ES2901383T3

ES2901383T3 - Producción in vitro de glóbulos rojos con proteínas marcables con sortasa

Info

Publication number: ES2901383T3
Application number: ES19171188T
Authority: ES
Inventors: Harvey Lodish; Hidde Ploegh; Hsiang-Ying Lee; Lenka Kundrat; Novalia Pishesha; Jiahai Shi
Original assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Current assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2014-05-09
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2034-05-09
Also published as: JP2016519933A; US11992505B2; HK1222662A1; JP6960177B2; US20180280440A1; JP6599848B2; EP3546484B1; JP2020018317A; EP2994491A2; EP3693398A1; AU2014262474A1; WO2014183071A3; JP2022001063A; US11266695B2; US20200069736A1; US10471099B2; WO2014183071A2; AU2019283766B2; EP2994491A4; EP3546485A1

Abstract

Un método de conjugación de un péptido de interés con la superficie de un glóbulo rojo genéticamente manipulado, comprendiendo el método: proporcionar el glóbulo rojo genéticamente manipulado que comprende una proteína de fusión superficial marcable con sortasa, en donde la proteína de fusión superficial marcable con sortasa comprende una proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo I y un péptido, y poner en contacto el glóbulo rojo con el péptido de interés en presencia de una sortasa, en donde el extremo N de la proteína de fusión superficial marcable con sortasa se expone al espacio extracelular o luminal, el péptido es cualquiera de oligoglicina u oligoalanina fusionado con el extremo N de la proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo I, y el péptido de interés comprende un motivo de reconocimiento de sortasa; y en donde la sortasa conjuga el péptido de interés con la proteína de fusión superficial marcable con sortasa, conjugando así el péptido de interés con la superficie del glóbulo rojo genéticamente manipulado.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción in vitro de glóbulos rojos con proteínas marcables con sortasa

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las superficies celulares se pueden modificar para modular la función superficial o para conferir nuevas funciones a dichas superficies. La funcionalización superficial puede incluir, por ejemplo, la adición de una marca detectable, un resto de unión o un agente terapéutico a una proteína de la superficie, lo que permite la detección o el aislamiento de las células modificadas en la superficie, para la generación de nuevas interacciones célula-célula que no ocurren naturalmente, o para la conjugación de un agente terapéutico o de diagnóstico con la superficie celular.

La modificación de la superficie celular se puede lograr por ingeniería genética o por modificaciones químicas de las proteínas de la superficie celular. Sin embargo, ambos enfoques están limitados en sus capacidades, por ejemplo, en que muchas proteínas de la superficie no toleran inserciones por encima de un cierto tamaño sin sufrir alteraciones en su función o expresión, y en que muchas modificaciones químicas requieren condiciones de reacción no fisiológicas.

El documento de patente US 8211656 desvela glóbulos rojos modificados que incluyen un agente que se une a diana.

Tanaka et al., 2008 (ChemBioChem Mar 25;9(5):802-7) desvelan un enfoque basado en transpeptidación para la bioconjugación de proteínas de la superficie celular.

Yamamoto et al., 2009 (Chemical Communications (9): 1022-1024) desvelan un método de marcado con sortasa para el marcado aminoterminal específico de sitio de proteínas de la superficie celular.

Popp et al., 2007 (Nature Chemical Biology, volumen 3, páginas 707-708) desvelan el marcado con sortasa in vitro sobre la superficie de células vivas.

Muzykantov et al., 2010 (Expert Opinion on Drug Delivery, volumen 7, edición 4) desvelan la encapsulación de fármacos en glóbulos rojos aislados ex vivo, seguido por infusión en receptores compatibles y acoplamiento de terapéuticos a la superficie de glóbulos rojos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método de conjugación de un péptido de interés con la superficie de un glóbulo rojo genéticamente manipulado, comprendiendo el método:

proporcionar el glóbulo rojo genéticamente manipulado que comprende una proteína de fusión superficial marcable con sortasa, en donde la proteína de fusión superficial marcable con sortasa comprende una proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo I y un péptido, y

poner en contacto el glóbulo rojo con el péptido de interés en presencia de una sortasa,

en donde el extremo N de la proteína de fusión superficial marcable con sortasa se expone al espacio extracelular o luminal, el péptido es cualquiera de oligoglicina u oligoalanina fusionado con el extremo N de la proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo I, y el péptido de interés comprende un motivo de reconocimiento de sortasa; y

en donde la sortasa conjuga el péptido de interés con la proteína de fusión superficial marcable con sortasa, conjugando así el péptido de interés con la superficie del glóbulo rojo genéticamente manipulado.

La presente invención también proporciona un método de conjugación de un péptido de interés con la superficie de un glóbulo rojo genéticamente manipulado, comprendiendo el método:

proporcionar el glóbulo rojo genéticamente manipulado que comprende una proteína de fusión superficial marcable con sortasa, en donde la proteína de fusión superficial marcable con sortasa comprende una proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo II y un péptido, y

en donde el extremo C de la proteína de fusión superficial marcable con sortasa se expone al espacio extracelular o luminal, el péptido es un motivo de reconocimiento de sortasa que está fusionado con el extremo C de la proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo II, y el péptido de interés comprende cualquiera de oligoglicina u oligoalanina; y

La presente divulgación se basa en el desarrollo de un proceso de cultivo multifásico in vitro para la diferenciación de células de sangre periférica CD34+ humanas en glóbulos rojos enucleados. Este proceso de cultivo in vitro sincronizó inesperadamente la expansión eritroide, la diferenciación terminal y la enucleación de células de sangre periférica CD34+ humanas movilizadas.

La presente divulgación también se basa en el desarrollo de un sistema marcable con sortasa para la modificación superficial de glóbulos rojos, en el que un agente de interés se conjuga con la superficie de los glóbulos rojos enucleados. Los glóbulos rojos enucleados se pueden producir por el sistema de cultivo multifásico in vitro descrito en el presente documento. Dichos glóbulos rojos enucleados modificados en la superficie se pueden usar para fines de diagnóstico y terapéuticos.

Por consiguiente, un aspecto de la presente divulgación caracteriza un método de producción de glóbulos rojos enucleados humanos, comprendiendo el método: (i) proporcionar una población de células progenitoras CD34+ humanas (por ejemplo, células de sangre periférica CD34+ humanas); (ii) expandir la población de células progenitoras CD34+ humanas en un primer medio durante 0~6 días (por ejemplo, 4 días), en donde el primer medio comprende el ligando Flt-3, factor de células madre (SCF), interleucina 3 (IL-3) e interleucina 6 (IL-6); (iii) diferenciar las células progenitoras CD34+ humanas expandidas obtenidas de la etapa (ii) en un segundo medio durante 4~7 días (por ejemplo, 5 días), en donde el segundo medio comprende dexametasona, p-estradiol, IL-3, SCF y eritropoyetina (EPO); (iv) diferenciar las células obtenidas de la etapa (iii) en un tercer medio durante 3~5 días (por ejemplo, 4 días), en donde el tercer medio comprende SCF y EPO; (v) diferenciar las células obtenidas de la etapa (iv) en un cuarto medio durante 4~12 días (por ejemplo, 9 días) para producir glóbulos rojos enucleados humanos, en donde el cuarto medio comprende EPO; y (vi) recoger los glóbulos rojos enucleados humanos obtenidos de la etapa (v). En algunas realizaciones, el periodo de tiempo total para las etapas (ii)-(v) del método descrito anteriormente oscila de 11 -25 días (por ejemplo, 21 días). La etapa (v) se puede realizar en un recipiente de cultivo recubierto con un componente de la matriz extracelular, tal como fibronectina.

En algunas realizaciones, uno o más del segundo, tercer y cuarto medios pueden comprender además holotransferrina humana e insulina. Cuando sea necesario, todos del segundo, tercer y cuarto medios comprenden además estas dos citocinas. En otras realizaciones, el segundo, tercer y/o cuarto medios pueden estar libres de ciertas citocinas, por ejemplo, trombopoyetina (TPO), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), 0 ambos.

En un ejemplo, el segundo medio usado en cualquiera de los métodos de producción in vitro descritos en el presente documento puede comprender 250-1500 pg/ml (por ejemplo, 500 pg/ml) de holo-transferrina humana, 5~20 pg/ml de insulina (por ejemplo, 10 pg/ml), dexametasona 100 nM -5 pM (por ejemplo, 2 pM), p-estradiol 0,5-5 pM (por ejemplo, 1 pM), 1-10 ng/ml (por ejemplo, 5 ng) de IL-3, 10-500 ng/ml (por ejemplo, 100 ng/ml) de SCF y/o 2 -10 U (por ejemplo, 6 U) de EPO. El segundo medio puede estar libre de ciertas citocinas, por ejemplo, Flt-3, IL-6, o ambos.

En otro ejemplo, el tercer medio usado en cualquiera de los métodos de producción in vitro descritos en el presente documento puede comprender 250-1500 pg/ml (por ejemplo, 500 pg/ml) de holo-transferrina humana, 5 -20 pg/ml (por ejemplo, 10 pg/ml) de insulina, 10-100 ng/ml (por ejemplo, 50 ng/ml) de SCF y/o 2 -10 U (por ejemplo, 6 U) de EPO. El tercer medio puede estar libre de ciertas citocinas, por ejemplo, Flt-3, lL-6, dexametasona, p-estradiol o cualquier combinación de los mismos.

En otro ejemplo más, el cuarto medio usado en cualquiera de los métodos de producción in vitro descritos en el presente documento puede comprender 250-1500 pg/ml (por ejemplo, 500 pg/ml) de holo-transferrina humana, 5 -20 pg/ml (por ejemplo, 10 pg/ml) de insulina y/o 0 ,5-3 U (por ejemplo, 2 U) de EPO. El cuarto medio puede estar libre de ciertas citocinas, por ejemplo, Flt-3, IL-6, dexametasona, p-estradiol, SCF, o cualquier combinación de los mismos.

En cualquiera de los métodos de producción in vitro descritos en el presente documento, las células progenitoras CD34+ humanas pueden ser cualquiera de los glóbulos sanguíneos enucleados genéticamente manipulados (que no existen de forma natural), como se describe en el presente documento, por ejemplo, un CD34+ humano que expresa una proteína de fusión que comprende una proteína de la membrana de los glóbulos rojos y un péptido de interés. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo I (por ejemplo, glicoforina A) fusionada con un péptido aceptor en el extremo N de la proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo I. El péptido aceptor puede incluir un resto de oligoglicina, por ejemplo, un fragmento de 1 -5 glicinas, o un resto de oligoalanina (por ejemplo, un fragmento de 1-5 alaninas). En otras realizaciones, la proteína de fusión comprende una proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo II (por ejemplo, Kell o CD71) fusionada con un péptido que comprende una secuencia reconocida por una sortasa (por ejemplo, una sortasa A) en el extremo C de la proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo II. La secuencia reconocible por la sortasa puede ser LPXTG (SEQ ID NO:1), en la que X es cualquier resto de aminoácido. En otras realizaciones más, la proteína de la membrana es una proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo III, tal como el transportador 1 de glucosa (GLUT1).

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un glóbulo rojo enucleado genéticamente manipulado que se expresa sobre la superficie de una primera proteína de fusión que comprende un primer péptido de interés y una primera proteína de la membrana celular de glóbulos rojos. En algunas realizaciones, la primera proteína de la membrana celular de glóbulos rojos es una proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo I (por ejemplo, glicoforina A, tal como la glicoforina A humana) y el primer péptido de interés está fusionado con el extremo N de la proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo I. En otras realizaciones, la primera proteína de la membrana celular de glóbulos rojos es una proteína transmembranaria de tipo II (por ejemplo, Kell o CD71) y el primer péptido de interés está fusionado con el extremo C de la proteína transmembranaria de tipo II. El primer péptido de interés puede comprender una secuencia reconocible por una sortasa, tal como la sortasa A. En un ejemplo, la secuencia reconocible por la sortasa es LPXTG (SEQ ID NO: 1), en la que X es cualquier resto de aminoácido. En otras realizaciones más, la primera proteína de la membrana celular de glóbulos rojos es una proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo III, tal como GLUT1.

En algunas realizaciones, la primera proteína de fusión comprende además una proteína de interés (por ejemplo, una proteína citoplásmica, que puede ser un agente de diagnóstico o un agente terapéutico). La proteína de interés está fusionada con el extremo de la primera proteína de la membrana celular de glóbulos rojos que se expone a un espacio citoplásmico y el primer péptido de interés está fusionado con el extremo de la primera proteína de la membrana celular de glóbulos rojos que se expone a un espacio extracelular o luminal.

En algunos ejemplos, la primera proteína de la membrana celular de glóbulos rojos puede ser una proteína de la membrana de tipo I (por ejemplo, una GPA). La proteína de interés está fusionada con el extremo C de la proteína de la membrana de tipo I y el primer péptido de interés está fusionado con el extremo N de la proteína de la membrana de tipo I.

En otros ejemplos, la primera proteína de la membrana celular de glóbulos rojos es una proteína de la membrana de tipo II. La proteína de interés está fusionada con el extremo N de la proteína de la membrana de tipo II, y el primer péptido de interés está fusionado con el extremo C de la proteína de la membrana de tipo I.

En aún otras realizaciones, el glóbulo rojo enucleado genéticamente manipulado como se describe en el presente documento puede expresar además sobre la superficie una segunda proteína de fusión que comprende un segundo péptido de interés y una segunda proteína de la membrana celular de glóbulos rojos.

En algunos ejemplos, el primer péptido de interés en la primera proteína de fusión comprende un sitio reconocible o un péptido aceptable de una primera sortasa y el segundo péptido de interés en la segunda proteína de fusión comprende un sitio reconocible o un péptido aceptable de una segunda sortasa. La primera sortasa y la segunda sortasa usan diferentes sitios reconocibles y diferentes péptidos aceptables. En un ejemplo, el primer péptido de interés comprende el motivo de LPXTA (SEQ ID NO:2), en el que X es cualquier resto de aminoácido, o una oligoalanina; y el segundo péptido de interés comprende el motivo LPXTG (SEQ ID NO:1), o una oligoglicina (por ejemplo, que consiste en 1 -5 restos de glicina). En otro ejemplo, la primera proteína de fusión comprende Kell, cuyo extremo C está fusionado con un primer péptido de interés que comprende el motivo LPXTG (SEQ ID NO:1), y la segunda proteína de fusión comprende GPA, cuyo extremo C está fusionado con un segundo péptido de interés que comprende una oligoalanina (por ejemplo, que consiste en 1-5 restos de alanina).

En cualquiera de los glóbulos sanguíneos enucleados genéticamente manipulados descritos en el presente documento que expresan dos proteínas de fusión sobre la superficie, cualquiera de una o ambas de las proteínas de fusión se puede conjugar con dos restos funcionales diferentes.

El glóbulo sanguíneo enucleado anteriormente descrito se puede preparar por cualquiera de los métodos de cultivo in vitro descritos en el presente documento.

En algunos casos, el primer péptido de interés, el segundo péptido de interés, o ambos, que están fusionados con la(s) proteína(s) de la membrana celular de glóbulos rojos descrita(s) en el presente documento pueden comprender un fármaco de proteína (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que puede ser un anticuerpo de un único dominio), un antígeno de vacuna, una proteína fluorescente, estreptavidina, biotina, una enzima, o un péptido capaz de dirigirse a una célula (por ejemplo, una célula enferma). En otros casos, el péptido de interés se conjuga con una marca detectable o un agente quimioterapéutico. Por ejemplo, el péptido de interés se puede conjugar con un lípido, un hidrato de carbono, un ácido nucleico, un agente de unión, una unidad de conexión de química click, un polímero, un péptido, una proteína, un metal, un quelante, una radiomarca o una molécula pequeña.

En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona métodos de administración de un agente a un sujeto, comprendiendo el método administrar cualquiera de los glóbulos sanguíneos enucleados descritos en el presente documento al sujeto. En algunos ejemplos, el corpúsculo sanguíneo enucleado que se suministra deriva del mismo sujeto al que se suministra la célula.

Dentro del alcance de la presente divulgación también están métodos de conjugación de cualquiera de los péptidos de interés descritos en el presente documento con la superficie de glóbulos rojos. Este método comprende: (i) proporcionar un glóbulo rojo que expresa una proteína de fusión que comprende una proteína de la membrana y un primer péptido, y (ii) poner en contacto el glóbulo rojo con un péptido de interés en presencia de una sortasa (por ejemplo, la sortasa A) en condiciones adecuadas para que la sortasa conjugue el péptido de interés con el primer péptido en la proteína de fusión. Cualquiera del primer péptido en la proteína de fusión o el péptido de interés comprende una secuencia reconocida por la sortasa. En un ejemplo, la secuencia reconocible por la sortasa es LPXTG (SEQ ID NO:1), en la que X es cualquier resto de aminoácido.

En algunas realizaciones, la proteína de la membrana es una proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo I (por ejemplo, glicoforina A) y el primer péptido es un péptido aceptor (por ejemplo, que incluye un fragmento de oligoglicina, tal como un fragmento de 1-5 glicinas) fusionado con el extremo N de la proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo I, en donde el péptido de interés comprende la secuencia reconocida por la sortasa. En otras realizaciones, la proteína de la membrana es una proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo II (por ejemplo, Kell o CD71) y el primer péptido está fusionado con el extremo C de la proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo II, en donde el primer péptido comprende la secuencia reconocible por la sortasa. En otras realizaciones más, la proteína de la membrana es una proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo III, tal como GLUT1.

En algunas realizaciones, la primera proteína de fusión en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede comprender además una proteína de interés (por ejemplo, una proteína citoplásmica, que puede ser un agente de diagnóstico o un agente terapéutico), que está fusionada con el extremo de la primera proteína de la membrana celular de glóbulos rojos que se expone a un espacio citoplásmico. El primer péptido de interés en la proteína de fusión está fusionado con el extremo de la primera proteína de la membrana celular de glóbulos rojos que se expone a un espacio extracelular o luminal.

En algunos ejemplos, la primera proteína de la membrana celular de glóbulos rojos es una proteína de la membrana de tipo I. La primera proteína de interés está fusionada con el extremo C de la proteína de la membrana de tipo I, y el primer péptido está fusionado con el extremo N de la proteína de la membrana de tipo I. En otros ejemplos, la primera proteína de la membrana celular de glóbulos rojos es una proteína de la membrana de tipo II. La proteína de interés está fusionada con el extremo N de la proteína de la membrana de tipo II, y el primer péptido está fusionado con el extremo C de la proteína de la membrana de tipo I.

En aún otras realizaciones, cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede comprender además poner en contacto el glóbulo rojo en presencia de una segunda sortasa en condiciones adecuadas para que la segunda sortasa conjugue un segundo péptido de interés con una segunda proteína de fusión expresada en la superficie del glóbulo rojo. La segunda proteína de fusión comprende una segunda proteína de la membrana celular de glóbulos rojos y un segundo péptido con el que se conjuga el segundo péptido de interés. En algunos ejemplos, cualquiera del segundo péptido en la proteína de fusión o el segundo péptido de interés comprende una secuencia reconocible por la segunda sortasa. La secuencia reconocible por la primera sortasa se diferencia de la secuencia reconocible por la segunda sortasa.

En algunos ejemplos, el primer péptido en la primera proteína de fusión comprende una secuencia reconocible por la primera sortasa o un péptido aceptable de la primera sortasa; y/o el segundo péptido en la segunda proteína de fusión comprende una secuencia reconocible por la segunda sortasa o un péptido aceptable de la segunda sortasa. El péptido aceptable de la primera sortasa es diferente del péptido aceptable de la segunda sortasa. La primera sortasa puede ser la sortasa A de Staphylococcus aureus. Uno del primer péptido en la primera proteína de fusión y el primer péptido de interés comprende el motivo LPXTG (SEQ ID NO:1), en el que X es cualquier resto de aminoácido, y el otro comprende un péptido aceptable, que es una oligoglicina. La primera proteína de fusión puede comprender Kell, cuyo extremo C está fusionado con el primer péptido que comprende el motivo LPXTG (SEQ ID NO: 1), y el primer péptido de interés comprende una oligoglicina (por ejemplo, que consiste en 1-5 restos de glicina).

En algunos ejemplos, la segunda sortasa es la sortasa A de Streptococcus pyogenes. Uno del segundo péptido en la segunda proteína de fusión y el segundo péptido de interés puede comprender el motivo LPXTA (SEQ ID NO:2), en el que X es cualquier resto de aminoácido, y el otro puede comprender un péptido aceptable, que puede ser una oligoalanina (por ejemplo, que consiste en 1 -5 restos de alanina). La segunda proteína de fusión puede comprender GPA, cuyo extremo N está fusionado con el segundo péptido que comprende una oligoglicina. El segundo péptido de interés puede comprender el motivo LPXTG (SEQ ID NO:1), en el que X es cualquier resto de aminoácido.

En algunas realizaciones, el primer y segundo péptidos de interés comprende o se conjuga con dos restos funcionales diferentes. Alternativamente o además, el primer péptido de interés, el segundo péptido de interés, o ambos, pueden ser un fármaco de proteína, un antígeno de vacuna, una proteína fluorescente, estreptavidina, biotina, una enzima, o un péptido capaz de dirigirse a una célula. En un ejemplo, uno del primer y segundo péptido de interés es un péptido capaz de dirigirse a una célula enferma.

Además, la presente divulgación proporciona (a) composiciones farmacéuticas para el diagnóstico o usos terapéuticos, comprendiendo la composición farmacéutica cualquiera de los glóbulos rojos enucleados descritos en el presente documento, que llevan cualquiera del péptido de interés como se describe en el presente documento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y (b) usos de las composiciones farmacéuticas para la fabricación de medicamentos para fines de diagnóstico o terapéuticos.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en la siguiente descripción. Otras características o ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de los siguiente Dibujos y Descripción detallada de ciertas realizaciones, y también de las Reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 ilustra un proceso de cultivo in vitro a modo de ejemplo para producir glóbulos rojos enucleados a partir de células progenitoras CD34+ humanas.

La Figura 2 incluye fotografías que muestran la morfología de las células en la expansión y las diferentes etapas de diferenciación en el proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento.

La Figura 3 es un diagrama que muestra la expresión de los marcadores de la superficie celular glicoforina A (CD235) y c-kit en células en la expansión y las diferentes etapas de diferenciación en el proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento, como se ha determinado por el análisis de FACS.

La Figura 4 es un diagrama que muestra la expresión de los marcadores de la superficie celular glicoforina A (CD235) y el receptor de transferrina (CD71) en células en la expansión y las diferentes etapas de diferenciación en el proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento, como se ha determinado por análisis de FACS. La Figura 5 es un diagrama que muestra la enucleación de células en la expansión y las diferentes etapas diferenciación en el proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento.

La Figura 6 incluye gráficos que muestran la proliferación celular en las diferentes etapas de diferenciación. La Figura 7 es un gráfico que muestra la proliferación celular en una ventana de aproximadamente 20 días. La Figura 8 incluyen gráficos que muestran la expresión de genes de globina, como se indica durante la diferenciación de células hCD34+.

La Figura 9 incluye gráficos que muestran la expresión de diversos genes, como se indica durante la diferenciación de células hCD34+.

La Figura 10 es un diagrama que muestra la construcción de vectores de expresión EF1 y MSCV para producir la proteína de fusión 5Gly (SEQ ID NO: 3)-myc-glicoforina A humana (hGYPA o hGPA).

La Figura 11 es un diagrama que muestra la expresión superficial de hGYPA marcable con sortasa en progenitores eritroides hCD34+ (en diferentes etapas de diferenciación) usando vectores de expresión EF1; 5Gly: (SEQ ID NO: 3). La Figura 12 es un diagrama que muestra la expresión superficial de hGYPA marcable con sortasa en progenitores eritroides hCD34+ (en diferentes etapas de diferenciación) usando vectores de expresión MSCV; 5Gly: (SEQ ID NO: 3).

La Figura 13 es una fotografía que muestra la conjugación de biotina con hGYPA en células progenitoras eritroides hCD34+ por marcado con sortasa como se ha determinado por transferencia Western; 5G: (SEQ ID NO: 3). La Figura 14 es un diagrama que muestra la conjugación de biotina con la superficie de células CD34+ humanas en la etapa de diferenciación terminal por marcado con sortasa; 5Gly: (SEQ ID NO: 3).

La Figura 15 es un diagrama que muestra la conjugación de biotina con la superficie de células CD34+ humanas en la etapa de diferenciación terminal por marcado con sortasa; 5Gly: (SEQ ID NO: 3).

La Figura 16 es un diagrama que muestra la expresión y el marcado aminoterminal mediado por sortasa de la glicoforina A sobre la superficie de glóbulos rojos maduros de ratón. (A) Esquema del marcado con sortasa del extremo N de glicoforina A. GPA se extendió en el extremo N para incluir 3 restos de glicina y una marca myc. La preincubación de sortasa con una sonda, que contiene un motivo de reconocimiento de sortasa carboxiterminal, LPETG (SEQ ID NO: 44) conduce a la escisión entre T y G y a la formación de un producto intermedio de enzima de acilo entre Cys en la sortasa y Thr en la sonda. El ataque nucleófilo de la glicina aminoterminal en GPA resuelve el producto intermedio, logando así la sonda con GPA. La sonda puede ser un péptido, proteína, lípido, hidrato de carbono, molécula pequeña, etc. Para la conjugación de biotina con GPA, la sonda es K(biotina)LPRTGG (SEQ ID NO: 45); LPXTGG: (s Eq ID NO: 46). (B) Evaluación de RBC maduros para la presencia de 3G-myc-hGPA sobre la superficie celular por tinción de cualquiera de sangre de control o sangre de ratones que se han sometido a trasplante de médula ósea para expresar 3G-myc-hGPA, con anticuerpos contra a-TER119 y contra la marca amyc y análisis por citometría de flujo. (C) Evaluación de RBC maduros para el marcado con sortasa incubando sangre de control o sangre de 3G-myc-hGPA con sortasa y la sonda que contiene biotina, tinción con anticuerpos contra a-TER119 y a-biotina, y analizando por citometría de flujo. (D) Evaluación de RBC para el marcado con sortasa por inmunotransferencia. Se incubó sangre de control o de 3G-myc-hGPA con sonda de biotina con o sin sortasa, y se resolvió la proteína celular total por SDS-PAGE e inmunotransferencia para la marca a-myc y abiotina. El desplazamiento en el peso molecular de GPA tras la conjugación con la biotina en la inmunotransferencia de la marca a-myc indica una modificación casi completa. El GPA conjugado con biotina se indica en la inmunotransferencia de a-biotina con una flecha. (E) Los RBC conjugados con biotina se clasificaron por citometría de flujo. Las imágenes de inmunofluorescencia muestran biotina (marcada con rojo) en el extremo N de hGPA en RBC maduros (marcados con el anticuerpo contra Ter119, morado). (F) Las células HEK 293T se transfectaron con 3A-myc-hGPA, hKell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA, o ambas. Las células se incubaron con sortasa de S. pyogenes y una sonda de biotina, seguido por sortasa de S. aureus e incubación con sonda que contiene TAMRA. La conjugación específica de biotina con GPA y de TAMRA con Kell se demuestra por obtención de imágenes de inmunotransferencia y fluorescencia.

La Figura 17 es un diagrama que muestra que la expresión en exceso de GPA humana modificada y GPA de ratón que contiene marca myc en los extremos N no afecta la diferenciación in vitro del progenitor eritroide de ratón. (A) Análisis de citometría de flujo de la capacidad de diferenciación de las células progenitoras obtenidas de hígado fetal murino diferenciado in vitro infectadas con construcciones retrovíricas que contienen construcciones de GPA humana (h) modificada o de ratón (m) extendida en sus extremos N con marca myc: myc-hGPA y myc-mGPA. La capacidad de diferenciación en estas células se evalúa basándose en las expresiones de Ter119 y la enucleación, es decir, la expulsión de núcleos, lo que produce reticulocitos Ter119+. Los porcentajes de reticulocitos producidos por células progenitoras eritroides infectadas con myc-hGPA o myc-mGPA (~20 %) son comparables a las células infectadas con vector vacío (de control), que indica que estas construcciones no alteran la diferenciación terminal eritroide. La cuantificación de la tasa de enucleación representa 3 experimentos independientes y se representaron como valores medios /- desviación estándar. (B) Evaluación de eritroblastos murinos terminalmente diferenciados, es decir, eritroblastos y reticulocitos nucleados, para la expresión superficial de myc-hGPA o myc-mGPA. Más del 60 % de estas células terminalmente diferenciadas expresaron las proteínas GPA modificadas deseadas como se mide por citometría de flujo usando anticuerpos contra la marca a-myc. El porcentaje de eritroblastos y reticulocitos con la marca myc sobre la superficie celular se determinó a partir de 3 experimentos independientes, se representó como el valor medio /- desviación estándar; ** indica p < 0,01. (C) Imágenes de inmunofluorescencia adicionales confirman la expresión superficial de la marca myc (marcada con rojo) y la capacidad de enucleación (tinción de núcleo azul) de los eritroblastos terminalmente diferenciados in vitro.

La Figura 18 es un diagrama que muestra la expresión en exceso de GPA humana manipulada y GPA de ratón que contiene marca myc con múltiples (3 o 5) glicinas (SEQ ID NO: 3) en sus extremos N no afecta la diferenciación in vitro de progenitores eritroides de ratón. Solo las células que expresan GPA humana manipulada con la marca myc y 3 glicinas en el extremo N pueden ser eficientemente marcadas con biotina por marcado con sortasa. (A) Análisis de citometría de flujo de la capacidad de diferenciación de células progenitoras obtenidas de hígado fetal murino diferenciadas in vitro infectadas con construcciones retrovíricas que contienen construcciones de GPA humana (h) modificada o de ratón (m) extendidas en su extremo N con la marca myc y múltiples (3 o 5) glicinas (SEQ ID NO: 3) (G): 5G (SEQ ID NO: 3)-myc-hGPA, 5G (SEQ ID NO: 3)-myc-mGPA y 3G-myc-hGPA. La capacidad de diferenciación en estas células se evalúa basándose en las expresiones de Ter119 y la enucleación, es decir, expulsión de núcleos, lo que da como resultado reticulocitos Ter119+. Véase el panel superior. Los porcentajes de reticulocitos producidos por células progenitoras eritroides infectadas con 5G (SEQ ID NO: 3)-myc-hGPA, 5G-mycmGPA y 3G-myc-hGPA (~ 17,5 %) son comparables a las células infectadas con vector vacío (de control), que indica que estas construcciones no alteran la diferenciación terminal eritroide. La cuantificación de la tasa de enucleación representa 3 experimentos independientes y se representó como valores medios /- desviación estándar. Véase el panel inferior. (B) Evaluación de los eritroblastos murinos terminalmente diferenciados, es decir, eritroblastos y reticulocitos nucleados, para la expresión superficial de 5G (SEQ ID NO: 3)-myc-hGPA, 5G (SEQ ID NO: 3)-myc-mGPA y 3G-myc-hGPA. Más del 50 % de estas células terminalmente diferenciadas expresaron las proteínas GPA modificadas deseadas como se mide por citometría de flujo usando anticuerpos contra la marca a-myc. Véase el panel superior. El porcentaje de eritroblastos y reticulocitos con marca myc sobre su superficie celular se determinó a partir de 3 experimentos independientes, se representó como el valor medio /- desviación estándar; ** indica p < 0,01. Véase el panel inferior. (C) Se transfectaron células HEK 293T para expresar 5G (SEQ ID NO: 3)-myc-hGPA, 5G (SEQ ID NO: 3)-myc-mGPA, 3G-myc-mGPA y 3G-myc-hGPA. Estas células se incubaron entonces con una sonda de biotina con o sin sortasa, y la proteína celular total se sometió a inmunotransferencia para la marca myc y biotina. La inmunotransferencia teñida para biotina muestra la satisfactoria conjugación de la biotina solo con construcciones de GPA humana 3G-myc-hGPA (banda fuerte) y 5G (SEQ ID NO: 3)-myc-hGPA (banda débil) con una eficiencia mucho mayor para 3G-myc (banda fuerte) y 5G (SEQ ID NO: 3)-myc-hGPA (banda débil) con una eficiencia mucho mayor para 3G-myc-hGPA. La inmunotransferencia de la marca a-myc confirma además la conjugación de la sonda de biotina, como se indica por un desplazamiento en el peso molecular de hGPA tras la conjugación con biotina.

La Figura 19 es un diagrama que muestra la expresión y el marcado aminoterminal mediado por sortasa de glicoforina A sobre la superficie de eritroblastos diferenciados in vitro. (A) Análisis de citometría de flujo de eritroblastos diferenciados in vitro para la presencia de 3G-myc-hGPA y para biotina-3G-myc-hGPA marcada con sortasa sobre la superficie celular por tinción con anticuerpos contra la marca a-myc y a-biotina. Véase el panel superior. Se determinó el porcentaje de eritroblastos y reticulocitos con marca myc sobre la superficie celular y el porcentaje de células positivas para la marca myc marcadas con sortasa con una sonda de biotina a partir de 3 experimentos independientes, se representó como valor medio /- desviación estándar; ** indica p < 0,01. Véase el panel inferior. (B) Evaluación de eritroblastos diferenciados in vitro para el marcado con sortasa incubando eritroblastos de control o con 3G-myc-hGPA con sortasa y la sonda que contiene biotina por medio de inmunotransferencia con anticuerpos contra la marca a-myc y a-biotina. El desplazamiento en el peso molecular de hGPA tras la conjugación con biotina en la transferencia de a-myc indica modificación completa de hGPA. La GPA conjugada con biotina se indica por una flecha en la inmunotransferencia de a-biotina. (C) La inmunofluorescencia muestra biotina (marcada con rojo) en el extremo N de hGPA sobre la superficie de eritroblastos diferenciados. El núcleo se tiñó por Hoechst (azul). La flecha indica reticulocitos, mientras que las puntas de flecha indican eritroblastos enucleantes. La barra de escala es 10 pm.

La Figura 20 es una ilustración esquemática de la producción de RBC manipulados por trasplante de médula ósea/células de hígado fetal de ratón. Se transdujeron células murinas aisladas de la médula ósea o células de hígado fetal con un retrovirus que lleva hKell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA o 3G-myc-hGPA. Los ratones letalmente irradiados se reconstituyeron con médula ósea transducida o células de hígado fetal. Después de 1 mes y en adelante, un porcentaje significativo de RBC maduros derivan de progenitores de donantes transducidos.

La Figura 21 es un diagrama que muestra la expresión y el marcado carboxiterminal mediado por sortasa de Kell sobre la superficie de glóbulos rojos maduros de ratón. (A) Esquema del marcado de sortasa carboxiterminal de Kell. Kell se extendió en el extremo C para incluir el motivo de reconocimiento de sortasa LPETG (SEQ ID NO: 44), seguido por una marca de epítope HA. La incubación de sortasa con células que contienen Kell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA sobre la superficie conduce a la escisión de péptidos entre T y G en el motivo de reconocimiento y la formación de un producto intermedio de enzima de acilo entre Cys sobre la sortasa y el motivo de sortasa en Kell. La adición de una sonda nucleófila con restos de glicina aminoterminales (GGG-K(biotina); SEQ ID NO: 47; para la conjugación de biotina) resuelve el producto intermedio, ligando así la sonda con el extremo C de Kell. La sonda puede ser un péptido, proteína, lípido, hidrato de carbono, molécula pequeña, etc.; LPXTG (SEQ ID NO: 1). (B) Evaluación de RBC maduros para la presencia de Kell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA sobre la superficie celular por tinción de cualquiera de sangre de control o sangre de ratones que han recibido un trasplante de médula ósea para expresar Kell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA con anticuerpo contra la marca a-HA y análisis por citometría de flujo (regulada en RBC maduros). (C) Evaluación de RBC maduros para el marcado de sortasa incubando sangre de control o sangre Kell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA con sortasa y la sonda que contiene biotina, tinción con anticuerpo contra a-biotina y análisis por citometría de flujo (regulada en RBC maduros). (D) Evaluación de RBC para el marcado con sortasa por inmunotransferencia. Se incubó sangre de control o Kell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA con sonda de biotina con o sin sortasa. Se resolvió la proteína celular total por SDS-PAGE y se sometió a inmunotransferencia para la marca a-HA y a-biotina. La pérdida de marca de HA tras el marcado con sortasa indica modificación completa. (E) Las imágenes de inmunofluorescencia muestran biotina conjugada con el extremo C de hKell en RBC maduros (marcados con anticuerpo Ter119).

La Figura 22 es un diagrama que muestra la expresión y el marcado carboxiterminal mediado por sortasa de Kell en la superficie de eritroblastos diferenciados in vitro. (A) Citometría de flujo de eritroblastos diferenciados in vitro para la presencia de hKell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-hA y para hKell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-biotina marcada con sortasa en la superficie celular por tinción con anticuerpo contra marca a-HA y a-biotina. Véase el panel superior. Se determinó el porcentaje de eritroblastos y reticulocitos con marca HA sobre la superficie celular y el porcentaje de células positivas para la marca HA marcadas con sortasa con una sonda de biotina a partir de 3 experimentos independientes, se representó como valor medio /- desviación estándar; ** indica p < 0,01. Véase el panel inferior. (B) Evaluación de eritroblastos diferenciados in vitro para marcado con sortasa incubando eritroblastos de control o hKell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA con sortasa y la sonda que contiene biotina, seguido por inmunotransferencia para biotina y Kell. (C) La inmunofluorescencia muestra biotina (marcada con ojo) en el extremo C de hKell sobre la superficie de eritroblastos diferenciados. El núcleo se tiñó por Hoechst (azul). La flecha indica reticulocitos, mientras que la punta de flecha indica eritroblastos enucleantes. La barra de escala es 10 pm.

La Figura 23 es un diagrama que muestra el marcado doble mediado por sortasa en el extremo N de hGPA y extremo C de hKell sobre la superficie de RBC maduros. Los RBC maduros que expresan hKell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA y 3A-myc-hGPA se incubaron con sortasa A de S. pyogenes y sonda de K(biotina)LPETAA (SEQ ID NO: 45) para el marcado de GPA aminoterminal (segundo panel), o con sortasa A de S. aureus y sonda GGGC(Alexa-647; SEQ ID NO: 48) para el marcado de Kell carboxiterminal (tercer panel), o tanto marca secuencial con ambas enzimas sortasas y sus sondas correspondientes (cuarto panel). El análisis de citometría de flujo de RBC maduros para la presencia de tanto hKell-LPET (SEQ ID NO: 49)-Alexa-647 como biotina-mychGPA indica un marcado doble satisfactorio.

La Figura 24 es varios gráficos que muestran la supervivencia de glóbulos rojos manipulados in vivo. (A) Se someten RBC no mutantes a marcado carboxiterminal simulado con la sortasa reaccionando con o sin sortasa (n=3, cada grupo) o dejados sin tratar (n=3) se hicieron reaccionar con CFSE y se transfundieron en ratones receptores por inyección intravenosa. Su supervivencia in vivo fue seguida por fluorescencia de CFSE y citometría de flujo. (B) Se obtuvieron RBC mKell-LPETG(SEQ ID NO: 44) de ratones genéticamente manipulados que tenían Kell endógeno extendido en su extremo C con una secuencia LPETG (SEQ ID NO: 44). Se tiñeron RBC no mutantes (n=6), RBC mKell-LPETG (SEQ ID NO: 44) (n=6) y RBC mKell-LPETG (SEQ ID NO: 44) marcados con sortasa con biotina (n=6) con CFSE, se transfundieron en receptores y su supervivencia se monitorizó por fluorescencia de CFSE o tinción anti-biotina usando citometría de flujo. (C) RBC no mutantes teñidos con CFSE (n=6) y RBC hKell-LPETG (SEQ ID NO: 44) aislados de ratones trasplantados (véase el Ejemplo 5) y marcados con sortasa con biotina (n=2) se transfundieron en ratones receptores y se siguió su supervivencia en circulación por fluorescencia de CfSe (RBC no mutantes) o tinción anti-biotina (RBC hKell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-biotina) usando citometría de flujo. (D) Se tiñeron con CFSE RBC no mutantes teñidos (n=6) y RBC biotina-3G-myc-hGPA marcados con sortasa (n=6), se transfundieron en ratones y se siguieron por fluorescencia de CFSE o tinción antibiotina usando citometría de flujo. Los RBC de control interno son células que se originan a partir de ratones trasplantados con 3G-myc-hGPA, se sometieron al marcado con reacción con sortasa y tinción con CFSE, pero no son mutantes. Las barras de error representan desviación estándar; * indica p < 0,01.

La Figura 25 es un diagrama que muestra la conjugación de anticuerpo de un solo dominio con glóbulos rojos manipulados y direccionamiento específico del tipo de célula. (A) Se incubó glóbulos rojos maduros de ratón manipulados para contener 3G-myc-GPA sobre la superficie celular con sortasa con o sin VHH7-LPETG (SEQ ID NO: 44), un anticuerpo de un solo dominio con especificidad de unión por moléculas de MHC de clase II de ratón y motivo de sortasa complementario con 3G. Una inmunotransferencia contra la marca myc de epítope sobre glicoforina A revela la fusión de VHH7 con GPA, como un aumento en el peso molecular de GPA. (B) Cualquiera de los linfocitos B de ratón naturales (que expresan la clase II del MHC) o linfocitos B obtenidos de ratones inactivados en la clase II del MHC se inmovilizaron sobre perlas magnéticas de estreptavidina por anticuerpo biotinilado contra a-CD19, se incubaron con glóbulos rojos 3G-myc-GPA o glóbulos rojos que contenían GPA VHH7-LPETG (SEQ ID NO: 44)-myc marcado con sortasa sobre su superficie, y se lavaron. La inmovilización de linfocitos B en todas las configuraciones experimentales se probó por la presencia de CD19 en inmunotransferencia de a-CD19 y la unión entre linfocitos B y glóbulos rojos se evaluó por la presencia de hemoglobina en la inmunotransferencia de a-hemoglobina. (C) Esquema del experimento mostrado en (B); LPETG: (SEQ ID NO: 44).

La Figura 26 es un diagrama que muestra la expresión y el marcado mediado por sortasa de glicoforina A sobre la superficie de reticulocitos diferenciados in vitro humanos. (A) Se transdujeron con virus células madre CD34+ de sangre periférica movilizadas con el factor estimulante de colonias de granulocitos humanos, o con vector vacío o un vector que contenía 3G-myc-GPA-GFP y se diferenciaron durante 18 días. El análisis de citometría de flujo de los reticulocitos revela el porcentaje de células transducidas (GFP+) y el porcentaje de células enucleadas (panel inferior con tinción de Hoechst). Los reticulocitos, ya fueran de control o transducidos con 3G-myc-GPA-GFP (3G-myc-hGPA-GFP-IRES-GFP), se incubaron con sortasa y una sonda que contenía biotina, se tiñeron para biotina con anticuerpo contra a-biotina-PE, se analizaron por citometría de flujo y se seleccionaron en células enucleadas. (B) Se incubaron reticulocitos transducidos con 3G-myc-GPA-GFP y diferenciados in vitro con una sonda de biotina con o sin sortasa, y la proteína celular total se inmunotransfirió para la marca myc y biotina. Tanto los monómeros, así como los dímeros (mayor peso molecular) de 3G-myc-GPA-GFP son visibles en ambas inmunotransferencias. Un desplazamiento en el peso molecular de GPA-GFP tras la conjugación con biotina en la inmunotransferencia de la marca a-myc indica modificación completa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE CIERTAS REALIZACIONES DE LA INVENCIÓN

Los glóbulos rojos son el tipo más numeroso de células en la sangre y representan un cuarto del número total de células en el cuerpo humano. Los RBC poseen muchas características únicas que hacen que sean una herramienta atractiva en terapéuticos y diagnósticos para diversos fines, por ejemplo, para la administración in vivo de cargas naturales o sintéticas. Yoo et al., 2011, Nature Reviews. Drug Delivery 10(7):521 -535. Por ejemplo, los glóbulos rojos maduros no tienen núcleos (es decir, enucleados) y así no habrá riesgo de suministrar restos de genes extraños a un hospedador. Por lo tanto, así se elimina la posibilidad de tumorigenicidad, un riesgo clave de las terapias basadas en células madre (Gruen et al., 2006 Stem cells 24(10):2162-2169). Además, los glóbulos rojos tiene una gran longevidad in vivo, por ejemplo, aproximadamente 120 días en la corriente sanguínea humana, y aproximadamente 50 días en ratones, y presencia en toda la macro- y microcirculación. La modificación de los glóbulos rojos con terapéuticos biodisponibles podría así conducir a una eficacia y cobertura prolongada de todas las áreas perfundidas por la circulación in vivo. Además, los RBC tienen grandes áreas superficiales celulares de aproximadamente 140 gm2 con una relación favorable entre superficie y volumen. Por tanto, los glóbulos rojos tienen buena biocompatibilidad cuando se usan como vehículos para la administración de agentes terapéuticos o de diagnóstico. Finalmente, se pueden retirar RBC viejos o dañados por células del sistema reticuloendotelial. Por lo tanto, cualquier modificación hecha al ADN de precursores de RBC se elimina tras su enucleación y no puede conducir a un crecimiento anormal o tumorigenicidad después de su transfusión a un receptor.

Por consiguiente, es de gran interés desarrollar métodos de producción de glóbulos rojos enucleados que lleven un agente de interés, tales como agentes de diagnóstico o terapéuticos. Dichos glóbulos rojos enucleados se pueden usar, por ejemplo, para suministrar el agente de interés en un sujeto.

Se han generado RBC manipulados usando encapsulación (Biagiotti et al., 2011, IUBMB life 63(8):621-631; Godfrin et al., 2012, Expert Opinion on Biological Therapy 12(1 ):127-133; y Muzykantov, 2010, Expert Opinion on Drug Delivery 7(4):403-427), por unión no covalente de péptidos extraños, o mediante la instalación de proteínas por fusión con un anticuerpo monoclonal específico para una proteína de la superficie de RBC (Murciano, 2003, Nature Biotechnology 21 (8):891-896; y Zaitsev et al., 2010, Blood 115(25):5241 -5248). Los RBC modificados se enfrentan a limitaciones si están previstos para aplicación in vivo. La encapsulación permite la compresión de cantidades considerables de material, pero a costa de alterar la integridad de la membrana plasmática, con una reducción concomitante en la semivida en circulación de los glóbulos rojos modificados. La compresión por ósmosis limita la naturaleza química de los materiales que pueden ser satisfactoriamente encapsulados, el sitio de liberación es difícil de controlar, y las enzimas encapsuladas son funcionales solo en el destino final, lo que compromete la capacidad de reutilización en otros sitios. Murciano et al., 2003 y Zaitsev et al., 2010. El encauzamiento de carga a los RBC por fusión con un anticuerpo específico de RBC (por ejemplo, anticuerpo anti-glicoforina) tiene sus limitaciones debido a que este modo de unión al RBC no es covalente y se disocia fácilmente, lo que reduce la semivida en circulación y la masa de carga disponible para administración. Murciano et al., 2003 y Zaitsev et al., 2010. Otros desarrollos que sacan provecho de los RBC para administración elegida como diana incluyen nanopartículas envueltas por una membrana que limita a los RBC, así como polímeros formados de RBC. Yoo et al., 2011 Nature Reviews. Drug Discovery 10(7):521-535. La corta tasa de supervivencia in vivo de estos vehículos inspirados en RBC (~7 días máximo) puede limitar su utilidad terapéutica.

Otra dificultad técnica asociada a la manipulación de RBC es la ausencia de un sistema in vitro adecuado para el cultivo y la diferenciación de RBC. Se han desvelado sistemas de cultivo de células CD34+ humanas en Miharada et al., Nat. Biotechnol., 24(10):1255-1256, 2006; Sankaran et al., Science, 322(5909):1839-1842, 2008, y Giarratana et al., Blood, 118(19):5071-5079, 2011. Sin embargo, los glóbulos rojos enucleados maduros obtenidos a partir de estos sistemas de cultivo celular no mostraron contenidos de hemoglobina similares y/o tamaños celulares en comparación con los reticulocitos o glóbulos rojos humanos normales, no mostraron expresión sincronizada de los marcadores de diferenciación de la superficie celular durante el proceso de cultivo. Por tanto, el sistema de cultivo celular enseñado en Sankaran et al. no generó células eritroides terminalmente diferenciadas ni glóbulos rojos enucleados.

En vista de las desventajas asociadas a la tecnología existente, existe la necesidad de desarrollar una nueva metodología para manipular RBC, de forma que puedan llevar una amplia variedad de cargas útiles a ubicaciones específicas en el cuerpo.

En los presentes estudios, se desarrollaron glóbulos rojos modificados para servir de vehículos para la administración sistémica de una amplia matriz de cargas. Estos RBC contienen proteínas modificadas en su membrana plasmática, que se pueden marcar en una reacción catalizada por sortasa en condiciones nativas sin infligir un daño a la membrana o célula diana. La sortasa adapta una amplia variedad de cargas naturales y sintéticas que permiten la modificación de los RBC con sustituyentes que no se pueden codificar genéticamente. Los presentes estudios demuestran la satisfactoria conjugación específica de sitio de la biotina con eritroblastos de ratón diferenciados in vitro, así como con RBC maduros de ratón. Inesperadamente, estos glóbulos rojos modificados permanecen en la circulación sanguínea durante hasta 28 días, que es mucho más que los glóbulos rojos manipulados por métodos conocidos en la técnica. Un anticuerpo de un solo dominio unido enzimáticamente a los RBC permite que se unan específicamente a células diana que expresan el anticuerpo diana. Este estudio se extendió a los glóbulos rojos humanos y muestra un inesperado y eficiente marcado mediado por sortasa de reticulocitos humanos diferenciados in vitro.

Los procesos de manipulación y marcado descritos en el presente documento no dañan las células ni afectan su supervivencia in vivo. Y, lo que es más importante, los glóbulos rojos manipulados se pueden marcar con una amplia matriz de sondas funcionales, que incluyen moléculas pequeñas, péptidos y proteínas, y así tienen el potencial de ser vehículos de una variedad de sustancias terapéuticas en la circulación sanguínea. Por lo tanto, los métodos descritos en el presente documento ofrecen ventajas con respecto a los métodos de encapsulación por osmosis conocidos en la técnica.

Se ha sacado provecho previamente del marcado de la superficie celular mediado por sortasa, por ejemplo, para explorar el tráfico de glucoproteínas de la gripe. Popp et al., 2012 PLos Pathogens 8(3):e1002604; y Sanyal et al., 2013 Cell Host & Microbe 14(5):510-521. Esta metodología se modificó y aplicó a células primarias como una plataforma para fines de diagnóstico o terapéuticos. Una variante de sortasa A de S. aureus se activa a 0 °C (Chen et al., 2011 PNAS 108(28):11399-11404) para reducir el riesgo de infringir daño celular en el transcurso del marcado.

Existen muchas otras posibles aplicaciones para los métodos presentados aquí, donde la amplia variedad de posibles cargas, que varían desde proteínas y péptidos hasta compuestos sintéticos y sondas fluorescentes, puede servir de guía. Por ejemplo, dichos métodos permitirían el direccionamiento de los glóbulos rojos modificados a un tipo de célula específico. Además, los métodos descritos en el presente documento se pueden combinar con protocolos establecidos de encapsulación de moléculas pequeñas (Godfrin et al., 2012). En este escenario, se podrían usar los glóbulos rojos manipulados cargados en el citosol con un agente terapéutico y modificados sobre la superficie con un módulo de reconocimiento específico del tipo de célula para suministrar cargas a un tejido/localización precisa en el cuerpo. Se ha demostrado en el presente documento la unión de dos sondas funcionales diferentes a la superficie de los glóbulos rojos, lo que saca provecho de las especificidades de reconocimiento sutilmente diferentes de dos sortasas distintas. Por lo tanto, debe ser posible unir tanto un resto terapéutico, así como un módulo de direccionamiento, a la superficie del glóbulo rojo, para dirigir los glóbulos rojos manipulados a tumores u otras células enfermas. También se podría usar la conjugación de una sonda de obtención de imágenes, es decir, un radioisótopo, junto con dicho resto de direccionamiento para fines diagnósticos.

La generación in vitro de RBC humanos e ingeniería genética de sus precursores como se describe en el presente documento puede proporcionar una robusta plataforma para la aplicación de este método de manipulación superficial, por ejemplo, junto con modificación citosólica, para aplicaciones clínicas (Liu et al., 2010 Blood 115(10):2021-2027; Cong et al., 2013 Science 339(6121):819-826; Mali et al., Science 339(6121):823-826; Giarratana et al., 2011 Blood 118(19):5071 -5079; Douay et al., 2009 Blood 105(1):85-94; y Griffiths et al., 2012 Blood 119(26):6296-6306). Además, la seguridad establecida de las transfusiones de sangre inspira la confianza de que estos glóbulos rojos manipulados encontrarán de hecho uso en seres humanos.

Por consiguiente, en el presente documento se describe un proceso de cultivo multifásico in vitro para producir glóbulos rojos enucleados a partir de células progenitoras CD34+ movilizadas (por ejemplo, células de sangre periférica CD34+ movilizadas humanas). Dichos glóbulos rojos enucleados pueden ser genéticamente manipulados de forma que expresen proteínas de interés, por ejemplo, proteínas de la superficie marcables con sortasa. En el presente documento también se describen métodos de conjugación de uno o más agentes de interés con la superficie de los glóbulos rojos enucleados genéticamente manipulados por una reacción de transpéptido mediada por sortasa, así como métodos de producción de proteína de interés citoplásmicamente dispuesta en RBC maduros, tales como RBC humanos, mientras que retienen la capacidad de dirigir selectivamente los RBC a una diana prevista por marcado con sortasa de una proteína de la membrana modificada con un resto diana de interés.

I. Sistemas de cultivo in vitro para producir glóbulos rojos enucleados

En el presente documento se describe un proceso de cultivo in vitro para producir glóbulos rojos enucleados maduros a partir de células progenitoras CD34+ (por ejemplo, de un sujeto humano). Este proceso de cultivo implica múltiples etapas de diferenciación (por ejemplo, 2, 3 o más) y opcionalmente una etapa de expansión antes de las fases de diferenciación. El periodo de tiempo total para el proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento puede variar de 11 -25 días (por ejemplo, 15-25 días, 15-20 días o 18-21 días). En un ejemplo, el periodo de tiempo total es 21 días.

a. Células progenitoras CD34+

El CD34 es una glucoproteína de la superficie celular y funciona como un factor de adhesión célula-célula. Muchas células progenitoras humanas expresan este marcador de la superficie celular. Novershtern et al., Cell 144:296-309, 2011. Una célula progenitora, como una célula madre, tiene una tendencia a diferenciarse en un tipo específico de célula. Las células progenitoras son normalmente más específicas que las células madre y son frecuentemente presionadas para diferenciarse en células diana. Cualquier tipo de célula progenitora CD34+ que posea una tendencia a diferenciarse en glóbulos rojos se puede usar en el proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento. Dichas células progenitoras se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Novershtern et al., Cell 144:296-309, 2011. En algunos ejemplos, el proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento utiliza células de sangre periférica CD34+ movilizadas como células progenitoras para la diferenciación en glóbulos rojos enucleados. Las células progenitoras CD34+ también se pueden obtener de otras fuentes (por ejemplo, médula ósea).

Se pueden usar diversas técnicas para separar o aislar la población de células CD34+ de una fuente adecuada, tal como células de sangre periférica. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales que se unen a CD34, para enriquecer o aislar células CD34+. Los anticuerpos anti-CD34 se pueden unir a un soporte sólido de forma que se inmovilicen las células que expresan estos marcadores superficiales, permitiendo así la separación de células CD34+ de células que no expresan este marcador superficial. Las técnicas de separación usadas deben maximizar la retención de células viables que se van a recoger. Dichas técnicas de separación pueden dar como resultado subpoblaciones de células, donde hasta el 10 %, normalmente no más de aproximadamente el 5 %, preferentemente no más de aproximadamente el 1 %, de las células seleccionadas no expresan CD34. La técnica particular empleada dependerá de la eficiencia de separación, la citotoxicidad asociada, la facilidad y velocidad de rendimiento, y la necesidad de equipo sofisticado y/o habilidad técnica.

Una población "aislada" o "purificada" de células CD34+ para su uso en el proceso de cultivo in vitro descrita en el presente documento está sustancialmente libre de células y materiales con los que está asociado en la naturaleza, en particular, libre de células que carecen del fenotipo deseado, por ejemplo, que expresan CD34. Sustancialmente libre o sustancialmente purificado incluye al menos 50 % de células CD34+, preferentemente al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, e incluso más preferentemente al menos 90 % de células CD34+.

Los procedimientos para separar la población de células CD34+ pueden incluir, pero no se limitan a, separación física, separación magnética, perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo, cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos a un anticuerpo monoclonal o usados junto con un anticuerpo monoclonal, que incluyen, pero no se limitan a, complemento y citotoxinas, y "adsorción" con anticuerpo unido a una matriz sólida, por ejemplo, placa, elutriación, o cualquier otra técnica conveniente.

El uso de las técnicas de separación física también incluye las basadas en las diferencias en las propiedades físicas (centrifugación en gradiente de densidad y elutriación centrífuga a contracorriente), superficie celular (afinidad por lectina y anticuerpo) y tinción vital (colorante que se une a mitocondrias rho123 y colorante que se une a ADN Hoechst 33342). Estos procedimientos son bien conocidos por los expertos en esta técnica.

Las técnicas que proporcionan la separación precisa de células CD34+ incluyen además citometría de flujo, que puede tener grados variables de sofisticación, por ejemplo, una pluralidad de canales de color, canales de detección de dispersión de la luz de bajo ángulo y obtusa, canales de impedancia. Las células CD34+ también se pueden seleccionar por citometría de flujo basándose en las características de dispersión de la luz, donde las células diana se seleccionan basándose en una baja dispersión lateral y perfiles de dispersión hacia delante de baja a media.

b. Etapa de expansión

Opcionalmente, el proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento incluye una etapa de expansión, en la que se deja que las células progenitoras CD34+ proliferen. Como se usa en el presente documento, la expansión o proliferación incluye cualquier aumento en el número de células. La expansión incluye, por ejemplo, un aumento en el número de células CD34+ con respecto al número de células CD34+ presentes en la población de células usada para iniciar el cultivo. La expansión también puede incluir un aumento de la supervivencia de las células CD34+ existentes. El término supervivencia se refiere a la capacidad de una célula para seguir estando viva o funcionar.

Una población de células progenitoras CD34+ (por ejemplo, células de sangre periférica CD34+ movilizadas) se puede poner en un recipiente adecuado para expandir las células CD34+. Por ejemplo, recipientes adecuados para cultivar la población de células incluyen matraces, tubos o placas. En una realización, el matraz puede ser un matraz T, tal como un matraz T de 12,5 cm2, o 75 cm2. La placa puede ser una placa de 10 cm, una placa de 3,5 cm, o una placa de múltiples pocillos, tal como una placa de 12, 24 o 96 pocillos. Los pocillos pueden ser pocillos planos, de fondo en v o de fondo en u. Los recipientes se pueden tratar con cualquier tratamiento adecuado para el cultivo de tejido para promover la adherencia celular o para inhibir la adherencia celular a la superficie del recipiente. Dichos recipientes están comercialmente disponibles de Falcon, Corning y Costar. Como se usa en el presente documento, "recipiente de expansión" también pretende incluir cualquier cámara o recipiente para expandir células tanto libres como incorporadas en un aparato de expansión.

La densidad celular de la población cultivada de células CD34+ puede ser al menos desde aproximadamente 1x102 células hasta aproximadamente 1x107 células/ml. Preferentemente, la densidad celular puede ser desde aproximadamente 1 x105 hasta aproximadamente 1 x106 células/ml. Las células se pueden cultivar a una concentración de oxígeno desde aproximadamente el 2 hasta el 20 %.

Se pueden usar diversos medios para expandir la población de células progenitoras CD34+, que incluyen, pero no se limitan a, MEM de Dulbecco, IMDM, X-Vivo 15 (reducido en suero) y RPMI-1640. Dichos medios de cultivo pueden estar libres de suero. En una realización, el medio es StemSpan sin suero (Stem Cell Technologies), que puede ser complementado con 10 pg/ml de heparina.

El medio de cultivo para su uso en la etapa de expansión puede contener una o más citocinas. Como se usa en el presente documento, las citocinas son factores que ejercen una variedad de efectos sobre las células, por ejemplo, crecimiento o proliferación. Los ejemplos no limitantes de las citocinas que se pueden usar en una o más etapas del proceso de cultivo in vitro (por ejemplo, en la etapa de expansión o cualquiera de la etapas de diferenciación descritas a continuación) incluyen interleucina-2 (IL-2), interleucina 3 (IL-3), interleucina 6 (IL-6) que incluye receptor de IL-6 soluble, interleucina 12 (IL12), G-CSF, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), interleucina 1 alfa (IL-1 .alfa.), interleucina 11 (IL-11), MIP-1a, factor inhibidor de leucemia (LIF), ligando c-kit, y ligando flt3. En algunos ejemplos, el proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento, o cualquier etapa del mismo, puede incluir condiciones de cultivo, en las que una o más citocinas se excluyen específicamente del medio de cultivo. Las citocinas están comercialmente disponibles de varios vendedores, tales como, por ejemplo, Amgen (Thousand Oaks, Calif.), R & D Systems e Immunex (Seattle, Wash.). La citocina también puede incluir factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (por ejemplo, FGF-1 o FGF-2), factor de crecimiento similar a la insulina (por ejemplo, IGF-2, o IGF-1), trombopoyetina (TPO) y factor de células madre (SCF), o análogos y equivalentes de los mismos. Los equivalentes de los mismos incluyen moléculas que tienen actividad biológica similar por estos factores (por ejemplo, FGF, TPO, IGF y SCF) en forma no mutante o purificada (por ejemplo, recombinantemente producidos). Los análogos incluyen fragmentos que retienen la actividad deseada y moléculas relacionadas. Por ejemplo, TPO es un ligando del receptor de mp1, así moléculas capaces de unirse al receptor de mp1 e iniciar una o más acciones biológicas asociadas a la unión de TPO a mp1 también están dentro del alcance de la invención. Un ejemplo de un mimético de TPO se encuentra en Cwirla et al. (1997) Science 276:1696.

En un ejemplo, la etapa de expansión del proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento se puede realizar del siguiente modo. Una población de células de sangre periférica CD34+ movilizadas humanas se pone en un recipiente de expansión a una densidad celular de 10x104-10x106 (por ejemplo, 1x105) células/ml. Las células CD34+ se cultivan en un medio de expansión (por ejemplo, medio sin suero StemSpan) complementado con una mezcla de citocinas de ligando Flt-3, SCF, IL-3, y IL-6 y 2 % de penicilina y estreptomicina en condiciones adecuadas (por ejemplo, 37 °C) durante 1-6 días (por ejemplo, 2-5 días, 3-4 días o 4 días). Las células CD34+ expandidas se pueden recoger y someter a un cultivo in vitro adicional en condiciones que permitan la diferenciación hacia glóbulos rojos enucleados maduros.

C. Múltiples etapas de diferenciación

El proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento implica múltiples etapas de diferenciación (2, 3, 4 o más), en las que células progenitoras CD34+ se diferencian en glóbulos rojos enucleados maduros. En cada etapa de diferenciación, las células progenitoras CD34+ (cualquiera de las obtenidas de la etapa de expansión o recogida de la fuente original) o células obtenidas de la etapa de diferenciación precedente se pueden cultivar en un medio que comprende una o más citocinas adecuadas (por ejemplo, las descritas en el presente documento) en condiciones adecuadas durante un periodo de tiempo adecuado. Las propiedades biológicas de las células, tales como el tamaño celular y la expresión de marcadores superficiales, se pueden monitorizar durante el transcurso o al final de cada etapa de diferenciación para evaluar el estado de la eritropoyesis. Siempre que sea necesario, las citocinas pueden ser oportunamente suministradas y/o extraídas en cada etapa de diferenciación para lograr la diferenciación eritroide óptima y/o la sincronización de la población de células en cultivo.

En cada una de las etapas de diferenciación, las células progenitoras CD34+, ya sean las obtenidas a partir de la etapa de expansión descrita en el presente documento o aisladas de una fuente original (por ejemplo, sangre periférica humana), o las células obtenidas de la etapa de diferenciación precedente, se pueden cultivar en un medio adecuado, tal como el descrito anteriormente, complementado con una o más citocinas en condiciones de cultivo adecuadas durante un periodo de tiempo adecuado. En un ejemplo, el medio de cultivo (por ejemplo, IMDM) se complementa con holo-transferrina humana e insulina en concentraciones adecuadas. Por ejemplo, la concentración de holo-transferrina humana varía desde 250-1.500 pg/ml (por ejemplo, 250-1.000 pg/ml; 300-800 pg/ml o 400-600 pg/ml); y la concentración de insulina puede variar de 5-20 pg/ml (por ejemplo, 5-15 pg/ml, 5-10 pg/ml o 10-20pg/ml). El medio de cultivo también puede ser complementado con otros componentes comúnmente usados en el cultivo celular, por ejemplo, suero bovino fetal, glutamina, albúmina de suero bovino, uno o más antibióticos (por ejemplo, penicilina y estreptomicina), o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento incluye tres etapas de diferenciación, la etapa de diferenciación I ("Dif. I"), la etapa de diferenciación II ("Dif. II") y la etapa de diferenciación III ("Dif. III").

En Dif. I, las células se pueden cultivar en presencia de una mezcla de citocinas que incluye un glucocorticoide (por ejemplo, dexametasona), p-estradiol, IL-3, SCF y EPO (incluyendo EPO humana, EPO de otras especies, o análogos de EPO, tales como epoyetina alfa, epoyetina beta o darbepoyetina alfa) en concentraciones adecuadas durante un periodo de tiempo adecuado (por ejemplo, 4-7 días, 4-6 días, 5-7 días o 5-6 días). En algunos ejemplos, la concentración de dexametasona puede variar de 100 nM a 5 pM (por ejemplo, 100 nM a 2 pM, 500 nM a 5 pM, 1 pM a 3 pM, 1 pM a 2 pM, o 2 pM a 5 pM). La concentración de p-estradiol puede variar desde 0,5-5 pM (por ejemplo, 0,5 4 pM, 1 -5 pM, 0,5-3 pM, 0,5-2 pM, 0,5-1 pM, 1 -2 pM, 1-3 pM o 3-5 pM). La concentración de IL-3 puede variar de 1 -10 ng/ml (por ejemplo, 1 -8 ng/ml, 1 -5 ng/ml, 3-6 ng/ml, 4-8 ng/ml o 5-10 ng/ml). La concentración de SCF puede variar de 10-500 ng/ml (por ejemplo, 10-300 ng/ml, 50-500 ng/ml, 50-200 ng/ml, 50-100 ng/ml, 100-200 ng/ml o 100-400 ng/ml). Alternativamente o además, la cantidad de EPO puede variar de 2-10 U (por ejemplo, 2-8 U, 2-6 U, 5-10 U o 6-10 U). Como es conocido en la técnica, una unidad de EPO provoca la misma respuesta estimulante de la eritropoyesis en roedores (históricamente: ratas en ayunas) que cinco micromoles de cloruro cobaltoso. Véase, por ejemplo, Jelkmann, Nephrol Dial. Transplant, 2009. En algunos ejemplos, el medio usado en Dif. I contiene holotransferrina humana, insulina, dexametasona, p-estradiol, IL-3, SCF y EPO. Este medio puede estar sustancialmente libre de ciertas otras citocinas, tales como el ligando Flt-3 o IL-6, o sustancialmente libre de otras citocinas.

En Dif. II, las células obtenidas de Dif. I se pueden cultivar en presencia de una mezcla de citocinas que incluye SCF y EPO en concentraciones adecuadas durante un periodo de tiempo adecuado (por ejemplo, 3-5 días, 3-4 días o 4-5 días). En algunos ejemplos, la concentración de SCF puede variar de 10-100 ng/ml (por ejemplo, 10-80 ng/ml, 20 80 ng/ml, 20-50 ng/ml, 30-50 ng/ml, 40-50 ng/ml, 50-80 ng/ml o 50-60 ng/ml). Alternativamente o además, la cantidad de EPO puede variar de 2-10 U (por ejemplo, 2-8 U, 2-6 U, 5-10 U o 6-10 U). En algunos ejemplos, el medio usados en Dif. II contiene holo-transferrina humana, insulina, SCF y EPO. Este medio puede estar sustancialmente libre de ciertas citocinas, tales como Flt-3, IL-6, dexametasona, p-estradiol, IL-3, o cualquier combinación de los mismos, o puede estar sustancialmente libre de otras citocinas.

En Dif. III, las células obtenidas de Dif. II se pueden cultivar en presencia de EPO en una concentración adecuada durante un periodo de tiempo adecuado (por ejemplo, 4-12 días, 5-10 días, 8-12 días o 8-10 días). En algunos ejemplos, la cantidad de EPO puede variar desde 0,5-3 U (por ejemplo, 1-3 U, 0,5-2 U, 1-2 U o 2-3 U). En algunos ejemplos, el medio usado en Dif. III contiene holo-transferrina humana, insulina y EPO. Este medio puede estar sustancialmente libre de ciertas citocinas, por ejemplo, Flt-3, IL-6, dexametasona, p-estradiol, IL-3, SCF, o cualquier combinación de los mismos, o sustancialmente libre de otras citocinas.

En algunas realizaciones, el proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento puede incluir una o cualquiera de una combinación de las etapas de diferenciación descritas en el presente documento, por ejemplo, Dif. I y Dif. III, Dif. II y Dif. III, o Dif. I y Dif. II.

Antes de las etapas de diferenciación, las células progenitoras CD34+ pueden ser genéticamente modificadas de forma que expresen proteínas de la superficie de interés, por ejemplo, proteínas de la superficie marcables con sortasa, que se tratan con detalle a continuación.

II. Preparación de glóbulos rojos que expresan proteínas de la superficie de interés

En el presente documento también se describen métodos de preparación de glóbulos rojos genéticamente manipulados capaces de expresar proteínas de la superficie de interés, tales como proteínas de la superficie marcables con sortasa, proteínas fluorescentes tales como proteína verde fluorescente (GFP), o fármacos de proteína (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos).

(a) Modificación genética de células progenitoras

Los vectores de expresión para producir la proteína de la superficie de interés se pueden introducir en células progenitoras CD34+, que se pueden aislar de una fuente original u obtener de la etapa de expansión descrita anteriormente por tecnología recombinante rutinaria. En algunos casos, los vectores de expresión se pueden diseñar de forma que se puedan incorporar en el genoma de células por recombinación homóloga o no homóloga por métodos conocidos en la técnica. Los métodos de transferencia de vectores de expresión en células progenitoras CD34+ incluyen, pero no se limitan a, transferencia génica mediada por virus, transferencia mediada por liposomas, transformación, transfección y transducción, por ejemplo, transferencia génica mediada por virus, tal como el uso de vectores basados en virus de ADN, tales como adenovirus, virus adenoasociados y virus del herpes, así como vectores basados en retrovirus. Los ejemplos de modos de transferencia génica incluyen, por ejemplo, ADN desnudo, precipitación con CaPO4, DEAE-dextrano, electroporación, fusión de protoplastos, lipofección, microinyección de células y vectores víricos, ADN asistido por adyuvante, pistola de genes, catéteres. En un ejemplo, se usa un vector vírico. Para potenciar la administración de vectores no víricos a una célula, el ácido nucleico o proteína se puede conjugar con anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que se unen a antígenos de la superficie celular, por ejemplo, CD34. Los liposomas que también incluyen un anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo se pueden usar en los métodos descritos en el presente documento.

Un "vector vírico", como se describe en el presente documento, se refiere a un virus recombinantemente producido o vector vírico que comprende un polinucleótido que se va a administrar a una célula hospedadora, ya sea in vivo, ex vivo o in vitro. Los ejemplos de vectores víricos incluyen vectores retrovíricos, tales como vectores lentivíricos, vectores de adenovirus, vectores de virus adeno-asociados y similares. En aspectos donde la transferencia génica está mediada por un vector retrovírico, una construcción de vector se refiere al polinucleótido que comprende el genoma retrovírico o parte del mismo, y un gen terapéutico.

Un gen que codifica la proteína de la superficie de interés se puede insertar en un vector adecuado (por ejemplo, un vector retrovírico) usando métodos bien conocidos en la técnica. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Por ejemplo, el gen y el vector se pueden poner en contacto, en condiciones adecuadas, con una enzima de restricción para crear extremos complementarios en cada molécula que pueden emparejarse entre sí y unirse juntos con una ligasa. Alternativamente, se pueden unir conectores sintéticos de ácido nucleico a los extremos de un gen. Estos conectores sintéticos contienen secuencias de ácidos nucleicos que corresponden a un sitio de restricción particular en el vector. Además, el vector puede contener, por ejemplo, algunos o todos de los siguientes: un gen marcador de selección, tal como el gen de neomicina para la selección de transfectantes estables o transitorios en células de mamífero; secuencias potenciadoras/ promotoras del gen temprano inmediato del CMV humano para altos niveles de transcripción; señales de terminación de la transcripción y de procesamiento de ARN del SV40 para la estabilidad de ARNm; orígenes de replicación del polioma del SV40 y ColEI para la apropiada replicación episómica; sitios de clonación múltiple versátiles; y promotores de ARN T7 y SP6 para la transcripción in vitro de ARN sentido y antisentido. Los vectores adecuados y los métodos de producción de los vectores que contienen transgenes son bien conocidos y están disponibles en la técnica. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press.

La modificación de células progenitoras CD34+ puede comprender el uso de un casete de expresión creado para cualquiera de la expresión constitutiva o inducible del gen introducido. Dicho casete de expresión puede incluir elementos reguladores, tales como un promotor, un codón de iniciación, un codón de terminación y una señal de poliadenilación. Los elementos son preferentemente operativos en las células progenitoras o en células que surgen de las células progenitoras (por ejemplo, glóbulos rojos enucleados) después de la administración (por ejemplo, infusión) en un individuo. Además, los elementos pueden estar operativamente unidos al gen que codifica la proteína de la superficie de interés de forma que el gen sea operativo (por ejemplo, se exprese) en las células progenitoras o glóbulos rojos derivados de las mismas.

Se puede usar una variedad de promotores para la expresión de la proteína de la superficie de interés. Los promotores que se pueden usar para expresar la proteína son bien conocidos en la técnica. Los promotores incluyen promotor temprano intermedio del citomegalovirus (CMV), una LTR vírica, tal como la LTR del virus del sarcoma de Rous, VIH-LTR, LTR de HTLV-1, el promotor temprano del virus simio 40 (SV40), promotor lac UV5 de E. coli y el promotor del virus del herpes simple tk.

También se pueden usar promotores regulables. Dichos promotores regulables incluyen aquellos que usan el represor lac de E. coli como un modulador de la transcripción para regular la transcripción de los promotores de células de mamífero que llevan el operador lac [Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)], los que usan el represor de tetraciclina (tetR) [Gossen, M., y Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992); Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)]. Otros sistemas incluyen el dímero FK506, VP16 o p65 que usa astradiol, RU486, difenol murislerona o rapamicina. Los sistemas inducibles están disponibles de Invitrogen, Clontech y Ariad.

Se pueden usar promotores regulables que incluyen un represor con el operón. En una realización, el represor lac de E. coli puede funcionar como modulador transcripcional para regular la transcripción de promotores de células de mamífero que llevan el operador lac [M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)]; Gossen y Bujard (1992); [M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)] combinaron el represor de tetraciclina (tetR) con el activador de la transcripción (VP 16) para crear una proteína de fusión de tetR-activador de la transcripción de células de mamífero, tTa (tetR-VP 16), con el promotor mínimo que lleva tetO derivado del principal promotor inmediato-temprano del citomegalovirus humano (hCMV) para crear un sistema operador tetR-tet para controlar la expresión génica en células de mamífero. En una realización, se usa un cambio inducible de tetraciclina. El represor de tetraciclina (tetR) solo, en vez de los derivados de fusión de tetR-factor de transcripción de células de mamífero puede funcionar como un potente trans-modulador para regular la expresión génica en células de mamífero cuando el operador de tetraciclina se sitúa apropiadamente en la dirección 3' para el elemento TATA del promotor de CMVIE [F. Yao et al., Human Gene Therapy, arriba]. Una ventaja particular de este cambio inducible de tetraciclina es que no requiere el uso de una proteína transactivadora o represora de células de mamífero del represor de la tetraciclina, que en algunos casos puede ser tóxica para las células [M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); P. Schockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)], para lograr sus efectos regulables.

La eficacia de algunos promotores inducibles puede aumentar con el tiempo. En tales casos, se puede potenciar la eficacia de dichos sistemas insertando múltiples represores en tándem, por ejemplo, TetR unido a un TetR por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Alternativamente, se puede esperar al menos 3 días antes del cribado para la función deseada. Aunque pueda ocurrir cierto silenciamiento, se puede minimizar usando un número de células adecuado, preferentemente al menos 1x104, más preferentemente al menos 1x105, todavía más preferentemente al menos 1 x106, e incluso más preferentemente al menos 1 x107. Se puede potenciar la expresión de proteínas deseadas por medios conocidos para potenciar la eficacia de este sistema. Por ejemplo, usando el elemento regulador postranscripcional del virus de hepatitis de Woodchuck (WPRE). Véanse Loeb, V. E., et al., Human Gene Therapy 10:2295-2305 (1999); Zufferey, R., et al., J. of Virol. 73:2886-2892 (1999); Donello, J. E., et al., J. de Virol. 72:5085-5092 (1998).

Los ejemplos de señales de poliadenilación útiles para poner en práctica los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, señal de poliadenilación del colágeno I humano, señal de poliadenilación del colágeno II humano y señal de poliadenilación del SV40.

El material genético exógeno que incluye el gen que codifica la proteína de la superficie unida operativamente a los elementos reguladores puede seguir presente en la célula como una molécula citoplásmica funcionante, una molécula episómica funcionante, o se puede integrar en el ADN cromosómico de la célula. El material genético exógeno se puede introducir en células donde sigue como un material genético separado en forma de un plásmido. Alternativamente, el ADN lineal, que se puede integrar en el cromosoma, se puede introducir en la célula. Cuando se introduce ADN en la célula, se pueden añadir reactivos, que promueven la integración del ADN en cromosomas. Las secuencias de ADN, que son útiles para promover la integración, también se pueden incluir en la molécula de ADN. Alternativamente, se puede introducir ARN en la célula.

Se pueden usar marcadores de selección para monitorizar la captación del transgén deseado en las células progenitoras descritas en el presente documento. Estos genes marcadores pueden estar bajo el control de cualquier promotor o promotor inducible. Éstos se conocen en la técnica e incluyen genes que cambian la sensibilidad de una célula a un estímulo, tal como un nutriente, un antibiótico, etc. Los genes incluyen aquellos para neo, puro, tk, múltiple resistencia a fármaco (MDR), etc. Otros genes expresan proteínas que se pueden cribar fácilmente, tales como proteína verde fluorescente (GFP), proteína azul fluorescente (BFP), luciferasa y LacZ.

(b) Modificación genética para expresar proteínas de la superficie marcables con sortasa

En algunas realizaciones, las células progenitoras CD34+ pueden ser genéticamente modificadas usando cualquiera de los métodos descritos en el presente documento o conocidos en la técnica, de forma que sean capaces de expresar una proteína de la superficie marcable con sortasa, tal como una proteína de fusión que comprende una proteína de la membrana celular de glóbulos rojos y un péptido (por ejemplo, un péptido heterólogo para la proteína de la membrana). Se puede conjugar una proteína de la superficie marcable con sortasa con otro péptido por una reacción de transpeptidación mediada por sortasa. Strijbis et al., Traffic 13(6):780-789, 2012. Preferentemente, la transducción de las células progenitoras CD34+ con un gen que codifica una proteína de la superficie marcable con sortasa es por un vector vírico, tal como un vector retrovírico (como se describe en, por ejemplo, los documentos de patente WO 94/29438, WO 97/21824 y WO 97/21825).

Una proteína de la superficie marcable con sortasa puede ser una proteína de fusión que comprende una proteína de la membrana y al menos una proteína heteróloga. En algunas realizaciones, una proteína de la membrana para su uso en los métodos descritos en el presente documento, que puede estar presente en RBC maduros, ni inhibe la diferenciación eritroide ni es seleccionada para la degradación durante la extensa remodelación de la membrana que ocurre durante la enucleación y en la posterior etapa de reticulocito. Dichas proteínas de la membrana se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, Liu et al., 2010, Blood, 115(10):2021 -2027. Por ejemplo, los precursores de glóbulos rojos expresan altos niveles del receptor de transferrina (Tfr), una proteína de la membrana de tipo II, pero puesto que ya no está presente en RBC maduros, Tfr puede no ser una diana adecuada para su uso en la preparación de una proteína de la superficie marcable con sortasa. Se puede usar cualquier proteína de la membrana presente en RBC maduros para construir la proteína de la superficie marcable con sortasa como se describe en el presente documento. La proteína de la membrana se puede fusionar con un péptido heterólogo en el extremo que se expone al espacio extracelular o luminal. En algunos ejemplos, el extremo de la proteína de la membrana que se expone al citoplasma también se puede fusionar con una segunda proteína heteróloga de interés, que puede ser una proteína citoplásmica.

Cuando el extremo N de la proteína de la membrana se expone al espacio extracelular o luminal (por ejemplo, una proteína de la membrana de tipo I), la proteína heteróloga puede comprender un péptido aceptor con el que se puede conjugar otro péptido por una reacción de transpeptidación catalizada por sortasa. Normalmente, el péptido aceptor es una oligoglicina u oligoalanina, tal como un fragmento de 1-5 glicinas o un fragmento de 1-5 alaninas. En algunos ejemplos, la oligoglicina consiste en 3 o 5 restos de glicina (SEQ ID NO: 3). En otros ejemplos, la oligoalanina consiste en 3 o 5 restos de alanina (SEQ ID NO: 79).

En un ejemplo, la proteína de la superficie marcable con sortasa es una proteína de fusión que comprende una proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo I, tal como glicoforina A, molécula de adhesión 4 intercelular (ICAM-4), glucoproteína luterana (CD329), basigina (CD147) y un péptido que comprende un péptido aceptor (por ejemplo, un péptido que incluye un resto de oligoglicina, tal como un fragmento de 1-5 glicinas). Estas proteínas de la membrana pueden ser proteínas humanas. El péptido aceptor está fusionado con el extremo N de la proteína transmembranaria de tipo I. Las proteínas transmembranarias de tipo I son proteínas transmembranarias de un solo paso que tienen expuestos sus extremos N al espacio extracelular o luminal.

En otro ejemplo, la proteína de la superficie marcable con sortasa es una proteína de fusión que comprende una proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo II, por ejemplo, Kell, o CD71, y un péptido que comprende una secuencia reconocible por una sortasa (por ejemplo, sortasa A). Las proteínas transmembranarias de tipo II son proteínas transmembranarias de un solo paso que tienen expuestos sus extremos C al espacio extracelular o luminal.

Los motivos reconocibles por una sortasa se conocen bien en la técnica. Un motivo reconocible por una sortasa a modo de ejemplo, particularmente la sortasa A, es LPXTG (SEQ ID NO: 1), en la que X puede ser cualquier resto de aminoácido (que existe de forma natural o que no existe de forma natural), por ejemplo, cualquiera de los 20 aminoácidos convencionales encontrados lo más comúnmente en las proteínas encontradas en los organismos vivos. En algunos ejemplos, el motivo de reconocimiento es LPXTG (SEQ ID NO: 1) o LPXT (SEQ ID NO: 50), en el que X es D, E, A, N, Q, K o R. En otros ejemplos, X se selecciona de K, E, N, Q, A en un motivo de LPXTG (s Eq ID NO: 1) o LPXT (SEQ ID NO: 50), que son reconocibles por una sortasa A. En aún otros ejemplos, X se selecciona de K, S, E, L, A, N en un motivo de LPXTG (SEQ ID NO: 1) o LPXT (SEQ ID NO: 50), que son reconocibles por una sortasa de clase C. Los motivos de reconocimiento de sortasa a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, LPKTG (SEQ ID NO: 51), LPITG (SEQ ID NO: 52), LPDTA (SEQ ID NO: 53), SPKTG (SEQ ID NO: 54), LAETG (SEQ ID NO: 55), LAATG (SEQ ID NO: 56), LAHTG (SEQ ID NO: 57), LASTG (SEQ ID NO: 58), LPLTG (SEQ ID NO: 59), LSRTG (SEQ ID NO: 60), LPETG (SEQ ID NO: 44), VPDTG (SEQ ID NO: 61), IPQTG (SEQ ID NO: 62), YPRRG (SEQ ID NO: 63), LPMTG (SEQ ID NO: 64), LAFTG (SEQ ID NO: 65), LPQTS (SEQ ID NO: 66), LPXT (SEQ ID NO: 50), LAXT (SEQ ID NO: 67), LPXA (SEQ ID NO: 68), LGXT (SEQ ID NO: 69) IPXT (SEQ ID NO: 70), NPXT (SEQ ID NO: 71), NPQS (SEQ ID NO: 72), LPST (SEQ ID NO: 73), NSKT (SEQ ID NO: 74), NPQT (SEQ ID NO: 75), NAKT (SEQ ID NO: 76), LPIT (SEQ ID NO: 77) o LAET (SEQ ID NO: 78)

La proteína de la superficie marcable con sortasa descrita en el presente documento también puede ser una proteína de fusión que comprende una proteína transmembranaria de glóbulos rojos de tipo III y un péptido heterólogo. Las proteínas de la membrana de tipo III son estructuras de múltiples pasos, que normalmente tienen sus extremos N expuestos al espacio extracelular o luminal. Los ejemplos de proteínas transmembranarias de glóbulos rojos de tipo III incluyen GLUT1, acuaporina 1 y Band 3. En un ejemplo, una proteína transmembranaria de tipo III se puede fusionar con un péptido aceptor en el extremo N de la proteína transmembranaria.

En algunas realizaciones, una secuencia de reconocimiento de sortasa como se ha descrito anteriormente puede comprender además uno o más aminoácidos adicionales, por ejemplo, en el extremo N o C. Por ejemplo, se pueden incorporar uno o más aminoácidos (por ejemplo, hasta 5 aminoácidos) que tienen la identidad de aminoácidos encontrada inmediatamente aminoterminal con respecto a, o carboxiterminal con respecto a, una secuencia de reconocimiento de cinco (5) aminoácidos en un sustrato de sortasa que existe de forma natural. Dichos aminoácidos adicionales pueden proporcionar contexto que mejora el reconocimiento del motivo de reconocimiento.

En algunas realizaciones, un motivo de reconocimiento de sortasa puede estar enmascarado. A diferencia de un motivo de reconocimiento de sortasa sin enmascarar, que puede ser reconocido por una sortasa, un motivo de reconocimiento de sortasa enmascarado es un motivo que no es reconocido por una sortasa, pero que puede ser fácilmente modificado ("desenmascarado") de forma que el motivo resultante sea reconocido por la sortasa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, al menos un aminoácido de un motivo de reconocimiento de sortasa enmascarado comprende una cadena lateral que comprende un resto que inhibe, por ejemplo, previene, el reconocimiento de la secuencia por una sortasa de interés, por ejemplo, SrtAaureus. La retirada del resto inhibidor permite, a su vez, el reconocimiento del motivo por la sortasa. El enmascaramiento puede, por ejemplo, reducir el reconocimiento en al menos el 80 %, el 90 %, el 95 %, o más (por ejemplo, hasta niveles indetectables) en ciertas realizaciones. A modo de ejemplo, en ciertas realizaciones, un resto de treonina en un motivo de reconocimiento de sortasa, tal como LPXTG (SEQ ID NO: 1), puede estar fosforilado, lo que lo convierte en resistente al reconocimiento y a la escisión por SrtA. La secuencia de reconocimiento enmascarada se puede desenmascarar mediante tratamiento con una fosfatasa, lo que permite que sea usado en una reacción de transaminación catalizada por SrtA.

Cuando sea necesario, la proteína de la membrana genéticamente modificada de una célula progenitora CD34+ puede incluir además marcas adecuadas adicionales, que incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos, azúcares, hidratos de carbono, polímeros, lípidos, ácidos grasos y moléculas pequeñas. Otras marcas adecuadas serán evidentes por los expertos en la técnica y la invención no está limitada en este aspecto.

En algunas realizaciones, dicha marca comprende una secuencia útil para purificar, expresar, solubilizar y/o detectar un polipéptido. En algunas realizaciones, una marca puede servir a múltiples funciones. En algunas realizaciones, la marca es relativamente pequeña, por ejemplo, que varía desde algunos aminoácidos hasta aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, una marca tiene más de 100 aminoácidos de longitud, por ejemplo, hasta aproximadamente 500 aminoácidos de longitud, o más. En algunas realizaciones, una marca comprende una marca HA, TAP, Myc, 6xHis, Flag, estreptavidina, biotina o GST, por nombrar algunos ejemplos. En algunas realizaciones, una marca comprende una marca potenciadora de la solubilidad (por ejemplo, una marca SUMO, una marca NUS A, una marca SNUT, o un mutante monomérico de la proteína Ocr del bacteriófago T7). Véase, por ejemplo, Esposito D y Chatterjee DK. Curr Opin Biotechnol.; 17(4):353-8 (2006). En algunas realizaciones, una marca es escindible, de manera que se puede retirar, por ejemplo, por una proteasa. En algunas realizaciones, esto se logra incluyendo un sitio de escisión de proteasa en la marca, por ejemplo, adyacente o unido a una porción funcional de la marca. Las proteasas a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, trombina, TEV proteasa, factor Xa, proteasa PreScission, etc. En algunas realizaciones, se usa una marca "autoescisora". Véase, por ejemplo, Wood et al., solicitud PCT internacional PCT/US2005/05763, presentada el 24 de febrero de 2005, y publicada como el documento de patente WO/2005/086654 el 22 de septiembre de 2005.

En algunas realizaciones, los glóbulos rojos genéticamente modificados pueden expresar una proteína de fusión sobre la superficie, comprendiendo la proteína de fusión una proteína de la membrana celular de glóbulos rojos como se describe en el presente documento, un primer péptido heterólogo fusionado con el extremo de la proteína de la membrana que se expone al espacio extracelular o luminal, y una segunda proteína heteróloga fusionada con el extremo de la proteína de la membrana que se expone al espacio citoplásmico. El primer péptido heterólogo puede comprender un péptido aceptor de una sortasa (cualquier péptido aceptor como se describe en el presente documento), si está fusionado con el extremo N de la proteína de la membrana (por ejemplo, una proteína de la membrana de tipo I). Alternativamente, el primer péptido heterólogo puede comprender una secuencia reconocible por una sortasa (por ejemplo, LPXTG (SeQ iD NO: 1) o LPXT (SEQ ID NO: 50)), si está fusionado con el extremo C de la proteína de la membrana (por ejemplo, una proteína de la membrana de tipo II).

Cuando la proteína de la membrana es una proteína de la membrana de tipo I (por ejemplo, GPA) o de tipo III, la segunda proteína heteróloga está fusionada con el extremo C de la proteína de la membrana. El casete de expresión para producir dicha proteína de fusión puede contener dos copias de secuencias que codifican la segunda proteína heteróloga, una que está fusionada dentro del marco de lectura con la proteína de la membrana, mientras que la otra está situada 3' aguas abajo con respecto a un sitio IRES situado entre las dos copias. Este diseño permitiría la producción de la segunda proteína heteróloga en forma libre y en forma de fusión con la proteína de la membrana. Véase, por ejemplo, Ejemplos más adelante. Alternativamente, cuando la proteína de la membrana es una proteína de la membrana de tipo II (por ejemplo, Kell), la segunda proteína heteróloga está fusionada con el extremo N de la proteína de la membrana. El casete de expresión para producir dicha proteína de fusión puede contener dos copias de la secuencia que codifican la segunda proteína heteróloga, que están separadas por un sitio IRES, para producir la segunda proteína heteróloga en tanto forma libre como de fusión.

La segunda proteína heteróloga puede ser una proteína citoplásmica. En algunos ejemplos, la proteína heteróloga es una proteína de diagnóstico, por ejemplo, una proteína, tal como una proteína fluorescente (por ejemplo, GFP) que puede liberar una señal detectable en condiciones adecuadas. En otros ejemplos, la proteína heteróloga es una proteína terapéutica, por ejemplo, un fármaco de proteína.

Cuando sea necesario, se puede conjugar un agente de direccionamiento con el primer péptido heterólogo, como se ha descrito anteriormente por una reacción de sortasa. Dicho agente diana (por ejemplo, un anticuerpo, tal como un anticuerpo de un solo dominio) se puede unir específicamente a un tipo específico de células (por ejemplo, células enfermas, tales como células cancerosas). Los glóbulos rojos genéticamente modificados resultantes son útiles en suministrar la proteína de interés citoplásmicamente dispuesta (la segunda proteína heteróloga) a células diana previstas reconocibles por el agente diana.

Alternativamente o además, la presente divulgación proporciona glóbulos rojos genéticamente manipulados que expresan dos proteínas de la superficie marcables con sortasa, que se pueden conjugar con diferentes restos funcionales por reacciones catalizadas por enzimas sortasa que tienen diferente especificidad por el sustrato. Véanse las siguientes discusiones. En un ejemplo, ambas de las dos proteínas de la superficie marcables con sortasa comprenden una proteína de la membrana de tipo I (por ejemplo, GPA). En una proteína de la superficie marcable con sortasa, el extremo N de la proteína de la membrana de tipo I está fusionado con una oligoglicina (por ejemplo, G3 o G5 (SEQ ID NO: 3)); en la otra proteína de la superficie marcable con sortasa, el extremo N de la proteína de la membrana de tipo I está fusionado con una oligoalanina (por ejemplo, A3 o A5 (SEQ ID NO: 79)). En otro ejemplo, ambas de las dos proteínas de la superficie marcables con sortasa comprenden una proteína de la membrana de tipo II (por ejemplo, Kell o CD71). En una proteína de la superficie marcable con sortasa, el extremo C de la proteína de la membrana de tipo II está fusionado con el motivo LPXTG (SEQ ID NO: 1); en la otra proteína de la superficie marcable con sortasa, el extremo C de la proteína de la membrana de tipo II está fusionado con el motivo LPXTA (SEQ ID NO: 2). En otro ejemplo más, una de la proteína de la superficie marcable con sortasa comprende una proteína de la membrana de tipo I (por ejemplo, GPA), cuyo extremo N está fusionado con un péptico aceptor, y la otra proteína de la superficie marcable con sortasa comprende una proteína de la membrana de tipo II (por ejemplo, Kell o CD71), cuyo extremo C está fusionado con una secuencia reconocible por una sortasa. Cuando el péptido aceptor es una oligoglicina (por ejemplo, G3 o G5 (SEQ ID NO: 3)), la secuencia reconocible por una sortasa puede ser el motivo LPXTA (SeQ ID NO: 2). Cuando el péptido aceptor es una oligoalanina (por ejemplo, A3 o A5 (SEQ ID NO: 79)), la secuencia reconocible por una sortasa puede ser el motivo LPXTG (SEQ ID NO: 1).

Cualquiera de las células progenitoras CD34+ genéticamente modificadas descritas en el presente documento se puede cultivar en condiciones adecuadas que permiten la diferenciación en glóbulos rojos enucleados maduros, por ejemplo, el proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento. Los glóbulos rojos enucleados resultantes son capaces de expresar la proteína de la superficie de interés, tal como una proteína de la superficie marcable con sortasa como se describe en el presente documento, que se puede evaluar y confirmar por metodología rutinaria (por ejemplo, transferencia Western o análisis FACS).

III. Conjugación de agentes con células Expresión de proteínas de la superficie marcables con sortasa por marcado con sortasa

Cualquiera de las células genéticamente modificadas (por ejemplo, células progenitoras CD34+ o glóbulos rojos enucleados maduros) que expresan proteína de la superficie marcable con sortasa se puede modificar en presencia de una sortasa para conjugar un agente de interés con la superficie de las células, un proceso conocido como marcado con sortasa. El término "marcado con sortasa", como se usa en el presente documento, se refiere al proceso de añadir una marca, por ejemplo, un resto o molécula (por ejemplo, una proteína, polipéptido, marca detectable, agente de unión o unidad de conexión de química click, sobre una molécula diana, por ejemplo, una proteína diana sobre la superficie de un glóbulo rojo por una reacción de transpeptidación mediada por sortasa.

(a) Sortasa

La sortasa es una familia de enzimas capaces de llevar a cabo una reacción de transpeptidación que conjuga el extremo C de una proteína con el extremo N de otra proteína por transamidación. Las sortasas también se denominan transamidasas, y normalmente presentan tanto una actividad de proteasa como de transpeptidación. Se han identificado diversas sortasas de organismos procariotas. Por ejemplo, algunas sortasas de bacterias Gram-positivas escinden y translocan proteínas a restos de proteoglicano en paredes celulares intactas. Entre las sortasas que han sido aisladas de Staphylococcus aureus, están la sortasa A (Srt A) y la sortasa B (Srt B). Así, en ciertas realizaciones, una transamidasa usada según los métodos de conjugación descritos en el presente documento es la sortasa A, por ejemplo, la de S. aureus, también denominada en el presente documento SrtAaureus. En otras realizaciones, una transamidasa es una sortasa B, por ejemplo, de S. aureus, también denominada en el presente documento SrtBaureus.

Las sortasas se han clasificado en cuatro clases, designadas A, B, C y D (es decir, sortasa A, sortasa B, sortasa C y sortasa D, respectivamente) basándose en el alineamiento de secuencias y el análisis filogenético de 61 sortasas de genomas de bacterias Gram-positivas (Dramsi et al., Res Microbiol. 156(3):289-97, 2005). Estas clases corresponden a las siguientes subfamilias, en las que las sortasas también han sido clasificadas por Comfort y Clubb (Comfort et al., Infect Immun., 72(5):2710-22, 2004): Clase A (subfamilia 1), clase B (subfamilia 2), clase C (subfamilia 3), clase D (subfamilias 4 y 5). Las referencias anteriormente mencionadas desvelan numerosas sortasas y sus motivos de reconocimiento. Véase también Pallen et al., TRENDS in Microbiology, 2001,9(3), 97-101). Los expertos en la técnica serán capaces de asignar fácilmente una sortasa a la clase correcta basándose en su secuencia y/u otras características, tales como las descritas en Drami, et al., arriba.

El término "sortasa A" se usa en el presente documento para referirse a una sortasa de la clase A, normalmente denominada SrtA, en cualquier especie bacteriana particular, por ejemplo, SrtA de S. aureus. Asimismo "sortasa B" se usa en el presente documento para referirse a una sortasa de la clase B, denominada normalmente SrtB, en cualquier especie bacteriana particular, por ejemplo, SrtB de S. aureus. La presente divulgación engloba realizaciones referentes a cualquiera de las clases de sortasa conocidas en la técnica (por ejemplo, una sortasa A de cualquier especie o cepa bacteriana, una sortasa B de cualquier especie o cepa bacteriana, una sortasa de clase C de cualquier especie o cepa bacteriana, y una sortasa de clase D de cualquier especie o cepa bacteriana).

Las secuencias de aminoácidos de Srt A y Srt B y las secuencias de nucleótidos que las codifican son conocidas por los expertos en la técnica y se desvelan en varias referencias citadas en el presente documento. Las secuencias de aminoácidos de SrtA y SrtB de S. aureus son homólogas, compartiendo, por ejemplo, 22 % de identidad de secuencia y 37 % de similitud de secuencia. La secuencia de aminoácidos de una sortasa-transamidasa de Staphylococcus aureus también tiene una homología sustancial con secuencias de enzimas de otras bacterias Gram-positivas, y dichas transamidasas se pueden utilizar en los procesos de unión descritos en el presente documento. Por ejemplo, para SrtA existe aproximadamente un 31 % de identidad de secuencia (y aproximadamente el 44 % de similitud de secuencias) con el mejor alineamiento con respecto a la región secuenciada entera del marco de lectura abierto de S. pyogenes. Hay aproximadamente un 28 % de identidad de secuencia con el mejor alineamiento con respecto a la región secuenciada entera del marco de lectura abierto de A. naeslundii. Se apreciará que diferentes cepas bacterianas pueden presentar diferencias en la secuencia de un polipéptido particular, y las secuencias en el presente documento son a modo de ejemplo.

En ciertas realizaciones, se puede cribar una transamidasa que lleva 18 % o más identidad de secuencia, 20 % o más identidad de secuencia, o 30 % o más identidad de secuencia, con un marco de lectura abierto de S. pyogenes, A. naeslundii, S. mutans, E. faecalis o B. subtilis que codifica una sortasa, y se pueden utilizar las enzimas que tienen actividad de transamidasa comparable con Srt A o Srt B de S. aureus (por ejemplo, la actividad comparable es algunas veces del 10 % de la actividad de Srt A o Srt B o más).

En algunas realizaciones, los métodos de conjugación descritos en el presente documento usan una sortasa A (SrtA). SrtA reconoce el motivo LPXTX (SEQ ID NO: 80; en donde cada aparición de X representa independientemente cualquier resto de aminoácido), siendo los motivos de reconocimiento comunes, por ejemplo, LPKTG (SEQ ID NO: 81), LPATG (SEQ ID NO: 82), LPNTG (SEQ ID NO: 83). En algunas realizaciones, LPETG (SEQ ID NO: 44) se usa como el motivo de reconocimiento de sortasa. Sin embargo, los motivos que se encuentran fuera de este consenso también pueden ser reconocidos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el motivo comprende una 'A' en vez de una T en la posición 4, por ejemplo, LPXAG (SEQ ID NO: 84), por ejemplo, LPNAG (SEQ ID NO: 85). En algunas realizaciones, el motivo comprende una 'A' en vez de una 'G' en la posición 5, por ejemplo, LPXt A (SEQ ID NO: 2), por ejemplo, LPNTA (SEQ ID NO: 86). En algunas realizaciones, el motivo comprende una 'G' en vez de 'P' en la posición 2, por ejemplo, LGXTG (SEQ ID NO: 87), por ejemplo, LGATG (SEQ ID NO: 88). En algunas realizaciones, el motivo comprende una 'I' en vez de 'L' en la posición 1, por ejemplo, IPXTG (SEQ ID NO: 89), por ejemplo, IPNTG (SEQ ID NO: 90) o IPETG (SEQ ID NO: 91). Los motivos de reconocimiento de sortasa adecuados adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, y la invención no está limitada a este respecto. Se apreciará que los términos "motivo de reconocimiento" y "secuencia de reconocimiento", con respecto a las secuencias reconocidas por una transamidasa o sortasa, se usan indistintamente. Dichos motivo de reconocimiento de sortasa se pueden usar para construir las proteínas de la superficie marcables con sortasa descritas en el presente documento.

En algunas realizaciones de la invención, la sortasa es una sortasa B (SrtB), por ejemplo, una sortasa B de S. aureus, B. anthracis o L. monocytogenes. Los motivos reconocidos por sortasas de la clase B (SrtB) entran frecuentemente dentro de las secuencias consenso NPXTX (SEQ ID NO: 92), por ejemplo, NP[Q/K]-[T/s]-[N/G/s] (SEQ ID NO: 93), tales como NPQTN (SEQ ID NO: 94) o NPKt G (SEQ ID NO: 95). Por ejemplo, la sortasa B de S. aureus o B. anthracis escinde el motivo NPQTN (SEQ ID NO: 94) o NPKTG (SEQ ID NO: 95) de IsdC en las bacterias respectivas (véase, por ejemplo, Marraffini et al., Journal of Bacteriology, 189(17): 6425-6436, 2007). Otros motivos de reconocimiento encontrados en los sustratos originales de las sortasas de clase B son NSKTA (SEQ ID NO: 96), NPQTG (SEQ ID NO: 97), NAKTN (SEQ ID NO: 98) y NPQSS (SEQ ID NO: 99). Por ejemplo, SrtB de L. monocytogenes reconoce ciertos motivos que carecen de P en la posición 2 y/o que carecen de Q o K en la posición 3, tales como NAKTN (SEQ ID NO: 98) y NPQSS (SEQ ID NO: 99) (Mariscotti et al., J Biol Chem. 2009 Jan 7). Dichos motivos de reconocimiento de sortasa también se pueden usar para construir las proteínas de la superficie marcables con sortasa descritas en el presente documento.

Usando sortasas con distinta especificidad por sustrato, es posible combinar las estrategias de marcado aminoterminal y carboxiterminal (Antos et al., 2009, J. Am. Chem. Soc., 131 (31):10800-10801) para generar RBC multi-marcados. Por ejemplo, a diferencia de la sortasa A de Staphylococcus aureus, la sortasa A derivada de Streptococcus pyogenes reconoce motivos LPXTA (SEQ ID NO: 2) y acepta sondas de oligoalanina como nucleófilos. Por lo tanto, las reacciones de sortasa de ambas enzimas se pueden realizar como reacciones ortogonales. La utilización de dichas reacciones de sortasa con sortasa(s) adecuada(s) también está dentro del alcance de la presente divulgación.

En algunas realizaciones, la sortasa es una sortasa C (Srt C). La sortasa C puede utilizar LPXTX (SEQ ID NO: 80) como motivo de reconocimiento, representando cada aparición de X independientemente cualquier resto de aminoácido. Este motivo de reconocimiento se puede usar para construir las proteínas de la superficie marcables con sortasa descritas en el presente documento.

En aún otras realizaciones, la sortasa es una sortasa D (Srt D). Se predice que las sortasas en esta clase reconocen motivos con una secuencia consenso NA-[E/A/S/H]-TG (SEQ ID NO: 100; Comfort D, arriba). Se ha encontrado la sortasa D, por ejemplo, en Streptomyces spp, Corynebacterium spp., Tropheryma whipplei, Thermobifida fusca y Bifidobacterium longhum. LPXTA (SEQ ID NO: 2) o LAXTG pueden servir de secuencia de reconocimiento para la sortasa D, por ejemplo, de las subfamilias 4 y 5, respectivamente, las enzimas de la subfamilia 4 y la subfamilia 5 procesan los motivos LPXTA (SEQ ID NO: 2) y La Xt G (SEQ ID NO: 101), respectivamente. Por ejemplo, se ha mostrado que la sortasa C de B. anthracis escinde específicamente el motivo LPNTA (SEQ ID NO: 102) en BasI y BasH de B. anthracis (véase Marrafini, arriba).

Las sortasas adicionales, que incluyen, pero no se limitan a, sortasas que reconocen motivos de reconocimiento de sortasa adicionales, también son adecuadas para su uso en algunas realizaciones de la presente invención. Por ejemplo, las sortasas descritas en Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Jul 12; 108(28): 11399; y una sortasa que reconoce el motivo QVPTGV (SEQ ID NO: 103) como se describe en Barnett et al., Journal of Bacteriology, Vol.

184, No. 8, p. 2181-2191,2002).

El uso de sortasas encontradas en cualquier organismo Gram-positivo, tal como los mencionados en el presente documento y/o en las referencias (incluyendo bases de datos) citadas en el presente documento, se contempla en el contexto de algunas realizaciones de la presente invención. También se contempla el uso de sortasas encontradas en bacterias Gram-negativas, por ejemplo, Colwellia psychrerythraea, Microbulbifer degradans, Bradyrhizobium japonicum, Shewanella oneidensis, and Shewanella putrefaciens. Colwellia psychrerythraea, Microbulbifer degradans, Bradyrhizobium japonicum, Shewanella oneidensis y Shewanella putrefaciens. Dichas sortasas reconocen motivos de secuencia fuera del consenso LPXTX (SEQ ID NO: 80), por ejemplo, LP[Q/K]T[A/S]T (SEQ ID NO: 104). De acuerdo con la variación tolerada en la posición 3 en sortasas de organismos Gram-positivos, se puede usar un motivo de secuencia LPXT[A/S] (SEQ ID NO: 105), por ejemplo, LPXTA (SEQ ID NO: 2) o LPSTS (SEQ ID NO: 106).

(b) Agente para la conjugación con la superficie celular

Los agentes que se pueden conjugar con superficies celulares por marcado con sortasa (directa o indirectamente) pueden ser cualquier molécula, entidad, o resto, que incluyen, pero no se limita a, una proteína, un aminoácido, un péptido, un polinucleótido, un hidrato de carbono, una marca detectable, un agente de unión, una marca, un átomo metálico, un agente de contraste, un catalizador, un polímero no polipeptídico, un polímero sintético, un elemento de reconocimiento, un lípido, un conector o un compuesto químico, tal como una molécula pequeña. En algunas realizaciones, el agente es un agente de unión, por ejemplo, un ligando o una molécula de unión al ligando, tal como estreptavidina/biotina, y un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

Cuando el agente es un polipéptido, se puede conjugar directamente con una célula que expresa una proteína de la superficie marcable con sortasa en presencia de una sortasa. Los términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a un polímero de restos de aminoácidos unidos juntos por enlaces peptídicos (amida). Los términos se refieren a una proteína, péptido o polipéptido de cualquier tamaño, estructura o función. Normalmente, una proteína, péptido o polipéptido tendrá al menos tres aminoácidos de longitud. Una proteína, péptido o polipéptido puede referirse a una proteína individual o a un conjunto de proteínas. Uno o más de los aminoácidos en una proteína, péptido o polipéptido se puede modificar, por ejemplo, mediante la adición de una entidad química, tal como un grupo de hidrato de carbono, un grupo hidroxilo, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofarnesilo, un grupo de ácido graso, un conector para la conjugación, funcionalización, u otra modificación, etc. Una proteína, péptido o polipéptido también puede ser una única molécula, o puede ser un complejo multimolecular. Una proteína, péptido o polipéptido puede ser solo un fragmento de una proteína o péptido que existe de forma natural. Una proteína, péptido o polipéptido puede ser que exista de forma natural, sea recombinante, o sintético, o cualquier combinación de los mismos.

Una proteína que se va a conjugar con superficies celulares por los métodos de conjugación descritos en el presente documento puede ser cualquier proteína que tenga una bioactividad deseada, por ejemplo, diagnóstico o terapéutico. En algunos ejemplos, la proteína es un fármaco de proteína (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo), un péptido capaz de dirigirse a un tipo específico de células (por ejemplo, célula enfermas, tales como células cancerosas), o un péptido inmunogénico capaz de provocar respuestas inmunitarias deseadas (por ejemplo, respuestas de linfocitos B o respuestas de linfocitos T). Dicha proteína también puede ser un agente de unión basado en proteína, por ejemplo, estreptavidina.

Sin limitar la presente divulgación de ningún modo, esta sección trata ciertas proteínas diana. En general, cualquier proteína o polipéptido se puede modificar para llevar una unidad de conexión de química click y/o conjugar con otra molécula por química click según los métodos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, la proteína diana comprende o consiste en un polipéptido que es al menos el 80 %, o al menos el 90 %, por ejemplo, al menos el 95 %, 86 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o el 100 % idéntico a una proteína o polipéptido que existe de forma natural. En algunas realizaciones, la proteína diana tiene no más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 diferencias de aminoácidos con respecto a una secuencia que existe de forma natural. En algunas realizaciones, la proteína que existe de forma natural es una proteína de mamífero, por ejemplo, de origen humano.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Los términos anticuerpo e inmunoglobulina se usan indistintamente. Con algunas excepciones, los anticuerpos de mamífero están normalmente hechos de unidades estructurales básicas cada una con dos cadenas pesadas grandes y dos cadenas ligeras pequeñas. Hay varios tipos diferentes de cadenas pesadas de anticuerpo, y varios tipos diferentes de anticuerpos, que se agrupan en diferentes isotipos basándose en la cadena pesada que poseen. Se conocen cinco isotipos diferentes de anticuerpos en los mamíferos, IgG, IgA, IgE, IgD e IgM, que desempeñan diferentes funciones, y ayudan a dirigir la respuesta inmunitaria apropiada para cada tipo diferente de objeto extraño que se encuentran. En algunas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo IgG, por ejemplo, un anticuerpo de la subclase humana IgG1,2, 3 o 4. Los anticuerpos de especies de mamífero (por ejemplo, humana, ratón, rata, cabra, cerdo, caballo, ganado vacuno, camello) están dentro del alcance del término, los anticuerpos de especies no de mamífero (por ejemplo, de aves, reptiles, anfibios) también están dentro del alcance del término, por ejemplo, los anticuerpos IgY.

Solo parte de un anticuerpo participa en la unión del antígeno, y los fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno, su preparación y uso son bien conocidos por los expertos en la técnica. Como es muy conocido en la técnica, solo una porción pequeña de una molécula de anticuerpo, el paratope, participa en la unión del anticuerpo con su epítope (véase, en general, Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7a Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Los anticuerpos adecuados y fragmentos de anticuerpos para su uso en el contexto de algunas realizaciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de dominio, fragmentos F(ab'), F(ab')2, Fab, Fv, Fc y Fd, anticuerpos en los que las regiones de la cadena ligera de Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de la cadena ligera se han sustituido por secuencias homólogas humanas o no humanas; los anticuerpos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de la cadena ligera se han sustituido por secuencias homólogas humanas o no humanas; anticuerpos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de la cadena ligera se han sustituido por secuencias homólogas humanas o no humanas; y anticuerpos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 se han sustituido por secuencias homólogas humanas o no humanas. En algunas realizaciones, los denominados anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv), anticuerpos de (un solo) dominio, y otros anticuerpos intracelulares, se pueden usar en el contexto de la presente invención. Los anticuerpos de dominio (anticuerpos de un solo dominio), anticuerpos de camélido y camelizados y fragmentos de los mismos, por ejemplo, dominios VHH, o nanocuerpos, tales como los descritos en patentes y solicitudes de patente publicadas de Ablynx NV y Domantis, también están englobadas en el término anticuerpo. Un anticuerpo de un solo dominio puede consistir en un único dominio variable de anticuerpo monomérico y es capaz de unirse específicamente a un antígeno. Además, los anticuerpos quiméricos, por ejemplo, anticuerpos que comprenden dos dominios de unión al antígeno que se unen a diferentes antígenos, también son adecuados para su uso en el contexto de algunas realizaciones de la presente invención.

El término "fragmento de anticuerpo de unión al antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el paratope, o un fragmento del anticuerpo que se une al antígeno al que se une el anticuerpo, con especificidad y afinidad similares como el anticuerpo intacto. Los anticuerpos, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales completamente humanos, se pueden identificar usando presentación en fagos (u otros métodos de presentación, tales como presentación en levadura, presentación en ribosomas, presentación bacteriana). Las bibliotecas de presentación, por ejemplo, las bibliotecas de presentación en fagos, están disponibles (y/o se pueden generar por un experto habitual en la técnica), se pueden cribar para identificar un anticuerpo que se une a un antígeno de interés, por ejemplo, usando adsorción. Véase, por ejemplo, Sidhu, S. (ed.) Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery (Drug Discovery Series; CRC Press; 1a ed., 2005; Aitken, R. (ed.) Antibody Phage Display: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2a ed., 2009.

Los anticuerpos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, abciximab (glucoproteína IIb/IIIa; enfermedad cardiovascular), adalimumab (TNF-a, diversos trastornos autoinmunitarios, por ejemplo, artritis reumatoide), alemtuzumab (CD52; leucemia linfocítica crónica), basiliximab (receptor de IL-2Ra (CD25); rechazo de trasplante), bevacizumab (factor de crecimiento endotelial vascular A; diversos cánceres, por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioblastoma, cáncer de riñón; degeneración macular húmeda senil), catumaxomab, cetuximab (receptor de EGF, diversos cánceres, por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello), certolizumab (por ejemplo, certolizumab pegol) (TNF alfa; enfermedad de Crohn, artritis reumatoide), daclizumab (receptor de IL-2Ra (CD25); rechazo de trasplante), eculizumab (proteína C5 del complemento; hemoglobinuria paroxística nocturna), efalizumab (CD11 a; psoriasis), gemtuzumab (CD33; leucemia mielógena aguda (por ejemplo, con calicheamicina)), ibritumomab tiuxetan (CD20; linfoma no hodgkiniano (por ejemplo, con itrio-90 o indio-111)), infliximab (TNF alfa; diversos trastornos autoinmunitarios, por ejemplo, artritis reumatoide) muromonab-CD3 (receptor de linfocitos T CD3; rechazo de trasplante), natalizumab (integrina alfa-4 (a4); esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn), omalizumab (IgE; asma relacionado con la alergia), palivizumab (epítope de la proteína F de RSV; infección por el virus respiratorio sincitial), panitumumab (receptor de EGF; cáncer, por ejemplo, cáncer colorrectal), ranibizumab (factor de crecimiento endotelial vascular A; degeneración macular húmeda senil) rituximab (CD20; linfoma no hodgkiniano), tositumomab (CD20; linfoma no hodgkiniano), trastuzumab (ErbB2; cáncer de mama), y cualquier fragmento de unión al antígeno de los mismos.

El término "agente de unión", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula que se une a otra molécula con alta afinidad. En algunas realizaciones, un agente de unión se une con su componente de unión con alta especificidad. Los ejemplos de agentes de unión incluyen, sin limitación, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, receptores, ligandos, aptámeros y adnectinas.

En algunas realizaciones, la proteína de interés que se va a conjugar con los glóbulos rojos es una citocina, por ejemplo, una citocina de tipo I. En algunas realizaciones de interés particular, la proteína diana es una proteína de haces de cuatro hélices, por ejemplo, una citocina de haces de cuatro hélices. Las citocinas de haces de cuatro hélices a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, ciertos interferones (por ejemplo, un interferón de tipo I, por ejemplo, IFN-a), interleucinas (por ejemplo, IL-2, IL -3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12) y factores estimulantes de colonias (por ejemplo, G-CSF, GM-CSF, M-CSF). El IFN puede ser, por ejemplo, interferón alfa 2a o interferón alfa 2b. Véanse, por ejemplo, Mott HR and Campbell ID. "Four-helix bundle growth factors and their receptors: protein-protein interactions." Curr Opin Struct Biol. 1995 Feb;5(1 ):114-21; Chaiken IM, Williams WV. "Identifying structure-function relationships in fourhelix bundle cytokines: towards de novo mimetics design." Trends Biotechnol. 1996 Oct;14(10):369-75; Klaus W, et al., "The three-dimensional high resolution structure of human interferon alpha-2a determined by heteronuclear NMR spectroscopy in solution". J. Mol Biol., 274(4):661-75, 1997, para una discusión adicional de ciertas de estas citocinas.

La proteína de interés también puede ser una proteína citocina que tiene una estructura similar a una o más de las citocinas anteriormente mencionadas. Por ejemplo, la citocina puede ser una citocina de clase IL-6, tal como factor inhibidor de leucemia (LIF) u oncostatina M. En algunas realizaciones, la citocina es una que en la naturaleza se une a un receptor que comprende una subunidad transductora de señal GP130. Otras proteínas de haces de cuatro hélices de interés incluyen hormona de crecimiento (GH), prolactina (PRL) y lactógeno placentario. En algunas realizaciones, la proteína diana es un agente estimulante de la eritropoyesis, por ejemplo, (EPO), que también es una citocina de haces de cuatro hélices. En algunas realizaciones, un agente estimulante de la eritropoyesis es una variante de EPO, por ejemplo, darbepoetina alfa, también denominada la novedosa proteína estimulante de la eritropoyesis (NESP), que se manipula para contener cinco cadenas de hidrato de carbono unidas en N (dos más que HuEPO recombinante). En algunas realizaciones, la proteína comprende cinco hélices. Por ejemplo, la proteína puede ser un interferón beta, por ejemplo, interferón beta-1a o interferón beta-1b, que (como se apreciará) se clasifica frecuentemente como una citocina de haces de cuatro hélices. En algunas realizaciones, una proteína diana es IL-9, IL-10, IL-11, IL-13 o IL-15. Véase, por ejemplo, Hunter, CA, Nature Reviews Immunology 5, 521 -531,2005, para la discusión de ciertas citocinas. Véase también Paul, WE (ed.), Fundamental Immunology, Lippincott Williams & Wilkins; 6a ed., 2008. Cualquier proteína descrita en las referencias citadas en el presente documento se puede usar como una proteína diana.

Además, la proteína de interés puede ser una proteína que está autorizado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. (o una autoridad sanitaria equivalente, tal como la Agencia Europea del Medicamento) para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno en seres humanos. Dichas proteínas pueden o pueden no ser una para la que se ha probado una versión PEGilada en ensayos clínicos y/o ha sido autorizada para comercialización.

La proteína de interés también puede ser un factor neurotrófico, es decir, un factor que promueve la supervivencia, el desarrollo y/o la función de células de linaje neural (término que como se usa en el presente documento incluye células progenitoras neurales, neuronas y células de la glía, por ejemplo, astrocitos, oligodendrocitos, microglía). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la proteína diana es un factor que promueve la excrecencia de axones. En algunas realizaciones, la proteína es el factor neurotrófico ciliar (CNTF; una proteína de haces de cuatro hélices) o un análogo de la misma, tal como Axokine, que es una versión modificada del factor neurotrófico ciliar humano con una truncación de 15 aminoácidos del extremo C y dos sustituciones de aminoácidos, que es tres a cinco veces más potente que el CNTF en ensayos in vitro e in vivo y tiene propiedades de estabilidad mejorada.

En otro ejemplo, la proteína de interés es una proteína que forma homodímeros o heterodímeros (u homo- o heterooligómeros que comprenden más de dos subunidades, tales como tetrámeros). En ciertas realizaciones, la estructura del homodímero, heterodímero u oligómero es tal que un extremo de una primera subunidad está en estrecha proximidad a un extremo de una segunda subunidad. Por ejemplo, un extremo N de una primera subunidad está en estrecha proximidad a un extremo C de una segunda subunidad. En ciertas realizaciones, la estructura del homodímero, heterodímero u oligómero es tal que un extremo de una primera subunidad y un extremo de una segunda subunidad no participan en la interacción con un receptor, de manera que los extremos se puedan unir por un elemento de péptido no genéticamente codificado sin afectar significativamente la actividad biológica. En algunas realizaciones, los extremos de dos subunidades de un homodímero, heterodímero u oligómero se conjugan por química click usando un método descrito en el presente documento, produciendo así un dímero (u oligómero) en el que al menos dos subunidades están unidas covalentemente. Por ejemplo, las neurotrofinas el factor de crecimiento nervioso (NGF); factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); neurotrofina 3 (NT3); y neurotrofina 4 (NT4) son moléculas diméricas que comparten aproximadamente el 50 % de identidad de secuencia y existen en formas diméricas. Véanse, por ejemplo, Robinson RC, et al., "Structure of the brain-derived neurotrophic factor/neurotrophin 3 heterodimer", Biochemistry. 34(13):4139-46, 1995; Robinson RC, et al., "The structures of the neurotrophin 4 homodimer and the brain-derived neurotrophic factor/neurotrophin 4 heterodimer reveal a common Trk-binding site", Protein Sci.

8(12):2589-97, 1999, y referencias en su interior. En algunas realizaciones, la proteína es una citocina, por ejemplo, una interleucina.

Alternativamente, la proteína de interés es una enzima, por ejemplo, una enzima que es importante en el metabolismo u otros procesos fisiológicos. Como se conoce en la técnica, las deficiencias de enzimas u otras proteínas pueden conducir a una variedad de enfermedades. Dichas enfermedades incluyen enfermedades asociadas a defectos en el metabolismo de los hidratos de carbono, metabolismo de los aminoácidos, metabolismo de los ácidos orgánicos, metabolismo de la porfirina, metabolismo de la purina o pirimidina, trastornos de almacenamiento lisosómico, coagulación de la sangre, etc. Los ejemplos incluyen enfermedad de Fabry, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Pompe, deficiencia de adenosina desaminasa, deficiencia de asparaginasa, porfiria, hemofilia y angioedema hereditario. En algunas realizaciones, una proteína es un factor de coagulación (por ejemplo, factor VII, VIIa, VIII o IX). En otras realizaciones, una proteína es una enzima que desempeña una función en el metabolismo de los hidratos de carbono, metabolismo de los aminoácidos, metabolismo de los ácidos orgánicos, metabolismo de la porfirina, metabolismo de la purina o pirimidina y/o almacenamiento lisosómico, en donde la administración exógena de la enzima alivia al menos en parte la enfermedad.

Además, la proteína de interés puede ser un receptor o fragmento de receptor (por ejemplo, dominio extracelular). En algunas realizaciones, el receptor es un receptor de TNFa. En ciertas realizaciones, la proteína diana comprende urato oxidasa.

En algunas realizaciones, la proteína de interés es una proteína antigénica, que puede derivar de un patógeno (por ejemplo, un virus o bacteria). Una proteína antigénica puede existir de forma natural o ser sintética en diversas realizaciones. Puede ser naturalmente producida por y/o comprende un polipéptido o péptido que está genéticamente codificado por un patógeno, una célula infectada o una célula neoplásica (por ejemplo, una célula cancerosa). En algunos ejemplos, la proteína antigénica es un autoantígeno ("auto-antígeno"), que tiene la capacidad de iniciar o potenciar una respuesta autoinmunitaria. En otros ejemplos, la proteína antigénica se produce o codifica genéticamente por un virus, bacteria, hongo o parásito que, en algunas realizaciones, es un agente patógeno. En algunas realizaciones, un agente (por ejemplo, virus, bacteria, hongo, parásito) infecta y, en algunas realizaciones, provoca la enfermedad en al menos una especie de mamífero o aviar, por ejemplo, especie humana, de primate no humano, bovina, ovina, equina, caprina y/o porcina. En algunas realizaciones, un patógeno es intracelular durante al menos parte de su ciclo vital. En algunas realizaciones, un patógeno es extracelular. Se apreciará que un antígeno que se origina a partir de una fuente particular se puede aislar, en diversas realizaciones, de dicha fuente, o producir usando cualquier medio apropiado (por ejemplo, recombinantemente, sintéticamente, etc.), por ejemplo, para los fines de uso del antígeno, por ejemplo, para identificar, generar, probar o usar un anticuerpo para el mismo). Un antígeno se puede modificar, por ejemplo, por conjugación con otra molécula o entidad (por ejemplo, un adyuvante), desnaturalización química o física, etc. En algunas realizaciones, un antígeno es una proteína de la envoltura, proteína de la cápside, proteína secretada, proteína estructural, proteína de la pared celular o polisacárido, proteína o polisacárido de la cápsula, o enzima. En algunas realizaciones, un antígeno es una toxina, por ejemplo, una toxina bacteriana.

Los virus a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, Retroviridae (por ejemplo, lentivirus, tales como el virus de la inmunodeficiencia humana, tal como el VIH-I); Caliciviridae (por ejemplo, cepas que provocan gastroenteritis);

Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubeola); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla, virus de la hepatitis C); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus);

Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del Ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus paragripales, virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe); Bunyaviridae (por ejemplo, virus de Hantaan, virus bunga, flebovirus y virus de Nairo); Arenaviridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (es decir, reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Adenoviridae; Herpesviridae (virus del herpes simple (VHS) 1 y 2, virus de la varicelazóster, citomegalovirus (CMV), EBV, KSV); Poxviridae (virus de la viruela, virus de la variolovacuna, poxvirus); y Picornaviridae (por ejemplo, virus de la poliomielitis, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus de Coxsackie humano, rhinovirus, echovirus).

Las bacterias a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, Helicobacter pylori, Borellia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M, intracellulare, M. kans Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus del grupo A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus del grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobic sps.), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp., Enterococcus sp., Chlamydia sp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasteurella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Leptospira, Actinomyces israelii y Francisella tularensis.

Los hongos a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Blastomyces, tales como Blastomyces dermatitidis, Candida, tales como Candida albicans, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Coccidioides, tales como Coccidioides immitis, Cryptococcus, tales como Cryptococcus neoformans, Epidermophyton, Fusarium, Histoplasma, tales como Histoplasma capsulatum, Malassezia, tales como Malassezia furfur, Microsporum, Mucor, Paracoccidioides, tales como Paracoccidioides brasiliensis, Penicillium, tales como Penicillium marneffei, Pichia, tales como Pichia anomala, Pichia guilliermondii, Pneumocystis, tales como Pneumocystis carinii, Pseudallescheria, tales como Pseudallescheria boydii, Rhizopus, tales como Rhizopus oryzae, Rhodotorula , tales como Rhodotorula rubra, Scedosporium, tales como Scedosporium apiospermum, Schizophyllum, tales como Schizophyllum commune, Sporothrix, tales como Sporothrix schenckii, Trichophyton, tales como Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Trichophyton verrucosum, Trichophyton violaceutn, Trichosporon, tales como Trichosporon asahii, Trichosporon cutaneum, Trichosporon inkin y Trichosporon mucoides.

En algunas realizaciones, un antígeno es un antígeno de tumor (TA). En general, un antígeno de tumor puede ser cualquier sustancia antigénica producida por células tumorales (por ejemplo, células tumorigénicas o en algunas realizaciones células del estroma tumoral, por ejemplo, células asociada a tumor, tales como fibroblastos asociados al cáncer). En muchas realizaciones, un antígeno de tumor es una molécula (o porción de la misma) que se expresa diferencialmente por células tumorales en comparación con células no tumorales. Los antígenos de tumor pueden incluir, por ejemplo, proteínas que normalmente se producen en cantidades muy pequeñas y se expresan en cantidades mayores por células tumorales, proteínas que normalmente se producen solo en ciertas etapas de desarrollo, proteínas cuya estructura (por ejemplo, secuencia o modificación (modificaciones) postraduccionales) se modifica debido a una mutación en células tumorales, o proteínas normales que son secuestradas (en condiciones normales) del sistema inmunitario. Los antígenos de tumor pueden ser útiles en, por ejemplo, identificar o detectar

células tumorales (por ejemplo, para los fines de diagnóstico y/o para los fines de monitorización de sujetos que han recibido tratamiento para un tumor, por ejemplo, para probar la reaparición) y/o para los fines de direccionamiento de diversos agentes (por ejemplo, agentes terapéuticos) a células tumorales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo quimérico, que comprende un anticuerpo de fragmento de anticuerpo que se une al antígeno de tumor, y se conjuga por química click con un agente terapéutico, por ejemplo, un agente citotóxico. En algunas realizaciones, un TA es un producto de expresión de un gen mutado, por ejemplo, un oncogén o gen supresor de tumores mutado, una proteína celular expresada en exceso o expresada de forma aberrante, un antígeno codificado por un virus oncogénico (por ejemplo, VHB; VHC; miembros de la familia del virus del herpes, tales como VEB, VSK; virus del papiloma, etc.), o un antígeno oncofetal. Los antígenos oncofetales normalmente se producen en las fases tempranas del desarrollo embrionario y desaparecen en gran medida o completamente para cuando el sistema inmunitario se ha desarrollado completamente. Los ejemplos son alfafetoproteína (AFP, encontrada, por ejemplo, en tumores de células germinativas y carcinoma hepatocelular) y antígeno carcinoembrionario (CEA, encontrado, por ejemplo, en cánceres intestinales y ocasionalmente en cáncer de pulmón o de mama). La tirosinasa es un ejemplo de una proteína normalmente producida en cantidades muy bajas, pero cuya producción es enormemente elevada en ciertas células tumorales (por ejemplo, células de melanoma). Otros TA a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, CA-125 (encontrado, por ejemplo, en cáncer de ovario); MUC-1 (encontrado, por ejemplo, en cáncer de mama); antígeno de tumor epitelial (encontrado, por ejemplo, en cáncer de mama); antígeno asociado a melanoma (MAGE; encontrado, por ejemplo, en melanoma maligno); fosfatasa ácida prostática (PAP, encontrada en cáncer de próstata). En algunas realizaciones, un TA se expone al menos en parte en la superficie celular de células tumorales. En algunas realizaciones, un antígeno de tumor comprende un polipéptido o lípido anormalmente modificado, por ejemplo, un glicolípido o glucoproteína de superficie celular aberrantemente modificado. Se apreciará que un TA puede ser expresado por un subconjunto de tumores de un tipo particular y/o por un subconjunto de células en un tumor.

La Tabla 1 a continuación enumera a modo de ejemplo proteínas de interés y sus secuencias de aminoácidos:

Tabla 1: Secuencias de proteínas de interés a modo de ejemplo:

Se puede modificar cualquiera de las proteínas de interés que se describen en el presente documento, que pueden comprender (i) uno o más restos nucleófilos, tales como glicina en el extremo N (por ejemplo, entre 1 y 10 restos) y, opcionalmente, una secuencia de reconocimiento de la escisión, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de la escisión de proteasa que enmascara el (los) resto(s) nucleófilo(s); o (ii) un motivo de reconocimiento de sortasa en o cerca del extremo C. En algunas realizaciones, la proteína diana comprende tanto (i) como (ii). Dichas proteínas modificadas se pueden usar en los métodos de conjugación de proteínas que se describen en el presente documento. Un experto en la técnica sabrá que ciertas proteínas, por ejemplo, proteínas eucariotas secretadas (por ejemplo, de mamífero) experimentan frecuentemente un procesamiento intracelular (por ejemplo, escisión de una señal de secreción antes de la secreción y/o retirada de otra(s) porción (porciones) que no son requeridas para la actividad biológica), para generar una forma madura. Dichas versiones maduras biológicamente activas de proteínas diana se usan en ciertas realizaciones de la presente divulgación.

Otras proteínas de interés se pueden encontrar en, por ejemplo, los documentos de patente USSN 10/773.530; 11/531.531; USSN 11/707.014; 11/429.276; 11/365.008. La invención engloba la aplicación de los métodos inventivos a cualquiera de las proteínas descritas en el presente documento y cualquier proteína conocida por los expertos en la técnica.

Cuando el agente no es una proteína, dicho agente se puede conjugar con un esqueleto de proteína, que se puede unir a una proteína marcable con sortasa de la superficie en presencia de una sortasa. Los agentes no proteicos incluyen, pero no se limitan a, un lípido, un hidrato de carbono, una molécula pequeña, tal como una unidad de conexión de química click o un agente quimioterapéutico, una marca detectable (por ejemplo, un agente de obtención de imágenes) o un agente quimioterapéutico. Los agentes adecuados adicionales para su uso en las realizaciones de la presente divulgación serán evidentes para el experto.

En algunos ejemplos, el agente no proteico es antigénico, de forma que pueda provocar respuestas inmunitarias. Dichos agentes antigénicos pueden comprender, por ejemplo, un polisacárido, un hidrato de carbono, un lípido, un ácido nucleico, o una combinación de los mismos, y pueden derivar de un patógeno, por ejemplo, de los descritos en el presente documento.

El término "conjugado" o "conjugación" se refieren a una asociación de dos moléculas, por ejemplo, dos proteínas o una proteína y un agente, por ejemplo, una molécula pequeña, con otra de tal forma que se unan por una interacción covalente o no covalente directa o indirecta. En ciertas realizaciones, la asociación es covalente, y se dice que las entidades están "conjugadas" entre sí. En algunas realizaciones, una proteína se conjuga postraduccionalmente con otra molécula, por ejemplo, una segunda proteína, una molécula pequeña, una marca detectable, una unidad de conexión de química click, o un agente de unión, formando un enlace covalente entre la proteína y la otra molécula después de que se haya formado la proteína, y, en algunas realizaciones, después de que la proteína se haya aislado. En algunas realizaciones, dos moléculas están conjugadas por un conector que conecta ambas moléculas. Por ejemplo, en algunas realizaciones donde dos proteínas se conjugan entre sí para formar una fusión de proteínas, las dos proteínas se pueden conjugar por un conector polipeptídico, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que conecta el extremo C de una proteína con el extremo N de la otra proteína. En algunas realizaciones, dos proteínas se conjugan en sus extremos C respectivos, generando una proteína quimérica conjugada C-C. En algunas realizaciones, dos proteínas se conjugan en sus extremos N respectivos, generando una proteína quimérica conjugada N-N. En algunas realizaciones, la conjugación de una proteína con un péptido se logra por transpeptidación usando una sortasa. Véase, por ejemplo, Ploegh et al., solicitud de patente internacional PCT, PCT/US2010/000274, presentada el 1 de febrero de 2010, publicada como el documento de patente WO/2010/087994 el 5 de agosto de 2010, y Ploegh et al., solicitud de patente internacional PCT/US2011/033303, presentada el 20 de abril de 2011, publicada como el documento de patente WO/2011/133704 el 27 de octubre de 2011, para sortasas a modo de ejemplo, proteínas, motivos de reconocimiento, reactivos y métodos para la transpeptidación mediada por sortasa.

La química click es una filosofía química introducida por K. Barry Sharpless de The Scripps Research Institute, que describe la química confeccionada para generar enlaces covalentes rápidamente y de forma fiable por unión de pequeñas unidades que comprenden grupos reactivos juntos (véase H. C. Kolb, M. G. Finn y K. B. Sharpless (2001). Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angewandte Chemie International Edition 40 (11): 2004-2021. La química click no se refiere a una reacción específica, sino a un concepto que incluye, pero no se limita a, reacciones que imitan reacciones encontradas en la naturaleza. En algunas realizaciones, las reacciones de la química click son modulares, de amplio alcance, dan altos rendimientos químicos, generan subproductos inofensivos, son estereoespecíficas, presentan una gran fuerza impulsora termodinámica > 84 kJ/mol para favorecer una reacción con un único producto de reacción, y/o se pueden llevar a cabo en condiciones fisiológicas. En algunas realizaciones, una reacción de química click presenta una alta economía de átomos, se puede llevar a cabo en condiciones de reacción simples, usa materiales de partida y reactivos fácilmente disponibles, usa disolventes no tóxicos o usa un disolvente que es benigno o se retira fácilmente (preferentemente agua) y/o proporciona un aislamiento sencillo de los productos por métodos no cromatográficos (cristalización o destilación).

Una unidad de conexión de química click puede ser un reactante, o un grupo reactivo, que puede participar en una reacción de química click. Por ejemplo, un alquino deformado, por ejemplo, un ciclooctino, es una unidad de conexión de química click, puesto que puede participar en una cicloadición promovida por la deformación. En general, las reacciones de química click requieren al menos dos moléculas que comprenden unidades de conexión de química click que pueden reaccionar entre sí. Dichos pares de unidades de conexión de química click que son reactivos entre sí se denominan algunas veces en el presente documento unidades de conexión de química compañeras. Por ejemplo, una azida es una unidad de conexión de química click compañera con un ciclooctino o cualquier otro alquino. Las unidades de conexión de química click a modo de ejemplo adecuadas para su uso según algunos aspectos de la presente invención se describen en el presente documento, por ejemplo, en las Tablas A y B. Otras unidades de conexión de química click adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica. Para dos moléculas que se van a conjugar por química click, las unidades de conexión de química click de las moléculas tienen que ser reactivas entre sí, por ejemplo, en las que el resto reactivo de una de las unidades de conexión de química click puede reaccionar con el resto reactivo de la segunda unidad de conexión de química click para formar un enlace covalente. Dichos pares reactivos de unidades de conexión de química click se conocen bien por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, los descritos en la Tabla 2:

La Tabla 2 proporciona ejemplos de unidades de conexión de química click y reacciones. R, R1 y R2 pueden representar cualquier molécula que comprenda un motivo de reconocimiento de sortasa. En algunas realizaciones, cada aparición de R, R1 y R2 es independientemente RR-LPXT (SEQ ID NO: 50)-[X]y-, o - [X]y-LPXT (SEQ ID NO: 50)-RR, en donde cada aparición de X representa independientemente cualquier resto de aminoácido, cada aparición de y es un número entero entre 0 y 10, ambos incluidos, y cada aparición de RR representa independientemente una proteína o un agente (por ejemplo, una proteína, péptido, una marca detectable, un agente de unión, una molécula pequeña, etc.) y, opcionalmente, un conector.

En algunas realizaciones, se usan unidades de conexión de química click que pueden reaccionar para formar enlaces covalentes en ausencia de un catalizador metálico. Dichas unidades de conexión de química click son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen las unidades de conexión de química click descritas en Becer, Hoogenboom y Schubert, Click Chemistry beyond Metal-Catalyzed Cycloaddition, Angewandte Chemie International Edition (2009) 48: 4900 - 4908. Véase la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3: Unidades de conexión de química click a modo de ejemplo y reacciones.

Reactivo A Reactivo B Mecanismo Notas sobre la reacción[a] Referencia

0 azida alquino cicloadición [3+2] de 2 h a 60 °C en H2O [9]

azida-alquino catalizada

por Cu (CuAAC)

1 azida ciclooctino cicloadición [3+2] de 1 h a TA [6-8,10,11] azida-alquino promovida

por deformación (SPAAC)

2 azida alquino cicloadición [3+2] de 4 h a 50 °C [12]

activado Huisgen

3 azida alquino cicloadición [3+2] 12 h a TA en H2O [13]

deficiente en

electrones

4 azida arino cicloadición [3+2] 4 h a TA en THF con éter [14,15]

corona o 24 h a TA en

CH3CN

5 tetrazina alqueno retro-cicloadición [4+2] de 40 min a 25 °C (100 % de [36-38]

Diels-Alder rendimiento) N2 es el único

subproducto

6 tetrazol alqueno cicloadición 1,3-dipolar Algunos minutos de [39,40]

(fotoclick) irradiación UV y luego

durante la noche a 4 °C

7 ditioéster dieno hetero-cicloadición de 10 min a TA [43]

Diels-Alder

Reactivo A Reactivo B Mecanismo Notas sobre la reacción[a] Referencia

8 antraceno maleimida reacción de Diels-Alder 2 días a reflujo en tolueno [41]

[4+2]

9 tiol alqueno adición de radicales (tio 30 min UV (conv. [19-23]

click) cuantitativa) o 24 h de

irradiación Uv (> 96 %)

10 tiol enona adición de Michael 24 h a TA en CH3CN [27]

11 tiol maleimida adición de Michael 1 h a 40 °C en THF o 16 h a [24-26]

TA en dioxano

12 tiol para-flúor sustitución nucleófila durante la noche a TA en [32]

DMF o 60 min a 40 °C en

DMF

13 amina para-flúor sustitución nucleófila 20 min MW a 95 °C en NMP [30]

como disolvente

[a] TA=temperatura ambiente, DMF= =W,W-dimetilformamida, NMP==W-metilpirrolidona, THF=tetrahidrofurano, CHaCN=acetonitrilo.

Una marca detectable es un resto que tiene al menos un elemento, isótopo o grupo funcional incorporado en el resto que permite la detección de la molécula, por ejemplo, una proteína o péptido, u otra entidad, con el que la marca está unido. Las marcas pueden estar directamente unidas (es decir, por un enlace) o se pueden unir por un conector (tal como, por ejemplo, un alquileno opcionalmente sustituido; un alquenileno opcionalmente sustituido; un alquinileno opcionalmente sustituido; un heteroalquileno opcionalmente sustituido; un heteroalquenileno opcionalmente sustituido; un heteroalquinileno opcionalmente sustituido; un arileno opcionalmente sustituido; un heteroarileno opcionalmente sustituido; o un acileno opcionalmente sustituido, o cualquier combinación de los mismos, que pueda constituir un conector). Se apreciará que la marca se puede unir a o incorporar en una molécula, por ejemplo, una proteína, polipéptido, u otra entidad, en cualquier posición. En general, una marca detectable se puede clasificar en una cualquiera (o más) de cinco clases: a) una marca que contiene restos isotópicos, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados, que incluyen, pero no se limitan a, 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 67Ga, 76Br, 99mTc (Tc-99m), 111 In, 123I, 125I, 1311, 153Gd, 169Yb y 186Re; b) una marca que contiene un resto inmunitario, que puede ser anticuerpos o antígenos, que se puede unir a enzimas (por ejemplo, tales como peroxidasa de rábano picante); c) una marca que es un resto coloreado, luminiscente, fosforescente o fluorescente (por ejemplo, tal como la marca fluorescente fluoresceína-isotiocianato (FITC); d) una marca que tiene uno o más restos de fotoafinidad; y e) una marca que es un ligando para uno o más componentes de unión conocidos (por ejemplo, biotina-estreptavidina, FK506-FKBP). En ciertas realizaciones, una marca comprende un isótopo radiactivo, preferentemente un isótopo que emite partículas detectables, tales como partículas p. En ciertas realizaciones, la marca comprende un resto fluorescente. En ciertas realizaciones, la marca es la marca fluorescente fluoresceína-isotiocianato (FITC). En ciertas realizaciones, la marca comprende un resto de ligando con uno o más componentes de unión conocidos. En ciertas realizaciones, la marca comprende biotina. En algunas realizaciones, una marca es un polipéptido fluorescente (por ejemplo, GFP o un derivado del mismo, tal como GFP potenciado (EGFP)) o una luciferasa (por ejemplo, una luciferasa de luciérnaga, Renilla o Gaussia). Se apreciará que, en ciertas realizaciones, una marca puede reaccionar con un sustrato adecuado (por ejemplo, una luciferina) para generar una señal detectable. Los ejemplos no limitantes de proteínas fluorescentes incluyen GFP y derivados de los mismos, proteínas que comprenden fluoróforos que emiten luz de diferentes colores, tales como proteínas fluorescentes rojas, amarillas y cian. Las proteínas fluorescentes a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, Sirius, Azurite, EBFP2, TagBFP, mTurquoise, ECFP, Cerulean, TagCFP, mTFP1, mUkG1, mAG1, AcGFP1, TagGFP2, EGFP, mWasabi, EmGFP, TagYPF, EYFP, Topaz, SYFP2, Venus, Citrine, mKO, mKO2, mOrange, mOrange2, TagRFP, TagRFP-T, mStrawberry, mRuby, mCherry, mRaspberry, mKate2, mPlum, mNeptune, T-Sapphire, mAmetrine, mKeima. Véanse, por ejemplo, Chalfie, M. y Kain, SR (eds.) Green fluorescent protein: properties, applications, and protocols Methods of biochemical analysis, v.47 Wiley-Interscience, Hoboken, N.J., 2006; y Chudakov, DM, et al., Physiol Rev. 90(3):1103-63, 2010, para una discusión de GFP y numerosas otras proteínas fluorescentes o luminiscentes. En algunas realizaciones, una marca comprende un extintor oscuro, por ejemplo, una sustancia que absorbe energía de excitación de un fluoróforo y disipa la energía como calor.

"Molécula pequeña" se refiere a moléculas que tanto existen de forma natural como son artificialmente creadas (por ejemplo, por síntesis química) que tienen un peso molecular relativamente bajo. Normalmente, una molécula pequeña es un compuesto orgánico (es decir, contiene carbono). Una molécula pequeña puede contener múltiples enlaces carbono-carbono, estereocentros y otros grupos funcionales (por ejemplo, aminas, hidroxilo, carbonilos, anillos heterocíclicos, etc.). En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas son monoméricas y tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 1500 g/mol. En ciertas realizaciones, el peso molecular de la molécula pequeña es inferior a aproximadamente 1000 g/mol o inferior a aproximadamente 500 g/mol. En ciertas realizaciones, la molécula pequeña es un fármaco, por ejemplo, un fármaco que ya ha sido considerado seguro y es eficaz para su uso en seres humanos o animales por la agencia gubernamental u organismo regulador apropiado.

Cualquiera de los agentes no proteicos descritos en el presente documento se puede conjugar con un esqueleto de proteína por métodos conocidos por los expertos en la técnica.

(c) Reacción de transpeptidación catalizada por sortasa

Las reacciones de transacilación catalizadas por sortasa, y su uso en la transpeptidación (algunas veces también denominada transacilación) para la manipulación de proteínas se conocen bien por los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, Ploegh et al., documento de patente WO/2010/087994, y Ploegh et al., documento de patente WO/2011/133704). En general, la reacción de transpeptidación catalizada por sortasa da como resultado la conjugación de una primera proteína que contiene un motivo de reconocimiento de sortasa carboxiterminal, por ejemplo, LPXTX (SEQ ID NO: 80; en donde cada aparición de X representa independientemente cualquier resto de aminoácido), con una segunda proteína que comprende un péptido aceptor de sortasa aminoterminal, por ejemplo, uno o más restos de glicina del aminoterminal. En algunas realizaciones, el motivo de reconocimiento de sortasa es un motivo de reconocimiento de sortasa descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, el motivo de reconocimiento de sortasa es el motivo LPXT (SEQ ID NO: 50) o LPXTG (SEQ ID NO: 1).

La reacción de transacilación de sortasa proporciona medios para unir eficientemente un donante de acilo con un aceptor de acilo nucleófilo. Este principio es ampliamente aplicable a muchos donantes de acilo y a una multitud de diferentes aceptores de acilo. Previamente, la reacción de sortasa se empleó para unir proteínas y/o péptidos entre sí, unir péptidos sintéticos con proteínas recombinantes, unir una molécula indicadora con una proteína o péptido, unir un ácido nucleico con una proteína o péptido, conjugar una proteína o péptido con un soporte sólido o polímero, y unir una proteína o péptido con una marca. Dichos productos y procesos ahorran costes y tiempo asociados con la síntesis de los productos de unión y son útiles para unir convenientemente un donante de acilo con un aceptor de acilo. Sin embargo, no se ha descrito previamente ni la modificación ni la funcionalización de proteínas sobre la superficie de partículas víricas por marcado con sortasa, como se proporciona en el presente documento.

Las reacciones de transpeptidación mediadas por sortasa (también denominadas algunas veces reacciones de transacilación) se catalizan por la actividad de transamidasa de la sortasa, que forma un enlace peptídico (un enlace amida), entre un compuesto donante de acilo y un aceptor de acilo nucleófilo que contiene un resto NH2-CH2-. En algunas realizaciones, la sortasa empleada para llevar a cabo una reacción de transpeptidación mediada por sortasa es la sortasa A (SrtA). Sin embargo, se debe observar que cualquier sortasa, o transamidasa, que catalice una reacción de transacilación se puede usar en algunas realizaciones de la presente invención, ya que la invención no se limita al uso de la sortasa A.

Normalmente, un agente de interés (por ejemplo, una proteína o un agente no proteico conjugado con un esqueleto de proteína) se puede unir con la superficie de una célula que expresa la proteína de la superficie marcable con sortasa poniendo en contacto el agente de proteína o esqueleto de proteína con el que un agente de interés está conjugado con la célula en condiciones adecuadas, lo que permite la manifestación de la reacción de transpeptidación. En algunos ejemplos, el agente de interés se puede incubar en primer lugar con una sortasa en condiciones adecuadas durante un periodo de tiempo adecuado que permita la escisión en el sitio de reconocimiento de sortasa. La mezcla está entonces en contacto con las células en condiciones adecuadas de forma que el agente de interés se conjugue con la superficie marcable con proteína sortasa sobre las células.

En algunos casos, la célula, tal como una célula progenitora CD4+ o un glóbulo rojo enucleado, expresa una proteína de fusión que comprende un motivo de reconocimiento de sortasa en el extremo C (por ejemplo, una proteína transmembranaria de glóbulos rojos de tipo II fusionada con un motivo de reconocimiento de sortasa en el extremo C). Una proteína de interés o un esqueleto de proteína conjugado con un agente de interés se puede conjugar con el extremo C de la proteína de fusión en presencia de una sortasa. En otros casos, la célula expresa una proteína de fusión que comprende una proteína de la membrana y un péptido aceptor (por ejemplo, un polímero de glicina) fusionado con el extremo N de la proteína de la membrana (por ejemplo, una proteína transmembranaria de tipo I o tipo III). Una proteína que se va a conjugar con la proteína de fusión superficial celular comprende un motivo de reconocimiento de sortasa como se ha descrito anteriormente en el extremo C y se puede conjugar con el extremo N de la proteína de fusión superficial.

El uso de una sortasa específica en un método de conjugación como se describe en el presente documento dependería del motivo de reconocimiento de sortasa incluido tanto en la proteína superficial marcable con sortasa sobre las células como en la proteína que se va a conjugar con la proteína de la superficie. Esto está perfectamente dentro del conocimiento de los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las descripciones anteriores referentes a los sitios de reconocimiento para diversas sortasas.

En algunas realizaciones, CD34+ o glóbulos rojos enucleados derivados de los mismos pueden expresar una pluralidad de diferentes proteínas superficiales marcables con sortasa (por ejemplo, 2, 3 o más). En algunas realizaciones, la modificación específica de una o más de la pluralidad de proteínas superficiales mercables con sortasa implica el uso de diferentes sortasas, reconociendo específicamente cada una un motivo de reconocimiento de sortasa diferente incluido en la una o más proteínas marcables con sortasa. Por ejemplo, una primera proteína marcable con sortasa se puede modificar con SrtAaureus, que reconoce el motivo de reconocimiento de sortasa carboxiterminal LPETGG (SEQ ID NO: 107) y el motivo de reconocimiento de sortasa del extremo N (G)n, y una segunda marcable con sortasa se puede modificar con SrtApyogenes, que reconoce el motivo de reconocimiento de sortasa carboxiterminal LPETAA (SEQ ID NO: 108) y el motivo de reconocimiento de sortasa aminoterminal (A)n. Las sortasas en este ejemplo reconocen su motivo de reconocimiento respectivo, pero no reconocen el otro motivo de reconocimiento de sortasa hasta un grado significativo, y, así reconocen "específicamente" su motivo de reconocimiento respectivo. En algunas realizaciones, una sortasa se une al motivo de reconocimiento de sortasa específicamente si se une al motivo con una afinidad que es al menos 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces o más de 1000 veces superior a la afinidad con la que la sortasa se une a un motivo diferente. Dicho emparejamiento de sortasas ortogonales y sus motivos de reconocimiento respectivos, por ejemplo, de las enzimas sortasa A ortogonales SrtAaureus y SrtApyogenes, se puede usar para conjugar de forma específica de sitio dos restos diferentes sobre dos proteínas marcables con sortasa de superficie diferentes.

En otras realizaciones, el marcado con sortasa de una pluralidad de diferentes proteínas se logra poniendo en contacto secuencialmente una célula que comprende las diferentes proteínas de la superficie marcables con sortasa con una primera sortasa que reconoce un motivo de reconocimiento de sortasa de una primera proteína marcable con sortasa y una primera proteína de interés adecuada, y luego con una segunda sortasa que reconoce un motivo de reconocimiento de sortasa de una segunda proteína marcable con sortasa y una segunda proteína de interés, etc. Alternativamente, la célula se puede poner en contacto con una pluralidad de sortasas en paralelo, por ejemplo, con una primera sortasa que reconoce un motivo de reconocimiento de sortasa de una primera proteína marcable con sortasa y una primera proteína de interés adecuada, y con una segunda sortasa que reconoce un motivo de reconocimiento de sortasa de una segunda proteína diana y una segunda proteína de interés, etc.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, una primera proteína marcable con sortasa, por ejemplo, una proteína transmembranaria de tipo I fusionada con una oligoglicina, se modifica usando sortasa A de Staphylococcus aureus (SrtAaureus), y una segunda proteína marcable con sortasa, por ejemplo, una proteína transmembranaria de tipo II fusionada con un motivo de reconocimiento de sortasa adecuado, se modifica usando sortasa A de Streptococcus pyogenes (SrtApyogenes). SrtAaureus reconoce el motivo LPXTG (SEQ ID NO: 1), en el que X es cualquier resto de aminoácido, y usa oligoglicina como péptido aceptor. De forma diferente, SrtApyogenes reconoce el motivo LPXTA (SEQ ID NO: 2), en el que X es cualquier resto de aminoácido, y usa oligoalanina como péptido aceptor.

Cualquier sortasa que reconozca motivos de reconocimiento de sortasa suficientemente diferentes con especificidad suficiente es adecuada para el marcado con sortasa de una pluralidad de proteínas marcables con sortasa expresadas en glóbulos rojos. Los motivos de reconocimiento de sortasa respectivos se pueden insertar en las proteínas marcables con sortasa o las proteínas que se van a conjugar con las proteínas marcables con sortasa usando tecnologías recombinantes conocidas por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, los motivos de reconocimiento de sortasa adecuados pueden estar presentes en una proteína natural de la membrana. El experto entenderá que la elección de una sortasa adecuada para la conjugación de una proteína dada puede depender de la secuencia de la proteína marcable con sortasa, por ejemplo, de si la proteína marcable con sortasa comprende o no una secuencia en su extremo C o su extremo N que pueda ser reconocida como un sustrato por cualquier sortasa conocida. En algunas realizaciones, se prefiere el uso de una sortasa que reconoce un motivo de reconocimiento carboxiterminal o aminoterminal que existe de forma natural, puesto que se puede evitar la manipulación adicional de la proteína diana.

IV. Usos de glóbulos rojos como vehículo para la administración in vivo de agentes de interés

Cualquiera de las células progenitoras CD34+ genéticamente modificadas y glóbulos rojos enucleados (incluyendo los obtenidos del proceso de cultivo in vitro descrito en el presente documento), que también pueden estar genéticamente modificados como se describió, están dentro del alcance de la presente divulgación.

Los glóbulos rojos enucleados que tienen una modificación superficial de un agente de interés como se describió en el presente documento se pueden administrar a un sujeto en necesidad de los mismos (por ejemplo, un paciente humano) para diversos fines, por ejemplo, tratar una enfermedad específica cuando el agente de interés es un agente terapéutico, detectar la presencia de tipos específicos de células cuando el agente de interés es capaz de reconocer las células diana y provocar respuestas inmunitarias deseadas cuando el agente de interés es inmunogénico. Se puede usar cualquier vía de administración adecuada en los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, infusión de células.

En algunos ejemplos, los glóbulos rojos se administran al mismo sujeto del que se obtiene originalmente las células. Por ejemplo, se pueden obtener células de sangre periférica de un sujeto, tal como un paciente humano, expandir in vitro, modificar genéticamente de forma que expresen proteínas de la superficie marcables con sortasa, diferenciar en glóbulos rojos enucleados y conjugar con un agente de interés. Los glóbulos rojos modificados enucleados se pueden administrar entonces al mismo sujeto.

En otros ejemplos, las células progenitoras CD34+ se obtienen de un sujeto adecuado y, después de ser diferenciadas y genéticamente modificadas como se describe en el presente documento, los glóbulos rojos enucleados resultantes se administran a un sujeto diferente, que preferentemente es inmunocompatible con el donante (por ejemplo, la administración de los glóbulos sanguíneos enucleados no provocaría respuestas inmunitarias no deseables).

Los glóbulos rojos enucleados se pueden administrar a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene una condición asociada a una deficiencia de glóbulos rojos, por ejemplo, anemia, pérdida de sangre debida a cirugía o traumatismo. Los glóbulos rojos enucleados también se pueden administrar a un sujeto en necesidad de un tratamiento o diagnóstico que se puede lograr por el agente de interés conjugado sobre la superficie de los glóbulos rojos enucleados. Por ejemplo, los glóbulos rojos enucleados se pueden conjugar con un antígeno del cáncer o un antígeno derivado de un patógeno. Dichas células se pueden administrar a un sujeto en necesidad (por ejemplo, un sujeto humano que tiene o está en riesgo de cáncer o infección por el patógeno) de o tratamiento preventivo o terapéutico.

En otro ejemplo, los glóbulos rojos nucleados se pueden conjugar con una enzima eficaz en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con una deficiencia de la enzima, por ejemplo, enfermedad de Fabry, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Pompe, deficiencia de adenosina desaminasa, deficiencia de asparaginasa, porfiria, hemofilia y angioedema hereditario.

En otros ejemplos, los glóbulos rojos enucleados llevan un factor de coagulación (por ejemplo, factor VII, VIIa, VIII o IX) y se pueden administrar a un sujeto humano que tiene o que se sospecha que tiene afecciones asociadas a una coagulación anormal de la sangre.

V. Kits

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan kits útiles para la modificación genética y modificación superficial de glóbulos rojos por marcado con sortasa. Dicho kit puede comprender uno o más vectores de expresión que codifican una o más proteínas de fusión, cada una de las cuales comprende una proteína de la membrana celular de glóbulos rojos y un péptido como se describe en el presente documento. Si un kit comprende múltiples vectores de expresión como se describió, puede incluir secuencias que codifican diferentes motivos de reconocimiento de sortasa. En algunas realizaciones, los diferentes motivos de reconocimiento de sortasa son reconocidos por sortasas ortogonales, por ejemplo, uno por SrtAaureus y otro por SrtApyogenes.

Alternativamente o además, los kits descritos en el presente documento pueden comprender uno o más de los componentes de medio para su uso en el proceso de cultivo in vitro para producir glóbulos rojos enucleados, por ejemplo, una o más de las citocinas usadas en ellos, y uno o más de los medios usados en ellos, y/u otros componentes para el cultivo celular.

Además, el kit puede comprender una o más sortasas adecuadas. Normalmente, la sortasa comprendida en el kit reconoce un motivo de reconocimiento de sortasa codificado por un ácido nucleico comprendido en el kit. En algunas realizaciones, la sortasa se proporciona en una disolución de almacenamiento y en condiciones que conservan la integridad estructural y/o la actividad de la sortasa. En algunas realizaciones, donde dos o más motivos de reconocimiento de sortasa ortogonales están codificados por el (los) ácido(s) nucleico(s) comprendidos en el kit, se proporciona una pluralidad de sortasas, cada una de las cuales reconoce un motivo de reconocimiento de sortasa diferente codificado por el (los) ácido(s) nucleico(s). En algunas realizaciones, el kit comprende SrtAaureus y/o SrtApyogenes.

En algunas realizaciones, el kit comprende además un agente de interés, por ejemplo, una proteína de interés o un esqueleto de proteína conjugado con un agente no proteico. En algunas realizaciones, la proteína de interés o el esqueleto de proteína comprende un motivo de reconocimiento de sortasa, que puede ser compatible con el péptido en la proteína de fusión codificada por un ácido nucleico en el kit en que ambos motivos pueden participar en una reacción de transpeptidación mediada por sortasa catalizada por la misma sortasa. Por ejemplo, si el kit comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la membrana que comprende una secuencia de reconocimiento aminoterminal de SrtAaureus, el kit también puede comprenden SrtAaureus y una proteína de interés o un esqueleto de proteína, que comprenderá el motivo de reconocimiento de sortasa carboxiterminal.

En algunas realizaciones, el kit comprende además un tampón o reactivo útil para llevar a cabo una reacción de transpeptidación mediada por sortasa, por ejemplo, un tampón o reactivo descrito en la sección de ejemplos.

Sin elaboración adicional, se cree que un experto en la técnica puede utilizar, basándose en la descripción anterior, la presente invención en toda su extensión. Las siguientes realizaciones específicas se deben interpretar, por lo tanto, como simplemente ilustrativas, y no limitantes del resto de la divulgación en modo alguno.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Producción in v itro de glóbulos rojos enucleados maduros humanos

Se compran células madre / progenitoras hematopoyéticas movilizadas con G-CSF de sangre periférica humana enriquecidas en CD34+ del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson (FHCRC), Seattle. Las células se descongelan según el protocolo del FHCRC. Los glóbulos sanguíneos CD34+ humanos (hCD34+) se diferenciaron en glóbulos rojos enucleados maduros por un método compuesto de 4 fases en 21 días: (a) Expansión, (b) Diferenciación I (''Dif I"), (c) Diferenciación II (''Dif II") y Diferenciación III (''Dif III") ilustradas en la Figura 1, y descritas a continuación.

En la fase de expansión, los glóbulos sanguíneos CD34+ humanos se cultivaron en medio de expansión (StemspanSFEM, mezcla de citocinas CC100, que incluye ligando Flt-3, SCF, IL-3 e IL-6, y 2 % de penicilinaestreptomicina) a 105 células/ml desde el día 1~4. Después de la expansión, las células se cultivaron posteriormente en medio de diferenciación eritroide basado en IMDM complementado con diferentes citocinas en Dif I, II y III. La base del medio para las tres fases de diferenciación comprende: IMDM, 15 % de FBS, glutamina 2 mM, 1 % de BSA, 500 pg/ml de holo-transferrina humana, 10 pg/ml de insulina humana recombinante y 2 % de penicilina-estreptomicina. Día 5~9, las células se cultivaron en medio de Dif I, que contenía base de medio eritroide, dexametasona 2 pM, bestradiol 1 pM, 5 ng/ml de IL-3, 100 ng/ml de SCF y 6 U de Epo. Día 10~13, las células se cultivaron en medio de Dif II que contenía base de medio eritroide, 50 ng/ml de SCF y 6 U de Epo. Día 14~21, las células se cultivaron en placas recubiertas de fibronectina en medio de Dif III, que es base de medio eritroide complementado con 2 U de Epo. Los números de células que se volvieron a sembrar al comienzo de Dif I, II y III fueron 105, 2x105 y 3x105/ml, respectivamente.

Los glóbulos rojos en diversos momentos de tiempo durante el proceso de 4 fases anteriormente indicado se sometieron a tinción con bencidina-Giemsa y se observó la morfología celular en un microscopio. Como se muestra en la Figura 2, la disminución de los tamaños celulares se observó con la maduración eritroide y los glóbulos rojos enucleados se observaron en el día 8 de Dif. III. Se encontró que los tamaños de los glóbulos rojos nucleados obtenidos del método de 4 fases descrito eran similares a los de reticulocitos o glóbulos rojos humanos normales. Tabla 4 a continuación.

Tabla 4. Diámetros y áreas de clones de glóbulos rojos

Se determinaron los contenidos de hemoglobina de los glóbulos rojos en Dif I, Dif II y Dif III por el reactivo de Drabkin. Los resultados indican que los glóbulos sanguíneos enucleados obtenidos al final del proceso de diferenciación son aproximadamente 30 pg/célula.

Se examinaron los niveles de expresión de diversas proteínas de los glóbulos rojos de la superficie celular, que incluyen CD235a (glicoforina A), c-Kit y CD71. El análisis de FACS indica que la expresión de CD235a se elevó durante la eritropoyesis roja (diferenciación de glóbulos rojos). Los niveles de expresión de CD235a frente a los de c-kit o CD71 (transferrina) en las diferentes etapas del proceso de diferenciación se muestran en las Figuras 4 y 5. La tinción con Hoechst y glicoforina A indicaron que aproximadamente el 40-50 % de los glóbulos rojos experimentaron enucleación al final del proceso de diferenciación. Figura 5. % de enucleación = 32,5/(37,8+32,5) = 46,2 %.

Se contaron los números de células durante el proceso de diferenciación y los resultados indican que el número de células se duplicó casi cada día durante Dif I hasta principios de Dif. III. Figuras 6 y 7. Los niveles de expresión de los genes de globina, así como otros genes (hc-kit, hGATA2, hGATA1, hGYPA, hALAS2 y hSLCA1) durante la diferenciación de células hCD34+ también se examinaron por análisis de FACS. Los resultados se muestran en las Figuras 8 y 9.

En resumen, el estudio descrito anteriormente indica que se ha desarrollado satisfactoriamente un cultivo celular de hCD34+ de cuatro fases y proceso de diferenciación. Este proceso dio una expansión celular de aproximadamente 17.000-32.000 veces (14-15 duplicaciones) después de un cultivo de 21 días y se encontró que aproximadamente el 40-50 % de las células experimentaron enucleación. Los glóbulos rojos enucleados obtenidos de este proceso de cultivo son similares a los reticulocitos humanos normales o glóbulos rojos normales en tamaño celular, contenido de hemoglobina (~ 30 pg/célula) y expresión del marcador de la superficie celular.

Ejemplo 2: Conjugación de sondas funcionales con glóbulos rojos manipulados por reacción de sortasa

Los RBC carecen de núcleo y en su etapa madura no se pueden modificar genéticamente. Por lo tanto, se manipularon genéticamente precursores eritroides para expresar proteínas modificables con sortasa que son retenidas sobre la membrana plasmática de RBC maduros. En este estudio, dos proteínas modificables con sortasa de la membrana se expresaron en progenitores eritroides, Kell y glicoforina A (GPA):

(1) El antígeno de grupo sanguíneo Kell es una proteína de la membrana de tipo II con un extremo C extracelularmente expuesto y se seleccionó como una diana para marcado carboxiterminal.

(2) GPA, una proteína de la membrana de tipo I con su extremo N extracelularmente dispuesto, es la proteína más abundante sobre la superficie de RBC y se eligió para modificación aminoterminal.

Materiales y métodos

(i) Plásmidos

Se obtuvieron las secuencias codificantes de glicoforina A (GPA) humana, de ratón y Kell de NCBI, secuencia de ref NM_002099.6, NM_010369.3 y NM_000420.2, respectivamente. La secuencia codificante de la marca Myc (GAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG; SEQ ID NO: 109) se insertó entre el péptido señal y la GPA madura para la detección de la expresión de la superficie celular. Para unir la marca de sortasa en el extremo N de GPA, se insertaron cinco secuencias codificantes de marca de glicina (SEQ ID NO: 3) o tres de glicina (GGTGGCGGAGGTGGA; SEQ ID NO: 110 o GGTGGCGGA) inmediatamente después del péptido señal. Se sintetizó la longitud completa de GPA manipuladas humanas y de ratón por Genscript, y posteriormente se clonó en vectores retrovíricos MSCV. Se clonó Kell humano en el vector retrovírico MSCV extendido en su extremo C con la secuencia codificante para la marca Myc (GAACAAAAACTT ATTTCTGAAGAAGAT CT G; SEQ ID NO: 112), LPETGG (SEQ ID NO: 107) (CTGCCAGa Aa c Tg GTGGA; SEQ ID NO: 113), seguido por la marca de epítope de HA (TACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT; SEQ ID NO: 114).

(ii) Expresión y purificación de proteínas

Ambas, la sortasa A de Staphylococcus aureus A59 mutada para la mejora de Kcat (1) (P94R, D160N, D165A, K190E, K196T) y la actividad independiente de Ca2+ (Hirakawa et al., Biotechnol. Bioeng 109(12):2955-2961) (E105K, E108Q) en pET30 y la sortasa A de Streptococcus pyogenes, se expresaron y purificaron como se describió previamente. Guimaraes et al., (2013) Nat Protoc 8(9):1787-1799. VHH7 se extendió de forma carboxiterminal con LPETGGHHHHHH (SEQ ID NO: 115) en pHEN y se purificó como se describió previamente (4). El diseño y la síntesis de sondas de sortasa también se ha descrito previamente. Guimaraes et al., 2013; y Theile et al., (2013) Nat. Protoc.

8(9) :1800-1807.

(iii) Reacción de marcado de sortasa

Para el marcado del extremo N de GPA con biotina, se preincubaron 30 gl de sortasa 500 gM de S. aureus, péptido K(biotina)LPRTGG 1 mM (SEQ ID NO: 116) en tampón Tris-HCl 83 mM a pH 7,5, NaCl 250 mM, sobre hielo durante 15 minutos y se añadió a 70 gl de ~ 1x106 células cultivadas (reticulocitos o células HEK293T) o hasta 5x107 glóbulos rojos (10 gl de sangre completa) en DMEM (prelavado con DMEM). Para marcar el extremo N de GPA con VHH7, se preincubaron 50 gl de sortasa 100 gM de S. aureus, VHH-LPETG-His6 100 gM (SEQ ID NO: 126) en tampón Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, NaCl 150 mM, sobre hielo durante 15 minutos y se añadió a 50 gl de hasta 5x107 glóbulos rojos en DMEM. Para marcar el extremo C de Kell con biotina, se añadieron 30 gl de sortasa 500 gM de S. aureus, péptido GGGK(biotina) 1,4 mM (SEQ ID NO: 47) en tampón Tris-HCl 83 mM a pH 7,5, NaCl 250 mM, a 70 gl de ~ 1x106 células cultivadas (reticulocitos o células HEK293T) o hasta 5x107 glóbulos rojos en DMEM (prelavado con DMEM). Todas las mezclas de sortasa y células se incubaron sobre hielo durante 30 minutos con mezcla suave ocasional. Se centrifugaron a 2000 rpm durante 2 minutos a 4 °C para retirar tampón/DMEM y se lavó 3 veces con 1 ml de PBS frío en hielo. Para el marcado doble secuencial de GPA y Kell, se preincubaron 30 gl de sortasa 333 gM de S. pyogenes, péptido K(biotina)LPETAA 1,33 mM (SEQ ID NO: 45) en tampón Tris-HCl 83 mM, NaCl 250 mM, CaCl2 16,7 mM, a 37 °C durante 15 minutos, se añadieron a 70 gl de 1x106 células HEK293T en DMEM (prelavado con Dm Em ) y se incubaron a 37 °C durante 25 minutos con mezcla suave ocasional. Las células se centrifugaron a 2000 rpm durante 2 minutos a 4 °C, se lavaron 2 veces con 1 ml de PBS frío en hielo y finalmente se resuspendieron en 70 gl de DMEM frío en hielo. Se añadieron 30 gl de sortasa 333 gM de S. aureus, péptido GGGK 1,67 mM (Alexa647; SEQ ID NO: 117) en Tris-HCl 83 mM a pH 7,5, NaCl 250 mM, a las células y se incubaron durante 30 minutos sobre hielo con mezcla suave ocasional. Las células se lavaron 3 veces con 1 ml de PBS frío en hielo.

(iv) Transferencia Western

Cuando se marca con sortasa sangre completa, primero se lisaron los glóbulos rojos con 500 gl de disolución de cloruro de amonio (Stemcell technologies) por una incubación de 5 minutos sobre hielo y se centrifugaron a 14000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Las membranas se lavaron una vez con 500 ql de PBS. Las células se solubilizaron en Tris-HCl 25 mM a pH 7,5, 0,5 % de NP40, MgCl25 mM, NaCl 150 mM, complementado con un minicomprimido de mezcla completa de inhibidor de la proteasa (Roche), se agitó con vórtex, se incubó sobre hielo durante 10 minutos y se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se incubó con tampón de muestra SDS y se hirvió durante 8 minutos. Después de SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron sobre membrana de PVDF y se inmunotransfirieron para biotina (usando estreptavidina-HRP (GE Healthcare)), marca myc (Cell Signaling N.° 2040), marca HA (Roche 3F10), hemoglobina o CD19 (Cell Signaling N.° 3574).

(v) Transfección

Producción de virus: Se dividieron seis millones de células 293T y se sembraron en placas de 10 cm un día antes de la transfección en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) sin antibiótico con adición de 15 % de suero bovino fetal (FBS) y L-glutamina 2 mM (Invitrogen). En el día 0, se añadieron 10 ug de plásmidos junto con 5 ug de vector de encapsidación a la placa de 10 cm de 293T con Fugene 6 (Promega). Seis-ocho horas después, DMEM nuevo con la adición de 15 % de FBS, L-glutamina 2 mM y 1 x Pen Strep (Invitrogen) sustituyó al medio antiguo. En el día 1, se recogió el sobrenadante que contenía el nuevo virus, se filtró a través de un filtro de 0,45 qm (Millipore) y luego se usó inmediatamente para infectar los progenitores eritroides murinos. Expresión de GPA y Kell: Se sembraron células HEK293T en una placa de 10 cm y se transfectaron con cualquiera de 15 qg de construcciones Gn-myc-h/mGPA en vectores retrovíricos, o 7,5 qg de hKell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA y 7,5 qg de 3G-myc-hGPA, ambos en vectores retrovíricos (para el marcado de sortasa doble secuencial) usando el reactivo de transfección TransIT según las recomendaciones del fabricante (Mirus). Las células se analizaron para la expresión de proteínas y se marcaron con sortasa 24 horas después de la transfección celular.

(vi) Aislamiento de progenitores eritroides de células de hígado fetal murino E14,5

Después de la eterización por dióxido de carbono, se diseccionaron ratonas C57BL/6J de día 14,5 preñadas, y se aislaron los embriones. Se separaron cuidadosamente los hígados fetales enteros y se dispusieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 2 % de suero bovino fetal (FBS) y EDTA 100 uM. Se obtuvieron suspensiones de células individuales de hígado fetal después de la trituración y el filtrado a través de un filtro de 70 qm (BD). Se lisaron los glóbulos rojos maduros entre la suspensión de células de hígado fetal después de la incubación con disolución de cloruro de amonio (Stemcell) durante diez minutos. Se recogieron las células nucleadas por centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos, y se resuspendieron en PBS. Usando BD Biotin Mouse Lineage Panel (559971) y BD Streptavidin Particles Plus DM (557812), los presentes inventores purificaron células de hígado fetal de linaje negativo, que se enriquecieron en progenitores eritroides (más del 90 %).

(viii) Infección vírica y cultivo de progenitores eritroides murinos

Después de la purificación, se prepararon células de hígado fetal de linaje negativo en una concentración de 10 millones de células por ml. Se sembraron diez microlitros de las células en cada pocillo de una placa de 24 pocillos, junto con 1 ml de sobrenadante que contenía virus con 5 ug/ml de polibreno. La placa se centrifugó a 2000 rpm durante 90 min a 37 grados. Inmediatamente después de la infección por centrifugación, se aspiró el sobrenadante que contenía virus y se sustituyó con medio de mantenimiento eritroide StemSpan-SFEM (StemCell technologies) complementado con factor de células madre de ratón recombinantes (100 ng/ml de SCF, R&D), IGF-1 de ratón recombinante (40 ng/ml, R&D), dexametasona (100 nM, Sigma) y eritropoyetina (2 u/ml, Amgen)). A la mañana siguiente, la tasa de infección se examinó por citometría de flujo comprobando la población de células GFP positivas. Fue normalmente superior al 95 %. Entonces se cultivaron las células en medio de diferenciación eritroide de solo Epo (medio Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) que contenía 15 % de FBS (Stemcell), 1 % de albúmina de suero bovino desintoxicada (BSA) (Stemcell), 500 qg/ml de holo-transferrina (Sigma-Aldrich), 0,5 U/ml de Epo (Amgen), 10 qg/ml de insulina humana recombinante (Sigma-Aldrich), L-glutamina 2 mM (Invitrogen) y 1 x Pen Estrep (Invitrogen)) durante 48 horas.

(ix) Citometría de flujo

Las células deseadas, se lavaron una vez por PBS y se resuspendieron a una densidad de 5-10 M/ml en PBS con 1 qg/ml de PI para la clasificación o análisis por FACS. Durante el análisis de enucleación, las células se tiñeron primero con anticuerpo anti-TER-119 de ratón (eBioscience, 14-5921) y Hoechst (Sigma) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para detectar la expresión superficial o el marcado de la marca myc, marca HA o el marcado con biotina, las células se tiñeron con anticuerpo anti-Myc (Cell signalling, 3739), anticuerpo anti-HA (Thermo Fisher Scientific, NC9843881) o anticuerpo anti-biotina (eBioscience, 12-9895-82), respectivamente, durante 30 minutos a temperatura ambiente.

(x) Infección vírica de células de la médula ósea

Se aisló médula ósea en fémur y tibias de ratones C57BL/6J usando una aguja 23G y se cultivó a densidad de 2x106 células/ml durante 18 horas en DMEM complementado con 15 % de suero de ternero fetal, L-glutamina 2 mM (Invitrogen), 1x Pen/Estrep (Invitrogen), 20 ng/ml de IL-3 (Peprotech), 50 ng/ml de SCF (Peprotech) y 50 ng/ml de IL-6 (Peprotech) en placas de 6 pocillos. Las células se infectaron incubando 4x106 células en 500 ql de medio que contenía retrovirus, 500 ql de DMEM y 5 qg/ml de polibreno y centrifugación de las células a 2500 rpm durante 1,5 horas a temperatura ambiente e incubación adicional en una estufa de incubación con CO2 durante 5 horas. Las células se devolvieron a los medios complementados con IL-3/SCF/IL-6 anteriores y se incubaron adicionalmente durante 16 horas.

(xi) Procedimiento de irradiación y trasplante de hígado fetal de ratón

Se sometieron ratones B6.SJL-Ptprca Pep3b/BoyJ (The Jackson Lab) a irradiación total del cuerpo con 1050 cGy en una cámara de irradiador Gammacell 40 1 día antes del trasplante. Se recogieron las células del hígado fetal de ratón y se prepararon como se ha mencionado anteriormente. Tras la infección retrovírica, las células se cultivaron en medios de mantenimiento eritroide durante 18 horas. Alternativamente, se recogieron las células de la médula ósea del ratón y el retrovirus se transdujo como se ha descrito anteriormente. Entonces se lavaron 2 veces las células infectadas en PBS estéril y se resuspendieron en PBS estéril a 2-5 millones de células/ml. Entonces se inyectaron retrorbitalmente 100 pl de estas células madre y progenitoras de ratón en los ratones letalmente irradiados. A partir de cuatro semanas, se extrajeron glóbulos rojos maduros de los ratones irradiados para el análisis y marcado con sortasa.

(xii) Preparación e inmunofluorescencia en Cytospin

Después de que los glóbulos rojos maduros y los reticulocitos diferenciados in vitro se marcaran con sortasa con biotina, se lavaron dos veces en IX PBS frío. Se centrifugaron 50.000 glóbulos rojos maduros biotinilados marcados con sortasa o reticulocitos diferenciados in vitro no marcados con sortasa sobre portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina durante 5 minutos a 400 rpm (Cytospin 3, Thermo Shandon). Las muestras se secaron al aire, se fijaron en 4 % de paraformaldehído durante 30 minutos a temperatura ambiente y se bloquearon durante 1 hora en tampón de bloqueo (2 % de BSA 2 % de suero de asno en PBS). Entonces se incubaron las células con anticuerpos primarios: anti-biotina conjugada con PE (1:1000, eBioscience, 12-9895-82) y anti-Ter119 conjugado con APC (1:100, eBioscience, 14-5921) en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C, seguido por tres lavados en IX PBS frío. Finalmente, las células se montaron en medio de montaje que contenía DAPI (Prolong Gold Antifade, Invitrogen) para visualizar los núcleos en todos los experimentos de inmunotinción. La visualización se llevó a cabo usando un microscopio confocal de barrido láser Zeiss LSM 700.

(xiii) Transfusión y supervivencia de eRBC

Después de que los RBC maduros se marcaran con sortasa, se lavaron dos veces en IX PBS y se resuspendieron en medio RPMI. Estos RBC marcados con sortasa se recogieron por centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos y se marcaron con CFSE 5 pM en solución salina equilibrada con Hank (HBSS) durante 8 minutos (Life Technologies). Entonces se añadieron equivolúmenes de 10 % de FBS en HBSS para extinguir la reacción. Se lavaron los RBC, se contaron y se resuspendieron en HBSS estéril para inyección. Entonces se inyectaron 2,5 billones de RBC marcados con CFSE (± 300 pl de sangre de ratón) por vía intravenosa en ratones CD451+ receptores. Los RBC normales sirvieron de control. Puesto que solo el 20~50 % de los RBC expresaron hGPA o hKell manipulado, el resto de los RBC fueron normales y sirvieron de control interno monitorizando la señal de CFSE. Una hora después de la transfusión, la primera muestra de sangre (20 pl) se recogió del retrorbital y se marcó como día 0. Las muestras de sangre posteriores con la misma cantidad se recogieron en los días 1, 4, 7, etc., hasta 28. Las muestras de sangre se tiñeron con anticuerpo anti-biotina conjugado con PE (ebioscience), de manera que los eRBC unidos a la biotina tuvieron una fuerte señal de PE durante el análisis de citometría de flujo. Sin embargo, los RBC con hKell-biotina tuvieron una intensidad fluorescente roja muy baja después de la tinción con anticuerpo anti-biotina conjugado con PE. Fue difícil detectarlo en presencia de señal fluorescente verde fuerte de CFSE. Los hKell-RBC se marcaron con sortasa con biotina, y se transfundieron en ratones sin tinción de CFSE. Los hKell-RBC se monitorizaron por su señal de GFP inherente y señal de PE débil de anticuerpos anti-biotina conjugados con PE. Los RBC de control y hGPA-RBC se transfundieron en un total de seis ratones en dos momentos separados. Los hKell-RBC se transfundieron a un total de tres ratones, muriendo uno de ellos de un motivo desconocido.

Resultados

(I) Se expresó la proteína de la membrana de tipo I genéticamente modificada glicoforina A (GPA) humana y se marcó con sortasa sobre la superficie de RBC

(a) Expresión de glicoforina humana (hGPA) marcable con sortasa en RBC

Se insertaron los casetes de expresión de proteínas de fusión 5Gly (SEQ ID NO: 3)-myc-hGYPA y 3Gly-myc-hGYPA en dos vectores lentivíricos EF1 y MSCV (System Biosciences, Inc.), como se muestra en la Figura 10. Ambos vectores llevan GFP como gen indicador. Los vectores lentivíricos resultantes para expresar las proteínas de fusión se transdujeron en células CD34+ humanas al comienzo de Dif I.

La Figura 11 muestra la expresión de las proteínas de fusión en las células CD34+ humanas y los glóbulos rojos obtenidos al final de Dif. I y Dif II como se describe en el Ejemplo 1 anterior. La expresión de la proteína de fusión 5Gly (SEQ ID NO: 3)-myc-hGYPA sobre la superficie de glóbulos rojos transducidos por los vectores EF1 se observó al menos al final de Dif. II.

Se observaron resultados similares en los glóbulos rojos transducidos con los vectores de expresión MSCV. Como se muestra en la Figura 12, la expresión de MSCV-5Gly (SEQ ID NO: 3)-myc-hGYPA sobre la superficie de glóbulos rojos se observó al final de Dif. III.

Los vectores lentivíricos para expresar las proteínas de fusión 5Gly (SEQ ID NO: 3)-myc-hGYPA y 3Gly-myc-hGYPA también se transdujeron en células K562 y se observó la expresión de ambas proteínas de fusión en la superficie de las células K562.

En resumen, la expresión de hGYPA marcable con sortasa se detectó en el 50~70 % de las células al final de Dif I por citometría de flujo y transferencia Western. La expresión de hGYPA siguió siendo constante y duró hasta el final de Dif III.

(b) Conjugado de un agente de interés con la superficie celular de glóbulos rojos en presencia de una sortasa

Para marcar con sortasa hGYPA, se pre-incubaron sortasa A 300 pM de Staphylococcus aureus y biotina-LPRTGG 500 pM (SEQ ID NO: 118) en un tampón de sortasa a 37 °C durante 30 minutos. Entonces se incubaron un millón de glóbulos rojos que expresaban hGYPA marcable con sortasa (5Gly (SEQ ID NO: 3)-myc-hGYPA o 3Gly-myc-hGYPA) con la mezcla de sortasa-sustrato a 37 °C durante 1 hora. Las células se lavaron con PBS durante 3~4 veces antes de la detección por citometría de flujo o transferencia Western de la conjugación de biotina. La eficiencia del marcado es normalmente del 80-100 %.

Como se muestra en la Figura 13, los resultados de la transferencia Western indican expresión de 5Gly (SEQ ID NO: 3)-myc-hGYPA en glóbulos rojos y la conjugación de biotina con hGYPA. El análisis de FACS indica que la biotina se conjugó con la superficie de glóbulos rojos el día 8 de Dif. III. Figuras 14 y 15. Este resultado muestra que la superficie de glóbulos rojos enucleados maduros se puede modificar por una reacción catalizada por sortasa.

Similarmente, hGYPA marcable con sortasa expresad en células K562 se modificó satisfactoriamente por biotina en presencia de una sortasa.

En otro experimento, un péptido conjugado con PE que comprende el motivo LPXTG (SEQ ID NO: 1) se incluyó con sortasa A durante 45 minutos a 37 °C. La mezcla se incubó entonces con eritrocitos que expresaban proteína de la superficie marcable con sortasa 3Gly-GYPA o 5Gly (SEQ ID NO: 3)-GYPA durante 30 minutos a 37 °C. Las células se sometieron entonces a análisis de FACS. Los resultados así obtenidos indican que el péptido conjugado con PE se conjugó con tanto 3Gly-GYPA como 5Gly (SEQ ID NO: 3)-GYPA sobre la superficie de los eritrocitos.

(c) hGPA genéticamente modificada se expresó como marcada con sortasa en RBC murinos

La extensión del extremo N de GPA (GPA) con restos de glicina fue la modificación mínima necesaria para convertir la GPA en un sustrato de sortasa adecuado. En la versión modificada, se retuvo la secuencia señal del extremo N, seguido por restos de glicina y una marca de epítope myc. La escisión del péptido señal daría (Gly)n-marca myc-GPA. La incubación de células que llevan la GPA modificada con sortasa A de Staphylococcus aureus y una sonda basada en LPETG (SEQ ID NO: 44) conduce a la conjugación de esta sonda con el extremo N de GPA (Fig. 16A).

Se prepararon cuatro construcciones retrovíricas para GPA, que codifican productos extendidos en su extremo N con cualquiera de los 3 o 5 restos de glicina aminoterminales (SEQ ID NO: 3), usando cualquiera de GPA de ratón o humana y el sistema de diferenciación eritroide in vitro (Zhang et al., 203, Blood 102(12):3938-3946) como con Kell a continuación, para probar la expresión de GPA y la modificación por sortasa. Tras la transducción retrovírica de progenitores, ninguna de las cuatro construcciones de GPA afectó el proceso de diferenciación, ya que en cada caso los presentes inventores obtuvieron números normales de eritroblastos Ter119 positivos enucleados que expresaron la GPA modificada sobre su superficie (Fig. 17 y Fig. 18, A,B).

Estas construcciones de GPA se confirmaron como modificables por sortasa expresándolas en células HEK293T, seguido por marcado con sortasa con una sonda que contiene biotina (Fig. 18C). Aunque se observaron altos niveles de expresión de las construcciones de ratón, no se detectó biotinilación de los productos codificados. A diferencia, se marcó fácilmente con sortasa 3G-myc-GPA (3G-myc-hGPA) humana y se usó para los experimentos posteriores. La expresión de 3G-myc-hGPA en progenitores eritroides dio - 36 % de eritroblastos nucleados y - 67 % de reticulocitos enucleados que llevan la GPA modificada sobre la superficie tras la diferenciación in vitro. Casi toda la GPA modificada en tanto las células nucleadas como enucleadas se marcó con sortasa con una sonda que contenía biotina, como se monitorizó por citometría de flujo, inmunotransferencia e inmunofluorescencia (Fig. 19).

Al igual que con Kell (véanse las descripciones a continuación), se infectaron células murinas de linaje de hígado fetalnegativas con el vector retrovírico que expresa 3G-myc-hGPA y se trasplantaron en ratones letalmente irradiados (Fig. 20). Después de 4 semanas, estos ratones trasplantados contuvieron 20-50 % de RBC maduros con forma discoide Ter119-positivos que expresaban la GPA modificada (Fig. 16B; n= 10), que puede ser marcada con sortasa con una sonda que contiene biotina con la eficiencia de 85 % /- 5 % como se ha determinado por citometría de flujo (Fig. 16C). La reducción observada en la movilidad en gel de 3G-myc-hGPA tras el marcado con sortasa con biotina se puede usar como una lectura de la eficiencia de reacción e indica que la mayor parte de la GPA se modifica por sortasa (Fig. 16D). La microscopía de inmunofluorescencia (Fig. 16E) confirmó que todos estos glóbulos rojos modificados tenían de hecho biotina conjugada con su superficie. Estos resultados muestran que la GPA marcable con sortasa fue retenida sobre la superficie de RBC maduros y se marcó eficientemente en una reacción catalizada por sortasa.

(d) La proteína de la membrana de tipo II Kell se expresó y se marcó son sortasa sobre la superficie de RBC

Se transfectaron células HEK293T con vectores de expresión para producir proteínas de fusión de superficie hsCD71-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA y hsKell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA por tecnología recombinante rutinaria. Se establecieron estirpes celulares estables que expresaban las proteínas de fusión. Las células se incubaron con sortasa 200 gM y GGG-biotina 0,5 mM o 1 mM y se sometieron a análisis de transferencia Western. Los resultados indican que la biotina se conjugó satisfactoriamente con las proteínas de fusión.

La extensión del extremo C de Kell con el motivo de reconocimiento de sortasa LPXTG (SEQ ID NO: 1) fue la modificación mínima requerida para convertirla en modificable con sortasa. Se construyó un construcción retrovírica que codificaba Kell humana, modificada en el extremo C por extensión con LPETG (SEQ ID NO: 44), como se describe en el presente documento, seguido por una marca de epítope de hemaglutinina (HA). Una reacción de sortasa realizada en Kell así modificada como se describe en el presente documento usando una sonda basada en glicina conduce a la conjugación de la sonda con el extremo C de Kell, con pérdida concomitante de la marca HA (Fig. 21 A).

Para probar la expresión y modificación de Kell por sortasa, se empleó un sistema de diferenciación eritroide in vitro descrito previamente. Zhang et al., 2003. El cultivo de progenitores derivados de hígado fetal murino in vitro durante ~ 48 horas permite ~ 4 divisiones celulares terminales y la formación de eritroblastos que contienen hemoglobina, aproximadamente 30-50 % de los cuales sufren enucleación dando reticulocitos. La expresión de hKell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA no inhibió el proceso de diferenciación in vitro. Casi la mitad de tanto los eritroblastos nucleados como los reticulocitos enucleados presentó Kell modificada en la superficie celular, y una gran fracción de estos podrían ser marcados con sortasa con una sonda que contiene biotina, como se muestra por citometría de flujo, inmunotransferencia e inmunofluorescencia (Fig. 22).

Los reticulocitos obtenidos por diferenciación in vitro deben someterse no solo a expulsión de los orgánulos restantes, sino que también deben ejecutar las reorganizaciones de la membrana que conducen a la forma de disco bicóncavo de los RBC maduros. Para garantizar que esta etapa de maduración no conduzca a una pérdida de Kell modificada, se infectaron células murinas de linaje de hígado fetal-negativo con vectores retrovíricos que expresaban hKell-LPETG manipulado (SEQ ID NO: 44)-HA y se trasplantaron en ratones letalmente irradiados (Fig. 20). Se recogieron glóbulos rojos maduros de ratones trasplantados después de 4 semanas y se analizaron para la presencia de Kell modificable con sortasa sobre su superficie. Se encontró rutinariamente que ~ 20-50 % de los RBC maduros en estos ratones quiméricos contuvieron Kell humana marcable con sortasa sobre su superficie (Fig.21 B) y que estas células podrían ser covalentemente modificadas con biotina usando sortasa (Fig. 21C) con eficiencia del 81 % /- 28 % como se ha determinado por citometría de flujo. Se observó un alto nivel de conjugación de la sonda de biotina sobre el extremo C de Kell tras el marcado con sortasa, como se evidencia por la pérdida completa de la marca HA sobre la inmunotransferencia (Fig. 21D). La inmunomicroscopía de fluorescencia (Fig. 21E) confirma la presencia de biotina conjugada con la superficie de glóbulos rojos. Estos datos demuestran que Kell, extendida en su extremo C con el motivo de reconocimiento de sortasa, no inhibe la diferenciación eritroide, es retenido sobre la membrana plasmática de glóbulos rojos maduros y se pueden marcar en una reacción de marcado con sortasa.

(e) Marcado doble de RBC

Usando sortasas con distinta especificidad por sustrato, es posible combinar las estrategias de marcado aminoterminal y carboxiterminal (Antos et al., 2009, J. Ameri. Chem. Soc., 131 (31 ):10800-10801) para generar RBC con múltiples marcas. A diferencia de la sortasa A de Staphylococcus aureus, la sortasa A derivada de Streptococcus pyogenes reconoce motivos LPXTA (SEQ ID NO: 2) y acepta sondas de oligoalanina como nucleófilos. Por lo tanto, las reacciones de sortasa de ambas enzimas se pueden realizar como reacciones ortogonales.

Se infectaron células HEK293T con 2 construcciones: AAA-myc-hGPA y hKell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA. Las células se incubaron secuencialmente con 2 tipos diferentes de sortasa A en presencia de cualquiera de biotina-LPETA (SEQ ID NO: 119; para el marcado con sortasa de GPA por sortasa de S. pyogenes) o GGG-TAMRA (para el marcado con sortasa de Kell por sortasa de S. aureus), dando lugar a células HEK293T que contenían tanto la GPA biotinilada como TAMRA-Kell modificado (Fig. 16F). Además, se generaron RBC maduros con expresión superficial celular de tanto 3A-myc-hGPA como hKell-LPETG (SEQ ID NO: 44)-HA. A pesar del hecho de que los niveles de expresión de hKell y hGPA sobre RBC individuales fueron algo variables, la hGPA fue satisfactoriamente marcada con sortasa, y hKell con Alexa-647 sobre la superficie de RBC (Fig. 23). Por lo tanto, se puede usar el marcado doble para unir dos restos funcionales diferentes sobre la superficie de RBC.

(f) Supervivencia de RBC manipulados en circulación

Para evaluar si el proceso de marcado con sortasa de RBC, que incluye incubación con sortasa, centrifugación y lavado, afecta su supervivencia in vivo, se marcaron RBC naturales y RBC naturales que se habían sometido a un marcado carboxiterminal simulado con reacción con sortasa - con o sin sortasa (no conjugación de una sonda) - con CFSE, un colorante fluorescente que tiñe establemente el citosol de células vivas. Los RBC se transfundieron entonces a ratones receptores normales; se evaluó periódicamente la supervivencia celular en circulación usando fluorescencia de CFSE. No se observó diferencia en la supervivencia in vivo de RBC entre los grupos experimentales (Fig. 24A), que indica que el procedimiento de marcado con sortasa no provoca un daño significativo a las células, que conduciría a su retirada prematura.

Ejemplo 3: Conjugación de un anticuerpo con glóbulos rojos manipulados para el direccionamiento específico de célula

Una posible aplicación de los RBC modificados es proporcionarles un resto de direccionamiento que permitiera su administración (y carga unida o incorporada) a tejidos o tipos de células particulares. Dicho direccionamiento se puede llevar a cabo por la instalación de proteínas u otras entidades, tales como ligandos para receptores específicos que pueden participar en el reconocimiento específico de la diana prevista.

Para probar la conjugación de una proteína funcional sobre la superficie de RBC, se usó un anticuerpo de un solo dominio derivado de alpaca marcable con sortasa. Este anticuerpo es específico para moléculas murinas de MHC de clase II, VHH7-LPETG (SEQ ID NO: 44), y se unió covalentemente a glóbulos rojos con 3G-myc-hGPA sobre su superficie. Como se muestra por la desplazamiento en la movilidad del gel en 3G-myc-hGPA, la reacción marcada con sortasa es estequiométrica (Fig. 25A).

Se realizó un ensayo de unión de linfocitos B - glóbulos rojos del siguiente modo. Los linfocitos B se aislaron de o ratones C57BL/6 naturales o ratones inactivados para la clase II de MHC usando Dynabeads Mouse CD43 (linfocitos B intactos) (Life Technologies) según recomendaciones del fabricante. Se incubaron las células de 1-1,5 bazos con 5 pg de anticuerpo anti-CD19 murino marcado con biotina (BD Pharmigen) durante 30 minutos sobre hielo y se lavaron una vez con 500 pl de PBS frío en hielo. Las células se resuspendieron en 500 pl de PBS junto con 70 pl de estreptavidina T1 Dynabeads MyOne magnética prelavada (Life Technologies), se incubaron en una plataforma giratoria durante 1 hora a 4 °C y se lavaron con 500 pl de PBS frío en hielo. Las células resuspensas (500 pl de PBS) se incubaron adicionalmente con ~ 2x107 glóbulos rojos que expresaban 3G-myc-hGPA y se marcaron con sortasa con VHH7 durante 1 hora a 4 °C, se lavaron 4 veces con 1 ml de PBS frío en hielo y finalmente se incubaron con tampón SDS de muestra y se hirvieron para el posterior análisis de SDS-PAGE.

La incubación de estos RBC modificados con linfocitos B de MHC de clase II-positivos inmovilizados sobre perlas da como resultado la unión de los RBC a linfocitos B. La unión específica se dedujo de la presencia de hemoglobina, que se copurifica con linfocitos B después de lavar. Ni la incubación de linfocitos B naturales con glóbulos rojos sin modificar ni la incubación de glóbulos rojos modificados con linfocitos B derivados de animales inactivados en MHC de clase II condujo a la unión de los dos tipos de células (Fig. 25fí, C).

Ejemplo 4: Marcado con sortasa y modificación citosólica de glóbulos rojos humanos terminalmente diferenciados

Para extender la utilidad del método descrito aquí, se investigó si la modificación de progenitores eritroides, así como el posterior marcado de la superficie celular mediado por sortasa, también es factible para células humanas.

Se manipularon genéticamente glóbulos rojos humanos terminalmente diferenciados del siguiente modo. Los plásmidos usados para manipular los RBC humanos diferenciados in vitro se crearon clonando la GPA humana que contiene GGG en el vector lentivírico VIH/MSCV con la adición de GFP potenciada en su extremo C para preparar 3G-myc-hGPA-EGFP. El lentivirus se produjo por cotransfección de células 293T con plásmidos de la envoltura de pVSV-G y vectores de encapsidación pDelta 8.9. Las células madre de sangre periférica de CD34+ movilizadas con G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos) se diferenciaron in vitro en 18 días en reticulocitos que contenían hemoglobina usando el método que se describió previamente (Zaitsev et al., 2010, Blood 115(25):5241-5248). En el día 3 de cultivo, las células en diferenciación se infectaron incubando 5x105 células en 2 ml de medio que contenían lentivirus en presencia de polibreno, y se centrifugaron a 2500 rpm durante 1,5 horas a temperatura ambiente, seguido por incubación adicional en una estufa de incubación de CO2 durante la noche. El día después, las células infectadas se lavaron dos veces y se pusieron en medio de diferenciación nuevo. En el día 18, los reticulocitos enucleados se recogieron y se sometieron a marcado con sortasa con una sonda que contenía biotina como se ha descrito anteriormente. Los análisis de los reticulocitos humanos manipulados resultantes se llevaron a cabo por medio de citometría de flujo usando los siguientes anticuerpos: anti-biotina conjugado con PE (1:1000, eBioscience, 12-9895 82), Hoechst (Sigma) y conjugado con APC (1:100, eBioscience, 17-0087-42).

Para los experimentos descritos en este ejemplo, un sistema de diferenciación eritroide humano in vitro como se describe previamente. Véase, por ejemplo, Hu et al., 2013. Las células madre de sangre periférica de CD34+ movilizadas con G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos) se diferenciaron in vitro en 18 días en reticulocitos que contenían hemoglobina, con una eficiencia de enucleación de ~50 %. Se construyó un vector lentivírico que codificaba una versión de 3G-myc-hGPA fusionada con GFP potenciada en su extremo C (3G-myc-GPA-GFP). Esto proporciona un ejemplo de un dominio de proteína citoplásmicamente expresada diseñada para ser retenida en RBC maduros por su fusión genética con GPA. Tanto el vector vacío (de control) como el vector 3G-mychGPA-GFP codificó un resto de GFP 3' de la secuencia IRES (3G-myc-hGPA-GFP-IRES-GFP). Cuando las células se transducen satisfactoriamente con 3G-myc-hGPA-GFP, que contiene una GFP potenciada adicional unida al dominio citoplásmico de GPA, estas células expresarán un nivel significativamente mayor (~2x) de señal de GFP, como se indica por citometría de flujo (Fig. 26A, primer panel). Puesto que los pesos moleculares de GFP y hGPA son 32,7 kDa y 37 kDa respectivamente, la movilidad de 3G-myc-hGPA-GFP en SDS-PAGE también indica que las proteínas GPA modificadas se expresan en formas monoméricas y diméricas (Fig. 26B). La transducción vírica de células CD34+ humanas con 3G-myc-hGPA-GFP no afectó su diferenciación, ya que se formaron números similares de reticulocitos enucleados (50-60 %) en cultivos infectados con un vector vacío (de control) (Fig. 26A, panel central).

Todos los reticulocitos enucleados que contienen la GPA modificada en la superficie podrían ser marcados con sortasa con una sonda que contiene biotina, como se monitorizó por citometría de flujo (Fig. 26A). Además, toda la 3G-mychGPA-GFP presente sobre la superficie del reticulocito se modificó por marcado con sortasa de biotina, como se demostró por el desplazamiento en la movilidad del gel de 3G-mychGPA-GFP (Fig. 26B). Este experimento establece, por lo tanto, la capacidad para equipar los RBC humanos maduros con una proteína de interés citoplásmicamente dispuesta, mientras que se retiene la capacidad para dirigir selectivamente los RBC a una diana prevista por marcado con sortasa de la GPA modificada con un resto de direccionamiento interés.

Ejemplo 5: Creación de ratones mKell-LPETG (SEQ ID NO: 44) usando la tecnología CRISPR/Cas9

Se diseñó una secuencia de ARNgu para la rotura de la cadena doble dependiente de CRISPR/Cas9 para estimular la reparación dirigida por homología (HDR) en el último exón del locus mKel como en la Tabla 5, y el ADN de oligonucleótidos como molde para introducir LPEt G (SEQ ID NO: 44) en el extremo C de mKel se diseñó como en la Tabla 6.

Tabla 5

Tabla 6

Se exploraron los posibles efectos inespecíficos de la secuencia diana usando BLAST de nucleótidos de Mus musculus de NCBI. Se preparó ARNm de Cas9 como se describe en Wang et al., 2013. Se añadieron el promotor T7 y la secuencia codificante de ARNgu que se dirige a mKel-CT sin motivo PAM justo delante de la cola genérica de ARNgu (la parte de la región de horquilla con respecto al motivo terminal) por amplificación por PCR usando el vector pX330 como molde y los cebadores, mKel T7-ARNgu Fw y ARNgu genérico Rv, como se muestra en la Tabla 7 a continuación.

Tabla 7

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de conjugación de un péptido de interés con la superficie de un glóbulo rojo genéticamente manipulado, comprendiendo el método:

2. Un método de conjugación de un péptido de interés con la superficie de un glóbulo rojo genéticamente manipulado, comprendiendo el método:

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el glóbulo rojo genéticamente manipulado es un glóbulo rojo enucleado genéticamente manipulado.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde la sortasa es una sortasa A.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde el motivo de reconocimiento de sortasa es LPXTG (SEQ ID NO: 1), en la que X es cualquier resto de aminoácido.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-5, en donde la proteína de fusión superficial marcable con sortasa comprende la proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo I, y en donde la proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo I es glicoforina A (GPA).

7. El método de la reivindicación 6, en donde el péptido es una oligoglicina que consiste en 1-5 restos de glicina.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en donde la proteína de fusión superficial marcable con sortasa comprende la proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo II, y en donde la proteína transmembranaria de glóbulo rojo de tipo II es Kell o CD71.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el péptido de interés es un anticuerpo o un fragmento del mismo, preferentemente en donde el anticuerpo es un anticuerpo de un solo dominio.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, en donde el péptido de interés está conjugado con una marca detectable, un agente quimioterapéutico, un lípido, un hidrato de carbono, un ácido nucleico, un agente de unión, una unidad de conexión de química click o una molécula pequeña.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el péptido de interés es una proteína citoplásmica, un agente de diagnóstico o un agente terapéutico.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el péptido de interés comprende un fármaco de proteína, un antígeno de vacuna, una proteína fluorescente, estreptavidina, biotina, una enzima, un péptido capaz de dirigirse a una célula, o una citocina, preferentemente un péptido capaz de dirigirse a una célula enferma.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, en donde el péptido de interés comprende una citocina, y la citocina comprende un interferón, una interleucina, un factor estimulante de colonias, un factor inhibidor de la leucemia u oncostatina M.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el péptido de interés comprende una interleucina, y la interleucina comprende IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13 o IL-15.