ES2903147T3 - Sistemas y procedimientos para analizar líquidos corporales - Google Patents

Abstract

Un sistema para analizar los glóbulos sanguíneos de los líquidos corporales que comprende: a. un aplicador para dosificar un fluido que comprende líquido corporal que contiene glóbulos sanguíneos, comprendiendo dicho aplicador un controlador de aplicador y una punta para dosificar el fluido sobre un portaobjetos, teniendo dicha punta una posición por encima del portaobjetos; b. un dispositivo receptor de luz que contiene una lente para capturar una imagen de los glóbulos sanguíneos en el portaobjetos; c. un mezclador para mezclar el líquido corporal con un diluyente para formar un fluido diluido; d. un ordenador que contiene un microprocesador y programa informático almacenados en medios legibles por ordenador, estando el ordenador adaptado para indicar al sistema que realice las etapas de: i.cambiar la posición de la punta con respecto al portaobjetos a una velocidad que tiene un componente direccional y un componente de velocidad medidos desde la punta o el portaobjetos; ii.hacer que el aplicador dosifique el fluido fuera de la punta a un caudal mientras la punta mantiene una coordenada Z constante con respecto al portaobjetos; iii.hacer que la punta aplique uno o más primeros flujos de células sobre el portaobjetos a lo largo de una primera trayectoria que tiene un componente X o Y fijo, comprendiendo dicho primer flujo un ancho de flujo; iv.capturar una imagen de los uno o más primeros flujos de células en el portaobjetos con el dispositivo receptor de luz; v.analizar la imagen para determinar si los uno o más primeros flujos de células están suficientemente diluidos para formar una monocapa de células en el portaobjetos; vi. si los uno o más primeros flujos de células no están suficientemente diluidos: vi.1 indicar al mezclador que añada más diluyente al fluido; vi.2 hacer que la punta aplique un flujo de células más diluido sobre el portaobjetos; vi.3 capturar una imagen del flujo de células más diluido en el portaobjetos con el dispositivo receptor de luz; vi.4 analizar la imagen para determinar si el flujo de células más diluido está suficientemente diluido para formar una monocapa de células en el portaobjetos; vi.5 si el flujo de células más diluido no está suficientemente diluido, indicar al sistema que repita las etapas vi.1 a vi.5; vii.cambiar la posición de la punta con respecto al portaobjetos en una distancia en una dirección X o Y; viii.hacer que la punta aplique un segundo flujo de células sobre el portaobjetos a lo largo de una segunda trayectoria que tiene un componente X o Y fijo, comprendiendo dicho segundo flujo una monocapa de células y 0 un ancho de flujo; en el que el segundo flujo de células se asienta en una posición contigua a los uno o más primeros flujos de células; y ix.capturar una o más imágenes de las células en el portaobjetos con el dispositivo receptor de luz.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistemas y procedimientos para analizar líquidos corporales

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un sistema y proceso para determinar la composición y componentes de fluidos. Más específicamente, la presente invención proporciona técnicas mejoradas para visualizar la morfología celular y determinar el número de un tipo particular de célula en una parte de un líquido corporal.

Antecedentes de la invención

La patología es un campo de la medicina donde los profesionales médicos determinan la presencia o ausencia de enfermedad mediante procedimientos que incluyen el examen morfológico de células individuales que se han recolectado, fijado o secado al aire, y a continuación visualizado mediante una tinción que resalta los rasgos característicos tanto del núcleo como el citoplasma. La recolección de las células a menudo implica capturar una parte del líquido corporal de una persona, colocar el líquido corporal en un portaobjetos y visualizar el fluido en el portaobjetos usando un microscopio.

Uno de los estudios patológicos realizados con más frecuencia es el CBC (hemograma completo). Para realizar un CBC, se extrae una muestra de sangre de un paciente y a continuación se cuentan las células mediante procedimientos automatizados o manuales. El CBC se realiza con frecuencia usando un instrumento, basado en el principio de citometría de flujo, que habitualmente aspira sangre entera anticoagulada y la divide en varios flujos de análisis. Se pueden determinar una serie de mediciones primarias y derivadas usando el citómetro de flujo incluyendo: i) recuento de hematíes (RBC), hemoglobina (Hb), hematocrito (Hct), índices de hematíes (volumen corpuscular medio, MCV, hemoglobina corpuscular media, MCH y concentración de hemoglobina corpuscular media MCHC), ancho de distribución de hematíes, enumeración de otros hematíes, incluyendo reticulocitos y hematíes nucleados, y morfología de hematíes; ii) recuento de leucocitos (WBC) y recuento "diferencial" de leucocitos (enumeración de los diferentes tipos de leucocitos normales, incluyendo neutrófilos, linfocitos, eosinófilos, basófilos y monocitos, y la probable presencia de otros tipos normales y anómalos de leucocitos que están presentes en diversas enfermedades); iii) recuento de plaquetas, anchos de distribución de plaquetas y otros rasgos característicos de las plaquetas, incluyendo los rasgos característicos morfológicos; y iv) otras células anómalas u otras células o componentes celulares inusuales que pueden estar en la sangre circulante. En los citómetros de flujo, las caracterizaciones morfológicas de hematíes, leucocitos y plaquetas se realizan típicamente de manera indirecta, en base a técnicas de absorción de luz y dispersión de luz y/o mediciones basadas en la citoquímica. Algunos citómetros de flujo avanzados calculan mediciones secundarias y terciarias a partir de las mediciones primarias.

Los instrumentos CBC basados en flujo en general requieren una gran calibración y control, mantenimiento y operarios capacitados, y tienen costes sustanciales asociados con la adquisición, el servicio, los reactivos, los consumibles y los desechables. Un problema importante con estos sistemas en su uso rutinario es que una gran proporción de muestras de sangre requieren más pruebas para completar la evaluación de los componentes morfológicos del CBC. Esto implica colocar una muestra de sangre en un portaobjetos, untar la muestra en el portaobjetos para formar un frotis en cuña y colocar el portaobjetos bajo un microscopio. Este proceso a menudo se realiza manualmente por tecnólogos médicos capacitados, lo que incrementa el coste y el tiempo para recibir los resultados de las pruebas. La visualización directa de los glóbulos sanguíneos en un portaobjetos de vidrio se debe realizar siempre que los resultados de la prueba automatizada requieran otro examen de la muestra de sangre. Por ejemplo, un recuento diferencial "manual" se realiza mediante la visualización directa de las células por un observador experimentado siempre que se encuentran hematíes inmaduros nucleados o leucocitos sospechosos de infección, leucemias u otras hemopatías.

La proporción de estas muestras que requieren una revisión adicional en general varía desde el 10 % al 50 %, dependiendo de la política del laboratorio, la población de pacientes y los criterios de "señalización", con una tasa mediana de alrededor del 27 %. Las razones más frecuentes para repetir la prueba incluyen la presencia de un número incrementado o disminuido de leucocitos, hematíes o plaquetas, tipos de células o morfología celular anómalos, sospecha clínica o de otro tipo de infecciones víricas o bacterianas.

Además del trabajo adicional involucrado en realizar recuentos diferenciales manuales, este proceso tiene un número de limitaciones técnicas adicionales. Estos incluyen distorsiones de la morfología celular debido a las fuerzas mecánicas involucradas en untar las células sobre el portaobjetos y las células superpuestas entre sí, lo que dificulta la visualización de la morfología celular individual.

La citopatología es una subespecialidad de la patología donde los profesionales médicos determinan la presencia o ausencia de enfermedad mediante el examen morfológico de células individuales que se han recolectado, fijado o secado al aire, y a continuación teñido con una tinción única que resalta los rasgos característicos tanto del núcleos como del citoplasma.

Los ejemplos de examen citológico incluyen la evaluación de células recolectadas del cuello uterino (la prueba de Papanicolaou), evaluación de muestras de orina para cáncer de vejiga, evaluación de muestras de pulmón para detectar la presencia de cáncer o enfermedades inflamatorias, evaluación de aspirados de potenciales sitios tumorales o la evaluación de muestras recolectadas de efusiones en cavidades corporales.

Las células que se recolectan para el examen citológico se pueden untar directamente en un portaobjetos de vidrio para microscopio, se pueden depositar en el portaobjetos por centrifugación, se pueden recolectar mediante un procedimiento de filtración o se pueden concentrar mediante procedimientos de citología de base líquida tales como los procedimientos ThinPrep o SurePath. Estos enfoques usaron diferentes tipos de soluciones conservantes que, típicamente son de base alcohólica e intentan depositar las células para conservar la morfología celular.

Existen varias limitaciones para los procedimientos actuales de preparación citológica. Estas incluyen distorsiones de la morfología celular debido a las fuerzas mecánicas involucradas en untar o sedimentar las células en el portaobjetos. El depósito de células sobre el portaobjetos puede dar como resultado que las células se superpongan entre sí, de modo que no se pueda visualizar la morfología celular individual. Las limitaciones adicionales asociadas con los procedimientos de preparación citológica actuales incluyen, aunque no se limitan a, las siguientes: muestreo heterogéneo de una muestra debido a tasas diferenciales de sedimentación de células en un portaobjetos; la pérdida de grupos de células durante determinados tipos de procedimientos de preparación; la pérdida de células pequeñas en procedimientos que dependen de procedimientos de preparación en gradiente de densidad; daño o pérdida inespecífica de células inflamatorias en procedimientos de centrifugación; y la incapacidad para determinar el número absoluto de tipos de células en una muestra, que puede ser importante para determinar el número de células anómalas en una muestra o para contar el número de células inflamatorias para determinar el tipo predominante de inflamación que existe en una muestra. Se encuentran ejemplos de estas limitaciones con las técnicas de prueba de Papanicolaou que pueden no mostrar adecuadamente determinados grupos de células debido a los procesos de frotis o filtración usados para preparar el portaobjetos. Es posible que el procedimiento de preparación en gradiente de densidad empleado por el procedimiento SurePath no capture células pequeñas y flotantes que floten encima del gradiente. Los procedimientos de centrifugación pueden dar como resultado la pérdida inconsistente de linfocitos pequeños, lo que puede ser problemático cuando se requiere un recuento diferencial exacto de células inflamatorias. Determinados tipos de enfermedades pulmonares inflamatorias, tales como la fibrosis pulmonar idiopática y la sarcoidosis, se caracterizan por perfiles únicos de inflamación que solo pueden ser útiles para el diagnóstico si se puede determinar una enumeración exacta de esas células.

Un procedimiento de preparación de muestras de citología que no distorsione la morfología y que dé como resultado la colocación de un número homogéneo y cuantificable de células en el portaobjetos superaría las limitaciones de los procedimientos de preparación actuales.

Otros ejemplos que involucran líquidos corporales incluyen la detección de células o componentes celulares que pueden estar circulando en la sangre periférica. Por ejemplo, se pueden encontrar células de un tumor no hematológico en la sangre y se podrían detectar mediante examen visual o examen automatizado de un portaobjetos. Se pueden usar marcadores especiales, tales como anticuerpos, para marcar estas células. Otros componentes celulares tales como proteínas específicas también pueden estar presentes en la sangre de forma intracelular o extracelular y se podrían evaluar en el portaobjetos, típicamente usando determinados marcadores para marcar estos portaobjetos. También se pueden detectar determinadas inclusiones en los glóbulos sanguíneos; por ejemplo parásitos.

El documento US 2005/0003458 A1 divulga procedimientos para formar matrices de células de múltiples muestras de células dispuestas sustancialmente en una monocapa sobre un único sustrato en particular adecuado para análisis de diagnóstico.

El documento US 2004/0175832 A1 divulga un aparato y procedimiento para calibrar un sistema dosificador en la industria de los semiconductores.

El documento US 2008/0318305 A1 divulga un procedimiento y un aparato automatizados de tinción y recuperación de antígenos inducidos por calor in situ para tratar una pluralidad de portaobjetos de microscopio. El documento US2006/0223172 A1 divulga un dispositivo de detección de fluorescencia múltiple y técnicas para la detección de múltiples especies diana en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real.

El documento US 6.711.283 B1 divulga un aparato y procedimiento de escaneo rápido y digitalización completamente automático de una muestra de microscopio completa, o una parte sustancialmente grande de una muestra de microscopio, usando un detector de matriz lineal sincronizado con una platina de posicionamiento que es parte de un escáner de portaobjetos de microscopio controlado por ordenador.

El documento US 2006/0223172 A1 divulga dispositivos y procedimientos para la recolección automatizada y el análisis de imágenes que permiten la identificación o clasificación de objetos microscópicos alineados o depositados en superficies.

El documento US 4.285.907 divulga un sistema de pipetas para la extracción volumétrica y el depósito lineal de un material en suspensión, en particular células o partículas.

El documento US 2007/0211460 A1 divulga una fuente de luz LED multicolor para iluminación de luz transmitida compatible con la mayoría de los microscopios.

La publicación "How to perform automated counts of fluorescently stained cells" [Cómo realizar recuentos automatizados de células teñidas con fluorescencia], de julio de 2004, de M. Fero (http://diyhpl.us/~bryan/irc/protocol-online/protocol-cache/cellcountsimagej.html) divulga un protocolo para recuentos de células semiautomatizados usando células marcadas con fluorescencia, un hemocitómetro y un programa informático de formación de imágenes.

Además, el Diccionario Oxford da una definición del sustantivo "flow" ["flujo"] (https://en.oxforddictionaries.com/definition/flow).

Finalmente, la publicación "Reticulocyte — wikidoc" de Michael Gibson, 25 de septiembre de 2007, XP055708225 (https://www.wikidoc.org/indes.php?title=Reticulocyte&printable=yes) da una definición de reticulocitos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona sistemas y procedimientos mejorados para preparar y aplicar glóbulos sanguíneos de un líquido corporal en un portaobjetos. Adicionalmente, se proporcionan sistemas y procedimientos para la formación de imágenes de las células. Las imágenes se pueden usar posteriormente para realizar pruebas, incluyendo el recuento basado en imágenes y la evaluación de la morfología de las células. La presente invención se usa en un líquido corporal, a saber, la sangre.

La presente invención proporciona el procesamiento de un portaobjetos y la captura de una imagen del portaobjetos. La imagen se puede usar posteriormente para realizar diversas pruebas que proporcionan un recuento de diversos tipos de células o una evaluación de la morfología de las células. Un ejemplo es un hemograma completo que incluye el recuento basado en imágenes y la evaluación de la morfología de los elementos formados de la sangre, incluyendo los hematíes, los leucocitos y las plaquetas. Los modos de realización de la presente invención pueden mejorar la exactitud del CBC como resultado de la visualización directa de los elementos formados de la sangre. El uso de los sistemas y procesos divulgados para aplicar una monocapa de células en un portaobjetos permite la evaluación de determinados tipos de células, en particular de leucocitos anómalos e inmaduros que se encuentran en casos de función anómala de la médula ósea, incluyendo las neoplasias hematológicas malignas. Además, la presente invención puede disminuir los costes asociados con la instrumentación; disminuir el coste de los consumibles y reactivos; y requerir menos tiempo del operario y reactivos, menos pruebas repetidas y menos piezas móviles. También puede reducir el tiempo de obtención para muchas de las pruebas de CBC que actualmente requieren la visualización de glóbulos sanguíneos después de que se completa la parte instrumental de la prueba, al permitir que las células se visualicen en un monitor en lugar de bajo un microscopio.

Los aspectos de la presente invención son eficaces para conservar la morfología celular. Esto puede ser importante para pacientes con neoplasias hematológicas malignas, tales como leucemia linfocítica crónica (LLC) o leucemia mieloide aguda (LMA). Los sistemas y procesos para crear una monocapa de células a partir de líquidos corporales pueden permitir la detección de un mayor número de células blásticas morfológicamente bien conservadas y otras células frágiles o inmaduras. Esto permitiría su reconocimiento más exacto en un estadio más temprano del proceso leucémico o de otra enfermedad. La presente invención proporciona la preparación de una distribución sustancialmente uniforme de células en un área de prueba de un portaobjetos.

La presente invención se refiere a la aplicación de glóbulos sanguíneos de líquidos corporales en un portaobjetos e incluye mezclar las células contenidas en el líquido corporal con un diluyente, depositar las células diluidas en el portaobjetos y capturar una imagen de las células en el portaobjetos. Otros aspectos de la presente invención se pueden referir a recolectar una submuestra (alícuota) de un volumen conocido de la solución y a continuación depositar la alícuota sobre un sustrato tal como un portaobjetos usando un dispositivo dosificador o aplicador. Se puede permitir que las células se sequen al aire o se pueden fijar (usando una solución fijadora) o ambas, dependiendo del examen que se anticipa. Las células también se pueden teñir. Las células teñidas en el sustrato se pueden contar y examinar mediante un sistema de formación de imágenes automatizado que utiliza un ordenador o se pueden visualizar mediante un examen microscópico manual. Las imágenes digitales se pueden mostrar en una pantalla de ordenador para reducir la necesidad de una revisión microscópica manual.

Los aspectos de la invención también se refieren a sistemas y procedimientos para recolectar células de un sitio del cuerpo, colocar las células en una solución conservante, mezclar las células en la solución para asegurar una distribución homogénea, recolectar una alícuota de volumen conocido de la solución conservante y a continuación depositar la alícuota en un portaobjetos usando un aplicador. Las células se pueden fijar, teñir o dejar secar al aire, dependiendo del examen que se anticipe. El portaobjetos que contiene la muestra se puede usar para un examen microscópico manual o mediante una técnica de formación de imágenes que puede enumerar los diferentes tipos de células que están presentes en el portaobjetos.

Los sistemas y procedimientos de la presente invención proporcionan un número de mejoras respecto a las técnicas de la técnica anterior. Por ejemplo, se puede usar un modo de realización de la presente invención para determinar el número de células en una muestra del cuello uterino que están infectadas por el virus del papiloma humano (esto puede indicar la carga vírica, que es un factor pronóstico para evaluar si una anomalía puede progresar, permanecer estable o retroceder). Los modos de realización de la presente invención pueden determinar cuántas células víricas o infectadas existen en la muestra. Adicionalmente, es posible que determinados modos de realización de la presente invención puedan determinar el recuento diferencial de células en una muestra no ginecológica recolectada de una efusión de cavidad corporal. En otros modos de realización, el sistema o procedimiento podría determinar que existe un gran número de células inflamatorias agudas en una muestra (que el sistema o procedimiento puede usar para determinar la presencia de una infección bacteriana). De forma similar, si un modo de realización de la presente invención determinó que existió un alto número de linfocitos en una muestra particular, esto puede sugerir una infección vírica, enfermedad autoinmunitaria o tuberculosis.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1A: es una vista esquemática en perspectiva de un sistema para analizar líquidos corporales. La fig. 1B: es una vista esquemática en perspectiva de un sistema para analizar líquidos corporales. La fig. 2: es una vista en perspectiva de un portaobjetos y un soporte de portaobjetos.

La fig. 3: es una vista superior ampliada del portaobjetos y la muestra del portaobjetos.

La fig. 4: es un ejemplo alternativo que no forma parte de la invención de la vista superior del portaobjetos y la muestra del portaobjetos.

La fig. 5: es un gráfico que ilustra la correlación entre los recuentos RBC de Sysmex y los recuentos RBC generados usando un modo de realización de la invención.

La fig. 6: es un gráfico que ilustra la correlación entre los recuentos WBC de Sysmex y los recuentos WBC generados usando un modo de realización de la invención.

La fig. 7A: es un esquema de flujo de proceso del modo de realización mostrado en la fig. 1A.

La fig. 7B: es un esquema de flujo de proceso del modo de realización mostrado en la fig. 1B.

Descripción detallada de la invención

Con referencia a la fig. 1A, se divulga un sistema 10 para analizar líquidos corporales. El sistema puede comprender una plataforma 100, un dispositivo receptor de luz 200, un ordenador 300, un aplicador 400, un dispositivo de circulación de gas 500, una fuente de luz 600, un dosificador 800, un dispositivo de descarga 190 900, una marcadora de portaobjetos 1000 y un lector de marcado de portaobjetos 1100. Las siguientes secciones a continuación incluyen encabezados en mayúscula destinados a facilitar la navegación a través de la memoria descriptiva, que no pretenden limitar la invención de modo alguno.

La plataforma 100

En modos de realización que presentan una plataforma 100, se puede configurar un impulsor 110 para recibir uno o más aparatos portaobjetos 700-700". El impulsor 110 puede estar sujeto a una superficie, tal como la superficie superior 101, de la plataforma. El impulsor 110 puede tomar la forma de una cinta como se muestra en la fig. 1A, el sistema puede usar un brazo mecánico, gravedad, magnetismo, sistema hidráulico, engranajes u otras técnicas de locomoción para mover el aparato portaobjetos a lo largo de la superficie 101 de la plataforma. La plataforma 100 también puede comprender un alimentador 102 y un recolector 106 para alimentar y recolectar respectivamente aparatos portaobjetos 700 desde o hacia un apilamiento o estante. El alimentador 102 puede estar equipado con un mecanismo propulsor del alimentador 103 (tal como ruedas de goma) para empujar los portaobjetos hacia abajo en una rampa 104 al impulsor 110. (Por supuesto, los modos de realización de la invención se podrían construir sin una rampa, por ejemplo, si el alimentador está nivelado con el impulsor 110, no se necesitaría ninguna rampa. De forma alternativa, se podría usar un brazo mecánico para agarrar el aparato portaobjetos 700 y colocar el aparato portaobjetos 700 directamente en el impulsor). Se pueden usar mecanismos alternativos para propulsar el portaobjetos fuera del alimentador 102, tales como imanes o sistemas hidráulicos. El alimentador puede comprender un sensor para determinar cuántos portaobjetos están presentes. El sensor podría medir el peso de los aparatos portaobjetos 700, por ejemplo, para determinar cuántos aparatos portaobjetos estaban presentes. La fig. 1A ilustra 3 aparatos portaobjetos 700 almacenados en el alimentador 102. El recolector 106 también puede comprender un sensor para determinar cuántos portaobjetos están presentes en el recolector 106. El sensor puede informar al ordenador cuando se ha analizado un número predeterminado de portaobjetos o puede informar al ordenador de la recepción de un portaobjetos de forma continuada.

El dispositivo receptor de luz 200

El dispositivo receptor de luz 200 puede ser un microscopio (tal como un microscopio de campo claro), una cámara de vídeo, una cámara fija u otro dispositivo óptico que recibe luz. El dispositivo receptor de luz puede comprender un objetivo, un ocular, una platina o cualquier combinación de los mismos. En modos de realización que usan un microscopio de campo claro estándar, se puede seleccionar uno que contenga una platina (un desplazador de portaobjetos 201) y enfoque automatizados. En un modo de realización, un microscopio puede estar sujeto a una platina motorizada y a un accesorio de motor de enfoque. El microscopio puede tener un portaobjetivos motorizado para permitir la selección de diferentes lentes de aumento bajo el control del ordenador 300. Una rueda de filtros puede permitir que el ordenador 300 seleccione automáticamente filtros de color de banda estrecha en la trayectoria de la luz. Los filtros se pueden sustituir por iluminación LED, y el uso de LED puede reducir el tiempo de obtención de imágenes en comparación con el tiempo requerido para la rotación de la rueda de filtros. En modos de realización de LED y rueda de filtros, el dispositivo receptor de luz puede contener un controlador de enfoque automático para desplazar el punto focal de la luz de modo que se enfoque cuando entra en el dispositivo receptor de luz. Por ejemplo, el controlador de enfoque automático puede controlar la posición relativa de un objetivo o platina del dispositivo receptor de luz 200 para enfocar la luz en una lente del dispositivo receptor de luz 200. Se puede usar una cámara Firewire de 1600 x 1200 píxeles para obtener las imágenes de banda estrecha.

En algunos casos, el dispositivo receptor de luz recibirá luz reflejada por el aparato portaobjetos 700" y almacenará una imagen de esa luz. Sin embargo, dado que la fuente de emisión de luz 600 se puede situar debajo de la plataforma, la fuente de emisión de luz puede dirigir la luz de modo que pase a través de la plataforma 100 y el portaobjetos 701 al dispositivo receptor de luz 200. En algunos modos de realización, la emisión fluorescente de los objetos celulares se puede detectar en el dispositivo receptor de luz 200. El dispositivo receptor de luz puede estar conectado a un ordenador a través de un enlace 11, y puede tener capacidad de movimiento axial X, Y y Z (en otros modos de realización, una platina motorizada o un desplazador de portaobjetos 201 puede proporcionar movimiento X, Y y Z). El dispositivo receptor de luz puede comprender un enlace 11 tal como un cable como se muestra en la fig. 1A, o se pueden usar otros sistemas inalámbricos. El dispositivo receptor de luz 200 y cualquiera de los otros componentes se pueden interconectar al ordenador 300 a través de un enlace (11-15), que pueden proporcionar energía al componente, proporcionar instrucciones desde el ordenador 300 al componente, o permitir que el componente envíe información al ordenador 300. El dispositivo receptor de luz 200 puede contener accionadores de giro, inclinación y/o locomoción para permitir que el ordenador 300 coloque el dispositivo receptor de luz 200 en una posición apropiada. El dispositivo receptor de luz puede contener una lente 210 que enfoca la luz. El dispositivo receptor de luz puede capturar imágenes en blanco y negro o en color. Alternativamente, se podrían usar dos o más dispositivos de recepción de luz para dividir el tiempo de procesamiento asociado con la captura de imágenes. Por ejemplo, un dispositivo receptor de luz puede funcionar como una estación de imágenes de bajo aumento mientras que otro dispositivo receptor de luz funciona como una estación de imágenes de gran aumento. De forma similar, en algunos modos de realización, el sistema 10, la plataforma 100, el ordenador 300 o el dispositivo receptor de luz 200 pueden dirigir un desplazador de portaobjetos 201 para mover el aparato portaobjetos 700 para almacenar imágenes de todas las células en el portaobjetos. Puede ser deseable usar un desplazador de portaobjetos 201 si, por ejemplo, el tamaño del campo del dispositivo receptor de luz 200 es más pequeño que la zona de muestra 710 (fig. 3).

El ordenador 300

El ordenador 300 puede ser un ordenador portátil como se muestra en la fig. 1A, o un servidor, estación de trabajo o cualquier otro tipo de dispositivo informático. El ordenador puede comprender un procesador, una pantalla 320, una interfaz 310 y una memoria interna y/o una unidad de disco. El ordenador 300 también puede comprender programa informático almacenado en la memoria o en medios legibles por ordenador, tal como una unidad óptica. El programa informático puede comprender instrucciones para hacer que el ordenador haga funcionar el dispositivo receptor de luz 200, el aplicador 400, el controlador del aplicador 490, el ventilador 500, la plataforma 100, el impulsor 110, la fuente de luz 600, el dosificador 450 u 800, o cualquier componente conectado a uno de estos componentes. De forma similar, el ordenador puede recibir información de cualquiera de estos componentes. Por ejemplo, los programas informáticos pueden controlar la velocidad de distribución de portaobjetos desde el alimentador 102, y el alimentador 102 puede informar al ordenador sobre el número de portaobjetos presentes. Además, el ordenador 300 también puede ser responsable de realizar el análisis de las imágenes capturadas por el dispositivo receptor de luz.

En un modo de realización de la invención que puede preparar y analizar células a partir de muestras de sangre, el ordenador 300 puede calcular el número de un tipo específico de célula en un volumen particular de sangre, por ejemplo, para hemogramas, recuentos de hematíes, leucocitos, y plaquetas y otros componentes medidos y derivados del CBC se podrían calcular tales como: contenido de hemoglobina, morfología de hematíes o diferencial de leucocitos. Los programas informáticos de análisis de imágenes pueden analizar cada campo individual y sumar los recuentos totales de hematíes y leucocitos. Para calcular los recuentos totales por microlitro en un vial del paciente, el número contado en el portaobjetos se multiplica por la proporción de dilución y el volumen de la submuestra. Los resultados de los recuentos, las mediciones morfológicas y las imágenes de hematíes y leucocitos del portaobjetos se pueden mostrar en la pantalla 320. En algunos modos de realización, el ordenador 300 puede mostrar datos numéricos, histogramas de poblaciones celulares, diagramas de dispersión y evaluaciones directas de la morfología celular usando imágenes de los glóbulos sanguíneos mostradas en la pantalla. La capacidad de mostrar la morfología celular proporciona a los usuarios del sistema 10 la capacidad de establecer rápidamente la presencia o ausencia de anomalías en la morfología celular que pueden justificar la preparación de un portaobjetos adicional para su revisión manual por un técnico experimentado u otro profesional. Los programas informáticos también pueden proporcionar al ordenador instrucciones para mostrar imágenes 331 recibidas del dispositivo receptor de luz o pueden hacer que la pantalla 330 muestre los resultados 332 (quizá en una gráfica o un gráfico, por ejemplo) de un análisis de las imágenes. De forma similar, el ordenador 300 puede ser capaz de enumerar el número de células de un tipo específico en un volumen de sangre particular o enumerar el número de células dañadas, células cancerosas o células lisadas en un volumen de sangre particular. La memoria del ordenador puede contener programa informático para permitir que el ordenador realice el proceso de análisis. El ordenador puede usar uno o más aumentos durante el análisis. Si bien el ejemplo anterior describe el uso de un modo de realización de la invención para preparar y analizar células de una muestra de sangre, los modos de realización de la presente invención se pueden usar para preparar y analizar células de otros fluidos tales como médula ósea, orina, tejido vaginal, tejido epitelial, tumores, semen, saliva y/u otros líquidos corporales.

Aunque se muestra como un componente, el ordenador 300 puede comprender múltiples ordenadores y se podría usar un primer ordenador para controlar los componentes y se podría usar un segundo ordenador para procesar las imágenes del dispositivo receptor de luz 200. En algunos modos de realización, los diversos ordenadores se pueden vincular para permitir que los ordenadores compartan información. El ordenador 300 también se puede conectar a una red o sistema de información del laboratorio para permitir que el ordenador envíe y reciba información de otros ordenadores.

El aplicador 400

En determinados modos de realización, el aplicador 400 puede comprender una jeringa, un pipeteador manual o accionado por motor 305, o una bomba controlada por motor sujeta a través de un tubo a la punta del aplicador 405. Si bien se pueden usar muchos tipos diferentes de pipetas o jeringas, los resultados de las pruebas han mostrado que se pueden obtener mejores resultados mediante el uso de un aplicador 400 que tiene una exactitud superior al 2 %. La bomba puede ser una bomba peristáltica, una bomba de jeringa u otro dispositivo similar que permita aspirar y dosificar a través de un orificio pequeños volúmenes de muestras de fluido que contienen células. Típicamente, dicho orificio estará contenido en una punta 405 que tiene de dos a cinco milímetros de diámetro exterior con un diámetro interior de 0,5 milímetros. La punta 405 puede ser desechable o lavable. La punta 405 puede ser redondeada para facilitar la inserción y limpieza de la punta. El flujo de fluido a través de la punta se controla para permitir que se deposite sobre el portaobjetos una capa delgada de líquido corporal que contiene células. Optimizando el caudal a través de la punta y la velocidad relativa y la altura de la punta sobre el portaobjetos, se puede depositar una densidad apropiada de células en el portaobjetos. Cada uno de estos factores influye en el otro, por lo que se debe determinar la combinación apropiada de altura, caudal a través de la punta y velocidad sobre el portaobjetos. En un modo de realización, el caudal a través de la punta es de 0,1 microlitros por segundo mientras que la punta se mueve a una velocidad de 30 milímetros por segundo sobre la superficie del portaobjetos a una altura de aproximadamente 70 micrómetros. En otro modo de realización, por ejemplo, cuando el líquido corporal comprende sangre sin diluir, el caudal a través de la punta es de aproximadamente 0,04 microlitros por segundo mientras que la punta se mueve a una velocidad con respecto a un punto del portaobjetos de 50 milímetros por segundo a una altura de aproximadamente 10 micrómetros por encima de la superficie del portaobjetos. La viscosidad y la consistencia de la muestra de líquido corporal particular influirán en el caudal a través de la punta y la velocidad relativa y la altura de la punta sobre el portaobjetos requeridos para garantizar que se deposite una densidad apropiada de células en el portaobjetos para su examen.

En uso, el aplicador 400 puede comprender un volumen conocido de líquido corporal tal como 30 microlitros (ul). Es posible que sea necesario preprocesar algunos líquidos corporales para dispersar las células que pueden estar agrupadas o para minimizar la mucosa u otro material proteico que puede hacer que las células se peguen entre sí. Es posible que sea necesario concentrar otros líquidos corporales, tal como la orina, antes de colocar el líquido corporal en el aplicador. El aplicador puede mezclar este fluido con una tinción o un diluyente, y expulsar una parte de este fluido sobre el aparato portaobjetos 700 (en particular la zona de muestra 710, fig. 3). Una submuestra típica sería una alícuota de aproximadamente 1/2 |jl a 2 jl, pero puede estar en el intervalo de 1/10 a 10 jl. En algunos modos de realización, el sistema 10 o el aplicador 400 pueden contener un primer depósito 420 para almacenar el líquido corporal y un segundo depósito 430 para almacenar el diluyente. En algunos ejemplos que no forman parte de la invención, el líquido corporal no se diluirá.

El sistema 10 o el aplicador 400 pueden contener uno o más dosificadores 800. El dosificador 800 (o 450 en la fig. 1B) se puede usar para dirigir un fijador o una tinción sobre el portaobjetos 701. En este modo de realización, el aplicador 400 puede contener una o más cámaras de fluido 410 para expulsar líquido corporal, diluyente, tinción y fijador del aplicador 400. Algunos dosificadores pueden 340 almacenar tanto el fijador como la tinción, y dirigirlos secuencialmente sobre el portaobjetos, o en modos de realización alternativos se pueden usar dos dosificadores (uno para el fijador y otro para la tinción). El exceso de tinción y fijador se puede retirar del portaobjetos inclinando el aparato portaobjetos de modo que quede ortogonal (o en ángulo) a la superficie de la plataforma 101. Se puede usar un inclinador de portaobjetos 801 para este propósito. El inclinador de portaobjetos puede comprender una cuña simple como se muestra, o puede comprender un brazo mecánico para inclinar el portaobjetos.

En el modo de realización mostrado en la fig. 1A, el dosificador de tinción está sujeto a la plataforma 100. Los ejemplos de tinciones compatibles con el modo de realización que se muestra en la Figura 1A pueden incluir: tinción de Wright-Giemsa, tinciones de Giemsa y tinciones de Romanowsky. Otras soluciones que se pueden dosificar son fijadores (metanol) y soluciones tampón. También se pueden usar otros procedimientos de visualización que implican reactivos inmunocitoquímicos u otros marcadores de componentes celulares específicos. El dosificador de tinción también se puede realizar como un depósito de tinción 450 y sujeto al aplicador 400 (véase la fig.1B). Los ejemplos de tinciones compatibles con el modo de realización que se muestra en la Figura 1B pueden incluir: Tinciones de Romanowsky, tinciones de reticulocitos y tinciones que usan anticuerpos específicos. Se pueden usar tinciones adicionales con modos de realización de la invención que incluyen hematoxilina y eosina; tinciones inmunocitoquímicas; tinciones histoquímicas para visualizar los componentes celulares; y tinciones de anticuerpos, aptámeros u otras basadas en la unión de un ligando a un antígeno. En el modo de realización que tiene un dosificador 800, el dosificador puede dosificar la tinción sobre el aparato portaobjetos (en particular, la zona de muestra 710). El dosificador 800 puede adoptar la forma de una bomba peristáltica. En el modo de realización que tiene un depósito de tinción 450, la tinción se puede mezclar con el líquido corporal y el diluyente de los depósitos 420 y 430. El líquido corporal y el diluyente se pueden mezclar mediante un mezclador 440, que puede mezclar el fluido y el diluyente en determinadas proporciones. En un modo de realización alternativo, el portaobjetos se podría sumergir en uno o más baños de las soluciones de fijación y tinción. En otro modo de realización, las soluciones de fijación y tinción se podrían mover por el portaobjetos usando acción capilar.

Se pueden usar diversos fijadores y diluyentes con la presente invención. Por ejemplo, se puede usar metanol al 85 % como fijador. Para algunas tinciones se puede usar un fijador a base de alcohol etílico o formaldehído. Los diluyentes útiles para diluir sangre entera, por ejemplo, pueden incluir soluciones salinas o soluciones proteicas. Las soluciones salinas varían desde "solución salina fisiológica" (0,9 N), hasta mezclas complejas de sales, hasta la preparación comercial Plasmalyte que simula prácticamente todas las sales que se encuentran en el suero sanguíneo humano. Las soluciones proteicas pueden variar desde soluciones simples de albúmina bovina hasta Plasmanato, una preparación comercial con proteínas plasmáticas humanas seleccionadas. Dichas preparaciones pueden variar en concentraciones de proteínas, tampones, pH, osmolalidad, capacidad tamponadora y aditivos de diversos tipos. También se pueden usar versiones sintéticas o "sustitutas" de estas soluciones, incluyendo Ficoll o Dextran u otros polisacáridos. Se pueden usar otros sustitutos. Un ejemplo de un diluyente es Plasmalyte más Plasmanato en la proporción de 4:1 (Plasmalyte: Plasmanato). Otro ejemplo de un diluyente es albúmina al 5 %. Al analizar sangre entera, se puede usar una dilución de 2 partes de sangre por 1 parte de diluyente, donde el diluyente es una solución fisiológicamente compatible, pero se puede usar un intervalo de dilución de 0:1 (sin dilución) a 10:1 (diluyente:sangre) en modos de realización alternativos.

Los modos de realización de la presente invención también se pueden usar con muestras de líquidos corporales que requieren concentración antes de aplicar flujos de células de dichas muestras de fluidos a un portaobjetos. Por ejemplo, los líquidos corporales tales como la orina pueden requerir concentración para garantizar que los flujos de células colocados en el portaobjetos contengan cantidades suficientes de células en el portaobjetos para su análisis. Las muestras de fluidos se pueden concentrar mediante técnicas tales como centrifugación, filtración o el uso de tubos de concentración de células.

El aplicador puede comprender un pistón hidráulico para empujar el fluido fuera de la cámara de fluido 410 (como una jeringa o una pipeta). Se puede proporcionar una punta 405 para ajustar el caudal del fluido. Si bien el tamaño de la punta no afecta la velocidad (ul/s) a la que la solución fluye fuera de la punta, en general, cuanto más pequeña es la abertura en la punta, mayor es la fuerza generada por el fluido que fluye desde la punta. Adicionalmente, el tamaño de la punta afecta el grosor de los flujos de fluido 750 que se muestran en las fig. 2 y 3. Una punta que tiene un diámetro interior de 0,3 milímetros puede proporcionar un caudal de 0,1 microlitros por segundo, y la distancia desde un punto medio 751 del primer flujo hasta el punto medio 752 del segundo flujo puede ser de 500 micrómetros. Para crear los flujos 750 mostrados en las fig. 2 y 3, el sistema 10 se puede configurar para tener en cuenta las variaciones en el número de células en una muestra de líquido corporal dada. Por ejemplo, en muestras de sangre periférica humana, el intervalo es grande pero dentro de un orden de magnitud. Para contar con exactitud los glóbulos sanguíneos, se debe minimizar la superposición entre los hematíes. Un procedimiento para proporcionar una superposición mínima entre las células es colocar filas de células que no se toquen desde la punta del aplicador. El incremento de la viscosidad del líquido diluido o el tipo o la cantidad de diluyente pueden afectar al ancho de las posiciones de asentamiento final de los flujos 750. Al seleccionar una distancia entre filas para permitir la variación típica de las muestras de sangre, todas las células se pueden contar en todas las muestras. Para muchas muestras, estos huecos se verán entre los flujos; sin embargo, esto no afecta el análisis de la imagen y el efecto de filas y huecos tiende a pasar desapercibido durante la revisión manual de gran aumento bajo el microscopio. Para evitar estos huecos, se podría sujetar un dispositivo receptor de luz al aplicador o colocarlo cerca de la estación A (véase la fig. 7A) para permitir que el ordenador 300 determine el ancho del primer flujo 751 (fig. 3) formado dirigiendo las células en el portaobjetos. Al determinar el ancho del flujo, es decir, hasta dónde fluye la sangre lateralmente desde la localización donde se colocó el fluido en el portaobjetos, el ordenador 300 podría hacer que el aplicador ajustara el tamaño del hueco entre los flujos. El ordenador 300 calcula la distancia que debe estar el segundo flujo 752 (fig. 3) desde el primer flujo 751, y coloca los flujos de manera que se asienten contiguos entre sí minimizando la formación de cualquier hueco entre los flujos. Usando este proceso, se puede aplicar un flujo de células contiguo o sin huecos a la zona de muestra 710.

Para colocar físicamente las células en el portaobjetos 701, el ordenador 300 podría dirigir el controlador del aplicador 490 para que realice el proceso de aplicación de líquidos corporales 7B (véase la fig.7B) que implica mover la cámara de líquidos corporales 410 en las direcciones X, Y o Z para colocar la punta 405 de modo que esté rastreando las localizaciones eventuales de los flujos 750. En algunos modos de realización, dos de las direcciones se pueden mantener fijas, de modo que la punta 405 se mueva en una trayectoria relativamente recta en relación con el portaobjetos 701. En otros modos de realización, una de las direcciones se puede mantener fija. En otros modos de realización, el sistema mueve el portaobjetos 701 en las direcciones X, Y o Z para colocar el portaobjetos debajo de la punta 405 y mover el portaobjetos mientras la punta 405 aplica flujos de células de líquido corporal en el portaobjetos.

El ordenador 300 puede estar conectado con el controlador del aplicador 490 para controlar este movimiento. En el modo de realización mostrado en la fig. 3, el controlador puede colocar la punta en la esquina superior izquierda de la zona de muestra 710 y proceder a colocar la muestra de fluido sobre el portaobjetos dosificando el fluido desde la cámara de fluido 410. A medida que la punta dosifica fluido, el controlador 490 puede mover la punta en la dirección X positiva hacia la parte superior derecha de la zona de muestra 710 (véase la fig. 3). Una vez que se alcanza la sección superior derecha, el controlador 490 puede mover la punta en la dirección Y negativa en un ancho de flujo. El ancho del flujo 750 puede variar desde 300 hasta 1000 micrómetros, y el grosor del flujo incrementa a medida que incrementa el caudal de fluido que sale de la punta y/o disminuye la velocidad de la punta a través del portaobjetos. Adicionalmente, la viscosidad del fluido y la elección del diluyente pueden afectar el ancho del flujo 750 (fig. 3). Típicamente, las células del fluido se asentarán en unos pocos segundos una vez colocadas en el portaobjetos. Una vez que la punta se ha movido en un ancho de flujo, el controlador puede mover la punta en la dirección X negativa hacia el lado más a la izquierda de la zona de muestra 710. Una vez que se alcanza el lado más a la izquierda, la punta nuevamente se puede mover en un ancho de flujo en la dirección Y negativa. Este proceso se puede repetir hasta que se cubra toda la zona de muestra o hasta que se haya dosificado una cantidad específica de líquido corporal en el portaobjetos, tal como un microlitro. En modos de realización alternativos, el líquido corporal diluido se podría aplicar al portaobjetos con un aplicador fijo y portaobjetos que se mueve por medio del controlador de portaobjetos móvil 760 (este proceso de aplicación 7A se muestra en la fig. 7A). El controlador de portaobjetos 760 se puede mover en la dirección X, Y, Z para mover el aparato portaobjetos en posiciones similares para permitir que el aplicador coloque flujos 750 de líquido corporal en la zona de muestra 710.

El número de células colocadas en el portaobjetos 701 usando este procedimiento variará dependiendo del tipo de líquido corporal que se esté examinando y la proporción de dilución. Suponiendo que se analizara sangre entera con una proporción de 1:3 (sangre:diluyente), se colocarían en el portaobjetos alrededor de 900.000 hematíes, 45.000 plaquetas y 1.000 leucocitos. Aunque la fig. 3 muestra la generación de una muestra de fluido distribuida uniformemente con conformación rectangular, se pueden construir otras conformaciones de manera similar. La fig. 4 muestra en un ejemplo que no forma parte de la invención un flujo de fluido que comprende una pluralidad de círculos concéntricos. Como en la fig. 3, los flujos de fluido 750 se colocan contiguos entre sí para crear un campo de visualización uniforme. Este proceso proporciona una distribución altamente uniforme de células en la zona de muestra 710, lo que facilita el proceso de análisis. Adicionalmente, el ordenador 300 puede alterar la apariencia y el ancho del fluido en la zona 710. Por ejemplo, el ordenador 300 puede controlar la velocidad a la que la punta se mueve a través de la zona de muestra, lo que afectaría al grosor del fluido que descansa sobre la zona. En algunos modos de realización, se pueden seleccionar velocidades de 10 a 100 mm/s para proporcionar a la zona una muestra de aproximadamente una célula de grosor. El controlador 490 también puede seleccionar la altura de la punta por encima del portaobjetos 700. Se puede usar una altura de 70 /- 40 micrómetros por encima del portaobjetos para minimizar el daño a las células de fluido cuando entran en contacto con el aparato portaobjetos 700 y para mantener el flujo de fluido desde la punta al sustrato.

El dispositivo de movimiento de gas 500

El dispositivo de movimiento de gas 500 puede comprender un ventilador (tal como se muestra en la fig. 1) o puede comprender otros dispositivos de movimiento de gas tales como un compresor o un fuelle, por ejemplo. El dispositivo de movimiento de gas 500 puede estar conectado directamente al ordenador 300 o puede estar conectado a través de otro componente tal como la plataforma 100 o el aplicador 400 (como se muestra). El dispositivo de movimiento de gas empuja el gas (en algunos casos, aire atmosférico) a lo largo del portaobjetos para controlar la velocidad a la que se seca el portaobjetos. Mover demasiado aire demasiado rápido (es decir, una velocidad demasiado alta del ventilador) a lo largo del portaobjetos puede provocar que las células en la muestra estallen debido al secado excesivamente rápido, y demasiado poco aire demasiado lento (es decir, una velocidad del ventilador demasiado baja) a lo largo del portaobjetos puede provocar que las células se sequen demasiado lentamente y parezcan encoger. El ordenador 300 puede seleccionar la cantidad de aire que se mueve a través del portaobjetos en un período de tiempo (es decir, los pies cúbicos de aire por segundo) en base a la distancia entre el dispositivo de movimiento de gas y el portaobjetos, el tipo de fluido que se analiza, la humedad relativa, el ancho de los flujos y el grosor promedio de los flujos (esta sería la cantidad de células en cada flujo en la dirección Z). El dispositivo de movimiento de gas 500 se puede colocar cerca del aparato portaobjetos 700, y colocar de modo que el dispositivo dirija el gas para que golpee el portaobjetos en un ángulo de 30-60° (se pueden usar 45° grados) durante un período de aproximadamente 15 a 20 segundos. En algunos modos de realización, el ordenador puede controlar la configuración de humedad y temperatura en las proximidades del sistema para permitir que el proceso de secado se produzca sin el uso de un dispositivo de movimiento de gas 500.

El dispositivo de emisión de luz 600

Se ilustran dos modos de realización diferentes del dispositivo de emisión de luz 600. En la fig. 1A, el dispositivo de emisión de luz 600 comprende una carcasa 601, una fuente de luz de múltiples espectros 610, un número de filtros de luz 620, 620' y 620" y un selector de filtro 621. Como se muestra en la fig. 1A, se ha retirado una parte de la carcasa para mostrar mejor la fuente de luz 610. La fuente de luz 610 puede comprender una fuente de luz blanca u otra fuente de luz de múltiples espectros tal como una bombilla halógena, 490 una bombilla fluorescente o una bombilla incandescente, etc. Se pueden usar filtros 620-620" para filtrar la luz de múltiples espectros en una única longitud de onda o una banda estrecha de longitudes de onda. El selector de filtro 621 puede seleccionar qué filtros aparecen delante de la fuente de luz 610. En algunos modos de realización, se puede usar más de un filtro para permitir que un intervalo particular de luz ilumine el portaobjetos. El selector de filtro 621 puede comprender un motor de rotación y una varilla para hacer girar los filtros dentro y 495 fuera de la trayectoria de la luz. En un segundo modo de realización, la fuente de luz puede comprender uno o más láseres o LED (630) que emiten una banda estrecha de luz (véase la fig. 1B). Una ventaja de usar LED en este sistema 10, es que los LED se pueden encender y apagar rápidamente, permitiendo que el dispositivo receptor de luz, por ejemplo una única cámara en blanco y negro, adquiera múltiples imágenes espectrales en un tiempo muy corto. Los LED también producen anchos de banda de iluminación estrechos, típicamente de 15 a 30 nm de ancho completo a la mitad del máximo (la amplitud de la distribución de intensidad de longitud de onda a la mitad del brillo máximo de la intensidad máxima). Además, los LED en el intervalo visible no proyectan energía infrarroja productora de calor en el sistema óptico y tienen una vida relativamente larga en comparación con las lámparas convencionales. Una ventaja de usar iluminación de banda estrecha en lugar de luz blanca sin filtrar (es decir, iluminación de banda ancha) es que usar iluminación de banda estrecha incrementa la nitidez de las imágenes generadas por el dispositivo receptor de luz 200. Si el dispositivo receptor de luz 200 contiene una lente, la presencia de la lente puede provocar alguna anomalía cromática que dé como resultado ligeros desplazamientos de enfoque o degradación de la calidad de la imagen cuando se usan diferentes colores. Con iluminación de luz blanca, esto puede dar como resultado una degradación general de la calidad de la imagen. El dispositivo receptor de luz 200 puede capturar una imagen en blanco y negro para cada banda estrecha de iluminación. El ordenador 300 puede corregir el enfoque y la calidad de imagen para cada longitud de onda ajustando la distancia focal o la distancia de la lente hasta el portaobjetos. En algunos modos de realización, el ordenador 300 puede desplazar la posición de enfoque de la lente mientras se emiten secuencialmente un número de colores claros para mejorar la calidad de la imagen.

El dispositivo de emisión de luz 600 puede dirigir diversas longitudes de onda de luz. Se pueden dirigir de dos a ocho o más longitudes de onda de luz diferentes al aparato portaobjetos 700. Por ejemplo, longitudes de onda de aproximadamente 405-430 nm son útiles para formar una imagen de solo hemoglobina para evaluar la morfología de los hematíes y el contenido de hemoglobina. El uso de una imagen tomada con dicha longitud de onda diseñada para mostrar solo hematíes también puede mostrar hematíes que están en contacto con leucocitos. Los hematíes en contacto se pueden retirar digitalmente de las imágenes para facilitar que el ordenador detecte los bordes de los leucocitos para realizar mediciones y enumeraciones celulares más exactas. La luz emitida a 570 nm puede ser útil para proporcionar imágenes de alto contraste de las plaquetas y los núcleos. Se pueden elegir otras longitudes de onda para distinguir mejor los colores de basófilos, monocitos, linfocitos (todos con tonos de azul), eosinófilos (rojo) y neutrófilos (color neutro). Para el recuento de plaquetas, por ejemplo, se pueden usar dos colores de iluminación (tal como 430 nm y 570 nm). Se puede obtener una imagen de alto contraste restando la imagen de 430 nm de la imagen de 570 nm. La luz que tiene una longitud de onda de 430, 500, 525 o 600 es en particular eficaz para mostrar información sobre el color de la célula, aunque el dispositivo de emisión de luz puede usar luz en longitudes de onda entre 400 nm y 700 nm inclusive. Estas longitudes de onda también se usarán para la visualización de las imágenes en color, si corresponde. De otro modo, es posible que sea necesario tomar una o dos imágenes adicionales para las 200+ células que se analizarán para el recuento diferencial y que se pueden mostrar en la pantalla 320. Típicamente, las imágenes de banda estrecha se elegirán en el intervalo de 400 nm a 750 nm. Los resultados de las pruebas han mostrado que funcionan bien de dos a ocho colores de luz separados, siendo óptimos de tres a cuatro colores de luz separados. El ordenador 300 puede refinar aún más las imágenes compensando los desplazamientos espaciales. Además, el ordenador puede combinar las diversas imágenes de colores para generar imágenes de múltiples colores para su visualización o análisis. Se pueden usar descriptores numéricos de las imágenes individuales o imágenes combinadas para determinar los rasgos característicos espaciales, densitométricos, colorimétricos y de textura de las células para la clasificación de los tipos de células. Otra ventaja de usar iluminación de banda estrecha es que la iluminación de banda estrecha permite eliminar el uso de objetivos de aceite o cubreobjetos. La luz se refracta cuando la luz pasa del vidrio al aire. Los sistemas de la técnica anterior han usado objetivos de aceite o cubreobjetos para minimizar esta refracción en las transiciones de aire a vidrio, pero tener que agregar aceite o cubreobjetos añade etapas al procesamiento de los portaobjetos e incrementa el tiempo de preparación por portaobjetos y el coste del análisis. Para superar esta carencia de los sistemas de la técnica anterior, se puede usar una combinación de LED de banda estrecha o luz filtrada sin la necesidad de usar cubreobjetos o aceite. Reducir la variación o el ancho de banda en las longitudes de onda de la luz disminuye la distorsión en la imagen capturada por el dispositivo receptor de luz 200 cuando la luz pasa a través del portaobjetos 701. El ordenador 300 también puede indicar al dispositivo de emisión de luz 600 que enfoque la luz de la fuente de luz (610 o bien 630) de modo que la luz se enfoque apropiadamente en el portaobjetos. Para hacer esto, el ordenador 300 puede indicar a un ajustador de enfoque que optimice el enfoque para cada color de luz.

El aparato portaobjetos 700

Las figuras 1A, 2 y 3 ilustran un modo de realización del aparato portaobjetos 700 que comprende un portaobjetos 701, una zona de muestra 710, un marco de portaobjetos 720 y un soporte de portaobjetos 730. Sin embargo, otros 555 modos de realización de la invención pueden no requerir el uso de un soporte de portaobjetos 730 o un marco de portaobjetos 720. Adicionalmente, la marca delimitadora de la zona de muestra 710 también es opcional y puede comprender uno o más anillos hidrófobos u otras marcas pintadas. Estos anillos pueden ayudar a contener la muestra de sangre y también facilitan la revisión de las imágenes de los portaobjetos al localizar rápidamente la zona de muestra cuando se observa un portaobjetos manualmente bajo un microscopio (también pueden ayudar en el proceso de análisis a interpretar la imagen). Los anillos también pueden ayudar a facilitar la transferencia de la tinción a los portaobjetos. Adicionalmente, aunque la zona de muestra se ha ilustrado como un rectángulo, se pueden usar otras conformaciones, tales como un círculo o un triángulo. Se pueden usar zonas de muestra de diferentes tamaños, incluyendo zonas que tienen un área total de medio a tres centímetros cuadrados. El portaobjetos 701 puede estar fabricado de vidrio o plástico y puede tener 1 pulgada de alto por 3 pulgadas de ancho por 1 mm de grosor. También se muestra en las fig. 2 y 3 una muestra de fluido dispersa en el portaobjetos en flujos 750. El fluido se puede dispersar en flujos como se muestra en la fig. 3, o, en un ejemplo que no forma parte de la invención, en un patrón en espiral como se muestra en la fig. 4.

El dispositivo de descarga 900

Con referencia a la fig. 1B, el sistema puede comprender un dispositivo de descarga 900 para pretratar el portaobjetos 701. El dispositivo de descarga puede adoptar la forma de un dispositivo de descarga de corona. El dispositivo de descarga 900 puede limpiar el portaobjetos 701 creando un calor de alta intensidad para quemar pequeñas partículas para limpiar el portaobjetos y crear una superficie hidrófila. Electro-Technic Products, Sawicki, ^pA, hace un dispositivo de descarga de corona compatible con los modos de realización de la presente invención. Para realizar el pretratamiento, el ordenador 300 encendería el dispositivo de descarga 900 y haría que el controlador del aparato portaobjetos 760 mueva el portaobjetos en un movimiento en espiral o de ráster durante aproximadamente 15 segundos (aunque se podría usar un intervalo de 1-20 segundos). El dispositivo de descarga se puede colocar en un ángulo con respecto al portaobjetos, o se puede colocar directamente encima del portaobjetos. Típicamente, el dispositivo de descarga 900 se puede colocar aproximadamente de 10 a 20 mm por encima del portaobjetos.

La marcadora de portaobjetos 1000 y el lector de marcado de portaobjetos 1100

El sistema 10 puede incluir opcionalmente una marcadora de portaobjetos 1000 y opcionalmente un lector de marcado de portaobjetos 1100. El lector de marcado de portaobjetos 1000 puede estar situado en la plataforma 100 cerca del alimentador 102 como se muestra en las fig. 1A y 1B o puede ser independiente o sujeto a otros componentes. La marcadora de portaobjetos 1000 puede colocar un marcador en el portaobjetos. Un marcador 770 puede incluir elementos tales como pegatinas, códigos de barras, marcas RFID, marcas EAS u otro tipo de marcado en el portaobjetos. La fig. 3 muestra un portaobjetos ejemplar que tiene un marcador de código de barras UPC, pero se pueden usar otras convenciones de marcado. Además, las marcas se pueden aplicar directamente al portaobjetos por medio de pintura o tinta, o se pueden pegar al portaobjetos usando un medio de escritura y un adhesivo (por ejemplo, una pegatina). El sistema 10 puede comprender un lector de marcado de portaobjetos 1100. El lector de marcado de portaobjetos 1100 puede leer las marcas colocadas en el portaobjetos desde la marcadora de portaobjetos 1000 o por marcadoras externas al sistema. El lector de marcado de portaobjetos 1100 podría comprender un interrogador, un lector de códigos de barras u otro dispositivo óptico. En algunos modos de realización, el sistema 10 puede ser capaz de determinar información de los marcadores 770 sin un lector de marcado de portaobjetos 1100 usando el dispositivo receptor de luz 200 para capturar una imagen del marcador 770. El ordenador 300 o el dispositivo receptor de luz (si contiene un procesador y una memoria) podría realizar el procesamiento de imágenes en la imagen que contiene el marcador y determinar la información sobre el marcador 770.

Médula ósea

Como se analiza anteriormente, la presente invención se puede usar para analizar sangre periférica o entera. Sin embargo, la invención también se puede usar para estudiar glóbulos sanguíneos en diversos tipos de fluidos que comprenden médula ósea, orina, tejido vaginal, tejido epitelial, tumores, semen, saliva y otros líquidos corporales. Por ejemplo, los procedimientos de preparación y las técnicas de análisis descritos aquí también se pueden aplicar a muestras de aspiración de médula ósea. Las muestras de médula ósea tienen una densidad celular más alta y contienen muchos tipos de hematíes y leucocitos inmaduros que rara vez se encuentran en la sangre periférica. La técnica de preparar una capa delgada de células, teñir con una tinción de Romanowsky y analizar con análisis de imágenes también se puede aplicar a los aspirados de médula ósea; sin embargo, puede ser necesario un análisis de imágenes más sofisticado para distinguir los tipos adicionales de células. Al igual que con las muestras de sangre periférica, las muestras de médula ósea se pueden recolectar en un recipiente con un anticoagulante. Este anticoagulante puede ser EDTA o heparina. Se puede añadir líquido de dilución o conservación adicional a la muestra. En el instrumento descrito aquí, se prepararía una muestra de médula ósea agitando primero la muestra para proporcionar un mezclado exhaustivo. Debido a la densidad celular incierta de dichas muestras, se pueden preparar una o más diluciones y pipetearse sobre el portaobjetos o los portaobjetos. En un modo de realización, se puede usar un proceso de triple dilución para crear tres muestras. Se puede crear una primera muestra añadiendo 2 partes de diluyente a una parte de médula ósea. A continuación, la primera muestra se puede dosificar sobre una primera parte de la zona de muestra 710 del portaobjetos 701. Se puede crear una segunda muestra añadiendo cuatro partes de diluyente a la médula ósea. A continuación, la segunda muestra se puede dosificar en una segunda parte de la zona de muestra 710 del portaobjetos 701. Se puede crear una tercera muestra añadiendo ocho partes de diluyente a la médula. A continuación, la tercera se puede dosificar sobre una tercera parte de la zona de muestra 710 del portaobjetos 701.

De acuerdo con la invención, el sistema 10 está provisto de un mecanismo de dilución en serie. En un modo de realización de este proceso, el aplicador 400 puede dirigir uno o más flujos de células sobre un portaobjetos 701. El dispositivo receptor de luz 200 puede capturar una imagen de los flujos de células, y el ordenador 300 puede determinar si los flujos están suficientemente diluidos para formar una monocapa de células en el portaobjetos, realizando un recuento exacto de un tipo de célula en particular o capturando imágenes que permiten evaluar la morfología celular. Si los flujos no están suficientemente diluidos, el ordenador puede indicar al mezclador 440 que diluya más el líquido corporal. A continuación, el aplicador 400 puede aplicar un flujo de células más diluido al portaobjetos 701, para que el dispositivo receptor de luz 200 puede formar imágenes. El ordenador 300 puede determinar de nuevo si los flujos están suficientemente diluidos para formar una monocapa, contar o evaluar la morfología y, en caso contrario, el sistema 10 puede indicar al mezclador 440 que diluya más el líquido corporal. Este proceso se puede repetir hasta que se cree una muestra de líquido corporal suficientemente diluida. En algunos modos de realización, el aplicador 400 aplicará flujos de células en todo el portaobjetos antes de que el dispositivo receptor de luz 200 forme imágenes de las células. En otros modos de realización, se puede aplicar un subconjunto de flujos de células (por ejemplo, 3-10) antes de formarse imágenes de los flujos de células. En algunos modos de realización, el ordenador 300 puede analizar la imagen capturada del flujo de células y determinar una cantidad aproximada de diluyente necesaria para diluir el líquido corporal de modo que los flujos posteriores de células se puedan contar cuando se formen imágenes. En otros modos de realización, el sistema 10 puede contener intervalos de dilución predeterminados para aplicar si el sistema determina que la proporción de dilución actual no es suficiente (es decir, si los flujos no están suficientemente diluidos, probar 1:1 (diluyente:líquido corporal). Si 1:1 es demasiado bajo y los flujos aún no están suficientemente diluidos, probar con 2:1 (diluyente:líquido corporal), etc.) En algunos modos de realización, un usuario del sistema puede seleccionar por medio de una entrada de usuario intervalos de dilución específicos para el líquido corporal tales como sin diluyente, 3:2 (diluyente:líquido corporal); 4:1; u 8:1. En algunos modos de realización, el aplicador 400 puede colocar un primer grupo de flujos de células sobre un portaobjetos; un segundo grupo de flujos de células sobre el portaobjetos; un tercer grupo de flujos de células sobre el portaobjetos, etc.; en el que cada grupo de flujos de células tiene una proporción de diluyente a líquido corporal diferente. De forma alternativa, el aplicador 400 puede aplicar un primer grupo de flujos de células sobre un primer portaobjetos; un 650 segundo grupo de flujos de células sobre un segundo portaobjetos; un tercer grupo de flujos de células sobre un tercer portaobjetos, etc; en el que cada grupo de flujos de células tiene una proporción de diluyente a líquido corporal diferente. Finalmente, aunque se contempla que el proceso de dilución en serie anterior sea especialmente útil para líquidos corporales viscosos tal como la médula ósea, este proceso se puede usar también para líquidos corporales menos viscosos tales como la sangre periférica o el semen. Para el análisis de la imagen, una evaluación de bajo aumento del área celular en el portaobjetos podría elegir el tercio óptimo para el análisis posterior. Una vez que se selecciona el área apropiada del portaobjetos, se medirían 200+ células de la médula ósea para determinar el recuento diferencial.

Reticulocitos

El sistema 10 también puede contar el número de reticulocitos en una muestra de sangre. Usando una tinción de Romanowsky para marcar el ARN, el ordenador 300 puede contar el número de reticulocitos presentes en la muestra. Cuando se usa una tinción de Romanowsky, los reticulocitos aparecen un poco más azules que otros hematíes y, normalmente, son un poco más grandes. El ordenador 300 puede usar su proceso de análisis (16A o 17B, de las fig. 7A y 7B) para cuantificar el componente azul de los hematíes. El proceso de análisis podría medir la densidad óptica integrada de la imagen de diferencia de una célula creada restando una imagen tomada con luz azul de 430 nm (intervalo de 400 a 470 nm) de una imagen tomada con luz no azul de 600 nm (intervalo de 470 a 750 nm). El proceso de análisis podría correlacionar la cantidad de hematíes con un intervalo definido de componente azul integrado con un número de reticulocitos contados manualmente o por procedimientos de flujo usando tinciones especiales. La exactitud del proceso de análisis se puede mejorar aún más si se requiere que el proceso de análisis (16A o 17B) mida el tamaño, la conformación, el color y las características medidas de los objetos celulares. Por ejemplo, el proceso de análisis podría detectar la diferencia entre un hematíe con una plaqueta azulada que se encuentra debajo o encima de un hematíe a diferencia de un verdadero reticulocito. En otros modos de realización, se puede usar una tinción especial para marcar el ARN en las células, y se podría usar un procedimiento de formación de imágenes para detectar la presencia de esta tinción.

Flujos de proceso

Se contemplan modos de realización de la presente invención para procesar múltiples aparatos portaobjetos 700 en una serie interconectada como se muestra en las fig. 1A o 1B, pero también se pueden construir modos de realización que 680 procesan los aparatos portaobjetos 700 en paralelo. Se pueden construir modos de realización que puedan procesar un gran número (por ejemplo, 10-20) de aparatos portaobjetos en serie o en paralelo, o se pueden construir sistemas de menor volumen 10 (que procesan 4-8 portaobjetos a la vez). Los dos párrafos siguientes describen un flujo de proceso de ejemplo para las fig. 1A y 1B, pero los flujos de proceso alternativos son posibles y factibles a través de modos de realización alternativos de la invención. Estos flujos de proceso también se ilustran en las fig. 10 A y 7B. Adicionalmente, son posibles otras configuraciones del sistema y probablemente tendrían diferentes flujos de proceso. Además, aunque las etapas se presentan en una serie, muchas de las etapas se pueden presentar en un orden diferente o realizarse simultáneamente. Finalmente, la mayoría de las siguientes etapas son opcionales y se pueden retirar del flujo de proceso. En el modo de realización mostrado en las fig. 1A y 7A7A, el programa informático almacenado en la memoria del ordenador 300 puede hacer que el ordenador controle el orden, la velocidad y las variables asociadas con los procesos 1A-16A. El proceso puede comenzar con el ordenador 300 enviando una instrucción a la marcadora de portaobjetos 1000 para colocar un marcador 770 en el portaobjetos 701. El proceso de marcado 1A se puede realizar en el alimentador 102 o se puede realizar en la rampa 104 o en el controlador del aparato portaobjetos 760. Para mover el aparato portaobjetos 700 desde el alimentador 102, el ordenador 300 puede enviar una instrucción al alimentador 102 para activar el mecanismo de propulsión del alimentador 103. El ordenador 300 también puede hacer que comience un proceso de alimentador 2A que puede incluir mover el aparato portaobjetos 700 sobre el impulsor 110. El proceso de alimentador puede incluir la utilización del sensor para determinar cuántos portaobjetos existen en el alimentador 102. El ordenador puede hacer que el impulsor 110 inicie un proceso de avance 3A que incluye mover el portaobjetos a la estación de aplicación A, y al controlador del aparato portaobjetos 760 (si existe uno presente). Una vez que el aparato portaobjetos está en el controlador del aparato portaobjetos, el dispositivo de descarga 900 puede pretratar el portaobjetos. El proceso de pretratamiento 4A puede incluir que el controlador de portaobjetos 760 haga rotar o girar el aparato portaobjetos 700 a medida que el dispositivo de descarga quema los residuos del portaobjetos 701. Una vez que se completa el proceso de pretratamiento opcional 4A, puede comenzar el proceso del aplicador 5A. El proceso del aplicador 5A puede comprender hacer que un operario llene el depósito 420 con diluyente y el depósito 430 con líquido corporal. Se pueden usar líquidos corporales tales como orina, tejido vaginal, tejido epitelial, tumores, semen, saliva, sangre periférica, aspirado de médula ósea u otros líquidos corporales. De forma alternativa, los fluidos se pueden aspirar automáticamente del vial de muestra de un paciente. El mezclador 440 puede comenzar el proceso de mezclado 6 A para mezclar el diluyente con el líquido corporal en una determinada proporción, tal como 2:1 (líquido corporal:diluyente) para formar un líquido corporal diluido. Para aplicar el líquido corporal diluido al portaobjetos 701, se puede realizar uno de los dos procesos de aplicación de líquido corporal 7A o 7B (las fig. 7A y 7B, descritas anteriormente junto con el aplicador 400) (pero cualquiera de los procesos se podría usar para ambos modos de realización). Después de que se complete la aplicación, el impulsor 110 puede continuar el proceso de avance moviendo el aparato portaobjetos a una segunda estación B. Una vez que se completa el proceso de aplicación de líquido corporal 7A, puede comenzar el proceso de secado 8A. El proceso de secado puede incluir el uso del dispositivo de movimiento de gas 500 para dirigir el gas sobre el portaobjetos durante un período de tiempo (tal como de 20-30 segundos). Una vez que se seca el portaobjetos, el líquido corporal se puede fijar usando el proceso de fijación 9A. Una vez fijado el líquido corporal, se puede teñir usando el proceso de tinción 7A. Después de teñir el líquido corporal, el exceso de tinción se puede retirar usando un proceso de retirada de tinción 11 A.

El proceso de retirada de tinción 11A puede incluir un proceso de inclinación del portaobjetos en el que el portaobjetos se inclina al menos parcialmente para permitir que la tinción o el fijador se drenen del portaobjetos. Para capturar imágenes de la muestra, el impulsor 110 puede continuar haciendo avanzar el aparato portaobjetos a la estación de formación de imágenes C. En la estación de formación de imágenes C, el sistema puede activar el proceso de iluminación de la muestra 12A y un proceso de formación de imágenes 15A, que usa el dispositivo de emisión de luz 600 y dispositivo receptor de luz 200 respectivamente para iluminar la muestra y capturar imágenes de la muestra iluminada. El ordenador 300 puede dirigir al dispositivo de emisión de luz para aplicar diferentes filtros a la luz para cambiar la longitud de onda de la luz emitida usando el proceso de filtración de luz 13A. De forma alternativa, el proceso de iluminación LED de 13B puede emitir una o más longitudes de onda de luz si un dispositivo de emisión de luz 600 comprende uno o más LED. El desplazador de portaobjetos 201 puede realizar un proceso de movimiento de portaobjetos 14A para colocar el portaobjetos 701 en diversas posiciones direccionales X, Y, Z. Dado que en muchos modos de realización, el aumento de la lente del dispositivo receptor de luz generará un campo de visión que solo contiene una parte del área total de la muestra, el proceso de movimiento de portaobjetos 14^a se puede utilizar para mover la muestra a diferentes posiciones de X, Y que permiten que el dispositivo receptor de luz 200 tome múltiples imágenes 331 para capturar la muestra completa. El desplazador de portaobjetos también puede mover el portaobjetos a múltiples estaciones de formación de imágenes, lo que permite que los dispositivos de recepción de luz tomen imágenes con diversos aumentos. El desplazador de portaobjetos también puede mover el portaobjetos en la dirección Z permitiendo que uno o más dispositivos receptores de luz tomen imágenes con diversos aumentos, posiciones de enfoque y longitudes de onda de luz. El sistema 10 puede usar el lector de marcado 1100 para leer los marcadores en los portaobjetos (usando el proceso de lectura de marcado 16A) o, de forma alternativa, el ordenador puede reconocer símbolos en el marcador usando un programa informático de reconocimiento de imágenes. El dispositivo receptor de luz puede transferir las imágenes al ordenador a través del enlace 11. El ordenador puede guardar las imágenes en la memoria interna y usar su programa informático para analizar las imágenes (usando el proceso de análisis 17A) para contar las células y realizar cálculos sobre los datos resultantes. El programa informático puede generar resultados que incluyen tablas, gráficas o un gráfico de los resultados 332, y puede mostrar las imágenes 331 en la pantalla 320 del ordenador 300.

En la fig. 7B se muestra un segundo flujo de proceso (consultar también la fig. 1B). El proceso puede comenzar con el ordenador 300 enviando una instrucción a la marcadora de portaobjetos 1000 para colocar un marcador 770 en el portaobjetos 701. El proceso de marcado 1B se puede realizar en el alimentador 102 o se puede realizar en la rampa 104 o en el controlador del aparato portaobjetos 760. Para mover el aparato portaobjetos 700 desde el alimentador 102, el ordenador 300 puede enviar una instrucción al alimentador 102 para activar el mecanismo de propulsión del alimentador 103. El ordenador 300 también puede hacer que comience un proceso de alimentador 2B que puede incluir mover el aparato portaobjetos 700 hacia abajo por la rampa 104 hasta el impulsor 110. El proceso de alimentador 2B puede incluir la utilización del sensor para determinar cuántos portaobjetos están en el alimentador 102. El ordenador puede hacer que el impulsor 110 inicie un proceso de avance 3B que incluye mover el portaobjetos a la estación de aplicación A, y al controlador del aparato portaobjetos 760 (si existe uno presente). Una vez que el aparato portaobjetos está en el controlador del aparato portaobjetos 760, el dispositivo de descarga 900 puede pretratar el portaobjetos 701. El proceso de pretratamiento 4B puede incluir que el controlador de portaobjetos 760 haga rotar o girar el aparato portaobjetos 700 a medida que el dispositivo de descarga quema cualquier residuo en el portaobjetos 701. Una vez que se completa el proceso de pretratamiento opcional 4B, puede comenzar el proceso del aplicador 5B. El proceso del aplicador 5B puede comprender hacer que un operario llene el depósito 420 con diluyente y el depósito 430 con líquido corporal. De forma alternativa, los fluidos se pueden aspirar automáticamente del vial de muestra de un paciente. Se pueden usar líquidos corporales tales como sangre periférica o aspirado de médula ósea, aunque se pueden preparar y analizar fluidos que comprenden médula ósea, orina, tejido vaginal, tejido epitelial, tumores, semen, saliva y otros líquidos corporales usando modos de realización de la invención. El aplicador 400 puede contener un tercer depósito para contener la tinción, y quizás un cuarto depósito para contener el fijador (sin embargo, en otros modos de realización, la tinción y el fijador se podrían almacenar en el mismo depósito). El mezclador 440 puede comenzar el proceso de mezclado 6B para mezclar el diluyente con el líquido corporal (y posiblemente la tinción y el fijador) en una determinada proporción, tal como 2:1 (líquido corporal:diluyente) para formar un líquido corporal diluido. En estos modos de realización, el aplicador 400 aplicaría la tinción y o el fijador después de aplicar el líquido corporal al portaobjetos usando el proceso de tinción y el proceso de fijación, respectivamente. Una vez que se seca el portaobjetos, el líquido corporal se puede fijar usando el proceso de fijación 9B. Una vez fijado el líquido corporal, se puede teñir usando el proceso de tinción 7B. Para aplicar el líquido corporal diluido al portaobjetos 701, se puede realizar uno de los dos procesos de aplicación de líquido corporal 7A o 7B (descritos anteriormente junto con el aplicador 400) (pero cualquiera de los procesos se podría usar para ambos modos de realización). Una vez que se completa el proceso de aplicación de líquido corporal 7B, puede comenzar el proceso de secado 8B. El proceso de secado puede incluir el uso del dispositivo de movimiento de gas 500 para dirigir el gas sobre el portaobjetos durante un período de tiempo (tal como de 20-30 segundos). Después de teñir y fijar el líquido corporal, la tinción se puede retirar usando un proceso de retirada de tinción 11B. El proceso de retirada de tinción 11B puede incluir un proceso de inclinación del portaobjetos en el que el portaobjetos se inclina al menos parcialmente para permitir que la tinción o el fijador se drenen del portaobjetos. Para capturar imágenes de la muestra, el impulsor 110 puede continuar haciendo avanzar el aparato portaobjetos a la estación de formación de imágenes C. En la estación de formación de imágenes C, el sistema puede activar el proceso de iluminación de la muestra 12B y un proceso de formación de imágenes 15B, que usa el dispositivo de emisión de luz 600 y dispositivo receptor de luz 200 respectivamente para iluminar la muestra y capturar imágenes de la muestra iluminada. El ordenador 300 puede dirigir la fuente de luz 600 para aplicar una secuencia de luz de banda estrecha sobre el portaobjetos 701 usando el proceso de iluminación LED 13B. De forma alternativa, si se proporciona un dispositivo de emisión de luz 600 con filtros, el ordenador 300 puede dirigir el dispositivo de emisión de luz para que irradie luz y aplique diferentes filtros a la luz para cambiar la longitud de onda de la luz emitida usando un proceso de filtración de luz 13A. Una vez que se iluminan los portaobjetos, el desplazador de portaobjetos 201 puede realizar un proceso de movimiento de portaobjetos 14B para colocar el portaobjetos 701 en diversas posiciones X, Y, Z. Dado que en muchos modos de realización, el aumento de la lente del dispositivo receptor de luz generará un campo de visión que solo contiene una parte del área total de la muestra, el proceso de movimiento de portaobjetos 14B se puede utilizar para mover la muestra a diferentes posiciones de X, Y que permiten que el dispositivo receptor de luz 200 tome múltiples imágenes para capturar la muestra completa. El desplazador de portaobjetos también puede mover el portaobjetos a múltiples estaciones de formación de imágenes, lo que permite que los dispositivos de recepción de luz tomen imágenes con diversos aumentos. El desplazador de portaobjetos también puede mover el portaobjetos en la dirección Z para permitir que el dispositivo receptor de luz tome imágenes con diversos aumentos. El sistema 10 puede usar el lector de marcado 1100 para leer los marcadores en los portaobjetos (usando el proceso de lectura de marcado 16B) o, de forma alternativa, el ordenador puede reconocer símbolos en el marcador usando un programa informático de reconocimiento de imágenes. El dispositivo receptor de luz puede transferir las imágenes al ordenador 805 a través del enlace 11. El ordenador puede guardar las imágenes en la memoria interna y usar su programa informático para analizar las imágenes (usando el proceso de análisis 17B) para contar las células y realizar cálculos sobre los datos resultantes. El programa informático puede generar resultados que incluyen tablas, gráficas o un gráfico de los resultados, y puede mostrar las imágenes 331 o los resultados 332 en la pantalla 320 del ordenador 300.

Resultados de las pruebas

Para determinar la exactitud de este procedimiento, se desarrollaron algoritmos informáticos para contar hematíes y leucocitos a partir de imágenes digitales tomadas de una muestra de fluido que comprende sangre. La Tabla 1 a continuación muestra un sumario de los datos para 34 portaobjetos. Los datos de la "invención" representan recuentos de hematíes y leucocitos de portaobjetos producidos usando el procedimiento descrito anteriormente, y analizados usando algoritmos de recuento de análisis de imágenes. Los datos "Sysmex" representan recuentos de hematíes y leucocitos de un analizador de CBC automatizado comercial "basado en flujo". Téngase en cuenta que las muestras incluyen recuentos de hematíes y leucocitos muy altos y muy bajos, respectivamente.

Tabla 1

Muestra Recuento RBC de la Recuento RBC de Recuento WBC de la Recuento WBC de invención X 106 Sysmex X 106 invención X 103 Sysmex X 103 1 4,97 5,69 5,00 5,64

2 3,66 4,22 5,92 6,99

3 4,32 4,83 4,13 4,00

4 4,00 4,01 3,36 2,91

5 4,27 4,22 9,66 8,48 6 2,83 3,20 8,60 9,25

7 4,46 4,79 5,80 6,40

8 4,04 4,78 4,02 4,63

9 2,98 3,10 10,02 10,16

10 4,88 5,04 6,24 6,44

11 2,95 3,29 7,28 8,43 Muestra Recuento RBC de la Recuento RBC de Recuento WBC de la Recuento WBC de invención X 106 Sysmex X 106 invención X 103 Sysmex X 103

12 4,47 4,97 6,75 7,70

13 2,75 3,01 4,91 4,62

14 4,35 4,73 8,48 9,27

15 3,82 4,16 6,26 6,06

16 3,16 3,50 14,49 14,97

17 3,87 4,22 5,37 4,67

18 3,69 4,04 3,75 3,50

19 4,08 4,51 11,42 11,22

20 3,03 3,26 2,00 1,87

21 3,23 3,49 6,68 6,50

22 4,35 4,63 10,09 9,95

23 2,84 3,03 10,28 11,62

24 3,02 3,27 0,59 0,57

25 2,75 2,87 17,06 16,42

26 2,78 3,01 5,80 5,56

27 2,73 2,90 8,84 8,28

28 2,97 2,98 17,18 17,41

29 3,56 3,75 16,70 16,79

30 2,91 3,16 7,05 7,89

31 3,32 3,55 9,80 9,73

32 3,01 3,29 45,00 44,62

33 4,77 5,24 6,11 6,44

34 4,34 4,57 7,01 6,89

La tabla 1 muestra los datos brutos de los recuentos realizados en 34 viales. Las segunda y tercera columnas muestran los recuentos de hematíes expresados como millones por microlitro de sangre del paciente para el recuento de la invención y el recuento de Sysmex, respectivamente. Las cuarta y quinta columnas muestran los recuentos de leucocitos expresados como miles por microlitro de sangre del paciente para el recuento de la invención y el recuento de Sysmex, respectivamente.

TABLA 2

Vial RBC Sysmex Recuentos RBC RBC a escala WBC Sysmex Recuentos WBC WBC a escala

1 5,69 1241765 4,97 5,64 1250 5,00

2 4,22 915262 3,66 6,99 1481 5,92

3 4,83 1080956 4,32 4,00 1033 4,13

4 4,01 998828 4,00 2,91 840 3,36

5 4,22 1068411 4,27 8,48 2414 9,66

6 3,20 707250 2,83 9,25 2149 8,60

7 4,79 1115913 4,46 6,40 1451 5,80

8 4,78 1010933 4,04 4,63 1006 4,02

9 3,10 744241 2,98 10,16 2504 10,02

10 5,04 1220400 4,88 6,44 1559 6,24 Vial RBC Sysmex Recuentos RBC RBC a escala WBC Sysmex Recuentos WBC WBC a escala

11 3,29 736701 2,95 8,43 1819 7,28

12 4,97 1117506 4,47 7,70 1688 6,75

13 3,01 687645 2,75 4,62 1228 4,91

14 4,73 1086737 4,35 9,27 2120 8,48

15 4,16 955279 3,82 6,06 1564 6,26

16 3,50 789218 3,16 14,97 3622 14,49

17 4,22 967780 3,87 4,67 1343 5,37

18 4,04 922880 3,69 3,50 937 3,75

19 4,51 1019878 4,08 11,22 2855 11,42

20 3,26 757606 3,03 1,87 500 2,00

21 3,49 808679 3,23 6,50 1670 6,68

22 4,63 1086451 4,35 9,95 2522 10,09

23 3,03 709164 2,84 11,62 2571 10,28

24 3,27 753952 3,02 0,57 147 0,59

25 2,87 688731 2,75 16,42 4265 17,06

26 3,01 695059 2,78 5,56 1451 5,80

27 2,90 682449 2,73 8,28 2209 8,84

28 2,98 741274 2,97 17,41 4295 17,18

29 3,75 890278 3,56 16,79 4174 16,70

30 3,16 727660 2,91 7,89 1762 7,05

31 3,55 831027 3,32 9,73 2450 9,80

32 3,29 753365 3,01 44,62 11250 45,00

33 5,24 1193348 4,77 6,44 1527 6,11

34 4,57 1085941 4,34 6,89 1753 7,01

RBC Correlación (RA2) 97,95 % WBC Correlación (RA2) 99,70 %

Tabla 2. La tabla 2 muestra los datos brutos de los recuentos realizados en 34 viales. La 2.a columna da los recuentos RBC de referencia (Sysmex), mientras que la 3.a columna informa de los recuentos automatizados del portaobjetos de microscopio. La 4.a columna ajusta a escala los recuentos a millones de células por microlitro, suponiendo una dilución 1:4. La 5.' - 7.' columna muestran los datos para el recuento WBC. En la parte inferior de la tabla se encuentran los coeficientes de correlación calculados (R cuadrado).

Los datos se obtuvieron de 34 muestras de pacientes durante dos sesiones de preparación de portaobjetos. Los datos son representativos de pacientes típicos, aunque los tubos se seleccionaron de pacientes con una amplia distribución de recuentos de hematíes y leucocitos. La mayoría, si no todas, de las 34 muestras, se obtuvieron a partir de muestras "archivadas" durante el día en el refrigerador, y a continuación extraídas y preparadas en el instrumento al final de la tarde. Una vez extraídos los tubos, se procesaron consecutivamente. Los algoritmos se validaron primero comparando los campos del microscopio contados manualmente con los recuentos automatizados. Existe una alta correlación entre las células contadas manualmente y las células contadas automáticamente.

Se encontró una alta correlación entre los dos procedimientos tanto para el recuento de hematíes como para el recuento de leucocitos (véanse las tablas 1 y 2 y las fig. 5 y 6). El gráfico de la fig. 5 muestra la correlación entre los recuentos de Sysmex y los recuentos automatizados basados en portaobjetos para los hematíes. Los puntos de datos están agrupados estrechamente y forman una línea que indica que los números en el eje vertical (los recuentos de la invención) son similares a los números en el eje horizontal (los recuentos de Sysmex). Típicamente, para dichos datos, se puede calcular un coeficiente de correlación (R cuadrado) para mostrar el grado de concordancia, donde el 100 % sería una concordancia perfecta. Se calculó un valor R cuadrado del 97,95 % para estos datos de hematíes, lo que indica un alto grado de concordancia y similar a lo que podrían mostrar dos instrumentos automatizados diferentes. El gráfico que se muestra en la fig. 6 muestra la correlación entre los recuentos de Sysmex y los recuentos de portaobjetos automatizados para los leucocitos. Los recuentos brutos variaron entre 147 y 11.250 leucocitos por portaobjetos. Se calculó un valor R cuadrado del 99,70 % para estos datos de leucocitos, lo que indica un alto grado de concordancia y similar a lo que podrían mostrar dos instrumentos automatizados diferentes. Esto confirma que el nuevo enfoque para la transferencia cuantitativa de células fue exitoso y que los recuentos de células automatizados a partir de la formación de imágenes por ordenador proporcionaron resultados exactos.

Proceso ejemplar para el cbc y diferencial de leucocitos (wbc):

La siguiente secuencia de etapas se puede realizar en cualquier orden y algunas etapas se pueden omitir o reemplazar por otras etapas.

Etapa 1. Extraer un volumen conocido de sangre de un tubo lleno de sangre de un paciente.

Etapa 2. Diluir la sangre si es necesario. Por ejemplo, se puede usar albúmina al 5 % en agua destilada como diluyente.

Etapa 3. Extender un volumen conocido de sangre o sangre más diluyente sobre un área en un portaobjetos de vidrio para microscopio en una capa delgada. El portaobjetos se puede tratar para producir una superficie hidrófila para extender mejor las células. El portaobjetos se puede tratar para permitir una adherencia óptima de los elementos sanguíneos al portaobjetos.

Etapa 4. Dejar que el portaobjetos se seque al aire o ayudar a secar con aire o calor ligero.

Etapa 5. Capturar una imagen sin un cubreobjetos usando un objetivo "seco" que esté corregido para un cubreobjetos, por ejemplo, se puede usar un objetivo de 10x o 20x acoplado a una cámara CCD. Determinar el recuento en cada trama de imagen que incluye hematíes (RBC) y posiblemente leucocitos (WBC) y plaquetas. Se pueden usar uno o más colores, por ejemplo usando una cámara a color o usando iluminación de banda estrecha producida por un filtro de interferencia o LED. En este momento también se puede realizar la medición del contenido de hemoglobina.

Etapa 6. Fijar y teñir las células en el portaobjetos. La fijación puede ser una etapa separada o combinarse con la tinción.

Etapa 7. Capturar una imagen del portaobjetos teñido sin cubrir con cubreobjetos, usando un objetivo "seco", para contar hematíes, leucocitos, plaquetas y hemoglobina. Esta etapa puede ser en lugar de o en conjunción con la etapa 5.

Etapa 8. Realizar el recuento diferencial WBC a partir de imágenes de alta resolución adquiridas sin un cubreobjetos, usando un objetivo "seco", por ejemplo, con un objetivo de 40x o 50x que no esté corregido para un cubreobjetos. Se puede usar una cámara en color o múltiples imágenes en blanco y negro tomadas usando filtros de color o usando iluminación LED. Esta etapa puede ser además de o combinada con la etapa 7.

Etapa 9. Calcular los parámetros deseados y los parámetros requeridos para el CBC.

Etapa 10. Mostrar todos los parámetros de CBC a un operario en una interfaz gráfica de usuario (GUI). Etapa 11. Mostrar los resultados de la diferencial de leucocitos a un operario en la GUI.

Etapa 12. Mostrar imágenes de hematíes, leucocitos, plaquetas y cualquier elemento sanguíneo inusual/anómalo a un operario.

Etapa 13. Permitir que un operario interactúe con las imágenes y los parámetros para "cerrar" el CBC, el recuento diferencial WBC y la identificación de objetos inusuales o anómalos.

Etapa 14. Si es necesario, actualizar los resultados de CBC y recuentos WBC dependiendo de la interacción del operario en la etapa 13.

Etapa 15. Opcionalmente, permitir que los objetos de interés se reubiquen en un microscopio que tenga una platina motorizada controlable por ordenador para permitir la reubicación automatizada de los objetos para su visualización.

Etapa 16. Opcionalmente, actualizar los resultados de CBC y recuentos WBC dependiendo de la interacción del operario microscópico.

Aunque el proceso ejemplar descrito anteriormente describe etapas para preparar y examinar una muestra de sangre, los modos de realización de la invención se pueden usar para preparar y examinar otros fluidos que comprenden médula ósea, orina, tejido vaginal, tejido epitelial, tumores, semen, saliva y otros líquidos corporales.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un sistema para analizar los glóbulos sanguíneos de los líquidos corporales que comprende:

a. un aplicador para dosificar un fluido que comprende líquido corporal que contiene glóbulos sanguíneos, comprendiendo dicho aplicador un controlador de aplicador y una punta para dosificar el fluido sobre un portaobjetos, teniendo dicha punta una posición por encima del portaobjetos;

b. un dispositivo receptor de luz que contiene una lente para capturar una imagen de los glóbulos sanguíneos en el portaobjetos;

c. un mezclador para mezclar el líquido corporal con un diluyente para formar un fluido diluido;

d. un ordenador que contiene un microprocesador y programa informático almacenados en medios legibles por ordenador, estando el ordenador adaptado para indicar al sistema que realice las etapas de:

i.cambiar la posición de la punta con respecto al portaobjetos a una velocidad que tiene un componente direccional y un componente de velocidad medidos desde la punta o el portaobjetos;

ii.hacer que el aplicador dosifique el fluido fuera de la punta a un caudal mientras la punta mantiene una coordenada Z constante con respecto al portaobjetos;

iii. hacer que la punta aplique uno o más primeros flujos de células sobre el portaobjetos a lo largo de una primera trayectoria que tiene un componente X o Y fijo, comprendiendo dicho primer flujo un ancho de flujo;

iv. capturar una imagen de los uno o más primeros flujos de células en el portaobjetos con el dispositivo receptor de luz;

v.analizar la imagen para determinar si los uno o más primeros flujos de células están suficientemente diluidos para formar una monocapa de células en el portaobjetos;

vi. si los uno o más primeros flujos de células no están suficientemente diluidos:

vi.1 indicar al mezclador que añada más diluyente al fluido;

vi.2 hacer que la punta aplique un flujo de células más diluido sobre el portaobjetos;

vi.3 capturar una imagen del flujo de células más diluido en el portaobjetos con el dispositivo receptor de luz; vi.4 analizar la imagen para determinar si el flujo de células más diluido está suficientemente diluido para formar una monocapa de células en el portaobjetos;

vi.5 si el flujo de células más diluido no está suficientemente diluido, indicar al sistema que repita las etapas vi.1 a vi.5;

vii.cambiar la posición de la punta con respecto al portaobjetos en una distancia en una dirección X o Y; viii.hacer que la punta aplique un segundo flujo de células sobre el portaobjetos a lo largo de una segunda trayectoria que tiene un componente X o Y fijo, comprendiendo dicho segundo flujo una monocapa de células y un ancho de flujo; en el que el segundo flujo de células se asienta en una posición contigua a los uno o más primeros flujos de células; y

ix.capturar una o más imágenes de las células en el portaobjetos con el dispositivo receptor de luz.

2. El sistema de la reivindicación 1, en el que los uno o más primeros y segundos flujos de células forman una monocapa contigua de células en el portaobjetos.

3. El sistema de la reivindicación 1, en el que la distancia es aproximadamente igual al ancho de flujo de dicho primer flujo.

4. El sistema de la reivindicación 1, en el que el aplicador comprende además un primer depósito para almacenar el líquido corporal y un segundo depósito para almacenar el diluyente.

5. El sistema de la reivindicación 1, en el que el ordenador está adaptado para indicar al sistema que realice las etapas de:

a. hacer que el dispositivo receptor de luz capture una imagen del primer flujo de células;

b. analizar la imagen para determinar el ancho del primer flujo de células; y

c. cambiar la posición de la punta con respecto al portaobjetos en la dirección X o Y en una distancia igual al ancho del primer flujo de células.

6. El sistema de la reivindicación 1, en el que el ordenador está adaptado para indicar al sistema que realice las etapas de:

a. dirigir el controlador del aplicador para aplicar un tercer flujo de células sobre el portaobjetos en una tercera trayectoria que tiene un componente X o Y fijo, comprendiendo dicho tercer flujo una monocapa de células y un ancho de flujo; y

b. dirigir el controlador del aplicador para aplicar un cuarto flujo de células sobre el portaobjetos a lo largo de una trayectoria que tiene un componente X o Y fijo, comprendiendo dicho cuarto flujo una monocapa de células y un ancho de flujo; en el que el tercer flujo de células se asienta contiguo al segundo flujo de células y el cuarto flujo de células se asienta contiguo al tercer flujo de células en el portaobjetos.

7. El sistema de la reivindicación 1, en el que el ordenador está adaptado para indicar al sistema que realice las etapas de:

a. dirigir el controlador del aplicador para que aplique un tercer flujo de células sobre el portaobjetos en una tercera línea que tiene un componente X o Y fijo, comprendiendo dicho tercer flujo una monocapa de células y un ancho de flujo; en el que el tercer flujo de células se asienta contiguo al segundo flujo de células;

b. capturar una imagen de los flujos de células;

c. determinar a partir de la imagen si las células están suficientemente diluidas para contar las células; d. diluir el líquido corporal y dirigir el controlador del aplicador para aplicar flujos adicionales de células sobre el portaobjetos si el sistema determina que las células no están suficientemente diluidas para contar las células.

8. El sistema de la reivindicación 1, en el que el ordenador está adaptado para indicar al sistema que realice las etapas de:

a. mover la punta a una localización con respecto al portaobjetos donde la punta esté aproximadamente de 2 a 100 micrómetros por encima del portaobjetos;

b. hacer que el aplicador dirija el fluido fuera de la punta a una velocidad de aproximadamente 0,01 a 1,0 microlitros por segundo; y

c. cambiar la posición de la punta con respecto al portaobjetos a una velocidad de aproximadamente 10 a 100 milímetros por segundo.

9. El sistema de la reivindicación 1, que comprende además una plataforma que tiene:

a. un alimentador para almacenar nuevos portaobjetos;

b. una primera estación para aplicar flujos de células sobre el portaobjetos;

c. una segunda estación para teñir, fijar y secar los portaobjetos,

d. una tercera estación para iluminar y formar imágenes de los portaobjetos;

e. un recolector para recibir los portaobjetos procesados; y

f. un impulsor para mover los portaobjetos a través del sistema partiendo del alimentador, moviendo los portaobjetos a una primera estación, la segunda estación, la tercera estación; y a continuación al recolector.

10. El sistema de la reivindicación 1, en el que el sistema comprende además un dispositivo de emisión de luz y en el que el ordenador está adaptado para indicar al sistema que realice las etapas de:

a. hacer que el dispositivo de emisión de luz:

emita luz blanca para iluminar el portaobjetos;

ii.aplique un primer filtro de luz a la luz para restringir la emisión de la luz a una primera longitud de onda; y b. aplicar un segundo filtro de luz a la luz para restringir la emisión de la luz a una segunda longitud de onda; e indicar al dispositivo receptor de luz que capture una o más imágenes de las células en el portaobjetos.

11. El sistema de la reivindicación 10, en el que el ordenador está adaptado para indicar al dispositivo de emisión de luz que aplique un tercer filtro de luz a la luz para restringir la emisión de la luz a una tercera longitud de onda.

12. El sistema de la reivindicación 10, en el que las primera y segunda longitudes de onda se seleccionan del intervalo de 400 a 700 nm, o el sistema de la reivindicación 11, en el que las primera, segunda y tercera longitudes de onda se seleccionan del intervalo de 400 a 700 nm.

13. El sistema de la reivindicación 1, en el que el sistema comprende además un dispositivo de emisión de luz y en el que el ordenador está adaptado para indicar al sistema que realice las etapas de:

a. indicar al dispositivo de emisión de luz que haga que un primer LED emita luz en una primera longitud de onda; y

b. al dispositivo de emisión de luz que haga que un segundo LED emita luz en una segunda longitud de onda; c. al dispositivo receptor de luz que capture una o más imágenes de las células en el portaobjetos; y d. desplazar una posición focal de luz que emana de al menos uno de los LED de modo que la luz se enfoque cuando entra en la lente del dispositivo receptor de luz.

14. Un proceso para analizar glóbulos sanguíneos de líquidos corporales, comprendiendo el proceso:

a. dosificar un fluido que contiene líquido corporal que comprende células sobre un portaobjetos usando una punta;

b. aplicar uno o más primeros flujos de células sobre del portaobjetos a lo largo de una primera trayectoria que tiene un componente X o Y fijo, comprendiendo dicho primer flujo un ancho de flujo;

c. capturar una imagen de los uno o más primeros flujos de células en el portaobjetos con un dispositivo receptor de luz que tiene una lente;

d. analizar la imagen para determinar si los uno o más primeros flujos de células están suficientemente diluidos para formar una monocapa de células en el portaobjetos;

e. si los uno o más primeros flujos de células no están suficientemente diluidos:

i. diluir aún más el fluido;

ii. aplicar un flujo de células más diluido sobre del portaobjetos;

iii. capturar una imagen del flujo de células más diluido en el portaobjetos con el dispositivo receptor de luz; iv. analizar la imagen para determinar si el flujo de células más diluido está suficientemente diluido para formar una monocapa de células en el portaobjetos;

v. si el flujo de células más diluido no está suficientemente diluido, repetir las etapas i. a v.;

f. cambiar la posición de la punta con respecto al portaobjetos en una distancia en la dirección X o Y;

g. aplicar un segundo flujo de células sobre el portaobjetos a lo largo de una segunda trayectoria que tiene un componente X o Y fijo, comprendiendo dicho segundo flujo una monocapa de células y un ancho de flujo, en el que el segundo flujo de células se asienta en una posición contigua al primer flujo de células; y

h. capturar una o más imágenes del portaobjetos con el dispositivo receptor de luz.

15. El sistema de la reivindicación 1 o el proceso de la reivindicación 14, en el que la distancia entre un punto central en el primer flujo y un punto central en el segundo flujo es igual al ancho de flujo del primer o segundo flujo de células.