ES2900859T3 - Portador en fase sólida, portador en fase sólida unido a un ligando, procedimiento para detectar o separar la sustancia objetivo y procedimiento para producir un portador en fase sólida - Google Patents
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Abstract
Un portador en fase sólida que comprende un polímero que incluye una unidad estructural representada por la siguiente Fórmula (1) y una unidad estructural representada por la siguiente Fórmula (2) unida a ella: **(Ver fórmula)** en el que en la Fórmula (1), R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y R2 representa un grupo orgánico que tiene una estructura zwitteriónica, **(Ver fórmula)** en la Fórmula (2), R3 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; R4 representa -(C=O)-O-*, -(C=O)-NR6-* (en la que R6 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y el símbolo * representa una posición de enlace con R5 en la Fórmula (2)), o un grupo fenileno; en un caso en el que R4 representa -(C=O)-O-*, R5 representa un átomo de hidrógeno, o un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo, o en un caso en el que R4 representa -(C=O)-NR6-* o un grupo fenileno, R5 representa un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo, siempre que R5 no sea un grupo orgánico con estructura zwitteriónica, en la que la distribución del peso molecular del polímero es de 1,0 a 2,5, en la que el polímero es un polímero en bloque que incluye un primer bloque compuesto por unidades estructurales dispuestas repetidamente representadas por la Fórmula (1), y un segundo bloque compuesto por unidades estructurales dispuestas repetidamente representadas por la Fórmula (2), y en la que la proporción de polimerización [m/(m + n)] es de 0,1 a 0,35, en la que n es el grado medio de polimerización de la unidad estructural representada por la Fórmula (1) por polímero y m el grado promedio de polimerización de la unidad estructural representada por la Fórmula (2) por polímero.
Description
DESCRIPCIÓN
Portador en fase sólida, portador en fase sólida unido a un ligando, procedimiento para detectar o separar la sustancia objetivo y procedimiento para producir un portador en fase sólida
Campo técnico
La presente invención se refiere a un portador en fase sólida, un portador en fase sólida unido a un ligando, un procedimiento para detectar o separar una sustancia objetivo y un procedimiento para producir el portador en fase sólida.
Técnica antecedente
Los portadores en fase sólida se han utilizado con el fin de detectar y separar sustancias objetivo tales como proteínas, ácidos nucleicos y células de muestras tal como la sangre. En lo que respecta a un procedimiento de detección y separación utilizando un portador en fase sólida, se utiliza generalmente un procedimiento que consiste en inmovilizar un ligando a un portador en fase sólida, poner en contacto una muestra con este portador en fase sólida y, de este modo, hacer reaccionar una sustancia objetivo con un ligando. Sin embargo, durante el contacto, la sustancia objetivo o las impurezas de la muestra pueden adsorberse de forma no específica no en el ligando sino en la superficie del portador en fase sólida, y esta adsorción puede convertirse en ruidos.
Por lo tanto, con el fin de suprimir la adsorción no específica, se ha sugerido una tecnología para introducir una cierta cantidad de un grupo iniciador de la polimerización por radicales de transferencia atómica (grupo iniciador ATRP) en la superficie de un chip de película de oro de un biosensor magnético, polimerizando un monómero de carboxibetaína particular utilizando dicho grupo iniciador ATRP como punto de partida, y formando así un cepillo de polímero (Literatura de Patentes 1).
Sin embargo, el chip de película de oro que tiene el cepillo de polímero hace que sea menos probable que un ligando se una este, y la captura de una sustancia objetivo se logra de manera insuficiente. Así, las señales de la sustancia objetivo pueden no ser fácilmente detectadas.
Mientras tanto, en los últimos años, se ha prestado atención a las partículas magnéticas como portadores en fase sólida para ser utilizados en, por ejemplo, un agente de diagnóstico para un inmunoensayo enzimático de exámenes clínicos, la separación de células, incluyendo la terapia celular, y la extracción de ácidos nucleicos. Mientras que las partículas magnéticas son relativamente fáciles de separar, por ejemplo, de un espécimen de muestra, las partículas magnéticas tienden a agregarse fácilmente en el agua, por lo que se espera desarrollar una tecnología para mejorar la dispersabilidad de las partículas magnéticas en el agua.
Debido a la demanda de un diagnóstico temprano de enfermedades o similares, también es deseable que esas partículas magnéticas utilizadas para un agente de diagnóstico puedan capturar suficientemente una sustancia objetivo. Además, se requiere que las partículas magnéticas utilizadas para la separación de células sean capaces de capturar específicamente sólo las células objetivo. En tales circunstancias, se han sugerido partículas magnéticas que tienen un cepillo de polímero formado en estas mediante la unión, por ejemplo, de un copolímero en bloque de poli(hidroxietilmetacrilamida)-poli(ácido metacrílico) a la superficie mediante ATRP (Literatura de la patente 2). Sin embargo, esas partículas magnéticas son susceptibles de adsorción inespecífica de una sustancia objetivo o de las impurezas de una muestra a la superficie de la partícula, y, por lo tanto, hay margen de mejora desde este punto de vista.
Lista de citas
Literatura sobre patentes
Literatura de patentes 1: JP 2009-69141 A
Literatura de patentes 2: JP 2009-542862 A
El documento EP 3115384 A1 (Art. 54(3) EPC) proporciona un portador en fase sólida formado por la unión de un polímero de cadena, en el que el polímero de cadena comprende una estructura polimérica aleatoria que contiene una primera unidad estructural que tiene un grupo funcional reactivo, y una segunda unidad estructural que no tiene ningún grupo funcional reactivo o que tiene un grupo funcional reactivo que tiene una reactividad inferior a la del grupo funcional reactivo de la primera unidad estructural, y la relación de contenido entre el número de moles "a" del grupo funcional reactivo contenido en la primera unidad estructural y el número de moles "b" de toda la unidad estructural contenida en el polímero de cadena, (a/b), es de 0,01 a 0,7.
El documento WO 2013/047527 A1 proporciona un sustrato para la inmovilización de ligandos, que comprende un portador insoluble en agua y un copolímero representado por una fórmula general (1) unido al menos a la superficie del portador insoluble en agua.
El documento JP 2007-155623 Ase refiere a un reactivo de medición de anticuerpos antifosfolípidos que se utiliza para diagnosticar la infección de la sífilis y que contiene un portador insoluble en el que se soporta un antígeno antifosfolípido y un copolímero que tiene el segmento procedente de 2-metacriloxietil fosforilcolina y el segmento procedente de un monómero hidrofílico.
Sumario de la Invención
Problema Técnico
Un objeto de la presente invención es proporcionar un portador en fase sólida que tenga una alta dispersabilidad en agua, que permita una unión facilitada de un ligando a un grupo funcional reactivo, y que exhiba una adsorción no específica suprimida, y con el cual, en el caso de utilizar el portador en fase sólida teniendo un ligando unido a este, por ejemplo, la detección de una sustancia objetivo pueda llevarse a cabo con alta sensibilidad y bajo ruido.
Solución al problema
Entonces, los inventores de la presente invención llevaron a cabo una investigación exhaustiva, y como resultado, encontraron que un portador en fase sólida que tiene unido a este un polímero que contiene una unidad estructural particular que tiene una estructura zwitteriónica y una unidad estructural particular que tiene un grupo funcional reactivo, tiene una alta dispersabilidad en agua, permite una unión facilitada de un ligando al grupo funcional reactivo, y exhibe una adsorción no específica suprimida, y con la que en caso de utilizar el portador en fase sólida teniendo un ligando unido al mismo, por ejemplo, la detección de una sustancia objetivo puede llevarse a cabo con alta sensibilidad y bajo ruido.
Es decir, la presente invención proporciona <1> un portador en fase sólida que incluye un polímero que incluye una unidad estructural (en lo sucesivo, también denominada unidad estructural(1))representada por la siguiente Fórmula (1) y una unidad estructural (en lo sucesivo, también denominada unidad estructural(2))representada por la siguiente Fórmula (2) unida al mismo:
en la que en la fórmula (1),
R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y
R2 representa un grupo orgánico que tiene una estructura zwitteriónica,
en la Fórmula (2),
R3 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo;
R4 representa -(C=O)-O-*, -(C=O)-NR6-* (en el que R6 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y el símbolo * representa una posición de enlace con R5 en la Fórmula (2)), o un grupo fenileno;
en un caso en el que R4 representa -(C=O)-O-*, R5 representa un átomo de hidrógeno, o un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo, y en un caso en el que R4 representa -(C=O)-NR6-* o un grupo fenileno, R5 representa un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo,
siempre que R5 no sea un grupo orgánico con estructura zwitteriónica,
en la que la distribución del peso molecular del polímero es de 1,0 a 2,5,
en la que el polímero es un polímero en bloque que incluye un primer bloque compuesto por unidades estructurales dispuestas repetidamente representadas por la Fórmula (1), y un segundo bloque compuesto por unidades estructurales dispuestas repetidamente representadas por la Fórmula (2), y
en la que la proporción de polimerización [m/(m n)] es de 0,1 a 0,35, en la que n es el grado medio de polimerización de la unidad estructural representada por la Fórmula (1) por polímero y m el grado promedio de polimerización de la unidad estructural representada por la Fórmula (2) por polímero.
Además, la presente invención proporciona <2> un portador en fase sólida unido a un ligando formado por la unión de un ligando al portador en fase sólida de <1>.
La presente invención también proporciona <3> un procedimiento para detectar o separar una sustancia objetivo en una muestra, comprendiendo el procedimiento el uso del portador en fase sólida unido a ligando de<2>.
La presente invención también proporciona <4> un procedimiento para producir un portador en fase sólida formado teniendo unido al mismo un polímero que contiene una unidad estructural (1) y una unidad estructural (2), incluyendo el procedimiento:
(Paso 1) un paso de preparación de un soporte que tenga un grupo iniciador de la polimerización; y (Paso 2) un paso de polimerización de un monómero utilizando el grupo iniciador de la polimerización como punto de partida,
en el que la distribución del peso molecular del polímero es de 1,0 a 2,5,
en el que el polímero es un polímero en bloque que incluye un primer bloque compuesto por unidades estructurales dispuestas repetidamente representadas por la Fórmula (1), y un segundo bloque compuesto por unidades estructurales dispuestas repetidamente representadas por la Fórmula (2), y
en el que la proporción de polimerización [m/(m n)] es de 0,1 a 0,35, en el que n es el grado medio de polimerización de la unidad estructural representada por la Fórmula (1) por polímero y m es el grado promedio de polimerización de la unidad estructural representada por la Fórmula (2) por polímero.
Efectos de la Invención
El portador en fase sólida de la presente invención tiene una alta dispersabilidad en agua, permite la unión facilitada de un ligando a un grupo funcional reactivo, y exhibe una adsorción no específica suprimida, con lo que en caso de utilizar el portador en fase sólida teniendo un ligando unido al mismo, por ejemplo, la detección de una sustancia objetivo puede llevarse a cabo con alta sensibilidad y bajo ruido.
De acuerdo con el procedimiento de producción de la presente invención, el portador en fase sólida de la presente invención puede producirse convenientemente.
Descripción Detallada de la Invención
<Portador en Fase Sólida>
El portador en fase sólida de la presente invención está formado teniendo unido al mismo un polímero que contiene una unidad estructural representada por la siguiente Fórmula (1) y una unidad estructural representada por la siguiente Fórmula (2). En primer lugar, se describirá en detalle el portador en fase sólida de la presente invención.
en la que en la fórmula (1),
R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y
R2 representa un grupo orgánico que tiene una estructura zwitteriónica.
en la que en la fórmula (2),
R3 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo;
R4 representa -(C=O)-O-*, -(C=O)-NR6-* (en el que R6 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y el símbolo * representa una posición enlazada a R5 en la Fórmula (2)), o un grupo fenileno;
en un caso en el que R4 representa -(C=O)-O-*, R5 representa un átomo de hidrógeno, o un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo, y en un caso en el que R4 representa -(C=O)-NR6-* o un grupo fenileno, R5 representa un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo;
siempre que R5 no sea un grupo orgánico con estructura zwitteriónica,
en la que la distribución del peso molecular del polímero es de 1,0 a 2,5,
en la que el polímero es un polímero en bloque que incluye un primer bloque compuesto por unidades estructurales dispuestas repetidamente representadas por la Fórmula (1), y un segundo bloque compuesto por unidades estructurales dispuestas repetidamente representadas por la Fórmula (2), y
en la que la proporción de polimerización [m/(m n)] es de 0,1 a 0,35, en la que n es el grado medio de polimerización de la unidad estructural representada por la Fórmula (1) por polímero y m el grado promedio de polimerización de la unidad estructural representada por la Fórmula (2) por polímero.
(Unidad Estructural (1))
En la Fórmula (1),R2 representa un grupo orgánico que tiene una estructura zwitteriónica. Dicho grupo orgánico indica un grupo orgánico que tiene un grupo funcional catiónico y un grupo funcional aniónico. El grupo orgánico que tiene una estructura zwitteriónica es preferentemente un grupo orgánico que tiene un grupo funcional catiónico de tipo sal de amonio cuaternario y un grupo funcional aniónico, y más preferentemente un grupo orgánico que tiene un grupo funcional catiónico de tipo sal de amonio cuaternario y un grupo funcional aniónico monovalente o divalente seleccionado del grupo que consiste en -(C=O)O-, -SO3- y -O-(O=P-O-)-O-. Entre ellos, con respecto a R2, un grupo orgánico representado por la siguiente Fórmula (3) o (4) es más preferible desde el punto de vista de la supresión de la adsorción no específica, y un grupo orgánico representado por la siguiente Fórmula (3) es particularmente preferible desde el punto de vista de que la síntesis de monómeros es factible.
en la que en la fórmula (3),
R7 representa -(C=O)-O-*, -(C=O)-NR13-* (en el que R13 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y el símbolo * representa una posición enlazada a R8 en la Fórmula (3)), o un grupo fenileno;
R8 y R9 representan independientemente un enlace simple o un grupo orgánico divalente que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
R10 representa -(C=O)O- o -SO3-; y
R11 y R12 representan independientemente un grupo metilo o un grupo etilo.
en la que en la fórmula (4),
R14 representa =(C=O)-O-*, -(C=O)-NR20-* (en el que R20 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y el símbolo * representa una posición enlazada a R15 en la Fórmula (4)), o un grupo fenileno;
R15 y R16 representan independientemente un enlace simple o un grupo orgánico divalente que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y
R17, R18y R19 representan independientemente un grupo metilo o un grupo etilo.
En la Fórmula (3), desde el punto de vista de aumentar la afinidad con el agua y suprimir la adsorción no específica, R7 es preferentemente -(C=O)-O-* o -(C=O)-NR13-*, y más preferentemente -(C=O)-O-*
R10 representa -(C=O)O- o -SO3-; y desde el punto de vista de lograr un equilibrio entre la mejora de la sensibilidad de detección y la reducción del ruido, R10 es preferentemente -(C=O)O-.
R13 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, y R13 es preferentemente un átomo de hidrógeno.
R8 y R9 en la Fórmula (3), y R15 y R16 en la Fórmula (4) representan independientemente un enlace simple o un grupo orgánico divalente que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Sin embargo, desde el punto de vista de la supresión de la adsorción inespecífica, se prefiere un grupo orgánico divalente que tenga de 1 a 10 átomos de carbono; se prefiere adicionalmente un grupo de hidrocarburo divalente que tenga de 1 a 10 átomos de carbono, o un grupo formado a partir de un grupo de hidrocarburo divalente que tenga de 2 a 10 átomos de carbono, con uno o más seleccionados del grupo que consiste en un enlace éter, un grupo imino, estando un enlace amida y un enlace éster dispuestos entre los átomos de carbono del grupo de hidrocarburo divalente; y se prefiere particularmente un grupo de hidrocarburo divalente que tenga de 1 a 10 átomos de carbono.
En un caso en el que el grupo orgánico divalente es un grupo hidrocarburo divalente, el número de átomos de carbono es preferentemente de 1 a 8, más preferentemente de 1 a 6, aún más preferentemente de 1 a 4, y de manera particular preferentemente de 1 a 3. Mientras tanto, en un caso en el que el grupo orgánico divalente es un grupo formado a partir de un grupo hidrocarburo divalente, con uno o más seleccionados del grupo que consiste en un enlace éter, un grupo imino, un enlace amida y un enlace éster que están dispuestos entre los átomos de carbono del grupo hidrocarburo divalente, el número de átomos de carbono del grupo hidrocarburo divalente en dicho grupo es preferentemente de 2 a 8, más preferentemente de 2 a 6, aún más preferentemente de 2 a 4, y particularmente preferentemente de 2 o 3.
El "grupo hidrocarburo divalente" para R8, R9, R15y R16 es preferentemente un grupo hidrocarburo alifático divalente. El grupo hidrocarburo alifático divalente puede ser una cadena recta o una cadena ramificada.
El grupo hidrocarburo alifático divalente es preferentemente un grupo alcanediilo, y los ejemplos específicos incluyen un grupo metano-1,1-diilo, un grupo etano-1,1 -diilo, un grupo etano-1,2-diilo, un grupo propano-1,1-diilo, un grupo propano-1,2-diilo un grupo propano-1,3-diilo, un grupo propano-2,2-diilo, un grupo butano-1,2-diilo, un grupo butano-1,3-diilo, un grupo butano-1,4-diilo, un grupo pentano-1,4-diilo, un grupo pentano-1,5-diilo, un grupo hexano-1,5-diilo y un grupo hexano-1,6-diilo.
Para R11 y R12 en la Fórmula (3), y R17, R18 y R19 en la Fórmula (4), se prefiere un grupo metilo.
En la Fórmula (4), desde el punto de vista de mejorar la afinidad con el agua y suprimir la adsorción no específica, R14 es preferentemente -(C=O)-O-* o -(C=O)-NR20-*, y más preferentemente -(C=O)-O-*. R20 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, y R20 es preferentemente un átomo de hidrógeno.
(Unidad Estructural (2))
En la Fórmula (2), desde el punto de vista de mejorar la afinidad con el agua y suprimir la adsorción no específica, R4 es preferentemente -(C=O)-O-* o -(C=O)-NR6-*. R6 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, y R20 es preferentemente un átomo de hidrógeno.
Además, en un caso en el que R4 representa -(C=O)-O-*, R5 representa un átomo de hidrógeno, o un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo; y en un caso en el que R4 representa -(C=O)-NR6-* o un grupo fenileno, R5 representa un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo. En un caso en el que R4 es -(C=O)-O-* y R5 es un átomo de hidrógeno, la combinación de R4 y R5 se convierte en un grupo funcional reactivo (grupo carboxilo). Sin embargo, R5 no es un grupo orgánico que tenga una estructura zwitteriónica representada por R2, y de acuerdo con la presente memoria descriptiva, el grupo funcional reactivo en R5 es un concepto que no contiene una estructura zwitteriónica.
Los ejemplos del grupo funcional reactivo incluyen un grupo carboxilo, un grupo tosilo, un grupo amino, un grupo epoxi, un grupo acilo y un grupo azida, y el grupo orgánico mencionado anteriormente puede tener un tipo de estos, o puede tener dos o más tipos de los mismos. Entre ellos, desde el punto de vista de hacer que el ligando unido no se desprenda fácilmente, o desde el punto de vista de que en un caso en el que se utiliza una molécula de, por ejemplo, una proteína o un ácido nucleico como ligando, el ligando se puede unir al portador en fase sólida utilizando un grupo funcional que el ligando contiene originalmente, se prefiere un grupo carboxilo, un grupo tosilo, un grupo amino o un grupo epoxi, y desde el punto de vista de que es fácil tener el ligando conveniente y rápidamente unido al portador en fase sólida, se prefiere más un grupo carboxilo.
Además, en lo que respecta al contenido del grupo funcional reactivo contenido en la unidad estructural (2), desde el punto de vista de la cantidad de unión del ligando, desde el punto de vista de la consecución de un equilibrio entre la mejora de la sensibilidad y la reducción del ruido en la detección, o desde el punto de vista del rendimiento de la separación celular el contenido es preferentemente 1 jm ol o más, más preferentemente 5 jm ol o más, aún más preferentemente 10 jm ol o más, aún más preferentemente 15 jm ol o más, aún más preferentemente 20 jm ol o más, aún más preferentemente 25 jm ol o más, y de manera particular preferentemente 30 jm ol o más, por gramo del contenido sólido del portador en fase sólida. Asimismo, desde el punto de vista de la supresión de la adsorción inespecífica, o desde el punto de vista de la consecución de un equilibrio entre la mejora de la sensibilidad y la reducción del ruido en la detección, el contenido es preferentemente 300 jm ol o menos, más preferentemente 200 |jmol o menos, incluso más preferentemente 190 jm ol o menos, y de manera particular preferentemente 180 jm ol o menos.
El contenido del grupo funcional reactivo puede medirse mediante un procedimiento de medición de la conductividad eléctrica, por ejemplo, en un caso en el que el grupo funcional reactivo es un grupo carboxilo, y específicamente, el contenido puede medirse de acuerdo con el procedimiento descrito en los siguientes Ejemplos. Además, en un caso en el que el grupo funcional reactivo es un grupo tosilo, el contenido puede determinarse, por ejemplo, midiendo la absorción de luz ultravioleta-visible del grupo tosilo introducido en el soporte en fase sólida. En un caso en el que el grupo funcional reactivo es un grupo amino, el contenido puede determinarse, por ejemplo, haciendo reaccionar el grupo amino con N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato, reduciendo posteriormente el resultante y midiendo la absorbancia de los grupos tiopiridilos libres.
Además, el grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo representado por R5 es preferentemente un grupo orgánico representado por la siguiente Fórmula (5).
--R21-Y (5)
en la que en la Fórmula (5),
R21 representa un grupo orgánico divalente; y
Y representa un grupo funcional reactivo.
El grupo orgánico divalente representado por R21 puede ser un grupo hidrocarburo divalente, o un grupo formado a partir de un grupo hidrocarburo divalente que tiene dos o más átomos de carbono, con uno o más seleccionados del grupo que consiste en un enlace éter, un grupo imino, un enlace amida y un enlace éster que se disponen entre los átomos de carbono del grupo hidrocarburo divalente.
En un caso en el que el grupo orgánico divalente es un grupo hidrocarburo divalente, el número de átomos de carbono es preferentemente de 1 a 10, más preferentemente de 1 a 8, y de manera particular preferentemente de 1 a 6.
Mientras tanto, en un caso en el que el grupo orgánico divalente es un grupo formado a partir de un grupo hidrocarburo divalente que tiene 2 o más átomos de carbono, con uno o más seleccionados del grupo que consiste en un enlace éter, un grupo imino, un enlace amida y un enlace éster dispuestos entre los átomos de carbono del grupo hidrocarburo divalente, el número de átomos de carbono del grupo hidrocarburo divalente en dicho grupo es preferentemente de 2 a 10, más preferentemente de 2 a 8, y de manera particular preferentemente de 2 a 6.
El "grupo hidrocarburo divalente" para R21 es preferentemente un grupo hidrocarburo alifático divalente. El grupo hidrocarburo alifático divalente puede ser una cadena recta o una cadena ramificada.
El grupo hidrocarburo alifático divalente es preferentemente un grupo alquenodiilo, y ejemplos específicos del mismo incluyen un grupo metano-1,1-diilo, un grupo etano-1,1-diilo, un grupo etano-1,2-diilo, un grupo propano-1,1-diilo, un grupo propano-1,2-diilo, un grupo propano-1,3-diilo, un grupo propano-2,2-diilo, un grupo butano-1,2-diilo, un grupo butano-1,3-diilo, un grupo butano-1,4-diilo, un grupo pentano-1,4-diilo, un grupo pentano-1,5-diilo, un grupo hexano-1,5-diilo y un grupo hexano-1,6-diilo.
Además, el grupo formado por un grupo hidrocarburo divalente que tiene 2 o más átomos de carbono, con uno o más seleccionados del grupo que consiste en un enlace éter, un grupo imino, un enlace amida y un enlace éster que se dispone entre los átomos de carbono del grupo hidrocarburo divalente, es preferentemente un grupo que tiene un enlace éster entre átomos de carbono-carbono de un grupo hidrocarburo divalente que tiene 2 o más átomos de carbono, y más preferentemente un grupo divalente representado por -Ra-O(C=O)-Rb-* (en el que Ra y Rb representan independientemente un grupo alkanediilo que tiene de 2 a 4 átomos de carbono; y el símbolo * representa una posición de enlace a Y en la Fórmula (5)), desde el punto de vista de que, por ejemplo, se obtiene convenientemente un polímero. El número de átomos de carbono del grupo alkanediilo es preferentemente 2 o 3, y más preferentemente 2. El grupo alkanediilo puede ser una cadena recta o una cadena ramificada, y ejemplos de los mismos incluyen un grupo etano-1,2-diilo, un grupo propano-1,2-diilo y un grupo propano-1,3-diilo.
Los ejemplos del grupo funcional reactivo representado por Y incluyen, como se ha descrito anteriormente, un grupo carboxilo, un grupo tosilo, un grupo amino, un grupo epoxi, un grupo acilo y un grupo azida. Entre ellos, desde el punto de vista de hacer que el ligando unido no se desprenda fácilmente, o desde el punto de vista de que en un caso en el que se utiliza una molécula de, por ejemplo, una proteína o un ácido nucleico como ligando, el ligando puede unirse al portador en fase sólida utilizando un grupo funcional que el ligando contiene originalmente, se prefiere un grupo carboxilo, un grupo tosilo, un grupo amino o un grupo epoxi, y desde el punto de vista de que es fácil tener el ligando conveniente y rápidamente unido al portador en fase sólida, se prefiere más un grupo carboxilo.
En cuanto a la combinación de R4 y R5 descrita anteriormente, se prefiere una combinación en la que R4 es -(C=O)-O-*, y R5 es un átomo de hidrógeno o un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo; y una combinación en la que R4 es -(C=O)-NR6-*, y R5 es un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo, y se prefiere una combinación en la que R4 es -(C=O)-O-* o -(C=O)-NR6-*, y R5 es un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo.
Además, el polímero puede tener una unidad estructural distinta de las unidades estructurales (1) y (2) (en lo sucesivo, también denominada otra unidad estructural). Los ejemplos de la otra unidad estructural incluyen unidades estructurales derivadas de, por ejemplo, (met)acrilatos, estirenos, (met)acrilonitrilos y acetato de vinilo.
Las unidades estructurales (1) y (2) están incluidas en el mismo polímero.
El grado promedio de polimerización n de la unidad estructural (1) por polímero es preferentemente 1 o superior, más preferentemente 3 o superior, aún más preferentemente 5 o superior, y particularmente preferentemente 10 o superior. Además, desde el punto de vista de la cantidad de unión del ligando, desde el punto de vista de la consecución de un equilibrio entre la mejora de la sensibilidad y la reducción del ruido en la detección, o desde el punto de vista del rendimiento de la separación celular, el grado promedio de polimerización n es preferentemente 500 o inferior, más preferentemente 300 o inferior, aún más preferentemente 200 o inferior, aún más preferentemente 100 o inferior, aún más preferentemente 70 o inferior, y de manera particular preferentemente 62 o inferior.
El grado promedio de polimerización m de la unidad estructural (2) por polímero es preferentemente 1 o superior, más preferentemente 3 o superior, aún más preferentemente 5 o superior, y particularmente preferentemente 10 o superior, desde el punto de vista de la cantidad de unión del ligando. Además, desde el punto de vista de la supresión de la adsorción inespecífica, o desde el punto de vista de la consecución de un equilibrio entre la mejora de la sensibilidad y la reducción del ruido en la detección, el grado promedio de polimerización m es preferentemente 500 o inferior, más preferentemente 300 o inferior, aún más preferentemente 200 o inferior, aún más preferentemente 100 o inferior, aún más preferentemente 70 o inferior, y de manera particular preferentemente 65 o inferior.
Además, desde el punto de vista de la supresión de la adsorción no específica y desde el punto de vista de la cantidad de unión del ligando, la proporción de polimerización [m/(m n)] calculada a partir del grado promedio de polimerización n y del grado medio de polimerización m es de 0,1 a 0,35. Es decir, el polímero es un polímero en
bloque y desde el punto de vista de la supresión de la adsorción inespecífica, desde el punto de vista de la cantidad de unión del ligando, y desde el punto de vista de lograr un equilibrio entre la mejora de la sensibilidad y la reducción del ruido en la detección, particularmente haciendo que el portador en fase sólida sea adecuado para aplicaciones de agentes de diagnóstico, la proporción de polimerización es de 0,1 a 0,35, y de manera particular preferentemente de 0,15 a 0,3.
Los grados promedio de polimerización, n y m, indican los grados promedio de polimerización de la unidad estructural (1) y de la unidad estructural (2), respectivamente, por polímero. Los grados promedio de polimerización pueden determinarse mediante espectrofotometría de fotoelectrones de rayos X, o pueden calcularse, por ejemplo, a partir del peso del polímero unido a 1 g del portador en fase sólida, el peso molecular del polímero y la cantidad de grupos funcionales reactivos. Específicamente, los grados promedio de polimerización pueden medirse por el procedimiento descrito en los siguientes Ejemplos.
El polímero es preferentemente un polímero de cadena. Un polímero de cadena se refiere a un polímero que tiene una estructura molecular lineal, y es un concepto que incluye un polímero que tiene una estructura que incluye una cadena principal larga y recta y cadenas laterales relativamente cortas unidas a la misma.
Además, el polímero es preferentemente un polímero de vinilo. El modo de disposición de las unidades estructurales en el polímero es un copolímero en bloque. Al ser el polímero un copolímero en bloque, los ligandos, por ejemplo, los anticuerpos pueden unirse fácilmente al polímero, y es probable que se logre un equilibrio entre la mejora de la sensibilidad y la reducción del ruido en la detección utilizando una reacción antígeno-anticuerpo. Las razones para obtener efectos como tales no se entienden necesariamente con claridad. Los inventores de la presente invención especulan que se debe a que, en el caso de un copolímero en bloque, dado que los grupos funcionales reactivos existen localmente, los anticuerpos pueden unirse fácilmente al mismo, y pueden adoptarse fácilmente estructuras de orden superior, tal como una estructura intercalada (anticuerpo primario-antígeno-anticuerpo secundario).
Este copolímero en bloque es un polímero que incluye un primer bloque compuesto por unidades estructurales (1) dispuestas repetidamente , y un segundo bloque compuesto por unidades estructurales (2) dispuestas repetidamente. En cuanto al copolímero en bloque como tal, desde el punto de vista de facilitar aún más la unión de un ligando, o desde el punto de vista de lograr un equilibrio entre la mejora de la sensibilidad y la reducción del ruido en la detección, se prefiere un copolímero en bloque representado por la siguiente Fórmula (6).
en la que, en la fórmula (6),
el símbolo ** representa una posición de unión en el lado del portador en fase sólida; y los demás símbolos de referencia tienen el mismo significado que los descritos anteriormente.
Además, un terminal del polímero no está particularmente limitado siempre que esté unido al portador en fase sólida, y es preferible que el único terminal esté unido al portador en fase sólida a través de un grupo de enlace divalente que contenga un residuo de un grupo iniciador de la polimerización. En cuanto al grupo iniciador de la polimerización, se prefiere un grupo iniciador de la polimerización capaz de realizar una polimerización viva; se prefiere más un grupo iniciador de la polimerización de radicales vivos; se prefiere aún más un grupo iniciador de la polimerización de radicales de transferencia atómica o un grupo iniciador de la polimerización de transferencia de cadena de fragmentación reversible; y se prefiere especialmente un grupo iniciador de la polimerización de radicales de transferencia atómica. El grupo de enlace divalente que contiene un residuo de un grupo iniciador de la polimerización por radicales de transferencia atómica puede ser un grupo divalente representado por la siguiente Fórmula (7-1) o (7 2).
en la que R25 y R29 representan cada uno -O- o -NH-;
R26 y R30 representan independientemente un enlace simple o un grupo fenileno;
R27 y R28 representan independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo; y
el símbolo ** representa una posición de unión a un terminal del polímero.
Con respecto a R25 y R29, se prefiere -O-; con respecto a R26 y R3, se prefiere un enlace simple; y con respecto a R27 y R28, se prefiere un grupo alquilo.
El número de átomos de carbono del grupo alquilo representado por R27y R28 es preferentemente de 1 a 8, más preferentemente de 1 a 4, y particularmente preferentemente 1 o 2. El grupo alquilo puede ser una cadena recta o una cadena ramificada, y ejemplos específicos de ello incluyen un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo n-propilo, un grupo isopropilo, un grupo n-butilo, un grupo isobutilo, un grupo sec-butilo, un grupo tert-butilo, un grupo pentilo, un grupo hexilo, un grupo heptilo y un grupo octilo.
Mientras tanto, el otro terminal del polímero no está particularmente limitado, y se prefiere un átomo de halógeno. Ejemplos del átomo de halógeno incluyen un átomo de bromo, un átomo de cloro y un átomo de flúor.
Es preferible que el polímero forme un cepillo polimérico en la superficie del portador en fase sólida. La densidad del polímero que ocupa la superficie del portador en fase sólida de la presente invención es preferentemente 0,01 moléculas/nm2 o más, más preferentemente 0,05 moléculas/nm2 o más, aún más preferentemente 0,1 moléculas/nm2 o más, aún más preferentemente 0,3 moléculas/nm2 o más, aún más preferentemente 0,4 moléculas/nm2 o más, aún más preferentemente 0,5 moléculas/nm2 o más, aún más preferentemente 0,6 moléculas/nm2 o más, y de manera particular preferentemente 0,7 moléculas/nm2 o más, desde el punto de vista de la supresión de la adsorción no específica, desde el punto de vista de la cantidad de unión del ligando, y desde el punto de vista de la consecución de un equilibrio entre la mejora de la sensibilidad y la reducción del ruido en la detección. Además, desde el punto de vista de que se pueda formar convenientemente un cepillo de polímero, la densidad es preferentemente de 2 moléculasnm2 o menos, más preferentemente de 1,6 moléculas/nm2 o menos, y aún más preferentemente de 1,2 moléculas/nm2 o menos.
La densidad del polímero puede calcularse, por ejemplo, mediante la siguiente fórmula. Específicamente, el polímero se libera del portador en fase sólida por, por ejemplo, hidrólisis, y la densidad puede medirse por el procedimiento descrito en los siguientes Ejemplos.
Densidad del polímero (moléculas/nm2) = Número de moléculas de polímero unidas a 1 g de portador (moléculas)/área de superficie total de 1 g de portador (nm2)
Además, el peso molecular promedio nominal (Mn) del polímero es preferentemente de 1.000 a 100.000, más preferentemente de 3.000 a 50.000, y aún más preferentemente de 5.000 a 30.000.
El peso molecular promedio (Mw) del polímero es preferentemente de 1.000 a 100.000, más preferentemente de 3.000 a 50.000, y particularmente preferible de 5.000 a 30.000.
La distribución del peso molecular (Mw/Mn) es de 1,0 a 2,5, preferentemente de 1,0 a 2,0, y más preferentemente de 1,0 a 1,5, desde el punto de vista de la supresión de la adsorción no específica y de la mejora de la actividad del ligando unido al portador en fase sólida.
Se observa que el peso molecular promedio nominal y el peso molecular promedio ponderado indican pesos moleculares promedio determinados liberando el polímero del portador en fase sólida por, por ejemplo, hidrólisis, y midiendo los pesos moleculares por cromatografía de permeación en gel, calculándose los pesos moleculares promedio en términos de estándares de polietilenglicol. Los pesos moleculares promedio pueden calcularse, por ejemplo, midiendo el peso molecular del polímero antes de la introducción de un grupo funcional reactivo mediante un procedimiento tal como el descrito en los siguientes Ejemplos, y calculando los pesos moleculares promedio a partir de dicho peso molecular, el número molar de la unidad estructural en la que se va a introducir el grupo funcional reactivo, y la estructura del compuesto utilizado para la introducción del grupo funcional reactivo.
El constituyente distinto del polímero, que constituye el portador en fase sólida de la presente invención, puede ser una sustancia orgánica o puede ser una sustancia inorgánica tal como un metal o un óxido metálico, y no está particularmente limitado a ello. Es preferible que el portador en fase sólida de la presente invención incluya una resina
distinta del polímero. La resina puede ser un polímero natural compuesto por polisacáridos tales como la agarosa, el dextrano y la celulosa, o puede ser un polímero sintético.
La forma del portador en fase sólida de la presente invención no está particularmente limitada, y puede ser cualquiera de, por ejemplo, partículas, un monolito, una película, una fibra y un chip. Desde el punto de vista de la facilidad de detección o separación de una sustancia objetivo, se prefieren las partículas, y se prefieren más las partículas magnéticas.
El término "partículas magnéticas" de acuerdo con la presente memoria descriptiva indica partículas que tienen un cuerpo magnético. El portador en fase sólida de la presente invención tiene una alta dispersabilidad en agua incluso si el portador está en forma de partículas magnéticas. Además, cuando el portador en fase sólida se produce en forma de partículas magnéticas, dado que el portador en fase sólida puede separarse utilizando, por ejemplo, un imán sin utilizar, por ejemplo, una centrífuga, la separación del portador en fase sólida de una muestra puede simplificarse o automatizarse.
El cuerpo magnético puede ser cualquiera de los ferromagnéticos, paramagnéticos y superparamagnéticos; y desde el punto de vista de facilitar la separación por medio de un campo magnético y la redispersión tras la retirada del campo magnético, es preferible que el cuerpo magnético sea superparamagnético. Los ejemplos del cuerpo magnético incluyen metales o aleaciones, tales como ferrita, óxido de hierro, hierro, óxido de manganeso, manganeso, óxido de níquel, níquel, óxido de cobalto y cobalto.
Además, en lo que respecta a las partículas magnéticas, pueden emplearse específicamente partículas formadas por el polímero descrito anteriormente unido a cualquiera de las partículas de los siguientes puntos (i) a (iv). Un ejemplo preferido de las partículas magnéticas son las partículas poliméricas magnéticas porosas o no porosas.
(i) Partículas en las que las micropartículas magnéticas están dispersas en una fase continua que contiene un cuerpo no magnético, como una resina.
(ii) Partículas en las que los agregados secundarios de micropartículas magnéticas están constituidos como núcleo, y un cuerpo no magnético, tal como una resina, está constituido como una concha.
(iii) Partículas en las que las partículas madre se forman como núcleos, teniendo las partículas madre partículas de núcleo formadas a partir de un cuerpo no magnético, tal como una resina, y una capa magnética que contiene micropartículas magnéticas (capa de agregado secundario) proporcionada en la superficie de las partículas de núcleo; y una capa no magnética, tal como una resina, se forma como una concha (en lo sucesivo, también denominada concha de la capa más externa) en la capa más externa de las partículas madre.
(iv) Partículas en las que las micropartículas magnéticas están dispersas en los poros de partículas porosas formadas a partir de una resina o sílice, mientras que las partículas pueden tener una capa no magnética, tal como una resina, proporcionada como una concha en la capa más externa de las partículas.
Las partículas de (i) a (iv) son todas bien conocidas, y pueden ser producidas de acuerdo con procedimientos convencionales.
Un ejemplo de la resina para las partículas del núcleo de (iii) y las partículas porosas de (iv) puede ser una resina derivada de un tipo o dos o más tipos seleccionados del grupo que consiste en monómeros monofuncionales y monómeros entrecruzables.
Los ejemplos de monómeros monofuncionales incluyen monómeros aromáticos monofuncionales con base en vinilo tales como estireno, a-metilestireno y estireno halogenado; y monómeros monofuncionales con base en (met)acrilato tales como (met)acrilato de metilo, (met)acrilato de etilo, (met)acrilato de estearilo, (met)acrilato de ciclohexilo y (met)acrilato de isobornilo.
Entre los ejemplos de monómeros entrecruzables se encuentran los monómeros aromáticos monofuncionales con base vinilo, tales como divinilbenceno; monómeros polifuncionales con base en (met)acrilato, tales como di(met)acrilato de etilenglicol, tri(met)acrilato de trimetilolpropano, hexa(met)acrilato de dipentaeritritol y (met)acrilato de alilo; y diolefinas conjugadas, tales como el butadieno y el isopreno.
En lo que respecta a la resina para su uso en (i) y (ii), así como a la resina para la capa exterior de (iii) y (iv), se prefiere una resina que tenga un tipo o dos o más tipos de grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en un grupo glicidilo, un grupo amino y un grupo hidroxilo. El grupo funcional puede introducirse por modificación química de la resina, o puede introducirse por polimerización de una composición de monómeros que incluya uno o dos o más tipos de monómeros que tengan los grupos funcionales mencionados. Ejemplos de la modificación química incluyen la producción de un grupo hidroxilo por hidrólisis de un grupo glicidilo, y la producción de un grupo amino por reducción
de un grupo nitro. La composición de monómero que tiene los grupos funcionales mencionados es más preferentemente una composición de monómero que incluye al menos un monómero que contiene un grupo glicidilo (en lo sucesivo, las partículas en las que la resina de la capa más externa es una resina formada a partir de una composición de monómero que incluye al menos un monómero que contiene un grupo glicidilo, también se denominan partículas magnéticas que contienen un grupo glicidilo). La composición de monómero puede incluir además un tipo o dos o más tipos seleccionados del grupo que consiste en los monómeros monofuncionales y los monómeros entrecruzables descritos anteriormente.
Los ejemplos de un monómero que contiene un grupo glicidilo incluyen (met)acrilato de glicidilo y éter de glicidilo. Entre los ejemplos de un monómero que contiene un grupo amino se encuentra (met)acrilato de 2-aminoetilo. Ejemplos de un monómero que contiene un grupo hidroxilo incluyen mono(met)acrilato de 1,4-ciclohexanodimetanol.
El tamaño promedio de las partículas (tamaño promedio de las partículas en volumen) en un caso en el que el portador en fase sólida de la presente invención esté en forma de partículas, es preferentemente de 0,1 a 500 pm, más preferentemente de 0,2 a 50 pm, y aún más preferentemente de 0,3 a 10 pm. Cuando el tamaño promedio de las partículas se encuentra dentro de este intervalo, en un caso en el que el portador de la fase sólida está en forma de partículas magnéticas, la tasa de recogida magnética se hace más rápida y se mejora la capacidad de manipulación. Además, se aumenta la cantidad de unión del ligando y se obtiene una sensibilidad de detección satisfactoria. Además, el coeficiente de variación del tamaño promedio de las partículas puede ser de aproximadamente 20 % o menos.
Además, la superficie específica puede ser de aproximadamente 1,0 a 2,0 m2/g.
El tamaño promedio de las partículas y el área de superficie específica pueden medirse, por ejemplo, midiendo la distribución del tamaño de las partículas por difracción/esparcimiento láser.
<Procedimiento de Producción de Portadores en Fase Sólida>
El portador en fase sólida de la presente invención puede producirse combinando adecuadamente los procedimientos convencionales; sin embargo, con respecto al procedimiento para producir el portador en fase sólida de la presente invención, desde el punto de vista de aumentar la densidad del polímero que ocupa la superficie del portador en fase sólida para suprimir aún más la adsorción no específica, desde el punto de vista de unir un polímero que tiene una distribución de peso molecular estrecha al portador en fase sólida para suprimir aún más la adsorción no específica y desde el punto de vista de aumentar la función del ligando que se va a unir al portador en fase sólida, es preferible un procedimiento que incluye (Paso 1) un paso de preparación de un portador que tiene un grupo iniciador de la polimerización (en lo sucesivo, también denominado portador que contiene un grupo iniciador de la polimerización) y (Paso 2) un paso de polimerización de un monómero utilizando el grupo iniciador de la polimerización como punto de partida.
Ejemplos específicos del procedimiento de producción incluyen los siguientes procedimientos <PR-1>y <PR-2>. En la siguiente descripción, estos procedimientos se describirán tomando como ejemplo un caso en el que el grupo funcional reactivo incluido en la unidad estructural (2) es un grupo carboxilo, un grupo amino o un grupo tosilo.
<PR-1> Un procedimiento que consiste en (Paso 1) preparar un portador que contiene un grupo iniciador de la polimerización; (Paso 2-1-1) polimerizar un monómero (11) que constituye una unidad estructural (1) y un monómero (12) que tiene un grupo funcional capaz de introducir un grupo carboxilo, un grupo amino o un grupo tosilo (por ejemplo, un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo éster, un grupo amino o un grupo protector del ácido carboxílico), utilizando el grupo iniciador de la polimerización como punto de partida; y (Paso2-1-2) introducir un grupo carboxilo, un grupo amino o un grupo tosilo en el polímero (14) que se ha introducido en el soporte en fase sólida mediante una reacción de adición, una reacción de sustitución, una reacción de condensación o una reacción de desprotección.
<PR-2> Un procedimiento que consiste en (Paso 1) preparar un portador que contenga un grupo iniciador de la polimerización; (Paso 2-2-1) introducir un grupo carboxilo, un grupo amino o un grupo tosilo en un monómero (12) que tenga un grupo funcional capaz de introducir un grupo carboxilo, un grupo amino o un grupo tosilo, mediante una reacción de adición, una reacción de sustitución, una reacción de condensación o una reacción de desprotección, y obtener así un monómero (13) que constituya una unidad estructural (2); y (Paso 2-2-2) polimerizar este monómero (13) con el monómero (11) utilizando el grupo iniciador de la polimerización como punto de partida. Cuando se utiliza un monómero que tiene un grupo carboxilo, un grupo amino o un grupo tosilo, el polímero puede producirse sin realizar (Paso 2-2-1). Ejemplos del monómero que tiene un grupo carboxilo, un grupo amino o un grupo tosilo incluyen ácido (met)acrílico, sal de ácido(met)acrílico y (met)acrilato de aminoetilo.
(Paso 1)
En lo que respecta al portador que contiene el grupo iniciador de la polimerización, se puede utilizar un producto disponible en el mercado o se puede sintetizar el portador para su uso. Por ejemplo, el portador que contiene un grupo iniciador de la polimerización puede obtenerse poniendo en contacto un portador de materia prima que tenga una
clase o dos o más clases seleccionadas del grupo que consiste en un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo epoxi y un grupo carboxilo (en lo sucesivo, también pueden denominarse colectivamente "un grupo hidroxilo o similares") (en lo sucesivo, también denominado portador de materia prima), en contacto con un compuesto que tiene un grupo iniciador de la polimerización, y convirtiendo el átomo de hidrógeno contenido en el grupo hidroxilo o similar en un grupo iniciador de la polimerización (en lo sucesivo, esta reacción también puede denominarse reacción de introducción del grupo iniciador de la polimerización). Mientras tanto, entre los portadores de materias primas descritos anteriormente, un portador de materias primas que tiene un grupo hidroxilo puede obtenerse, por ejemplo, poniendo en contacto las partículas magnéticas que contienen el grupo glicidilo con un ácido, tal como un ácido inorgánico o un ácido orgánico, y abriendo en anillo el grupo glicidilo.
El portador que contiene un grupo iniciador de la polimerización también puede obtenerse polimerizando una composición de monómero que incluye un monómero que tiene un grupo iniciador de la polimerización. Ejemplos del monómero que tiene un grupo iniciador de la polimerización incluyen metacrilato de 2-(2-bromoisobutiriloxi).
El compuesto que tiene un grupo iniciador de la polimerización es preferentemente un compuesto que tiene un grupo iniciador de la polimerización capaz de polimerización viva; más preferentemente un compuesto que tiene un grupo iniciador de la polimerización de radicales vivos; aún más preferentemente un compuesto que tiene un grupo iniciador de la polimerización de radicales de transferencia atómica o un compuesto que tiene un grupo iniciador de la polimerización de transferencia de cadena de fragmentación de adición reversible; y de manera particular preferentemente un compuesto que tiene un grupo iniciador de la polimerización de radicales de transferencia atómica. Los ejemplos del compuesto que tiene un grupo iniciador de la polimerización de transferencia atómica incluyen bromuro de 2-bromoisobutirilo, ácido 4-(bromometil)benzoico, 2-bromoisobutirato de etilo, bromuro de 2-bromopropionilo y cloruro de tosilo.
La cantidad total de uso del compuesto que tiene un grupo iniciador de la polimerización en la reacción de introducción del grupo iniciador de la polimerización suele ser de aproximadamente 0,001 a 100 veces en masa, y preferentemente de aproximadamente 0,01 a 50 veces en masa, con respecto al portador de la materia prima.
La reacción de introducción del grupo iniciador de la polimerización se realiza preferentemente en presencia de un catalizador básico tal como trietilamina, N,N-dimetil-4-aminopiridina, diisopropiletilamina o piridina. Estos catalizadores básicos pueden utilizarse por separado o en combinación de dos o más tipos de los mismos.
La cantidad total de uso del catalizador básico suele ser de aproximadamente 1 a 10 equivalentes molares, y preferentemente de aproximadamente 1 a 5 equivalentes molares, con respecto al compuesto que tiene un grupo iniciador de la polimerización. Además, la reacción de introducción del grupo iniciador de la polimerización se realiza preferentemente en presencia de un disolvente. Entre los ejemplos del disolvente se encuentran los disolventes con base en éter, tal como tetrahidrofurano, 1,4-dioxano y 1,3-dioxano, y disolventes próticos, tal como dimetilformamida y dimetilsulfóxido. Estos disolventes pueden utilizarse por separado o en combinación de dos o más tipos de ellos.
El tiempo de reacción para la reacción de introducción del grupo iniciador de la polimerización suele ser de aproximadamente 30 minutos a 24 horas, y la temperatura de reacción puede seleccionarse adecuadamente para que sea menor que o igual al punto de ebullición del disolvente.
(Paso 2-1-1)
El procedimiento de polimerización para la reacción de polimerización en el paso 2-1-1 puede seleccionarse en función del tipo de grupo iniciador de la polimerización. Sin embargo, desde el punto de vista de la obtención de una sustancia prevista de forma conveniente y fácil, se prefiere la polimerización viva; se prefiere más la polimerización radical viva; se prefiere aún más la polimerización radical de transferencia atómica (polimerización ATRP) o la polimerización de transferencia de cadena de fragmentación reversible (polimerización RAFT); y se prefiere particularmente la polimerización radical de transferencia atómica. Al polimerizar el polímero mediante polimerización radical de transferencia atómica, el polímero puede unirse convenientemente a una amplia variedad de portadores, y la biocompatibilidad, la alta elasticidad de compresión, las características de baja fricción y las características de exclusión de tamaño se imparten al portador en fase sólida resultante. Además, al aumentar la densidad del polímero que ocupa la superficie del portador en fase sólida, la adsorción no específica no se produce fácilmente.
Además, se puede introducir un copolímero en bloque en un soporte en fase sólida polimerizando el monómero (12), después de haber polimerizado el monómero (11), utilizando el grupo iniciador de la polimerización en un terminal del polímero así formado, tal como punto de partida; o polimerizando el monómero (11), después de haber polimerizado el monómero (12), utilizando el grupo iniciador de la polimerización en un terminal del polímero así formado, como punto de partida.
Los ejemplos del monómero (11) incluyen [2-((met)acriloxi)etilo] (carboxilometil)dimetilaminio, [2-((met)acriloxi)etilo] (carboxilometil)dimetilaminio, [2-((met)acriloxi)etilo) (carboxilatopropil)dimetilaminio, [2-((met)acriloxi)etil]dimetil-(3-sulfometil)hidróxido de amonio, [2-((me)acriloxi)etil]dimetil-(3-sulfotil)hidróxido de amonio, [2-((met)acriloxi)etil]dimetil(3-sulfopropil)hidróxido de amonio, y O-[2-((met)acriloxi)etoxi(oxilato)fosfinil]colina. Entre ellos, un tipo de los mismos puede ser utilizado solo, o dos o más tipos de los mismos pueden ser utilizados en combinación.
Los ejemplos del monómero (12) incluyen (met)acrilamida de 2-hidroxietilo, (met)acrilato de 2-hidroxietilo, (met)acrilato de glicidilo, (met)acrilato de aminoetilo y (met)acrilato de tert-butilo. Entre ellos, un tipo de los mismos puede ser utilizado solo, o dos o más tipos de los mismos pueden ser utilizados en combinación.
Las cantidades totales de uso de los monómeros (11) y (12) son cada una generalmente de aproximadamente 5 a 10.000 equivalentes molares, y preferentemente de aproximadamente 10 a 5.000 equivalentes molares, con respecto a los respectivos grupos iniciadores de la polimerización unidos al portador.
En un caso en el que la reacción de polimerización del Paso 2-1-1 se realiza por polimerización de radicales de transferencia atómica, desde el punto de vista de la eficiencia de la reacción, es preferible realizarla en presencia de un compuesto de metal de transición y un ligando.
El compuesto de metal de transición es preferentemente un compuesto de cobre. Ejemplos del compuesto de cobre incluyen haluros de cobre, tal como bromuro de cobre(I), bromuro de cobre(II), cloruro de cobre(I) y cloruro de cobre(II); triflato de cobre(I) y triflato de cobre(II). Entre ellos, un tipo de los mismos puede ser utilizado solo, o dos o más tipos de los mismos pueden ser utilizados en combinación. La cantidad total de uso del compuesto de metal de transición suele ser de 1 a 10.000 ppm en el sistema de reacción.
El ligando es preferentemente un ligando que contiene dos o más átomos de nitrógeno en la misma molécula. Entre los ejemplos del ligando que contiene dos o más átomos de nitrógeno en la misma molécula se encuentran tris(2-piridilmetil)amina, bipiridina, derivados de bipiridina y tris[2-(dimetilamino)etil]amina. Entre ellos, un tipo de los mismos puede ser utilizado solo, o dos o más tipos de los mismos pueden ser utilizados en combinación. La cantidad total de uso del ligando suele ser de aproximadamente 0,5 a 10 equivalentes molares con respecto al compuesto de metal de transición.
Desde el punto de vista de la eficacia de la reacción, es preferible que la reacción de polimerización en el Paso 2-1-1 se realice en presencia de un agente reductor y un disolvente.
Ejemplos del agente reductor incluyen ácido ascórbico, glucosa, hidracina y cobre, y estos agentes reductores pueden utilizarse por separado o en combinación de dos o más tipos de los mismos.
Ejemplos del disolvente incluyen agua; disolventes con base en amida, tal como dimetilformamida; y disolventes con base en alcohol, tal como metanol y etanol. Estos disolventes pueden utilizarse por separado o en combinación de dos o más tipos de los mismos.
El pH del sistema de reacción de la reacción de polimerización es preferentemente de 3 a 10. El tiempo de reacción para la reacción de polimerización suele ser de aproximadamente 30 minutos a 12 horas, y la temperatura de reacción puede seleccionarse adecuadamente para que sea menor o igual al punto de ebullición del disolvente. La reacción de polimerización se lleva a cabo también bajo condiciones suaves, de aproximadamente 25 °C y 60 °C.
(Paso 2-1-2)
El paso 2-1-2 consiste en introducir un grupo carboxilo, un grupo amino o un grupo tosilo en el polímero (14) que se ha introducido en el soporte en fase sólida, mediante una reacción de adición, una reacción de sustitución, una reacción de condensación o una reacción de desprotección.
Los ejemplos del procedimiento para introducir un grupo carboxilo incluyen un procedimiento que consiste en utilizar un monómero que tiene un grupo hidroxilo o un grupo amino como monómero (12), y someter el polímero (14) así obtenido a una reacción de adición con un anhídrido de ácido carboxílico; un procedimiento que consiste en utilizar un monómero que tiene un grupo epoxi como monómero (12), hidrolizar el polímero (14) así obtenido para producir un grupo hidroxilo, y luego someter el polímero (14) a una reacción de adición con un anhídrido de ácido carboxílico; un procedimiento que consiste en utilizar un monómero que tiene un grupo epoxi como monómero (12), y someter el polímero (14) así obtenido a una reacción de adición con un compuesto que tiene un grupo nucleófilo tal como un grupo mercapto o un grupo amino y un grupo carboxilo; y un procedimiento que consiste en utilizar un monómero que tiene un grupo carboxilo protegido como monómero (12), y desproteger el polímero (14) así obtenido.
Entre los ejemplos de anhídrido de ácido carboxílico se encuentran anhídrido succínico, anhídrido maleico, anhídrido glutárico, anhídrido ftálico y anhídrido hexahidrófilo. Entre ellos, desde el punto de vista de que la reacción con un grupo hidroxilo o un grupo amino procede fácilmente, se prefiere el anhídrido succínico. La cantidad total de uso de, por ejemplo, anhídrido de ácido carboxílico es generalmente de aproximadamente 0,1 a 2.000 equivalentes molares, y preferentemente de 1 a 1.000 equivalentes molares, con respecto a la unidad estructural derivada del monómero
Los ejemplos del compuesto que tiene un grupo nucleófilo tal como un grupo mercapto o un grupo amino y un grupo carboxilo incluyen el ácido mercaptopropiónico y un aminoácido. Ejemplos del monómero que tiene un grupo carboxilo protegido son (met)acrilato de tert-butilo y (met)acrilato de N-hidroxisuccinimida. Mientras tanto, el procedimiento de desprotección puede llevarse a cabo mediante un procedimiento bien conocido en función del grupo protegido, y ejemplos de los mismos incluyen la hidrólisis.
Los ejemplos del procedimiento para introducir un grupo amino incluyen un procedimiento que consiste en utilizar un monómero que tenga un grupo epoxi como monómero (12), y someter el polímero (14) así obtenido a una reacción de adición con amoníaco o un compuesto que tenga dos o más grupos amino. Los ejemplos del compuesto que tiene dos o más grupos amino incluyen etilendiamina.
Los ejemplos del procedimiento para introducir un grupo tosilo incluyen un procedimiento que consiste en utilizar un monómero que tiene un grupo hidroxilo o un grupo amino como monómero (12), y añadir cloruro de tosilo al polímero (14) así obtenido; y un procedimiento que consiste en utilizar un monómero que tiene un grupo epoxi como monómero (12), hidrolizar el polímero (14) así obtenido para producir un grupo hidroxilo, y luego añadir cloruro de tosilo al mismo.
También es preferible que el Paso 2-1-2 se lleve a cabo en presencia de un catalizador básico y un disolvente similar a los utilizados en el Paso 1. El tiempo de reacción para el Paso 2-1-2 suele ser de aproximadamente 30 minutos a 24 horas, y la temperatura de reacción puede seleccionarse adecuadamente para que sea menor que o igual al punto de ebullición del disolvente.
Mientras tanto, el Paso 2-2-1 puede llevarse a cabo de forma equivalente al Paso 2-1-2, y el Paso 2-2-2 puede llevarse a cabo de forma equivalente la Paso 2-1-1.
El portador en fase sólida de la presente invención que se puede obtener como se ha descrito anteriormente tiene una alta dispersabilidad en agua, permite una unión facilitada de un ligando a un grupo funcional reactivo y presenta una adsorción no específica suprimida. Además, en un caso en el que el portador en fase sólida se utiliza teniendo un ligando unido al mismo, la relación S/N (señal/ruido) en, por ejemplo, la detección de una sustancia objetivo puede incrementarse, y, por ejemplo, la detección puede llevarse a cabo con una alta sensibilidad y un ruido reducido. Además, se puede lograr la separación de una sustancia objetivo con una alta pureza. En un caso en el que el portador en fase sólida se utiliza teniendo un ligando unido al mismo, las células objetivo pueden ser capturadas específicamente a una alta tasa.
Por lo tanto, cuando el portador en fase sólida de la presente invención se utiliza como portador de afinidad, el portador en fase sólida puede ser ampliamente utilizado en estudios en diagnósticos extracorpóreos y en el campo de la bioquímica, incluyendo inmunoensayos que utilizan una reacción antígeno-anticuerpo, tales como un inmunoensayo enzimático, un radioinmunoensayo y un inmunoensayo de quimioluminiscencia; detección de proteínas y ácidos nucleicos; bioseparación de materiales relacionados con la biología, tales como células, proteínas y ácidos nucleicos; búsqueda de fármacos; y biosensores. El portador en fase sólida de la presente invención es especialmente adecuado para un inmunoensayo, para la bioseparación (en particular la separación de células) y para su uso destinado a la detección de ácidos nucleicos.
<Portador en Fase Sólida Unido a un Ligando>
El portador en fase sólida unido a un ligando de la presente invención se forma uniendo un ligando al portador en fase sólida de la presente invención.
El ligando es deseablemente una molécula que se une a una sustancia objetivo, y ejemplos de la misma incluyen anticuerpos; antígenos; ácidos nucleicos como ADN y ARN; nucleótidos; nucleósidos; proteínas tales como proteína A, proteína G, (estrepto)avidina, enzimas y lectina; péptidos tales como insulina; aminoácidos; azúcares o polisacáridos, tales como heparina; lípidos; vitaminas tales como biotina; fármacos; sustratos; hormonas; neurotransmisores; y moléculas sintéticas.
Entre ellos, desde el punto de vista de la fabricación de un portador en fase sólida unido a un ligando, apropiado para su uso, por ejemplo, en agentes de diagnóstico, el ligando es preferentemente un anticuerpo o un antígeno. El anticuerpo y el antígeno pueden ser cualquier anticuerpo o antígeno que se una a una sustancia objetivo, y entre los ejemplos de los mismos se incluyen anticuerpos para exámenes relacionados con la fibrinolisis de solidificación, tales como anticuerpo antiAntiplasmina, anticuerpo antiD dímero, anticuerpo antiFDP, anticuerpo antitPA, anticuerpo del complejo antiTrombina y anticuerpo antiFPA, o antígenos de los mismos; anticuerpos para pruebas relacionadas con tumores, tales como anticuerpo antiBFP, anticuerpo antiCEA, anticuerpo antiTSH, anticuerpo antiFerritina, anticuerpo antiCA19-9, o antígenos de los mismos anticuerpos para pruebas relacionadas con proteínas séricas, tales como anticuerpo antipolipoproteína, anticuerpo antip2-microblobulina, anticuerpo antia1-microglobulina, anticuerpo antiinmunoglobulina, anticuerpo antiPCR y anticuerpo antiEpCAM, o antígenos de los mismos; anticuerpos para pruebas de función endocrina, tales como anticuerpo antiHCG, o antígenos de los mismos: anticuerpos para el análisis de medicamentos, tales como anticuerpo antiDigoxina y anticuerpo antiLidocaína, o antígenos de los mismos;
antígenos para pruebas relacionadas con infecciones, tales como antígeno HBs, antígeno HCV, antígeno VIH-1, antígeno VlH-2, antígeno HTLV-1, antígeno micoplasma, antígeno toxoplasma y antígeno estreptolisina O, o anticuerpos de los mismos; y antígenos para pruebas relacionadas con la autoinmunidad, tales como antígeno ADN e IgG humana modificada térmicamente, o anticuerpos de los mismos. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales.
La unión del ligando puede llevarse a cabo de acuerdo con un procedimiento convencional; sin embargo, es preferible que la unión se lleve a cabo mediante un procedimiento de unión covalente. Por ejemplo, en un caso en el que el grupo funcional reactivo es un grupo carboxilo, y el ligando tiene un grupo amino, la unión puede lograrse utilizando un agente de condensación de deshidratación.
El portador en fase sólida unido a un ligando de la presente invención puede ser ampliamente utilizado, por ejemplo, en diagnósticos y estudios extracorpóreos en el campo de la bioquímica. El portador en fase sólida unido a un ligando de la presente invención es especialmente adecuado para un inmunoensayo, para la bioseparación (en particular la separación de células) y para su uso en la detección de ácidos nucleicos.
<Procedimiento de Detección o Separación de la Sustancia Ob¡etivo>
El procedimiento para detectar o separar una sustancia objetivo en una muestra de la presente invención utiliza el portador en fase sólida unido a ligando de la presente invención.
La sustancia objetivo puede ser cualquier sustancia capaz de unirse al ligando, y los ejemplos específicos incluyen antígenos; anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales; células (células normales y células cancerosas tales como las células cancerosas del intestino grueso y las células cancerosas que circulan por la sangre); ácidos nucleicos tales como el ADN y el ARN; y sustancias biorelacionadas tales como proteínas, péptidos, aminoácidos, azúcares, polisacáridos, lípidos y vitaminas. La sustancia objetivo también puede ser un fármaco que sirva de potencial objetivo farmacológico, o un compuesto de pequeño peso molecular tal como la biotina. Mientras tanto, la sustancia objetivo puede ser una sustancia que ha sido etiquetada con, por ejemplo, una sustancia fluorescente.
La muestra puede ser cualquier muestra que incluya la sustancia objetivo, o que tenga la posibilidad de incluir una sustancia objetivo. Algunos ejemplos específicos incluyen sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo y una solución tampón que contenga una sustancia objetivo.
El procedimiento de detección o separación de la presente invención puede llevarse a cabo de acuerdo con un procedimiento convencional, excepto que se utiliza el portador en fase sólida unido a ligando de la presente invención. Por ejemplo, el procedimiento puede ser un procedimiento que incluya una etapa de poner en contacto el portador en fase sólida unido a ligando de la presente invención con una sustancia objetivo, por ejemplo, mezclando (paso de contacto); y un paso de separar el portador en fase sólida unido a ligando que ha capturado la sustancia objetivo, de la muestra utilizando, por ejemplo, un imán (paso de separación). El procedimiento puede incluir, además, después del paso de separación, un paso de detección de la sustancia objetivo, o un paso de disociación del ligando y la sustancia objetivo.
Ejemplos
En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle mediante Ejemplos; sin embargo, la presente invención no pretende limitarse a estos Ejemplos. Las distintas condiciones de análisis de los Ejemplos son las que se describen a continuación.
<Medida del peso molecular del polímero de cadena>
El peso molecular del polímero de cadena se midió después de liberar el polímero de cadena de las partículas realizando una hidrólisis con una solución acuosa de hidróxido de sodio.
Es decir, se dispersó 1 g de partículas en 4 g de una solución acuosa de hidróxido de sodio (1 N, pH 14), se agitó la dispersión durante 3 horas a 25 °C, y así se liberó un polímero de cadena de las partículas. Las partículas se separaron mediante magnetismo y se recogió un sobrenadante que tiene el polímero de cadena disuelto allí. A continuación, se añadió ácido clorhídrico 1 M a esta solución de polímero de cadena hasta que el pH de la solución llegó a 7, con lo que la solución quedó neutralizada. Para el cálculo del peso del polímero de cadena, se calculó el peso del cloruro de sodio producido a partir del peso del ácido clorhídrico 1 M añadido al mismo, y la solución después de la neutralización se liofilizó. De este modo, se obtuvo un polímero de cadena que incluía cloruro de sodio en forma de polvo. Además, se midió el peso del polvo para utilizarlo en el cálculo del peso del polímero de cadena.
El polvo se utilizó como espécimen, y el Mn y el Mw del polímero de cadena formado en la superficie de la partícula se midieron haciendo la medición por cromatografía de permeación en gel (GPC) bajo las siguientes condiciones,
utilizando una columna TSKgel G3000PWXL fabricada por Tosoh Corp. y el programa de estación de datos de cromatografía Chrom NAV fabricado por JASCO Corp.
(Condiciones de medición)
Caudal: 0,8 ml/min
Disolvente de elución: 0,2 M de solución tampón de fosfato sódico (pH 7,0)
Temperatura de la columna: 25 °C
Sustancia estándar: TSKgel kit SE estándar de poli(óxido de etileno) fabricado por Tosoh Corp., y polietilenglicol 4.000 fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
<Densidad del polímero de la cadena que ocupa la superficie de la partícula>
Se calculo la densidad del polímero mediante la siguiente fórmula, a partir del peso del polímero de cadena liberado de las partículas, el peso molecular promedio nominal del polímero de cadena y la superficie de las partículas.
[Densidad del polímero de cadena que ocupa la superficie de la partícula (cadenas/nm2)] = [Número de moléculas de polímero de cadena unidas a 1 g de partículas (cadenas)]/[área de superficie total por gramo de partículas (nm2)]
Los procedimientos de cálculo para el número de moléculas de polímero de cadena unidas a 1 g de partículas y la superficie total de 1 g de las partículas son los siguientes.
(Número de moléculas de polímero de cadena unidas a 1 g de partículas)
Se calculó el peso del polímero de cadena unido a 1 g de partículas mediante la siguiente fórmula (a), y a partir del valor así obtenido, se calculó el número de moléculas de polímero de cadena unidas a 1 g de las partículas mediante las siguientes fórmulas (p) y (y ):
(a): Peso (mg) de polímero de cadena unido a 1 g de partículas = Peso (mg) de polvo después de ser liofilizado - peso (mg) de cloruro de sodio
(P): Número (mol) de moléculas de polímero de cadena unidas a 1 g de partículas = {Peso (mg) de polímero de cadena unidas a 1 g de partículas / peso molecular promedio nominal (g/mol) de polímero de cadena} /1000
(y): Número (cadenas) de moléculas de polímero de cadena unidas a 1 g de partículas = Número (mol) de moléculas de polímero de cadena unidas a 1 g de partículas x 6,02 x 1023
(Número de Avogadro)
(Área de superficie total por gramo de partículas)
Se calculó el área de superficie total por gramo de partículas mediante las siguientes fórmulas (8) a (0). Se calculó la gravedad específica de las partículas en la fórmula (£) a partir de la gravedad específica del polímero, la gravedad específica del cuerpo magnético y la relación entre el polímero y el cuerpo magnético
(5): Volumen (^m3) por partícula = 4/3 x n x {radio promedio de volumen (^m) de partículas)}3
(s): Masa por partícula (g) = Volumen (^m3) por partícula x gravedad específica de las partículas (g/^m3) (Z)Número de partículas (partículas) por gramo de partículas = 1 g / masa por partícula (g)
(q): Área de superficie (nm2) por partícula = 4 X n X {radio (nm) de partícula}2
(0): Área de superficie total (nm2) por gramo de partículas = Área de superficie (nm2) por partícula X número de partículas (partículas) por gramo de partículas
<Contenido del grupo funcional reactivo>
Se midió el contenido del grupo funcional reactivo (grupo carboxilo) contenido en el polímero de cadena liberado de las partículas utilizando un procedimiento de medición de la conductividad eléctrica (Metrohm AG, 794 Basic Titrino), y así se determinó el contenido de los grupos funcionales reactivos por gramo del contenido sólido de las partículas. <Porcentaje de polimerización Tm/(m n)1>
Se calculó el valor de m/(m n) a partir del grado promedio de polimerización n obtenible a partir de las siguientes fórmulas (A), (B) y (C), y el grado promedio de polimerización m obtenible a partir de la siguiente fórmula (D)
(A) : Peso (g) de la unidad estructural (2) por gramo de partículas = Cantidad (mol) de grupos funcionales reactivos por gramo de partículas x peso molecular (g/mol) de la unidad estructural (2)
(B) : Peso (g) de la unidad estructural (1) por gramo de partículas = Peso (g) de polímero de cadena por gramo de partículas - peso (g) de la unidad estructural (2) por gramo de partículas
(C) : n = {Peso (g) de la unidad estructural (1) por gramo de partículas/peso molecular (g / mol) de la unidad estructural (1)}/número de moléculas de polímero (moléculas) por gramo de partículas
(D) : m = Cantidad de grupos funcionales reactivos (mol) por gramo de partículas/número de moléculas de polímero (moléculas) por gramo de partículas
<Tamaño promedio de las partículas>
Se midieron los tamaños de partícula promedio por volumen de diversas partículas utilizando un analizador de distribución de tamaño de partícula por difracción/esparcimiento láser (Beckman Coulter LS13320).
[Ejemplo 1 de Síntesis. Síntesis de partículas magnéticas que tienen grupos hidroxilos en la superficie]
Se mezclaron 2 g de una solución al 75 % de peróxido de di(3,5,5-trimetilhexanoil) ("PEROYL 355-75(S)", fabricado por NOF Corp.) con 20 g de una solución acuosa de dodecilsulfato de sodio al 1 % en masa, y la mezcla se emulsionó finamente con un dispersor ultrasónico. Se introdujo en un reactor que contenía 13 g de partículas de poliestireno (tamaño promedio de las partículas: 0,77 pm) y 41 g de agua, y la mezcla se agitó durante 12 horas a 25 °C.
A continuación, en otro recipiente, se emulsionaron 96 g de estireno y 4 g de divinilbenceno con 400 g de una solución acuosa de dodecilsulfato de sodio al 0,1% en masa, que se introdujo en el reactor y se agitó durante 2 horas a 40 °C. Posteriormente, se elevó la temperatura a 75 °C y se realizó la polimerización durante 8 horas. El sistema se enfrió a temperatura ambiente, y luego sólo se sacaron las partículas por centrifugación y se lavaron con agua y se secaron. Estas partículas se denominan partículas centrales (tamaño promedio de las partículas: 1,5 pm).
A continuación, en otro recipiente separado, se añadió acetona a un fluido magnético aceitoso ("serie EXP, EMG", fabricado por Ferrotec Corporation), y las partículas se precipitaron y sedimentaron. Posteriormente, las partículas se secaron y, de este modo, se obtuvieron micropartículas magnéticas con base en ferrita (tamaño promedio de las partículas primarias: 0,01 pm) con una superficie hidrofobizada.
A continuación, se mezclaron minuciosamente 15 g de las partículas del núcleo y 15 g de las micropartículas magnéticas hidrofobizadas con un mezclador, y esta mezcla se trató durante 5 minutos utilizando un sistema de hibridación del tipo NHS-O (fabricado por Nara Machinery Co., Ltd.) a una velocidad circunferencial de la cuchilla (cuchilla agitadora) de 100 m/segundo (16,200 rpm). Así, se obtuvieron las partículas madre que tienen en la superficie una capa magnética formada por micropartículas magnéticas (tamaño promedio de partícula nominal: 2.0 pm).
A continuación, se introdujeron 250 g de una solución acuosa al 0,50 % en masa de dodecil sulfato de sodio en un matraz separable de 500 ml, y luego se añadieron 10 g de las partículas madre que tenían una capa magnética. La mezcla se dispersó con un homogeneizador y luego se calentó a 60 °C. La dispersión se mantuvo a esa temperatura.
A continuación, se introdujeron 75 g de una solución acuosa al 0,50% en masa de dodecilsulfato de sodio, 13,5 g de metacrilato de metilo (en lo sucesivo, denominado "MMA"), 1,5 g de trimetilolpropano-trimetacrilato (en lo sucesivo, denominado "TMP"), y se introdujeron 0,3 g de una solución al 75 % de peróxido de di(3,5,5-trimetilhexanoil) ("PEROYL 355-75(S)", fabricado por NOF Corp.) en otro recipiente, y la mezcla se dispersó para obtener una preemulsión. Toda la cantidad de esta preemulsión se añadió gota a gota durante 2 horas al matraz separable de 500 ml que se había mantenido a 60 °C. Una vez completada la adición gota a gota, la mezcla se agitó durante una hora mientras se mantenía a 60 °C.
Se introdujeron en otro recipiente 37,5 g de una solución acuosa al 0,50% en masa de dodecilsulfato de sodio, 6,56 g de metacrilato de glicidilo (en adelante, "GMA"), 0,94 g de TMP y 0,15 g de una solución al 75 % de peróxido de di(3,5,5-trimetilhexanoilo) ("PEROYL 355-75(S)", fabricado por n Of Corp.), y se dispersó la mezcla. Así, se obtuvo una preemulsión. La cantidad total de esta preemulsión se añadió gota a gota durante 1 hora y 20 minutos al matraz separable de 500 ml que se había mantenido a 60 °C. Posteriormente, la mezcla se calentó a 75 °C, y luego se continuó la polimerización durante 2 horas. A continuación, se completó la reacción. Posteriormente, se introdujeron 10 ml de una solución acuosa de ácido sulfúrico de 1 mol/l en este matraz separable de 500 ml, y la mezcla se agitó durante 6 horas a 60 °C. A continuación, se separaron las partículas en el matraz separable de 500 ml utilizando el magnetismo, y luego las partículas se lavaron repetidamente con agua destilada.
Así, se obtuvieron partículas magnéticas con grupos hidroxilos en la superficie.
[Ejemplo 2 de Síntesis. Síntesis de partículas magnéticas que tienen grupos iniciadores de la polimerización por transferencia atómica en la superficie (1)]
Se introdujeron en un matraz 10 g de las partículas magnéticas que tiene grupos hidroxilos en la superficie, que se obtuvieron en el Ejemplo 1 de Síntesis, y bajo flujo de nitrógeno se añadieron 32 ml de tetrahidrofurano deshidratado y 7,5 ml de trietilamina. Se agitó la mezcla. Se sumergió este matraz en un baño de hielo, y se añadieron 6,3 ml de bromuro de 2-bromo-butilo gota a gota durante 30 minutos. Se dejó reaccionar la mezcla durante 6 horas a temperatura
ambiente, posteriormente se separaron las partículas del matraz mediante magnetismo y se sometieron a una redispersión en acetona. Se llevaron a cabo la separación magnética y la redispersión varias veces, y luego las partículas se dispersaron en una solución acuosa al 0,10 % en masa de dodecil sulfato de sodio . Se detectó el Br contenido en el grupo iniciador de la polimerización por radical de transferencia atómica (grupo 2-bromoisobutiril) mediante un análisis de rayos X fluorescentes.
Así, se obtuvieron partículas magnéticas con grupos iniciadores de la polimerización por transferencia atómica (grupos 2-bromoisobutirilo) en la superficie. Estas partículas se designan como partículas (A).
[Ejemplo 3 de Síntesis. Síntesis de partículas magnéticas que tienen grupos iniciadores de polimerización por transferencia atómica (2)]
Se introdujeron en un matraz 10 g de partículas magnéticas que tenían grupos hidroxilos en la superficie, que se obtuvieron en el Ejemplo 1 de Síntesis, y bajo flujo de nitrógeno se añadieron 32 ml de tetrahidrofurano deshidratado y 0,4 ml de trietilamina. Se agitó la mezcla. Se sumergió este matraz en un baño de hielo y se añadieron 0,2 ml de bromuro de 2-bromobutilo. Se dejó reaccionar la mezcla durante 6 horas a temperatura ambiente, posteriormente se separaron las partículas del matraz mediante magnetismo y luego se sometieron a una redispersión en acetona. Se llevaron a cabo la separación magnética y la redispersión varias veces, y luego las partículas se dispersaron en una solución acuosa al 0,10 % en masa de dodecil sulfato de sodio . Se detectó el Br contenido en el grupo iniciador de la polimerización por radical de transferencia atómica (grupo 2-bromoisobutiril) mediante un análisis de rayos X fluorescentes.
Así, se obtuvieron partículas magnéticas con grupos iniciadores de la polimerización por transferencia atómica (grupos 2-bromoisobutirilo) en la superficie. Estas partículas fueron designadas como partículas (B).
[Ejemplo 4 de Síntesis. Síntesis de partículas magnéticas que tienen grupos iniciadores de polimerización por transferencia atómica (3)]
Se introdujeron en un matraz 10 g de partículas magnéticas que tenían grupos hidroxilos en la superficie, que se obtuvieron en el Ejemplo 1 de Síntesis, y bajo flujo de nitrógeno se añadieron 32 ml de tetrahidrofurano deshidratado y 0,2 ml de trietilamina. Se agitó la mezcla. Se sumergió este matraz en un baño de hielo, y se añadieron 0,1 ml de bromuro de 2-bromo-butilo gota a gota durante 30 minutos. Se dejó reaccionar la mezcla durante 6 horas a temperatura ambiente, posteriormente se separaron las partículas del matraz mediante magnetismo y se sometieron a una redispersión en acetona. Se llevaron a cabo la separación magnética y la redispersión varias veces, y luego las partículas se dispersaron en una solución acuosa al 0,10 % en masa de dodecil sulfato de sodio . Se detectó el Br contenido en el grupo iniciador de la polimerización por radical de transferencia atómica (grupo 2-bromoisobutiril) mediante un análisis de rayos X fluorescentes.
Así, se obtuvieron partículas magnéticas con grupos iniciadores de la polimerización por transferencia atómica (grupos 2-bromoisobutirilo) en la superficie. Estas partículas se designan como partículas (C).
[Ejemplo 1 de Referencia, útil para comprender la invención]
(Reacción de extensión de polímeros de cadena (1))
Se realizó una reacción de extensión de polímeros de cadena de acuerdo con el siguiente procedimiento de síntesis
Es decir, se dispersaron 2 g de las partículas (A) obtenidas en el Ejemplo 2 de Síntesis en 6 ml de una solución tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH 7,8), y a esto, se añadieron 0,5 g de [2-(metacriloxi)etil] (carboxilatometil)dimetilaminio (en lo sucesivo, denominado "CBMA") y 0,40 ml de una solución acuosa mixta de 0,05 mol/l de tris(2-piridilmetil)amina y 0,05 mol/l de bromuro de cobre(II). Posteriormente, se añadieron 1,0 ml de una solución acuosa de 0,2 mol/l de ácido L-ascórbico, se cerró herméticamente la mezcla y se inició la reacción. Se agitó el sistema durante 4 horas a 45 °C, y
luego se detuvo la reacción abriendo el sello y exponiendo el sistema al aire. Se separaron las partículas mediante magnetismo y, por ejemplo, se eliminaron los monómeros o el catalizador que no habían reaccionado.
(Reacción de extensión de polímeros de cadena (2))
A continuación, se llevó a cabo una reacción de extensión de la cadena de polímeros de acuerdo con el siguiente procedimiento de síntesis
Es decir, las partículas obtenidas como se ha descrito anteriormente se dispersaron en 6 ml de una solución tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH 7,8), y a ésta se añadieron 0,5 g de 2-hidroxietilacrilamida (en adelante, "HEAA") y 0,40 ml de una solución acuosa mixta de 0,05 mol/l de tris(2-piridilmetil)amina y 0,05 mol/l de bromuro de cobre (II). Posteriormente, se añadieron 1,0 ml de una solución acuosa de 0,2 mol/l de ácido L-ascórbico, se cerró herméticamente la mezcla y se inició la reacción. Se agitó el sistema durante 3 horas a 45 °C, y luego se detuvo la reacción abriendo el sello y exponiendo el sistema al aire. Se separaron las partículas mediante magnetismo y, por ejemplo, se eliminaron los monómeros o el catalizador que no habían reaccionado. De este modo, se obtuvieron partículas magnéticas que tienen un copolímero en bloque de CBMA y HEAA unido a la superficie. El tamaño promedio de las partículas en volumen fue de 3,0 ^m.
Se midieron el Mn, el Mw y el Mw/Mn del copolímero en bloque de CBMA y HEAA, y la densidad del polímero del copolímero en bloque. Los resultados de las mediciones se presentan en la Tabla 1.
(Reacción de condensación)
A continuación, se realizó una reacción de condensación de acuerdo con el siguiente procedimiento de síntesis
Es decir, se dispersaron 1,5 g de las partículas obtenidas como se ha descrito anteriormente en 8 ml de dimetilsulfóxido (DMSO), y a esto se añadieron 7,2 ml de una solución de DMSO que tenía 1,5 g de anhídrido succínico disuelto en la misma, y 0,3 ml de trietilamina. Así, se inició una reacción. El sistema se agitó durante 4 horas a 25 °C, posteriormente se separaron las partículas mediante magnetismo y se eliminó el exceso de materia prima.
Así, se obtuvieron las Partículas Magnéticas 1 en las que los grupos hidroxilos terminales de1 HEAA se habían convertido en grupos funcionales reactivos (grupos carboxilos). Se midió el contenido de grupos carboxilos y la proporción de polimerización [m/(m n)]. Los resultados de las mediciones se presentan en la Tabla 1.
[Ejemplo 2]
La operación se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 1 de Referencia, excepto que el tiempo de reacción para la reacción de extensión del polímero de cadena (2), mediante la cual se extendió el polímero de cadena con HEAA, se cambió de 3 horas a 1 hora. Así, se obtuvieron Partículas Magnéticas 2 en las que los grupos hidroxilos terminales del HEAA se habían convertido en grupos funcionales reactivos (grupos carboxilo). El tamaño promedio de las partículas en volumen fue de 3,0 ^m.
En la Tabla 1 se presentan diversos resultados de medición obtenidos de la misma manera que en el Ejemplo 1 de Referencia, excepto el tamaño promedio de las partículas en volumen.
[Ejemplo 3]
La operación se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 1 de Referencia, excepto que el tiempo de reacción para la reacción de extensión del polímero de cadena (2), mediante la cual se extendió el polímero de cadena con HEAA, se cambió de 3 horas a 30 minutos. Así, se obtuvieron Partículas Magnéticas 3 en las que los grupos hidroxilos terminales del HEAA se habían convertido en grupos funcionales reactivos (grupos carboxilo). El tamaño promedio de las partículas en volumen fue de 3,0 pm.
En la Tabla 1 se presentan diversos resultados de medición obtenidos de la misma manera que en el Ejemplo 1 de Referencia, excepto el tamaño promedio de las partículas en volumen.
[Ejemplo 4]
La operación se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 1 de Referencia, excepto que el tiempo de reacción para la reacción de extensión del polímero de cadena (2), mediante la cual se extendió el polímero de cadena con HEAA, se cambió de 3 horas a 15 minutos. Así, se obtuvieron Partículas Magnéticas 4 en las que los grupos hidroxilos terminales del HEAA se habían convertido en grupos funcionales reactivos (grupos carboxilo). El tamaño promedio de las partículas en volumen fue de 3,0 pm.
En la Tabla 1 se presentan diversos resultados de medición obtenidos de la misma manera que en el Ejemplo 1 de Referencia, excepto el tamaño promedio de las partículas en volumen.
[Ejemplo 1 de Referencia, útil para comprender la invención]
Se dispersaron 2 g de las partículas (A) obtenidas en el Ejemplo 2 de Síntesis en 6 ml de una solución tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH 7,8), y a esto se añadieron 0,5 g de CBMA, 0,5 g de HEAA, y 0,40 ml de una solución acuosa mixta de 0,05 mol/L de tris(2-piridilmetil)amina y 0,05 mol/L de bromuro de cobre(II). Posteriormente, se añadieron 1,0 ml de una solución acuosa de 0,2 mol/l de ácido L-ascórbico, se cerró herméticamente la mezcla y se inició la reacción. Se agitó el sistema durante 4 horas a 45 °C, y luego se detuvo la reacción abriendo el sello y exponiendo el sistema al aire. Se separaron las partículas mediante magnetismo y, por ejemplo, se eliminaron los monómeros o el catalizador que no habían reaccionado. Así, se obtuvieron partículas magnéticas que tenían un copolímero aleatorio de CBMA y HEAA unido a la superficie. Se midieron el Mn, el Mw y el Mw/Mn del copolímero aleatorio de CBMA y HEAA, y la densidad del polímero del copolímero aleatorio. Los resultados de las mediciones se presentan en la Tabla 1.
Se dispersaron 1,5 g de las partículas obtenidas como se ha descrito anteriormente en 8 ml de dimetilsulfóxido (DMSO), y a esto se añadieron 7,2 ml de una solución de DMSO que tenía 1,5 g de anhídrido succínico disuelto en ella, y 0,3 ml de trietilamina. Así, se inició una reacción. El sistema se agitó durante 4 horas a 25 °C, posteriormente se separaron las partículas mediante magnetismo y se eliminó el exceso de materia prima.
Así, se obtuvieron las Partículas Magnéticas 5 en las que los grupos hidroxilos terminales de1 HEAA se habían convertido en grupos funcionales reactivos (grupos carboxilos). El tamaño promedio de las partículas en volumen fue de 3,0 pm. Se midió el contenido de grupos carboxilos y la proporción de polimerización [m/(m n)]. Los resultados de las mediciones se presentan en la Tabla 1.
[Ejemplo 1 de Referencia, útil para comprender la invención]
La operación se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 5 de Referencia, excepto que la cantidad de uso de CBMA se cambió de 0,5 g a 0,8 g, y la cantidad de uso de HEAa se cambió de 0,5 g a 0,2 g. Así, se obtuvieron las Partículas Magnéticas 6 en las que los grupos hidroxilos terminales de HEAA se habían convertido en grupos funcionales reactivos (grupos carboxilo). El tamaño promedio de las partículas en volumen fue de 3,0 pm.
Los resultados de las mediciones obtenidas de la misma manera que en el Ejemplo 5 de Referencia, excepto el tamaño promedio de las partículas en volumen, se presentan en la Tabla 1.
[Ejemplo 7]
La operación se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que las partículas (A) se cambiaron por las partículas (B) obtenidas en el Ejemplo 3 de Síntesis, y así se obtuvieron Partículas Magnéticas 7 en las que los grupos hidroxilos terminales del HEAa se habían convertido en grupos funcionales reactivos (grupos carboxilo). El tamaño promedio de las partículas en volumen fue de 3,0 pm.
Los resultados de las mediciones obtenidas de la misma manera que en el Ejemplo 1 de Referencia, excepto el tamaño promedio de las partículas en volumen, se presentan en la Tabla 1.
[Ejemplo 8]
(Reacción de extensión de la cadena de polímeros (1))
Se dispersaron 2 g de las partículas (A) obtenidas en el Ejemplo 2 de Síntesis en 6 ml de una solución tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH 7,8), y a esto se añadieron 0.5 g de hidróxido de 2-(metacriloxi)etilo]dimetil-(3-sulfopropil)amonio (en adelante, denominado "SBMA"), y se añadieron 0,40 ml de una solución acuosa mixta de 0,05 mol/l de tris(2-piridilmetil)amina y 0,05 mol/l de bromuro de cobre(II). Posteriormente, se añadieron 1,0 ml de una solución acuosa de 0,2 mol/l de ácido L-ascórbico, se cerró herméticamente la mezcla y se inició la reacción. Se agitó el sistema durante 4 horas a 45 °C, y luego se detuvo la reacción abriendo el sello y exponiendo el sistema al aire. Se separaron las partículas mediante magnetismo y, por ejemplo, se eliminaron los monómeros o el catalizador que no habían reaccionado.
(Reacción de extensión de polímeros en cadena (2))
A continuación, las partículas obtenidas como se ha descrito anteriormente se dispersaron en 6 ml de una solución tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH 7,8), a la que se añadieron 0,5 g de HEAA y 0,40 ml de una solución acuosa mixta de 0,05 mol/l de tris(2-piridilmetil)amina y 0,05 mol/l de bromuro de cobre(II). Posteriormente, se añadieron 1,0 ml de una solución acuosa de 0,2 mol/l de ácido L-ascórbico, se cerró herméticamente la mezcla y se inició la reacción. El sistema se agitó durante 30 minutos a 45 °C, y luego se detuvo la reacción abriendo el sello y exponiendo el sistema al aire. Se separaron las partículas mediante magnetismo y, por ejemplo, se eliminaron los monómeros o el catalizador que no habían reaccionado. Así, se obtuvieron partículas magnéticas que tenían un copolímero en bloque de SBMA y HEAA unido a la superficie. El tamaño promedio de las partículas en volumen fue de 3,0 pm.
Se midieron el Mn, el Mw y el Mw/Mn del copolímero en bloque de SBMA y HEAA, y la densidad del polímero del copolímero en bloque. Los resultados de las mediciones se presentan en la Tabla 1.
(Reacción de condensación)
A continuación, se dispersaron 1,5 g de las partículas obtenidas como se ha descrito anteriormente en 8 ml de dimetilsulfóxido (DMSO), y a esto se añadieron 7,2 ml de una solución de DMSO que tenía 1,5 g de anhídrido succínico disuelto allí, y 0,3 ml de trietilamina. Así, se inició una reacción. El sistema se agitó durante 4 horas a 25 °C, posteriormente se separaron las partículas mediante magnetismo y se eliminó el exceso de materia prima.
Así, se obtuvieron las Partículas Magnéticas 8 en las que los grupos hidroxilos terminales de1 HEAA se habían convertido en grupos funcionales reactivos (grupos carboxilos). Se midió el contenido de grupos carboxilos y la proporción de polimerización [m/(m n)]. Los resultados de las mediciones se presentan en la Tabla 1.
[Ejemplo 1 Comparativo]
Se dispersaron 2 g de las partículas (A) obtenidas en el Ejemplo de Síntesis 2 en 6 mL de una solución tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH 7,8), y a esto se añadieron 0,5 g de metacrilato de 2-hidroxietilo (en adelante, denominado "HEMA"), y 0,40 mL de una solución acuosa mixta de 0,05 mol/l de tris(2-piridilmetil)amina y 0,05 mol/l de bromuro de cobre(II). Posteriormente, se añadieron 1,0 ml de una solución acuosa de 0,2 mol/l de ácido L-ascórbico, se cerró herméticamente la mezcla y se inició la reacción. Se agitó el sistema durante 4 horas a 45 °C, y luego se detuvo la reacción abriendo el sello y exponiendo el sistema al aire. Se separaron las partículas mediante magnetismo y, por ejemplo, se eliminaron los monómeros o el catalizador que no habían reaccionado. Así, se obtuvieron las Partículas Magnéticas 9 que tenían un homopolímero de HEMA unido a la superficie. El tamaño promedio de las partículas en volumen fue de 3,0 pm.
[Ejemplo 2 Comparativo]
Se llevó a cabo la operación de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el CBMA se cambió por el producto de cuaternización de dimetilaminoetilmetacrilato (LlGHT ESTER DQ-100 fabricado por Kyoeisha Chemical Co., Ltd.). (producto obtenido por cuaternización de metacrilato de dimetilaminoetilo con cloruro de metilo)). Así, se obtuvieron Partículas Magnéticas 10 en las que los grupos hidroxilos terminales del HEAA se habían convertido en grupos funcionales reactivos (grupos carboxilo). El tamaño promedio de las partículas en volumen fue de 3,0 pm.
Los resultados de las mediciones obtenidas de la misma manera que en el Ejemplo 1 de Referencia, excepto el tamaño promedio de las partículas en volumen, se presentan en la Tabla 1.
[Ejemplo 3 Comparativo]
Se llevó a cabo la operación de la misma manera que en el Ejemplo 6, excepto que el CBMA se cambió por el producto de cuaternización de dimetilaminoetilmetacrilato (LlGHT ESTER DQ-100 fabricado por Kyoeisha Chemical Co., Ltd.). (producto obtenido por cuaternización de metacrilato de dimetilaminoetilo con cloruro de metilo)). Así, se obtuvieron Partículas Magnéticas 11 en las que los grupos hidroxilos terminales del HEAA se habían convertido en grupos funcionales reactivos (grupos carboxilo). El tamaño promedio de las partículas en volumen fue de 3,0 pm.
Los resultados de las mediciones obtenidas de la misma manera que en el Ejemplo 5 de Referencia, excepto el tamaño promedio de las partículas en volumen, se presentan en la Tabla 1.
[Ejemplo 4 Comparativo]
Se dispersó 1 g de las partículas magnéticas que tienen grupos hidroxilos en la superficie, que se obtuvieron en el Ejemplo 1 de Síntesis, en 4,8 ml de 1,3-dioxolano, y a esto se añadió una solución obtenida disolviendo 0,2 ml de trietilamina y 0,08 g de anhídrido succínico en 4,8 ml de 1,3-dioxolano. Se llevó a cabo una reacción durante 4 horas a 25 °C, y luego se separaron las partículas utilizando el magnetismo, y se dispersaron las partículas en agua. Así, se obtuvieron Partículas Magnéticas 12 que contenían grupos funcionales reactivos y que no tenían ningún polímero de cadena. Se midió el contenido de grupos carboxilos. Los resultados de las mediciones se presentan en la Tabla 1.
[Ejemplo 5 Comparativo]
Se dispersaron 2 g de las partículas (A) obtenidas en el Ejemplo 2 de Síntesis en 6 ml de una solución tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH 7,8), y a esto se añadieron 0,5 g de CBMA, y 0,40 ml de una solución acuosa mixta de 0,05 mol/ñ de tris(2-piridilmetil)amina y 0,05 mol/L de bromuro de cobre(II). Posteriormente, se añadieron 1,0 ml de una solución acuosa de 0,2 mol/l de ácido L-ascórbico, se cerró herméticamente la mezcla y se inició la reacción. Se agitó el sistema durante 4 horas a 45 °C, y luego se detuvo la reacción abriendo el sello y exponiendo el sistema al aire. Se separaron las partículas mediante magnetismo y, por ejemplo, se eliminaron los monómeros o el catalizador que no habían reaccionado. Así, se obtuvieron las Partículas Magnéticas 13 que tenían un homopolímero de CBMA unido a la superficie. El tamaño promedio de las partículas en volumen fue de 3,0 pm.
[Ejemplo 1 de Prueba (dispersabilidad en agua)]
Se dispersaron respectivamente 100 mg de las partículas magnéticas obtenidas en diversos Ejemplos y Ejemplos Comparativos en 1 ml de agua. Las partículas magnéticas obtenidas en el Ejemplo 1 Comparativo presentaban una escasa dispersabilidad en el agua, y las partículas se agregaban. Otras partículas magnéticas se dispersaron sin agregarse. Los resultados de la evaluación se presentan en la Tabla 2.
[Ejemplo 2 de Prueba (efecto supresor de la adsorción no específica)
Se dispersó 1 mg de las partículas magnéticas obtenidas en cada uno de los Ejemplos y Ejemplos Comparativos 2 a 5 en 2 ml de agua. Se introdujo este líquido de dispersión de agua en un tubo Eppendorf, se separaron las partículas mediante magnetismo y se extrajo un sobrenadante del mismo. A continuación, se añadieron 100 pl de una suspensión de células Jurkat disgregadas (incluyendo 100 pg de impurezas proteicas) a las partículas, se incubó la mezcla durante 30 minutos y se separaron las partículas mediante magnetismo. Se eliminó el sobrenadante y se lavaron las partículas cinco veces con una solución tampón TBS-T (Tween 20 al 0,05 % en masa). Se prepararon las partículas de nuevo mediante magnetismo, se eliminó el sobrenadante y, a continuación, se añadió a las partículas una solución acuosa de dodecilbencenosulfonato de sodio (0,5 % en masa) para desprender de las partículas las impurezas proteicas adsorbidas de forma no específica. Se sometió esta solución de desprendimiento a una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, y se sometió el gel a una tinción de CBB. Se comprobó visualmente la cantidad de proteínas que se habían adsorbido de forma inespecífica a las partículas, y se evaluó la adsorción inespecífica de acuerdo con los siguientes criterios. Como las partículas tienen una menor cantidad de proteínas, las partículas son satisfactorias y tienen menos adsorción no específica. Los resultados de la evaluación se presentan en la Tabla 2.
(Criterios de Evaluación)
4: Apenas se observa adsorción de proteínas y el estado es muy bueno.
3: La adsorción de proteínas no se observa mucho, y el estado es bueno.
2: Se observa ligeramente la adsorción de proteínas y el estado es algo bueno.
1: Se reconoce claramente la adsorción de proteínas, y el estado es pobre.
[Ejemplo 3 de Prueba (cantidad de unión de anticuerpos)]
Se dispersó 1 mg de las partículas magnéticas obtenidas en cada uno de los Ejemplos y Ejemplos Comparativos 2 a 5 en 2 ml de agua. Se introdujo este líquido de dispersión de agua en un tubo Eppendorf, se separaron las partículas mediante magnetismo y se extrajo un sobrenadante. A continuación, se dispersaron las partículas en 990 pl de una solución tampón MES (100 mM, pH 5,0), se añadieron 10 pl de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (10 mg/ml) y se incubó la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se
separaron las partículas mediante magnetismo y se extrajo un sobrenadante. Se dispersaron las partículas en 1 ml de una solución tampón MES (100 mM, pH 5,0), a la que se añadieron 15 |jg de anticuerpo anti-TSH (fabricado por Funakoshi Co., Ltd.). Se incubó la mezcla durante 12 horas a temperatura ambiente, posteriormente se separaron las partículas mediante magnetismo y se extrajo el sobrenadante. Se lavaron las partículas cinco veces con una solución tampón TBS-T (Tween 20 al 0,05% en masa), y así se obtuvieron partículas unidas a anticuerpos.
A continuación, se determinó la cantidad de unión del anticuerpo mediante un ensayo BCA. Es decir, se dispersó 1 mg de las partículas unidas a anticuerpos en 1 ml de una solución mezclada A/B del Kit de Reactivos de Ensayo de Proteínas BCA (fabricado por Thermo Fisher Scientific, Inc.), y se sometió la dispersión a una mezcla por inversión durante 30 minutos a 37 °C. Se separaron las partículas mediante magnetismo, se eliminó el sobrenadante y se midió la absorbancia a 570 nm. Por separado, se mezclaron respectivamente las soluciones de anticuerpos preparadas mediante la disolución de 0 jg , 2 jg , 4 jg , 8 jg y 16 jg de anticuerpos antiTSH con 1 ml de la solución mixta A/B, y las mezclas se sometieron a una mezcla por inversión durante 30 minutos a 37 °C. Posteriormente, se midieron las absorbancias de las soluciones de reacción a 570 nm. Se determinó la cantidad de anticuerpos unidos a las partículas magnéticas a partir de una curva de calibración así obtenida. Los resultados se presentan en la Tabla 2.
[Ejemplo 4 prueba (CLEIA)]
Se introdujeron en un tubo de ensayo 5 j l de un líquido de dispersión de las partículas unidas a anticuerpos obtenidas en el Ejemplo 3 de Prueba (equivalente a 50 jg de las partículas), y se mezclaron con 50 j l de una solución de antígeno de TSH de 200 jIU/m l (solución de Ts H estándar LUMlPuLSE TSH-III fabricada por Fujirebio, Inc.) que contenía 50 j l de suero de ternera fetal (FCS). Se dejó reaccionar la mezcla durante 10 minutos a 25 °C. Se separaron las partículas mediante magnetismo y se eliminó el sobrenadante. Posteriormente, se añadieron 40 j l de anticuerpo antiTSH marcado con fosfatasa alcalina (incluido en el cartucho de inmunorreacción LUMIPULSE TSH-III fabricado por Fujirebio, Inc.) como anticuerpo secundario a las partículas. Se dejó reaccionar la mezcla durante 10 minutos a 25 °C. Se separaron las partículas mediante magnetismo, se eliminó un sobrenadante y, a continuación, se lavaron las partículas repetidamente tres veces con PBS. Se dispersaron las partículas así obtenidas en 50 j l de Tritón X-100 al 0,01%, y se transfirió la dispersión a un nuevo tubo. Se añadieron 100 j l de una solución de sustrato para la fosfatasa alcalina (solución de sustrato LUMIPULSE fabricada por Fujirebio, Inc.), se dejó que la mezcla reaccionara durante 10 minutos a 37 °C y luego se midió la cantidad de quimioluminiscencia como señal. Para la medición de la quimioluminiscencia se utilizó un analizador de quimioluminiscencia (LUMAT LB9507) fabricado por Berthold Japan Co. Se midió la cantidad de quimioluminiscencia como ruido la misma manera que la descrita anteriormente, excepto que se utilizó 0 jIU /m l de calibrador de TSH en lugar de la solución de antígeno de TSH de 200 jIU/ml. Además, se calculó el valor que se obtiene al dividir la señal (S) por el ruido (N), S/N. Los resultados se presentan en la Tabla 2.
[Ejemplo 5 de Prueba (tasa de captura de células)]
Se dispersó 1 mg de las partículas magnéticas obtenidas en cada uno de los Ejemplos y Ejemplos Comparativos 2 a 5 en 2 ml de agua. Se introdujo este líquido de dispersión de agua en un tubo Eppendorf, se separaron las partículas mediante magnetismo y se extrajo un sobrenadante. A continuación, se dispersaron las partículas en 990 j l de una solución tampón MES (100 mM, pH 5,0), se añadieron 10 j l de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (10 mg/ml) y se incubó la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se separaron las partículas mediante magnetismo y se extrajo un sobrenadante. Se dispersaron las partículas en 1 ml de una solución tampón MES (100 mM, pH 5,0), a la que se añadieron 5 jg de anticuerpo anti-EpCAM. Se incubó la mezcla durante 12 horas a temperatura ambiente, posteriormente se separaron las partículas mediante magnetismo y se extrajo el sobrenadante. Se lavaron las partículas cinco veces con una solución tampón TBS-T ( Tween 20 al 0,05% en masa), y así se obtuvieron partículas unidas a anticuerpos.
Se lavaron estas partículas unidas a anticuerpos cuatro veces con una solución tampón PBS (-), y luego se dispersaron las partículas en 250 j l de una solución tampón PBS (-). A continuación, se mezclaron 90.000 células cancerosas de intestino grueso (HT-29) dispersas en 50 j l de solución tampón PBS (-) de Dulbecco con las partículas unidas a anticuerpos, se agitó la mezcla durante 30 minutos a 4 °C y se procedió a la captura de células. Se separaron las partículas mediante magnetismo y se extrajo un sobrenadante. Se lavaron las partículas cuatro veces con una solución tampón PBS (-), y así se obtuvieron partículas capturadas por las células. A continuación, se añadieron 50 j l de proteinasa K a las partículas capturadas por las células, y se dejó que la mezcla reaccionara durante 15 minutos a 55 °C y luego durante 20 minutos a 100 °C. De este modo, se eluyó el ADN contenido en las células. Se separaron las partículas mediante magnetismo, se recogió un sobrenadante y se realizó la PCR añadiendo un cóctel de PCR dirigido a la p-globina. Se calculó la tasa específica de captura de células a partir del número de células capturadas que se determinó a partir del valor Ct. Los resultados se presentan en la Tabla 2.
La operación se llevó a cabo de la misma manera que la descrita anteriormente, excepto que el anticuerpo EpCAM no se unió a las partículas, y la tasa de captura celular no específica se calculó a partir del número de células capturadas. Los resultados se presentan en la Tabla 2.
Como se muestra en las Tablas 1 y 2, las partículas magnéticas de los Ejemplos 1 a 8 (los Ejemplos 1, 5 y 6 son Ejemplos de Referencia útiles para entender la invención) presentaban una alta dispersabilidad en agua y suprimían la adsorción no específica, y permitían una unión facilitada de los ligandos a los grupos funcionales reactivos. Además, las partículas magnéticas presentaban una elevada relación S/N (señal/ruido), y podían detectar antígenos con una alta sensibilidad y un ruido reducido. Las partículas magnéticas de los Ejemplos 1 a 8 (los Ejemplos 1, 5 y 6 son Ejemplos de Referencia útiles para entender la invención) podrían capturar específicamente las células objetivo con en una alta proporción, y podrían suprimir la adsorción no específica.
Claims (12)
1. Un portador en fase sólida que comprende un polímero que incluye una unidad estructural representada por la siguiente Fórmula (1) y una unidad estructural representada por la siguiente Fórmula (2) unida a ella:
en el que en la Fórmula (1),
R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y
R2 representa un grupo orgánico que tiene una estructura zwitteriónica,
en la Fórmula (2),
R3 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo;
R4 representa -(C=O)-O-*, -(C=O)-NR6-* (en la que R6 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y el símbolo * representa una posición de enlace con R5 en la Fórmula (2)), o un grupo fenileno;
en un caso en el que R4 representa -(C=O)-O-*, R5 representa un átomo de hidrógeno, o un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo, o en un caso en el queR4 representa -(C=O)-NR6-* o un grupo fenileno, R5 representa un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo,
siempre que R5 no sea un grupo orgánico con estructura zwitteriónica,
en la que la distribución del peso molecular del polímero es de 1,0 a 2,5,
en la que el polímero es un polímero en bloque que incluye un primer bloque compuesto por unidades estructurales dispuestas repetidamente representadas por la Fórmula (1), y un segundo bloque compuesto por unidades estructurales dispuestas repetidamente representadas por la Fórmula (2), y
en la que la proporción de polimerización [m/(m n)] es de 0,1 a 0,35, en la que n es el grado medio de polimerización de la unidad estructural representada por la Fórmula (1) por polímero y m el grado promedio de polimerización de la unidad estructural representada por la Fórmula (2) por polímero.
2. El portador en fase sólida de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R2 es un grupo orgánico que tiene un grupo funcional catiónico de tipo sal de amonio cuaternario y un grupo funcional aniónico monovalente o divalente seleccionado del grupo que consiste en -(C=O)O-, -SO3- y -O-(O=P-O-)-O-.
3. El portador en fase sólida de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que R2 es un grupo orgánico representado por la siguiente fórmula (3) o (4):
en el que en la Fórmula (3),
R7 representa -(C=O)-O-*, -(C=O)-NR13-* (en la que R13 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y el símbolo representa una posición de enlace con R8 en la Fórmula (3)), o un grupo fenileno;
R8 y R9 representan independientemente un enlace simple o un grupo orgánico divalente que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
R10 representa -(C=O)O- o -SO3-; y
R11 y R12 representan independientemente un grupo metilo o un grupo etilo, o
en la Fórmula (4),
R7 representa -(C=O)-O-*, -(C=O)-NR20-* (en la que R20representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y el símbolo representa una posición de enlace con R15 en la Fórmula (4)), o un grupo fenileno;
R15 y R16 representan independientemente un enlace simple o un grupo orgánico divalente que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y
R17, R18y R19 representan independientemente un grupo metilo o un grupo etilo.
4. El portador en fase sólida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que está en forma de partículas magnéticas.
5. El portador en fase sólida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la densidad del polímero que ocupa la superficie del portador en fase sólida es de 0,1 a 1,2 moléculas/nm2.
6. El portador en fase sólida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el grado promedio de polimerización n de la unidad estructural representada por la Fórmula (1), y el grado promedio de polimerización m de la unidad estructural representada por la Fórmula (2) son 1 o mayores, respectivamente.
7. El portador en fase sólida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el contenido del grupo funcional reactivo es de 1 a 200 ^mol por gramo del contenido sólido del soporte en fase sólida.
8. El portador en fase sólida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, obtenido por un procedimiento para producir un portador en fase sólida, incluyendo el procedimiento al menos un paso de preparación de un portador que tiene un grupo iniciador de la polimerización; y un paso de polimerización de un monómero utilizando el grupo iniciador de la polimerización como punto de partida.
9. El portador en fase sólida de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el grupo iniciador de la polimerización es un grupo iniciador de la polimerización de radicales de transferencia atómica.
10. Un portador en fase sólida unido a un ligando, que comprende el portador en fase sólida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y un ligando unido al mismo.
11. Un procedimiento para detectar o separar una sustancia objetivo en una muestra, comprendiendo el procedimiento utilizar el portador en fase sólida unido a un ligando de acuerdo con la reivindicación 10.
12. Un procedimiento para producir un portador en fase sólida, teniendo el portador en fase sólida unido al mismo un polímero que incluye una unidad estructural representada por la siguiente Fórmula (1) y una unidad estructural representada por la siguiente Fórmula (2), comprendiendo el procedimiento:
(Paso 1) un paso de preparación de un soporte que tenga un grupo iniciador de la polimerización; y (Paso 2) un paso de polimerización de un monómero utilizando el grupo iniciador de la polimerización como punto de partida:
en el que en la Fórmula (1),
R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y
R2 representa un grupo orgánico que tiene una estructura zwitteriónica,
en la Fórmula (2),
R3 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo
R4representa -(C=O)-O-*, -(C=O)-NR6-* (en la que R6 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo; y el símbolo representa una posición de enlace con R8 en la Fórmula (2)), o un grupo fenileno; en un caso en el que R4 representa -(C=O)-O-*, R5 representa un átomo de hidrógeno, o un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo, y en un caso en el que R4 representa -(C=O)-NR6-* o un grupo fenileno, R5 representa un grupo orgánico que tiene un grupo funcional reactivo, siempre que R5 no sea un grupo orgánico con estructura zwitteriónica,
en la que la distribución del peso molecular del polímero es de 1,0 a 2,5,
en la que el polímero es un polímero en bloque que incluye un primer bloque compuesto por unidades estructurales dispuestas repetidamente representadas por la Fórmula (1), y un segundo bloque compuesto por unidades estructurales dispuestas repetidamente representadas por la Fórmula (2), y en la que la proporción de polimerización [m/(m n)] es de 0,1 a 0,35, en la que n es el grado medio de polimerización de la unidad estructural representada por la Fórmula (1) por polímero y m el grado promedio de polimerización de la unidad estructural representada por la Fórmula (2) por polímero.
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