ES2897933T3 - Proteínas de Mycobacterium tuberculosis - Google Patents
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Abstract
Un método para diagnosticar la infección por el complejo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) en un sujeto, que comprende detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia un conjunto de fragmentos derivados de una proteína de M. tuberculosis, en donde el conjunto comprende dos o más fragmentos diferentes derivados de Rv0840c (SEQ ID NO: 6) y en donde los fragmentos del conjunto forman una quimioteca de fragmentos proteicos que abarca al menos el 80 % de la secuencia de SEQ ID NO: 6 en la que los fragmentos tienen una longitud de 12 a 18 aminoácidos y se solapan en 9 a 12 aminoácidos.
Description
DESCRIPCIÓN
Proteínas de Mycobacterium tuberculosis
Campo de la invención
La presente invención se refiere a fragmentos inmunológicamente activos (péptidos o péptidos mimótopos) de proteínas de Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). En particular, la invención se refiere a un grupo de péptidos de M. tuberculosis que son altamente antigénicos y característicos de las cepas clínicas de M. tuberculosis. Por consiguiente, la invención se refiere además al uso de estos péptidos de M. tuberculosis en el diagnóstico de la infección por el complejo M. tuberculosis.
Antecedentes
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa predominante provocada por miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). La mayoría de las infecciones producidas por el complejo M. tuberculosis son asintomáticas o latentes. Sin embargo, aproximadamente una de cada diez infecciones latentes progresa finalmente a una enfermedad activa (generalmente tuberculosis pulmonar) que, si se deja sin tratar, es mortal en más del 50 % de las personas.
El diagnóstico de laboratorio eficaz de la infección por el complejo M. tuberculosis es un aspecto clave para controlar la propagación de la tuberculosis. Asimismo, un diagnóstico rápido y fiable permite implementar el régimen de tratamiento correcto de manera oportuna.
Tradicionalmente, la infección por el complejo M. tuberculosis se ha diagnosticado mediante la demostración de micobacterias en los fluidos corporales mediante un examen microscópico (usando la tinción para bacilos acidorresistentes (AFB, Acid Fast Bacilli) o un cultivo microbiológico. Sin embargo, las muestras deben contener una alta concentración de micobacterias (es decir, de 5 a 10000/ml) para que el examen microscópico sea fiable y el diagnóstico basado en cultivos sea lento.
Los métodos más nuevos para diagnosticar la infección por el complejo M. tuberculosis implican detectar una reacción inmunitaria asociada con la infección. Al igual que otras micobacterias, M. tuberculosis estimula los linfocitos T CD4+ y CD8+, así como otras células inmunitarias, para provocar una fuerte reacción proinflamatoria de tipo 1 que implica la secreción de citocinas tales como el interferón (IFN)-y y el Factor de Necrosis Tumoral (FNT)-a. Se pueden utilizar ensayos de liberación de IFN-y (IGRA, IFN-Gamma Release Assay) para detectar esta reacción de Hipersensibilidad de Tipo Retardado (HTR). Los IGRA se basan en el principio de que los linfocitos T de personas sensibilizadas (infectadas) producen IFN-y cuando se reencuentran con los antígenos de M. tuberculosis. Los IGRA disponibles en el mercado para M. tuberculosis incluyen el ensayo QuantiFERON-TB original y sus versiones potenciadas QuantiFERoN-TB Gold y QuantiFER-ON-TB Gold In-Tube (Cellestis International, Carnegie, Australia), el enzimoinmunoanálisis por manchas (ELISPOT, Enzyme-Linked ImmunoSPOT) T SPOT-TB (Oxford Immunotec, Oxford, Reino Unido) y diferentes especialidades veterinarias (Bovigam®, Cervigam®, Primagam®, Prionics, Schlieren-Zurich, Suiza).
Una ventaja significativa de estos IGRA es su mayor especificidad para la infección por el complejo M. tuberculosis. Esto se logra mediante el uso de antígenos específicos de M. tuberculosis que están codificados en la Región de Diferencia (RD)1, un segmento genómico que está ausente en la vacuna de bacilo de Calmette-Guérin (BCG) y en la mayoría de las micobacterias ambientales. Los antígenos RD1 utilizados en los IGRA incluyen ESAT6 y CFP10. Si bien el diagnóstico basado en la reacción inmunitaria a tales antígenos es eficaz, existe una necesidad constante de desarrollar nuevos antígenos alternativos para usar en pruebas de diagnóstico. Por ejemplo, es importante que los antígenos utilizados en las pruebas de diagnóstico sean diferentes a los utilizados en las vacunas para evitar la obtención de resultados falsos positivos en los sujetos vacunados. ESAT6, en particular, se puede incluir en vacunas frente a M. tuberculosis. Por supuesto, también se pueden usar nuevos antígenos eficaces en vacunas para prevenir o tratar la infección por el complejo M. tuberculosis.
El documento WO 03/004520 describe un método para identificar genes micobacterianos que son inducidos o regulados positivamente en condiciones de cultivo que carecen de nutrientes y que mantienen la latencia micobacteriana, y el uso de los genes o péptidos identificados que codifican en vacunas o para identificar la presencia de una infección por micobacterias en una muestra clínica. El documento US 2006/115847 divulga un método para diagnosticar la infección por el complejo M. tuberculosis en un sujeto, que comprende detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia un conjunto de fragmentos derivados de una proteína de M. tuberculosis.
Sumario de la invención
Sorprendentemente, los inventores han identificado varios antígenos de M. tuberculosis y fragmentos de los mismos que son particularmente útiles en pruebas de diagnóstico para M. tuberculosis. Los antígenos identificados contienen varios epítopos de linfocitos T y/o linfocitos B que se asocian eficazmente con moléculas o anticuerpos de Antígenos
Leucocitarios Humanos (ALH), respectivamente. Por lo tanto, los antígenos y fragmentos pueden utilizarse para detectar una reacción inmunitaria anti-M. tuberculosis y, por tanto, para determinar la presencia o ausencia de infección por el complejo M. tuberculosis en un individuo. Los antígenos y fragmentos también son capaces de inducir una reacción inmunitaria en una persona, por lo que pueden utilizarse para la vacunación profiláctica o terapéutica.
Por consiguiente, la invención proporciona un método para diagnosticar la infección por el complejo M. tuberculosis en un sujeto, que comprende detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia un conjunto de fragmentos derivados de una proteína de M. tuberculosis, en donde el conjunto comprende dos o más fragmentos diferentes derivados de Rv0840c (SEQ ID NO: 6) y en donde los fragmentos del conjunto forman una quimioteca de fragmentos proteicos que abarca al menos el 80 % de la secuencia de SEQ ID NO: 6 en la que los fragmentos tienen una longitud de 12 a 18 aminoácidos y se solapan en 9 a 12 aminoácidos.
La invención también proporciona el uso de un conjunto de fragmentos para diagnosticar la infección por el complejo M. tuberculosis en una muestra obtenida de un sujeto, en donde el conjunto comprende dos o más fragmentos diferentes derivados de Rv0840c (SEQ ID NO: 6) y los fragmentos del conjunto forman una quimioteca de fragmentos proteicos que abarca al menos el 80 % de la secuencia de SEQ ID NO: 6 en la que los fragmentos tienen una longitud de 12 a 18 aminoácidos y se solapan en 9 a 12 aminoácidos.
Descripción de las figuras
La FIGURA 1 muestra la reactividad de diferentes sueros de un grupo (Controles, ITL (Infección Tuberculosa Latente), TB (TuBerculosis) activa y TB curada) hacia un conjunto seleccionado de epítopos de linfocitos B de las proteínas descritas en el presente documento.
La FIGURA 2A muestra una comparación de la Serie A, Serie B y Máx de Serie A/Serie B en el ensayo T-SPOT, n = 183 (87 donantes con TB, 96 donantes sanos).
La FIGURA 2B muestra la sensibilidad y la especificidad del Máx de Serie A/Serie B en el ensayo T-SPOT.TB, calculadas mediante el análisis de CRD (Curva de Rendimiento Diagnóstico). n = 183 (87 donantes con TB, 96 donantes sanos)
La FIGURA 3 muestra una comparación de conjuntos de epítopos de CD4/CD8 y las correspondientes quimiotecas peptídicas en el ensayo T-SPOT. A - Rv1495, B - TBFG_13463, C - Rv3845 (87 donantes con TB).
La FIGURA 4 muestra el rendimiento de las quimiotecas peptídicas en el ensayo T-SPOT-TB. A - Mtub2_17866, B - Rv2654c, C - Rv1677, D - Rv0840c. (87 donantes con t B).
La FIGURA 5 muestra una comparación del máx de los conjuntos de epítopos de CD4/CD8 TBFG_13463, Mtub2_17866, Rv2654c, Rv3845, Rv1495, Rv0840c y Rv1677, y del máx de las quimiotecas de los péptidos TBFG 13463, Mtub2_17866, Rv2654c, Rv3845, Rv1495, Rv0840c y Rv1677 (n = 183; con TB = 87).
La FIGURA 6 muestra la curva CRD para un ensayo T-SPOT-TB usando un conjunto de epítopos combinado que comprende todos los conjuntos de epítopos de CD4/CD8 (TBFG 13463, Mtub2_17866, Rv2654c, Rv3845, Rv1495, Rv0840c y Rv1677).
La FIGURA 7 muestra el reemplazo de ESAT-6 por la quimioteca de péptidos Rv0840c (n = 183; 87 con TB). La FIGURA 8 muestra el reemplazo de CPF10 por la quimioteca de péptidos Rv0840c (n = 183; 87 con TB). La FIGURA 9 muestra la adición de Rv0840c a la Serie A y a la Serie B en el ensayo T-SPOT-TB. Más específicamente, la Figura 8 muestra una comparación de las curvas CRD para el Máx de Serie A/Serie B y el Máx de Serie A/Serie B/quimioteca de péptidos Rv0840c.
Descripción del listado de secuencias
La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de TBFG_13463.
La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de Mtub2_17866.
La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de Rv2654c.
La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de Rv3845.
La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos de Rv1495.
La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de Rv0840c.
La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos de Rv1677.
Las SEQ ID NO: 8 a 10 son secuencias de aminoácidos de epítopos de ALH de clase II derivados de TBFG_13463. Las SEQ ID NO: 11 y 12 son secuencias de aminoácidos de epítopos de ALH de clase II derivados de Mtub2_17866.
Las SEQ ID NO: 13 a 19 son secuencias de aminoácidos de epítopos de ALH de clase II derivados de Rv0840c. Las SEQ ID NO: 20 a 24 son secuencias de aminoácidos de epítopos de ALH de clase II derivados de Rv3845. Las SEQ ID NO: 25 a 27 son secuencias de aminoácidos de epítopos de ALH de clase II derivados de Rv2654c. Las SEQ ID NO: 28 a 33 son secuencias de aminoácidos de epítopos de ALH de clase II derivados de Rv1677. Las SEQ ID NO: 34 a 40 son secuencias de aminoácidos de epítopos de ALH de clase II derivados de Rv1495. Las SEQ ID NO: 41 a 48 son secuencias de aminoácidos de epítopos de ALH de clase I derivados de TBFG_13463. Las SEQ ID NO: 49 a 52 son secuencias de aminoácidos de epítopos de ALH de clase I derivados de Mtub2_17866. Las SEQ ID NO: 53 a 58 son secuencias de aminoácidos de epítopos de ALH de clase I derivados de Rv2654c. Las SEQ ID NO: 59 a 64 son secuencias de aminoácidos de epítopos de ALH de clase I derivados de Rv3845. Las SEQ ID NO: 65 a 69 son secuencias de aminoácidos de epítopos de ALH de clase I derivados de Rv1495.
Las SEQ ID NO: 70 a 87 son secuencias de aminoácidos de epítopos de ALH de clase I derivados de Rv0840c. Las SEQ ID NO: 88 a 100 son secuencias de aminoácidos de epítopos de linfocitos B derivados de TBFG_13463. Las SEQ ID NO: 101 a 103 son secuencias de aminoácidos de epítopos de linfocitos B derivados de Mtub2_17866. La SEQ ID NO: 104 es secuencias de aminoácidos de epítopos de linfocitos B derivados de Rv2654c.
Las SEQ ID NO: 105 a 112 son secuencias de aminoácidos de epítopos de linfocitos B deriva Rdovs3 d8e45. Las SEQ ID NO: 113 a 120 son secuencias de aminoácidos de epítopos de linfocitos B deriva Rdovs1 d4e95. Las SEQ ID NO: 121 a 136 son secuencias de aminoácidos de epítopos de linfocitos B derivados de Rv0840c. Las SEQ ID NO: 137 a 141 son secuencias de aminoácidos de epítopos de linfocitos B deriva Rdovs1 d6e77. Las SEQ ID NO: 142 a 145 son epítopos de linfocitos B adicionales derivados de TBFG_13463.
La SEQ ID NO: 146 es un epítopo de linfocitos T adicional derivado de Mtub2_17866.
Las SEQ ID NO: 147 y 148 son epítopos de linfocitos T adicionales derivados de Rv2654c.
Las SEQ ID NO: 149 a 152 son epítopos de linfocitos T adicionales derivados de Rv3845.
La SEQ ID NO: 153 es un epítopo de linfocitos T adicional derivado de Rv1495.
Las SEQ ID NO: 154 a 157 son epítopos de linfocitos T adicionales derivados de Rv0840c.
Descripción detallada de la invención
Debe entenderse que diferentes aplicaciones de los productos y métodos divulgados pueden adaptarse a las necesidades específicas de la técnica. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene únicamente el fin de describir aspectos particulares de la divulgación, y no se pretende ser limitante.
Adicionalmente, como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen las referencias en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un fragmento" incluye "fragmentos", la referencia a "una célula" incluye dos o más de dichas células, la referencia a "un sujeto" incluye dos o más de dichos sujetos, y similares.
Métodos
Los presentes inventores han identificado antígenos de M. tuberculosis y fragmentos de los mismos que son capaces de desencadenar una reacción inmunitaria hacia M. tuberculosis. Por consiguiente, estos antígenos pueden usarse en métodos para diagnosticar la infección por el complejo M. tuberculosis en un sujeto. Los antígenos también pueden usarse para tratar o prevenir la infección por el complejo M. tuberculosis (infección por el complejo M. tuberculosis), por ejemplo, mediante vacunación. El complejo M. tuberculosis incluye uno o más de Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis (incluyendo la cepa de bacilo de Calmette-Guérin), Mycobacterium microti, Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium suricattae y Mycobacterium mungi, entre otros. El complejo M tuberculosis incluye preferentemente Mycobacterium tuberculosis.
En el presente documento, se describe un método para diagnosticar la infección por el complejo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) en un sujeto, que comprende detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia uno o más de (a) Rv0840c (SEQ ID NO: 6), o uno o más fragmentos del mismo; (b) TBFG_13463 (SEQ ID NO: 1), o uno o más fragmentos del mismo; (c) Rv1677 (SEQ ID NO: 7), o uno o más fragmentos del mismo; (d) Rv2654c (SEQ ID NO: 3), o uno o más fragmentos del mismo; (e) Rv3845 (SEQ ID NO: 4), o uno o más fragmentos del mismo; (f) Rv1495 (SEQ ID NO: 5), o uno o más fragmentos del mismo; y (g) Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2), o uno o más fragmentos del mismo. Por ejemplo, el método puede comprender detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos 5 o al menos seis de (a) a (g). El método puede comprender detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia la totalidad de (a) a (g).
En la definición de (a) a (g) dada anteriormente, una reacción inmunitaria hacia cualquier combinación de uno o más de (a) a (g) puede detectarse in vitro. Por ejemplo, para cada definición de (a) a (g), se puede detectar una reacción inmunitaria in vitro hacia: (a); (b); (c); (d); (e); (f); (g); (a) y (b); (a) y (c); (a) y (d); (a) y (e); (a) y (f); (a) y (g); (b) y (c); (b) y (d); (b) y (e); (b) y (f); (b) y (g); (c) y (d); (c) y (e); (c) y (f); (c) y (g); (d) y (e); (d) y (f); (d) y (g); (e) y (f); (e) y (g); (f) y (g); (a), (b) y (c); (a), (b) y (d); (a), (b) y (e); (a), (b) y (f); (a), (b) y (g); (a), (c) y (d); (a), (c) y (e); (a), (c) y (f); (a), (c) y (g); (a), (d) y (e); (a), (d) y (f); (a), (d) y (g); (a), (e) y (f); (a), (e) y (g); (a), (f) y (g); (b), (c) y (d); (b), (c) y (e); (b), (c) y (f) ; (b), (c) y (g); (b), (d) y (e); (b), (d) y (f); (b), (d) y (g); (b), (e) y (f); (b), (e) y (g); (b), (f) y (g); (c), (d) y (e); (c), (d) y (f); (c) , (d) y (g); (c), (e) y (f); (c), (e) y (g); (c), (f) y (g); (d), (e) y (f); (d), (e) y (g); (d), (f) y (g); (e), (f) y (g); (a), (b), (c) y (d); (a), (b), (c) y (e); (a), (b), (c) y (f); (a), (b), (c) y (g); (a), (b), (d) y (e); (a), (b), (d) y (f); (a), (b), (d) y (g); (a), (b), (e) y (f); (a), (b), (e) y (g); (a), (b), (f) y (g); (a), (c), (d) y (e); (a), (c), (d) y (f); (a), (c), (d) y (g); (a), (c), (e) y (f); (a), (c), (e) y (g); (a) , (c), (f) y (g); (a), (d), (e) y (f); (a), (d), (e) y (g); (a), (d), (f) y (g); (a), (e), (f) y (g); (b), (c), (d) y (e); (b), (c), (d) y (f); (b) , (c), (d) y (g); (b), (c), (e) y (f); (b), (c), (e) y (g); (b), (c), (f) y (g); (b), (d), (e) y (f); (b), (d), (e) y (g); (b), (d), (f) y (g); (b), (e), (f) y (g); (c), (d), (e) y (f); (c), (d), (e) y (g); (c), (d), (f) y (g); (c), (e), (f) y (g); (d), (e), (f) y (g); (a), (b), (c), (d) y (e); (a), (b), (c), (d) y (f); (a), (b), (c), (d) y (g); (a), (b), (c), (e) y (f); (a), (b), (c), (e) y (g); (a), (b), (c), (f) y (g); (a), (b), (d) , (e) y (f); (a), (b), (d), (e) y (g); (a), (b), (d), (f) y (g); (a), (b), (e), (f) y (g); (a), (c), (d), (e) y (f); (a), (c), (d), (e) y (g); (a), (c), (d), (f) y (g); (a), (c), (e), (f) y (g); (a), (d), (e), (f) y (g); (b), (c), (d), (e) y (f); (b), (c), (d), (e) y (g); (b), (c), (d), (f) y (g); (b), (c), (e), (f) y (g); (b), (d), (e), (f) y (g); (c), (d), (e), (f) y (g); (a), (b), (c), (d), (e) y (f); (a), (b), (c), (d), (e) y (g); (a), (b), (c), (d), (f) y (g); (a), (b), (c), (e), (f) y (g); (a), (b), (d), (e), (f) y (g); (a), (c), (d), (e), (f) y (g); (b), (c), (d), (e), (f) y (g) ; o (a), (b), (c), (d), (e), (f) y (g). Las combinaciones de (a) a (g) se pueden seleccionar independientemente de esta
lista.
El método comprende preferentemente detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia (i) Rv0840c (SEQ ID NO: 6), o uno o más fragmentos del mismo; (ii) TBFG_13463 (SEQ ID NO: 1), o uno o más fragmentos del mismo; (iii) Rv1677 (SEQ ID NO: 7), o uno o más fragmentos del mismo; (iv) Rv3845 (SEQ ID NO: 4), o uno o más fragmentos del mismo; y (v) Rv2654c (SEQ ID NO: 3), o uno o más fragmentos del mismo. En la definición de (i) a (v) dada anteriormente, una reacción inmunitaria hacia cualquier combinación de uno o más de (i) a (iv) puede detectarse in vitro. Por ejemplo, para cada definición de (i) a (iv), se puede detectar una reacción inmunitaria in vitro hacia: (i); (ii); (iii); (iv); (v); (i) y (ii); (i) y (iii); (i) y (iv); (i) y (v); (ii) y (iii); (ii) y (iv); (ii) y (v); (iii) y (iv); (iii) y (v); (iv y (v); (i), (ii) y (iii); (i), (ii) y (iv); (i), (ii) y(v); (i), (iii) y (iv); (i), (iii) y (v); (i), (iv) y (v); (ii), (iii) y (iv); (ii), (iii) y (v); (ii), (iv) y (v); (iii), (iv) y (v); (i), (ii), (iii) y (iv); (i), (ii), (iii) y (v); (i), (ii), (iv) y (v); (i), (iii), (iv) y (v); (ii), (iii), (iv) y (v); o (i), (ii), (iii), (iv) y (v). Las combinaciones de (i) a (v) se pueden seleccionar independientemente de esta lista.
El método puede comprender detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia (i) Rv0840c (SEQ ID NO: 6), o uno o más fragmentos del mismo; (ii) TBFG_13463 (SEQ ID NO: 1), o uno o más fragmentos del mismo; (iii) Rv1677 (SEQ ID NO: 7), o uno o más fragmentos del mismo; y (iv) Rv2654c (SEQ ID NO: 3). En un aspecto, el método comprende detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia Rv0840c (SEQ ID NO: 6), o uno o más fragmentos del mismo.
Fragmentos
Un fragmento de Rv0840c (SEQ ID NO: 6), TBFG 13463 (SEQ ID NO: 1), Rv1677 (SEQ ID NO: 7), Rv2654c (SEQ ID NO: 3), Rv3845 (SEQ ID NO: 4), Rv1495 (SEQ ID NO: 5) o Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2) puede ser una secuencia que comprende cinco o más aminoácidos que se ha obtenido mediante el truncamiento en el extremo N y/o en el extremo C de la secuencia original. Por ejemplo, el fragmento puede comprender aproximadamente 5 o más, aproximadamente 6 o más, aproximadamente 7 o más, aproximadamente 8 o más, aproximadamente 9 o más, aproximadamente 10 o más, aproximadamente 11 o más, aproximadamente 12 o más, aproximadamente 13 o más, aproximadamente 14 o más, aproximadamente 15 o más, aproximadamente 16 o más, aproximadamente 17 o más, aproximadamente 18 o más, aproximadamente 19 o más, aproximadamente 20 o más, aproximadamente 21 o más, aproximadamente 22 o más, aproximadamente 23 o más, aproximadamente 24 o más, aproximadamente 25 o más, aproximadamente 26 o más, o aproximadamente 27 o más aminoácidos. El fragmento puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 27, de aproximadamente 6 a aproximadamente 26, de aproximadamente 7 a aproximadamente 25, de aproximadamente 8 a aproximadamente 24, de aproximadamente 9 a aproximadamente 23, de aproximadamente 10 a aproximadamente 22, de aproximadamente 11 a aproximadamente 21, de aproximadamente 12 a aproximadamente 20, de aproximadamente 13 a aproximadamente 19, de aproximadamente 14 a aproximadamente 18, de aproximadamente 12 a aproximadamente 18, de aproximadamente 12 a aproximadamente 15, de aproximadamente 15 a aproximadamente 18, de aproximadamente 13 a aproximadamente 17, de aproximadamente 14 a aproximadamente 16, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos de longitud.
Los fragmentos pueden derivar químicamente de la proteína original, por ejemplo, mediante una escisión proteolítica, o pueden derivar, en un sentido intelectual, de la proteína original, por ejemplo, haciendo uso de la secuencia de aminoácidos de la proteína original y sintetizando los fragmentos tomando como base la secuencia. Los fragmentos pueden sintetizarse usando métodos bien conocidos en la técnica.
El término "fragmento" incluye no solo moléculas en las que los restos de aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-), sino también moléculas en las que se invierte el enlace peptídico. Tales peptidomiméticos retroinversos se pueden preparar usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, tales como los descritos en Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Este enfoque implica preparar pseudopéptidos que contienen cambios que implican la cadena principal y no la orientación de las cadenas laterales. Meziere et al. (1997) muestran que, al menos para las reacciones del MHC de clase II y de los linfocitos T auxiliares, estos pseudopéptidos son útiles. Los péptidos retroinversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteólisis.
De manera similar, se puede prescindir del enlace peptídico por completo siempre que se utilice un resto conector adecuado que conserve la separación entre los átomos de carbono de los restos de aminoácidos; se prefiere particularmente que el resto conector tenga sustancialmente la misma distribución de cargas y sustancialmente la misma planicidad que un enlace peptídico. También se apreciará que el fragmento puede bloquearse convenientemente en su extremo N o C para ayudar a reducir la susceptibilidad a la digestión exoproteolítica. Por ejemplo, el grupo amino del extremo N de los péptidos puede protegerse haciéndolo reaccionar con un ácido carboxílico, y el grupo carboxilo del extremo C del péptido puede protegerse haciéndolo reaccionar con una amina. También pueden añadirse uno o más restos de aminoácidos adicionales en el extremo N y/o en el extremo C del fragmento, por ejemplo, para aumentar la estabilidad del fragmento. Otros ejemplos de modificaciones incluyen glicosilación y fosforilación. Otra modificación potencial es que los hidrógenos de las aminas de la cadena lateral de R o K pueden reemplazarse por grupos metileno (-NH2 ^ -NH(Me) o -N(Me)2).
Los fragmentos de Rv0840c (SEQ ID NO: 6), TBFG 13463 (SEQ ID NO: 1), Rv1677 (SEQ ID NO: 7), Rv2654c (SEQ ID NO: 3), Rv3845 (SEQ ID NO: 4), Rv1495 (SEQ ID NO: 5) o Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2) también pueden incluir variantes de fragmentos que aumenten o disminuyan la semivida de los fragmentos in vivo. Algunos ejemplos de variantes capaces de aumentar la semivida de los fragmentos descritos en el presente documento incluyen análogos peptoides de los fragmentos, derivados de D-aminoácidos de los fragmentos e híbridos de péptido-peptoide. El fragmento también puede comprender formas de D-aminoácido del fragmento. La preparación de polipéptidos usando D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos disminuye en gran medida cualquier degradación indeseada de dicho agente mediante procesos metabólicos normales, disminuyendo las cantidades de agente que es necesario administrar, junto con la frecuencia de su administración. También pueden usarse las formas de D-aminoácido de la proteína original.
Los fragmentos descritos en el presente documento se pueden obtener de variantes de corte y empalme de las proteínas originales codificadas por el ARNm generadas mediante el corte y empalme alternativo de los transcritos primarios que codifican las cadenas de la proteína original. Los fragmentos también pueden derivar de mutantes de aminoácidos, de variantes de glicosilación y otros derivados covalentes de las proteínas originales que conservan al menos una propiedad de unión al MHC o de unión al anticuerpo de la proteína original. Algunos ejemplos de derivados incluyen moléculas en donde los fragmentos descritos en el presente documento están modificados covalentemente por sustitución, un medio químico, enzimático u otro medio apropiado con un resto distinto a un aminoácido natural.
El método puede comprender detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia uno o más fragmentos de Rv0840c (SEQ ID NO: 6), TBFG 13463 (SEQ ID NO: 1), Rv1677 (SEQ ID NO: 7), Rv2654c (SEQ ID NO: 3), Rv3845 (SEQ ID NO: 4), Rv1495 (SEQ ID NO: 5) o Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, el método puede comprender detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 16 o más, 17 o más, 18 o más, 19 o más, 20 o más, 25 o más, o 30 o más fragmentos hacia Rv0840c (SEQ ID NO: 6), TBFG 13463 (SEQ ID NO: 1), Rv1677 (SEQ ID NO: 7), Rv2654c (SEQ ID NO: 3), Rv3845 (SEQ ID NO: 4), Rv1495 (SEQ ID NO: 5) o Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2). Si el método comprende detectar una reacción inmunitaria hacia dos o más fragmentos derivados de una proteína particular, todos los fragmentos derivados de esa proteína pueden ser iguales. Como alternativa, algunos o todos los fragmentos derivados de esa proteína pueden ser diferentes. Por ejemplo, si el método comprende detectar una reacción inmunitaria hacia 3 fragmentos derivados de Rv0840c (SEQ ID NO: 6), los 3 fragmentos pueden ser (i) 3 del mismo fragmento; (ii) 2 del mismo fragmento y un fragmento diferente; o (iii) 3 fragmentos diferentes.
En algunos aspectos, el método descrito en el presente documento comprende detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia uno o más conjuntos de fragmentos. Los conjuntos de fragmentos se describen en detalle a continuación.
Muestras
La detección in vitro de una reacción inmunitaria hacia uno o más de (a) a (g) definidos anteriormente se realiza usando una muestra obtenida del sujeto. La muestra puede ser un líquido corporal, tal como sangre, plasma, suero, esputo u otras secreciones respiratorias, saliva, orina o líquido cefalorraquídeo. La muestra es preferentemente sangre, plasma, suero o esputo, u otras secreciones respiratorias. Como alternativa, la muestra puede ser una muestra de tejido, tal como una biopsia o un aspirado. Por ejemplo, la muestra puede ser un aspirado de ganglio linfático, o una muestra tomada del interior o alrededor de una lesión de tuberculosis, tal como un granuloma. En otro aspecto, la muestra puede obtenerse de un fluido corporal o una muestra de tejido, tal como un lisado celular.
Sujeto
El método de la invención puede usarse para diagnosticar la infección por el complejo M. tuberculosis en cualquier sujeto adecuado. El sujeto es generalmente un sujeto humano. Como alternativa, el sujeto puede ser producido otro animal o mamífero, por ejemplo, un animal de granja comercial, tal como un caballo, una vaca, una oveja o un cerdo, un animal de laboratorio, tal como un ratón o una rata, un animal de compañía, tal como un gato, un perro, un conejo o conejillo de indias, u otro animal tal como un ave o un primate.
Reacciones inmunitarias
La reacción inmunitaria que se detecta in vitro puede ser cualquier reacción que sea desencadenada por uno o más de (a) a (g). La reacción inmunitaria puede estar mediada por cualquier tipo de célula inmunitaria. Por ejemplo, la reacción inmunitaria puede estar mediada por linfocitos T, linfocitos B, células dendríticas, neutrófilos, basófilos, mastocitos, eosinófilos, linfoblastos innatos (ILC, Innate Lymphoid Cells), linfocitos citolíticos naturales (NK, Natural Killer), monocitos, macrófagos y/o timocitos. La reacción inmunitaria es preferentemente una reacción de linfocitos T. La reacción de linfocitos T es preferentemente la secreción de citocinas y, más preferentemente, la secreción de IFN-Y (IFNy). La reacción de linfocitos T puede ser la proliferación de linfocitos T. Como alternativa, la reacción inmunitaria puede ser una reacción de linfocitos B. La reacción de linfocitos B puede ser la proliferación de linfocitos B, o la producción o secreción de anticuerpos. La reacción inmunitaria es preferentemente la producción de anticuerpos frente a uno o más de (a) a (g) definidos anteriormente. Los métodos para medir la proliferación de linfocitos T, la proliferación
de linfocitos B, la secreción de citocinas y la secreción o producción de anticuerpos son bien conocidos en la técnica.
La reacción inmunitaria puede producirse in vitro. Preferentemente, la reacción inmunitaria es una reacción Inmunitaria Mediada por Células (IMC) in vitro. Como se describe con mayor detalle a continuación, una reacción IMC es una reacción inmunitaria en la que no participan anticuerpos. En cambio, una reacción IMC puede implicar la activación de fagocitos, una activación de linfocitos T citotóxicos, un aumento en la producción de diversas citocinas y/o la liberación de diversas citocinas como reacción frente a un antígeno. Los métodos para detectar reacciones de IMC in vitro se conocen en la técnica y se describen con más detalle a continuación.
Como alternativa, la reacción inmunitaria puede producirse in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos frente a uno o más de (a) a (g) definidos anteriormente pueden producirse in vivo, pero detectarse in vitro usando un método descrito en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en el sujeto y retirarse del sujeto en una muestra, tal como una muestra de sangre. A continuación, puede ponerse en contacto la muestra (y los anticuerpos) con uno o más de (a) a (g) definidos anteriormente para detectar la presencia de los anticuerpos y/o cuantificar los anticuerpos, por ejemplo, mediante un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Los ELISA se describen con más detalle en los Ejemplos 1 a 3 a continuación. La proliferación de linfocitos T y la proliferación de linfocitos B in vivo también se pueden medir in vitro. Por ejemplo, puede ponerse en contacto una muestra de sangre del sujeto con uno o más de (a) a (g) y se puede medir el predominio de los linfocitos T y/o linfocitos B específicos del antígeno.
El método descrito en el presente documento puede detectar la presencia o ausencia de una reacción inmunitaria. La presencia de una reacción inmunitaria hacia uno o más de (a) a (g) definidos anteriormente puede indicar que el sujeto está infectado con M. tuberculosis. La ausencia de una reacción inmunitaria hacia uno o más de (a) a (g) definidos anteriormente puede indicar que el sujeto no está infectado con M. tuberculosis. En los métodos que implican la detección de una reacción inmunitaria hacia dos o más de (a) a (g) definidos anteriormente, la presencia de una reacción inmunitaria hacia uno o más de (a) a (g) puede indicar infección, como se explica con mayor detalle posteriormente.
Ensayos de las reacciones IMC
Las reacciones inmunitarias mediadas por células (IMC) se utilizan comúnmente para definir el estado inmunitario de un individuo. Normalmente, en la técnica de la inmunología clínica, la expresión reacción IMC abarca pruebas cutáneas in vivo, ensayos de proliferación de linfocitos y la detección in vitro de citocinas producidas por Células MonoNucleares Periféricas (CMNP) en presencia de un antígeno específico. El método descrito en el presente documento puede comprender la detección de una reacción inmunitaria mediada por células in vitro. En particular, se puede detectar la reacción IMC basada en citocinas in vitro hacia las proteínas y los péptidos descritos en el presente documento. Este ensayo se denomina a continuación en el presente documento "Ensayo de IMC".
Las células del sistema inmunitario son capaces de producir moléculas efectoras inmunitarias tales como citocinas después de la estimulación por parte de un antígeno. Los ensayos de IMC consisten en la incubación de una muestra celular con un antígeno y la medición de la presencia (o la ausencia) o de la cantidad de una molécula efectora inmunitaria tal como una citocina, para proporcionar una indicación de la capacidad del individuo para generar una reacción inmunitaria mediada por células frente al antígeno seleccionado. Las células para usar en un ensayo de IMC incluyen poblaciones aisladas de linfocitos (particularmente linfocitos T) y Células Presentadoras de los Antígenos (CPAg). Las CPAg participan en el procesamiento del antígeno para que este último pueda ser reconocido por los receptores de linfocitos T en la superficie de cada linfocito T. El reconocimiento del antígeno puede inducir la producción de citocinas. Las células productoras de citocinas pueden identificarse mediante citometría de flujo. La citometría de flujo puede usarse para cuantificar la frecuencia de las células productoras de citocinas y/o la cantidad de producción de citocinas por parte de las células. Las citocinas inducidas por el antígeno pueden ser liberadas al medio de ensayo y detectadas directamente mediante, por ejemplo, métodos de ELISA, o cuantificarse en términos de la frecuencia de los linfocitos T secretores de citocinas usando un enzimoinmunoanálisis por manchas (ELISPOT). El método de la invención comprende preferentemente un ELISPOT.
El enzimoinmunoanálisis por manchas (ELISPOT), de otro modo conocido como ensayo de inmunoplaca en filtro, fue desarrollado inicialmente para detectar y cuantificar los linfocitos B secretores de anticuerpos individuales. En el momento de su desarrollo, la técnica proporcionó una alternativa rápida y versátil a los ensayos convencionales con células formadoras de placa. Las recientes modificaciones han mejorado la sensibilidad del ELISPOT de forma que pueden detectarse células que producen tan pocas como 100 moléculas de una proteína específica por segundo. Esto hace que los ensayos de ELISPOT sean mucho más sensibles que los ensayos de ELISA convencionales. Los ensayos de ELISPOT aprovechan la concentración relativamente alta de un producto celular proteico dado (tal como una citocina) en el entorno inmediatamente circundante de la célula secretora de la proteína. Estos productos celulares se capturan y detectan usando anticuerpos de alta afinidad. El ensayo ELISPOT se revisa en "Current Protocols in Immunology", Unidad 6.19, páginas 6.19. 1-8.
El ensayo ELISPOT implica normalmente seis etapas: (1) recubrir con un anticuerpo purificado específico para una citocina una placa de microvaloración soportada en membrana; (2) bloquear la placa para impedir la absorción no
específica de cualquier otra proteína; (3) incubar las células secretoras de citocinas con los reactivos apropiados; (4) eliminar las células y los reactivos; (5) añadir un segundo anticuerpo marcado anticitocina; y (6) detectar el complejo anticuerpo-citocina en la membrana.
El método de la invención comprende preferentemente un ensayo T-SPOT.TB (Oxford Immunotec, Oxford, Reino Unido). El ensayo T-SPOT.TB es una variante simplificada de la técnica de ensayo ELISPOT. El ensayo T-SPOT.TB está diseñado para la detección de linfocitos T efectores que reaccionan a la estimulación con antígenos específicos de M. tuberculosis. El ensayo enumera los linfocitos T específicos de la TB activados individuales. Es adecuado para usar con todos los pacientes con riesgo de infección TB latente (ITL) o con sospecha de tener la enfermedad de TB, independientemente de la edad, sexo, etnia, terapia o estado inmunitario. Se utilizan dos series separadas de antígenos, que simulan las proteínas RD1 bien caracterizadas ESAT-6 y CFP10, para optimizar la sensibilidad de la prueba.
Proteínas de M. tuberculosis
En algunos aspectos, el método de la invención comprende además detectar una o más proteínas adicionales de M. tuberculosis. La una o más proteínas de M. tuberculosis adicionales pueden ser cualquier proteína de M. tuberculosis. En la técnica, se conocen numerosas proteínas de M. tuberculosis. La una o más proteínas de M. tuberculosis adicionales pueden comprender una proteína RD1. La proteína RD1 puede comprender una o ambas de CFP-10 y ESAT-6.
Conjuntos de fragmentos
El método descrito en el presente documento puede comprender detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia uno o más conjuntos de fragmentos, en donde cada conjunto comprende dos o más fragmentos derivados de TBFG_13463 (SEQ ID NO: 1), Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2), Rv2654c (SEQ ID NO: 3), Rv3845 (SEQ ID NO: 4), Rv1495 (SEQ ID NO: 5), Rv0840c (SEQ ID NO: 6) o Rv1677 (SeQ ID NO: 7). Por ejemplo, cada conjunto puede comprender tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, o 250 o más, fragmentos derivados de TBFG_13463 (SEQ ID NO: 1), Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2), Rv2654c (SEQ ID NO: 3), Rv3845 (SEQ ID NO: 4), Rv1495 (SEQ ID NO: 5), Rv0840c (SEQ ID NO: 6) o Rv1677 (SEQ ID NO: 7).
El método puede comprender detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, o 14 o más conjuntos de fragmentos definidos anteriormente. Cuando el método comprende detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia dos o más conjuntos de fragmentos, cada conjunto puede comprender fragmentos derivados de la misma proteína o una proteína diferente seleccionada entre TBfG_13463 (SEQ ID NO: 1), Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2), Rv2654c (SEQ ID NO: 3), Rv3845 (SEQ ID NO: 4), Rv1495 (SEQ ID NO: 5), Rv0840c (SEQ ID NO: 6) y Rv1677 (SEQ ID NO: 7). Cuando el método comprende detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia tres o más conjuntos de fragmentos, cada uno de los conjuntos puede comprender fragmentos derivados de una proteína diferente. Como alternativa, algunos o todos los conjuntos pueden comprender fragmentos derivados de la misma proteína. Por ejemplo, si el método comprende detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia tres conjuntos de fragmentos, todos los conjuntos pueden comprender fragmentos derivados de la misma proteína. Como alternativa, dos de los conjuntos pueden comprender fragmentos derivados de la misma proteína, y el tercer conjunto puede comprender fragmentos derivados de una proteína diferente, o cada uno de los tres conjuntos puede comprender fragmentos derivados de una proteína diferente. Si cualquiera de los dos o más conjuntos se obtiene de la misma proteína, esos conjuntos pueden comprender los mismos fragmentos o diferentes.
Como se expone a continuación, el método también puede comprender detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia una o más quimiotecas de fragmentos proteicos y/o uno o más conjuntos de epítopos. Cuando el método comprende detectar la reacción inmunitaria in vitro hacia una o más quimiotecas de fragmentos proteicos y uno o más conjuntos de epítopos, los fragmentos comprendidos en la quimioteca o quimiotecas de fragmentos proteicos pueden obtenerse de la misma proteína o de dos o más proteínas diferentes como fragmentos comprendidos en el (los) conjunto(s) de epítopos.
Quimiotecas de fragmentos proteicos
En un aspecto descrito en el presente documento, los fragmentos de un grupo forman una quimioteca de fragmentos proteicos. Una quimioteca de fragmentos proteicos comprende una pluralidad de fragmentos derivados de una proteína original (para la presente divulgación, TBFG_13463 (SEQ ID nO: 1), Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2), Rv2654c (SEQ ID NO: 3), Rv3845 (SEQ ID NO: 4), Rv1495 (SEQ ID NO: 5), Rv0840c (SEQ ID NO: 6) o Rv1677 (SEQ ID NO: 7)), que en conjunto engloban al menos el 10 %, tal como al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 %, de la secuencia de la proteína original. En la presente invención, los fragmentos de un conjunto forman una quimioteca de fragmentos proteicos que engloba al menos el 80 % de la secuencia de la proteína a partir de la que se obtienen los fragmentos. Más preferentemente, los
fragmentos de un conjunto forman una quimioteca de fragmentos proteicos que engloba toda la secuencia de la proteína a partir de la que se obtienen los fragmentos.
La quimioteca de fragmentos proteicos puede comprender fragmentos que son capaces de estimular los linfocitos T CD4+ y/o CD8+. Preferentemente, la quimioteca de fragmentos proteicos comprende fragmentos que son capaces de estimular los linfocitos T tanto CD4+ como CD8+. En la técnica se sabe que el tamaño óptimo del fragmento para la estimulación es diferente para los linfocitos T CD4+ y CD8+. Los fragmentos que consisten aproximadamente en 9 aminoácidos (nonámeros) normalmente estimulan únicamente los linfocitos T c D8+, y los fragmentos que consisten aproximadamente en 20 aminoácidos (icosámeros) normalmente estimulan únicamente los linfocitos T CD4+. En términos generales, esto es debido a que los linfocitos T CD8+ tienden a reconocer a su antígeno basándose en su secuencia, mientras que los linfocitos T CD4+ tienden a reconocer a su antígeno basándose en su estructura de un mayor nivel. Sin embargo, los fragmentos que consisten aproximadamente en 15 aminoácidos (pentadecámeros) pueden estimular los linfocitos T tanto CD4+ como CD8+. Por consiguiente, la quimioteca de fragmentos proteicos comprende preferentemente fragmentos que tienen aproximadamente 15 aminoácidos, tal como aproximadamente 12 aminoácidos, aproximadamente 13 aminoácidos, aproximadamente 14 aminoácidos, aproximadamente 15 aminoácidos, aproximadamente 16 aminoácidos, aproximadamente 17 aminoácidos o aproximadamente 18 aminoácidos de longitud.
Todos los fragmentos de un conjunto pueden tener la misma longitud. Como alternativa, un conjunto puede comprender fragmentos de diferentes longitudes. Las longitudes de los fragmentos se han analizado anteriormente.
Una quimioteca de fragmentos proteicos puede comprender fragmentos cuyas secuencias se solapan. Por consiguiente, cada conjunto puede comprender fragmentos cuyas secuencias se solapan. Las secuencias pueden solaparse en uno o más, tal como dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 16 o más, 17 o más, 18 o más, 19 o más, o 20 o más, aminoácidos. Preferentemente, las secuencias se solapan en 9 o más aminoácidos, tal como 10 o más, 11 o más, o 12 o más aminoácidos, ya que esto maximiza el número de fragmentos que comprenden los nonámeros capaces de estimular los linfocitos T CD8+. Más preferentemente, las secuencias se solapan en 11 aminoácidos. Todos los fragmentos solapantes de un conjunto pueden solaparse en el mismo número de aminoácidos. Como alternativa, un conjunto puede comprender fragmentos cuyas secuencias se solapan en diferentes números de aminoácidos.
La quimioteca de fragmentos proteicos puede comprender fragmentos de 12 a 18 (tal como de 12 a 15, de 15 a 18, de 13 a 17 o de 14 a 16) aminoácidos de longitud que se solapan en de 9 a 12 (tal como de 9 a 11 o de 10 a 12) aminoácidos. Por ejemplo, la quimioteca de fragmentos proteicos puede comprender fragmentos de (i) 14 aminoácidos de longitud que se solapan en 9, 10 u 11 aminoácidos, (ii) 15 aminoácidos de longitud que se solapan en 9, 10 u 11 aminoácidos, o (iii) 16 aminoácidos de longitud que se solapan en 9, 10 u 11 aminoácidos. La quimioteca de fragmentos proteicos comprende preferentemente fragmentos de 15 aminoácidos de longitud que se solapan en 11 aminoácidos.
Las propiedades generales de los fragmentos se han expuesto anteriormente.
Conjuntos de epítopos
Un epítopo es la parte de un antígeno que es reconocida por el sistema inmunitario. Específicamente, un epítopo es la parte de un antígeno que es reconocida por un anticuerpo, un linfocito B o un linfocito T. Por consiguiente, un epítopo de linfocitos T es la parte de un antígeno que es reconocido por un linfocito T. Como los linfocitos T reconocen el antígeno a través del receptor de linfocitos T (RCT), un epítopo de linfocitos T puede ser la parte de un antígeno que se une al (es decir, es reconocido por el) receptor de linfocitos T. De manera similar, un epítopo de linfocitos B es la parte de un antígeno que es reconocido por un linfocito B. Dado que los linfocitos B reconocen el antígeno a través del receptor de linfocitos B (RCB), un epítopo de linfocitos B puede ser la parte de un antígeno que se une al (es decir, es reconocido por el) receptor de linfocitos B.
Los epítopos de linfocitos B y linfocitos T pueden identificarse analizando proteínas nativas completas y fragmentadas, o proteínas antigénicas recombinantes, para el reconocimiento por el RCB o RCT, respectivamente. Los epítopos de linfocitos B y linfocitos T también pueden identificarse usando métodos informáticos, tales como en los presentes ejemplos. Los resultados de la identificación informática de epítopos pueden verificarse analizando un péptido que tenga la secuencia del epítopo para determinar su antigenicidad. Los métodos para analizar la antigenicidad son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden examinar muestras de sangre del sujeto para detectar la presencia de anticuerpos frente al epítopo mediante ELISA.
En un aspecto descrito en el presente documento, uno o más de los fragmentos del conjunto comprenden un epítopo de linfocitos T o un epítopo de linfocitos B de la proteína de la que se obtienen los fragmentos. Esto da lugar a un "conjunto de epítopos". Uno o más de los fragmentos pueden comprender un epítopo de linfocitos T y un epítopo de linfocitos B. De manera similar, uno o más de los fragmentos pueden comprender uno o más (tal como dos, tres o cuatro) epítopos de linfocitos T y/o uno o más (tal como dos, tres o cuatro) epítopos de linfocitos B. Si un fragmento
comprende más de un epítopo de linfocitos T o linfocitos B, los epítopos pueden ser iguales o diferentes. El epítopo de linfocitos T puede ser un epítopo de linfocitos T CD4+ o un epítopo de linfocitos T CD8+. Como alternativa, el epítopo de linfocitos T puede ser un epítopo para linfocitos T tanto CD4+ como CD8+. La Tabla 4 enumera epítopos de linfocitos T CD4+ ilustrativos. La Tabla 5 enumera epítopos de linfocitos T CD8+ ilustrativos. La Tabla 6 enumera epítopos de linfocitos B ilustrativos. El uno o más fragmentos de un conjunto pueden comprender cualquiera de estos epítopos. El uno o más fragmentos de un conjunto pueden comprender cualquiera de un número y una combinación de estos epítopos.
Las propiedades generales de los fragmentos se han expuesto anteriormente. Además, y como se ha indicado anteriormente en relación con los fragmentos que forman una quimioteca de fragmentos proteicos, los fragmentos que comprenden un epítopo de linfocitos T o un epítopo de linfocitos B pueden tener aproximadamente 12 aminoácidos, aproximadamente 13 aminoácidos, aproximadamente 14 aminoácidos, aproximadamente 15 aminoácidos, aproximadamente 16 aminoácidos, aproximadamente 17 aminoácidos o aproximadamente 18 aminoácidos de longitud. Los fragmentos tienen preferentemente aproximadamente 15 aminoácidos de longitud. Como alternativa, los fragmentos pueden tener al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24 o al menos 25 aminoácidos de longitud. Todos los fragmentos de un conjunto pueden tener la misma longitud, o un conjunto puede comprender fragmentos de diferentes longitudes.
Los fragmentos que comprenden un epítopo de linfocitos T o un epítopo de linfocitos B pueden tener secuencias solapadas, es decir, cada conjunto puede comprender fragmentos cuyas secuencias se solapen. Las secuencias pueden solaparse en al menos uno, tal como al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20, aminoácidos. Preferentemente, las secuencias se solapan en 9 o más aminoácidos, tal como 10 o más, 11 o más, o 12 o más aminoácidos. Lo más preferentemente, las secuencias se solapan en 11 aminoácidos. Todos los fragmentos solapantes de un conjunto pueden solaparse en el mismo número de aminoácidos. Como alternativa, un conjunto puede comprender fragmentos cuyas secuencias se solapan en diferentes números de aminoácidos.
Los fragmentos que comprenden un epítopo de linfocitos T o un epítopo de linfocitos B pueden tener de 12 a 18 (tal como de 12 a 15, de 15 a 18, de 13 a 17 o de 14 a 16) aminoácidos de longitud y/o solaparse en de 9 a 12 (tal como de 9 a 11 o de 10 a 12) aminoácidos. Por ejemplo, los fragmentos pueden tener (i) 14 aminoácidos de longitud y solaparse en 9, 10 u 11 aminoácidos, (ii) 15 aminoácidos de longitud y solaparse en 9, 10 u 11 aminoácidos, o (iii) 16 aminoácidos de longitud y solaparse en 9, 10 u 11 aminoácidos. En algunos casos, los fragmentos tienen preferentemente 15 aminoácidos de longitud y se solapan en 11 aminoácidos.
Células
En un aspecto, el método descrito en el presente documento comprende poner en contacto una población de células inmunitarias obtenidas del sujeto con uno o más de (a) a (g) definidos anteriormente. El uno o más de (a) a (g) pueden comprender una o más quimiotecas de fragmentos proteicos y/o uno o más conjuntos de epítopos como se ha explicado con detalle anteriormente.
Normalmente, la población se pone en contacto con una cantidad suficiente de uno o más de (a) a (g) para generar una reacción inmunitaria hacia uno o más de (a) a (g). La población puede ponerse en contacto con cualquier cantidad de uno o más de (a) a (g), tal como aproximadamente 1 ng/ml, aproximadamente 5 ng/ml, aproximadamente 10 ng/ml, aproximadamente 50 ng/ml, aproximadamente 100 ng/ml, aproximadamente 500 ng/ml, aproximadamente 1 pg/ml, aproximadamente 5 pg/ml, aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 50 pg/ml, aproximadamente 100 pg/ml, aproximadamente 500 pg/ml, 1 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml o aproximadamente 500 mg/ml de uno o más de (a) a (g),
La población de células inmunitarias puede comprender uno o más tipos de células inmunitarias seleccionadas entre linfocitos T, linfocitos B, células dendríticas, neutrófilos, basófilos, mastocitos, eosinófilos, linfoblastos innatos (ILC, Innate Lymphoid Cells), linfocitos citolíticos naturales (NK, Natural Killer), monocitos, macrófagos y timocitos. La población puede comprender todos estos tipos de células inmunitarias. En un aspecto, la población de células inmunitarias comprende linfocitos T. Preferentemente, la población de células inmunitarias comprende linfocitos T y células presentadoras de antígenos, tales como linfocitos B, células dendríticas o macrófagos. En otro aspecto, la población de células inmunitarias comprende linfocitos B.
La población de células inmunitarias puede ponerse en contacto además con una o más proteínas de M. tuberculosis adicionales definidas anteriormente. La población puede ponerse en contacto con una cantidad suficiente de una o más proteínas de M. tuberculosis para generar una reacción inmunitaria hacia una o más proteínas. Por ejemplo, la población puede ponerse en contacto con aproximadamente 1 ng/ml, aproximadamente 5 ng/ml, aproximadamente 10 ng/ml, aproximadamente 50 ng/ml, aproximadamente 100 ng/ml, aproximadamente 500 ng/ml, aproximadamente 1 pg/ml, aproximadamente 5 pg/ml, aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 50 pg/ml, aproximadamente 100 pg/ml, aproximadamente 500 pg/ml, 1 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml,
aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml o aproximadamente 500 mg/ml de una o más proteínas adicionales de M. tuberculosis. Por ejemplo, la población de células inmunitarias puede ponerse en contacto además con dos o más proteínas de M. tuberculosis adicionales. Si la población se pone en contacto con dos o más proteínas de M. tuberculosis adicionales, la población puede ponerse en contacto con las dos o más proteínas de M. tuberculosis adicionales de forma simultánea o secuencial. Por otra parte, la población puede ponerse en contacto con una o más, o dos o más, de (a) a (g) y una o más, o dos o más, proteínas de M. tuberculosis de forma simultánea o secuencial. La población puede ponerse en contacto con cantidades iguales o diferentes de las dos o más proteínas de M. tuberculosis adicionales. Las cantidades de proteínas de M. tuberculosis se han explicado con detalle anteriormente.
En otro aspecto, el método descrito en el presente documento comprende detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia dos o más de (a) a (g) definidos anteriormente, en donde la misma población de células inmunitarias se pone en contacto con dos o más de (a) a (g). Los dos o más de (a) a (g) pueden comprender una o más quimiotecas de fragmentos proteicos y/o uno o más conjuntos de epítopos como se ha explicado con detalle anteriormente. La población puede ponerse en contacto con dos o más de (a) a (g) de forma simultánea o secuencial. La población puede ponerse en contacto con cantidades iguales o diferentes de dos o más de (a) a (g). Las cantidades de (a) a (g) se han explicado con detalle anteriormente.
En este aspecto, la población de células inmunitarias puede ponerse en contacto además con una o más proteínas de M. tuberculosis adicionales definidas anteriormente. Por ejemplo, la población de células inmunitarias puede ponerse en contacto además con dos o más proteínas de M. tuberculosis adicionales. Si la población se pone en contacto con dos o más proteínas de M. tuberculosis adicionales, la población puede ponerse en contacto con las dos o más proteínas de M. tuberculosis adicionales de forma simultánea o secuencial. Por otra parte, la población puede ponerse en contacto con una o más, o dos o más, de (a) a (g) y una o más, o dos o más, proteínas de M. tuberculosis de forma simultánea o secuencial. La población puede ponerse en contacto con cantidades iguales o diferentes de las dos o más proteínas de M. tuberculosis adicionales. Las cantidades de proteínas de M. tuberculosis se han explicado con detalle anteriormente.
En un aspecto adicional, el método descrito en el presente documento comprende detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia dos o más de (a) a (g) definidos anteriormente, en donde cada uno de los dos o más de (a) a (g) se pone en contacto con una población diferente de células inmunitarias. Los dos o más de (a) a (g) pueden comprender una o más quimiotecas de fragmentos proteicos y/o uno o más conjuntos de epítopos como se ha explicado con detalle anteriormente. Cada población de células inmunitarias puede comprender el mismo tipo o tipos de célula(s) inmunitaria(s). Como alternativa, cada población de células inmunitarias puede comprender un tipo o tipos diferentes de células inmunitarias. Las células inmunitarias ilustrativas se han detallado anteriormente. Por otra parte, los dos o más de (a) a (g) pueden ponerse en contacto con las diferentes poblaciones de células inmunitarias de forma simultánea o secuencial. Cada población diferente puede ponerse en contacto con cantidades iguales o diferentes de dos o más de (a) a (g). Las cantidades de (a) a (g) se han explicado con detalle anteriormente.
En este aspecto adicional, el método puede comprender además detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia una o más proteínas de M. tuberculosis adicionales definidas anteriormente, en donde cada una de las proteínas de M. tuberculosis adicionales se pone en contacto con una población diferente de células inmunitarias. Por ejemplo, dos o más proteínas de M. tuberculosis adicionales pueden ponerse en contacto cada una con una población diferente de células inmunitarias. Cada población de células inmunitarias puede comprender el mismo tipo o tipos de célula(s) inmunitaria(s). Como alternativa, cada población de células inmunitarias puede comprender un tipo o tipos diferentes de células inmunitarias. Las células inmunitarias ilustrativas se han detallado anteriormente. Por otra parte, las dos o más proteínas de M. tuberculosis adicionales pueden ponerse en contacto con las diferentes poblaciones de células inmunitarias de forma simultánea o secuencial. Cada población diferente puede ponerse en contacto con cantidades iguales o diferentes de las dos o más proteínas de M. tuberculosis adicionales. Las cantidades de proteínas de M. tuberculosis se han explicado con detalle anteriormente.
La puesta en contacto puede llevarse a cabo en cualquier volumen adecuado. Los volúmenes típicos de las muestras varían de aproximadamente 10 |jl a aproximadamente 1 ml, preferentemente de aproximadamente 50 pl a aproximadamente 500 pl, más preferentemente de aproximadamente 100 pl a aproximadamente 200 pl. Normalmente, el período de tiempo durante el que las células se ponen en contacto con el uno o más de (a) a (g) (y opcionalmente la una o más proteínas de M. tuberculosis adicionales) es de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 50 horas, por ejemplo, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 40 horas, de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 30 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 20 horas, de aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 12 horas, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 6 horas, preferentemente de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 2 horas. Las células pueden estar en contacto con los antígenos durante una noche.
Las células pueden ponerse en contacto con el antígeno a cualquier temperatura adecuada. La temperatura adecuada normalmente está en el mismo intervalo que la temperatura corporal normal del ser humano o del animal a partir del cual se derivan las células. Normalmente, la incubación se lleva a cabo a una temperatura fija de entre aproximadamente 4 °C y aproximadamente 38 °C, preferentemente de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 38 °C, más preferentemente aproximadamente a 37 °C.
Las células normalmente están presentes en pocilios. Las células están presentes preferentemente en los pocilios de una placa plana, que preferentemente es una placa soportada en membrana. Las muestras están presentes más preferentemente en los pocillos de una placa convencional de 96 o 384 pocillos. Tales placas son comercializadas por Fisher Scientific, VWR suppliers, Nunc, Starstedt o Falcon. Los pocillos normalmente tienen una capacidad de aproximadamente 25 pl a aproximadamente 250 pl, de aproximadamente 30 pl a aproximadamente 200 pl, de aproximadamente 40 pl a aproximadamente 150 pl o de aproximadamente 50 a 100 pl. Las células obtenidas a partir del sujeto pueden cultivarse antes de usarse en los métodos. Esto permite que haya presentes unas cifras iguales de células adherentes en cada muestra que se está ensayando. Como alternativa, si las células están inmovilizadas o capturadas, las células, tales como células de sangre roja, pueden contarse antes de colocarlas en las placas. Las técnicas de cultivo celular son bien conocidas por la persona experta en la materia. Las células se cultivan normalmente en las condiciones convencionales de 37 °C, 5 % de CO2 en medio complementado con suero.
Las células pueden cultivarse en cualquier matraz o recipiente adecuado, y después transferirse a los pocillos. Las células se cultivan normalmente en pocillos. Las células se cultivan preferentemente en una placa plana que comprende dos o más pocillos, tal como una placa convencional de 96 o 384 pocillos. La incubación de las células con el marcador normalmente implica la sustitución del medio de cultivo de cada pocillo por una solución adecuada que comprende el marcador. Las soluciones adecuadas son bien conocidas por un experto en la materia.
Interpretación de resultados
Como se ha expuesto anteriormente, el método descrito en el presente documento comprende detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia uno o más antígenos de M. tuberculosis. La detección de una reacción inmunitaria indica que el sujeto tiene una infección por el complejo M. tuberculosis. La falta de detección (o ausencia de detección) de una reacción inmunitaria indica que el sujeto no tiene infección por el complejo M. tuberculosis. Por consiguiente, el método descrito en el presente documento comprende preferentemente detectar in vitro la presencia o ausencia de una reacción inmunitaria hacia uno o más antígenos de M. tuberculosis.
En otras palabras, la detección, o la presencia, de una reacción inmunitaria hacia uno o más antígenos de M. tuberculosis indica que el sujeto tiene una infección por el complejo M. tuberculosis. La falta de detección, o la ausencia, de una reacción inmunitaria hacia uno o más antígenos de M. tuberculosis indica que el sujeto no tiene infección por el complejo M. tuberculosis.
Se pueden aplicar diferentes criterios para determinar un resultado positivo de la prueba (es decir, la presencia de infección por el complejo M. tuberculosis en el sujeto). En primer lugar, se obtiene un resultado positivo de la prueba si se detecta una reacción inmunitaria hacia uno o más (a) a (g) definidos anteriormente. En segundo lugar, se obtiene un resultado positivo de la prueba si se detecta una reacción inmunitaria hacia uno o más (a) a (g) definidos anteriormente y se detecta una reacción inmunitaria hacia uno o más antígenos de M. tuberculosis adicionales definidos anteriormente. La reacción inmunitaria hacia uno o más de (a) a (g) y, si procede, la una o más proteínas de M. tuberculosis adicionales pueden detectarse (o no detectarse) en la misma o diferente población de células, como se ha explicado con detalle anteriormente.
En un aspecto preferido descrito en el presente documento, la divulgación proporciona un método para determinar si un sujeto tiene o no una infección por el complejo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), que comprende detectar in vitro la presencia o ausencia de una reacción inmunitaria hacia uno o más de (a) Rv0840c ( SEQ ID NO: 6), o uno o más fragmentos del mismo; (b) TBFG_13463 (SEQ ID NO: 1), o uno o más fragmentos del mismo; (c) Rv1677 (SEQ ID NO: 7), o uno o más fragmentos del mismo; (d) Rv2654c (SEQ ID NO: 3), o uno o más fragmentos del mismo; (e) Rv3845 (SEQ ID NO: 4), o uno o más fragmentos del mismo; (f) Rv1495 (s Eq ID NO: 5), o uno o más fragmentos del mismo; y (g) Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2), o uno o más fragmentos del mismo, en donde la presencia de una reacción inmunitaria indica que el sujeto tiene una infección por el complejo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) y en donde la ausencia de una reacción inmunitaria indica que el sujeto no tiene una infección por el complejo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis).
Kits
La divulgación también proporciona una combinación de componentes descritos en el presente documento adecuados para usar en un método de la invención que se envasan en forma de un kit en un recipiente.
Específicamente, la divulgación proporciona un kit para diagnosticar la infección por el complejo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) en un sujeto que comprende uno o más de (a) Rv0840c (SEQ ID NO: 6), o uno o más fragmentos del mismo; (b) TBFG_13463 (SEQ ID NO: 1), o uno o más fragmentos del mismo; (c) Rv1677 (SEQ ID NO: 7), o uno o más fragmentos del mismo; (d) Rv2654c (SEQ ID NO: 3), o uno o más fragmentos del mismo; (e) Rv3845 (SEQ ID NO: 4), o uno o más fragmentos del mismo; (f) Rv1495 (SEQ ID NO: 5), o uno o más fragmentos del mismo; y (g) Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2), o uno o más fragmentos del mismo. Preferentemente, el kit contiene uno o más fragmentos definidos anteriormente en relación con quimiotecas de fragmentos proteicos o conjuntos de epítopos.
El kit puede comprender además un medio para detectar la reacción inmunitaria. Por ejemplo, el kit puede comprender algunos o todos los equipos o reactivos necesarios para realizar un ELISA o un ELISPOT. En particular, el kit puede comprender una o más placas convencionales de fondo plano o soportadas en membrana de 96 o 384 pocillos. El kit puede comprender el uno o más de los reactivos necesarios para recubrir las placas pertinentes y/o para bloquear las placas a fin de evitar una absorción inespecífica. El kit puede comprender uno o más anticuerpos marcados para detectar citocinas u otros productos inmunitarios. El kit puede comprender uno o más reactivos de detección para detectar los anticuerpos marcados.
Medicamentos, métodos y uso terapéutico
La divulgación proporciona una composición que comprende uno o más de (a) a (g) definidos anteriormente, para usar en el tratamiento o la prevención de la infección por el complejo M. tuberculosis en un sujeto. La divulgación proporciona adicionalmente un método para tratar o prevenir la infección por el complejo M. tuberculosis en un sujeto, que comprende administrar al sujeto uno o más de (a) a (g) definidos anteriormente.
La infección por el complejo M. tuberculosis puede ser una infección activa o latente.
La formulación de una composición adecuada se puede llevar a cabo usando químicas y metodologías de formulación farmacéutica convencionales, todas ellas muy asequibles al experto en la materia.
Por ejemplo, se pueden combinar uno o más de (a) a (g) con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. En el excipiente o vehículo, puede haber sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares. Estos excipientes, vehículos y sustancias auxiliares son generalmente agentes farmacéuticos que no inducen una reacción inmunitaria en el individuo que recibe la composición, y que pueden administrarse sin producir excesivos efectos secundarios. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, líquidos tales como agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico, glicerol, tioglicerol y etanol. También se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Se puede encontrar una exposición detallada de excipientes, vehículos y sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables en "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
Tales composiciones se pueden preparar, acondicionar o comercializar en una forma adecuada para la administración en bolo o para la administración continua. Las composiciones inyectables se pueden preparar, acondicionar o comercializar en formas farmacéuticas unitarias, tal como en ampollas o en recipientes multidosis que contengan un conservante. Las composiciones incluyen, pero sin limitación, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación sostenida o biodegradables. Tales composiciones pueden comprender adicionalmente uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilizantes o dispersantes. En una composición para la administración parenteral, el principio activo se puede proporcionar en forma seca (p. ej., un polvo o granulado) para la reconstitución con un vehículo adecuado (p. ej., agua estéril apirógena) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Las composiciones se pueden preparar, acondicionar o comercializar en forma de suspensión o solución acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión o solución se puede formular de acuerdo con la técnica conocida, y puede comprender, además del principio activo, ingredientes adicionales tales como los agentes dispersantes, agentes humectantes o agentes de suspensión descritos en el presente documento. Tales formulaciones inyectables estériles se pueden preparar utilizando un diluyente o disolvente, no tóxico, parenteralmente aceptable, tal como agua o 1,3-butanodiol, por ejemplo. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero sin limitación, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio y aceites no volátiles tales como monoglicéridos o diglicéridos sintéticos.
Otras composiciones útiles que se pueden administrar por vía parenteral incluyen aquellas que comprenden el principio activo en forma microcristalina, en una preparación liposomal o como un componente de un sistema polimérico biodegradable. Las composiciones para la liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero poco soluble o una sal soluble en pequeñas cantidades.
Como alternativa, uno o más de (a) a (g) pueden encapsularse, adsorberse a, o asociarse con, vehículos de partículas. Los vehículos de partículas adecuados incluyen aquellos derivados de polímeros de polimetilmetacrilato, así como micropartículas de PLG derivadas de poli(lactidas) y poli(lactida-co-glicólidos). Véase, p. ej., Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368. También se pueden usar otros sistemas de partículas y polímeros, por ejemplo, polímeros tales como polilisina, poliarginina, poliornitina, espermina, espermidina, así como conjugados de estas moléculas.
La formulación de la composición dependerá de factores tales como la naturaleza de las sustancias en la composición y el método de administración. La composición se puede administrar en una variedad de formas farmacéuticas. Puede administrarse por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, transdérmica, intradérmica, intraósea o mediante técnicas de infusión. Un médico será capaz de determinar la vía de administración necesaria para cada
persona en particular.
Las composiciones administradas comprenderán una concentración adecuada de uno o más de (a) a (g) que sea eficaz sin provocar una reacción adversa. Normalmente, la concentración de cada proteína en la composición estará en el intervalo de 0,03 a 200 nmol/ml. Más preferentemente en el intervalo de 0,3 a 200 nmol/ml, de 3 a 180 nmol/ml, de 10 a 150 nmol/ml, de 50 a 200 nmol/ml o de 30 a 120 nmol/ml. La composición o las formulaciones deben tener una pureza superior al 95 % o 98 %, o una pureza de al menos el 99 %.
La composición también puede comprender un adyuvante. El adyuvante se administra preferentemente en una cantidad que sea suficiente para aumentar el efecto de uno o más de (a) a (g). El adyuvante u otro agente terapéutico puede ser un agente que potencie los efectos de uno o más de (a) a (g). Por ejemplo, el otro agente puede ser una molécula inmunomoduladora o un adyuvante que potencie la reacción hacia uno o más de (a) a (g).
En un aspecto descrito en el presente documento, el uno o más de (a) a (g) se usan en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos. Los agentes se pueden administrar por separado, simultánea o secuencialmente. Pueden administrarse en la misma o en diferentes composiciones que uno o más de (a) a (g). Por consiguiente, en un método descrito en el presente documento, el sujeto también puede tratarse con un agente terapéutico adicional.
Por lo tanto, se puede formular una composición con uno o más de (a) a (g) y también una o más de otras moléculas terapéuticas. El uno o más de (a) a (g) pueden usarse, como alternativa, de forma simultánea, secuencial o separada con una o más de otras composiciones terapéuticas como parte de un tratamiento combinado.
Los ejemplos no limitantes de adyuvantes incluyen alumbre, lípido monofosforílico, oligonucleótidos, toxina del cólera y adyuvante incompleto de Freund.
La administración del uno o más de (a) a (g) puede ser mediante cualquier método adecuado como se ha descrito anteriormente. Las cantidades adecuadas de uno o más de (a) a (g) pueden determinarse empíricamente, pero normalmente están en el intervalo dado a continuación. Para la prevención de la infección por el complejo M. tuberculosis, puede bastar con una sola administración de la composición para obtener un efecto beneficioso para el paciente. Sin embargo, se apreciará que el efecto beneficioso puede ser mayor si la composición se administra al sujeto más de una vez, en cuyo caso las pautas posológicas típicas pueden ser, por ejemplo, una vez o dos veces a la semana durante 2-4 semanas cada 6 meses, o una vez al día durante una semana cada cuatro a seis meses.
Las posologías para la administración dependerán de varios factores, incluyendo la naturaleza de la composición, la vía de administración, y el programa y la cronología de la pauta de administración. Las dosis adecuadas pueden ser del orden de hasta 15 |jg, hasta 20 |jg, hasta 25 |jg, hasta 30 |jg, hasta 50 |jg, hasta 100 |jg, hasta 500 |jg o más por administración. Las dosis adecuadas pueden ser de menos de 15 |jg, pero al menos 1 ng, o al menos 2 ng, o al menos 5 ng, o al menos 50 ng, o al menos 100 ng, o al menos 500 ng, o al menos 1 jg , o al menos 10 jg . Para algunas moléculas, la dosis usada puede ser mayor, por ejemplo, de hasta 1 mg, hasta 2 mg, hasta 3 mg, hasta 4 mg, hasta 5 mg o mayor. Tales dosis pueden proporcionarse en una formulación líquida, a una concentración adecuada para permitir un volumen apropiado para su administración por la vía seleccionada.
La dosis de uno o más de (a) a (g) que se va a administrar en la composición puede determinarse de acuerdo con diferentes parámetros, especialmente de acuerdo con la edad, el peso y el estado del sujeto que se va a tratar; la vía de administración; la pauta requerida. Un médico será capaz de determinar la vía de administración necesaria y la posología para cualquier sujeto particular. Una dosis diaria típica es de aproximadamente 0,1 a 50 mg por kg de peso corporal, dependiendo de la actividad del inhibidor específico, la edad, el peso y el estado del sujeto que se vaya a tratar, así como de la frecuencia y la vía de administración. La dosis puede proporcionarse como una sola dosis o puede proporcionarse como múltiples dosis, por ejemplo, tomadas a intervalos regulares, por ejemplo, 2, 3 o 4 dosis administradas cada hora.
La composición descrita en el presente documento, o (a) a (g) definidos anteriormente, se puede administrar al sujeto en un día. Como alternativa, la composición descrita en el presente documento (a) a (g) definidos anteriormente puede administrarse al sujeto en al menos dos días, tal como al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 días. El intervalo entre las ocasiones puede ser de 1 a 28 días, tal como de 3 a 25 días, de 6 a 22 días, de 9 a 18 días o de 12 a 15 días. Preferentemente, el intervalo entre ocasiones es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 días.
Si el método para tratar o prevenir la infección por el complejo M. tuberculosis en un sujeto comprende administrar al sujeto dos o más de (a) a (g) definidos anteriormente, cada uno de los dos o más de (a) a (g) puede ser administrado al sujeto individual o conjuntamente.
La composición descrita en el presente documento, o (a) a (g) definidos anteriormente, se pueden administrar a cualquier sujeto adecuado. El sujeto es generalmente un sujeto humano. El sujeto puede ser cualquiera de los animales o mamíferos mencionados anteriormente con referencia al método de diagnóstico.
El sujeto puede ser un lactante, un joven o un adulto. El sujeto puede tener tuberculosis confirmada o sospecha de tuberculosis. El sujeto puede ser propenso a, o estar en riesgo de contraer, la tuberculosis. Por ejemplo, el sujeto puede tener una predisposición genética a la tuberculosis, vivir en una región de alto riesgo o tener un sistema inmunitario debilitado. El sujeto puede estar infectado con VIH o tener SIDA.
Los medicamentos descritos en el presente documento se pueden usar junto con otros medios y sustancias para tratar prevenir la tuberculosis. En algunos casos, la composición descrita en el presente documento o los (a) a (g) definidos anteriormente se pueden administrar de manera simultánea, secuencial o por separado con otras sustancias que están destinadas a tratar la tuberculosis o a mejorar los síntomas de la tuberculosis, o a aliviar el dolor. La composición o los (a) a (g) definidos anteriormente se pueden usar junto con tratamientos existentes para la tuberculosis y pueden, por ejemplo, simplemente mezclarse con tales tratamientos. Por tanto, los medicamentos descritos en el presente documento se pueden usar para aumentar la eficacia de los tratamientos existentes para la enfermedad.
Ejemplos
Ejemplo 1
Análisis del genoma de Mycobacterium tuberculosis utilizando la plataforma NeutraCorp.
Los genomas de Mycobacterium tuberculosis se analizaron utilizando la plataforma inmunoinformática desarrollada por Proxagen (marca registrada: BG Per.No.85788, de 27/08/2013). Se analizaron los genomas obtenidos de los aislados clínicos para la identificación de los antígenos proteicos inmunogénicos. Se obtuvo un total de 44 genomas completos para MTB de la base de datos GOLD.
TABLA 1: li l n m l MTB iliz
continuación
Análisis de los genomas de Mycobacterium tuberculosis y selección de proteínas
Usando la plataforma inmunoinformática de NeutraCorp (Marca registrada: BG Per. No.85788, de 27/08/2013), los presentes inventores analizaron completamente los genomas de MTB para la identificación de todos los posibles fragmentos proteicos con propiedades antigénicas, tanto epítopos de linfocitos T como epítopos de linfocitos B continuos.
En cada genoma, se seleccionaron proteínas con al menos 1 epítopo disponible (epítopo de linfocitos T y B) de afinidad informática superior al 1 % de la teórica. Estas proteínas se analizaron para detectar la presencia de epítopos de linfocitos T para los alelos o grupos alélicos de ALH-DR asociados a la susceptibilidad o a la protección frente al desarrollo de TB según la Tabla 2.
TABLA 2
Se seleccionaron proteínas que presentaban un número de epítopos significativamente mayor (>3 DT de la media de epítopos para cada proteína para todos los alelos) para los alelos o grupos alélicos asociados a los ALH con TB activa con respecto a los asociados a los ALH con protección frente a la TB.
El análisis de ortología para todas las proteínas identificadas se realizó usando el software EGM2 (Nucl. Acids Res.
2011 doi: 10.1093/nar/gkr1261). Se seleccionaron proteínas seleccionadas presentes en más de 20 genomas de cepas clínicas comunes analizados.
Esto dio lugar a una lista de siete proteínas según la Tabla 3.
TABLA 3
Identificación final del epítopos de linfocitos T y diseño de péptidos.
Se examinaron las 7 secuencias de proteínas identificadas para la identificación y el diseño de epítopos de linfocitos
T con la plataforma inmunoinformática NeutraCorp™ (Marca registrada: BG Per.No.85788, de 27/08/2013)
Específicamente, en las secuencias de proteínas, se identificaron los posibles epítopos de linfocitos T de alta afinidad (afinidad equivalente al 1 % de los péptidos mejor unidos a cualquier alelo de ALH de clase I y II) de las 7 proteínas. Las áreas de la proteína que contenían fragmentos multiepitópicos y/o promiscuos de ALH se seleccionaron como posibles reactivos para el análisis de linfocitos T. Se diseñó un total de 33 péptidos como epítopos de linfocitos T para moléculas de ALH de clase II (Tabla 4).
TABLA 4
continuación
Se diseñó un total de 47 péptidos como epítopos de linfocitos T para moléculas de ALH de clase I (Tabla 5).
TABLA 5
continuación
Identificación final del epítopos de linfocitos B y diseño de péptidos.
Se examinaron las 7 proteínas identificadas para determinar la presencia de epítopos de linfocitos B lineales con la plataforma inmunoinformática desarrollada NeutraCorp™ (Marca registrada: BG Per.No.85788, de 27/08/2013)
Para los epítopos de linfocitos B continuos, se identificó la región de la proteína que podía reaccionar con los anticuerpos, de 7 aminoácidos de longitud, en la proteína de secuencia de proteína lineal. Las áreas de las secuencias de proteínas con puntos calientes que contenían más de un fragmento identificado se consideraron solo una. Se diseñaron los posibles fragmentos de cada proteína.
Para la predicción de epítopos de linfocitos B discontinuos y el diseño de péptidos mimótopos, los presentes inventores determinaron primero mediante un modelo de homología la estructura 3D de las 6 proteínas, usando la función Swiss-Prot. Se evaluaron los modelos 3D con el módulo Neutracorp de la plataforma inmunoinformática desarrollada y se identificaron partes de posible antigenicidad a lo largo de la estructura 3D. Tras la identificación de los diferentes fragmentos que componían los epítopos de linfocitos B discontinuos, la siguiente etapa fue el diseño de los péptidos que imitaban la estructura del epítopo de linfocitos B completo, también denominados mimótopos. Para este fin, para cada epítopo de linfocitos B discontinuo, la inspección manual del modelo de estructura proteica 3D, permitió la identificación espacial de los diferentes fragmentos lineales incluidos en el epítopo. Se determinaron las distancias y la orientación de los fragmentos individuales y se incluyeron espaciadores apropiados de glicina y prolina para permitir la distancia y los ángulos apropiados entre las diferentes partes lineales.
Se diseñó un total de 48 epítopos y mimótopos peptídicos como antígenos de linfocitos B en las secuencias y estructuras de proteínas (Tabla 6).
TABLA 6
(continuación)
(continuación)
Síntesis de péptidos
La síntesis química de los péptidos terminales libres identificados se ha realizado mediante química Fmoc convencional (Espikem, Prato, Italia). Los péptidos se produjeron con una pureza >90 %.
Exploración del banco de péptidos sintetizados con biobanco de suero, para la validación de la antigenicidad de las proteínas de MTB seleccionadas
Proxagen disponía de un banco de sueros de pacientes con tuberculosis y controles a través de los resultados de la subvención del proyecto para la competitividad con fondos regionales de la UE "Desarrollo de un prototipo de prueba rápida para el diagnóstico de la tuberculosis activa" (número de proyecto BG161P0003-1.1.01-0220, de 28/12/2011).
Se han analizado muestras de suero de los siguientes grupos para confirmar la inmunogenicidad de las proteínas y los fragmentos identificados:
- Controles sanos (N = 60)
- TB activa (N = 50)
- TB curada (N = 10)
Análisis de los péptidos ID n.° 88-ID n.° 136 mediante el procedimiento operativo convencional para el ensayo ELISA de múltiples péptidos.
Procedimiento:
a. Reactivos
- PBS (Phosphate-Buffered Saline, solución salina tamponada con fosfato) estéril 1x
- Tampón de recubrimiento - Na2CO3/NaHCO3 pH 9,3
- Tampón de lavado - PBS 1x
- Tampón de bloqueo - PBS 1 % de ASB (Albúmina Sérica Bovina)
- Tampón de ensayo - PBS 1 % de ASB
- IgG anti-humana conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP, HorseRadish Peroxidase) (Zymed) - Sustrato -(0,04 mg/ml o-fenilendiamina (Sigma)
- Solución de detención - IN H2SO4
- Tampón de formulación - comprimido de UREA H2O2 (Sigma)
b. Recubrimiento de placas de ELISA:
- Se diluyen los péptidos hasta 1 □g/ml en tampón de recubrimiento.
- Se transfieren 50 pl de péptidos diluidos por pocillo a la placa de ELISA.
- Se sella la placa y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora y a 4 °C durante la noche.
c. Placa de bloqueo:
- Se añaden 200 |jl de solución de bloqueo (PBS 1 % de ASB) por pocilio
- Se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora
- Se desecha el contenido de la placa de ELISA
d. Etapa 1 del ELISA: adición de la muestra
- Se diluyen los sueros del conjunto en tampón de ensayo (PBS 1 % de ASB) 1:100
- Se transfieren 50 j l de sueros diluidos en cada placa de ELISA bajo prueba como en el esquema
- Se incuban durante 2 horas a 37 °C
- Se lavan 3 veces con PBS (200 jl/pocillo)
e. Etapa 2 del ELISA: dilución del conjugado de anticuerpo y adición a la placa de ELISA
- Se diluye IgG anti-humana conjugada con HRP 1:4000 en tampón de ensayo (PBS 1 % de ASB)
- Se transfieren 50 j l por pocillo a la placa de ELISA usando una pipeta multicanal como en el esquema - Se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente
- Se lava 5 veces con tampón de lavado (200 jl/pocillo)
f. Etapa 3 del ELISA: adición de sustrato y lectura de la placa
- Se prepara el tampón de formulación mediante la adición de 1 comprimido de UREA en 20 ml de H2Od - Se prepara el tampón de sustrato mediante la adición de 1 comprimido de OPD en 20 ml de tampón de formulación
- Se añaden 50 j l por pocillo de tampón de sustrato y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente a oscuras.
- Se detiene la reacción con 50 j l de ácido sulfúrico 1 N.
- Se lee la absorbancia usando un lector de placas de ELISA a 492 nm.
Resultados:
La Figura 1 muestra los resultados obtenidos con los diferentes sueros del grupo. Hay niveles de anticuerpos significativamente más altos en sujetos con TB activa en comparación con otros grupos cuando se usa el grupo de epítopos de las 6 proteínas como antígenos. Esto demuestra la antigenicidad de estos reactivos y su uso en pruebas de diagnóstico.
Ejemplo 2
Detección de la antigenicidad prolongada
Para confirmar la antigenicidad de los péptidos de epítopos de linfocitos B identificados mediante análisis inmunobioinformático, se examinaron mediante ELISA sueros de sujetos con infección por complejo de M tuberculosis activa confirmada microbiológicamente, sujetos con infección por complejo de M. tuberculosis latente (ITL) confirmada mediante el ensayo IGRA y sujetos de control sanos para determinar la presencia de anticuerpos dirigidos frente a los péptidos de SEQ ID NO: 88 a SEQ ID NO: 141.
Procedimiento de ELISA
a. Reactivos
- PBS (Phosphate-Buffered Saline, solución salina tamponada con fosfato) estéril 1x
- Tampón de recubrimiento - Na2CO3/NaHCO3 pH 9,3
- Tampón de lavado - PBS 1x
- Tampón de bloqueo - PBS 1 % de ASB (Albúmina Sérica Bovina)
- Tampón de ensayo - PBS 1 % de ASB
- IgG anti-humana conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP, HorseRadish Peroxidase) (Zymed) - Sustrato -(0,04 mg/ml o-fenilendiamina (Sigma)
- Solución de detención - IN H2SO4
- Tampón de formulación - comprimido de UREA H2O2 (Sigma)
b. Recubrimiento de placas de ELISA:
- Se diluyen los péptidos hasta 1 pg/ml en tampón de recubrimiento.
- Se transfieren 50 j l de péptidos diluidos por pocillo a la placa de ELISA.
- Se sella la placa y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora y a 4 °C durante la noche.
c. Placa de bloqueo:
- Se añaden 200 pl de solución de bloqueo (PBS 1 % de ASB) por pocillo
- Se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora
- Se desecha el contenido de la placa de ELISA
d. Etapa 1 del ELISA: adición de la muestra
- Se diluyen los sueros del conjunto en tampón de ensayo (PBS 1 % de ASB) 1:100
- Se transfieren 50 pl de sueros diluidos en cada placa de ELISA bajo prueba como en el esquema
- Se incuban durante 2 horas a 37 °C
- Se lavan 3 veces con PBS (200 pl/pocillo)
e. Etapa 2 del ELISA: dilución del conjugado de anticuerpo y adición a la placa de ELISA
- Se diluye IgG anti-humana conjugada con HRP 1:4000 en tampón de ensayo (PBS 1 % de ASB)
- Se transfieren 50 pl por pocillo a la placa de ELISA usando una pipeta multicanal como en el esquema - Se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente
- Se lava 5 veces con tampón de lavado (200 pl/pocillo)
f. Etapa 3 del ELISA: adición de sustrato y lectura de la placa
- Se prepara el tampón de formulación mediante la adición de 1 comprimido de UREA en 20 ml de H2Od - Se prepara el tampón de sustrato mediante la adición de 1 comprimido de OPD en 20 ml de tampón de formulación
- Se añaden 50 pl por pocillo de tampón de sustrato y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente a oscuras.
- Se detiene la reacción con 50 pl de ácido sulfúrico 1 N.
- Se lee la absorbancia usando un lector de placas de ELISA a 492 nm.
Resultados
La Tabla 21 muestra la densidad óptica (datos de DO) para cada combinación de péptido/sueros analizada mediante ELISA para establecer los datos de antigenicidad y de sensibilidad preliminar para los péptidos de epítopos de linfocitos B de SEQ ID NO: 88 a SEQ ID NO: 141. Los datos de DO son el valor absoluto de la reactividad de cada suero por duplicado para el pocillo que contiene péptido (es decir, de prueba) menos la reactividad basal del mismo suero para los pocillos sin péptido (es decir, control negativo).
Al establecer el percentil 99 o el promedio 3 DT de los controles, se puede definir un valor de corte que dé una puntuación positiva para la reactividad hacia cada péptido en los sueros analizados de sujetos con infección por el complejo M. tuberculosis activa confirmada microbiológicamente (sueros con TB activa). Esto permite determinar la reactividad de los sueros con TB activa para cada péptido o para cada serie de péptidos derivados de una sola proteína. Con más detalle:
• el valor p de la prueba de Mann-Whitney para la TB frente a los controles da la significación de los resultados en términos generales para cada péptido;
• el valor de corte del percentil 99 de la distribución de los datos de control proporciona un umbral de valor de corte simple por encima del cual un suero con TB activa se considera positivo;
• el promedio 3 DT del valor de corte de la distribución de datos de control proporciona un valor de corte más conservador con una tasa de error teórica <1 %;
• los N positivos entre la TB analizada usando el valor de corte del percentil 99 muestran el número de resultados positivos entre los sueros con TB activa para cada péptido, de acuerdo con el valor de corte del percentil 99; • el % de positivos entre TB en el valor de corte del percentil 99 muestra el porcentaje de sueros con TB activa que tienen un resultado positivo de acuerdo con el valor de corte del percentil 99;
• los N positivos entre la TB analizada usando el promedio 3 DT muestran el número de resultados positivos entre los sueros con TB activa para cada péptido, de acuerdo con el promedio 3 DT del valor de corte;
• el % de positivos entre t B en el promedio 3 DT del valor de corte muestra el porcentaje de sueros con TB activa que tienen un resultado positivo de acuerdo con el promedio 3 DT;
• N positivos > promedio de TB muestra el número de sueros con TB activa que tienen una DO superior al promedio (media) de la DO de todos los sueros con TB activa para ese péptido (en esencia, los sueros que más reaccionan para el péptido); y
• el % de positivos > promedio de TB muestra el porcentaje de sueros con TB activa que tienen una DO superior al promedio (media) de la DO de todos los sueros con TB activa para ese péptido (en esencia, los sueros que más reaccionan para el péptido).
Para cada proteína, se ha calculado el rendimiento hipotético de una serie que comprende todos los péptidos derivados de la proteína. Como esto se ha calculado usando el promedio 3 DT del valor de corte y el promedio de la DO para los sueros con TB activa (es decir, resultados siempre positivos), no se muestra el rendimiento hipotético para los sueros de control.
Los valores de DO de la Tabla 21 muestran que hay niveles significativamente más altos de anticuerpos frente a SEQ ID NO: 88 a SEQ ID NO: 141 en los sujetos que tienen una infección activa por el complejo M. tuberculosis en comparación con los sujetos de control (es decir, personas sanas o sujetos que tienen ITL). Estos resultados confirman la antigenicidad de los péptidos de Se Q ID NO: 88 a SEQ ID NO: 141.
Por otra parte, los resultados demuestran que los péptidos de SEQ ID NO: 88 a SEQ ID NO: 141 se pueden utilizar individualmente o en series de proteínas para identificar sueros de sujetos que tienen una infección activa por el complejo M. tuberculosis, es decir, para diagnosticar una infección activa por el complejo M. tuberculosis.
Ejemplo 3
ELISA de múltiples péptidos
Las pruebas de diagnóstico basadas en la reactividad hacia múltiples péptidos suelen ser más sensibles que las pruebas basadas en la reactividad hacia un solo péptido, ya que puede haber variación individual en la reacción debido a, p. ej., el acervo genético. Por lo tanto, se examinó un conjunto de péptidos que comprendía los péptidos cribados en el Ejemplo 2 para determinar la reactividad con un gran conjunto de sueros de control (con resultados negativos para el IGRA y/o positivos para el IGRA), sueros de pacientes que tenían infección activa por el complejo M. tuberculosis (TB activa) y sueros de pacientes que habían permanecido curados de la infección por el complejo M. tuberculosis durante más de 24 meses (TB curada). El número de muestras de cada conjunto fue el siguiente:
- Controles sanos (resultados negativos en el IGRA) (N = 74)
- Controles sanos infectados con MTB (ITL, resultados positivos en el IGRA y ningún otro signo de TB activa) (N = 30)
- TB activa (N = 66)
- TB curada (N = 10).
Fue necesario seleccionar los péptidos de mejor rendimiento cribados en el Ejemplo 2 para su inclusión en el conjunto de péptidos. En particular, el número de péptidos que pueden incluirse en un solo pocillo de un ELISA de múltiples péptidos se limita a aproximadamente 15-20, ya que la inclusión de demasiados péptidos puede introducir competencia por los sitios de unión durante la etapa de absorción. Por consiguiente, se seleccionaron los péptidos más reactivos del Ejemplo 2 y los péptidos que proporcionaban reactividad complementaria hacia los sueros con TB activa para optimizar la sensibilidad. Específicamente, el conjunto consistió en SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 129 y SEQ ID NO: 134.
El procedimiento de ELISA se realizó de acuerdo con el Ejemplo 2, excepto que las placas se recubrieron con el conjunto de péptidos, en lugar de un péptido individual.
Resultados
La Tabla 7 muestra la densidad óptica (datos de DO) para cada suero analizado con el conjunto de péptidos. Los datos de DO son el valor absoluto de la reactividad de cada suero individual por duplicado para el pocillo que contenía múltiples péptidos (es decir, de prueba) menos el valor simulado del suero.
La Tabla 8 muestra las estadísticas descriptivas para los datos contenidos en la Tabla 7 descriptivos de diferentes valores de corte y las comparaciones de Mann-Whitney de los resultados. Como el conjunto de datos es suficientemente grande, los porcentajes mostrados pueden interpretarse como datos preliminares de sensibilidad y especificidad.
TABLA 7
(continuación)
(continuación)
(continuación)
TABLA 8
continuación
Ejemplo 4
Identificación de antígenos de linfocitos T candidatos
1. Introducción
Este estudio fue un estudio de viabilidad inicial diseñado para identificar nuevos posibles antígenos para el ensayo T-SPOT.TB y calcular si podrían reemplazar a los antígenos ESAT-6 y CFP10 o poderse añadir al ensayo y aumentar la sensibilidad del ensayo T-SPOT®.TB actual. Para lograr esto, se cribó un conjunto de nuevos antígenos de TB en el ensayo T-SPOT®.TB con 87 donantes con TB confirmada y 96 donantes sanos.
2. Métodos
Se analizaron células mononucleares de sangre periférica (CMNP) aisladas de donantes con TB confirmada (confirmada por el ensayo GeneXpert® MTB/RIF) y donantes sanos en el ensayo T-SPOT.TB con la Serie A (SA) del T-SPOT. TB, la Serie B (SB) del T-SPOT. TB y 24 antígenos de TB alternativos. El ensayo GeneXpert® MTB/RiF es una prueba de amplificación de ácido nucleico para la tuberculosis, fabricada por Cepheid. Está respaldado por la Organización Mundial de la Salud para usar en países donde la tuberculosis es endémica, y tiene una sensibilidad declarada del 92,2 % en donantes con TB confirmada por cultivo (675/732) y una especificidad del 99,2 % en donantes sin TB (604/609), Boehme, C. (2011).
Los antígenos analizados se enumeran en la Tabla 9.
TABLA 9
Los epítopos de CD4/CD8 de cada conjunto de epítopos se enumeran en las Tablas 10 a 16.
TABLA 1: n n í D4 D TBF 1 43
TABLA 11: n n í D4 D M 217
TABLA 12: n n í D4 D Rv2 4
TABLA 1: n n í D4 D Rv 45
TABLA 14: n n í D4 D Rv14
TABLA 1: n n í D4 D Rv 4
TABLA 1 : n n í D4 D Rv1 77
El conjunto Massi CD4+8 contiene todos los epítopos de CD4/CD8 usados en los conjuntos de epítopos de CD4/CD8 para TBFG_13463, Mtub2_17866, Rv2654c, Rv3845, Rv1495, Rv0840c y Rv1677. Los conjuntos de la quimioteca peptídica para TBFG_13463, Mtub2_17866, Rv2654c, Rv3845, Rv1495, Rv0840c and Rv1677 contienen pentadecámeros que tienen un solapamiento de 11 aminoácidos y cubren la secuencia completa de aminoácidos de las proteínas utilizadas en la selección de epítopos.
3. Resultados
3.1 Donantes
3.1.1 Donantes con TB
Se analizaron 120 donantes en el ensayo T-SPOT en la Universidad de Ciudad del Cabo. El estado de la infección por TB se confirmó mediante el ensayo GeneXpert MTB RIF. 93 de los 120 donantes tuvieron resultados positivos en el GeneXpert (8/120 dieron resultados negativos en el GeneXperty 19/120 no fueron analizados en el GeneXpert). De los 93 donantes con resultados positivos en el GeneXpert, 4/93 donantes tuvieron recuentos de células bajos (<2,0 * 106 células/ml) y 2/93 donantes tuvieron controles negativos altos (>10 manchas). Por lo tanto, estos donantes fueron excluidos. Los 87 donantes con TB restantes se utilizaron para el presente ejemplo.
3.1.2 Donantes sanos
Se analizaron 107 donantes sanos en el ensayo T-SPOT en Oxford Immunotec RU. Se excluyeron 11 donantes de este grupo debido a un mayor riesgo de infección por TB (8 donantes se excluyeron debido a su origen de nacimiento en una región con TB endémica o al tiempo pasado como extranjero en regiones de TB endémica, 1 donante se excluyó debido a un contacto estrecho con una persona infectada por TB y 2 donantes se excluyeron debido a un historial previo de reacciones positivas en el ensayo T-SPOT.TB). Los 96 donantes restantes se incluyeron en el análisis.
Debido a la escasez de antígenos, no se analizó la totalidad de los 96 donantes con los 17 antígenos. Los números analizados con cada antígeno se enumeran en la Tabla 17.
TABLA 17
continuación
3.2 Curvas de rendim iento diagnóstico (CRD)
Los datos se analizaron utilizando el software GraphPad Prism 6. Los recuentos de manchas normalizados de donantes sanos se representaron gráficamente como valores de control. Los recuentos de manchas normalizados de donantes con TB confirmada se representaron gráficamente como valores de pacientes.
El ensayo T-SPOT. TB utiliza el recuento máximo de manchas de la Serie A o de la Serie B como lectura del ensayo, por ejemplo: Donante 1, Serie A = 4 manchas, Serie B = 10 manchas, el resultado del ensayo T-SPOT.TB, por lo tanto, = 10 manchas. Este análisis se ha aplicado para calcular el rendimiento del ensayo cuando se utilizan diferentes combinaciones de antígenos. Su uso se indica con el término Máx que sigue a los antígenos enumerados.
3.3 Análisis estadístico
Las curvas CRD se han comparado con el software MedCalc. Se ha utilizado el método de Hanley y McNeil, (Hanley, J., McNeil B. J. (1983)) para comparar la diferencia en el área bajo la curva (AUC, Area Under the Curve) entre curvas obtenidas del mismo grupo de pacientes (p < 0,05 = diferencia significativa entre curvas).
3.4 Rendimiento del ensayo T-SPOT. TB
En la Figura 2A, se muestra una curva CRD del rendimiento del ensayo T-SPOT.TB. En la Figura 2B, se muestran la sensibilidad y la especificidad del ensayo en diferentes valores de corte para el Máx de Serie A/Serie B. El rendimiento del ensayo T-SPOT.TB en este estudio fue del 94,2 % de sensibilidad y 97,9 % de especificidad en un valor de corte de 6 manchas. Estas cifras de rendimiento son similares al rendimiento publicado anteriormente en las instrucciones de uso del ensayo T-SPOT.TB de EE.UU. (sensibilidad = 95,6 % (175/183), especificidad = 97,1 % (297/306), PI-TB-US-V4, marzo de 2013). 2/96 donantes sanos dieron positivo con los antígenos de la Serie A/Serie B, estos donantes tienen cita para volver a realizar la prueba en el ensayo T-SPOT.TB para confirmar este resultado. La reducción del valor de corte a 3 manchas no afectaría a la sensibilidad, pero habría reducido la especificidad del ensayo al 87,5 %.
3.5 Comparación de epítopos de CD4/CD8 seleccionados frente a quimiotecas peptídicas que cubren la secuencia de proteína completa
En este grupo del estudio, se sintetizaron las secuencias peptídicas identificadas informáticamente como posibles epítopos de CD4/CD8 del genoma de Mtb y se combinaron de acuerdo con la proteína Mtb de la que se obtuvieron. Al mismo tiempo, se obtuvieron copias de las secuencias de la proteína Mtb y se sintetizaron quimiotecas peptídicas (pentadecámeros con un solapamiento de 11 aminoácidos) y se combinaron para cada proteína. Se analizaron ambos grupos de conjuntos de péptidos en el ensayo T-SPOT.TB en comparación con la Serie A y la Serie B. Los resultados se muestran en las Figuras 3 y 4.
La Figura 3 compara el conjunto de epítopos de CD4/CD8 frente a la quimioteca de péptidos Rv1495, TBFG_13463 y Rv3845. La comparación estadística de las curvas CRD muestra que hubo una diferencia significativa en el rendimiento entre el conjunto de epítopos de CD4/CD8 y la quimioteca peptídica correspondiente en A (p = 0,0267). En este caso, la quimioteca peptídica superó a su correspondiente conjunto de epítopos de CD4/CD8. En B y C, no hubo diferencia significativa en el rendimiento entre el conjunto de epítopos de CD4/CD8 y su proteinoteca correspondiente (0,3208 y p = 0,1850 respectivamente).
La Figura 4 muestra las curvas CRD para la quimioteca de péptidos Mtub2_17866, Rv2654c, Rv1677 y Rv0840C. La Tabla 18 muestra la sensibilidad y especificidad de Rv0840c en el T-SPOT.TB utilizando diferentes valores de corte (n = 180; con TB = 87; Donantes sanos = 93).
TABLA 18
La Tabla 19 resume las sensibilidades y especificidades individuales de los conjuntos de epítopos de CD4/CD8 de y quimiotecas de péptidos TBFG 13463, Mtub2_17866, Rv2654c, Rv3845, Rv1495, Rv0840c y Rv1677, y el conjunto Massi CD4+8, usando un valor de corte de 6 manchas.
TABLA 19
La Figura 5 muestra una comparación del máx de los conjuntos de epítopos de CD4/CD8 de TBFG 13463, Mtub2_17866, Rv2654c, Rv3845, Rv1495, Rv0840c y Rv1677 y el máx de las quimiotecas de péptidos TBFG 13463, Mtub2_17866, Rv2654c, Rv3845, Rv1495, Rv0840c y Rv1677. De acuerdo con la definición de "máx" anterior, cada conjunto de epítopos y quimioteca peptídica se analizó individualmente en el ensayo T-SPOT.TB. Hubo una diferencia significativa entre el máx de los conjuntos de epítopos de CD4/CD8 y el máx de las quimiotecas peptídicas (p = 0,0033).
Claims (14)
1. Un método para diagnosticar la infección por el complejo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) en un sujeto, que comprende detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia un conjunto de fragmentos derivados de una proteína de M. tuberculosis, en donde el conjunto comprende dos o más fragmentos diferentes derivados de Rv0840c (SEQ ID NO: 6) y en donde los fragmentos del conjunto forman una quimioteca de fragmentos proteicos que abarca al menos el 80 % de la secuencia de SEQ ID NO: 6 en la que los fragmentos tienen una longitud de 12 a 18 aminoácidos y se solapan en 9 a 12 aminoácidos.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia uno o más conjuntos de fragmentos derivados de una proteína de M. tuberculosis, en donde cada conjunto comprende fragmentos derivados de una proteína diferente seleccionada entre TBFG_13463 (SEQ ID NO: 1), Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2), Rv2654c (SEQ ID NO: 3), Rv3845 (SEQ ID NO: 4), Rv1495 (SEQ ID NO: 5) y Rv1677 (SEQ ID NO: 7), y en donde cada fragmento comprende 8 o más aminoácidos.
3. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia una o más proteínas de M. tuberculosis adicionales, opcionalmente en donde la una o más proteínas de M. tuberculosis adicionales comprenden una proteína RD1 y opcionalmente en donde la proteína RD1 es CFP-10 o ESAT-6.
4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los fragmentos del conjunto forman una quimioteca de fragmentos proteicos que engloba toda la secuencia de la proteína a partir de la que se obtienen los fragmentos.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde lo fragmentos se solapan en 11 aminoácidos.
6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los fragmentos tienen 15 aminoácidos de longitud.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde uno o más de los fragmentos comprenden un epítopo de linfocitos T o un epítopo de linfocitos B de la proteína de la que se obtienen los fragmentos, opcionalmente en donde el epítopo de linfocitos T es un epítopo de CD4 o un epítopo de CD8.
8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la reacción inmunitaria es una reacción inmunitaria mediada por células o una reacción de linfocitos T in vitro, opcionalmente en donde la reacción de linfocitos T es secreción de citocinas o proliferación de linfocitos T, y opcionalmente en donde la secreción de citocinas es secreción de interferón y (IFNy).
9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde:
(i) la reacción inmunitaria es una reacción de linfocitos B, opcionalmente en donde la reacción de linfocitos B es secreción de anticuerpos o proliferación de linfocitos B; o
(ii) la reacción inmunitaria es la producción de anticuerpos frente al conjunto de fragmentos definido en la reivindicación 1.
10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende un enzimoinmunoanálisis por manchas (ELISPOT).
11. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además poner en contacto una población de células inmunitarias obtenidas del paciente con el conjunto de fragmentos definido en la reivindicación 1.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde:
(I) el método comprende además detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia uno o más de (a) dos o más fragmentos derivados de TBFG_13463 (SEQ ID NO: 1; (b) dos o más fragmentos derivados de Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2); (c) dos o más fragmentos derivados de Rv2654c (SEQ ID NO: 3); (d) dos o más fragmentos derivados de Rv3845 (SEQ ID NO: 4); (e) dos o más fragmentos derivados de Rv1495 (SEQ ID NO: 5); o (f) dos o más fragmentos derivados de Rv1677 (SEQ ID NO: 7), en donde cada fragmento comprende 8 o más aminoácidos, y en donde la misma población de células inmunitarias se pone en contacto con el conjunto de fragmentos definido la reivindicación 1 y el uno o más de (a) a (f); y/o
(II) la población de células inmunitarias se pone en contacto además con una o más proteínas de M. tuberculosis adicionales definidas en la reivindicación 3.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde:
(I) el método comprende además detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia uno o más de (a) dos o más
fragmentos derivados de TBFG_13463 (SEQ ID NO: 1; (b) dos o más fragmentos derivados de Mtub2_17866 (SEQ ID NO: 2); (c) dos o más fragmentos derivados de Rv2654c (SEQ ID NO: 3); (d) dos o más fragmentos derivados de Rv3845 (SEQ ID NO: 4); (e) dos o más fragmentos derivados de Rv1495 (SEQ ID NO: 5); o (f) dos o más fragmentos derivados de Rv1677 (SEQ ID NO: 7), en donde cada fragmento comprende 8 o más aminoácidos, y en donde el conjunto de fragmentos definido en la reivindicación 1 y del uno o más de (a) a (f) se ponen en contacto cada uno con una población diferente de células inmunitarias; y/o
(II) el método comprende además detectar in vitro una reacción inmunitaria hacia una o más proteínas de M. tuberculosis adicionales definidas en la reivindicación 3, y en donde cada una de las proteínas de M. tuberculosis adicionales se pone en contacto con una población diferente de células inmunitarias.
14. Uso de un conjunto de fragmentos definidos en la reivindicación 1 para diagnosticar la infección por el complejo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) en una muestra obtenida de un sujeto.
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