ES2903154T3 - Identificación de anticoagulantes en una muestra - Google Patents
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Abstract
Método para determinar cualitativa y cuantitativamente la presencia de un anticoagulante en una muestra usando tiempo de coagulación inducido por protrombinasa (PiCT), en donde la presencia de anticoagulantes en la muestra prolonga, en un modo dependiente de la dosis, el tiempo hasta la coagulación, en donde dicho método comprende: (1) el uso de PiCT estándar, que comprende añadir a la muestra una cantidad definida de activador de PiCT, incubación a 37°C por un período de tiempo específico, añadir el reactivo de partida y medir el tiempo hasta la coagulación en dicha mezcla de reacción; (2) el uso de una versión adaptada tal como PiCT invertido, que comprende añadir a la muestra el reactivo de partida, incubación a 37°C por un período de tiempo específico, añadir una cantidad definida de activador de PiCT y medir el tiempo hasta la coagulación en dicha mezcla de reacción; (3) el uso de intervalos de referencia que se adaptan al sistema de detección y al método de ensayo, en donde los intervalos de referencia se comparan con los tiempos de coagulación en la mezcla de reacción y en donde los tiempos de reacción fuera del intervalo en la mezcla de reacción indican la presencia de anticoagulantes; y (4) confirmación de tiempos de coagulación en la mezcla de reacción usando tiempo de trombina parcial activado (aPTT) y tiempo de protrombina (PT) para identificar la naturaleza del anticoagulante; en donde la muestra se selecciona entre sangre o plasma, y los anticoagulantes se seleccionan entre anticoagulantes directos o indirectos FIIa o FXa.
Description
DESCRIPCIÓN
identificación de anticoagulantes en una muestra
La presente invención se refiere a un nuevo método para determinar inhibidores de factores de coagulación proteolíticamente activos, en este documento denominados anticoagulantes, en una muestra, en particular a la detección cualitativa de inhibidores directos de trombina y factor Xa en una muestra. El método de la presente invención permite una determinación cualitativa de los anticoagulantes naturales presentes en una muestra. Esto se puede lograr con tan solo una prueba basada en la coagulación. El método se puede utilizar en un kit reactivo, que incluye un sistema de punto de cuidado (POC).
La llamada cascada de coagulación de la hemostasia secundaria consiste en la vía de activación de contacto (también conocida como la vía intrínseca) y la vía de factor de tejido (también conocida como la vía extrínseca) que conduce a la formación de fibrina. En la vía de factor de tejido, el tejido dañado expone el factor de tejido que activa el factor VII a su forma activada VIIa. El factor de tejido y el factor VIIa forman un complejo que activa el factor X en la vía común. En la vía de contacto, las superficies negativamente cargadas se exponen a la acción del factor XII y la precalicreína en la sangre. El factor activado XIIa activa el factor XI al factor XIa. El factor XIa activa el factor IX a la forma activada IXa. El factor IXa, VIlla, los fosfolípidos y los iones de calcio libres se requieren para la formación del complejo tenasa, que activa el factor X para convertirse en el factor Xa. La formación del complejo protrombinasa se realiza mediante la acción de los factores Xa, Va, fosfolípidos y iones de calcio libres. Dicho complejo de protrombinasa activa la formación de trombina a partir de protrombina.
Durante los últimos 50 años, los antagonistas de vitamina K (VKA) fueron la única solución terapéutica disponible para la anticoagulación a largo plazo en pacientes con riesgo tromboembólico crónico. El tratamiento con VKA requiere el control periódico, lo que representa una desventaja importante para el paciente.
En muchas situaciones que incluyen tratamiento a corto plazo son necesarias diferentes estrategias para la rápida anticoagulación. Una estrategia para obtener la anticoagulación en pacientes es la inhibición directa o indirecta de los factores de coagulación activados usando heparinas y heparinoides, que requieren el factor III antitrombina o el cofactor heparina II de plasma, los inhibidores naturales o sintéticos del factor IIa y Xa. Los ejemplos son heparinas, o bien heparina no fraccionada (UFH), la sal de sodio o las heparinas de bajo peso molecular (LMWH), entre ellas la enoxaparina o su sal de sodio (comercializada, p. ej., como. Lovenox®, Clexane®, Xaparin®), dalteparina o su sal de sodio (comercializada como p. ej., Fragmin®), tinzaparina o su sal de sodio (comercializada como, p. ej., Innohep®), nadroparina (comercializada como, p. ej., Fraxiparin®), certoparina (comercializada como, p. ej., Sandoparin®, Mono-Embolex®), reviparina (comercializada como, p. ej., Clivarin®).
Otros inhibidores de trombina incluyen hirudina, un polipéptido natural de 65 aminoácidos que se usa como agente terapéutico en la forma de bivalhirudina (comercializado como, p. ej., Angiox®) o lepirudina (comercializado como, p. ej., Refludan®); argatrobán, un derivado de arginina (comercializado como, p. ej., Argatra®); o los anticoagulantes de garrapata.
Fondaparinux o su sal de sodio (comercializado como, p. ej., Arixtra®) se conoce como un inhibidor indirecto del factor Xa, que es un pentasacárido sintético, con algunas ventajas sobre las heparinas o hirudinas.
Excepto por los VKA, todos estos fármacos se deben administrar por vía parenteral, es decir mediante infusión, inyección o implantación, lo que los convierte en los más utilizados para el tratamiento médico en hospitales, p. ej., en relación con una cirugía médica.
Desde el año 2000, se han desarrollado los llamados anticoagulantes orales nuevos o directos (NOAC/DOAC) para mitigar la necesidad del control recurrente y para mejor el manejo fuera del entorno hospitalario. Estos NOAC cumplen una función cada vez más importante en la prevención y/o el tratamiento de trastornos cardiovasculares o tromboembólicos. Estos son actualmente tres NOAC (rivaroxabán, apixabán y dabigatrán) en el mercado y se esperan nuevos en un futuro próximo.
Los NOAC actúan como anticoagulantes directos, es decir, inhibidores de los factores procoagulatorios centrales del sistema de coagulación de la sangre. Incluyen inhibidores del factor IIa (trombina), como etexilato de dabigatrán o dabigatrán (comercializado como, p. ej., Pradaxa®, Prazaxa®, Pradax®) e inhibidores del factor Xa, tales como rivaroxabán (comercializado, p. ej., como Xarelto®), apixabán (comercializado, p. ej., como Eliquis®), edoxabán (comercializado, p. ej., como Lixiana®), betrixabán u otamixabán.
Existen varios ensayos estándar disponibles para medir el efecto de la coagulación y/o la concentración de dichos fármacos en una muestra tal como sangre o plasma. Estas pruebas basadas en la coagulación consisten en un reactivo que desencadena la cascada de coagulación en una muestra tal como, p. ej., sangre o plasma, con el fin de inducir la formación de coágulos. El tiempo requerido para la formación de coágulos en dicha muestra (llamado tiempo de coagulación; CT) es medido por un operador. La presencia de un anticoagulante en dicha muestra puede en ciertas circunstancias conducir a una demora en el tiempo requerido para la coagulación, dependiendo de la naturaleza de la prueba y su nivel de sensibilidad a un anticoagulante particular. El experto en la técnica conoce estos métodos de
ensayo, la mayoría de los cuales se describen, p. ej., en el documento EP1240528 (incorporado a la presente memoria por referencia).
La medición del tiempo de trombina parcial activado (aPTT) y el tiempo de protrombina (PT) son ejemplos de pruebas basadas en coagulación fácilmente disponibles cuya respuesta se ve afectada por la presencia de un anticoagulante en una muestra, por ejemplo, sangre o plasma. Si bien la PT o la relación normalizada internacional (INR) se usan como un ensayo estándar para la medición de los valores de VKA, el aPTT se utiliza normalmente para medir el nivel de UFH e hirudina.
Para algunas de las pruebas de coagulación utilizadas habitualmente, tales como p. ej., PT o aPTT, se sabe que responden de manera ineficiente a algunos anticoagulantes, en particular con respecto a la medición cuantitativa. Con el ensayo del tiempo de coagulación inducido por protrombinasa (PiCT®) está disponible una prueba basada en la coagulación con respuesta eficiente a la presencia del anticoagulante más importante en una muestra, tal como por ejemplo sangre o plasma. Más concretamente, se sabe que PiCT® responde de manera eficiente en un modo cuantitativo a la presencia de todos los anticoagulantes antitrombina y anti-Xa conocidos (véanse, p. ej., Calatzis, Haemostasis 2000, 30:172-174; Calatzis et al., Am J Clin Pathol 2008, 130:446-454). Otro método de prueba, el llamado tiempo de coagulación de ecarina (ECT) responde a la presencia de hirudina en una muestra. Se sabe que un ensayo amidolítico responde, p. ej., a UFH, LMWH o fondaparinux. Los expertos en la técnica consideran todas estas pruebas basadas en la coagulación como útiles para el análisis del efecto de un anticoagulante, pero solo una vez que se conoce la presencia y la naturaleza de un anticoagulante. (véase, p. ej., el documento. EP 1240528 o Korte et al., Hamostaseologie 30, 212-216, 2010).
Si bien los fabricantes de fármacos no recomiendan el control periódico del nivel de NOAC en la sangre de los pacientes, los NOAC han creado una preocupación considerable en laboratorios de hemostasia desde su introducción en la práctica clínica debido a la falta de herramientas adecuadas para el manejo del paciente o falta de antídotos específicos. Ya se han descrito casos de sangrado importante bajo terapia de NOAC. La necesidad de medir los efectos anticoagulantes de los NOAC todavía se debate entre los expertos. Existen ciertas condiciones clínicas en las que la toma de pruebas para estos agentes sería conveniente o incluso salvaría vidas. Esto es extremadamente importante en una situación de emergencia que trata con pacientes con sangrado o en riesgo de sangrado y resulta necesario practicar un procedimiento invasivo, en caso de sobredosis o si un paciente ha desarrollado fallas renales o similares. Por lo tanto, el médico debe saber, y en caso afirmativo, qué fármaco o por lo menos qué clase de fármaco se ha tomado con el fin de tomar medidas inmediatas, incluido el uso del antídoto correcto. Es también importante destacar que algunos ensayos producen diferentes resultados dependiendo de la concentración del anticoagulante, tal como los NOAC en la muestra. Para esta evaluación, un sistema de prueba confiable sería también conveniente, en particular con respecto a un sistema POC.
Existen algunas pruebas que miden las concentraciones de anticoagulantes específicos gracias a las curvas de calibración. Ya que no hay intervalos terapéuticos establecidos a los cuales asociar una terapia apropiada, la utilidad de estas curvas solamente puede demostrarse tras la asociación con situaciones clínicamente relevantes. Por consiguiente, estas pruebas pueden utilizarse solamente para monitoreo y solamente una vez que se conoce la presencia del fármaco. Por otra parte, no hay pruebas disponibles que permitan detectar la presencia de los NOAC en muestras tales como p, ej., plasma o sangre para identificar la naturaleza del fármaco anticoagulante, si está presente. La adaptaciones de las pruebas de hemostasia de rutina existentes, p. ej., (dTT), ECT, aPTT o tiempo de trombina (TT), destinadas a evaluar el estado de coagulación global o el efecto anticoagulante de otros fármacos anticoagulantes, no pudieron aportar una solución óptima a los médicos en pacientes tratados con NOAC.
Por consiguiente, existe la necesidad de un método de prueba fácilmente disponible, que sea sencillo de realizar y fiable, que pueda proporcionar información sobre la presencia de un anticoagulante, en particular con respecto a los NOAC, en una muestra, dentro de un período de tiempo breve, incluido el uso en un sistema de POC. Existe además la necesidad de un método de prueba que pueda permitir la identificación de la naturaleza de dichos fármacos, en particular con respecto a los NOAC en la muestra tal como, p. ej., sangre o plasma humano. Particularmente, en el caso de los NOAC, este método debería proporcionar información cualitativa o cuantitativa a la persona que realiza el ensayo, p. ej., el médico o el propio paciente.
Sorprendentemente, hemos descubierto ahora un método en el que la presencia de un anticoagulante en una muestra seleccionada entre sangre o plasma se determina cualitativa y cuantitativamente usando una sola prueba basada en la coagulación, es decir tiempo de coagulación inducido por protrombinasa (PiCT). Asimismo, el uso de dicha única prueba basada en la coagulación permite que la persona que efectúa la prueba determine la presencia de varias clases de anticoagulantes tales como, por ejemplo, antitrombina o anticoagulantes anti-Xa en una muestra seleccionada entre sangre o plasma, tal como, p. ej., sangre o plasma humano. Para confirmación de los resultados, dicha única prueba de coagulación se usa en combinación con otros ensayos conocidos, p. ej., PT o aPTT, para identificar incluso en más detalle la naturaleza de un anticoagulante presente en una muestra seleccionada entre sangre o plasma humano. Este método es en particular útil para la identificación de los NOAC en una muestra.
Un rasgo importante de dicho sistema de prueba es la tecnología PiCT®, en particular la prueba Pefakit® PiCT®, que es sensible a todos los fármacos inhibidores del factor Xa y del factor IIa. Contrariamente a las pruebas de rutina estándar de uso específico limitado, Pefakit® PiCT® cuenta con el potencial de basarse en una sola prueba con el fin
de abordar todas las necesidades clínicas relacionadas con la evaluación de las terapias anticoagulantes. El sistema ha sido específicamente adaptado para este propósito. PiCT® o bien se usa como se describe en el documento EP 1240528 o ligeramente adaptado para ciertos fármacos, en particular adaptado como el llamado PiCT® invertido, como se explica en más detalle en este documento, que es en particular útil para la identificación de los NOAC. El método nuevo e inventivo se basa en una sorprendente reacción excesiva o reacción disminuida de la prueba a determinados anticoagulantes cuando se utiliza para hacer uso de una metodología particular. Asimismo, el uso de este mismo principio en combinación con otras pruebas basadas en coagulación tales como, por ejemplo, aunque sin limitarse a ello, aPTT y PT, lo cual permite una mayor determinación/confirmación de la naturaleza del anticoagulante presente en una muestra, como por ejemplo de sangre o plasma humano.
Esta es la primera vez que la identificación de la presencia de un anticoagulante, es decir sí/no usando solamente una prueba, es decir, el sistema PiCT®, y la identificación de la naturaleza del anticoagulante usando solamente una prueba, es posible con confirmación mediante aPTT y PT. Asimismo, presentamos en este documento por primera vez un sistema en el que los NOAC se pueden identificar por aplicación de solamente un solo sistema de ensayo.
Se puede utilizar PiCT® para controlar el nivel de todos los anticoagulantes conocidos que son directamente inhibidores del factor Xa y/o del factor IIa, en particular utilizados para controlar el nivel de UFH, LMWH, hirudina, fondaparinux, argatrobán y NOAC, preferiblemente, dabigatrán, rivaroxabán y apixabán.
Una muestra, tal como se emplea en este documento, se selecciona entre sangre o plasma e incluye fluidos tomados de un ser humano o animal, en particular fluidos tomados de seres humanos, tales como p. ej., sangre completa o plasma que contienen el anticoagulante a analizar o monitorear. La presente invención es capaz de determinar si un anticoagulante está presente o no en dicha muestra y, en caso afirmativo, la persona que lleva a cabo la prueba puede determinar qué fármaco o clase de fármaco está presente en la muestra.
Tal como se emplean en este documento, los términos "fármaco" y "anticoagulante" se utilizan de manera intercambiable.
Tal como se emplean en este documento, los términos Pefakit® PiCT® y PiCT® se utilizan de manera intercambiable. Pefakit® PiCT® es un kit diagnóstico disponible de DSM Nutritional Products Branch Pentapharm, Suiza, que hace uso de la tecnología PiCT®.
Como lo describen Korte et al. (más arriba) o como se describe en el documento EP 1240528, Pefakit® PiCT® es un ensayo de coagulación funcional basado en la activación directa del complejo de protrombinasa que produce un resultado analítico minucioso directamente proporcional a la actividad anticoagulante final de los inhibidores de los anticoagulantes del factor Xa o el factor IIa (véase Calatzis, Haemostasis 2000, 30:172-174). Para realizar la prueba Pefakit® PiCT® (en adelante método 1 estándar "PiCT® o PiCT®), una cantidad definida de activador PiCT® (= reactivo 1) se añade a una muestra, tal como, p. ej., plasma. La mezcla se deja proceder a 37°C por un período de tiempo específico. El reactivo de partida (= reactivo 2) se añade luego a la mezcla y se mide el tiempo requerido para la formación de coágulos. La presencia de anticoagulantes en las muestras prolonga, en forma dependiente de la dosis, el tiempo de coagulación. Pefakit® PiCT® se adapta a instrumentos de laboratorio en sistemas de detección mecánicos u ópticos que incluyen, aunque sin limitarse a ello, la familia ACL TOP® (Instrumentation Laboratory), preferiblemente ACL TOP® 500, la serie STA compact® (Stago) o la serie BCS® XP (Siemens).
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención comprende añadir a la muestra seleccionada entre sangre o plasma, en particular seleccionada entre sangre o plasma humano, los reactivos y todos los compuestos necesarios para que ocurra la reacción, creando así una mezcla de reacción. Esta mezcla de reacción es el objeto de la detección. La mezcla de reacción se puede proporcionar durante la parte de detección del método, pero preferiblemente se realiza antes de comenzar la detección. Se realiza una adaptación con respecto a la cantidad de muestra, la cantidad de reactivos, el tiempo de reacción y/o el orden de los reactivos que se han de añadir, como se describe en más detalle en este documento.
Para la correcta interpretación de los resultados, se emplean conjuntos específicos de valores o intervalos de referencia (RR) que se adaptan al sistema de detección, p. ej., el coagulómetro, y la clase de método de prueba, como por ejemplo PT, aPTT o PiCT®. El experto en la técnica sabe cómo establecer estos RR para los distintos sistemas de detección en relación con el método de prueba utilizado, p. ej., PT, aPTT o PiCT®. En caso de que el valor ensayado en una muestra esté fuera del intervalo, la persona que realiza la prueba sabe que la muestra contiene anticoagulantes. Un ejemplo de dicha medición del RR se muestra en la Tabla 1, en donde las configuraciones se adaptan al analizador ACL TOP® 500 (Instrumentation Laboratory).
Si las mediciones se efectúan con otro instrumento conocido por el experto en la técnica, los RR deben determinarse de manera acorde, es decir, se deben diseñar esquemas específicos de introducción con pipeta con el fin de lograr alta capacidad de reproducción en la muestra, incluido plasma de donantes sanos y combinaciones de plasma normal (NPP) con adición de cantidades incrementales de anticoagulantes. Después de la determinación del RR, se deben definir las mejores curvas de dosis y respuesta (DRC) para cada fármaco y/o cada sistema de detección. Estos procedimientos se conocen en la técnica.
Tabla 1: Adaptación de PiCT®, aPTT y PT, y RR medidos en ACL TOP® 500. Los valores se indican en segundos. "Fuera" significa fuera del intervalo, es decir, la extensión del tiempo de coagulación debido a la presencia de anticoagulantes en la muestra. Para más detalles, véase el texto.
La presente invención se refiere, en un aspecto, al uso de un ensayo de coagulación, en particular al método de prueba PiCT® en un sistema de detección tal como, p. ej., el analizador ACL TOP® 500 y a un método para detectar cuantitativa y cualitativamente anticoagulantes en una muestra seleccionada entre sangre o plasma, es decir, a un método para determinar cualitativa y cuantitativamente la presencia de un anticoagulante en una muestra usando tiempo de coagulación inducido por protrombinasa (PiCT), en donde la presencia de anticoagulantes en la muestra prolonga, en un modo dependiente de la dosis, el tiempo de coagulación, en donde dicho método comprende:
(1) el uso de PiCT estándar que comprende añadir a la muestra una cantidad definida de activador de PiCT, incubación a 37°C por un período de tiempo específico, añadir el reactivo de partida y medir el tiempo de coagulación en dicha mezcla de reacción;
(2) el uso de una versión adaptada tal como PiCT invertido, que comprende añadir a la muestra el reactivo de partida, incubación a 37°C por un período de tiempo específico, añadir una cantidad definida de activador de PiCT y medir el tiempo hasta la coagulación en dicha mezcla de reacción;
(3) el uso de intervalos de referencia que se adaptan al sistema de detección y al método de ensayo, en donde los intervalos de referencia se comparan con los tiempos de coagulación en la mezcla de reacción y en donde los tiempos de coagulación fuera del intervalo en la mezcla de reacción indican la presencia de anticoagulantes; y
(4) confirmación de los tiempos de coagulación en la mezcla de reacción usando el tiempo de trombina parcial activado (aPTT) y el tiempo de protrombina (PT) para identificar la naturaleza del anticoagulante;
en donde la muestra se selecciona entre sangre o plasma, y los anticoagulantes se seleccionan entre anticoagulantes directos o indirectos de FIIa o FXa.
Particularmente, se han desarrollado 4 métodos diferentes/adaptados basados en PiCT® estándar (es decir, método 1 PiCT®) para lograr las mejores DRC en todos los tipos de anticoagulantes - excepto en anticoagulantes del tipo VKA - tal como en particular en anticoagulantes seleccionados entre UFH, LMWH, hirudina, fondaparinux, argatrobán y NOAC, incluidos dabigatrán, rivaroxabán y apixabán. Por lo tanto, para identificación de fármacos como fondaparinux, el método 2 PiCT® es particularmente útil e incluye un esquema de introducción con pipeta modificado/adaptado comparado con el procedimiento estándar. El mismo resultó ser útil para dabigatrán o argatrobán (= método 3 PiCT®), en donde se usa otro esquema de introducción con pipeta modificado/adaptado, o para NOAC tales como, p. ej. rivaroxabán o apixabán (= método 4 PiCT®) o PiCT® invertido. Los métodos 1 a 4 de PiCT® se describen en más detalle en los Ejemplos.
Los 4 métodos (ver arriba) se describen en más detalle en los Ejemplos. Los esquemas de introducción con pipeta específicos se diseñaron usando NPP con adición de cantidades incrementales de anticoagulantes con el fin de lograr gran reproducibilidad del sistema de prueba, que se requiere para la identificación de fármacos que incluyen el uso en un sistema POC. Con respecto al analizador ACL TOP® 500, los métodos 1 a 4 PiCT® se han establecido de la siguiente manera:
Método 1 PiCT®: 50 gl de plasma se incuban durante 180 seg. con 50 gl de reactivo 1 y luego se añaden 50 gl de reactivo 2, y se registra el tiempo hasta la coagulación en ACL TOP® 500 (es decir, esquema de introducción con pipeta: P-50/ A-50/ I-180/ 50-S). Este método es particularmente útil para la detección de UFH, LMWH o hirudina.
Método 2 PiCT®: P-75/ A-65/ I-180/ 35-S en ACL TOP® 500 o P-80/ A-65/ I-180/ 40-S en STA compact® o P-75/ A-65/ I-180/ S-40 en BCS® XP. Este método es particularmente útil para fondaparinux.
Método 3 PiCT®: P-90/ A-70/ I-180/ 40-S en ACL TOP® 500 o STA compact®, o P-70/ A-60/ I-180/ 45-S en BCS® XP. Este método es particularmente útil para dabigatrán o argatrobán.
Método 4 PiCT®: P-140/ S-45 / I160/ A-40 en ACL TOP® 500 o STA compact®, o P-125/ S-45/ I-150/ A-40 en BCS® XP. Este método es particularmente útil para rivaroxabán o apixabán.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere al uso de PiCT® que comprende el uso de PiCT estándar, al uso de PiCT invertido, al uso de intervalos de referencia y a la confirmación usando aPTT y PT como se describió anteriormente para identificación de NOAC, en particular rivaroxabán o apixabán, en una muestra seleccionada entre sangre o plasma, tal como p. ej., sangre o plasma humano, en donde la muestra se enriquece primero con el reactivo activador, la mezcla se deja proceder y finalmente se enriquece con el reactivo de partida.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para medir la presencia de un anticoagulante en una muestra seleccionada entre sangre o plasma, en particular humano o animal. Por ende, el médico/paciente, es decir, la persona que realiza la prueba, debe saber si un anticoagulante está presente o no en una muestra de sangre o plasma. Se realiza una primera evaluación con pruebas PiCT® estándar (método 1 PiCT®): una medición de tiempos de coagulación fuera de intervalo, es decir, encima del RR, indica la presencia de UFH, LMWH, hirudina, argatrobán, fondaparinux o dabigatrán en la muestra. Con respecto a NOAC tales como rivaroxabán o apixabán, este método 1, es decir, PiCT® estándar, está en el RR incluso si las concentraciones en el intervalo de aproximadamente 300 ng/ml están presentes en la muestra. En el caso de dabigatrán, los tiempos de coagulación medidos con este método están encima del RR, lo que significa fuera de intervalo.
La detección de (bajos) niveles de anticoagulantes como los NOAC en una muestra es otro aspecto de la presente invención. El uso del llamado método de prueba PiCT® invertido (ver arriba) resultó ser un método particularmente útil para este propósito.
Los ejemplos de anticoagulantes, preferiblemente en bajas concentraciones, que se pueden detectar con dicho método (Método 4 PiCT®) se seleccionan entre dabigatrán, heparinas tales como, p. ej., UFH y LMWH, hirudina, fondaparinux, argatrobán además de los NOAC, p. ej., rivaroxabán o apixabán. Como se usa en este documento, una baja concentración de anticoagulante significa un intervalo de 20 a 35 ng/ml con respecto a rivaroxabán, apixabán o dabigatrán, en el intervalo de 0,3 a 0,4 gg/ml con respecto a fondaparinux o argatrobán o hirudina, en el intervalo de 0,3 a 0,4 IU/ml con respecto a heparinas, tales como p. ej., UFH o LMWH.
Por lo tanto, para la identificación de fármacos tales como dabigatrán, rivaroxabán o apixabán, el método de prueba PiCT® invertido (denominado en este documento método 4 PiCT®) se usa como prueba de detección.
Para determinar si el NOAC en la muestra seleccionada entre sangre o plasma es dabigatrán o similar, la primera prueba, es decir que el método 1 PiCT® resultó en tiempos de coagulación fuera del intervalo, se realiza una segunda prueba, en donde se puede usar PiCT® invertido descrito anteriormente, correspondiente al método 4 PiCT®, junto con, p. ej., el analizador ACL TOP® 500, y un tiempo de coagulación encima del RR de aproximadamente 21,4 a aproximadamente 37,9, tal como, p. ej., encima de aproximadamente 29,6, significa la presencia de dabigatrán en la muestra. El RR medido con dabigatrán (ver arriba) usando PiCT® estándar produce resultados fuera del intervalo, en contraste con otros NOAC tales como rivaroxabán y apixabán. Los tiempos de coagulación particulares medidos para los diferentes anticoagulantes se muestran en la Tabla 2.
En un aspecto particular, la presente invención se refiere a un método para determinar qué clase de anticoagulante está presente en una muestra, p. ej., en particular si la muestra comprende un anticoagulante seleccionado entre el grupo que consiste en UFH, LMWH, hirudina, fondaparinux, argatrobán, dabigatrán, rivaroxabán y apixabán, en donde la muestra se selecciona entre sangre o plasma, tal como en particular humano o animal. Este método básicamente es una combinación de 4 pruebas, en donde primero se realizan los métodos 1 y 4 PiCT®, combinados con aPTT y PT (para confirmación de los resultados), y los resultados combinados, es decir los tiempos de coagulación medidos, se analizan con el sistema de detección tal como p. ej., el analizador ACL TOP® 500:
(1) Si las 4 pruebas resultan en tiempos de coagulación dentro del RR determinado con antelación (véase, p. ej., la Tabla 1 como se establece para el analizador ACL TOP® 500), no hay ningún fármaco presente en la muestra.
(2) Si el método 1 PiCT® está dentro del RR, pero el método 4 produce resultados fuera del intervalo (tal como p. ej., tiempos de coagulación debajo de aproximadamente 24,4 a aproximadamente 30,4, como p. ej., debajo de aproximadamente 27,6, y si los tiempos de coagulación de acuerdo con el método 4 PiCT® están encima del Rr de aproximadamente 21,4 a aproximadamente 37,9, tal como p. ej., encima de aproximadamente 29,6 (como se estableció para el analizador ACL TOP® 500 que se muestra en la Tabla 1), la muestra contiene los NOAC
seleccionados entre rivaroxabán o apixabán. Dependiendo de la concentración, PT y aPTT están o bien fuera del RR (es decir, PT fuera del RR con mayores concentraciones de ambos NOAC) o dentro del RR (es decir, aPTT dentro del RR con concentración normal o inferior de ambos NOAC). Esto se señala en más detalle en los Ejemplos.
(3) Si el PiCT® modificado, es decir, método 3 PiCT®, además del método 4 PiCT®, muestran tiempos de coagulación fuera del intervalo, la muestra podría contener o bien dabigatrán o argatrobán. Estos resultados se confirmarían con PT y aPTT, es decir, los tiempos de coagulación también encima del RR. Solamente en caso de baja concentración de dabigatrán, el PT muestra tiempos de coagulación dentro del RR.
(4) Si el PiCT® estándar, es decir el método 1 PiCT®, además del método 4 PiCT®, muestran tiempos de coagulación fuera del intervalo, la muestra podría contener o bien UFH, LMWH o hirudina. Mientras que aPTT podría también estar fuera del intervalo para los tres anticoagulantes, el PT estará fuera del intervalo solamente para hirudina, pero dentro del RR para UFH, LMWH o baja concentración de hirudina.
(5) Si PiCT® modificado, es decir método 2 PiCT®, además del método 4 PiCT®, está fuera del intervalo, la muestra podría contener fondaparinux. En este caso, PT y aPTT muestran tiempos de coagulación dentro del RR.
Mediante la adición de polibreno, se puede hacer una distinción acerca de cuál de los anticoagulantes está realmente presente en la muestra: si después de la adición de polibreno los tiempos de coagulación medidos vuelven al RR al usar el método 1 PiCT®, la muestra comprende heparinas, tales como p. ej., UFH o LMWH. Alternativamente, si el resultado no vuelve al RR, la muestra comprende bajas concentraciones de dabigatrán o hirudina. Se obtienen resultados similares con los NOAC como rivaroxabán o apixabán en la muestra: después de la adición de polibreno, los tiempos de coagulación medidos están fuera del intervalo cuando se usa el método 1 PiCT® (en lugar de dentro del RR sin la adición de polibreno). No obstante, en caso de bajas concentraciones de rivaroxabán o apixabán en la muestra, la adición de polibreno no tiene ningún efecto sobre los tiempos de coagulación. Los tiempos de coagulación particulares medidos para los distintos anticoagulantes se muestran en la Tabla 6, que es un ejemplo de los resultados obtenidos en muestras de plasma con adición de anticoagulantes.
En una realización particular, la presente invención se refiere a un método para cuantificación del efecto de los anticoagulantes en una muestra como se describió anteriormente, en donde la muestra se selecciona entre sangre o plasma, tal como en particular humano o animal. En particular, el método 1 PiCT® se puede usar para detectar el efecto de la hirudina o las heparinas, tal como p. ej., UFH y LMWH, junto con, p. ej., el analizador ACL TOP® 500. Por lo tanto, primero la muestra tal como por ejemplo plasma, en particular 50 pl de plasma, se incuba, en particular durante 180 seg., con el reactivo 1, en particular 50 pl, y luego se añade el reactivo 2, en particular 50 pl, y se registra el tiempo hasta la coagulación como se describió previamente. Los tiempos de coagulación particulares medidos para UFH, LMWH o hirudina que se muestran en la Tabla 7 son ejemplos de resultados obtenidos en muestras con adición de NPP.
Si se ha de cuantificar el efecto de fondaparinux en una muestra, se emplea un método similar al método 1 PiCT®, denominado en este documento y en la Tabla 3 como método 2 PiCT®, junto con, p. ej., el analizador ACL TOP® 500, es decir, primero la muestra tal como p. ej., plasma, en particular 75 pl, se incuba, en particular durante 180 seg., con el reactivo 1, en particular 65 pl, y luego se añade el reactivo 2, en particular 35 pl, y se registra el tiempo hasta la coagulación, es decir, DRC. Los tiempos de coagulación particulares medidos para fondaparinux que se muestran en la Tabla 8 son ejemplos de resultados obtenidos en muestras con adición de NPP.
En el caso de dabigatrán o argatrobán, es decir, la determinación del efecto cuantitativo de dicho fármaco en una muestra, un método similar al descrito anteriormente y al que se hace referencia en la Tabla 3 como el método 3 PiCT®, se puede usar junto con, p. ej., el analizador ACL TOP® 500, es decir, primero se incuba la muestra tal como p. ej., plasma, en particular 90 pl, en particular durante 180 seg, con el reactivo 1, en particular 70 pl, y después se añade el reactivo 2, en particular 40 pl, y se registra el tiempo hasta la coagulación. Los tiempos de coagulación particulares medidos para dabigatrán se muestran en la Tabla 9, que es un ejemplo de los resultados obtenidos en las muestras con adición de NPP.
En el caso de rivaroxabán o apixabán en una muestra, se puede usar el método 4 PiCT® junto con, p. ej., el analizador ACL TOP® 500, en donde la DRC se genera por extrapolación de los tiempos de coagulación relevantes. Los resultados se muestran en la Tabla 10, que es un ejemplo de los resultados obtenidos en las muestras con adición de NPP.
La evaluación de si el nivel de los NOAC en una muestra es suficientemente bajo como para definir esto como situación no crítica es otro objeto de la presente invención. Para efectuar esta determinación, la muestra se selecciona entre sangre o plasma, tal como en particular humano o animal, y los tiempos de coagulación se miden con el método 4 PiCT® junto con, p. ej., el analizador ACL TOP® 500. En el caso de que el nivel no crítico para rivaroxabán o apixabán deba ser medido en la muestra, primero se deben desarrollar las DRC y extrapolar los tiempos de coagulación relevantes. Los resultados se muestran en la Tabla 11, que es un ejemplo de los resultados obtenidos en las muestras con adición de plasma. Para la medición de dabigatrán, se podría usar el método 3 PiCT® anteriormente descrito, junto con, p. ej., el analizador ACL TOP® 500. Los resultados se muestran en la Tabla 11 usando las muestras de plasma con adición de anticoagulantes.
La presente invención comprende las siguientes realizaciones, que son solamente ejemplos y no tienen como fin limitar el alcance de la presente invención:
El uso de PiCT, aPTT y PT para identificación de fármacos anticoagulantes en una muestra seleccionada entre sangre o plasma, en donde la presencia de anticoagulantes en la muestra prolonga, en un modo dependiente de la dosis, el tiempo hasta la coagulación en comparación con los intervalos de referencia que se adaptan al sistema de detección y al método de prueba que comprende:
(1) medir el tiempo de coagulación en la muestra mediante PiCT estándar, que comprende añadir a la muestra una cantidad definida de activador de PiCT, incubación a 37°C por un período de tiempo específico, añadir el reactivo de partida y medir el tiempo hasta la coagulación en dicha mezcla de reacción;
(2) medir el tiempo de coagulación en la muestra mediante PiCT invertido, que comprende añadir a la muestra el reactivo de partida, incubación a 37°C por un período de tiempo específico, añadir una cantidad definida de activador de PiCT y medir el tiempo hasta la coagulación en dicha mezcla de reacción;
(3) medir el tiempo de coagulación en la muestra mediante aPTT, y
(4) medir el tiempo de coagulación en la muestra mediante PT;
en donde:
(a) en ausencia de todo fármaco, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1) a (4) están dentro de los intervalos de referencia,
(b) en presencia de inhibidores directos de FXa, los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (1) están dentro de los intervalos de referencia, los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (2) están fuera del intervalo, y los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (3) y (4) están dentro de los intervalos de referencia en presencia de hasta 50 ng/ml y fuera del intervalo en presencia de más de 300 ng/ml de inhibidores directos de FXa;
(c) en presencia de inhibidores directos de FIIa, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1), (2), (3) y (4) están fuera del intervalo;
(d) en presencia de hasta 150 ng/ml de dabigatrán, UFH, LMWH o hasta 0,4 pg/ml de hirudina, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1), (2) y (3) están fuera del intervalo y los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (4) están dentro de los intervalos de referencia;
(e) en presencia de más de 0,4 pg/ml de hirudina, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1), (2), (3) y (4) están fuera del intervalo;
(f) en presencia de fondaparinux, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1) y (2) están fuera del intervalo, y los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (3) y (4) están dentro de los intervalos de referencia. Figuras
Figura 1. DRC para los diferentes anticoagulantes usando el método 1 PiCT® 1 (Fig. 1A), el método 2 PiCT® (Fig. 1B), el método 3 PiCT® (Fig. 1C), el método 4 PiCT® (Fig. 1D) usando el analizador ACL TOP® 500. El intervalo terapéutico se indica con la "T", el intervalo profiláctico se indica con la "P". Para más detalles, véase el texto.
Figura 2. Evaluación de una muestra en la que fondaparinux está presente. Los valores fuera del intervalo están en negrita, los valores en el RR se indican con un color de fondo gris, los valores límite están en cursiva. Los anticoagulantes se enumeran en la columna de la derecha, con UFH, LMWH, Fonda (fondaparinux), hirudina, argatrobán, Dabi (dabigatrán), Riva (rivaroxabán), Apixa (apixabán). Se usa NPP sin ningún anticoagulante como control. Las columnas son las siguientes: (A) = PiCT® estándar, (B) = PiCT® invertido, (C) = aPTT, (D) = PT; (E) = PiCT® estándar de polibreno, (F) = PiCT® invertido de polibreno.
Figura 3. Evaluación de una muestra en donde están presentes UFH, LMWH, hirudina o baja concentración de dabigatrán. Los valores fuera del intervalo están en negrita, los valores en el RR se indican con color de fondo gris, los valores límite están en cursiva. Para más detalles, véase el texto o la inscripción de la Figura 2.
Figura 4. Confirmación de los resultados que se muestran en la Figura 3 para UFH y LMWH. Para más detalles, véase el texto o la inscripción de la Figura 2.
Figura 5. Evaluación de una muestra en donde está presente rivaroxabán o apixabán. Para más detalles, véase el texto o la inscripción de la Figura 2.
Figura 6. Evaluación de una muestra en donde están presentes hirudina, argatrobán o dabigatrán. Para más detalles, véase el texto o la inscripción de la Figura 2.
Figura 7. Con el fin de ensayar el método para factibilidad bajo condiciones de la vida real y para evaluar su uso en un sistema de punto de cuidado (POC), se ensayaron muestras de plasma individuales con la combinación de ensayos
(véase la inscripción de la Figura 2). Para cada paciente, se realizaron dos pasadas separadas. Los resultados se muestran en las Fig. 7A y 7B para el paciente 1 y en las Fig. 7C y 7D para el paciente 2.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos solamente y no están destinados a limitar el alcance de la invención en forma alguna.
Ejemplos
Se prepararon disoluciones stock de anticoagulantes en agua desionizada para UFH (250 IU/ml, WHO estándar 07/328, NIBSC), LMWH (250 IU/ml, Fragmin®, Pfizer) y lepirudina (0,5 mg/ml, (Refludan®, Bayer HealthCare Pharmaceuticals Inc) o en DMSO para rivaroxabán (0,5 mg/ml, Alsachim, Francia) y apixabán (2 mg/ml, Alsachim) o en HCl 0,1 M para dabigatrán (Alsachim), y se conservaron a -20°C. Fondaparinux (5 mg/ml, disolución inyectable, Arixtra®, GlaxoSmithKlines) se almacenó a 4°C. Los anticoagulantes se diluyeron más con agua desionizada y se les adicionó NPP preparado a partir de 24 donantes sanos (Universitatsklinikum Würzburg, Alemania) para mediciones de PiCT®. Las concentraciones finales de DMSO o HCl en NPP no excedieron 0,15% y 0,4 mM respectivamente, y no afectaron la coagulación.
Ejemplo 1: Adaptaciones de PiCT® y determinación de intervalos de referencia (RR)
Como punto de partida, se debió establecer el RR para cuatro tipos de anticoagulantes distintos, como se describió anteriormente. Estos deben adaptarse al sistema de ensayo y también a la clase de fármaco, como p. ej., en el caso de fondaparinux (método 2 PiCT®) o dabigatrán/argatrobán (método 3 PiCT®). Los resultados se muestran en la Tabla 2, en donde los resultados se exponen usando plasma nuevo de 17 donantes sanos.
Tabla 2: Establecimiento del RR en el analizador ACL TOP® 500. El tiempo de coagulación (RR, límite, fuera del intervalo) se expone en segundos, lo que indica el promedio y los intervalos superior e inferior (entre paréntesis).
Los protocolos y los esquemas de introducción con pipeta diseñados para ACL TOP® 500 se describen en la Tabla 3. Para determinar el potencial de Pefakit® PiCT® de evaluar los efectos anticoagulantes de la mayoría de los fármacos anticoagulantes, se realizaron DRC usando NPP con adición de niveles en aumento de UFH, LMWH, fondaparinux, hirudina, rivaroxabán, apixabán o dabigatrán. Los detalles de los distintos métodos, es decir, métodos 1 a 4 PiCT®, se describen en el texto.
Tabla 3: esquema de introducción con pipeta para los 4 métodos PiCT® distintos descritos en el texto, en donde "P" significa plasma en gl, "A" significa reactivo activador en gl, "S" significa reactivo en gl y "I" significa tiempo de incubación en segundos.
Se identificó que el método 4 PiCT® ofrecía los mejores resultados. Consiste en invertir el orden de adición de reactivos al plasma. PiCT® es muy sensible a los bajos niveles de NOAC.
Ejemplo 2: Pefakit® PiCT® como herramienta para identificar si una muestra de plasma contiene un anticoagulante
El método 4 PiCT®, que es un PiCT® invertido, se desarrolló como nuevo método para lograr las mejores DRC para rivaroxabán y apixabán. Después de calcular el RR para las distintas clases de anticoagulantes (véase el Ejemplo 1), se usaron muestras de NPP con adición de cantidades incrementales de anticoagulantes en el analizador ACL TOP® 500, en donde 45 pl de reactivo de partida se incubaron con 140 pl plasma durante 60 seg. El tiempo hasta la coagulación se registró después de la adición de 40 pl de activador (es decir, el llamado PiCT® invertido). El resultado se muestra en la Tabla 4, en donde se indica el número de muestras (NPP) con adición de cantidades incrementales de anticoagulantes (AC) (n), es decir, indicado como "tratamiento". Cada muestra con un resultado comenzando desde un umbral determinado encima del RR contiene un anticoagulante, que es verdadero para todos los fármacos enumerados en la Tabla.
Tabla 4: Identificación de anticoagulantes en muestras de plasma que usan el método 4 PiCT®. Situación inicial significa que el RR en una muestra sin la adición de ningún fármaco se muestra como el promedio y como el intervalo completo (entre paréntesis). “Conc.” significa la concentración del anticoagulante por ml de muestra. Los números en negrita indican un tiempo de coagulación fuera del intervalo, es decir la presencia de un fármaco en la muestra, en donde el control negativo, es decir, dentro del RR, se marca con fondo de color gris.
Usando este método, pudieron detectarse escasas cantidades de todos los NOAC, UFH, LMWH, hirudina, fondaparinux o argatrobán, como se muestra en la Tabla 4.
Ejemplo 3: Pefakit® PiCT® como herramienta para determinar qué NOAC está presente en una muestra
Con el PiCT® normal, es decir método 1 PiCT®, en donde 50 pl de plasma se mezclan con la misma cantidad de reactivo 1 (activador de PiCT®), se incuban durante 180 seg. y se mezclan con la misma cantidad de reactivo 2 (reactivo de partida PiCT®) en un analizador ACL TOP® 500, la presencia de los NOAC no puede determinarse en una muestra. Esto es verdadero incluso con altos niveles de dichos fármacos en la muestra, es decir, en el intervalo de 300 ng/ml. Por lo tanto, con el fin de determinar qué NOAC está presente en la muestra, se debe usar una combinación del método 1 PiCT® y del método 4 PiCT® (véase arriba para descripción detallada). Para confirmar esto, se prepararon muestras de plasma con adición de diferentes niveles de NOAC, y el tiempo de coagulación se midió usando primero
el método 1 PiCT® seguido del método 4 PiCT®. El resultado se muestra en la Tabla 5. En el caso de rivaroxabán o apixabán presente en una muestra ensayada, el método 1 PiCT® está dentro del intervalo (indicado por el fondo de color gris) mientras que el método 4 PiCT® está fuera del intervalo (indicado en negrita). En caso de que esté presente dabigatrán en la muestra, tanto el método 1 PiCT® (que tuvo que ser adaptado, es decir el método 3 PiCT®) como el 4 están fuera del intervalo, como se indica en negrita.
Tabla 5: distinción entre diferentes NOAC presentes en una muestra determinada por
un desempeño subsiguiente del método 1 PÍCT®(método 3PÍCT®para dabigatrán)
y el método 4 PiCT® Los resultados dentro del RR se indican con el color de fondo gris,
los resultados encima del RR se marcan en negrita. Para más detalles, véase el texto o la
inscripción de la Tabla 4.
Ejemplo 4: Pefakit® PiCT® como herramienta para determinar en más detalle la naturaleza de un anticoagulante en una muestra de plasma
Con el fin de abordar la cuestión anterior, es decir, determinar la naturaleza de un anticoagulante en una muestra, se debe realizar una combinación de varios métodos, incluidos el método 1 PiCT®, el método 4 PiCT®, aPTT (HemosIL™ aPTT SP), PT (HemosIL™ PT recombiplastin), y algunas veces incluso un método 1 PiCT® modificado en donde se ha añadido polibreno. Con el fin de simular esto, se analizaron muestra de plasma con adición de diferentes niveles de anticoagulantes usando el analizador ACL TOP® 500. Los resultados se muestran en la Tabla 6. Para cada fármaco, se obtuvo un patrón específico, es decir, tiempos de coagulación dentro del RR y tiempos de coagulación encima del RR, dependiendo del método de ensayo utilizado, que es único por lo menos para la clase de anticoagulante o incluso para un anticoagulante específico.
Tabla 6: esquema para determinación de qué clase de anticoagulante está presente en muestras de plasma adicionadas. Solamente se exponen los valores promedio, "n" se refiere al número de donantes sanos. Para más detalles, véanse el texto y la inscripción de las Tablas 4 o 5.
En caso de una medición usando el método 1 PiCT® y el método 4 PiCT®, en donde el tiempo de coagulación determinado con el primer método está dentro del RR pero el tiempo medido con el segundo método está encima del RR, el anticoagulante presente en la muestra es o bien apixabán o rivaroxabán. Se realizaron otras pruebas, es decir, aPTT o PT, con el fin de distinguir entre ambos anticoagulantes: en caso de rivaroxabán, con ambas pruebas los tiempos de coagulación estuvieron encima del RR -pero solamente en dosis más altas, como en el intervalo de 200 ng o más (véase la Tabla de arriba). Si, por ejemplo, ambos resultados del método 1 y el método 4 PiCT® están encima del RR pero aPTT y PT revelaron tiempos de coagulación dentro del RR, el fármaco presente en la muestra es fondaparinux.
Ejemplo 5: Pefakit® PiCT® como herramienta para cuantificar el efecto de un anticoagulante
Dependiendo del fármaco utilizado, los protocolos para determinar el efecto cuantitativo de un anticoagulante podrían diferir, es decir, usando distintos métodos de ensayo, incluidos los enumerados en la Tabla 1 que muestran los RR para los diversos métodos. Si se ha de cuantificar el efecto de las heparinas o hirudinas, como por ejemplo UFH, LMWH e hirudina, Pefakit® PiCT® con el método 1 PiCT® resultó útil, como se muestra en la Tabla 7A-C que expone DRC en muestras de NPP con adición de UFH (Tabla 7A), LMWH (Tabla 7B) o hirudina (Tabla 7C) según lo medido con el método 1 PiCT® y el analizador ACL TOP® 500. Se exponen solamente los valores promedio. Para la situación inicial, es decir, sin ningún anticoagulante presente en la muestra, el número de mediciones fue n=6 con un tiempo de coagulación de 24 segundos medido con el método 1 PiCT®.
Tabla 7A: Método 1 PiCT® que usa NPP con adición de UFH y n=4.
Para más detalles véanse el texto y la inscripción de la Tabla 4.
Tabla 7B: Método 1 PiCT® que usa NPP con adición de LMWH y n=4.
Para más detalles véanse el texto y la inscripción de la Tabla 4.
Tabla 7C: Método 1 PiCT® que usa NPP con adición de hirudina y n=4.
Para más detalles véanse el texto y la inscripción de la Tabla 4.
Para fondaparinux, se determinó que el método 2 PiCT® era útil. Los ejemplos de los resultados obtenidos con muestras de NPP en el analizador ACL TOP® 500 se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8: DRC en muestras de NPP con adición de fondaparinux según lo medido con el método 2 PiCT® 2. Solamente se exponen los valores promedio. El número de mediciones fue n=4. El tiempo de coagulación para la situación inicial, es decir, sin ningún anticoagulante presente en la muestra, fue 39 segundos medidos con el método 2 PiCT®.
Con respecto a dabigatrán y argatrobán, la DRC se estableció usando el método 3 PiCT®, los tiempos de coagulación relevantes se extrapolaron con las condiciones particulares descritas en este documento. Para todas las mediciones, el analizador ACL TOP® 500 se usó haciendo uso de muestras de NPP adicionadas con cantidades incrementales de anticoagulante que cubrían el pico promedio o el punto mínimo (véanse Stangier J, Clin Pharmacokinet 2008, 47:47
59; van Ryn J, Thromb Haemost 2010, 103:1116-1127; Baglin T, J Thromb Haemost. 2013 Jan 24). Los ejemplos de los resultados obtenidos con las muestras de NPP adicionadas con dabigatrán (Tabla 9A) o argatrobán (Tabla 9B) se presentan a continuación.
Tabla 9A: DRC en muestras de NPP con adición de dabigatrán según lo medido con el método 3 PiCT®. Se exponen solamente los valores promedio. El número de mediciones fue n=4. El tiempo de coagulación para la situación inicial, es decir, sin ningún anticoagulante presente en la muestra, fue 45 segundos medidos con el método 3 PiCT®.
Tabla 8B: DRC en muestras de NPP con adición de argatrobán según lo medido con el método 3 PiCT®. Se exponen solamente los valores promedio. El número de mediciones ("n") fue n=4. El tiempo de coagulación para la situación inicial, es decir, sin ningún anticoagulante presente en la muestra, fue 45 segundos medidos con el método 3 PiCT®.
Con respecto a rivaroxabán o apixabán, se estableció la DRC haciendo uso del método 4 PiCT® con extrapolación de los tiempos de coagulación relevantes asociados con las condiciones particulares. Los siguientes son ejemplos de tiempos de coagulación obtenidos en el analizador ACL TOP® 500 haciendo uso de las muestras de NPP con adición de cantidades incrementales de niveles de anticoagulantes que cubren el pico promedio y las concentraciones mínimas de rivaroxabán (véanse Mueck W, Thromb Haemost 2008, 100:453-461; Xu XS, Br J Clin Pharmacol 2012, 74:86-97; Baglin T, J Thromb Haemost. 2013 Jan 24) como se muestra en la Tabla 10A o apixabán (véanse Raghavan N, Drug Metab Dispos 2009, 37:74-81; Frost C, Br J Clin Pharmacol 2012, 75:476-487; Frost C, Br J Clin Pharmacol 2013, 76:776-786) como se muestra en la Tabla 10B. Se exponen solamente los valores promedio. Para la situación inicial, es decir, sin ningún anticoagulante presente en la muestra, el número de mediciones fue n=4 con un tiempo de coagulación de 54 segundos medidos con el método 4 PiCT®.
Tabla 10A: Método 4 PiCT® usando NPP con adición de rivaroxabán y n=4.
Para más detalles, véase el texto.
Tabla 10B: Método 4 PiCT® usando NPP con adición de apixabán y n=4.
Para más detalles, véase el texto.
Ejemplo 6: Pefakit® PiCT® como herramienta para evaluar si los niveles de NOAC son lo suficientemente bajos
Para responder esta pregunta con respecto a rivaroxabán o apixabán, se generó una DRC haciendo uso del método 4 PiCT® (ver arriba). Los tiempos de coagulación relevantes asociados con las condiciones particulares se extrapolaron. Todos los datos se obtuvieron usando el analizador ACL TOP® 500 y muestras de plasma con adición de niveles de anticoagulante correspondientes a la concentración en el plasma descrito como niveles de lavado. El resultado se expone en la Tabla 11.
Tabla 11: uso del método 4 PiCT® y muestras de plasma con adición de distintas concentraciones reducidas de dos anticoagulantes, es decir rivaroxabán y apixabán. Para más detalles, véase el texto.
Con el propósito de evaluar el nivel de dabigatrán en una muestra, se generó una DRC haciendo uso del método 3 PiCT®, los tiempos de coagulación relevantes asociados con las condiciones particulares se extrapolaron. Todos los datos se obtuvieron usando el analizador ACL TOP® 500 y las muestras de plasma con adición de niveles de anticoagulante correspondientes a la concentración en el plasma se describieron como niveles de lavado. El resultado se expone en la Tabla 12.
Tabla 12: uso del método 3 PiCT® y muestras de plasma con adición de diferentes concentraciones reducidas de dabigatrán. Para más detalles, véase el texto.
Claims (14)
1. Método para determinar cualitativa y cuantitativamente la presencia de un anticoagulante en una muestra usando tiempo de coagulación inducido por protrombinasa (PiCT), en donde la presencia de anticoagulantes en la muestra prolonga, en un modo dependiente de la dosis, el tiempo hasta la coagulación, en donde dicho método comprende: (1) el uso de PiCT estándar, que comprende añadir a la muestra una cantidad definida de activador de PiCT, incubación a 37°C por un período de tiempo específico, añadir el reactivo de partida y medir el tiempo hasta la coagulación en dicha mezcla de reacción;
(2) el uso de una versión adaptada tal como PiCT invertido, que comprende añadir a la muestra el reactivo de partida, incubación a 37°C por un período de tiempo específico, añadir una cantidad definida de activador de PiCT y medir el tiempo hasta la coagulación en dicha mezcla de reacción;
(3) el uso de intervalos de referencia que se adaptan al sistema de detección y al método de ensayo, en donde los intervalos de referencia se comparan con los tiempos de coagulación en la mezcla de reacción y en donde los tiempos de reacción fuera del intervalo en la mezcla de reacción indican la presencia de anticoagulantes; y
(4) confirmación de tiempos de coagulación en la mezcla de reacción usando tiempo de trombina parcial activado (aPTT) y tiempo de protrombina (PT) para identificar la naturaleza del anticoagulante;
en donde la muestra se selecciona entre sangre o plasma, y los anticoagulantes se seleccionan entre anticoagulantes directos o indirectos FIIa o FXa.
2. Método según la reivindicación 1, en donde los inhibidores directos de FIIa se seleccionan entre hirudina, argatrobán, dabigatrán, dabigatrán exilato.
3. Método según la reivindicación 1, en donde los fármacos anticoagulantes directos de FXa se seleccionan entre rivaroxabán, apixabán, edoxabán, betrixabán u otamixabán.
4. Método según la reivindicación 1, en donde los fármacos anticoagulantes se seleccionan entre fondaparinux o heparinas.
5. Método según la reivindicación 4, en donde las heparinas se seleccionan entre UFH o LMWH.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende la identificación de fármacos anticoagulantes en la mezcla de reacción, en donde:
(a) en ausencia de todo fármaco, los tiempos de reacción de acuerdo con los pasos (1), (2) y (4) de la reivindicación 1 están dentro de los intervalos de referencia,
(b) en presencia de inhibidores directos de FXa, los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (1) de la reivindicación 1 están dentro de los intervalos de referencia y los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (2) de la reivindicación 1 están fuera del intervalo, y el PT y el aPTT de acuerdo con el paso (4) de la reivindicación 1 dependen de la dosis o bien dentro o fuera de los intervalos de referencia;
(c) en presencia de inhibidores directos de FIIa, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1) y (2) de la reivindicación 1, y tanto el PT como el aPTT de acuerdo con el paso (4) de la reivindicación 1, están fuera del intervalo; (d) en presencia de hasta 150 ng/ml de dabigatrán, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1) y (2) de la reivindicación 1 y el aPTT de acuerdo con el paso (4) de la reivindicación 1 están fuera del intervalo, pero el PT de acuerdo con el paso (4) de la reivindicación 1 está dentro de los intervalos de referencia;
(e) en presencia de UFH, LMWH o hasta 0,4 pg/ml de hirudina, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1) y (2) de la reivindicación 1 y el aPTT de acuerdo con el paso (4) de la reivindicación 1 están fuera del intervalo, pero el PT de acuerdo con el paso (4) de la reivindicación 1 está dentro de los intervalos de referencia;
(f) en presencia de más de 0,4 pg/ml de hirudina, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1), (2) y (4) de la reivindicación 1 están fuera del intervalo;
(g) en presencia de fondaparinux, los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (1) y el paso (2) de la reivindicación 1 están fuera del intervalo, y el PT y el aPTT de acuerdo con el paso (4) están dentro de los intervalos de referencia.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que además comprende:
(5) adición de polibreno a la muestra,
(6) repetición de (a) PiCT estándar o (b) PiCT invertido de acuerdo con el paso (1) o el paso (2) de la reivindicación 1.
8. Método según la reivindicación 7, en donde:
(a) en presencia de heparinas, los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (6a) de la reivindicación 7 retornan a los intervalos de referencia;
(b) en presencia de inhibidores directos de FII o hirudina, los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (6a) o (6b) de la reivindicación 7 permanecen fuera del intervalo;
(c) en presencia de hasta 50 ng/ml de inhibidores directos de FXa, los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (6a) de la reivindicación 7 permanecen dentro de los intervalos de referencia;
(d) en presencia de más de 300 ng/ml de inhibidores directos de FXa, los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (6a) de la reivindicación 7 salen del intervalo;
(e) en presencia de inhibidores directos de FXa, los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (6b) de la reivindicación 7 permanecen fuera del intervalo.
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para identificación de inhibidores directos de FIIa o FXa en una muestra.
10. Uso de PiCT, aPTT y PT para identificación de fármacos anticoagulantes en una muestra seleccionada entre sangre o plasma, en donde la presencia de anticoagulantes en la muestra prolonga, en un modo dependiente de la dosis, el tiempo hasta la coagulación en comparación con los intervalos de referencia que se adaptan al sistema de detección, y en donde el método de ensayo comprende:
(1) medir el tiempo de coagulación en la muestra mediante PiCT estándar, que comprende añadir a la muestra una cantidad definida de activador de PiCT, incubación a 37°C por un período de tiempo específico, añadir el reactivo de partida y medir el tiempo hasta la coagulación en dicha mezcla de reacción;
(2) medir el tiempo de coagulación en la muestra mediante PiCT invertido, que comprende añadir a la muestra el reactivo de partida, incubación a 37°C por un período de tiempo específico, añadir una cantidad definida de activador de PiCT y medir el tiempo hasta la coagulación en dicha mezcla de reacción;
(3) medir el tiempo de coagulación en la muestra mediante aPTT, y
(4) medir el tiempo de coagulación en la muestra mediante PT;
en donde:
(a) en ausencia de todo fármaco, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1) a (4) están dentro de los intervalos de referencia,
(b) en presencia de inhibidores directos de FXa, los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (1) están dentro de los intervalos de referencia, los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (2) están fuera del intervalo y los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (3) y (4) están dentro de los intervalos de referencia en presencia de hasta 50 ng/ml y fuera del intervalo en presencia de más de 300 ng/ml de inhibidores directos de FXa;
(c) en presencia de inhibidores directos de FIIa, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1), (2), (3) y (4) están fuera del intervalo;
(d) en presencia de hasta 150 ng/ml de dabigatrán, UFH, LMWH o hasta 0,4 gg/ml de hirudina, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1), (2) y (3) están fuera del intervalo, y los tiempos de coagulación de acuerdo con el paso (4) están dentro de los intervalos de referencia;
(e) en presencia de más de 0,4 gg/ml de hirudina, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1), (2), (3) y (4) están fuera del intervalo;
(f) en presencia de fondaparinux, los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (1) y (2) están fuera del intervalo y los tiempos de coagulación de acuerdo con los pasos (3) y (4) están dentro de los intervalos de referencia.
11. Uso según la reivindicación 10, que además comprende:
(5) adición de polibreno a la muestra y
(6) repetición de PiCT estándar de acuerdo con el paso (1) y/o PiCT invertido de acuerdo con el paso (2) de la reivindicación 10.
12. Uso según la reivindicación 11, en donde en el paso (6) de la reivindicación 11 se repite el PiCT estándar, y en donde:
(a) los tiempos de coagulación de UFH o LMWH según la reivindicación 10(d) retornan a los intervalos de referencia, (b) los tiempos de coagulación según la reivindicación 10(c) o 10(e) no retornan a los intervalos de referencia, (c) los tiempos de coagulación de hasta 50 ng/ml de inhibidores directos de FXa según la reivindicación 10(b) aún están dentro de los intervalos de referencia, mientras que los tiempos de coagulación de más de 300 ng/ml de inhibidores directos de FXa según la reivindicación 10(b) salen del intervalo.
13. El método o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende el uso de Pefakit® PiCT®.
14. El método o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el sistema de detección se selecciona entre la serie ACL-TOP, la serie Stago STA compact o la serie Siemens BCS XP.
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