ES2897599T3 - Mejora de la administración de genes a células asesinas naturales, células madre hematopoyéticas y macrófagos - Google Patents

Mejora de la administración de genes a células asesinas naturales, células madre hematopoyéticas y macrófagos Download PDF

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Abstract

Un procedimiento in vitro para mejorar la administración de genes a las células que comprende la coadministración de (5Z)-7-Oxozeaenol, junto con un vector retroviral o lentiviral a una célula en un medio nutritivo en el que las células se seleccionan entre asesinas naturales, células madre y macrófagos.

Description

DESCRIPCIÓN
Mejora de la administración de genes a células asesinas naturales, células madre hematopoyéticas y macrófagos Antecedentes
Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos del sistema inmunitario innato. Son productoras de citocinas y tienen capacidad citotóxica para eliminar tanto las células infectadas por el virus como las tumorales. De este modo, la inmunoterapia adoptiva con células NK es un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer. En la última década, varios productos anticancerígenos basados en células NK se han llevado a la fase de ensayo clínico con resultados clínicos prometedores. Sin embargo, para fabricar productos de terapia con células NK más eficaces es esencial desarrollar estrategias novedosas, tales como la modificación genética de las células NK. Además, el uso de células NK modificadas genéticamente que han sido redirigidas a dianas tumorales por medio de la introducción de receptores de antígenos activadores o quiméricos presenta una perspectiva atractiva para otras aplicaciones clínicas (Pegram et al., 2009). La introducción de genes que expresan diversas citoquinas para mejorar la supervivencia in vivo y la citotoxicidad de las células NK transferidas adoptivamente también se encuentra entre los diversos enfoques. El problema sigue siendo que las células NK son inherentemente resistentes a las infecciones retrovirales (Lanier 2008; Alici et al., 2009; Brandstadler y Yang, 2011; Sutlu et al., 2012). Mientras que se ha demostrado la mejora de la administración de genes retrovirales y lentivirales a las células NK por medio del aumento de la proliferación y la focalización del mecanismo de defensa viral intracelular por medio de inhibidores de moléculas pequeñas (Sutlu et al., 2012). También es un problema entregar materiales genéticos a través de vectores virales a los macrófagos y a las células madre. Sigue existiendo la necesidad en la técnica de una transfección más eficiente de células, en particular las NK, las células madre hematopoyéticas y los macrófagos. Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a la administración de (5Z)-7-Oxozeaenol (iX) in vitro a las células con un vector viral de ARN para mejorar la transfección y, por lo tanto, aumentar la proliferación de NK, células madre y macrófagos. Este procedimiento se puede aplicar a la preparación de dichas células con vistas a su uso en la terapia celular adoptiva. Aunque no se quiere limitar a ninguna teoría, se cree que los aumentos de la modificación genética observados se deben a la regulación a la baja de los mecanismos de defensa intracelulares mediados por el Rig I. Las células tratadas de esta manera se pueden utilizar para tratar el cáncer, las enfermedades causadas por una mutación genética conocida y los trastornos metabólicos causados por una mutación genética conocida.
Específicamente, la invención se define en las reivindicaciones y se refiere, en un primer aspecto, a un procedimiento in vitro para mejorar la administración de genes a las células que comprende la coadministración de (5Z)-7-Oxozeaenol, junto con un vector retroviral o lentiviral a una célula en un medio nutritivo en el que las células se seleccionan entre las asesinas naturales, las células madre y los macrófagos.
En una realización, las células son células NK92. En otra realización, el (5Z)-7-Oxozeaenol se administra en una cantidad suficiente para lograr una concentración de aproximadamente 0,04 pM a aproximadamente 10 pM en el medio nutritivo.
En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento ex vivo de preparación de células adecuadas para su uso en la transferencia celular adoptiva a un paciente, dicho procedimiento comprende la administración de genes a las células mediante el uso de un vector retroviral o lentiviral con la coadministración de 5Z)-7-Oxozeaenol, en el que las células se seleccionan entre las asesinas naturales, las células madre y los macrófagos.
En una realización, las células transfectadas son adecuadas para su uso en la transferencia celular adoptiva para el tratamiento del cáncer. El cáncer se puede seleccionar entre: carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemias y blastomas: leucemia linfoblástica aguda (todas), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el sida, cáncer anal, astrocitoma, carcinoma de células basales, cáncer de vías biliares extrahepáticas (colangiocarcinoma), cáncer de vejiga, tumor óseo (osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno), glioma del tronco del encéfalo, cáncer cerebral, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, vía visual y glioma hipotalámico, cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, linfoma de Burkitt, linfoma del sistema nervioso central, cáncer de cuello uterino, condrosarcoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (gist), tumor de células germinales extracraneal, extragonadal u ovárico, linfoma hodgkin trofoblástico gestacional, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (cáncer de células renales), leucemia linfoblástica aguda (también llamada leucemia linfocítica aguda), leucemia mieloide aguda (también llamada leucemia mielógena aguda), leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica (también llamada leucemia mieloide crónica), leucemia de células pilosas, cáncer de labio y cavidad oral, liposarcoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, macroglobulinemia, waldenstrom, cáncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (ojo), cáncer de células de Merkel, mesotelioma, cáncer escamoso de cuello metastásico con primario oculto, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide, mieloma múltiple (cáncer de la médula ósea), trastornos mieloproliferativos, mixoma, cáncer de cavidad nasal y senos paranasales, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, oligodendroglioma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario (tumor epitelial-estromal de superficie),tumor de células germinales de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, cáncer de páncreas, cáncer de senos paranasales y cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales (cáncer de riñón), cáncer de células transicionales de pelvis renal y uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, síndrome de Sezary, cáncer de piel melanoma y no melanoma, carcinoma de piel de células de Merkel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer escamoso de cuello con primario oculto, cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, linfoma de células t (micosis fungoide y síndrome de Sezary), cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y del uréter, tumor trofoblástico, cáncer de células transicionales del uréter y de la pelvis renal, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma uterino, cáncer de vagina, vía visual y glioma hipotalámico.
En otra realización, las células transfectadas son adecuadas para su uso en la transferencia celular adoptiva para tratar una enfermedad causada por una mutación genética. Dicha enfermedad se puede seleccionar entre: deficiencia de 21-hidroxilasa, acondroplasia, porfiria intermitente aguda, deficiencia de adenilosuccinato liasa, adrenoleucodistrofia, síndrome de Alagille, enfermedad de Alexander, síndrome de Alstrom, amelogénesis imperfecta, deficiencia de biotinidasa, CGD Trastorno granulomatoso crónico, síndrome de Di George, anemia de Fanconi, Deficiencia de G6PD, deficiencia de lipoproteína lipasa, distrofia muscular, tipo Duchenne, síndrome de retraso mental ligado al X de Siderius causado por mutaciones en el gen PHF8, inmunodeficiencia combinada grave ligada al X (XSCID), o anemia sideroblástica ligada al X (XLSA), enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave ligada al X.
Alternativamente, la enfermedad puede ser un trastorno metabólico causado por una mutación genética conocida, tal como la enfermedad de Niemann-Pick, la enfermedad de Tay-Sachs, la enfermedad de Gaucher o la enfermedad de Fabry.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 contiene dos gráficos de barras que muestran que la inhibición de la señalización inmunitaria innata con iX mejora la eficacia de la transducción lentiviral en las células NK. Las células NK-92 y las células NK humanas primarias aisladas de PBMC de donantes sanos fueron sometidas a transducción lentiviral en presencia de 6 pM de BX795 o iX durante 6 horas. La expresión de GFP se adquiere 72 horas después. Los porcentajes de las células se muestran en el gráfico.
La Figura 2A es un gráfico que muestra que el iX tiene un efecto dependiente de la dosis con una toxicidad mínima para las células NK. Las células NK humanas primarias y las células NK-92 son transducidas con el virus LeGO-G2 en presencia de dosis variables de BX795 o iX durante 6 horas. La expresión de GFP se analiza por citometría de flujo 72 horas después de la transducción. Los porcentajes de células GFP+ se muestran en el gráfico. Datos de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado.
La Figura 2B contiene dos gráficos de barras que comparan las células apoptóticas con las muertas de Annexin -V+ /PI.
La Figura 3 contiene fotos de un gel que muestra que el tratamiento con iX durante la transducción lentiviral disminuye RIG-I e IRF-3.
La Figura 4 contiene dos gráficos de barras que muestran que el tratamiento con iX interfiere con la secreción de citoquinas antivirales IFNy y TNF.
La Figura 5 es un gráfico que muestra que el tratamiento iX tiene una firma transcriptómica única en comparación con el BX795.
Las Figuras 6A a d muestran las supuestas vías de señalización afectadas por BXx795.
Las Figuras 6E a H muestran las supuestas vías de señalización afectadas por el iX.
La Figura 7 es un gráfico que muestra que la administración de iX aumenta la edición de genes.
Descripción detallada de la invención
La terapia celular se está convirtiendo rápidamente en un medio viable para el tratamiento de las enfermedades de los mamíferos. Desgraciadamente, muchas aplicaciones terapéuticas se ven limitadas por la escasa eficacia con la que los genes pueden llegar a las células diana. El uso de iX junto con los procedimientos que se indican a continuación consigue resultados inesperados. Antes de estos experimentos se desconocía que una pequeña molécula pudiera dirigirse a RIG I y regular a la baja los mecanismos de defensa intracelulares. Con la presente invención se pueden introducir más fácilmente los genes deseados en las células diana. Se cree que los análogos, derivados o miméticos del iX también serían eficaces.
Ejemplo 1
Materiales y Procedimientos:
Líneas celulares:
Las células 293FT se adquirieron de Invitrogen (Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.) y se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (GIBCO, Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (GIBCO), 01 mM de aminoácidos no esenciales (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 6 mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich), 1 mM de piruvato sódico (Sigma-Aldrich) y 20 mM de HEPES (Sigma-Aldrich). Las células NK92 se mantuvieron en medio CellGro SCGM (Cellgenix) complementado con un 20% de FBS y 1000 U/ml de rhIL-2 (Proleukin, Chiron Corporation).
Producción de vectores lentivirales
Para la producción de vectores lentivirales pseudotipados VSV-G, se sembraron 14x106 células 293FT en una placa de 150 mm recubierta de poli-D-lisina (BD Biosciences, San José, CA, USA). Al día siguiente se transfectaron las células con 30 |jg del plásmido LeGO-G2 (cortesía del Prof. Boris Fehse, Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf, Hamburgo, Alemania), 15 jg de pMDLg/pRRE (Addgene, Cambridge, MA, EE.UU.), 10 jg de pRSV-REV (Addgene) y 5 jg de phCMV-VSV-G (Addgene) mediante el uso de un kit de transfección con fosfato de calcio (Sigma-Aldrich) en presencia de 25 jM de cloroquina (Sigma-Aldrich). 10 horas después de la transfección, se cambió el medio y, a continuación, se recogió el sobrenadante que contenía virus cada 24 horas durante 2 a 3 días y se almacenó a - 80 °C hasta su uso posterior. Se utilizó una pequeña alícuota de cada producción para determinar los títulos virales por medio de la transducción de células 293FT con cantidades diluidas en serie del sobrenadante del virus.
Aislamiento y cultivo de células asesinas naturales primarias
Las capas leucocitarias se obtuvieron de donantes sanos a través del banco de sangre de1Hospital Universitario Karolinska, Huddinge. El protocolo experimental fue aprobado por el comité ético de investigación local.
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron por centrifugación en gradiente, mediante el uso de Lymphoprep (Nyegaard, Oslo, Noruega) y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (GIBCO, Grand Island, NY, USA). El recuento de células y la viabilidad se evaluaron por exclusión del colorante Turk y Trypan Blue. Las células NK se obtuvieron mediante el uso del kit de aislamiento de células NK (Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania) y la máquina AutoMACS (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras el aislamiento, las células n K se pusieron en cultivo a una concentración de 1x106 células/ml en CellGro SCGM (Cellgenix) suplementado con 10% de suero AB humano (Lonza, Basilea, Suiza) y 1000 U/ml de rhIL-2 (Proleukin, Chiron Corporation). Para las pruebas iniciales de estimulación con citocinas antes de la transducción (Figura 1), se utilizaron iL-12 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), IL-15 (Peprotech) e IL-21 (Peprotech) a una concentración de 20 ng/ml. Para el resto de los experimentos, sólo se utilizaron 1000 U/ml de rhIL-2 y 20 ng/ml de IL-21.
Transducción lentiviral de células asesinas naturales
Para cada transducción lentiviral, se sembraron 0,25x106 células NK por pocillo en una placa de 24 pocillos (BD Biosciences) y se mezclaron con una cantidad apropiada de sobrenadante del virus en presencia de 8 jg/ml de sulfato de protamina (Sigma-Aldrich) o polibreno (Sigma-Aldrich) en un volumen final no superior a 1 ml. Se reponen las citocinas y las placas se centrifugan a 1000xg durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, sin eliminar los sobrenadantes virales, las placas se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 durante 4 a 6 horas. Al final de la incubación, se llevó a cabo una segunda centrifugación a 1000xg durante 1 hora a temperatura ambiente, tras lo cual se retiraron los sobrenadantes de los pocillos y se añadió 1 ml de medio de crecimiento de células NK fresco (CellGro SCGM suplementado con 10% de suero a B humano) por pocillo. Las células se mantuvieron en este medio con adición diaria de citoquinas (IL-2: 1000 U/ml, y la IL-21: 20 ng/ml. Se utilizaron combinaciones de citoquinas como se indica en la Figura 1. En el resto de los experimentos sólo se utilizaron IL-2 e IL-21) durante al menos 3 días antes de la adquisición de la expresión de eGFP. En los experimentos indicados, los siguientes inhibidores estuvieron presentes durante la transducción: BX795 (Invivogen) y (5z)-7-Oxozeaenol (iX) (Tocris).
Transducción lentiviral de la línea celular NK92
Para la transducción de líneas celulares, se sembraron 2x105 células por pocillo en placas de 24 pocillos. El tratamiento con 6jM de BX795 y (5Z)-7-Oxozeaenol (iX) se inició simultáneamente con el proceso de transducción. Se añadió una cantidad adecuada de sobrenadantes virales en los pocillos junto con sulfato de protamina (NK92, células) y se ajustó el volumen total a 500 jl. Las placas se centrifugaron a 1000Xg durante 1 hora y luego se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 durante 4 a 6 horas, tras lo cual se eliminó el sobrenadante que contenía el virus y se añadió medio de cultivo fresco. Las células se cultivaron durante al menos 3 días antes de adquirir la expresión de eGFP.
Edición de genes
La reciente aparición del sistema de repeticiones palindrómicas agrupadas y regularmente espaciadas (CRISPR) para la edición de genes tiene el potencial de superar estas limitaciones. La tecnología CRISPR utiliza una nucleasa fija, a menudo la proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) de Streptococcus pyogenes, en combinación con un ARN guía corto (ARNg) para dirigir la nucleasa a una secuencia de a Dn específica. Confirmamos que el reconocimiento del ARNg y, por lo tanto, la eficacia de la edición podían aumentar con la introducción del inhibidor iX. Los macrófagos primarios humanos, las HSCs CD34+ y la línea celular NK92 fueron transfectados con plásmidos que codifican Cas9-2A-GFP y ARNg mediante el uso de los respectivos kits de Amaxa y el programa específico para cada célula mediante el uso del dispositivo Nucleofector II (VAPA-1003 para las HSCs CD34+, VAPA-1008 para las células de los macrófagos, y VVPA-1005 para las células NK92) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que en la mitad de los grupos, se ha añadido 1uM de iX en el reactivo de transfección del fabricante.
Los siguientes ARN guía disponibles en el mercado de Origene Technologies fueron probados contra la Beta 2 Microglobulina: GATGTCTCGCTCCGTGGCCT (Sec. ID Núm. 1); CTCGCGCTACTCTCTTTC (Sec. ID Núm. 2); GACTCACGCTGGATAGCCTC (Sec. ID Núm. 3); CCAGAAAGAGAGTAGC (Sec. ID Núm. 4) CACAGCTAAGGCCACGGAGC (Sec. ID Núm. 5); GGCCGAGATGTCTCGCTCCG (Sec. ID Núm. 6); TTGCGGAGCGCATGCCTTT (Sec. ID Núm. 7); CCACCTCTTGATGGGCTAG (Sec. ID Núm. 8); ATACCTTGGTTGATCCACT (Sec. ID Núm. 9); CGTGAGTAAACCTGAATCTT (Sec. ID Núm. 10); AAGTCAACTTCAATGTCGGA (Sec. ID Núm. 11); CATAGATCGAGACATGTAAG (Sec. ID Núm.12); GCTACTCTCTTTCTGGCC (Sec. ID Núm. 13);ACCCAAACCAAGCCTTTCTA (Sec. ID Núm. 14); y TATAAGTGAGGCGTCGC (Sec. ID Núm. 15). 48 horas después de la transfección, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-B2M (clon:2M2, Biolegend) para comparar la pérdida de expresión de p2m. A continuación, se analizaron las células por medio de flujometría, como se describe a continuación.
Citometría de flujo
Todas las tinciones de anticuerpos para la citometría de flujo se llevaron a cabo de acuerdo con el siguiente protocolo: Para las tinciones de superficie, las células se lavaron una vez con PBS y se incubaron con las cantidades adecuadas de anticuerpos a 4 °C durante 30 minutos. A continuación, las células marcadas se lavaron con PBS y se fijaron en PFA al 1% antes de la adquisición de datos. La adquisición de datos se llevó a cabo en un FACSCalibur (BD Biosciences), CyFlow ML (Partec GmbH, Munster, Alemania) y LSRII-Fortessa (BD Biosciences) con filtros estándar. Los datos se analizaron con el software FlowJo (TreeStar Inc.). Los anticuerpos utilizados para las células NK fueron, CD56 (NCAM16.2), CD56 (B159), CD3 (SK7), CD3 (SP34-2) de BD Biosciences.
Resultados y discusión:
La inhibición de las vías del sensor inmunitario innato intracelular mejora la eficacia de la administración de genes lentivirales en las células NK
Se ha demostrado que la detección de los componentes del vector viral mediada por un sensor inmunitario innato activa una respuesta antiviral en las células NK, lo que afecta negativamente a la eficacia de la transducción lentiviral. Se ha utilizado con éxito pequeñas moléculas inhibidoras de la señalización inmunitaria innata durante la transducción lentiviral para desactivar o reducir la respuesta antiviral.
Como se ha informado previamente (Sutlu et al., 2012), el uso de BX795 aumenta drásticamente la eficiencia de transducción en las células NK. BX795 es un inhibidor del complejo TBK1/IKKe que actúa como mediador común en las vías de señalización de RIG-I, MDA-5 y TLR3 (Clark, et al. 2009). Por lo tanto, se podría afirmar que el ARN lentiviral es reconocido por uno o más de estos receptores y se desencadena una respuesta antiviral, que puede ser inhibida por el uso de BX795.
Aquí se muestra que el uso del inhibidor de TAK1 iX mejora la administración de genes lentivirales a las células NK en mayor medida en comparación con BX795. Cuando se utiliza a una concentración de 6 pM durante la transducción lentiviral, iX proporciona una mejora estadísticamente significativa en la administración de genes tanto a las células NK humanas primarias como a la línea de células NK humanas NK-92 (Figura 1).
En conjunto, estos resultados apoyan la hipótesis de que durante la transducción se activan los mecanismos de defensa antivirales intracelulares y contribuyen significativamente a la resistencia de las células NK a la modificación genética lentiviral. La inhibición de esta respuesta mediante el uso de inhibidores de moléculas pequeñas mejora significativamente la eficacia de la administración de genes.
Se ha demostrado que el iX aumenta la eficacia de la edición de genes en células madre hematopoyéticas, macrófagos y células NK. La prueba de iX a un nivel de 1pM durante un corto período de tiempo ha aumentado la edición de p2M de forma significativa en los tres tipos de células. Los resultados se sintetizan en la Figura 7 (n=4). iX muestra un efecto dependiente de la dosis con una toxicidad mínima para las células NK
El ensayo de diferentes concentraciones de iX ha demostrado que el inhibidor, como se demostró anteriormente para el BX795, tiene un efecto dependiente de la dosis en el aumento de la eficiencia de la modificación genética en las células NK (Figura 2A). En el caso de iX, aunque se observa un efecto significativo ya a una concentración de 0,5|j M, este efecto aumenta aún más hasta 1,5|j M, tras lo cual parece estabilizarse. En comparación con el BX795, el iX funciona mejor a dosis más bajas y mejora la eficacia de la administración de genes lentivirales en un grado significativamente mayor.
Notablemente, el uso de iX a la concentración óptima no presenta efectos tóxicos inmediatos en las células NK, como se determinó por medio de la tinción de Annexin-V/PI después del tratamiento con BX795 (Figura 2b). A la dosis óptima de 1,5j M, el iX no muestra una toxicidad significativa sobre las células NK en comparación con los controles de DMSO. A 1,5j M, el BX795 tampoco muestra toxicidad, mientras que a la dosis óptima de 6j M se observa un aumento bastante pequeño pero estadísticamente significativo de las células apoptóticas y muertas en el cultivo. Por el contrario, no se observaron signos de toxicidad inmediata para las células NK en el caso del iX, incluso a la concentración de 6j M.
En conjunto, estos resultados indican que iX no sólo es más eficiente que BX795 en la mejora de la eficiencia de la administración de genes lentivirales, sino también significativamente menos tóxico para las células.
El tratamiento con iX durante el suministro de genes lentivirales regula a la baja RIG-I e IRF3
A fin de caracterizar mejor los efectos de los inhibidores sobre la señalización inmunitaria innata durante la transducción lentiviral, se ha analizado la expresión de la molécula sensorial de ARN viral RIG-I y del factor de transcripción IRF3 que actúa corriente abajo de RIG-I. Mientras que los cambios de expresión de estos genes no eran detectables a nivel proteico después del periodo de transducción de 6 horas, se observó una disminución significativa de la expresión tanto de RIG-I como de IRF3 atribuible al uso de BX795 e iX a las 24 horas (Figura 3). Además, hemos observado que el grado de regulación a la baja en RIG-I e IRF3 fue significativamente mayor cuando se utilizó iX, en comparación con el uso de BX795. Esta podría ser una posible explicación de por qué el iX funciona mejor que el BX795 a la hora de mejorar la administración de genes lentivirales.
El tratamiento con iX durante la administración de genes lentivirales suprime las respuestas de IFNy y TNF.
Para caracterizar aún más los mecanismos detrás de la entrega superior de genes lentivirales desencadenada por iX, se probaron las respuestas mediadas por citoquinas tras la exposición a partículas lentivirales en presencia de BX795 e iX. Las células NK92 tratadas con iX durante la entrega del gen lentiviral, disminuyeron significativamente la secreción de la citoquina antiviral, IFNy, ya a las seis horas, mientras que BX795 sólo pudo desencadenar significativamente un efecto similar 24 horas después de la exposición a las partículas lentivirales. (Figura 4). Además, se observó una tendencia similar en la misma configuración para otra citoquina antiviral, el TNF. (Figura 4). En general, el uso de iX durante la administración de genes lentivirales es superior a BX795 y esto podría deberse a la inactivación de la vía RIG-I y de la molécula de señalización descendente IRF-3, que conduce a la disminución de la secreción de señales de peligro, citoquinas antivirales. (Figura 4).
iX y BX795 tienen un perfil de expresión génica diferencial.
Se evalúa el perfil de expresión génica por ARNseq para identificar las vías desencadenadas por la entrada del lentivirus en ausencia y presencia de inhibidores de moléculas pequeñas. Las células NK-92 se transducen como se ha descrito anteriormente. Al final del protocolo de transducción de 6 horas, se extrae el ARN de las células y se secuencia en un instrumento HiSeq 2500. Tras el control de calidad, las lecturas se asignan al genoma humano mediante el uso del alineador STAR y se estima la abundancia de genes con HT-Sec. La expresión diferencial se analiza con el software DeSec. En síntesis, el pretratamiento de iX y BX795 dio lugar a diferentes perfiles de ARNm. (Figura 5). Además, en consonancia con los experimentos in vitro anteriores, el tratamiento de iX durante la administración de genes lentivirales afectó a las vías asociadas con las respuestas antivirales, tales como el TNF, el IFN y las vías de reconocimiento de patrones (Figuras 6E a H), mientras que el BX795 no logró suprimir por completo respuestas antivirales similares a nivel del ARNm (Figuras 6A a D).
Ejemplo profético 2: Administración in vivo
Aunque no se reivindique como parte de la invención y se recomiende debido al efecto supresor inherente de iX en las vías de reconocimiento de ARN intracelular y la mayor susceptibilidad de infección viral incontrolable que resultaría, es concebible que iX se pueda utilizar para la administración de genes in vivo con concentraciones séricas que varíen entre 0,2 y 6mM. El Ix se puede administrar por vía inyectable, oral, nasal o mucosa por medio de tecnologías conocidas en la técnica. Las posibles aplicaciones terapéuticas de iX incluyen el cáncer, la terapia génica hepática, los trastornos de un solo gen, los trastornos de almacenamiento, así como la reorientación de genes tumorales.
En este contexto, los cánceres tratables por la presente invención incluyen carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemias y blastomas: leucemia linfoblástica aguda (todas), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el sida, cáncer anal, astrocitoma, carcinoma de células basales, cáncer de vías biliares extrahepáticas (colangiocarcinoma), cáncer de vejiga, tumor óseo (osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno) glioma de tronco cerebral, cáncer de cerebro, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma de la vía visual y del hipotálamo, cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, linfoma de Burkitt, linfoma del sistema nervioso central, cáncer de cuello uterino, condrosarcoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (gist), tumor extracraneal, extragonadal u ovárico de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, glioma del tronco cerebral, astrocitoma cerebral infantil, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (cáncer de células renales), leucemia linfoblástica aguda (también llamada leucemia linfocítica aguda), leucemia mieloide aguda (también llamada leucemia mielógena aguda), leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica (también llamada leucemia mieloide crónica), leucemia de células pilosas, cáncer de labio y cavidad oral, liposarcoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, macroglobulinemia waldenstrom, cáncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (ojo), cáncer de células de Merkel, mesotelioma, cáncer escamoso de cuello metastásico con primario oculto, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide, mieloma múltiple (cáncer de la médula ósea), trastornos mieloproliferativos, mixoma, cáncer de la cavidad nasal y de los senos paranasales, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de pulmón no microcítico, oligodendroglioma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario (tumor epitelial-estromal de superficie), tumor de células germinales de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, cáncer de páncreas, cáncer de senos paranasales y cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales (cáncer de riñón), cáncer de células transicionales de pelvis renal y uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, síndrome de Sezary, melanoma y cáncer de piel no melanoma, carcinoma de piel de células de Merkel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer de cuello escamoso con primario oculto cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, linfoma de células t (micosis fungoide y síndrome de Sezary), cáncer de testículo, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y del uréter, tumor trofoblástico, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y del uréter, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma uterino, cáncer de vagina, glioma de la vía visual y del hipotálamo, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms (cáncer de riñón).
La presente invención también es útil en el tratamiento de trastornos genéticos como: Deficiencia de 21-hidroxilasa, acondroplasia, porfiria intermitente aguda, deficiencia de adenilosuccinato liasa, adrenoleucodistrofia, síndrome de Alagille, enfermedad de Alexander, síndrome de Alstrom, amelogénesis imperfecta, deficiencia de biotinidasa, CGD trastorno granulomatoso crónico, síndrome de Di George, anemia de Fanconi, deficiencia de G6PD, deficiencia de lipoproteína lipasa, distrofia muscular, tipo Duchenne, síndrome de retraso mental ligado al X de Siderius causado por mutaciones en el gen PHF8, inmunodeficiencia combinada grave ligada al X (X-SCID), anemia sideroblástica ligada al X (XLSA).
Los trastornos metabólicos tratables con la presente invención incluyen: Enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry.
Ejemplo 3: Transferencia celular adoptiva
En un uso más preferido, el iX se utiliza para tratar las células antes de la transferencia celular adoptiva a un paciente. Mediante el uso de los protocolos descritos anteriormente, iX se puede utilizar en cualquier momento durante la manipulación ex vivo. La concentración preferida de iX en los intervalos de cultivo es de aproximadamente 0,4mM a aproximadamente 10mM. Lo más preferido es de 0,5mM a 6mM Estas células de este modo pueden ser infundidas inmediatamente o congeladas para un punto de tiempo de infusión posterior mediante el uso de protocolos muy conocidos en la técnica. La administración de iX se puede hacer tanto in vivo como ex vivo como una dosis única o repetitiva mediante el uso de la ventana de dosis donde la concentración sérica del inhibidor puede estar entre 0,4 a6 uM, preferentemente la dosis más baja. Las células así tratadas se pueden utilizar en la transferencia celular adoptiva para tratar las condiciones descritas en el Ejemplo 2 anterior
Ejemplo profético 4 Tratamiento de la inflamación viral
Aunque este aspecto no se reivindica como parte de la invención, también puede ser posible tratar a los pacientes que sufren una inflamación causada por una infección viral, tal como la miositis, la miocarditis, la artritis viral, la encefalitis viral y la meningitis. En estas enfermedades, el iX se puede coadministrar con una terapia antiviral para

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento in vitro para mejorar la administración de genes a las células que comprende la coadministración de (5Z)-7-Oxozeaenol, junto con un vector retroviral o lentiviral a una célula en un medio nutritivo en el que las células se seleccionan entre asesinas naturales, células madre y macrófagos.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células son células NK92.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el (5Z)-7-Oxozeaenol se administra en una cantidad suficiente para lograr una concentración de aproximadamente 0,04 pM a aproximadamente 10 pM en el medio nutritivo.
4. Un procedimiento ex vivo de preparación de células adecuadas para su uso en la transferencia celular adoptiva a un paciente, dicho procedimiento comprende la administración de genes a las células mediante el uso de un vector retroviral o lentiviral con la coadministración de (5Z)-7-Oxozeaenol, en el que las células se seleccionan entre asesinas naturales, células madre y macrófagos.
5. El procedimiento ex vivo de acuerdo con la reivindicación 4, en el que las células transfectadas son adecuadas para su uso en la transferencia celular adoptiva para el tratamiento del cáncer.
6. El procedimiento ex vivo de la reivindicación 5, en el que el cáncer se selecciona entre: carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemias y blastomas: leucemia linfoblástica aguda (todas), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el sida, cáncer anal, astrocitoma, carcinoma de células basales, cáncer de vías biliares extrahepáticas (colangiocarcinoma), cáncer de vejiga, tumor óseo (osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno) glioma de tronco cerebral, cáncer de cerebro, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma de la vía visual y del hipotálamo, cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, linfoma de Burkitt, linfoma del sistema nervioso central, cáncer de cuello uterino, condrosarcoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (gist), extracraneal, tumor de células germinales extracraneal, extragonadal u ovárico, tumor trofoblástico gestacional, glioma del tronco cerebral, astrocitoma cerebral infantil, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (cáncer de células renales), leucemia linfoblástica aguda (también llamada leucemia linfocítica aguda), leucemia mieloide aguda (también llamada leucemia mielógena aguda), leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica (también llamada leucemia mieloide crónica), leucemia de células pilosas, cáncer de labio y cavidad oral, liposarcoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, macroglobulinemia, waldenstrom, cáncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (ojo), cáncer de células de Merkel, mesotelioma, cáncer escamoso de cuello metastásico con primario oculto, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide, mieloma múltiple (cáncer de la médula ósea), trastornos mieloproliferativos, mixoma, cáncer de cavidad nasal y senos paranasales, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, oligodendroglioma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario (tumor epitelial-estromal de superficie), tumor de células germinales de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, cáncer de senos paranasales y cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales (cáncer de riñón), cáncer de células transicionales de pelvis renal y uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, síndrome de Sezary, melanoma y cáncer de piel no melanoma, carcinoma de piel de células de Merkel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer escamoso de cuello con primario oculto, cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, linfoma de células t (micosis fungoide y síndrome de Sezary), cáncer de testículo, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales de pelvis renal y uréter, tumor trofoblástico, cáncer de células transicionales de uréter y pelvis renal, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma uterino, cáncer de vagina, glioma de la vía visual y del hipotálamo, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms (cáncer de riñón), cáncer de hígado, mieloma múltiple o un sarcoma.
7. El procedimiento ex vivo de acuerdo con la reivindicación 4, en el que las células transfectadas son adecuadas para su uso en la transferencia celular adoptiva para el tratamiento de una enfermedad causada por una mutación genética.
8. El procedimiento ex vivo de la reivindicación 7, en el que la enfermedad se selecciona entre: deficiencia de 21-hidroxilasa, acondroplasia, porfiria intermitente aguda, deficiencia de adenilosuccinato liasa, adrenoleucodistrofia,
síndrome de Alagille, enfermedad de Alexander, síndrome de Alstrom, amelogénesis imperfecta, deficiencia de
biotinidasa, CGD trastorno granulomatoso crónico, síndrome de Di George, anemia de Fanconi, Deficiencia de
G6PD, deficiencia de lipoproteína lipasa, distrofia muscular, tipo Duchenne, síndrome de retraso mental ligado al
X de Siderius causado por mutaciones en el gen PHF8, inmunodeficiencia combinada grave ligada al X (X-SCID), o anemia sideroblástica ligada al X (XLSA), enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave ligada al
X.
9. El procedimiento ex vivo de la reivindicación 4, en el que la enfermedad es un trastorno metabólico causado por
una mutación genética conocida.
10. El procedimiento ex vivo de la reivindicación 9, en el que el desorden metabólico se selecciona entre la
enfermedad de Niemann-Pick, la enfermedad de Tay-Sachs, la enfermedad de Gaucher y la enfermedad de
Fabry.
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