ES2899191T3 - Péptidos y procedimientos de detección de alergia alimentaria - Google Patents

Péptidos y procedimientos de detección de alergia alimentaria Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para diagnosticar una alergia a la leche en un sujeto que comprende: a) proporcionar una pluralidad de péptidos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33, donde la pluralidad de péptidos consiste en los 33 péptidos de SEQ ID NOs:1-33, un subconjunto de 20-25 péptidos, un subconjunto de 15-20 péptidos, un subconjunto de 10-15 péptidos, un subconjunto de 5-10 péptidos o un subconjunto de 2-5 péptidos, cada péptido conjugado con un soporte sólido identificable por separado; b) poner en contacto cada soporte sólido con suero obtenido del sujeto en condiciones suficientes para permitir la unión de inmunoglobulina asociada a alergia (AAI) en el suero al péptido en cada soporte sólido para formar un complejo péptido-IgE; c) unir un reactivo de marcaje específico de AAI al complejo péptido-AAI; y d) analizar la unión del reactivo de marcaje a cada complejo péptido-AAI para identificar péptidos reconocidos por la AAI en el suero del sujeto; donde el reconocimiento de al menos un péptido por la AAI en el suero del sujeto indica que el sujeto es alérgico a la leche.

Description

DESCRI PCI ÓN
Péptidos y procedimientos de detección de alergia alimentaria
CAMPO TÉCNI CO
La invención se refiere a biomarcadores de péptidos para el diagnóstico de alergia y para determinar si es probable que un sujeto alérgico supere la alergia. La invención también se refiere a procedimientos de diagnóstico y kits de diagnóstico que emplean los biomarcadores de péptidos.
ANTECEDENTES
Las alergias alimentarias son un problema común entre adultos y niños, y los síntomas pueden variar desde un prurito oral leve hasta un shock anafiláctico potencialmente mortal. Las alergias alimentarias se diagnostican actualmente mediante pruebas cutáneas o provocación oral, y la medición de los niveles séricos de IgE específica y, en algunos casos, otros anticuerpos séricos, como IgG4. Estas pruebas indican la probabilidad de reactividad clínica pero no distinguen los diferentes fenotipos de alergia alimentaria ni proporcionan información de pronóstico. También implican cierto nivel de riesgo para el paciente. La relación entre las pruebas de IgE actuales y la sensibilidad clínica real del paciente es débil y generalmente se define como una combinación de la gravedad de la reacción y la cantidad de alérgeno que provoca una reacción. Otra limitación de las pruebas actuales es la incapacidad de determinar si los pacientes pediátricos superarán o no la alergia durante la infancia. En este caso, existe una correlación positiva pero débil entre el nivel de IgE específico y la duración de la alergia clínica.
Más recientemente, se ha sugerido que la reactividad clínica a los alérgenos alimentarios puede correlacionarse mejor con la IgE específica de alérgenos en el nivel de reconocimiento de epítopos. Se ha informado de que los pacientes con reacciones alérgicas persistentes o más graves reconocen un mayor número de epítopos de IgE, lo que sugiere que el mapeo de epítopos es una herramienta adicional para el diagnóstico y la predicción de alergias. Se han utilizado inmunoensayos basados en membranas SPOT para el mapeo de epítopos. En este sistema, los péptidos se sintetizan en la membrana y se incuban con los sueros del paciente. El procedimiento requiere una gran cantidad de péptidos y, por lo tanto, es propenso a errores, requiere mucho tiempo, requiere mucha mano de obra y es costoso. Los inmunoensayos en este formato también requieren un gran volumen de suero del paciente.
El desarrollo de tecnologías de ensayo multiplex, como las micromatrices, y los avances en las técnicas de síntesis de péptidos han mejorado el mapeo de epítopos de alérgenos alimentarios. Los inmunoensayos en formato de micromatrices pueden analizar miles de péptidos diana en paralelo utilizando pequeños volúmenes de suero diluido, lo que reduce en gran medida el costo y permite una mejor replicación y aproximaciones estadísticas al análisis. Desafortunadamente, la prueba basada en micromatrices no tiene un alto rendimiento y con frecuencia requiere múltiples réplicas para superar las limitaciones en la reproducibilidad.
Los formatos de ensayo de alto rendimiento tienen la ventaja de procesar rápidamente múltiples muestras de pacientes de forma automatizada y se han desarrollado para su aplicación a procedimientos de examen multiplex. Multiplexación basada en perlas, como la tecnología LUMINEX/xMAP, utiliza perlas de poliestireno de 5,6 pm teñidas con fluoróforos rojos e infrarrojos. Usando diferentes cantidades de cada uno de los dos fluoróforos, se pueden producir hasta 500 firmas espectrales específicas diferentes y teóricamente es posible hasta 500 pruebas en un solo volumen de reacción. En el ensayo de proteínas típico, los anticuerpos se conjugan a la superficie de las perlas para capturar el analito de interés. Los anticuerpos de detección biotinilados específicos del analito de interés se unen a continuación para formar un sándwich anticuerpo-antígeno. La interacción de la biotina con una estreptavidina conjugada con ficoeritrina (SA-PE) se utiliza para marcar el complejo. Para detectar el analito, las perlas se leen en un instrumento de detección basado en flujo de láser dual. Un láser clasifica la perla según los colorantes incorporados y determina el analito que se está detectando. El segundo láser determina la magnitud de la señal derivada de PE, que es directamente proporcional a la cantidad del analito unido. Tales ensayos reducen la cantidad de anticuerpo de captura y de muestra requerida en comparación con un ensayo de placa ELISA, reduciendo así el costo y conservando material de muestra raro o difícil de obtener. El intervalo dinámico y la sensibilidad del ensayo también se mejoran generalmente.
La alergia a la leche de vaca (CMA) es una de las alergias alimentarias más comunes en los niños. Por lo general, implica sensibilidad a varias de las proteínas componentes de la leche de vaca. Estos incluyen proteínas en la fracción de caseína (as -i-, as-2-, p- y K-caseína), a-lactoalbúmina y p-lactoglobulina. Tanto los epítopos conformacionales como los secuenciales pueden provocar respuestas de anticuerpos. Aunque la mayoría de los niños finalmente superan su CMA (es decir, se vuelven clínicamente tolerantes), algunos conservan su sensibilidad en la edad adulta. Los mecanismos que contribuyen al desarrollo de la tolerancia clínica no se comprenden bien, pero se plantea la hipótesis de que los anticuerpos IgE de aquellos con CMA persistente pueden reconocer ciertos epítopos de las proteínas de la leche de vaca que no son reconocidos por los anticuerpos IgE de pacientes que probablemente superen su alergia.
El análisis de epítopos, como el reconocimiento de epítopos secuenciales, puede proporcionar información útil sobre la persistencia de CMA. Los resultados de la micromatriz de péptidos han mostrado una correlación con las características clínicas de la alergia a la leche, es decir, los pacientes con alergia a la leche y los pacientes tolerantes a la leche evidenciaron diferentes patrones de reconocimiento de epítopos. También se demostró que los cambios en la unión relativa de IgE e IgG4 a los péptidos de la leche se correlacionaban con la presencia de alergia o con una mejoría clínica.
MATSUMOTO y col., Peptides, (20090000), vol. 30, no. 10, páginas 1840-1847 considera el análisis basado en matrices de péptidos de la IgE e IgG4 específicas en los alérgenos de la leche de vaca y su uso en la evaluación de alergias,
LIN y col., Journal of Allergy and Clinical Immunology, (20090000), vol. 124, no. 2, páginas 315 - 322, se refiere al desarrollo de una nueva micromatriz de péptidos para el mapeo de epítopos a gran escala de alérgenos alimentarios,
WANG y col., Journal of Allergy and Clinical Immunology, (20100000), vol. 125, no. 3, páginas 695 - 702 considera una correlación de IgE/IgG4 epítopos de la leche y afinidad de los anticuerpos IgE específicos de la leche con diferentes fenotipos de alergia clínica a la leche,
El procedimiento del documento WO2015/015043A1 que permite hacer un pronóstico sobre el número de reacciones que se producirán durante la inmunoterapia oral (ITO) contra las proteínas de la leche de vaca y/o una estimación del tiempo de tratamiento necesario para lograr la tolerancia o la desensibilización durante la ITO a las proteínas de la leche de vaca y/o la necesidad de premedicación durante la ITO en un sujeto humano.
Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de identificar epítopos informativos que sean útiles para diagnosticar la CMA y para predecir el resultado clínico de la CMA. También existe la necesidad de nuevas plataformas de ensayo que superen las deficiencias de los inmunoensayos de micromatrices y proporcionen un alto rendimiento, una mayor flexibilidad, un volumen de muestra reducido y un costo más bajo, con un flujo de trabajo similar. La presente invención aborda estas necesidades.
RESUMEN
La invención se refiere a péptidos que contienen epítopos alergénicos de proteínas de la leche de vaca que son útiles para el diagnóstico de CMA, para detectar el desarrollo de tolerancia clínica a las proteínas de la leche de vaca y para monitorizar los aumentos y disminuciones en la intensidad de la respuesta alérgica.
En una primera realización, la invención proporciona un procedimiento para diagnosticar una alergia a la leche en un sujeto que comprende:
a) proporcionar una pluralidad de péptidos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33, donde la pluralidad de péptidos consiste en los 33 péptidos de SEQ ID NOs:1-33, un subconjunto de 20-25 péptidos, un subconjunto de 15-20 péptidos, un subconjunto de 10-15 péptidos, un subconjunto de 5-10 péptidos o un subconjunto de 2-5 péptidos, cada péptido conjugado con un soporte sólido identificable por separado ;
b) poner en contacto cada soporte sólido con suero obtenido del sujeto en condiciones suficientes para permitir la unión de inmunoglobulina asociada a alergia (AAI) en el suero al péptido en cada soporte sólido para formar un complejo péptido-IgE;
c) unir un reactivo de marcaje específico de AAI al complejo péptido-AAI; y
d) analizar la unión del reactivo de marcaje a cada complejo péptido-AAI para identificar péptidos reconocidos por la AAI en el suero del sujeto;
donde el reconocimiento de al menos un péptido por la AAI en el suero del sujeto indica que el sujeto es alérgico a la leche.
En una realización, se detectan IgG e IgE.
En una realización, la IgG es IgG4.
En una realización, la pluralidad de péptidos está representada por SEQ ID NOs:1-9, SEQ ID NOs:10-15, SEQ ID NO: 16-23, SEQ ID NOs:24-27, SEQ ID NOs:28-33, y combinaciones de los mismos.
La invención también proporciona un procedimiento para detectar el desarrollo de tolerancia clínica o un aumento en la intensidad de la alergia a la leche en un sujeto que es alérgico a la leche que comprende:
a) proporcionar un perfil inicial de reactividad de inmunoglobulina asociada a alergia (AAI) del suero del sujeto a una pluralidad de péptidos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33, donde la pluralidad de péptidos consiste en los 33 péptidos de SEQ ID NO: 1-33, un subconjunto de 20-25 péptidos, un subconjunto de 15-20 péptidos, un subconjunto de 10-15 péptidos, un subconjunto de 5-10 péptidos, o un subconjunto de 2-5 péptidos, donde el perfil inicial define un número inicial de péptidos reconocidos por AAI en el suero del sujeto o una concentración inicial de AAI en el suero del sujeto que reconoce cada péptido;
b) proporcionar la pluralidad de péptidos, cada uno de ellos conjugado con un soporte sólido identificable por separado;
c) poner en contacto cada soporte sólido con suero obtenido del sujeto en un momento posterior al perfil inicial en condiciones suficientes para permitir la unión de AAI en el suero al péptido en cada soporte sólido para formar un complejo péptido-AAI;
d) unir un reactivo de marcaje específico de AAI al complejo péptido-AAI; y
e) analizar la unión del reactivo de marcaje a cada complejo péptido-AAI para identificar un número posterior de péptidos reconocidos por AAI en el suero del sujeto o una concentración posterior de AAI en el suero del sujeto que reconoce cada péptido;
donde el desarrollo de tolerancia clínica a la leche es indicado cuando el número posterior de péptidos reconocidos por AAI en el suero del sujeto es menor que el número inicial de péptidos reconocidos por AAI en el suero del sujeto, o cuando la concentración posterior de AAI en el suero del sujeto que reconoce al menos un péptido es menor que la concentración inicial de AAI en el suero del sujeto que reconoce el al menos un péptido, y
donde se indica una mayor intensidad de la respuesta alérgica cuando el número posterior de péptidos reconocidos por AAI en el suero del sujeto es mayor que el número inicial de péptidos reconocidos por AAI en el suero del sujeto, o cuando la concentración posterior de AAI en el suero del sujeto que reconoce al menos un péptido es mayor que la concentración inicial de AAI en el suero del sujeto que reconoce el al menos un péptido.
En una realización, se usa un patrón de reducción cuantitativa en la reactividad de AAI con péptidos seleccionados para predecir el desarrollo de tolerancia clínica a la leche alergénica en el sujeto o se usa un patrón de reactividad de AAI cuantitativamente aumentada con péptidos seleccionados para predecir el aumento de la intensidad de la alergia a la leche a lo largo del tiempo.
La invención también proporciona un conjunto de péptidos que contienen epítopos alergénicos para la detección de alergia a la leche que consiste en una pluralidad de péptidos representados por SEQ ID NOs:1-33, donde la pluralidad de péptidos consiste en los 33 péptidos de SEQ ID NOs:1-33, un subconjunto de 15-20 péptidos, un subconjunto de 10-15 péptidos o un subconjunto de 5-10 péptidos.
En un aspecto específico de la primera realización, los péptidos que contienen epítopos alergénicos son una pluralidad de péptidos seleccionados del grupo que consiste en alergénicos Los péptidos que contienen el epítopo alergénico son una pluralidad de péptidos seleccionados de entre las SEQ ID NOs:1-33:
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Los péptidos útiles en procedimientos para el diagnóstico de CMA, para detectar el desarrollo de tolerancia clínica a las proteínas de la leche de vaca y para detectar aumentos y disminuciones en la intensidad de la alergia también pueden incluir péptidos que contienen epítopos no reactivos de proteínas de la leche de vaca. Estos péptidos son útiles como controles negativos. En aspectos específicos, los péptidos que contienen epítopos de control negativo son uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en epítopos peptídicos no reactivos de aS2-caseína, p-caseína y p-lactoglobulina. En una realización específica adicional, los péptidos que contienen epítopos no reactivos son uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en:
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BREVE DESCRI PCI ÓN DE LOS DI BUJOS
La Fig. 1 ilustra la reactividad sérica a lo largo del tiempo al panel de péptidos de SEQ ID. NOs:1-33 de un individuo tolerante a la leche de vaca que recibe inmunoterapia para CMA.
La Fig. 2 ilustra la reactividad sérica a lo largo del tiempo al panel de péptidos de SEQ ID. NOs:1-33 de un individuo con CMA que se desensibilizó en respuesta a la inmunoterapia para CMA.
La Fig. 3 ilustra la reactividad sérica a lo largo del tiempo al panel de péptidos de SEQ ID. NOs:1-33 de un individuo con CMA que respondió parcialmente a la inmunoterapia para CMA.
En los dibujos, los péptidos identificados que comienzan con "a" representan "alfa", los péptidos identificados que comienzan con "b" representan "beta" y los péptidos identificados que comienzan con "k" representan "kappa".
DESCRI PCI ÓN DETALLADA
Antes de describir diversas realizaciones ejemplares de la invención, se debe entender que la invención no se limita a los detalles de la construcción o a las etapas del procedimiento establecidos en la siguiente descripción. La invención es capaz de otras realizaciones y de ponerse en práctica o llevarse a cabo de varias formas.
La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a "una realización", "ciertas realizaciones", "una o más realizaciones" o "una realización" significa que un rasgo, estructura, material o característica particular descrito en relación con la realización está incluido en al menos una realización de la invención. Por lo tanto, las apariciones de las frases como "en una o más realizaciones", "en ciertas realizaciones", "en una realización" o "en una realización" en varios lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no se refieren necesariamente a la misma realización de la invención. Además, los rasgos, estructuras, materiales o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.
Como se usa en esta invención, los términos "inmunoglobulina asociada a alergia" y "AAI" se refieren a inmunoglobulinas en sueros que median la hipersensibilidad a los alérgenos alimentarios. Estos incluyen uno o más de IgE, IgA e IgG (incluida IgG4).
Como se usa en esta invención, los términos "reactivo", "reactividad", "reconocer" y similares se refieren a la capacidad de una inmunoglobulina asociada a alergia para unirse a un péptido que contiene epítopos alergénicos. El nivel de reactividad indica la concentración de AAI en el suero, con alta reactividad asociada con concentraciones más altas de AAI y reactividad más baja asociada con concentraciones más bajas de AAI. La concentración relativa de AAI (es decir, la reactividad sérica relativa) se determina mediante la cantidad de señal detectada en el ensayo. El nivel de reactividad de AAI a los péptidos que contienen epítopos alergénicos también indica la intensidad de la respuesta alérgica, es decir, mayor reactividad está asociada con una reacción alérgica más intensa.
Como se usa en esta invención, el término "tolerancia clínica" se refiere a la tolerancia inmunológica a un alérgeno alimentario que es desarrollada por un sujeto alérgico como resultado de la exposición al alérgeno, es decir, tolerancia desarrollada como resultado de la inmunoterapia.
Como se usa en esta invención, el término "tolerancia natural" se refiere a la tolerancia inmunológica a un alérgeno alimentario que es desarrollada por un sujeto alérgico como un proceso bioquímico a lo largo del tiempo, ya sea como resultado de la exposición natural al alérgeno durante su vida o en ausencia de exposición.
Debe entenderse que aunque los péptidos que contienen epítopos alergénicos descritos en esta invención se describen como que tienen secuencia de aminoácidos específica, un experto en la materia reconocerá que cada uno de tales péptidos puede desplazarse en la dirección N-terminal o C-terminal de la proteína de la que se deriva para obtener una secuencia peptídica relacionada que todavía contiene el epítopo relevante pero en la que el epítopo relevante está flanqueado por aminoácidos diferentes a los especificados.
Los péptidos que contienen epítopos alergénicos representados por SEQ ID NOs:1-33 se identificaron en una biblioteca de péptidos derivados de aS1-caseína, aS2-caseína, p-caseína, p-lactoglobulina y K-caseína con una puntuación z en individuos altamente alérgicos de más de 10. En sujetos muy alérgicos, los treinta y tres péptidos de SEQ ID NOs:1-33 son reactivos con sueros. A la inversa, en sujetos no alérgicos, ninguno de los treinta y tres péptidos de SEQ ID NOs:1-33 son reactivos con sueros. Los péptidos individuales de SEQ ID NOs:1-33 también proporcionan un continuo de reactividad que es útil para determinar la intensidad de CMA en un individuo y para monitorizar los cambios en la intensidad de CMA a lo largo del tiempo. Los individuos que tienen intensidades de alergia a la leche de vaca que se encuentran entre los no reactivos y los más altamente reactivos tienen sueros que son reactivos con algunos, pero no con todos, los péptidos entre SEQ ID NOs:1-33. En general, el número de péptidos entre SEQ ID NOs:1-33 que son reactivos con los sueros de estos individuos se correlaciona positivamente con la intensidad de la alergia, es decir, cuanto más intensa es la alergia, más péptidos entre SEQ ID NOs:1-33 son reactivos con los sueros. Los sueros de individuos con alergia leve son reactivos con menos péptidos que los sueros de individuos con alergia más intensa. Por lo tanto, la invención no solo proporciona procedimientos para diagnosticar la CMA, proporciona procedimientos para determinar la intensidad de la alergia y procedimientos para determinar los cambios en la intensidad de la alergia a lo largo del tiempo, incluida la detección del desarrollo de tolerancia clínica a las proteínas de la leche de vaca.
En ciertos aspectos de la invención, el número de péptidos que contienen epítopos alergénicos dentro del grupo de SEQ ID NOs:1-33 que son reactivos con los sueros de un sujeto con CMA tiene una correlación positiva con la intensidad de la respuesta alérgica, es decir, la reactividad con menos péptidos indica una respuesta alérgica más leve a la leche de vaca y la reactividad con más péptidos indica que el sujeto es más altamente alérgico a la leche de vaca. En otro aspecto de la invención, la intensidad de unión de la IgE sérica a los péptidos representados por SEQ ID NOs:1-33 (una medida de la concentración de IgE en los sueros) se correlaciona con la intensidad de la respuesta alérgica, es decir, una reactividad más débil con los treinta y tres péptidos, o con un subconjunto de los treinta y tres péptidos, indica una respuesta alérgica más moderada en comparación con una reactividad más fuerte con los treinta y tres péptidos o con el subconjunto de péptidos. Como se usa en esta invención, la referencia a reactividad "no reactiva" o "negativa" con un péptido que contiene epítopos alergénicos significa una relación señal/ruido (S/N) en el ensayo que es inferior a aproximadamente 2. Una señal de fondo típica (N) es la generada por un grupo de sueros de individuos no alergénicos. Alternativamente, la invención contempla el uso de péptidos negativos como base para establecer la señal de fondo. Como se usa en esta invención, la referencia a reactividad "débil" o "moderada" "moderada" con un péptido que contiene epítopos alergénicos significa una S/N de aproximadamente 2-10, aunque este valor puede variar dependiendo del péptido y la alergia. Como se usa en esta invención, la referencia a reactividad "alta" o "fuerte" con un péptido que contiene epítopos alergénicos significa una S/N de más de aproximadamente 10.
Los ensayos previamente conocidos para CMA basados en el análisis de epítopos peptídicos en proteínas de la leche de vaca son inmunoensayos competitivos que se basan en el análisis de la afinidad relativa de unión de IgE e IgG4 al epítopo. Se cree que la afinidad de la unión del anticuerpo está relacionada con si el sujeto desarrollará o no tolerancia clínica a la leche de vaca. Por el contrario, en un aspecto, la presente invención se basa en un análisis de la presencia o ausencia de la unión de AAI a cada péptido individual en un conjunto de epítopos clave de la proteína de la leche de vaca que se correlaciona con un diagnóstico de CMA, con la intensidad de la respuesta alérgica, y con el potencial de que un paciente desarrolle tolerancia o experimente una mayor respuesta alérgica en base al número de epítopos (es decir, péptidos) unidos por IgE en el suero del sujeto. En un segundo aspecto, la invención se basa en el análisis de la concentración de AAI en sueros que son reactivos con cada uno de los péptidos que contienen epítopos alergénicos, lo que también se correlaciona con la intensidad de la respuesta alérgica.
Una realización de la invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar CMA en un sujeto que comprende proporcionar una pluralidad de péptidos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33, cada péptido conjugado a un soporte sólido identificable por separado, poner en contacto cada soporte sólido con suero obtenido del sujeto en condiciones suficientes para permitir la unión de AAI en el suero al péptido en cada soporte sólido para formar un complejo péptido-AAI, unir un reactivo de marcaje específico de AAI al complejo péptido-AAI, y analizar la unión del reactivo de marcaje a cada complejo péptido-AAI para identificar péptidos reconocidos por la AAI en el suero del sujeto. Si, después de la exposición a alérgenos de leche de vaca, al menos un péptido es moderada o altamente reactivo con la AAI sérica (S/N > 2) y la reactividad de uno o más de los péptidos reactivos no disminuye al menos 2 veces en aproximadamente seis meses, se diagnostica que el sujeto tiene CMA.
La reactividad sérica de un individuo tolerante a la leche de vaca después de la administración de inmunoterapia CMA se muestra en la Fig. 1. En este experimento, un individuo tolerante a la leche de vaca fue tratado con inmunoterapia para CMA y se tomaron muestras de suero con 6-12 meses de diferencia. Puede verse que la respuesta inicial a la inmunoterapia dio como resultado una reactividad moderada a alta con aproximadamente once de los péptidos (barras azules, S/N >2). Al cabo de seis meses (barras naranjas), hubo al menos una reducción de aproximadamente 2 veces en la reactividad para todos estos péptidos. Aunque kcas--04 estuvo en el intervalo de una reducción de reactividad ligeramente inferior a 2 veces, los péptidos más altamente reactivos (por ejemplo, as1-09, as1-44) exhibieron reducciones en la reactividad al cabo de seis meses que fueron sustancialmente mayores que 2 veces, en el intervalo de al menos 5 veces. Además, la reactividad de ninguno de los péptidos reactivos (S/N > 2) dejó de disminuir a los seis meses.
En otro aspecto del procedimiento, el análisis de unión del reactivo de marcaje a cada complejo péptido-AAI puede incluir el análisis del grado de unión, que indica una concentración de cada AAI específica de péptido en el suero. Una reactividad sérica de baja a moderada con todos los péptidos de SEQ ID NOs:1-33, o con un subconjunto de los mismos, indica una concentración más baja de AAI específica de péptido en el suero y CMA leve a moderada, mientras que una reactividad sérica alta con todos los péptidos, o un subconjunto de los mismos, indica una concentración más alta de AAI específica de péptido en el suero y CMA más grave. El análisis de la unión para el diagnóstico de CMA puede emplear el número de péptidos reactivos con los sueros, el grado de unión de la AAI sérica a los péptidos, o ambos.
En ciertos aspectos, la invención se refiere además a péptidos de proteínas de la leche de vaca que contienen epítopos que no son reactivos con los sueros de sujetos que son alérgicos a la leche de vaca, incluso si el sujeto es fenotípicamente altamente alérgico. Los sueros de sujetos no alérgicos tampoco son reactivos con estos péptidos. Estos péptidos están representados por SEQ ID NOs:34, 35 y 36, y son útiles como controles negativos en realizaciones específicas de los ensayos para el diagnóstico de CMA. Tener un control negativo altamente fiable disponible para este propósito reduce la probabilidad de diagnósticos falsos positivos y determinaciones falsamente altas de concentración de AAI reactiva.
En realizaciones específicas, de los procedimientos para diagnosticar CMA en un sujeto usando una pluralidad (dos o más) de péptidos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33 incluyen ensayos en fase sólida. La pluralidad de péptidos seleccionados para su uso en el ensayo en fase sólida puede representar los 33 péptidos de SEQ ID NOs:1-33, un subconjunto de 5-10 péptidos, un subconjunto de 10-15 péptidos o un subconjunto de 15-20 péptidos. Los procedimientos también pueden emplear dos o más de tales subconjuntos de los péptidos. Cada uno de la pluralidad de péptidos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33 se proporciona conjugado con un soporte sólido, que puede ser una perla, una placa de microtitulación, un material cromatográfico (por ejemplo, un filtro) o cualquier otro soporte sólido adecuado. Cada perla, pocillo de placa de microtitulación o ubicación discreta en el material cromatográfico está ocupado por un único péptido seleccionado de entre SEQ ID NOs:1-33. A continuación, los soportes sólidos se ponen en contacto con suero obtenido del sujeto en condiciones apropiadas para la unión específica del anti-péptido AAIE en el suero (si está presente) al péptido en cada soporte sólido o ubicación discreta en un soporte sólido para formar un complejo péptido-AAI en el soporte sólido.
Cualquier complejo péptido-AAI formado en un soporte sólido se detecta a continuación poniendo en contacto el complejo en cada soporte sólido o ubicación discreta en el soporte sólido con un reactivo de marcaje que se une específicamente al complejo, típicamente al unirse al anticuerpo AAI en suero inmovilizado. Generalmente, se utilizará un único reactivo de marcaje para la detección universal de todos los complejos. El complejo péptido-AAI específico puede identificarse a continuación por su posición en la placa de microtitulación o soporte cromatográfico. Cuando el soporte sólido con el que se conjuga cada péptido tiene diferentes propiedades espectrales, el complejo péptido-AAI específico también puede identificarse mediante el análisis de las propiedades espectrales del soporte sólido asociado con el complejo péptido-AAI, una vez que se identifica la presencia de un complejo mediante una señal detectable del reactivo de marcaje unido al complejo. Como ejemplo, la presencia o ausencia de un complejo péptido-AAI en cada pocillo de una placa de microtitulación se puede determinar uniendo al complejo un anticuerpo AAI antihumano que está conjugado con una fracción reportera, como un colorante fluorescente, un colorante cromogénico, un marcador enzimático o un marcador radiactivo. Alternativamente, el anticuerpo AAI antihumano se puede conjugar con una fracción reportera que no es directamente detectable, por lo que es necesaria la unión específica de una segunda fracción reportera directamente detectable al reactivo de marcaje para el análisis de la unión.
En ciertos aspectos, los procedimientos para el diagnóstico de CMA son procedimientos cualitativos, es decir, basados únicamente en la presencia o ausencia de AAI reactiva a cada péptido seleccionado. Se puede considerar que la presencia de AAI moderada o altamente reactiva con cualquier péptido seleccionado indica algún grado de CMA, siempre que la reactividad no disminuya sustancialmente en un período de tiempo corto, tal como aproximadamente seis meses. Los procedimientos también pueden ser semicuantitativos, es decir, cuanto mayor es el número de péptidos reactivos con el suero del sujeto, relativamente más intensa es la alergia y, a la inversa, cuanto menor es el número de péptidos reactivos, relativamente menos intensa es la alergia. La reactividad sérica con 5-15 de los péptidos de s Eq ID NOs:1-33 puede indicar CMA leve a moderada, con reactividad dentro del extremo inferior de este intervalo generalmente caracterizada como CMA leve. La reactividad sérica con 16-33, 16­ 30, 16-25, 16-20, 16-18 o los 33 péptidos de SEQ ID NOs:1-33 puede indicar CMA de moderada a grave, con reactividad dentro del extremo inferior de este intervalo generalmente caracterizada como CMA moderada. En el intervalo medio, se puede considerar generalmente que la reactividad sérica con 10-20, 12-18 o 14-16 de los péptidos de SEQ ID NOs:1-33 indica CMA moderada. Es un rasgo particularmente útil de los péptidos de SEQ ID NOs:1-33 que generalmente no más de aproximadamente 8-10 son altamente reactivos (S/N > 10) con los sueros de individuos no alérgicos y, por lo tanto, proporcionan un mayor nivel de confianza en el resultado del ensayo de diagnóstico que los ensayos convencionales.
En otros aspectos, los procedimientos para el diagnóstico de CMA son procedimientos cuantitativos, es decir, basados en la cuantificación del nivel de reactividad de AAI a cada péptido seleccionado. En este ejemplo, el nivel de reactividad se correlaciona con la cantidad de reactivo de marcaje unido al complejo péptido-AAI, con niveles más altos de señal de la fracción reportera indicando una concentración más alta de una AAI específica de péptido particular en el suero. Para obtener la cantidad o concentración de fracción reportera unida a un complejo péptido-AAI en particular, la cantidad de fluorescencia de un colorante fluorescente, la intensidad del color de un colorante coloreado o cromogénico o de un marcador enzimático, o la cantidad de radiactividad de un marcador radiactivo se correlaciona positivamente con la cantidad de AAI unido en el complejo y, por tanto, con su concentración. Los procedimientos para medir estos parámetros son conocidos en la técnica. Se puede considerar que las cantidades relativas de AAI reactiva con cualquiera de los péptidos indican el grado o la intensidad de CMA. Es decir, cuanto más alto es el nivel de reactividad de la pluralidad de péptidos seleccionados, o de uno o más péptidos dentro de los péptidos seleccionados, más intensa es la alergia. A la inversa, cuanto más bajo es el nivel de reactividad de la pluralidad de péptidos seleccionados, o de uno o más péptidos dentro de los péptidos seleccionados, menos intensa es la alergia.
Un ensayo cuantitativo particularmente útil para su uso en cualquiera de los procedimientos de la invención es un ensayo de perlas de péptidos multiplex para análisis de citometría de flujo, como el ensayo de perlas multiplex LUMINEX exMAP, que es una alternativa de alto rendimiento al ELISA. En este ensayo, se utilizan como soporte sólido perlas de poliestireno (microesferas) teñidas con distintas proporciones de fluoróforos rojo e infrarrojo cercano. Los péptidos pueden enlazarse químicamente a las perlas o unirse a las mismas mediante anticuerpos de captura específicos del péptido que recubren las perlas. Las proporciones de los fluoróforos definen una "dirección espectral" para cada población de perlas que puede identificarse mediante un citómetro de flujo utilizando procesamiento de señales digitales. La detección de un tercer color de fluorescencia se usa para medición de la intensidad de fluorescencia de la fracción reportera del reactivo de marcaje unido a la perla. Se pueden detectar múltiples analitos simultáneamente uniendo cada péptido seleccionado de entre SEQ ID NOs:1-33 a una perla que tiene una "dirección espectral" específica. El contacto de las perlas con suero que contiene AAI que son específicas para el péptido unido a él va seguido de la adición de anticuerpos AAI antihumanos conjugados con una fracción reportera. En un ejemplo, la fracción reportera de la AAI antihumana es biotina y la unión a estreptavidina conjugada con ficoeritirina (PE) proporciona la señal fluorescente para la detección. Después de la unión del reactivo de marcaje, las perlas se analizan en un instrumento de detección de flujo de láser dual, como el analizador LUMINEX 200 o Bio-Rad BIO-PLEX. Un láser clasifica la perla e identifica el péptido unido a ella. El segundo láser determina la magnitud de la señal derivada de la reportera, que es directamente proporcional a la cantidad de la AAI sérica unida.
Debido a que se puede cuantificar el grado de unión de cada AAI específica de péptido al complejo péptido-AAI en el soporte sólido, la pluralidad de péptidos seleccionados de entre los péptidos representados por SEQ ID NOs:1-33 también son útiles en procedimientos para detectar un aumento en la intensidad de CMA a lo largo del tiempo en un sujeto diagnosticado con CMA o desarrollo de CMA a lo largo del tiempo en un sujeto inicialmente diagnosticado como no alérgico. Se realiza un ensayo inicial en una pluralidad de péptidos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33 como se describió anteriormente para proporcionar un número inicial de péptidos reactivos o una concentración inicial de cada AAI específica de péptido. En un momento posterior al ensayo inicial, el análisis se repite con la misma pluralidad de péptidos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33 como perfil inicial para obtener un número posterior de péptidos reactivos o una concentración posterior de AAI específica de péptido. Este procedimiento se puede resumir de la siguiente manera: proporcionar un perfil inicial de la reactividad de AAI sérica de un sujeto a una pluralidad de péptidos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33, donde el perfil inicial indica un número inicial de péptidos reconocidos (unidos) por AAI en el suero del sujeto o una concentración inicial de AAI en el suero del sujeto que reconoce (se une a) cada péptido; en un momento posterior al perfil inicial, poner en contacto cada péptido de la misma pluralidad de péptidos conjugados con un soporte sólido identificable por separado con suero del sujeto en condiciones suficientes para permitir la unión de AAI en el suero al péptido en cada soporte sólido, formando un complejo péptido-AAI; unir un reactivo de marcaje específico de AAI al complejo, y; analizar la unión del reactivo de marcaje a cada complejo péptido-AAI para identificar un número posterior de péptidos reconocidos por AAI en el suero del sujeto o una concentración posterior de AAI en el suero del sujeto que reacciona con cada péptido seleccionado.
Un formato de ensayo alternativo útil en la invención es un ensayo de flujo lateral o inmunocromatográfico. En tal ensayo, el epítopo alergénico seleccionado que contiene el péptido o péptidos se inmovilizan en el soporte poroso y el suero que contiene la AAI se pone en contacto con el péptido o los péptidos para formar inmunocomplejos. La migración adicional del inmunocomplejo a través del soporte poroso lo pone en contacto con un reactivo de captura específico para la detección del inmunocomplejo utilizando reactivos de detección apropiados.
Los procedimientos para detectar un aumento en la intensidad de la alergia pueden hacer uso de cualquier formato de ensayo apropiado, incluidos los descritos anteriormente. Ejemplos de los tipos de análisis disponibles para analizar la unión del reactivo de marcaje también son los descritos anteriormente. Un aumento en el número de péptidos reactivos con AAI en el momento posterior en comparación con el perfil inicial (incluido un aumento en comparación con ningún péptido reactivo con AAI en el perfil inicial), o un aumento en la intensidad de unión de AAI a cualquiera de los péptidos en el momento posterior en comparación con el perfil inicial (incluido un aumento desde la ausencia de unión a un péptido particular en el perfil inicial hasta la unión detectable en el momento posterior), indica un aumento en la intensidad de CMA en un sujeto previamente diagnosticado con CMA o desarrollo de CMA en el sujeto previamente no alérgico. Como se discutió anteriormente, la comparación del perfil inicial de un sujeto con el de un momento posterior puede usarse para predecir el aumento de la gravedad del sujeto o la tolerancia más baja en una alergia particular, o para predecir la probabilidad de desarrollo de tolerancia clínica o natural al alérgeno.
La pluralidad de péptidos seleccionados de entre los péptidos representados por SEQ ID NOs:1-33 también son útiles en procedimientos para detectar el desarrollo de tolerancia clínica a las proteínas de la leche de vaca en un sujeto diagnosticado con CMA. En estas realizaciones, el ensayo generalmente como se describió anteriormente para la detección de un aumento en la intensidad de la alergia, se realiza primero en un momento inicial para establecer un perfil inicial de reactividad de AAI sérica con la pluralidad de péptidos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33. El perfil inicial se basa en el análisis semicuantitativo o cuantitativo de la reactividad sérica con los péptidos seleccionados, como se discutió anteriormente. Los péptidos seleccionados conjugados con los soportes sólidos a continuación se ponen en contacto con el suero del sujeto obtenido en un momento posterior al perfil inicial y el ensayo se lleva a cabo como se indicó anteriormente con semicuantificación o cuantificación de la intensidad de CMA en el momento posterior. Una reducción en el número de péptidos reactivos con AAI en el momento posterior en comparación con el perfil inicial, o una reducción en la intensidad de la unión de AAI a cualquiera de los péptidos en el momento posterior en comparación con el perfil inicial, particularmente una reducción de al menos 2 veces, indica el desarrollo de tolerancia clínica a las proteínas de la leche de vaca. Se apreciará que el desarrollo de tolerancia clínica a las proteínas de la leche de vaca en un sujeto previamente diagnosticado con CMA también indica una disminución en la intensidad de la alergia durante el período de tiempo entre el perfil inicial y el momento posterior, y que el procedimiento también puede usarse para detectar y predecir tales disminuciones en la intensidad de la alergia a lo largo del tiempo.
Como ejemplo, la reactividad sérica de un individuo alérgico a CMA se muestra en la Fig. 2. En este experimento, un individuo alérgico a la leche de vaca fue tratado con inmunoterapia para CMA y se tomaron muestras de suero 6 meses y 12 meses después. Puede verse que la respuesta inicial a la inmunoterapia implicaba una reactividad moderada a alta con aproximadamente 15-17 péptidos (es decir, S/N >2, barras azules). A los seis meses, la reactividad sérica había disminuido más de 2 veces para todos los péptidos más reactivos (barras naranjas). La reducción en la reactividad para ciertos péptidos estuvo en el intervalo de 4 a 7 veces (por ejemplo, as1-03, as1-09, as1-57, as1-44, bcas-01). Se observó poca o ninguna reducción adicional en la reactividad a los 12 meses (barras grises), y ninguno de los péptidos inicialmente más reactivos volvió a niveles no reactivos (S/N < 2). Este individuo se volvió insensible a la leche de vaca durante el transcurso de la inmunoterapia, lo que demuestra que el ensayo detectó con éxito el desarrollo de tolerancia clínica a las proteínas de la leche de vaca en un sujeto diagnosticado con CMA.
Varios péptidos del panel fueron altamente reactivos con los sueros del individuo mostrado en la Fig. 2 (S/N > 10). De forma similar, los sueros del individuo analizado en la Fig. 3 fueron de moderada a altamente reactivos con al menos aproximadamente 15 péptidos, lo que indica alergia a la leche de vaca. En contraste, sin embargo, a los seis meses (barras naranjas) menos de todos los péptidos inicialmente más reactivos exhibieron una reducción en la reactividad de al menos 2 veces. Ejemplos de reducción mínima en la reactividad < 2 veces se ven, por ejemplo, con as1-61, bcas-25 y bcas-53. El individuo mostrado en la Fig.3 solo respondió parcialmente a la inmunoterapia y, aunque hubo reducciones de más de 2 veces en la reactividad con algunos de los péptidos más altamente reactivos, el hallazgo de que algunos de los péptidos altamente reactivos no exhibieron una reducción similar en la reactividad puede ser una indicación de que es menos probable que la inmunoterapia dé como resultado la desensibilización completa o que la desensibilización completa puede requerir un tratamiento más prolongado con inmunoterapia.
También se reconocerá que el análisis de los treinta y tres péptidos representados por SEQ ID NOs:1-33 no siempre es necesario obtener resultados útiles en los procedimientos anteriores de la invención. Solo es necesario emplear un número suficiente de péptidos seleccionados de entre los péptidos representados por SEQ ID NOs:1-33 para proporcionar un resultado estadísticamente fiable. Por ejemplo, si no se conoce el estado de CMA de un sujeto, generalmente es deseable analizar un mayor número de péptidos que contienen epítopos alergénicos seleccionados de entre los péptidos representados por SEQ ID NOs:1-33 para asegurar que la CMA leve a moderada, que puede involucrar reactividad con solo algunos de los péptidos representados por SEQ ID NOs:1-33, es detectable. A la inversa, si se sabe que un sujeto tiene CMA de alta intensidad, menos péptidos que contienen epítopos alergénicos seleccionados de entre los péptidos representados por SEQ ID NOs:1-33 pueden ser suficientes para detectar cambios en la intensidad de la alergia o el desarrollo de tolerancia clínica, porque un mayor número de péptidos representados por SEQ ID NOs:1-33 serán inicialmente reactivos. Sin embargo, debido a que los cambios en la intensidad de la alergia y el desarrollo de tolerancia clínica se evidencian por cambios en el número de péptidos reactivos con los sueros, así como cambios en la concentración de IgE sérica reactiva con un péptido particular, es particularmente deseable incluir en los ensayos un conjunto suficientemente grande de péptidos seleccionados de entre los péptidos representados por SEQ ID NOs:1-33 para asegurar que no se pierdan los cambios con respecto a un péptido que es diagnóstico para un sujeto particular. Por consiguiente, la pluralidad de péptidos que contienen epítopos alergénicos seleccionados de entre péptidos representados por SEQ ID NOs:1-33 para su uso en cualquiera de los procedimientos anteriores puede representar los 33 péptidos de SEQ ID NOs:1-33, un subconjunto de 20-25 péptidos, un subconjunto de 15-20 péptidos, un subconjunto de 10-15 péptidos, un subconjunto de 5-10 péptidos o un subconjunto de 2-5 péptidos. A modo de ejemplo, se ha descubierto que en muchos casos los péptidos betalac (SEQ ID NOs:24-27) son sustancialmente menos reactivos, o no reactivos, con sueros de individuos alérgicos. Por consiguiente, puede ser deseable utilizar los SEQ ID NOs:1-23 (los péptidos AlfaS1, AlfaS2 y betacas) solos o con los SEQ ID NOs:28-33 (los péptidos kappacas) para determinadas aplicaciones. Cada uno de estos subgrupos también puede usarse solo en la invención si se desea.
Por comodidad del usuario, los reactivos para su uso en cualquiera de los procedimientos anteriores pueden empaquetarse juntos en forma de un kit que comprende una pluralidad de péptidos que contienen epítopos alergénicos seleccionados de entre los péptidos representados por SEQ ID. NOs:1-33 o cualquiera de los subgrupos útiles, un reactivo de marcaje que comprende un anticuerpo IgE antihumano conjugado con una primera fracción reportera y, opcionalmente (si se requiere para detección indirecta) una segunda fracción reportera que se une específicamente al reactivo de marcaje. El kit incluirá típicamente instrucciones para el uso de estos reactivos en uno o más de los procedimientos de la invención descritos anteriormente.
En determinadas realizaciones del kit, así como en los procedimientos de la invención, el anticuerpo AAI antihumano puede proporcionarse conjugado con una fracción reportera que puede detectarse directamente. Fracciones reporteras directamente detectables son aquellas que pueden identificarse y/o cuantificarse sin necesidad de unirse a un ligando específico. Ejemplos de fracciones reporteras directamente detectables que pueden conjugarse con el anticuerpo AAI antihumano incluyen colorantes fluorescentes, colorantes coloreados, colorantes cromogénicos y marcadores enzimáticos que pueden detectarse mediante una reacción química posterior y radiomarcadores. En otras realizaciones del kit, como en los procedimientos de la invención, el anticuerpo AAI antihumano puede proporcionarse conjugado con una fracción reportera que es detectable indirectamente, es decir, una fracción reportera que no es detectable por sí misma sino que experimenta una reacción o interacción con una segunda fracción reportera que comprende una fracción reportera directamente detectable, tal como un ligando específico para la fracción reportera conjugada con un marcador directamente detectable. Ejemplos de fracciones reporteras detectables indirectamente incluyen biotina, digoxigenina y otros haptenos que son detectables tras la unión posterior de un anticuerpo secundario (por ejemplo, antidigoxigenina) u otro ligando (por ejemplo, estreptavidina) que es marcado para detección directa. Se entenderá que cualquiera de estos reactivos de mareaje y fracciones reporteras son útiles en el formato de ensayo apropiado en los procedimientos anteriores de la invención y como componentes de los kits. En un ejemplo específico de un kit para realizar el ensayo multiplex de citometría de flujo descrito anteriormente, los componentes del kit pueden comprender una pluralidad de péptidos que contienen epítopos alergénicos seleccionados de entre los péptidos representados por SEQ ID NOs:1-33, un anticuerpo AAI antihumano biotinilado (reactivo de marcaje con primera fracción reportera) y estreptavidina conjugada con PE (segunda fracción reportera).
La pluralidad de péptidos que contienen epítopos alergénicos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33 para su inclusión en cualquiera de los kits anteriores puede representar los 33 péptidos de SEQ ID NOs:1-33, un subconjunto de 20-25 péptidos, un subconjunto de 15-20 péptidos, un subconjunto de 10-15 péptidos, un subconjunto de 5-10 péptidos o un subconjunto de 2-5 péptidos. La pluralidad de péptidos que contienen epítopos alergénicos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33 para su inclusión en cualquiera de los kits anteriores también puede representar uno o más de los subgrupos de péptidos relacionados (es decir, péptidos AlfaS1, AlfaS2, betacas, betalac y kappacas)
EJEMPLOS
Se obtuvieron sueros de individuos tolerantes a CM y CMA y se analizaron en el ensayo LUMINEX para obtener los resultados representativos mostrados en las Figs. 1-3. Se prepararon diluciones de tampón de lavado, sueros, perlas y anticuerpos según las instrucciones del fabricante. La placa de filtro se humedeció previamente con tampón durante 1 min. y el tampón se eliminó por vacío. Se añadieron 100 pl del cóctel de perlas a cada pocillo, el tampón se eliminó por vacío y las perlas se lavaron dos veces con 100 pl de tampón. Se añadieron 100 pl de dilución de suero a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas con agitación. Se aplicó vacío para eliminar el líquido. Las perlas se lavaron de nuevo dos veces con tampón. Se aplicaron 50 pl de la dilución de anticuerpo a cada pocillo y se incubaron durante 30 min. con agitación. Después de la aplicación de vacío, el pocillo se lavó tres veces. Se añadieron 100 pl de tampón a los pocillos y las muestras se transfirieron a una placa fija. Los pocillos se leyeron en el instrumento LUMINEX. Los resultados se muestran en las Figs. 1-3 y se discutieron anteriormente.
Apl icaciones adicionales de los procedimientos
Los conceptos de la invención con respecto a los péptidos que contienen epítopos alergénicos derivados de la leche de vaca y su uso para el diagnóstico de CMA, para detectar el desarrollo de tolerancia clínica a las proteínas de la leche de vaca y para detectar aumentos y disminuciones en la intensidad de la alergia también pueden aplicarse al desarrollo de otros paneles de péptidos que contienen epítopos alergénicos y su uso en el diagnóstico, detección de tolerancia y detección de aumentos y desarrollo de tolerancia a otras proteínas alergénicas.
En un aspecto adicional, la solicitud proporciona un procedimiento para detectar un aumento en la intensidad de la alergia a la leche de vaca en un sujeto a lo largo del tiempo, comprendiendo el procedimiento:
a) proporcionar un perfil inicial de la reactividad de IgE sérica del sujeto a una pluralidad de péptidos derivados de una o más proteínas alergénicas que se encuentran en el alimento, donde el perfil inicial define un número inicial de péptidos reconocidos por la IgE en el suero del sujeto o una concentración inicial de IgE en el suero del sujeto que reconoce cada péptido;
b) proporcionar la pluralidad de péptidos, cada uno de ellos conjugado con un soporte sólido identificable por separado
c) poner en contacto cada soporte sólido con suero obtenido del sujeto en un momento posterior al perfil inicial en condiciones suficientes para permitir la unión de IgE en el suero al péptido en cada soporte sólido para formar un complejo péptido-IgE;
d) unir un reactivo de marcaje específico de IgE al complejo péptido-IgE; y
e) analizar la unión del reactivo de marcaje a cada complejo péptido-IgE para identificar un número posterior de péptidos reconocidos por IgE en el suero del sujeto o una concentración posterior de IgE en el suero del sujeto que reconoce cada péptido;
donde un aumento en el número posterior de péptidos reconocidos por IgE en el suero del sujeto en comparación con el número inicial de péptidos reconocidos por IgE en el suero del sujeto, o un aumento en la concentración posterior de IgE en el suero del sujeto que reconoce al menos un péptido en comparación con la concentración inicial de IgE en el suero del sujeto que reconoce el al menos un péptido, indica una mayor intensidad en el sujeto de la respuesta alérgica al alimento.
Los reactivos y materiales usados en cualquiera de los procedimientos anteriores pueden empaquetarse en forma de un kit en el que la pluralidad de péptidos que contienen epítopos alergénicos, un reactivo de mareaje que comprende un anticuerpo anti-IgE conjugado con una primera fracción reportera y, opcionalmente, una segunda fracción reportera que se une específicamente al reactivo de marcaje se empaquetan juntos.
Aunque la invención en esta invención se ha descrito con referencia a realizaciones particulares, deberá entenderse que estas realizaciones son meramente ilustrativas de los principios y aplicaciones de la presente invención. Por lo tanto, se pretende que la presente invención incluya modificaciones y variaciones que estén dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para diagnosticar una alergia a la leche en un sujeto que comprende:
a) proporcionar una pluralidad de péptidos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33, donde la pluralidad de péptidos consiste en los 33 péptidos de SEQ ID NOs:1-33, un subconjunto de 20-25 péptidos, un subconjunto de 15-20 péptidos, un subconjunto de 10-15 péptidos, un subconjunto de 5-10 péptidos o un subconjunto de 2-5 péptidos, cada péptido conjugado con un soporte sólido identificable por separado;
b) poner en contacto cada soporte sólido con suero obtenido del sujeto en condiciones suficientes para permitir la unión de inmunoglobulina asociada a alergia (AAI) en el suero al péptido en cada soporte sólido para formar un complejo péptido-IgE;
c) unir un reactivo de marcaje específico de AAI al complejo péptido-AAI; y
d) analizar la unión del reactivo de marcaje a cada complejo péptido-AAI para identificar péptidos reconocidos por la AAI en el suero del sujeto;
donde el reconocimiento de al menos un péptido por la AAI en el suero del sujeto indica que el sujeto es alérgico a la leche.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde se detectan IgG e IgE.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, donde la IgG es IgG4.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la pluralidad de péptidos está representada por SEQ ID NOs:1-9, SEQ ID NOs:10-15, SEQ ID NOs:16-23, SEQ ID NOs:24-27, SEQ ID NOs:28-33, y combinaciones de los mismos.
5. Un procedimiento para detectar el desarrollo de tolerancia clínica o un aumento en la intensidad de la alergia a la leche en un sujeto que es alérgico a la leche que comprende:
a) proporcionar un perfil inicial de reactividad de inmunoglobulina asociada a alergia (AAI) del suero del sujeto a una pluralidad de péptidos seleccionados de entre SEQ ID NOs:1-33, donde la pluralidad de péptidos consiste en los 33 péptidos de SEQ ID NO: 1-33, un subconjunto de 20-25 péptidos, un subconjunto de 15-20 péptidos, un subconjunto de 10-15 péptidos, un subconjunto de 5-10 péptidos, o un subconjunto de 2-5 péptidos, donde el perfil inicial define un número inicial de péptidos reconocidos por AAI en el suero del sujeto o una concentración inicial de AAI en el suero del sujeto que reconoce cada péptido;
b) proporcionar la pluralidad de péptidos, cada uno de ellos conjugado con un soporte sólido identificable por separado;
c) poner en contacto cada soporte sólido con suero obtenido del sujeto en un momento posterior al perfil inicial en condiciones suficientes para permitir la unión de AAI en el suero al péptido en cada soporte sólido para formar un complejo péptido-AAI;
d) unir un reactivo de marcaje específico de AAI al complejo péptido-AAI; y
e) analizar la unión del reactivo de marcaje a cada complejo péptido-AAI para identificar un número posterior de péptidos reconocidos por AAI en el suero del sujeto o una concentración posterior de AAI en el suero del sujeto que reconoce cada péptido;
donde el desarrollo de tolerancia clínica a la leche es indicado cuando el número posterior de péptidos reconocidos por AAI en el suero del sujeto es menor que el número inicial de péptidos reconocidos por AAI en el suero del sujeto, o cuando la concentración posterior de AAI en el suero del sujeto que reconoce al menos un péptido es menor que la concentración inicial de AAI en el suero del sujeto que reconoce el al menos un péptido, y
donde se indica una mayor intensidad de la respuesta alérgica cuando el número posterior de péptidos reconocidos por AAI en el suero del sujeto es mayor que el número inicial de péptidos reconocidos por AAI en el suero del sujeto, o cuando la concentración posterior de a A i en el suero del sujeto que reconoce al menos un péptido es mayor que la concentración inicial de AAI en el suero del sujeto que reconoce el al menos un péptido.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, donde se usa un patrón de reducción cuantitativa en la reactividad de AAI con péptidos seleccionados para predecir el desarrollo de tolerancia clínica a la leche alergénica en el sujeto o se usa un patrón de reactividad de AAI cuantitativamente aumentada con péptidos seleccionados para predecir el aumento de la intensidad de la alergia a la leche a lo largo del tiempo.
7. Un conjunto de péptidos que contienen epítopos alergénicos para la detección de alergia a la leche que consiste en una pluralidad de péptidos representados por SEQ IDNOs:1-33, donde la pluralidad de péptidos consiste en los 33 péptidos de SEQ ID NOs:1-33, un subconjunto de 15-20 péptidos, un subconjunto de 10-15 péptidos o un subconjunto de 5-10 péptidos.
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