ES2898783T3 - Péptido inhibidor de la angiogénesis mejorado y composición para la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis que comprende el mismo como ingrediente activo - Google Patents
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Abstract
Una composición para su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis, seleccionada del grupo que consiste en el crecimiento y la metástasis de tumores, la retinopatía diabética, la degeneración macular senil, la artritis reumatoide, la psoriasis y el cáncer, que comprende un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos Arg-Leu-Tyr-Glu, en la que la L-Arg N-terminal está acetilada o sustituida por D-Arg como ingrediente activo.
Description
DESCRIPCIÓN
Péptido inhibidor de la angiogénesis mejorado y composición para la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis que comprende el mismo como ingrediente activo
[Campo técnico]
[0001] La presente invención se refiere a un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos Arg-Leu-Tyr-Glu, en la que el L-Arg N-terminal está acetilado o sustituido por D-Arg. En algunos ejemplos, el péptido es para inhibir la angiogénesis, tal como Ac-RLYE y R(D)LYE. La presente invención se refiere además a una composición para su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis, seleccionada del grupo que consiste en el crecimiento y la metástasis de tumores, la retinopatía diabética, la degeneración macular senil, la artritis reumatoide, la psoriasis y el cáncer, que comprende un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos Arg-Leu-Tyr-Glu, en la que la L-Arg N-terminal está acetilada o sustituida por D-Arg como agente activo. En ejemplos fuera del ámbito de la presente invención, se proporciona una técnica de prevención y tratamiento de una enfermedad (cáncer, retinopatía diabética o degeneración macular senil) causada por un exceso de angiogénesis utilizando una composición que contiene estos péptidos como ingrediente activo.
[Técnica antecedente]
[0002] La angiogénesis se produce tanto en condiciones normales como patológicas y se refiere a la generación de un nuevo vaso sanguíneo a partir de un vaso sanguíneo existente. Todos los tipos de angiogénesis que se producen en condiciones fisiológicas, como el desarrollo embrionario y la cicatrización de heridas, y en condiciones patológicas, como el crecimiento del cáncer y la aparición de enfermedades de la retina, están regulados por un equilibrio entre factores promotores e inhibidores de la angiogénesis. Sin embargo, la angiogénesis anormal causada por la generación y acumulación excesivas de factores promotores de la angiogénesis en condiciones fisiológicas es la causa de varias enfermedades, como el crecimiento y la metástasis de tumores, la artritis reumatoide, la retinopatía diabética y la degeneración macular senil.
[0003] La angiogénesis es comúnmente inducida por un procedimiento secuencial de activación, proliferación, migración y formación de tubos de las células endoteliales vasculares, que es causado por diversos factores promotores de la angiogénesis. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que forma parte de los factores promotores de la angiogénesis, sirve para inducir la proliferación, la migración y la diferenciación de las células endoteliales mediante la activación de diversas cascadas de señalización. En condiciones patológicas, el VEGF induce una angiogénesis anormal para promover el crecimiento de las células tumorales y de la retina y la fuga vascular, lo que da lugar al crecimiento y la metástasis de los tumores, la retinopatía diabética y la degeneración macular senil. Por lo tanto, el inicio de la formación de nuevos vasos cancerosos y vasos de la retina puede controlarse interfiriendo con la actividad biológica y la transducción de señalización del VEGF mediante un anticuerpo neutralizador y un inhibidor de señalización del VEGF. Los fármacos inhibidores de la angiogénesis dirigidos al VEGF o a un receptor del VEGF son excelentes estrategias terapéuticas para controlar eficazmente las enfermedades humanas patológicas (anormales) relacionadas con la angiogénesis.
[0004] En los últimos años, se han desarrollado varios anticuerpos, proteínas y productos químicos inhibidores de la angiogénesis para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis excesiva, incluyendo tumores, retinopatía diabética y degeneración macular senil, y se han utilizado clínicamente. Sin embargo, pueden producirse efectos secundarios como la hipertensión y la hemorragia, o se han notificado limitaciones terapéuticas como la baja especificidad y biodisponibilidad, la antigenicidad y una farmacocinética inadecuada. Por lo general, un péptido pequeño es fácil de producir en masa, no tiene antigenicidad y tiene una alta solubilidad y biodisponibilidad, por lo que se propone como un buen material para el desarrollo de fármacos.
[0005] Por lo tanto, los inventores han llevado a cabo diversos estudios para desarrollar péptidos que puedan inhibir eficazmente la angiogénesis inducida por el VEGF, dando como resultado el desarrollo de un péptido Arg-Leu-Tyr-Glu (RLYE) que bloquea eficazmente la unión entre el receptor-2 del VEGF y el VEGF. Este péptido mostró una actividad de inhibición eficaz de la angiogénesis inducida por el VEGF, y se confirmó que tal actividad es muy útil como agente terapéutico para una enfermedad causada por la angiogénesis excesiva, en particular, el cáncer.
[0006] Sin embargo, según estudios adicionales, se confirmó que el péptido RLYE se degrada rápidamente en la sangre y no tiene una semivida larga, lo que debe mejorarse. Si se puede prolongar la semivida, cabe esperar un efecto sostenido, por lo que se determinó que el péptido RLYE es más eficaz para tratar una enfermedad causada por un exceso de angiogénesis (cáncer, retinopatía diabética o degeneración macular senil). En consecuencia, se estudió un procedimiento para mejorar la semivida del péptido RLYE.
[Documentos de la técnica anterior]
[Documento de patente]
[0007] (Documento de patente 0001) Publicación de patente internacional n°WO 97/41824
[Documentos no de patentes]
[0008]
(Documento no de patente 0001) G. Neufeld, T. Cohen, S. Gengrinovitch, Z. Poltorak, Vascular endothelial growth factor ( V E g F ) and its receptors, FASEBJ. 13 (1999) 9-22.
(Documento no de patente 0002) J. Folkman, Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease, Nat. Med. 1 (1995)27-31.
(Documento no de patente 0003) R. H. Adams, K. Alitalo, Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (2007) 8464-8478.
(Documento no de patente 0004) N. Ferrara, H. P. Gerber, J. LeCouter, The biology of VEGF and its receptors, Nat. Med. 9 (2003) 669-676.
(Documento no de patente 0005) N. Ferrara, R.S. Kerbel, Angiogenesis as a therapeutic target, Nature 438 (2005) 967-74.
(Documento no de patente 0006) H. Takahashi, M. Shibuya, The vascular endothelial growth factor (VEGF)/VEGF receptor system and its role under physiological and pathological conditions, Clin. Sci. (Lond) 109 (2005) 227-241.
(Documento no de patente 0007) M. Shibuya, VEGF-VEGFR Signals in Health and Disease, Biomol. Ther. (Seúl) 22 (2014) 1-9.
(Documento no de patente 0008) F. M. Yakes, J. Chen, J. Tan, K. Yamaguchi, Y. Shi, P. Yu, F. Qian, F. Chu, F. Bentzien, B. Cancilla, J. Orf, A. You, A. D. Laird, S. Engst, L. Lee, J. Lesch, Y. C. Chou, A.H. As a result, the effect of modified RLYE in a living body in which blood is present will be very high. Cáncer Ther. 10 (2011) 2298-2308.
(Documento no de patente 0009) S. R. Wedge, D. J. Ogilvie, M. Dukes, J. Kendrew, R. Chester, J. A. Jackson, S. J. Boffey, P. J. Valentine, J. O. Curwen, H. L. Musgrove, G. A. Graham, G. D. Hughes, A. P. Thomas, E. S. Stokes, B. Curry, G. H. Richmond, P. F. Wadsworth, A. L. Bigley, L. F. Hennequin, ZD6474 inhibits vascular endothelial growth factor signaling, angiogenesis, and tumor growth following oral administration,Cancer Res.
62 (2002) 4645-4655.
(Documento no de patente 0010) W. K. You, B. Sennino, C. W. Williamson, B. Falcon, H. Hashizume, L. C. Yao, D.T. Aftab, D. M. McDonald, VEGF and c-Met blockade amplify angiogenesis inhibition in pancreatic islet cancer, Cancer Res. 71(2011) 4758-4768.
(Documento no de patente 0011) D. D. Hu-Lowe, H. Y. Zou, M. L. Grazzini, M.E. Hallin, G. R. Wickman, K. Amundson, J.H. Chen, D.A. Rewolinski, S. Yamazaki, E.Y. Wu, M. A. McTigue, B.W. Murray, R.S. Kania, P. O'Connor, D.R. Shalinsky, S. L. Bender, Nonclinical antiangiogenesis and antitumor activities of axitinib (AG-013736), an oral, potent, and selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases 1, 2, 3, Clin. Cancer Res. 14 (2008)7272-7283.
(Documento no de patente 0012) F. Hilberg, G. J. Roth, M. Krssak, S. Kautschitsch, W. Sommergruber, U. Tontsch-Grunt, P. Garin-Chesa, G. Bader, A. Zoephel, J. Quant, A. Heckel, W.J. Rettig, BIBF 1120: triple angiokinase inhibitor with sustained receptor blockade and good antitumor efficacy, Cancer Res. 68(2008) 4774-4782.
(Documento no de patente 0013) J.C. Soria, A. Mauguen, M. Reck, A.B. Sandler, N. Saijo, D.H. Johnson, D. Burcoveanu, M. Fukuoka, B. Besse, J.P. Pignon, Systematic review and meta-analysis of randomised, phase II/IN trials adding bevacizumab to platinum-based chemotherapy as first-line treatment in patients with advanced non-small-cell lung cancer, Ann. Oncol. 24 (2013) 20-30.
(Documento no de patente 0014) S. J. Lee, S. Namkoong, Y. M. Kim, C. K. Kim, H. Lee, K. S. Ha, H. T. Chung, Y. G. Kwon, Y. M. Kim, Fractalkine stimulates angiogenesis by activating the Raf-1/MEK/ERK- and PI3K/Akt/eNOS-dependent signal pathways, Am. J. Physiol. Circ. del Corazón Physiol. 291 (2006) H2836-H2846.
(Documento no de patente 0015) J. H. So, S. K. Hong, H. T. Kim, S. H. Jung, M. S. Lee, J. H. Choi, Y. K. Bae, T. Kudoh, J. H. Kim, C. H. Kim, 2010. Gicerin/Cd146 is involved inzebrafish cardiovascular development and tumor angiogenesis. Genes Cells 15 (2010) 1099-110.
(Documento no de patente 0016) Y. Cao, A. Chen, S. S. A. An, R. W. Ji, D. Davidson, M. Llinas, Kringle 5 of plasminogen is a novel inhibitor of endothelial cell growth, J. Biol. Chem. 272 (1997) 22924-22928
(Documento no de patente 0017) P. C. Lee, A. N. Salyapongse, G. A. Bragdon, L. L. Shears 2nd, S. C. Watkins, H. D. Edington, T. R. Billiar, Impaired wound healing and angiogenesis in eNOS-deficient mice, Am. J. Physiol. 277 (1999) H1600-1608.
(Documento no de patente 0018) K. R. Kidd, B. M. Weinstein, Fishing for novel angiogenic therapies, Br. J. Pharmacol. 140 (2003) 585-594.
(Documento no de patente 0019) S. Isogai, M. Horiguchi, B. M. Weinstein, The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Dev. Biol. 230 (2001) 278-301.
(Documento no de patente 0020) J. I. Greenberg, D. A. Cheresh, VEGF as an inhibitor of tumor vessel maturation: implications for cancertherapy, ExpertOpin. Biol. Ther. 9 (2009) 1347-1356.
(Documento no de patente 0021) A. Idbaih, F. Ducray, M. Sierra Del Rio, K. Hoang-Xuan, J.Y. Delattre, Therapeutic application of noncytotoxic molecular targeted therapy in gliomas: growth factor receptors and angiogenesis inhibitors, Oncologist 13 (2008) 978-992.
(Documento no de patente 0022) K. M. Cook, W. D. Figg, Angiogenesis inhibitors: current strategies and future prospects, CA Cancer J. Clin. 60 (2010) 222-243.
(Documento no de patente 0023) H. M. Verheul, H. M. Pinedo, Possible molecular mechanisms involved in the toxicity of angiogenesis inhibition, Nat. Rev. Cancer 7 (2007)475-485.
(Documento no de patente 0024) M. S. O'Reilly, L. Holmgren, Y. Shing, C. Chen, R. A. Rosenthal, M. Moses, W. S. Lane, Y. Cao, E. H. Sage, J. Folkman, Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma, Cell 79 (1994) 315-328.
(Documento no de patente 0025) G.S. Sheppard, M. Kawai, R.A. Craig, D.J. Davidson, S. M. Majest, R. L. Bell, J. Henkin, Lysyl 4-aminobenzoic acid derivatives as potent small molecule mimetics of plasminogen kringle 5, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14 (2004) 965-966.
(Documento no de patente 0026) Y. Wang, D. Fei, M. Vanderlaan, A. Song, Biological activity of bevacizumab, a humanized anti-VEGF antibody in vitro, Angiogenesis 7 (2004) 335-345.
[Divulgación]
[Problema técnico]
[0009] Es un objetivo proporcionar un péptido novedoso que tenga efectos de prevención y tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis excesiva, ya que tiene un efecto inhibidor de la angiogénesis sostenido debido a una semivida más larga.
[0010] Otro objeto es proporcionar una composición que contenga el péptido como ingrediente activo y que, por tanto, presente efectos de prevención y tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis, por ejemplo, el cáncer y las enfermedades de la retina.
[0011] Es todavía otro objeto proporcionar un procedimiento para prevenir y tratar una enfermedad relacionada con la angiogénesis, por ejemplo, cáncer y enfermedades de la retina, el procedimiento incluye administrar el péptido en un sujeto.
[0012] Es aún otro objeto proporcionar un uso de una composición que contiene el péptido como ingrediente activo para exhibir excelentes efectos en la prevención y el tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis, por ejemplo, el cáncer y las enfermedades de la retina.
[Solución técnica]
[0013] En un aspecto, la presente invención proporciona un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos Arg-Leu-Tyr-Glu (R-L-Y-E o RLYE), en la que el L-Arg N-terminal está acetilado o sustituido por D-Arg.
[0014] En un ejemplo, los dos péptidos pueden inhibir la angiogénesis inducida por el VEGF.
[0015] En un ejemplo, se proporciona una composición que contiene al menos uno de los péptidos como ingrediente activo para prevenir y tratar una enfermedad relacionada con la angiogénesis excesiva.
[0016] En un ejemplo fuera del ámbito de la presente invención, se proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad relacionada con la angiogénesis, el procedimiento incluye administrar al menos uno de los péptidos a un sujeto.
[0017] En otro ejemplo fuera del ámbito de la presente invención, se proporciona un procedimiento para prevenir una enfermedad relacionada con la angiogénesis, el procedimiento incluye administrar al menos uno de los péptidos a un sujeto.
[0018] En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición para su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis seleccionadas del grupo que consiste en el crecimiento y la metástasis de tumores, la retinopatía diabética, la degeneración macular senil, la artritis reumatoide, la psoriasis y el cáncer, que comprende un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos Arg-Leu-Tyr-Glu, en la que la L-Arg N-terminal está acetilada o sustituida por D-Arg como ingrediente activo.
[0019] En una realización de la composición de uso, cuando la enfermedad relacionada con la angiogénesis es cáncer, el cáncer es un tumor sólido.
[0020] En una realización adicional de la composición de uso, el tumor sólido es un cáncer colorrectal.
[0021] En aún otro ejemplo fuera del ámbito de la presente invención se proporciona un procedimiento para tratar el cáncer, el procedimiento incluye administrar al menos uno de los péptidos a un sujeto.
[0022] En aún otro ejemplo fuera del ámbito de la presente invención se proporciona un procedimiento para prevenir el cáncer, el procedimiento incluye la administración de al menos uno de los péptidos a un sujeto.
[0023] En aún otro ejemplo fuera del ámbito de la presente invención se proporciona un procedimiento para tratar la retinopatía diabética, el procedimiento incluye administrar al menos uno de los péptidos a un sujeto.
[0024] En aún otro ejemplo fuera del ámbito de la presente invención se proporciona un procedimiento para prevenir la retinopatía diabética, el procedimiento incluye la administración de al menos uno de los péptidos a un sujeto.
[0025] En aún otro ejemplo fuera del ámbito de la presente invención se proporciona un procedimiento para tratar la degeneración macular senil, el procedimiento incluye administrar al menos uno de los péptidos a un sujeto.
[0026] En aún otro ejemplo fuera del ámbito de la presente invención se proporciona un procedimiento para prevenir la degeneración macular senil, el procedimiento incluye administrar al menos uno de los péptidos a un sujeto.
[0027] En algunos ejemplos, el péptido puede utilizarse en fármacos, alimentos o piensos para humanos o animales.
[0028] En este caso, el péptido puede formularse de acuerdo con una norma para la formulación de una preparación farmacéutica convencional y una norma para la formulación de alimentos suplementarios para la salud de la Administración de Alimentos y Medicamentos de Corea (KFDA).
[0029] El péptido puede utilizarse tal cual, o en forma de una sal, tal como una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable o un complejo metálico, por ejemplo, una sal de sodio (Na), potasio (K), calcio (Ca), zinc (Zn) o hierro (Fe). Más específicamente, la sal de adición de ácido puede ser cloruro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno, un sulfato, un fosfato, un maleato, un acetato, un citrato, un benzoato, un succinato, un malato, un ascorbato o un tartrato.
[0030] El péptido puede diluirse mezclando el oligopéptido con un portador farmacéuticamente aceptable por un procedimiento convencional según un procedimiento de administración, un tipo de administración y un propósito terapéutico, o encapsulado en un portador tipo contenedor.
[0031] Cuando el portador se utiliza como diluyente, el portador puede prepararse en una formulación como un polvo, gránulos, inyecciones, un jarabe, una solución, comprimidos, supositorios, pesarios, pomada, crema o aerosol para la administración oral o parenteral utilizando al menos uno seleccionado del grupo que consiste en una solución salina, un tampón, dextrosa, agua, glicerol, solución de Ringer, lactosa, sacarosa, silicato de calcio, metilcelulosa y etanol. Sin embargo, el portador no se limita a los tipos de portadores mencionados. Aquí, la administración parenteral se refiere a la administración intravítrea, rectal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraaórtica, transdérmica o intranasal de un ingrediente eficaz, o a la inhalación, distinta de la administración oral.
[0032] La formulación mencionada anteriormente puede prepararse añadiendo además un agente de carga, un anticoagulante, un lubricante, un agente humectante, un agente saborizante, un emulsionante o un conservante para inducir la liberación rápida, sostenida o prolongada de un ingrediente activo tras su administración a un mamífero. Además, la dosificación puede ajustarse según el estado del paciente, la vía de administración y el tipo de administración, y será obvio para los expertos en la materia que la dosificación puede variar en un amplio intervalo sin limitaciones. Convencionalmente, se determina que el péptido puede administrarse diariamente de forma continua o intermitente en una cantidad experimentalmente eficaz de aproximadamente 0,5 a 1,0 mg por kg de peso corporal.
[Efectos ventajosos]
[0033] Un péptido de la presente invención tiene una semivida larga, y un efecto inhibidor de la angiogénesis inducido por el VEGF muy excelente. Por lo tanto, cuando el péptido desarrollado en la presente invención se utiliza para
enfermedades relacionadas con la angiogénesis excesiva, el cáncer, la retinopatía diabética o la degeneración macular senil, estas enfermedades pueden prevenirse o tratarse de forma muy eficaz.
[Descripción de los dibujos]
[0034] La FIG. 1 muestra los resultados experimentales que demuestran la estabilidad de un péptido RLYE en suero humano. A: Un resultado experimental que muestra la estabilidad de RLYE en suero humano y en solución salina fisiológica (sin suero), B: Un resultado que muestra el efecto de un inhibidor de la proteasa sobre la estabilidad de RLYE en suero humano, C: Un resultado experimental que muestra el efecto de un inhibidor de la aminopeptidasa B, la bestatina, sobre la estabilidad de la RLYE en suero humano. NC: control negativo; CTRL: control salino fisiológico (control).
[0035] La FIG. 2 muestra los resultados experimentales que demuestran los efectos de los RLYE y los RLYE modificados sobre la estabilidad en el suero humano y la migración de las células endoteliales vasculares. A: Un resultado experimental que muestra la estabilidad de RLYE y de los RLYE modificados (Ac-RLYE, RLYE-NH2 , Ac-RLYE-NH2 y R(D)LYE) en suero humano, B: Un resultado experimental que muestra los efectos de los RLYE y los RLYE modificados sobre la semivida (t1/2) en el suero humano y la inhibición (IC50) de la migración de las células endoteliales vasculares.
[0036] La FIG. 3 muestra los resultados experimentales que muestran los efectos de RLYE, Ac-RLYE y R(D)LYE en la formación de tubos de células endoteliales vasculares en función del pretratamiento de suero humano. A: Un resultado experimental que muestra el efecto de un péptido pretratado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante tres horas sobre la formación de tubos de células endoteliales vasculares inducida por VEGF(V), B: Un resultado experimental que muestra el efecto de un péptido pretratado con suero humano durante tres horas sobre la formación de tubos de células endoteliales vasculares inducidas por el VEGF(V).
[0037] La FIG. 4 muestra los efectos de RLYE, Ac-RLYE y R(D)LYE en la inhibición del crecimiento tumoral en modelos de ratón implantados con células de cáncer colorrectal humano. A: Un resultado experimental que muestra un efecto de la administración de un péptido o de bevacizumab (BVZ) sobre el tamaño de un tumor (durante 30 días después de la inducción del tumor), B: Un resultado experimental que muestra el efecto de la administración de un péptido o de bevacizumab (BVZ) sobre la inhibición del crecimiento del tumor (durante 30 días después de la inducción del tumor), C: Un resultado experimental que muestra el efecto de la administración de un péptido o bevacizumab (BVZ) en la inhibición de la angiogénesis tumoral.
[0038] La FIG. 5 muestra los resultados experimentales que muestran los efectos de RLYE y Ac-RLYE en la inhibición de la neovascularización coroidea en modelos de ratón de neovascularización coroidea inducida por láser. A: Un resultado experimental que muestra el efecto de un péptido en la inhibición de la neovascularización coroidea, detectada mediante tinción de hematoxilina-eosina (H&E) (las partes mostradas por una línea de puntos representan el límite de una lesión de neovascularización coroidea), B: Un resultado del análisis cuantitativo del área de neovascularización coroidea, C: Un resultado experimental que muestra el efecto de un péptido en la inhibición de la neovascularización coroidea en el tejido del complejo epitelio pigmentario de la retina/coroides/esclerótica de un globo ocular extraído tras la inyección intravenosa de dextrano con unión a isotiocianato de fluoresceína (FITC).
[0039] La FIG. 6 muestra los resultados experimentales que demuestran los efectos de RLYE y Ac-RLYE en la inhibición de la fuga vascular de la retina en modelos de ratones diabéticos. A: Un resultado experimental que muestra el efecto de un péptido en la inhibición de la fuga vascular retiniana debida a la diabetes inducida por la estreptozotocina (STZ). B: Un resultado experimental que muestra el efecto de un péptido en la inhibición de la fuga vascular de la retina debida a la diabetes.
[Modos de la invención]
[0040] En lo sucesivo, la presente invención se describirá con más detalle haciendo referencia a ejemplos.
<Confirmación del efecto del péptido Ac-RLYE y R(D)LYE en la antiangiogénesis y el tratam iento del cáncer y la enfermedad de la retina>
1. Procedimientos experimentales
1-1. Materiales experimentales y ética animal
[0041] Todos los péptidos [RLYE, EYLR, Ac-RLYE (el péptido preparado por acetilación del N-terminal de RLYE), RLYE-NH2 (el péptido preparado por amidación del C-terminal de RLYE), y R(D)LYE (el péptido preparado por sustitución de la arginina de tipo L de RLYE por arginina de tipo D)] utilizados en el experimento fueron sintetizados con referencia a Peptron, Inc. (Daejeon, Corea). Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Ética para la Protección y el Uso de Animales Experimentales de la Universidad Nacional de Kangwon.
1-2. Análisis de la estabilidad de los péptidos
[0042] El suero se separó por centrifugación (centrífuga de mesa, 3000 rpm, 20 min) de la sangre obtenida de una persona sana. El suero se filtró utilizando un filtro (Millipore) con un tamaño de poro de 0,22 jM , y luego se mezclaron 50 j l del suero humano con 100 jg de RLYE, R(D)LYE, RLYE-NH2 o Ac-RLYE (100 jg/50 jl, PBS, pH 7,4), y se incubaron por tiempo a una temperatura constante de 37 °C. La concentración de péptidos de la muestra se calculó por el área del pico después de separar la muestra mediante cromatografía líquida de alto rendimiento en fase reversa C18 (HPLC; columna C18 de proteínas y péptidos Vydac, trifluoroacetato al 0,1% en H2O para el equilibrio y trifluoroacetato al 0,1% en acetonitrilo para la elución).
1-3. Análisis de la m igración de las células endoteliales vasculares
[0043] El análisis de la migración de las células endoteliales vasculares del cordón umbilical humano (HUVECs) se llevó a cabo utilizando una placa de cultivo Transwell a la que se añadió un filtro de policarbonato (tamaño de poro 8 jm ) con un diámetro de 6,5 mm. Una superficie del filtro se recubrió con 10 jg de gelatina. Se añadió medio M199 fresco (1% de suero bovino fetal) que contenía VEGF (10 ng/ml) en un compartimento inferior de la placa Transwell, y se transfirieron cuidadosamente a un compartimento superior de la placa las HUVEC (1*10® células/100 j l ) que habían reaccionado con péptidos de 0,15 nM o 1,5 nM a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las HUVECs resultantes se cultivaron en una cámara de temperatura y humedad constantes de C02 durante 4 horas, y las células migradas bajo el filtro Transwell se tiñeron con tinción de H&E y se cuantificaron utilizando un microscopio óptico.
1-4. Análisis de la formación de tubos de las células endoteliales vasculares
[0044] Se determinó el grado de formación de tubos de las HUVECs utilizando Matrigel reducido con factor de crecimiento. Se añadieron 250 j l del Matrigel (10 mg de proteína/ml) en una placa de 24 pocillos para permitir la polimerización durante 30 minutos a 37 °C. Las HUVEC cultivadas en medio M199 (suero bovino fetal al 1%) durante 6 horas se transfirieron cuidadosamente al Matrigel en la placa de cultivo a una densidad de 2*105 células/pocillo, y se cultivaron VEGF (10 ng/ml) solo o con péptidos (0,15 nM) a 37 °C durante 20 horas. También se utilizaron péptidos que reaccionaron en PBS o en suero humano fresco durante 3 horas. El grado de formación de tubos de las HUVEC se visualizó utilizando un microscopio invertido de contraste de fase, y se midió y cuantificó la longitud del tubo formado con la versión 4.5 de Image-Pro Plus (Media Cybernetics, San Diego, CA).
1-5. Modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer de colon humano (HCT116)
[0045] Se inyectaron células de cáncer de colon humano (HCT116, 1*107 células/100 j l) por vía subcutánea en el lado izquierdo de un ratón lampiño (BALB/c nu/nu, macho de 6 semanas de edad), y luego, cuando el volumen del tumor alcanzó al menos 50 a 70 mm3 (aprox. 7 días), se inyectó por vía intraperitoneal una vez al día solución salina fisiológica (control negativo), RLYE (1,0 mg/kg), R(D)LYE (1,0 mg/kg) o Ac-RLYE (1,0 mg/kg; anormal, grupo experimental). Se inyectó por vía intraperitoneal un anticuerpo neutralizador del VEGF, bevacizumab, a razón de 2 mg/kg dos veces por semana (control positivo). El tamaño del tumor se midió bidimensionalmente utilizando calibradores. El volumen del tumor (mm3) se calculó mediante la fórmula: anchura2 * longitud*0,52.
1-6. Medición de la angiogénesis tumoral
[0046] El tejido tumoral se fijó con formalina al 10% y se introdujo en parafina. Se preparó un portaobjetos utilizamdo una sección de tejido tumoral, se sumergió en xileno para eliminar la parafina y se rehidrató mediante un tratamiento gradual con etanol al 100%, 95%, 80% y 70%. Después, el portaobjetos se lavó con agua desionizada varias veces a temperatura ambiente. Para inhibir la actividad intracelular de una peroxidasa, la sección de tejido se hizo reaccionar en metanol con peróxido de hidrógeno al 0,3% durante 15 minutos, y se lavó con PBS tres veces. La sección de tejido se hizo reaccionar en PBS con suero de cabra al 3% durante 2 horas a temperatura ambiente, y se hizo reaccionar con FITC-isolectina B4 (5 mg/ml; Vector Laboratories) durante 1 hora. La sección de tejido se lavó con PBS tres veces y, a continuación, se preparó un portaobjetos permanente utilizando una solución de criomontaje (medio de muestreo OCT, Tissue Tek, Sakura Finetek), y luego se visualizaron los vasos tumorales utilizando un microscopio de fluorescencia.
1-7. Medición de la neovascularización coroidea inducida por láser
[0047] Para preparar un modelo animal de neovascularización coroidea inducida por láser, se destruyó una membrana de Bruch entre una capa retiniana y una capa coroidea irradiando la retina del ratón con un láser de diodo a una intensidad de 400 mW y una duración de 50 ms, y luego se produjo la neovascularización coroidea durante 14 días. Se irradiaron las retinas de ratones C57BL/6 macho de 6 semanas de edad con un láser en las condiciones mencionadas, se confirmó la formación de una lesión mediante una inspección de seguridad el día 10 y se inyectó intravítreamente 1 j l de una solución de EYLR, RLYE o Ac-RLYE de 1,5 mM. Aquí se inyectó la misma cantidad de solución salina en el grupo de control. Al cabo de 4 días (14 días después de la irradiación láser), se realizó un experimento para analizar el efecto terapéutico extrayendo los globos oculares de los ratones. Los globos oculares extraídos se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 12 horas y se incrustaron en parafina. Se prepararon secciones con un grosor de 4 jm a partir de tejido en parafina y se sometieron a la tinción de H&E. Posteriormente, se tomó una imagen de una sección con la mayor área de membrana neovascular coroidea de cada sujeto, y se analizó cuantitativamente el área de la membrana neovascular coroidea mediante el programa ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE.UU.). En el grupo de control inyectado con solución salina, la media de las áreas neovasculares coroideas se
representó como el 100%, y se analizó el efecto terapéutico de cada grupo de tratamiento. Mientras tanto, se inyectó 1 ml (1,25 mg) de FITC-dextrano (250 kDa) en el ventrículo izquierdo una hora antes de la extracción del globo ocular del ratón para permitir la perfusión sistémica. Tras la extracción, el globo ocular se fijó en paraformaldehído al 4% durante 1 hora. A continuación, se cortaron la córnea y el cristalino con unas tijeras, y se extrajo cuidadosamente la retina con unas pinzas para preparar un complejo de tejidos de epitelio pigmentario de la retina/coroides/esclerótica. El tejido complejo de la retina montado en plano se observó bajo un microscopio de fluorescencia y se fotografió.
1- 8. Modelo de ratón con retinopatía diabética inducida por estreptozotocina (STZ)
[0048] Se inyectó por vía intraperitoneal una solución de STZ recién preparada (100 mM) en un tampón de citrato (100 mM, pH 4,5) a 150 mg/kg en los ratones y, para evitar el choque hipoglucémico, se proporcionó un 10% de sacarosa. Al cabo de dos días, se midió la glucosa en sangre con un medidor de glucosa en sangre Accu-Chek Performa (Roche Diagnostics GmbH, Alemania), y cuando la glucosa en sangre sin ayuno en el plazo de 1 a 2 semanas se mantuvo en 300 mg/dl o más, los ratones se utilizaron como modelos animales diabéticos. Los ratones inducidos por la diabetes fueron anestesiados con avertin al 2%, y se inyectó intravítreamente 1 pl de una solución de EYLR, RLYE o Ac-RLYE de 1,5 mM. Aquí se inyectó la misma cantidad de PBS en el grupo de control. Se inyectó el péptido y, al cabo de 24 horas, se inyectó 1 ml (1,25 mg) de FITC-dextrano (250 kDa) en el ventrículo izquierdo de cada ratón para que circulara durante aproximadamente 5 minutos. Los ratones fueron sometidos a eutanasia por dislocación cervical, y los globos oculares fueron extraídos y fijados en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 1 hora. Se aisló la retina del globo ocular fijado para preparar un montaje plano de la retina, y se observó la fuga vascular bajo un microscopio confocal. Mientras tanto, se midió la fluorescencia del FITC-dextrano filtrado en los vasos de la retina utilizando el software Fluoview.
2. Resultados experimentales
2- 1. Experimento sobre la estabilidad del péptido RLYE en suero humano y análisis de la causa de su corta semivida
[0049] Para evaluar la estabilidad de RLYE, se agregó un péptido RLYE a cada uno de los PBS y al suero humano, y se incubó por tiempo a una temperatura constante de 37 °C. Cuando se incubó RLYE en PBS a una temperatura constante, no se produjo la degradación del péptido RLYE, y cuando se incubó el péptido RLYE en suero humano, la semivida de RLYE fue de 1,2 horas (refiérase a la FIG. 1A).
[0050] Mientras tanto, para identificar qué componente del suero humano causaba la disminución de la estabilidad de RLYE, se añadió a RLYE un componente principal del suero, la albúmina, e inhibidores de varias proteasas, seguido de una incubación a una temperatura constante de 37 °C. Como resultado, la albúmina no indujo la degradación de RLYE, y se confirmó que la degradación de RLYE debida al suero humano no fue inhibida por el tratamiento de aprotinina, EDTA, leupeptina y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), que son conocidos como inhibidores de proteasas (refiérase a la FIG. 1B). Sin embargo, cuando se añadió el inhibidor de la aminopeptidasa B, bestatina, se confirmó que la degradación de RLYE por el suero humano se inhibió de forma efectiva (refiérase a la FIG. 1C). Estos resultados sugieren que la RLYE fue degradada por la aminopeptidasa B presente en el suero.
2-2. Estudios sobre la estabilidad y la actividad farmacológica de RLYE y del péptido modificado en el terminal N/C de RLYE en suero humano
[0051] Para evaluar la estabilidad de RLYE y RLYE modificado (Ac-RLYE, RLYE-NH2, Ac-RLYE-NH o R(D)LYE), el RLYE y RLYE modificado se incubaron en suero humano durante 12 horas a una temperatura constante de 37 °C. Como resultado, la semivida de RLYE y RLYE-NH2 fue de 1,2 horas y 1,3 horas, respectivamente, y la semivida de los péptidos Ac-RLYE y R(D)LYE fue de 8,8 horas y 7,0 horas, respectivamente (refiérase a la FIG. 2A).
[0052] Para confirmar los efectos farmacológicos de RLYE y RLYE modificado, se estudiaron los efectos sobre la migración de células endoteliales vasculares, uno de los fenómenos típicos de la angiogénesis. Bajo una condición en la que las HUVEC fueron tratadas con VEGF y se indujo la migración de las células endoteliales vasculares, se añadió cada péptido y se midió el valor IC50 para la inhibición de la migración celular. Como resultado, los valores IC50 de RLYE, Ac-RLYE, RLYE-NH2 , Ac-RLYE-NH y R(D)LYE fueron de 0,08, 0,05, 0,11, 80,2 y 0,06 nM, respectivamente, y se confirmó que los efectos inhibidores de la angiogénesis de Ac-RLYE y R(D)LYE eran similares o un poco mejores que los de RLYE, cuyo efecto inhibidor de la angiogénesis se confirmó en una etapa temprana (refiérase a la FIG. 2B). Tales resultados muestran que, cuando RLYE se modificó en Ac-RLYE y R(D)LYE, la estabilidad del péptido se incrementó, y la migración de las células endoteliales puede inhibirse eficazmente.
2-3. Estudio de la actividad farmacológica de RLYE, Ac-RLYE y R(D)LYE según la ausencia o presencia de suero
[0053] La angiogénesis es muy importante no sólo en la proliferación y migración de las células endoteliales vasculares, sino también en la diferenciación morfológica relacionada con la formación de tubos de las células endoteliales. Por lo tanto, RLYE, Ac-RLYE y R(D)LYE se incubaron en cada uno de PBS y en suero humano durante 3 horas a temperatura constante, y luego se investigaron los efectos de RLYE, Ac-RLYE y R(D)LYE en la formación de tubos de células endoteliales vasculares utilizando Matrigel bidimensional. Cuando estos péptidos se pretrataron
con PBS, la formación de tubos inducida por el VEGF se inhibió eficazmente, y los efectos inhibitorios se mostraron de forma similar en los tres tipos de péptidos (refiérase a la FIG. 3A). Mientras tanto, cuando estos péptidos fueron pretratados con suero humano durante tres horas, Ac-RLYE y R(D)LYE inhibieron eficazmente la formación de tubos de las células endoteliales, pero RLYE inhibió de forma insignificante la formación de tubos (refiérase a la FIG. 3B). Tales resultados sugieren que, debido a la baja estabilidad de RLYE en la sangre, se redujo el efecto farmacológico, y debido a la alta estabilidad de Ac-RLYE y R(D)LYE, el efecto farmacológico se mantiene. Como resultado, el efecto de RLYE modificado en un cuerpo vivo en el que hay sangre será muy alto.
2-4. Estudio de los efectos anticancerígenos de RLYE, Ac-RLYE y R(D)LYE en modelos tumorales de ratón
[0054] Para investigar los efectos anticancerígenos de RLYE, Ac-RLYE y R(D)LYE en modelos de ratones lampiños xenoinjertados con células de cáncer de colon humano (HCT116), se inyectó cada péptido en la cavidad peritoneal una vez al día a una dosis de 1,0 mg/kg/día, y se inyectaron por vía intraperitoneal dos veces por semana 2,0 mg/kg de un anticuerpo neutralizador del VEGF utilizado clínicamente, el bevacizumab (Avastin), como control positivo. Como resultado, se observó que estos péptidos inhibían el tamaño y el crecimiento de un tumor, y los efectos anticancerígenos de Ac-RLYE y R(D)lYe son mayores que los de RLYE (refiérase a las FIGS. 4A y 4B). Los efectos anticancerígenos de Ac-RLYE y R(D)LYE fueron un poco menores que los del control positivo bevacizumab. Mediante la tinción de los vasos sanguíneos generados en el tejido tumoral con FITC-isolectina B4, se confirmó que los efectos de la inhibición de la angiogénesis del cáncer por parte de Ac-RLYE y R(D)LYE eran mayores que los de RLYE (refiérase a la FIG. 4C). Tales resultados muestran que los efectos anticancerígenos de Ac-RLYE y R(D)LYE preparados mediante la modificación del aminoácido N-terminal L-arginina (R) de RLYE se incrementaron debido a su alta estabilidad en un cuerpo vivo y, por lo tanto, la inhibición efectiva de la angiogénesis del cáncer.
2-5. Estudio sobre los efectos inhibidores de RLYE y Ac-RLYE en la angiogénesis coroidea inducida por láser
[0055] Para el desarrollo de un agente terapéutico para una enfermedad ocular refractaria tal como la degeneración macular senil (DMAE húmeda o neovascular), generalmente se estudia un efecto inhibidor de la neovascularización coroidea inducida por láser en modelos de ratón. Cada péptido se añadió a la neovascularización coroidea inducida por láser en ratones, y se confirmó su efecto inhibidor de la neovascularización coroidea, y así EYLR (secuencia reversa del péptido RLYE) no tuvo ningún cambio en la aparición de la neovascularización coroidea, pero cuando se añadieron RLYe y Ac-RLYE, la neovascularización coroidea se redujo eficazmente, y Ac-RLYE fue altamente eficaz en comparación con RLYE (refiérase a las FIGS. 6A y 6B). En una investigación que utilizó una técnica de montaje plano de la retina, también se confirmó que el Ac-RLYE mostró un mayor efecto de inhibición de la neovascularización coroidea que el RLYE (refiérase a la FIG. 6C). Estos resultados sugieren que el Ac-RLYE modificado en su N-terminal puede ser utilizado como agente terapéutico para la degeneración macular senil relacionada con la angiogénesis.
2-6. Estudio sobre los efectos terapéuticos de RLYE y Ac-RLYE en la retinopatía diabética
[0056] Se confirmó que la fuga vascular de la retina aumentó considerablemente en los modelos de ratón en los que se indujo la retinopatía diabética mediante la administración de estreptozotocina (STZ), y la administración de RLYE y Ac-RLYE inhibió eficazmente la fuga vascular de la retina (refiérase a las FIGS. 6A y 6B). Mientras tanto, al comparar los efectos inhibitorios de estos dos péptidos sobre la fuga vascular de la retina, se confirmó que el Ac-RLYE mostró un mayor efecto inhibidor sobre la fuga vascular sanguínea que el RLYE. Estos resultados sugieren que el Ac-RLYE, que inhibe eficazmente las fugas vasculares de la retina que se producen en una enfermedad relacionada con la diabetes, puede utilizarse como agente terapéutico para la retinopatía diabética.
Claims (4)
1. Una composición para su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis, seleccionada del grupo que consiste en el crecimiento y la metástasis de tumores, la retinopatía diabética, la degeneración macular senil, la artritis reumatoide, la psoriasis y el cáncer, que comprende un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos Arg-Leu-Tyr-Glu, en la que la L-Arg N-terminal está acetilada o sustituida por D-Arg como ingrediente activo.
2. Una composición para su uso de la reivindicación 1, en la que cuando la enfermedad relacionada con la angiogénesis es cáncer, el cáncer es un tumor sólido.
3. Una composición para su uso de la reivindicación 2, en la que el tumor sólido es cáncer colorrectal.
4. Un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos Arg-Leu-Tyr-Glu, en la que la L-Arg N-terminal está acetilada o sustituida por D-Arg.
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