ES2900148T3 - Dispositivo de obtención de imágenes basado en láminas de luz con profundidad de campo aumentada - Google Patents
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Abstract
Microscopio de lámina de luz para el registro de imágenes en 3D de una muestra, que comprende un generador de lámina de luz (1) y una unidad de escaneo de lámina (8) que produce una lámina de luz (8a) que se escanea a través de la muestra, una lente objetivo (4) y un detector de imágenes (5) y que está caracterizado porque además comprende un elemento o sistema codificador de frente de onda (7) situado entre la lente objetivo (4) y el detector de imágenes (5) en el plano de la pupila de salida o en un plano conjugado de la lente objetivo (4), para ampliar la profundidad de campo de la lente objetivo (4), y que comprende además una unidad de sincronización (9) para sincronizar el detector de imágenes (5) con la unidad de escaneo (8) para adquirir con la lámina de luz (8a) las funciones de dispersión de puntos (PSF) y las imágenes 2D en cada posición en la dirección z, y una unidad de procesamiento digital (6) para decodificar las imágenes 2D con un proceso de deconvolución, utilizando las funciones de dispersión de puntos a diferentes profundidades que se han medido previamente en diferentes posiciones de la lámina de luz en la dirección z, y transformar las imágenes 2D deconvuladas en una imagen 3D.
Description
DESCRIPCIÓN
Dispositivo de obtención de imágenes basado en láminas de luz con profundidad de campo aumentada
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere a dispositivos de obtención de imágenes tales en los que una muestra se ilumina por medio de una lámina de luz y se forma una imagen con un objetivo cuya profundidad de campo se ha ampliado mediante el uso de un elemento o sistema codificador de frente de onda.
Descripción de la técnica relacionada
La microscopía de lámina de luz (LSM) es una técnica en la que una muestra investigado se ilumina con una lámina de luz láser de forma que la fluorescencia emitida por la muestra se registra en la dirección ortogonal con un detector de imágenes (como un CCD, CMOS, cámaras sCMOS o equivalentes/similares) (Fig. 1). Al mover el objeto se obtienen secciones ópticas que pueden combinarse para obtener una representación 3D del objeto.
La LSM tiene una amplia gama de variantes que se han desarrollado en los últimos años, adoptando nombres como Microscopía de Iluminación Plana Selectiva (SPIM), ultramicroscopía, Microscopía de Fluorescencia de Lámina de Luz Láser Digital (DSLM), Seccionamiento Óptico de Fluorescencia Plana Ortogonal (OPFOS), Microscopía de Lámina de Luz Láser Fina (TLSM), Iluminación Plana Acoplada al Objetivo (OCPI), entre otros. (Véase, por ejemplo, Siedentopf, H. & Zsigmondy, R., Ann. Phys. -Berlin 10 , 1 -39 ( 1902) ; Voie, A. H. , et al., J. Microsc. -Oxf. 170 , 229-236 ( 1993) ; Fuchs, E. , et al. , Opt. Express 10 , 145- 154 (2002) ; Huisken, J., et al. , Science 305, 1007 1009 (2004) ; Holekamp, T. F. , et al., Neuron 57, 661 -672 (2008) ; Dodt, H. U. et ai, Nat. Methods A, 331 -336 (2007) ; Huisken, J. & Stainier, D. Y. R. , Development s, 1963- 1975 (2009) ; y Keller, P. J. & Stelzer, E. H. K., Curr. Opin. Neurobiol. 18, 624-632 (2008), y las patentes US2012098949 A1, US 20070109633 A1, EP 2444833 A1 y EP 2494399 A2.
En una realización típica de LSM, la luz de una fuente, generalmente un láser, se adapta para generar una lámina de luz. La lámina de luz puede crearse utilizando una lente cilíndrica, ya que estos elementos ópticos enfocan el haz en una dirección (z) perpendicular a la propagación del haz (x). Esto da lugar (a efectos de esta patente) a una lámina de luz en el plano x-y. La figura 1 muestra un esquema de un sistema de microscopía de lámina de luz estándar de este tipo. La iluminación de la lámina de luz se envía a la muestra. La muestra se suele girar o trasladar a través de la lámina de luz. La detección de la señal generada se realiza de forma ortogonal a la lámina de luz.
Un procedimiento alternativo consiste en crear la lámina de luz de forma dinámica utilizando un haz de igual o similar anchura o sección en las direcciones y y z y escaneando el haz en la dirección y, a gran velocidad, para crear la lámina de luz. En este último caso, el haz puede tener diferentes perfiles de intensidad transversales, por ejemplo, un haz de Gauss o haces de Bessel. También podrían utilizarse otros perfiles de intensidad del haz, como patrones 2D o 3D generados por interferencia de luz. Una vez generada la lámina de luz, se utiliza para iluminar la muestra de la que se va a formar la imagen.
La figura 2 muestra un esquema detallado de este sistema estándar de microscopía de lámina de luz. Un generador de láminas de luz, 1, proyecta la lámina de luz sobre la muestra. La muestra se apoya en un soporte para la muestra, 2, que normalmente está contenido en una cámara fisiológica, 3, y se mueve en la dirección z, o gira (no se muestra en la imagen para mayor claridad) a través de la lámina de luz. La luz generada es captada ortogonalmente a la lámina de luz por una lente objetivo, 4, que proyecta una imagen de la luz generada de la parte iluminada del objeto sobre una unidad de detección, 5. La unidad de detección contiene un detector de imágenes y puede incluir también otros elementos, como lentes de tubo, sistemas de zoom, filtros, etc. Las imágenes capturadas son entonces procesadas digitalmente por la unidad de procesamiento digital, 6, para recuperar la información de la muestra. La luz generada en la muestra suele describirse mediante alguno de los siguientes procesos físicos: luz reflejada/refractada/dispersada, generación de fluorescencia por absorción de un fotón o de dos fotones, generación de luz de segundo y tercer armónico, entre otros. A continuación, la señal generada se detecta en la dirección z, que es perpendicular a la lámina de luz (es decir, perpendicular tanto a la dirección x como a la y) para formar una imagen en un detector de imágenes mediante un objetivo de captación y un sistema de obtención de imágenes adecuado (véase la Fig. 2). El punto clave de esta disposición es que el objetivo de captación debe estar a una distancia en la dirección z igual a la distancia focal del objetivo, con una tolerancia correspondiente a la profundidad de campo del objetivo (del orden de unas pocas micras) para obtener de este modo una imagen 2D clara generada por el plano iluminado con la lámina de luz. Como puede verse en la figura 3, en la LSM estándar, la lámina de luz se proyecta en la muestra a través de un generador de lámina de luz, 1. La lente del objetivo, 2, se sitúa a una distancia igual a su distancia focal de la posición de la lámina de luz. Esta distancia se mantiene fija dentro de la profundidad de campo (DoF) del objetivo. La lente objetivo forma una imagen 2D del objeto que está siendo iluminado por la lámina de luz. En este caso, la profundidad de campo de la lente objetivo viene determinada por el objetivo utilizado.
Para obtener una imagen en 3D, la lámina de luz debe iluminar las diferentes partes de la muestra. Dado que la distancia entre la lámina de luz y el objetivo debe mantenerse igual a la distancia focal, el enfoque más habitual para obtener el conjunto de imágenes 2D consiste en un desplazamiento (véase la Fig. 4A) o en la rotación de la muestra (Fig. 4B). Esto dará como resultado una captación de imágenes 2D que se combinan por ordenador para generar una imagen 3D. Alternativamente, la lámina de luz puede ser escaneada (desplazada) en la dirección z, pero en este caso, el objetivo de captación debe ser también desplazado en la dirección z para mantener la distancia con la lámina de luz constante (ver Fig. 4C).
Dado que en todas las realizaciones de LSM la distancia entre el objeto y la lámina de luz es fija y debe permanecer constante, todos los montajes realizados hasta la fecha presentan una serie de problemas:
■ La alineación es fundamental. La distancia del objetivo a la lámina de luz debe ajustarse con una precisión de micras dentro de la DoF del objetivo, y la lámina de luz debe estar a 90° del eje óptico del objetivo de captación.
■ Un cambio del objetivo de captación requiere una realineación y un ajuste de la distancia entre el objeto y la lámina de luz.
■ Los cambios en el índice de refracción interno de la muestra modifican efectivamente la distancia focal del objetivo y pueden inducir deformaciones, curvaturas y otras inhomogeneidades de la lámina de luz. Esto puede dar lugar a una pérdida de la posición focal y, por tanto, a una imagen borrosa.
■ Para obtener una imagen en 3D
• Es necesario mover el objeto (en la dirección z o girarlo).
• Tanto la lámina de luz como el objetivo de captación deben ser escaneados (desplazados) en la dirección z, manteniendo siempre constante la distancia con la lámina de luz.
Ambos inducen movimientos mecánicos u ondas de presión que pueden interferir con la muestra y la medición.
■ Todos los puntos mencionados anteriormente impiden que la técnica se utilice para la obtención rápida de imágenes 3d de muestras biológicas. Además, para la obtención de imágenes in vivo, el movimiento puede perturbar el comportamiento y el desarrollo de la muestra, lo que da lugar a una técnica invasiva.
Codificación de frente de onda
La codificación de frente de onda (WFE) se refiere al uso de un elemento o sistema de modulación de fase junto con un algoritmo de deconvolución para ampliar la profundidad de campo (EDoF) de un sistema de obtención de imágenes al tiempo que se mantiene eficientemente el rendimiento lumínico del sistema (véanse, por ejemplo, las patentes PCT/US1999/009546, US6940649 B2, US7583442 B2).
En general, en la WFE, el elemento o sistema de modulación de fase es una máscara o una combinación de elementos ópticos que se coloca en el plano de la pupila de salida (o en cualquiera de sus planos conjugados) de la lente de obtención de imágenes (por ejemplo, de un objetivo) o del sistema de obtención de imágenes. El elemento o sistema WFE introduce una diferencia de trayectoria óptica que da lugar a una modulación de fase. Por ejemplo, en la transmisión por cambios en el índice de refracción, el grosor o las variaciones en la transmitancia/absorbancia del elemento WFE, en la reflexión por variaciones en el perfil de la superficie del elemento WFE.
Los elementos de fase de codificación de frente de onda pueden, en general, describirse mediante la fórmula que describe el perfil de fase espacial introducido por la WFE a la luz que lo atraviesa:
fase(
Donde j es la unidad de obtención de imágenes, k,I son números enteros y .0 < k j. < oo ESfa fórmula puede interpretarse como: cualquier máscara de fase destinada a la extensión de la DdF puede generarse como una combinación lineal de polinomios de Legendre sobre una forma de pupila predefinida. Cualquier representación equivalente que utilice otras bases (por ejemplo, polinomios de Zernike) puede transformarse a dicha fórmula realizando la correspondiente transformación lineal de cambio de base. El elemento WFE cúbico, que es la implementación más común, ha demostrado ofrecer un buen equilibrio entre la extensión de la DoF y la sensibilidad al ruido en el paso de post-procesamiento. Esta familia de máscaras puede ser descrita por:
donde r* representa la fuerza de la máscara. Para valores altos de <>la invarianza de la PSF se extiende a volúmenes más grandes, pero también aumenta la amplificación del ruido en las imágenes post-procesadas. En las
aplicaciones de microscopía, la presencia de la aberración esférica es un problema importante que puede mitigarse mediante el uso de la codificación del frente de onda. Para ello, puede utilizarse un Pm cúbico generalizado de la forma
fase(a;, y) = e x p ( j [a (x 3 y3) f3(x2y y2x)\)
donde los valores de « y $ son optimizados para los requerimientos de cada experimento en particular. Cuando $ — — 3o-; |a primera ecuación puede escribirse en forma polar como
fasefp. 9) — exp ( j[ap3 cos(30)])
Aquí P y 0 son el radio normalizado de la pupila y el ángulo azimutal, respectivamente. Esta expresión se asemeja a los componentes del trébol de los polinomios de Zernike, lo que permite una síntesis directa de estas máscaras en cualquier modulador basado en la corrección del frente de onda, como los espejos deformables y los moduladores espaciales de luz.
Otra familia especial de elementos WFE que se puede implementar se basa en una simetría rotacional dada por:
fase
Donde P son el radio normalizado de la pupila y « está relacionado con el ángulo del cono que determina la cantidad de extensión de la DoF. En el caso particular de k=1 se refiere a una lente cónica o axicón que puede describirse como:
fase(J) = exp | ja p |
Se puede obtener más flexibilidad para ajustar la DoF cambiando la dependencia polinómica del perfil de fase por una logarítmica, que puede expresarse como
O
fase(p) = e x p ( - ^ — ln(/? a p 2))
' ¿ o í
Donde a y $ se pueden variar para ajustar la extensión de la DoF. La primera ecuación describe la versión hacia atrás y la última la versión hacia delante del axicón logarítmico.
También se pueden utilizar otras fases con diferentes formas que son capaces de aumentar la DoF de un sistema de obtención de imágenes y que no se mencionan aquí.
En todos los casos, la imagen 3D grabada resultante se procesa para recuperar la imagen 3D final. Para ello se pueden utilizar procedimientos de deconvolución adecuados.
Los microscopios de campo amplio estándar sólo son capaces de visualizar correctamente objetos situados a la distancia focal del objetivo (véase la Fig. 5A). Convertir un microscopio de campo amplio estándar en un sistema WFE con una profundidad de campo aumentada es sencillo. El elemento WFE está diseñado para producir una determinada DoF y simplemente se coloca en la pupila posterior del objetivo del microscopio. Una vez que se conoce el elemento WFE, se puede diseñar un filtro inverso digital adecuado midiendo la PSF. La restauración digital se realiza entonces mediante deconvolución. El resultado es una imagen 2D que es la proyección dentro de la dirección de la DoF aumentada del objeto del que se obtiene la imagen en 3D (véase la Fig. 5B).
Sin embargo, la WFE utilizada por sí sola presenta varios problemas a la hora de obtener imágenes de un objeto 3D:
■ La estructura 3D se codifica en la imagen 2D resultante, pero la imagen 3D no puede recuperarse. Esto es incompatible con el concepto de seccionamiento óptico y da lugar a un sistema incapaz de discriminar la profundidad.
■ La WFE puede introducir un desplazamiento lateral en la imagen de las características de la muestra en planos alejados de la posición de mejor enfoque. Esto introduce artefactos en la imagen resultante que no pueden ser identificados ni corregidos con el post-procesamiento de la imagen.
■ La WFE provoca un cambio de la ampliación a lo largo del eje z (proyección en perspectiva), que introduce artefactos en la imagen y que no pueden ser identificados, ni corregidos con el post-procesamiento de la imagen.
■ La región iluminada de la muestra fuera de la DoF aumentada diseñada aparece como un ruido (un desenfoque) en la imagen 2D resultante.
■ Para reconstruir eficazmente la imagen, los algoritmos de WFE requieren que la función de dispersión de puntos (PSF) sea invariable a lo largo de la DoF. Esto no suele ser así.
Sumario de la invención
La presente invención consiste en el uso de un elemento o sistema de codificación de frente de onda (WFE) que se coloca en la pupila de salida de la lente objetivo en el brazo de captación de un microscopio de lámina de luz (LSM). Este elemento o sistema WFE se utiliza para ampliar la profundidad de campo del sistema de obtención de imágenes en LSM.
Combinando las técnicas LSM y WFE es posible superar varios problemas relacionados, como se ha mencionado anteriormente. En resumen, el uso de WFE en el brazo de detección del LSM da lugar a una DoF aumentada que relaja la restricción de la distancia entre el objetivo de captación y la lámina de luz. Como resultado, la alineación no es crítica, no es necesario reajustar cuidadosamente la distancia del objetivo si se sustituye por otro, los cambios en la distancia focal del objetivo y las deformaciones de la lámina de luz causadas por las variaciones en el índice de refracción interno de la muestra no son críticas y, por último, permite una rápida obtención de imágenes en 3D con sólo escanear la lámina de luz a través del objeto sin necesidad de mover ni la muestra ni el objetivo de captación. Además, gracias al escaneo de la lámina de luz, los problemas descritos anteriormente en las técnicas WFE no están presentes en la invención, ya que la reconstrucción 3D es posible, el desplazamiento lateral y el cambio en el aumento pueden ser calibrados y corregidos, la amplitud de escaneo puede ser ajustada a la DoF para evitar el ruido de luz generado fuera de la DoF y la PSF puede ser calibrada en cada plano. Una última ventaja del enfoque mixto presentado es que las técnicas WFE mitigan las aberraciones en la trayectoria de detección.
Breve descripción de los dibujos
Para completar la descripción y con el fin de proporcionar una mejor comprensión de la invención, se proporciona un conjunto de dibujos. Dichos dibujos ilustran una realización preferente de la invención, lo cual no debe interpretarse como una restricción del alcance de la invención, sino sólo como un ejemplo de cómo se puede materializar la invención.
La figura 1 muestra un esquema de un sistema estándar de microscopía de lámina de luz.
La figura 2 muestra un esquema detallado de un sistema estándar de microscopía de lámina de luz.
La figura 3. representa una LSM estándar.
La figura 4 muestra cómo hay que desplazar la muestra y/o la lente del objetivo en la LSM
La figura 5 muestra el concepto de codificación del frente de onda.
La figura 6 es un esquema del concepto de WFE utilizado en la invención.
La figura 7 muestra el esquema básico de la invención.
La figura 8 es una realización particular de la invención.
Descripción de la invención
La invención se basa en el uso de la WFE para ampliar la profundidad de campo del objetivo de captación en la microscopía de lámina de luz (LSM).
Un microscopio de lámina de luz está compuesto por una fuente de luz, generalmente un láser, un generador de lámina de luz, una cámara con el soporte de la muestra. Perpendicular a la dirección del plano de la lámina de luz se encuentra el sistema de obtención de imágenes que incluye un objetivo de captación situado a una distancia de la lámina de luz igual a la distancia focal, y un detector de imágenes (como una cámara CCD, CMOS, sCMOS o equivalente/similar).
Según la invención, se coloca una WFE, 7, en el plano de la pupila de salida (o en cualquiera de sus planos conjugados) de la lente del objetivo (véase la Fig. 6). La lámina de luz creada por el generador de láminas de luz se escanea en la dirección z mientras la lente del objetivo, 4, y la muestra se mantienen estáticas. Colocando un elemento/sistema de codificación de frente de onda (WFE), 7, en la pupila de salida (o en cualquiera de sus planos conjugados) de la lente del objetivo, 4, se aumenta su profundidad de campo. Al escanear la lámina de luz a través
de la muestra y dentro de la DoF aumentada, se pueden captar imágenes 2D para cada posición z de la lámina de luz para crear una imagen 3D.
El elemento WFE es un elemento óptico único, mientras que el sistema WFE es una combinación de elementos ópticos. Ambos dan lugar a una modulación de fase descrita por una combinación lineal de polinomios de Legendre, una función cúbica, una función cúbica generalizada, una función cúbica generalizada detallada, un polinomio con simetría de rotación que incluye axicones y logaritmos y todas las fases del frente de onda descritas en la sección de antecedentes o cualquier equivalente que dé lugar a una DoF aumentada.
El elemento WFE puede funcionar en configuraciones de transmisión o reflexión y la modulación de fase requerida puede introducirse mediante cambios en el índice de refracción, el grosor del material o variaciones en el perfil de la superficie. Están diseñados para colocarse entre la lente del objetivo y la unidad de detección, normalmente en el plano de la pupila de salida de la lente del objetivo. Algunos ejemplos son máscaras de fase, espejos de forma rígida, espejos deformables, moduladores espaciales de luz (SLM) de cristal líquido, elementos ópticos difractivos, elementos holográficos, microespejos, elementos fotorrefractivos y axicones.
El sistema WFE también puede funcionar en transmisión o reflexión y la modulación de fase requerida puede ser introducida por cambios en el índice de refracción, el espesor del material, variaciones en el perfil de la superficie y variaciones en la transmitancia/absorbancia. Se diseñan normalmente para colocarse en un plano conjugado, normalmente utilizando una configuración 4f, con el plano de la pupila de salida de la lente objetivo. Ejemplos de ello son los sistemas ópticos que incorporan lentes refractivas o difractivas en combinación con máscaras de fase, espejos de forma rígida, espejos deformables, cristales líquidos SLM, elementos ópticos difractivos, elementos holográficos, microespejos, elementos fotorrefractivos, axicones, máscaras de amplitud, máscaras binarias.
En el caso de utilizar espejos deformables (DM) o moduladores espaciales de luz (SLM), el perfil de la superficie, la transmisión o el índice de refracción pueden modificarse activamente para adaptar la profundidad de campo a cualquier requisito específico. Esto puede hacerse mediante el uso de sensores de frente de onda (WS). El WS se calibra previamente y se utiliza para medir el frente de onda en la pupila o en cualquier plano conjugado del sistema de obtención de imágenes. A través de un bucle de retroalimentación, el WS establece la forma deseada al DM o SLM que produce la modulación de fase requerida.
La figura 7 ilustra una realización generalizada de la invención, que no debe interpretarse como una restricción del alcance de la invención, sino sólo como un ejemplo de cómo puede realizarse la invención. Como se muestra en la figura 7, una lámina de luz, creada por un generador de láminas de luz, 1, se proyecta en la muestra que es sostenido por un soporte para la muestra, 2, y puede ser colocado dentro de una cámara apropiada, 3, para asegurar las condiciones adecuadas para preservar la muestra. Una unidad de exploración de la lámina de luz z, 8, está incorporada al generador de la lámina de luz para desplazar axialmente (dirección z) la lámina de luz. La lente del objetivo, 4, se mantiene fija y su DoF se aumenta mediante el elemento o sistema WFE, 7, que se coloca en el plano de la pupila de salida o en cualquiera de sus planos conjugados. Una unidad de detección, 5, capta las imágenes generadas por la lámina de luz de forma sincronizada, mediante una unidad de sincronización, 9, a medida que la lámina de luz se desplaza en la dirección z. A continuación, una unidad de procesamiento digital, 6, obtiene una imagen tridimensional, después de haberla decodificado adecuadamente mediante un proceso de deconvolución adecuado.
Descripción de una realización preferente
La figura 8. Muestra una realización preferente de la invención basada en un sistema WFE que no debe interpretarse como una restricción del alcance de la invención, sino sólo como un ejemplo de cómo puede aplicarse la invención en la práctica.
-- El generador de la lámina de luz consiste en una lente cilíndrica, 10, y una lente de excitación, 11, separadas por la suma de sus distancias focales. Esto produce una lámina de luz en el plano x, y, en la posición focal de la lente de excitación.
-- La unidad de exploración de la lámina de luz z, 8, consiste en un espejo galvanométrico que explora el haz de excitación en la dirección z. Está situado a una distancia igual a la distancia focal de la lente de excitación. -- La muestra, situada en el plano de la muestra, es sujetada por un portamuestras, 2, con seis grados de libertad, posición (x, y, z) y ángulos (0, 0xz y 0yz). La cámara, 3, contiene las condiciones adecuadas para permitir la excitación óptica y la captación de la luz mientras se mantienen las condiciones adecuadas para la muestra (humedad, temperatura, pH, presión osmótica, etc.).
-- La lente objetivo, 4, se coloca a una distancia igual a su distancia focal del eje óptico del brazo de excitación. -- En el brazo de detección se coloca un sistema de codificación de frente de onda. Éste se compone de un sistema de relés, que consiste en un par de lentes de relé, 16 y 18, que conjugan la pupila de salida de la lente objetivo, 12, con la superficie de un espejo deformable, 19 (los espejos, 15 y 17, se utilizan sólo para dirigir el haz). El espejo deformable se utiliza para producir la modulación de fase apropiada requerida para la
codificación del frente de onda, típicamente una máscara de fase cúbica. Este sistema WFE también incorpora un sensor de frente de onda, 23, para asegurar la forma adecuada del espejo según la modulación de fase requerida. Nótese que, por comodidad, hemos incorporado un sensor de frente de onda que sólo es necesario para la calibración del espejo. En nuestra configuración, el sensor de frente de onda se coloca en un plano conjugado de la superficie del espejo utilizando un par de lentes de relé, 13 y 22. El espejo 21 sólo se utiliza para dirigir la luz hacia el sensor de frente de onda y tiene que ser retirado de la trayectoria óptica una vez que se produce la fase correcta en el espejo deformable.
-- La unidad de detección consiste en una lente tubular, 13, que se utiliza para enfocar la luz captada por la lente objetivo, 4, hacia la zona activa del detector de imágenes 2D, 14 (el espejo 21 se retira de la trayectoria óptica). La captación de las imágenes se realiza de forma sincronizada con el desplazamiento de la lámina de luz en dirección z mediante una unidad de sincronización, 9.
-- El sistema puede utilizarse como un LSM normal quitando los espejos 15, 20 y 21.
De acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, una lámina de luz, creada por cualquier procedimiento, colocada dentro de la EDoF, será correctamente captada por la unidad de detección. Esto relaja el requisito de distancia entre la lámina de luz y el objetivo, lo que resulta en una alineación más sencilla.
De acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, una vez que el elemento WFE diseñado se coloca entre la lente del objetivo y la unidad de detección, la lente del objetivo puede ser reemplazada y no es necesario un reenfoque crítico.
De acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, una lámina de luz, creada por cualquier procedimiento, que se deforma por los cambios de índice de refracción en la muestra, puede ser correctamente captada por la unidad de detección en la medida en que la lámina de luz cae dentro de la DoF aumentada.
De acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, el desplazamiento en la posición de la lámina de luz y en la longitud focal de la lente objetivo que son causados por los cambios en el índice de refracción de la muestra puede ser correctamente captada por la unidad de detección ya que la lámina de luz todavía cae dentro de la DoF aumentada. Esto puede lograrse ya que normalmente la DoF aumentada es del orden de decenas a cientos de micras y el desplazamiento del foco es del orden de unas pocas micras.
De acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, una lámina de luz escaneada en la dirección z dentro de los límites de la DoF aumentada será correctamente captada por la unidad de detección para cualquier posición de la lámina de luz (Fig. 6). Por lo tanto, se pueden capturar imágenes 2D en diferentes posiciones z de la lámina de luz para reconstruir una imagen 3D sin necesidad de mover ni la muestra ni el objetivo de captación. De este modo, el movimiento mecánico y las ondas de presión no afectan a la muestra, y el desarrollo y la viabilidad del mismo no se ven comprometidos. En este caso, el procedimiento para escanear la lámina de luz en la dirección z puede producirse por cualquier medio, incluidos los espejos mecánicos, accionados por motores de pasos o galvanómetros, el modulador acústico-óptico (AOM), los dispositivos digitales de microespejos (DMD/DLP), las válvulas de luz de rejilla, los deflectores de luz digitales de cristal líquido, los deflectores de luz digitales inorgánicos o los espejos giratorios poligonales. En este caso, la velocidad de obtención de imágenes en 3D sólo está limitada por la velocidad dada por el sistema de escaneo y el tiempo de captura de la unidad de detección. De acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, tanto el desplazamiento lateral de la imagen de la muestra como el aumento causado por el elemento WFE pueden caracterizarse para cualquier posición de la lámina de luz en la dirección z, y corregirse con técnicas de post-procesamiento de imágenes. Un procedimiento para corregir ambos efectos consiste en utilizar una muestra de microperlas para adquirir funciones de dispersión de puntos (PSF) a diferentes profundidades. Estas PSF se adquieren tanto con el sistema de lámina de luz estándar como con el sistema de lámina de luz EDOF. Posteriormente se emplea un proceso de registro de imágenes, obteniendo los operadores de transformación para la traslación, la rotación y la deformación a partir de las coordenadas espaciales X, Y, Z de las mismas microperlas obtenidas con ambos sistemas ópticos. A continuación, cualquier imagen 3D de una muestra puede reconstruirse correctamente utilizando los operadores de transformación obtenidos.
Según cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, la posición de la lámina de luz y/o la amplitud del escaneo de la lámina de luz en la dirección z pueden ajustarse para que queden dentro de la DoF. Por lo tanto, ninguna región fuera de la DoF aumentada se ilumina y no da lugar a ruido en las imágenes 2D resultantes.
De acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, la PSF puede ser caracterizada para cualquier posición de la lámina de luz en la dirección z, y por lo tanto la naturaleza invariante de la PSF en la dirección z ya no es necesaria. En consecuencia, pueden evitarse los artefactos presentes en los microscopios tradicionales de DOF aumentada que dependen de una única PSF invariante para restaurar digitalmente todo el volumen.
Al igual que la LSM clásica, la presente invención puede aprovechar las ventajas de tener una DOF aumentada para combinar la LSM con otras técnicas de microscopía, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica
(STORM), la microscopía de luz de fotoactivación (PALM), la microscopía de iluminación estructurada (SIM), la microespectroscopía Raman, la microscopía de transferencia de energía resonante de Foster (FRET), microscopía de agotamiento de la emisión estimulada (STED), tomografía de proyección óptica (OPT), obtención de imágenes ratiométricas, anisotropía de la polarización, etc., pero con la ventaja de que es una técnica no invasiva (no perturbadora), rápida y ultraestable, capaz de obtener imágenes de muestras grandes y de seguir la dinámica rápida in vivo o el seguimiento rápido de una sola partícula.
En este texto, el término "comprende" y sus derivaciones (como "que comprende", etc.) no deben entenderse en un sentido excluyente, es decir, estos términos no deben interpretarse como excluyentes de la posibilidad de que lo descrito y definido pueda incluir otros elementos, pasos, etc.
Claims (10)
1. Microscopio de lámina de luz para el registro de imágenes en 3D de una muestra, que comprende un generador de lámina de luz (1) y una unidad de escaneo de lámina (8) que produce una lámina de luz (8a) que se escanea a través de la muestra, una lente objetivo (4) y un detector de imágenes (5) y que está caracterizado porque además comprende un elemento o sistema codificador de frente de onda (7) situado entre la lente objetivo (4) y el detector de imágenes (5) en el plano de la pupila de salida o en un plano conjugado de la lente objetivo (4), para ampliar la profundidad de campo de la lente objetivo (4), y que comprende además una unidad de sincronización (9) para sincronizar el detector de imágenes (5) con la unidad de escaneo (8) para adquirir con la lámina de luz (8a) las funciones de dispersión de puntos (PSF) y las imágenes 2D en cada posición en la dirección z, y una unidad de procesamiento digital (6) para decodificar las imágenes 2D con un proceso de deconvolución, utilizando las funciones de dispersión de puntos a diferentes profundidades que se han medido previamente en diferentes posiciones de la lámina de luz en la dirección z, y transformar las imágenes 2D deconvuladas en una imagen 3D.
2. Microscopio de lámina de luz según la reivindicación 1, en el que el codificador de frente de onda es un elemento óptico único que está adaptado para introducir una diferencia de trayectoria óptica que da lugar a una modulación de fase descrita por una combinación lineal de polinomios de Legendre, un perfil cúbico o un polinomio con simetría de rotación.
3. Microscopio de lámina de luz según la reivindicación 2, en el que el elemento WFE puede trabajar en configuración de transmisión o reflexión.
4. Microscopio de lámina de luz según la reivindicación 2, en el que el elemento WFE (7) es una máscara de fase.
5. Microscopio de lámina de luz según la reivindicación 2, donde el elemento WFE (7) es un axicón.
6. Microscopio de lámina de luz según la reivindicación 1, en el que el sistema codificador de frente de onda es una combinación de elementos ópticos que está adaptada para introducir una diferencia de trayectoria óptica que da lugar a una modulación de fase descrita por una combinación lineal de polinomios de Legendre, un perfil cúbico o un polinomio con simetría de rotación
7. Microscopio de lámina de luz según la reivindicación 6, en el que el sistema WFE puede trabajar en configuración de transmisión o reflexión.
8. Microscopio de lámina de luz según la reivindicación 6, en el que el sistema de codificación de frente de onda (7) está compuesto por un espejo deformable (19) y un sistema de relés, formado por un par de lentes de relé, (16, 18) que conjugan la pupila de salida de la lente objetivo (12), con la superficie del espejo deformable (19) cuyo perfil de superficie se modula para dar lugar a una DoF aumentada.
9. Microscopio de lámina de luz según la reivindicación 8, en el que un sensor de frente de onda, (23) está colocado en un plano conjugado de la superficie del espejo para medir y controlar la modulación de fase introducida por el espejo deformable.
10. Un microscopio de lámina de luz según las reivindicaciones 2 y 6, en el que el elemento o sistema WFE se cambia activamente para adaptar la profundidad de campo a un requisito específico.
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