ES2899679T3 - Agentes de formación de imágenes - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula (I), **(Ver fórmula)** cuyo compuesto está radiomarcado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Description
DESCRIPCIÓN
Agentes de formación de imágenes
Campo de la invención
La presente invención se refiere a derivados de 4-(furo[3,2-c]piridin-4-ilo) radiomarcados y su uso como trazadores radiactivos, y en particular como agentes de formación de imágenes.
En particular, la presente invención se refiere a compuestos de 6-[2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil]-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1 H,3H)-diona radiomarcados y su uso como trazadores radiactivos y, en particular, como agentes de formación de imágenes.
Más particularmente, la invención se refiere al uso de compuestos de 6-[2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil]-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona radiomarcados como agentes de formación de imágenes de PET.
Antecedentes de la invención
Las neuronas dopaminérgicas en el cerebro humano juegan un papel central en la salud y función del cerebro. La neurotransmisión dopaminérgica es importante para el movimiento, la cognición y el comportamiento de recompensa. Se han identificado cinco neuroreceptores dopaminérgicos post-sinápticos (D1-D5).
La monoamina dopamina actúa a través de dos familias de GPCR para modular la función motora, los mecanismos de recompensa, los procesos cognitivos y otras funciones fisiológicas. Específicamente, la dopamina actúa sobre las neuronas a través de receptores tipo D1, que comprenden dopamina D1 y D5, que se acoplan principalmente a la proteína G Gs y, por lo tanto, estimulan la producción de cAMP, y los receptores tipo D2, que comprenden D2, D3 y D4, que se acoplan a las proteínas G Gi/q y que atenúan la producción de cAMP. Estos receptores se expresan ampliamente en diferentes regiones del cerebro.
Se han desarrollado fármacos basados en modos de acción antagonistas y agonistas en los receptores dopaminérgicos para la enfermedad de Parkinson, esquizofrenia, síndrome de piernas inquietas y TDAH, como se informa en Stocchi, F. et al. Advances in dopamine receptor agonists for the treatment of Parkinson’s disease. Expert Opin Pharmacother 2016, 17 (14), 1889-1902; Buckley, P. F. Broad therapeutic uses of atypical antipsychotic medications. Biol Psychiatry 2001, 50 (11), 912-924; y Davidson, M. A. ADHD in adults: a review of the literature. J Atten Disord 2008, 11 (6), 628-641.
Para algunos GPCR, sin embargo, ha resultado difícil desarrollar moléculas pequeñas o lograr suficiente selectividad debido al alto grado de homología en el sitio de unión del ligando entre subtipos, p.ej. dopamina D1 y D5 (tipo D1) o D2 y D3 y, por lo tanto, los fármacos existentes no están completamente exentos de efectos secundarios.
A pesar de los muchos esfuerzos realizados durante los últimos 15 años para disminuir la deserción en el desarrollo de fármacos, todavía hay menos del 10% de posibilidades de que un fármaco que ingresa en ensayos clínicos llegue al mercado.
La deserción es más alta para el desarrollo de fármacos oncológicos y del SNC, en particular con dianas nuevas con un conocimiento limitado de la biología. Para reducir la deserción de fármacos en los ensayos clínicos, existe una clara necesidad de desarrollar herramientas de evaluación traduccional confiables que permitan tomar decisiones más rápidas y mejores, como se ilustra en Woodcock, J. y al. The FDA critical path initiative and its influence on new drug development. Annu Rev Med 2008, 59, 1-12.
Debido a que no es posible acceder a los tejidos del cerebro en seres humanos vivos, el desarrollo de tales herramientas de traducción para apoyar el descubrimiento de fármacos del SNC tiene que depender, entre otras cosas, de técnicas no invasivas como formación de imágenes in vivo. En los últimos años, el uso de imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET) se ha desarrollado ampliamente para respaldar el descubrimiento de fármacos del SNC.
El PET es una técnica precisa y sofisticada que se basa en isótopos producidos en un ciclotrón. Se introduce un radionúclido emisor de positrones, p.ej. por inyección y se acumula en el tejido diana. A medida que se desintegra, emite un positrón que se combina rápidamente con un electrón cercano, lo que da como resultado la emisión simultánea de dos rayos gamma identificables en direcciones opuestas. Son detectados por una cámara PET y dan una indicación precisa de su origen. El PET es una técnica muy sensible y, por lo tanto, requiere una pequeña cantidad de compuestos radiomarcados que se denominan trazadores PET o agentes de formación de imágenes PET o ligandos PET.
La formación de imágenes por PET es particularmente adecuada ya que se basa en la incorporación de radioisótopos de átomos que están presentes en la mayoría de los candidatos a fármacos de moléculas pequeñas. Puede proporcionar información cuantitativa para respaldar el proceso de toma de decisiones en diferentes etapas del desarrollo de fármacos preclínicos y clínicos.
Por ejemplo, la formación de imágenes PET puede proporcionar información farmacocinética del cerebro en sujetos
vivos. Mediante el radiomarcaje directo de un fármaco candidato, se puede obtener información sobre la penetración de la barrera hematoencefálica (BBB) tanto en sujetos sanos como enfermos.
El desarrollo de un agente de formación de imágenes PET validado para la proteína/receptor tomado como objetivo por el programa de desarrollo de fármacos también brinda la oportunidad de evaluar, a través de estudios de bloqueo, la ocupación o unión a la diana de un candidato a fármaco. Estos estudios pueden proporcionar información crítica, como la relación entre la ocupación de la diana y la dosis administrada, así como la cinética de ocupación de la diana. Cuando se obtiene en la fase I del desarrollo clínico, dicha información puede ser decisiva para seleccionar el rango de dosis y el régimen más adecuados para los estudios POC de fase II.
Los estudios de imágenes de PET también pueden proporcionar alguna información sobre el mecanismo de acción de un fármaco candidato y pueden permitir la estratificación del paciente, el seguimiento de la progresión de la enfermedad o utilizarse como prueba de farmacología o como criterios de valoración objetivos en estudios POC de fase II.
El diseño de agentes de formación de imágenes PET requiere compuestos con propiedades específicas que no están necesariamente alineadas con las propiedades de los fármacos candidatos.
Las propiedades ideales necesarias para que los compuestos sean adecuados como agentes de formación de imágenes PET se han informado en Zhang, L et al. Strategies to facilitate the discovery of novel CNS PET ligands. EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry 2016, 1 (13), 1-12; Need, A et al. Approaches for the discovery of novel positron emission tomography radiotracers for brain imaging. Clin. Transl. Imaging 2017, 5 (3), 265-274; Pike, V. W. Considerations in the development of reversibly binding PET radioligands for brain imaging. Curr Med Chem. 2016, 23 (18), 1818-1869; Zhang, L. et al. Design and selection parameters to accelerate the discovery of novel central nervous system PET ligands and their application in the development of a novel phosphodiesterase 2A PET ligand. J Med Chem. 2013, 56 (11), 4568-4579. Sin embargo, la combinación apropiada de estas propiedades a menudo es complicada de lograr.
Además, más allá de la formación de imágenes in vivo, los trazadores radiactivos que se pueden utilizar in vitro o ex vivo, p.ej. en la autorradiografía de tejidos animales, son igualmente importantes en la toma de decisiones sobre el desarrollo de fármacos. Estos estudios ayudan a comprender el mecanismo de acción de los compuestos que modulan un receptor particular vinculado a una o más enfermedades, o a comprender los cambios en la densidad diana que resultan de la acción farmacológica de los compuestos.
Los receptores tipo D1 están involucrados en numerosas funciones fisiológicas y procesos de comportamiento. Por ejemplo, están involucrados en la plasticidad sináptica, la función cognitiva y las funciones motoras dirigidas a objetivos, pero también en los procesos de recompensa. Debido a su papel en varios procesos fisiológicos/neurológicos, los receptores tipo D1 han sido implicados en una variedad de trastornos que incluyen síntomas cognitivos y negativos en la esquizofrenia, deterioro cognitivo relacionado con la terapia antipsicótica clásica, impulsividad, trastorno de atención con hiperactividad (TDAH), enfermedad de Parkinson y trastornos del movimiento relacionados, distonía, enfermedad de Huntington, demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo leve (DCL), trastornos del sueño por adicción a las drogas y apatía.
Se han desarrollado algunos agentes de formación de imágenes PET para subtipos de neuroreceptores dopaminérgicos, como se informa en Prante, O. et al. Radioligands for the dopamine receptor subtypes. J labelled Comp Radiopharm 2013, 56 (3-4), 130-148.
Sin embargo, estos agentes de formación de imágenes PET presentan ciertos inconvenientes como la falta de selectividad para los receptores tipo D1, en particular en la neocorteza del cerebro, propiedades farmacocinéticas no adecuadas o generación de metabolitos radiactivos que penetran la barrera hematoencefálica y pueden alterar las medidas de cuantificación.
La mayoría de estos agentes de formación de imágenes PET también se basan en antagonistas más que en agonistas.
Por tanto, es deseable desarrollar agentes de formación de imágenes agonistas ortostéricos de receptores tipo D1, en particular agentes de formación de imágenes PET, porque serían más sensibles a los moduladores D1 ortostéricos, así como a los niveles de dopamina, el ligando D1 endógeno. Esto podría permitir un estudio más preciso sobre el efecto de los fármacos que se dirigen a ese sitio receptor y determinar los cambios en la estimulación del receptor en estados patológicos.
En años recientes, ha habido un interés renovado por desarrollar agonistas ortostéricos tipo D1 no selectivos de catecol o moduladores alostéricos que modulan la actividad de los receptores de dopamina, en particular el receptor D1, y que podrían usarse para tratar trastornos mediados por D1.
Los ligandos ortostéricos no de catecol D1 se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional publicada bajo el núm. WO 2014/072881.
Los moduladores alostéricos tipo D1 se describen, por ejemplo, en las solicitudes de patente internacional publicadas bajo el núm. WO 2014/193781 y el número WO2016/055479.
Dado este interés renovado, existe la necesidad de agentes de formación de imágenes selectivos tipo D1, en particular agentes de formación de imágenes PET tipo D1, que podrían utilizarse en pruebas in vitro, ex vivo o in vivo y también en estudios clínicos en humanos, ya sea para apoyar el desarrollo de candidatos a fármacos o para delinear las funciones del receptor D1 en patologías de interés.
Compendio de la invención
Por tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar compuestos que sean agonistas selectivos del receptor tipo D1 y que sean útiles como trazadores radiactivos, en particular como agentes de formación de imágenes PET. También es un objetivo de la presente invención proporcionar un método de formación de imágenes y cuantificación de la expresión del receptor D1 usando los compuestos según la presente invención.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para la detección in vitro o ex vivo y la cuantificación de la densidad del receptor tipo D1 disponible en tejidos cerebrales, con o sin un ligando endógeno o exógeno, método que comprende tratar el tejido con un compuesto radiomarcado según la presente invención y medir el nivel de unión de dicho compuesto radiomarcado.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para la detección in vivo y la cuantificación de la densidad del receptor tipo D1 disponible en el cerebro, con o sin un ligando endógeno o exógeno, método que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto radiomarcado según la presente invención y medir el nivel de captación cerebral de dicho compuesto radiomarcado en una región de interés relevante.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para la detección in vitro o ex vivo y la cuantificación del efecto de un PAM D1 sobre la disponibilidad del receptor D1 en tejidos cerebrales, método que comprende tratar el tejido con un compuesto radiomarcado según la presente invención en combinación con un PAM D1 y detectar el aumento de unión de dicho compuesto radiomarcado en presencia del PAM.
Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un método para la detección in vivo y la cuantificación del efecto de un PAM D1 sobre la disponibilidad del receptor D1 en el cerebro de un sujeto, método que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto radiomarcado según la presente invención, en combinación con la administración de un PAM D1 y detectar el aumento de la captación cerebral de dicho compuesto radiomarcado en una región de interés relevante en comparación con las condiciones iniciales.
Otros aspectos de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el resultado de un ensayo funcional del receptor D1 basado en células con un compuesto de fórmula (I), como se describe a continuación.
La figura 2 muestra imágenes PET in vivo del cerebro en monos usando un compuesto radiomarcado de fórmula (I) como se describe a continuación.
La figura 3 muestra experimentos de unión in vitro con un compuesto radiomarcado de fórmula (I) como se describe a continuación, y un antagonista D1 radiomarcado al receptor D1 recombinante humano en ausencia o presencia de un PAM D1.
La figura 4 muestra la autorradiografía de experimentos de unión ex vivo con un compuesto radiomarcado de fórmula (I) en tejidos cerebrales de primates no humanos (NHP), en ausencia o presencia de un PAM D1.
La figura 5 muestra imágenes PET de cerebro in vivo realizadas en monos en presencia de un compuesto radiomarcado de fórmula (I) con o sin un PAM D1, y las curvas de tiempo-actividad del valor de absorción estandarizado (SUV) asociadas.
La Figura 6 es un gráfico de potenciación que muestra el aumento del volumen de distribución (Vt) de un compuesto radiomarcado de fórmula (I) en diferentes regiones del cerebro después de la dosificación in vivo con un PAM D1.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), que está radiomarcado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
En particular, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde al menos uno de los hidrógenos es 3H; o al menos uno de los carbonos es un 11C; o el átomo de flúor es un 18F.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que uno de los carbonos es un 11C, en lo sucesivo denominado compuesto de fórmula (Ia).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el flúor es un 18F, denominado en lo sucesivo compuesto de fórmula (lb).
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde uno o más de los hidrógenos es 3H, en lo sucesivo denominado compuesto de fórmula (Ic),
El término "radiomarcado" como se usa en la presente memoria con referencia a un compuesto particular significa marcado con un isótopo radiactivo.
Un isótopo radiactivo es cualquiera de varias especies de un elemento químico con diferentes masas cuyos núcleos son inestables y disipan el exceso de energía emitiendo radiaciones espontáneamente en forma de rayos alfa, beta y gamma. Ejemplos específicos de isótopos radiactivos según la presente invención son 3H, 18F y 11C.
La presente invención incluye dentro de su alcance sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula (I) anteriores. Para el uso en medicina, las sales de los compuestos de fórmula (I) serán sales farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, otras sales pueden ser útiles en la preparación de los compuestos de uso en la invención o de sus sales farmacéuticamente aceptables. Los principios estándar que subyacen a la selección y preparación de sales farmacéuticamente aceptables se describen, por ejemplo, en Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, ed. P.H. Stahl y C.G. Wermuth, Wiley-VCH, 2002.
Con respecto a la presente invención, se pretende que la referencia a un compuesto o compuestos incluya ese compuesto en cada una de sus posibles formas isoméricas y mezclas de las mismas, a menos que se mencione específicamente la forma isomérica particular.
En particular, se pretende que la referencia a un compuesto o compuestos incluya ese compuesto en cada uno de sus posibles atropoisómeros.
Los atropoisómeros son estereoisómeros que surgen debido a la rotación obstaculizada alrededor de un enlace simple, donde las diferencias de energía debidas a la tensión estérica u otros contribuyentes crean una barrera a la rotación que es lo suficientemente alta como para permitir el aislamiento de los confórmeros individuales (ver por ejemplo Bringmann G. et al. Atroposelective Synthesis of Axially Chiral Biaryl Compounds. Angewandte Chemie International Edition. (2005) 44 (34): 5384-5427)
Los atropoisómeros se identifican generalmente como isómeros (+) y (-) y su configuración se determina midiendo la rotación óptica [a]D del compuesto en un polarímetro según métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
En una realización, la presente invención se refiere a un compuesto radiomarcado de fórmula (I) que es una mezcla 50:50 de atropisómeros (+) y (-). En una realización particular, la presente invención se refiere a un compuesto radiomarcado de fórmula (I) que consiste esencialmente en atropisómero (-).
El término "que consiste esencialmente" en referencia a un atropoisómero significa que el atropoisómero está presente en una proporción de al menos 95:5 con respecto al otro atropoisómero.
Los compuestos radiomarcados de fórmula (I) según la presente invención son agonistas ortostéricos de D1. Son particularmente ventajosos porque son selectivos para los receptores tipo D1 en comparación con los trazadores D1 radiomarcados existentes que también se unen al receptor de serotonina 5-HT2A.
Por tanto, en una realización, la presente invención se refiere a compuestos de fórmula (I) como se describe en la presente memoria que son agonistas ortostéricos selectivos del receptor de tipo D1.
Normalmente, los compuestos de fórmula (I) como se describen en la presente memoria tienen una afinidad por los receptores tipo D1, expresada en forma de un valor de pKi, que es al menos de aproximadamente 8, preferiblemente al menos de aproximadamente 9. Esto significa que los compuestos de la fórmula (I) como se describe en la presente memoria tiene una afinidad en el rango de nanomolar bajo por estos receptores. Los valores específicos se proporcionan en la sección experimental.
El experto en la técnica entenderá que los valores de pKi obtenidos con compuestos no radiomarcados de fórmula (I) son transponibles a los correspondientes compuestos radiomarcados.
Se realizaron ensayos de unión de radioligandos competitivos para medir la afinidad de los compuestos de fórmula (I) por el receptor D1 y evaluar su selectividad con respecto a un gran panel de 80 dianas biológicas relacionadas y no relacionadas. Se demostró que los compuestos de fórmula (I) se unen a los receptores D1 y D5 (en lo sucesivo denominados como "receptores tipo D1") con una afinidad en el rango subnanomolar y no se unen significativamente a ninguna de las otras dianas ensayadas.
Además, como se muestra en la Figura 1 y como se detalla más en la sección experimental, la actividad y potencia de los compuestos de fórmula (I) en un ensayo funcional basado en células D1 se realizaron y se compararon con la dopamina, el ligando agonista endógeno del receptor D1. En este ensayo, se demostró que el receptor D1 estaba activado in vitro por el compuesto de fórmula (I) probablemente por la dopamina. Además, los compuestos según la invención muestran una mejor potencia (valor de pEC50 de al menos 8) en comparación con el ligando endógeno dopamina. Los valores y condiciones específicos se detallan con más detalle en la sección experimental.
La evidencia mencionada aquí anteriormente y en la sección experimental apoya el hecho de que los compuestos radiomarcados de fórmula (I) son ligandos agonistas selectivos de los receptores tipo D1.
Esto hace a los compuestos radiomarcados de fórmula (I) como se describen en la presente memoria particularmente adecuados para su uso en estudios de formación de imágenes PET, ya sea solos o en combinación con moduladores ortostéricos o alostéricos D1 desarrollados para el tratamiento de enfermedades mediadas por D1.
En otra realización, la presente invención se refiere al uso de compuestos radiomarcados de fórmula (I) como se describe en la presente memoria para estudios in vitro o ex vivo.
En un aspecto particular según esta realización, la presente invención se refiere al uso de compuestos de fórmula (Ic) en estudios in vitro o ex vivo.
La presente invención también se refiere a un método para detectar la expresión del receptor D1 en el cerebro que comprende la incubación in vitro o ex vivo de una cantidad detectable de un compuesto radiomarcado de fórmula (I), como se describe en la presente memoria, y la detección de dicho compuesto radiomarcado.
Dicho método permite la cuantificación de la densidad del receptor D1 disponible en enfermedades en las que los receptores D1 juegan un papel.
El gráfico de la Figura 4 muestra que el compuesto de fórmula (Ic) se une significativamente en el putamen caudado de acuerdo con los niveles más altos de expresión del receptor D1 encontrados en la región del cuerpo estriado del tejido cerebral.
En otra realización, la presente invención se refiere al compuesto de fórmula (I) para su uso en estudios de formación de imágenes PET in vivo. En un aspecto de esta realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (Ia) o (Ib) para su uso en estudios de formación de imágenes PET in vivo.
En otra realización, la presente invención se refiere al compuesto de fórmula (I) para el uso de imágenes PET in vivo.
La Figura 2 muestra la formación de imágenes PET realizada con el compuesto de fórmula (Ia) en un mono cynomolgus y que demuestra un patrón de captación de acuerdo con la distribución informada de receptores tipo D1 en el cerebro.
En un aspecto particular de esta realización, la presente invención se refiere a compuestos de fórmula (I) para su uso en un método de diagnóstico in vivo de trastornos mediados por D1.
En otro aspecto particular de esta realización, la presente invención se refiere a compuestos de fórmula (I) como se describe en la presente memoria para su uso en un método de cuantificación in vivo de la densidad del receptor D1 disponible en enfermedades en las que los receptores D1 desempeñan un papel.
La presente invención también incluye dentro de su alcance un compuesto radiomarcado de fórmula (I), como se describe en la presente memoria, para su uso en un método de formación de imágenes in vivo y detección de trastornos neurológicos mediados por el receptor D1 que comprende administrar una cantidad detectable de un compuesto radiomarcado de fórmula (I), como se describe en la presente memoria, a un sujeto que lo necesite, o su sal farmacéuticamente aceptable, y detectar el compuesto radiomarcado unido al receptor D1.
Se han realizado algunos estudios in vivo con compuesto radiomarcado de fórmula (I), y en particular con compuesto de fórmula (Ia), que muestran que no existe ningún metabolito lipofílico asociado que pueda penetrar la barrera hematoencefálica y por tanto afectar a la cuantificación de la densidad del receptor D1 en estudios de formación de imágenes PET in vivo.
En otra realización más, la presente invención se refiere al uso de compuestos de fórmula (I) para cuantificar in vitro o ex vivo la unión a la diana de los ligandos ortostéricos D1.
La presente invención se refiere además a un método in vitro o ex vivo para medir la unión a la diana de los ligandos ortostéricos endógenos o exógenos del receptor D1.
En otra realización más, la presente invención se refiere a compuestos de fórmula (I) como se describe en la presente memoria para su uso en un método de formación de imágenes in vivo y medición de la unión a la diana de los agonistas ortostéricos del receptor tipo D1. En un aspecto particular de esta realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (la o Ib) para su uso en un método de formación de imágenes in vivo y medición de la unión a la diana de un agonista ortostérico del receptor tipo D1. El término "unión a la diana", como se usa en la presente memoria, significa una molécula endógena o exógena que interactúa con su proteína diana pretendida (receptor tipo D1) ortostérica o alostéricamente y que provoca un evento biológico corriente abajo.
Además, se ha descubierto sorprendentemente que algunos compuestos radiomarcados de fórmula (I) como se describen en la presente memoria son adecuados para cuantificar el efecto de compuestos que son moduladores alostéricos positivos del receptor D1 en in vitro, ex vivo e in vivo.
El término "moduladores alostéricos" significa un compuesto que se une a sitios diana distintos del agonista natural ortostérico pero que induce un cambio conformacional en el GPCR modulando así alostéricamente la función del receptor.
Los moduladores alostéricos positivos (PAM) potencian la actividad del ligando endógeno o la actividad de un agonista ortostérico exógeno.
Debido a que los PAM D1 actúan sobre el receptor D1 desde un sitio de unión diferente al del sitio ortostérico del ligando endógeno/exógeno, es deseable tener una forma de cuantificar el efecto real de estos compuestos sobre el receptor D1 para, por ejemplo, poder optimizar la dosis eficaz del compuesto PAM D1 que será necesaria para obtener el efecto terapéutico deseado sobre las enfermedades mediadas por D1.
Por lo tanto, en una realización particular, la presente invención se refiere al uso de compuestos de fórmula (I) como se describe en la presente memoria para la cuantificación in vitro o ex vivo del efecto de PAM D1 sobre el receptor D1.
En un aspecto de esta realización, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (Ic) en la cuantificación in vitro del efecto de PAM D1 sobre el receptor D1. Como se muestra en la Figura 3, el compuesto PAM D1 mejoró significativamente las propiedades de unión del compuesto de fórmula (Ic).
En un aspecto de esta realización, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (Ic) en la cuantificación ex vivo del efecto de PAM D1 sobre el receptor D1. En particular, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (Ic) en la cuantificación por autorradiografía del efecto de PAM D1 sobre el receptor D1.
La Figura 4 muestra por autorradiografía que en presencia de un compuesto PAM D1, la unión específica del compuesto (-)-Ic medido en cortes de cerebro NHP se aumenta significativamente.
Por lo tanto, la presente invención también incluye dentro de su alcance un método para la detección in vitro o por autorradiografía y la cuantificación de la expresión de los receptores tipo D1 y del efecto de un modulador alostérico D1 en la línea celular que expresa el receptor D1 o en tejidos cerebrales.
Los métodos de unión o autorradiografía de radioligando in vitro comprenden tratar la muestra biológica con un compuesto radiomarcado según la presente invención en presencia o ausencia de un ligando ortostérico o alostérico tipo D1 o D1 y cuantificar la expresión del receptor tipo D1 o el efecto de los moduladores alostéricos midiendo el compuesto radiomarcado unido resultante de la presente invención.
En otra realización particular, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (Ia) o (Ib) para su uso en la cuantificación in vivo del efecto de PAM D1 sobre el receptor D1.
Por lo tanto, la presente invención también incluye dentro de su alcance compuestos de fórmula (Ia) o (Ib) para uso en la detección in vivo y la cuantificación de la expresión de receptores tipo D1 y del efecto de un modulador alostérico D1.
En una realización particular, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (Ib) para su uso en la detección in vivo y la cuantificación de la expresión de receptores tipo D1 y del efecto de un modulador alostérico D1.
Como se muestra en la Figura 5, el compuesto PAM D1 mejoró significativamente las propiedades de unión del compuesto de fórmula (lb), en particular el compuesto de fórmula (-)-(Ib). El efecto de potenciación de dicho PAM D1 se muestra en la Figura 6.
Cuando en la presente memoria se hace referencia al "sujeto", se pretende hacer referencia a un ser humano, rata, ratón, gato, perro, caballo, oveja, vaca, primates humanos o no humanos, aves o anfibios. Preferiblemente se hace referencia a un ratón, un primate humano o no humano o un ser humano.
Para estudios de formación de imágenes, y en particular estudios de formación de imágenes PET in vivo, los compuestos radiomarcados de fórmula (I) o su sal farmacéuticamente aceptable se pueden administrar en forma de una composición farmacéutica.
Por tanto, otra realización de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad detectable de un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
El término "cantidad detectable" como se usa en la presente memoria significa una cantidad de compuesto necesaria para ser detectada por el método de detección elegido. Generalmente, el experto en la técnica determinará dicha cantidad detectable basándose en el compuesto y el método de detección utilizado.
Por tanto, la presente invención también incluye dentro de su alcance, compuestos de fórmula (I) y su composición farmacéutica, para su uso en el diagnóstico in vivo de trastornos mediados por D1.
Los compuestos radiomarcados de fórmula (I) como se describen en la presente memoria se prepararon según los métodos que se detallan más en la sección experimental.
Los compuestos de fórmula (Ia) y (Ib) se prepararon mediante una síntesis de múltiples etapas a partir del compuesto acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-1,2,3,6-tetrahidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)bencilo,
denominado en lo sucesivo como intermedio a13. Las condiciones de reacción se detallan con más detalle en la sección experimental.
El compuesto de fórmula (Ic) se prepara tritiando el compuesto 6-[2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil]-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1 H,3H)-diona (I) en presencia de catalizador de Kerr según métodos conocidos por el experto en la técnica y como se detalla más adelante en la sección experimental.
Sección experimental
I. Síntesis del compuesto de fórmula (I)
a. Abreviaturas/reactivos recurrentes
Ac: acetilo
Boc: ferc-Butiloxicarbonilo
Salmuera: solución acuosa saturada de cloruro de sodio
Bz: benzoilo
cAMP: monofosfato de adenosina cíclico
DAST: trifluoruro de dietilaminosulfuro
DCM: diclorometano
DEA: dietilamina
DMAP: 4-dimetilaminopiridina
DMSO: dimetilsulfóxido
dppf: 1,1'-Bis(difenilfosfino)ferroceno
pEC50: concentración que produce el 50% de la respuesta máxima
Erel: eficacia relativa
ES+: Ionización positiva por electropulverización
ESI: ionización por electropulverización
Et: etilo
EtOH: etanol
Et2O: éter dietílico
EtOAc: acetato de etilo
h: hora
(h) D1R: receptor D1 de dopamina humano
(h) D5R: receptor de dopamina D5 (humano)
HEK: células renales embrionarias humanas
HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico
HPLC: cromatografía líquida de alta presión
HTRF: fluorescencia homogénea de resolución temporal
LC: cromatografía líquida
LCMS: cromatografía líquida con espectrometría de masas
LDA: diisopropilamida de litio
MeOH: metanol
min.: minutos
NHP: primate no humano
RMN: resonancia magnética nuclear
PAM: modulador alostérico positivo
PrOH: isopropanol
ta: temperatura ambiente
RV: Vaso de reacción
SEM: 2-(trimetilsilil)etoximetilo
SFC: Cromatografía de fluidos supercríticos
SPE: Extracción en fase sólida
SUV: valor de captación estandarizado
TAC: curva tiempo-actividad
TEA: Trietilamina
TFA: ácido trifluoroacético
THF: tetrahidrofurano
TLC: cromatografía de capa fina
WFI: agua para inyección
b. métodos analíticos
Todas las reacciones que implican aire o reactivos sensibles a la humedad se realizaron bajo una atmósfera de nitrógeno o argón utilizando disolventes secos y material de vidrio. Los experimentos que requieren irradiación de microondas se realizan en un horno microondas Biotage Initiator Sixty actualizado con la versión 2.0 del software operativo. Se realizan experimentos para alcanzar la temperatura requerida lo más rápido posible (potencia máxima de irradiación: 400 W, sin refrigeración externa). Los disolventes y reactivos comerciales se utilizaron generalmente sin purificación adicional, incluyendo disolventes anhidros cuando fuera apropiado (generalmente productos Sure-Seal™ de Aldrich Chemical Company o AcroSeal™ de ACROS Organics). En general, las reacciones se controlaron mediante análisis de cromatografía en capa fina, HPLC o espectrometría de masas.
i) Los análisis de HPLC se realizan de la siguiente manera:
Método A: ácido
El análisis HPLC se realiza con el sistema HPLC Shimadzu equipado con módulo LC-2010 CHT, detector de matriz de fotodiodos SPD-M20A (210-400 nm), utilizando la columna y Mc Triart C-18 (150 x 4,6) mm 3 g. El gradiente de elución se realiza con formiato de amonio 5 mM en agua ácido fórmico al 0,1% (fase A) y acetonitrilo disolvente A al 5% ácido fórmico al 0,1% (fase B), con gradiente de B al 5-95% en 8 minutos en espera hasta 13,0 min, 5% de B a 15,0 min en espera hasta 18,0 min. Caudal de HPLC: 1,0 ml/min, volumen de inyección: 10 gL.
Método B: básico
El análisis HPLC se realiza con el sistema HPLC Shimadzu equipado con módulo LC-2010 CHT, detector de matriz de fotodiodos SPD-M20A (210-400 nm), utilizando la columna YMC Triart C-18 (150 x 4,6) mm 3 g. El gradiente de elución se realiza con formiato de amonio 5 mM en agua amoniaco al 0,1% (fase A) y acetonitrilo disolvente A al 5% amoniaco al 0,1% (fase B), con gradiente de 5-95% en 8,0 min en espera hasta 13,0 min, 5% de B a 15,0 min en espera hasta 18,0 min. Caudal de HPLC.
Resultará evidente para los expertos en la técnica que pueden obtenerse diferentes tiempos de retención (TR) para los datos de CL si se utilizan diferentes condiciones analíticas.
ii) Las mediciones de espectrometría de masas en modo LCMS se realizan de la siguiente manera:
Método A: ácido
El espectrómetro de masas de un solo cuadrupolo Shimadzu 2010EV se utiliza para el análisis LC-MS. Este espectrómetro está equipado con una fuente ESI y una bomba de gradiente binaria LC-20AD, detector de matriz de fotodiodos SPD-M20A (210-400 nm). Los datos se adquieren en una exploración MS completa de m/z 70 a 1200 en modo positivo y negativo. El análisis de fase inversa se lleva a cabo utilizando una columna Waters XBridge C 18 (30 x 2,1) mm 2,5 g. El gradiente de elución se realiza con formiato de amonio 5 mM en agua ácido fórmico al 0,1% (fase A) y acetonitrilo disolvente A al 5% ácido fórmico al 0,1% (fase B), con gradiente de 5-95% de B en 4,0 min en espera hasta 5,0 min, B al 5% a 5,1 min. en espera hasta 6,5 min. Caudal de HPLC: 1,0 ml/min, volumen de inyección: 5 gL.
Parámetros MS: Voltaje del detector 1,5 kV. Temperatura del bloque fuente 200°C. Temperatura de desolvatación 240°C. Flujo de gas nebulizador 1,2 L/min (nitrógeno). Los datos se adquieren en una exploración MS completa de m/z 70 a 1200 en modo positivo y negativo.
Método B: básico
El espectrómetro de masas de un solo cuadrupolo Shimadzu 2010EV se utiliza para el análisis LC-MS. Este espectrómetro está equipado con una fuente ESI y una bomba de gradiente binaria LC-20AD, detector de matriz de fotodiodos SPD-M20A (210-400 nm). Los datos se adquieren en una exploración MS completa de m/z 70 a 1200 en modo positivo y negativo. El análisis de fase inversa se lleva a cabo utilizando una columna Waters XBridge C 18 (30 x 2,1) mm 2,5 g. El gradiente de elución se realiza con formiato de amonio 5 mM en agua amoniaco al 0,1% (disolvente A) o acetonitrilo 5% de disolvente A Amoníaco al 0,1% (disolvente B), con gradiente de 5-95% de B en 4,0 min en espera hasta 5,0 min, 5% de B a 5,1 min en espera hasta 6,5 min. Caudal de HPLC: 1,0 ml/min, volumen de inyección: 5 gL.
Parámetros de MS: voltaje del detector 1,5 kV. Temperatura del bloque fuente 200°C. Temperatura de desolvatación 240°C. Caudal de gas de nebulización 1,2 L/min (nitrógeno). Los datos se adquieren en una exploración MS completa de m/z 70 a 1200 en modo positivo y negativo.
Los espectros de RMN se registran en un espectrómetro de RMN Varian MR de 400 MHz equipado con un software Linux 3.2 con sistema operativo Redhat Enterprise Linux 5.1. y cabezal de sonda de 1H /13C inverso de 5 mm, o RMN Varian VNMR de 400 MHz equipado con software Linux 3.2 con sistema operativo Redhat Enterprise Linux 6.3 y cabezal de sonda triple de 1H /13C/19F inverso de 5 mm. Los compuestos se estudian en disolventes deuterados como DMSO-cfe, CDCl3, MeOD o D2O a una temperatura de la sonda de 300 K y a una concentración de alrededor de 4-5 mg/mL. El instrumento está bloqueado en la señal de deuterio del disolvente deuterado utilizado. Los desplazamientos químicos se dan en ppm campo abajo del TMS (tetrametilsilano) tomado como patrón interno.
Las rotaciones ópticas ([a]D) se midieron en un polarímetro PERKIN-ELMER 341 en una cubeta (/ = 1 dm) a una concentración de 10 mg/mL, a una temperatura mencionada en los ejemplos específicos, a 589 nm (lámpara de sodio).
iii) La purificación preparativa se realiza utilizando los siguientes sistemas en condición ácida básica y neutra:
Sistema A. Sistema de HPLC Waters Prep:
HPLC preparativa de Waters equipada con módulo 2545 de bomba binaria con detector PDA 2998 y que comprende un gestor de muestras 2767. El detector cuádruple único Waters 3100 se utiliza para la detección y el disparador de recolección.
HPLC preparativa de Shimadzu consiste en una bomba LC8A binaria y un detector PDA SPD M20A con inyección manual y recolección manual de fracciones.
La purificación se lleva a cabo utilizando las siguientes columnas para los dos sistemas anteriores:
Phenomenex, Synergy Fusion C18, (100 x 30) mm, 4 g
YMC ODS (500 x 30) mm 10 g.
YMC Triart (250 x 30) mm 10 g.
Sistema B. Purificación en SFC
Sistema preparativo Thar SFC 100 compuesto por bomba co-disolvente 2545 y bomba de Co2, horno de columna, muestreador automático 2767 y colector de fracciones, ABPR para mantener la presión del sistema, detector PDA 2998. El sistema está controlado por el software Masslynx V4.1. Las columnas para SFC se seleccionan entre las que se enumeran a continuación:
Virdis, 2-etilpiridina (250 x 30) mm, 5g
Virdis, CSH Fluorofenilo (250 x 30) mm, 5g
Phenomenex Luna Hilic (250 x 30) mm, 5g
YMC, ciano (250 x 19) mm, 5g
YMC, Diol (250 x 30) mm, 10p
Chiralpak IA (250 x 30) mm, 5g
C. Síntesis de intermedios
C.1. Síntesis de 6-bromo-1,5-dimetil-3-(2-trimetilsililetoximetil)pirimidina-2,4-diona a1
a1 se describe y se prepara según el método descrito en la solicitud de patente internacional publicada en el núm. WO2014/072881.
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 55,21 (s, 2H), 3,56 (t, J = 7,83 Hz, 2H), 3,52 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 0,83 (t, J = 7,83 Hz, 2H), -0,04 (s, 9H).
C.2. Síntesis de 6-yodo-5-metilpirimidina-2,4(1 H,3H)-diona a6.
C.2.1. Síntesis de 5-metilpirimidina-2,4,6(1 H,3H,5H)-triona a3
A una solución de Na (3,18 g, 137 mmoles) en MeOH (500 ml), se añadió urea (8,28 g, 137 mmoles) seguido de la adición de 2-metilpropanodioato de dietilo a2 (20,0 g, 114 mmoles). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 16 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se acidificó a pH 3 con una solución acuosa 2 N de HCl, luego se enfrió a -10°C y se agitó a la misma temperatura durante 3 h. La mezcla de reacción se filtró, se lavó con agua fría (50 ml), Et2O (100 mL) y hexanos (100 mL). El producto en bruto obtenido se secó al vacío para proporcionar 15 g de 5-metilpirimidina-2,4,6(1 H,3H,5H)-triona. a3 como un sólido blanco.
Rendimiento (producto en bruto): 92%
LCMS (ES+): 143 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 511,07 (s, 2H), 3,63 (q, J = 6,80 Hz, 1H), 1,29 (d, J = 6,80 Hz, 3H).
C.2.2. Síntesis de 2,4,6-tricloro-5-metilpirimidina a4
A una solución de 5-metilpirimidina-2,4,6(1 H,3H,5H) -triona a3 (15,0 g, 105 mmoles) en POCl3 (158 g, 1035 mmoles) se añadió H3 PO4 (2 mL) y la mezcla de reacción se calentó a 100°C durante 45 min. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se vertió en hielo, se filtró y se secó al vacío para proporcionar 8 g de 2,4,6-tricloro-5-metilpirimidina a4 en bruto como un sólido blanco, que se usó en la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional.
C.2.3. Síntesis de 6-cloro-5-metilpirimidina-2,4(1 H,3H)-diona a5
Una solución agitada de 2,4,6-tricloro-5-metilpirimidina a4 en bruto (8,00 g, 40,8 mmoles) en una solución acuosa al 10% de NaOH (75 ml) se calentó a reflujo durante 1,5 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se acidificó a pH 2 con una solución acuosa 2 N de HCl, se filtró y se secó al vacío para proporcionar 4,8 g de 6-cloro-5-metilpirimidina-2,4(1 H,3H)-diona. a5 como un sólido blanco, que se usó en la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional.
Rendimiento (producto en bruto): 21%
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 511,78 (s, 1H), 11,29 (s, 1H), 1,80 (s, 3H).
C.2.4. Síntesis de 6-yodo-5-metilpirimidina-2,4(1 H,3H)-diona a6
Una solución agitada de 6-cloro-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona a5 (4,80 g, 0,30 mmoles) y Nal (23,4 g, 150 mmoles) en HI (60 ml) se agitó en un tubo sellado a temperatura ambiente durante 66 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se filtró y se lavó con agua fría (50 ml) y se secó al vacío para proporcionar 2,1 g de 6-yodo-5-metilpirimidin-2,4(1H,3H)-diona. a6 se aisló como un sólido marrón, que se usó en la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional.
LCMS (ES+): 253 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 511,21 (s, 1H), 1,90 (s, 3H).
C.3. Síntesis de acetato de 5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)bencilo a12 a12 se preparó a partir del compuesto a7 a través de una síntesis de múltiples etapas según procedimientos análogos a los descritos en la solicitud de patente internacional WO2014/072881, y como se establece específicamente a continuación.
V'i
CO xr*
a11 c a ó12
C.3.1.Síntesis de 4-(4-bromo-3-metilfenoxi)furo[3,2-c]piridina a8
A una solución de 4-clorofuro[3,2-c]piridina a7 (12 g, 78,1 mmoles) y 4-bromo-3-metilfenol (17,5 g, 93,7 mmoles) en DMSO (300 ml), Cs2CO3 (63,4 g, 195 mmoles) y la mezcla de reacción se calentó a 125°C durante 16 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se vertió sobre hielo y se filtró. El residuo se disolvió en EtOAc (100 ml) y se lavó con salmuera (2 x 100 ml). La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró al vacío. El producto en bruto obtenido se purificó mediante trituración con Et2O al 1% en pentano (100 ml) para proporcionar 12,6 g de 4-(4-bromo-3-metilfenoxi)furo[3,2-c]piridina a8 como un sólido beige.
Rendimiento: 53%
LCMS (ES+): 304 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 58,14 (s, 1H), 7,96 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 8,80 Hz, 1H), 7,46 (d, J = 5,60 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 1,20 Hz, 1H), 7,10 (s, 1H), 7,04-6,98 (m, 1H), 2,34 (s, 3H).
C.3.2. Síntesis de 4-(4-bromo-3-(bromometil)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a9
A una solución de 4-(4-bromo-3-metilfenoxi)furo[3,2-c]piridina a8 (12,5 g, 41,1 mmoles) en CCl4 (250 mL) se añadieron NBS (8,05 g, 45,2 mmoles) y Bz2O2 (1,99 g, 8,22 mmoles). La mezcla de reacción se calentó a 80°C durante 12 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con DCM (100 ml) y agua (100 ml). La fase orgánica se lavó con una solución acuosa 1 N de NaOH (50 ml) y salmuera (50 ml), se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró al vacío para proporcionar 22 g de 4-(4-bromo-3-(bromometil)fenoxi)furo[3,2-c] piridina a9 como un semisólido marrón, que se usó en la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional.
LCMS (ES+): 284 (M H)+.
C.3.3. Síntesis de (2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)metanol a10
A una solución de 4-(4-bromo-3-(bromometil)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a9 (22,0 g, 57,4 mmoles) en DMF (80 ml), se añadió NaOAc (23,0 g, 287 mmoles) y la mezcla de reacción se calentó a 80°C durante 3 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con DCM (100 ml) y agua
(50 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SÜ4 anhidro y se concentró al vacío. El residuo se disolvió en MeOH (50 ml) seguido de la adición de una solución acuosa 1 N de NaOH (20 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se diluyó con agua (100 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 40 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna usando EtOAc a partir de 20% en hexanos como eluyente para proporcionar 3,5 g de (2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)metanol a10 como un sólido blanco.
Rendimiento: 19%
LCMS (ES+): 320 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 58,14 (d, J = 2,40 Hz, 1H), 7,96 (d, J = 5,60 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 8,80 Hz, 1H), 7,48 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,32 (d, J = 2,80 Hz, 1H), 7,12-7,08 (m, 2H), 5,51 (t, J = 5,60 Hz, 1H), 4,51 (d, J = 5,60 Hz, 2H).
C.3.4. Síntesis de acetato de 2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)bencilo a11
A una solución de (2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)metanol a10 (3,50 g, 11,0 mmoles) en THF (50 ml), se añadió piridina (2,60 g, 33,0 mmoles) a 0°C y la mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura durante 10 min. Se añadió gota a gota cloruro de acetilo (1,73 g, 22,0 mmoles) a 0°C y la mezcla de reacción se calentó a 100°C durante 16 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se neutralizó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 y se extrajo con EtOAc (50 ml). La fase orgánica se lavó sucesivamente con agua (50 mL) y salmuera (10 mL), se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna usando EtOAc del 2 al 5% en hexanos como eluyente para proporcionar 4 g de acetato de 2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)bencilo a11 como líquido incoloro.
Rendimiento: 98%
LCMS (ES+): 362 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 58,14 (d, J = 2,00 Hz, 1H), 7,95 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 8,80 Hz, 1H), 7,49 7,45 (m, 1H), 7,35 (d, J = 2,80 Hz, 1H), 7,20-7,17 (m, 1H), 7,14-7,11 (m, 1H), 5,10 (s, 2H), 2,07 (s, 3H).
C.3.5. Síntesis de acetato de 5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)bencilo a12
A una solución de acetato de 2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)bencilo a11 (4 g, 11,1 mmoles) y 4,4,5,5-tetrametil-2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1,3,2-dioxaborolano ( 3,66 g, 14,4 mmoles) en dioxano (50 ml) se añadió KOAc (3,26 g, 33,3 mmoles). La mezcla de reacción se purgó con argón durante 30 min, luego con PdCl2(dppf). Se añadió DCM (2,70 g, 3,33 mmoles) y la mezcla de reacción se purgó de nuevo con argón durante 5 min. La mezcla de reacción se calentó a 110°C durante 16 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (50 ml) y se filtró a través de Celite®. El filtrado se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna usando EtOAc del 10 al 12% en hexanos para proporcionar 4,1 g de acetato de 5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)bencilo a12 que se aisló como un sólido de color crudo.
LCMS (ES+): 410 (M H)+.
C.4. Síntesis de acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-1,2,3,6-tetrahidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)bencilo a13, a13_Atropoisómero_1 y a13_Atropoisómero_2
A una solución de acetato de 5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)bencilo a12 (200 mg, 0,49 mmoles) y 6-bromo-1,5-dimetil-3-(2-trimetilsililetoximetil)pirimidin-2,4-diona a1 (130 mg, 0,38 mmoles) en dioxano (9 ml) y agua (1 ml) se añadió K2CO3 (160 mg, 1,13 mmoles). La mezcla de reacción se purgó con argón durante 30 min. Se añadió PdCL(dppf).DCM (90 mg, 0,11 mmol) y la mezcla de reacción se purgó de nuevo con argón durante 5 min. La mezcla de reacción se calentó con irradiaciones de microondas a 120°C durante 2 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. La reacción se repitió en 13 x 0,20 g y se combinaron las mezclas en bruto de las 14 reacciones. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (150 ml), se filtró a través de Celite® y se
lavó con EtOAc (250 mL). El filtrado se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna usando EtOAc del 20 al 40% en hexanos como eluyente para proporcionar 827 mg de acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1 -((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-1,2,3,6-tetrahidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)bencilo a13 como un sólido de color crudo, que es una mezcla racémica de atropisómeros (+) y (-).
Rendimiento: 31%
LCMS (ES+): 494 (M H-SiMea)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 58,18 (d, J = 1,96 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,54 (dd, J = 5,87, 0,98 Hz, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,44 (s, 2H), 7,14-7,12 (m, 1H), 5,76 (s, 2H), 5,32 (s, 2H), 3,68-3,59 ( m, 2H), 2,97 (s, 3H), 1,95 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 1,17 (t, J = 7,09 Hz, 2H), -0,01 (s, 9H).
La separación quiral (LC, YMC Chiralart Cellulose-SC, 250*4,6 mm, 1 mL/min, 252 nm, 25°C, eluyente: 50% de nhexanos (con DEA al 0,1%), 50% de iPrOH) de 500 mg de racemato de acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1- ((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-1,2,3,6-tetrahidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)bencilo a13 produjo:
• 151 mg de acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-1,2,3,6-tetrahidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c] piridin-4-iloxi)bencilo (a13_atropisómero 1) como un sólido blanco.
Rendimiento: 30%
LCMS (ES+): 494 (M H-SiMea)+.
Análisis quiral (LC, YMC Chiralart Cellulose-SC, 250*4,6 mm, 1 ml/min, 252 nm, eluyente: n-hexanos al 50% (con DEA al 0,1%), iPrOH al 50%) TA 28,93 min, 98,5% de ee.
• 152 mg de acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-1,2,3,6-tetrahidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c] piridin-4-iloxi)bencilo (a13_atropisómero 2) como un sólido blanco.
Rendimiento: 30%
LCMS (ES+): 494 (M H-SiMea)+.
Análisis quiral (LC, YMC Chiralart Cellulose-SC, 250 * 4,6 mm, 1 ml/min, 252 nm, eluyente: n-hexanos al 50% (con DEA al 0,1%), iPrOH al 50%) TA 31,28 min, 92,5% de ee.
En esta etapa no se asignó una configuración particular (+) o (-) de los respectivos atropoisómeros.
D. Síntesis de compuestos de fórmula (I)
D.1. Síntesis de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1 H,3H)-diona (+)-(I) y (-)-(I).
D.1.1. Síntesis de 6-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(hidroximetil)fenil)-1,5-dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a14_Atropoisómero 1 y de a14_Atropoisómero 2
A una solución de acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-1,2,3,6-tetrahidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)bencilo a13_Atropoisómero 1 (151 mg, 0,27 mmoles) en THF (7,71 ml) y agua (860 gl) se
añadió NaOH (50 mg, 1,36 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se diluyó con agua (15 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 50 ml). La fase orgánica se lavó con salmuera (10 ml), se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró al vacío para proporcionar 124 mg de 6-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(hidroximetil)fenil)-1,5-dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil) pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a14_Atropoisómero 1 como un líquido de color marrón claro, que se utilizó en la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional.
Rendimiento (en bruto): 90%
LCMS (ES+): 510 (M H)+.
6-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(hidroximetil)fenil)-1,5-dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)pirimidina-2,4(1 H,3H)-diona a14 Atropoisómero 2
Compuesto a14_Atropoisómero 2_ pueden sintetizarse según el mismo método que usa acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1 -((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-1,2,3,6-tetrahidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)bencilo a13_Atropoisómero 1 como material de partida.
Rendimiento (en bruto): 93%.
LCMS (ES+): 510 (M H)+.
En esta etapa no se asignó una configuración particular (+) o (-) de los respectivos atropoisómeros.
D.1.2. Síntesis de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a15_Atropoisómero 1 y a15_Atropoisómero 2
A una solución de 6-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(hidroximetil)fenil)-1,5-dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a14_Atropoisómero 1 (0,13 g, 0,25 mmoles) en DCM (3 ml) se añadió DAST (0,20 g, 1,23 mmoles) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se inactivó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 (2 mL) y se extrajo con EtOAc (2 x 10 mL). La fase orgánica se lavó sucesivamente con agua (10 mL) y salmuera (5 mL), se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna usando EtOAc del 20 al 30% en hexanos como eluyente para proporcionar 74 mg de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a15_Atropoisómero 1 como un sólido de color crudo.
Rendimiento: 59%
LCMS (ES+): 512 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 58,18 (d, J = 2,45 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,58-7,53 (m, 2H), 7,48 (s, 2H), 7.16- 7,12 (m, 1H), 5,39 (d, J = 2,45 Hz, 1H), 5,32 (s, 2H), 5,27 (s, 1H), 3,69-3,62 (m, 2H), 2,93 (s, 3H), 1,54 (s, 3H), 0,92-0,84 (m, 2H), 0,03 (s, 9H).
6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)pirimidina-2,4(1 H,3H)-diona a15 Atropoisómero 2
El compuesto a15_Atropoisómero 2 puede sintetizarse según el mismo método que usa 6-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(hidroximetil)fenil)-1,5-dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)pirimidina-2,4(1 H,3H)-diona a14_Atropoisómero 2 como material de partida.
Rendimiento: 58%
LCMS (ES+): 512 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 58,18 (d, J = 2,45 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,58-7,53 (m, 2H), 7,48 (s, 2H), 7.16- 7,12 (m, 1H), 5,39 (d, J = 2,45 Hz, 1H), 5,32 (s, 2H), 5,27 (s, 1H), 3,69-3,62 (m, 2H), 2,93 (s, 3H), 1,54 (s, 3H), 0,92-0,84 (m, 2H), 0,03 (s, 9H).
En esta etapa no se asignó una configuración particular (+) o (-) de los respectivos atropoisómeros.
D.1.3. Síntesis de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1 H,3H)-diona (+)-(I) y (-)-(I)
A una solución de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a15_Atropoisómero 1 (0,07 g, 0,15 mmoles) en Dc M (1 ml) se añadió TFA (1 ml) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se disolvió en CH3CN (1 mL) y una solución acuosa de amoniaco al 25% (1 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 30 min, luego se filtró, se lavó con agua fría (2 mL) y se secó al vacío. El residuo se purificó mediante trituración con DCM: pentano (1: 4, 2,5
ml) y se secó al vacío para proporcionar 20 mg de atropisómero (+) de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidin-2,4(1 H,3H)-diona (+)-(I) como un sólido de color crudo.
Rendimiento: 36%
Pureza de HPLC: 97,5%
LCMS (ES+): 382 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 11,48 (s, 1H), 8,16-8,19 (m, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,56-7,52 (m, 2H), 7,49 7,44 (m, 2H), 7,13 (d, J = 1,47 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 3,42 Hz, 1H), 5,27 (d, J = 2,93 Hz, 1H), 2,86 (s, 3H), 1,48 (s, 3H).
[a]D (MeOH, 30°C) = 14,7
6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidin-2,4(1H,3H)-diona (I) atropisómero (-), ((-)-I)El compuesto (-)-I puede sintetizarse según el mismo método que usa 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a15_Atropoisómero 2 como material de partida. Pureza de HPLC: 99,8%
LCMS (ES+): 382 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 5 11,48 (s, 1H), 8,19-8,16 (m, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,56-7,52 (m, 2H), 7,46 (brs, 2H), 7,13 (d, J = 1,47 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 3,42 Hz, 1H), 5,27 (d, J = 2,93 Hz, 1H), 2,86 (s, 3H), 1,48 (s, 3H). [a]D (MeOH, 30°C) = -8,3
D.2. Síntesis del atropoisómero (-) de [11 C]-6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidin-2,4(1 H,3H)-diona (Ia), (-)-(Ia)
D.2.1. Síntesis de 4-(4-bromo-3-(fluorometil)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a16
A una solución de (2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)metanol a10 (5 g, 15,7 mmoles) en DCM (100 ml) se añadió DAST (10 g, 62,8 mmoles) a 0°C, luego la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se inactivó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 (20 mL) y se extrajo con DCM (100 mL). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna usando EtOAc del 10 al 15% en hexanos como eluyente para proporcionar 2,1 g de 4-(4-bromo-3-(fluorometil)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a16 como un sólido de color crudo.
Rendimiento: 41%
LCMS (ES+): 322 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,99 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,68-7,64 (m, 1H), 7,59 (d, J = 8,80 Hz, 1H), 7,38-7,36 (m, 1H), 7,22 (d, J = 5,60 Hz, 1H), 7,14 - 7,10 (m, 1H), 6,91 (s, 1H), 5,46 (d, J = 46,8 Hz, 2H).
D.2.2. Síntesis de 4-(3-(fluorometil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a17 A una solución de 4-(4-bromo-3-(fluorometil)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a16 (2 g, 6,23 mmoles) y 4,4,5,5-tetrametil-2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1,3,2-dioxaborolano (2,05 g, 8,09 mmoles) en dioxano (50 ml) se añadió
KOAc (1,83 g, 18,6 mmoles), luego la reacción se purgó con argón durante 30 min. Se añadió PdCÍ2(dppf) (1,52 g, l , 86 mmoles) y la mezcla de reacción se purgó de nuevo con argón durante 5 min. La mezcla de reacción se calentó a 100°C durante 12 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se filtró a través de Celite® y se lavó con EtOAc (100 mL). El filtrado se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna usando EtOAc al 10% en hexanos como eluyente para proporcionar 2,1 g de 4-(3-(fluorometil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a17 como un sólido de color crudo.
Rendimiento: 91%
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 58,16-8,14 (m, 1H), 7,98 (d, J = 5,20 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 8,40 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,32-7,28 (m, 1H), 7,24-7,20 (m, 1H), 7,09 (s, 1H), 5,65 (d, J = 47,6 Hz, 2H), 1,31 (s, 12H).
D.2.3. Síntesis de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona a18
A una solución de 4-(3-(fluorometil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a17 (100 mg, 0,27 mmoles) y 6-yodo-5-metilpirimidina-2,4(1 H,3H)-diona a6 (130 mg, 0,54 mmoles) en dioxano (10 ml) y agua (1 ml) se añadió K2CO3 (110 mg, 0,81 mmoles) y la reacción se purgó con argón durante 30 min. Se añadió PdCb(dppf) (60 mg, 0,08 mmoles) y la mezcla de reacción se purgó de nuevo con argón durante 5 min. La mezcla de reacción se calentó a 80°C durante 1 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se filtró a través de Celite®. El filtrado se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna usando EtOAc del 50 al 60% en hexanos como eluyente para proporcionar 20 mg de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenilo)-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona a18 como un sólido de color crudo.
Rendimiento: 21%
Pureza de HPLC: 98,4%
LCMS (ES+): 368 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 511,18 (s, 1H), 10,85 (s, 1H), 8,17 (d, J = 2,00 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,45-7,37 (m, 3H), 7,11 (d, J = 1,60 Hz, 1H), 5,36 (d, J = 46,8 Hz, 2H), 1,51 (s, 3H).
D.2.4. Síntesis del atropisómero (-) de [11 C]-6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidin-2,4(1 H,3H)-diona (la), (-)-(Ia).
[11 C]-(6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidin-2,4(1H,3H)-diona) como una mezcla de dos atropoisómeros se preparó a partir del a18 precursor y [11C]metano. El [11C]metano se produjo en un ciclotrón PETtrace de GE irradiando el gas diana que contiene una mezcla de hidrógeno al 10% en gas nitrógeno con un haz de protones a 16,5 MeV, que produce [11C]metano a través de reacción nuclear 14N(p, a)11C y posterior reacción en la diana del carbono-11 con nitrógeno para formar metano.
El [11C]metano producido se atrapó luego a aproximadamente -180°C en una trampa HayeSep que posteriormente se lavó con helio para eliminar las trazas de hidrógeno y nitrógeno. Luego se liberó el [11C]metano atrapado calentando en un sistema de recirculación donde se hizo reaccionar con vapor de yodo a aproximadamente 720°C para proporcionar yoduro de [11C]metilo. Después de la recirculación, el yoduro de [11C]metilo se pasó en una corriente de helio a través de una columna que contenía triflato de plata caliente en un vehículo inerte para proporcionar el agente de marcado, triflato de [11C]metilo. Este, a su vez, quedó atrapado en una solución que contenía el precursor no marcado a18, 0,2-0,4 mg, 4-5 gl de NaOH 0,5 M ac. y 600-700 gl de acetona.
Después de aproximadamente 120 segundos, la mezcla de reacción se diluyó con agua y se transfirió a una columna XBridge C18 semipreparativa (200 x 10 mm, 5 gm) y se eluyó con una mezcla de acetonitrilo y NH4OH acuoso (0,15%) 29:71 a un flujo de 7 ml/min. El efluente se monitorizó con un detector de radioactividad y UV conectados secuencialmente, con el detector de UV ajustado a 254 nm. Se recogió el pico que contenía el producto marcado radiactivo, se diluyó en aprox. 50 ml de agua estéril y se pasó por un cartucho Waters Oasis 3cc SPE para atrapar el producto. A continuación, el cartucho se lavó con 8 ml de agua estéril y el producto se eluyó con aprox. 1,1 ml de etanol al 96% en un vial que contenía 12 ml de solución salina. A continuación, el producto se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 gm (Millex GV). La muestra para el control de calidad se tomó del vial de producto después de la filtración. La pureza radioquímica se determinó usando un sistema HPLC estándar, con un detector de radioactividad y UV conectados en serie, usando una columna analítica XBridge C18 (150x4,6 mm, 5 gm) con acetonitrilo/NH4OH ac. (0,15%) 25:75 como fase móvil, con el detector de UV ajustado a 254 nm.
Como los dos atropoisómeros no se pueden separar en una columna HPLC C18 normal, se desarrolló un método de separación quiral para su separación.
Para el aislamiento del atropisómero (-) de (la), la HPLC semipreparativa se realizó mediante columna Chiralpak IA (250x10 mm, 5 gm) utilizando mezcla acetonitrilo/etanol 7:93 como fase móvil, a un flujo de 5 mL/min, con detector de UV ajustado a 254 nm. La reacción en sí y la formulación del producto se realizaron como se describió anteriormente.
Las purezas radioquímicas y atropoisoméricas se determinaron utilizando un sistema HPLC estándar equipado con columna analítica Chiralpak IA-3, eluida con fase móvil MeCN/EtOH 7:93 a un flujo de 1 ml/min, con detector UV ajustado a 254 nm (tiempo de retención de (-)-Ia = 7,2 minutos, ee> 99%).
D.3. Síntesis del atropisómero (-) de [18F]-6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidin-2,4(1 H,3H)-diona (Ib), (-)-(Ib)
D.3.1. Síntesis de acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)bencilo a19
A una solución de acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-1,2,3,6-tetrahidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)bencilo a13 (2,60 g, 4,71 mmoles) en DCM (50 ml), se añadió TFA (26,0 ml, 350 mmoles) a 0°C y luego la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se disolvió en una mezcla de acetonitrilo: amoniaco (1:1, 10 ml) y se agitó durante 30 min. La mezcla de reacción se filtró, se lavó con agua fría (20 ml) y pentano (20 ml) y se secó al vacío para proporcionar 1,6 g de acetato de 2-(3,5-dimetil-2.6- dioxo-1,2,3,6-tetrahidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)bencilo a19 como un sólido de color crudo, que se usó en la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional.
Rendimiento (en bruto): 81%
LCMS (ES+): 422 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 511,47 (s, 1H), 8,18 (d, J = 1,96 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,54 (dd, J = 5,87, 0,98 Hz, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,45-7,41 (m, 2H), 7,13 (s, 1H), 5,02-4,97 (m, 1H), 4,97-4,91 (m, 1H), 2,90 (s, 3H), 1,97 (s, 3H), 1,50 (s, 3H).
D.3.2. Síntesis de 4-(2-(acetoximetil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6- dihidropirimidina-1(2H)-carboxilato de terc-butilo a20 Se disolvieron acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)bencilo a19 (1,60 g, 3,80 mmoles), (Boc)2O (1,57 ml, 6,83 mmoles), trietilamina (0,64 ml, 4,56 mmoles) y DMAP (0,05 g, 0,38 mmoles) en THF (33,3 ml) y la mezcla de reacción se calentó a 70°C durante 16 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna usando EtOAc del 70 al 80% en hexanos como eluyente para proporcionar 1,1 g de 4-(2-(acetoximetil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3.6- dihidropirimidin-1 (2H)-carboxilato de terc-butilo a20 como un sólido de color crudo.
Rendimiento: 56%
LCMS (ES+): 522 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 58,17 (d, J = 1,96 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 8,31 Hz, 2H), 7,34-7,30 (m, 1H), 7,10 (d, J = 1,47 Hz, 1H), 4,33-4,38 (m, 2H), 2,94 (s, 3H), 1,95 (s, 3H), 1,55 (s, 9H), 1,52 (s, 3H).
D.3.3. Síntesis de 4-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(hidroximetil)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6- dihidropirimidina-1 (2H)-carboxilato de terc-butilo a21
Una solución de 4-(2-(acetoximetil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6-dihidropirimidina-1 (2H)-carboxilato de terc-butilo a20 (1,1 g, 2,11 mmoles) en THF (15 ml) y agua (2 ml) se añadió NaOH (90 mg, 2,32 mmoles), luego la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se extrajo con
EtOAc (2 x 50 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SÜ4 anhidro y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna usando EtOAc al 50% en hexanos como eluyente para proporcionar 300 mg de 4-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(hidroximetil)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6-dihidropirimidin-1 (2H)-carboxilato de tercbutilo a21 como un sólido blanco.
Rendimiento: 30%
LCMS (ES+): 480 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 58,14 (s, 1H), 8,01 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,40-7,34 (m, 2H), 7,32-7,27 (m, 1H), 7,08 (s, 1H), 5,37 (t, J = 5,62 Hz, 1H), 4,36-4,29 (m, 2H), 2,91 (s, 3H), 1,52 (s, 9H), 1,49 (s, 3H).
D.3.4. Síntesis de 4-(2-(clorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6- dihidropirimidina-1 (2H)-carboxilato de terc-butilo a22
A una solución de 4-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(hidroximetil)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6-dihidropirimidina-1 (2H)-carboxilato de terc-butilo a21 (300 mg, 0,63 mmoles) en DCM (5 ml) se añadió una solución de SOCl2 (0,09 g, 0,75 mmoles) DCM (1 ml) a 0°C, luego la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, la mezcla de reacción se inactivó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 (5 mL) y se extrajo con DCM (2 x 20 mL). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna usando EtOAc del 50 al 55% en hexanos como eluyente para proporcionar 150 mg de 4-(2-(clorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6-dihidropirimidin-1 (2H)-carboxilato de terc-butilo a22 como un sólido blanco.
Rendimiento: 48%
Pureza de HPLC: 98,4%
LCMS (ES+): 498 (M H)+.
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 58,18 (d, J = 1,96 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,57 (d, J = 1,96 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 5,38 Hz, 1H), 7,51-7,48 (m, 1H), 7,46-7,43 (m, 1H), 7,13 (d, J = 1,47 Hz, 1H), 4,72 (s, 2H), 2,93 (s, 3H), 1,56 (s, 9H), 1,55 (brs, 3H).
D.3.5. Síntesis del atropisómero (-) de [18F]-6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidin-2,4(1 H,3H)-diona (Ib), (-)-(Ib)
En un procedimiento típico, [18F]fluoruro en un vial de envío (agua diana obtenida de una instalación de ciclotrón) se transfiere y se atrapa en un cartucho de intercambio iónico. Luego se eluye con una solución de carbonato de potasio y Kryptofix 222 en el recipiente de reacción (RV1) del módulo TRACERlab®. La solución se evapora primero calentando a 95°C durante 4 min al vacío y con flujo de helio. Se añade acetonitrilo (1 ml) a RV1 y se continúa la evaporación en las mismas condiciones durante 2 min al vacío. Después de una segunda adición de acetonitrilo (1 mL), se lleva a cabo la evaporación final a 95°C durante 2 min al vacío y flujo de helio. Luego, el reactor se enfría a 50°C.
Una solución del precursor a22 (0,7 mg) en acetonitrilo anhidro se añade al recipiente de reacción y la mezcla de reacción se calienta a 80°C durante 5 min. Después de 5 min, el reactor se enfría a 70°C, se agrega ácido clorhídrico (1 M) y se calienta a 70°C durante 4 min antes de enfriarlo a 40°C y diluirse con WFI. La mezcla se transfiere de RV1 a un cartucho de extracción en fase sólida intermedio (SPE, Oasis HLB light). RV1 se enjuaga con metanol y se transfiere a través de SPE para eluir el producto en RV2, precargado con WFI. Todo el contenido de RV2 se transfiere al bucle del inyector de HPLC para su purificación.
El aislamiento de (-)-Ib se realiza mediante HPLC utilizando una columna Chiralcel OJ-H semipreparativa (5 gm, 250 x 10 mm) y Phenomenex Luna C18 (2) (10 gm, 250 x10 mm) y se eluye con una mezcla de acetonitrilo/solución de acetato de amonio (5 mM) (40/60, v/v) a un caudal de 4 ml/min. La fracción de producto se recoge en el matraz 1, que contiene 25 mL de ácido ascórbico en WFI. La mezcla de producto diluido se pasa a través de un cartucho de extracción en fase sólida tC18 y el cartucho se enjuaga con 10 ml de ácido ascórbico en WFI. El producto radiomarcado se eluye del cartucho SPE con 1 ml de etanol de grado USP de prueba 200 en el matraz de formulación, precargado con 10 ml de base de formulación. El cartucho se enjuaga con 4 mL de base de formulación y el enjuague se mezcla con el contenido del matraz de formulación. La solución resultante se pasa a través de un filtro de membrana esterilizante de 0,2 gm a un vial estéril con filtro ventilado (vial de producto final, FPV).
La pureza radioquímica se determinó utilizando un sistema HPLC estándar, con detector de radioactividad y UV conectados en serie, utilizando una columna analítica Kinetex EVO C18 (250 x 4,6 mm, 5 gm) con MeOH/NH4OAc 5 mM 50/50, aumentando a 80/20 en 15 minutos, como fase móvil, con detector UV ajustado a 254 nm (tiempo de retención de (-)-1b = 9,7 minutos, pureza radioquímica> 99%)
La pureza atropoisomérica se determinó usando un sistema HPLC estándar, con detector de radioactividad y UV conectados en serie, usando una columna analítica quiralpak OJ-H (250x4,6 mm, 5gM), se eluyó con MeCN/5 mM NH4OAc 40/60 fase móvil a una flujo de 1 ml/min, con detector de UV ajustado a 254 nm (tiempo de retención de (-)1a = 10,1 minutos, ee> 99%).
D. 4. Síntesis del atropisómero (-) de [3H]-6-(2-(fluorometil)-4-(furo [3,2-c] piridin-4-iloxi) fenil)-1,5-dimetilpirimidin-2,4 (1 H,3H)-diona (Ic), (-)-(Ic)
Compuesto de fórmula (-)-(I) (2mg), catalizador de Kerr (2 mg) y diclorometano (1 ml) se combinaron en un matraz de tritiación y se agitaron bajo 5 Ci de gas tritio durante 2,5 horas. El tritio lábil se eliminó mediante evaporaciones repetidas hasta sequedad en etanol. Los residuos se disolvieron en etanol (20 ml). (-)-(Ic) en bruto se purificó por HPLC usando una columna Gemini C185|j 250x10mm, agua TFA (0,1%) como eluyente A, acetonitrilo TFA (0,1%) como eluyente B, 20% de B a 100% de B durante 60 min como gradiente a 3 ml/min de caudal. (-)-(Ic) se recogió, se sometió a evaporación rotatoria hasta sequedad y se disolvió en etanol (20 ml).
La pureza radioquímica de (-)-(Ic), determinada por cromatografía líquida de alta resolución, se midió usando una columna analítica ODS3 inertsil (150x4,6 mm, 5 |uM), eluida con agua/TFA como eluyente A y CH3CN/TFA como fase eluyente B a un flujo de 1 ml/min (gradiente que varía desde 20% de B en t = 0 a 100% de B en t = 20 minutos) con un detector de radioactividad (tiempo de retención de (-)-(Ic) = 12,9 minutos, pureza radioquímica = 99,4%).
LCMS (ES+): Ion principal en 384 (M H)+ de acuerdo con la incorporación de principalmente 1 tritio y una actividad específica medida a 18Ci/mmol.
E. Biología
Para evaluar la actividad del compuesto (I) en el receptor D1, se probó en un ensayo funcional. El ensayo funcional mide la estimulación de la producción de adenosin monofosfato cíclico (cAMP) en el ensayo de fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF), con el aumento máximo de cAMP al aumentar las concentraciones del agonista endógeno, dopamina, definido como 100% de la activación del receptor D1. Cuando se prueba, el compuesto (±)-(I) muestra un efecto similar a un agonista directo significativo.
Para evaluar la afinidad y selectividad del compuesto (I) por D1, se ha probado en ensayos de unión de radioligando competitivos. Luego se utilizaron los ensayos de unión de radioligando competitivos para medir la afinidad (±)-I por el receptor D1 y evaluar su selectividad con respecto a un gran panel de 80 dianas relacionadas y no relacionadas. El compuesto (±)-(I) se une a los receptores D1 y D5 con una afinidad en el rango subnanomolar y no se unen significativamente a ninguno de los otros objetivos probados.
El compuesto (-)-(I) luego ha sido tritiado para medir y comparar:
1) las propiedades de unión a radioligando de un antagonista D1 conocido [3H]SCH23390 y del compuesto agonista D1 de fórmula (-)-(Ic), y
2) la capacidad de los moduladores alostéricos positivos D1 (PAM) para potenciar la unión del agonista o antagonista al receptor D1 (D1R). Se midió la potenciación inducida por PAM D1 como un aumento en la unión de radioligando en la membrana celular que expresa D1R humano o en cortes de cerebro de primates no humanos (NHP) por autorradiografía.
Las condiciones de ensayo particulares en las que se ha probado el compuesto se describen a continuación.
E.1. Materiales y métodos
La transfección transitoria de dopamina D1R humana se realizó con el vector pcDNA3.1 en células de riñón embrionario humano (HEK hD1 R).
Motac (Burdeos, Francia) proporcionó secciones de cerebro de primates no humanos (NHP) Macaca mulatta, donde todos los experimentos con animales se llevaron a cabo según la legislación y las directrices éticas europeas sobre el uso de animales.
El compuesto antagonista D1 es [3H]SCH23390 (actividad específica de 73 Ci/mmol) que se obtuvo de Perkin Elmer (Zaventem, Bélgica).
El kit de ensayo dinámico de cAMP de HTRF, las células SK-N-MC de neuroepitelioma humano y todos los demás reactivos eran de grado analítico, se obtuvieron de fuentes comerciales convencionales y se utilizaron siguiendo las recomendaciones de los fabricantes.
Los datos se analizaron utilizando los softwares Excel y Graphpad Prism®. Kd, Bmax, pIC50 y pECsü y Erel se midieron mediante el ajuste de curvas computarizado según ecuaciones que describen los diferentes modelos competitivos de actividad funcional y de unión alostérica.
E.2. Ensayo funcional de cAMP HTRF D1
Al acoplarse la dopamina D1R a la proteína G de tipo Gs, su activación desencadena un aumento en la concentración
de cAMP intracelular ([cAMP]i). Los cambios en [cAMP]i se midieron usando tecnología HTRF en células SK-N-MC de neuroepitelioma humano que expresan endógenamente D1R. En una placa de 384 pocillos, se incubaron 20.000 células por pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente en un volumen final de 20 pL de solución salina equilibrada de Hank tamponada con HEPES 20 mM (tampón HBSS HEPES, pH 7,4) que contenía isobutil metilxantina 0,1 mM y 10 concentraciones crecientes de dopamina o de compuesto de fórmula (I) (10-5M a 10-12M). La reacción se terminó mediante adiciones consecutivas de 10 pl de reactivo de detección d2 y el reactivo de criptato, ambos diluidos en tampón de lisis. Después de un período de 60 min a temperatura ambiente, se determinaron los cambios en la relación de emisión de HTRF y se transformaron en [cAMP]i usando una curva estándar. Todas las incubaciones se realizaron por duplicado y los resultados se compararon con una curva de concentración-efecto de dopamina. La potencia pEC50 de un compuesto es el —log 10 de la concentración del compuesto que produce el 50% de la activación de los niveles de cAMP y el Erel es la eficacia relativa, definida como el % máximo de potenciación producido por el compuesto en comparación con la respuesta máxima producida al aumentar concentraciones de dopamina (Erel de 1 = respuesta máxima de dopamina).
Cuando se prueba en células SK-N-MC de neuroblastoma humano, el compuesto (-)-i mostró un efecto de tipo agonista parcial D1 con un pECsü de 8,3 y Erel del 53% en comparación con la dopamina. Resultados funcionales comparativos para el compuesto (-)-1 y dopamina se resumen en la Tabla 1 y se ilustran más en la Figura 1.
Tabla 1: pEC50 y valores de Erel del compuesto (-)-I y dopamina para hD1 R en células SK-N-MC
E.3 Afinidad del compuesto (±)-I por D1R humano y perfil de selectividad
La afinidad (pKi) del compuesto de fórmula (±)-(I) por D1R humano recombinante se midió en CEREP (Celle I'Evescault, Francia) por experimentos de unión competitiva de radioligando [3H]SCH23390. El compuesto (±)-I mostró un pKi de 9,2 por D1R humano.
La selectividad del compuesto por D1R humano se evaluó a 10 pM en CEREP frente a un panel de 80 dianas (n = 1 con datos por duplicado) que incluyen receptores, transportadores, enzimas y canales iónicos. Se identificó una afinidad potencialmente relevante para solo 3 dianas: receptor de dopamina D5 (D5R), receptores de taquiquinina NK1 y transportador de adenosina (ADET) con >60% de inhibición a 10 pM del compuesto (±)-(I). Se midió luego la afinidad (pKi) del compuesto de fórmula (±)-I por el receptor D5R, NK1 y ADET humanos. El compuesto de fórmula (±)-I es un ligando selectivo de tipo D1 (D1R y D5R) (pKi de 9,4 para D5R humano), porque es selectivo más de 1000 veces con respecto a las otras 79 dianas ensayadas (pKi <6,0).
E.4. Ensayo de unión de radioligando
La membrana de células HEK hD1 R se utilizó para medir la unión de radioligando.48 horas después de la transfección, las células se granularon mediante centrifugación a 1.500 g y 4°C durante 10 min. El granulado se lavó una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo y se centrifugó como se describe justo antes. El granulado se homogeneizó en un tampón que contenía Tris-HCl 15 mM, ácido etilendiaminotetraacético 0,3 mM, ácido etilenglicol tetraacético 1 mM, MgCl2 2 mM (pH 7,5) y se complementó con un cóctel inhibidor de proteasas. El homogeneizado se congeló-descongeló dos veces y se equilibró a 25°C seguido de un tratamiento con ADNasa de 10 minutos (10 U/ml). Posteriormente, la solución se centrifugó a 40.000 g y 4°C durante 30 min. Finalmente, el granulado se resuspendió en tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) que contenía sacarosa 250 mM y se almacenó a -80°C hasta el ensayo de unión de radioligando D1. La preparación de membrana de HEK hD1R (5 pg de proteínas por ensayo) se incubó durante 120 min a 25°C con (-)-(Ic) o [3H]SCH23390 en 0,2 ml de tampón de unión que contiene DMSO al 1%. Al final del período de incubación, el radioligando unido a proteína se recuperó mediante filtración a través de filtros de fibra de vidrio GF/B empapados previamente. Los filtros se lavaron con al menos 4 veces el volumen de ensayo de tampón Tris-HCl 50 mM enfriado con hielo (pH 7,4). La etapa de filtración completa no superó los 10 segundos. Los filtros se secaron y se determinó la radioactividad mediante centelleo líquido. Los ensayos de unión por saturación se llevaron a cabo utilizando concentraciones crecientes de (-)-(Ic) o [3H]SCH23390 (0,5 a 50 nM) en ausencia y en presencia de PAM D1 10 pM, compuesto a (CAS 1900706-51-5) y compuesto b (CAS 1904661-53-5), también denominado compuesto B en el párrafo E.7 y en las Figuras 5 y 6.
Se llevaron a cabo experimentos de unión de competición/potenciación a concentración de (-)-(Ic) constante (1 - 4 nM) y 10 concentraciones crecientes de (-)-(Ic) o compuesto b (10-10M a 10-5M). En todos los experimentos, la unión no específica (NSB) se definió como la unión de radioligando residual observada en presencia de 10 pM del compuesto respectivo no marcado.
El compuesto PAM D1 no tuvo ningún efecto sobre la unión radioligando antagonista D1 [3H] SCH23390 (Fig. 3A),
pero mejoró significativamente las propiedades de unión del radioligando agonista D1 (-)-(Ic) aumentando Bmax del 45% y disminuyendo Kd del 20% (Fig. 3B).
La capacidad del compuesto PAM D1 para potenciar una concentración nanomolar baja (relevante para un trazador de PET) de radioligando agonista (-)-(Ic) que se une a D1R se demostró en la figura 3C (> 50% de potenciación de la unión a (-)-(Ic) ).
Las curvas resultantes se muestran en la Figura 3.
E.5. Autorradiografía
Se prepararon cortes de cerebro de 12 pm a partir de hemisferio cerebral de NHP recién congelado y se colocaron en portaobjetos de vidrio para microscopio. El experimento de autorradiografía se realizó a temperatura ambiente en tampón HBSS HEPES (pH 7,4). Las secciones de cerebro de NHP se equilibraron primero durante 30 min antes de incubarse durante una hora con [3H]compuesto en DMSO al 1 %. A continuación, los portaobjetos se lavaron en tampón Tris-HCl 50 mM helado (pH 7,4) durante 5 min, seguido de dos lavados en agua destilada helada. Las secciones se secaron a presión atmosférica a temperatura ambiente. La radioactividad en el corte se midió indirectamente después de la exposición de los portaobjetos a una pantalla de fósforo, o bien usando un contador directo. En todos los experimentos de autorradiografía, un [3H]estándar se incluyó para la cuantificación y el NSB se definió como la unión residual de [3H]compuesto observado en presencia de compuesto no marcado 10 pM.
Cuando se prueba en autorradiografía en cortes de cerebro de NHP, de manera similar al trazador conocido tipo D1 (ver Cadet JL et al. Dopamine D1 receptors, regulation of gene expression in the brain, and neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. (2010) 9 (5): 526—538), (-)-Ic demostró una unión significativa (unión total) en el putamen caudado de acuerdo con los niveles más altos de expresión del receptor D1 encontrados en estas estructuras (Cadet et al.). Esta unión es desplazable y el 20% se evaluó como unión no específica (medida en presencia de compuesto 10 pM (I)).
En presencia de 10 pM PAM D1 Compuesto b, la unión específica a (-)-Ic aumenta significativamente (> 150%), lo que muestra que hay una potenciación significativa.
La Figura 4 muestra los resultados obtenidos en los ensayos de autorradiografía. El encarte muestra la región seleccionada para la cuantificación de datos. Los datos se representan como la media de duplicados ± desviación estándar.
E.6. Estudios de formación de imágenes PET in vivo en monos Cynomolgus
El experimento se realizó en un mono cynomolgus (hembra, peso corporal 6,02 kg). Los monos se sedaron mediante inyección intramuscular de ketamina y se mantuvieron anestesiados con una mezcla de sevoflurano, oxígeno y aire medicinal durante la duración del experimento. Se realizó una exploración inicial tras la administración intravenosa de 141 MBq de (-)-(Ia) a una actividad específica de 795 GBq/pmol y las imágenes PET del cerebro se adquirieron utilizando el escáner PET de Siemens HRRT (Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN).
Los datos se adquirieron durante 123 minutos y se agruparon en sinogramas con el siguiente marco temporal: 9 x 20 segundos; 3 x 1 min; 5 x 3 min; y 17 x 6 min. Las regiones de interés utilizadas en este estudio fueron núcleo caudado, putamen, cerebelo, corteza frontal, corteza occipital, globo pálido, mesencéfalo, estriado ventral, tálamo y corteza temporal. Se obtuvieron parámetros de registro para aplicar las regiones de interés al escaneo PET y se generaron curvas de tiempo-actividad regionales (TAC). Se extrajeron muestras de sangre venosa a los 4, 15, 30, 60, 90, 120 minutos después de la administración de (-)-(Ia) para el análisis de metabolitos.
Curvas de tiempo-actividad del valor de absorción estandarizado (SUV) de (-)-la
Las curvas de tiempo-actividad del valor de absorción estandarizado (SUV) de (-)-Ia se han adquirido en múltiples regiones de interés. La absorción máxima de (-)-Ia alcanza un SUV de aproximadamente 3,5-4 a los 5-10 minutos después de la administración en las diversas regiones del cerebro y va seguida por un lavado rápido del cerebelo para alcanzar un SUV de aproximadamente 1 a 60 minutos como se esperaba de una región de referencia desprovista de receptor D1.
El lavado de las regiones de interés caudado y putamen es significativamente más lento hasta alcanzar un SUV de aproximadamente 2 a los 60 minutos, lo que se esperaría de la distribución informada de D1 en esas regiones. Utilizando el cerebelo como región de referencia y el modelo de tejido de referencia de Logan, el potencial de unión (BPnd) se ha calculado respectivamente como 0,94 y 0,87 en el caudado y el putamen, lo que significa que el compuesto de fórmula (-)-(Ia) tiene una unión específica que puede cuantificarse de forma fiable mediante la formación de imágenes PET.
Las imágenes de SUV sumadas obtenidas entre 33 y 63 minutos demuestran un patrón de absorción de acuerdo con la autorradiografía en tejidos cerebrales y la distribución informada de D1 con alta absorción en las estructuras estriatales.
Perfil de metabolitos de compuestos de fórmula (I)
El perfil de metabolitos de (-)-Ia se determinó mediante análisis de radio-HPLC de las muestras de sangre venosa recogidas después de la administración en varios puntos temporales. La fracción original en plasma es del 85% a los 15 minutos, del 60% a los 30 minutos y todavía de aproximadamente el 45% a los 60 minutos. A diferencia de los trazadores de agonistas D1 descritos anteriormente, solo se han detectado metabolitos hidrófilos que es poco probable que atraviesen la barrera hematoencefálica.
E.7. Estudios de formación de imágenes PET de potenciación in vivo en monos Cynomolgus
Se utilizaron dos monos cynomolgus (Macaca fascicularis) alojados en MPI Research (Mattawan, Ml) como sujetos de investigación para los estudios PET de potenciación in vivo.
E.7.1. Administración de compuestos y adquisición de imágenes
Cada animal se anestesió con propofol iv en bolo (2,5-5,0 mk/kg) y se mantuvo con infusión de velocidad continua de propofol iv (CRI, 0,1-0,6 mg/kg/min) durante al menos 30 minutos antes del inicio de la administración de dosis i.v. del compuesto-B. Se administraron varios niveles de dosis. Para el nivel de dosis de 20 mg/kg (dosis total), el Compuesto-B se administró como una dosis de infusión de carga de 8,54 mg/kg; administrado a un CRI de 34,2 mg/kg/h durante un período de aproximadamente 15 minutos, seguido de una dosis de mantenimiento de la infusión de 11,45 mg/kg; para ser administrado a través de CRI a una velocidad de 17,2 mg/kg/h durante un período de aproximadamente 40 minutos. La administración del compuesto B se interrumpió después de un tiempo total de infusión de aproximadamente 55 minutos. El compuesto (-)-Ib se administró de forma iv mediante inyección en bolo, con la administración iniciada 10 minutos después del inicio de la infusión del Compuesto-B. Los datos de formación de imágenes cerebrales se adquirieron inmediatamente después del inicio de la administración del radiotrazador en el escáner microPET Focus 220 (Siemens Medical Systems, Knoxville, TN). Los datos de emisión dinámica se recopilaron en modo de lista durante 120 minutos inmediatamente después de la inyección del compuesto (-)-Ib, luego se reconstruyeron en una imagen dinámica de fotogramas múltiples (fotogramas de 6x0,5 min, 3x1 min, 2x2 min y 22x5 min). Las imágenes PET se corrigieron para la normalización del detector, el tiempo muerto, el muestreo radial no uniforme, la atenuación, la dispersión y la desintegración radiactiva utilizando software y metodologías proporcionados por el fabricante de la cámara PET.
E.7.2. Muestreo de sangre arterial
Después de la administración del compuesto (-)-Ib, se extrajeron muestras de sangre arterial de la arteria ilíaca central antes de la dosificación con el compuesto (-)-Ib y en 13 puntos temporales hasta 120 minutos después de la inyección del compuesto (-)-Ib. Todas las muestras de sangre se recogieron en tubos anticoagulantes y se almacenaron en hielo húmedo hasta la cuantificación de la radioactividad mediante un contador gamma, medida de la fracción original del compuesto (-)-Ib en plasma a lo largo del tiempo por HPLC y la estabilidad del compuesto (-)-Ib ex vivo en sangre.
E.7.3. Procesamiento y análisis de imágenes
Las imágenes PET del cerebro dinámico reconstruidas se transfirieron y analizaron utilizando el paquete de software de procesamiento de imágenes PMOD (PMOD Technologies, Zurich, Suiza). Las imágenes PET adquiridas al inicio del estudio se alinearon con las imágenes de resonancia magnética estructural (MRI) del cerebro del animal previamente adquiridas. La MRI del cerebro del animal se normalizó espacialmente a una plantilla de cerebro de mono cynomolgus de MR común y la transformación de normalización resultante se aplicó a las imágenes PET. Las imágenes PET posteriores adquiridas durante los estudios de fármacos se alinearon primero con las imágenes de la línea de base y luego se transformaron en el espacio de la plantilla de MR común utilizando la transformación ya calculada a partir de las imágenes de la línea de base.
Las regiones de interés (ROI) definidas en el espacio de la plantilla se aplicaron a las imágenes PET para calcular las curvas de tiempo-actividad (TAC). Se determinó la concentración de actividad promedio (kBq/cc) dentro de cada ROI y se generaron los TAC que representan la concentración de actividad cerebral regional a lo largo del tiempo. Los TAC cerebrales y las imágenes se presentaron en unidades SUV (g/mL) normalizando por el peso del animal y la dosis inyectada.
Se aplicó el método basado en plasma de análisis gráfico de Logan (LGA) a los TAC regionales para determinar los volúmenes totales de distribución (Vt) para cada región del cerebro. La función de entrada arterial utilizada para el modelado se generó corrigiendo la actividad plasmática de los metabolitos utilizando la fracción parental medida.
Se utilizó una gráfica de potenciación, similar en concepto a la gráfica de Lassen de ocupación global, donde VTTratamiento -VTInicial está en el eje y y VTTratamiento está en el eje x. La potenciación, definida como el aumento de una señal específica, potenciación = VsTratamiento/ VTInicial donde Vs es el volumen de distribución específico, se puede derivar de la gráfica de potenciación como pendiente/(pendiente 1) de la gráfica, mientras que el volumen de distribución no desplazable (Vnd), viene dada por la intersección con el eje x de la gráfica.
E.7.4. Resultados
Las imágenes SUV PET promediadas (ponderadas en el tiempo) durante 40-90 min adquiridas al inicio y después de la dosificación con compuesto-B a 20 mg/kg y las curvas de tiempo-actividad asociadas se muestran en la Figura 5. Ambas imágenes muestran el efecto del Compuesto-B sobre la absorción del compuesto-B, donde se observa una absorción aumentada debido a la potenciación del compuesto (-)-Ib por la unión del compuesto-B al sitio alostérico D1.
Para cuantificar el efecto de potenciación, el volumen de distribución (Vt) se estimó a partir de las curvas de actividad en el tiempo al inicio y después de la dosificación con el compuesto-B usando LGA. A 20 mg/kg, se observó un aumento de -100% en promedio en el núcleo caudado y el putamen en un macaco cynomolgus.
La gráfica de potenciación se muestra en la Figura 6 para el núcleo caudado, el putamen, el estriado ventral, el pálido, la sustancia negra, la ínsula, el cingulado y el cerebelo.
A partir del gráfico, se estimó que la potenciación era aproximadamente 136% para una dosis total de compuesto-B de 20 mg/kg, infundido durante 55 min.
Claims (14)
1. Un compuesto de fórmula (I),
cuyo compuesto está radiomarcado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que al menos uno de los hidrógenos es 3H; o al menos uno de los carbonos es un 11C; o el átomo de flúor es un 18F.
3. El compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, representado por la fórmula (Ia), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
4. El compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, representado por la fórmula (lb), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en el que el flúor es un 18F.
5. El compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, representado por la fórmula (Ic), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en el que uno o más de los hidrógenos es 3H.
6. El compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que consiste esencialmente en atropisómero (-).
7. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad detectable de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. El compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso como trazador radiactivo.
9. El compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 8 para su uso en un método de cuantificación de la densidad de receptores de tipo D1.
10. El compuesto de fórmula (Ia) según la reivindicación 3 o el compuesto de fórmula (Ib) según la reivindicación 4, o la composición farmacéutica según la reivindicación 7, para su uso en un método de formación de imágenes PET in vivo.
11. El compuesto de fórmula (Ia) según la reivindicación 3 o el compuesto de fórmula (Ib) según la reivindicación 4, para su uso en un método de formación de imágenes PET in vivo y medición de la unión a la diana de un modulador agonista ortostérico de receptores tipo D1.
12. El compuesto de fórmula (Ia) según la reivindicación 3 o el compuesto de fórmula (Ib) según la reivindicación 4, para su uso en la cuantificación in vivo del efecto de los moduladores alostéricos D1 sobre el receptor D1.
13. Uso de un compuesto de fórmula (Ic) según la reivindicación 5 para medir in vitro o ex vivo la unión a la diana de un modulador agonista ortostérico de receptores tipo D1.
14. Uso de un compuesto de fórmula (Ic) según la reivindicación 5 para cuantificar in vitro o ex vivo el efecto de los moduladores alostéricos D1 sobre el receptor D1.
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