ES2901629T3 - Uso de dominios de proteínas de interacción con el nucleosoma para mejorar la modificación dirigida del genoma - Google Patents

Uso de dominios de proteínas de interacción con el nucleosoma para mejorar la modificación dirigida del genoma Download PDF

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Abstract

Una proteína de fusión que comprende una proteína de repeticiones palindrómicas cortas regularmente intercaladas (CRISPR) unida a al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma, en la que la proteína CRISPR es una nucleasa o nickasa CRISPR/Cas9 de tipo II, o la proteína CRISPR es una nucleasa o nickasa CRISPR/Cpf1 de tipo V, y en la que la proteína de fusión además comprende al menos una señal de localización nuclear, al menos un dominio de penetración celular, al menos un dominio marcador, o una combinación de los mismos, y en la que el dominio de al menos una proteína de interacción con el nucleosoma es un dominio de unión al ADN de la caja del grupo de alta movilidad (HMG); una proteína de unión al nucleosoma HMG (HMGN); un dominio globular central de la histona H1, un dominio de unión al ADN de una proteína del complejo de remodelación de la cromatina elegida entre el complejo interruptor/sacarosa no fermentable (SWI/SNF), el complejo interruptor de imitación (ISWI), el complejo cromodominio-helicasa-unión al ADN (CHD), el complejo de remodelación del nucleosoma y desacetilasa (NuRD), el complejo INO80, el complejo SWR1 o el complejo RSC; o una combinación de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de dominios de proteínas de interacción con el nucleosoma para mejorar la modificación dirigida del genoma Campo
La presente divulgación se refiere a composiciones y procedimientos para aumentar la eficacia de la modificación dirigida del genoma, la regulación transcripcional dirigida o la modificación epigenética dirigida.
Antecedentes
Las endonucleasas programables se han convertido cada vez más en una herramienta importante para la ingeniería o modificación selectiva del genoma en eucariotas. Recientemente, los sistemas de repeticiones palindrómicas cortas regularmente intercaladas (CRISPR) guiados por ARN han surgido como una nueva generación de herramientas de modificación del genoma. Estas nuevas endonucleasas programables proporcionan una simplicidad y versatilidad sin precedentes en comparación con las generaciones anteriores de nucleasas, tal como las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN). Sin embargo, las barreras de la cromatina en las células eucariotas pueden dificultar el acceso a la diana y la escisión por parte de los sistemas CRISPR derivados de procariotas (Hinz et al., Biochemistry, 2015, 54:7063 a 7066; Horlbeck et al., eLife, 2016, 5:e12677).
De hecho, se ha observado una actividad de edición nula o baja en ciertos sitios genómicos de mamíferos cuando se utiliza Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), que se considera la nucleasa CRISPR más activa hasta la fecha. Además, muchas de las nucleasas CRISPR que se han caracterizado hasta ahora no muestran actividad en las células de mamíferos, aunque sean activas en bacterias o en sustratos de ADN purificados. Por lo tanto, es necesario mejorar la capacidad de los sistemas de nucleasas CRISPR y de otras proteínas programables de modificación del ADN para superar el obstáculo de la cromatina, con el fin de aumentar la eficacia de la modificación genómica o epigenética dirigida en los eucariotas.
Sumario
Entre los diversos aspectos de la presente divulgación está la provisión de una proteína de fusión que comprende una proteína de repeticiones palindrómicas cortas regularmente intercaladas agrupadas (CRISPR) unida a al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma, en la que la proteína CRISPR es una nucleasa o nickasa CRISPR/Cas9 de tipo II, o una nucleasa o nickasa CRISPR/Cpf1 de tipo V, y en la que la proteína de fusión comprende al menos una señal de localización nuclear, al menos un dominio de penetración celular, al menos un dominio marcador, o una combinación de los mismos
En ciertas realizaciones, la proteína CRISPR puede ser Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9), Staphylococcus aureus (SaCas9), Francisella novicida Cas9 (FnCas9), Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9), Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9), Francisella novicida Cpf1 (FnCpfl), Acidaminococcus sp. Cpf1 (AsCpfl), o la bacteria Lachnospiraceae ND2006 Cpf1 (LbCpf1).
En otras realizaciones, la proteína CRISPR tiene actividad no nucleasa. En tales iteraciones, la proteína CRISPR puede ser una proteína CRISPR/Cas9 de tipo II modificada para carecer de toda actividad nucleasa y unida a un dominio no nucleasa, o una proteína CRISPR/Cpf1 de tipo V modificada para carecer de toda actividad nucleasa y unida a un dominio no nucleasa, en el que el dominio no nucleasa puede tener actividad citosina desaminasa, actividad histona acetiltransferasa, actividad de activación transcripcional o actividad represora transcripcional. El al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma de la proteína de fusión CRISPR puede ser un dominio de unión al ADN de la caja del grupo de alta movilidad (HMG), una proteína de unión al nucleosoma HMG (HMGN), un dominio globular central de una variante de la histona H1, un dominio de unión al ADN de una proteína del complejo de remodelación de la cromatina, o una combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma de la proteína de fusión CRISPR puede ser el dominio de la caja A de HMGB1, la proteína HMGN1, la proteína h Mg N2, la proteína HMGN3a, la proteína HMGN3b, el dominio globular central de la histona H1, el dominio de unión al ADN de la proteína del interruptor de imitación (ISWI), el dominio de unión al ADN de la proteína 1 del cromodominio-helicasa (CHD1), o una combinación de los mismos.
El al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma puede estar enlazado a la proteína CRISPR directamente a través de un enlace químico, indirectamente a través de un enlazador, o una combinación de los mismos. El al menos un dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma puede estar unido al N-terminal, al C-terminal y/o a una localización interna de la proteína CRISPR. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende al menos dos dominios proteicos de interacción con el nucleosoma unidos a la proteína CRISPR.
En ciertas realizaciones, la proteína de fusión CRISPR puede tener una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEC. ID NÚM.: 61, la SEC. ID NÚM.: 62, la SEC. ID Nú M.: 63, la SEC. ID NÚM.: 64, la SEC. ID NÚM.: 65, la SEC. ID NÚM.: 66, la SEC. ID NÚM.: 67, la SEC. ID NÚM.: 68, la SEC. ID NÚM.: 69, la SEC. ID NÚM.: 70, la SEC. ID NÚM.: 71, la SEC. ID NÚM.: 72, la SEC. ID NÚM.: 73, la SEC. ID NÚM.: 74, la SEC. ID NÚM.: 75, la SEC. ID NÚM.: 76, la SEC. ID NÚM.: 77, la SEC. ID NÚM.: 78 o la SEC. ID NÚM.: 79.
En otras realizaciones, la proteína de fusión CRISPR puede tener una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC. ID NÚM.: 61, la SEC. ID NÚM.: 62, la SEC. ID NÚM.: 63, la SEC. ID NÚM.: 64, la SEC. ID NÚM.: 65, la SEC. ID NÚM.: 66, la SEC. ID NÚM.: 67, la SEC. ID NÚM.: 68, la SEC. ID NÚM.: 69, la SEC. ID NÚM.: 70, la SEC. ID NÚM.: 71, la SEC. ID NÚM.: 72, la SEC. ID NÚM.: 73, la SEC. ID NÚM.: 74, la SEC. ID NÚM.: 75, la SEC. ID NÚM.: 76, la SEC. ID NÚM.: 77, la SEC. ID NÚM.: 78 o la SEC. ID NÚM.: 79.
Otro aspecto de la presente divulgación abarca complejos de proteína-ARN que comprenden al menos una de las proteínas de fusión que contienen CRISPR desveladas en la presente memoria y al menos un ARN guía.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las proteínas de fusión desveladas en la presente memoria. Los ácidos nucleicos pueden estar optimizados por codones para su traducción en una célula eucariota. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos pueden formar parte de un vector tal como, por ejemplo, un vector viral, un vector plasmídico o un ARN autorreplicante.
Todavía otro aspecto de la presente divulgación proporciona un procedimiento para aumentar la eficiencia de la modificación genómica o epigenética dirigida en una célula eucariota, el procedimiento comprende introducir en la célula eucariota (a) al menos una proteína de fusión CRISPR como se desvela en la presente memoria o ácido nucleico que codifica dichas proteínas de fusión CRISPR, en la que la proteína CRISPR (i) tiene actividad nucleasa o nickasa o (ii) está modificada para carecer de toda actividad nucleasa y está unida a un dominio no nucleasa; y (b) al menos un ARN guía o ácido nucleico que codifica al menos un ARN guía; en el que la proteína CRISPR de la al menos una proteína de fusión CRISPR se dirige a una secuencia cromosómica diana y el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma de la al menos una proteína de fusión CRISPR altera la estructura nucleosómica o de la cromatina de forma que la al menos una proteína de fusión CRISPR tiene un mayor acceso a la secuencia cromosómica diana, para de ese modo aumentar la eficacia de la modificación genómica o epigenética dirigida, en el que el procedimiento no comprende un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal por medio de cirugía o terapia.
En ciertas realizaciones, los procedimientos además pueden comprender la introducción en la célula eucariota de al menos un polinucleótido donante, el polinucleótido donante que comprende al menos una secuencia donante.
Las células eucariotas utilizadas en los procedimientos desvelados en la presente memoria pueden ser células de mamífero. En algunas realizaciones, las células pueden ser humanas. Las células pueden ser in vitro o in vivo. A continuación se detallan otros aspectos y características de la divulgación.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 presenta la eficiencia de escisión (como el porcentaje de indeles) de CjCas9 de tipo salvaje (CjeCas9), una proteína de fusión que comprende CjCas9 enlazada a HMGN1 y a la caja A de HMGB1 (CjeCas9-HN1HB1), y una proteína de fusión que comprende CjCas9 enlazada a HMGN1 y al dominio globular central de la histona H1 (CjeCas9-HN1H1G) en presencia del andamio de ARNsg de tipo salvaje o del andamio de ARNsg modificado. Descripción detallada
La presente divulgación proporciona composiciones y procedimientos para aumentar la accesibilidad del ADN cromosómico a las proteínas programables de modificación del ADN que son los sistemas CRISPR. En particular, la presente divulgación proporciona proteínas de fusión que comprenden al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma unido a una proteína de modificación del ADN programable que es una proteína CRISPR. Los dominios de la proteína de interacción con el nucleosoma alteran o remodelan la estructura nucleosómica y/o de la cromatina de forma que la proteína de modificación del ADN programable tiene un mayor acceso a las secuencias cromosómicas diana, para de ese modo aumentar la eficacia de la modificación del genoma diana, la regulación transcripcional diana o la modificación epigenética diana.
(I) Proteínas de Fusión
Un aspecto de la presente divulgación proporciona proteínas de fusión, en las que cada proteína de fusión comprende al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma unido a una proteína de modificación del ADN programable. La proteína de modificación del ADN programable puede tener actividad de nucleasa (véase la sección (I)(b)(i), a continuación) o actividad de no nucleasa (véase la sección (I)(b)(ii), a continuación). Los dominios de la proteína de interacción con el nucleosoma se describen a continuación en la sección (I)(a) y los enlaces entre los dominios se describen a continuación en la sección (I)(c).
(a) Dominios de Proteínas de Interacción con el Nucleosoma
Los dominios de proteínas que interactúan con el nucleosoma se refieren a proteínas cromosómicas o fragmentos de las mismas de interacción con el nucleosoma y/o proteínas cromosómicas para facilitar la reordenación del nucleosoma y/o la remodelación de la cromatina. En algunas realizaciones, el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma se puede derivar de las proteínas de caja de alta movilidad (HMG). En otras realizaciones, el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma puede ser proteínas de unión al nucleosoma HMG (HMGN) o fragmentos de las mismas. En otras realizaciones, el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma se puede derivar de variantes de la histona H1 enlazadora. En otras realizaciones, el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma se puede derivar de las proteínas del complejo de remodelación de la cromatina. (i) Proteínas HMGB
En algunas realizaciones, el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma se puede derivar de una proteína HMGB. Las proteínas HMGB interactúan con los nucleosomas y otras proteínas cromosómicas para regular la estructura y la función de la cromatina. Las proteínas HMGB adecuadas incluyen la HMGB1 de mamífero, la HMGB2 de mamífero y la HMGB3 de mamífero. Por ejemplo, el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma se puede derivar de un HNGB1 humano (RefSeqGene, U51677), HMGB2 humano (RefSeqGene, M83665) o Hm Gb3 humano (RefSeqGene, NM_005342). En otras realizaciones, el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma se puede derivar de una proteína HMGB o de una proteína similar a la HMGB de otros vertebrados, invertebrados (por ejemplo, DSP1 de Drosophila), plantas, levaduras u otros eucariotas unicelulares.
En realizaciones específicas, el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma puede ser un fragmento de una proteína HMGB. En particular, el fragmento de la proteína HMGB es un dominio de unión al ADN. Las proteínas Hm Gb suelen contener dos dominios de unión al ADN, que se denominan caja A y caja B. En algunas realizaciones, el dominio de interacción con el nucleosoma puede ser un dominio caja A o un dominio caja B de una proteína HMGB. En realizaciones específicas, el dominio de interacción con el nucleosoma puede ser un dominio de la caja A de HMGB1, un dominio de la caja A de HMGB2 o un dominio de la caja A de HMGB3.
(ii) Proteínas HMGN
En otras realizaciones, el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma puede ser una proteína HMGN o un fragmento de la misma. Las proteínas HMGN son proteínas cromosómicas que modulan la estructura y la función de la cromatina. Las proteínas HMGN de mamíferos adecuadas incluyen HMGN1, HMGN2, HMGN3, HMGN4 y HMGN5. En diversas realizaciones, el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma puede ser HMGN1 humano (RefSeqGene, M21339), HMGN2 humano (RefSeqGene, X13546) hMGN3a o HMGN3b humano (RefSeqGene, l40357), HMGN4 humano (RefSeqGene, NM_030763), HMGN5 humano (RefSeqGene, NM_016710), un fragmento del mismo o un derivado del mismo. En otras realizaciones, el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma puede ser una proteína HMGN no humana, un fragmento o un derivado de la misma. Las proteínas HMGN son proteínas relativamente pequeñas. De este modo, toda la proteína HMGN se puede enlazar a la proteína de modificación del ADN programable. En algunas realizaciones, sin embargo, un fragmento (por ejemplo, el dominio de unión a nucleosomas localizado en el centro) de una proteína HMGN se puede unir a la proteína de modificación del ADN programable.
(ii) Variantes de la Histona H1
En otras realizaciones, el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma se puede derivar de una variante de la histona H1 enlazadora. Por ejemplo, el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma puede ser un dominio globular central de una variante de la histona H1. Las variantes de la histona H1 se unen al ADN enlazador entre los nucleosomas y el dominio globular central (de aproximadamente 80 aminoácidos) se une al ADN enlazador en los sitios de entrada y salida del nucleosoma cerca de la díada del nucleosoma. Las variantes de la histona H1 comprenden una gran familia de proteínas relacionadas con una especificidad distinta para los tejidos, las etapas de desarrollo y los organismos en los que se expresan. Por ejemplo, el ser humano y el ratón contienen 11 variantes de la histona H1, el pollo tiene seis variantes (que se denominan histona H5), la rana tiene cinco variantes, el nematodo tiene ocho variantes, las especies de mosca de la fruta tienen de una a tres variantes y el tabaco tiene seis variantes. En algunas realizaciones, la variante de la histona H1 puede ser una variante humana como se muestra a continuación.
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(iv) Proteínas del Complejo de Remodelación de la Cromatina
En otras realizaciones, el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma se puede derivar de una proteína del complejo de remodelación de la cromatina. Por ejemplo, el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma puede ser el dominio de unión al ADN de una proteína del complejo de remodelación de la cromatina. Los complejos de remodelación de la cromatina son complejos enzimáticos de varias subunidades con capacidad para remodelar la estructura de la cromatina. Estos complejos de remodelación utilizan la energía de la hidrólisis del ATP para mover, desestabilizar, expulsar o reestructurar los nucleosomas.
Entre los ejemplos de complejos de remodelación de la cromatina se encuentran SWI/SNF (Conmutador/Sacarosa No-Fermentable), ISWI (Conmutador de Imitación), CHD (Unión de Cromodominio-Helicasa-ADN), Mi-2/NuRD (Remodelación de Nucleosoma y Deacetilasa), IN080, SWR1 y complejos RSC. En varias realizaciones, el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma se puede derivar de una ATPasa, una helicasa y/o una proteína de unión al ADN en el complejo de remodelación de la cromatina. En algunas realizaciones, el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma se puede derivar de la ATPasa ISWI del complejo ISWI, la proteína de unión al ADN CHD1 del complejo CHD, la helicasa dependiente de ATP SMARCA4 o la ATPasa Snf2 del complejo SWI/SNF, la ATPasa Mi-2a o la ATPasa Mi2-p del complejo Mi-1/NuRD, la ATPasa AAA 1 o la ATPasa AAA 2 del complejo INO80, la ATPasa Swr1 del complejo SwRl, o la ATPasa Rsc1 o la ATPasa Rcs2 del complejo RSC. En realizaciones específicas, el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma puede ser un dominio de unión al ADN de la proteína ISWI o un dominio de unión al ADN de la proteína CHD1.
(b) Proteínas de Modificación del ADN Programables
Una proteína de modificación del ADN programable es una proteína dirigida a unirse a una secuencia específica en el a Dn cromosómico, donde modifica el ADN o una proteína asociada con el ADN en o cerca de la secuencia dirigida. De este modo, una proteína de modificación del ADN programable comprende un dominio de unión al ADN programable y un dominio de modificación catalíticamente activo.
El dominio de unión al ADN de las proteínas de modificación del ADN programable es programable, lo que significa que puede ser diseñado o manipulado para reconocer y unir diferentes secuencias de ADN. En algunos ejemplos, la unión al ADN está mediada por interacciones entre la proteína de modificación del ADN y el ADN diana. De este modo, el dominio de unión al ADN se puede programar para que se una a una secuencia de ADN de interés por medio de ingeniería de proteínas. En otros ejemplos, la unión del ADN está mediada por un ARN guía de interacción con la proteína de modificación del ADN y el a Dn diana. En estos casos, la proteína de unión al ADN programable se puede dirigir a una secuencia de ADN de interés por medio del diseño del ARN guía adecuado.
En la proteína de modificación del ADN programable se puede incluir una variedad de dominios de modificación. En algunas realizaciones, el dominio de modificación tiene actividad de nucleasa y puede escindir una o ambas hebras de una secuencia de ADN de doble cadena. A continuación, la rotura del ADN se puede reparar por medio de un proceso de reparación del ADN celular, tal como la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR), de forma que la secuencia de ADN se puede modificar por medio de una supresión, inserción y/o sustitución de al menos un par de bases. Entre los ejemplos de proteínas programables de modificación del ADN que tienen actividad de nucleasa se incluyen, sin límite, las nucleasas CRISPR (o nickasas), las nucleasas de dedos de zinc, las nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción, las meganucleasas y un dominio de unión al ADN programable unido a un dominio de nucleasa. Las proteínas programares de modificación del ADN que tienen actividad nucleasa se detallan a continuación en la sección (I)(b)(i).
Las proteínas programables de modificación del ADN pueden comprender dominios de unión y/o modificación del ADN de tipo salvaje o de origen natural, versiones modificadas de dominios de unión y/o modificación del ADN de origen natural, dominios de unión y/o modificación del ADN sintéticos o artificiales, y combinaciones de los mismos.
(i) Proteínas Programables de Modificación del ADN con Actividad Nucleasa
Entre los ejemplos de proteínas programables de modificación del ADN que tienen actividad de nucleasa se incluyen, sin límite, las nucleasas CRISPR, las nucleasas de dedos de zinc, las nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción, las meganucleasas y los dominios de unión al ADN programables unidos a dominios de nucleasa.
Nucleasas CRISPR. La nucleasa CRISPR se puede derivar de una proteína CRISPR de tipo I, de tipo II (es decir, Cas9), de tipo III, de tipo V (es decir, Cpf1) o de tipo VI (es decir, Cas13), que están presentes en diversas bacterias y arqueas. En otras realizaciones, la nucleasa CRISPR se puede derivar de un sistema CRISPR arqueológico, un sistema CRISPR/CasX o un sistema CRISPR/CasY (Burstein et al., Nature, 2017, 542(7640):237 a 241). En varias realizaciones, la nucleasa CRISPR puede ser de Streptococcus sp. (por ejemplo, S. pyogenes, S. thermophilus, S. pasteurianus), Campylobacter sp. (por ejemplo, Campylobacter jejuni), Francisella sp. (por ejemplo, Francisella novicida), Acaryochloris sp., Acetohalobium sp, Acidaminococcus sp., Addithiobadllus sp., Alicydobadllus sp., Allochromatium sp., Ammonifex sp., Anabaena sp., Arthrospira sp., Bacillus sp., Burkholderiales sp., Caldicelulosiruptor sp., Candidatus sp., Clostridium sp., Crocosphaera sp., Cyanothece sp, Exiguobacterium sp., Finegoldia sp., Ktedonobacter sp., Lachnospiraceae sp., Lactobacillus sp., Lyngbya sp., Marinobacter sp., Methanohalobium sp., Microscilla sp., Microcoleus sp., Microcystis sp., Natranaerobius sp., Neisseria sp., Nitrosococcus sp., Nocardiopsis sp, Nodularia sp., Nostoc sp., Oscilatoria sp., Polaromonas sp., Pelotomaculum sp., Pseudoalteromonas sp., Petrotoga sp., Prevotella sp., Staphylococcus sp., Streptomyces sp., Streptosporangium sp., Synechococcus sp., Thermosipho sp., o Verrucomicrobia sp.
La nucleasa CRISPR puede ser una proteína de tipo salvaje o de origen natural. Alternativamente, la nucleasa CRISPR puede ser diseñada para tener una especificidad mejorada, una especificidad PAM alterada, una disminución de los efectos fuera de la diana, una mayor estabilidad, y similares.
En algunas realizaciones, la nucleasa CRISPR puede ser una proteína CRISPR/Cas 9 de tipo II. Por ejemplo, la nucleasa CRISPR puede ser Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9), Staphylococcus aureus (SaCas9), Francisella novicida Cas9 (FnCas9), Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9) o Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9). En otras realizaciones, la nucleasa CRISPR puede ser una proteína CRISPR/Cpf1 de tipo V, por ejemplo, Francisella novicida Cpf1 (FnCpf1), Acidaminococcus sp. Cpf1 (AsCpfl), o la bacteria Lachnospiraceae ND2006 Cpf1 (LbCpfl). En general, la nucleasa CRISPR comprende al menos un dominio de nucleasa con actividad de endonucleasa. Por ejemplo, una nucleasa Cas9 comprende un dominio HNH, que escinde la cadena complementaria del ARN guía, y un dominio RuvC, que escinde la cadena no complementaria, una proteína Cpf1 comprende un dominio RuvC y un dominio NUC, y una nucleasa Cas13a comprende dos dominios HNEPN. En algunas realizaciones, ambos dominios de la nucleasa están activos y la nucleasa CRISPR tiene actividad de corte de doble cadena (es decir, corta ambas cadenas de una secuencia de ácido nucleico de doble cadena). En otras realizaciones, uno de los dominios de la nucleasa está inactivado por una o más mutaciones y/o supresiones, y la variante CRISPR es una nickasa que escinde una hebra de una secuencia de ácido nucleico de doble cadena. Por ejemplo, una o más mutaciones en el dominio RuvC de la proteína Cas9 (por ejemplo, D10A, D8A, E762A, y/o D986A) da lugar a una nickasa HNH que corta la cadena complementaria del ARN guía; y una o más mutaciones en el dominio HNH de la proteína Cas9 (por ejemplo, H840A, h559A, N854A, N856A, y/o N863A) da lugar a una nickasa RuvC que corta la cadena no complementaria del ARN guía. Mutaciones comparables pueden convertir las nucleasas Cpf1 y Cas13a en nickasas. Dominios de Unión al ADN Programables Unidos a Dominios de Nucleasa. En otras realizaciones, la proteína de modificación del ADN programable con actividad nucleasa puede ser una proteína quimérica que comprende un dominio de unión al ADN programable unido a un dominio nucleasa. El dominio de nucleasa puede ser cualquiera de los descritos anteriormente en la subsección que describe las ZFN (por ejemplo, el dominio de nucleasa puede ser un dominio de nucleasa Fokl), un dominio de nucleasa derivado de una nucleasa CRISPR (por ejemplo, los dominios de nucleasa RuvC o HNH de Cas9), o un dominio de nucleasa derivado de una meganucleasa o endonucleasa de corte raro.
El dominio de unión al ADN programable de la proteína quimérica puede ser cualquier proteína de unión al ADN programable tal como, por ejemplo, una proteína de dedo de zinc o un efector tipo activador de la transcripción. Alternativamente, el dominio de unión al ADN programable puede ser una proteína CRISPR catalíticamente inactiva (muerta) que fue modificada por supresión o mutación para carecer de toda actividad nucleasa. Por ejemplo, la proteína CRISPR catalíticamente inactiva puede ser una Cas9 catalíticamente inactiva (muerta) (dCas9) en la que el dominio RuvC comprende una mutación D10A, D8A, E762A, y/o D986A y el dominio HNH comprende una mutación H840A, H559A, N854A, N865A, y/o N863A. Alternativamente, la proteína CRISPR catalíticamente inactiva puede ser una proteína Cpf1 catalíticamente inactiva (muerta) que comprende mutaciones comparables en los dominios de la nucleasa. En otras realizaciones, el dominio de unión al ADN programable puede ser una meganucleasa catalíticamente inactiva en la que la actividad nucleasa se ha eliminado por mutación y/o supresión, por ejemplo, la meganucleasa catalíticamente inactiva puede comprender un truncamiento C-terminal.
(ii) Proteínas Programables de Modificación del ADN con Actividad No Nucleásica
En realizaciones alternativas, la proteína de modificación del ADN programable puede ser una proteína quimérica que comprende un dominio de unión al ADN programable unido a un dominio no nucleasa. El dominio de unión al ADN programable puede ser una proteína dedo de zinc, un efector tipo activador de la transcripción, una proteína CRISPR catalíticamente inactiva (muerta) o una meganucleasa catalíticamente inactiva (muerta). Por ejemplo, la proteína CRISPR catalíticamente inactiva puede ser una Cas9 catalíticamente inactiva (muerta) (dCas9) en la que el dominio RuvC comprende una mutación D10A, D8A, E762A, y/o D986A y el dominio HNH comprende una mutación H840A, H559A, N854A, N865A, y/o N863A. Alternativamente, la proteína CRISPR catalíticamente inactiva puede ser una proteína Cpf1 catalíticamente inactiva (muerta) que comprende mutaciones comparables en los dominios de la nucleasa.
En algunas realizaciones, el dominio no nucleasa de la proteína quimérica puede ser un dominio de modificación epigenética, que altera la estructura del ADN o de la cromatina (y puede o no alterar la secuencia del ADN). Los ejemplos no limitantes de dominios de modificación epigenética adecuados incluyen los que tienen actividad de metiltransferasa de ADN (por ejemplo, citosina metiltransferasa), actividad de desmetilasa de ADN, desaminación de ADN (por ejemplo, citosina desaminasa, adenosina desaminasa, guanina desaminasa), aminación de ADN, actividad de oxidación de ADN, actividad de helicasa de ADN, actividad de histona acetiltransferasa (HAT) (por ejemplo, dominio HAT derivado de la proteína de unión a E1A p300), actividad de histona desacetilasa, actividad de histona metiltransferasa, actividad de histona desmetilasa, actividad de histona quinasa, actividad de histona fosfatasa, actividad de histona ubiquitina ligasa, actividad de histona desubiquitinante, actividad de histona adenilante, actividad de histona deadenilante, actividad de SUMOilación de las histonas, actividad de deSUMOilación de las histonas, actividad de ribosilación de las histonas, actividad de deribosilación de las histonas, actividad de miristoilación de las histonas, actividad de desmitificación de las histonas, actividad de alquilación de las histonas, actividad de desalquilación de las histonas o actividad de oxidación de las histonas. En realizaciones específicas, el dominio de modificación epigenética puede comprender actividad de citidina desaminasa, actividad de histona acetiltransferasa o actividad de ADN metiltransferasa.
En otras realizaciones, el dominio de modificación no nucleasa de la proteína quimérica puede ser un dominio de activación transcripcional o un dominio represor transcripcional. Los dominios de activación transcripcional adecuados incluyen, sin límite, el dominio VP16 del virus del herpes simple, el VP64 (que es un derivado tetramérico del VP16), el VP160, los dominios de activación de NFKB p65, los dominios de activación de p531 y 2, los dominios de activación de CREB (proteína de unión a elementos de respuesta a cAMP), los dominios de activación de E2A, el dominio de activación del factor de choque térmico humano 1 (HSF1) o los dominios de activación de NFAT (factor nuclear de células T activadas). Los ejemplos no limitantes de dominios represores transcripcionales adecuados incluyen dominios represores tempranos de AMPc inducible (ICER), dominios represores de caja asociada a Kruppel (KRAB), dominios represores ricos en glicina YY1, represores similares a Sp1, represores E(spl), represor IKB o represor de proteína de unión a metil-CpG 2 (MeCP2). Los dominios de activación transcripcional o de represión transcripcional se pueden fusionar genéticamente con la proteína de unión al ADN o unirse por medio de interacciones no covalentes proteína-proteína, proteína-ARN o proteína-ARN.
En realizaciones particulares, el dominio no nucleasa de la proteína quimérica puede comprender actividad de citidina desaminasa, actividad de histona acetiltransferasa, actividad de activación transcripcional o actividad de represión transcripcional.
En algunas realizaciones, la proteína quimérica con actividad no nucleasa además puede comprender al menos una etiqueta detectable. La etiqueta detectable puede ser un fluoróforo (por ejemplo, fAm , TMR, Cy3, Cy5, Rojo Texas, Verde Oregon , Flúor Alexa , etiquetas Halo , o un tinte fluorescente adecuado), una etiqueta de detección (por ejemplo, biotina, digoxigenina y similares), puntos cuánticos o partículas de oro.
(c) Enlaces
Las proteínas de fusión desveladas en la presente memoria comprenden al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma unido a una proteína de modificación del ADN programable. El enlace entre el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma y la proteína de modificación del ADN programable puede ser directo a través de un enlace químico, o el enlace puede ser indirecto a través de un enlazador.
En algunas realizaciones, el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma puede estar unido directamente a la proteína de modificación del ADN programable por medio de un enlace covalente (por ejemplo, enlace peptídico, enlace éster, y similares). Alternativamente, el enlace químico puede ser no covalente (por ejemplo, iónico, electrostático, hidrógeno, hidrofóbico, interacciones Van der o efectos n).
En otras realizaciones, el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma puede estar enlazado a la proteína de modificación del ADN programable por medio de un enlazador. Un enlazador es un grupo químico que conecta uno o más grupos químicos por medio de al menos un enlace covalente. Los enlazadores adecuados incluyen aminoácidos, péptidos, nucleótidos, ácidos nucleicos, moléculas enlazadoras orgánicas (por ejemplo, derivados de maleimida, N-etoxibenzilimidazol, ácido bifenil-3,4',5-tricarboxílico, p-aminobenziloxicarbonilo y similares), enlazadores disulfuro y enlazadores poliméricos (por ejemplo, PEG). El enlazador puede incluir uno o más grupos espaciadores que incluyen, pero no se limitan a alquileno, alquenileno, alquil, alquenilo, alquinilo, alcoxi, arilo, heteroarilo, aralquil, aralquenilo, aralquinilo y similares. El enlazador puede ser neutro o tener una carga positiva o negativa. Además, el enlazador puede ser escindible, de forma que el enlace covalente del enlazador que conecta el enlazador con otro grupo químico se puede romper o escindirse bajo ciertas condiciones, que incluye el pH, la temperatura, la concentración de sal, la luz, un catalizador o una enzima.
En otras realizaciones, el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma puede estar enlazado a la proteína de modificación del ADN programable por medio de enlazadores peptídicos. El enlazador peptídico puede ser un enlazador aminoácido flexible (por ejemplo, que comprenda aminoácidos pequeños, no polares o polares). Los ejemplos no limitantes de enlazadores flexibles incluyen LEGGGS (SEC. ID NÚM.: 1), TGSG (SEC. ID NÚM.: 2), GGSGGGSG (SEC. ID NÚM.: 3), (GGGGS)-m (SEC. ID NÚM.: 4), y (Gly)6-8 (SEC. ID NÚM.: 5). Alternativamente, el enlazador peptídico puede ser un enlazador aminoácido rígido. Tales enlazadores incluyen (EAAAK)1-4 (SEC. ID NÚM.: 6), A(EAAAK)M a (SEC. ID NÚM.: 7), PAPAP (SEC. ID NÚM.: 8), y (AP)6-8 (SEC. ID NÚM.: 9). Los ejemplos de enlazadores adecuados son bien conocidos en la técnica y los programas para diseñar enlazadores están fácilmente disponibles (Crasto et al., Protein Eng., 2000, 13(5):309 a 312).
El al menos un dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma puede estar unido al N-terminal, al C-terminal, y/o a una ubicación interna de la proteína de modificación del ADN programable. En algunas realizaciones, al menos un dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma puede estar unido al N-terminal de la proteína de modificación del ADN programable. En otras realizaciones, el al menos un dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma puede estar unido al C-terminal de la proteína de modificación del ADN programable. En otras realizaciones, al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma puede estar unido al N-terminal y al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma puede estar unido al C-terminal de la proteína de modificación del ADN programable.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión puede comprender un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma. En otras realizaciones, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de proteína de interacción con el nucleosoma. En otras realizaciones, la proteína de fusión puede comprender tres dominios de proteína de interacción con el nucleosoma. En otras realizaciones, la proteína de fusión puede comprender cuatro, cinco o más de cinco dominios de proteína de interacción con el nucleosoma. Los uno o más dominios de la proteína de interacción con el nucleosoma pueden ser los mismos o pueden ser diferentes.
En las realizaciones en las que la proteína de fusión comprende dos o más dominios de proteína de interacción con el nucleosoma, los dos o más dominios de interacción con el nucleosoma pueden estar unidos a cualquiera de los extremos, a ambos extremos y/o a una ubicación interna de la proteína de modificación del ADN programable. Los dos o más dominios de la proteína de interacción con el nucleosoma pueden ser los mismos o pueden ser diferentes. Por ejemplo, el complejo puede comprender al menos dos dominios de unión al ADN HMG, al menos dos proteínas HMGN, al menos un dominio de unión al ADN HMG y al menos una proteína HMGN, al menos un dominio de unión al ADN HMG o una proteína HMGN y al menos un dominio central de una variante de la histona H1, al menos un dominio de unión al ADN HMG o una proteína HMGN y al menos un dominio de una proteína del complejo de remodelación de la cromatina, al menos un dominio de unión al ADN HMG o una proteína HMGN, al menos un dominio central de una variante de la histona H1 y al menos un dominio de una proteína del complejo de remodelación de la cromatina, y similares.
(d) Señal de Localización Nuclear, Dominio de Penetración Celular y/o Dominio Marcador
Las proteínas de fusión desveladas en la presente memoria además comprenden al menos una señal de localización nuclear, un dominio de penetración celular y/o un dominio marcador.
Los ejemplos no limitantes de señales de localización nuclear incluyen PKKKRKV (SEC. ID NÚM.: 10), PKKKRRV (SEC. ID NÚM.: 11), KRPAATKKAGQAKKK (SEC. ID NÚM.: 12), YGRKKRRQRRR (SEC. ID NÚM.: 13), RKKRRQRRR (SEC. ID NÚM.: 14), PAAKRVKLD (SEC. ID NÚM.: 15), RQRRNELKRSP (SEC. ID NÚM.: 16), VSRKRPRP (SEC. ID NÚM.: 17), PPKKARED (SEC. ID NÚM.: 18), PQPKKKPL (SEC. ID NÚM.: 19), SALIKKKKKMAP (SEC. ID NÚM.: 20), PKQKKRK (SEC. ID NÚM.: 21), RKLKKKIKKL (SEC. ID NÚM.: 22), REKKKFLKRR (SEC. ID NÚM.: 23), KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (SEC. ID NÚM.: 24), RKCLQAGMNLEARKTKK (SEC. ID NÚM.: 25), NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGQYFAKPRNQGGY (SEC. ID NÚM.: 26), y RMRIZFKNKKDTAELRRRVEVSVELRKAKDEQILKRRNV (SEC. ID NÚM.: 27).
Los ejemplos de dominios de penetración celular adecuados incluyen, sin límite, GRKKRRQRPPQPKKRKV (SEC. ID NÚM.: 28), PLSSIFSRIGDPPKKRKV (SEC. ID NÚM.: 29), GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV (SEC. ID NÚM.: 30), GALFLGGAAGSTMGAWSQPKKKRKV (SEC. ID NÚM.: 31), KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEC. ID NÚM.: 32), YARAAARQARA (SEC. ID NÚM.: 33), THRLPRRRRRR (SEC. ID NÚM.: 34), GGRRARRRRRR (SEC. ID NÚM.: 35), RRQRRTSKLMKR (SEC. ID NÚM.: 36), GWTLNSAGYLLGKINLKALAKKIL (SEC. ID NÚM.: 37), KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEC. ID NÚM.: 38), y RQIKIWFQNRRMKWKK (SEC. ID NÚM.: 39).
Los dominios marcadores incluyen proteínas fluorescentes y etiquetas de purificación o epítopo. Las proteínas fluorescentes adecuadas incluyen, sin límite, proteínas fluorescentes verdes (por ejemplo, GFP, eGFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, Esmeralda, Verde Azami, Verde Azami Monomérico, CopGFP, AceGFP, Verde Zs1), proteínas fluorescentes amarillas (por ejemplo, YFP, EYFP, Citrino, Venus, YPet, PhiYFP, Amarillo Zs1), proteínas fluorescentes azules (por ejemplo, BFP, EBFP, EBFP2, Azurita, mKalama1, GFPuv, Zafiro, Zafiro T), proteínas fluorescentes cian (por ejemplo ECFP, Cerúleo, CyPet, Cian Am1, Cian Midoriishi), proteínas fluorescentes rojas (por ejemplo, mKate, mKate2, mPlum, Rojo Ds monómero, mCereza, mRFP1, Rojo Ds-Express, Rojo Ds2, Rojo Ds-Monómero, Rojo Hc-Tándem, Rojo Hc1, Rojo As2, eqFP611, Frambuesa m, Fresa m, Rojo J), y proteínas fluorescentes naranjas, por ejemplo, Naranja m, mKO, Naranja Kusabira, Naranja Kusabira Monomérica, Mandarina m, Tomate td). Los ejemplos no limitantes de etiquetas de purificación o epítopo adecuadas incluyen 6xHis, FLAG®, HA, GST, Myc, y similares.
La al menos una señal de localización nuclear, el dominio de penetración celular, y/o el dominio marcador pueden estar localizados en el N-terminal, el C-terminal, y/o en una localización interna de la proteína de fusión.
(e) Proteínas de Fusión Específicas
En general, el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma de la proteína de fusión se elige entre el dominio de la caja A de HMGB1, la proteína HMGN1, la proteína HMGN2, la proteína HMGN3a, la proteína HMGN3b, el dominio globular central de la histona H1, el dominio de unión al ADN de la proteína del interruptor de imitación (ISWI), el dominio de unión al ADN de la proteína 1 del cromodominio-helicasa (CHD1), o combinaciones de los mismos.
La proteína de modificación del ADN programable de la proteína de fusión es una proteína CRISPR. Por ejemplo, la proteína CRISPR puede ser Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9), Staphylococcus aureus (SaCas9), Francisella novicida Cas9 (FnCas9), Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9), Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9), Francisella novicida Cpf1 (FnCpfl), Acidaminococcus sp. Cpf1 (AsCpfl), o la bacteria Lachnospiraceae ND2006 Cpf1 (LbCpf1).
En algunas realizaciones, la proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEC. ID NÚMS.: 61 a 79. En general, cualquier sustitución de aminoácidos es conservadora, es decir, se limita a intercambios dentro de los miembros del grupo 1: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; grupo 2: serina, cisteína, treonina y metionina; grupo 3: prolina; grupo 4: fenilalanina, tirosina y triptófano; y grupo 5: aspartato, glutamato, asparagina y glutamina. En varias realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión tiene al menos aproximadamente el 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98, o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEC. ID NÚMS.: 61 a 79. En algunas realizaciones, la proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos como la establecida en la SEC. ID NÚM.: 61, la SEC. ID NÚM.: 62, la SEC. ID NÚM.: 63, la SEC. ID NÚM.: 64, la SEC. ID NÚM.: 65, la SEC. ID NÚM.: 66, la SEC. ID NÚM.: 67, la SEC. ID NÚM.: 68, la SEC. ID NÚM.: 69, la SEC. ID NÚM.: 70, la SEC. ID NÚM.: 71, la SEC. ID NÚM.: 72, la SEC. ID NÚM.: 73, la SEC. ID NÚM.: 74, la SEC. ID NÚM.: 75, la SEC. ID NÚM.: 76, la SEC. ID NÚM.: 77, la SEC. ID NÚM.: 78 o la SEC. ID NÚM.: 79.
(II) Complejos
Otro aspecto de la presente divulgación abarca complejos que comprenden al menos un sistema CRISPR (es decir, proteína CRISPR y ARN guía) y al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma. El al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma está unido a la proteína CRISPR del sistema CRISPR (es decir, el complejo comprende una proteína de fusión CRISPR como se describe en la sección (I) anterior). En otros ejemplos, el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma puede estar enlazado al ARN guía del sistema CRISPR. El enlace puede ser directo o indirecto, esencialmente como se describe en la sección (I)(c). Por ejemplo, un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma puede estar enlazado a una proteína de unión de aptámeros de ARN, y el ARN guía puede comprender secuencias de aptámeros, de forma que la unión de la proteína de unión de aptámeros de ARN a la secuencia de aptámeros de ARN enlaza el dominio de proteína de interacción con el nucleosoma al ARN guía.
Los dominios de la proteína de interacción con el nucleosoma se describen arriba en la sección (I)(a), y las proteínas CRISPR se detallan arriba en la sección (I)(b). La proteína CRISPR puede tener actividad nucleasa o nickasa (por ejemplo, puede ser una CRISPR/Cas9 de tipo II, o una CRISPR/Cpf1 de tipo V). Por ejemplo, un complejo puede comprender una nucleasa CRISPR, o un complejo puede comprender dos nickasas CRISPR. Alternativamente, la proteína CRISPR se puede modificar para carecer de toda actividad nucleasa y unirse a dominios no nucleasas (por ejemplo, dominios con actividad citosina deaminasa, actividad histona acetiltransferasa, actividad de activación transcripcional o actividad represora transcripcional). En algunas realizaciones, el dominio de no nucleasa también puede estar enlazado a una proteína de unión de aptámeros de ARN.
Un ARN guía comprende (i) un ARN CRISPR (ARNcr) que contiene una secuencia guía en el extremo 5' que se hibrida con una secuencia diana y (ii) una secuencia de ARNcr transactante (ARNtr) de interacción con la proteína CRISPR. La secuencia guía del ARNcr de cada ARN guía es diferente (es decir, es específica de la secuencia). La secuencia del ARNtracr es generalmente la misma en los ARN guía diseñados para formar un complejo con una proteína CRISPR de una especie bacteriana concreta.
La secuencia guía del ARNcr está diseñada para hibridarse con una secuencia diana (es decir, protospacer) que está bordeada por un motivo adyacente al protospacer (PAM) en una secuencia de doble cadena. Las secuencias PAM para las proteínas Cas9 incluyen 5'-NGG, 5'-NGGNG, 5'-NNAGAAW, y 5'-ACAY, y las secuencias PAM para Cpf1 incluyen 5'-TTN (donde N se define como cualquier nucleótido, W se define como A o T, e Y se define como C 0 T). En general, la complementariedad entre la secuencia guía del ARNcr y la secuencia diana es de al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99%. En determinadas realizaciones, la complementariedad es completa (es decir, del 100%). En varias realizaciones, la longitud de la secuencia guía del ARNcr puede oscilar entre aproximadamente 15 nucleótidos y aproximadamente 25 nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia guía del ARNcr puede tener una longitud de aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos. En realizaciones específicas, el ARNcr puede tener una longitud de aproximadamente 19, 20, 21 o 22 nucleótidos.
El ARNcr y el ARNtracr comprenden secuencias repetidas que forman una o más estructuras de bucle de un tallo, que pueden interactuar con la proteína CRISPR. La longitud de cada bucle y del tallo puede variar. Por ejemplo, los uno o más bucles pueden tener una longitud de entre 3 y 10 nucleótidos, y los uno o más tallos pueden tener una longitud de entre 6 y 20 pares de bases. Los uno o más tallos pueden comprender uno o más bultos de 1 a aproximadamente 10 nucleótidos.
El ARNcr puede tener una longitud de aproximadamente 25 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. En varias realizaciones, el ARNcr puede tener una longitud de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos, de aproximadamente 590 a aproximadamente 75 nucleótidos, o de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 nucleótidos. El ARNtracr puede tener una longitud de aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos. En varias realizaciones, el ARNtracr puede tener una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nucleótidos, de aproximadamente 90 a aproximadamente 110 nucleótidos, de aproximadamente 110 a aproximadamente 130 nucleótidos, de aproximadamente 130 a aproximadamente 150 nucleótidos, de aproximadamente 150 a aproximadamente 170 nucleótidos, de aproximadamente 170 a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 200 a aproximadamente 250 nucleótidos, o de aproximadamente 250 a aproximadamente 300 nucleótidos.
La secuencia de ARNtracr en el ARN guía generalmente se basa en la secuencia de codificación del ARNtracr de tipo salvaje en la especie bacteriana de interés. En algunas realizaciones, la secuencia de ARNtra de tipo salvaje (o la región de repetición constante del ARNcr y la correspondiente región 5' del ARNtra que forma una estructura dúplex con la región de repetición constante del ARNcr) se puede modificar para facilitar la formación de la estructura secundaria, aumentar la estabilidad de la estructura secundaria, facilitar la expresión en células eucariotas, aumentar la eficiencia de la edición, etc. Por ejemplo, se pueden introducir uno o más cambios de nucleótidos en la secuencia de ARN guía constante (véase el Ejemplo 8, más adelante).
El ARN guía puede ser una sola molécula (es decir, un ARN guía único o ARNsg), en la que la secuencia de ARNcr está enlazada a la secuencia de ARNtracr. Alternativamente, el ARN guía puede ser dos moléculas separadas. Una primera molécula que comprende la secuencia guía de ARNcr en el extremo 5' y una secuencia adicional en el extremo 3' que es capaz de emparejarse con el extremo 5' de una segunda molécula, en la que la segunda molécula comprende una secuencia 5' que es capaz de emparejarse con el extremo 3' de la primera molécula, así como una secuencia adicional de ARNcr. En algunas realizaciones, el ARN guía de los sistemas CRISPR/Cpf1 de tipo V puede comprender únicamente ARNcr.
En algunas realizaciones, las una o más regiones de bucle de tallo del ARN guía se pueden modificar para comprender una o más secuencias de aptámeros (Konermann et al., Nature, 2015, 517(7536):583 a 588 Zalatan et al., Cell, 2015, 160(1-2):339 a 350). Entre los ejemplos de dominios de proteínas aptámeras de ARN adecuados se incluyen la proteína de cubierta MS2 (MCP), la proteína de cubierta del bacteriófago PP7 (PCP), la proteína Com del bacteriófago Mu, la proteína N22 del bacteriófago Lambda, la proteína de unión al bucle del tallo (SLBP), la proteína 1 relacionada con el síndrome de retraso mental del cromosoma X frágil (FXR1), proteínas derivadas de bacteriófagos tales como AP205, BZ13, f1, f2, fd, fr, ID2, JP34/GA, JP501, JP34, JP500, KU1, M11, M12, MX1, NL95, PP7, 9Cb5, 9Cb8r, 9Cb12 r, 9Cb23r, Qp, R17, SP-p, TW18, TW19, y VK, fragmentos de las mismas o derivados. La longitud de la secuencia adicional de aptámeros puede oscilar entre aproximadamente 20 nucleótidos y aproximadamente 200 nucleótidos.
El ARN guía puede comprender ribonucleótidos estándar, ribonucleótidos modificados (por ejemplo, pseudouridina), isómeros de ribonucleótidos y/o análogos de ribonucleótidos. En algunas realizaciones, el a Rn guía además puede comprender al menos una etiqueta detectable. La etiqueta detectable puede ser un fluoróforo (por ejemplo, FAM, TMR, Cy3, Cy5, Rojo Texas, Verde Oregon, Flúor Alexa, etiquetas Halo, o un tinte fluorescente adecuado), una etiqueta de detección (por ejemplo, biotina, digoxigenina y similares), puntos cuánticos o partículas de oro. Los expertos en la técnica están familiarizados con el diseño y la construcción de ARNg, por ejemplo, las herramientas de diseño de ARNg están disponibles en Internet o en fuentes comerciales.
El ARN guía puede ser sintetizado químicamente, sintetizado enzimáticamente, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, el ARN guía se puede sintetizar mediante el uso de procedimientos estándar de síntesis en fase sólida basados en fosforamida. Alternativamente, el ARN guía se puede sintetizar in vitro por medio de la unión operable del ADN que codifica el ARN guía a una secuencia de control del promotor que es reconocida por una ARN polimerasa de fago. Entre los ejemplos de secuencias promotoras de fagos adecuadas se encuentran las secuencias promotoras T7, T3, SP6 o sus variaciones. En las realizaciones en las que el ARN guía comprende dos moléculas separadas (es decir, ARNcr y ARNtracr), el ARNcr se puede sintetizar químicamente y el ARNtracr se puede sintetizar enzimáticamente.
En algunas realizaciones, el complejo puede comprender al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma, como se ha descrito anteriormente en la sección (I)(a), unido a cualquiera de las proteínas de modificación del ADN programable, como se ha descrito anteriormente en la sección (I)(b).
(III) Ácidos Nucleicos
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión descritas anteriormente en la sección (I) y los complejos CRISPR descritos en la sección (II). Los complejos CRISPR pueden estar codificados por ácidos nucleicos simples o múltiples. Los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, lineales o circulares, monocatenarios o bicatenarios. El ARN o el ADN pueden estar optimizados en cuanto a los codones para una traducción eficiente en proteínas en la célula eucariota de interés. Los programas de optimización de codones están disponibles como freeware o en fuentes comerciales.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión o los componentes proteicos del complejo CRISPR o el puede ser ARN. El ARN se puede sintetizar enzimáticamente in vitro. Para ello, el ADN que codifica la proteína de interés se puede unir de forma operativa a una secuencia promotora que sea reconocida por una ARN polimerasa de fago para la síntesis de ARN in vitro. Por ejemplo, la secuencia promotora puede ser una secuencia promotora T7, T3 o SP6 o una variación de una secuencia promotora T7, T3 o SP6. El ADN que codifica la proteína puede formar parte de un vector, como se detalla a continuación. En tales realizaciones, el ARN transcrito in vitro puede ser purificado, tapado y/o poliadenilado. En otras realizaciones, el ARN que codifica la proteína de fusión o el componente proteico del complejo puede formar parte de un ARN autorreplicante (Yoshioka et al., Cell Stem Cell, 2013, 13:246 a 254). El ARN autorreplicante se puede derivar de un replicón de Ar N del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) no infeccioso y autorreplicante, que es un ARN monocatenario de sentido positivo capaz de autorreplicarse durante un número limitado de divisiones celulares y que se puede modificar para codificar proteínas de interés (Yoshioka et al., Cell Stem Cell, 2013, 13:246 a 254).
En otras realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión o la proteína CRISPR y el ARN guía del complejo puede ser ADN. La secuencia codificadora de ADN puede estar enlazada de forma operativa a al menos una secuencia de control del promotor para su expresión en la célula de interés. En ciertas realizaciones, la secuencia codificadora de ADN puede estar enlazada de forma operable a una secuencia promotora para la expresión de la proteína o ARN en células bacterianas (por ejemplo, E. coli) o eucariotas (por ejemplo, levadura, insecto o mamífero). Los promotores bacterianos adecuados incluyen, sin límite, los promotores T7, los promotores del operón lac, los promotores trp, los promotores tac (que son híbridos de los promotores trp y lac), variaciones de cualquiera de los anteriores y combinaciones de cualquiera de los anteriores. Los ejemplos no limitantes de promotores eucariotas Pol II adecuados incluyen promotores constitutivos, regulados o específicos de células o tejidos. Las secuencias de control del promotor constitutivo eucariótico adecuadas incluyen, entre otras, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), el promotor del virus de los simios (SV40), el promotor tardío principal del adenovirus, el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) el promotor del virus del tumor mamario del ratón (MMTV), el promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK), el promotor del factor de elongación (ED1)-alfa, los promotores de la ubiquitina, los promotores de la actina, los promotores de la tubulina, los promotores de la inmunoglobulina, fragmentos de los mismos, o combinaciones de cualquiera de los anteriores. Entre los ejemplos de secuencias de control de promotores regulados por eucariotas adecuados se incluyen, sin limitación, los regulados por choque térmico, metales, esteroides, antibióticos o alcohol. Los ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido incluyen el promotor de B29, el promotor de CD14, el promotor de CD43, el promotor de CD45, el promotor de CD68, el promotor de desmina, el promotor de elastasa-1, el promotor de endoglina, el promotor de Flt-1, el promotor de GFAP, el promotor de GPIIb, el promotor de ICAM-2, el promotor de INF-p, el promotor de Mb, el promotor de Nphsl, el promotor de OG-2, el promotor de SP-B, el promotor de SYN1 y el promotor de WASP. La secuencia del promotor puede ser de tipo salvaje o puede ser modificada para una expresión más eficiente o eficaz. En algunas realizaciones, la secuencia codificadora de ADN también puede estar enlazada a una señal de poliadenilación (por ejemplo, la señal poliA de SV40, la señal poliA de la hormona de crecimiento bovina (BGH), etc.) y/o al menos una secuencia de terminación transcripcional. La secuencia que codifica el ARN guía está unida de forma operativa a una secuencia de control del promotor Pol III para su expresión en células eucariotas. Los ejemplos de promotores Pol III adecuados incluyen, pero no se limitan a, promotores de ARN U6, U3, H1 y 7SL de mamíferos. En algunas situaciones, la proteína de fusión o los componentes del complejo se pueden purificar a partir de células bacterianas o eucariotas.
En varias realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión o la proteína CRISPR y el ARN guía del complejo puede estar presente en un vector. Los vectores adecuados incluyen vectores plasmídicos, vectores virales y ARN autorreplicante (Yoshioka et al., Cell Stem Cell, 2013, 13:246 a 254). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión o los componentes del complejo puede estar presente en un vector plasmídico. Los ejemplos no limitantes de vectores plasmídicos adecuados incluyen pUC, pBR322, pET, pBluescript y sus variantes. En otras realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión o los componentes del complejo o puede formar parte de un vector viral (por ejemplo, vectores lentivirales, vectores virales adenoasociados, vectores adenovirales, etc.). El plásmido o vector viral puede comprender secuencias adicionales de control de la expresión (por ejemplo, secuencias potenciadoras, secuencias de Kozak, secuencias de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, etc.), secuencias de marcadores seleccionables (por ejemplo, genes de resistencia a los antibióticos), orígenes de replicación y similares. Se puede encontrar información adicional sobre los vectores y su uso en "Current Protocols in Molecular Biology Ausubel et al., John Wiley & Sons, Nueva York, 2003 o "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3ra edición, 2001.
(IV) Kits
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona kits que comprenden al menos una de las proteínas de fusión detalladas anteriormente en la sección (I), al menos uno de los complejos CRISPR descritos anteriormente en la sección (II), y/o al menos uno de los ácidos nucleicos descritos anteriormente en la sección (III). Los kits además pueden comprender reactivos de transfección, medios de crecimiento celular, medios de selección, reactivos de transcripción in vitro, reactivos de purificación de ácidos nucleicos, reactivos de purificación de proteínas, tampones y similares. Los kits proporcionados en la presente memoria generalmente incluyen instrucciones para llevar a cabo los procedimientos que se detallan a continuación. Las instrucciones incluidas en los kits pueden estar adheridas al material de embalaje o pueden estar incluidas como un prospecto. Aunque las instrucciones suelen ser materiales escritos o impresos, no se limitan a ello. Cualquier medio capaz de almacenar dichas instrucciones y comunicarlas a un usuario final está contemplado en esta divulgación. Tales medios incluyen, pero no se limitan a, medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM), y similares. Como se utiliza en la presente memoria, el término "instrucciones" puede incluir la dirección de un sitio de Internet que proporcione las instrucciones.
(V) Células
La presente divulgación también proporciona células que comprenden al menos una de las proteínas de fusión detalladas anteriormente en la sección (I), al menos uno de los complejos CRISPR descritos anteriormente en la sección (II), y/o al menos uno de los ácidos nucleicos descritos anteriormente en la sección (III). En general, la célula es una célula eucariota. Por ejemplo, la célula puede ser una célula humana, una célula de mamífero no humano, una célula de vertebrado no mamífero, una célula de invertebrado, una célula de insecto, una célula de planta, una célula de levadura o un organismo eucariota unicelular.
(VI) Procedimientos para Aumentar la Eficacia de la Modificación Genómica, Transcripcional o Epigenética Dirigida
Otro aspecto de la presente divulgación abarca procedimientos para aumentar la eficiencia de la modificación genómica dirigida, la modificación transcripcional dirigida o la modificación epigenética dirigida en células eucariotas por medio del aumento de la accesibilidad de una proteína de modificación del ADN programable a su secuencia diana en el ADN cromosómico. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende introducir en la célula eucariota de interés al menos una de las proteínas de fusión descritas anteriormente en la sección (I), al menos uno de los complejos CRISPR descritos anteriormente en la sección (II), o el ácido nucleico que codifica la al menos una proteína de fusión o el complejo CRISPR como se describe anteriormente en la sección (III), y opcionalmente, un polinucleótido donante.
La proteína de modificación del ADN programable de la proteína de fusión está diseñada para reconocer y unirse a una secuencia diana en el ADN cromosómico, y los uno o más dominios proteicos de interacción con el nucleosoma de la proteína de fusión interactúan con los nucleosomas en la secuencia diana o cerca de ella para alterar o remodelar la estructura nucleosómica y/o de la cromatina. Como consecuencia, la proteína de modificación del ADN tiene un mayor acceso a la secuencia cromosómica diana, de forma que aumenta la eficacia de la modificación por parte de la proteína de modificación del ADN. En realizaciones específicas, la proteína de fusión comprende al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma enlazado a una nucleasa CRISPR, de forma que las interacciones entre el dominio de proteína de interacción con el nucleosoma y los nucleosomas/cromatina en la secuencia diana o cerca de ella aumentan la eficacia de las modificaciones genómicas dirigidas (véanse los Ejemplos 1 a 8).
Por lo tanto, los procedimientos desvelados en la presente memoria pueden aumentar la eficiencia de la edición del genoma dirigido (por ejemplo, correcciones de genes, knock-outs de genes, knock-ins de genes, y similares), modificaciones epigenéticas dirigidas, y la regulación transcripcional dirigida.
(a) Introducción en la Célula
Como se ha mencionado anteriormente, el procedimiento comprende introducir en la célula al menos una proteína de fusión, al menos un complejo CRISPR, o ácidos nucleicos que codifican dicha proteína de fusión o complejo CRISPR (y, opcionalmente, un polinucleótido donante). La al menos una proteína de fusión, el complejo CRISPR o los ácidos nucleicos se pueden introducir en la célula de interés por diversos medios.
En algunas realizaciones, la célula puede ser transfectada con las moléculas apropiadas (es decir, proteínas, ADN y/o ARN). Los procedimientos de transfección adecuados incluyen la nucleofección (o electroporación), la transfección mediada por fosfato de calcio, la transfección por polímeros catiónicos (por ejemplo, DEAE-dextrano o polietilenimina), la transducción viral, la transfección de virosomas, la transfección de viriones, la transfección de liposomas, la transfección de liposomas catiónicos, la transfección de lípidos no liposomales, la transfección de dendrímeros, la transfección por choque térmico, la magnetofección, la lipofección, la entrega de pistolas de genes, la impalefección, la sonoporación, la transfección óptica y la captación de ácidos nucleicos potenciada por agentes propios. Los procedimientos de transfección son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, Nueva York, 2003 o "Molecular Cloning: A Laboratory Manual' Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3ra edición, 2001). En otras realizaciones, las moléculas se pueden introducir en la célula por microinyección. Por ejemplo, las moléculas se pueden inyectar en el citoplasma o en los núcleos de las células de interés. La cantidad de cada molécula introducida en la célula puede variar, pero los expertos en la técnica están familiarizados con los medios para determinar la cantidad adecuada.
Las distintas moléculas se pueden introducir en la célula simultánea o secuencialmente. Por ejemplo, la proteína de fusión o el complejo CRISPR (o los ácidos nucleicos codificantes) y el polinucleótido donante se pueden introducir al mismo tiempo. Alternativamente, se puede introducir uno primero y luego el otro en la célula.
En general, la célula se mantiene en condiciones apropiadas para el crecimiento y/o mantenimiento celular. Las condiciones de cultivo celular adecuadas son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Santiago et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105:5809 a 5814 Moehle et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 2007, 104:3055 a 3060 Urnov et al., Nature, 2005, 435:646 a 651 y Lombardo et al., Nat. Biotechnol., 2007, 25:1298 a 1306. Los expertos en la técnica aprecian que los procedimientos de cultivo de células son conocidos en la técnica y pueden variar, y lo harán, en función del tipo de célula. La optimización rutinaria se puede utilizar, en todos los casos, para determinar las mejores técnicas para un tipo de célula concreto.
(b) Modificación Genómica o Epigenética Dirigida
Los uno o más dominios proteicos de interacción con el nucleosoma de la proteína de fusión o del complejo CRISPR interactúa con los nucleosomas y/o el ADN cromosómico en la secuencia cromosómica diana o cerca de ella, de forma que la estructura nucleosómica y/o de la cromatina se altera/remodela, para de ese modo aumentar la accesibilidad de la proteína de modificación del ADN programable de la proteína de fusión o de la proteína CRISPR del complejo CRISPR a la secuencia cromosómica diana. Un mayor acceso a la secuencia cromosómica diana da lugar a un aumento de la frecuencia/eficacia de la modificación genómica, transcripcional o epigenética diana.
En las realizaciones en las que la proteína de fusión comprende una proteína de modificación del ADN programable con actividad de nucleasa, la proteína de fusión puede escindir una o ambas cadenas de la secuencia cromosómica diana. Las roturas de doble cadena se pueden reparar por medio de un proceso de reparación de unión de extremos no homólogos (NHEJ). Dado que la NHEJ es propensa a errores, durante la reparación de la rotura se pueden producir indeles (es decir, supresiones o inserciones) de al menos un par de bases, sustituciones de al menos un par de bases o combinaciones de las mismas. En consecuencia, la secuencia cromosómica diana puede ser modificada, mutada o inactivada. Por ejemplo, una supresión, inserción o sustitución en el marco de lectura de una secuencia codificadora puede dar lugar a un producto proteico alterado, o a la ausencia de producto proteico (lo que se denomina "knock out"). En algunas iteraciones, el procedimiento además puede comprender la introducción en la célula de un polinucleótido donante (véase más adelante) que comprende una secuencia donante flanqueada por una secuencia que tiene una identidad de secuencia sustancial con las secuencias situadas a ambos lados de la secuencia cromosómica diana, de forma que durante la reparación de la rotura de doble cadena por medio de un proceso de reparación dirigido por homología (HDR) la secuencia donante en el polinucleótido donante se puede intercambiar con la secuencia cromosómica diana o integrarse en ella. La integración de una secuencia exógena se denomina "knock in"
Por lo tanto, en varias iteraciones, la eficiencia de la modificación del genoma dirigido se puede aumentar en al menos aproximadamente 0,1 veces, al menos aproximadamente 0,5 veces, al menos aproximadamente 1 vez, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, o al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, o más de aproximadamente 100 veces en relación con la proteína de modificación del ADN programable parental que no está enlazada a al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma.
En las realizaciones en las que la proteína de fusión comprende una proteína de modificación del ADN programable con actividad no nucleásica, la proteína de fusión puede modificar el ADN o las proteínas asociadas en la secuencia cromosómica diana o modificar la expresión de la secuencia cromosómica diana. Por ejemplo, cuando la proteína de modificación del ADN programable comprende una actividad de modificación epigenética, se puede modificar el estado de acetilación, metilación, fosforilación, adenilación, etc. de las histonas o el estado de metilación, aminación, etc. del ADN. Como ejemplo, en las realizaciones en las que la proteína de modificación del ADN programable comprende actividad de citidina desaminasa, uno o más residuos de citidina en la secuencia cromosómica diana se pueden convertir en residuos de uridina. Alternativamente, cuando la proteína de modificación del ADN programable comprende actividad de activación o represión transcripcional, la transcripción en la secuencia cromosómica diana puede aumentar o disminuir.
La modificación epigenética o la regulación transcripcional resultante puede aumentar al menos en aproximadamente 0,1 veces, al menos en aproximadamente 0,5 veces, al menos en aproximadamente 1 vez, al menos en aproximadamente 2 veces, al menos en aproximadamente 5 veces, al menos en aproximadamente 10 veces, o al menos en aproximadamente 20 veces, al menos en aproximadamente 50 veces, al menos en aproximadamente 100 veces, o más de aproximadamente 100 veces en relación con la proteína de modificación del ADN programable parental que no está enlazada a al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma.
Las modificaciones genómicas, transcripcionales y epigenéticas detalladas anteriormente se pueden llevar a cabo de forma individual o multiplexada (es decir, dos o más secuencias cromosómicas pueden ser dirigidas simultáneamente).
(c) Polinucleótido Donante Opcional
En las realizaciones en las que la proteína de fusión comprende una proteína de modificación del ADN programable que tiene actividad de nucleasa, el procedimiento además puede comprender la introducción de al menos un polinucleótido donante en la célula. El polinucleótido donante puede ser monocatenario o bicatenario, lineal o circular, y/o ARN o ADN. En algunas realizaciones, el polinucleótido donante puede ser un vector, por ejemplo, un vector plasmídico.
El polinucleótido donante comprende al menos una secuencia donante. En algunos aspectos, la secuencia donante del polinucleótido donante puede ser una versión modificada de una secuencia cromosómica endógena o nativa. Por ejemplo, la secuencia donante puede ser esencialmente idéntica a una porción de la secuencia cromosómica en o cerca de la secuencia diana de la proteína de modificación del ADN, pero que comprende al menos un cambio de nucleótido. De este modo, tras la integración o el intercambio con la secuencia nativa, la secuencia en la localización cromosómica diana comprende al menos un cambio de nucleótidos. Por ejemplo, el cambio puede ser una inserción de uno o más nucleótidos, una supresión de uno o más nucleótidos, una sustitución de uno o más nucleótidos, o combinaciones de los mismos. Como consecuencia de la integración de la "corrección genética" de la secuencia modificada, la célula puede producir un producto génico modificado a partir de la secuencia cromosómica diana. En otros aspectos, la secuencia donante del polinucleótido donante puede ser una secuencia exógena. Como se utiliza en la presente memoria, una secuencia "exógena" se refiere a una secuencia que no es nativa de la célula, o a una secuencia cuya ubicación nativa se encuentra en un lugar diferente del genoma de la célula. Por ejemplo, la secuencia exógena puede comprender una secuencia codificadora de proteínas, que puede estar enlazada de forma operativa a una secuencia exógena de control del promotor, de forma que, tras la integración en el genoma, la célula sea capaz de expresar la proteína codificada por la secuencia integrada. Alternativamente, la secuencia exógena se puede integrar en la secuencia cromosómica de forma que su expresión esté regulada por una secuencia de control del promotor endógeno. En otras iteraciones, la secuencia exógena puede ser una secuencia de control transcripcional, otra secuencia de control de expresión, una secuencia codificadora de ARN, etc. Como se ha señalado anteriormente, la integración de una secuencia exógena en una secuencia cromosómica se denomina "knock in"
Como pueden apreciar los expertos en la técnica, la longitud de la secuencia donante puede variar y lo hará. Por ejemplo, la secuencia donante puede variar en longitud desde varios nucleótidos a cientos de nucleótidos a cientos de miles de nucleótidos.
Típicamente, la secuencia donante en el polinucleótido donante está flanqueada por una secuencia corriente arriba y una secuencia corriente abajo, que tienen una identidad de secuencia sustancial con secuencias situadas corriente arriba y corriente abajo, respectivamente, de la secuencia diana de la proteína de modificación del ADN programable. Debido a estas similitudes de secuencia, las secuencias ascendentes y descendentes del polinucleótido donante permiten la recombinación homóloga entre el polinucleótido donante y la secuencia cromosómica diana, de forma que la secuencia donante se puede integrar en la secuencia cromosómica (o intercambiarse con ella).
La secuencia ascendente, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comparte una identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosómica ascendente de la secuencia a la que se dirige la proteína de modificación del ADN programable. Del mismo modo, la secuencia descendente se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comparte una identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosómica descendente de la secuencia a la que se dirige la proteína de modificación del ADN programable. Como se utiliza en la presente memoria, la frase "identidad de secuencia sustancial" se refiere a las secuencias que tienen al menos un 75% de identidad de secuencia. De este modo, las secuencias corriente arriba y corriente abajo en el polinucleótido donante pueden tener aproximadamente un 75%, un 76%, un 77%, un 78%, un 79%, un 80%, un 81%, un 82%, un 83%, un 84%, un 85%, un 86%, un 87%, un 88%, un 89%, un 90%, un 91%, un 92%, un 93%, un 94%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99% de identidad de secuencia con la secuencia corriente arriba o corriente abajo de la secuencia diana. En una realización ejemplar, las secuencias corriente arriba y corriente abajo del polinucleótido donante pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente el 95% o el 100% con las secuencias cromosómicas corriente arriba o corriente abajo de la secuencia diana de la proteína de modificación del ADN programable.
En algunas realizaciones, la secuencia corriente arriba comparte una identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosómica situada inmediatamente corriente arriba de la secuencia diana de la proteína de modificación del ADN programable. En otras realizaciones, la secuencia ascendente comparte una identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosómica que se encuentra dentro de aproximadamente cien (100) nucleótidos ascendentes de la secuencia diana. De este modo, por ejemplo, la secuencia ascendente puede compartir una identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosómica que se encuentra entre 1 y 20, entre 21 y 40, entre 41 y 60, entre 61 y 80, o entre 81 y 100 nucleótidos corriente arriba de la secuencia diana. En algunas realizaciones, la secuencia descendente comparte una identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosómica situada inmediatamente después de la secuencia a la que se dirige la proteína de modificación del ADN programable. En otras realizaciones, la secuencia descendente comparte una identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosómica que se encuentra dentro de aproximadamente cien (100) nucleótidos corriente abajo de la secuencia diana. De este modo, por ejemplo, la secuencia descendente puede compartir una identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosómica que se encuentra entre 1 y 20, entre 21 y 40, entre 41 y 60, entre 61 y 80, o entre 81 y 100 nucleótidos corriente abajo de la secuencia diana.
Cada secuencia ascendente o descendente puede tener una longitud de aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 5000 nucleótidos. En algunas realizaciones, las secuencias ascendentes y descendentes pueden comprender aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2800, 3000, 3200, 3400, 3600, 3800, 4000, 4200, 4400, 4600, 4800, o 5000 nucleótidos. En realizaciones específicas, las secuencias ascendentes y descendentes pueden tener una longitud de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1500 nucleótidos.
(d) Tipos de Células
Una variedad de células son adecuadas para su uso en los procedimientos desvelados en la presente memoria. En general, la célula es una célula eucariota. Por ejemplo, la célula puede ser una célula humana, una célula de mamífero no humano, una célula de vertebrado no mamífero, una célula de invertebrado, una célula de insecto, una célula de planta, una célula de levadura o un organismo eucariota unicelular. En algunas realizaciones, la célula también puede ser un embrión unicelular. Por ejemplo, un embrión de mamífero no humano, que incluye embriones de rata, hámster, roedores, conejos, felinos, caninos, ovinos, porcinos, bovinos y primates. En otras realizaciones, la célula puede ser una célula madre tales como las células madre embrionarias, las células madre tipo ES, las células madre fetales, las células madre adultas, y similares. En una realización, la célula madre no es una célula madre embrionaria humana. Además, las células madre pueden incluir las llevadas a cabo por las técnicas desveladas en WO2003/046141 o Chung et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2:113 a 117). La célula puede ser in vitro o in vivo (es decir, dentro de un organismo). En realizaciones ejemplares, la célula es una célula de mamífero o una línea celular de mamífero. En determinadas realizaciones, la célula es una célula humana o una línea celular humana.
Los ejemplos no limitantes de células o líneas celulares de mamíferos adecuadas incluyen células de riñón embrionario humano (HEK293, HEK293T); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de osteosarcoma humano U2-OS, células humanas A549, células humanas A-431 y células humanas K562; células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de hámster bebé (BHK); células de mieloma de ratón NS0, células de fibroblasto embrionario de ratón 3T3 (NIH3T3), células de linfoma B de ratón A20; células de melanoma de ratón B16; células de mioblasto de ratón C2C12; células de mieloma de ratón SP2/0; células de mesénquima de ratón C3H-10T1/2; células de carcinoma de ratón CT26, células de próstata de ratón DuCuP; células de mama de ratón EMT6; células de hepatoma de ratón Hepa1c1c7; células de mieloma de ratón J5582; células epiteliales de ratón MTD-1A; células de miocardio de ratón MyEnd; células renales de ratón RenCa; células pancreáticas de ratón RIN-5F; células de melanoma de ratón X64; células de linfoma de ratón YAC-1; células de glioblastoma de rata 9L; células de linfoma B de rata RBL; células de neuroblastoma de rata B35; células de hepatoma de rata (HTC); células de hígado de rata de búfalo BRL 3A; células de riñón canino (MDCK); células mamarias caninas (CMT); células de osteosarcoma de rata D17; células de monocitos/macrófagos de rata DH82; células de fibroblastos transformados SV-40 de riñón de mono (COS7); células de riñón de mono CVI-76; células de riñón de mono verde africano (VERO-76). En el catálogo de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) se puede encontrar una amplia lista de líneas celulares de mamíferos. (VII) Procedimientos de Detección de Loci Genómicos Específicos
En las realizaciones en las que la proteína de fusión comprende una modificación programable del ADN que tiene actividad no nucleásica o el complejo CRISPR comprende una proteína CRISPR catalíticamente inactiva que tiene actividad no nucleásica, dicha proteína de fusión o complejo CRISPR se puede utilizar en procedimientos para detectar o visualizar loci genómicos específicos en células eucariotas. En tales realizaciones, la proteína de fusión o la proteína CRISPR del complejo además comprende al menos una etiqueta detectable, tal como un fluoróforo (por ejemplo, FAM, TMR, Cy3, Cy5, Rojo Texas, Verde Oregon, Flúor Alexa, etiquetas Halo, o un colorante fluorescente adecuado), una etiqueta de detección (por ejemplo, biotina, digoxigenina y similares), puntos cuánticos o partículas de oro. Alternativamente, el ARN guía del complejo CRISPR además puede comprender una etiqueta detectable para la detección in situ (por ejemplo, FISH o CISH). El dominio de al menos una proteína de interacción con el nucleosoma de la proteína de fusión o del complejo CRISPR aumenta el acceso de la proteína de modificación del ADN programable o de la proteína CRISPR con actividad no nucleasa a la secuencia cromosómica diana, para de ese modo mejorar la detección de loci genómicos específicos o de secuencias cromosómicas diana.
El procedimiento comprende la introducción en la célula eucariota de la proteína de fusión detectablemente etiquetada, el complejo CRISPR detectablemente etiquetado o el ácido nucleico codificador, y la detección de la proteína de modificación del ADN programable etiquetada o de la proteína CRISPR etiquetada unida a la secuencia cromosómica diana. La detección se puede llevar a cabo por medio de imágenes dinámicas de células vivas, microscopía fluorescente, microscopía confocal, inmunofluorescencia, inmunodetección, unión ARN-proteína, unión proteína-proteína, y similares. La etapa de detección se puede llevar a cabo en células vivas o en células fijadas. En las realizaciones en las que el procedimiento comprende la detección de la dinámica estructural de la cromatina en células vivas, la proteína de fusión detectablemente etiquetada o el complejo CRISPR detectablemente etiquetado se pueden introducir en la célula como proteínas o ácidos nucleicos. En las realizaciones en las que el procedimiento comprende la detección de la secuencia cromosómica diana en células fijadas, la proteína de fusión marcada de forma detectable o el complejo CRISPR marcado de forma detectable se pueden introducir en la célula como proteínas (o complejos proteína-ARN). Los medios para fijar y permeabilizar las células son bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, las células fijadas se pueden someter a procesos de desnaturalización química y/o térmica para convertir el ADN cromosómico de doble cadena en ADN de cadena simple. En otras realizaciones, las células fijadas no se someten a procesos de desnaturalización química y/o térmica.
(VIII) Aplicaciones
Las composiciones y procedimientos desvelados en la presente memoria se pueden utilizar en una variedad de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, industriales y de investigación. En algunas realizaciones, la presente divulgación se puede utilizar para modificar cualquier secuencia cromosómica de interés en una célula, animal o planta con el fin de modelar y/o estudiar la función de los genes, estudiar las condiciones genéticas o epigenéticas de interés, o estudiar las vías bioquímicas implicadas en diversas enfermedades o trastornos. Por ejemplo, se pueden crear organismos transgénicos que modelen enfermedades o trastornos, en los que se altere la expresión de una o más secuencias de ácido nucleico asociadas a una enfermedad o trastorno. El modelo de enfermedad se puede utilizar para estudiar los efectos de las mutaciones en el organismo, estudiar el desarrollo y/o la progresión de la enfermedad, estudiar el efecto de un compuesto farmacéuticamente activo en la enfermedad, y/o evaluar la eficacia de una posible estrategia de terapia génica.
En otras realizaciones, las composiciones y los procedimientos se pueden utilizar para llevar a cabo pantallas genómicas funcionales eficientes y rentables, que se pueden utilizar para estudiar la función de los genes implicados en un proceso biológico particular y cómo cualquier alteración en la expresión génica puede afectar al proceso biológico, o para llevar a cabo mutagénesis de barrido profundo o saturante de loci genómicos en conjunción con un fenotipo celular. La mutagénesis saturada o de barrido profundo se puede utilizar para determinar las características mínimas críticas y las vulnerabilidades discretas de los elementos funcionales necesarios para la expresión de los genes, la resistencia a los medicamentos y la reversión de la enfermedad, por ejemplo.
En otras realizaciones, las composiciones y procedimientos desvelados en la presente memoria se pueden utilizar para pruebas de diagnósti
determinación de opciones de tratamiento. Entre los ejemplos de pruebas de diagnóstico adecuadas se incluyen la detección de mutaciones específicas en las células cancerosas (por ejemplo, la mutación específica en EGFR, HER2 y similares), la detección de mutaciones específicas asociadas a enfermedades concretas (por ejemplo, repeticiones de trinucleótidos, mutaciones en p-giobina asociadas a la anemia de células falciformes, SNP específicos, etc.), detección de hepatitis, detección de virus (por ejemplo, Zika), etc.
En otras realizaciones, las composiciones y procedimientos desvelados en la presente memoria se pueden utilizar para corregir mutaciones genéticas asociadas con una enfermedad o trastorno particular tal como, por ejemplo, corregir mutaciones del gen de la globina asociadas con la enfermedad de células falciformes o la talasemia, corregir mutaciones en el gen de la adenosina deaminasa asociadas con la inmunodeficiencia combinada severa (SCID), reducir la expresión de HTT, el gen causante de la enfermedad de Huntington, o corregir mutaciones en el gen de la rodopsina para el tratamiento de la retinitis pigmentosa. Estas modificaciones se pueden llevar a cabo en las células ex vivo.
En otras realizaciones, las composiciones y los procedimientos desvelados en la presente memoria se pueden utilizar para generar plantas de cultivo con rasgos mejorados o mayor resistencia a las tensiones ambientales. La presente divulgación también se puede utilizar para generar animales de granja con rasgos mejorados o animales de producción. Por ejemplo, los cerdos tienen muchas características que los hacen atractivos como modelos biomédicos, especialmente en medicina regenerativa o xenotransplantes.
Definiciones
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el significado comúnmente entendido por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a los expertos una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2da Ed. 1994), The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988), The Glossary of Genetics, 5ta ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Los siguientes términos tienen el significado que se les atribuye, a menos que se especifique lo contrario.
Cuando se introducen elementos de la presente divulgación o las realizaciones preferidas de la misma, los artículos "un", "una", "el", "la", "dicho" y "dicha" pretenden significar que hay uno o más de los elementos. Los términos "que comprende", "que incluye" y "que tiene" pretenden ser inclusivos y significan que puede haber elementos adicionales a los enumerados.
El término "aproximadamente" cuando se utiliza en relación con un valor numérico, x, por ejemplo, significa x ± 5%. Como se utilizan en la presente memoria, los términos "complementario" o "complementariedad" se refieren a la asociación de ácidos nucleicos de doble cadena por emparejamiento de bases a través de enlaces de hidrógeno específicos. El emparejamiento de bases puede ser el estándar Watson-Crick (por ejemplo, 5'-A G T C-3' se empareja con la secuencia complementaria 3'-T C A G-5'). El emparejamiento de las bases también puede ser un enlace de hidrógeno Hoogsteen o Hoogsteen invertido. La complementariedad se mide normalmente con respecto a una región dúplex y, por tanto, excluye los salientes, por ejemplo. La complementariedad entre dos hebras de la región dúplex puede ser parcial y expresarse como un porcentaje (por ejemplo, 70%), si sólo algunas (por ejemplo, 70%) de las bases son complementarias. Las bases que no son complementarias son "no coincidentes" La complementariedad también puede ser completa (es decir, del 100%), si todas las bases de la región dúplex son complementarias.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "sistema CRISPR" se refiere a un complejo que comprende una proteína CRISPR (es decir, una nucleasa, una nickasa o una proteína catalíticamente muerta) y un ARN guía.
El término "secuencia endógena", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia cromosómica que es nativa de la célula.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "exógeno" se refiere a una secuencia que no es nativa de la célula, o a una secuencia cromosómica cuya ubicación nativa en el genoma de la célula se encuentra en una ubicación cromosómica diferente.
Un "gen", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una región de ADN (que incluye exones e intrones) que codifica un producto génico, así como a todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico, independientemente de que dichas secuencias reguladoras sean adyacentes a las secuencias codificantes y/o transcritas. En consecuencia, un gen incluye, pero no está necesariamente limitado a, secuencias promotoras, terminadoras, secuencias reguladoras de la traducción, tales como sitios de unión a ribosomas y sitios de entrada de ribosomas internos, potenciadores, silenciadores, aisladores, elementos límite, orígenes de replicación, sitios de unión a la matriz y regiones de control de locus.
El término "heterólogo" se refiere a una entidad que no es endógena o nativa de la célula de interés. Por ejemplo, una proteína heteróloga se refiere a una proteína que se deriva o se derivó originalmente de una fuente exógena, tal como una secuencia de ácido nucleico introducida exógenamente. En algunos casos, la proteína heteróloga no es producida normalmente por la célula de interés.
El término "nickasa" se refiere a una enzima que escinde una hebra de una secuencia de ácido nucleico de doble cadena (es decir, que corta una secuencia de doble cadena). Por ejemplo, una nucleasa con actividad de corte de doble cadena puede ser modificada por mutación y/o supresión para que funcione como una nickasa y corte sólo una cadena de una secuencia de doble cadena.
El término "nucleasa", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una enzima que escinde ambas cadenas de una secuencia de ácido nucleico de doble cadena.
Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refieren a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido, en conformación lineal o circular, y en forma de cadena simple o doble. A efectos de la presente divulgación, estos términos no se deben interpretar como limitativos con respecto a la longitud de un polímero. Los términos pueden abarcar análogos conocidos de los nucleótidos naturales, así como nucleótidos modificados en la base, el azúcar y/o los restos de fosfato (por ejemplo, esqueletos de fosforotioato). En general, un análogo de un determinado nucleótido tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases; es decir, un análogo de A se emparejará con T.
El término "nucleótido" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Los nucleótidos pueden ser nucleótidos estándar (es decir, adenosina, guanosina, citidina, timidina y uridina), isómeros de nucleótidos o análogos de nucleótidos. Un análogo de nucleótido se refiere a un nucleótido que tiene una base de purina o pirimidina modificada o una fracción de ribosa modificada. Un análogo de nucleótido puede ser un nucleótido natural (por ejemplo, inosina, pseudouridina, etc.) o un nucleótido no natural. Los ejemplos no limitantes de modificaciones en los restos de azúcares o bases de un nucleótido incluyen la adición (o eliminación) de grupos acetilo, grupos amino, grupos carboxilo, grupos carboximetilo, grupos hidroxilo, grupos metilo, grupos fosforilo y grupos tiol, así como la sustitución de los átomos de carbono y nitrógeno de las bases por otros átomos (por ejemplo, 7-deaza purinas). Los análogos de los nucleótidos también incluyen los dideoxi-nucleótidos, los 2'-O-metil-nucleótidos, los ácidos nucleicos bloqueados (LNA), los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y los morfolinos.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "proteína de modificación del ADN programable" se refiere a una proteína que está diseñada para unirse a una secuencia diana específica en el ADN cromosómico y que modifica el ADN o las proteínas asociadas al ADN en la secuencia diana o cerca de ella.
El término "identidad de secuencia", como se utiliza en la presente memoria, indica una medida cuantitativa del grado de identidad entre dos secuencias de longitud sustancialmente igual. El porcentaje de identidad de dos secuencias, ya sean de ácidos nucleicos o de aminoácidos, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido por la longitud de la secuencia más corta y multiplicado por 100. El algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482 a 489 (1981). Este algoritmo se puede aplicar a las secuencias de aminoácidos mediante el uso de la matriz de puntuación desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 supl. 3:353 a 358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EE.UU.y normalizado por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745 a 6763 (1986). Una implementación ejemplar de este algoritmo para determinar el porcentaje de identidad de una secuencia es proporcionada por Genetics Computer Group (Madison, Wis.) en la aplicación de utilidad "BestFit". Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias son generalmente conocidos en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, utilizado con parámetros por defecto. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP se pueden utilizar con los siguientes parámetros por defecto: código genético=estándar; filtro=ninguno; cadena=ambas; corte=60; espera=10; matriz=BLOSUM62; descripciones=50 secuencias; ordenar por=PUNTAJE ALTO; bases de datos=no redundantes, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+traducciones CDS de GenBank+proteínas suizas+Spupdate+PIR. Los detalles de estos programas se pueden encontrar en el sitio web de GenBank. En general, las sustituciones son sustituciones de aminoácidos conservadoras: se limitan a intercambios dentro de los miembros del grupo 1: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; grupo 2: serina, cisteína, treonina y metionina; grupo 3: prolina; grupo 4: fenilalanina, tirosina y triptófano; grupo 5: aspartato, glutamato, asparagina y glutamina.
Los términos "secuencia diana", "secuencia cromosómica diana" y "sitio diana" se utilizan indistintamente para referirse a la secuencia específica del ADN cromosómico a la que se dirige la proteína de modificación del ADN programable, y al sitio en el que la proteína de modificación del ADN programable modifica el ADN o las proteínas asociadas al ADN.
Las técnicas para determinar la identidad de secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos son conocidas en la técnica. Típicamente, tales técnicas incluyen la determinación de la secuencia de nucleótidos del ARNm de un gen y/o la determinación de la secuencia de aminoácidos codificada por el mismo, y la comparación de estas secuencias con una segunda secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Las secuencias genómicas también se pueden determinar y comparar de este modo.
En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas, respectivamente. Dos o más secuencias (de polinucleótidos o aminoácidos) se pueden comparar por medio de la determinación de su porcentaje de identidad. Dado que se pueden llevar a cabo varios cambios en las células y procedimientos descritos anteriormente sin apartarse del alcance de la invención, se pretende que todo el material contenido en la descripción anterior y en los ejemplos que se dan a continuación, se interprete como ilustrativo y no en un sentido limitante.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran ciertos aspectos de la divulgación. La Tabla 1 enumera las secuencias peptídicas de los dominios de interacción con el nucleosoma y la Tabla 2 presenta las secuencias cromosómicas diana utilizadas en los Ejemplos 1 a 8 que se presentan a continuación.
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Ejemplo 1. Mejora de la actividad de Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) mediante el uso del dominio HMGB1 box A humano
Se fusionó un dominio HMGB1 caja A humano (SEC. ID NÚM.: 40) con SpCas9 (+NLS) en el extremo carboxilo de la nucleasa con el enlazador LEg Gg S (SEC. ID NÚM.: 1) entre Cas9 y el dominio HMGB1 caja A. Se transfectaron células humanas K562 (1 * 106) con ADN de plásmido que codificaba la proteína de fusión o la proteína SpCas9 de tipo salvaje en cantidades molares equivalentes (5,2 y 5,0 |jg para la proteína de fusión y la proteína Cas9 de tipo salvaje, respectivamente) en combinación con 3 jg de un plásmido de ARNsg para dirigir un sitio genómico (Núm. 1) en el locus de la citocromo p450 oxidorreductasa (POR) humana. La transfección se llevó a cabo por medio de nucleofección en un nucleofector Amaxi. Tres días después de la transfección, las células se lisaron con una solución de extracción de ADN (QuickExtract™) y se amplificó la región genómica diana por medio de PCR. Las actividades de escisión de la nucleasa Cas9 (% de indeles) se midieron por medio de ensayos Cel-I. Como se muestra en la Tabla 3, la fusión del dominio de la caja A del HMGB1 humano con la nucleasa aumentó la eficiencia de corte de SpCas9 en el sitio diana.
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Ejemplo 2. Mejora de la actividad de Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) mediante el uso de HMGN1, HMGN2, HMGN3a y HMGN3b humanos
Las HMGN1, HMGN2, HMGN3a y HMGN3b humanas (SEC. ID NÚMS.: 41 a 44, respectivamente) se fusionaron cada una con SpCas9 (+NLS) en el extremo carboxilo de la nucleasa con el enlazador LEGGGS (SEC. ID NÚM.: 1) entre Cas9 y cada uno de los péptidos HMGN. Se transfectaron células humanas K562 (1 * 106) con ADN de plásmido que codificaba cada una de las proteínas de fusión o la proteína SpCas9 de tipo salvaje en cantidades molares equivalentes (5,2 y 5,0 jg para cada una de las proteínas de fusión y la proteína Cas9 de tipo salvaje, respectivamente) en combinación con 3 jg de un plásmido de ARNsg para dirigir un sitio genómico (Núm. 1) en el locus de la citocromo p450 oxidorreductasa (POR) humana. La transfección se llevó a cabo por medio de nucleofección en un nucleofector Amaxi. Tres días después de la transfección, las células se lisaron con una solución de extracción de ADN (QuickExtract™) y se amplificó la región genómica diana por medio de PCR. Las actividades de escisión de la diana Cas9 (% de indeles) se midieron por medio de ensayos Cel-I. Los resultados, resumidos en la Tabla 4, muestran que la fusión de cada uno de los péptidos HMGN humanos con la nucleasa aumentó la eficiencia de corte de SpCas9 en el sitio diana.
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Ejemplo 3. Mejora de la actividad de Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) mediante el uso del dominio globular central de la histona H1 humana
Se fusionó un dominio globular central de histona H1 humana (SEC. ID NÚM.: 45) con SpCas9 (+NLS) en el extremo carboxilo de la nucleasa con el enlazador LEGGGS (SEC. ID NÚM.: 1) entre Cas9 y el dominio globular. Se transfectaron células humanas K562 (1 * 106) con ADN de plásmido que codificaba la proteína de fusión o la proteína SpCas9 de tipo salvaje en cantidades molares equivalentes (5,2 y 5,0 jg para la proteína de fusión y la proteína Cas9 de tipo salvaje, respectivamente) en combinación con 3 jg de un plásmido de ARNsg para dirigir un sitio genómico (Núm. 1) en el locus de la citocromo p450 oxidorreductasa (POR) humana. La transfección se llevó a cabo por medio de nucleofección en un nucleofector Amaxi. Tres días después de la transfección, las células se lisaron con una solución de extracción de ADN (QuickExtract™) y se amplificó la región genómica diana por medio de PCR. Las actividades de escisión de la diana Cas9 (% de indeles) se midieron por medio de ensayos Cel-I. Los resultados se presentan en la Tabla 5. La fusión del dominio globular central de la histona H1 humana con la nucleasa aumentó la eficiencia de corte de SpCas9 en el sitio diana.
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Ejemplo 4. Mejora de la actividad de Streptococcuspyogenes Cas9 (SpCas9) mediante el uso de un dominio de unión al ADN de una proteína remodeladora de la cromatina
SpCas9 (+NLS) se fusionó con el dominio de unión al ADN de la ATPasa del complejo de remodelación de la cromatina ISWI de levadura (SEC. ID NÚM.: 46) en el extremo amino de la nucleasa con el enlazador TGSG (SEC. ID NÚM.: 2) entre Cas9 y el dominio de unión al ADN. Independientemente, la SpCas9 de tipo salvaje se fusionó con el dominio de unión al ADN de la proteína 1 que contiene el cromodominio de la levadura (CHD1) (SEC. ID NÚM.: 47) en el extremo carboxilo de la nucleasa con el enlazador LEGGGS (SEC. ID NÚM.: 1) entre Cas9 y el dominio de unión al ADN. Se transfectaron células humanas K562 (1 * 106) con ADN de plásmido que codificaba cada una de las proteínas de fusión o la proteína SpCas9 de tipo salvaje en cantidades molares equivalentes (6,0 y 5,0 |jg para cada una de las proteínas de fusión y la proteína Cas9 de tipo salvaje, respectivamente) en combinación con 3 jg de un plásmido de ARNsg para dirigir un sitio genómico (Núm. 1) en el locus de la citocromo p450 oxidorreductasa (POR) humana. La transfección se llevó a cabo por medio de nucleofección en un nucleofector Amaxi. Tres días después de la transfección, las células se lisaron con una solución de extracción de ADN (QuickExtract™) y se amplificó la región genómica diana por medio de PCR. Las actividades de escisión de la diana Cas9 (% de indeles) se midieron por medio de ensayos Cel-I. Los resultados, resumidos en la Tabla 6, muestran que la fusión de cada uno de los dominios de unión al ADN con la nucleasa aumentó la eficiencia de corte de SpCas9 en el sitio diana.
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Ejemplo 5. Mejora de la actividad de Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) por medio de combinaciones de dominios de interacción con nucleosomas
SpCas9 (+NLS) se fusionó con la HMGN1 humana (SEC. ID NÚM.: 41) en el extremo amino de la nucleasa con el enlazador TGSG (SEC. ID NÚM.: 2) entre Cas9 y HMGN1 y con el dominio caja A de la HMGB1 humana (SEC. ID NÚM.: 40) o el dominio globular central de la histona H1 humana (SEC. ID Nú M.: 45) o el dominio de unión al ADN de la proteína 1 que contiene el cromodominio de la levadura (CHD1) (SEC. ID NÚM.: 47) en el extremo carboxilo de la nucleasa con el enlazador LEGGGS (SEC. ID NÚM.: 1) entre Cas9 y cada uno de los dominios proteicos. Se transfectaron células humanas K562 (1 * 106) con ADN de plásmido que codificaba cada una de las proteínas de fusión o la proteína SpCas9 de tipo salvaje en cantidades molares equivalentes (5,4 jg para las proteínas de fusión de la caja A de HMGB1 y el dominio globular central H1, 6,0 jg para la proteína de fusión del dominio de unión al ADN CHD1 y 5,0 jg para la proteína Cas9 de tipo salvaje) en combinación con 3 jg de un plásmido de ARNsg para dirigirse a un sitio genómico (Núm. 1, Núm. 2, Núm. 3) en el locus de la citocromo p450 oxidorreductasa humana (POR), o a un sitio genómico (Núm. 1) del locus del receptor nuclear humano subfamilia 1 grupo I miembro 3 (CAR), o a un sitio genómico (Núm. 1, Núm. 2) del locus de la homeobox humana de espiráculos vacíos 1 (EMX1). La transfección se llevó a cabo por medio de nucleofección en un nucleofector Amaxi. Cinco días después de la transfección, las células se lisaron con una solución de extracción de ADN (QuickExtract™) y cada región genómica diana se amplificó por PCR. Las actividades de escisión de la diana Cas9 (% de indeles) se midieron por medio de ensayos Cel-I. Los resultados, resumidos en la Tabla 7, muestran que la fusión combinada de estos dominios proteicos con la nucleasa aumentó la eficiencia de corte de SpCas9 en los sitios diana.
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Ejemplo 6. Mejora de la actividad de Streptococcus pasteurianus Cas9 (SpaCas9) por medio de combinaciones de dominios de interacción con nucleosomas
Streptococcus pasteurianus Cas9 (SpaCas9) (+NLS) se fusionó con la HMGN1 humana (SEC. ID NÚM.: 41) en el extremo amino de la nucleasa con el enlazador TGSG (SEC. ID NÚM.: 2) entre Cas9 y HMGN1 y con el dominio de caja A de HMGB1 humana (SEC. ID NÚM.: 41) o el dominio globular central de la histona H1 humana (SEC. ID NÚM.: 45) o el dominio de unión al ADN de la proteína 1 que contiene el cromodominio de la levadura (CHD1) (SEC. ID NÚM.: 47) en el extremo carboxilo de la nucleasa con el enlazador LEGGGS (SEC. ID NÚM.: 1) entre Cas9 y cada uno de los dominios proteicos. Se transfectaron células humanas K562 (1 * 106) con ADN plasmídico que codificaba cada una de las proteínas de fusión o la proteína SpaCas9 de tipo salvaje en cantidades molares equivalentes (5,4 y 5,0 |jg para cada una de las proteínas de fusión y la proteína Cas9 de tipo salvaje, respectivamente) en combinación con 3 jg de un plásmido de ARNsg para dirigirse a un sitio genómico (Núm. 1, Núm. 2) en el locus de la citocromo p450 oxidorreductasa (POR) humana. La transfección se llevó a cabo por medio de nucleofección en un nucleofector Amaxi. Tres días después de la transfección, las células se lisaron con una solución de extracción de ADN (QuickExtract™) y se amplificó la región genómica diana por medio de PCR. Las actividades de escisión de la diana Cas9 (% de indeles) se midieron por medio de ensayos Cel-I. Como se resume en la Tabla 8, la fusión combinada de estos dominios proteicos con la nucleasa aumentó la eficiencia de corte de SpaCas9 en los sitios diana.
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Ejemplo 7. Mejora de la actividad de Francisella novicida Cpf1 (FnCpfl) por medio de combinaciones de dominios de interacción con nucleosomas
La Cpf1 de Francisella novicida (FnCpf1) (+NLS) se fusionó con la HMGN1 humana (SEC. ID NÚM.: 41) en el extremo amino de la nucleasa con el enlazador TGSG (SEC. ID NÚM.: 2) entre la Cpf1 y la HMGN1 y con el dominio caja A de la HMGB1 humana (SEC. ID NÚM.: 40) o el dominio globular central de la histona H1 humana (SEC. ID NÚM.: 45) o el dominio de unión al ADN de la proteína 1 que contiene el cromodominio de la levadura (CHD1) (SEC. ID NÚM.: 47) en el extremo carboxilo de la nucleasa con el enlazador LEGGGS (SEC. ID NÚM.: 1) entre Cpf1 y cada uno de los dominios proteicos. Se transfectaron células K562 humanas (1 * 106) con ADN plasmídico que codificaba cada una de las proteínas de fusión o la proteína FnCpf1 de tipo salvaje en cantidades molares equivalentes (5,4 y 5,0 jg para cada una de las proteínas de fusión y la proteína Cas9 de tipo salvaje, respectivamente) en combinación con 3 jg de un plásmido de ARNsg para dirigir un sitio genómico (Núm. 1, Núm. 2, Núm. 3) en el locus de la citocromo p450 oxidorreductasa (POR) humana. La transfección se llevó a cabo por medio de nucleofección en un nucleofector Amaxi. Tres días después de la transfección, las células se lisaron con una solución de extracción de ADN (QuickExtract™) y se amplificó la región genómica diana por medio de PCR. Las actividades de escisión de la diana Cas9 (% de indeles) se midieron por medio de ensayos Cel-I. Los resultados, resumidos en la Tabla 9, muestran que la fusión combinada de estos dominios proteicos con la nucleasa aumentó la eficiencia de corte de FnCpfl en los sitios diana.
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Ejemplo 8. Mejora de la eficacia de la edición génica de Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9)
Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9) (+NLS) se fusionó con la HMGN1 humana (SEC. ID NÚM.: 41) en el extremo amino de la nucleasa con el enlazador TGSG (SEC. ID NÚM.: 2) entre Cas9 y HMGN1 y con el dominio de caja A de HMGB1 humana (SEC. ID NÚM.: 40) o el dominio globular central de la histona H1 humana (SEC. ID NÚM.: 45) en el extremo carboxilo de la nucleasa con el enlazador LEGGGS (SEC. ID NÚM.: 1) entre Cas9 y cada uno de los dominios proteicos. El ARNg CjCas9 de tipo salvaje se modificó por medio de la introducción de una mutación de U a C en la región de repetición constante del ARNcr y una mutación correspondiente de A a G en la región 5' de la secuencia del ARNtr. La secuencia de ARNsg modificada es: 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNGUUCUAGUCCCUGAAAAGGGACUAGAAUAA AGAGUUUGCGGGACUCUGCGGGUUACCCCUAAACCGCUUUU-3', donde los nucleótidos mutados en las partes de ARNcr y ARNtracr están subrayados. Se clonaron secuencias guía dirigidas a dos sitios diferentes (Núm. 1, Núm.
2) en el gen de la citocromo p450 oxidorreductasa humana (POR) en el andamio de ARN de tipo salvaje y en el de CjCas9 modificado, respectivamente. La expresión de los ARNsg estaba bajo el control de un promotor U6. Se transfectaron células humanas K562 (1* 106) con 4 |jg de ADN del plásmido CjCas9 y 3 |jg de ADN del plásmido ARNsg. La transfección se llevó a cabo por medio de nucleofección en un nucleofector Amaxi. Tres días después de la transfección, las células se lisaron con QuickExtract y las regiones genómicas seleccionadas se amplificaron por PCR. Las actividades de escisión del ADN diana de CjCas9 (% de indeles) se midieron por medio de ensayos Cel-I. Los resultados se presentan en la FIG. 1 y muestran que las proteínas de fusión tenían una mayor eficiencia de escisión en los sitios diana, y que el andamio de CjCas9 ARNsg modificado aumentó efectivamente la eficiencia de escisión de CjCas9 en los sitios diana.
La Tabla 10 presenta las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión específicas. Los dominios de la proteína de interacción con el nucleosoma se muestran en negrita, los enlazadores se muestran en cursiva y el NLS está subrayado.
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Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de fusión que comprende una proteína de repeticiones palindrómicas cortas regularmente intercaladas (CRISPR) unida a al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma,
en la que la proteína CRISPR es una nucleasa o nickasa CRISPR/Cas9 de tipo II, o la proteína CRISPR es una nucleasa o nickasa CRISPR/Cpf1 de tipo V, y
en la que la proteína de fusión además comprende al menos una señal de localización nuclear, al menos un dominio de penetración celular, al menos un dominio marcador, o una combinación de los mismos, y en la que el dominio de al menos una proteína de interacción con el nucleosoma es un dominio de unión al ADN de la caja del grupo de alta movilidad (HMG); una proteína de unión al nucleosoma HMG (HMGN); un dominio globular central de la histona H1, un dominio de unión al ADN de una proteína del complejo de remodelación de la cromatina elegida entre el complejo interruptor/sacarosa no fermentable (SWI/SNF), el complejo interruptor de imitación (ISWI), el complejo cromodominio-helicasa-unión al ADN (CHD), el complejo de remodelación del nucleosoma y desacetilasa (NuRD), el complejo INO80, el complejo SWR1 o el complejo RSC; o una combinación de los mismos.
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína CRISPR es una proteína CRISPR/Cas9 de tipo II modificada para carecer de toda actividad nucleasa y unida a un dominio no nucleasa, o una proteína CRISPR/Cpfl de tipo V modificada para carecer de toda actividad nucleasa y unida a un dominio no nucleasa.
3. La proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que el dominio no nucleasa tiene actividad de citosina desaminasa, actividad de histona acetiltransferasa, actividad de activación transcripcional o actividad de represión transcripcional.
4. La proteína de fusión de cualquier reivindicación anterior, en la que al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma es el dominio de la caja A de HMGB1, la proteína HMGN1, la proteína HMGN2, la proteína HMGN3a, la proteína HMGN3b, el dominio globular central de la histona H1, el dominio de unión al ADN de la proteína del interruptor de imitación (ISWI), el dominio de unión al ADN de la proteína 1 del cromodominiohelicasa (CHD1), o una combinación de los mismos.
5. La proteína de fusión de cualquier reivindicación anterior, en la que el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma está enlazado a la proteína CRISPR directamente a través de un enlace químico, indirectamente a través de un enlazador, o una combinación de los mismos, y/o en la que el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma está enlazado a la proteína CRISPR en su N-terminal, C-terminal, una ubicación interna, o una combinación de los mismos.
6. La proteína de fusión de cualquier reivindicación anterior, que comprende al menos una señal de localización nuclear.
7. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína CRISPR es Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9), Staphylococcus aureus (SaCas9), Francisella novicida Cas9 (FnCas9), Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9), Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9), Francisella novicida Cpfl (FnCpf1), Acidaminococcus sp. Cpfl (AsCpf1), o la bacteria Lachnospiraceae ND2006 Cpfl (LbCpf1).
8. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEC. ID NÚM.: 61, la SEC. ID NÚM.: 62, la SEC. ID NÚM.: 63, la SEC. ID NÚM.: 64, la SEC. ID NÚM.: 65, la SEC. ID NÚM.: 66, la SEC. ID NÚM.: 67, la SEC. ID NÚM.: 68, la SEC. ID NÚM.: 69, la SEC. ID NÚM.: 70, la SEC. ID NÚM.: 71, la SEC. ID NÚM.: 72, la SEC. ID NÚM.: 73, la SEC. ID NÚM.: 74, la SEC. ID NÚM.: 75, la SEC. ID NÚM.: 76, la SEC. ID NÚM.: 77, la SEC. ID NÚM.: 78 o la SEC. ID NÚM.: 79; opcionalmente, en el que la proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la Se C. ID NÚM.: 61, la Se C. ID NÚM.: 62, la SEC. ID NÚM.: 63, la SEC. ID NÚM.: 64, la SEC. ID NÚM.: 65, la SEC. ID NÚM.: 66, la SEC. ID NÚM.: 67, la SEC. ID NÚM.: 68, la SEC. ID NÚM.: 69, la SEC. ID NÚM.: 70, la SEC. ID NÚM.: 71, la SEC. ID NÚM.: 72, la SEC. ID NÚM.: 73, la SEC. ID NÚM.: 74, la SEC. ID NÚM.: 75, la SEC. ID NÚM.: 76, la SEC. ID NÚM.: 77, la SEC. ID NÚM.: 78 o la SEC. ID NÚM.: 79.
9. Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de cualquier reivindicación anterior, opcionalmente optimizado en codones para su traducción en una célula eucariótica, y/u opcionalmente que forma parte de un vector viral, un vector plasmídico o un ARN autorreplicante.
10. Un complejo que comprende al menos una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y al menos un Ar N guía.
11. Un kit que comprende la proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 o el complejo de acuerdo con la reivindicación 10.
12. Una célula eucariota que comprende la proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 o el complejo de acuerdo con la reivindicación 10.
13. Un procedimiento para aumentar la eficiencia de la modificación genómica o epigenética dirigida en una célula eucariota, el procedimiento comprende introducir en la célula eucariota:
(a) al menos una proteína de fusión o un ácido nucleico que codifica al menos una proteína de fusión, cada proteína de fusión comprende una proteína CRISPR unida a al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma, en el que la proteína CRISPR (i) tiene actividad nucleasa o nickasa o (ii) está modificada para carecer de toda actividad nucleasa y está unida a un dominio no nucleasa, en el que la proteína CRISPR es una proteína CRISPR/Cas9 de tipo II o una proteína CRISPR/Cpfl de tipo V, y en la que la al menos una proteína de fusión además comprende al menos una señal de localización nuclear, al menos un dominio de penetración celular, al menos un dominio marcador, o una combinación de los mismos;
(b) al menos un ARN guía o un ácido nucleico que codifique al menos un ARN guía;
en la que la proteína CRISPR de la al menos una proteína de fusión se dirige a una secuencia cromosómica diana y el dominio de la proteína de interacción con el nucleosoma de la al menos una proteína de fusión altera la estructura nucleosómica o de la cromatina de forma que la al menos una proteína de fusión tiene un mayor acceso a la secuencia cromosómica diana, para de ese modo aumentar la eficacia de la modificación genómica o epigenética dirigida,
en la que el dominio de al menos una proteína de interacción con el nucleosoma es un dominio de unión al ADN de la caja del grupo de alta movilidad (HMG); una proteína de unión al nucleosoma HMG (HMGN); un dominio globular central de la histona H1, un dominio de unión al ADN de una proteína del complejo de remodelación de la cromatina elegida entre el complejo interruptor/sacarosa no fermentable (SWI/SNF), el complejo interruptor de imitación (ISWI), el complejo cromodominio-helicasa-unión al ADN (CHD), el complejo de remodelación del nucleosoma y desacetilasa (NuRD), el complejo INO80, el complejo SWR1 o el complejo RSC; o una combinación de los mismos, y
en la que el procedimiento no comprende un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal por medio de cirugía o terapia.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el dominio no nucleasa tiene actividad de citosina desaminasa, actividad de histona acetiltransferasa, actividad de activación transcripcional o actividad de represión transcripcional.
15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, en el que el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma está enlazado a la proteína CRISPR directamente a través de un enlace químico, indirectamente a través de un enlazador, o una combinación de los mismos; y/o en el que el al menos un dominio de proteína de interacción con el nucleosoma está enlazado a la proteína CRISPR en su N-terminal, C-terminal, una ubicación interna, o una combinación de los mismos.
16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la al menos una proteína de fusión comprende al menos una señal de localización nuclear.
17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que el ácido nucleico que codifica la al menos una proteína de fusión está optimizado en codones para su traducción en la célula eucariota, y/o en el que el ácido nucleico que codifica la al menos una proteína de fusión forma parte de un vector viral, un vector plasmídico o un ARN autorreplicante.
18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que el procedimiento además comprende introducir en la célula eucariota al menos un polinucleótido donante, el polinucleótido comprende donante al menos una secuencia donante.
19. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en el que la célula eucariota es in vitro o in vivo, y/o en el que la célula eucariota es una célula de mamífero o una célula humana.
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