ES2897573T3

ES2897573T3 - Dispositivo y procedimiento para la detección de analitos

Info

Publication number: ES2897573T3
Application number: ES13769064T
Authority: ES
Inventors: Leah Amir; Gary Anderson
Original assignee: XCELLCURE LLC
Current assignee: XCELLCURE LLC
Priority date: 2012-03-26
Filing date: 2013-03-26
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2033-03-26
Also published as: EP3968026A1; HK1207422A1; CN108226482A; US20200363427A1; US20150065372A1; US10564166B2; CN104755930A; US20180292414A1; US20240019445A1; CA2867298C; WO2013148708A1; CA3121358C; EP2831586A4; US11802880B2; CA3121358A1; CN104755930B; EP2831586A1; US12292449B2; DK2831586T3; US9958457B2

Abstract

Un dispositivo para la detección de uno o más analitos en una muestra obtenida de un sujeto, comprendiendo el dispositivo: a) una superficie para llevar a cabo al menos una reacción de detección, comprendiendo la superficie: una región de detección que comprende uno o más agentes de unión a epítopos; y una región de referencia que comprende el mismo uno o más agentes de unión a epítopos, en la que cada agente de unión a epítopos está configurado para unirse exclusivamente a uno de los al menos un analito, en el que la región de detección está separada de la región de referencia; b) uno o más sensores de detección para detectar la luz asociada a la región de detección; c) uno o más sensores de referencia para detectar la luz asociada a la región de referencia; y en el que el dispositivo está configurado de tal manera que la diferencia entre la señal generada desde la región de detección y la región de referencia se establece en cero antes de la adición de la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivo y procedimiento para la detección de analitos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere en general a dispositivos, sistemas y procedimientos para detectar analitos en una muestra de fluido corporal.

ANTECEDENTES

Los sistemas y dispositivos actuales para determinar la concentración de analitos en una muestra son adecuados para medir un solo analito por muestra, o utilizan equipos que no son adecuados para su uso portátil y con pilas. Los ejemplos incluyen WO 2008/113361 A1que divulga un sistema de flujo continuo, un dispositivo y un procedimiento para cuantificar un componente objetivo en un líquido, y US 2010/240149 A1que divulga un dispositivo de prueba de un solo paso procesado electrónicamente para detectar la presencia de un analito preseleccionado en un fluido. Para utilizar de la manera más eficaz la información que puede obtenerse de los biomarcadores, se necesita un sistema que sea rápido, portátil y capaz de detectar más de un analito a la vez. Este sistema puede utilizarse junto con diferentes biomarcadores para proporcionar la información necesaria para un pronóstico y un diagnóstico precisos.

Por lo tanto, existe la necesidad de un dispositivo que sea capaz de utilizar luz ambiental o de bajo nivel, que sea capaz de funcionar con batería u otra fuente de energía portátil, y que sea capaz de proporcionar información sobre más de un biomarcador a partir de una sola muestra biológica en menos de una hora.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Según un primer aspecto, la invención proporciona un dispositivo para la detección de uno o más analitos en una muestra obtenida de un sujeto, comprendiendo el dispositivo: a) una superficie para llevar a cabo al menos una reacción de detección, comprendiendo la superficie una región de detección que comprende uno o más agentes de unión a epítopos; y una región de referencia que comprende el mismo uno o más agentes de unión a epítopos, en la que cada agente de unión a epítopos está configurado para unirse exclusivamente a uno de los al menos uno de los analitos, en la que la región de detección está separada de la región de referencia; b) uno o más sensores de detección para detectar la luz asociada a la región de detección; c) uno o más sensores de referencia para detectar la luz asociada a la región de referencia; y en la que el dispositivo está configurado de tal manera que la diferencia entre la señal generada a partir de la región de detección y la región de referencia se establece en cero antes de la adición de la muestra.

Según un segundo aspecto, la invención proporciona un sistema para detectar uno o más analitos en una muestra y diagnosticar una condición, el sistema comprende: a) un dispositivo según el primer aspecto y al menos una fuente de luz para iluminar la región de detección y la región de referencia; b) un dispositivo informático que comprende uno o más procesadores; c) una memoria que comprende una base de datos de calibración que comprende uno o más conjuntos de calibración, cada conjunto de calibración comprende una conversión entre una lectura combinada del sensor y una concentración de un analito; una base de datos de diagnóstico que comprende uno o más valores de umbral y una o más reglas de diagnóstico; un CRM codificado con una aplicación de detección de analitos que comprende una pluralidad de módulos ejecutables por el uno o más procesadores, los módulos comprenden: un módulo de control para controlar el funcionamiento del dispositivo y coordinar la función de la pluralidad de módulos; un módulo de detección equilibrada para controlar el funcionamiento de uno o más sensores y/o fuentes de luz del dispositivo; un módulo de detección de analitos para procesar las señales de salida combinadas recibidas del módulo de detección equilibrada; un módulo de posprocesamiento para analizar aún más las concentraciones de analitos calculadas por el módulo de detección de analitos; un módulo de diagnóstico para comparar las entradas de la matriz de diagnóstico y determinar la condición de un sujeto de acuerdo con una o más reglas de diagnóstico definidas dentro de la base de datos de diagnóstico almacenada en la memoria; y un módulo de interfaz gráfica de usuario para generar uno o más formularios para recibir la entrada al sistema y/o mostrar la salida del sistema; y d) una pantalla.

De acuerdo con un tercer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para predecir un fallo cardíaco en un sujeto, el procedimiento comprende: (a) poner en contacto un dispositivo del primer aspecto con una muestra biológica obtenida del sujeto, en la que la región de detección y la región de referencia del dispositivo comprenden agentes de unión a epítopos específicos para al menos cuatro biomarcadores seleccionados de la Tabla A; (b) detectar con el dispositivo si el nivel de un analito estaba en el intervalo positivo indicado en la Tabla A; (c) identificar al sujeto como en riesgo de una futura insuficiencia cardíaca cuando uno o más de los analitos en la muestra biológica están en el intervalo positivo.

Otras características de la invención se describen en detalle a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 representa los niveles plasmáticos de varias quimiocinas en pacientes estabilizados y refractarios con angina inestable. Los niveles de CCL5 y CCL18 se determinaron por multiplexación en pacientes estabilizados y refractarios con angina de pecho inestable en t=0 (A). El ELISA se utilizó para el patrón temporal en t=0, t=2 y t=180 días. Los niveles de CCL5 disminuyeron significativamente en t=2 y se mantuvieron en el mismo nivel en t=180 (B), mientras que los niveles de CCL18 se mantuvieron elevados en t=2 y volvieron a disminuir en t=180 (C). Los niveles del ligando CD40 soluble (sCD40L) alcanzaron un máximo en t=0 y se redujeron en t=2 y t=180 (D). Los niveles de PCR mostraron un pico en t=2, y bajaron a valores inferiores a los de referencia (t=0) en t=180 (E). Los valores representan la media ± SEM, *P<0,05, **P<0,001 y N.S.=no significativo.

La FIG. 2 representa los niveles plasmáticos del cuartil superior de CCL5 y CCL18. Los niveles plasmáticos del cuartil superior de CCL5 y CCL18 se asociaron significativamente con la aparición de síntomas isquémicos refractarios en la angina de pecho inestable, mientras que los niveles del cuartil de sCD40L y PCR no mostraron ninguna correlación significativa (A). Los niveles del cuartil superior de CCL5 en el día 0 son predictivos de la necesidad de futuros procedimientos de revascularización (B), mientras que los niveles del cuartil superior de CCL18 fueron predictivos de síndromes coronarios agudos (C) o de síntomas recurrentes de angina de pecho inestable (D; UAP) en los siguientes 18 meses (C,D). *P=0,02, **P=0,01, #P<0,01 y N.S.=no significativo.

La FIG. 3 representa el análisis por PCR de la expresión de CCL5 y CCL18. El análisis cuantitativo de PCR mostró una expresión marcadamente reducida de CCL5 y CCL18 en las PBMC no estimuladas de pacientes con síntomas isquémicos en t=0 en comparación con las PBMC en t=180 (A). En contraste con la expresión de la proteína de superficie de los receptores de quimioquinas en las PBMC, la expresión del ARNm de los receptores de CCL5 y CCL18, CCR1, CCR3, CCR4 y c Cr 5, también fue aproximadamente 2 veces menor en la línea de base (B). Los valores representan la media ± SEM, *P<0,05 y **P<0,001.

La FIG. 4 representa la expresión proteica de CCR3 y CCR5 en las PBMC. La expresión proteica de CCR3 y CCR5 en las PBMC mostró una clara sobrerregulación de ambos receptores en las células CD14+ (A,B) y en las células CD330 (C,D) al inicio del estudio. El portal triple para CD14, CD3 y CCR3/5 reveló la misma tendencia, aunque las células CD14+ mostraron una sobrerregulación más prominente de la expresión de CCR3 y CCR5 que las células CD3+ (E,F). El análisis de la expresión total de la superficie de CCR3 y CCR5 en todas las PBMC también mostró una sobrerregulación drástica de la expresión de CCR3 y CCR5, lo que indica que el aumento de la expresión de CCR3 y CCR5 sólo está causado en parte por las células positivas CD3+ y CD14+ (G,H,I). *P<0,05, **P<0,01 y#P<0,001.

La FIG. 5 representa los efectos de la estimulación de las PBMC con rCCL5 y sCCL18 sobre la expresión de CCR1, CCR3, CCR4 y CCR5. La estimulación de las PBMC durante 6 horas con rCCL5 y sCCL18 no mostró diferencias significativas en la expresión del ARNm de CCR1 (A), CCR4 (C) y CCR5 (D ). La expresión de CCR3 se redujo notablemente tras la estimulación con sCCL18, pero no con rCCL5 (B). Los valores representan la media ± SEM, *P<0,01, N.S.=no significativo, rCCL5=CCL5 recombinante, sCCL18=CCL18 sintético.

La FIG. 6 representa la evaluación de la interacción heterofílica entre CCL5 y CCL18 en PAGE (18 %). Los carriles 1 y 2 muestran la movilidad de referencia de rCCL5 (7.851 kDa) y sCCL18 (7.855 kDa), ambas quimioquinas mostraron una escasa tendencia a formar homodímeros de 15,6 kDa. Los carriles 3 y 4 se cargaron con mezclas de rCCL5 y sCCL18 en una relación 1:1 y 1:5 (peso:peso), respectivamente, en las que los dímeros se han reticulado mediante incubación durante 30 min a TA con paraformaldehído 25 mM. Obsérvese la movilidad electroforética ligeramente superior y la tinción ligeramente más amarillenta del monómero y dímero de CCL18. El grado deformación de dímeros no se alteró tras la coincubación y posterior reticulación de CCL5 y CCL18, lo que indica que CCL5 y CCL18 probablemente no participan en ninguna interacción cruzada heterofílica significativa incluso a concentraciones suprafisiológicas. La carga total de proteínas por carril fue constante (2 |jg).

La FIG. 7 representa los resultados del análisis de la EM MALDI-TOF. El análisis PAGE fue corroborado por el análisis MALDI-TOF MS: CCL5 y CCL18 (10 pmol/jl) dieron picos de masa a aproximadamente 7.860 Da (M+; masa teórica de CCL5 y CCL18 7.851 y 7.855 Da, respectivamente), con sólo picos menores a aproximadamente 15.730 Da, ilustrando la baja tendencia a formar homodímeros (M2+) (A,B). La espectrometría de masas MALDI-TOF de CCL18 que se había preincubado con CCL5 en una relación 1:1 y 1:5 w:w (concentración total 10 pmol/jl) en 50 mM HEPES/0,1 mM EDTAcon paraformaldehído dio un patrón esencialmente similar y la formación de dímeros fue igualmente marginal en ambas proporciones (C,D).

La FIG. 8 representa gráficamente los niveles totales de células CD14+. Los niveles totales de células CD 14+ (monocitos y neutrófilos) no difirieron entre t=0 y t=180, mientras que las células CD3+ mostraron una pequeña (11,8 %), aunque significativa, disminución al inicio (A). A nivel de ARNm, se observó un aumento de neutrófilos HNP-3+, lo que sugiere una mayor liberación de neutrófilos tras la isquemia. Sin embargo, la relación de expresión CCR2:CX3CR1, una medida del perfil del subconjunto de monocitos, no estaba regulada de forma diferencial (B). Los valores representan la media ± SEM, *P=0,01, **P<0,001 y N.S.=no significativo.

La FIG. 9 representa un gráfico que demuestra que una exposición transitoria de los ratones a niveles elevados de CCL18 en la circulación (como la efectuada por la administración repetida de la proteína CCL18 recombinante) agravará el desarrollo de la aterosclerosis y, por tanto, aumentará el riesgo de enfermedad cardiovascular

La FIG. 10 representa un gráfico que demuestra que el desarrollo de la placa aterosclerótica en el seno aórtico de ratones hiperlimidémicos (LDLr-/-) con una deficiencia de CCL3 se reduce drásticamente. WT = tipo salvaje; CCL3-/- = ratones hiperlimidémicos. Eje Y = desarrollo de la placa aterosclerótica, reportado como área de la raíz aórtica ( ^|J m2).

La FIG. 11 representa gráficamente los niveles de CCL3 circulante (eje Y). Los niveles de CCL3 circulante en APRAIS eran comparables a los observados en los pacientes de la cohorte MISSION ! La monitorización temporal de CCL3 realizada en la cohorte APRAIS de pacientes con angina de pecho inestable muestra claramente el aumento transitorio de CCL3 durante la isquemia, ya que los niveles se redujeron significativamente en t=180 en comparación con t=0 (B). *P=0,03 y **P<0,001.

La FIG. 12 representa gráficamente los niveles del cuartil superior de CCL3. Los niveles de CCL3 en el cuartil superior al inicio del estudio predicen la aparición de síndromes coronarios agudos durante el seguimiento (A) . Además, los niveles del cuartil superior también eran indicativos de síntomas isquémicos recurrentes durante o directamente después de la hospitalización (B). *P=0,01 y **P<0,01.

La FIG. 13 representa gráficamente los niveles de varias quimiocinas. Los niveles plasmáticos de CCL3 (A), CCL5 (B) y CXCL8 (C) fueron significativamente elevados en los pacientes con IAM (•) frente a los controles ^{(o), mientras que el}cXcL10 ^(D) ^{mostró el patrón contrario. *P=0,025, **P=0,006, ***P=0,02 y #P=0,004.}La FIG. 14 representa gráficamente la evaluación de los niveles de IL-6, CCL3 y CXCL10 en ratones ligados a la LAD u operados de forma simulada. La isquemia cardíaca indujo niveles significativamente elevados de IL-6, y CCL3, (A,B). Por otro lado, CXCL10 mostró un patrón inverso (C). *P=0,007, **P=0,02 y ***P=0,03. La FIG. 15 representa gráficos que demuestran que los ratones ligados mostraron un aumento significativo en el porcentaje de células T circulantes con un enriquecimiento concomitante en los subconjuntos CCR5+ y CXCR3+ (A-C). El aumento de las células T circulantes se acompañó de una disminución de las células T esplénicas CCR5+ (E), mientras que no se observaron efectos sobre las células T esplénicas totales (D) o CXCR3+ (F). *P=0,04, **P-0,02, ***P=0,04 y #P=0,004.

La FIG. 16 representa el perfil temporal de la expresión de CCL3, CD86 y CD36 en el modelo de placa de la arteria carótida inducida por collar. Las placas de la arteria carótida inducidas por el collar mostraron una mayor producción de CCL3 2 semanas después de la colocación del collar (A). Se observó una inducción rápida y constante del marcador de macrófagos CD68 (B), mientras que la inducción del CD36 fue algo más tardía (C). **p<0,01 en comparación con la línea base (t=0).

La FIG. 17 muestra que la expresión de CCL3 en los macrófagos está fuertemente sobrerregulada tras la estimulación con LPS (50 ng/ml) (A) pero no con ox-LDL (10 ug/ml) (B ). La respuesta de CCL3 inducida por el LPS in vivo queda anulada en las quimeras CCL3-/-(C, barras negras)) ***p<0,001.

La FIG. 18 muestra que las lesiones ateroscleróticas eran significativamente más pequeñas en las quimeras CCL3-/- en comparación con los controles WT (A con imágenes representativas). El contenido de macrófagos ^{(B) ,} ^{colágeno (C) y células T (D) fue similar entre las quimeras}Wt ^{y CCL3-/-. La afluencia de neutrófilos (E)}y la adhesión (f ) se atenuaron significativamente en las quimeras CCL3-/-. Las barras blancas representan controles WT y las barras negras quimeras CCL3-/-. *p<0,05, **p<0,01.

La FIG. 19 representa el número total de glóbulos blancos (A; WBC) y el porcentaje de monocitos (B) no fue diferente en los ratones CCL3-/-, mientras que el número de neutrófilos (C) disminuyó significativamente. Las barras blancas representan WT y las negras quimeras CCL3-/-. **p<0,0l, ***p<0,001.

La FIG. 20 representa la cinética de la leucopenia transitoria inducida por la ciclofosfamida (A; recuento de glóbulos blancos en el eje Y) y la neutropenia (B; recuento de neutrófilos en el eje Y) en ratones de ^{control (barras blancas) y}Ccl3-/ ^{(barras negras). La eliminación de neutrófilos se acelera en las quimeras}CCL3-/-(C), mientras que la repoblación es similar (D). Las barras negras representan a los ratones WT y las barras blancas a los ratones CCL3-/-. *p<0,05. **p<0,01.

La FIG. 21 muestra que la inyección intraperitoneal de KC no afectó al número de neutrófilos circulantes ^{CD11b+ CD71- Gr1high en ratones WT y}cCl3 ^{-/- (A).} ^{La inducción de la afluencia de neutrófilos a la cavidad}peritoneal provocada por KC fue “ 2,5 veces menor en los ratones CCL3-/- en comparación con los ratones WT (B). Las barras blancas representan a los ratones WT y las barras negras a los ratones CCL3-/-. **p=0,003, La FIG. 22 es una ilustración esquemática del dispositivo.

La FIG. 23 es un diagrama de bloques que ilustra los elementos de un sistema.

La FIG. 24 es un diagrama de flujo que ilustra el funcionamiento del módulo de detección equilibrada.

La FIG. 25 es un diagrama de flujo que ilustra el funcionamiento del módulo de detección de analitos.

La FIG. 26 es un diagrama de flujo que ilustra el funcionamiento del módulo de posprocesamiento.

La FIG. 27 es un diagrama de flujo que ilustra el funcionamiento del módulo de diagnóstico.

La FIG. 28 es la ilustración esquemática de una vista superior de una superficie.

La FIG. 29 es una ilustración esquemática del dispositivo en una realización. (A ) representa una realización en una condición inicial, y (B) representa una realización durante una reacción enzimática.

La FIG. 30 es un ejemplo ilustrativo de una curva de calibración del analito.

Los caracteres de referencia y las etiquetas correspondientes indican los elementos correspondientes entre las vistas de los dibujos. Los títulos utilizados en las figuras no deben interpretarse como una limitación del ámbito de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En el presente documento se proporcionan dispositivos, sistemas y procedimientos para detectar analitos a partir de una reacción múltiplex. El dispositivo de detección puede incluir un sensor de imagen de óxido metálico complementario (CMOS). En una realización, el sensor CMOS puede estar diseñado para capturar/medir la detección de imágenes equilibradas resultantes de una reacción multiplexada de analitos en microarreglos seleccionados para informar de cantidades discretas de analitos objetivo individuales y/o combinados resultantes de una reacción de detección. La reacción de detección de analitos multiplexados en microarreglo puede llevarse a cabo utilizando el dispositivo con la expectativa de que el dispositivo mida e informe cantidades discretas o combinaciones de analitos discretos que proporcionen información para ayudar en el pronóstico y/o diagnóstico de estados de salud alterados en los vertebrados. La demostración de la sensibilidad de un enfoque de multiplexación para detectar cantidades de analitos objetivo en un fluido corporal, junto con la detección de imagen equilibrada diseñada específicamente para medir los resultados de una reacción de detección, demostró los principios científicos para habilitar una tecnología basada en CMOS como un sistema de detección de imagen equilibrada, y cuantificación de analitos seleccionados en un medio fluido.

Además, este dispositivo novedoso, ligero, portátil y de bajo consumo de energía, diseñado para detectar biomarcadores de enfermedades mediante la multiplexación de proteínas y/o ácidos nucleicos, también es capaz de utilizar luz ambiental de bajo nivel y temperatura ambiente para detectar los analitos/biomarcadores objetivo que se encuentran en los fluidos corporales de los vertebrados. En el presente documento se describen nuevos procedimientos para multiplexar un microarreglo de analitos, cuya combinación de resultados proporciona información para pronosticar o diagnosticar un estado de salud alterado. Los procedimientos para medir dichos analitos se logran adaptando los principios de la detección equilibrada capaz de utilizar un bajo nivel de luz apoyado por una fuente de baja energía. El procedimiento de detección es capaz de distinguir la concentración individual de 1 analito objetivo, o los valores individuales de múltiples analitos objetivo, y mediante el uso de software informar de una relación de múltiples analitos entre sí y con los estándares. El procedimiento de detección equilibrada permite un dispositivo portátil de bajo coste y peso ligero capaz de informar sobre múltiples analitos de forma rápida mediante, en algunas realizaciones, la adaptación de una reacción ELISA o una reacción de detección similar. El procedimiento de detección equilibrada puede adaptarse utilizando chip(s) CMOS para obtener imágenes de la diferencia de luz baja entre los grupos de píxeles que controlan los pocillos de reacción designados y los pocillos sin reacción (de referencia). El sistema de detección de imágenes CMOS, que incorpora una reacción ELISA modificada y un sistema de iluminación de bajo nivel, detecta un analito individual o múltiples analitos e informa mediante un novedoso algoritmo para proporcionar una salida en forma de gráfico o mediciones discretas de los analitos objetivo.

El prototipo de validación de la detección de la balanza adaptada para capturar y reportar una reacción ELISA de proteínas, material de ácido nucleico, polisacáridos u otras sustancias que pueden ser medidas o detectadas por un proceso enzimático demuestra el sustrato, el pocillo de reacción ELISA, la luz de bajo nivel, la portabilidad, la estabilidad y el bajo consumo de energía. El sistema prototipo incorpora un enfoque que es capaz de utilizar un mínimo de luz, reduce el tiempo de la reacción enzimática en comparación con los procedimientos estándar de laboratorio, y es capaz de modular la luz ambiental para permitir estandarizar el control según sea necesario en diferentes entornos. Todas las reacciones pueden llevarse a cabo a temperatura ambiente.

A continuación se proporcionan descripciones detalladas de diversos aspectos de los dispositivos de detección rápida, así como de los sistemas y procedimientos asociados para utilizar los dispositivos.

I. DISPOSITIVO

Según el primer aspecto, se proporciona un dispositivo para la detección rápida de uno o más analitos de una muestra de fluido corporal. El dispositivo puede estar configurado para recibir una muestra de fluido corporal y someter la muestra a una reacción de detección para detectar uno o más analitos en la muestra. La reacción de detección, como se describe en detalle más adelante, incluye múltiples pasos como la captura del analito y el marcado del analito capturado, pero no requiere otros pasos como el lavado, reduciendo así el tiempo necesario para detectar cada analito. Además, en ciertas realizaciones, la reacción de detección incorpora anticuerpos monoclonales altamente selectivos, lo que permite la detección múltiple de más de un analito a partir de una sola muestra de fluido corporal y reduce aún más el tiempo total requerido para detectar uno o más analitos.

El dispositivo utiliza una metodología de detección de sensor equilibrado para detectar y/o cuantificar uno o más analitos utilizando la diferencia en las lecturas medidas desde uno o más pares de sensores de luz: un primer sensor de luz situado cerca de una región de detección del analito y un segundo sensor de luz situado cerca de una región de control o estándar. La metodología de detección del sensor equilibrado mejora la sensibilidad del dispositivo, proporcionando la capacidad de detectar uno o más analitos bajo una variedad de condiciones de iluminación, incluyendo, pero no limitado a, condiciones de poca luz o luz ambiental.

El dispositivo, en diversas realizaciones, incorpora la detección de analitos multiplex y proporciona información de diagnóstico valiosa de manera oportuna para informar la toma de decisiones del sujeto o del médico del sujeto en una variedad de entornos clínicos, de punto de atención y/o en el hogar. Los procedimientos y elementos del dispositivo son capaces de funcionar a temperatura ambiente con una necesidad mínima de control ambiental. Además, el dispositivo es capaz de obtener mediciones incluso con una luz mínima mediante la modulación de la luz ambiental para poder normalizar el control según sea necesario en diferentes entornos.

FIG. 22 es una ilustración esquemática del dispositivo 100 en una realización. Como se ilustra en la FIG. 22, el dispositivo 100 puede incluir una superficie 102 para llevar a cabo una reacción de detección que incluye, pero no se limita a, el procedimiento ELISA modificado. La superficie 102 puede estar provista de una región de detección 104 y una región de referencia 106. La región de detección 104 y la región de referencia 106 pueden ser proporcionadas en una variedad de formas sin limitación, incluyendo, pero sin limitarse a, depresiones o pocillos como se ilustra en la FIG. 22. Tanto la región de detección 104 como la región de referencia 106 pueden contener uno o más agentes de unión a epítopos 108 para capturar uno o más analitos 110 de la muestra.

En uso, una muestra 112 que contiene uno o más analitos 110 puede introducirse en la región de detección 104 , y una sustancia de referencia 114, que no contiene el uno o más analitos 110 puede introducirse en la región de referencia 106. Alternativamente, una sustancia de referencia 114 puede contener analitos en cantidades conocidas. En otra alternativa, la región de referencia 106 puede comprender analito en cantidades conocidas absorbidas a la región de referencia. En otras realizaciones, la región de referencia 106 puede comprender cantidades conocidas de analito absorbido en lugares específicos conocidos (por ejemplo, patrones) a la región de referencia. Dentro de la región de detección, el o los analitos 110 pueden participar en una reacción de detección que puede alterar las propiedades ópticas de la región de detección 104. Por ejemplo, la reacción de detección puede capturar uno o más analitos 110 utilizando uno o más agentes de unión a epítopos 108 y puede unir además uno o más epítopos de detección marcados 116 a los analitos 110 capturados, provocando así la formación de productos de reacción opacos que reducen las propiedades de transmisión de luz de la región de detección 104.

El dispositivo 100 puede incluir además una fuente de luz 122, un sensor de luz de detección 118 y un sensor de luz de referencia 120. La fuente de luz 122 proporciona luz incoherente y/o coherente a la región de detección 104 y a la región de referencia 106. El sensor de luz de detección 118 y el sensor de luz de referencia 120 están configurados para detectar la luz asociada a la región de detección 104 y a la región de referencia 106, respectivamente. Por ejemplo, el sensor de luz de detección 118 puede estar situado cerca de un lado de la región de detección 104 opuesto a la fuente de luz 122 y puede detectar la luz transmitida a través de la región de detección 104 como se ilustra en la FIG. 22. El sensor de luz de referencia 120 puede estar situado de forma similar cerca de un lado de la región de referencia 106 opuesto a la fuente de luz 122 y puede detectar la luz transmitida a través de la región de referencia 106. Son posibles otras disposiciones de la fuente de luz 122, el sensor de luz de detección 118 y el sensor de luz de referencia 120 , como se describe más adelante.

En esta realización, la señal de detección 122 producida por el sensor de luz de detección 118 puede ser comparada con la señal de referencia 124 producida por el sensor de luz de referencia 120 utilizando un dispositivo de comparación de señales 126, tal como un amplificador óptico o un amplificador diferencial como se ilustra en la FIG.

22. La señal combinada 128, que puede ser una diferencia entre la señal de detección 122 y la señal de referencia 124 , puede compararse con una regla de calibración predeterminada para determinar la presencia y/o concentración de uno o más analitos 110 dentro de la muestra 112.

En varias realizaciones, un sistema (no mostrado) asociado con el dispositivo 100 puede ser usado para controlar la operación del dispositivo 100, para recoger la una o más señales combinadas 128, para procesar la una o más señales combinadas 128 para detectar y/o cuantificar el uno o más analitos 110 en la muestra 112, para determinar una o más condiciones de un sujeto, y/o comunicar uno o más resultados al usuario del sistema incluyendo, pero no limitado a la concentración o ratios de concentración del uno o más analitos 110, y/o la una o más condiciones del sujeto. A continuación, se describen en detalle varias formas de realización del sistema.

En diversas otras realizaciones, el dispositivo puede implementar la detección múltiplex de uno o más analitos 110 mediante la incorporación de dos o más agentes de unión a epítopos 108 dentro de la región de detección 104, donde cada uno de los agentes de unión a epítopos se selecciona para unirse exclusivamente a un único analito 110 que es diferente de los analitos 110 unidos porcada uno de los otros agentes de unión a epítopos 108. En otra realización, el dispositivo y la metodología de detección del sensor equilibrado para una reacción ELISA pueden utilizarse con un dispositivo de chip de semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS) que es portátil y rápido en la lectura de la respuesta de multiplexación a cada uno de los múltiples analitos objetivo, ya sea discretamente o en un grupo de analitos objetivo para crear una relación específica de la enfermedad.

(a) Superficie para una reacción de detección

El dispositivo comprende una superficie para una reacción de detección. Dicha superficie debe permitir la detección de una diferencia de luz entre un lugar de referencia y un lugar que comprende la reacción de detección. A modo de ejemplo no limitativo, la superficie puede ser de vidrio, plástico, nitrocelulosa, indio, estaño, cadmio, sílice, polímero de injerto de poli(etilenglicol) metacrilato, o variaciones de los mismos. El material de la superficie puede seleccionarse para que sea compatible con la composición particular o el tipo de muestra a analizar. Además, el material de la superficie puede seleccionarse para que sea compatible con una reacción de detección particular y/o con la configuración del sensor. Por ejemplo, se puede seleccionar un material transparente si los sensores están configurados para detectar la luz transmitida a través de cada punto o región dentro de la cual se produce una reacción de detección. En otro ejemplo, un material como la poliesterina puede utilizarse como superficie para facilitar la inmovilización del agente de unión al epítopo dentro de una región utilizada para llevar a cabo la reacción de detección. La superficie puede estar formada por un pocillo, un punto, una concavidad, un espacio, un pico u otras formaciones que permitan la detección de una diferencia de luz entre un lugar de referencia y un lugar que comprende una reacción de detección.

En general, una superficie para una reacción de detección será diseñada para sostener o apoyar una muestra de fluido corporal. Las muestras de fluidos corporales adecuadas pueden comprender sangre (incluyendo sangre entera, plasma, suero o una combinación de ellos), orina, esputo, lágrimas, líquido cefalorraquídeo, linfa, saliva, sudor u otros fluidos corporales. Los procedimientos de recolección de muestras de fluidos corporales son conocidos en la técnica. Típicamente, una muestra de fluido corporal debe comprender un volumen de aproximadamente 0,2 microlitros a aproximadamente 100 microlitros o más.

Una superficie para una reacción de detección comprende un medio para una reacción de detección. En general, un medio para una reacción de detección comprende uno o más agentes de unión al epítopo (es decir, agentes de unión al analito) y un medio para producir un cambio de luz. El cambio de luz puede ser una disminución de la luz detectable o un aumento de la luz detectable. En una realización, el cambio en la luz puede ser creado por la formación de un producto insoluble que no transmite la luz, y por lo tanto, resulta en una disminución de la luz detectable. Por ejemplo, el producto insoluble puede ser un complejo de agente de unión al epítopo/analito, un complejo de agente de unión al epítopo/analito/agente de detección marcado, o un agente de unión al epítopo/analito/agente de detección/marcado específico para el complejo de agente de detección. En otras realizaciones, el cambio en la luz puede ser creado por la formación de un producto que produce luz, lo que resulta en un aumento de la luz detectable. Los cambios de luz adecuados pueden incluir reacciones quimioluminiscentes y reacciones fluorescentes.

El término "agente de unión al epítopo" se refiere a una sustancia que es capaz de unirse a un analito. Los agentes de unión al epítopo adecuados pueden incluir un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de cadena única, un fragmento de anticuerpo, etc.), un aptámero, una secuencia de a Dn de doble cadena, un ligando y un fragmento de ligando, un receptor y un fragmento de receptor, un polinucleótido, una coenzima, un coregulador, una molécula alostérica o un ion. En una realización ejemplar, un agente de unión al epítopo es un anticuerpo.

Un agente de unión a epítopos puede ser absorbido o unido de otro modo a la superficie para una reacción de detección utilizando medios conocidos en la técnica.

El término "agente de detección" se refiere a una sustancia capaz de unirse a un analito. Los agentes de detección adecuados son equivalentes a los agentes de unión a epítopos, con la excepción de que, para un analito determinado, un agente de unión a epítopos y un agente de detección no se unirán al mismo epítopo del analito. En una realización ejemplar, un agente de unión al epítopo es un anticuerpo. En general, un agente de detección no se absorbe en una superficie. El término "agente de detección etiquetado" se refiere a un agente de detección que comprende una etiqueta detectable. Tal y como se utiliza aquí, una etiqueta detectable es aquella que provoca un cambio de luz, tal y como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, una etiqueta detectable puede ser una sustancia colorimétrica.

En algunas realizaciones, se utiliza más de un agente de unión al epítopo. Por ejemplo, se pueden utilizar dos agentes de unión a epítopos para un solo analito. En general, si se utilizan dos agentes de unión a epítopos, cada uno de ellos debe reconocer un epítopo distinto del analito. En realizaciones ejemplares, se utilizan uno o más anticuerpos como agentes de unión al epítopo.

Un analito, como se utiliza aquí, se refiere a una sustancia en una muestra de fluido corporal que puede medirse como una indicación del estado de salud/enfermedad de un sujeto. Tal y como se utiliza aquí, "analito" equivale a "biomarcador" Por ejemplo, un analito puede ser una proteína (por ejemplo, una quimioquina, un anticuerpo u otra proteína), un carbohidrato o una fracción de carbohidrato (por ejemplo, un azúcar, un almidón o un proteoglicano), un lípido o una fracción de lípido, un nucleótido o una secuencia de nucleótidos u otra biomolécula. Un analito puede ser extracelular, o la muestra de fluido corporal puede ser tratada para liberar un analito intracelular utilizando medios conocidos en la técnica. Alternativamente, un analito puede estar presente en la superficie de una célula en una muestra de fluido corporal. Dichas muestras pueden ser tratadas para liberar el analito de la membrana celular o de la superficie de la célula utilizando medios conocidos en la técnica.

Un dispositivo de la invención puede utilizarse para medir más de un analito. En tales casos, una superficie para una reacción de detección puede comprender múltiples agentes de unión a epítopos, con diferentes agentes de unión a epítopos dirigidos a diferentes analitos. En algunas realizaciones, se pueden utilizar más de un par de anticuerpos, siendo cada par de anticuerpos específico para un analito particular. En realizaciones ejemplares, un dispositivo puede medir más de un analito en un formato multiplex. Es decir, todos los analitos más de uno pueden ser medidos en un solo pocillo. En otras realizaciones ejemplares, se puede medir más de un analito en una reacción multiplexada de tipo microarreglo. Por ejemplo, en diversas realizaciones, se pueden detectar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o más de 13 analitos en una reacción multiplex. Tal y como se utiliza en el presente documento, múltiplex significa que los analitos se detectan simultáneamente en una única muestra de fluido corporal, a diferencia de los analitos individuales que se detectan en varias muestras diferentes, o en diferentes momentos con una única muestra.

Por ejemplo, para una realización de un dispositivo que incorpora un sensor CMOS, a) se pueden incluir múltiples anticuerpos de detección o sustratos pre-manchados para unirse con los analitos objetivo, o se puede utilizar la concavidad de cada espacio del chip CMOS. La localización de referencia o los controles pueden producirse dentro de la misma localización de reacción utilizando el procedimiento diferencial equilibrado y pueden ser realizados por el software de reconocimiento. La diferencia de señal entre los analitos en el CMOS mantiene la capacidad de identificar simultáneamente los analitos objetivo discretos mediante la comparación con los controles.

En otro ejemplo, utilizando una realización de dispositivo que incorpora un sensor CMOS (o quizás otro enfoque de pocillos de multiplexación) puede haber múltiples (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o más de 13) analitos situados en un pocillo de concavidad CMOS detectados juntos, multiplexando así un microarreglo de proteínas. Comparativamente puede haber otra concavidad del CMOS que contenga los controles para cada analito objetivo en este ejemplo. En otra realización, cada concavidad del sensor de imagen CMOS puede utilizarse para un solo analito y dentro del pocillo del analito objetivo su control para el objetivo en un pocillo inmediatamente adyacente.

Además, en este ejemplo se puede llevar a cabo una metodología ELISA competitiva con una concentración conocida de control. Durante la reacción, la ubicación de cada analito en la región de detección se comparará con los controles correspondientes dentro de la ubicación de cada control, con cada ubicación dentro de las mismas condiciones ambientales. Por ejemplo, la comparación puede ser entre el analito individual en la región de detección y un pocillo estándar que contiene los controles múltiples.

Los analitos individuales dentro de un pocillo/localización se diferencian por la ubicación estandarizada del punto del microarreglo dentro de ese pocillo/localización. La orientación espacial de los analitos producirá un patrón reconocido por la lectura del voltaje. Un sistema que incluye un software de análisis puede utilizarse para analizar el patrón y determinar la concentración de cada analito en la muestra.

FIG. 28 es una vista superior de una superficie 700 en una realización. La superficie puede incluir una o más regiones 702 dentro de las cuales puede ocurrir una reacción de detección. Por ejemplo, la región 702 etiquetada como "1" en la FIG. 28 puede contener reactivos adecuados para la reacción de detección de un primer analito, la región 702 etiquetada como "2" puede contener reactivos adecuados para la reacción de detección de un segundo analito, y así sucesivamente. En otra realización, un subconjunto de las regiones 702 puede ser regiones de detección utilizadas para llevar a cabo reacciones de detección de los analitos, y otro subconjunto de las regiones 702 puede ser regiones de referencia correspondientes a las regiones de detección y utilizadas para implementar la metodología de detección del sensor equilibrado. Por ejemplo, la región 702 etiquetada como "1" puede ser una región de detección para un primer analito y la región 702 etiquetada como "9" puede ser una región de referencia correspondiente a la región 702 etiquetada como "1". Del mismo modo, las regiones etiquetadas como "2" y "10" pueden ser una región de detección y la correspondiente región de referencia para un segundo analito, y así sucesivamente.

La forma de la superficie 700 y la disposición espacial de las regiones 702 puede ser cualquier forma y disposición conocida sin limitación. Ejemplos no limitantes de formas superficiales adecuadas incluyen la circular, la cuadrada y la rectangular. Ejemplos no limitantes de disposiciones adecuadas de las regiones 702 incluyen circular o anular, filas y columnas, y lineal.

Además, el patrón de las regiones de detección y las regiones de referencia correspondientes puede ser cualquier patrón conocido sin limitación. En una realización, la región de detección puede ser diametralmente opuesta a su correspondiente región de referencia en una disposición circular de regiones 702 como se ilustra en la FIG. 28. En otra realización, la región de detección y la región de referencia pueden ser inmediatamente adyacentes entre sí. Por ejemplo, las regiones 702 etiquetadas como "1" y "2" en la FIG.28 pueden ser las regiones de detección y de referencia para un primer analito Si se añade una cantidad conocida de analito a la región de referencia, entonces se necesitan pocillos separados (o equivalentes) para la región de detección y la región de referencia. Sin embargo, si la región de referencia comprende un analito conocido que está "pre-manchado" en la región de referencia, la región de referencia puede estar en el mismo pocillo (o equivalente) que la región de detección. Dicho de otro modo, en un pocillo (o equivalente), un dispositivo de la invención puede comprender un agente de unión al epítopo absorbido específico para un analito, y en el mismo pocillo (pero en una ubicación diferente dentro del pocillo), el dispositivo puede comprender además una cantidad conocida del analito en cuestión. Esto permite exponer la reacción de detección y la región de referencia a la misma muestra, y elimina la necesidad de dividir una muestra.

Volviendo a la FIG. 28, la superficie 700 puede incluir además un puerto de introducción de muestras 704 para la introducción de la muestra en la superficie 700. El puerto de introducción de la muestra puede ser un orificio o conducto como se ilustra en la FIG. 28. Alternativamente, el puerto de introducción de la muestra 704 puede ser una región de la superficie 700 sobre la que se coloca una gota de la muestra. En una realización, la muestra puede moverse desde el puerto de introducción de muestras 704 a las regiones 702 por cualquier medio conocido. En una realización, la muestra puede difundirse radialmente hacia fuera a través de la superficie hacia las regiones 702 por difusión o acción capilar. En otra realización, la superficie puede incluir canales microfluídicos 706 para transportar la muestra desde el puerto de introducción de muestras 704 a cada región 702. En otra realización, la superficie 700 puede incluir además una región de acondicionamiento 708 que contiene reactivos utilizados para formar un sustrato fluido a partir de la muestra que es adecuado para llevar a cabo las reacciones de detección múltiplex dentro de las regiones 702.

(b) Sensor

El dispositivo comprende además uno o más sensores en diversas realizaciones. En general, los uno o más sensores se utilizan para medir la diferencia de luz transmitida o reflejada desde puntos o regiones dentro de los cuales se realizan las reacciones de detección de los analitos y los controles correspondientes. Típicamente, el uno o más sensores son compatibles con la utilización de una metodología de detección de sensor equilibrado para detectar una diferencia de luz entre los grupos de píxeles que monitorizan las ubicaciones de reacción designadas en la superficie para una reacción de detección y la ubicación de referencia correspondiente de cada ubicación de reacción designada.

Cualquier dispositivo de detección de luz puede ser utilizado como sensor en diversas realizaciones del dispositivo sin limitación. En una realización, el sensor puede ser un sensor de imagen CMOS. En otra realización, el sensor puede ser un par de fotodiodos. En otras alternativas, el sensor puede ser cualquier sensor conocido en el arte para poder visualizar la diferencia de luz baja entre los grupos de píxeles que monitorizan las ubicaciones de reacción designadas en la superficie para una reacción de detección y las ubicaciones de referencia.

En diversas realizaciones, los uno o más sensores del dispositivo pueden utilizarse en un procedimiento de detección equilibrado que se implementa mediante circuitos de sensores asociados y software incluido en un sistema asociado al funcionamiento del dispositivo. En general, el "procedimiento de detección equilibrada" es un procedimiento en el que la diferencia entre la señal generada a partir de una localización de referencia y una localización de reacción correspondiente se fija en cero como condición inicial (por ejemplo, antes de la adición de un analito). Por ejemplo, cuando se utilizan fotodiodos, un par de fotodiodos puede configurarse como un "detector equilibrado", de manera que las corrientes de los fotodiodos se restan y se ponen a cero como condición inicial, como se ilustra en la FIG. 29A.

El equilibrado de los sensores puede realizarse al menos de dos maneras en diversas realizaciones. Volviendo a la FIG. 29A , que ilustra una realización, una fuente de luz de referencia 122B , como una fuente de luz LED o de diodo láser, puede estar dedicada a la región de referencia 106 y una fuente de luz de detección 122A separada puede estar dedicada a la región de detección 104. Si no hay un equilibrio inicial, la intensidad de la luz de cada una de las fuentes de luz 122A/122B puede ajustarse de tal manera que la intensidad de la luz detectada medida por el sensor de luz de detección 118 y el sensor de luz de referencia l20 sean esencialmente iguales entre sí, lo que resulta en lecturas iguales 122 y 124 del sensor de detección 118 y la referencia 120, respectivamente. En una segunda realización (no mostrada), las salidas de una o más fuentes de luz se fijan a una intensidad preseleccionada y el equilibrio de los sensores se consigue controlando el valor de una resistencia variable u otro componente de un circuito de control asociado a cada sensor. En una realización, si el sensor es un generador de imágenes CMOS, las resistencias variables asociadas con los píxeles que generan imágenes de la región de detección 104 y/o los píxeles que generan imágenes de la región de referencia 106 pueden ajustarse para equilibrar los sensores.

Refiriéndose a la FIG.29B, como la reacción enzimática tiene lugar dentro de la región de detección 104, la luz captada por el sensor de detección 118 puede ser alterada por los productos de la reacción de detección. Por ejemplo, la reacción de detección puede producir precipitados ópticamente opacos que pueden disminuir la intensidad de la luz detectada por el sensor de detección 118. El sensor de referencia 120 puede seguir detectando la misma intensidad de luz porque las condiciones dentro de la región de referencia 106 permanecen esencialmente inalteradas durante la reacción de detección en la región de reacción 104 , y por lo tanto genera la misma lectura 124 que su lectura inicial. Esta diferencia en la lectura 122 del sensor de detección 118 altera el "equilibrio" inicial de los sensores, dando lugar a una señal combinada 128no nula .

El cambio en la lectura combinada 128 puede entonces traducirse en una concentración de analito utilizando una curva de calibración. Un ejemplo ilustrativo de una curva de calibración del analito 900 se representa en la FIG. 30.

En una realización, la curva de calibración 900 puede desarrollarse realizando mediciones repetidas 902 utilizando el dispositivo 100 ilustrado en la FIG. 29A y FIG. 29B para una pluralidad de muestras que contienen concentraciones conocidas de analito que varían a través de un intervalo de calibración. En una realización, la curva de calibración puede utilizarse para convertir la señal de salida combinada que codifica el diferencial de luz detectado por uno o más sensores en mediciones de concentración de analitos dentro de 0,01 picogramos por mililitro de las concentraciones de analitos objetivo.

En diversas realizaciones, se puede utilizar un sensor CMOS para detectar las intensidades de luz de una o más regiones de detección y regiones de referencia del dispositivo. En una realización, el sensor CMOS puede obtener una imagen que contiene una matriz de píxeles que codifica un mapa espacial de la intensidad de luz medida detectada por el sensor CMOS. La imagen del sensor CMOS puede contener una pluralidad de subregiones en diferentes ubicaciones espaciales a lo largo de la imagen, en la que cada subregión corresponde a la intensidad de la luz medida desde una de las regiones de detección o de referencia de la superficie del dispositivo. Cada subregión puede contener uno o más píxeles de la imagen; cada píxel está asociado a una ubicación espacial y a una intensidad de píxel que codifica la intensidad de luz medida en esa ubicación espacial. En una realización, las intensidades de los píxeles dentro de cada subregión pueden clasificarse como región de detección o región de referencia para un analito concreto, basándose en la disposición espacial conocida de las regiones de detección y referencia en la superficie del dispositivo.

En diversas realizaciones, el equilibrio del píxel o grupos de píxeles asignados para cada biomarcador/analito puede realizarse de diferentes maneras. En una realización, el píxel o los grupos de píxeles de cada biomarcador/analito pueden equilibrarse individualmente. En otra realización, los píxeles de referencia de la región de referencia y los píxeles de detección de la ubicación de detección pueden elegirse sin tener en cuenta su asociación con ningún analito en particular y su señal de diferencia puede utilizarse para equilibrar los sensores. En esta segunda realización, no es necesario equilibrar la reacción y el/los píxel(s) de referencia asignados a cada biomarcador/analito a detectar.

En otro ejemplo, cuando se utiliza un sensor CMOS, para cada biomarcador/analito prepicado en la micromatriz que se va a multiplexar y detectar, habrá dos grupos de píxeles que tendrán cada uno un conjunto idéntico de índices asociados a cada uno de los uno o más analitos asignados. Uno de los grupos de píxeles controlará el lugar de la reacción mientras que el otro grupo se utilizará como referencia y controlará un lugar de referencia en el que no se produce ninguna reacción. Como condición inicial, la diferencia de las intensidades (por ejemplo, píxel a píxel o la media dentro de una región de interés) detectada por los dos grupos de píxeles para cada biomarcador/analito se equilibrará para que sea lo más cercana a cero posible, de forma similar al detector equilibrado construido por un par de fotodiodos. El cambio en la diferencia de las intensidades de luz detectadas se procesará para dar salida a la información sobre la reacción que se está produciendo para ser capturada como una diferencia de voltaje. La salida de tensión es comparada por el dispositivo y la salida de tensión es amplificada para producir un conjunto de señales combinadas asociadas a las concentraciones de uno o más analitos.

La implementación de la metodología del sensor equilibrado utilizando los sensores del dispositivo en diversas realizaciones puede mejorar la sensibilidad de las mediciones de las concentraciones de analitos en una amplia variedad de condiciones de iluminación, incluyendo condiciones de poca luz como la luz ambiental. Como resultado, la sensibilidad de las mediciones de la concentración de analitos puede mantenerse en niveles altos adecuados independientemente de las condiciones de iluminación. En una realización, el dispositivo puede utilizar la iluminación ambiental como fuente de luz, lo que resulta en un dispositivo con requisitos de energía relativamente bajos y una mayor portabilidad.

(c) Fuente de luz

En diversas realizaciones, una fuente de luz ilumina las regiones de detección y de referencia. En una realización, la luz ambiental o la luz de bajo nivel puede utilizarse como fuente de luz, eliminando así la necesidad de incluir una fuente de luz alimentada en el dispositivo. Alternativamente, otras fuentes de luz coherentes o incoherentes pueden ser incorporadas al dispositivo para su uso como fuente de luz. Ejemplos no limitantes de fuentes de luz adecuadas incluyen fuentes de luz incandescente, diodos láser y diodos emisores de luz (LED).

La fuente de luz puede estar situada en cualquier ubicación relativa a uno o más sensores del dispositivo sin limitación. En diversas realizaciones, la fuente de luz puede estar situada en el mismo lado de la superficie del dispositivo que los sensores, y los sensores están configurados para detectar la luz reflejada desde las regiones de detección y referencia. En otras realizaciones, la fuente de luz puede estar situada en un lado opuesto de la superficie en relación con los sensores, y los sensores están configurados para medir la luz transmitida a través de las regiones de detección y referencia.

La FIG. 22 ilustra la disposición de la fuente de luz 122 en relación con los otros componentes del dispositivo 100 en una realización. En esta realización, la fuente de luz 122 está situada por encima del sustrato/bandeja 102 y los sensores de detección/referencia 118/120 están situados por debajo de la bandeja 102 para detectar la luz transmitida a través de la región de detección 104 y la región de referencia 106. En otra realización, la fuente de luz 122 del dispositivo 100 ilustrado en la FIG. 22 puede omitirse, y los sensores 118/120 pueden detectar la luz ambiental transmitida a través de las regiones de detección y referencia 104 y 106.

(d) Otras características del dispositivo

Un dispositivo de la invención está destinado a ser portátil. Para ello, el dispositivo debe ser ligero, debe ser funcional a temperatura ambiente, debe producir un resultado en menos de 40 minutos, preferentemente 30 minutos o menos, debe utilizar una fuente de energía baja, como una o más baterías, y debe funcionar con luz ambiental o de bajo nivel.

II. PROCEDIMIENTOS DE USO

Un procedimiento de detección puede utilizar el dispositivo de detección para medir uno o más de un analito en una muestra. En una realización ejemplar, un dispositivo de la invención puede utilizarse para medir un analito o una combinación de analitos detallados en la sección III más adelante. El procedimiento de detección puede incluir, entre otros, un procedimiento ELISA modificado y la multiplexación de la detección de analitos. El ELISA modificado puede incluir una solución combinada que contenga una muestra de fluido corporal, un agente de detección marcado y cualquier otro reactivo necesario para el procedimiento ELISA modificado. La solución combinada puede incluir múltiples agentes de detección marcados para múltiples analitos dentro de la muestra de fluido corporal.

La detección multiplexada de analitos puede utilizarse para hacer una determinación de enfermedad basada en la señal del dispositivo. Las mediciones obtenidas mediante un dispositivo de detección pueden utilizarse para tomar decisiones de tratamiento sobre el sujeto a partir de la muestra de fluido corporal proporcionada. Por ejemplo, véase la tabla C más abajo.

(a) Procedimiento ELISA modificado

En una realización, la reacción de detección es un ELISA modificado. En general, un ELISA incluye el recubrimiento de un sustrato con un anticuerpo de captura específico para el analito, la inmovilización del analito mediante la adición de la muestra, la adición de un anticuerpo de detección para formar un complejo con el analito y la detección del complejo mediante un anticuerpo secundario unido a una enzima. Entre cada paso, el sustrato se lava con un detergente suave para eliminar cualquier proteína o anticuerpo que no esté específicamente unido. Puede ser necesario repetir el paso de lavado varias veces para asegurar que se eliminan todos los anticuerpos y proteínas en exceso. A continuación se añade un sustrato enzimático que producirá una señal visible que se correlaciona con la concentración del analito en esa muestra. La señal de la muestra puede compararse con una escalera estándar conocida para determinar la concentración. Un ELISA típico puede tardar entre 5 y 24 horas en completarse debido a los tiempos de incubación para cada uno de los pasos junto con los pasos de lavado entre cada paso de incubación.

Alternativamente, una reacción de detección de la presente invención puede incluir un procedimiento ELISA modificado. Un procedimiento ELISA modificado puede incluir la combinación de una muestra de fluido corporal que comprende uno o más analitos, agentes de detección marcados (o anticuerpos de detección y reactivos indicadores) en una solución combinada y la incubación conjunta. En una realización, el sustrato puede ser pretratado con uno o más agentes de unión al epítopo (anticuerpos de captura) antes de la adición de la solución combinada.

El agente de unión al epítopo y el agente de detección utilizados en el procedimiento ELISA modificado pueden ser anticuerpos. En una realización, el agente de unión al epítopo puede ser un anticuerpo monoclonal. En otra realización, el agente de detección marcado puede ser un anticuerpo monoclonal. Una ventaja del uso de anticuerpos monoclonales es que los reactivos pueden mezclarse, lavarse y ponerse en el sustrato al mismo tiempo, reduciendo así el tiempo de la reacción de detección. En una realización, se puede utilizar más de un anticuerpo monoclonal en el procedimiento ELISA modificado para detectar más de un analito en la muestra de fluido corporal.

En algunas realizaciones, un agente de unión a epítopos de anticuerpos monoclonales y un agente de detección de anticuerpos monoclonales pueden coincubarse con la muestra. La combinación de la muestra y el agente de detección o el agente de detección marcado y los reactivos indicadores puede disminuir los pasos estándar de ELISA al eliminar los tiempos de incubación por separado y eliminar los pasos de lavado entre ellos. Además de la reducción de los tiempos de reacción, el procedimiento ELISA modificado puede mejorarse mediante la selección y modificación de los reactivos en curso.

La metodología del estándar ELISA fue modificada para utilizar el esquema de detección de equilibrio, tomando alrededor de 30 minutos en lugar de las típicas 5 horas a 24 horas. Por ejemplo, el procedimiento ELISA modificado que utiliza anticuerpos monoclonales individuales puede proporcionar un resultado preciso en aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 minutos desde la introducción del analito en el anticuerpo. Este aspecto del procedimiento de detección de anticuerpos monoclonales puede medir una combinación de analitos objetivo y puede adaptarse a un sensor de imagen CMOS portátil con metodología de detección equilibrada. En una realización preferida, un dispositivo de la invención puede proporcionar un resultado preciso en menos de 35 minutos después de la introducción del analito al agente de unión al epítopo.

En una realización, un procedimiento de tinción del procedimiento ELISA modificado (BCIP/NBT) puede detectarse utilizando el sistema de detección equilibrado con luz ambiental. El sustrato insoluble puede permitir la monitorización en tiempo real de diferentes biomarcadores en puntos individuales del microarreglo sin detener el desarrollo del sustrato.

En otra realización, un dispositivo de la invención mide el cambio de luz del complejo agente de unión epitópico/analito/agente de detección solo, sin el uso de una sustancia colorimétrica.

Una vez en la región de detección, la reacción ELISA acortada puede utilizarse para reducir el tiempo necesario para detectar la concentración de los analitos objetivo. Múltiples analitos en el fluido corporal pueden ser expuestos a las cámaras dentro del dispositivo. La reacción puede modificar los analitos de la muestra para permitir la detección de la luz. En una realización, el procedimiento de detección simplificado puede cumplir con las especificaciones de un dispositivo de multiplexación del sensor de imagen CMOS.

(b) Detección multiplexada de analitos

La solución combinada puede utilizarse para detectar múltiples analitos dentro de una muestra. Como se ha descrito anteriormente, se puede colocar en el dispositivo una solución combinada que contenga una muestra con analitos, múltiples agentes de detección marcados o sin marcar, y/o reactivos indicadores. El procedimiento ELISA modificado junto con la multiplexación de anticuerpos puede permitir un procedimiento relativamente rápido de detección de múltiples analitos en una sola muestra.

Los agentes de unión al epítopo y/o los agentes de detección marcados pueden ser anticuerpos monoclonales en una realización. Esto puede permitir una unión específica al analito sin una reacción cruzada significativa. El uso de anticuerpos monoclonales permite la unión específica de cada analito a su anticuerpo monoclonal de captura y/o detección específico (agente de captura de epítopos y/o agente de detección marcado). No es necesario aplicar soluciones separadas que contengan diferentes agentes de detección para cada analito que se desee detectar, lo que reduce el tiempo de ensayo y simplifica el proceso.

La multiplexación de pares de anticuerpos novedosos y únicos con una reactividad cruzada mínima puede utilizarse para identificar de forma exclusiva cada analito objetivo. Una solución combinada que contenga múltiples anticuerpos puede colocarse en un sustrato de pocillo de reacción. En una realización, la solución combinada puede contener más de un anticuerpo que oscila entre aproximadamente 2 y aproximadamente 20 anticuerpos. En otra realización, la solución puede contener más de un anticuerpo que va de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 anticuerpos, de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 anticuerpos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 anticuerpos, de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 anticuerpos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 14 anticuerpos, y de aproximadamente 12 a aproximadamente 16 anticuerpos, de aproximadamente 14 a aproximadamente 18 anticuerpos, de aproximadamente 16 a aproximadamente 20 anticuerpos. En una realización, la solución puede contener al menos 13 anticuerpos combinados.

En una realización, se puede utilizar vidrio recubierto como sustrato. A continuación, el portaobjetos puede leerse utilizando un microscopio ELISA estándar, un lector de placas Elisa o fotografías de microscopio con procesamiento de imágenes.

Se verificó que el procedimiento de detección equilibrada era adaptable al ensayo ELISA estándar para la adaptación de la multiplexación de los pares de anticuerpos.

Los pares de anticuerpos monoclonales seleccionados y probados pueden utilizarse para los analitos objetivo en el sistema de detección portátil. Específicamente, en una realización del dispositivo se probaron repetidamente cinco analitos diana CCL3, CCL5, CCL18, hsCRP y Tnl cardíaca para identificar la combinación ideal de pares de anticuerpos capaces de detectar individualmente cada analito diana específico en una cámara de reacción sin reaccionar de forma cruzada con los otros pares de anticuerpos monoclonales. La sensibilidad medida fue consistente con la necesidad de reportar niveles dentro de los límites normales para que un humano tenga el intervalo para detectar niveles elevados de los anticuerpos específicos.

En otras realizaciones, cada uno de los analitos de la Tabla A a continuación son detectables utilizando un dispositivo de la invención. Específicamente, en una realización ejemplar, el dispositivo comprende un único pocillo (o equivalente) que comprende al menos un agente de unión a epítopos específico para cada analito enumerado en la Tabla A. Los analitos de la Tabla A se detectan entonces utilizando agentes de detección incluidos en la solución combinada. En estas realizaciones, la región de referencia puede estar situada en el mismo pocillo que la región de detección, o en un pocillo separado. En otras realizaciones, un dispositivo de la invención se utiliza para detectar al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 de los analitos enumerados en la Tabla A. En una realización particular, un dispositivo de la invención puede utilizarse para detectar una combinación de analitos indicados en las Tablas B o C.

La señal combinada de los múltiples analitos puede entonces ser comparada con un estándar a través de la comparación diferencial descrita anteriormente. El resultado puede utilizarse para desarrollar una relación específica de la enfermedad y proporcionar una respuesta al médico o al paciente.

En otra realización, debido al aspecto único de utilizar el comparador equilibrado con un sustrato ópticamente opaco (BCIP/NBT), los pares individuales de estándar y referencia para cada analito pueden ser monitorizados en tiempo real a medida que las localizaciones desarrollan su opacidad. Esto permite que los analitos individuales se midan de forma independiente a medida que se desarrollan y elimina la necesidad de que todos los analitos se lean simultáneamente.

(c) Detección de analitos en la muestra

El procedimiento de detección puede incluir la introducción de una muestra en el dispositivo de detección, la adición de la solución combinada y la obtención de lecturas del dispositivo de detección. Antes de introducir la muestra, el sustrato del dispositivo de detección puede ser pretratado con agentes de unión a epítopos. Los agentes de unión a epítopos son específicos para los analitos objetivo que se desea detectar.

La muestra de fluido corporal puede introducirse en la cámara de reacción o en el sustrato. El mecanismo de introducción puede ser el resultado de un pinchazo de sangre en el dedo, la captura de esputo o cualquier otra captura de otros fluidos corporales. La muestra de fluido corporal puede introducirse en enzimas, tampones y/o reactivos para permitir una reacción enzimática. El fluido corporal puede ser introducido utilizando un procedimiento de pipeteo externo en una realización.

La muestra de fluido corporal puede combinarse con múltiples agentes de detección marcados y cualquier otro reactivo deseado para el procedimiento ELISA modificado. Una vez en la cámara de reacción, el procedimiento ELISA modificado puede utilizarse para reducir el tiempo necesario para detectar la concentración de los analitos objetivo. Múltiples analitos en la muestra de fluido corporal pueden ser expuestos a las cámaras dentro del dispositivo.

La reacción puede modificar los analitos en la muestra de fluido corporal para permitir que se informe una detección de luz. La señal puede entonces ser detectada por el dispositivo. El protocolo simplificado puede cumplir las especificaciones del dispositivo de multiplexación del sensor de imagen CMOS. En una realización, el dispositivo puede informar sobre el estado del paciente basándose en los niveles de cada analito detectado.

El dispositivo utiliza una metodología de detección de sensor equilibrado para detectar y/o cuantificar uno o más analitos utilizando la diferencia en las lecturas medidas desde uno o más pares de sensores de luz: un primer sensor de luz situado cerca de una región de detección del analito y un segundo sensor de luz situado cerca de una región de control o estándar. La metodología de detección del sensor equilibrado mejora la sensibilidad del dispositivo, proporcionando la capacidad de detectar uno o más analitos bajo una variedad de condiciones de iluminación, incluyendo, pero no limitado a, condiciones de poca luz o luz ambiental. Una evaluación de exceso/defecto del comparador puede informar de un par de comparadores a la vez mientras un sustrato se desarrolla y precipita en un punto apropiado.

En otra realización de la invención, el sensor de imagen CMOS puede escanear una serie de reacciones por encima/por debajo para producir una serie de resultados que luego se convierten en una salida de voltaje convertida en una medida específica de cada analito desconocido o objetivo que se pretende medir.

MI. Combinaciones específicas de biomarcadores/analitos

Se ha descubierto que un panel de biomarcadores puede utilizarse para predecir un fallo cardíaco y/o el cierre de una herida, por nombrar algunas aplicaciones del presente dispositivo. En particular, un procedimiento de detección puede utilizarse para predecir un fallo cardíaco inminente en un sujeto incluso cuando otros procedimientos de diagnóstico no indican un fallo cardíaco. Ventajosamente, el procedimiento de detección de la invención puede predecir un fallo cardíaco inminente en aproximadamente 180 días. En realizaciones ejemplares, el procedimiento de la invención puede predecir un fallo cardíaco inminente en un plazo de entre 72 horas y 2 semanas después de emplear el procedimiento. También se describe en el presente documento un procedimiento de detección que puede utilizarse para determinar el curso y/o la fase de curación de la herida en un sujeto. En general, el procedimiento comprende, en parte, la determinación del nivel de biomarcadores en una muestra biológica tomada del sujeto. Los componentes del procedimiento y los biomarcadores se describen con más detalle a continuación.

(a) sujeto

A los efectos de los aspectos y las realizaciones de la invención, el sujeto puede ser un ser humano o cualquier otro animal. En determinadas realizaciones, el sujeto se selecciona del grupo que consiste en primates, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, leporinos, aviares, felinos, roedores o caninos. En una realización, el sujeto es un roedor. Algunos ejemplos de roedores son los ratones, las ratas y las cobayas. En otra realización, el sujeto es un primate. Ejemplos de primates son los monos, los simios y los humanos. En una realización ejemplar, el sujeto es un humano.

En algunas realizaciones, el sujeto puede quejarse de molestias que pueden indicar o ser sugestivas de insuficiencia cardíaca. Entre los ejemplos no limitantes de molestias que pueden indicar una insuficiencia cardíaca se encuentran el dolor o la presión en el pecho, una sensación extraña en el pecho, sudoración, dificultad para respirar, náuseas o vómitos, dolor, presión o una sensación extraña en la espalda, el cuello, la mandíbula o la parte superior del vientre, o en uno o ambos hombros o brazos, aturdimiento o debilidad repentina, pesadez o debilidad de las extremidades inferiores, o un ritmo cardíaco rápido o irregular. Un experto en la materia reconocerá que tales ejemplos de incomodidad pueden variar, y muy probablemente lo harán, de un sujeto a otro, y de un hombre a una mujer.

También se describe en el presente documento cuando un sujeto puede tener una herida abierta. En términos generales, el modelo clásico de curación de heridas se divide en tres o cuatro fases secuenciales, aunque superpuestas: (1) hemostasia (no considerada una fase por algunos autores), (2) inflamatoria, (3) proliferativa y (4) de remodelación. Un sujeto adecuado de la invención puede tener una herida en cualquiera de estas cuatro etapas. Un sujeto puede tener una herida que está progresando en el proceso de curación, o puede tener una herida que no está progresando (por ejemplo, no está curando).

(b) Muestra biológica

El nivel de biomarcadores se determina en una muestra biológica tomada del sujeto. Una muestra biológica, como se define en el presente documento, puede ser una cantidad de fluido corporal tomada de un sujeto. Ejemplos no limitantes de fluidos corporales pueden ser el plasma, el suero, la sangre entera, el líquido cefalorraquídeo (LCR), el líquido sinovial, el líquido tisular, el líquido de órganos, como la bilis, el semen y similares, los humores, como el humor vítreo, los fluidos de lavado como el fluido de lavado nasal y el fluido de lavado broncoalveolar, secreciones, como los fluidos mucinosos, exudados, saliva, transpiración y lágrimas, productos de desecho y otros fluidos biológicos en el caso de los animales no humanos. En una realización ejemplar, la muestra biológica es sangre.

En una realización, la muestra biológica se selecciona del grupo que comprende la sangre entera, el suero y el plasma. En una realización adicional, la muestra biológica es sangre entera. En otra realización, la muestra biológica es suero. En otra realización, la muestra biológica es plasma. En otra realización, la muestra biológica es suero humano. En una realización ejemplar, la muestra biológica es sangre entera humana.

El procedimiento de recolección de un fluido corporal de un sujeto puede variar y variará dependiendo de la naturaleza del fluido corporal. Para recoger un fluido corporal de un sujeto se puede utilizar cualquiera de los procedimientos generalmente conocidos en la técnica. Los fluidos corporales de la muestra de ensayo pueden tomarse de un sujeto utilizando cualquier dispositivo o procedimiento conocido. Los dispositivos o procedimientos adecuados para tomar fluidos corporales de un mamífero incluyen vasos para muestras de orina, catéteres uretrales, hisopos, agujas hipodérmicas, biopsias con agujas finas, biopsias con agujas huecas, biopsias con sacabocados, jaulas metabólicas y aspiración. En las realizaciones preferidas, el fluido corporal proporcionado es sangre. Los procedimientos de recolección de sangre o de fracciones de la misma son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, véase Patente estadounidense n° 5.286.262. En general, independientemente del procedimiento utilizado para recoger un fluido corporal, el procedimiento mantiene preferentemente la integridad de los biomarcadores de manera que puedan ser cuantificados con precisión en el fluido corporal.

(c) Biomarcadores/analitos

Una realización de la invención mide el nivel de un biomarcador dentro de una muestra biológica. Tal y como se utiliza aquí, "nivel de un biomarcador" se refiere a la cantidad de ARN que codifica el biomarcador/analito presente en una muestra, la tasa de transcripción de un biomarcador, la cantidad de proteína del biomarcador en una muestra, la tasa de síntesis de proteínas o el nivel de actividad enzimática de un biomarcador.

Los biomarcadores adecuados incluyen pero no se limitan a CCL2, CCL3,CCL11, CCL17, CCL18, CCL22, CCL5, troponina, hs-Troponina, isoformas de troponina esquelética, cistatina C, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-6, IL-7 IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-18, TNF/TNFalfa, MMP9, MMP2, MMP3, CK-MB, GDF-15, H-FABP/FABP3, hs-CRP, LpPLA2, MPO, Mioglobina, NT-proBNP, proteína plasmática A asociada al embarazo (PAPP-A), FAS soluble, TIMP-1, IL-33, IL-34, IL-23, IL-17, CXCR4/CXCL12 (SDF-1), CX3CL1, CXCL2, CXCL8, CXCL9, CXCL10 (IP-10), CXCL16, CCL25, proteína de choque térmico 27 (HSP27, CCR 9, sCD40L, factor similar a las quimiocinas MIF (factor inhibidor de la migración de macrófagos), OSM (oncostatina M), interferones, osteoprotegerina (OPG), sRANKL (ligando del receptor soluble activador del factor nuclear-KB), sVCAM (molécula soluble de adhesión celular vascular), sICAM (molécula soluble de adhesión intercelular), Beta-catenina (o p-catenina) es una proteína que en humanos está codificada por el gen CTNNB1, VEGF, CSF2/GM-CSF, Myc (c-Myc) es un gen regulador que codifica un factor de transcripción, Semaphorin-4D (SEMA4D) también conocido como Cluster of Differentiation 100 (CD100), es una proteína de la familia de las semaforinas que en los humanos está codificada por el gen SEMA4D, y Factor de crecimiento placentario (PIGF). En algunas realizaciones, un biomarcador puede abarcar una célula y/o tejido que produzca, secrete, sintetice o exprese un marcador de los mencionados anteriormente. En una realización alternativa, un biomarcador puede abarcar una célula endotelial circulante (CEC). Tres biomarcadores de quimioquinas, CCL3, CCL5 y CCL18, son complementarios, ya que probablemente cubren diferentes procesos de la inflamación, la epitelización y la remodelación de los tejidos, pero no hay reactividad cruzada con los anticuerpos. Estos biomarcadores y otros que pueden utilizarse en el procedimiento de detección se describen más adelante.

El biomarcador CCL3 es la proteína quimioquina (motivo C-C) ligando 3 (CCL3), también conocida como proteína inflamatoria de macrófagos-1a (MIP-1a). El CCL3 es una citoquina perteneciente a la familia de las quimiocinas CC que participa en el estado inflamatorio agudo en el reclutamiento y la activación de los leucocitos polimorfonucleares.

El biomarcador CCL18 es la citoquina ligando de quimioquinas (motivo C-C) 18 que pertenece a la familia de quimioquinas CC. Anteriormente se denominaba PARC (quimioquina pulmonar y regulada por la activación).

El biomarcador CCL5 es el ligando de quimioquina (motivo C-C) 5. También se conoce como RANTES (Regulada tras la activación, células T normales expresadas y secretadas).

La troponina es un complejo de tres proteínas reguladoras (troponina C, troponina I y troponina T) que forma parte de la contracción muscular en el músculo esquelético y cardíaco, pero no en el músculo liso. En algunas realizaciones, el biomarcador de troponina en la troponina C. En otras realizaciones, el biomarcador de troponina en la troponina I. En otras realizaciones, el biomarcador de troponina en la troponina T. En otras realizaciones, el biomarcador de troponina es el complejo de troponina que comprende la troponina C, I y T. El biomarcador de troponina cardíaca (hs cTnl) puede estar asociado con el infarto de miocardio y una alta concentración de esta proteína puede ser evidencia de un infarto de miocardio.

El NT-proBNP, fragmento N-terminal de 76 aminoácidos del péptido natriurético cerebral (BNP), es una proteína secretada que funciona como hormona cardíaca. La proteína sufre dos eventos de escisión, uno dentro de la célula y un segundo después de la secreción en la sangre. Tal y como se utiliza aquí, el término "NT-proBNP" se refiere a la proteína NT-proBNP de longitud completa o a cualquier producto de escisión de la proteína. Las acciones biológicas de la proteína incluyen la natriuresis, la diuresis, la vasorelajación, la inhibición de la secreción de renina y aldosterona, y un papel clave en la homeostasis cardiovascular. Una concentración elevada de esta proteína en el torrente sanguíneo es indicativa de una insuficiencia cardíaca asintomática o sintomática. El número de identificación del gen Entrez para el péptido natriurético cerebral se proporciona en la Tabla 1. A partir de esto, se puede determinar la secuencia de nucleótidos y aminoácidos del NT-proBNP.

El biomarcador HFABP (Proteína de unión a ácidos grasos de tipo corazón) es una proteína que se libera de los cardiomiocitos tras un episodio isquémico. La proteína participa en el metabolismo de los ácidos grasos para su oxidación. Una concentración elevada de esta proteína es indicativa de un empeoramiento de la función cardíaca y puede detectarse entre una y tres horas después del dolor de un infarto de miocardio.

La PAPPA (proteína plasmática A asociada al embarazo) es una proteína asociada al embarazo y los niveles plasmáticos bajos pueden estar asociados al síndrome de Down.

El biomarcador de la proteína C reactiva (PCR) es una proteína que aumenta en la sangre en respuesta a la inflamación. Una prueba de PCR de alta sensibilidad puede medir niveles bajos de PCR. Una concentración elevada de esta proteína en la sangre puede ser indicativa de un empeoramiento de la enfermedad arterial coronaria y puede estar asociada a una mayor probabilidad de desarrollar un accidente cerebrovascular, un infarto de miocardio o una enfermedad vascular periférica grave.

El biomarcador del factor de crecimiento placentario (PIGF) es una proteína implicada en la angiogénesis, especialmente durante el embarazo, y forma parte de la familia del VEGF. Las bajas concentraciones de PIGF pueden asociarse a la preeclampsia.

La proteína 10 inducida por el interferón gamma (IP-10), también conocida como quimioquina 10 con motivo C-X-C (CXCL10) es una quimioquina secretada en respuesta al interferón. El IP-10 se ha asociado a varias funciones, como la quimioatracción de monocitos/macrófagos y la angiogénesis.

El biomarcador de citoquina inhibidora de macrófagos 1 (MIC-1) es una molécula reguladora autocrina en los macrófagos. Una concentración elevada de esta proteína puede proporcionar un valor predictivo aditivo de un infarto de miocardio.

El biomarcador cistatina C, o cistatina 3, es una proteína que se asocia con la función renal. Una concentración elevada de esta proteína puede estar asociada con el infarto de miocardio, el ictus y la insuficiencia cardíaca.

El biomarcador fosfolipasa A2 asociada a las lipoproteínas (LP PLA2), que también puede conocerse como acetilhidrolasa del factor activador de las plaquetas (PAF-AH), es una enzima que se asocia a las proteínas de baja densidad y está implicada en el desarrollo de la aterosclerosis. Una alta concentración de esta proteína puede contribuir a las medidas de inestabilidad de la placa.

La metaloproteinasa de la matriz-1 (MMP-1), también conocida como colagenasa intersticial y colagenasa de fibroblastos, es una enzima que en los humanos está codificada por el gen MMP1. El gen forma parte de un grupo de genes MMP que se localizan en el cromosoma 11q22.3. La MMP-1 fue la primera colagenasa vertebrada purificada hasta la homogeneidad como proteína y clonada como ADNc.

La interleucina 8 (IL-8) es una quimioquina producida por los macrófagos y otros tipos de células, como las células epiteliales. También es sintetizada por las células endoteliales, que almacenan la IL-8 en sus vesículas de almacenamiento, los cuerpos de Weibel-Palade. En los seres humanos, la proteína interleucina 8 está codificada por el gen IL8.

El inhibidor de metalopéptidas TIMP 1, también conocido como TIMP1, un inhibidor tisular de metaloproteinasas, es una glicoproteína que se expresa en varios tejidos.

Los números de identificación de genes Entrez para muchos de estos biomarcadores pueden encontrarse en la Tabla 1.

Se puede medir el nivel de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en CCL3, CCL5, CCL18, HFABP, PaPPa, hsCRP, hs cTnl, PIGF, Nt-proBNP, IP-10, MIC-1, cistatina C, l P PLA2, y cualquier combinación de los mismos. Los biomarcadores IL-8, MMP1 y TIMP1 pueden añadirse al panel de biomarcadores a medir. La tabla A enumera las concentraciones de los biomarcadores como un intervalo inferior en el que el biomarcador puede ser descartado y un intervalo superior (positivo) en el que el biomarcador puede estar asociado con el infarto de miocardio, el empeoramiento de la función cardíaca o cualquier otro evento predictivo o pronóstico.

Tabla A

En algunas realizaciones, se puede medir el nivel de troponina y uno, dos, tres o cuatro biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en CCL3, CCL18, CCL5 y NT-proBNP. La tabla B enumera las combinaciones preferidas de biomarcadores que pueden medirse. En ciertas realizaciones, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez biomarcadores adicionales pueden utilizarse junto con una combinación enumerada en la Tabla B.

Tabla B

continuación

continuación

continuación

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continuación

continuación

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Una medición positiva de un biomarcador dentro del intervalo superior o positivo de la Tabla A puede indicar una asociación con una enfermedad o un cambio de condición. Un intervalo positivo de los analitos seleccionados utilizando un sistema rápido y portátil proporciona una medida discreta puede utilizarse para crear una relación de enfermedad o informar sobre un hallazgo específico. El número positivo es relevante para diagnosticar la enfermedad. El sistema informa sobre una medida específica comparada con un control para un paciente individual, no la mediana o la media de las tecnologías de multiplexación basadas en cuentas. Refiriéndose a la Tabla A, la medida de intervalo representa un procedimiento para examinar una población. En una ización, el dispositivo puede ser específico para diagnosticar una enfermedad en un paciente concreto.

Se ha informado de que los marcadores pronósticos de quimioquinas pueden ayudar a la toma de decisiones clínicas para estratificar el riesgo de los pacientes que tienen más probabilidades de sufrir un infarto agudo de miocardio (IAM) emergente o mortal. La Tabla C con la Tabla A representa las proteínas multiplex con su intervalo de sensibilidad de detección y intervalo indicativo de una enfermedad clínica. Por ejemplo, si las quimiocinas CCL3, CCL5 y CCL18, individualmente o combinadas en su(s) intervalo(s) más alto(s) están elevadas, es probable que el paciente sufra un futuro IAM mortal.

Los cambios temporales en la subida y bajada de cada analito objetivo son indicativos de una información clínica diferente. Los niveles de los analitos cambian con el tiempo a medida que cambia el estado del paciente. Los cambios pueden producirse a lo largo de un período de días en lugar de un período de horas. Esta información, combinada con los datos relativos a los signos y síntomas del paciente, se introduce en el sistema de software de apoyo a la toma de decisiones médicas para proporcionar un pronóstico o diagnóstico decisivo de la enfermedad.

Se ha demostrado que los pacientes que tienen las 3 quimiocinas, CCL3, CCL5, CCL18, elevadas en el tertil más alto tenían un mayor riesgo de un futuro evento fatal de 2,5 a 5,65 de riesgo (p < 0,011). Además, se ha demostrado que la troponina T cardíaca (TnT), con un valor de 0,29 ng/ml para los que experimentan un evento, no era en absoluto indicativa del empeoramiento de la salud cardíaca del paciente ni tenía ninguna relevancia para un futuro evento mortal en 180 días. Por lo tanto, utilizando el sensor de imagen CMOS aplicando la metodología de detección equilibrada utilizada para captar el cambio relativo en condiciones de poca luz, luego transpuesto a una salida utilizando un algoritmo de software informaría que un paciente está en riesgo de un futuro IAM fatal, cuando la troponina cardíaca era negativa, sin embargo CCL3, CCL5, CCL18 individualmente o en total fueron detectados en su tertil más alto.

La Tabla C enumera algunas combinaciones positivas de biomarcadores y hallazgos resultantes de la novedosa multiplexación de múltiples marcadores que pueden estar asociados con la enfermedad o con una mejora de la salud. En la tabla C, "Pos/-" indica un intervalo bajo de positivos ligeramente elevado.

La Tabla C informa sobre el diseño de multiplexación del kit utilizando portaobjetos de vidrio recubiertos como sustrato. En la lista se incluyen las primeras quimiocinas de las que se ha informado que están relacionadas con un evento cardíaco mortal, ya sea de forma individual o combinada: CCL3, CCL5, CCL18, CXCL10 (IP-10). Además hay marcadores (cTnl, hs CRP) indicativos de un IAM activo. La PaPPa, la PIGF y la HFABP se utilizan para informar de un IAM después de la necrosis del tejido cardíaco pero antes de que se eleve la Tnlc. El Mic 1 alfa y el GDF 15 se utilizan para informar, junto con el CCL18 y el Nt-proBNP elevados, de un empeoramiento del estado cardíaco en aquellos pacientes que han sufrido un IAM y que requieren un diagnóstico más profundo para considerar las opciones de tratamiento. La cistatina C es una medida de la tasa de filtración glomerular (TFG). Este marcador, en combinación con el CCL3, el CCL5, el CCL18 y el CXCL10, mejora una medida de la probabilidad general de que el paciente evolucione hacia un IAM mortal. La Lp PLA 2 que se ha comunicado como asociada a la placa vulnerable se incluye como medida de prueba para comparar su fiabilidad con los predictores demostrados de un acontecimiento mortal inminente debido a su respuesta a aspectos clave de la modificación de los vasos coronarios.

Por ejemplo, en un paciente traumatizado en el que el CCL3, CCL18, cTnl, PaPPa, PIGF, Mic 1 alpha, HFABP, NtproBNP está ligeramente elevado, la PCR hs está elevada y el CCL5 está muy elevado y el paciente tiene una lesión traumática evidente, el clínico podría descartar la afectación cardíaca durante su triaje.

El sistema de multiplexación reporta cada analito individual, o proteína como un número. Sobre la base de la información clínica previamente demostrada que definió el intervalo clínico positivo (véase, por ejemplo, la Tabla A), se proporcionará al clínico información para ayudar a la toma de decisiones clínicas. Si la troponina cardíaca I está elevada hasta el intervalo positivo, debido a la multiplexación de la combinación de marcadores, sin embargo el CCL3 no está elevado, o el CCL18 no está dentro del tertil más alto de los intervalos positivos, esto puede indicar que el paciente está experimentando un IAM y necesita un tratamiento adecuado. Los estudios han demostrado que las quimiocinas CCL3, CCL5, CCL18 y CXCL-10 (IP-10) son los primeros marcadores de un IAM inminente. Es posible que el CCL3 no esté significativamente elevado en una población de pacientes con IAM, sin embargo, en una población de pacientes con angina inestable que evolucionaron a un evento cardíaco, el CCL3 puede tener una mayor elevación. Por lo tanto, el dispositivo y el procedimiento multiplexados para informar sobre una serie de marcadores cardíacos relevantes, es novedoso y está indicado desde el punto de vista médico debido a la nueva expresión temporal de cada uno de los marcadores y su relación con los cambios en el daño de los vasos coronarios, la remodelación, así como los marcadores elevados en respuesta a la necrosis del tejido cardíaco.

El nivel de un biomarcador en la muestra biológica tomada del sujeto puede compararse con un nivel de referencia del biomarcador en un individuo sano para determinar si el nivel de dicho biomarcador es significativamente diferente. Se puede calcular una diferencia significativa utilizando técnicas de análisis estadístico conocidas. Ejemplos no limitativos de técnicas de análisis estadístico que pueden utilizarse para calcular la puntuación de riesgo son la correlación cruzada, el análisis de componentes principales (PCA), la rotación de factores, la regresión logística (LogReg), el análisis discriminante lineal (LDA), el análisis discriminante lineal Figengene (ELDA), las máquinas de vectores de apoyo (SVM), el bosque aleatorio (RF), el árbol de partición recursiva (RPART), técnicas de clasificación de árboles de decisión relacionadas, centros encogidos (SC), StepAIC, Kth-Nearest Neighbor, Boosting, árboles de decisión, redes neuronales, redes bayesianas, máquinas de vectores de apoyo y modelos de Markov ocultos, algoritmos de regresión lineal o de clasificación, algoritmos de regresión no lineal o de clasificación, análisis de variantes (ANOVA), algoritmos de análisis jerárquico o de agrupación; algoritmos jerárquicos que utilizan árboles de decisión; algoritmos de máquinas basados en núcleos, como los algoritmos de mínimos cuadrados parciales de núcleos, los algoritmos de búsqueda de coincidencias de núcleos, los algoritmos de análisis discriminante de Fisher de núcleos, los algoritmos de análisis de componentes principales de núcleos, o la prueba de hipótesis estadística de la t de Student. En una realización ejemplar, se utiliza una prueba de hipótesis estadística de la t de Student para calcular un valor P. En algunas realizaciones, un valor P inferior a aproximadamente 0,1, 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04, 0,03, 0,02 o 0,01 significa una diferencia estadísticamente significativa. En algunas realizaciones, se puede utilizar el análisis de terciles.

(d) Insuficiencia cardíaca

El tercer aspecto de la invención proporciona un procedimiento para predecir un fallo cardíaco en un sujeto. Tal y como se utiliza en el presente documento, una "insuficiencia cardíaca" puede definirse como cualquier insuficiencia cardíaca que conduzca a la muerte o pueda conducir a la muerte si no se administra una intervención médica de emergencia inmediata. Ejemplos no limitantes de insuficiencia cardíaca pueden ser el infarto de miocardio, el infarto agudo de miocardio, el infarto de miocardio con elevación del ST (IAMCEST), el infarto de miocardio sin elevación del ST (IAMCEST), la rotura aguda de placa en cualquiera de los vasos coronarios, la angina estable o la angina inestable. En las realizaciones preferidas, un fallo cardíaco es un infarto de miocardio. En otras realizaciones preferidas, un fallo cardíaco es un infarto agudo de miocardio. En otras realizaciones preferidas, un fallo cardíaco es una ruptura aguda de la placa en cualquiera de los vasos coronarios. En algunas realizaciones, un fallo cardíaco es un infarto de miocardio ^{con elevación del}St. ^{En ciertas realizaciones, un fallo cardíaco es un infarto de miocardio sin elevación del ST. En}ciertas realizaciones, una insuficiencia cardíaca es una no curación o remodelación del tejido cardíaco dañado.

El procedimiento de la invención puede predecir un fallo cardíaco inminente. Tal como se utiliza en el presente documento, una "insuficiencia cardíaca inminente" es una insuficiencia cardíaca que puede producirse dentro de los 180 días siguientes a la medición de uno o más biomarcadores de la invención en un sujeto. En realizaciones ejemplares, una insuficiencia cardíaca inminente es una insuficiencia cardíaca que puede ocurrir dentro de unas dos

semanas después de que uno o más biomarcadores de la invención se midan en un sujeto. En algunas realizaciones,

una insuficiencia cardíaca inminente puede ser una insuficiencia cardíaca que puede ocurrir alrededor de 1,2, 3, 4, 5,

99, 100,

, 121, , 144,

, 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, o 180 días después de la medición de uno o más biomarcadores de

la invención en un sujeto. En otras realizaciones, un fallo cardíaco inminente puede ser un fallo cardíaco que puede

ocurrir aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 días después de que uno o más biomarcadores de la invención se midan en

un sujeto. En otras realizaciones, una insuficiencia cardíaca inminente puede ser una insuficiencia cardíaca que puede

ocurrir aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días después de que uno o más biomarcadores de la invención se midan

en un sujeto. En otras realizaciones, una insuficiencia cardíaca inminente puede ser una insuficiencia cardíaca que

puede ocurrir alrededor de 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 días después de que uno o más biomarcadores de la invención

se midan en un sujeto.

(e) Medición de un biomarcador

Como se describe en la sección (c) anterior, un nivel de un biomarcador puede referirse a la cantidad de ARN que

codifica el biomarcador presente en una muestra, la tasa de transcripción de un biomarcador, la cantidad de proteína

del biomarcador en una muestra, la tasa de síntesis de proteínas o el nivel de actividad enzimática de un biomarcador.

En cada caso, el nivel se cuantifica, de manera que se determina un valor, un valor medio o un intervalo de valores.

En una realización, se cuantifica la cantidad de proteína.

En algunas realizaciones, el procedimiento utilizado para medir la concentración del biomarcadores un procedimiento

adecuado para la determinación de la concentración del microarreglo de proteínas multiplex. Un dispositivo de ensayo

multiplexado, tal como se define en el presente documento, es un ensayo capaz de determinar simultáneamente la

concentración de tres o más analitos de muestra diferentes utilizando un único dispositivo y/o procedimiento. En la

medición de la proteína se incluye una medida discreta de la concentración a partir de una muestra de fluido en lugar

de informar sobre la media o la mediana de múltiples muestras de la misma fuente de fluido.

Un procedimiento adecuado de detección puede implicar el contacto de un biomarcador con un agente de unión al

epítopo. El término "agente de unión a epítopos" se refiere a un agente capaz de unirse a un epítopo específico de

una biomolécula. Ejemplos no limitantes de agentes de unión a epítopos pueden incluir aptámeros, secuencia de ADN

de doble cadena, ligandos y fragmentos de ligandos, receptores y fragmentos de receptores, anticuerpos y fragmentos

de anticuerpos, coenzimas, coreguladores, moléculas alostéricas e iones. En una realización ejemplar, un biomarcador

se pone en contacto con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Por ejemplo, a modo de ejemplo no limitativo,

un biomarcador puede ponerse en contacto con uno o más anticuerpos monoclonales específicos para el biomarcador.

Un medio de detección ejemplar puede utilizarse como dispositivo de punto de atención. Típicamente, tal medio de

detección es portátil, y en realizaciones ejemplares, puede ser desechable. En una realización ejemplar, un medio de

detección puede emplear un sistema de detección fotovoltaico. Por ejemplo, un medio de detección puede ser capaz

de utilizar la luz ambiental para producir una señal detectable basada en el nivel de un biomarcador en una muestra

biológica.

Para ajustar las concentraciones esperadas de los analitos de la muestra en la muestra de ensayo para que caigan

dentro del intervalo dinámico del ensayo, la muestra de ensayo puede diluirse para reducir la concentración de los

analitos de la muestra antes del análisis. El grado de dilución puede depender de una serie de factores que incluyen,

entre otros, el tipo de ensayo utilizado para medir los analitos, los reactivos utilizados en el ensayo y el tipo de fluido

corporal contenido en la muestra de ensayo.

En una realización alternativa, para ajustar las concentraciones esperadas de los analitos de la muestra en la muestra

de ensayo para que caigan dentro del intervalo dinámico del ensayo, la muestra de ensayo puede concentrarse para

aumentar la concentración de los analitos de la muestra antes del análisis.

En una realización ejemplar, si la muestra de ensayo es suero humano y el ensayo multiplexado es un ensayo de

captura-sándwich basado en anticuerpos, que emplea pares de anticuerpos monoclonales específicamente

identificados o nanopartículas que tienen una carga específica única para el biomarcador de interés de detección, la

muestra de ensayo se diluye añadiendo un volumen de diluyente que es aproximadamente 5 veces el volumen original

de la muestra de ensayo antes del análisis. En otra realización ejemplar, si la muestra de ensayo es plasma humano

y el ensayo multiplexado es un ensayo de captura-sándwich basado en anticuerpos, la muestra de ensayo se diluye

añadiendo un volumen de diluyente que es aproximadamente 2.000 veces el volumen original de la muestra de ensayo

antes del análisis.

El diluyente puede ser cualquier fluido que no interfiera con la función del ensayo utilizado para medir la concentración de los analitos en la muestra de ensayo. Ejemplos no limitantes de diluyentes adecuados incluyen agua desionizada, agua destilada, solución salina, solución de Ringer, solución salina tamponada con fosfato, solución salina tamponada con TRIS, citrato salino estándar y solución salina tamponada con HEPES.

En una realización alternativa, en ciertos procedimientos se puede concentrar una muestra biológica para permitir la detección de un biomarcador.

(f) Predicción de la insuficiencia cardíaca

El procedimiento de la invención puede predecir la insuficiencia cardíaca en un sujeto utilizando un dispositivo de prueba portátil desechable. Por ejemplo, un sujeto puede quejarse de malestar con síntomas descritos como similares a los de la insuficiencia cardíaca, tal y como se describe en la sección (a) anterior. Sin embargo, las pruebas diagnósticas normales realizadas al sujeto en el momento del malestar pueden no mostrar ninguna evidencia de insuficiencia cardíaca. A pesar de ello, el sujeto sufre más tarde un fallo cardíaco unas dos semanas después de la realización de las pruebas diagnósticas. En tal situación, un procedimiento de la invención puede utilizarse para predecir la insuficiencia cardíaca a pesar de la falta de evidencia de insuficiencia cardíaca basada en pruebas de diagnóstico normales.

Tal y como se utiliza en el presente documento, las "pruebas diagnósticas normales" pueden ser cualquier prueba clínica conocida en la técnica para diagnosticar la insuficiencia cardíaca. Las pruebas clínicas normalmente utilizadas para diagnosticar la insuficiencia cardíaca pueden incluir la electrocardiografía, la ecocardiografía, una radiografía de tórax, una prueba de esfuerzo cardíaco, una ecocardiografía, un índice cardíaco, biomarcadores probados clínicamente, un cateterismo cardíaco, una ecografía intravascular, una tomografía computarizada o una combinación de ellas.

La prueba diagnóstica normal puede ser una radiografía de tórax. Los procedimientos para realizar una radiografía de tórax son conocidos en la técnica y pueden emplear radiación ionizante en forma de rayos X para generar imágenes del tórax.

La prueba diagnóstica normal puede ser una prueba de esfuerzo cardíaco. Los procedimientos para realizar una prueba de esfuerzo cardíaco son conocidos en la técnica. En resumen, la prueba de esfuerzo cardíaco, o prueba de diagnóstico cardíaco, mide la capacidad del corazón para responderal estrés externo en un entorno clínico controlado. La respuesta de estrés puede inducirse en una cinta de correr, pedaleando en un ergómetro de ejercicio estacionario o con estimulación farmacológica intravenosa. La respuesta del corazón al estrés puede medirse entonces mediante una cardiografía.

La prueba diagnóstica normal puede ser un índice cardíaco. El índice cardíaco es un parámetro vasodinámico que relaciona el gasto cardíaco con la superficie corporal, relacionando el rendimiento del corazón con el tamaño del individuo. El índice cardíaco puede utilizarse como marcador del buen funcionamiento del corazón como bomba al correlacionar directamente el volumen de sangre bombeado por el corazón con la superficie corporal de un individuo.

La prueba diagnóstica normal puede ser la determinación del nivel de biomarcadores clínicamente conocidos, por ejemplo, la troponina.

La prueba diagnóstica normal puede ser la cardiografía. Algunos ejemplos de cardiografía que pueden utilizarse para diagnosticar la insuficiencia cardíaca son la ecocardiografía, la electrocardiografía y la gammagrafía. Un ecocardiograma es una ecografía del corazón también conocida como ecografía cardíaca. La ecocardiografía utiliza técnicas de ultrasonido estándar para obtener imágenes del corazón. En algunos ejemplos, la cardiografía es una centellografía. Los procedimientos para realizar gammagrafías son conocidos en la técnica y pueden utilizar una radiosonda seguida de la obtención de imágenes de la distribución de la radiosonda en el sujeto. En otros ejemplos, la cardiografía es una ecocardiografía. Los procedimientos para realizar una ecografía son conocidos en el arte y son un sonograma del corazón también conocido como ecografía cardíaca. La ecocardiografía utiliza técnicas de ultrasonido estándar para obtener imágenes del corazón.

La prueba diagnóstica normal puede ser la electrocardiografía. Los procedimientos para realizar la electrocardiografía son conocidos en la técnica. La electrocardiografía es una interpretación transtorácica de la actividad eléctrica del corazón durante un período de tiempo, detectada por electrodos fijados a la superficie externa de la piel y registrada por un dispositivo externo al cuerpo. El registro producido por este procedimiento no invasivo se denomina electrocardiograma (ECG o EKG). El ECG puede utilizarse para medir la frecuencia y la regularidad de los latidos del corazón, así como el tamaño y la posición de las cámaras, la presencia de cualquier daño en el corazón y los efectos de los fármacos o dispositivos utilizados para regular el corazón (como un marcapasos).

La prueba diagnóstica normal puede ser la electrocardiografía y la determinación del nivel detroponina.

El procedimiento de la invención puede predecir un fallo cardíaco inminente en un sujeto cuando el nivel de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en CCL3, CCL18, CCL5, hs, troponina, PaPPA y NTproB (por ejemplo) son elevados en comparación con los normales. El intervalo de los marcadores seleccionados puede ser de 1,5 a 10 veces mayor que el normal en la muestra biológica son significativamente diferentes de un nivel de referencia en un individuo de control sano, y los resultados de las pruebas de diagnóstico normales son negativosLos resultados de diagnóstico normales negativos pueden ser resultados de electrocardiograma negativos. En otros casos, los resultados diagnósticos normales negativos son niveles de troponina en la muestra biológica que no son significativamente diferentes cuando se comparan con el nivel de troponina en una muestra biológica de un individuo de control sano. En los casos preferidos, los resultados normales de diagnóstico negativos son niveles de troponina en la muestra biológica que no son significativamente diferentes cuando se comparan con el nivel de troponina en una muestra biológica de un individuo de control sano, y los resultados del electrocardiograma son negativos.

En realizaciones preferidas, un procedimiento de la invención puede predecir una insuficiencia cardíaca grave inminente cuando el nivel de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en CCL3, CCL18, CCL5 y NTproB en una muestra biológica de un sujeto es significativamente diferente de un nivel de referencia de los biomarcadores en una muestra biológica de un individuo de control sano, el nivel de troponina en la muestra biológica no es significativamente diferente de un nivel de referencia de los biomarcadores en una muestra biológica de un individuo de control sano, y los resultados de las pruebas de diagnóstico normales son negativos. Además, el riesgo de futuros acontecimientos adversos aumentó con un número creciente de biomarcadores en el tertil superior; los pacientes con concentraciones de CCL3, CCL5 y CCL18 en el tertil más alto tenían un riesgo cuatro veces mayor de futuros acontecimientos adversos, en comparación con los pacientes sin un solo biomarcador en el tertil más alto.

En una realización ejemplar, un procedimiento de la invención puede predecir un fallo cardíaco inminente cuando el nivel de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en CCL3, CCL18, CCL5 y NTproB en una muestra biológica de un sujeto es significativamente diferente de un nivel de referencia de los biomarcadores en una muestra biológica de un individuo de control sano, el nivel de troponina en la muestra biológica no es significativamente diferente de un nivel de referencia de los biomarcadores en una muestra biológica de un individuo de control sano, y los resultados del electrocardiograma son negativos.

IV. SISTEMA

Una realización del segundo aspecto de la invención proporciona un sistema para detectar analitos en una muestra de fluido corporal de un paciente y determinar una condición del paciente. FIG. 23 es un diagrama de bloques que ilustra los elementos de un sistema 200 en una realización. En esta realización, el sistema 200 incluye el dispositivo 100 descrito anteriormente y los elementos asociados para controlar el funcionamiento del dispositivo, para analizar los datos obtenidos utilizando el dispositivo para determinar las concentraciones de uno o más analitos, y analizar además las concentraciones de analitos para determinar una condición del paciente.

El sistema 200 incluye el dispositivo 100, una pantalla 202 para comunicar la entrada y/o la salida de los otros elementos del sistema 200, uno o más procesadores 204 para ejecutar el software incluido en el sistema 200, un medio legible por ordenador 206 codificado con el software de la aplicación de detección de analitos 208 y una memoria 210 que contiene información almacenada utilizada para implementar las instrucciones codificadas dentro de la aplicación de detección de analitos 208.

La aplicación de detección de analitos 208 incluye uno o más módulos ejecutables en el uno o más procesadores 204 que contienen instrucciones utilizadas para implementar las diversas funciones del sistema 200. El uno o más módulos incluyen un módulo de control 212 para controlar el funcionamiento del dispositivo y coordinar la ejecución de las instrucciones de los otros módulos de la aplicación de detección de analitos 208. Por ejemplo, el módulo de control 212 puede controlar la circuitería asociada a uno o más sensores del dispositivo 100 , cualquier control microfluídico incluido dentro del dispositivo 100, y/o la circuitería asociada a una o más fuentes de luz del dispositivo 100.

Los módulos del sistema incluyen un módulo de detección equilibrada 214 para controlar el funcionamiento de uno o más sensores y/o fuentes de luz del dispositivo 100 para implementar un procedimiento de detección equilibrada descrito anteriormente en este documento. La FIG.24 es un diagrama de flujo que ilustra el funcionamiento del módulo de detección equilibrada 214 en una realización. El módulo de detección equilibrada 214 puede obtener las lecturas iniciales del sensor de referencia del dispositivo 100 en el paso 302, y las lecturas iniciales del sensor de detección del dispositivo 100 en el paso 304. El módulo de detección equilibrada 214 puede entonces restar la salida del sensor de detección y la salida del sensor de referencia en el paso 306 para calcular una señal de salida diferencial. Si se determina que la señal diferencial no es igual a cero en el paso 308, el módulo de detección equilibrada 214 puede ajustar la intensidad de la luz producida por una o más de las fuentes de luz, y/o ajustar la circuitería asociada de los sensores, como un ajuste de resistencia variable en el paso 310. Los pasos 302-308 se repiten hasta que la señal de salida diferencial es igual a cero en el paso 308. Una vez que se logra una señal de salida diferencial de cero en el paso 308, la señal de salida diferencial puede entonces ser monitorizada sin más ajustes en el paso 312 para determinar la concentración de cualquier analito en una muestra introducida en el dispositivo 100.

Los módulos del sistema incluyen además un módulo de detección de analitos 216 para procesar las señales de salida combinadas recibidas del módulo de detección equilibrado 214 para determinar la presencia y/o concentración de uno o más analitos contenidos en la muestra introducida en el dispositivo 100. FIG. 25 es un diagrama de flujo que ilustra el funcionamiento del módulo de detección de analitos 216 en una realización. El módulo de detección de analitos 216 puede obtener una señal de salida diferencial para cada uno de los uno o más analitos desde el módulo de detección equilibrada 214 en el paso 402. Si se determina que una señal de salida diferencial es igual a cero en el paso 404, la concentración del analito se establece igual a cero en el paso 406 y se recibe la señal de salida diferencial para otro analito en el paso 402. Si se determina que la señal de salida diferencial no es igual a cero en el paso 404, los datos de calibración para ese analito se obtienen en el paso 406 de la base de datos de calibración 226 almacenada en la memoria 210 del sistema (véase la FIG. 23). Volviendo a la FIG. 25, la concentración del analito puede determinarse en el paso 408 utilizando los datos de calibración como se ha descrito anteriormente.

Los módulos del sistema 200 pueden incluir además un módulo de post-procesamiento 218 para analizar aún más las concentraciones de analitos calculadas por el módulo de detección de analitos 216 y para calcular cantidades combinadas tales como ratios de concentración de analitos, sumas, o cualquier otra combinación aritmética de concentraciones de analitos sin limitaciones. Además, el módulo de posprocesamiento 218 puede analizar aún más las concentraciones de analitos y clasificar estas concentraciones como bajas, altas o cualquier otra clasificación de concentración de analitos descrita en el presente documento utilizando las definiciones de clasificación definidas dentro de la base de datos de diagnóstico 224 almacenada en la memoria 210 (véase la FIG. 23); estas clasificaciones de la concentración se describieron anteriormente en el presente documento, por ejemplo en la Tabla C .

La FIG. 26 es un diagrama de flujo que ilustra el funcionamiento del módulo de posprocesamiento 218 en una realización. Las concentraciones de analitos pueden recibirse del módulo de detección de analitos 216 en el paso 502.

Los valores umbral u otros valores o definiciones utilizados para clasificar las concentraciones de analitos pueden obtenerse de la base de datos de diagnóstico 224 en el paso 504. Si la concentración del analito es inferior a una concentración mínima detectable en el paso 506, la concentración del analito puede definirse como cero o "negativa" en el paso 508. Si la concentración del analito no es mayor que un umbral de concentración baja en el paso 510, pero es mayor que un umbral mínimo detectable en el paso 506, la concentración del analito puede clasificarse como "sub baja" o "negativa" en el paso 512. Si la concentración del analito es inferior a un umbral de concentración alto en el paso 514 , la concentración del analito puede clasificarse como "baja" en el paso 516. Si la concentración de analito es mayor que un umbral alto en el paso 514, la concentración de analito puede definirse como "alta" o "positiva" en el paso 518. Todas las clasificaciones de las concentraciones de analitos pueden utilizarse para poblar una matriz de diagnóstico en el paso 520. La matriz de diagnóstico puede incluir cada analito, la concentración del analito, la clasificación de diagnóstico del analito, así como cualquier otra combinación aritmética de concentraciones de analitos descrita anteriormente en este documento.

Los módulos del sistema 200 incluyen además un módulo de diagnóstico 220 para comparar las entradas de la matriz de diagnóstico y determinar una condición de un paciente según una o más reglas de diagnóstico definidas dentro de la base de datos de diagnóstico 224 almacenada en la memoria 210 (véase la FIG. 23); estas reglas de diagnóstico se describieron anteriormente en el presente documento, por ejemplo en la Tabla C .

La FIG. 27 es un diagrama de flujo que ilustra el funcionamiento del módulo de diagnóstico 220 en una realización. La matriz de diagnóstico puede recibirse en el paso 602 desde el módulo de posprocesamiento. Las reglas de diagnóstico pueden obtenerse de la base de datos de diagnóstico 224 en el paso 604. Si la matriz de diagnóstico no coincide con los valores o definiciones proporcionados en una regla de diagnóstico asociada a una condición del paciente en el paso 506, esa condición es rechazada en el paso 608. Si el conjunto de diagnósticos coincide con los valores o definiciones proporcionados en una regla de diagnóstico asociada a una condición del paciente en el paso 506, esa condición se asigna al paciente en el paso 610.

Los módulos del sistema 200 incluyen además un módulo GUI 222 para generar uno o más formularios para ser mostrados por la pantalla 202. Estos formularios pueden utilizarse para recibir entradas del usuario al sistema 200 o para comunicar salidas del sistema 200 al usuario. Por ejemplo, se puede mostrar un formulario para comunicar las concentraciones de analitos determinadas por el sistema en un formato de gráfico o tabla. En otro ejemplo, se puede mostrar un formulario para comunicar una condición de un paciente determinada por el sistema.

El CRM 206 puede incluir medios volátiles, medios no volátiles, medios extraíbles, medios no extraíbles, y/o otro medio disponible al que pueda acceder el dispositivo informático o los procesadores 204. A modo de ejemplo y no de limitación, el medio legible por ordenador 206 comprende medios de almacenamiento informático y medios de comunicación. Los medios de almacenamiento informático incluyen la memoria no transitoria, los medios volátiles, los medios no volátiles, los medios extraíbles y/o los medios no extraíbles implementados en un procedimiento o tecnología para el almacenamiento de información, como instrucciones legibles por ordenador, estructuras de datos, módulos de programa u otros datos. Los medios de comunicación pueden incorporar instrucciones legibles por ordenador, estructuras de datos, módulos de programa u otros datos e incluir un medio o sistema de entrega de información.

Varias modificaciones y alteraciones de las realizaciones descritas serán evidentes para los expertos en la materia a la vista de las enseñanzas del presente documento. Por lo tanto, se apreciará que los expertos en la materia podrán idear numerosos sistemas, disposiciones y procedimientos que, aunque no se muestren o describan explícitamente en el presente documento, están dentro del ámbito de la presente invención. A partir de la descripción y los dibujos anteriores, se entenderá por aquellos con conocimientos normales en la materia que las realizaciones particulares mostradas y descritas son sólo para fines de ilustración y no pretenden limitar el ámbito de la presente invención. Las referencias a los detalles de determinadas realizaciones no pretenden limitar el ámbito de la invención.

Ejemplo 1: Identificación de biomarcadores que tienen utilidad diagnóstica y pronóstica en la enfermedad de Alzheimer (EA).

En una cohorte de pacientes que se quejan de dolor torácico se pueden realizar ECG y análisis de sangre para electrocardiografía, una radiografía de tórax, monitorización del ritmo cardíaco, nivel de oxígeno en sangre y análisis de sangre para marcadores miocárdicos como troponina I o T, un dímero D, albúmina modificada por isquemia (IMA), mieloperoxidasa (MPO), proteína C reactiva, isoenzima BB de la glucógeno-fosforilasa (GPBB), mioglobina, CK-MB y BNP. Se pueden realizar las mismas pruebas todos los días y registrar y tratar la insuficiencia cardíaca cuando se produzca. Las pruebas clínicas realizadas a un subconjunto de pacientes que se quejan de dolor torácico pueden no dar ningún resultado positivo, lo que indica que estas pruebas no podrían diagnosticar una insuficiencia cardíaca. Sorprendentemente, este subgrupo de pacientes puede desarrollar insuficiencia cardíaca. Además, este subconjunto de pacientes también puede tener niveles de CCL3, CCL18, CCL5 que pueden ser significativamente diferentes de los niveles de CCL3, CCL18, CCL5 en un control sano.

Ejemplo 2. El CCL5 (RANTES) y el CCL18 (PARC) son marcadores específicos de la angina de pecho inestable refractaria y se elevan transitoriamente durante los síntomas isquémicos graves.

Procedimientos

P o b la c ió n de estud io . Todas las quimiocinas y parámetros inflamatorios se determinaron en muestras de plasma de una cohorte de pacientes, derivada del bien definido estudio APRAIS (Reacción en fase aguda y síndromes isquémicos). En resumen, se incluyeron 54 pacientes que ingresaron en el servicio de urgencias del Centro Médico de la Universidad de Leiden entre marzo y septiembre de 1995 con angina de pecho inestable de clase IIIB de Braunwald y se les hizo un seguimiento de hasta 18 meses. Se obtuvieron muestras de sangre venosa al ingreso (t=0), después de 2 (t=2) y 180 días después del ingreso (t=180), se centrifugaron y las alícuotas de plasma se almacenaron a -80°C. hasta su posterior análisis. Todos los pacientes habían recibido un tratamiento médico estándar, es decir, aspirina 300 mg por vía oral, nitroglicerina por vía intravenosa y heparina en infusión titulada según el tiempo de tromboplastina parcial activado. Un punto final clínico del estudio APRAIS fue la aparición de angina de pecho inestable refractaria durante la hospitalización. La angina de pecho inestable se consideraba refractaria si la angina en reposo, a pesar del tratamiento médico, permanecía o reaparecía, lo que motivaba una evaluación coronaria invasiva y un posterior tratamiento de revascularización. Aunque la cohorte del estudio era relativamente pequeña, constituía una población claramente definida y bien documentada con un punto de partida similar. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito y el protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Centro Médico de la Universidad de Leiden.

A is la m ie n to de la s cé lu las . Las PBMC de los pacientes (t=0 y t=180), así como de 6 voluntarios sanos de la misma edad, se aislaron de muestras de sangre venosa con EDTA mediante centrifugación por densidad en Histopaque (Sigma, St. Louis, Mo.). Las PBMC se recogieron en la interfase y se lavaron dos veces con medio de cultivo, consistente en medio de Dulbecco modificado de Iscove que contenía glutamax (Gibco, Paisly, Reino Unido) y complementado con un 10 % de FCS. Las PBMC se criopreservaron en un medio de cultivo que contenía un 20 % de FCS y un 10 % de dimetilsulfóxido hasta su posterior utilización.

E n sa yo m u ltip le x de q u im io qu ina s . Los niveles circulantes de las quimiocinas CCL2, CCL3, CCL5, CCL11, CCL17, CCL18, CCl22, CXc L8, CXCL9, CXCL10 y el factor similar a la quimioquina MIF, las citocinas OSM, IFN-y y OPG y las moléculas de adhesión sRank1, sVCAM y sICAM se determinaron en muestras t=0 con un bioensayo multiplex hecho a medida utilizando el sistema Bio-Plex Suspension Array (Bio-Rad laboratories, Hercules, Calif.).) Las muestras de plasma se filtraron y posteriormente se diluyeron con un 10 % de suero normal de rata y de ratón (Rockland, Gilvertsville, Pa.) para bloquear la unión residual de anticuerpos no específicos. Se añadieron 1.000 microesferas por quimioquina (10 pl/pocillo) en un volumen total de 60 pl, junto con muestras estándar y en blanco, y la suspensión se incubó durante 1 hora en una placa filtrante de 96 pocillos a temperatura ambiente (TA). A continuación, se añadieron 10 pl de mezcla de anticuerpos biotinilados (16,5 pg/ml) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras el lavado con PBS-1 % BSA-0,5 % Tween 20, las perlas se incubaron con 50 ng/pocillo de estreptavidina R-ficoeritrina (BD Biosciences, San Diego, California) durante 10 minutos. Por último, las perlas se lavaron de nuevo con PBS-1 % BSA-0,5 % Tween 20, y se midió la intensidad de la fluorescencia en un volumen final de 100 pl de tampón ELISA de alto rendimiento (Sanquin, Amsterdam, Países Bajos). Las mediciones y el análisis de datos se realizaron con el sistema Bio-Plex Suspension Array en combinación con el software Bio-Plex Manager versión 3.0 (Bio-Rad laboratories, Hercules, Calif.) (ver también ref. No: 14)

E L IS A y o tro s ensayos . Para el análisis temporal de los niveles plasmáticos de CCL5 y CCL18 en humanos durante el seguimiento, las muestras t=0, t=2 y t=180 se analizaron mediante un kit ELISA instantáneo de CCL5 (Bender MedSystems, Viena, Austria) y un ELISA de CCL18 (RayBiotech, Norcross, Ga.), respectivamente, según el protocolo del fabricante. Se determinaron los parámetros inflamatorios basales, como la proteína C reactiva, el fibrinógeno, la velocidad de sedimentación globular (VSG) y el inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1), tal como se ha descrito detalladamente con anterioridad13. El ligando CD40 soluble (sCD40L) y la interleucina 6 (IL-6) se determinaron mediante un inmunoensayo de alta sensibilidad (Quantakine HS, R&D Systems, Minneapolis, Minn.), t=180 muestras de PCR mediante un ensayo turbidimétrico en una unidad Modular P800 totalmente automatizada (Roche, Almere, Países Bajos).

E v a lu a c ió n de la in te ra cc ió n h e te ro fílica de C C L 5 y C C L18. Se utilizó la electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio y poliacrilamida (SDS-PAGE) para evaluar si el c CL5 recombinante (7,8 kDa) y el CCL18 sintético (7,8 kDa) participan en interacciones heterofílicas. Las proteínas (rCCL5, sCC118, rCCL5/sCCL18 en una relación de peso (w:w) de 1:1 y 1:5; 2 |jg de proteína total por carril) se incubaron durante una hora a TA en un tampón HEPES 50 mM/0,1 mM EDTA (pH=7,4), tras lo cual se añadió 25 mM de paraformaldehído para reticular cualquier homo o heterodímero formado. Tras 30 minutos, las mezclas de proteínas se desnaturalizaron en tampón de carga y se sometieron a SDS-PAGE (18 %; 2 jg de proteína por carril, una hora a 70 mV y 30 minutos a 150 mV), las proteínas se visualizaron mediante tinción de plata. Las mezclas de proteínas también se analizaron en un espectrómetro de masas Voyager-DE Pro MALDI-TOF (PerSeptive Biosystems, Framingham, Mass.).

A n á lis is R T -P C R . Para evaluar la expresión de CCL5, CCL18, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CX3CR1 y el péptido 3 de los neutrófilos humanos (HNP-3) en las PBMC, se aisló y analizó el ARNm. Se utilizó tiocianato de guanidio-fenol para extraer el ARN total de las PBMC, las muestras se sometieron a un tratamiento de DNAsa I (Promega, Madison, Wis.) tras el cual se generó el ADNc utilizando la transcriptasa inversa RevertAid M-MuLV (Fermentas, Burlington, Canadá) según el protocolo del fabricante2. La expresión génica semicuantitativa se llevó a cabo mediante el procedimiento SYBR-Green (Eurogentec, Lieja, Bélgica) en un equipo ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, FosterCity, California) con cebadores para CCL5, CCL18, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CX3CR1, CD11b y péptido humano de neutrófilo-3 (HNP-3). La ciclofilina y la hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HPRT) se utilizaron como genes de mantenimiento.

La expresión génica relativa se calculó restando el número de ciclo umbral (Ct) del gen diana del Ct medio de la ciclofilina y la HPRT y elevando dos a la potencia de esta diferencia.

C ito m e tría de flu jo . La expresión superficial de CCR3 y CCR5 en las PBMC CD3+ y CD 14+ se evaluó mediante citometría de flujo. Las PBMC criopreservadas se descongelaron, se lavaron tres veces en RPMI 1640 que contenía un 20 % de FCS y posteriormente se tiñeron utilizando anticuerpos anti-CD3 y anti-CD14 conjugados con APC (BD Biosciences, San José, California), así como anticuerpos anti-CCR3 y anti-CCR5 conjugados con FITC (R&D Systems). Se utilizaron como controles negativos los isotipos no específicos IgG2a de rata conjugada con FITC y los anticuerpos IgG2b de ratón conjugados con FITC (eBiosciences, San Diego, California). Las muestras se analizaron con un citómetro de flujo activado por fluorescencia (FACSCalibur) y posteriormente se analizaron con el software CELLQuest (BD Biosciences), se contaron 50.000 células para cada muestra.

E n sa yo de e s tim u la c ió n de P B M C . Las muestras de PBMC criopreservadas, obtenidas de seis voluntarios sanos, se descongelaron como se ha descrito anteriormente, se colocaron en una placa de 96 pocillos de fondo redondo en forma de U (Greiner Bio-one) y se estimularon durante 6 horas a 37 °C. con un medio normal (control) o un medio complementado con 50 ng/ml de CCL5 recombinante (Peprotech, Rocky Hill, N.J.), 50 ng/ml del péptido sintético CCL18 SM-1 (sCCL18), o una combinación de rCCL5 y sCCL18 (25 ng/ml por péptido)3. Tras la incubación, se aisló el ARN total de las células, se preparó el ADNc y se determinó la expresión del receptor de quimioquinas.

A n á lis is es ta d ís tico . Las diferencias entre las poblaciones de nuestro estudio y la cohorte original se examinaron mediante la prueba exacta de Fisher y la prueba t de Student no apareada. Se comprobó que los niveles plasmáticos de quimiocinas y marcadores inflamatorios tuvieran una distribución gaussiana normal y se transformaron los valores en forma de logaritmo en caso de que la distribución fuera asimétrica. Con respecto a esto último, se dan medias geométricas en lugar de aritméticas. Las medias se compararon mediante la prueba t de Student no apareada de dos colas o la prueba U de Mann-Whitney cuando fue necesario. Para evaluar el valor predictivo de CCL5 y CCL18 para la aparición de síntomas refractarios, independientemente de los factores potencialmente confusos, se realizó un análisis multivariante, corrigiendo por edad, niveles de HDL y ESR, así como por otros factores de riesgo cardiovascular establecidos (por ejemplo, hipertensión, hipercolesterolemia, uso de medicación hipolipemiante y reductora de la presión arterial, diabetes mellitus, comportamiento tabáquico, IMC y antecedentes de enfermedad cardiovascular) y los biomarcadores sCD40L y PCR. Se evaluó la distribución de cuartiles y se utilizó el coeficiente de correlación de Spearman y la prueba de chi-cuadrado de Pearson para determinar la asociación de los niveles plasmáticos de quimiocinas, así como los niveles de sCD40L y PCR, con la aparición de PAU refractaria. Se generaron curvas de características operativas del receptor para evaluar el valor predictivo de las quimiocinas para los síntomas isquémicos refractarios. El análisis de correlación entre los valores del multiplex y del ELISA y entre las quimiocinas y los parámetros inflamatorios se realizó mediante la prueba de correlación de intervalos de Spearman. Los resultados de FACS se analizaron mediante una prueba t emparejada, el ensayo de estimulación se analizó mediante ANOVA. Un valor p de dos caras<0,05 se consideró significativo. Todos los análisis se realizaron con el software SPSS versión 14.0 (SPSS, Chicago, III.).

Resultados

P o b la c ió n de estud io . Los análisis plasmáticos de quimiocinas (enumerados en la Tabla 1) se realizaron en una subcohorte de muestras de plasma previamente descongeladas de 54 pacientes consecutivos, excluyendo el sesgo de selección. Esta subcohorte, formada por 31 pacientes con síntomas isquémicos estabilizados y 23 con síntomas isquémicos refractarios, se emparejó con la cohorte original en cuanto a factores de riesgo cardiovascular, antecedentes de infarto de miocardio o ACTP/BAC y parámetros de laboratorio (tablas 2A y B).

Tabla 1.

TABLA 2A

Características basales de los pacientes y parámetros de laboratorio.

Cohorte de quimioquinas (N = 54) APRAIS(N =211) Valor P Edad, años 65,4 ± 11,0 62,7 ± 10,2 0,08 Refractario (%) 43 36 0,43 Género masculino (%) 73,8 71,1 0,75 Fumador actual (%) 24,6 30,5 0,45 IMC (kg/m2) 25,2 ± 6,0 25,9 ± 3,36 0,23 Diabetes (%) 16,4 14,6 0,98 Hipertensión (%) 23 23,5 0,99 Uso de estatinas (%) 8,2 12,2 0,48 Historia de:

Infarto de miocardio (%) 45 43,2 0,88 ACTP (%) 26 29,1 0,75 CABG (%) 23 21,6 0,86 Parámetros de laboratorio :

Colesterol total, mmol/l 6,00 ± 1,5 6,18 ± 1,2 0,38 HDL, mmol/l 1,14 ± 0,4 1,14 ± 0,3 0,97 PCR, mg/l * 2,36 2,66 0,50 ESR, mm/hr* 16,44 14,88 0,30 Fibrinógeno, g/l * 3,56 3,42 0,34

TABLA 2B

Características basales de los pacientes y parámetros de laboratorio de la cohorte de quimiocinas Estabilizado (N- 31) Refractario (N = 23) Valor P Edad, años 67,3 ± 10,2 64,5 ± 11,4 0,30

Género masculino (%) 87 63 0,05 Fumador actual (%) 22 25 0,69

IMC (kg/m2) 24,9 26,7 0,78 Diabetes (%) 9 19 0,16 Hipertensión (%) 17 38 0,39

Historia de:

Infarto de miocardio (%) 48 47 0,89

ACTP (%) 30 25 0,57

CABG (%) 35 16 0,19

Parámetros de laboratorio :

Hemoglobina, mmol/l 8,27 ± 2,1 8,51 ± 0,8 0,61 Hematocrito (%) 47 41 0,26

Estabilizado (N = 31) Refractario (N = 23) Valor P Leucocitos,109/l 7,49 ± 2,9 7,68 ± 2,2 0,79 Recuento de plaquetas,106/l 186,5 ± 66 223,9 ± 75 0,07 Glucosa, mmol/l. 7,37 ± 2,7 6,49 ± 1,4 0,15 Creatinina, pmol/l 99,2 ± 52,3 108,7 ± 32,1 0,44 Colesterol, mmol/l 5,92 ± 1,8 6,16 ± 1,0 0,56

HDL, mmol/l 1,23 ± 0,4 0,99 ± 0,2 0,02

ESR, mm/hr* 14,15 20,70 0,03 Fibrinógeno, g/l * 3,42 3,78 0,26

PCR, mg/l * 2,14 2,77 0,47 sCD40L, pg/ml 23,6 20,3 0,32

Como no todos los 54 pacientes respondieron a la donación de sangre después de 180 días, el análisis de ELISA en este punto se realizó para 47 pacientes (estabilizados 29 frente a refractarios 18), pero las características basales de esta subcohorte coincidieron con las de la cohorte original (datos no mostrados). La comparación de los datos demográficos de partida en la cohorte de quimiocinas no mostró diferencias llamativas entre los pacientes refractarios y los estabilizados, salvo una pequeña pero significativa diferencia en la composición por sexos (87 % frente a 67 % de varones; P=0,05); la edad media de todos los pacientes era de 65 años (41 a 85 años). En cuanto a los parámetros clínicos y de lípidos plasmáticos al inicio, los niveles de colesterol total en los pacientes estabilizados y refractarios no diferían (5,92 frente a 6,16 mmol/l; P=0,56), mientras que los niveles de HDL eran más bajos (1,23 frente a 0,99 mmol/l; P=0,02) en esta última población. Este grupo también mostraba una mayor tendencia a un estado inflamatorio más elevado, como ilustran los niveles elevados de la VSG (14,15 frente a 20,7 mm/h; P=0,03), aunque los niveles de fibrinógeno y PCR eran esencialmente similares. No se observaron diferencias en los niveles basales de sCD40L entre los grupos.

A n á lis is m u ltip le x : S o b re rre g u la c ió n de C C L 5 y C C L18. Todos los datos de quimiocinas y citocinas determinados por el análisis multiplex (muestras t=0) se transformaron en logaritmos antes de realizar el análisis estadístico posterior debido a sus perfiles de distribución sesgados, excepto en el caso de la OPG. Los niveles plasmáticos de la mayoría de las quimiocinas y citocinas no difirieron entre los pacientes estabilizados y los refractarios. Sin embargo, los niveles de CCL5 (23,1 frente a 32,7 ng/ml; P=0,018) y CCL18 (53,7 frente a 104,4 ng/ml; P=0,011) parecían estar significativamente aumentados en los pacientes refractarios, mientras que había un aumento ligeramente significativo en los de CCL3 (53,6 frente a 73,7 pg/ml; P=0,09) (Tabla 3 y FIG. 1A).

TABLA 3

Concentraciones plasmáticas de quimioquinas analizadas mediante la técnica multiplex.

Variable Estabilizado Refractario Valor P

CCL5, pg/ml 23158 32704 0,018

CCL18, pg/ml 53678 104399 0,011

CCL2, pg/ml 154 146 0,77

CCL3, pg/ml 53,6 73,7 0,09

CCL11, pg/ml 63,7 65,8 0,88

CCL17, pg/ml 40,3 51,2 0,34

CCL22, pg/ml 527 546 0,79

CXCL8, pg/ml 12,4 13,4 0,84

CXCL9, pg/ml 158 156 0,96

CXCL10, pg/ml 221 157 0,12

TABLA 3-continuación

Variable Estabilizado Refractario Valor P

MIF, pg/ml 330 439 0,45

OPG, pg/ml* 937 1096 0,25

OSM, pg/ml 456 690 0,25

sRankL, pg/ml 5,0 5,7 0,83

sVCAM, pg/ml 681082 735190 0,45

sICAM, pg/ml 106340 117625 0,28

Los valores son medias geométricas *indica la media aritmética

Además, las diferencias observadas en los niveles de CCL5 siguieron siendo significativas tras un análisis multivariante que ajustaba los factores de riesgo cardiovascular y los niveles de sCD40L y CRP (P=0,023), mientras que los niveles de CCL18 eran ligeramente significativos (P=0,06). Sin embargo, las diferencias en los niveles de CCL18 alcanzaron la significación tras el análisis multivariante para todos los factores de confusión excepto e1HDL (P=0,021). Por lo tanto, tanto el CCL5 como el CCL18 parecen ser predictores independientes de la aparición de síntomas isquémicos refractarios, incluso cuando se ajustan los niveles de sCD40L y PCR. Además, los niveles de CCL5 y CCL18 no mostraron ninguna correlación mutua (R=0,05; P=0,7), lo que refleja que estas quimiocinas están reguladas u operan de forma independiente. Sin embargo, aunque no se observaron interacciones heterofílicas significativas entre CCL5 y CCL18, es concebible que ambas quimiocinas, que comparten CCR3 como receptor objetivo común, interactúen funcionalmente (FIGs. 6 y 7). El CXCL10 tuvo una tendencia a aumentar en los pacientes estabilizados, aunque no muy significativa (221,6 frente a 157,5 pg/ml; P=0,12), lo que podría apuntar a un efecto protector de esta quimioquina específica. Los niveles de IFN-y eran simplemente indetectables y, por tanto, no se muestran.

A continuación, se trató de evaluar si los niveles de CCL5 y CCL18 tienen potencial de diagnóstico. Dado el tamaño de la cohorte, los niveles de CCL5 y CCL18 se clasificaron en cuartiles y se analizó su correlación con la aparición de futuros síntomas isquémicos refractarios (Tabla 4A).

TABLA 4A

Niveles de cuartil de CCL5 y CCL18 en la línea de base determinados por el análisis multiplex

Cuartiles CCL5 CCL18

1 <15,1 <39,3

2 >15,1 y <25,5 >39,3 y <66,0

3 >25,5 y <40,3 >66,0 y <130,0

4 >40,3 >130,0

Todos los valores están en ng/ml

Se observó que el riesgo de síntomas isquémicos refractarios aumentaba en los cuartiles superiores de CCL5 (R=0,32; P=0,017; Chi-cuadrado de asociación lineal por lineal 5,53; P=0,019), mientras que esta tendencia era aún más pronunciada para CCL18 (R=0,392; P=0,003; Linear-by-linear association chi-square 8,105; P=0,004) (FIG. 2A). Los niveles elevados de CCL18 fueron ligeramente más predictivos que los de CCL5, como indica la curva de características operativas del receptor (área bajo la curva 0,71 frente a 0,69). Los valores de corte de >40 ng/ml para CCL5 y >130 ng/ml para CCL18 arrojaron una sensibilidad del 73,9 % y del 65,2 %, respectivamente, así como una especificidad del 67,7 % y del 61,3 %. El análisis combinado de los dos cuartiles superiores de CCL5 y CCL18 para la aparición de síntomas isquémicos refractarios reveló una relación muy significativa (X2 con corrección de continuidad 8,12; P<0,01). Mientras que la sensibilidad alcanzó el 47,8 %, la especificidad del análisis combinado fue de un notable 90,3 %. El valor predictivo positivo del análisis combinado de los niveles de CCL5 y CCL18 fue del 78,5 %, con un valor predictivo negativo concomitante del 70,0 %. La adición de los niveles de sCD40L o PCR al análisis no supuso un aumento adicional de la sensibilidad, la especificidad o el valor predictivo (datos no mostrados).

V erificac ió n d e l E L IS A de C C L 5 y C C L 18 y a n á lis is de seg u im ien to . La media y los niveles individuales de CCL5 por ELISA y multiplex se correspondieron de forma excelente (P<0,001). Además, los niveles plasmáticos de CCL5 también se vieron aumentados en los pacientes refractarios en comparación con los estabilizados en el día 0 cuando se evaluaron mediante ELISA (36,4 frente a 26,5 ng/ml). Curiosamente, ya después de dos días, se observó una marcada disminución de los niveles de CCL5 en plasma en toda la cohorte (12,1 frente a 30,3 ng/ml; P<0,001) y también se observaron niveles reducidos de CCL5 en t=180, lo que demuestra que el CCL5 se eleva transitoriamente durante un episodio de angina de pecho inestable (FIG. 1B). No se observaron diferencias entre los grupos estabilizados y refractarios a los 2 y 180 días después de la inclusión. Los niveles plasmáticos de CCL18 mostraron un patrón temporal diferente tras los síntomas isquémicos. El análisis ELISA confirmó la expresión diferencial de CCL18 en el día 0 entre los pacientes refractarios y los estabilizados (56,2 frente a 41,1 ng/ml; P=0,02). Aunque los valores absolutos fueron ligeramente inferiores en el ELISA en comparación con el ensayo multiplex, el análisis estadístico reveló una excelente correlación entre los dos ensayos (prueba de Spearman; P<0,001). Curiosamente, los niveles de CCL18 de la cohorte total en el día 2 no difirieron de los niveles de referencia (día 0), lo que sugiere que los niveles de CCL18 y CCL5 podrían estar regulados a través de mecanismos separados. A los 180 días, los niveles de CCL18 se redujeron significativamente en comparación con los valores del día 2 (48,4 frente a 34,5 ng/ml; P<0,001), lo que sugiere un papel de CCL18 en los procesos relacionados con la isquemia-reperfusión cardíaca (FIG. 1C).

L ig a n d o C D 40 s o lu b le y CR P. Los niveles tanto de sCD40L como de PCR fueron significativamente elevados en t=0 en comparación con t=180 (sCD40L 2,04 frente a 0,69 ng/ml; P<0,001, PCR 2,36 frente a 0,96 mg/l; P<0,001) (FIG.

1D, E). Sin embargo, los niveles de sCD40L empezaron a disminuir ya en t=2 (1,35 ng/ml; P<0,05), lo que indica que los niveles elevados al inicio reflejan una respuesta de fase aguda relacionada con la activación plaquetaria. Como los niveles de CD40L soluble t=0 y t=2 se correlacionaron significativamente con los niveles de CCL5 t=0 y t=2 (t=0 R=0,40; P<0,01, t=2 R=0,35; P=0,01), los niveles elevados de CCL5 pueden ser causados principalmente por la activación plaquetaria también. sCD40L sin embargo mostró una correlación negativa significativa con los niveles de CCL18 en t=0 (R=-0,36; P=0,01), sugiriendo que estos últimos representan una respuesta de retroalimentación a la activación plaquetaria. Los niveles de PCR aumentaron aún más en t=2 (6,43 mg/l; P<0,001), lo que concuerda con informes anteriores y presumiblemente indica un mayor estado inflamatorio sistémico post-isquémico en estos pacientes dos días después de la isquemia y/o la intervención coronaria. Los niveles de PCR no mostraron ninguna correlación con los niveles de CCL5 o CCL18. Los niveles de cuartil de sCD40L, así como de PCR, no tenían ningún potencial para predecir los síntomas isquémicos refractarios (R=0,043 y R=-0,034; N.S) (FIG. 2A: para la distribución por cuartiles, véase la tabla 4B).

Tabla 4B

Niveles de cuartil de PCR y sCD40L al inicio del estudio.

Cuartiles PCR mg/L sCD40L ng/ml

1 <1,2 <14,2

2 >1,2 y <2,6 >14,2 y <26,4

3 >2,6 <6,5 >26,4 y <33,7

4 >6,5 >33,7

Todos los valores se expresan en ng/ml

In fla m a c ió n y se g u im ie n to c lín ico . El análisis de correlación de todas las quimiocinas con los parámetros inflamatorios sistémicos fibrinógeno, IL-6, PAI-1 y ESR no reveló ninguna asociación, salvo una débil correlación entre los niveles de CXCL10 y de IL-6 (R=0,29; P=0,02, otros datos no mostrados). Es importante destacar que los niveles del cuartil superior de CCL5 al inicio del estudio, determinados mediante multiplexación, se correlacionaron con la necesidad de procedimientos de revascularización en los siguientes 18 meses (R=0,35; P=0,01). Además, los niveles basales del cuartil superior de CCL18 se correlacionaron con la reaparición de la angina de pecho inestable (PAI) durante la hospitalización (R=0,36; P=0,007), así como con la aparición de un síndrome coronario agudo (SCA) durante el periodo de seguimiento de 18 meses (R=0,31; P=0,02) (FIGS. 2B-D). Los niveles iniciales de sCD40L y PCR no se correlacionaron con ninguno de los parámetros de seguimiento (datos no mostrados).

A n á lis is de la e xp re s ió n de q u im io c in a s y re c e p to re s de q u im io c in a s en P B M C . Mientras que la interacción de CCL5 con CCR1, CCR3, CCR4 y CCR5 está bien descrita, el receptor real de CCL18 es todavía desconocido, lo que hace que CCL18 sea actualmente un ligando huérfano17. Sin embargo, se ha informado de que CCL18 es un inhibidor competitivo de la unión de CCL11 (eotaxina) a CCR318. Por lo tanto, se examinó la expresión de ARNm de los receptores de quimioquinas CCR1, Cc R3, c Cr 4 y CCR5, así como la de CCL5 y CCL18 en las PBMC. Se observó una notable y muy significativa subregulación de los cuatro receptores de quimioquinas implicados en la línea de base (t=0) en comparación con las PBMC en t=180 (FIG. 24B). Se observó un patrón temporal similar para CCL5 y CCL18, con CCL5 expresándose abundantemente en las PBMC y CCL18 sólo en niveles menores (FIG. 24A). El análisis FACS posterior para detectar la expresión de CCR3 y CCR5 en las células T CD3+ y los monocitos CD14+ reveló, para nuestra sorpresa, una expresión proteica significativamente elevada de CCR3 y CCR5 tanto en las células CD3+ como en las CD 14+ en t=0 en comparación con t=180 (FIG. 4A-D). La tinción triple para CD3 o CD14 con CCR3 y CCR5 mostró un aumento de la expresión de receptores de quimioquinas en la población CD3+ (3,1 % de células triplemente positivas en t=0 frente al 2,3 % en t=180; P=0,007) y aún más prominente en las células CD14+ (32,1 % frente al 5,1 % en t=0 y t=180, respectivamente; P<0,001). Se observó un patrón idéntico para el porcentaje de células CCR3+ y CCR5+, así como de las células CCR3+/CCR5+ combinadas en la población total de p Bm C (FiG. 4G-I).

Para evaluar si el patrón de expresión génica reducido en la línea de base fue causado por cambios transitorios en el perfil de distribución de los leucocitos, se monitorizó el porcentaje total de células CD14+ (monocitos) y CD3+ (linfocitos T) en las PBMC. Los recuentos de monocitos no fueron diferentes entre los dos puntos temporales, mientras que las células CD3+ disminuyeron ligeramente en t=0 (54,2 frente a 66,6 %; P=0,01)(FIG. 8A). Otro estudio no reveló diferencias en la relación de expresión de CCR2:CX3CR1, una medida de la distribución del subconjunto de monocitos, en las PBMC. Sin embargo, observamos niveles de expresión significativamente elevados de HNP-3, un marcador selectivo de neutrófilos, en t=0, lo que apunta a una mayor liberación de neutrófilos durante la PAU (FIG. 8B). Es posible que los cambios observados en la expresión de los receptores de quimiocinas en t=0 puedan atribuirse, al menos en parte, al aumento de los recuentos de neutrófilos. A diferencia de los niveles plasmáticos de quimioquinas, no se observaron diferencias en el nivel de expresión de los receptores de quimioquinas entre los pacientes estabilizados y refractarios en t=0 (datos no mostrados).

E n sa yo de e s tim u la c ió n de P B M C . Sin embargo, en parte, la subregulación de los receptores de quimiocinas puede reflejar una respuesta de retroalimentación sobre la ráfaga de inmunomoduladores después de la PAU. Para verificar si la regulación expresiva observada de CCR1, CCR3, CCR4 y CCR5 en las PBMC está relacionada con los elevados niveles de CCL5 y CCL18 durante los eventos isquémicos, se estimularon las PBMC con rCCL5 y/o sCCL18. Tras 6 horas de estimulación, no se observó ningún efecto diferencial en la expresión del ARNm de CCR1, CCR4 y CCR5. Sin embargo, el sCCL18 provocó una drástica subregulación de la expresión de CCR3, y este efecto se amplificó aún más mediante la coincubación con rCCL5 (P<0,01, FIG. 5A-D). Por lo tanto, la subregulación del ARNm de CCR3 en las PBMC observada in vivo podría estar causada por el aumento de los niveles de CCL18. La subregulación de CCR1, CCR4 y CCR5 in vivo podría estar regulada por otros ligandos además de CCL5 y CCL18.

Discusión

De todas las quimiocinas probadas, sólo los niveles de CCL5 y CCL18, independientemente de otros marcadores inflamatorios y de sCD40L, se observaron transitoriamente elevados en los pacientes refractarios frente a los estabilizados en la línea de base y disminuyeron en los 6 meses siguientes a la aparición de los síntomas de PAU. Estos fenómenos iban acompañados de una fuerte disminución, probablemente inducida por CCL18, de la expresión del ARNm de los receptores de quimioquinas afines CCR3 y CCR5 en las PBMC en el día 0 frente al día 180. Concomitantemente, se encontró que la expresión de superficie de CCR3 y CCR5 estaba aumentada en la línea de base, lo que posiblemente refleja una rápida exposición del receptor por parte de las PBMC durante los síntomas isquémicos. Tanto el CCL5 como el CCL18 también muestran características predictivas en cuanto al resultado clínico.

El panel múltiplex contenía varias quimiocinas, que se han relacionado previamente con la aterosclerosis o la enfermedad cardiovascular, como c Cl2, CCL5, CCL11, CXCL8 y CXCL105. CCL5 y CCL18 fueron las únicas dos quimiocinas que se regularon de forma diferencial al inicio del estudio entre los pacientes refractarios y los estabilizados. Los pacientes refractarios presentaban molestias isquémicas graves y sostenidas a pesar de la medicación antianginosa que justificaban una angiografía coronaria con o sin intervención coronaria percutánea. Por lo tanto, mientras que los niveles de otras quimiocinas que se han implicado en la ECV estaban relativamente inalterados y mientras que los pacientes refractarios no suelen diferir de los estabilizados en el grado de inflamación sistémica general, CCL5 y CCL18 podrían ser marcadores exclusivos de quimiocinas de la gravedad de la isquemia en los pacientes con PAU.

Se seleccionaron CCL5 y CCL18 para un análisis temporal posterior durante un seguimiento de 180 días. Como se ha mencionado anteriormente, el papel del CCL5 como mediador inflamatorio en las enfermedades cardiovasculares está ampliamente reconocido, y se ha visto que los niveles de CCL5 están elevados en pacientes con síndromes coronarios agudos. Sin embargo, estos estudios examinaron los niveles de CCL5 en el momento de la hospitalización y, con una sola excepción, no incluyeron un diseño de estudio prospectivo. Sólo Nomura et al. mostraron un descenso de los niveles de CCL5 a los 30 días en los pacientes con PAU después de la ICP, hasta niveles comparables a los de 180 días en nuestro estudio. Los datos de este ejemplo amplían esta observación, ya que demuestran que el descenso de los niveles de CCL5 no es una consecuencia de la ICP, sino una característica intrínseca de los pacientes con PAU estabilizados. Aunque todavía faltan datos sobre los niveles de referencia de CCL5, el CCL5 a los 2 y 180 días después de la inclusión era muy comparable a los valores comunicados en los controles sanos por Parissis et al., lo que sugiere que los niveles de CCL5 habían vuelto a la línea de base a los 2 días del inicio de los síntomas isquémicos.

Para obtener más información sobre la contribución de las plaquetas activadas a los niveles máximos de CCL5, se realizó una evaluación temporal de sCD40L22. Se observaron niveles significativamente elevados de sCD40L al inicio del estudio, lo que concuerda con estudios anteriores y refleja el mayor estado de activación plaquetaria en la PAU. Sin embargo, el descenso progresivo observado en los niveles de sCD40L en t=2 y t=180 después de la PAU nunca se ha documentado en pacientes con PAU y puede ilustrar la rápida restauración de la homeostasis de sCD40L después de la PAU. Además, los niveles de t=0 y t=2 se correlacionaron con los niveles de CCL5, lo que sugiere que las plaquetas activadas pueden ser, directa o indirectamente, una fuente importante de CCL5. Además de su secreción masiva por parte de las plaquetas activadas, los niveles elevados de CCL5 durante la PAU también podrían provenir de los linfocitos T activados y como resultado de una homeostasis alterada en el tejido isquémico distal a la oclusión. Dado que Rothenbacher et al. observaron una reducción de los niveles de CCL5 en pacientes con cardiopatía coronaria estable en comparación con los controles, es poco probable que la inflamación aguda per se sea responsable del aumento transitorio de CCL5 durante la PAU27. Esto se ve subrayado por los hallazgos en este ejemplo, ya que se observó una subregulación de la expresión del ARNm de CCL5 en las PBMC al inicio, en comparación con 180 días después del comienzo de la isquemia. Queda por determinar si el aumento de la respuesta en los pacientes refractarios refleja una activación plaquetaria (o de células T) más extensa o una mayor capacidad de las plaquetas y las células T para elaborar CCL5.

Curiosamente, el CCL18 aún no se ha asociado con trastornos cardiovasculares en cohortes de pacientes. El CCL18 está presente en altos niveles en la sangre y es producido por las células presentadoras de antígenos y por los eosinófilos. Se cree que actúa en la respuesta inmune primaria funcionando como un atrayente para las células T, los linfocitos B y los monocitos17. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, no se ha identificado su receptor, aunque se ha informado de que CCL18 funciona como un antagonista neutral de CCR3. Las pruebas sobre el papel directo de CCL18 en las enfermedades cardiovasculares no son concluyentes y se limitan a dos estudios descriptivos que documentan la expresión de CCL18 en las placas ateroscleróticas y, en particular, en los lugares de menor estabilidad. En este ejemplo se demuestra que los niveles plasmáticos de CCL18 están aumentados en los pacientes con PAU y aún más en los pacientes con síntomas refractarios. La elevación de CCL18 es transitoria y sostenida, pero los niveles disminuyen después de 180 días. El origen real del aumento persistente de CCL18tras la PAU está menos claro. La expresión de CCL18 estaba regulada a la baja en las PBMC en la línea de base, descalificando la producción abundante de estas células como fuente principal de CCL18 en plasma. Es posible que los niveles plasmáticos reflejen una liberación desde las placas vulnerables que contienen CCL18. Los niveles de CCL18 se correlacionaron negativamente con los niveles de sCD40L, lo que posiblemente apunta a una respuesta de retroalimentación negativa tras la activación de las plaquetas. Las investigaciones posteriores deberán aclarar su papel en los síndromes coronarios agudos.

Se ha sugerido que varias quimiocinas pueden actuar en la patogénesis de la cardiomiopatía isquémica no infartada, ya que la generación de oxígeno reactivo y la hipoxia predominantes en el tejido isquémico inducirán una respuesta de quimiocinas. De forma ilustrativa, se observó que la MCP-1 estaba regulada al alza en el miocardio al menos 7 días después de la isquemia en ratones y estaba asociada a la fibrosis intersticial y a la disfunción ventricular izquierda en ausencia de infarto de miocardio. Los niveles de CCL18 también persistieron en un nivel alto durante al menos dos días, y dada su capacidad para activar los fibroblastos y aumentar la producción de colágeno, es tentador proponer un papel similar de CCL18 en la curación de las lesiones. No sólo puede modular la atracción de subconjuntos de leucocitos, sino que CCL18 también puede desempeñar un papel facilitador en la función de las células madre hematopoyéticas de la médula ósea. Por lo tanto, los niveles elevados de CCL18 podrían contribuir a la respuesta inflamatoria, pero también a la movilización de células progenitoras hacia las zonas de isquemia miocárdica en previsión del proceso de reparación del miocardio.

Para subrayar aún más el papel de CCL5 y CCL 18 en la fisiopatología de la isquemia miocárdica, se observó un aumento significativo de la exposición superficial de CCR3 y CCR5 por parte de las células T CD3+ y los monocitos CD14+ y una paradójica subregulación del ARNm de CCR1, CCR3, CCR4 y CCR5 en la línea de base. Se trata de una observación intrigante y contraria a la intuición, aunque no es la primera vez que se observa una discrepancia de este tipo entre la expresión de receptores de quimiocinas en proteínas y ARNm en las PBMC de pacientes con PAU. De hecho, se ha informado previamente de un efecto similar pero opuesto para el CXCR4, es decir, una subregulación a nivel de proteína pero sobrerregulación a nivel de ARNm en la PAU en comparación con los sujetos de control sanos, mientras que los niveles de su ligando CXCL12 se redujeron en los pacientes con PAU en comparación con los controles. El rápido aumento de la exposición de la proteína de superficie puede ser el resultado de una movilización aguda de los receptores intracelulares en respuesta a un aumento de los niveles plasmáticos de los ligandos afines o de otros agentes que se liberan en la angina inestable. La subregulación relativa del ARNm de los receptores de quimiocinas en las PBMC puede reflejar en parte un cambio en el perfil leucocitario en la PAU, con una rápida movilización de neutrófilos HNP-3+, a juzgar por el aumento de la expresión de HNP-3 en el ARNm de las PBMC en t=0, y una pequeña disminución de las células CD3+, mientras que los niveles totales de CD14+ no se vieron afectados. Sin embargo, en parte también puede ser atribuible a una respuesta de retroalimentación negativa para normalizar los niveles de los receptores expuestos, como se desprende de nuestros estudios de regulación de CCL18 in vitro (FIG.

5). La retroalimentación transcripcional puede efectuarse en respuesta directa a la exposición de los receptores de superficie a CCL18, ya que los niveles de ARNm de CCR3 disminuyeron drásticamente tras la exposición a sCCL18, identificando así un nuevo papel modulador de CCL18 en la isquemia cardíaca.

El examen de la distribución de los cuartiles de CCL5 y CCL18 muestra una clara relación con la aparición de síntomas refractarios. Además, los niveles del cuartil superior también se correlacionaron con futuros eventos cardiovasculares y procedimientos de revascularización, mientras que el sCD40L y la PCR, que han demostrado tener un fuerte poder pronóstico en otros estudios, no lo hicieron en este tamaño de cohorte. Dadas las principales fuentes celulares de CCL5 y CCL18, las plaquetas activadas y el tejido isquémico, el aumento de los niveles en la PAU refractaria puede reflejar una inducción más pronunciada relacionada con la trombosis y la isquemia en estos pacientes. Queda por aclarar si es o no causal en la progresión refractaria de la enfermedad. En cuanto a las capacidades pronósticas de CCL5 y CCL18, la sensibilidad y la especificidad de los niveles del cuartil superior de las quimiocinas por separado no superaron el 80 %. La combinación de los dos cuartiles superiores de ambas quimiocinas arrojó una especificidad viable del 90,3 %, lo que descarta con bastante eficacia los síntomas refractarios por niveles bajos de CCL5 y CCL18. Sin embargo, aunque CCL5 y CCL18 pueden tener potencial como biomarcadores prospectivos independientes de la enfermedad, las correlaciones observadas entre estas quimiocinas y la gravedad clínica de los síntomas, así como diversos parámetros de seguimiento, aunque muy significativas, no son actualmente lo suficientemente fuertes por sí solas. Por lo tanto, la determinación de los niveles plasmáticos de CCL5 y CCL18, en combinación con otros parámetros de diagnóstico clínico, podría añadir características pronósticas a la evaluación de los pacientes con PAU.

Cabe señalar algunas cuestiones y limitaciones de este estudio. En primer lugar, la configuración impidió principalmente estudiar los niveles de control de estas quimiocinas antes de la PAU. No obstante, se cree que, al haberse realizado análisis prospectivos en los mismos pacientes, las conclusiones sobre el perfil temporal de CCL5 y CCL18 están justificadas. Dado que todos los pacientes están en gran medida libres de síntomas a los 180 días después de la PAU, puede asumirse con seguridad que estos últimos valores se aproximarán a los niveles previos a la PAU de los pacientes con EAC. En segundo lugar, se ha demostrado recientemente que las estatinas pueden influir en los niveles séricos de quimioquinas, así como en la expresión de los receptores de quimioquinas en las PBMC. Como se dio la afortunada circunstancia de que el muestreo de la cohorte tuvo lugar cuando el tratamiento con estatinas acababa de comenzar, sólo el 8,2 % de los pacientes de esta cohorte estaba en tratamiento con estatinas. Dado que los datos se corrigieron para este uso menor de estatinas, se cree que los resultados de este ejemplo no están sesgados por el tratamiento con estatinas. Por último, el panel multiplex también incluía quimiocinas que se han relacionado previamente con la aterosclerosis o la isquemia miocárdica, como CCL2, CCL3, CXCL8 y CXCL1021,39,40. En este estudio, los pacientes con angina inestable refractaria no mostraron diferencias significativas para estas quimiocinas ni para los demás inmunomoduladores ensayados. Por lo tanto, estas citocinas no se han seleccionado para un análisis temporal posterior, pero no se puede descartar a priori que estas citocinas puedan afectar a la angina de pecho inestable y a la isquemia miocárdica.

Además, los datos preliminares en ratones ApoE-/- propensos a la aterosclerosis que ya habían desarrollado placas en la arteria carótida inducidas por el collar mostraron que un régimen de administración intraperitoneal de 3 semanas de CCL18 recombinante agravó la progresión de la lesión en un 50 % significativo (FIG. 9), lo que sugiere que CCL18 puede ser no sólo un prometedor marcador de enfermedad cardiovascular sino también un candidato válido para la intervención terapéutica en la enfermedad cardiovascular.

Para concluir, CCL5 y particularmente CCL18 fueron identificados como quimiocinas relevantes en UAP. En futuros estudios habrá que determinar si desempeñan un papel causal en la patogénesis o si están implicados de forma más indirecta a través de otros mecanismos, si estos marcadores albergan algún otro potencial diagnóstico y si son objetivos terapéuticos adecuados.

Ejemplo 3. Los niveles de CCL3 (MIP-1a) están elevados durante los síndromes coronarios agudos y muestran un fuerte poder pronóstico de futuros eventos isquémicos.

Procedimientos

Cohortes de pacientes

M IS S IO N Las poblaciones del estudio se recopilaron a partir del estudio de intervención MISSION! El grupo de pacientes con iA m estaba formado por 44 pacientes (54,5 % varones; edad media de 61,8 ± 11,6 años) diagnosticados de IAM sobre la base del ECG y los parámetros químicos clínicos (niveles elevados de troponina y creatina-cinasa). El grupo de control estaba formado por 22 sujetos no sintomáticos emparejados por edad y sexo (54,5 % hombres; edad media de 61,7 ± 12,8), que no padecían una enfermedad arterial coronaria manifiesta (Tabla 5). Las muestras de sangre iniciales de los pacientes con IAM se tomaron a las 2 horas de la hospitalización y a las 6 horas del inicio del IAM. Se excluyeron del estudio los pacientes que padecían enfermedades autoinmunes, neoplasias, enfermedades inflamatorias crónicas como la artritis reumatoide o que recibían inmunosupresores o quimioterapia. Este estudio fue aprobado por el comité ético local y todos los pacientes y voluntarios sanos dieron su consentimiento informado antes de ser reclutados. La investigación se ajustó a los principios establecidos en la Declaración de Helsinki.

A P R A IS . Para determinar los niveles de CCL3 circulante se utilizaron muestras de plasma de pacientes con angina inestable, procedentes del estudio APRAIS (Acute Phase Reaction and Ischemic Syndromes), que está bien definido. En resumen, se incluyeron 54 pacientes que ingresaron en el servicio de urgencias del Centro Médico de la Universidad de Leiden entre marzo y septiembre de 1995 con angina de pecho inestable de clase IIIB de Braunwald y se les hizo un seguimiento de hasta 18 meses. Se obtuvieron muestras de sangre venosa en el momento del ingreso (t=0), después de 2 (t=2) y 180 días después del ingreso (t=180), se centrifugaron y las alícuotas de plasma se almacenaron a -80 °C. hasta su posterior análisis. Todos los pacientes habían recibido un tratamiento médico estándar, es decir, aspirina 300 mg por vía oral, nitroglicerina por vía intravenosa y heparina en infusión titulada según el tiempo de tromboplastina parcial activado. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito y el protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Centro Médico de la Universidad de Leiden.

E n sa yo m u ltip le x de q u im io qu ina s . Se determinaron los niveles de quimioquinas circulantes de CCL2, CCL3, CCL5, CCL11, CCL17, CCL18, CCL22, CXCL8, CXCL9 y CXCL10, así como cuatro citocinas de referencia, en la cohorte MISSION! Brevemente, las muestras de plasma se filtraron y posteriormente se diluyeron con un 10 % de suero normal de rata y ratón (Rockland, Gilvertsville, Pa.) para bloquear la unión residual de anticuerpos no específicos. Se añadieron 1.000 microesferas por quimioquina (10 pl/pocillo) en un volumen total de 60 pl, junto con muestras estándar y en blanco, y la suspensión se incubó durante 1 hora en una placa filtrante de 96 pocillos a temperatura ambiente (TA). A continuación, se añadieron 10 pl de mezcla de anticuerpos biotinilados (16,5 pg/ml) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras el lavado con PBS-1 % BSA-0,5 % Tween 20, las perlas se incubaron con 50 ng/pocillo de estreptavidina R-ficoeritrina (BD Biosciences, San Diego, California) durante 10 minutos. Por último, las perlas se lavaron de nuevo con PBS-1 % BSA-0,5 % Tween 20, y se midió la intensidad de la fluorescencia en un volumen final de 100 pl de tampón ELISA de alto rendimiento (Sanquin, Amsterdam, Países Bajos). Las mediciones y el análisis de datos se realizaron con el sistema Bio-Plex Suspension Array en combinación con el software Bio-Plex Manager versión 3.0 (Bio-Rad laboratories, Hercules, Calif.).

In fa rto de m io c a rd io m urino . Los ratones fueron anestesiados y ventilados artificialmente con una mezcla de oxígeno y N2O [1:2 (vol/vol)] utilizando un ventilador para roedores (Harvard Apparatus, Holliston, Mass.) al que se añadió 2 2,5 % de isoflurano (Abbott Laboratories, Hoofddorp, Países Bajos) para la anestesia. El infarto de miocardio se indujo mediante la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior proximal con una sutura de seda estéril de 7/0 (Ethicon, Johnson & Johnson, Amersfoort, Países Bajos). Tres horas después de la ligadura se sacrificaron los ratones, se aislaron las PBMC y los bazos para el análisis de citometría de flujo y se recogió el plasma para la detección de quimiocinas. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Leiden.

E L IS A y o tros ensayos. Los niveles de CCL3 humano y murino (Biosource, Carlsbad, Calif.), CXCL10 murino (R&D systems, Minneapolis, Minn.) e IL-6 murino (eBioscience, San Diego, Calif.) se determinaron mediante ensayos Elisa en sándwich como se describe en el protocolo del fabricante. Los parámetros inflamatorios basales de la cohorte APRAIS, como la proteína C reactiva, el fibrinógeno y la velocidad de sedimentación globular (VSG), se determinaron según lo descrito anteriormente13. El ligando CD40 soluble (sCD40L) se determinó mediante un inmunoensayo de alta sensibilidad (Quantakine HS, R&D Systems, Minneapolis, Minn.).

C ito m e tría de flu jo . Las PBMC se aislaron de la sangre total mediante la ablación de los eritrocitos. Los esplenocitos se aislaron exprimiendo los bazos a través de un colador celular de 70 pm (BD falcon, BD Biosciences, San José, California). Tras la recolección, las células sanguíneas totales y los esplenocitos se incubaron con tampón de lisis de eritrocitos durante 5 minutos en hielo. Las células se centrifugaron durante 5 minutos y se resuspendieron en tampón de lisis. Los eritrocitos residuales se lisaron mediante una incubación de 5 minutos en hielo. Las células se lavaron dos veces con PBS y se contaron. Por consiguiente, las células se tiñeron para los marcadores de superficie CD4, CCR3, CCR5 (BD Biosciences), CD8, F4/80 (eBioscience) y CXCR3 (US biological, Swampscott, Mass.) añadiendo 0,25 pg de anticuerpo por muestra. Tras 45 minutos de incubación en hielo, las células se lavaron con PBS y posteriormente se analizaron por citometría de flujo (FACScalibur, BD biosciences).

P ro ce d im ie n to s es ta d ís ticos . El análisis estadístico se realizó con el SPSS versión 13.0 (SPSS, Chicago, III.) Todos los valores se expresan como media E error estándar de la media. Las diferencias en la distribución de los factores de riesgo entre el grupo de control y el de IAM se analizaron con una prueba de probabilidad exacta de Fishers. Se comprobó la normalidad de los datos de las quimiocinas mediante un análisis de Kolmogorov-Smirnov. Los datos con distribución no gaussiana se analizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney, mientras que las variables con distribución normal se analizaron mediante la prueba t de Student. El análisis de correlación con los parámetros inflamatorios se realizó mediante la prueba de correlación de intervalos de Spearman. El ajuste de covariantes para los factores de riesgo se realizó mediante una prueba de regresión lineal univariante. Se evaluó la distribución de los cuartiles de CCL3 y se utilizó la prueba de Chi-Cuadrado para asociar los niveles elevados de CCL3 con futuros eventos cardiovasculares. Un valor P <0,05 se consideró significativo.

Resultados

E s ta d ís tica s de lo s p a c ie n te s de M IS S IO N . Se recopilaron dos subcohortes en una relación de 2:1, ya que un estudio piloto reveló que la desviación estándar de los niveles de citoquinas en la población con IAM era de media 1,5 veces superior a la de los sujetos de control. Las subcohortes de IAM y de control se emparejaron por sexo, edad y factores de riesgo que se sabe que están asociados al estado inflamatorio (diabetes mellitus tipo 2, hipertensión e hiperlipidemia). La cohorte de IAM abarcaba una fracción mayor de fumadores y exfumadores que la cohorte de control (56,8 % en el IAM frente a 22,7 % en los controles; P=0,01; Tabla 5). Por lo tanto, todos los valores de quimiocinas se ajustaron al tabaquismo mediante un análisis univariante. Todas las proteínas estaban dentro del intervalo detectable del ensayo utilizado.

TABLA 5

¡MISSION! Características de los pacientes

Controla Infarto agudo de miocardio Valor P

Edad (años) 61,7 ± 2,6 61,8 ± 1,8 0,96

Hombre/Mujer 12/10 24/20 1,00

Diabetes Mellitus 3 (13,6%) 6 (13,6% 1,00

Hipertensión 8 (36,3%) 11 (25 %) 0,39

Colesterol total 5,6 ± 0,3 mmol/L 6,0 ± 0,1 mmol/L 0,14

Fumar 5 (22,7%) (56,8 %)*; 0,01

4 (18,1 %) exfumadores 4 (9,1 %) exfumadores

P a n e l de re fe re nc ia . Como control de la validez del ensayo multiplex, se incluyó en el análisis un panel de citocinas y marcadores de adhesión celular de referencia. De acuerdo con los resultados anteriores, los niveles plasmáticos de IL-2 (0,07 ± 0,06 pg/ml en los controles frente a 0,65 ± 0,28 en el IAM; P=0,003), TNF-a (1,05 ± 0,32 pg/ml en los controles frente a 2,4 ± 0,72 en el IAM; P=0,03), sICAM-1 (476,1 ± 80,7 ng/ml en los controles frente a 7 l3,0 ± 49,9 en el IAM; P=0,04) y la IL-6 (9,8 ± 4,1 en los controles frente a 23,7 ± 8,0 pg/ml en el IAM; P=0,04) estaban significativamente elevados en los pacientes con IAM (Tabla 6). Otros marcadores generales de inflamación como la IL-1a, el IFN-y y la sVCAM-1 no se modificaron (datos no mostrados), lo que demuestra que la cohorte de pacientes con IAM no estaba enriquecida en sujetos con un estado general de hiperinflamación.

TABLA 6

Niveles del cuartil APRAIS CCL31 = 0 determinados por multiplex

Cuartiles CCL3 p /ml

Q u im ioq u in as . Los niveles plasmáticos de las quimiocinas CC CCL3 (39,8 pg/ml, 21,3-50,3 IQR en los controles frente a 47,8 pg/ml, 39,6-67,2 IQR en el IAM; P=0,01: FIG. 13A) y CCL5 (13,4 ng/ml, 6,4-29,2 IQR en los controles frente a 33.3 ng/ml, 19,1-45,3 en el IAM; P=0,001: FIG. 14B) fueron significativamente sobrerregulados en el IAM en comparación con los pacientes de control (Tabla 7). Tras la corrección de los factores de riesgo cardiovascular, CCL3 y c CL5 permanecieron significativamente elevados durante el IAM (P=0,025 y P=0,006 respectivamente). De las quimiocinas CXC, sólo la CXCL8 (4,2 ± 0,50 pg/ml en los controles frente a 6,8 ± 0,56 en el iA m ; P=0,01; FIG. 13C) estaba significativamente regulado al alza, mientras que el CXCL10 (255,1 ± 47,2 pg/ml en el control frente a 162,6 ± 20.3 en el IAM; P=0,002: FIG. 13D) estaba subregulado en el IAM en comparación con los controles. Tras el ajuste de las covariables, tanto el CXCL8 como el CXCL10 permanecieron "significativamente modificados" (P=0,02 y P=0,04 respectivamente). Todas las demás quimiocinas medidas no estaban reguladas de forma diferencial durante el IAM (Tabla 7).

TABLA 7

Valores medios de citoquinas y quimioquinas

Controlar AMI P P*

IL-2 0,07 ± 0,06 pg/ml 0,65 ± 0,28 pg/ml T 0,003 0,047

IL-6 9,8 ± 4,1 pg/ml 23,8 ± 8,0 pg/ml T 0,04 0,07

TNFa 0,6 pg/ml, (0-1,6) 1,4 pg/ml, (0,5-2,4) T 0,03 0,01 sICAM-1 476 ± 80,7 ng/ml 714 ± 50,0 ng/ml T 0,045 <0,001 CCL2 30:5 ± 81 pg/ml 522 ± 77 pg/ml = 0,08 0,14

CCL3 49,8 pg/ml (21,3-50,6) 47,7 pg/ml, (39,6-67,2) T 0,02 0,025 CCL5 13,4 ng/ml (6,4-29,2) 33,3 ng/ml, (19,8-45,3) T 0,001 0,006 CCL11 15,9 pg/ml, (12,7-22,0) 21,2 pg/ml, (13,6-29,8) = 0,27 0,33 CCL17 16,4 pg/ml, (10,5-21,4) 16,6 pg/ml, (8,6-28,9) = 0,46 0,26 CCL18 555 ± 186 ng/ml 681 ± 160 ng/ml = 0,18 0,85 CCL22 356 pg/ml, (264-409) 371 pg/ml, (296-549) = 0,11 0,08 CXCL8 3,5 pg/ml, (1,9-4,3) 5,1 pg/ml, (3,5-7,4) T 0,004 0,02 CXCL9 163 ± 51 pg/ml 155 ± 25 pg/ml = 0,16 0,87 CXCL10 255 ± 47,4 pg/ml 120 ± 20,3 pg/ml 1 0,001 0,004

Panel de parámetros medidos de referencia (IL-2, IL-6, TNF-a y sICAM-1) y de quimiocinas que contiene el valor P y el valor P corregido (P*) tras el ajuste por tabaquismo. Los valores se expresan como media ± SEM o mediana con IQR cuando es apropiado.

A P R A IS . Para verificar esta observación, se compararon los niveles de CCL3 de la cohorte MISSION! con los de la cohorte APRAIS, tal y como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 2. El análisis entre estudios demostró que los pacientes con PAU también mostraban un aumento similar de los niveles plasmáticos de CCL3 en comparación con el grupo MISSION! Los pacientes con IAM (FIG. 11A). A continuación, se realizó un análisis temporal de los niveles de CCL3 circulante en la cohorte APRAIS de pacientes con angina de pecho inestable. Las muestras de plasma de la línea de base (t=0), t=2 y t=180, analizadas por ELISA, revelaron una disminución significativa de los niveles de CCL3 en t=180 en comparación con t=0 así como con t=2 (t=07,57 pg/ml; t=26,49 pg/ml; t=1804,31 pg/ml, P<0,001) (FIG.

11B). Aunque los niveles plasmáticos absolutos de CCL3 detectados por ELISA fueron menores, la comparación de ambas técnicas reveló una correlación altamente significativa (R=0,92, P<0,001). A continuación, se trató de evaluar si los niveles plasmáticos de CCL3 tenían algún potencial para predecir el resultado clínico. Dado el tamaño de la cohorte, los niveles plasmáticos de CCL3 t=0 se clasificaron en cuartiles y se analizó su correlación con la aparición de síntomas isquémicos durante o inmediatamente después de la hospitalización y/o de los síndromes coronarios agudos (para la distribución por cuartiles, véase la tabla 6). Los niveles del cuartil superior de CCL3 fueron altamente predictivos de la aparición de síndromes coronarios agudos durante el seguimiento (cociente de probabilidad 11,52; P<0,01) y de angina de pecho inestable recurrente durante la hospitalización (cociente de probabilidad 14,63; P<0,01) (FIG. 12A, B). La muerte cardíaca durante el seguimiento también mostró una asociación significativa, aunque menos fuerte (Likelihood ratio 7,92; P<0,05) (datos no mostrados). Por último, CCL3 no se correlacionó con ninguno de los parámetros inflamatorios (datos no mostrados). Sin embargo, los niveles de sCD40L revelaron una correlación negativa significativa con los niveles de CCL3 (R=-0,44; P=0,001), lo que sugiere una respuesta de retroalimentación tras la activación de las plaquetas.

A diferencia de CCL5 y CCL18, los niveles de CCL3 no fueron predictivos de la naturaleza refractaria de la PAU (etapa temprana), pero sí lo fueron de manera altamente significativa de más eventos a medio plazo que ocurren dentro de los 180 días posteriores a la PAU.

In fa rto de m io c a rd io m urino . Los resultados obtenidos en humanos sugieren un importante papel de CCL3 en la lesión miocárdica isquémica. Para comprobar si el aumento de las quimiocinas estaba relacionado con la isquemia se realizaron experimentos de infarto de miocardio en ratones. Dado que las quimiocinas CCL5 y CXCL8 se han estudiado ampliamente en relación con la aterotrombosis y el IAM, se investigaron además CCL3 y CXCL10. Para inducir un infarto agudo de miocardio se ligó la arteria coronaria descendente anterior izquierda en ratones C57B16. Los niveles de CCL3 fueron, en concordancia con los hallazgos anteriores de MISSION!, significativamente elevados después del IAM (33,2 ± 1,5 vs. 76,4 ± 37,4 pg/ml en los animales ligados; P=0,02) (FIG. 14B). Como control del modelo de IAM, se midieron los niveles de la citoquina IL-6 relacionada con la isquemia16,17. Los niveles de IL-6 aumentaron significativamente tras la ligadura (0,67 ± 0,26 en los animales simulados frente a 1,34 ± 0,46 ng/ml en los ligados; P=0,007, FIG. 14A). Sorprendentemente, los niveles de CXCL10, a diferencia de los hallazgos de MISSION!, aumentaron significativamente tras el IAM (157,3 ± 64,8 en los animales operados de forma simulada, frente a 310,6 ± 86,6 pg/ml en los animales ligados; P=0,03) (FIG. 14C). Además, se cosecharon PBMC y se analizó la expresión de receptores de quimioquinas en diferentes subconjuntos celulares. Como se esperaba, la población total de células T aumentó en la circulación después de la ligadura (14,1 ± 3,8 % en los controles frente a 32,8 ± 14,4 % en los ratones ligados; P=0,038), mientras que no se observaron efectos en las células T esplénicas (P=0,9, FIGS. 15A y D respectivamente). Además, el número de macrófagos tanto circulantes como esplénicos no estaba regulado por la lesión isquémica (datos no mostrados). Un análisis más exhaustivo de la población de células T reveló un enriquecimiento específico de las células T CCR5+ (8,0 ± 2,0 % en los controles frente al 11,4 ± 1,4 % en los animales ligados; P=0,02) (FIG. 15B). El enriquecimiento de las células T CCR5+ circulatorias se acompañó de una reducción de las células T CCR5+ esplénicas (19,95 ± 0,5 % frente a 14,1 ± 3,1 %; P=0,004) (FIG. 15E). El CCR3 es el receptor conocido para la quimioquina relacionada con el CCL3, el CCL4. Como CCL3 y CCL4 suelen estar corregidos, también se analizó la expresión de CCR3 en las PBMC y los esplenocitos. El número de células T CCR3+ circulantes era muy bajo. El análisis mostró un ligero, aunque no significativo (P=0,24), aumento de las células T CCR3+ circulantes (datos no mostrados). No se observaron diferencias en las células T CCR3+ esplénicas (datos no mostrados). En conjunto, estos datos sugieren una migración específica de CCL3 de las células T desde los órganos linfoides secundarios hacia el lugar de la lesión isquémica. Además, se determinó la expresión del receptor de quimioquinas CXC CXCR3 en las células T circulantes. En coincidencia con el aumento de los niveles de CXCL10, el número de células T CXCR3+ circulantes aumentó significativamente tras la ligadura de la DAI (29,1 ± 1,9 % frente a 43,5 ± 5,7 %; P=0,04) (FIG.

15C). Sin embargo, no se observaron efectos en las células T esplénicas CXCR3+ (P=0,78) (FIG. 15F).

Los datos preliminares sugieren que los niveles de CCL3 no sólo son predictivos del riesgo de futuros eventos cardiovasculares, sino que también pueden estar implicados de forma causal en el desarrollo de la enfermedad, ya que el crecimiento de la placa aterosclerótica en el seno aórtico de ratones hiperlipidémicos knockout del receptor l Dl con una deficiencia leucocitaria de CCL3 es significativamente menor (-60 %) que el de los ratones con una producción leucocitaria normal de CCL3 (FIG. 10).

Ejemplo 4. Papel causal de los neutrófilos en el desarrollo de la aterosclerosis.

Materiales y procedimientos

A n im a le s . Los ratones LDLr/_ se obtuvieron de la instalación local de cría de animales. Los ratones se mantuvieron con pienso regular esterilizado (RM3; Special Diet Services, Essex, Reino Unido). El agua de bebida se suministró con antibióticos (83 mg/L de ciprofloxacina y 67 mg/L de sulfato de polimixina B) y 6,5 g/L de sacarosa y se suministró ad libitum. Los experimentos con animales se realizaron en las instalaciones de los laboratorios Gorlaeus de la Universidad de Leiden. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el comité de ética para experimentos con animales de la Universidad de Leiden.

P e rfil de e xp res ión tem po ra l. Los ratones macho LDLr/_ fueron alimentados con una dieta de tipo occidental que contenía un 0,25 % de colesterol y un 15 % de cacaobutter (Special Diet Services, Sussex, Reino Unido) dos semanas antes de la cirugía y durante todo el experimento. Para determinar los niveles de expresión génica en las placas de ratones (n=20), se indujeron lesiones ateroscleróticas en la arteria carótida mediante la colocación de un collar perivascular, tal como se ha descrito anteriormente! Los ratones fueron anestesiados mediante la inyección subcutánea de ketamina (60 mg/kg, Eurovet Animal Health, Bladel, Países Bajos), citrato de fentanilo y fluanisona (1,26 mg/kg y 2 mg/kg respectivamente, Janssen Animal Health, Sauderton, Reino Unido). De 0 a 8 semanas después de la colocación del collar, cada dos semanas se sacrificó un subconjunto de 4 ratones. Los animales fueron anestesiados como se ha descrito anteriormente y perfundidos a través del ventrículo cardíaco izquierdo con PBS y desangrados por transección de la arteria femoral. Posteriormente, se extrajeron ambas arterias carótidas comunes y se congelaron en nitrógeno líquido para una óptima conservación del ARN. Las muestras se almacenaron a -80 °C. hasta su uso posterior.

A is la m ie n to de A R N . Se agruparon dos o tres carótidas por muestra y se homogeneizaron triturándolas en nitrógeno líquido con un mortero. El ARN total se extrajo del tejido utilizando el reactivo Trizol según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Breda, Países Bajos). El ARN se transcribió a la inversa utilizando la transcriptasa inversa M-MuLV (RevertAid, MBI Fermentas, Leon-Roth) y se utilizó para el análisis cuantitativo de la expresión génica con un aparato ABI PRISM 7700 Taqman (Applied Biosystems, Foster City, California) como se ha descrito anteriormente, utilizando la hipoxantina fosforribosiltransferasa murina (HPRT) y la ciclofilina A (CypA) como genes estándar de mantenimiento (Tabla 8).

T rasp lan te de m é d u la ósea. Para inducir la aplasia de la médula ósea, los ratones receptores LDLr/_ macho fueron expuestos a una dosis única de 9 Gy (0,19 Gy/min, 200 kV, 4 mA) de irradiación corporal total utilizando una fuente Rontgen Andrex Smart 225 (YXLON International) con un filtro de aluminio de 6 mm 1 día antes del trasplante. Se aisló la médula ósea de los machos CCL3'/_ o de sus compañeros de camada mediante el lavado de los fémures y las tibias. Los receptores irradiados recibieron 0,5*107 células de médula ósea por inyección en la vena de la cola y se les permitió recuperarse durante 6 semanas. Los animales fueron sometidos a una dieta de tipo occidental que contenía un 0,25 % de colesterol y un 15 % de mantequilla de cacao (SDS) durante 12 semanas y posteriormente fueron sacrificados. Veinticuatro horas antes del sacrificio, un subconjunto de animales fue inyectado por vía intraperitoneal con lipopolisacárido (LPS) (Salmonella minnesota R595 (Re) (List Biological Laboratories Inc., Campbell, Calif.)). Los niveles plasmáticos de CCL3 se determinaron por medio de un sándwich Elisa (Biosource, Carlsbad, California, de acuerdo con el protocolo del fabricante) para confirmar el deterioro de la producción de CCL3 de los leucocitos.

A n á lis is h is to ló g ico . Se recogieron secciones de criostato de la raíz aórtica (10 |jm) y se tiñeron con Oil-red-O. Se determinó el tamaño de la lesión en 5 secciones de la zona de la valva de la válvula aórtica. Las secciones correspondientes en portaobjetos separados se tiñeron inmunohistoquímicamente con un anticuerpo dirigido contra un antígeno específico de los macrófagos (MOMA-2, IgG2b monoclonal de rata, dilución 1:50; Serotec, Oxford, Reino Unido). Se utilizó IgG-AP de cabra (dilución 1:100; Sigma, St. Louis, Mo.) como anticuerpo secundario y NBT-BCIP (Dako, Glostrup, Dinamarca) como sustratos enzimáticos. Se utilizó la tinción con tricrómico de Masson (Sigma, St. Louis, Mo.) para visualizar el colágeno (tinción azul). Los neutrófilos se visualizaron con la tinción de cloroacetatoesterasa Naphtol AS-D, según el protocolo del fabricante (Sigma).

E s tim u la c ió n de m acró fa go s . Los macrófagos RAW264.7 privados de suero fueron estimulados con 10 jg/m l de ox-LDL o 1 ng/ml de LPS durante 24 horas. Se aisló el ARN total para la PCR en tiempo real para evaluar la expresión de CCL3. Los macrófagos RAW264.7 privados de suero fueron estimulados con CCL3 recombinante (10 o 100 ng/ml) durante 24 horas. Posteriormente se añadió [3H]-Timidina (1 jCi/pocillo, actividad específica 24 Ci/mmol; Amersham Biosciences, Países Bajos) a cada pocillo y se dejó que las células proliferaran durante otras 24 horas. Las células se enjuagaron dos veces con PBS frío y posteriormente se lisaron con NaOH 0,1M. La cantidad de incorporación de [3H]-timidina se midió con un analizador de centelleo líquido (Tri-Carb 2900R).

N e u tro p e n ia in d u c id a p o r c ic lo fos fam ida . Los ratones hembra CCL3'/_ o el control WT recibieron una inyección intraperitoneal (i.p) de ciclofosfamida (6 mg/ratón) para agotar los neutrófilos de la sangre como se ha descrito anteriormente. Se tomaron regularmente muestras de sangre por la vena de la cola y se determinó la diferenciación de las células sanguíneas en un aparato de diferenciación celular Sysmex (Goffin Meyvis, Etten-Leur, Holanda).

Q u im io ta x is in vivo. Los ratones hembra CCL3'/_ o el control WT recibieron una inyección i.p. de 500 ng de KC recombinante (Peprotech, Rocky Hill, N.J.) o PBS. Dos horas más tarde se aislaron las células sanguíneas y peritoneales y se analizó la composición de los neutrófilos mediante citometría de flujo.

C ito m e tría de flu jo. Los leucocitos peritoneales se recogieron mediante un lavado de la cavidad peritoneal con PBS. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y los leucocitos peritoneales en bruto se incubaron a 4°C. con tampón de lisis eritrocitaria (155 mM NH4CL en 10 mM Tris/HCL, pH 7,2) durante 5 minutos. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 1500 rpm y se resuspendieron en tampón de lisis para eliminar los eritrocitos residuales. Las células se lavaron dos veces con PBS. Las suspensiones celulares se incubaron con suero de ratón normal al 1 % en PBS y se tiñeron para los marcadores de superficie CD11b, GR1 y CD71 (eBioscience, San Diego, California) a una concentración de 0,25 jg Ab/200,000 células. Posteriormente, las células se sometieron a un análisis citrométrico de flujo (FACSCalibur, BD Biosciences, San Diego, California). Los datos FACS se analizaron con el software CELLQuest (BD Biosciences).

A n á lis is es ta d ís tico . Los datos se expresan como media ± SEM. Se utilizó una prueba t de Student de dos colas para comparar grupos individuales, mientras que los grupos múltiples se compararon con un ANOVA de una vía y una prueba posterior de comparaciones múltiples de Student-Newman-Keuls. Los datos no paramétricos se analizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney. Un nivel de P<0,05 se consideró significativo.

Resultados

El análisis de la expresión temporal de las lesiones ateroscleróticas en ratones LDLrA mostró una clara y transitoria sobrerregulación de CCL3 en las placas iniciales (2 semanas después de la colocación del collar). En fases más avanzadas de la progresión de la lesión, CCL3 vuelve a su nivel original. Esta expresión va acompañada inicialmente de un aumento de la expresión del marcador de macrófagos CD68, cuyos niveles se mantienen elevados en momentos posteriores. La expresión de CD36 está algo retrasada en comparación con la de CD68 y CCL3 (FIG. 16). Los perfiles de expresión sugieren que CCL3 puede estar implicado en el reclutamiento crítico de células inflamatorias a los sitios de las lesiones ateroscleróticas. La exposición in v itro de macrófagos RAW 264.7 a ox-LDL produce una inducción moderada de la expresión de CCL3, mientras que el ligando TLR4 LPS induce fuertemente MIP1a a nivel de ARNm (FIG. 17).

Para evaluar los efectos de la deficiencia hematopoyética de CCL3 en la migración y activación leucocitaria, así como en la aterogénesis, reconstituimos ratones LDLr-/ con médula ósea CCL3-/. La deficiencia de CCL3 no influyó en el peso corporal ni en los niveles de colesterol total durante el transcurso del experimento (datos no mostrados). Los niveles plasmáticos de MIP1a no fueron significativamente diferentes entre las quimeras CCL3'/_ y los controles de camada (2,4 ± 0,8 pg/ml en WT frente a 0,9 ± 0,6 pg/ml en las quimeras CCL3'/_; p=0,1, FIG. 17C). El fenotipo deficiente de CCL3 fue mucho más pronunciado tras el tratamiento in vivo con LPS. Los niveles circulantes de MIP1a 24 h después del tratamiento con LPS aumentaron considerablemente en el WT pero no en las quimeras CCL3'/_ (14,7 ± 0,4 pg/ml en el control frente a 2,1 ± 1,0 pg/ml en las quimeras CCL3'/_; p=0,00005, FIG. 18a ).

El desarrollo de lesiones en la raíz aórtica de las quimeras CCL3'/_ se redujo en un significativo 31 % (135,1 ± 76,5*103 jm 2en CCL3'/_ comparado con 198,4 ± 51,4*103 jm 2 en los controles; P=0,04, FIG. 19A). El porcentaje de macrófagos MoMa-2+ de la íntima no fue diferente entre los grupos (19,3 ± 2,6 % en los controles frente a 22,9 ± 3,0 % en CCL3'/_ , FIG. 18B), lo que sugiere que el CCL3 por sí solo puede no ser muy crítico en la acumulación y proliferación de macrófagos en la placa aterosclerótica. El número de células T CD3 no se vio influido por la deficiencia de CCL3 (2,9 ± 1,2 células T/mm2 de placa en los controles y 2,6 ± 1,5 células T/mm2 de placa en CCL3-/-, FIG. 18D). Por el contrario, la cantidad de neutrófilos de la placa (7,0 ± 0,7 en WT frente a 2,9 ± 0,8/mm2 de tejido intimal en las placas CCL3-/-; p=0,001, FIG. 18E), así como la adherencia de neutrófilos se redujo significativamente en las placas CCL3-/-(FIG.

18F). Como medida de la etapa de progresión de la lesión se determinó la deposición de colágeno intimal. El porcentaje de colágeno en las placas CCL3-/- no se vio influido por la deficiencia de c CL3 (7,5 ± 1,4 en WT frente a 5,7 ± 1,0 % en las quimeras CCL3-/-, FIG. 18C).

La deficiencia de CCL3 no influyó en el número total de glóbulos blancos circulantes en los animales trasplantados WT y CCL3-/-(4,4 ± 0,7 en WT frente a 3,9 ± 0,6*106 células/ml en CCL3-/-, FIG. 19A) y el número de monocitos circulantes tampoco se vio afectado por la deficiencia de CCL3 (7,7 ± 1,1 en WT frente a 8,9 ± 1,0 % en quimeras CCL3-/-, FIG. 19B). Curiosamente, el porcentaje de neutrófilos circulantes disminuyó significativamente en las quimeras CCL3-/-(35,3 ± 3,9 en WT frente a 23,6 ± 2,5 % en las quimeras CCL3-/-; p=0,02, FIG. 19C).

La disminución del número de neutrófilos puede ser el resultado de una reducción de la vida media o de un deterioro de la diferenciación y la salida del estroma de los neutrófilos. Para investigar esto, se trató a los animales con una única inyección de ciclofosfamida y se monitorizó la cinética de eliminación/repoblación de neutrófilos durante 10 días. El número de glóbulos blancos basales y la composición celular no fueron diferentes entre los controles WT y los ratones CCL3-/. Las células deficientes en CCL3 fueron ligeramente más sensibles al tratamiento con ciclofosfamida (FIG. 20A, B) , ya que la vida media de los glóbulos blancos aumentó significativamente en los ratones CCL3-/- en comparación con los WT (1,09 ± 0,07 días en los WT frente a 0,89 ± 0,06 días en los CCL3-/-; p=0,04, FIG. 20C) y aparecieron distribuidos por igual en el subconjunto de neutrófilos y linfocitos (FIG. 20C). Así, los ratones deficientes en CCL3 muestran una menor vida media de los neutrófilos, lo que coincide con la reducción del número de neutrófilos circulantes y en placa en esta cepa. La repoblación de células se inició 5 días después de la inyección y fue similar entre los controles CCL3-/- y WT (FIG. 20D)

A continuación se evaluó la respuesta quimiotáctica de los neutrófilos WT y CCL3-/- hacia un gradiente de la principal quimioquina en el reclutamiento de neutrófilos, KC. Dos horas después de la inyección i.p. de KC, se aislaron los glóbulos blancos y los leucocitos peritoneales y se analizó su contenido en neutrófilos. El número de neutrófilos circulantes fue similar entre los animales WT y CCL3-/-(6,1 ± 1,0 en WT frente a 5,3 ± 1,0 en CCL3-/-, FIG. 21A). Sorprendentemente, dado el reducido número de neutrófilos circulantes, los animales CCL3-/- tenían un número ligeramente mayor de neutrófilos en el peritoneo en condiciones normales (0,6 ± 0,5 % en WT comparado con 1,4 ± 0,07, p=0,2, datos no mostrados). Las inyecciones de KC indujeron fuertemente la migración de neutrófilos hacia el peritoneo de los animales de control. Los recuentos de neutrófilos peritoneales tras las inyecciones de KC en los animales CCL3-/- fueron sólo marginalmente inferiores en comparación con los animales WT (12,3 ± 0,4 en los controles frente a 10,2 ± 1,9 en los animales CCL3-/-, datos no mostrados). Sin embargo, la inducción de la afluencia de neutrófilos disminuyó en los animales CCL3-/-(20 veces la inducción en WT comparada con 7,5 veces en CCL3-/-, p=0,003; FIG. 21C), lo que sugiere un deterioro de la quimiotaxis de los neutrófilos CCL3-/- en condiciones de inflamación.

Curiosamente, la formación de placas se atenuó como resultado de la ausencia específica de CCL3 en los leucocitos, lo que puede deberse a una menor acumulación de neutrófilos en la placa. En conjunto, los datos indican que la deficiencia de CCL3 se traducirá en una reducción de la vida media de los neutrófilos y en un deterioro de la acumulación de neutrófilos en la placa dependiente de CXCR2, que posteriormente se traducirá en una atenuación de la progresión de la placa.

Discusión

La migración de leucocitos hacia la pared del vaso mediada por quimiocinas es un paso esencial en la formación y progresión de la lesión aterosclerótica. La quimioquina CC CCL3 puede interactuar con los receptores de quimioquinas CCR4, CCR1 y CCR5, de los cuales los dos últimos han sido implicados en la aterogénesis. En combinación con la expresión aórtica sobrerregulada durante la aterogénesis6 y su potente efecto quimiotáctico sobre las células T, los macrófagos y los neutrófilosTNF-a, es concebible el papel de esta quimioquina en la aterogénesis. Aquí demostramos que los leucocitos son la principal fuente de CCL3 en condiciones de inflamación y que la deficiencia de CCL3 en los leucocitos atenúa el desarrollo de la placa al alterar la vida media de los neutrófilos y reducir su acumulación.

Los experimentos in vitro establecieron claramente que los macrófagos activados son una rica fuente de CCL3, lo que coincide con datos anteriores. Además, se observó que los niveles de referencia de CCL3 en la circulación eran sólo en parte de origen leucocitario, sino que eran producidos casi exclusivamente por los leucocitos durante las respuestas inflamatorias provocadas por el LPS. Los perfiles de expresión del desarrollo de la lesión aterosclerótica revelaron que CCL3 se sobrerregula principalmente durante la progresión temprana de la lesión, lo que sugiere que CCL3 está implicado en la inflamación de la placa6. La aterogénesis en los ratones CCL3-/- se atenuó significativamente, pero no se apreciaron efectos en el contenido de macrófagos o células T. Curiosamente, la deficiencia hematopoyética y sistémica de uno de los receptores de CCL3, el CCR1, provocó una aceleración de la aterosclerosis. Las placas deficientes en CCR1 contenían más macrófagos y células T y las células T CCR1-/- producían más IFNy. Por el contrario, la deficiencia funcional de CCR5, ya sea en el linaje hematopoyético o de forma sistémica, demostró reducir el desarrollo de las lesiones ateroscleróticas y las placas contenían menos macrófagos y células T. El antagonismo del CCR5 mediante el uso de Met-RANTES atenuó de forma similar el desarrollo de la aterosclerosis y el contenido de macrófagos y células T. Además, el tratamiento con Met-Rantes provocó una disminución de los niveles de expresión de CCR5, pero no de su ligando CCL313. Se demostró que el CCL3 tiene una mayor afinidad de unión con el CCR5, lo que sugiere que los efectos mediados por el CCR5 son primarios durante una inflamación crónica de baja tasa, mientras que la inflamación aguda sustancial podría corregir estos efectos a través de la señalización del CCR1. El cambio fenotípico observado en la deficiencia de CCL3 hematopoyético parece ser más coherente con el de la función CCR5 alterada, aunque no observamos efectos notables en el contenido de macrófagos de la placa. Esto indica que, aunque el CCL3 podría influir en la migración de células inflamatorias, no es crucial en la migración de monocitos o células T hacia la placa.

Hasta hace poco, los neutrófilos no estaban implicados en la patogénesis de la aterosclerosis. Sin embargo, cada vez se acumulan más datos que apoyan un papel activo de este subconjunto de glóbulos blancos en esta enfermedad. Por ejemplo, se ha demostrado que los infiltrados de neutrófilos en la placa se asocian con los eventos coronarios agudos. El apoyo experimental demostró la abundante presencia de neutrófilos en las placas avanzadas de los ratones, y de una expansión colaborativa tras el bloqueo de CXCR4. Los neutrófilos de la placa son potentes células inflamatorias que actúan en un estrecho margen de tiempo. Los neutrófilos se asocian a un aumento de la apoptosis intimista y a un fenotipo proinflamatorio. Es de suponer que la acumulación de neutrófilos en las lesiones ateroscleróticas puede inducir la desestabilización de la placa como resultado de una mayor inflamación, la formación de un núcleo necrótico como consecuencia de una lesión oxidativa y la degradación de la matriz por la liberación de elastasas de neutrófilos. Se ha informado de que el CCL3 puede aumentar la quimiotaxis de los neutrófilos inducida por la citoquina proinflamatoria TNFa de forma dependiente del CCR5. En concordancia con estos hallazgos se muestra en este ejemplo la migración atenuada de neutrófilos hacia la placa y la diapédesis en la deficiencia de CCL3 hematopoyético. Además, la migración in v ivo de neutrófilos hacia el KC (análogo murino de la IL8) se redujo en los ratones CCL3'/_. Esto indica que la IL-8, al igual que el TNFa, puede inducir la migración de neutrófilos mediada por CCL3.

Otra opción intrigante es que el CCL3 afecta a la homeostasis de los neutrófilos. Durante la inflamación, el número de neutrófilos circulantes era significativamente menor en los ratones CCL3'/_, lo que encaja bien con la idea de que la apoptosis de los neutrófilos se considera una medida protectora para amortiguar las respuestas inflamatorias agudas y evitar daños tisulares no deseados. Por lo tanto, los neutrófilos madurados en fase terminal muestran una vida media muy reducida. Además, tienen alterada la migración y la degranulación. Se observó un claro efecto de CCL3'/_ en la cinética de eliminación de neutrófilos, ya que la vida media de los neutrófilos deficientes en CCL3 estaba disminuida. Sin embargo, la repoblación de neutrófilos no se vio influenciada por la deficiencia de CCL3, lo que demuestra que la maduración de los neutrófilos y la liberación del estroma por sí mismas no se ven influenciadas. Estos datos sugieren que los neutrófilos CCL3'/_ son más sensibles a la ciclofosfamida, y quizás a otras señales pro-apoptóticas que conducen a una vida media reducida.

En conjunto, los datos de este ejemplo establecen claramente un papel causal de los neutrófilos en el desarrollo de la aterosclerosis. Además, se plantea la hipótesis de que, en condiciones de inflamación, el CCL3 derivado de los leucocitos puede, posiblemente junto con el TNFa, alterar la homeostasis de los neutrófilos y potenciar su quimiotaxis hacia la placa aterosclerótica para acelerar la formación de la lesión.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo para la detección de uno o más analitos en una muestra obtenida de un sujeto, comprendiendo el dispositivo:

a) una superficie para llevar a cabo al menos una reacción de detección, comprendiendo la superficie: una región de detección que comprende uno o más agentes de unión a epítopos; y una región de referencia que comprende el mismo uno o más agentes de unión a epítopos, en la que cada agente de unión a epítopos está configurado para unirse exclusivamente a uno de los al menos un analito, en el que la región de detección está separada de la región de referencia;

b) uno o más sensores de detección para detectar la luz asociada a la región de detección;

c) uno o más sensores de referencia para detectar la luz asociada a la región de referencia; y

en el que el dispositivo está configurado de tal manera que la diferencia entre la señal generada desde la región de detección y la región de referencia se establece en cero antes de la adición de la muestra.

2. El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende además al menos una fuente de luz para iluminar la región de detección y la región de referencia, en la que la al menos una fuente de luz es luz ambiental.

3. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que la región de detección comprende al menos cinco agentes de unión a epítopos.

4. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que la región de detección comprende agentes de unión a epítopos específicos para CCL3, CCL5, CCL18, hsCRP y Tnl cardíaca.

5. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que la región de detección comprende agentes de unión a epítopos específicos para cada uno de los analitos de la Tabla A.

6. Un sistema para detectar uno o más analitos en una muestra y diagnosticar una condición, comprendiendo el sistema :

a) un dispositivo según la reivindicación 1 y al menos una fuente de luz para iluminar la región de detección y la región de referencia;

b) un dispositivo informático que comprende uno o más procesadores;

c) una memoria que comprende:

una base de datos de calibración que comprende uno o más conjuntos de calibración, comprendiendo cada conjunto de calibración una conversión entre una lectura combinada del sensor y una concentración de un analito;

una base de datos de diagnóstico que comprende uno o más valores de umbral y una o más reglas de diagnóstico;

un CRM codificado con una aplicación de detección de analitos que comprende una pluralidad de módulos ejecutables por el uno o más procesadores, comprendiendo los módulos:

un módulo de control para controlar el funcionamiento del dispositivo y coordinar la función de la pluralidad de módulos;

un módulo de detección equilibrado para controlar el funcionamiento de uno o más sensores y/o fuentes de luz del dispositivo;

un módulo de detección de analitos para procesar las señales de salida combinadas recibidas del módulo de detección equilibrado;

un módulo de posprocesamiento para analizar además las concentraciones de analitos calculadas por el módulo de detección de analitos;

un módulo de diagnóstico para comparar las entradas de la matriz de diagnóstico y determinar la condición de un sujeto de acuerdo con una o más reglas de diagnóstico definidas dentro de la base de datos de diagnóstico almacenada en la memoria; y

un módulo GUI para generar uno o más formularios para recibir entradas al sistema y/o mostrar salidas del sistema; y

d) una pantalla.

7. Un procedimiento para predecir un fallo cardíaco en un sujeto, comprendiendo el procedimiento :

a. poner en contacto el dispositivo de la reivindicación 1 con una muestra biológica obtenida del sujeto, en el que la región de detección y la región de referencia del dispositivo comprenden agentes de unión a epítopos específicos para al menos cuatro biomarcadores seleccionados de la Tabla A;

b. detectar con el dispositivo si el nivel de un analito se encuentra en el intervalo positivo indicado en la Tabla A; c. identificar al sujeto como en riesgo de una futura insuficiencia cardíaca cuando uno o más de los analitos en la muestra biológica se encuentran en el intervalo positivo.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el sujeto se queja de un malestar que puede indicar una insuficiencia cardíaca.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el fallo cardíaco es un síndrome coronario agudo o un infarto de miocardio.

10. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la insuficiencia cardíaca inminente es una insuficiencia cardíaca que se produce dentro de las 2 semanas siguientes a la determinación del nivel de biomarcadores.

11. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la insuficiencia cardíaca puede comprender una insuficiencia cardíaca mortal o casi mortal.

12. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en líquido cefalorraquídeo, sangre, orina, saliva, sudor y lágrimas.