marcador EnVision.
Los datos se presentaron gráficamente usando GraphPad Prism 5.0. Para calcular la IC50, se ajustó una curva de respuesta a la dosis usando un modelo de regresión no lineal con una respuesta a la dosis sigmoidal. La fórmula para calcular la tasa de supervivencia se muestra a continuación; la IC50 absoluta se calcula cuando el eje Y se establece al 50% usando el software GraphPad Prism 5.0.
La tasa de supervivencia (%) = (Lumartícuio de prueba " Lumcontrol de medio) / (Lumsin tratamiento " Lumcontrol de medio) X Lumsin tratamiento - Lumcontroi de medio se establece al 100% y el Lumcontroi de medio se establece a una tasa de supervivencia del 0%. El valor TO se presentó como porcentaje de Lumsin tratramiento.
Análisis estadístico
Dividimos las 63 líneas celulares en grupos sensibles, insensibles e inciertos de acuerdo con sus IC50 para SCH772984 y Trametinib, respectivamente, luego detectamos genes con expresión diferencial o diferentes tipos de mutación entre grupos sensibles e insensibles. Estos genes se enriquecieron en varias vías relacionadas con el cáncer.
Las 63 líneas celulares se dividieron en 3 grupos (Ver Tabla 1): un grupo sensible (los valores de IC50 fueron menores de 1), un grupo insensible (los valores IC50 son mayores de 10), y un grupo incierto (el resto). Por consiguiente, obtuvimos 25 líneas celulares sensibles y 22 insensibles para SCH772984, y 34 líneas celulares sensibles y 24 insensibles para Trametinib. En el análisis posterior solo se usaron líneas celulares con datos genómicos. Los genes expresados diferencialmente y las vías enriquecidas se analizaron usando el software GSEA, los genes con diferentes tipos de mutación se detectaron usando la prueba exacta de Fisher.
Resultados
Para Trametinib, 32 líneas celulares sensibles y 23 insensibles tienen expresión génica perfilada por matrices Affymetrix U219, 34 conjuntos de genes están significativamente enriquecidos con un valor p nominal < 1% (Ver Tabla S2). 29 líneas celulares sensibles y 20 insensibles tienen información de mutación, y ADAM12, ( COL14A1, TNN y TP53 no son de acuerdo con la invención) se identificaron por un valor de corte de P de 0,01 (Ver Tabla 3 y FIG: 1-5).
Para SCH772984, 23 líneas celulares sensibles y 22 insensibles tienen expresión génica perfilada por matrices Affymetrix U219, 10 conjuntos de genes están significativamente enriquecidos con un valor p nominal < 1%.
21 líneas celulares sensibles y 18 insensibles tienen información de mutación, y ADAM12, (PEX5L, TNN y TP53; no son de acuerdo con la invención) se identificaron por un valor de corte de P de 0,01 (Ver Tabla 3 y FIG. 6-10).
Tabla 2. Información de IC50
N úm ero L ínea ce lu la r IC 50 a b s o lu ta (ulM )
SCH772984 Trametinib
1 A549 1.78 0.24
2 A2058 NA 0.12
3 Calu6 0.56 0.14
4 DLD-1 52.77 6.52
5 HCT1 16 0.45 0.04
6 HcpG2 0.13 0.00
7 MDA-MB-23 1 32.28 23.98
8 NC1-H23 3.69 0.30
9 NCI-H460 5.53 NA
10 RKO 17.46 6.70
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para predecir la capacidad de respuesta de una célula cancerosa a un inhibidor de MEK, que comprende:
detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12 en la célula cancerosa, poniendo en contacto una muestra de ácido nucleico derivada de la célula cancerosa con por lo menos un oligonucleótido que permite la detección específica de la mutación;
en donde la presencia de mutación en ADAM12 es indicativa de una capacidad de respuesta disminuida de la célula cancerosa al inhibidor de MEK.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la célula cancerosa se deriva de un paciente con cáncer; o en donde el inhibidor de MEK es Trametinib.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la mutación de ADAM12 se selecciona del grupo que consiste de la mutación Q650K, R240L, C440Y, Q228E, H247D, M322I, T97fs, P168L y G308E en ADAM12.
4. El método de la reivindicación 1, en donde el paso de detección comprende amplificar por lo menos una parte del gen con el oligonucleótido como cebador y detectar el producto de amplificación y determinar de este modo la presencia de la mutación en el gen.
5. El método de la reivindicación 1, en donde el paso de detección comprende poner en contacto la muestra de ácido nucleico con el oligonucleótido que hibrida específicamente con la mutación del gen para formar un complejo, y detectar la formación del complejo y determinar de este modo la presencia de la mutación en el gen.
6. Un método para identificar un probable respondedor o un probable no respondedor a un inhibidor de MEK, que comprende:
a) detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12 en una muestra del paciente, poniendo en contacto la muestra con por lo menos un oligonucleótido que permite la detección específica de la mutación; b) identificar al paciente como un probable no respondedor al inhibidor de MEK si se detecta por lo menos una mutación en ADAM12 en la muestra.
7. El método de la reivindicación 6,
en donde el inhibidor de MEK es Trametinib; o
en donde la mutación en ADAM12 se selecciona del grupo que consiste de la mutación Q650K, R240L, C440Y, Q228E, H247D, M322I, T97fs, P168L y G308E en ADAM12; o
en donde el método comprende además recomendar al paciente que se ha identificado como un probable no respondedor que no sea tratado con una monoterapia del inhibidor de ERK, o que no sea tratado con un inhibidor de MEK; o
en donde el método comprende además recomendar al paciente que se ha identificado como un probable no respondedor que sea tratado con un inhibidor de MEK diferente, o que sea tratado con una terapia combinada de un inhibidor de MEK diferente y un agente terapéutico adicional de distinto mecanismo; o
en donde el método comprende además recomendar al paciente que se ha identificado como un probable respondedor que sea tratado con el inhibidor de MEK; o
en donde la muestra es una célula cancerosa o tejido derivado del paciente.
8. Un método para predecir la capacidad de respuesta de una célula cancerosa a un inhibidor de ERK, que comprende:
detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12 en la célula cancerosa, poniendo en contacto una muestra de ácido nucleico derivada de la célula cancerosa con por lo menos un oligonucleótido que permite la detección específica de la mutación;
en donde la presencia de la mutación en ADAM12 es indicativa de una capacidad de respuesta disminuida de la célula cancerosa al inhibidor de ERK.
9. El método de la reivindicación 8,
en donde la célula cancerosa se deriva de un paciente con cáncer; o
en donde el inhibidor de ERK es SCH772984; o
en donde la mutación en ADAM12 se selecciona del grupo que consiste de la mutación Q650K, R240L, C440Y, Q228E, H247D, M322I, T97fs, P168L y G308E en ADAM12; o
en donde el paso de detección comprende amplificar por lo menos una parte del gen con el oligonucleótido como cebador y detectar el producto de amplificación y determinar de este modo la presencia de la mutación en el gen; o en donde el paso de detección comprende poner en contacto la muestra de ácido nucleico con el oligonucleótido que híbrida específicamente con la mutación del gen para formar un complejo, y detectar la formación del complejo y determinar de este modo la presencia de la mutación en el gen.
10. Un método para identificar un probable respondedor o un probable no respondedor a un inhibidor de ERK, que comprende:
a) detectar la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12 en una muestra del paciente, poniendo en contacto la muestra con por lo menos un oligonucleótido que permite la detección específica de la mutación; b) identificar al paciente como un probable no respondedor al inhibidor de ERK si se detecta por lo menos una mutación en ADAM12 en la muestra.
11. El método de la reivindicación 9,
en donde el inhibidor de ERK es SCH772984; o
en donde la mutación en ADAM12 se selecciona del grupo que consiste de la mutación Q650K, R240L, C440Y, Q228E, H247D, M322I, T97fs, P168L y G308E en ADAM12; o
en donde el método comprende además recomendar al paciente que se ha identificado como un probable no respondedor que no sea tratado con una monoterapia del inhibidor de ERK, o que no sea tratado con un inhibidor de ERK; o
en donde el método comprende además recomendar al paciente que se ha identificado como un probable no respondedor que sea tratado con un inhibidor de ERK diferente, o que sea tratado con una terapia combinada de un inhibidor de ERK diferente y un agente terapéutico adicional de distinto mecanismo; o
en donde la muestra es una célula cancerosa o tejido derivado del paciente.
12. El uso de un kit para predecir la capacidad de respuesta de una célula cancerosa a un inhibidor de MEK que comprende por lo menos un oligonucleótido útil en la determinación de la presencia de por lo menos una mutación en ADAM12.
13. El uso de un kit de la reivindicación 12, que comprende hibridar por lo menos un oligonucleótido con una secuencia de ácido nucleico de ADAM12 que codifica por lo menos una mutación seleccionada de Q650K, R240L, C440Y, Q228E, H247D, M322I, T97fs, P168L y G308E.
14. El uso de un kit de la reivindicación 13, en donde el por lo menos un oligonucleótido comprende una pareja de cebador útil para amplificar por lo menos una parte de la secuencia génica, o comprende una sonda útil para hibridar específicamente con la mutación del gen para formar un complejo.
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