ES2901468T3 - Promotores para mejorar la expresión en poxvirus - Google Patents

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Abstract

Un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos el 90% con la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO:72 o SEQ ID NO:73.

Description

DESCRIPCIÓN
Promotores para mejorar la expresión en poxvirus
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a uno o más promotores novedosos de la expresión de proteínas en poxvirus, especialmente poxvirus aviares tales como poxvirus de aves de corral y poxvirus de canario. La invención se refiere además a polinucleótidos que comprenden dicho promotor, en particular, polinucleótidos que comprenden dicho promotor y un ácido nucleico que debe expresarse; y vectores que comprenden los mismos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Poxvirus recombinantes se han usado como vacunas para organismos infecciosos y, más recientemente, para tumores. Mastrangelo et al, J Clin Invest. 2000; 105(8): 1031-1034. Dos de estos grupos de poxvirus, poxvirus aviar y ortopoxvirus, han mostrado ser efectivos en la lucha contra tumores y se han implicado con tratamientos contra el cáncer potenciales. id,
Se ha mostrado que una especie de poxvirus aviar a modo de ejemplo, la viruela aviar, es un vehículo seguro para administraciones humanas ya que el virus de la viruela aviar entra en las células de mamífero y expresa proteínas, pero las replica de manera abortiva. Skinner et al, Expert Rev Vaccines. Febrero de 2005;4(1):63-76. Adicionalmente, el uso de virus de la viruela aviar como vehículo para la expresión está evaluándose en numerosos ensayos clínicos de vacunas frente al cáncer, la malaria, la tuberculosis, el SIDA y el ÉBOLA. id,
Se ha usado poxvirus recombinantes, tal como la viruela aviar, para expresar una amplia gama de genes insertados, incluyendo varios genes asociados a enfermedades infecciosas y tumores tales como p97, HER-2/neu, p53 y ETA (Paoletti, et al,, 1993). Un antígeno tumoral a modo de ejemplo que está estudiándose recientemente es Brachyury (también conocido como “T”).
Brachyury se identificó en ratones como un mutante de cola corta dominante que es también un letal recesivo; los embriones T/T homocigóticos mueren a mitad de la gestación debido a un fallo de la formación de mesodermo posterior (Chesley, J. Exp. Zool., 70: 429-459, 1935). El gen Brachyury murino se ha clonado (Herrmann et al,, Nature (Lond.), 343: 617-622, 1990), así como los homólogos en otras especies, tales como seres humanos. La expresión del homólogo humano del Brachyury de ratón se detectó mediante RT-PCR en el resto de notocorda, el núcleo pulposo, de abortos humanos a las 14-15 semanas de gestación (Edwards et al,, Genome Res., 6: 226-233, 1996).
Brachyury ha demostrado en general ser un marcador valioso para el reconocimiento de diferenciación mesodérmica (Herrmann et al,, Trends Genet., 10: 280-286, 1994). Por ejemplo, aparte de la expresión en los propios embriones, se ha notificado que Brachyury se activa durante la diferenciación de ciertas líneas celulares EC y ES murinas que se diferencian a lo largo de linajes mesodérmicos ln vltro (véase, por ejemplo, Bain et al,, Biochem. Biophys. Res. Commun., 223: 691-694, 1996). En seres humanos, se ha mostrado que Brachyury se expresa en teratocarcinomas (Gokhele et al,, Cell Growth and Differentiation 11:157-62, 2000), cordomas (Vujovic et al,, J. Pathol. 2: 157-65, 2006) y hemangioblastomas (Glasker et al,, Cancer Res. 66: 4167-4172, 2006).
Más recientemente, se ha descrito que los poxvirus que expresan Brachyury pueden ser efectivos como agente inmunoterapéutico activo frente a tumores (véase, documento WO 2014/043535).
Hay claramente una necesidad médica sustancial no cubierta de mejorar los tratamientos de enfermedades infecciosas y del cáncer, incluyendo inmunoterapias activas y vacunas. Basándose en lo anterior, existe una necesidad en la técnica de mejorar la expresión de antígenos, como Brachyury, usados en inmunoterapias activas. La presente invención satisface esta necesidad.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona uno o más promotores, ácidos nucleicos, casetes de expresión, péptidos recombinantes y poxvirus recombinantes asociados con mejoras en la expresión de secuencias codificantes y antígenos incorporados como parte de poxvirus.
En un aspecto de la invención, hay un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos el 90% con la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO:72 o SEQ ID NO:73.
En aspectos adicionales de la presente invención, el casete de expresión puede incorporarse como parte de un vector tal como un virus o plásmido, para la expresión mejorada de la secuencia codificante en el mismo. Preferiblemente, el casete de expresión es parte de un poxvirus, tal como, pero sin limitarse a, ortopoxvirus y poxvirus aviar. Más preferiblemente, el casete de expresión es un poxvirus aviar tal como poxvirus de aves de corral.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 ilustra la expresión de la proteína Brachyury en células dendríticas humanas (CD) infectadas con el virus no recombinante FPV-Wt o los virus recombinantes FPV-mBN343A, FPV-mBN344A o FPV-mBN345A. Se realizó un análisis de inmunotransferencia Western usando anticuerpo anti-Brachyury monoclonal de conejo tal como se detalla en el ejemplo 1.
La Figura 2 ilustra la expresión de la proteína Brachyury en células dendríticas humanas (CD) infectadas con los virus no recombinantes Mv A-WT o FPV-Wt o los virus recombinantes MVA-Brachyury-TRICOM, FPV-mBN249B, FPV-mBN281A clon 32, FPV-mBN281A clon 35, FPV-mBN343A, FPV-mBN344A, FPV-mBN345A, FPV-mBN354A o FPV-mBN355A. Se realizó un análisis de inmunotransferencia Western usando anticuerpo anti-Brachyury monoclonal de conejo tal como se detalla en el ejemplo 2.
La Figura 3 representa la expresión relativa de proteína Brachyury en comparación con GAPDH del análisis de inmunotransferencia Western de células dendríticas humanas (CD) infectadas con los virus no recombinantes MVA-WT o FPV-WT o los virus recombinantes MVA-Brachyury-TRICOM, FPV-mBN249B, FPV-mBN281A clon 32, FPV-mBN281A clon 35, FPV-mBN343A, FPV-mBN344A, FPV-mBN345A, FPV-mBN354A o FPV-mBN355A, tal como se detalla en el ejemplo 2.
La Figura 4 ilustra la expresión de proteínas Brachyury y TRICOM en células CMMT (una línea celular de tumor mamario de mono Resus) infectadas con los virus recombinantes MVA-Brachyury-TRICOM, FPV-mBN249B, FPV-mBN343A o FPV-mBN345A evaluada mediante citometría de flujo usando anticuerpos etiquetados de manera fluorescente específicos para cada proteína, tal como se describe en el ejemplo 3.
La Figura 5 representa la mediana de niveles de expresión de proteína Brachyury en células CMMT (una línea celular de tumor mamario de mono Resus) infectadas con los virus recombinantes MVA-Brachyury-TRICOM, FPV-mBN249B, FPV-mBN343A o FPV-mBN345A evaluada mediante citometría de flujo, tal como se describe en el ejemplo 3.
La Figura 6 representa expresión de proteínas Brachyury y TRICOM en células CMMT (una línea celular de tumor mamario de mono Resus) infectadas con un virus recombinante FPV-mBN345B evaluada mediante citometría de flujo, tal como se describe en el ejemplo 4.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención se basa en la determinación sorprendente de que el casete de expresión tal como se expone en las reivindicaciones mejora la expresión del antígeno tumoral Brachyury. Como se muestra en las Figuras 1-6 y se describe en más detalle en el presente documento, la expresión de antígeno Brachyury se mejora cuando se usan promotores de la presente invención. La expresión se mejora adicionalmente cuando los promotores y el antígeno Brachyury se usan como parte de un poxvirus recombinante.
En al menos un aspecto, las diversas realizaciones de la presente divulgación se crearon como resultado de niveles de expresión insuficientes de proteína Brachyury usando promotores Vaccinia conocidos, tales como PrS y virus Vaccinia 40k (VV-40K). Al intentar mejorar los niveles de expresión de Brachyury, los presentes inventores analizaron diversos promotores Vaccinia y proteínas asociadas (por ejemplo, VV-40k, 13, etc.) y cualquier posible homólogo en FPV. Los inventores se dieron cuenta de que algunas secuencias homólogas de FPV se descubrieron previamente. Véase, por ejemplo, Zantinge, J Gen Virol. Abril de 1996;77 (Punto 4):603-14 y el gen FPV 088 en la secuencia de referencia del NCBI: NP_039051.1, Afonso,C.L et al., J. Virol. 74 (8), 3815-3831 (2000).
En un intento inicial por mejorar la expresión de Brachyury, los inventores construyeron con Brachyury una posible región promotora del gen FPV 088 en la secuencia de referencia del NCBI: NP_039051.1 y la sometieron a prueba dando resultados no deseados (véanse, por ejemplo, las Figuras 1 y 2 en mBN344A) de promotor. Los inventores crearon un promotor posterior con una adición de nucleótidos del ORF del gen FPV 088, que de manera similar dio resultados no deseados (véanse, por ejemplo, las Figuras 1 y 2 en mBN354A). Los presentes inventores crearon constructos adicionales con nucleótidos aún adicionales del ORF del gen FPV 088, que, tal como se describe e ilustra en el presente documento, mejoran la expresión del antígeno tumoral Brachyury.
Definiciones
Debe indicarse que, tal como se usan en el presente documento, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un epítopo” incluye uno o más epítopos y la referencia a “el método” incluye la referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos habituales en la técnica que podrían modificarse o sustituirse por los métodos descritos en el presente documento.
A menos que se indique lo contrario, el término “al menos” antes de una serie de elementos debe entenderse como que hace referencia a cada elemento en la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en el presente documento. Se pretende que tales equivalentes estén abarcados por la presente invención.
Por toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, implica la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de número entero o etapa. Cuando se usa en el presente documento, el término “que comprende” puede sustituirse por el término “que contiene” o “que incluye” o en ocasiones cuando se usa en el presente documento con el término “que tiene”. Cualquiera de los términos mencionados anteriormente (que comprende, que contiene, que incluye, que tiene), aunque es menos preferido, siempre que se use en el presente documento en el contexto de un aspecto o realización de la presente invención puede sustituirse por el término “que consiste en”. Cuando se usa en el presente documento, “que consiste en” excluye cualquier elemento, etapa o componente no especificado en el elemento reivindicado. Cuando se usa en el presente documento, “que consiste esencialmente en” no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación.
Tal como se usa en el presente documento, el término conjuntivo “y/o” entre múltiples elementos citados se entiende como que abarca opciones tanto individuales como combinadas. Por ejemplo, cuando dos elementos están unidos por “y/o”, una primera opción se refiere a la aplicabilidad del primer elemento sin el segundo. Una segunda opción se refiere a la aplicabilidad del segundo elemento sin el primero. Una tercera opción se refiere a la aplicabilidad del primer y del segundo elemento juntos. Se entiende que cualquiera de estas opciones se encuentra dentro del significado, y por tanto satisface el requisito del término “y/o” tal como se usa en el presente documento. También se entiende que la aplicabilidad concurrente de más de una de las opciones se encuentra dentro del significado, y por tanto satisface el requisito del término “y/o.”
Tal como se usa en el presente documento, el término “promotor” designa una región reguladora de ácido nucleico, habitualmente ADN, ubicada en el sentido de 5’ de la secuencia de un ácido nucleico que debe expresarse, que contiene elementos de secuencia de ADN específicos, que se reconocen y se unen, por ejemplo, por factores de transcripción de proteína y polimerasas responsables de sintetizar el ARN de la región codificante del gen que está promoviéndose. Como los promotores están normalmente de manera inmediatamente adyacente al gen en cuestión, las posiciones en el promotor se designan en relación con el sitio de iniciación transcripcional, donde empieza la transcripción de ADN para un gen particular (es decir, las posiciones en el sentido de 5’ son números negativos que se cuentan hacia atrás desde -1, por ejemplo, -100 es una posición 100 pares de bases en el sentido de 5’). Por tanto, la secuencia promotora puede comprender nucleótidos hasta la posición -1. Sin embargo, los nucleótidos desde la posición 1 no forman parte del promotor, es decir a este respecto debe indicarse que el codón de iniciación de la traducción (ATG o AUG) no forma parte del promotor.
Tal como se usa en el presente documento, el término “que mejora” o “mejorado” cuando se usa con respecto a niveles de expresión de una secuencia codificante, ácido nucleico, proteína y/o antígeno, se refiere a un aumento en la expresión de una secuencia codificante, ácido nucleico, proteína y/o antígeno cuando se asocia con y/o como parte de uno o más de los promotores, casetes de expresión, ácidos nucleicos, proteínas y/o vectores de la presente invención en relación con los niveles de expresión de una secuencia codificante, ácidos nucleicos, proteína y/o antígeno cuando se asocia con y/o como parte de uno o más de los promotores conocidos en la técnica, tal como PrS o VV-40k.
Tal como se usa en el presente documento, una secuencia de nucleótidos que tiene “esencialmente las mismas características de expresión” que la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOs: 1-10 y 77 presentará al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, incluso más preferiblemente al menos el 90% de la actividad promotora de SEQ ID NOs: 1-10 y 77, tal como se mide mediante la cantidad de proteína recombinante producida. Si una secuencia promotora en cuestión tiene o no “esencialmente las mismas características de expresión” que cualquiera de SEQ ID NOs: 1-10 y 77 puede determinarse fácilmente por un experto habitual en la técnica usando los métodos expuestos en los ejemplos 1-4 de la presente solicitud. Los promotores según la presente invención son preferiblemente activos como promotores de poxvirus, preferiblemente poxvirus aviar, o activos como promotores en células infectadas con poxvirus, preferiblemente células infectadas con poxvirus aviar. El poxvirus aviar es preferiblemente virus de la viruela aviar. “Activo como promotor de poxvirus” significa que el promotor es capaz de dirigir la expresión de un gen al que está ligado operativamente en un poxvirus tras la infección de células con dicho virus. Las células son preferiblemente células que permiten la expresión tardía y/o temprana y/o temprana/tardía del poxvirus. “Un promotor activo en células infectadas con poxvirus” incluye también la situación en la que el promotor no forma parte de un genoma de poxvirus, por ejemplo, parte de un plásmido o polinucleótido lineal o un genoma viral no de poxvirus; en una situación de este tipo el promotor según la presente invención es activo si la célula que comprende el promotor también comprende un genoma de poxvirus, por ejemplo, si la célula está infectada con un poxvirus. En estas circunstancias, la ARN polimerasa viral reconoce el promotor según la presente invención y la expresión del gen/secuencia codificante que está ligada al promotor está activada.
Tal como se usa en el presente documento, el término “derivada del ácido nucleico expuesto en SEQ ID NOs: 1-10 y 77” significa que la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOs: 1-10 y 77 se toma como base para efectuar las modificaciones de nucleótido especificadas, por ejemplo, al menos una adición, deleción, sustitución y/o inversión de nucleótido. El término “derivada” incluye la posibilidad, por ejemplo, de modificar realmente la secuencia física que corresponde a SEQ ID NOs: 1-10 y 77 mediante métodos conocidos, por ejemplo, PCR propensa a error. El término “derivada” incluye adicionalmente la posibilidad de realizar modificaciones en la secuencia de SEQ ID NOs: 1-10 y 77 in síIíco, y entonces sintetizar la secuencia así determinada como ácido nucleico físico. Por ejemplo, el término “derivada” abarca la posibilidad de usar cualquier programa informático conocido para el análisis de secuencias de ácido nucleico con respecto a, por ejemplo, la estabilidad de hibridación y la posibilidad de cualquier estructura de ácido nucleico secundaria de modificar la secuencia de partida de SEQ ID NOs: 1-10, y 77. Preferiblemente, no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos se han añadido, delecionado, sustituido y/o invertido con respecto a los ácidos nucleicos de SEQ ID NOs: 1-10 y 77. Además, la adición, inserción o deleción de al menos un nucleótido no debería dar como resultado un codón de iniciación del ácido nucleico que debe expresarse.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “expresado”, “expresar”, “expresión” y similares designan la transcripción sola así como tanto la transcripción como la traducción de una secuencia de interés. Por tanto, al hacer referencia a la expresión de un ácido nucleico presente en la forma de ADN, el producto que resulta de esta expresión puede ser o bien ARN (que resulta de la transcripción sola de la secuencia que debe expresarse) o bien una secuencia de polipéptido (que resulta tanto de la transcripción como de la traducción de la secuencia que debe expresarse). Por tanto, el término “expresión” también incluye la posibilidad de que tanto el ARN como el producto polipeptídico resulten de dicha expresión y permanezcan juntos en el mismo medio compartido. Por ejemplo, este es el caso cuando el ARNm persiste tras su traducción al producto polipeptídico.
Tal como se usa en el presente documento, el término “casete de expresión” se define como parte de un vector o virus recombinante usado normalmente para la clonación y/o transformación. Un casete de expresión está compuesto normalmente por a) una o más secuencias codificantes (por ejemplo, marco de lectura abierto (ORF), genes, ácidos nucleicos que codifican para una proteína y/o antígeno), y b) secuencias que controlan la expresión la una o más secuencias codificantes. Adicionalmente, un casete de expresión puede comprender una región no traducida 3’ que en eucariotas contiene habitualmente un sitio de poliadenilación.
El término “recombinante” significa un polinucleótido o polipéptido de origen semisintético o sintético, que o bien no se produce en la naturaleza o bien está ligado a otro polinucleótido en una disposición no encontrada en la naturaleza.
El “porcentaje (%) de homología o identidad de secuencia” con respecto a secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en la secuencia de referencia (es decir, la secuencia de ácido nucleico de la que se deriva), tras alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad u homología de secuencias de nucleótidos puede conseguirse de diversas maneras que se encuentran dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente tal como software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir una alineación máxima por la longitud completa de las secuencias que están comparándose.
Por ejemplo, una alineación apropiada para secuencias de ácido nucleico se proporciona por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, (1981), Advances in Applied Mathematics 2:482- 489. Este algoritmo puede aplicarse a secuencias de aminoácidos usando la matriz de puntuación desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 supl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EE. UU., y normalizada por Gribskov (1986), Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763. Una implementación a modo de ejemplo de este algoritmo para determinar el porcentaje de identidad de una secuencia se proporciona por el Genetics Computer Group (Madison, Wis.) en la aplicación de utilidad “BestFit” . Los parámetros por defecto para este método se describen en el Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, versión 8 (1995) (disponible de Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Un método preferido para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es usar el paquete MPSRCH de programas sujetos a derechos de autor de la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif). A partir de este juego de paquetes, puede emplearse el algoritmo de Smith-Waterman cuando se usen parámetros por defecto para la tabla de puntuaciones (por ejemplo, penalización por apertura de hueco de 12, penalización por extensión de hueco de uno, y un hueco de seis). A partir de los datos generados, el valor “coincidencia” refleja la “identidad de secuencia”. En general, en la técnica se conocen otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o de similitud entre secuencias, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, usado con parámetros por defecto. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP pueden usarse usando los siguientes parámetros por defecto: código genético=estándar; filtro=ninguno; hebra=ambas; límite=60; esperado=10; matriz=BLOSUM62; descripciones=50 secuencias; clasificar por=ALTA PUNTUACIÓN; bases de datos=no redundantes, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+ GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Detalles de estos programas pueden encontrarse en la siguiente dirección de Internet: http:// http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
Casetes de expresión
Según una realización, la presente invención se refiere a un casete de expresión que comprende uno o más de los promotores y/o proteínas recombinantes Brachyury y/o ácidos nucleicos según la presente invención.
La invención abarca un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos el 90% con la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO:72 o SEQ ID NO:73.
En una realización preferida, hay un casete de expresión que comprende SEQ ID NO: 72.
En a más realización preferida, hay un casete de expresión que comprende SEQ ID NO: 73.
Poxvirus recombinantes
Según una realización adicional, los casetes de expresión según la presente invención pueden formar parte de un vector. El término “vector” se refiere a cualquier vector conocido por el experto en la técnica. Un vector puede ser un vector de plásmido tal como pBR322 o un vector de la serie pUC. Más preferiblemente, el vector es un virus recombinante. En el contexto de la presente invención, el término “virus” o “virus recombinante” se refiere a un virus infeccioso que comprende un genoma viral. En este caso, los ácidos nucleicos, promotores, proteínas recombinantes y/o casetes de expresión de la presente invención forman parte del genoma viral del respectivo virus recombinante. El genoma viral recombinante está empaquetado y los virus recombinantes obtenidos pueden usarse para la infección de células y líneas celulares, en particular para la infección de animales vivos incluyendo seres humanos. Virus recombinantes típicos que pueden usarse según la presente invención son vectores adenovirales, vectores retrovirales o vectores basados en el virus adenoasociado 2 (AAV2). Los más preferidos son los vectores poxvirales.
En varias realizaciones, los casetes de expresión según la presente invención son preferiblemente activos como promotores poxvirales o activos como promotores en células infectadas con poxvirus. El poxvirus es preferiblemente un poxvirus aviar o un ortopoxvirus. Más preferiblemente, el poxvirus es un poxvirus aviar.
El término “poxvirus aviar” se refiere a cualquier poxvirus aviar, tal como poxvirus de aves de corral, poxvirus de canario, uncopoxvirus, poxvirus de estornino, poxvirus de paloma, poxvirus de psitácidos, poxvirus de codorniz, poxvirus de pavo real, poxvirus de pingüino, poxvirus de gorrión, poxvirus de estornino pinto y poxvirus de pavo. Poxvirus aviares preferidos son el poxvirus de canario y el poxvirus de aves de corral.
Un ejemplo de un virus de viruela de canario es la cepa Rentschler. Una capa de viruela de canario purificada en placa denominada ALVAC (patente estadounidense n.° 5.766.598) se depositó bajo los términos del tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), número de registro VR-2547. Otra cepa de viruela de canario es la cepa de vacuna para la viruela de canario comercial denominada LF2 CEP 52424 1075, disponible de Institute Merieux, Inc.
Ejemplos de un virus de la viruela aviar son las cepas FP-1, FP-5, TROVAC (patente estadounidense nT 5.766.598), y POXVAC-TC (patente estadounidense 7.410.644). FP-1 es una cepa Duvette modificada para usarse como vacuna en pollos de un día de edad. La cepa es una cepa de vacuna para el virus de la viruela aviar comercial denominada O DCEP 25/CEP67/2309 octubre de 1980 y está disponible de Institute Merieux, Inc. FP-5 es una cepa de vacuna para el virus de la viruela aviar comercial de origen de embrión de pollo disponible de American Scientific Laboratories (División de Schering Corp.) Madison, Wis., licencia veterinaria de los Estados Unidos n ° 165, n ° de serie 30321.
En las diversas otras realizaciones de la presente divulgación, el poxvirus recombinante es un ortopoxvirus tal como, pero sin limitarse a, un virus Vaccinia, un virus Vaccinia modificado de Ankara (MVA), o MVA-BN.
Ejemplos de cepas de virus Vaccinia son las cepas Temple of Heaven, Copenhagen, Paris, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, New York City Board of Health, Elstree, Ikeda y WR. Una cepa de virus Vaccinia (VV) preferida es la cepa Wyeth (DRYVAX) (patente estadounidense 7.410.644). Otra cepa de VV preferida es MVA (Sutter, G. et al, [1994], Vaccine 12: 1032-40). Otra cepa de VV preferida es MVA-BN.
Ejemplos de cepas de virus MVA que son útiles en la práctica de la presente invención y que se han depositado en cumplimiento con los requisitos del Tratado de Budapest son las cepas MVA 572, depositadas en la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC), Laboratorio de investigación y producción de vacunas, Servicio de laboratorio de sanidad pública, Centro de microbiología aplicada e investigación, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP40JG, Reino Unido, con el número de depósito ECACC 94012707 el 27 de enero de 1994, y Mv A 575, depositada bajo ECACC 00120707 el 7 de diciembre de 2000. MVA-BN, depositada el 30 de agosto de 2000 en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) con el número V00083008, y sus derivados, son cepas a modo de ejemplo adicionales.
Aunque se prefiere MVA-BN por su mayor seguridad (menos competente para la replicación), todas las MVA son adecuadas para esta invención. Según una realización de la presente invención, la cepa MVA es MVA-BN y sus derivados. Una definición de MVA-BN y sus derivados se facilita en el documento PCT/EP01/13628, que se incorpora como referencia en el presente documento.
En una realización, la invención abarca ortopoxvirus recombinantes, preferiblemente un virus Vaccinia (VV), una cepa Wyeth, ACAM 1000, ACAM 2000, MVA o Mv A-BN para la terapia contra el cáncer. Los ortopoxvirus recombinantes se generan mediante la inserción de secuencias heterólogas en un ortopoxvirus.
En determinadas realizaciones, el MVA es MVA-BN, depositada el 30 de agosto de 2000, en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) con el número V00083008, y descrita en la publicación PCT internacional WO2002042480 (véanse también, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.761.893 y 6.913.752), que se incorporan como referencia en el presente documento.
En determinadas realizaciones, un MVA recombinante es un derivado de MVA-BN. Tales “derivados” incluyen virus que presentan esencialmente las mismas características de replicación que la cepa depositada (ECACC n° V00083008), pero que presenta diferencias en una o más partes de su genoma. Virus que tienen las mismas “características de replicación” que el virus depositado son virus que replican con relaciones de amplificación similares a la cepa depositada en células CEF y las líneas celulares, HeLa, HaCat y 143B; y que muestran características de replicación, in vivo, similares tal como se determina, por ejemplo, en el modelo de ratón transgénico AGR129.
El experto en la técnica conoce métodos de cómo puede insertarse el casete de expresión según la presente invención en un genoma viral, en particular en el genoma de un poxvirus, lo más preferiblemente en el genoma de un ortopoxvirus y/o FPV. Por ejemplo, el casete de expresión según la presente invención puede insertarse en el genoma de un poxvirus mediante recombinación homóloga. Para este fin se transfecta un ácido nucleico a una línea celular permisiva tal como células CEF o BHK, comprendiendo el ácido nucleico el casete de expresión según la presente invención flanqueado por tramos de nucleótido que son homólogos a la región del genoma poxviral en el que debe insertarse el casete de expresión según la presente invención. Las células se infectan mediante el poxvirus y en las células infectadas se produce recombinación homóloga entre el ácido nucleico y el genoma viral. Alternativamente, también es posible infectar en primer lugar las células con un poxvirus y entonces transfectar el ácido nucleico a las células infectadas. De nuevo se produce recombinación en las células. El poxvirus recombinante se selecciona entonces mediante métodos conocidos en la técnica anterior. La construcción de poxvirus recombinante no está restringida a este método particular. En su lugar, puede usarse cualquier método adecuado conocido por el experto en la técnica para este fin.
El casete de expresión según la presente invención puede introducirse en cualquier parte adecuada del virus o vector viral, en particular en un genoma viral. En el caso de un ortopoxvirus y un poxvirus aviar, la inserción puede hacerse en partes no esenciales del genoma viral o en una región intergénica del genoma viral. El término “región intergénica” se refiere preferiblemente a aquellas partes del genoma viral ubicadas entre dos genes adyacentes que no comprenden secuencias codificantes. Si el virus es un ortopoxvirus y un poxvirus aviar, la inserción también puede hacerse en un sitio de deleción del genoma viral. El término “sitio de deleción” se refiere a aquellas partes del genoma viral que se delecionan con respecto al genoma de un ortopoxvirus o poxvirus aviar que se produce de manera natural. Sin embargo, los sitios de inserción no están restringidos a estos sitios de inserción preferidos en el genoma de ortopoxvirus y un poxvirus aviar, dado que está dentro del alcance de la presente invención que el casete de expresión pueda insertarse en cualquier punto en el genoma viral siempre que sea posible obtener recombinantes que puedan amplificarse y propagarse en al menos un sistema de cultivo celular, tal como fibroblastos de embrión de pollo (células CEF).
Vacunas y/o composiciones que no forman parte de la invención
La divulgación también abarca el vector según la presente invención como vacuna o medicamento. En un término más general, la divulgación se refiere a una vacuna o composición farmacéutica que comprende un casete de expresión, un ADN o un vector según la presente invención. El experto en la técnica conoce métodos de cómo puede administrarse la vacuna o composición farmacéutica al cuerpo animal o humano. En el caso de ADN y vectores de plásmido recombinantes, el ADN y el vector pueden simplemente administrarse mediante inyección. Si la vacuna o composición es un virus recombinante tal como un ortopoxvirus o un poxvirus aviar, en particular un MVA recombinante o FPV recombinante, también puede administrarse al cuerpo animal o humano según el conocimiento del experto en la técnica, por ejemplo, mediante administración intravenosa, intramuscular, intranasal, intradérmica o subcutánea. Detalles adicionales sobre la cantidad de virus administra se facilitan a continuación.
La composición farmacéutica o la vacuna puede incluir generalmente uno o más portadores farmacéuticos aceptables y/o aprobados, aditivos, antibióticos, conservantes, adyuvantes, diluyentes y/o estabilizadores además del promotor, casete de expresión o vector según la presente invención. Tales sustancias auxiliares pueden ser agua, solución salina, glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponamiento de pH o similares. Los portadores adecuados son moléculas normalmente grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, agregados lipídicos o similares.
Para la preparación de composiciones farmacéuticas o vacunas, el ADN, casete de expresión o vector según la presente invención, en particular un ortopoxvirus o poxvirus aviar recombinante tal como MVA recombinante o FPV recombinante se convierte en una forma fisiológicamente aceptable. Para MVA y FPV, esto puede hacerse basándose en la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus usadas para la vacunación contra la viruela (tal como se describe por Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). Por ejemplo, el virus purificado se almacena a -80°C, con un título de 5x108 TCID50/ml formulado en Tris aproximadamente 10 mM, NaCl 140 mM pH 7,4. Para la preparación de inyecciones de vacuna, por ejemplo, 101-109 partículas del virus recombinante según la presente invención se liofilizan en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en presencia del 2% de peptona y del 1% de albúmina humana en una ampolla, preferiblemente una ampolla de vidrio. Alternativamente, las inyecciones de vacuna pueden producirse criodesecando paso a paso el virus en una formulación. Esta formulación puede contener aditivos adicionales tales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona u otros aditivos tales como antioxidantes o gas inerte, estabilizadores o proteínas recombinantes (por ejemplo, albúmina sérica humana) adecuados para la administración in vivo. Una formulación que contiene virus típica adecuada para la criodesecación comprende tampón Tris 10 mM, NaCl 140 mM, 18,9 g/l de dextrano (MW 36000-40000), 45 g/l de sacarosa, 0,108 g/l de monohidrato de sal de monopotasio de L-ácido glutámico pH 7,4. La ampolla de vidrio se sella entonces y puede almacenarse entre 4°C y temperatura ambiente durante varios meses. Sin embargo, siempre que no exista ninguna necesidad, la ampolla se almacena preferiblemente a temperaturas por debajo de -20°C.
Para la vacunación o terapia, el liofilizado o el producto criodesecado puede disolverse en de 0,1 a 0,5 ml de una disolución acuosa, preferiblemente agua, solución salina fisiológica o tampón Tris, y administrarse o bien de manera sistémica o bien de manera local, es decir mediante una ruta de administración parenteral, intramuscular o cualquier otra ruta de administración conocido por el médico experto. El modo de administración, la dosis y el número de administraciones pueden optimizarse por los expertos en la técnica de una manera conocida.
La siguiente divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere además a un método para introducir una secuencia codificante en una célula diana, tal como una célula humana con fines terapéuticos, que comprende la introducción de los ácidos nucleicos, promotores, proteínas recombinantes y/o casetes de expresión según la presente invención en la célula diana. Las células diana humanas a modo de ejemplo pueden incluir células presentadoras de antígeno (APC) tales como células dendríticas, macrófagos y otras distintas de APC tales como fibroblastos, células tumorales, etcétera.
La siguiente divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere además a un método para producir un péptido, proteína y/o virus que comprende la infección de una célula huésped con un virus recombinante según la presente invención, seguido del cultivo de la célula huésped infectada en condiciones adecuadas, y seguido además por el aislamiento y/o enriquecimiento del péptido y/o proteína y/o virus producidos por dicha célula huésped. Si se pretende producir, es decir amplificar el virus según la presente invención, la célula tiene que ser una célula en la que el virus sea capaz de replicarse. Para poxvirus, en particular MVA, células adecuadas son células CEF (fibroblasto embrionario de pollo) o BHK (riñón de hámster bebé). Para poxvirus aviares, tal como poxvirus de aves de corral, las células adecuadas incluyen células CEF o CED (dérmicas embrionarias de pollo). Si se pretende producir un péptido/proteína codificado/a por el virus recombinante según la presente invención, la célula puede ser cualquier célula que pueda infectarse mediante el vector de virus recombinante y que permita la expresión de las proteínas/péptidos codificados por virus.
La siguiente divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere además a un método para producir un péptido, proteína y/o virus que comprende la transfección de una célula con el casete de expresión, un ácido nucleico, promotor, proteína recombinante y/o ADN de casete de expresión según la presente invención, seguido de la infección de la célula con un poxvirus. Las células huésped infectada se cultiva en condiciones adecuadas. Una etapa adicional comprende el aislamiento y/o el enriquecimiento del péptido y/o la proteína y/o los virus producidos por dicha célula huésped. La etapa de infectar las células con un poxvirus puede hacerse antes o después de la etapa de transfección de las células.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención.
Ejemplo 1: Expresión de Brachyury en CD humanas infectadas con virus de la viruela aviar recombinantes
Para identificar la expresión de proteína Brachyury, se infectaron células dendríticas (CD) humanas con un virus control positivo, MVA recombinante que comprende Brachyury y TRICOM, a una multiplicidad de infección (MOI) de 2,5. También se infectaron CD humanas con una cepa de viruela aviar no recombinante de control negativo (FPV-WT) o cepas de virus de la viruela aviar recombinantes que comprenden un casete de expresión Brachyury y TRICOM según la presente divulgación. Cada cepa de FPV (listadas en más detalle en la tabla 1), incluyendo FPV-WT, FPV-mBN343A, FPV-mBN344A y FPV-mBN345A, se usó para infectar CD con una MOI de 20. La expresión de FPVBrachyury se detectó por medio de un análisis de inmunotransferencia Western realizado con un anticuerpo anti-Brachyury monoclonal de conejo. La proteína de mantenimiento gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) también se detectó por medio de análisis de inmunotransferencia Western como control de carga.
Tabla 1. Cepas de virus
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Viruela aviar recombinante que comprende un casete de expresión Brachyury y TRICOM
Los resultados se muestran en la Figura 1. La expresión de Brachyury se detectó con los FPV recombinantes FPV-mBN343A y FPVmBN345, pero no se detectó usando el FPV recombinante FPV-mBN344A. La expresión de Brachyury también se detectó con MVA-Brachyury-TRICOM. Una carga similar de muestras se demostró mediante la expresión de GAPDH.
Ejemplo 2: Expresión de Brachyury en CD humanas infectadas con virus de la viruela aviar recombinantes
También se compararon los niveles de expresión de proteína Brachyury entre cepas de FPV recombinantes adicionales que expresan Brachyury con diferentes promotores. Se infectaron células dendríticas humanas (CD) con una MOI de 5 del MVA recombinante de control positivo que comprende Brachyury y TRICOM, y la cepa no recombinante de control negativo MVA-WT. También se infectaron CD humanas con FPV recombinantes que comprenden un casete de expresión Brachyury y TRICOM según la presente divulgación (por ejemplo, FPV-mBN343A, FPV-mBN344A, FPV-mBN345A, FPV-mBN354A, FPV-mBN355A, véase la tabla 1). Se infectaron adicionalmente CD humanas con un poxvirus de aves de corral recombinante (FPV) que comprende un casete de expresión Brachyury que tienen o bien un promotor de virus Vaccinia (VV)-40k o bien un promotor PrS. La cepa FPV-WT no recombinante sirvió como control negativo. Todos los FPV se usaron a una MOI de 40. La expresión de Brachyury se detectó por medio de un análisis de inmunotransferencia Western realizado con un anticuerpo anti-Brachyury monoclonal de conejo. También se detectó GAPDH como control de carga.
Los resultados se muestran en la Figura 2. La expresión de Brachyury se detectó con los FPV recombinantes FPV-mBN343A y FPV-mBN345A, pero no se detectó usando el FPV recombinante FPV-mBN344A y FPV-mBN354A. Más particularmente, se detectó expresión de Brachyury a menores niveles para los FPV recombinantes que tienen los promotores VV-40k o PrS que dirigen Brachyury (es decir, FVP-mBN281A, FVP-mBN249B). No se detectó expresión de Brachyury en los controles negativos (CD no infectadas, MVA-WT o FPV-WT). Una carga similar de muestras se demostró mediante la expresión de GAPDH.
Los niveles de expresión de Brachyury de la inmunotransferencia Western mostrados en el ejemplo 2 se normalizaron en relación con la expresión del gen de mantenimiento GAPDH, que se espera que se exprese a niveles equivalentes entre células. Se midió la intensidad de cada banda de Brachyury y GAPDH y se calculó una relación entre la intensidad de las bandas de Brachyury y GAPDH dentro de la misma muestra.
Los resultados se muestran en la Figura 3. Entre los constructos de FPV, la máxima expresión de Brachyury en relación con GAPDH se detectó en CD infectadas con FPV-mBN355A. Se detectó una expresión de Brachyury relativa moderada en CD infectadas con FPV-mBN343A o FPV-mBN345A. La mínima expresión de Brachyury relativa se detectó a partir de los FPV recombinantes que tienen los promotores VV-40k o PrS que dirigen Brachyury (es decir, FVP-mBN281A, FVP-mBN249B). La máxima expresión de Brachyury relativa se observó a partir de la infección con el virus de control positivo MVA-Brachyury-TRICOM; no se detectó ninguna expresión de Brachyury en las muestras de control negativo. Por tanto, entre las cepas de FPV recombinantes, se indujo una expresión de Brachyury superior mediante vectores que dirigen la expresión de Brachyury de los promotores FPV-mBN355, FPV-mBN345 o FPV-mBN344.
Ejemplo 3: Expresión de Brachyury y TRICOM en células CMMT infectadas con virus de la viruela aviar recombinantes
También se evaluó la expresión de las proteínas Brachyury y TRICOM mediante citometría de flujo usando anticuerpos etiquetados de manera fluorescente específicos para cada proteína. Se infectaron células CMMT (una línea celular de tumor mamario de mono Resus) con el MVA recombinante de control positivo que comprende Brachyury y TRICOM, o con FPV recombinantes que comprenden un casete de expresión Brachyury y TRICOM según la presente divulgación (por ejemplo, FPV-mBN343A, FPV-mBN345A), o con el FPV recombinante que tiene el promotor PrS que

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos el 90% con la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO:72 o SEQ ID NO:73.
  2. 2. - Un vector poxviral que comprende el casete de expresión según la reivindicación 1.
  3. 3. - El vector poxviral según la reivindicación 2, en el que el poxvirus es un virus de la viruela aviar.
  4. 4.- El vector poxviral según la reivindicación 2, en el que el poxvirus es un virus Vaccinia modificado de Ankara que es MVA-BN.
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