ES2903003T3 - Medios para generar vectores adenovirales para clonar grandes ácidos nucleicos - Google Patents

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Abstract

Una combinación de una molécula de ácido nucleico, que también se denomina como tercera molécula de ácido nucleico, y una molécula de ácido nucleico, que también se denomina como segunda molécula de ácido nucleico, en la que la tercera molécula de ácido nucleico comprende (1) una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos: (a) una primera parte de un genoma de un adenovirus, en el que la primera parte de un genoma de un adenovirus comprende exactamente una repetición terminal invertida de un adenovirus; (b) una secuencia de nucleótidos, preferiblemente una secuencia de nucleótidos genómica, o una unidad de transcripción; (c) una secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene actividad reguladora en un procariota; (d) exactamente un sitio de recombinación específico de sitio que se recombina en presencia de una recombinasa correspondiente; (e) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa; (f) una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva; y (g) un primer sitio de restricción; o (2) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 6; o (3) una molécula heteróloga de ácido nucleico que comprende una tercera molécula de ácido nucleico como se define en (1) contenida en el organismo depositado en la DSMZ bajo el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 23754; y en el que la segunda molécula de ácido nucleico comprende (1) una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos: (a) una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación de una sola copia, y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección; (b) exactamente un sitio de recombinación específico de sitio que se recombina en presencia de una recombinasa correspondiente; (c) una segunda parte de un genoma de un adenovirus, en la que la segunda parte de un genoma de un adenovirus comprende exactamente una repetición terminal invertida de un adenovirus; y (d) un sitio de restricción que se denomina como segundo sitio de restricción; o (2) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 14; o (3) una molécula heteróloga de ácido nucleico que comprende una segunda molécula de ácido nucleico como se define en (1) contenida en el organismo depositado en la DSMZ bajo el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 24298 y/o DSM 24299; en el que la segunda molécula de ácido nucleico y la tercera molécula de ácido nucleico son cada una e independientemente una molécula lineal o una molécula circular, preferiblemente la segunda molécula de ácido nucleico es una molécula circular y la tercera molécula de ácido nucleico es una molécula circular; en el que la segunda molécula de ácido nucleico y la tercera molécula de ácido nucleico se complementan entre sí para formar un genoma viral completo; y en el que la recombinasa que recombina el sitio de recombinación de la tercera molécula de ácido nucleico es la misma que la recombinasa que recombina el sitio de recombinación de la segunda molécula de ácido nucleico.

Description

DESCRIPCIÓN
Medios para generar vectores adenovirales para clonar grandes ácidos nucleicos
Campo de la invención
La presente invención está relacionada con una combinación de una molécula de ácido nucleico, que también se denomina como tercera molécula de ácido nucleico, y una molécula de ácido nucleico, que también se denomina como segunda molécula de ácido nucleico, una combinación de una molécula de ácido nucleico que también se denomina como primera molécula de ácido nucleico, y una molécula de ácido nucleico que también se denomina como segunda molécula de ácido nucleico, métodos para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus, métodos para la generación de una biblioteca de secuencias nucleicas, y que contiene al menos una combinación de la tercera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico o al menos una combinación de la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico.
Antecedentes de la invención
El desarrollo de virus recombinantes para la expresión génica desde los años 80 condujo a su amplia aplicación como vectores de expresión génica tanto in vitro como in vivo. La clonación y expresión de numerosos genes, incluidos los ácidos nucleicos no codificantes, como los pequeños ARN de interferencia que utilizan bibliotecas de expresión virales o no virales, se reconoce como una de las herramientas más poderosas en la genómica funcional y ya ha conducido al descubrimiento y la validación de nuevos genes diana de fármacos. La generación de bibliotecas de expresión basadas en virus requiere un procedimiento de clonación que produzca un gran número de clones precisos, preferiblemente sin necesidad de seleccionar recombinantes positivos, y asegurando la estabilidad de los genomas virales en las construcciones basadas en ADN durante la amplificación.
Particularmente, los vectores virales preferidos son los vectores adenovirales. La construcción de vectores adenovirales se puede realizar por diversos medios. Los primeros protocolos proporcionados en la literatura involucraron la co-transfección de células permisivas, generalmente líneas celulares que complementan genes como las células 293 o 911, con un plásmido lanzadera que contiene el extremo izquierdo del genoma viral, donde la región E1 típicamente se reemplaza con ADN extraño, y ADN viral aislado cortado cerca del extremo izquierdo del genoma por una enzima de restricción apropiada. La recombinación homóloga se produce in vivo entre las secuencias superpuestas del plásmido lanzadera y el ADN adenoviral produciendo un genoma viral recombinado que puede replicarse. La aplicabilidad de esta tecnología para la construcción de vectores está limitada por la transfección ineficiente de grandes fragmentos de ADN viral aislados y, además, las preparaciones de vectores pueden estar contaminadas por adenovirus de tipo salvaje debido a la digestión solo parcial del ADN de adenovirus.
Una variación de este sistema comprende el uso de dos plásmidos que proporcionan cada uno una parte del genoma del adenovirus individualmente incapaz de replicarse que se co-transfectan en la línea celular de producción complementaria para producir ADN viral replicable mediante recombinación homóloga. Este método se ha descrito en detalle (Bett et al. J. Virol. 67: 5921-5921, 1993). La desventaja de la contaminación por virus de tipo salvaje, también denominada contaminación por virus wt, ha sido superada por esta variación. Sin embargo, el uso de este método para generar grandes números de vectores de adenovirus recombinantes está limitado por la baja eficiencia de recombinación y la eficiencia de transfección de los ADN de vectores grandes en células productoras tales como 293. En general, la construcción del vector de adenovirus a través de la recombinación homóloga entre dos entidades de ADN en células eucariotas que soportan la replicación de adenovirus con deleción de E1 consume tiempo y requiere el cribado y purificación de clones de virus individuales mediante purificación en placa.
Las recombinasas específicas de sitio como las implicadas en los procesos de recombinación de los fragmentos de ADN viral, son proteínas que tienen propiedades tanto de endonucleasa como de ligasa y existen en múltiples organismos. Estas recombinasas reconocen secuencias específicas de bases en el ADN e intercambian los segmentos de ADN que flanquean esos segmentos. Por tanto, el producto de recombinación resultante consiste en una inserción del primer ácido nucleico en el segundo ácido nucleico. En tal caso, los plásmidos son plásmidos circulares que contienen una secuencia de reconocimiento de recombinasa en cada ácido nucleico. Alternativamente, hay una escisión del fragmento de ácido nucleico entre dos secuencias de reconocimiento de recombinasa en el mismo ácido nucleico, o un intercambio de partes de ácidos nucleicos entre dos ácidos nucleicos que tienen cada uno de los ácidos nucleicos intercambiados entre dos sitios de reconocimiento presentes en cada uno de los ácidos nucleicos. Dos plásmidos que tienen cada uno loxP, u otros sitios de unión a recombinasa, tales como, por ejemplo, un sitio de reconocimiento de recombinasa Frt, formarán una mezcla de producto de monómero, dímero, trímero, etc. Se han descrito numerosos sistemas de recombinación de varios organismos. (Landy A., Curr Opin Genet Dev. 3: 699-707, 1993; Hoess RH., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 79: 3398-3402, 1982; Abremski et al., J Biol Chem 261: 391-396, 1986; Esposito D, Scocca JJ, Nucl Acids Res 25: 3605-3614, 1997). Los miembros mejor estudiados de la familia de recombinasas integrasa son el sistema Integrasa/att del bacteriófago lambda, (Landy A., Current Opinions in Genetics and Devel. 3 : 699-707, 19934, el sistema Cre/loxP del bacteriófago PI (Hoess RH, Abremski K. "The Cre-Iox Recombination System", (1990) en Nucleic Acids and Molecular Biology, vol. 4. Eds.: Eckstein y Lilley, Berlín-Heidelberg: Springer-Verlag; págs. 90-109, y el sistema Flp/FRT de plásmido circular 2.mu. de Saccharomyces cerevisiae (Broach JR., et al., Cell 29: 227-234, 1982). Se desarrolló un sistema para la construcción de vectores de adenovirus mediante recombinación específica de sitio mediada por Cre a partir de bacteriófagos PI Hardy et al., J. Virol. 71: 1842-1849, 1997). Este método proporciona un medio para generar adenovirus sustituidos con E1 con inserción de ADN extraño en esta región tras la recombinación entre un plásmido lanzadera que contiene la unidad de transducción génica y un sitio loxP, y un vector de adenovirus auxiliar eliminado para su señal de empaquetamiento mediante recombinación intramolecular entre dos sitios loxP en células que expresan Cre. Una aplicación de este método para la construcción de adenovirus recombinantes a través de recombinación específica del sitio mediada por Cre-Iox entre dos plásmidos en células 293Cre se describió en la patente de EE.UU. 6.379.943.
En un enfoque diferente Farmer y Quinn (Solicitud de patente de EE.UU. US 2003/0054555) describen un método para la generación de vectores adenovirales recombinantes usando recombinación específica de sitio mediada por Cre-lox entre un vector donante y un vector aceptor que codifica un genoma de adenovirus con gen eliminado. El uso de plásmidos de alto número de copias como vectores, como se describe en este método de la técnica anterior, no permite la generación de ciertos tipos de vectores de expresión de adenovirus recombinantes de 'serotipo' no adenovirus de tipo 5. Se observó inestabilidad del genoma cuando el genoma del adenovirus tipo 19a se clonó en plásmidos cuando se propagó en E. coli. Se proporcionó una solución clonando el genoma del adenovirus en un BAC, lo que permitió la amplificación y modificación del genoma en bacterias sin la inestabilidad del genoma asociada al plásmido (Ruzsics Z et al. J. Virol. 80: 8100-8113, 2006). Farmer y Quinn también describen el uso de un vector aceptor que codifica un genoma de adenovirus con un gen eliminado (eliminado para la región E) que incluye ambas ITR, y que puede complementarse y propagarse en una línea celular complementaria como las células 293. Tras la recombinación específica de sitio entre el vector donante y aceptor, el producto de recombinación resultante contiene el ácido nucleico de inserción del vector donante. En este método de la técnica anterior proporcionado para la construcción de genomas adenovirales recombinantes, se usa un plásmido donante que contiene dos sitios diana de recombinación específicos de secuencia que están dispuestos de una manera que permite la recombinación entre estas dos secuencias. El plásmido aceptor contiene un sitio de recombinación específico de secuencia. Las construcciones donante y aceptora se hacen reaccionar in vitro o en una célula huésped con recombinasa específica de sitio, y el producto de recombinación resultante, que es una construcción de genoma de adenovirus recombinante, contiene el fragmento donante deseado. En una realización adicional, un marcador seleccionable (es decir, sacB) se divide entre el vector donante y aceptor, y la primera parte del marcador está presente en el vector aceptor y la segunda parte del marcador seleccionable presente en el vector donante. Tras la recombinación específica de sitio mediada por la expresión de una recombinasa específica de sitio (Cre recombinasa), ambas partes forman un marcador seleccionable funcional en la construcción de recombinación resultante. La generación de un marcador seleccionable permite la selección de productos de reacción. La reacción de recombinación mediada por Cre cataliza ambas reacciones al mismo tiempo, escisión e inserción, lo que finalmente conduce a un equilibrio que contiene una mezcla de productos de reacción. La aplicación de este método de la técnica anterior usando un vector aceptor y donante produjo un 80% de productos de recombinación deseados con un total de 10 clones analizados en el ejemplo proporcionado que eran vectores adenovirales recombinantes. Este método de la técnica anterior descrito en la presente memoria es propenso a la generación de múltiples productos de reacción, especialmente porque no se aplica ningún mecanismo que limite el número de recombinaciones específicas de sitio entre el vector aceptor y donante a exactamente una. Sin embargo, esto es un problema técnico no resuelto y un requisito previo para la generación de una biblioteca de expresión de vector adenoviral puro y complejo sin la necesidad de secuenciación y caracterización de clones individuales.
Se describió otro método para la construcción de vectores de adenovirus gutless dependientes de auxiliares (Parks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 13565-13570, 1996), y se describe como un método para "Sistema basado en Cre/loxP de alta eficiencia para la construcción de vectores de adenovirus" en la patente de EE.UU. 6.379.943. Sin embargo, los elementos genéticos incorporados en el genoma del AdV adenoviral (AdV) que están flanqueados por sitios LoxP están sujetos a escisión espontánea durante la propagación de los vectores de adenovirus (Anton M. y Graham F.L., J.Virol. 69: 4600-4606, 1995). En otra aplicación, la recombinación mediada por Cre se usó para generar vectores de adenovirus después de dos eventos de recombinación secuenciales y selección negativa contra un adenovirus eliminado para su señal de empaquetamiento después de la recombinación (Hardy S et al., J. Virol. 71: 1842-1849, 1997).
Los métodos que utilizan la recombinación mediada por Cre entre dos ácidos nucleicos para la generación de genomas de adenovirus infecciosos en E. coli o en células eucariotas no logran generar bibliotecas no sesgadas, estables. La capacidad de la Cre-recombinasa para catalizar la reacción en ambas direcciones da como resultado preparaciones de adenovirus que aún pueden estar contaminadas por el adenovirus parental no recombinado. Además, dos mecanismos limitan el uso de la recombinación específica del sitio Cre/loxP para la construcción de bibliotecas genómicas. Debido al pequeño tamaño de la secuencia reconocida por la Cre recombinasa, los sitios loxP crípticos en los genomas están presentes, lo que induce la recombinación entre sitios compatibles o la introducción de roturas de cadena simple o doble, lo que afecta la capacidad de crecer y modificar BAC, PAC, Cósmidos o Fósmidos que contienen sitios loxP en cepas de E. coli que expresan Cre, incluso si se usa un sistema inducible para la expresión de Cre (Semprini S et al. Nucleic Acids Res. 35: 1402-1410, 1997). Este proceso también ocurre en células y organismos de mamíferos; aquí, los eventos de recombinación entre sitios crípticos (pseudo) loxP dentro de los genomas de ratones y humanos conducen a la inestabilidad del genoma induciendo reordenamientos cromosómicos ilegítimos (Schmidt EE et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 13702-13707, 2000; Sauer B. J. Mol. Biol. 223: 911928, 1992). Por tanto, una biblioteca de genomas de vectores de adenovirus construidos mediante recombinación homologa mediada por Cre específica de sitio puede estar sujeta a un grado significativo de contaminación, lo que requiere un trabajo de cultivo celular intensivo y métodos virológicos para obtener clones individuales.
Un método que utiliza la recombinación mediada por Cre-lox para construir adenovirus se perfeccionó y describió aún más en Graham et al., Patente de EE.UU. 7.132.290. El uso de complejos ADN-TP se incorporó en dicha patente para superar las limitaciones relacionadas con la baja infectividad de los ácidos nucleicos que codifican adenovirus cuando se transfectan en células productoras como 293. Los expertos en la técnica saben que la infectividad del ADN de adenovirus aumenta 100 veces si se utilizan complejos de ADN-TP en lugar de ADN derivado de plásmido. El ADN viral se purifica de manera que la proteína terminal, que está unida al extremo 5' de cada hebra del adenovirus dúplex, quede intacta. La co-transfección de complejos ADN-TP que albergan un sitio loxP junto con un segundo plásmido que produce ADN adenoviral competente para la replicación tras la recombinación específica del sitio en presencia de la Cre recombinasa puede aumentar significativamente el número de placas virales generadas por gg de ADN viral transfectado (Sharp PA et al., Virology 75: 442-456, 1976; Chinnadurai G et al., J. Virol. 26: 195-199, 1978). El uso de complejos ADN-TP (ADN-TPC) corre el riesgo de contaminarse con la forma de ADN de adenovirus infeccioso parental de la que se derivan los complejos ADN-TP mediante digestión de restricción.
La construcción de genomas de adenovirus recombinantes a través de la recombinación homóloga de dos fragmentos en células 293 usando ADN-TPC se usó además en combinación con una selección positiva con eficiencia de biblioteca (Elahi SM et al., Gene Ther. 9: 1238-1246, 2002); se ha presentado una solicitud de patente para este método y se remite al lector para obtener detalles técnicos a la Solicitud de Patente de EE.UU. núm. 2006210965. Aquí, la co-transfección de un plásmido que alberga la ITR del extremo izquierdo y el casete de expresión de la proteasa de adenovirus junto con el ADN-TPC viral eliminado para el gen de la proteasa de adenovirus produjo grandes cantidades de vectores virales recombinantes. Sin embargo, una biblioteca de genomas de vectores de adenovirus construidos por recombinación homóloga o específica de sitio en células 293 puede estar sujeta a un grado significativo de sesgos debido a la selección de mutantes de virus que tienen propiedades de crecimiento variables (por ejemplo, en el caso de bibliotecas de expresión de ADNc donde la expresión del ADNc confiere una ventaja o desventaja de crecimiento) y, por tanto, están sobrerrepresentadas o subrrepresentadas en la población de bibliotecas. La propagación de dicha biblioteca es crítica y, además, requiere un trabajo intensivo de cultivo celular y métodos virológicos para obtener clones individuales.
Varios métodos de la técnica anterior permiten la construcción de adenovirus recombinantes sin ningún antecedente de genomas de adenovirus parentales. Los métodos que utilizan la ligadura directa de fragmentos de ADN al genoma del adenovirus para la construcción de adenovirus recombinantes se han desarrollado desde el principio (Ballay A et al., EMBO J. 30: 3861-5, 1985). Sin embargo, la ligadura de fragmentos grandes es poco eficiente y la escasez de sitios de restricción únicos limita el uso de este método para la construcción de bibliotecas de genoma viral.
La recombinación entre elementos genéticos en bacterias en lugar de en células eucariotas puede usarse para construir vectores de adenovirus sin la necesidad de purificación de placas. En una aplicación comercializada como sistema AdEasy® (He T-C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 95: 2509-2514, 1998) la recombinación entre un genoma de adenovirus súper-enrollado co-transfectado y un plásmido lanzadera se produce en bacterias BJ5183. Esta cepa bacteriana tiene propiedades favorables para el mantenimiento de la estabilidad genética de los genomas de adenovirus. Según la información proporcionada por el manual del productor más del 20% de las colonias son productos de recombinación correcta. En otro método descrito por Chartier et al. (Chartier C et al., J. Virol. 70: 4805­ 4810, 1996) la mayor longitud de los dos brazos de homología aumenta la eficacia de recombinación. Una mejora de este método fue descrita por Crouzet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 94: 1414-1419, 1997. Aquí, el número de colonias de fondo se redujo mediante la introducción de un marcador de selección negativa. Sin embargo, la eficiencia y la estabilidad genética del sistema no es suficiente para la generación de grandes bibliotecas, ya que las secuencias de ADN clonadas en vectores plásmidos que albergan repeticiones directas o secuencias de ADN repetitivas sufren inestabilidad genética. Esto es especialmente cierto para los vectores plásmidos que se replican con un alto número de copias en E. coli. En otro intento exitoso de usar este método para la construcción de adenovirus recombinantes, se estableció la recombinación homóloga en levadura. Sin embargo, este método se basa en la linealización del ADN para inducir la recombinación entre secuencias idénticas. La escasez de sitios de restricción únicos en los genomas adenovirales, además de los bajos rendimientos de ADN de YAC obtenidos de cultivos de esferoblastos de levadura grandes (típicamente 500 ml) limita esta aplicación.
El sistema Gateway™ comercializado por Invitrogen Corp. utiliza la recombinación específica del sitio para la recombinación in vitro entre ácidos nucleicos generando un tercer ácido nucleico que se puede seleccionar en las células huésped. Para detalles técnicos se hace referencia a la Patente de EE.UU. núm.7.282.326 (Invitrogen Corp.) y la Patente de EE.UU. núm. 5.888.732 (Life Technologies). Este sistema produce el plásmido recombinante con alta eficiencia y precisión sin antecedentes de los vectores plasmídicos no recombinados, y evita los eventos de recombinación impredecibles que ocurren durante la recombinación en huéspedes de E. coli. Los genomas de adenovirus recombinantes, (comercializados como ViralPower™), se pueden generar con alta eficacia, típicamente >90% de genomas virales recombinados correctos (observación propia y de acuerdo con el manual) usando este método.
Sin embargo, la eficiencia de la recombinación in vitro disminuye con el tamaño de los fragmentos de ADN (Katzen, F. Gateway® recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion Drug Discovery 2: 571-589, 2007), y en el caso de los genomas de adenovirus, el número resultante de colonias obtenidas después de la transformación de células huésped de E. coli apropiadas disminuyen varias veces, si se comparan con la recombinación in vitro entre moléculas de ADN pequeñas, lo que limita el uso del sistema Gateway para la construcción de bibliotecas de ADN de gran tamaño. Además, la eficiencia de la transformación bacteriana, que aquí es el factor limitante para la construcción de la biblioteca, disminuye con el tamaño del ADN transformado de una manera dependiente de la cepa bacteriana (Sheng Y et al., Nucleic Acids Res. 23: 1990-1996, 1995).
El uso de BAC en lugar de vectores plasmídicos evita la inestabilidad de las secuencias genómicas clonadas en vectores plasmídicos en E. coli. Los ejemplos se aplican a grandes genomas virales clonados en vectores plásmidos (Bzymek M y Lovett ST, Proc Natl Acad Sci USA. 98: 8319-8325, 2001; y genomas de vectores de adenovirus de otros subgrupos (Ruzsics Z et al., J. Virol. 80: 8100-8113, 2006). Los vectores virales son inestables si se propagan en un vector plásmido en huéspedes de E. coli y requieren propagación como genomas estables en plásmidos de cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Aunque los genomas se pueden mantener y manipular en BAC, el procedimiento de selección implica múltiples etapas y todavía no hay ningún método disponible para la construcción de grandes bibliotecas de dichos genomas.
Hasta la fecha no se ha observado la aparición de inestabilidad genómica de BAC genómicos debido a la presencia de sitios Frt crípticos y Flp. Por lo tanto, este sistema se usa aquí en esta invención para la construcción de bibliotecas genómicas. El intercambio dirigido de partes de ácidos nucleicos entre dos ácidos nucleicos se puede lograr mediante el uso de recombinación específica de sitio mediada por Flp si se usan dos sitios Frt no idénticos. Se ha reivindicado un método para la modificación dirigida de un genoma de una célula eucariota en la solicitud de patente PCT WO 1999/025854. La adaptación de este sistema para la construcción de bibliotecas de genomas requeriría el intercambio de un marcador seleccionable y la unidad de transducción de genes. Sin embargo, de manera similar al sistema gateway, la eficiencia de esta reacción disminuye con el tamaño del fragmento de ácido nucleico a intercambiar y no es 100% confiable, lo que hace necesaria una caracterización extensa de la biblioteca obtenida. La construcción de una biblioteca de genomas de vector de adenovirus utilizando recombinación homóloga específica de sitio mediada por Cre solo se logró en células eucariotas y, por lo tanto, se sometió a un grado significativo de contaminación, lo que requirió un trabajo intensivo de cultivo celular y métodos virológicos para obtener clones individuales. El uso de recombinación específica de sitio mediada por Cre en E. coli está asociado con la inestabilidad genómica y no se puede utilizar con los sistemas de plásmidos de alto número de copias del estado de la técnica.
Especialmente si la biblioteca de virus se construye en células eucariotas, se produce un grado significativo de sesgos de biblioteca debido a la selección de mutantes de virus que tienen propiedades de crecimiento variables, lo que conduce a una biblioteca con virus sobrerrepresentados o subrrepresentados. La propagación estable de dicha biblioteca es crítica y, además, requiere un trabajo intensivo de cultivo celular y métodos virológicos para obtener clones individuales. Además, el uso de fragmentos de ADN-TPC para mejorar la infectividad del ADN viral corre el riesgo de contaminarse con ADN de adenovirus infeccioso parental del que se derivan los complejos ADN-TP mediante digestión de restricción. El uso de métodos que involucran el intercambio recíproco doble mediado por recombinación específica de un sitio de secuencias de ácido nucleico entre dos sitios de recombinación no idénticos para la construcción de bibliotecas genómicas está limitado por la eficiencia y fidelidad de la reacción, lo que hace una selección y caracterización extensas de la biblioteca resultante necesario. Los sistemas alternativos que utilizan recombinación específica de sitio in vitro están limitados por la eficiencia de la reacción de recombinación, especialmente si se utilizan plásmidos grandes, y además sufren de una eficiencia de transformación reducida de los plásmidos grandes resultantes en E. coli.
El documento US 2003/054555 A1 está relacionado con métodos basados en recombinasas específicas de sitio para hacer un genoma adenoviral recombinante.
El documento US 6.379.943 B1 está relacionado con virus, plásmidos de ambos que contienen ADN viral y lox ubicados de tal manera que la recombinación específica del sitio entre los sitios lox colocados en plásmidos separados da como resultado la generación de ADN viral infeccioso.
NG P et al. (Biotechniques, vol. 29, no. 3, 1 de septiembre de 2000 (2000-09-01), páginas 524-528) informa sobre la recombinasa FLP de levadura que funciona eficientemente en células humanas para la construcción de vectores de adenovirus.
NG P et al. (Human Gene Therapy, Mary Ann Liebert, Nueva York, NY, EE. UU., Vol. 10, no. 16, 1 de noviembre de 1999 (1999-11-01), páginas 2667-2672) informan sobre un sistema basado en CRE/LOXP de alta eficiencia para la construcción de vectores adenovirales.
Thirion C et al. (Human Gene Therapy FEB 2006, vol. 17, núm. 2, febrero de 2006 (2006-02), páginas 193-205) informan sobre vectores de adenovirus basados en el adenovirus humano tipo 19a que tienen un alto potencial para la terapia génica dirigida al músculo humano.
El problema que subyace a la presente invención es superar las deficiencias de los métodos de la técnica anterior en la generación de genomas de adenovirus y proporcionar métodos y medios respectivos mejorados para realizar dichos métodos.
Otro problema más que subyace a la presente invención es proporcionar métodos y medios para realizar dichos métodos, que permitan la clonación de grandes secuencias de ácidos nucleicos, tales como secuencias de ácidos nucleicos genómicos con alta eficacia.
Compendio de la invención
Estos y otros problemas subyacentes a la presente invención se resuelven mediante el objeto de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las realizaciones preferidas pueden tomarse de las reivindicaciones dependientes adjuntas. Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un primer aspecto mediante una combinación de una molécula de ácido nucleico, que también se denomina como tercera molécula de ácido nucleico, y una molécula de ácido nucleico, que también se denomina como segunda molécula de ácido nucleico, donde la tercera molécula de ácido nucleico comprende
(1) una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos:
(a) una primera parte de un genoma de un adenovirus, en el que la primera parte de un genoma de un adenovirus comprende exactamente una repetición terminal invertida de un adenovirus;
(b) una secuencia de nucleótidos, preferiblemente una secuencia de nucleótidos genómica, o una unidad de transcripción;
(c) una secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene actividad reguladora en un procariota;
(d) exactamente un sitio de recombinación específico de sitio que se recombina en presencia de una recombinasa correspondiente;
(e) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa;
(f) una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva; y (g) un primer sitio de restricción; o
(2) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 6; o
(3) una molécula de ácido nucleico heteróloga que comprende una tercera molécula de ácido nucleico como se define en (1) contenida en el organismo depositado en la DSMZ bajo el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 23754;
y
en el que la segunda molécula de ácido nucleico comprende
(1) una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos:
(a) una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende
(1) secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación de una sola copia, y
(ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección;
(b) exactamente un sitio de recombinación específico de sitio que se recombina en presencia de una recombinasa correspondiente;
(c) una segunda parte de un genoma de un adenovirus, en el que la segunda parte de un genoma de un adenovirus comprende exactamente una repetición terminal invertida de un adenovirus; y
(d) un sitio de restricción que se denomina segundo sitio de restricción; o
(2) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 14; o
(3) una molécula de ácido nucleico heteróloga que comprende una segunda molécula de ácido nucleico como se define en (1) contenida en el organismo depositado en la DSMZ bajo el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 24298 y/o DSM 24299;
en el que la segunda molécula de ácido nucleico y la tercera molécula de ácido nucleico son cada una e independientemente una molécula lineal o una molécula circular, preferiblemente la segunda molécula de ácido nucleico es una molécula circular y la tercera molécula de ácido nucleico es una molécula circular;
en el que la segunda molécula de ácido nucleico y la tercera molécula de ácido nucleico se complementan entre sí para formar un genoma viral completo; y
en el que la recombinasa que recombina el sitio de recombinación de la tercera molécula de ácido nucleico es la misma que la recombinasa que recombina el sitio de recombinación de la segunda molécula de ácido nucleico. En una realización del primer aspecto, en la molécula de ácido nucleico de (1) la secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene una actividad reguladora en un procariota, el sitio de recombinación específico del sitio y la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa están dispuestos en una dirección 5' -> 3'.
En una realización del primer aspecto, la tercera molécula de ácido nucleico es una molécula lineal, en la que los elementos (a) a (f), preferiblemente tras la escisión de la molécula circular de la tercera molécula de ácido nucleico con la primera enzima de restricción que reconoce y escinde en el primer sitio de restricción, están dispuestos en una dirección 5' -> 3' en la siguiente secuencia de la siguiente manera:
1. la primera parte del genoma de un adenovirus;
2. la secuencia de nucleótidos, preferiblemente la secuencia de nucleótidos genómica, o la unidad de transcripción; 3. la secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene actividad reguladora en un procariota;
4. el sitio de recombinación específico del sitio que se recombina en presencia de una recombinasa correspondiente; 5. la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa; y
6. la unidad de secuencia de nucleótidos bacterianos que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva. En una realización del primer aspecto, el adenovirus es un adenovirus humano y preferiblemente el adenovirus es adenovirus humano tipo 5, y más preferiblemente todo el extremo izquierdo del adenovirus tipo 5 corriente arriba de la caja TATA de la unidad de transcripción E1, o uno o varios partes del mismo.
En una realización del primer aspecto, las secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación condicional comprenden un origen de replicación, por lo que preferiblemente el origen de replicación es el origen mínimo del fago gR6K.
En una realización del primer aspecto, la secuencia reguladora que tiene una actividad reguladora en un procariota es una secuencia que dirige la expresión de una secuencia de nucleótidos en un procariota, preferiblemente en una célula huésped procariota.
En una realización del primer aspecto, el marcador de selección negativa o la expresión de la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa media o confiere sensibilidad a un agente de selección y/o una condición de selección.
En una realización del primer aspecto, la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa es un gen seleccionado del grupo que comprende los genes galK, tetAR, pheS, thyA, lacy, ccdB y rpsL.
Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un segundo aspecto mediante una combinación de una molécula de ácido nucleico que también se denomina como primera molécula de ácido nucleico y una molécula de ácido nucleico que también se denomina como segunda molécula de ácido nucleico, en la que la primera molécula de ácido nucleico comprende
(1) una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos:
(a) exactamente un sitio de recombinación específico de un sitio que se recombina en presencia de una recombinasa correspondiente;
(b) una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianos para replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un primer marcador de selección;
(c) una primera parte de un genoma de un adenovirus, en el que la primera parte de un genoma de un adenovirus comprende exactamente una repetición terminal invertida de un adenovirus;
(d) una unidad de transcripción; y
(e) un primer sitio de restricción; o
(2) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID No: 15; o
(3) una molécula de ácido nucleico heteróloga que comprende una primera molécula de ácido nucleico como se define en (1) contenida en el organismo depositado en la DSMZ según el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 23753;
y en el que la segunda molécula de ácido nucleico comprende
(1) una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos:
(a) una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende
(1) secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación de una sola copia, y
(ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección;
(b) exactamente un sitio de recombinación específico de sitio que se recombina en presencia de una recombinasa correspondiente;
(c) una segunda parte de un genoma de un adenovirus, en el que la segunda parte de un genoma de un adenovirus comprende exactamente una repetición terminal invertida de un adenovirus; y
(d) un sitio de restricción que se denomina como segundo sitio de restricción; o
(2) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 14; o
(3) una molécula de ácido nucleico heteróloga que comprende una segunda molécula de ácido nucleico como se define en (1) contenida en el organismo depositado en la DSMZ bajo el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 24298 y/o DSM 24299, en el que preferiblemente la molécula de ácido nucleico contenida en el organismo es una molécula de ácido nucleico heteróloga;
y en el que la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico son cada una e independientemente una molécula lineal o una molécula circular, preferiblemente la primera molécula de ácido nucleico es una molécula circular y la segunda molécula de ácido nucleico es una molécula circular;
en el que la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico se complementan entre sí para formar un genoma viral completo; y
en el que la recombinasa que recombina el sitio de recombinación de la primera molécula de ácido nucleico es la misma que la recombinasa que recombina el sitio de recombinación de la segunda molécula de ácido nucleico. En una realización del segundo aspecto, el genoma de un adenovirus de la primera molécula de ácido nucleico es un genoma de adenovirus humano, preferiblemente un genoma de adenovirus humano que es diferente del genoma de adenovirus humano tipo 5, más preferiblemente el genoma de un adenovirus de la primera molécula de ácido nucleico es un genoma adenoviral humano de tipo 19a.
En una realización del segundo aspecto, las secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación condicional de la primera molécula de ácido nucleico comprenden un origen de replicación.
En una realización del segundo aspecto, la secuencia que proporciona un primer marcador de selección de la primera molécula de ácido nucleico es una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que confiere resistencia a una célula huésped que alberga dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima.
En una realización del segundo aspecto, la primera parte de un genoma de un adenovirus de la primera molécula de ácido nucleico es una repetición terminal adenoviral.
En una realización del segundo aspecto, la primera parte de un genoma de un adenovirus de la primera molécula de ácido nucleico contiene el promotor adenoviral pIX, preferiblemente el promotor adenoviral pIX es un promotor pIX del adenovirus humano 19a.
En una realización del primer y segundo aspecto, el genoma de adenovirus de la segunda molécula de ácido nucleico es un genoma de adenovirus humano, por lo que en el caso de la combinación según la reivindicación 1, el genoma de adenovirus de la segunda molécula de ácido nucleico es preferiblemente un genoma de adenovirus humano tipo 5 o un genoma de adenovirus humano de tipo 19a y en el caso de la combinación según la reivindicación 9, el genoma de adenovirus de la segunda molécula de ácido nucleico es preferiblemente un genoma de adenovirus humano que es diferente del genoma de adenovirus humano de tipo 5, más preferiblemente el genoma de virus de la segunda molécula de ácido nucleico es un genoma adenoviral humano de tipo 19a.
En una realización del primer y segundo aspecto, la secuencia de nucleótidos bacteriana para la replicación de una sola copia de la segunda molécula de ácido nucleico comprende un origen de replicación para el mantenimiento de una sola copia en células huésped procariotas.
En una realización del primer y segundo aspecto, la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección de la segunda molécula de ácido nucleico es una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que confiere resistencia a una célula huésped que alberga dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima.
En una realización del primer y segundo aspecto, la segunda parte de un genoma de un adenovirus de la segunda molécula de ácido nucleico comprende una repetición terminal invertida derecha adenoviral y la primera parte de un genoma de un adenovirus de la primera molécula de ácido nucleico y la tercera molécula de ácido nucleico comprende una repetición terminal invertida izquierda adenoviral.
Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un tercer aspecto mediante un método para la generación de una molécula de ácido nucleico que codifica un virus que comprende las siguientes etapas
a) proporcionar una tercera molécula de ácido nucleico como se define en relación con el primer aspecto;
b) proporcionar una segunda molécula de ácido nucleico como se define en relación con el primer aspecto; o
c) proporcionar una combinación de una tercera molécula de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico según el primer aspecto;
d) permitir que la tercera y la segunda moléculas de ácido nucleico reaccionen de modo que se produzca una recombinación específica de sitio, en la que la recombinación específica de sitio está mediada por una recombinasa específica de sitio y la recombinación específica de sitio forma un producto de recombinación que comprende una copia, preferiblemente una sola copia del genoma de un o el virus, por lo que el genoma es un genoma completo complementado y el genoma completo complementado se complementa con la recombinación específica del sitio;
e) seleccionar el producto de recombinación; y
f) opcionalmente escindir el producto de recombinación con la primera y la segunda enzimas de restricción.
Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un cuarto aspecto mediante un método para la generación de una molécula de ácido nucleico que codifica un virus que comprende las siguientes etapas
a) proporcionar una combinación de una primera molécula de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico como se define en relación con el segundo aspecto;
b) permitir que la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico reaccionen de modo que se produzca una recombinación específica de sitio, en la que la recombinación específica de sitio esté mediada por una recombinasa específica de sitio y la recombinación específica de sitio forma un producto de recombinación que comprende una copia, preferiblemente una sola copia del genoma de un o el virus, por lo que el genoma es un genoma completo complementado y el genoma completo complementado se complementa con la recombinación específica del sitio;
c) seleccionar el producto de recombinación; y
d) opcionalmente escindir el producto de recombinación con la primera y la segunda enzimas de restricción.
En una realización del tercer aspecto, la tercera y la segunda moléculas de ácido nucleico se hacen reaccionar en una célula huésped procariota, preferiblemente en E. coli.
En una realización del cuarto aspecto, la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico se hacen reaccionar en una célula huésped procariota, preferiblemente en E. coli.
Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un quinto aspecto mediante un método para generar una biblioteca de secuencias de nucleótidos, en la que dicha biblioteca comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos individuales, en la que dicha biblioteca está representada por una pluralidad de genomas virales y cada genoma viral contiene una sola de las secuencias de nucleótidos individuales, que comprende las etapas del método según el tercer aspecto, incluida cualquier realización del mismo, en el que la secuencia de nucleótidos individual es parte de la unidad de transcripción de la tercera molécula de ácido nucleico.
Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un sexto aspecto mediante un método para generar una biblioteca de secuencias de nucleótidos, en el que dicha biblioteca comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos individuales, en el que dicha biblioteca está representada por una pluralidad de genomas virales y cada genoma viral contiene una sola de las secuencias de nucleótidos individuales, que comprende las etapas del método según el cuarto aspecto, incluida cualquier realización del mismo, en el que la secuencia de nucleótidos individual es parte de la unidad de transcripción de la primera molécula de ácido nucleico.
Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un séptimo aspecto mediante un kit que comprende opcionalmente un prospecto y, en (un(os)) recipiente(s) adecuado(s), al menos una combinación de la tercera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico según el primer aspecto, incluida cualquier realización de la misma.
Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un octavo aspecto mediante un kit que comprende opcionalmente un prospecto y, en (un(os)) recipiente(s) adecuado(s), al menos una combinación de la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto, incluida cualquier realización de la misma.
En una realización del séptimo y octavo aspecto, la molécula o moléculas de ácido nucleico está(n) contenida(s) en una forma lista para usar y/o en la que el kit contiene una línea celular permisiva que proporciona una recombinasa e instrucciones de uso.
Se describe una primera molécula de ácido nucleico que comprende
(1) una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos:
(a) un sitio de recombinación específico del sitio, preferiblemente exactamente un sitio de recombinación específico del sitio;
(b) una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianos para replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un primer marcador de selección;
(c) una primera parte del genoma de un virus;
(d) una unidad de transcripción; y
(e) opcionalmente un primer sitio de restricción; o
(2) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID No: 15; o
(3) una molécula de ácido nucleico que sea similar o idéntica a la molécula de ácido nucleico contenida en el organismo depositado en la DSMZ según el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 23753, en el que preferiblemente la molécula de ácido nucleico contenida en el organismo es una molécula de ácido nucleico heteróloga;
en el que la primera molécula de ácido nucleico es una molécula circular o lineal.
En un ejemplo, la primera molécula de ácido nucleico comprende una señal de empaquetamiento.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, la primera parte de un genoma de un virus comprende una secuencia terminal de un genoma de un o el virus, preferiblemente de un genoma del virus.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, la secuencia terminal de un genoma de un o el virus comprende una repetición terminal del genoma de uno del virus, preferiblemente una repetición terminal invertida viral. En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, el primer sitio de restricción está ausente en la primera parte de un o el genoma viral y la unidad de transcripción.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, el primer sitio de restricción se selecciona del grupo que comprende AbsI, BstBI, PacI, PsrI, SgrDI y SwaI.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, el virus es un adenovirus.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, el virus es un adenovirus humano tipo 5 o el virus es un adenovirus humano tipo 19a.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, los elementos (a) a (e) están dispuestos en una dirección 5' -> 3'.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, la repetición terminal es una repetición terminal viral, preferiblemente una repetición terminal viral izquierda.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, la primera molécula de ácido nucleico es una molécula lineal, en la que los elementos (a) a (d), preferiblemente tras la escisión de la molécula circular de la primera molécula de ácido nucleico con la primera enzima de restricción que reconoce y se escinde en el primer sitio de restricción, se disponen en una dirección 5' -> 3' en la siguiente secuencia:
1. la primera parte del genoma de un virus;
2. la unidad de transcripción;
3. el sitio de recombinación específico del sitio;
4. la unidad de secuencia de nucleótidos bacterianos que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un primer marcador de selección.
5. opcionalmente, un sitio de restricción que se denomina primer sitio de restricción.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, la primera parte de un o el genoma de un virus comprende una secuencia terminal de un genoma de un virus, preferiblemente una secuencia de repetición terminal de un genoma de un virus, y más preferiblemente una secuencia de repetición terminal invertida del genoma de un virus.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, la secuencia terminal de un genoma de un virus comprende una repetición terminal de un o el genoma de un virus, preferiblemente una primera repetición terminal izquierda de un o el genoma de un o el virus y más preferiblemente, la secuencia terminal es una primera repetición terminal invertida izquierda de un o el genoma de un virus.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, la repetición terminal invertida es la secuencia terminal invertida de adenovirus y preferiblemente tiene cualquier longitud de aproximadamente 18 a 103 pares de bases.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, la señal de empaquetamiento es una señal de empaquetamiento de un adenovirus.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, la unidad de transcripción comprende un promotor, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico a expresar, y una señal de terminación, por lo que preferiblemente, el promotor y el ácido nucleico a expresar están operativamente unidos entre sí, más preferiblemente al promotor, el ácido nucleico y la señal de terminación están operativamente unidos entre sí.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, el promotor se selecciona del grupo que comprende promotores eucariotas, promotores virales, promotores reconocidos por la ARN polimerasa II y promotores reconocidos por la ARN polimerasa III, en el que, preferiblemente, los promotores reconocidos por la a Rn polimerasa II son seleccionados del grupo que comprende el promotor PGK y el promotor CMV, y en el que, preferiblemente, los promotores reconocidos por la ARN polimerasa se seleccionan del grupo que comprende el promotor U6, el promotor HI, el promotor ARNt y el promotor VA de adenovirus.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, la secuencia que se va a expresar es una secuencia seleccionada del grupo que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido, un ácido nucleico que codifica un polipéptido, un ácido nucleico que codifica una proteína, un ARN no codificante, ARNip, microARN.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, la señal de terminación se selecciona del grupo que comprende señales de terminación viral eucariotas y señales de terminación para promotores dependientes de ARN polimerasa III, preferiblemente la señal de terminación es una señal poliA.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, el sitio de recombinación específico del sitio se selecciona del grupo que comprende el sitio de recombinación para la recombinasa Flp.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, las secuencias bacterianas para la replicación condicional comprenden un origen de replicación.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, las secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación condicional comprenden un origen de replicación, por lo que preferiblemente el origen de replicación es el origen mínimo del fago gR6K.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, la secuencia que proporciona un primer marcador de selección es una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que confiere resistencia a una célula huésped que alberga dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, la resistencia es la resistencia contra un agente, preferiblemente contra un antibiótico, en el que más preferiblemente dicho agente comprende gentamicina, kanamicina, zeocina, cloranfenicol, ampicilina, tetraciclina.
En un ejemplo de la primera molécula de ácido nucleico, el gen que confiere resistencia se selecciona del grupo que comprende bla, ant(3")-ia, aph(3')-II, aph(3')-II, cmlA, ble aadA, aadB, sacB y tetA.
También se describe una segunda molécula de ácido nucleico que comprende
(1) una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos:
(a) una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación de una sola copia, y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección;
(b) un sitio de recombinación específico del sitio, preferiblemente exactamente un sitio de recombinación específico del sitio;
(c) una segunda parte del genoma de un virus; y
(d) opcionalmente un sitio de restricción que se denomina como segundo sitio de restricción; o
(2) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según SEQ ID No: 2 y/o SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 14; o
(3) una molécula de ácido nucleico similar o idéntica a la molécula de ácido nucleico contenida en los organismos depositados en la DSMZ según el tratado de Budapest con los números de acceso DSM 24298 y/o DSM 24299, en el que preferiblemente la molécula de ácido nucleico contenida en el organismo es una molécula de ácido nucleico heteróloga;
en el que la segunda molécula de ácido nucleico es una molécula circular o lineal.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, la segunda parte de un genoma de un o el virus da como resultado un genoma completo, que es competente para la replicación si se combina con una o varias partes distintas de un o el genoma de un o el virus.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, el sitio de recombinación específico del sitio se selecciona del grupo que comprende el sitio de recombinación para la recombinasa Flp.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, el virus es un adenovirus.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, el genoma del virus es un genoma de adenovirus humano de tipo 5 o un genoma de adenovirus humano de tipo 19a.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, la segunda parte del genoma de un o el virus comprende una secuencia terminal de un genoma de un virus, preferiblemente de un genoma del virus.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, la secuencia de un genoma de un o el virus comprende una repetición terminal, preferiblemente una secuencia viral terminal y más preferiblemente una repetición terminal de un o el virus y más preferiblemente una repetición terminal invertida de un o el virus, e incluso más preferiblemente una repetición terminal invertida derecha de un o el virus.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, el segundo sitio de restricción está ausente en la segunda parte del genoma.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, el segundo sitio de restricción se selecciona del grupo que comprende los sitios de restricción para las enzimas de restricción AbsI, BstBI, PacI, PsrI, SgrDI y SwaI, por lo que el virus es preferiblemente un adenovirus humano tipo 5.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, las secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación, preferiblemente la replicación de una sola copia, comprenden un origen de replicación para el mantenimiento de una sola copia en las células huésped procariotas.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, el origen de replicación es un origen de copia única derivado del factor f-episomal o un origen de replicación PI.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, la segunda molécula de ácido nucleico es una molécula lineal, en la que los elementos (a) a (d), preferiblemente tras la escisión de la molécula circular de la segunda molécula de ácido nucleico con la segunda enzima de restricción que reconoce y escinde en el segundo sitio de restricción, se disponen en una dirección 5' -> 3' en la siguiente secuencia:
1. una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación de una sola copia, y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección;
2. un sitio de recombinación específico del sitio, preferiblemente exactamente un sitio de recombinación específico del sitio;
3. una segunda parte de un genoma de un virus; y
4. opcionalmente, un sitio de restricción que se denomina como segundo sitio de restricción.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, la secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección es una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que confiere resistencia a una célula huésped que alberga dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, la resistencia es la resistencia contra un agente seleccionado del grupo de marcadores de selección positiva que comprende gentamicina, kanamicina, zeocina, cloranfenicol, ampicilina y estreptomicina.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, el gen que confiere resistencia se selecciona del grupo que comprende bla, ant(3")-Ia, aph(3')-II, aph(3')-II, cmlA, ble, aadA, y aadB.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, la segunda molécula de ácido nucleico es una molécula lineal, en la que los elementos (a) a (c), preferiblemente tras la escisión de la molécula circular de la segunda molécula de ácido nucleico con la segunda enzima de restricción que reconoce y escinde en el segundo sitio de restricción, están dispuestos en una dirección 5' -> 3'
(1) la unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación de una sola copia, y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección (2) el sitio de recombinación específico del sitio; y
(3) la segunda parte de un genoma de un virus.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, la segunda parte de un o el genoma de un o el virus comprende una secuencia terminal de un genoma de un o el virus, preferiblemente de un genoma del virus.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, la secuencia terminal de un o el virus comprende una repetición terminal de un o el virus, preferiblemente una repetición terminal derecha de un o el virus.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, la segunda parte de un o el genoma de un o el virus comprende una señal de empaquetamiento.
En un ejemplo de la segunda molécula de ácido nucleico, la segunda molécula de ácido nucleico es un BAC.
El problema subyacente a la presente invención se resuelve en un tercer aspecto, que es también la primera realización del tercer aspecto, mediante una combinación de una primera molécula de ácido nucleico según cualquiera de la realización primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima, decimotercera, decimocuarta, decimoquinta, decimosexta, decimoséptima, decimoctava, decimonovena, vigésima, vigesimoprimera, vigesimosegunda, vigesimotercera, vigesimocuarta y vigesimoquinta del primer aspecto y una segunda molécula de ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima, decimotercera, decimocuarta, decimoquinta, decimosexta, decimoséptima, decimoctava, decimonovena y vigésima realizaciones del segundo aspecto.
En una realización del segundo aspecto, tanto la primera molécula de ácido nucleico como la segunda molécula de ácido nucleico están presentes como moléculas de ácido nucleico cerradas circulares.
En una realización del tercer segundo aspecto, la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico están presentes como moléculas separadas.
En una realización del segundo aspecto, el primer sitio de restricción y el segundo sitio de restricción son los mismos tanto en la primera molécula de ácido nucleico como en la segunda molécula de ácido nucleico.
En una realización del segundo aspecto, el primer y segundo sitio de restricción se selecciona del grupo que comprende la restricción ubicada para AbsI, BstBI, PacI, PsrI, SgrDI y SwaI.
En una realización del segundo aspecto, la primera parte de un o el genoma de un o el virus y la segunda parte de un o el genoma de un o la forma del virus, si se toman en conjunto, un o el genoma del virus que es competente para la replicación en celdas permisivas.
En una realización del segundo aspecto, el primer marcador de selección y el segundo marcador de selección es una enzima que confiere resistencia contra un antibiótico, en el que dicho antibiótico se selecciona del grupo que comprende kanamicina, estreptomicina, neomicina, puromicina, ampicilina, zeocina, gentamicina y cloranfenicol en el que el primer marcador de selección es diferente del segundo marcador de selección.
En una realización del segundo aspecto, el primer marcador de selección es una enzima que confiere resistencia a la kanamicina, y el segundo marcador de selección es una enzima que confiere resistencia al cloranfenicol.
En una realización del segundo aspecto, la señal de empaquetamiento se proporciona por la primera o la segunda molécula de ácido nucleico.
En una realización del segundo aspecto, el primer sitio de restricción y el segundo sitio de restricción están ausentes en la unidad de transcripción, en la primera y segunda parte de un o el genoma.
En una realización del segundo aspecto, el virus es un adenovirus humano de serotipo 5.
En una realización del cuarto aspecto, la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico se hacen reaccionar en una célula huésped procariota y se selecciona el producto de recombinación, y en el que preferiblemente la célula huésped procariota es E. coli, más preferiblemente, la célula huésped es el organismo o un organismo similar a dicho organismo que ha sido depositado en la DSMZ según el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 23743 y/o DSM 23742.
En una realización del cuarto aspecto, la célula huésped se selecciona de un grupo de cepas de E. coli que carecen del factor F y son sensibles al primer y segundo marcador de selección.
En una realización del cuarto aspecto, la célula huésped es la E. coli tipo derivado de K12, preferiblemente DH10B. En una realización del cuarto aspecto, la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico se hacen reaccionar en una célula huésped eucariota, más preferiblemente la célula huésped es el organismo o un organismo similar a dicho organismo que se ha depositado en la DSMZ según al tratado de Budapest con el número de acceso DSM ACC3077m o DSM ACC3077, en presencia de la recombinasa específica del sitio y la etapa de seleccionar el producto de recombinación está ausente, en el que preferiblemente la célula huésped eucariota es una célula huésped permisiva.
En una realización del cuarto aspecto, se proporciona la recombinasa específica de sitio, y en la que la célula huésped permisiva es una célula que se selecciona del grupo que comprende células 293, células 911, células PER.C6 y células CAP.
En una realización del cuarto aspecto, el primer marcador de selección es kanamicina y el segundo marcador de selección es cloranfenicol.
En una realización del cuarto aspecto, la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico se hacen reaccionar en presencia de la recombinasa.
En una realización del cuarto aspecto, la recombinasa interactúa con el sitio de recombinación específico del sitio proporcionado por la primera molécula de ácido nucleico y el sitio de recombinación específico del sitio proporcionado por la segunda molécula de ácido nucleico.
En una realización del cuarto aspecto, la recombinasa es recombinasa Flp.
En una realización del cuarto aspecto, la recombinasa está codificada por la primera molécula de ácido nucleico o la segunda molécula de ácido nucleico.
En una realización del cuarto aspecto, la recombinasa se proporciona o produce por la célula huésped procariota o la célula huésped eucariota.
En una realización del cuarto aspecto, después de la recombinación, preferiblemente la recombinación específica de sitio, la recombinasa se inactiva.
En una realización del cuarto aspecto, la recombinasa y preferiblemente la recombinasa Flp está controlada por un promotor inducible o un represor sensible a la temperatura.
En una realización del cuarto aspecto, las enzimas de restricción se seleccionan del grupo que comprende AbsI, BstBI, PacI, PsrI, SgrDI y SwaI.
En una realización del cuarto aspecto, el método comprende como una etapa adicional transfectar el genoma complementado de un o el virus que es preferiblemente un genoma viral replicable en una célula huésped permisiva. En una realización del cuarto aspecto, la expresión de la recombinasa está controlada por un origen de replicación sensible a la temperatura.
En una realización del cuarto aspecto, el método se usa en la construcción de vectores para transferencia de genes, vacunas o aplicaciones terapéuticas.
En una realización del cuarto aspecto, el método se usa en la construcción de una biblioteca de genomas de virus. También se describe una tercera molécula de ácido nucleico que comprende
(1) una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos:
(a) opcionalmente, una primera parte de un genoma de un virus;
(b) una secuencia de nucleótidos, preferiblemente una secuencia de nucleótidos genómica, o una unidad de transcripción;
(c) una secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene una actividad reguladora en un procariota;
(d) un sitio de recombinación específico del sitio, preferiblemente exactamente un sitio de recombinación específico del sitio;
(e) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa;
(f) una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva; (g) opcionalmente un primer sitio de restricción;
en el que la secuencia de nucleótidos bacteriana con actividad reguladora en un procariota, el sitio de recombinación específico del sitio y la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa están dispuestos en una dirección de 5' a 3'.
o
(2) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 6; o
(3) una molécula de ácido nucleico similar o idéntica a la molécula de ácido nucleico contenida en el organismo depositada en la DSMZ según el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 23754, en la que preferiblemente la molécula de ácido nucleico contenida en el organismo es una molécula de ácido nucleico heteróloga;
en la que la tercera molécula de ácido nucleico es una molécula lineal o circular.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la tercera molécula de ácido nucleico es una molécula lineal, en la que los elementos (a) a (f), preferiblemente tras la escisión de la molécula circular de la tercera molécula de ácido nucleico con la primera enzima de restricción que reconoció y escinde en el primer sitio de restricción, se disponen en una dirección 5' -> 3' en la siguiente secuencia como sigue:
1. opcionalmente, la primera parte de un genoma de un virus;
2. la secuencia de nucleótidos, preferiblemente una secuencia de nucleótidos genómica, o una unidad de transcripción; 3. la secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene actividad reguladora en un procariota;
4. el sitio de recombinación específico del sitio;
5. la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa; y
6. la unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva. En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la tercera molécula de ácido nucleico comprende además la primera parte de un genoma de un virus y, en el que, preferiblemente, la primera parte comprende una o más secuencias terminales de un o el genoma de un o el virus.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la primera parte de un genoma de un virus media o es necesaria para la replicación y/o empaquetamiento de un virus en una célula permisiva.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la unidad de transcripción es una unidad de transcripción para una secuencia de ácido nucleico, por lo que dicha secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ácido nucleico heteróloga.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la tercera molécula de ácido nucleico es un plásmido bacteriano o un cromosoma artificial bacteriano.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la tercera molécula de ácido nucleico comprende además un primer sitio de restricción.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la tercera molécula de ácido nucleico comprende además una primera parte de un genoma de un virus.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la primera parte de un genoma de un virus comprende una señal de empaquetamiento.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la señal de empaquetamiento se deriva de un genoma de adenovirus, preferiblemente la señal de empaquetamiento es la señal de empaquetamiento ^ 5 del adenovirus humano tipo 5.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la primera parte de un o el genoma de un virus comprende la secuencia terminal de un o el genoma de un o el virus o una o varias partes de la secuencia terminal.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la secuencia terminal de un o el virus comprende una o varias repeticiones terminales de un o el genoma de un o el virus.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la primera parte de un o el genoma de un o el virus es una primera parte del genoma de un adenovirus, preferiblemente un adenovirus humano y más preferiblemente el adenovirus es un adenovirus humano tipo 5, y lo más preferiblemente todo el extremo izquierdo del adenovirus tipo 5 corriente arriba de la caja TATA de la unidad de transcripción E1, o una o varias partes de la misma.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la secuencia terminal de un o el genoma de un o el virus o una o varias partes de la secuencia terminal comprende una repetición terminal invertida, en la que preferiblemente la repetición terminal invertida es la repetición terminal invertida de un adenovirus y más preferiblemente la repetición terminal invertida es del extremo izquierdo del adenovirus humano tipo 5.
En una realización del primer aspecto, la repetición terminal invertida comprende cualquier longitud de aproximadamente 18 a 103 pares de bases.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, el primer sitio de restricción está ausente tanto de la primera parte de un o el genoma de un o el virus como de la unidad de transcripción.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, el sitio de restricción está ausente de un genoma adenoviral. En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, el virus es un adenovirus, preferiblemente un adenovirus humano y más preferiblemente un adenovirus humano tipo 5.
En una realización del primer aspecto, el sitio de restricción es un sitio de restricción para una enzima de restricción, por lo que la enzima de restricción se selecciona del grupo que comprende AbsI, BstBI, PacI, PsrI, SgrDI y SwaI. En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la tercera molécula de ácido nucleico comprende, preferiblemente en una orientación 5' -> 3',
1. la secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene una actividad reguladora en un procariota;
2. el sitio de recombinación específico del sitio;
3. la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa;
4. la unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva; 5. el primer sitio de restricción;
6. la primera parte de un o el genoma de un o el virus; y
7. la unidad de transcripción.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la primera parte de un o el genoma de un o el virus comprende una repetición terminal, por lo que preferentemente dicha repetición terminal es una repetición terminal izquierda y más preferentemente la repetición terminal izquierda es la repetición terminal invertida derecha de un genoma de adenovirus.
En un ejemplo de la tercera molécula de ácido nucleico, la primera parte de un o el genoma de un o el virus comprende una repetición terminal, preferiblemente una repetición terminal invertida, más preferiblemente una repetición terminal derecha de un genoma de virus, e incluso más preferiblemente la repetición terminal derecha de un adenovirus. En una realización del primer aspecto, la repetición del terminal derecha de un adenovirus comprende al menos 103 nucleótidos del genoma de un genoma de virus de adenovirus humano tipo 5.
En una cuarta realización del primer aspecto, la primera parte de un o el genoma de un o el virus comprende una señal de empaquetamiento, por lo que preferiblemente la señal de empaquetamiento es una señal de empaquetamiento adenoviral, y más preferiblemente la señal de empaquetamiento adenoviral es el ^ 5 del extremo izquierdo del adenovirus humano tipo 5.
En una realización del primer aspecto, la unidad de transcripción comprende un promotor, un ácido nucleico a expresar y una señal de terminación.
En una realización del primer aspecto, el promotor es activo en células eucariotas, preferiblemente el promotor se selecciona del grupo que comprende promotores eucariotas o procariotas.
En una realización del primer aspecto, el promotor es uno que se reconoce por la ARN polimerasa II, por lo que dicho promotor se selecciona preferiblemente del grupo que comprende el promotor PGK y el promotor CMV.
En una realización del primer aspecto, el promotor es uno que se reconoce por la ARN polimerasa III, por lo que dicho promotor se selecciona preferiblemente del grupo que comprende el promotor U6, el promotor HI, el promotor ARNt, el promotor VA de adenovirus.
En una realización del primer aspecto, el ácido nucleico a expresar se selecciona del grupo que comprende ácidos nucleicos codificantes y secuencias de ácidos nucleicos no codificantes.
En una realización del primer aspecto, el ácido nucleico a expresar es un ácido nucleico codificante, por lo que el ácido nucleico codificante codifica una proteína, un polipéptido o un péptido.
En una realización del primer aspecto, el ácido nucleico a expresar es un ARN no codificante, preferiblemente el ácido nucleico a expresar es un microARN, un ARN pequeño de interferencia (ARNip) o un ARNhc.
En una realización del primer aspecto, la señal de terminación es una señal de terminación de un gen eucariota o viral, preferiblemente la señal de terminación se selecciona del grupo que comprende una señal poliA y señales de terminación para genes transcritos con ARN Pol III.
En una realización del primer aspecto, el sitio de recombinación específico del sitio es el sitio para la recombinasa Flp. En una realización del primer aspecto, el sitio para la recombinasa Flp es el sitio de tipo salvaje o un derivado del mismo, por lo que el derivado del mismo es adecuado para unirse a la recombinasa Flp.
En una realización del primer aspecto, el derivado del sitio para la recombinasa Flp es un sitio de recombinación mínimo que tiene una longitud de 34 nucleótidos y que comprende los elementos R2, U y R3 del sitio FRT de tipo salvaje.
En una realización del primer aspecto, las secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional comprenden un origen de replicación, por lo que preferiblemente el origen de replicación es el origen mínimo del fago gR6K.
En una realización del primer aspecto, el marcador de selección positiva media la resistencia contra un agente de selección.
En una realización del primer aspecto, el agente de selección se selecciona del grupo que comprende ampicilina, zeocina, gentamicina, cloranfenicol, kanamicina, neomicina y puromicina.
En una realización del primer aspecto, la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva es un gen seleccionado del grupo de genes que comprende bla, ant(3 )-¡a, aph(3')-II, aph(3')-II, ble y cmlA.
En una realización del primer aspecto, la secuencia reguladora que tiene una actividad reguladora en un procariota es una secuencia que dirige la expresión de una secuencia de nucleótidos en un procariota, preferiblemente en una célula huésped procariota.
En una realización del primer aspecto, la secuencia reguladora es un promotor, preferiblemente un promotor procariótico, e incluso más preferiblemente el promotor de galactoquinasa de E. coli.
En una realización del primer aspecto, el promotor es un promotor inducible, preferiblemente un promotor procariótico inducible.
En una realización del quinto aspecto, el marcador de selección negativa o la expresión de la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa media o confiere sensibilidad a un agente de selección y/o una condición de selección.
En una realización del primer aspecto, la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa es un gen seleccionado del grupo que comprende el gen galK, tetAR, pheS, thyA, lacy, ccdB y rpsL.
En una realización del primer aspecto, el agente de selección se selecciona del grupo que comprende compuestos lipofílicos, sacarosa, p-clorofenilalanina, trimetoprima, t-o-nitrofenil-beta-D-galactopiranósido y estreptomicina.
En una realización del primer aspecto, la segunda y la tercera molécula de ácido nucleico están presentes cada una como una molécula separada.
En una realización del primer aspecto, la tercera molécula de ácido nucleico es un plásmido y la segunda molécula de ácido nucleico es un BAC.
En una realización del primer aspecto, el virus es un adenovirus humano tipo 5.
En la realización del primer aspecto, el genoma completo contiene una, preferiblemente exactamente una unidad de transducción.
En una realización del primer aspecto, el primer sitio de restricción y el segundo sitio de restricción están ausentes tanto de la primera parte de un o el genoma de un o el virus como de la segunda parte de un o el genoma de un o el virus, por lo que preferiblemente, el virus es un adenovirus y más preferiblemente un adenovirus humano e incluso más preferiblemente un adenovirus humano de tipo 5.
En una realización del primer aspecto, la primera enzima de restricción y la segunda enzima de restricción se seleccionan del grupo que comprende AbsI, BstBI, PacI, PsrI, SgrDI y SwaI.
En una realización del primer aspecto, el genoma completo se puede liberar mediante digestión con la primera y la segunda enzimas de restricción, por lo que preferiblemente la primera enzima de restricción y la segunda enzima de restricción son iguales, más preferiblemente la primera y la segunda enzima de restricción es PacI.
En una realización del primer aspecto, el virus que comprende el genoma completo es viable y competente para la replicación en una célula huésped permisiva, preferiblemente una línea celular permisiva.
En una realización del primer aspecto, el genoma completo comprende una deleción de partes del genoma de un o el virus, preferiblemente una deleción de uno o varios genes o regiones codificantes.
En una realización del primer aspecto, la deleción es una deleción de una región del genoma adenoviral, por lo que la región se selecciona del grupo que comprende la región E1, la región E2, la región E3, la región E4 y combinaciones de las mismas.
En una realización del primer aspecto, el marcador de selección positiva de la tercera molécula de ácido nucleico confiere resistencia contra la kanamicina, el marcador de selección negativa de la tercera molécula de ácido nucleico confiere sensibilidad a la estreptomicina y el segundo marcador de selección de la segunda molécula de ácido nucleico confiere resistencia al cloranfenicol.
En una realización del primer aspecto, el marcador de selección positiva de la tercera molécula de ácido nucleico confiere resistencia contra la kanamicina, el marcador de selección negativa de la tercera molécula de ácido nucleico confiere sensibilidad a la estreptomicina y el segundo marcador de selección de la segunda molécula de ácido nucleico confiere resistencia al cloranfenicol pero no a la kanamicina y/o la estreptomicina.
En una realización del primer aspecto, el marcador de selección positiva de la tercera molécula de ácido nucleico confiere resistencia contra un primer agente de selección, el marcador de selección negativa de la tercera molécula de ácido nucleico confiere sensibilidad a un segundo agente de selección y el segundo marcador de selección de la segunda molécula de ácido nucleico confiere resistencia contra un tercer agente de selección, en el que el primer agente de selección, el segundo agente de selección y el tercer agente de selección son diferentes entre sí.
En una realización del primer aspecto, la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa está bajo el control de un promotor, preferiblemente bajo el control de un promotor procariótico.
En una realización del primer aspecto, la segunda molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos bacteriana para la replicación de una única copia.
En una realización del primer aspecto t, la combinación, una vez que se ha introducido en una célula huésped, permite únicamente la replicación de la segunda molécula de ácido nucleico.
En una realización del primer aspecto, las secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional comprenden el origen mínimo del fago gR6K, y las secuencias para la replicación de una sola copia comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica factores que son partes de o el origen de replicación del factor F.
También se describe una cuarta molécula de ácido nucleico que comprende:
los siguientes elementos de la segunda molécula de ácido nucleico
(a) la unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación de una sola copia, y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección; (b) el sitio de recombinación específico del sitio;
(c) la segunda parte del genoma de un virus; y
(d) el sitio de restricción que se denomina como segundo sitio de restricción;
y los siguientes elementos de la primera molécula de ácido nucleico
(a) el sitio de recombinación específico del sitio;
(b) la unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un primer marcador de selección; (c) la primera parte de un genoma de un virus;
(d) la unidad de transcripción; y
(e) el primer sitio de restricción
en el que la cuarta molécula de ácido nucleico es preferiblemente una molécula circular, por lo que, preferiblemente, la cuarta molécula de ácido nucleico se puede obtener mediante un método según el cuarto aspecto.
En una realización del tercer aspecto, la tercera y la segunda molécula de ácido nucleico se hacen reaccionar en una célula huésped procariota, preferiblemente la célula huésped es el organismo o un organismo similar a dicho organismo que ha sido depositado en la DSMZ según el tratado de Budapest bajo número de acceso DSM 23743. En una realización del tercer aspecto, el virus es un adenovirus, preferiblemente un adenovirus humano, y más preferiblemente un adenovirus humano tipo 5.
En una realización del tercer aspecto, la célula huésped se selecciona de un grupo de cepas E. coli que carecen del origen de replicación del factor F y son sensibles a los marcadores de selección proporcionados por la tercera y la segunda molécula de ácido nucleico.
En una realización del tercer aspecto, la célula huésped es una cepa E. coli que es deficiente en la expresión de la proteína pi.
En una realización del tercer aspecto, la célula huésped se selecciona de un grupo que comprende células derivadas de K12 E. coli, preferiblemente DH10B.
En una realización del tercer aspecto, la tercera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico se hacen reaccionar en una célula huésped eucariota y la etapa de seleccionar el producto de recombinación está ausente, en el que preferiblemente la célula huésped eucariota es una célula huésped permisiva.
En una realización del tercer aspecto, la célula huésped permisiva es una célula que se selecciona del grupo que comprende células 293, células 911, células PER.C6 y células CAP.
En una realización del tercer aspecto, el número de eventos de recombinación se limita a un evento de recombinación. En una realización del tercer aspecto, la selección del producto de recombinación se realiza seleccionando la(s) célula(s) huésped que albergan un producto de recombinación que proporciona el marcador de selección positiva de la tercera molécula de ácido nucleico y el segundo marcador de selección de la segunda molécula de ácido nucleico, y que no son sensibles al marcador de selección negativa.
En una realización del tercer aspecto, el marcador de selección positiva de la tercera molécula de ácido nucleico confiere resistencia contra la kanamicina, el marcador de selección negativa de la tercera molécula de ácido nucleico confiere sensibilidad a la estreptomicina y el segundo marcador de selección de la segunda molécula de ácido nucleico confiere resistencia contra cloranfenicol, y en la que la selección del producto de recombinación se obtiene sometiendo a la célula huésped procariota a kanamicina, estreptomicina y cloranfenicol.
En una realización del tercer aspecto, el marcador de selección positiva de la tercera molécula de ácido nucleico confiere resistencia contra la kanamicina, el marcador de selección negativa de la tercera molécula de ácido nucleico confiere sensibilidad a la estreptomicina, y el segundo marcador de selección de la segunda molécula de ácido nucleico confiere resistencia contra el cloranfenicol pero no contra la kanamicina y/o la estreptomicina, y en la que la selección del producto de recombinación se obtiene sometiendo a la célula huésped procariota a kanamicina, estreptomicina y cloranfenicol. En una realización del tercer aspecto, el marcador de selección positiva de la tercera molécula de ácido nucleico confiere resistencia contra un primer agente de selección, el marcador de selección negativa de la tercera molécula de ácido nucleico confiere sensibilidad a un segundo agente de selección y el segundo marcador de selección de la segunda molécula de ácido nucleico confiere resistencia contra un tercer agente de selección, en el que el primer agente de selección, el segundo agente de selección y el tercer agente de selección son diferentes entre sí, y en el que la selección del producto de recombinación se obtiene sometiendo a la célula huésped procariota al primer, segundo y tercer agentes de selección.
En una realización del tercer aspecto, la tercera y la segunda moléculas de ácido nucleico se hacen reaccionar en presencia de una recombinasa.
En una realización del tercer aspecto, la recombinasa interactúa con el sitio de recombinación específico del sitio proporcionado por la tercera molécula de ácido nucleico y el sitio de recombinación específico del sitio proporcionado por la segunda molécula de ácido nucleico.
En una realización del tercer aspecto, la recombinasa es recombinasa Flp.
En una realización del cuarto aspecto, la recombinasa está codificada por la primera molécula de ácido nucleico o la segunda molécula de ácido nucleico.
En una realización del tercer aspecto, la recombinasa se proporciona por la célula huésped procariota o la célula huésped eucariota.
En una realización del tercer aspecto, después de la recombinación, se inactiva la recombinasa.
En una realización del tercer aspecto, la recombinasa y preferiblemente la recombinasa Flp está controlada por un promotor condicional o inducible.
En una realización del tercer aspecto, la expresión de la recombinasa está controlada por un origen de replicación sensible a la temperatura.
En una realización del tercer aspecto, la enzima de restricción se selecciona del grupo que comprende AbsI, BstBI, PacI, PsrI, SgrDI y SwaI.
En uno del tercer aspecto, la tercera y la segunda molécula de ácido nucleico se introducen por separado en la célula huésped.
En una realización del tercer aspecto, la segunda molécula de ácido nucleico se introduce en la célula huésped antes que la tercera molécula de ácido nucleico.
En una realización del tercer aspecto, la escisión del producto de recombinación proporciona un genoma del virus completo complementado que es competente para la replicación en células permisivas.
En una realización del tercer aspecto, el método comprende, como etapa adicional, transfectar el genoma del virus completo complementado en una célula huésped complementaria.
En una realización del tercer aspecto, el método se usa en la construcción de vectores para transferencia de genes, vacunas o aplicaciones terapéuticas.
En una realización del tercer aspecto, el método se usa en la construcción de una biblioteca del genoma de virus. También se describe una quinta molécula de ácido nucleico que comprende:
los siguientes elementos de la segunda molécula de ácido nucleico
(a) la unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación de una sola copia, y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección; (b) el sitio de recombinación específico del sitio;
(c) la segunda parte de un genoma de un virus; y
(d) el sitio de restricción que se denomina segundo sitio de restricción;
y los siguientes elementos de la tercera molécula de ácido nucleico
(a) opcionalmente la primera parte del genoma de un virus;
(b) la secuencia de nucleótidos, preferiblemente una secuencia de nucleótidos genómica, o una unidad de transcripción; (c) la secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene actividad reguladora en un procariota;
(d) el sitio de recombinación específico del sitio;
(e) la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa;
(f) la unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva; y (g) el primer sitio de restricción,
en el que la quinta molécula de ácido nucleico es preferiblemente una molécula circular, por lo que, preferiblemente, la quinta molécula de ácido nucleico se puede obtener mediante un método según el tercer aspecto.
También se describe una pluralidad de la cuarta molécula de ácido nucleico, en la que la pluralidad de la molécula de ácido nucleico consiste en un número de moléculas de ácido nucleico individuales, en las que las moléculas de ácido nucleico individuales difieren entre sí en el ácido nucleico a expresar, que es parte de la unidad de transcripción.
También se describe una pluralidad de la quinta molécula de ácido nucleico, en la que la pluralidad de la molécula de ácido nucleico consiste en un número de moléculas de ácido nucleico individuales, en las que las moléculas de ácido nucleico individuales difieren entre sí en el elemento (b) de la tercera molécula de ácido nucleico, preferiblemente en la secuencia de nucleótidos del elemento (b) o en el ácido nucleico a expresar que es parte de la unidad de transcripción del elemento (b).
En una realización del séptimo y octavo aspecto, la molécula o moléculas de ácido nucleico está(n) contenida(s) en una forma lista para usar.
En una realización del séptimo y octavo aspecto, el kit es para el uso en un método para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus según el tercer y cuarto aspecto, incluida cualquier realización de los mismos.
En una realización del séptimo y octavo aspecto, el kit es para el uso en un método para generar una biblioteca de secuencias de nucleótidos según las reivindicaciones 5 y 6, incluida cualquier realización de las mismas.
Una persona experta en la técnica entenderá que el término "proporcionar" o "que proporciona" como se usa en la presente memoria en relación con los diversos métodos, preferiblemente también significa que la molécula de ácido nucleico que se proporciona, está disponible para la realización de cualquier etapa sujeta a dichos métodos y que no hay necesidad de sintetizar dicha molécula de ácido nucleico antes o inmediatamente antes de dicha etapa. Más bien, dicha molécula de ácido nucleico puede tomarse de cualquier reserva de dicha molécula de ácido nucleico.
Los métodos de la presente invención, como se definen en las reivindicaciones, permiten la construcción de genomas de vectores virales infecciosos independientemente del número de eventos de recombinación cuando se usa la recombinación específica del sitio en bacterias, y limitan el número de eventos de recombinación a uno cuando se usa la recombinación específica del sitio como se describe para el segundo sistema de ácido nucleico, en el que un primer sistema de este tipo consiste en una combinación de la primera molécula de ácido nucleico según la presente invención y la segunda molécula de ácido nucleico según la presente invención, y un segundo sistema de este tipo consiste en una combinación de la tercera molécula de ácido nucleico según la presente invención y la segunda molécula de ácido nucleico según la presente invención. Los expertos en la técnica reconocerán que, según la presente invención, un cierto porcentaje de los eventos de recombinación dan como resultado múltiples recombinaciones. Preferiblemente, dicho porcentaje es menos del 5%, preferiblemente menos del 3% y más preferiblemente menos del 2,5%. La ocurrencia de múltiples eventos de recombinación es una contaminación que hace necesario cribar y caracterizar los recombinantes. Dicho cribado se realiza en relación con los métodos de la invención para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus y se denomina como selección del producto recombinante.
Ambos sistemas descritos pueden usarse para generar genomas de vectores de virus recombinantes. Los productos de recombinación resultantes en ambos sistemas contienen exactamente una copia de un genoma de un virus independientemente del número de eventos de integración. Esta invención, como se define en las reivindicaciones, proporciona una solución para eliminar múltiples recombinaciones y evitar el cribado de una biblioteca que contiene una pluralidad de genomas de vectores virales. Dicho genoma de virus o pluralidad de genomas de virus es un genoma complementado y completo de un virus, preferiblemente de un adenovirus. El genoma de dicho virus se libera mediante digestión de restricción con una enzima de restricción única, eliminando así todas las secuencias bacterianas conectadas al genoma del virus. Por lo tanto, los genomas del virus generados por estos métodos están esencialmente libres de cualquier secuencia bacteriana no deseada.
La disposición de los elementos genéticos en la primera, segunda y tercera moléculas de ácido nucleico implica que los productos de recombinación resultantes contienen exactamente una copia de un genoma de virus completo complementado independientemente del número de eventos de integración. Por lo tanto, en esta invención se describe un método en el que una forma linealizada del primer o tercer ácido nucleico se hace reaccionar con una forma lineal del segundo ácido nucleico en una célula huésped eucariota permisiva para el o un adenovirus en presencia de la recombinasa específica del sitio. Este método no requiere la etapa de seleccionar el producto de recombinación.
Los métodos de la presente invención como se definen en las reivindicaciones superan sustancialmente las limitaciones actuales de las tecnologías que hacen uso de la recombinación específica de sitio como, por ejemplo, sujeto al sistema Gateway™, para la construcción de genomas de adenovirus o una pluralidad de genomas de adenovirus. Más específicamente, la recombinación entre un sitio Frt presente en la primera o la tercera molécula de ácido nucleico según la presente invención y en la segunda molécula de ácido nucleico evita las desventajas asociadas con la recombinación entre dos sitios de recombinación no idénticos in vitro y permite la generación de una pluralidad de genomas virales con alta eficiencia y fidelidad.
Los métodos de la presente invención como se definen en las reivindicaciones también resuelven el problema del quimerismo en los cromosomas artificiales de levadura (YAC) y la inestabilidad del ADN genómico en vectores plásmidos o cósmidos de múltiples copias. En relación con dichos métodos, este efecto está mediado por el uso de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) que se replican utilizando el replicón de factor F de copia única (Kim UJ et al., Nucleic Acids Res., 20: 1083-1085, 1992; Shizuya H y Kouros-Mehr H., Keio J. Med. 50: 26-30, 2001). Además, los métodos de la presente invención superan la limitación de la recombinación específica de sitio para la construcción de bibliotecas puras, limitando el número de eventos de recombinación a uno para las reacciones de recombinación que ocurren en E. coli sujeto a las consideraciones anteriores sobre el porcentaje de eventos de recombinación múltiple. La biblioteca se puede mantener de manera estable en BAC de copia única y, por lo tanto, supera la limitación de las bibliotecas de expresión viral actuales. En el caso de adenovirus, las bibliotecas se mantienen como virus vivos y, por lo tanto, están sujetas a un sesgo debido a la selección de virus mutantes que tienen una ventaja de crecimiento, que se debe en el caso de bibliotecas de expresión de ADNc donde la expresión del ADNc confiere una ventaja o desventaja de crecimiento, y por lo tanto están sobre o sub-representadas en la población de bibliotecas. Además, mediante el uso de una selección o cribado según los métodos de la presente invención como se definen en las reivindicaciones, se eliminan por completo aquellos productos de recombinación que tienen inserciones múltiples. Como se usa preferiblemente en la presente memoria, la selección, en el caso del método para la generación de una molécula de ácido nucleico que codifica un virus usando la tercera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico, significa que el producto de reacción se puede seleccionar mediante el uso de una combinación de marcadores de selección positiva y negativa proporcionados por ambas moléculas de ácido nucleico, por lo que el marcador de selección positiva proporcionado por la tercera molécula de ácido nucleico confiere resistencia contra un agente de selección, el marcador de selección negativa proporcionado por el tercer ácido nucleico confiere sensibilidad a un agente de selección y el segundo marcador de selección proporcionado por el segundo ácido nucleico, proporciona resistencia contra un segundo agente de selección.
Finalmente, la presente descripción está relacionada con el sistema de recombinación que permite la construcción de grandes bibliotecas de ADN y una solución para aplicar el sistema Frt/Flp para la construcción de genomas de vectores recombinantes in vitro e in vivo.
El presente inventor ha descubierto sorprendentemente que un sistema que comprende la recombinación específica de un sitio entre dos ácidos nucleicos, cada uno con un sitio de reconocimiento para la recombinasa Flp, en una huésped E. coli que alberga un plásmido que permite la expresión de recombinasa condicional fue capaz de superar las limitaciones mencionadas anteriormente y permitió la construcción de un genoma de adenovirus, y una pluralidad de genomas de adenovirus con alta eficiencia, precisión, conservando la estabilidad genética de los genomas de adenovirus en el segundo ácido nucleico y en los productos de recombinación resultantes, y limitando el número de recombinaciones entre los dos ácidos nucleicos a uno. En consecuencia, el problema de la presente invención también se resuelve mediante un sistema de dos ácidos nucleicos para la recombinación específica del sitio mediada por la recombinasa Flp, que proporciona un método simple, confiable y altamente eficiente para la construcción de vectores virales basado en la recombinación específica del sitio en E. coli.
Es un objetivo adicional de la invención utilizar la recombinación específica de sitio mediada por Flp-Frt junto con los dos sistemas de ADN de vector descritos, es decir, el sistema que comprende las primeras moléculas de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico, y el sistema que comprende la segunda molécula de ácido nucleico y la tercera molécula de ácido nucleico. Esto proporciona un método sencillo, fiable y altamente eficiente para la construcción de una pluralidad de ácidos nucleicos recombinados que contienen una secuencia de nucleótidos. Preferiblemente, dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos genómica de un virus, preferiblemente adenovirus, o (una) parte(s) del mismo. Es posible utilizar este aspecto de la invención para mantener establemente genomas en exceso de 300 kb, con el fin de conservar una buena eficiencia de transformación, sin embargo, el tamaño del primer y tercer ácido nucleico debe ser menor de 100 kb y, si se va a construir una biblioteca de ácidos nucleicos, preferiblemente menos de 40 kb, e incluso más preferiblemente menos de 10 kb.
La invención, como se define en las reivindicaciones, se refiere a una combinación de moléculas de ácido nucleico, vectores y métodos que utilizan la recombinación específica del sitio para recombinar dichas moléculas de ácido nucleico en E. coli. Se describen métodos para la generación de bibliotecas de ácidos nucleicos, por lo que en una realización preferida del método de la presente invención, el método es para la generación de genomas de virus y una pluralidad de genomas de virus de los mismos. Las moléculas de ácido nucleico individualmente o como combinación, y los métodos descritos en la presente invención son más confiables y amplían el uso de sistemas de recombinación específicos de sitio, permitiendo, entre otros, la construcción de genomas virales complementados y completos, respectivamente, y la generación de bibliotecas no sesgadas y estables de genomas virales.
La invención, como se define en las reivindicaciones, también se refiere a métodos para la generación de moléculas de ácido nucleico, generación de genomas de virus o una pluralidad de genomas de virus de los mismos, utilizando la recombinación específica de sitio para recombinar dichas moléculas de ácido nucleico en células huésped eucariotas permisivas en presencia de la recombinasa específica de sitio. Se describen métodos para la generación de genomas de virus o una pluralidad de genomas de virus, por lo que en una realización preferida del método de la presente invención, el método es para la generación de vectores de adenovirus. Los métodos descritos en la presente invención son considerablemente más rápidos que los métodos establecidos para la generación de adenovirus y amplían el uso de sistemas de recombinación específicos del sitio, lo que permite la generación de genomas de virus o una pluralidad de genomas de virus, que son competentes para la replicación en una línea celular complementaria.
La presente invención, como se define en las reivindicaciones, proporciona un primer sistema de ácido nucleico en E. coli con alta eficiencia para la recombinación específica del sitio mediada por la recombinasa Flp, para unir dos ADN que por separado no se replican y forman un genoma completo complementado de una virus, preferiblemente un adenovirus, después de la recombinación. Una aplicación de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, y más específicamente la primera molécula de ácido nucleico, la segunda molécula de ácido nucleico y la tercera molécula de ácido nucleico, es la construcción de genomas de adenovirus eliminados para los genes E1 y opcionalmente E3, que contienen ADN extraño en lugar del gen E1 (vectores de adenovirus de primera generación).
En una realización adicional de esta invención, como se define en las reivindicaciones, se proporciona un primer sistema de ácido nucleico en E. coli, con alta eficiencia para la recombinación específica del sitio mediada por la recombinasa Flp, para unir dos ADN que por separado no se replican y forman un genoma completo complementado de adenovirus humano que no es de tipo 5, preferiblemente un adenovirus humano de tipo 19a después de la recombinación. Una aplicación de la combinación de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención como se define en las reivindicaciones, y más específicamente la primera molécula de ácido nucleico, y la segunda molécula de ácido nucleico, es la construcción de genomas de adenovirus humanos no de tipo 5 suprimidos para los genes E1 y opcionalmente E3, que contienen ADN extraño en lugar del gen E1 (vectores de adenovirus de serotipo de primera generación).
De acuerdo con la presente invención, como se define en las reivindicaciones, se describe una segunda molécula de ácido nucleico que es preferiblemente un BAC, que contiene un sitio Frt de tipo salvaje, idéntico o similar al vector pBACSir2 (SEQ ID No. 2), o pBACSir Ad19a (s Eq ID No. 14) que comprende una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) una secuencia de nucleótidos bacteriana para la replicación de una sola copia, y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección, un sitio de recombinación específico del sitio, preferentemente un sitio Frt tipo salvaje (SEQ. ID 8), una segunda parte de un genoma de un virus, preferentemente una segunda parte de un genoma de un adenovirus, e incluso más preferentemente una segunda parte de un adenovirus humano tipo 5 o un adenovirus humano tipo 19a, y opcionalmente un segundo sitio de restricción. Además, se proporciona un plásmido idéntico o similar a pDonorSir1 (SEQ. ID No. 1) o al plásmido pDonorSir19a (SEQ ID No. 15), correspondiente a la primera molécula de ácido nucleico que comprende una primera parte de un genoma de un virus, preferentemente una primera parte de un genoma de un adenovirus, e incluso más preferentemente una segunda parte de un adenovirus tipo 5 o adenovirus humano tipo 19a, una unidad de transcripción, un sitio de recombinación específico de sitio, preferentemente un sitio Frt mínimo (SEQ. ID No. 7), una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un primer marcador de selección.
Otra realización del segundo sistema de ácido nucleico descrito es un plásmido similar o idéntico a pDonorSir2 (SEQ ID No. 6) correspondiente a la tercera molécula de ácido nucleico de la presente invención, que contiene opcionalmente una primera parte de un genoma de un virus, preferentemente un primera parte de un genoma de un adenovirus, e incluso más preferentemente una segunda parte de un adenovirus tipo 5 una secuencia de nucleótidos, preferiblemente una secuencia de nucleótidos genómica, o una unidad de transcripción, una secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene actividad reguladora en un procariota, preferentemente un promotor bacteriano, un sitio Frt específico del sitio, preferentemente un Frt mínimo (SEQ. ID No. 7), una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa, una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva y, opcionalmente, un primer sitio de restricción.
Una aplicación de este método que utiliza los dos sistemas de ácido nucleico es la construcción de genomas de virus, o una pluralidad de genomas de virus de los mismos, preferentemente genomas de adenovirus, o una pluralidad de genomas de adenovirus, y más preferentemente genomas de adenovirus tipo 5 o una pluralidad de genomas de adenovirus tipo 5. Una aplicación adicional de los métodos descritos es la generación de bibliotecas de expresión viral. Los sistemas de ácido nucleico según la presente invención y los métodos para la generación de una molécula de ácido nucleico que codifica un genoma de virus también son aplicables por analogía a la manipulación y construcción de genomas equivalentes de tipo 5 no adenovirales. En una realización adicional, dichas moléculas de ácido nucleico y métodos, respectivamente, se pueden aplicar en la configuración en espejo, y las secuencias de nucleótidos se pueden rescatar en el extremo derecho del genoma de adenovirus (por ejemplo, E3), o se pueden aplicar para eliminar genes E4, o para generar genomas de adenovirus, o una pluralidad de genomas de adenovirus que llevan dichas secuencias de nucleótidos. Una aplicación del uso de los dos sistemas de ácido nucleico en la "configuración en espejo" es la construcción de un genoma de adenovirus o una pluralidad de genomas de adenovirus con proteínas virales mutadas.
La presente invención, como se define en las reivindicaciones, abarca el uso de una combinación que comprende la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico, y el uso de una combinación que comprende la tercera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico, respectivamente. La primera con la segunda o la tercera con la segunda molécula de ácido nucleico se hace reaccionar en E. coli con alta eficiencia mediante recombinación específica de sitio mediada por recombinasa Flp. En la presente invención, la segunda molécula de ácido nucleico es un BAC y contiene uno, preferiblemente un sitio Frt de tipo salvaje, por lo que la segunda molécula de ácido nucleico es idéntica o similar al vector pBACSir1, pBACSir2 o BacSir19a. Además, se describe un tercer ácido nucleico idéntico o similar a pDonorSir2. Una aplicación de este sistema es la construcción de un cuarto, un quinto ácidos nucleicos o una pluralidad de cuarta o quinta moléculas de ácido nucleico, cada una de las cuales contiene una copia de un genoma de virus completo complementado.
Breve descripción de los ejemplos
El producto de reacción, correspondiente a una cuarta molécula de ácido nucleico según el método proporcionado en esta invención, resulta de una combinación seguida de una recombinación específica del sitio en una célula huésped E. coli entre las moléculas de ácido nucleico pDonorSir1 o pDonorSir19a y una molécula de ácido nucleico idéntica o similar a pBACSir1 o pBACSir19a, respectivamente. Los productos de reacción que resultan de la recombinación específica del sitio entre las dos moléculas de ácido nucleico pDonorSir1 y pBACSir1 se caracterizaron mediante análisis de restricción usando XhoI (Figura 2A). El análisis de restricción del producto de reacción pRAB1x una vez recombinado (SEQ. ID 4) y el producto de reacción pRAB2x (SEQ. ID5) dos veces recombinado se muestra en la Fig. 2A. Los productos de reacción obtenidos pRAB1x y pRAB2x contenían exactamente una copia de un genoma de adenovirus humano tipo 5 completo complementado, que se liberaron de los productos de reacción mediante digestión de restricción con PacI. El ADN digerido con PacI se transfectó en células 293 y se obtuvo un adenovirus recombinante. El ADN de los adenovirus aislados después de la infección productiva de las células 293 se analizó mediante digestión de restricción con XhoI (Fig. 2A). En la figura 1 se da una representación esquemática de la reacción de recombinación mediada por Flp y los productos de reacción resultantes una y dos veces recombinados.
Una pluralidad de productos de reacción, correspondientes cada uno a una quinta molécula de ácido nucleico según el método proporcionado en esta invención, que resultan de una combinación y recombinación específica de sitio en una célula huésped E. coli de pDonorSir2 y pBACSir2 se caracterizaron mediante análisis de restricción usando XhoI (Figura 2B). El análisis de restricción con XhoI del producto de reacción una vez recombinado pRAB_RPSL_1x (SEQ. ID. 11) y el producto de reacción dos veces recombinado pRAB_RPSL_2x (SEQ. ID. 12) se muestra en la figura 2B. La mayoría (83/88) de los productos de reacción obtenidos resultaron de una sola recombinación entre pDonorSir2 y pBACSir2 (Figura 2B). El patrón de digestión de restricción de (2/88) productos de recombinación correspondió al producto de doble recombinación pRAB_RPSL_2x. En la figura 3 se da una representación esquemática del esquema de reacción y los productos de reacción. En el producto recombinado único pRAB_RPSL_1x la secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene actividad reguladora en un procariota, aquí el promotor de galactoquinasa de E. coli y el marcador de selección negativa, aquí el gen RPSL, están funcionalmente separados entre sí, mientras que, sorprendentemente, para el producto de doble recombinación pRAB_RPSL_2x, el marcador de selección negativa en combinación con los dos marcadores de selección positiva fue altamente funcional, lo que condujo a un fondo mínimo de productos de reacción de doble recombinación. En base a los resultados obtenidos en este ejemplo (Fig. 3), en la Fig. 6 se da una matriz que describe posibles combinaciones de marcadores de selección positiva y negativa para una contra-selección altamente eficiente de productos de doble recombinación pRAB_RPSL_2x.
En otro ejemplo, la recombinación específica de sitio mediada por la recombinasa Flp entre la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico se realizó en una célula huésped eucariota que proporciona la recombinasa específica de sitio. Las moléculas de ácido nucleico pDonorSirl-EGFP (Seq. ID No. 9) y pBACSir2 se digirieron con una enzima que reconoce el primer y segundo sitio de restricción, respectivamente, y las moléculas de ácido nucleico linealizadas se transfectaron en células 293 que expresan de manera estable la recombinasa Flp. Los productos de recombinación resultantes contenían una copia de un genoma de adenovirus humano de tipo 5 completo complementado que expresaba el gen EGFP que era competente para la replicación en células 293 (Fig. 4).
El presente inventor pudo transferir la técnica basada en FRT/Flp aquí descrita a otro serotipo de adenovirus, y generó vectores de adenovirus recombinantes de tipo Ad19a que expresaban GFP. El genoma del adenovirus tipo 19a se clonó en un BAC (pBACSir19a) eliminado para el extremo izquierdo del genoma de Ad19a, que incluía la ITR izquierda, el sitio de empaquetamiento y la región del gen E1 incluido su sitio de poliadenilación, con un sitio FRT introducido en este sitio para permitir la inserción mediada por Flp de un plásmido donante, que llevaba una copia de los elementos eliminados. Además, el promotor pIX que es necesario para la expresión del gen pIX que codifica una proteína de la cápside menor se conservó en el ácido nucleico pBACSir19a. Además, pBACSir19a también tenía eliminada la región E3. La secuencia del vector pBACSir19a se proporciona en la Seq. ID No. 14). El promotor pIX y más específicamente el promotor pIX adenoviral se conocen en la técnica y su secuencia se puede recuperar de bancos de datos disponibles públicamente. En relación con esto, una persona experta en la técnica reconocerá que el promotor pIX, como se usa preferiblemente en la presente memoria, es un promotor unido operativamente a una secuencia codificante de pIX en un adenovirus, por lo que dicho adenovirus es preferiblemente un adenovirus tipo 5 o un adenovirus tipo 19a. En una realización, el promotor pIX es un promotor mínimo, en el que dicho promotor mínimo es un elemento de ADN de 70 nucleótidos derivado de la región promotora corriente arriba del gen pIX del adenovirus. En una realización adicional, el promotor pIX mínimo comprende una caja TATA y una caja Sp1 y, en Ad5, corresponde a los nucleótidos 3511 a 3580 del genoma adenoviral. Muchos otros (sero)tipos de adenovirus contienen el gen pIX y su promotor corriente arriba también, y los promotores mínimos derivados de estos promotores pIX también están incluidos en esta invención.
El ácido nucleico donante pDonorSir19a lleva un sitio PacI, ITR de Ad19a y señal de empaquetamiento y una unidad de transcripción EGFP, y es comparable al vector donante pDonorSir1 pero todos los elementos cis virales son reemplazados por secuencias del adenovirus humano tipo 19a (SEQ ID No. 15). Los productos de reacción obtenidos según el método proporcionado en esta invención contenían un genoma completo de adenovirus recombinante de tipo 19a competente para la replicación resultante de la combinación seguida de una recombinación específica del sitio en una célula huésped de E. coli entre las moléculas de ácido nucleico pDonorSir19a y una molécula de ácido nucleico idéntica o similar a pBACSir19a, respectivamente. Los productos de reacción obtenidos se caracterizaron mediante análisis de restricción utilizando KpnI (Fig. 7). Se purificaron dos clones independientes (carril 1 y carril 4) del ácido nucleico resultante y se digirieron con PacI y se transfectaron con células 293, dando como resultado vectores Ad19a recombinantes viables.
Una pluralidad de productos de reacción, correspondientes cada uno a una quinta molécula de ácido nucleico según el método proporcionado en esta invención, resulta de una combinación y recombinación específica de sitio en una célula huésped E. coli de pDonorSir2_Ad19a. El plásmido pDonorSir2_Ad19a es una realización de la tercera molécula de ácido nucleico de la presente invención y difiere de pDonorSir2 con respecto a todas las secuencias derivadas de Ad5, que han sido reemplazadas por las correspondientes secuencias de Ad19a. La recombinación entre pDonorSir2_ad19a y pBACSir19a da como resultado, según la presente invención, un único producto de recombinación. En este único producto recombinado, la secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene actividad reguladora en un procariota, aquí el promotor de galactoquinasa de E. coli y el marcador de selección negativa, aquí el gen RPSL, están funcionalmente separados entre sí, mientras que, sorprendentemente, para el producto de doble recombinación, el marcador de selección negativa en combinación con los dos marcadores de selección positiva es altamente funcional, lo que lleva a un fondo mínimo de los productos de reacción de doble recombinación. En base a los resultados obtenidos en este ejemplo, en la figura 6 se proporciona una matriz que describe posibles combinaciones sinérgicas de marcadores de selección positiva y negativa para una contra-selección altamente eficiente de productos de doble recombinación.
Descripción de las realizaciones preferidas
La presente invención, como se define en las reivindicaciones, está, en un aspecto, relacionada con una combinación de un primer ácido nucleico con una primera parte de un genoma de un virus que se combina con una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una segunda parte de un genoma de un virus, mediante el cual la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico se combinan y se hacen reaccionar mediante recombinación específica del sitio en células huésped E. coli que proporcionan una recombinasa específica de sitio. La molécula de ácido nucleico resultante contiene exactamente una copia de un genoma completo complementado de un o el virus, por lo que el genoma del virus es competente para la replicación en células permisivas. En la Fig. 1 se muestra una ilustración esquemática de esta invención. En otro aspecto de la presente invención como se define en las reivindicaciones, un tercer ácido nucleico se combina y se hace reaccionar mediante recombinación específica de sitio con una segunda molécula de ácido nucleico en células huésped E. coli que proporcionan una recombinasa específica de sitio. La organización de los elementos genéticos en la tercera molécula de ácido nucleico es inventiva y, según el método proporcionado en esta invención, restringe el número de eventos de recombinación a uno en >97,5% de los casos. Esta eficiencia es suficiente para la construcción de una pluralidad o biblioteca de quintas moléculas de ácido nucleico y resuelve el problema de la necesidad de seleccionar tal pluralidad de ácido nucleico o biblioteca para productos recombinados simples. En la Fig.3 se muestra una representación esquemática de este método.
La primera molécula de ácido nucleico comprende una primera parte de un genoma de un virus, preferentemente una primera parte de un genoma de un adenovirus, e incluso más preferentemente una primera parte del adenovirus humano tipo 5 o un adenovirus humano tipo 19a. Además, la primera molécula de ácido nucleico comprende una unidad de transcripción, un sitio de recombinación específico del sitio, preferentemente un sitio Frt mínimo (SEQ. ID No 7), una unidad de secuencia de nucleótidos bacterianos que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un primer marcador de selección. En una realización preferida, el primer ácido nucleico es un plásmido bacteriano que contiene una primera parte de un o el genoma de un virus, por lo que la primera parte de un genoma de un o el virus es una repetición terminal, preferiblemente una repetición terminal invertida. En una realización más preferida, el virus es el adenovirus humano tipo 5 y la primera parte del genoma del adenovirus humano tipo 5 es la repetición terminal invertida izquierda.
En una realización de la presente invención como se define en las reivindicaciones, la primera parte de un genoma de un virus comprende una señal de empaquetamiento. En una realización preferida, la señal de empaquetamiento es parte de la secuencia terminal, por lo que en una realización más preferida la señal de empaquetamiento es la señal de empaquetamiento (^5) del adenovirus humano tipo 5 que se extiende desde nt194 a nt385 del genoma AV5 El empaquetamiento de vectores adenovirales depende de una serie de 7 repeticiones 'A' que se utilizan en un orden jerárquico, siendo algunas más importantes que otras. Por lo tanto, es posible definir secuencias de empaquetamiento sintéticas o mínimas combinando partes de secuencias derivadas de esta región. La ubicación de estos elementos de empaquetamiento que actúan en cis en la parte izquierda del genoma del adenovirus se ha confirmado experimentalmente para muchos otros tipos de adenovirus. Además, la identificación de factores que actúan en trans para el proceso de empaquetamiento ha identificado varias proteínas de adenovirus que actúan de una manera específica de subtipo, permitiendo solo el empaquetamiento de ADN viral si la señal de encapsidación ^ y los factores que actúan en trans se derivan del mismo subtipo o son compatibles. .
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, la primera parte de un genoma de un virus que comprende la totalidad o partes del extremo izquierdo del genoma AV5 corriente arriba de la caja TATA de la unidad de transcripción E1 desde nt1 a nt 342 (SEQ ID 10).
Según la invención como se define en las reivindicaciones, la primera parte de un genoma de un virus contiene una repetición terminal invertida (ITR), por lo que en una realización preferida la repetición invertida se deriva del extremo izquierdo del adenovirus humano tipo 5 (AV5) y comprende la repetición terminal invertida izquierda. La longitud de la secuencia de repetición terminal invertida izquierda (ITR izquierda) se extiende desde el nucleótido 1 al nucleótido 103 de la secuencia AV5. El tamaño de las ITR varía entre los tipos serológicamente distintos de adenovirus, y se pueden definir secuencias de ITR terminales mínimas tan cortas como 18 pb (nt1 a nt18) que soportan la replicación del virus del adenovirus tipo 4 humano in vivo. Aunque las 18 pb terminales de la ITR soporta el nivel basal de replicación del ADN, la región auxiliar es necesaria para la máxima eficiencia en los adenovirus del subgrupo C, AV2 y AV5, respectivamente. Otros tipos de virus (por ejemplo, virus adenoasociados AVV) también dependen de la presencia de una ITR para la replicación del virus. Para el AAV de tipo 2 humano, la longitud de la ITR es de 145 nucleótidos y es una secuencia terminal esencial necesaria para la replicación del virus. El principio también se aplica a otros tipos de virus que contienen secuencias terminales distintas de las ITR (por ejemplo, SV40, baculovirus, gamma herpesvirus) necesarias para la replicación y encapsidación. Como ejemplo, la secuencia alfa del genoma del citomegalovirus funciona como una señal de escisión/empaquetamiento para los genomas defectuosos del virus del herpes simple.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, el primer ácido nucleico comprende un primer sitio de restricción, por lo que esta secuencia está ausente en la primera parte del genoma de un virus y en la unidad de transcripción presente en el primer ácido nucleico. En una realización preferida de esta invención, el sitio de restricción se elige entre un grupo de sitios de restricción ausentes en el genoma de un adenovirus. En una realización más preferida, el sitio de restricción se selecciona de un grupo de sitios ausentes en el adenovirus humano tipo 5 (AV5) que comprende AbsI, BstBI, PacI, PsrI, SgrDI y SwaI.
La primera molécula de ácido nucleico comprende los siguientes elementos: un sitio de recombinación específico del sitio, una secuencia de nucleótidos bacterianos que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un primer marcador de selección, un primer sitio de restricción, una primera parte de un genoma de un virus y una unidad de transcripción, por lo que en una realización preferida el virus es un adenovirus, y en una realización más preferida, el virus es un adenovirus humano tipo 5 o un adenovirus humano tipo 19a.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, la primera molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos en una orientación 5' a 3 obtenida después de la linealización de la primera molécula de ácido nucleico opcionalmente con la primera enzima de restricción: la primera parte de una genoma de un virus, una unidad de transcripción, un sitio de recombinación específico del sitio, la unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un primer marcador de selección, opcionalmente un primer sitio de restricción. Ésta es la orientación preferida de los elementos genéticos de la primera molécula de ácido nucleico.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, el primer ácido nucleico contiene los elementos genéticos en una "conformación en espejo", que comprende en una orientación en 5' -> 3': un sitio de recombinación específico del sitio, una unidad de transcripción, una primera parte de un genoma de un virus, opcionalmente un primer sitio de restricción, y una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para replicación condicional, y (ii) una secuencia que proporciona un primer marcador de selección. Según la invención, esta es una orientación adicional de los elementos genéticos de la primera molécula de ácido nucleico.
En una realización adicional como se define en las reivindicaciones, la primera parte de un genoma de un virus en una "conformación en espejo" comprende una repetición terminal. En una realización preferida, la primera parte de un genoma de un virus comprende una repetición terminal invertida. En una realización más preferida, comprende una repetición terminal derecha de un genoma de virus, e incluso más preferiblemente la repetición terminal derecha de un adenovirus, siendo los últimos 103 nucleótidos del genoma de un genoma de virus adenovirus humano tipo 5.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, se proporciona una unidad de transcripción que contiene un promotor, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico a expresar y una señal de terminación.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, el primer ácido nucleico contiene la unidad de transcripción que comprende una secuencia de ácido nucleico a expresar operativamente enlazada a un promotor, y una señal de terminación, por lo que el promotor se seleccionará del grupo de promotores eucariotas o virales reconocidos por el ARN eucariota Pol II como PGK y CMV, o del grupo de promotores eucariotas o virales reconocidos por ARN Pol III como el promotor U6, HI, ARNt y Adenovirus VA.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, la unidad de transcripción contiene un promotor, una secuencia de ácido nucleico a expresar y una señal de terminación, por lo que el ácido nucleico a expresar se elige del grupo de ácidos nucleicos que codifican un proteína, un péptido, un ácido nucleico que codifica el ARN no codificante, incluidos los microARN y los ARN de interferencia pequeños (ARNip) y ARNhc.
En otra realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la unidad de transcripción contiene un promotor, una secuencia a expresar y una señal de terminación de la transcripción, por lo que la señal de terminación se deriva de genes eucariotas o virales tales como una señal poli A, señales de terminación para genes transcritos con ARN PolIII, tales como nucleótidos T de estiramiento.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, el primer ácido nucleico comprende un sitio de recombinación específico de sitio para la recombinasa Flp. El sitio Frt utilizado en la primera molécula de ácido nucleico se basa en el sitio Frt de tipo salvaje del plásmido p de S. cerevisiae. En una realización de la invención, el sitio Frt usado no está restringido a formas derivadas del sitio 48 Frt de tipo salvaje (SEQ ID. 8). Puede elegirse de un grupo de otros sitios Frt, incluidos los sitios Frt mutados conocidos en la técnica. (Schlake T. y Bode J. Biochemistry 33: 12746-12751, 199454; documento WO/1999/025854). En una realización preferida, el sitio Frt usado en la primera molécula de ácido nucleico es un sitio de recombinación mínimo de 34 nt de longitud (SEQ. ID 7) que contiene los elementos R2, U y R3 del sitio wt FRT (Cherepanov PP y Wackernagel W. Gene 158: 9-14, 1995).
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la primera molécula de ácido nucleico con una unidad de secuencia bacteriana comprende (i) secuencias bacterianas para la replicación condicional y (ii) una secuencia que proporciona un primer marcador de selección, por lo que las secuencias bacterianas para la replicación contienen un origen de replicación (ori).
En otra realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la primera molécula de ácido nucleico con una unidad de secuencia bacteriana comprende (i) secuencias bacterianas para la replicación condicional y (ii) una secuencia que proporciona un primer marcador de selección, por lo que las secuencias bacterianas para la replicación contienen un origen de replicación para la replicación condicional en cepas de E. coli especiales o en cepas de E. coli normales en condiciones específicas donde la célula bacteriana proporciona todas las funciones necesarias. En una realización preferida, las secuencias bacterianas en la primera molécula de ácido nucleico contienen el ori mínimo del fago gR6K como replicón condicional que se puede mantener solo en presencia de expresión de la proteína pi (Shafferman A et al., J. Mol. Biol. 161: 57-76, 1982).
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la primera molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que proporciona un primer marcador de selección, por lo que el marcador de selección es un ácido nucleico que confiere resistencia a una célula que alberga dicho ácido nucleico contra un agente de selección. En una realización preferida de la invención, el primer marcador de selección codifica un gen, y en una realización más preferida el primer marcador de selección preferiblemente media la resistencia contra un antibiótico que incluye ampicilina, zeocina, gentamicina, cloranfenicol, tetraciclina y kanamicina entre otros conocidos en la técnica. En una realización más preferida de esta invención, el primer marcador de selección media la resistencia contra la kanamicina.
El primer marcador de selección se puede seleccionar de un grupo de genes que median la resistencia a los antibióticos, que incluyen los genes bla, ant(3")-ia, aph(3')-II, aph(3')-II, ble, y cmlA, aadA, aadB, sacB y tetA entre otros genes conocidos en la técnica. En una realización preferida, un gen que codifica una proteína que media la resistencia a la kanamicina es el primer marcador de selección.
En una realización preferida de la invención como se define en las reivindicaciones, la segunda molécula de ácido nucleico contiene la segunda parte de un genoma de adenovirus humano tipo 5 (AV5). En una realización más preferida, la segunda parte del genoma de un virus es el genoma de AV5 eliminado para la ITR izquierda, la región E1 y la región E3 de AV5, y opcionalmente para la señal de encapsidación ^5 , por lo que el primer ácido nucleico complementa este genoma del virus para la ITR izquierda y opcionalmente la señal de encapsidación. Además, las deleciones de la segunda parte del genoma de AV5 no se limitan a E1 y E3, ya que también se pueden eliminar secuencias adicionales de la región E2 o E4, siempre que una línea celular permisiva pueda complementar las secuencias eliminadas en cis o trans.
En otra realización preferida como se define en las reivindicaciones, el segundo ácido nucleico contiene la segunda parte de un genoma de adenovirus humano tipo 19a (AV19a). En una realización más preferida, la segunda parte del genoma de un virus es el genoma de AV19a eliminado para la ITR izquierda, la región E1 y la región E3 de AV19a, y opcionalmente para la señal de encapsidación ^5 , por lo que el primer ácido nucleico complementa este genoma del virus para la ITR izquierda y opcionalmente la señal de encapsidación. Además, las deleciones de la segunda parte del genoma de AV19a no se limitan a E1 y E3, ya que también se pueden eliminar secuencias adicionales de la región E2 y/o E4, siempre que una línea celular permisiva pueda complementar las secuencias suprimidas en cis o trans. Además, el promotor pIX que es necesario para la expresión del gen pIX que codifica una proteína de la cápside menor se conservó en el ácido nucleico pBACSirl9a.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la segunda molécula de ácido nucleico contiene un sitio de recombinación específico de sitio, en el que el sitio de recombinación específico de sitio se selecciona del grupo que comprende el sitio de recombinación para la recombinasa Flp. En una realización preferida de la invención, el sitio Frt usado es el sitio Frt48 de tipo salvaje del plásmido p de S. cerevisiae sin estar restringido a ello. Pueden usarse otros sitios Frt, incluidos los sitios Frt mutados conocidos en la técnica.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, la repetición terminal invertida es la repetición terminal invertida derecha de un genoma de adenovirus, y en una realización más preferida, el genoma de adenovirus se deriva de adenovirus humano tipo 5 o adenovirus humano tipo 19a, y la repetición terminal invertida es la repetición terminal invertida derecha del adenovirus humano tipo 5 o del adenovirus humano tipo 19a.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la segunda molécula de ácido nucleico comprende un segundo sitio de restricción, por lo que el sitio de restricción está ausente en la segunda parte del genoma de un virus. El sitio de restricción se usa para la linealización de los ácidos nucleicos contenidos según los métodos descritos en esta patente. Además, el segundo sitio de restricción está ausente en la primera parte del genoma de un virus proporcionado por la primera molécula de ácido nucleico, y en la parte de la secuencia del primer ácido nucleico que va desde el primer sitio de restricción hasta el sitio de recombinación y que abarca la primera parte del genoma del virus. En una realización más preferida de esta invención, el sitio de restricción se elige entre un grupo de sitios de restricción ausentes en el genoma de un adenovirus. En una realización aún más preferida, el sitio de restricción se selecciona de un grupo de sitios ausentes en el adenovirus humano tipo 5 (AV5) que comprende AbsI, BstBI, PacI, PsrI, SgrDI y SwaI, entre otros sitios de restricción conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo otros tipos de sitios reconocidos por endonucleasas autodirigidas y sitios de unión sintéticos para nucleasas con dedos de zinc.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, el segundo ácido nucleico contiene una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación de una única copia y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección. En una realización preferida, las secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación (ori) contienen todos los elementos necesarios de copia baja, preferiblemente mantenimiento de una sola copia en E. coli. En una realización más preferida, el ori en el segundo ácido nucleico se basa en el factor f-episomal (factor F-) y contiene todos los elementos que son necesarios para la replicación y el mantenimiento en E. coli.
En otra realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la segunda molécula de ácido nucleico comprende los siguientes elementos en una dirección 5' -> 3' tras la linealización de la segunda molécula de ácido nucleico con una enzima de restricción, preferiblemente una enzima de restricción que reconoce y que corta en el segundo sitio de restricción: una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) una secuencia de nucleótidos bacterianas para la replicación de una sola copia, y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección, un sitio de recombinación específico del sitio, una segunda parte de un genoma de un virus y, opcionalmente, un segundo sitio de restricción.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, la segunda molécula de ácido nucleico contiene una secuencia que proporciona un marcador de selección que codifica un gen mediador de resistencia, y más preferiblemente un gen mediador de resistencia que codifica una enzima. El marcador de selección usado en el segundo ácido nucleico es diferente del marcador de selección presente en la primera molécula de ácido nucleico. En una realización preferida, el marcador de selección confiere resistencia contra antibióticos, que incluyen ampicilina, zeocina, gentamicina, cloranfenicol y kanamicina, entre otros conocidos en la técnica. En una realización más preferida, el marcador de selección media la resistencia contra el cloranfenicol.
El marcador de selección en la segunda molécula de ácido nucleico se puede seleccionar de un grupo de genes que median la resistencia a los antibióticos, que incluyen los genes bla, ant(3")-ia, aph(3')-II, aph(3')-II, ble, aadA, aadB, y cmlA entre otros genes conocidos en la técnica. En una realización más preferida, el segundo marcador de selección es un gen que codifica una proteína que media la resistencia al cloranfenicol.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, denominada como "la conformación en espejo", las segundas moléculas de ácido nucleico proporcionan los siguientes elementos en una dirección 5' -> 3': opcionalmente un segundo sitio de restricción, una segunda parte de un o el genoma de un virus, un sitio de recombinación y una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación de una sola copia y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección, por lo que la segunda parte del genoma del virus proporciona una repetición terminal izquierda y, en una realización preferida, la repetición terminal invertida izquierda (ITR) de un genoma de virus. En una realización más preferida, el virus es un adenovirus, y en una realización aún más preferida, el adenovirus es el adenovirus humano tipo 5 o el adenovirus humano tipo 19a.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, las segundas moléculas de ácido nucleico en una "conformación en espejo" proporcionan la segunda parte de un o el genoma del virus que proporciona una señal de empaquetamiento, por lo que en una realización preferida el virus es un adenovirus, y en una realización más preferida, el adenovirus es el adenovirus humano tipo 5 o el adenovirus humano tipo 19a.
En una realización de la presente invención como se define en las reivindicaciones, el segundo ácido nucleico se replica como un vector de copia única en E. coli, por lo que el ori utilizado se basa en un factor F o un replicón PI. En una realización preferida, el segundo ácido nucleico es un cromosoma artificial bacteriano (BAC) sin limitarse a un BAC. Sin embargo, el sistema requiere copias bajas, preferiblemente mantenimiento de una sola copia del segundo ácido nucleico en E. coli para mantener la funcionalidad completa. En una realización más preferida, el vector BAC idéntico o similar a pBACSir1, pBACSir2 o pBAC Sir19a codifica un genoma del vector Ad eliminado de E1 y E3 de primera generación eliminado para la ITR izquierda y la señal de encapsidación, y contiene los genes parS el parA, parB y parC como elementos del origen de la replicación que son necesarios para el mantenimiento de una sola copia.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la combinación es una combinación de una forma circular cerrada de la primera molécula de ácido nucleico y una forma circular cerrada de la segunda molécula de ácido nucleico, por lo que en una realización preferida el primer ácido nucleico usado es un plásmido y el segundo ácido nucleico es un vector BAC.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en la combinación de la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico, ambas moléculas de ácido nucleico están presentes como moléculas separadas. El término "moléculas separadas" significa que cada molécula es disociable en compartimentos físicos distintos. En una realización preferida de la invención como se define en las reivindicaciones, la primera molécula de ácido nucleico es un plásmido y la segunda molécula de ácido nucleico es un BAC.
Como se usa preferiblemente en la presente memoria, el término "genoma completo del virus" describe un ácido nucleico que codifica una secuencia genómica viral que tras la transfección en unas líneas celulares eucariotas da lugar a un virus viable y competente para la replicación. Dicha línea celular se denomina línea celular permisiva. En una realización preferida de la invención, el genoma del virus es un genoma de adenovirus, y en una realización más preferida de la invención, el genoma del virus es el genoma del adenovirus humano tipo 5 o el genoma del adenovirus humano tipo 19a.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en la combinación de una primera molécula de ácido nucleico con la segunda molécula de ácido nucleico, el primer sitio de restricción proporcionado por la primera molécula de ácido nucleico y el segundo sitio de restricción proporcionado por la segunda molécula de ácido nucleico se eligen de un grupo que comprende sitios de restricción que están ausentes en la primera parte y la segunda parte del genoma de un virus, y la unidad de transcripción. En una realización preferida, los sitios de restricción se seleccionan del grupo que no corta en el genoma del adenovirus humano tipo 5: AbsI, BstBI, PacI, PsrI, SgrDI y SwaI. En una realización preferida adicional, el primer y segundo sitio de restricción son idénticos, y en una realización aún más preferida, el primer y segundo sitios de restricción es PacI.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, el genoma del virus completo es un genoma de adenovirus, por lo que el adenovirus es el adenovirus humano tipo 5 o el adenovirus humano tipo 19a. En una realización aún más preferida, el genoma completo del virus es un adenovirus humano tipo 5 o adenovirus humano tipo 19a con eliminación de E1 y E3 de primera generación sin limitarse a este tipo de genoma de adenovirus, ya que las secuencias adicionales de la región E2 pueden ser adicionalmente eliminadas o cambiadas múltiples regiones, o incluso el genoma completo del virus, excepto las ITR izquierda y derecha y la señal de empaquetamiento eliminada en vectores de adenovirus gutless.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en la combinación de una primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico, el primer marcador de selección proporcionado por la primera molécula de ácido nucleico y el segundo marcador de selección proporcionado por la segunda molécula de ácido nucleico, es un gen que codifica preferiblemente una enzima que confiere resistencia contra un antibiótico. El gen puede elegirse de un grupo que confiere resistencia contra la kanamicina, neomicina, puromicina, ampicilina, zeocina, gentamicina y cloranfenicol, entre otros conocidos en la técnica. En una realización preferida, el primer marcador de selección es un gen que confiere resistencia contra la kanamicina, y el marcador de selección es un gen que confiere resistencia contra el cloranfenicol pero no la kanamicina. Se sabe en la técnica que varios genes median la resistencia contra más de un agente de selección, especialmente si el agente de selección es un antibiótico (Tenorio C et al. J. Clin. Microbiol. 39: 824-825, 2001), limitando las posibles combinaciones de marcadores de selección para el primer y segundo ácidos nucleicos.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en la combinación de una primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico, las secuencias bacterianas para la replicación proporcionadas por la primera molécula de ácido nucleico permiten la replicación condicional en Cepas de E. coli especiales o en cepas de E. coli normales en condiciones específicas donde la célula bacteriana proporciona todas las funciones necesarias. Además, la combinación de las secuencias para la replicación del primer y segundo ácidos nucleicos solo permite la replicación del segundo ácido nucleico en una célula huésped. Se sabe en la técnica que la combinación de secuencias para la replicación bacteriana está restringida a la presencia de factores proporcionados por la célula huésped o el propio ácido nucleico (Scott JR. Regulation of plasmid replication. Microbiol. Rev. 48: 1-23, 1984). En una realización preferida, las secuencias bacterianas en la primera molécula de ácido nucleico contienen el ori mínimo del fago gR6K como replicón condicional que se puede mantener solo en presencia de expresión de la proteína pi, y las secuencias para la replicación del segundo ácido nucleico se basan en la Factor F y permiten el mantenimiento de una sola copia en células E. coli.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en la combinación de una primera molécula de ácido nucleico que proporciona la primera parte de un o el genoma de un virus y una segunda molécula de ácido nucleico que proporciona la segunda parte de un o el genoma de un virus, la señal de empaquetamiento puede proporcionarse por la primera o la segunda parte del genoma de un virus. En una realización preferida, el virus es un adenovirus, y en una realización más preferida, el virus es un adenovirus humano y en una realización aún más preferida, el virus es el adenovirus humano tipo 5 (AV5) o el adenovirus humano tipo 19a, y la señal de empaquetamiento se deriva de AV5 o del adenovirus humano tipo 19a (^19a) y proporcionado por la primera molécula de ácido nucleico.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en la combinación de una primera molécula de ácido nucleico con la segunda molécula de ácido nucleico, una primera secuencia repetida terminal es parte de la primera parte del genoma de un o el virus proporcionado por la primera molécula de ácido nucleico y una segunda secuencia repetida terminal es parte de la segunda parte de un genoma de un virus proporcionado por la segunda molécula de ácido nucleico.
En una realización adicional de esta invención como se define en las reivindicaciones, las repeticiones terminales invertidas se derivan de AV5 o adenovirus humano tipo 19a.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en el método para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus, ambos ácidos nucleicos se hacen reaccionar a través de sus sitios de recombinación específicos del sitio formando un producto de recombinación, por lo que se selecciona el producto de recombinación y contiene solo una copia de un genoma de virus completo, y por lo que el producto de recombinación se escinde con la primera y la segunda enzimas de restricción.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en el método para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus, la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico se combinan y se hacen reaccionar a través de sus sitios de recombinación específicos de sitio en una célula huésped procariota. La célula huésped es preferiblemente una célula bacteriana y puede aceptar ácidos nucleicos mediante electroporación o haciéndola químicamente competente según los métodos estándar. En una realización preferida, la célula huésped bacteriana alberga la segunda molécula de ácido nucleico y acepta la primera molécula de ácido nucleico mediante electroporación. En una realización más preferida, la bacteria es E. coli.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, la célula huésped bacteriana se selecciona de un grupo de células E. coli que carecen del factor F y son sensibles al primer y segundo agentes de selección. En una realización preferida, la cepa de E. coli está derivada de K12 y no proporciona o expresa la proteína pi. La proteína pi mantiene la replicación de la primera molécula de ácido nucleico, pero no de la segunda molécula de ácido nucleico. En una realización más preferida, la cepa de E. coli es sensible a la kanamicina y el cloranfenicol, y se selecciona de un grupo que comprende DH5alfa, DH10B, entre otros conocidos en la técnica.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en el método para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus, se combinan una primera molécula de ácido nucleico con un primer marcador de selección y una segunda molécula de ácido nucleico con un segundo marcador de selección y se hacen reaccionar a través de sus sitios de recombinación en presencia de una recombinasa específica de sitio, formando un producto de recombinación en una célula huésped procariota. El método es tal que el producto de reacción se selecciona en la célula huésped confiriendo resistencia contra ambos marcadores de selección. El uso de un origen de replicación condicional en el primer ácido nucleico asegura que el método selecciona exclusivamente los productos que han reaccionado. En una realización preferida, el primer marcador de selección es kanamicina y el segundo marcador de selección es cloranfenicol.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en el método para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus, una primera molécula de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico se combinan y se hacen reaccionar en presencia de una recombinasa específica del sitio que cataliza sin la necesidad de una fuente de energía como ATP la recombinación entre los primeros sitios de recombinación específicos del sitio proporcionados por la primera molécula de ácido nucleico y el segundo sitio de recombinación específico del sitio proporcionado por la segunda molécula de ácido nucleico. En una realización preferida, la recombinasa específica de sitio es Flp, por lo que media la recombinación entre el sitio de recombinación específico de sitio Frt presente en el primer ácido nucleico y el sitio de recombinación específico de sitio Frt presente en el segundo ácido nucleico. Flp cataliza la recombinación específica de sitio entre sitios Frt, por lo que los sitios de recombinación específicos de sitio reconocidos son lo suficientemente grandes como para estar estadísticamente ausentes en el genoma humano y bacteriano. Según la invención, se usa un sitio Frt34 de tipo salvaje mínimo en el primer ácido nucleico y se hace reaccionar con un sitio Frt48 de tipo salvaje presente en el segundo ácido nucleico. Sin embargo, pueden usarse otras recombinasas específicas de sitio conocidas en la técnica, siempre que funcionen con una selectividad y eficacia igualmente altas.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en un método para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus, una primera molécula de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico se combinan y se hacen reaccionar en presencia de una recombinasa de sitio específico, por lo que la recombinasa se inactiva. En general, se reconoce que una presencia prolongada de una recombinasa específica de sitio en E. coli interfiere con la estabilidad del genoma. En el caso de Cre, los sitios loxP crípticos se reconocen en el genoma de los mamíferos causando inestabilidad genética y limitando el uso de E. coli que contiene Cre para recibir vectores BAC y PAC (Semprini S et al. Cryptic IoxP sites in mammalian genomes: genome-wide distribution and relevance for the efficiency of BAC/PAC recombineering techniques. Nucleic Acids Res. 35: 1402-1410, 1997). Preferiblemente, se desea la expresión transitoria de la recombinación específica del sitio cuando las moléculas de ácido nucleico necesitan recombinarse y propagarse adicionalmente en E. coli, e incluso más preferiblemente, la expresión de la recombinasa específica de sitio se elimina por completo después de que se haya producido la recombinación y durante el crecimiento de las bacterias.
En una realización preferida de la invención como se define en las reivindicaciones, en el método para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus, la expresión de Flp se controla mediante un represor sensible a la temperatura del fago lambda. La expresión de Flp se induce cambiando la temperatura del cultivo a 43°C. Este procedimiento permite la eliminación (curado) del plásmido al mismo tiempo. En su lugar, se pueden usar otros sistemas para la expresión condicional y/o inducible de una recombinasa específica de sitio, por ejemplo, sin estar limitado a ello, el uso de un promotor AraC-PBAD inducible por arabinosa para inducir la expresión (Lee EC. et al. Genomics 73: 56-65, 2001).
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, en el método para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus, se usa la expresión condicional para una recombinasa específica de sitio en células bacterianas, por lo que la replicación de un plásmido que alberga una unidad de expresión para la recombinasa específica del sitio Flp está controlada por un origen de replicación sensible a la temperatura. En una realización preferida, la célula huésped E. coli que alberga la segunda molécula de ácido nucleico y un plásmido bacteriano (pCP20) que proporciona una unidad de expresión Flp, puede mantenerse y propagarse a 30°C en presencia de ampicilina. La expresión de Flp se induce cambiando la temperatura del cultivo a 43°C. Este procedimiento permite la eliminación (curado) del pCP20 al mismo tiempo (Cherepanov PP y Wackernagel W, Gene 158: 9-14, 1995).
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en el método para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus, el ácido nucleico que codifica el virus completo puede liberarse mediante digestión de restricción con la primera y la segunda enzimas de restricción. En una realización preferida de esta invención, el sitio de restricción se elige de un grupo de sitios de restricción ausentes en el genoma de un adenovirus, y en una realización aún más preferida, el sitio de restricción se selecciona de un grupo de sitios ausentes en el adenovirus humano tipo 5 (AV5) que comprende Absl, BstBI, PacI, Psrl, SgrDI y SwaI.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en el método para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus, tanto el primer como el segundo ácido nucleico se hacen reaccionar a través de sus sitios de recombinación específicos del sitio formando un producto de recombinación en una forma celular permisiva, por lo que el producto de recombinación no se selecciona, y por lo que contiene solo una copia de un genoma de virus completo, y por lo que la recombinasa específica del sitio se proporciona por la célula permisiva, y por lo que la recombinasa específica del sitio se expresa de forma constitutiva, condicional o inducida. La expresión condicional o inducida de la recombinasa específica de sitio se puede lograr con el sistema de expresión regulado por tetraciclina entre otros sistemas conocidos en la técnica. En una realización preferida de la invención, la célula permisiva expresa la recombinasa específica de sitio de manera estable, por lo que la célula permisiva se selecciona de un grupo que comprende células 293, 911, Per.C6 y CAP. En una realización aún más preferida, la célula permisiva es 293, y la recombinasa Flp específica de sitio se expresa constitutivamente.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en el método para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus, una primera molécula de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico se combinan y se hacen reaccionar en presencia de una recombinasa específica del sitio, por lo cual, según la invención, la molécula de ácido nucleico resultante contiene una copia de un genoma de virus completo, que puede liberarse mediante digestión de restricción con la primera y la segunda enzimas de restricción, y genera un virus viable competente para la replicación cuando se transfecta a una línea celular permisiva, en la que la célula permisiva se selecciona de un grupo que comprende células 293, 911, Per.C6 y CAP. En una realización aún más preferida, la celda permisiva es 293.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en el método para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus, el virus puede usarse como vector de transferencia génica, como vacuna o usarse para aplicaciones terapéuticas.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en el método para la generación de moléculas de ácido nucleico que codifican un virus, el método puede usarse para generar grandes números de virus o una biblioteca de virus que expresan ácidos nucleicos.
La presente descripción está relacionada con un tercer ácido nucleico, por lo que la tercera molécula de ácido nucleico comprende los siguientes elementos: opcionalmente una primera parte de un o el genoma de un o el virus, una secuencia de nucleótidos, preferiblemente una secuencia de nucleótidos genómica o una unidad de transcripción, una secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene actividad reguladora en un procariota, un sitio de recombinación específico de sitio, una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa, una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva y, opcionalmente, un primer sitio de restricción.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, la tercera molécula de ácido nucleico comprende los siguientes elementos en una orientación 5' a 3' preferiblemente tras la escisión con la primera enzima de restricción: opcionalmente la primera parte de un o el genoma de un o el virus, la secuencia de nucleótidos, preferiblemente una secuencia de nucleótidos genómica, o una unidad de transcripción, la secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene actividad reguladora en un procariota, un sitio de recombinación específico del sitio, una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa, un unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianos para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la primera parte de un o el genoma de un o el adenovirus proporcionado por el tercer ácido nucleico comprende exactamente una repetición terminal intercalada de un adenovirus. Además, la primera parte de un o el genoma de un o el virus debe estar presente para que sea un genoma de virus completo capaz de replicarse en una línea celular permisiva. En una realización más preferida de la invención, la primera parte de un o el genoma de un o el virus se deriva de un genoma de adenovirus humano tipo 5 (AV5), que comprende la totalidad o partes del extremo izquierdo del genoma de AV5 corriente arriba de la caja TATA de la unidad de transcripción E1 (nt1 a nt 342) (SEQ.ID. No. 10). En una realización adicional de esta invención, la tercera molécula de ácido nucleico proporciona una primera parte de un o el genoma de un o el virus que comprende una señal de empaquetamiento como parte del genoma viral. En una realización más preferida, la señal de empaquetamiento se deriva de un genoma de adenovirus, y en una realización aún más preferida, la primera parte del genoma de adenovirus contiene la señal de empaquetamiento ^ 5 derivada del extremo izquierdo del adenovirus humano tipo 5 (AV5).
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la primera parte de un o el genoma de un o el virus proporcionado por la tercera molécula de ácido nucleico contiene una repetición terminal invertida derivada del extremo izquierdo del adenovirus humano tipo 5 (AV5).
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, el tercer ácido nucleico comprende un primer sitio de restricción, por lo que el primer sitio de restricción está ausente en la primera parte de un o el genoma de un o el virus y en la unidad de transcripción presente en el tercer ácido nucleico. En una realización preferida de esta invención, el sitio de restricción se elige de un grupo de sitios de restricción ausentes en el genoma de un adenovirus, y en una realización más preferida, el sitio de restricción se selecciona de un grupo de sitios ausentes en el adenovirus humano tipo 5 (AV5) que comprenden AbsI, BstBI, PacI, PsrI, SgrDI y SwaI.
En una realización adicional como se define en las reivindicaciones, la tercera molécula de ácido nucleico proporciona en una confirmación en espejo, preferiblemente tras la escisión con la primera enzima de restricción en orientación 5' -> 3': una secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene actividad en un procariota, un sitio de recombinación específico del sitio, una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa, una secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva, un primer sitio de restricción, un primera parte de un o el genoma de un o el virus, y una unidad de transcripción, por lo que la primera parte de un o el genoma de un o el virus comprende una repetición terminal. En una realización preferida, la primera parte de un o el genoma de un o el virus proporcionado por el tercer ácido nucleico en la confirmación en espejo comprende una repetición terminal invertida. En una realización más preferida, la repetición terminal invertida es una repetición terminal derecha de un genoma de virus, e incluso más preferiblemente la repetición terminal derecha de un adenovirus, por lo que en una realización más preferida la repetición terminal derecha de un adenovirus es la ITR derecha del adenovirus humano tipo 5 que abarca los últimos 18-103 nucleótidos de AV5.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la tercera molécula de ácido nucleico comprende una unidad de transcripción génica, por lo que la unidad de transcripción contiene un promotor, una secuencia de ácido nucleico a expresar y una señal de terminación. El promotor se selecciona del grupo de promotores eucarióticos o virales reconocidos por ARN Pol II eucariótico como PGK y CMV, o del grupo de promotores eucarióticos o virales reconocidos por ARN Pol III como U6, HI, ARNt y promotor de adenovirus VA. El ácido nucleico a expresar se elige del grupo de ácidos nucleicos que codifican una proteína, un péptido, un ácido nucleico que codifica ARN no codificante, incluidos los microARN y los ARN de interferencia pequeños (ARNip) y ARNhc. La señal de terminación se deriva de genes eucariotas o virales como una señal poli A, señales de terminación para genes transcritos con PolIII, como nucleótidos T estirados.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, el tercer ácido nucleico comprende un sitio de recombinación específico de sitio reconocido por la recombinasa Flp. El sitio Frt usado en la tercera molécula de ácido nucleico se basa en el sitio Frt de tipo salvaje del plásmido g de S. cerevisiae. En una realización adicional de la invención, el sitio Frt usado no está restringido a formas derivadas del sitio 48 Frt de tipo salvaje. Puede elegirse de un grupo de otros sitios Frt, incluidos los sitios Frt mutados conocidos en la técnica. En una realización preferida de la invención, el sitio Frt usado en la tercera molécula de ácido nucleico es un sitio de recombinación mínimo de 34 nt de longitud (sitio Frt34, SEQ.ID.7) que contiene los elementos R2, U y R3 del sitio wt FRT48 (SEQ.ID.NO. 8).
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la tercera molécula de ácido nucleico con una unidad de secuencia bacteriana comprende (i) secuencias bacterianas para la replicación condicional y (ii) una secuencia que proporciona un marcador de selección positiva, por lo que las secuencias bacterianas para la replicación condicional contienen un origen de replicación (ori) para la replicación en cepas de E. coli especiales o en cepas de E. coli normales en condiciones específicas donde la célula bacteriana proporciona todas las funciones necesarias. La replicación de los vectores plasmídicos en bacterias gram negativas está controlada por las enzimas del huésped y los determinantes que se proporcionan por el plásmido. La replicación de plásmidos solo ocurre si todos los factores necesarios para la replicación están presentes en cis o en trans en el huésped bacteriano (Kües U y Stahl U. Microbial reviews 53: 491-516). En una realización preferida, las secuencias bacterianas en la tercera molécula de ácido nucleico contienen el ori mínimo del fago gR6K como replicón condicional que puede mantenerse sólo en presencia de expresión de la proteína pi.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la tercera molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que proporciona un marcador de selección positiva, por lo que el marcador de selección es un ácido nucleico que codifica una enzima, y la enzima media la resistencia contra un agente de selección, por lo cual el marcador de selección positiva puede seleccionarse de un grupo de genes que median la resistencia contra antibióticos, incluyendo los genes bla, ant(3")-ia, aph(3')-II, aph(3’)-II, ble, y cmlA, entre otros genes conocidos en la técnica. En una realización preferida, se usa un gen que codifica una proteína que media la resistencia a la kanamicina como marcador de selección positiva.
La tercera molécula de ácido nucleico sujeta a la presente invención, como se define en las reivindicaciones, proporciona un marcador de selección negativa, por lo que el marcador de selección es un ácido nucleico que codifica una enzima que media la sensibilidad a un agente y condiciones de selección, por lo que la expresión del marcador de selección negativa en una célula huésped procariota está controlada por una secuencia de nucleótidos que tiene actividad reguladora en un procariota. En una realización preferida, la secuencia reguladora de nucleótidos es un promotor, por lo que el promotor se selecciona preferentemente del grupo de promotores procarióticos. En una realización aún más preferida, el promotor es promotor de galactoquinasa de E. coli.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, la secuencia reguladora de nucleótidos se puede elegir del grupo de promotores procarióticos inducibles, por lo que la actividad del promotor se puede regular por diversos medios, incluida la desrepresión de operones, la inducción de genes por iones y moléculas, regulación de la actividad promotora por temperatura, entre otros métodos y sistemas conocidos en la técnica.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, el marcador de selección negativa proporcionado por la tercera molécula de ácido nucleico se elige de una clase de genes que codifican una enzima, por lo que la enzima confiere sensibilidad a un agente o condición de selección que incluye: sensibilidad a estreptomicina, compuestos lipofílicos (ácido fusárico y quinárico), sacarosa, p-clorofenilalanina, trimetoprima, t-o-nitrofenil-p-D-galactopiranósido entre otros conocidos en la técnica. En una realización preferida de esta invención, la enzima codificada por el marcador de selección negativa media la sensibilidad a la estreptomicina. Por consiguiente, el ácido nucleico que codifica el marcador de selección negativa se puede seleccionar de un grupo de genes que incluyen galK, tetAR, pheS, thyA, lacy, ccdB y rpsL entre otros genes conocidos en la técnica. En una realización preferida el gen rpsL que codifica una proteína que media predominantemente la sensibilidad a la estreptomicina se utiliza como marcador de selección negativa (Reyrat JM et al., Gene 15: 99-102, 1981).
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, en la combinación de la tercera y la segunda moléculas de ácido nucleico, ambos ácidos nucleicos están presentes como moléculas circulares cerradas. En una realización preferida, la tercera molécula de ácido nucleico utilizada es un plásmido y el segundo ácido nucleico es un vector BAC.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, en la combinación de la tercera y la segunda moléculas de ácido nucleico, ambas moléculas de ácido nucleico están presentes como moléculas separadas. El término "moléculas separadas" significa que cada molécula es disociable en compartimentos físicos distintos. En una realización preferida de esta invención, la tercera molécula de ácido nucleico es un plásmido y la segunda molécula de ácido nucleico es un BAC.
En una realización preferida definida en las reivindicaciones, el ácido nucleico proporcionado por la tercera molécula de ácido nucleico proporciona una primera parte del genoma de un virus, y una segunda molécula de ácido nucleico proporciona una segunda parte del genoma de un virus. El ácido nucleico resultante después de la combinación de la tercera con la segunda molécula de ácido nucleico contiene una copia de un genoma de virus completo. En una realización preferida de la invención, el genoma del virus es un genoma de adenovirus, y en una realización más preferida de la invención, el genoma del virus es el genoma de adenovirus humano tipo 5.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, en la combinación de la tercera molécula de ácido nucleico y el segundo ácido nucleico, el ácido nucleico proporcionado por la tercera molécula de ácido nucleico es la primera parte de un o el genoma de un o el virus y contiene una unidad de transducción de genes, y se combina con una segunda molécula de ácido nucleico que proporciona una segunda parte de un o el genoma del virus. La molécula de ácido nucleico resultante contiene una copia del genoma del virus completo que contiene exactamente una unidad de transducción de genes. En una realización preferida de la invención, el genoma del virus es un genoma de adenovirus, y en una realización más preferida de la invención, el genoma del virus es el genoma de adenovirus humano tipo 5.
Según la invención como se define en las reivindicaciones, el genoma del virus completo resultante puede liberarse mediante digestión de restricción con la primera y la segunda enzimas de restricción. En una realización preferida de la invención, el primer y segundo sitios de restricción son idénticos en ambas moléculas de ácido nucleico, y en una realización más preferida de la invención se utiliza el sitio de restricción reconocido por la enzima PacSe.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la tercera molécula de ácido nucleico que proporciona la primera parte de un o el genoma de un virus con un primer sitio de restricción y una unidad de transcripción se combina con la segunda molécula de ácido nucleico que proporciona la segunda parte de un o el genoma de un virus con un segundo sitio de restricción, por lo que los sitios de restricción se eligen de un grupo que comprende sitios de restricción que están ausentes en la primera parte y la segunda parte de un o el genoma de un o el virus, y el unidad de transcripción. En una realización preferida, los sitios de restricción se seleccionan del grupo que no corta en el genoma del adenovirus humano de tipo 5: Absl, BstBI, Pac\, Psrl, SgrDIy Swal. En una realización aún más preferida de la invención, el primer y segundo sitio de restricción es Pacl.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en la combinación de una tercera molécula de ácido nucleico que proporciona la primera parte de un o el genoma de un virus y una segunda molécula de ácido nucleico que proporciona una segunda parte de un o el genoma de un adenovirus, ambos ácidos nucleicos pueden recombinarse a través de sus sitios Frt para formar una molécula que contiene una copia de un genoma de virus complementado completo. El genoma del virus complementado completo resultante se puede liberar mediante digestión de restricción con la primera y la segunda enzimas de restricción, en consecuencia, y es viable y competente para la replicación si se transfecta en una línea celular permisiva. En una realización preferida de la invención, el virus es un adenovirus y, en una realización más preferida, el adenovirus es el adenovirus humano tipo 5 (AV5). En una realización aún más preferida, el genoma del virus completo resultante es un AV5 con deleción de E1 y E3 de primera generación, por lo que la composición del genoma del adenovirus no se limita a los genomas con deleción E1 y E3, ya que las secuencias adicionales de la región E2 y E4 pueden adicionalmente se pueden eliminar o cambiarse múltiples regiones, o incluso el genoma completo del virus excepto por la \TR izquierda y derecha y la señal de empaquetamiento eliminadas en vectores de adenovirus gutless. La línea celular utilizada para la reconstitución y propagación del virus, también denominada "línea celular permisiva", es capaz de complementar todas las regiones eliminadas o cambiadas en cis o trans. En el caso del genoma del virus AV5 de primera generación, se puede utilizar una línea celular complementaria para E1, como 293, 911, Per.C6, N52.E6 entre otras conocidas en la técnica. También se pueden usar otras líneas celulares que proporcionan componentes adicionales del genoma viral en trans si es necesario. Además, la expresión transitoria o condicional de dichos componentes eliminados también se puede usar para permitir la reconstitución y replicación del virus.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la tercera molécula de ácido nucleico proporciona un marcador de selección positiva y un marcador de selección negativa. La segunda molécula de ácido nucleico proporciona un segundo marcador de selección. Tras la combinación de la tercera con la segunda molécula de ácido nucleico, la molécula de ácido nucleico resultante comprende el marcador de selección positiva y negativa del tercer ácido nucleico y el segundo marcador de selección forma la segunda molécula de ácido nucleico. En una realización preferida de la invención, el marcador de selección positiva del tercer ácido nucleico confiere resistencia contra kanamicina y el marcador de selección negativa confiere sensibilidad a la estreptomicina, y el marcador de selección proporcionado por la segunda molécula de ácido nucleico confiere resistencia contra cloranfenicol.
Según la invención como se define en las reivindicaciones, una tercera molécula de ácido nucleico se combina con una segunda molécula de ácido nucleico, por lo que el segundo marcador de selección proporcionado por la segunda molécula de ácido nucleico es un gen mediador de resistencia que codifica una enzima que confiere resistencia contra un agente de selección distinto del agente de selección positiva y del agente de selección negativa proporcionados por la tercera molécula de ácido nucleico. En una realización preferida de la invención, el marcador de selección positiva es un gen que confiere resistencia contra la kanamicina, y el marcador de selección negativa es un gen que confiere sensibilidad a la estreptomicina, y el segundo marcador de resistencia proporcionado por el segundo ácido nucleico confiere resistencia contra el cloranfenicol pero no la kanamicina o estreptomicina. Se sabe en la técnica que varios genes median la resistencia a más de un agente de selección, especialmente si el agente de selección es un antibiótico (Tenorio C et al. J. Clin. Microbiol. 39: 824-825, 2001), limitando las posibles combinaciones de marcadores de selección en el tercer y segundo ácidos nucleicos.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, en la combinación de un tercer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, la tercera molécula de ácido nucleico proporciona un marcador de selección positiva y un marcador de selección negativa, por lo que la actividad del marcador de selección negativa está controlada por una secuencia de ácido nucleico proporcionada por el tercer ácido nucleico, que tiene actividad reguladora en un procariota. En una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico que controla la actividad del marcador de selección negativa es un promotor y, en una realización más preferida, un promotor procariótico. En una realización aún más preferida, el promotor es el promotor de galactoquinasa de E. coli.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en la combinación la tercera molécula de ácido nucleico comprende unas secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional, y la segunda molécula de ácido nucleico comprende unas secuencias de nucleótidos bacterianas adicionales para la replicación de una sola copia. Por lo tanto, las secuencias bacterianas para la replicación de la tercera molécula de ácido nucleico permiten la replicación condicional en cepas de E. coli especiales o en cepas de E. coli normales en condiciones específicas, por lo que la célula bacteriana proporciona todas las funciones necesarias.
En una realización preferida, la unidad de secuencia de nucleótidos bacterianas en la tercera molécula de ácido nucleico contiene el ori mínimo del fago gR6K como replicón condicional, que se puede mantener solo en presencia de expresión de la proteína pi, y las secuencias para la replicación del segundo ácido nucleico se basan en el factor F y permiten el mantenimiento de una sola copia en células de E. coli (Scott JR. Regulation of plasmid replication. Microbiol. Rev. 48: 1-23, 1984).
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la combinación de la tercera molécula de ácido nucleico proporciona la primera parte de un o el genoma de un virus y la segunda molécula de ácido nucleico proporciona la segunda parte de un o el genoma de un virus, por lo que la señal de empaquetamiento puede proporcionarse por la primera o la segunda parte de un o el genoma de un virus. En una realización preferida, el virus es AV5 y la señal de empaquetamiento es la señal de empaquetamiento de AV5 y la proporciona la tercera molécula de ácido nucleico.
Según la invención como se define en las reivindicaciones, la combinación de la tercera molécula de ácido nucleico proporciona la primera parte de un o el genoma de un virus y la segunda molécula de ácido nucleico proporciona la segunda parte de un o el genoma de un virus, por lo que la tercera molécula de ácido nucleico proporciona exactamente una secuencia repetida terminal invertida y la segunda molécula de ácido nucleico proporciona exactamente una secuencia repetida terminal invertida. Se describe que un ácido nucleico puede proporcionar todas las secuencias terminales, sin embargo, en este caso, el ácido nucleico resultante contendrá entonces un genoma viral completo que contiene la unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana de una de las moléculas de ácido nucleico. En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la repetición terminal invertida (ITR) se deriva de un adenovirus, por lo que la tercera molécula de ácido nucleico proporciona la ITR izquierda y la segunda molécula de ácido nucleico proporciona la ITR derecha. En una realización más preferida, la ITR es la ITR del adenovirus humano tipo 5.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la tercera y segunda moléculas de ácido nucleico se pueden combinar y hacer reaccionar en una célula huésped a través de sus sitios de recombinación Frt mediante la acción de una recombinasa específica de sitio. La molécula de ácido nucleico resultante contiene exactamente una copia de un genoma de virus completo complementado, que se puede liberar mediante digestión de restricción con la primera y la segunda enzimas de restricción, por lo que el sitio de restricción está ausente en la unidad de transcripción proporcionada por el tercer ácido nucleico, la primera parte de un o el genoma de un virus, y la segunda parte de un o el genoma de un virus. En una realización más preferida de esta invención, el sitio de restricción se elige de un grupo de sitios de restricción ausentes en el genoma de un adenovirus, y en una realización aún más preferida, el sitio de restricción se selecciona de un grupo de sitios ausentes en el adenovirus humano tipo 5 (AV5) que comprende Absl, BstBI, PacI, Psr\, SgrDI y SwaI.
En una realización preferida de la invención como se define en las reivindicaciones, en la combinación de una tercera molécula de ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, el virus es un adenovirus humano tipo 5.
Según el método proporcionado en esta invención como se define en las reivindicaciones, el producto de recombinación de una primera molécula de ácido nucleico con una segunda molécula de ácido nucleico es una cuarta molécula de ácido nucleico, preferiblemente circular, que comprende preferiblemente los siguientes elementos: una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias bacterianas para la replicación de una sola copia, y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección, el sitio de recombinación específico del sitio, la segunda parte de un genoma de un virus, opcionalmente un segundo sitio de restricción, un sitio de recombinación específico del sitio, una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional, y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona el primer marcador de selección, la primera parte de un genoma de un virus, preferiblemente una unidad de transcripción, y el primer sitio de restricción.
Se describe un método para la generación de una cuarta molécula de ácido nucleico que codifica un genoma de virus, por lo que se proporcionan una primera molécula de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico y se combinan y se dejan reaccionar para que se produzca una recombinación específica del sitio y se forma un producto de recombinación específico del sitio. Preferiblemente, la recombinación específica del sitio ocurre en una célula huésped, por lo que más preferiblemente la célula huésped es E. coli. El producto de recombinación puede seleccionarse opcionalmente y contiene una copia, preferiblemente una copia única de un o el genoma de un o el virus, por lo que el genoma de un o el virus es un genoma de virus complementado y completo, y tras la escisión opcional con la primera y la segunda enzimas de restricción, el ácido nucleico resultante se puede transfectar a una línea celular permisiva y se puede generar y propagar un o el virus en esta línea celular permisiva. En una realización más preferida, el virus es un adenovirus, y en una realización aún más preferida, el virus es el adenovirus humano tipo 5.
En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, en un método para la generación de una molécula de ácido nucleico que codifica un virus, se combinan una primera molécula de ácido nucleico y un segundo ácido nucleico y se dejan reaccionar en una célula huésped de manera que se produce una recombinación específica del sitio y se forma un producto de recombinación específico del sitio. La célula huésped permite la selección del producto de reacción, por lo que el genoma de la célula huésped es deficiente para partes de o el factor F que permite la replicación de copia única del segundo ácido nucleico, y por lo que la célula huésped es deficiente para la expresión de factores que permiten la replicación condicional del primer ácido nucleico. Esto permite la selección contra cualquier primera molécula de ácido nucleico que no haya reaccionado en la célula huésped. En una realización preferida, la célula huésped es una célula huésped procariota, y más preferiblemente E. coli. En una realización aún más preferida la célula huésped se selecciona de un grupo que comprende células huésped de E. coli derivadas de K12 que incluyen DH10B entre otras conocidas en la técnica.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, en un método para la generación de una molécula de ácido nucleico que codifica un virus, se proporcionan una primera molécula de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico. La primera y la segunda moléculas de ácido nucleico se combinan y se dejan reaccionar en una célula huésped para que se produzca la recombinación específica del sitio y se forme un producto de recombinación específico del sitio, por lo que el producto de reacción no necesita seleccionarse y contiene un genoma completo complementado de un o el virus. Según el método proporcionado, la célula huésped es una célula huésped eucariota, y la primera y segunda moléculas de ácido nucleico preferiblemente son moléculas de ácido nucleico lineales, preferiblemente tras la escisión con la primera y segunda enzimas de restricción, y por lo que la célula huésped eucariota es preferiblemente una célula huésped permisiva, e incluso más preferiblemente la célula huésped se selecciona de un grupo que permite la replicación del adenovirus humano tipo 5 que comprende células 293, 911, Per.C6, CAP, entre otras conocidas en la técnica. Si el adenovirus es diferente del adenovirus humano tipo 5, una célula huésped permisiva se define como la que permitirá la replicación de este virus. Se sabe en la técnica que las moléculas de ácido nucleico lineales que contienen un genoma de adenovirus completo son replicables en una célula huésped permisiva. La eficiencia de la replicación del virus es óptima si los extremos del genoma del adenovirus terminan exactamente con las ITR del adenovirus, e incluso es más eficiente si la proteína terminal está unida al extremo izquierdo del genoma del adenovirus, sin embargo, esto no es un requisito previo para la replicación de adenovirus en una célula permisiva, ya que las moléculas de ácido nucleico que contienen un genoma de adenovirus completo con secuencias que extienden las ITR también se replicarán.
Se describe un método para la generación de una quinta molécula de ácido nucleico que codifica un virus, por lo que una tercera molécula de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico se combinan y se dejan reaccionar para que se produzca la recombinación específica del sitio y se forma un producto de recombinación específico del sitio, y por lo que se genera un producto de reacción en el que el número de eventos de recombinación se limita a uno. Preferiblemente, la recombinación específica del sitio ocurre en una célula huésped, por lo que más preferiblemente la célula huésped es E. coli, y por lo que la selección del producto de recombinación se realiza seleccionando la(s) célula(s) huésped que alberga(n) el producto de recombinación que proporciona el marcador de selección positiva de la tercera molécula de ácido nucleico, el marcador de selección negativa de la tercera molécula de ácido nucleico y el segundo marcador de selección de la segunda molécula de ácido nucleico, y por lo que la célula huésped no es sensible al marcador de selección negativa. Según este método, se usa una célula huésped que no es sensible al agente de selección negativa, por lo que preferiblemente el agente de selección negativa es estreptomicina. En una realización preferida, la célula huésped es E. coli, expresa una forma mutante del gen rpsL que confiere resistencia a la estreptomicina. Por tanto, las células huésped pueden seleccionarse de un grupo de células E. coli que expresan la forma mutante del gen rpsL, y preferiblemente las células huésped se seleccionan del grupo que comprende DH10B entre otros conocidos en la técnica. En una realización preferida, los agentes de selección usados para seleccionar las células huésped que albergan el producto de reacción son kanamicina para el marcador de selección positiva, cloranfenicol para el segundo agente de selección y estreptomicina como agente de selección negativa. El marcador de selección negativa codifica la forma salvaje de rpsL, por lo que la resistencia a la estreptomicina conferida por las células huésped que expresan el rpsL mutante es recesiva si los alelos de tipo salvaje y mutante de rpsL se expresan en la misma cepa de la célula huésped, lo que resulta en sensibilidad a la estreptomicina (Reyrat JM et al. Infect. Immun. 1998, 66: 4011-4017; Lederberg J. Streptomycin resistance: a genetically recessive mutation. J. Bacteriol. 1951,61: 549-550).
Según este método, la tercera molécula de ácido nucleico que proporciona un sitio de recombinación específico del sitio se combina con una segunda molécula de ácido nucleico que proporciona un sitio de recombinación específico del sitio, y se dejan reaccionar ambas moléculas de ácido nucleico mediante recombinación específica del sitio en la célula huésped, por lo que la recombinasa específica de sitio se proporciona por la célula huésped procariota. Por tanto, la recombinasa específica de sitio se proporciona preferiblemente por la célula huésped, como parte del genoma de una célula huésped o como elemento extracromosómico. En una realización preferida, la célula huésped proporciona la recombinasa específica de sitio como un plásmido extracromosómico, por lo que en una realización más preferida la recombinasa específica del sitio es Flp y el plásmido es pCP20. Según este método, la expresión de una recombinasa específica del sitio se controla durante la reacción, por lo que el control de la expresión se puede lograr de varias maneras, incluido el uso de un sistema de expresión inducible como el promotor AraC-PBAD inducible por arabinosa para inducir la expresión (Lee EC. et al. Genomics 73: 56-65, 2001) sin limitarse a esto. En una realización preferida, la expresión de la recombinasa específica del sitio y la replicación de este plásmido está controlada por la temperatura, por lo que en una realización aún más preferida, la expresión de Flp está controlada por un represor sensible a la temperatura del fago lambda, y la replicación del plásmido controlada por un origen de replicación sensible a la temperatura, y por el que se usa el plásmido pCP20 de expresión de FLP sensible a la temperatura (Cherepanov PP y Wackernagel W. Gene 158: 9-14, 1995; Bubeck A, et al., J. Virol. 78: 8026-8035, 2004).
Según este método, el producto de reacción seleccionado resultante de una combinación de una tercera molécula de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico y la posterior reacción de recombinación específica del sitio en una célula huésped comprende un genoma completo del virus, por lo que la molécula de ácido nucleico seleccionada alberga un primer sitio de restricción, y un segundo sitio de restricción, que están preferiblemente ausentes en un genoma de adenovirus, y más preferiblemente que se seleccionan de un grupo de sitios de restricción que comprenden Absl, BstB\, Pac\, Psrl, SgrDI y Swa\, que están ausentes en el genoma de un adenovirus humano tipo 5. Según este método, la tercera y la segunda moléculas de ácido nucleico se pueden introducir por separado en la célula huésped procariota, por lo que en una realización preferida la célula huésped alberga el segundo ácido nucleico y se hace competente para la transformación con una tercera molécula de ácido nucleico utilizando técnicas de vanguardia. Según el método proporcionado, el producto de recombinación seleccionado comprende un genoma del virus complementado completo, que puede liberarse del producto de reacción tras la digestión de restricción, preferiblemente tras la digestión de restricción con una o más enzimas de restricción que se unen y escinden el ácido nucleico en el primer y segundo sitio de restricción, respectivamente. Este método comprende una etapa de transfección adicional, por la que el genoma del virus liberado se introduce en una célula huésped eucariota permisiva usando métodos estándar, preferiblemente usando el reactivo de transfección polietilenimina (PE\) o el método de transfección con fosfato de calcio, entre otros métodos conocidos en la técnica. La transfección del genoma del virus complementado completo en la célula huésped eucariota permisiva produce un vector de adenovirus competente para la replicación, por lo que el vector se usa para transferencia génica, vacuna o cualquier aplicación terapéutica.
La invención como se define en las reivindicaciones, está relacionada con un método para la generación de una biblioteca de moléculas de ácido nucleico que codifican un genoma de virus, por lo que se proporciona una pluralidad de terceras moléculas de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico, por lo que la pluralidad de terceras moléculas de ácido nucleico y una pluralidad de segundas moléculas de ácido nucleico se combinan y se dejan reaccionar para que se produzca la recombinación específica del sitio y se forme una pluralidad de moléculas de ácido nucleico, por lo que la pluralidad en su totalidad forma una biblioteca, y por lo que la biblioteca consiste en una pluralidad de quintas moléculas de ácido nucleico, que comprenden los siguientes elementos de la segunda molécula de ácido nucleico: la unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación de una sola copia, y (ii) una unidad de secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección, el sitio de recombinación específico del sitio, la segunda parte de un genoma de un virus y el sitio de restricción al que se hace referencia como segundo sitio de restricción, y los siguientes elementos de una tercera molécula de ácido nucleico que comprenden opcionalmente la primera parte de un genoma de un virus la secuencia de nucleótidos, preferiblemente una secuencia de nucleótidos genómica, o una unidad de transcripción, la secuencia reguladora del ácido nucleico que tiene actividad reguladora en un procariota, el sitio de recombinación específico del sitio, la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa, la unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva, y el primer sitio de restricción.
La invención definida en las reivindicaciones está relacionada con un método para la generación de una pluralidad de o una biblioteca de quintas moléculas de ácido nucleico, codificando cada una un genoma de virus complementado completo, por lo que una pluralidad de terceras moléculas de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico se combinan y se hacen reaccionar según el método proporcionado en una célula huésped procariota, y por lo que la célula huésped es preferiblemente una célula bacteriana y puede aceptar ácidos nucleicos mediante electroporación o haciéndola químicamente competente según métodos estándar. En una realización preferida, la célula huésped bacteriana alberga la segunda molécula de ácido nucleico y acepta una tercera molécula de ácido nucleico mediante electroporación. En una realización más preferida, la bacteria es E. coli.
Según el método para la generación de una biblioteca de secuencias de nucleótidos como se define en las reivindicaciones, la biblioteca de moléculas de ácido nucleico no necesita ser rastreada para múltiples productos recombinados. El método es tal que la célula huésped que alberga el producto de recombinación confiere resistencia al segundo marcador de selección y al marcador de selección positiva, y no es sensible al agente de selección negativa sin expresión del marcador de selección negativa. Además, según el método proporcionado, la replicación condicional de la tercera molécula de ácido nucleico asegura que las células huésped solo replicarán el producto de reacción evitando cualquier molécula de ácido nucleico contaminante no deseada. En una realización preferida, el marcador de selección positiva confiere resistencia a la kanamicina, el marcador de selección negativa confiere sensibilidad a la estreptomicina y el segundo marcador de selección proporcionado por el segundo ácido nucleico confiere resistencia al cloranfenicol.
En el método para la generación de una biblioteca de secuencias de nucleótidos según la invención como se define en las reivindicaciones, se proporciona una pluralidad de secuencias de nucleótidos individuales, por lo que la biblioteca está representada por una pluralidad de genomas de virus, conteniendo cada uno una sola de las secuencias de nucleótidos individuales, por lo que la secuencia de nucleótidos es parte de una unidad de transcripción. En una realización preferida de la invención, la secuencia nucleica es un ácido nucleico a expresar y la secuencia de nucleótidos está presente en el genoma completo del virus como una única copia. En una realización más preferida, el virus es un adenovirus y el método proporciona un medio para construir una pluralidad de adenovirus individuales. En una realización aún más preferida, el adenovirus es el adenovirus humano tipo 5. La biblioteca de virus de adenovirus resultante puede usarse para la identificación de funciones génicas, en aplicaciones de cribado, para la construcción de una biblioteca de expresión o genómica y para transferencia génica.
Según el método de la invención como se define en las reivindicaciones, se proporciona una pluralidad de genomas de adenovirus complementados completos, conteniendo cada uno una secuencia de nucleótidos, por lo que cada genoma de adenovirus complementado completo puede liberarse por digestión de restricción con la primera y segunda enzimas de restricción, generando una adenovirus competente para la replicación tras la transfección en una célula huésped permisiva. La línea celular permisiva usada para la reconstitución y propagación del adenovirus es capaz de complementar todas las regiones eliminadas en cis o trans. En el caso del genoma del virus AV5 de primera generación, puede usarse la línea celular permisiva que complementa la función E1, por lo que la línea celular puede elegirse de un grupo que comprende 293, 911, Per.C6, CAP, entre otros conocidos en la técnica. También se pueden usar otras líneas celulares que proporcionen componentes adicionales del genoma viral en trans, si es necesario. Además, la expresión transitoria de dichos componentes eliminados también puede usarse para permitir la reconstitución y replicación del virus.
La invención como se define en las reivindicaciones está relacionada con un kit que comprende opcionalmente un prospecto y, en (a) contenedor(es) adecuado(s), al menos una primera molécula de ácido nucleico, una segunda molécula de ácido nucleico, opcionalmente una línea celular permisiva que proporciona la recombinasa específica del sitio, una combinación de la primera molécula de ácido nucleico y el segundo ácido nucleico, una tercera molécula de ácido nucleico, una combinación de la tercera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico, una cuarta molécula de ácido nucleico, un quinto ácido nucleico ácido, una pluralidad de una cuarta molécula de ácido nucleico, una pluralidad de una quinta molécula de ácido nucleico o una pluralidad de adenovirus individuales.
En una realización adicional de la invención como se define en las reivindicaciones, el kit comprende una primera molécula de ácido nucleico, partes de o un segundo ácido nucleico, preferiblemente una forma lineal del segundo ácido nucleico, y una línea celular permisiva que proporciona la recombinasa específica del sitio. En una realización preferida, la parte del segundo ácido nucleico comprende al menos el sitio de recombinación específico del sitio y la segunda parte de un genoma de un virus. Según el método proporcionado en esta invención, se puede construir un ácido nucleico o biblioteca de dicho ácido nucleico que comprenda una secuencia de nucleótidos o biblioteca de secuencias de nucleótidos, cada una en un genoma de virus completo complementado, por lo que las moléculas de ácido nucleico están listas para usarse y pueden introducirse directamente en dicha línea celular permisiva para generar un adenovirus, o una pluralidad de adenovirus individuales, por lo que en una realización preferida la línea celular es 293 y la recombinasa es la recombinasa Flp de tipo salvaje, y el adenovirus el adenovirus humano tipo 5.
En relación con la presente invención, se prefiere que si una parte de un genoma de un virus está sujeta a recombinación o va a estar sujeta a recombinación con un o una parte diferente de un genoma de un virus como en el caso de la recombinación entre la primera molécula de ácido nucleico de la presente invención con la segunda molécula de ácido nucleico de la presente invención o entre la segunda molécula de ácido nucleico de la presente invención con la tercera molécula de ácido nucleico de la presente invención, los virus son de la misma especie y preferiblemente del mismo serotipo. Más específicamente, si la primera molécula de ácido nucleico de la presente invención contiene una parte de un genoma de un adenovirus tipo 19a y está sujeta a recombinación o va a estar sujeta a recombinación con una segunda molécula de ácido nucleico de la presente invención, dicha segunda molécula de ácido nucleico de la presente invención también contiene una parte de un adenovirus tipo 19a. Además, si la primera molécula de ácido nucleico de la presente invención contiene una parte de un genoma de un adenovirus tipo 5 y está sujeta a recombinación o va a estar sujeta a recombinación con una segunda molécula de ácido nucleico de la presente invención, dicha segunda molécula de ácido nucleico de la presente invención también contiene una parte de un adenovirus tipo 5. Asimismo, si la tercera molécula de ácido nucleico de la presente invención contiene una parte de un genoma de un adenovirus tipo 19a y está sujeta a recombinación o va a estar sujeta a recombinación con una segunda molécula de ácido nucleico de la presente invención, dicha segunda molécula de ácido nucleico de la presente invención también contiene una parte de un adenovirus tipo 19a. Además, si la tercera molécula de ácido nucleico de la presente invención contiene una parte de un genoma de un adenovirus tipo 5 y está sujeta a recombinación o va a estar sujeta a recombinación con una segunda molécula de ácido nucleico de la presente invención, dicha segunda molécula de ácido nucleico de la presente invención también contiene una parte de un adenovirus tipo 5.
Como se usa en la presente memoria, el término ácido nucleico y ácido nucleico se usan preferiblemente de una manera sinónima.
La invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras y ejemplos que son meramente ilustrativos y no deben considerarse como una limitación del alcance de la invención.
Fig. 1
es una representación esquemática que muestra un método para construir un genoma de adenovirus de primera generación, por el que un primer ácido nucleico idéntico o similar a pDonorSirl, y una segunda molécula de ácido nucleico idéntica o similar a pBACSir1 se combinan y se hacen reaccionar a través de sus sitios de recombinación formando un cuarto ácido nucleico (pRAB) como producto de recombinación que puede seleccionarse y contiene exactamente una copia de un genoma de virus complementado completo. Las bacterias que albergan el cuarto ácido nucleico contienen el primer y segundo marcadores de selección y pueden seleccionarse con el primer y segundo agente de selección. La composición de una cuarta molécula de ácido nucleico resultante de un evento de recombinación simple (pRABIx) se da en la figura 1A, la composición de una cuarta molécula de ácido nucleico resultante de un evento de recombinación doble (pRAB2x) se da en la figura 1B.
Fig. 2A
ilustra la composición del ADN de los BAC de adenovirus recombinantes analizados por digestión de restricción con una enzima de restricción, y la composición del ADN de dos virus adenovirus de primera generación complementados reconstituidos generados a partir de estos BAC utilizando el método descrito del ejemplo 1 y el ejemplo 2
Fig. 2B
ilustra la composición del ADN de los BAC de adenovirus recombinantes analizados por digestión de restricción con una enzima de restricción obtenida después de la recombinación específica de sitio en E. coli usando el método descrito del ejemplo 3
Fig. 3
es una representación esquemática del método descrito en el ejemplo 3 para construir una pluralidad o biblioteca de quintas moléculas de ácido nucleico. Un tercer ácido nucleico idéntico o similar a pDonorSir2 y un segundo ácido nucleico idéntico o similar a pBACSir2 se combinan y se hacen reaccionar a través de sus sitios de recombinación formando un quinto ácido nucleico como producto de recombinación que puede seleccionarse y contiene exactamente una copia de un genoma de virus complementado completo (Fig. 3A). Pueden seleccionarse las bacterias que albergan el quinto ácido nucleico que contiene los marcadores de selección positiva y negativa del tercer ácido nucleico y el segundo marcador de selección. La composición esquemática de una quinta molécula de ácido nucleico resultante de un evento de recombinación único (pRAB_RPSL1x) se da en la figura 3a , la composición esquemática de una quinta molécula de ácido nucleico resultante de un evento de recombinación doble ((pRAB_RPSL2x)) se da en la figura 3B.
Fig. 4
muestra los vectores de adenovirus que expresan GFP obtenidos después de la transfección directa de formas linealizadas del primer y segundo ácido nucleico en células 293 que expresan la recombinasa específica de sitio Flp usando el método descrito del ejemplo 5.
Fig. 5
ilustra la inhibición selectiva del crecimiento de bacterias en un medio que contiene el agente de selección negativa a diferentes concentraciones que albergan un BAC doblemente recombinado (pRAB_RPSL2x) según el método descrito del ejemplo 3.
Fig. 6
muestra las combinaciones del marcador de selección positiva y negativa útiles para la generación de una pluralidad de quintas moléculas de ácido nucleico según el método proporcionado por esta invención.
Fig. 7
ilustra la composición de ADN de BAC de adenovirus humano recombinante tipo 19a analizados por digestión de restricción con una enzima de restricción usando el método descrito del ejemplo 6
Breve descripción de las figuras
Fig. 1 Representación esquemática que muestra un método para construir un genoma de adenovirus de primera generación, por el que dos ácidos nucleicos se combinan y se hacen reaccionar a través de sus sitios de recombinación formando un producto de recombinación correspondiente a una cuarta molécula de ácido nucleico según un método descrito de los ejemplos 1 y 2. El cuarto ácido nucleico generado se puede seleccionar y contiene exactamente una copia de un genoma de virus complementado completo. El producto de reacción se puede escindir opcionalmente con una primera y una segunda enzimas de restricción para liberar un genoma completo del virus que se puede replicar en una célula permisiva. Según el ejemplo 1, un primer vector de ácido nucleico idéntico o similar a pDonorSir1 (Seq. ID. No. 1) contiene un sitio de recombinación Frt34 mínimo (SEQ. ID. No. 7) derivado del sitio Frt de tipo salvaje, una secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional (OriR6K) y una secuencia de nucleótidos que proporciona un primer marcador de selección que confiere a una célula huésped resistencia contra la kanamicina (KnR), un primer sitio de restricción (RS1), una primera parte de un genoma de un virus que contiene la ITR izquierda de un genoma de adenovirus (ITRleft) y la señal de empaquetamiento ES, y una unidad de transcripción (TU). El segundo ácido nucleico es un vector BAC idéntico o similar a pBACSir1 (Seq. ID NO. 13) o pBACSir2 (Seq. ID No.2), que comprende un sitio de recombinación de Frt48 de tipo salvaje (SEQ.ID. No. 8), un segunda parte del genoma de un adenovirus (Ad) que comprende la ITR derecha de un genoma de adenovirus (ITRrigth), un segundo sitio de restricción (RS2) y una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación de una sola copia (F'ori), y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección que confiere a una célula huésped resistencia contra cloranfenicol (CmR). Ambas moléculas de ácido nucleico se hacen reaccionar a través de sus sitios de recombinación en una célula huésped bacteriana en presencia de recombinasa Flp. Las cuartas moléculas de ácido nucleico resultantes son BAC de adenovirus recombinantes (pRAB) que consisten en productos únicos recombinados o en múltiples productos recombinados. En la figura 1A se da la composición esquemática de un único producto de recombinación (pRAB1x) (Seq. ID. No. 4). En la figura 1B se da la composición esquemática de un producto de recombinación doble (pRAB2x) (Seq.ID. No. 5). Tras la digestión del ADN de un cuarto ácido nucleico con la primera y la segunda enzimas de restricción, se libera un genoma de adenovirus completo de los pRAB que contienen la ITR izquierda y la derecha, la señal de empaquetamiento y la unidad de transcripción (figura 1C). Los vectores de adenovirus de primera generación viables se obtienen en el 97% de los casos si el ADN de un cuarto ácido nucleico obtenido según el método descrito en el ejemplo 1 y digerido con la primera y segunda enzimas de restricción según el método descrito en el ejemplo 2 se transfecta en células 293 permisivas.
La Fig. 2A ilustra la composición de dos adenovirus de primera generación reconstituidos obtenidos usando el método descrito en el ejemplo 1. El ADN de dos tipos de productos de reacción son pRAB1 x y pRAB2x, resultantes de la inserción simple y doble de pDonorSir1 en pBACSir1, por lo que pDonorSir1 es idéntico al organismo depositado en la DSMZ según el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 23753, y por el cual pBAcSir1 es idéntico al organismo depositado en la DSMZ según el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 24298. Los respectivos productos de reacción se aislaron de un cultivo en desarrollo de bacterias DH10B según los protocolos estándar, y se caracterizaron por digestión de restricción con XhoI (Figura 2A, carriles 3-4). En el carril 1 se cargó un marcador de longitud de nucleótidos, proporcionando fragmentos de referencia con una longitud definida entre 1 y 10 kb. En el carril 2, el patrón de restricción del vector pRABref de adenovirus recombinante BAC (Seq. ID. No. 3) se da como referencia. El patrón de restricción XhoI generado in silico de pRABref es el siguiente: 14,5 kb, 10,274 kb, 7,403 kb, 2,466 kb, 1,445 kb y 0,595 kb. El análisis del producto de recombinación único RAB1x (carril 3) produce un par de bandas adicionales características de 6,266 kb y 4,187 kb de longitud, respectivamente. El patrón generado in silico para la digestión con XhoI del producto de reacción único recombinado RAB1x (Seq. ID. No.4) es como sigue: 14,5 kb, 10,274 kb, 6,266 kb, 4,187 kb, 2,466 kb, 1,445 kb y 0,595 kb. En el caso del producto de doble recombinación, aparece una tercera banda adicional de 3,05 kb en el (carril 4). El patrón generado in silico para la digestión con XhoI del producto de reacción de doble recombinación RAB2x (Seq. ID. No. 5) es como sigue: 14,5 kb, 10,274 kb, 6,266 kb, 4,187 kb, 3,05 kb, 2,466 kb, 1,445 kb y 0,595 kb. En un experimento adicional, el ADN de RAB1x y RAB2x se aisló y se cortó con enzimas de restricción PacI (correspondientes a RS1 y RS2 en la figura 1, respectivamente) y se transfectó en células 293 permisivas. La Figura 2A muestra el patrón de restricción del ADN del virus aislado de células 293 transfectadas con RAB1x (carril 6) y RAB2x (carril 7) restringidos con PacI. El patrón generado in silico para la digestión con XhoI del ADN viral obtenido de ambos adenovirus recombinantes reconstituidos, RAB1x y RAB2x respectivamente, es como sigue: 14,5 kb, 8,499 kb, 3,365 kb, 2,466 kb, 1,445 kb y 0,595 kb. El patrón de fragmentos de restricción es idéntico para ambos virus, ya que el genoma de adenovirus complementado completo idéntico se libera de los pRAB tras la digestión con PacI. El patrón de restricción de RAB1x o RAB2x se comparó con un adenovirus vacío, siendo esencialmente el mismo que el de RAB1x y RAB2x, pero sin la unidad de transcripción (Figura 2, carril 5). El patrón del fragmento de restricción in silico tras la digestión con XhoI del ADN de adenovirus aislado de la forma RAB1x o RAB2x, respectivamente, es como sigue: 14,5 kb, 8,499 kb, 3,365 kb, 2,466 kb, 1,445 kb y 0,595 kb.
La Fig. 2B muestra el análisis de fragmentos de restricción de los productos de recombinación entre pDonorSir2 y pBACSir2 obtenidos según el método descrito en el ejemplo 3, en el que pDonorSir2 es idéntico al organismo depositado en la DSMZ según el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 23754, y en el que pBACSir2 es idéntico al organismo depositado en la DSMZ con el número de acceso según el tratado de Budapest DSM 24299. La selección de los productos de recombinación se realizó en placas de agar que contenían kanamicina (25 pg/ml), cloranfenicol (25 pg/ml) y sulfato de estreptomicina (50 pg/ml) como agentes de selección. Bajo estas condiciones E. coli contenía BAC de adenovirus recombinantes recombinados (pRABs), y contenía pRAB_RPSL_1x (Seq. ID. No.
11) como producto de reacción en 83 de los 88 productos de reacción analizados. Sólo en 2 de 88 casos se obtuvo un producto de reacción de doble recombinación pRAB_RPSL_2x (Seq. ID. No. 12). Se recogieron colonias individuales de la placa de selección, se sub-cultivaron en medio líquido que contenía cloranfenicol (25 pg/ml) y se aisló el ADN de BAC de los subcultivos posteriores de las colonias que contenían pRAB y se analizó la integridad de los productos de reacción mediante análisis de fragmentos de restricción tras la digestión con XhoI (figura 2B). Los 6 recombinantes analizados contenían pRAB_RPSL_1x. Para probar la fiabilidad del método, se repitió el experimento y se recogieron 82 clones más de las placas de selección y se caracterizaron como antes. Solo se pudieron encontrar 2 clones que contenían múltiples productos de inserción correspondientes a pRAB_RPSL_2x marcados con D en la Fig. 2B; números de clon núm. 47 y núm. 53, respectivamente. Otras 7 preparaciones de ADN de BAC estaban contaminadas por el vector parental pBACSir2 (marcado con V, número de clon núm. 9, núm. 17, núm. 22, núm. 39, núm. 41, núm. 62, núm. 67), y 3 fueron productos de recombinación resultantes de reordenamientos (marcado con r, número de clon núm. 25, núm. 46, núm. 68. En un experimento adicional se analizaron un total de 44BAC correspondientes a un quinto ácido nucleico, por lo que solo 1 producto de recombinación correspondió a pRAB_RPSL_2x y 43 de los 44 clones correspondieron a pRAB_RPSL_1 x. En total, 126/132 BAC correspondieron al producto de recombinación único pRAB_RPSL_1x (95,5% de los productos de recombinación analizados) y se observó recombinación múltiple en 3/132 correspondiente al 2,3% de los clones.
Fig. 3 Representación esquemática que muestra el método descrito en el ejemplo 3 para construir genomas de vector de adenovirus completos complementados, o una pluralidad o biblioteca de estos. La recombinación entre una tercera molécula de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico se combinan y se hacen reaccionar a través de sus sitios de recombinación Frt formando un producto de recombinación que puede seleccionarse y por lo que el número de eventos de recombinación se limita a uno. Según el ejemplo 3, una tercera molécula de ácido nucleico idéntica o similar a pDonorSir2 que contiene un promotor procariótico (promotor PK), un sitio de recombinación Frt34 mínimo derivado del sitio Frt de tipo salvaje, un marcador de selección negativa (Rpsl), una secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para replicación condicional (OriR6K) y una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva que confiere a una célula huésped resistencia a la kanamicina (KnR), un primer sitio de restricción (RS1), una primera parte de un genoma de un virus que contiene la ITR izquierda de un genoma de adenovirus (ITRleft) y la señal de empaquetamiento ES, una unidad de transcripción o gen de interés (GOI). El segundo ácido nucleico, que es idéntico o similar a pBACSir2 (SEQ. ID. No. 2) comprende un sitio de recombinación Frt48 de tipo salvaje (SEQ.ID. No. 8), una segunda parte del genoma de un adenovirus que comprende la ITR derecha de un genoma de adenovirus (ITRrigth), un segundo sitio de restricción (RS2) y una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación de una sola copia (F'ori) y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un segundo marcador de selección que confiere a una célula huésped resistencia al cloranfenicol (CmR). Ambas moléculas de ácido nucleico se hacen reaccionar a través de sus sitios de recombinación en una célula huésped bacteriana en presencia de recombinasa Flp. Usando el método descrito, los BAC recombinantes resultantes consisten predominantemente (> 95%) en productos recombinados simples. En la figura 3A se da la composición esquemática de un único producto de recombinación pRAB_RPSL_1x. En la figura 3B se representa esquemáticamente la doble recombinación. En el producto de recombinación pRAB_RPSL_2x, el promotor procariótico (Promotor PK) está próximo al marco de lectura abierta del marcador de selección negativa (RpsI). Este producto se observa en menos del 2,5% de los productos de recombinación según el método descrito en el ejemplo 3.
Fig. 4 muestra la reconstitución de virus adenovirus infecciosos complementados en células 293 Flp que expresan la recombinasa Flp según un método descrito en el ejemplo 5, en el que las células 293 Flp son idénticas al organismo depositado en la DSMZ con el número de acceso según el tratado de Budapest DSM ACC3077. Se transfectaron células 293Flp con una primera molécula de ácido nucleico correspondiente a pSirDonor1-EGFP (SEQ. ID No. 9), y una segunda molécula de ácido nucleico correspondiente a pBACSir2, por lo que ambos ácidos nucleicos se trataron con PacI antes de la transfección. Después de 3 días de cultivo a 37°C en condiciones de cultivo celular estándar, se detectaron microscópicamente conglomerados de células fluorescentes en forma de cometa que mostraban el efecto citopático (CPE) característico para la producción de adenovirus productivos en células 293.
La Fig. 5 muestra la inhibición selectiva del crecimiento por estreptomicina de células E. coli DH10B que llevan pRAB_RPSL_2x obtenidas a partir de la doble recombinación de pDonorSir2 con pBACSir2. Se generaron curvas de crecimiento a partir de células E. coli DH10B transformadas con el vector vacío pBACSir2, el pRAB_RPSL_1x_núm.
1 recombinado simple o dos vectores BAC de adenovirus recombinados dobles pRAB_RPSL_2x_núm. 47 y pRAB_RPSL_2x_núm. 53, respectivamente. El crecimiento de cultivos bacterianos se realizó a diferentes concentraciones de estreptomicina a partir de un cultivo nocturno saturado diluido como material de partida, y el seguimiento de la DO600 a lo largo del tiempo. Después de que el promedio de la DO600 del cultivo replicado que contiene el vector BAC de control pBACSir2 alcanzó 0,8, generalmente 8 horas después de la inoculación, se midieron los valores de DO600 y se calculó la densidad óptica y se hizo referencia a la DO600 promedio del cultivo de control, que se estableció en 100%. Los resultados de 5 experimentos independientes se representaron para cada condición de crecimiento y las desviaciones estándar de las densidades ópticas relativas dentro de los 5 experimentos representados se incluyeron como barras de error. Los clones de E. coli que llevaban el vector BAC de control pBACSir2 o el vector BAC simple recombinado pRAB_RPSL_1x crecieron bien incluso en presencia de una concentración muy alta (200 gg/ml) de estreptomicina. En contraste, el crecimiento de los clones que portaban una doble inserción de pDonorSir2 (pRAB_RPSL_2x núm. 47) y pRAB_RPSL_2x_ núm. 53) fue bloqueado por 50 gg/ml de estreptomicina, ya se pudo detectar alguna inhibición en presencia de 25 gg/ml de estreptomicina.
La Fig. 6 muestra una matriz de sinergia de marcadores de selección. En base al modo de acción de los antibióticos, los marcadores de selección positiva y negativa tienen el potencial de funcionar de forma sinérgica en presencia de kanamicina. Las combinaciones de marcadores de selección positiva y negativa que se espera que funcionen sinérgicamente para la contra-selección de productos recombinados múltiples según el método de la presente invención descrito en la presente memoria para la generación de vectores de virus adenovíricos recombinantes están marcados con "+" en la tabla y las combinaciones que no se espera que funcionen sinérgicamente se marcan con "0".
La Fig. 7 ilustra la composición de dos vectores de adenovirus tipo 19a de primera generación recombinantes obtenidos usando el método descrito en el ejemplo 6. Los productos de reacción se aislaron de un cultivo en crecimiento de bacterias DH10B según los protocolos estándar, y se caracterizaron por digestión de restricción con KpnI. En el primer carril marcado con M se cargó un marcador de longitud de nucleótidos, proporcionando fragmentos de ADN de referencia con una longitud definida entre 1 y 10 kb. Se muestran los análisis de restricción con KpnI del producto de recombinación simple pRAB19a1x (carril 1, 2, 3) y productos de recombinación doble (carriles 4). El patrón generado in silico para la digestión con KpnI del producto de reacción simple recombinado pRAB19a1x (Seq. ID. No. 16) es como sigue: 11,361 kb, 6,254 kb, 5,447 kb, 4,443 kb, 3,271 kb, 2,016 kb, 1,886 kb, 1,868 kb, 1,585 kb y 28 bp. En el caso del producto de doble recombinación, aparece una banda adicional de 3,364 kb (carril 4). El patrón generado in silico para la digestión con KpnI del producto de reacción de doble recombinación pRAB19a2x (Seq. ID. No. 17) es como sigue: 11,361 kb, 6,254 kb, 5,447kb, 4,443 kb, 3,364 kb, 3,271 kb, 2,016 kb, 1,886 kb, 1,868 kb, 1,585 kb y 28 pb.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de BAC de adenovirus recombinantes usando recombinación específica de sitio en E. coli que expresa recombinasa Flp.
Para la construcción de un genoma de adenovirus recombinante, un primer ácido nucleico pDonorSir1 y una segunda molécula de ácido nucleico pBACSirl se combinaron y se hicieron reaccionar en células E. coli DH10B que albergan pBACSirI y el plásmido pCP20 para la expresión condicional de recombinasa FLP, por lo que pDonorSir1 es idéntico al organismo depositado en la DSMZ con el número de acceso según el tratado de Budapest DSM 23753, y por el cual pBACSir1 es idéntico al organismo depositado en la DSMZ según el tratado de Budapest con el número de acceso DSM24298, y por el cual las células E. coli que albergan pBACSir1 y pCP20 son idénticas al organismo depositado en la DSMZ según el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 23742. El plásmido pDonorSir1 se introdujo en las células E. coli DH10B mediante electroporación utilizando un protocolo estándar. La molécula de ácido nucleico pBACSir1 es un derivado del vector pKSO BAC (Messerle et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 14759-14763, 1997) y contienen la parte derecha del genoma del adenovirus humano tipo 5 (AV5) eliminado para la región E1 y la región E3. La molécula de ácido nucleico pBACSir1 se mantuvo en E. coli DH10B (o cepas E. coli derivadas de K12 equivalentes que carecen del factor F) que albergan un sistema de expresión condicional para la expresión de Flp. Aquí, en el ejemplo 1, las células DH10B albergaron el adenovirus BAC pBACSir1, y la recombinasa Flp se proporcionó por el plásmido pCP20, cuya replicación está controlada por un origen de replicación sensible a la temperatura (Bubeck A. et al., J. Virol. 78: 8026-8035, 2004). Las células DH10B que albergan pBACSir1 y pCP20 se mantuvieron a 30°C en presencia de ampicilina (50 pg/ml) y cloranfenicol (25 pg/ml). A continuación, estas células DH10B se transformaron eléctricamente con pDonorSir1 y se cultivaron durante 60 minutos a 42°C en ausencia de antibióticos. La Flp expresada indujo la recombinación específica de sitio entre sitios FRT presentes en pDonorSir1 y pBACSir1, respectivamente. Al mismo tiempo, también comenzó la eliminación de la expresión de Flp, ya que pCP20 no puede replicarse en E. coli a temperatura elevada. El cultivo transformado se sembró en placas de agar que contenían kanamicina (25 pg/ml) y cloranfenicol (25 pg/ml) como agentes de selección. Bajo estas condiciones se seleccionaron E. coli que contienen BAC de adenovirus recombinantes recombinados (pRAB) en los que al menos un plásmido pDonorSir1 se había recombinado con pBACSir1. Se aisló el ADN de cultivos en crecimiento de células DH10B que contenían pRAB y se analizó la integridad de los productos de reacción mediante digestión de restricción con Xhol (Fig. 2A (carriles 2-4). Todos los productos de recombinación analizados contenían pRAB, que eran productos recombinados simples (pRAB1x) o múltiples (pRAB2x).
Ejemplo 2: Reconstitución de adenovirus recombinantes generados por recombinación específica de sitio en E. coli que expresa recombinasa Flp
Los dos tipos predominantes de vectores BAC obtenidos de la recombinación específica de sitio según el método descrito en el ejemplo 1 fueron pRAB1x y pRAB2x, respectivamente. Los pRAB generados por la recombinación de Flp en células DH10B contenían una, y sólo una secuencia continua de un genoma de adenovirus complementado completo, que era competente para la replicación en células 293. El ADN de pRAB se purificó a partir de cultivos nocturnos de E. coli saturados (100 ml) en medio LB usando un kit para la preparación de plásmidos. En este caso, se utilizó el kit Nucleobond PC-100 de Macherey y Nagel, Alemania, según las recomendaciones del fabricante. La identidad de los pRBA obtenidos se verificó mediante análisis de restricción de los ADN de pRAB (Fig. 2A, carriles 2­ 4). Para la reconstitución del virus, el ADN de pRAB purificado se trató con 10U de Pací por pg de ADN durante 2 h según las recomendaciones del fabricante. Posteriormente, los ADN de pRAB1x y pRAB2x digeridos con Pad se purificaron usando fenol-cloroformo según los protocolos estándar antes de la transfección en células 293. En resumen, se digirieron 10 pg de ADN de pRAB en un volumen de 100 pl durante 1,5 h a 37°C en un baño de agua. Posteriormente, se añadieron 50 pl de fenol/cloroformo (mezcla 1:1) al tubo de reacción (tamaño de copa Eppendorff 1,5 ml, Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) y se agitó durante 20 segundos aquí se utilizó el Vortexer MS-3 basic (IKAIKA® Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Alemania). El tubo se centrifugó en una centrífuga de mesa a velocidad máxima (20000 x g) durante 5 min a temperatura ambiente y se transfirieron 80 pl de la fase superior acuosa a un tubo nuevo y se añadieron 10 pl de NaAc 3 M (pH 4,5) y 200 pl de EtOH. Todos los reactivos y productos químicos se adquirieron en Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU. El tubo se mezcló con las yemas de los dedos hasta que el ADN precipitado se hizo visible. Además, el tubo se incubó durante 5 min a temperatura ambiente y el ADN se sedimentó en una centrífuga de sobremesa a velocidad máxima durante 15 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se eliminó cuantitativamente y el sedimento se disolvió inmediatamente en 20 pl de agua desionizada estéril. La transfección de células 293 se realizó mediante lipofección. Aquí, se utilizó el reactivo de transfección Superfect (Qiagen, Hilden, Alemania) según la recomendación del fabricante. Los adenovirus resultantes eran competentes para la replicación en células 293 y podían propagarse según los protocolos estándar (Green M y Loewenstein P, Human Adenoviruses: Propagation, Purification, Quantification, and Storage in Current Protocols in Microbiology79). La identidad de los vectores de adenovirus recombinantes obtenidos según el método descrito en este ejemplo se verificó mediante digestión de restricción del ADN del vector de adenovirus con Xhoí y análisis de fragmentos de ADN usando electroforesis en gel de agarosa (Fig. 2A). Para la preparación de ADN de vector de adenovirus genómico, las células 293 (2,5 x 107 células) se infectaron con una MOI de 3 con los vectores de adenovirus recombinantes obtenidos después de la transfección de los PRAB digeridos con PacI en las células 293. Una vez que se completó el efecto citopático (CPE), las células infectadas se lavaron una vez en PBS, se rasparon de las placas y se resuspendieron en PBS. Las células (~4x106 células/ml) se lisaron añadiendo un volumen igual de tampón TST (TritonX-100 al 2%, NaCl 400 mM, Tris-HCl 20 mM pH 8,0) a la suspensión celular seguido de incubación en hielo durante 30 minutos. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 20.000 g durante 10 minutos a 4°C y el sobrenadante se trató con 50 gg/ml de proteinasa K (Roche) en presencia de SDS al 0,5% durante 60 minutos a 56°C. Después de la extracción de los ácidos nucleicos mediante fenol/cloroformo y precipitación con etanol, el extracto se trató con RNasa A (Sigma). El ADN viral libre de ARN se extrajo de nuevo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. El patrón de restricción Xho\ del virus reconstituido derivado de pRABIx y pRAB2x correspondió al patrón generado in silico, confirmando la integridad del genoma de adenovirus en los virus de adenovirus recombinantes obtenidos (Fig. 2A carriles 5-7).
Ejemplo 3: Generación de RAB recombinantes con recombinación controlada mediante selección negativa
Para evitar inserciones múltiples y mejorar la construcción de una biblioteca de expresión de adenovirus, se construyó pDonorSir2, que es una realización de la tercera molécula de ácido nucleico de la presente invención, por lo que pDonorSir2 es idéntico al organismo depositado en la DSMZ según el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 23754. pDonorSir2 difiere de pDonorSirl en su locus FRT, junto a este pDonorSir2 contiene un promotor de galactoquinasa fuerte de E. coli (Warming, S., N. Costantino, Court DL, N. A. Jenkins y N. G. Copeland. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res 2005, 33: e36) corriente arriba del sitio FRT y corriente abajo del sitio FRT un marco de lectura abierto rpsL, que mediaba la sensibilidad a la estreptomicina si se expresaba (Reyrat JM, Pelicic V, Gicquel B, Rappuoli R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. \nfect. \mmun. 1998, 66: 4011 -4017). El uso de pDonorSir2 se ejemplifica como sigue: las células DH10B que albergan pBACSir2 y pCP20 se mantuvieron a 30°C en presencia de ampicilina y cloranfenicol, por lo que pBACSir2, que es una realización de la segunda molécula de ácido nucleico de la presente invención, es idéntica a el organismo depositado en la DSMZ con el número de acceso según el tratado de Budapest DSM 24299, y por lo que las células E. coli que albergan pBACSir2 y pCP20 son idénticas al organismo depositado en la DSMZ según el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 23743. A continuación, las células DH10B se transformaron eléctricamente con pDonorSir2 y se cultivaron durante 150 minutos a 42°C en ausencia de cualquier antibiótico. El Flp expresado indujo la recombinación específica de sitio entre sitios FRT presentes en pDonorSir2 y pBACSir2, respectivamente. Al mismo tiempo, también comenzó la eliminación de la expresión de Flp, ya que pCP20 no puede replicarse en E. coli a temperatura elevada. El cultivo transformado se sembró en placas de agar que contenían kanamicina (25 gg/ml), cloranfenicol (25 gg/ml) y sulfato de estreptomicina (50 gg/ml) como agentes de selección. En estas condiciones, se seleccionaron E. coli que contienen BAC de adenovirus recombinantes recombinados (pRAB _RPSL), en los que el plásmido pDonorSir2 se había recombinado con pBACSir2. Se recogieron colonias individuales de la placa de selección y se cultivaron en 10 ml de medio LB líquido que contenía cloranfenicol (25 gg/ml) durante la noche a 37°C en una incubadora con agitación. Todos los productos químicos y medios utilizados se adquirieron en Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU. El ADN de pRAB_RPSL de estos cultivos se aisló posteriormente según las recomendaciones del fabricante utilizando un kit de aislamiento de plásmido de ADN, y se analizó la integridad de los productos de reacción mediante digestión de restricción con Xhol (figura 2B). En este caso, se utilizó el kit Nucleobond PC-100 de Macherey y Nagel, Alemania para el aislamiento de ADN de pRAB_RPSL según las recomendaciones del fabricante. El patrón de restricción Xho\ de los 6 pRAB analizados correspondía a productos recombinados simples (pRAB_RPSL_1x). Para probar la fiabilidad de la contra-selección aplicada, se cogieron 82 clones adicionales de las placas de selección y se probaron como anteriormente. Solo 2 clones contenían múltiples productos de inserción (marcados con 'D' en la figura 2B), otros 7 clones estaban contaminados por pBACSir2 (marcados con 'V' en la figura 2B) y 3 contenían otras reordenaciones no identificadas (marcadas con 'r' en la figura 2B). En total, la gran mayoría (83/88) de las colonias contenían solo pRAB_RPSL_1x (Fig. 2B). En un experimento adicional se analizaron un total de 44 clones, por lo que solo 1 producto de recombinación correspondía a pRAB_RPSL_2x, y 43 de los 44 clones correspondían a pRAB_RPSL_1x. En total, 126/132 BAC correspondieron al producto de recombinación único pRAB_RPSL_1x (95,45% de los productos de recombinación analizados) y se observó recombinación múltiple en 3/132 correspondiente al 2,3% de los clones.
Ejemplo 4: Determinación de la eficiencia media de la biblioteca para la generación de bibliotecas BAC de adenovirus recombinantes
Para probar la eficacia de nuestro sistema de recombinación de E. coli y evitar la contaminación de las preparaciones de ADN pRAB_RPSL según el ejemplo 3 con el vector pBACSir2 no recombinado, el experimento descrito en el ejemplo 3 se repitió dos veces más con las siguientes modificaciones:
i) Para probar la eficiencia de clonación primaria, se toman 50 gl de un cultivo de post-transformación de 10 ml y se sembraron diluciones seriadas de 10 veces en una placa de agarosa de selección triple que contenía kanamicina (25 gg/ml), cloranfenicol (25 gg/ml) y sulfato de estreptomicina (50 gg/ml) como agentes de selección (Experimento 2). Todos los productos químicos y medios utilizados se adquirieron en Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU. Después de 60 minutos, el resto del cultivo se incubó durante otros 90 minutos dando finalmente un tiempo total de cultivo posterior a la transformación de 150 minutos como anteriormente (Experimento 3). Se inocularon dos placas con 200 gl de 1 ml de volumen final de cada dilución de 50 gl de cultivo post-transfección (1:101, 1:102, y 1:103) de cada experimento.
ii) Después de que aparecieron las colonias que contenían los pRAB en las placas de selección, se hicieron placas de réplica en una segunda ronda de placas de selección triple que contenían kanamicina (25 gg/ml), cloranfenicol (25 gg/ml) y sulfato de estreptomicina (50 gg/ml) como agentes de selección. Este procedimiento minimizó la contaminación tanto por el vector como por los productos de inserción múltiple, por lo que la generación de placas de réplica se aplica regularmente para mantener las bibliotecas de E. coli.
Los recuentos de colonias en placas de réplica fueron 52 y 89 en el experimento 2, y 204 y 129 en el experimento 3 con la dilución 1:102. Teniendo en cuenta que se usaron 50 ng de ADN de pDonorSir2, y el volumen del cultivo posterior a la transformación fue de 50 pl, y se sembró una quinta parte de cada dilución, la eficiencia de clonación promedio fue de 1,85 x 106 colonias para la entrada de 1 pg.
Ejemplo 5: Generación de adenovirus competente para la replicación en células 293 que expresan recombinasa FLP
Para la construcción de células HEK 293 Flp que expresan recombinasa Flp se transfectaron 2,5 x 105 células HEK 293 usando lipofección con 10 pg del plásmido pFlp-Puro linealizado con PvuI, por lo que las células 293 Flp son idénticas al organismo depositado en la DSMZ según el tratado de Budapest con el número de acceso DSM ACC3077. Aquí, se utilizó el reactivo de transfección Superfect (Qiagen, Hilden, Alemania) según la recomendación del fabricante. Las células transfectadas se incubaron durante 48 h a 37°C en condiciones estándar de cultivo celular (95% de humedad, 5% de CO2). El medio de cultivo celular utilizado fue DMEM que contenía FCS al 10%, glutamina 2 mM y penicilina/estreptavidina al 1% (P/S)). Para la selección, se añadió puromicina hasta una concentración final de 1 pg/pl al medio, y las células se cultivaron en condiciones selectivas durante 12 días para obtener células 293 que expresan de forma estable recombinasa FLP. Todos los productos químicos y medios utilizados se adquirieron en Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU. El conjunto de células estables se amplió y se estableció un banco de células maestras. Para la reconstitución de adenovirus recombinante se sembraron 2 x 105 células 293 FlpP por pocillo en una placa de 6 pocillos y 5 horas después de sembrar las células se co-transfectaron con 0,8 pg de pDonorSir2-EGFP (SEQ. ID No.
9) y 2,5 pg de pBACSir2, ambos linealizados con PacI, utilizando lipofección. Aquí, se utilizó el reactivo de transfección Superfect (Qiagen, Hilden, Alemania) según la recomendación del fabricante. Después de un cultivo de 3 días a 37°C en condiciones estándar de cultivo celular, las células se recolectaron raspando y recogiendo por centrifugación posterior durante 5 min a 200 x g. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 400 pl de medio de cultivo celular (DMEM, FCS al 10%, glutamina 2 mM, P/S al 1%) y se sometieron a tres ciclos sucesivos de congelación/descongelación. Los restos celulares se separaron del material soluble mediante centrifugación a 4.400 x g durante 15 min. Para demostrar un rescate exitoso de vectores de adenovirus que expresan el gen EGFP, se sembraron 2 x 105 células HEK-293/pocillo en una placa de 6 pocillos y se infectaron 12 h más tarde con 200 pl del lisado de congelación/descongelación seguido de 3 días de incubación a 37°C en condiciones estándar de cultivo celular. En este momento, los conglomerados de células fluorescentes en forma de cometa que mostraban el efecto citopático (CPE) característico para la replicación productiva de adenovirus eran microscópicamente detectables (véase la figura 4). El método permitió así la generación de vectores de adenovirus competentes para la replicación recombinante de primera generación mediante co-transfección de una tercera molécula de ácido nucleico con una segunda molécula de ácido nucleico en células 293 Flp.
Ejemplo 6: Construcción de BAC de Adenovirus tipo 19a recombinantes usando recombinación específica de sitio en E. coli que expresa recombinasa Flp.
Para la construcción de un genoma de adenovirus recombinante humano no tipo 5, un primer ácido nucleico Ad19a pDonorSir19a, que es una realización de la primera molécula de ácido nucleico de la presente invención, y una segunda molécula de ácido nucleico Ad19a pBACSir19a, que es una realización de la segunda molécula de ácido nucleico de la presente invención, se combinaron y se hicieron reaccionar en células E. coli DH10B que albergan pBACSir19a y el plásmido pCP20 para la expresión condicional de recombinasa FLP. El plásmido pDonorSir19a se introdujo en las células E. coli DH10B mediante electroporación utilizando un protocolo estándar. La molécula de ácido nucleico Ad19a pBACSir19a se mantuvo en E. coli DH10B (o cepas E. coli derivadas de K12 equivalentes que carecen del factor F) que albergan un sistema de expresión condicional para Flp. Aquí, en el ejemplo 6, las células DH10B albergaron el BAC de adenovirus tipo 19a pBACSir19a, y la recombinasa Flp fue proporcionada por el plásmido pCP20, cuya replicación está controlada por un origen de replicación sensible a la temperatura. Las células DH10B que albergaban pBACSir19a y pCP20 se mantuvieron a 30°C en presencia de ampicilina (50 pg/ml) y cloranfenicol (25 pg/ml). A continuación, estas células DH10B se transformaron eléctricamente con pDonorSir19a y se cultivaron durante 60 minutos a 42°C en ausencia de antibióticos. El Flp expresado indujo la recombinación específica del sitio entre los sitios FRT presentes en pDonorSir19a y pBACSir19a, respectivamente. Al mismo tiempo, también comenzó la eliminación de la expresión de Flp, ya que pCP20 no puede replicarse en E. coli a temperatura elevada. El cultivo transformado se sembró en placas de agar que contenían kanamicina (25 pg/ml) y cloranfenicol (25 pg/ml) como agentes de selección. Bajo estas condiciones las E. coli que contenían BAC de adenovirus recombinante recombinados de tipo 19a (pRAB19a) se seleccionaron en los que al menos un plásmido pDonorSir19a se había recombinado con pBACSir19a. Se aisló el ADN de cultivos en crecimiento de células DH10B que contenían pRAB19a y se analizó la integridad de los productos de reacción mediante digestión de restricción con Kpnl (figura 7). Todos los productos de recombinación analizados contenían pRAB19a, ya sea de forma única (pRAB19alx Seq ID. No. 16) o productos recombinados múltiples (pRAB19a2x, Seq ID No. 17).
Ejemplo 7: Generación de RAB recombinantes no adenovirus humanos de tipo 5 con recombinación controlada mediante selección negativa
Para la construcción de una pluralidad o biblioteca de genomas de adenovirus recombinantes humanos no de tipo 5, un tercer ácido nucleico Ad19a pDonorSir2_19a, que es una realización de la tercera molécula de ácido nucleico de la presente invención, y una segunda molécula de ácido nucleico Ad19a pBACSir19a, que es una realización de la segunda molécula de ácido nucleico de la presente invención, se combinan y se hacen reaccionar en células E. coli

Claims (27)

REIVINDICACIONES
1. Una combinación de una molécula de ácido nucleico, que también se denomina como tercera molécula de ácido nucleico, y una molécula de ácido nucleico, que también se denomina como segunda molécula de ácido nucleico, en la que la tercera molécula de ácido nucleico comprende
(1) una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos:
(a) una primera parte de un genoma de un adenovirus, en el que la primera parte de un genoma de un adenovirus comprende exactamente una repetición terminal invertida de un adenovirus;
(b) una secuencia de nucleótidos, preferiblemente una secuencia de nucleótidos genómica, o una unidad de transcripción;
(c) una secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene actividad reguladora en un procariota;
(d) exactamente un sitio de recombinación específico de sitio que se recombina en presencia de una recombinasa correspondiente;
(e) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa;
(f) una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva; y (g) un primer sitio de restricción; o
(2) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 6; o
(3) una molécula heteróloga de ácido nucleico que comprende una tercera molécula de ácido nucleico como se define en (1) contenida en el organismo depositado en la DSMZ bajo el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 23754;
y
en el que la segunda molécula de ácido nucleico comprende
(1) una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos:
(a) una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende
(1) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación de una sola copia, y
(ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección;
(b) exactamente un sitio de recombinación específico de sitio que se recombina en presencia de una recombinasa correspondiente;
(c) una segunda parte de un genoma de un adenovirus, en la que la segunda parte de un genoma de un adenovirus comprende exactamente una repetición terminal invertida de un adenovirus; y
(d) un sitio de restricción que se denomina como segundo sitio de restricción; o
(2) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 14; o
(3) una molécula heteróloga de ácido nucleico que comprende una segunda molécula de ácido nucleico como se define en (1) contenida en el organismo depositado en la DSMZ bajo el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 24298 y/o DSM 24299;
en el que la segunda molécula de ácido nucleico y la tercera molécula de ácido nucleico son cada una e independientemente una molécula lineal o una molécula circular, preferiblemente la segunda molécula de ácido nucleico es una molécula circular y la tercera molécula de ácido nucleico es una molécula circular;
en el que la segunda molécula de ácido nucleico y la tercera molécula de ácido nucleico se complementan entre sí para formar un genoma viral completo; y
en el que la recombinasa que recombina el sitio de recombinación de la tercera molécula de ácido nucleico es la misma que la recombinasa que recombina el sitio de recombinación de la segunda molécula de ácido nucleico. 2. La combinación según la reivindicación 1, en la que en la molécula de ácido nucleico de (1) la secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene una actividad reguladora en un procariota, el sitio de recombinación específico del sitio y la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa están dispuestas en una dirección 5' -> 3'.
3. La combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que la tercera molécula de ácido nucleico es una molécula lineal, en la que los elementos (a) a (f), preferiblemente tras la escisión de la molécula circular de la tercera molécula de ácido nucleico con la primera enzima de restricción que reconoce y escinde en el primer sitio de restricción, se disponen en una dirección 5' -> 3' en la siguiente secuencia de la siguiente manera:
1. la primera parte del genoma de un adenovirus;
2. la secuencia de nucleótidos, preferiblemente la secuencia de nucleótidos genómica, o la unidad de transcripción; 3. la secuencia reguladora de ácido nucleico que tiene una actividad reguladora en un procariota;
4. el sitio de recombinación específico del sitio que se recombina en presencia de una recombinasa correspondiente; 5. la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa; y
6. la unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección positiva.
4. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el adenovirus es un adenovirus humano y preferiblemente el adenovirus es un adenovirus humano tipo 5, y más preferiblemente todo el extremo izquierdo del adenovirus tipo 5 corriente arriba de la caja TATA de la unidad de transcripción E1, o una o varias partes del mismo.
5. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, preferiblemente la reivindicación 4, en la que las secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional comprenden un origen de replicación, por lo que preferiblemente el origen de replicación es el origen mínimo del fago gR6K.
6. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, preferiblemente cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en la que la secuencia reguladora que tiene actividad reguladora en un procariota es una secuencia que dirige la expresión de una secuencia de nucleótidos en un procariota, preferiblemente en un célula huésped procariota.
7. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, preferiblemente cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, en la que el marcador de selección negativa o la expresión de la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa media o confiere sensibilidad a un agente de selección y/o un condición de selección.
8. La combinación según la reivindicación 7, en la que la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección negativa es un gen seleccionado del grupo que comprende los genes galK, tetAR, pheS, thyA, lacy, ccdB y rpsL.
9. Una combinación de una molécula de ácido nucleico que también se denomina como primera molécula de ácido nucleico y una molécula de ácido nucleico que también se denomina como segunda molécula de ácido nucleico, en la que la primera molécula de ácido nucleico comprende
(1) una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos:
(a) exactamente un sitio de recombinación específico de sitio que se recombina en presencia de una recombinasa correspondiente;
(b) una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende (i) secuencias de nucleótidos bacterianas para replicación condicional y (ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un primer marcador de selección;
(c) una primera parte de un genoma de un adenovirus, en el que la primera parte de un genoma de un adenovirus comprende exactamente una repetición terminal invertida de un adenovirus;
(d) una unidad de transcripción; y
(e) un primer sitio de restricción; o
(2) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID No: 15; o
(3) una molécula heteróloga de ácido nucleico que comprende una primera molécula de ácido nucleico como se define en (1) contenida en el organismo depositado en la DSMZ según el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 23753;
y en la que la segunda molécula de ácido nucleico comprende
(1) una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes elementos:
(a) una unidad de secuencia de nucleótidos bacteriana que comprende
(1) secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación de una sola copia, y
(ii) una secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección;
(b) exactamente un sitio de recombinación específico de sitio que se recombina en presencia de una recombinasa correspondiente;
(c) una segunda parte de un genoma de un adenovirus, en la que la segunda parte de un genoma de un adenovirus comprende exactamente una repetición terminal invertida de un adenovirus; y
(d) un sitio de restricción que se denomina como segundo sitio de restricción; o
(2) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 14; o
(3) una molécula heteróloga de ácido nucleico que comprende una segunda molécula de ácido nucleico como se define en (1) contenida en el organismo depositado en la DSMZ bajo el tratado de Budapest con el número de acceso DSM 24298 y/o DSM 24299, en el que preferiblemente la molécula de ácido nucleico contenida en el organismo es una molécula heteróloga de ácido nucleico;
y en el que la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico son cada una e independientemente una molécula lineal o una molécula circular, preferiblemente la primera molécula de ácido nucleico es una molécula circular y la segunda molécula de ácido nucleico es una molécula circular;
en el que la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico se complementan entre sí para formar un genoma viral completo; y
en el que la recombinasa que recombina el sitio de recombinación de la primera molécula de ácido nucleico es la misma que la recombinasa que recombina el sitio de recombinación de la segunda molécula de ácido nucleico.
10. La combinación según la reivindicación 9, en la que el genoma de un adenovirus de la primera molécula de ácido nucleico es un genoma de adenovirus humano, preferiblemente un genoma de adenovirus humano que es diferente del genoma de adenovirus humano tipo 5, más preferiblemente el genoma de un adenovirus de la primera molécula de ácido nucleico es un genoma adenoviral humano de tipo 19a.
11. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en la que las secuencias de nucleótidos bacterianas para la replicación condicional de la primera molécula de ácido nucleico comprenden un origen de replicación.
12. La combinación según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que la secuencia que proporciona un primer marcador de selección de la primera molécula de ácido nucleico es una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que confiere resistencia a una célula huésped que alberga dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima.
13. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que la primera parte de un genoma de un adenovirus de la primera molécula de ácido nucleico es una repetición terminal adenoviral.
14. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en la que la primera parte de un genoma de un adenovirus de la primera molécula de ácido nucleico contiene el promotor adenoviral pIX, preferiblemente el promotor adenoviral pIX es un promotor pIX del adenovirus humano 19a.
15. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que el genoma de adenovirus de la segunda molécula de ácido nucleico es un genoma de adenovirus humano, por lo que en el caso de la combinación según la reivindicación 1, el genoma de adenovirus de la segunda molécula de ácido nucleico es preferiblemente un genoma de adenovirus humano de tipo 5 o un genoma de adenovirus humano de tipo 19a y en el caso de la combinación según la reivindicación 9, el genoma de adenovirus de la segunda molécula de ácido nucleico es preferiblemente un genoma de adenovirus humano que es diferente del genoma de adenovirus humano de tipo 5, más preferiblemente el genoma del virus de la segunda molécula de ácido nucleico es un genoma adenoviral humano de tipo 19a.
16. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que la secuencia de nucleótidos bacteriana para la replicación de una sola copia de la segunda molécula de ácido nucleico comprende un origen de replicación para el mantenimiento de una sola copia en células huésped procariotas.
17. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que la secuencia de nucleótidos que proporciona un marcador de selección de la segunda molécula de ácido nucleico es una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que confiere resistencia a una célula huésped que alberga dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima.
18. La combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que la segunda parte de un genoma de un adenovirus de la segunda molécula de ácido nucleico comprende una repetición terminal invertida derecha adenoviral y la primera parte de un genoma de un adenovirus de la primera molécula de ácido nucleico y la tercera molécula de ácido nucleico comprende una repetición terminal invertida izquierda adenoviral.
19. Un método para la generación de una molécula de ácido nucleico que codifica un virus que comprende las siguientes etapas
a) proporcionar una tercera molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;
b) proporcionar una segunda molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; o
c) proporcionar una combinación de una tercera molécula de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y 15 a 18;
d) permitir que la tercera y la segunda moléculas de ácido nucleico reaccionen de modo que se produzca una recombinación específica de sitio, en la que la recombinación específica de sitio está mediada por una recombinasa específica de sitio y la recombinación específica de sitio forma un producto de recombinación que comprende una copia, preferiblemente una sola copia del genoma de un o el virus, por lo que el genoma es un genoma completo complementado y el genoma completo complementado se complementa con la recombinación específica del sitio;
e) seleccionar el producto de recombinación; y
f) opcionalmente escindir el producto de recombinación con la primera y la segunda enzimas de restricción.
20. Un método para la generación de una molécula de ácido nucleico que codifica un virus que comprende las siguientes etapas
a) proporcionar una combinación de una primera molécula de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18;
b) permitir que la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico reaccionen de modo que se produzca una recombinación específica de sitio, en la que la recombinación específica de sitio esté mediada por una recombinasa específica de sitio y la recombinación específica de sitio forme un producto de recombinación que comprende una copia, preferiblemente una sola copia del genoma de un o el virus, por lo que el genoma es un genoma completo complementado y el genoma completo complementado se complementa con la recombinación específica del sitio;
c) seleccionar el producto de recombinación; y
d) opcionalmente escindir el producto de recombinación con la primera y la segunda enzimas de restricción.
21. El método según la reivindicación 19, en el que la tercera y la segunda moléculas de ácido nucleico se hacen reaccionar en una célula huésped procariota, preferiblemente en E. coli.
22. El método según la reivindicación 20, en el que la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico se hacen reaccionar en una célula huésped procariota, preferiblemente en E. coli.
23. Un método para generar una biblioteca de secuencias de nucleótidos, en el que dicha biblioteca comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos individuales, en el que dicha biblioteca está representada por una pluralidad de genomas virales y cada genoma viral contiene una sola de las secuencias de nucleótidos individuales, que comprende las etapas del método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 19 y 21, en el que la secuencia de nucleótidos individual es parte de la unidad de transcripción de la tercera molécula de ácido nucleico.
24. Un método para generar una biblioteca de secuencias de nucleótidos, en el que dicha biblioteca comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos individuales, en el que dicha biblioteca está representada por una pluralidad de genomas virales y cada genoma viral contiene una sola de las secuencias de nucleótidos individuales, que comprende las etapas del método según se define en cualquiera de las reivindicaciones 20 y 22, en el que la secuencia de nucleótidos individual es parte de la unidad de transcripción de la primera molécula de ácido nucleico.
25. Un kit que comprende opcionalmente un prospecto y, en (un) recipiente(s) adecuado(s), al menos una combinación de la tercera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y 15 a 18.
26. Un kit que comprende opcionalmente un prospecto y, en (un) recipiente(s) adecuado(s), al menos una combinación de la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18.
27. El kit según una cualquiera de las reivindicaciones 25 y 26, en el que la(s) molécula(s) de ácido nucleico está(n) contenida(s) en una forma lista para usar y/o en el que el kit contiene una línea celular permisiva que proporciona una recombinasa e instrucciones de uso.
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