ES2903187T3 - Procedimientos de producción de organoides neuronales de bioingeniería (BENO) y sus usos - Google Patents

Procedimientos de producción de organoides neuronales de bioingeniería (BENO) y sus usos Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de producción de un organoide neuronal de bioingeniería (BENO) a partir de células madre pluripotentes (PSC), comprendiendo el procedimiento: (A) cultivar PSC, incrustadas en una matriz inmersa en un medio de cultivo celular sin suero; (B) cultivar las PSC en dicha matriz de la etapa (A) en un medio de cultivo celular sin suero que comprende un inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCKi) y FGF-2; (C) cultivar el BENO en formación procedente de las PSC y la matriz de la etapa (B) en un medio de cultivo celular sin suero que comprende ácido retinoico y uno o más inhibidores de la señalización SMAD para inducir la neurogénesis; (D) cultivar el BENO en formación de la etapa (C) en un medio de cultivo celular sin suero que comprende TGF-beta y FGF-2 para potenciar la génesis de células gliales y la neurogénesis; (E) cultivar el BENO en formación de la etapa (D) en un medio de cultivo celular sin suero que comprende TGF-beta y uno o más inhibidores de la señalización notch para mejorar la génesis de las células gliales y la neurodiferenciación, en el que la matriz comprende colágeno y en el que el BENO se produce dentro de un entorno 3D, en el que el entorno 3D está definido inicialmente por la matriz.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos de producción de organoides neuronales de bioingeniería (BENO) y sus usos
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El modelado 3D in vitro de tejidos neuronales, en particular de tejidos derivados de un cerebro de mamífero, tal como un cerebro humano, representa una poderosa herramienta de bioingeniería de tejidos que permite el estudio de sistemas celulares neuronales complejos. En general, los sistemas de cultivo celular en 3D ofrecen una diferenciación celular más rápida, una mayor complejidad celular y una mayor longevidad en comparación con los sistemas de cultivo en 2D respectivos. Un enfoque prometedor para el modelado 3D in vitro de tejidos neuronales implica el uso de células madre pluripotentes (PSC), que se han empleado en el modelado de varios tejidos y órganos humanos. Estas ventajas de las metodologías de modelado en 3D, en combinación con las recientes tecnologías utilizadas, por ejemplo, en la reprogramación de fibroblastos de pacientes en PSC inducidas, ofrecen colectivamente un nuevo horizonte para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes responsables de una variedad de enfermedades humanas basadas en las neuronas.
Existen en la literatura numerosos protocolos para inducir la diferenciación neuronal de las células madre humanas. Uno de estos procedimientos consiste en la inducción del neuroectodermo mediante la inhibición de la vía de señalización SMAD (Sma and Mad Related Family) dual (es decir, mediante la inhibición de BMP y TGF beta) durante aproximadamente 8-12 días en cultivo (Chambers, Fasano et al., Nat. Biotechnol., 2009). En este momento, la mayoría de las células madre se transforman en células progenitoras neuronales (NCP). Después del día 12, varios protocolos (Lancaster and Knoblich, Science, 2014) permiten la diferenciación espontánea de las células a diversas células neuronales y gliales, mientras que otros protocolos (Qian, Nguyen et al., Cell, 2016; Birey, Andersen et al., Nature, 2017) aplican varios factores de patrón para modelar los tejidos, o factores neurotróficos (BDNF, GDNF) para mejorar la supervivencia neuronal. Además, se ha observado que la adición de dbcAMP o la inhibición de notch mediante DAPT puede potenciar la diferenciación neuronal de dichas células pluripotentes (Crawford and Roelink, Dev. Dyn., 2007 Kriks, Shim et al., Nature, 2011). Las diferencias en los factores utilizados para la inducción y la diferenciación neuronal, así como el momento de los tratamientos, definen el potencial de diferenciación que ofrecen estos procedimientos. En otro informe, se produjeron organoides cerebrales humanos como modelo de microcefalia, una enfermedad que no es fácilmente reproducible utilizando modelos de ratón (Lancaster et al., Nature, 2013, Qian, Nguyen et al., Cell, 2016). Lancaster et al., Nature Biotechnology 2017; Bagley et al., Nature Methods 2017 Paca et al., Nature Methods 2015; Kothapalli & Kamm, Biomaterials 2013 Kuijlaars et al., Scientific Reports 2016 documento WO 2016/028880 A1; y Quadrato et al., Nature 2017 desvelan otros protocolos para la generación de organoides cerebrales.
A pesar de los avances en la generación de organoides neuronales humanos, todavía existen numerosas deficiencias que limitan la utilidad de los organoides neuronales existentes. Por ejemplo, los procedimientos conocidos carecen de una definición precisa de los organoides neuronales, por lo que éstos suelen presentar una gran variabilidad fenotípica. Esto se debe en parte al uso rutinario de Matrigel como sustrato de apoyo a la neurogénesis.
Otro inconveniente asociado a los procedimientos conocidos es la falta de función de la red neuronal de los organoides producidos, lo que limita significativamente cualquier investigación sobre la funcionalidad y plasticidad neuronal. La modelización de enfermedades y el desarrollo de fármacos también se ven limitados por el remoto parecido fenotípico de las estructuras de organoides neuronales producidas de forma conocida en comparación con el tejido cerebral normal.
Por lo tanto, existe la necesidad de procedimientos para generar organoides neuronales basados en el uso de componentes químicamente definidos para permitir la consistencia de las estructuras producidas. Además, es necesario producir organoides neuronales capaces de formar redes neuronales funcionales para imitar de forma significativa las estructuras neuronales naturales.
La presente invención proporciona procedimientos que permiten una diferenciación neuronal robusta y reproducible en un sistema de cultivo celular 3D bien definido, que además proporciona una base sólida para las investigaciones sobre la formación, y las características de plasticidad, de una red neuronal funcional.
Los organoides de la presente invención ofrecen además una valiosa herramienta en el desarrollo de fármacos. Por ejemplo, estos organoides pueden disminuir significativamente los costes típicamente exorbitantes asociados al desarrollo de fármacos tanto preclínicos como clínicos, al menos por la menor necesidad de experimentación con animales y la reducción del número de pacientes necesarios en los ensayos clínicos a la hora de predecir el resultado posterior a la comercialización. Además, los nuevos productos biológicos (por ejemplo, las terapias con ARN no codificante) y la edición del genoma (por ejemplo, mediante plataformas basadas en CRISPR) pueden probarse eficazmente en modelos humanos. Los rápidos avances en este campo se benefician, por tanto, de la disponibilidad de modelos de organoides humanos altamente predictivos como los que proporciona la presente invención.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de un organoide neuronal de bioingeniería (BENO) a partir de células madre pluripotentes (PSC), comprendiendo el procedimiento:
(A) cultivar PSC incrustadas en una matriz inmersa en un medio de cultivo celular sin suero;
(B) cultivar las PSC en dicha matriz de la etapa (A) en un medio de cultivo celular sin suero que comprenda un inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCKi) y FGF-2;
(C) cultivar el BENO en formación procedente de las PSC y la matriz de la etapa (B) en un medio de cultivo celular sin suero que comprenda ácido retinoico y uno o más inhibidores de la señalización SMAD para inducir la neurogénesis;
(D) cultivar el BENO en formación de la etapa (C) en un medio de cultivo celular sin suero que comprende TGF-beta y FGF-2 para potenciar la génesis de células gliales y la neurogénesis;
(E) cultivar el BENO en formación de la etapa (D) en un medio de cultivo celular sin suero que comprende TGF-beta y uno o más inhibidores de la señalización notch para potenciar la génesis de las células gliales y la neurodiferenciación.
La matriz comprende colágeno y el BENO se produce dentro de un entorno 3D definido inicialmente por la matriz.
En algunas realizaciones, la matriz no comprende Matrigel. En otras realizaciones, la matriz no comprende Matrigel u otros componentes de origen natural que tengan una composición no definida. En las realizaciones más preferentes, la matriz comprende colágeno de tipo I. En algunas realizaciones, la matriz es colágeno. En algunas realizaciones, la matriz es colágeno I.
En algunas realizaciones, el medio de la etapa (C) comprende al menos dos inhibidores de la señalización de SMAD, preferentemente en los que los inhibidores de la señalización de SMAD comprenden nogina y SB 431542. En algunas realizaciones, los inhibidores de la señalización SMAD son nogina y SB 431542.
En algunas realizaciones, el inhibidor de la señalización notch de la etapa E es DAPT.
En una realización, los inhibidores de la señalización SMAD son nogina y SB 431542 y el inhibidor de la señalización notch de la etapa E es DAPT.
En algunas realizaciones, la matriz es colágeno empleado a una concentración entre 0,05 mg/ml y 50 mg/ml, preferentemente entre 0,1 mg/ml y 10 mg/ml, más preferentemente entre 0,5 mg/ml y 5 mg/ml, lo más preferentemente a una concentración de 1 mg/ml.
En algunas realizaciones, el ácido retinoico se emplea a una concentración efectiva entre 0,01 pM y 100 pM, preferentemente entre 0,1 pM y 10 pM, más preferentemente entre 0,5 pM y 5 pM, lo más preferentemente a una concentración de 1 pM. En algunas realizaciones, la nogina se emplea a una concentración efectiva de 0,1 ng/ml -1 pg/ml, preferentemente 1 ng/ml - 500 ng/ml, más preferentemente 10 ng/ml - 200 ng/ml, lo más preferentemente 50 ng/ml. En algunas realizaciones, SB 431542 se emplea a una concentración efectiva de 0,1 pM -1 mM, preferentemente 1 pM -100 pM, más preferentemente entre 5 pM y 50 pM, lo más preferentemente 10 pM. En algunas realizaciones, TGF-beta se emplea a una concentración efectiva de entre 0,1 ng/ml y 100 ng/ml, preferentemente entre 0,3 ng/ml y 30 ng/ml, más preferentemente entre 1 ng/ml y 10 ng/ml, lo más preferentemente a una concentración de 5 ng/ml. En algunas realizaciones, FGF-2 se emplea a una concentración efectiva de 0,1 ng/ml y 1 pg/ml, preferentemente entre 1 ng/ml y 100 ng/ml, más preferentemente entre 5 ng/ml y 50 ng/ml, lo más preferentemente a una concentración de 10 ng/ml. En algunas realizaciones, DAPT se emplea a una concentración efectiva de entre 0,01 pM y 100 pM, preferentemente entre 0,1 pM y 10 pM, más preferentemente entre 0,5 pM y 5 pM, lo más preferentemente a una concentración de 2,5 pM.
En algunas realizaciones, ácido retinoico se emplea a una concentración de entre 05 pM y 5 pM, el nogina se emplea a una concentración de 10 ng/ml - 200 ng/ml, el SB 431542 se emplea a una concentración de entre 5 pM y 50 pM, TGF-beta se emplea a una concentración de entre 1 ng/ml y 10 ng/ml, FGF-2 se emplea a una concentración de entre 5 ng/ml y 50 ng/ml, y DAPT se emplea a una concentración de entre 0,5 pM y 5 pM.
En algunas realizaciones, el ácido retinoico se emplea a una concentración de entre 0,5 pM y 5 pM, nogina se emplea a una concentración de entre 10 ng/ml y 200 ng/ml, SB 431542 se emplea a una concentración de entre 5 pM y 50 pM, TGF-beta se emplea a una concentración de entre 1 ng/ml y 10 ng/ml, FGF-2 se emplea a una concentración de entre 5 ng/ml y 50 ng/ml, el DAPT se emplea a una concentración de entre 0,5 pM y 5 pM, y la matriz es colágeno, empleada a una concentración entre 0,1 mg/ml y 10 mg/ml.
En algunas realizaciones, ácido retinoico se emplea a una concentración de 1 pM, nogina se emplea a una concentración de 50 ng/ml, SB 431542 se emplea a una concentración de 10 pM, TGF-beta se emplea a una concentración de 5 ng/ml, FGF-2 se emplea a una concentración de 10 ng/ml, y DAPT se emplea a una concentración de 2,5 |jM.
En algunas realizaciones, ácido retinoico se emplea a una concentración de 1 j M, nogina se emplea a una concentración de 50 ng/ml, SB 431542 se emplea a una concentración de 10 j M, TGF-beta se emplea a una concentración de 5 ng/ml, FGF-2 se emplea a una concentración de 10 ng/ml, DAPT se emplea a una concentración de 2,5 j M, y la matriz es colágeno, empleada a una concentración entre 0,5 mg/ml y 5 mg/ml
En alguna realización, las PSC son células animales. En alguna realización, las PSC son células de mamífero. En alguna realización, las PSC son células de roedores (por ejemplo, de ratones o ratas) o humanas. En las realizaciones preferentes, las PSC son PSC humanas. Las PSC de la presente invención no se producen mediante un procedimiento que implique una modificación de la identidad genética de la línea germinal de un ser humano o que implique el uso de un embrión humano con fines industriales o comerciales.
Las diferentes etapas de la invención se realizan durante varios períodos. En una realización, la etapa (A) se realiza en el día -1. En una realización, la etapa (B) se realiza desde el día -1 hasta el día 0. En una realización, la etapa (C) se realiza desde el día 0 hasta el día 8. En una realización, la etapa (D) se realiza desde el día 8 hasta el día 15. En una realización, la etapa (E) se realiza desde el día 15 hasta al menos el día 28. En una realización, la etapa (A) se realiza en el día -1 y la etapa (B) se realiza desde el día -1 hasta el día 0. En una realización, la etapa (A) se realiza el día -1, la etapa (B) se realiza desde el día -1 hasta el día 0 y la etapa (C) se realiza desde el día 0 hasta el día 8. En una realización, la etapa (A) se realiza en el día -1, la etapa (B) se realiza del día -1 al día 0, la etapa (C) se realiza del día 0 al día 8, y la etapa (D) se realiza del día 8 al día 15. En una realización, la etapa (A) se realiza el día -1, la etapa (B) se realiza desde el día -1 hasta el día 0, la etapa (C) se realiza desde el día 0 hasta el día 8, la etapa (D) se realiza desde el día 8 hasta el día 15 y la etapa (E) se realiza desde el día 15 hasta al menos el día 28. En una realización, la etapa (A) se realiza el día -1, la etapa (B) se realiza desde el día -1 hasta el día 0, la etapa (C) se realiza desde el día 0 hasta el día 10, la etapa (D) se realiza desde el día 10 hasta el día 15 y la etapa (E) se realiza desde el día 15 hasta al menos el día 28.
En un aspecto, la invención proporciona organoides neuronales, por ejemplo, organoides neuronales de bioingeniería (BENO) producidos por el procedimiento de la invención, caracterizados en que el BENO está incrustado en una matriz que comprende colágeno y que las células neuronales del organoide neuronal están organizadas en una red neuronal funcional.
En algunos aspectos, la invención está dirigida al uso de BENO producidos por procedimientos de la invención como modelo para una enfermedad. En algunas realizaciones, la invención se dirige al uso de BENO producidos por procedimientos de la invención como modelos para una enfermedad relacionada con el tejido neuronal. En algunas realizaciones, la invención está dirigida al uso de BENO producidos por los procedimientos de la invención como modelos para una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en derrame cerebral, trastornos de inflamación cerebral, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades neuroinflamatorias, lesiones traumáticas, canalopatías y enfermedades psiquiátricas. En algunas realizaciones, la invención se dirige al uso de BENO producidos por procedimientos de la invención como modelos para una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades neurodegenerativas (tal como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer), enfermedades neuroinflamatorias (por ejemplo, esclerosis múltiple), lesiones traumáticas (por ejemplo, lesiones inducidas por cirugía cerebral), canalopatías (por ejemplo, epilepsia) y enfermedades psiquiátricas (por ejemplo, autismo, esquizofrenia).
En otros aspectos, la invención se dirige al uso de BENO producidos por procedimientos de la invención como modelo para una enfermedad, en el que los BENO están en co-cultivo con otra plataforma de ingeniería de tejidos. En algunas realizaciones, la otra plataforma de ingeniería de tejidos se selecciona del grupo que consiste en EHM (músculo cardíaco de ingeniería), BSM (músculo esquelético de bioingeniería), ESM (músculo esquelético de ingeniería), ELT (tejido hepático de ingeniería) y ECT (tejido conectivo de ingeniería). En otras realizaciones, la otra plataforma de ingeniería de tejidos se selecciona del grupo que consiste en modelos de tumores (por ejemplo, invasión cerebral del tumor, propagación de metástasis) y modelos de infiltración de leucocitos (por ejemplo, enfermedad autoinmune).
En algunos aspectos, la invención está dirigida al uso de BENO producidos por procedimientos de la invención en las pruebas de fármacos, como el descubrimiento de fármacos y el perfeccionamiento de fármacos mediante pruebas fenotípicas de fármacos. Este uso de los BENO incluye, pero sin limitación, el descubrimiento y perfeccionamiento de fármacos que puedan inducir o mejorar la reparación, regeneración, protección y prevención de enfermedades en el tejido cerebral y neuronal.
En otros aspectos, la invención se dirige a un kit para practicar un procedimiento de la invención. En algunas realizaciones, el kit contiene PSC; una matriz que comprende colágeno; medios adecuados y los suplementos necesarios (ROCKi; FGF-2; ácido retinoico; uno o más inhibidores de la señalización SMAD seleccionados de nogina, SB 431542 (Tocris), dorsomorfina y LDN-193189 (Tocris); TGF-beta; y uno o más inhibidores de la señalización notch seleccionados de A/-[(3,5-Difluorofenil)acetil]-L-alanil-2-fenil]glicina-1,1-dimetiletil éster (DAPT), Compuesto E (Stem Cell Technologies), e inhibidores Y-secretasa). En otras realizaciones, un kit contiene una matriz que comprende colágeno; medios adecuados y los suplementos necesarios (ROCKi; FGF-2; ácido retinoico; uno o más inhibidores de la señalización SMAD seleccionados de nogina, SB 431542 (Tocris), dorsomorfina y LDN-193189 (Tocris); TGF-beta; y uno o más inhibidores de la señalización notch seleccionados de N-[(3,5-Difluorofenil)acetil]-L-alanil-2-fenil]glicina-1,1-dimetiletil éster (DAPT), Compuesto E (Stem Cell Technologies), e inhibidores Y-secretasa ). En otras realizaciones, un kit contiene una matriz que comprende colágeno y los suplementos necesarios (ROCKi; FGF-2; ácido retinoico; uno o más inhibidores de la señalización SMAD seleccionados de nogina, SB 431542 (Tocris), dorsomorfina y LDN-193189 (Tocris); TGF-beta; y uno o más inhibidores de la señalización notch seleccionados de N-[(3,5-Difluorofenil)acetil]-L-alanil-2-fenil]glicina-1,1-dimetiletil éster (DAPT), Compuesto E (Stem Cell Technologies), e inhibidores Y-secretasa).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1. Esquema de la diferenciación neuronal típica a partir de células madre.
FIG. 2. Aumento de la neurogénesis bajo la inhibición de la vía de señalización SMAD dual. FIG. 2A. Análisis de IF de los tejidos tratados exclusivamente con nogina o nogina y SB431542. Las neuronas se visualizaron utilizando un anticuerpo contra el neurofilamento (FITC-verde) y los núcleos con DAPI (Azul). El gráfico de barras representa 10 pm. La cuantificación de la relación de fluorescencia media de los tejidos enteros se presenta en el gráfico de la derecha. FIG. 2B. El análisis qPCR de los marcadores neuronales PAX6 y MAP2 muestra un aumento de 21 veces en ambos marcadores tras el tratamiento con SB431542 (n=4 tejidos/grupo).
FIG. 3. FGF-2 potencia la diferenciación neuronal. FIG. 3A. El aumento del aporte de células madre pluripotentes dio lugar a una mayor tinción de neurofilamentos en el día 28 de cultivo de BENO. FIG. 3B. Efecto proliferativo de FGF-2 sobre las células madre y NPC. La cantidad de neuronas, así como la complejidad de la red dentro de los tejidos, tal como se visualiza con la tinción de neurofilamentos, es mayor en los tejidos tratados con FGF-2 en los días 8-15.
FIG. 4. Análisis de transcripciones neuronales tras el tratamiento con BDNF y GDNF. Ni la expresión de PAX6 ni la de MAP2 aumentaron con la adición de BDNF y GDNF en el cultivo desde el día 10 hasta el día 28. Los BENO se analizaron en el día 28.
FIG. 5. Mejora de la neurogénesis mediante la inhibición de Notch. El tratamiento con DAPT desde el día 15 hasta el día 28 aumentó la abundancia de los transcritos de PAX6, sugiriendo así una mayor cantidad de compromiso neuronal.
FIG. 6. Evaluación del potencial neurogénico y gliogénico de diferentes protocolos. FIG. 6A. Resume un esquema de tratamiento realizado en los protocolos individuales del Ejemplo 1. FIG. 6B. Análisis transcriptómico del curso temporal de la generación de BENO. Se utilizó OCT4 como marcador de células madre, GFAP como marcador glial, PAX6 como marcador de NPC y neuronas y finalmente MAP2, GRIN1 y GABBR2 como marcador de neuronas maduras. Los datos se normalizaron con respecto a GAPDH. FIG. 6C. Análisis de IF de montaje completo de BENO en el día 60. Se utilizaron neurofilamentos, MAP2, sinaptofisina y GFAP para teñir las neuronas, las neuronas maduras, la sinapsis y la glía, respectivamente. FIG. 6D. Actividad de BENO calculada por la detección de la actividad del calcio documentada en 5 zonas del tejido.
FIG. 7. Mapas térmicos del análisis de RNAseq durante el curso temporal del desarrollo mostrando los datos de RNAseq sobre la neurogénesis y la maduración en BENO. FIG. 7A. Marcadores que representan los diferentes estados de diferenciación de las células madre en neuronas y glía. FIG. 7B. Marcadores de diferentes identidades neuronales. FIG. 7C. Marcadores de la capa cortical. FIG. 7D. Diferentes proteínas de maduración como receptores, canales iónicos y proteínas relacionadas con la sinapsis. Realizado en colaboración con el Dr. Rashi Halder/Prof. A. Fischer (DZNE).
FIG. 8. Desarrollo de la capa cortical en los BENO. Los progenitores de la zona subventricular TBR2+ migran concéntricamente desde el centro del organoide hacia la periferia. Allí, CTIP2 marca las neuronas de la capa profunda.
FIG. 9. Los BENO contienen neuronas inhibidoras y excitadoras. FIG 9A. GABA se expresa fuertemente en el pericarion (centro) y en los botones sinápticos de los axones de las neuronas GABAérgicas (periferia). FIG 9B. Los receptores GABBR2 se encontraron expresados en el pericarion neuronal (centro). FIG 9C. La tirosina hidroxilasa (TH) que marca las neuronas dopaminérgicas se encontró en el centro y la periferia de los organoides de forma similar a la localización del GABA. FIG 9D. La tinción con sinaptofisina indicó una red sináptica muy densa presente en la periferia del organoide. Se utilizaron neurofilamentos, MAP2 y DAPI para teñir los axones, las neuronas maduras y los núcleos, respectivamente. Gráfico de barras: 10 pm a menos que se indique lo contrario.
FIG. 10. La función de la red neuronal en los BENO sugiere funciones sinápticas integradas y jerárquicas. Las neuronas teñidas con Fura-4 se muestran en el panel izquierdo. El análisis en Matlab de diferentes regiones de interés (ROI) indicó 12 trazos diferentes que se muestran en el panel derecho. Antes de la inhibición GABAR se sincronizaron las ROI (2,3), ROI (4,5), ROI (6, 7) y ROI (11,12). La inhibición de GABAR condujo a la desincronización de las células y tras 10 minutos de lavado las células volvieron a sincronizarse. Realizado en colaboración con el Dr. Guobin Bao/Prof. D. Schild (UMG).
FIG. 11. Duración óptima de la incubación con NCM y NPEM. FIG. 11A. Análisis por qPCR de la expresión relativa del transcrito PAX6 15 días después de la generación de BENO utilizando los protocolos indicados en el esquema. FIG. 11B. Definición de la duración máxima del tratamiento de BENO con NCM (etapa C). Análisis de qPCR de la expresión relativa del transcrito PAX6 15 días después de la generación de BENO utilizando los protocolos indicados en el esquema. FIG. 11C. Análisis de inmunofluorescencia de las células positivas a PAX6/ki67 para marcar las células progenitoras neuronales en proliferación.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "organoide" se refiere a un cultivo de tejidos que forma un conjunto tridimensional, que imita, al menos parcialmente, la estructura y/o función de un órgano, tal como un órgano humano. Los organoides pueden generarse a partir de células madre pluripotentes en, por ejemplo, un entorno tridimensional (3D). Uno de estos entornos 3D para organoides es un entorno 3D con forma de esferoide. Un organoide puede considerarse además como una versión miniaturizada y simplificada de un órgano.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "organoide neuronal de bioingeniería" (BENO) es un organoide derivado de tejido neuronal que ha sido producido de acuerdo con los procedimientos de la presente invención. Un BENO puede considerarse un modelo miniaturizado y simplificado de un órgano neuronal, incluido el cerebro, o del tejido neuronal existente dentro de un órgano o que controla un órgano, por ejemplo, el tejido neuronal presente dentro del corazón (por ejemplo, el sistema nervioso simpático) y el músculo esquelético (por ejemplo, las terminaciones nerviosas nicotinérgicas en las uniones neuromusculares esqueléticas).
Un "BENO en formación", tal como se utiliza en la presente memoria, es una composición de células y matriz que está en procedimiento de convertirse en un BENO. Un BENO en formación se caracteriza porque su material celular y matricial ha sido sometido a la etapa B de los procedimientos de la invención, pero o bien no ha sido sometido aún a la etapa E de los procedimientos de la invención o bien la etapa E no ha terminado.
El término "entorno 3D", tal como se utiliza en la presente memoria, representa una estructura que se extiende en las tres dimensiones del espacio. En el contexto de un cultivo celular, un entorno 3D corresponde a una estructura en la que las células están dispuestas en un espacio tridimensional en relación con las demás. Un ejemplo de entorno 3D es una disposición esférica. A diferencia de un entorno 3D, se trata de un entorno 2D, en el que las células están dispuestas en una sola capa, por ejemplo, no hay diferencia en una de las dimensiones de la relación espacial entre las células.
El término "sistema de cultivo celular 3D", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere al cultivo de células en un entorno 3D, al menos inicialmente definido por una matriz 3D.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "células madre pluripotentes" (CMP) son células que tienen la propiedad de autorreplicarse y una propensión a diferenciarse en células que se encuentran en las tres capas germinales (endodermo, ectodermo y mesodermo). las PSC existen en un estado indiferenciado y se caracterizan por una abundante expresión de factores de estaminalidad tal como Oct-3/4, SSEA-4 y TRA1-60, una propiedad de autorreplicación y una propensión a diferenciarse en células de las tres capas germinales (endodermo, ectodermo y mesodermo). Las PSC pueden derivarse de numerosas fuentes, incluyendo pero sin limitación, células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células madre partenogenéticas, células madre generadas por transferencia de núcleo y células madre embrionarias (ESC) y sus combinaciones. Las ESC pueden ser de líneas de ESC existentes. Las PSC de la presente invención no se producen mediante un procedimiento que implique una modificación de la identidad genética de la línea germinal de un ser humano o que implique el uso de un embrión humano con fines industriales o comerciales. Las PSC incluyen además líneas celulares de PSC. El origen de las PSC tal y como se utilizan en la presente memoria no está particularmente limitado, pero son preferentes las células derivadas de mamíferos, más preferentemente las células son de origen humano.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "reprogramación" se refiere a los procedimientos en los que una célula más especializada o una célula en alguna otra forma de etapa avanzada de desarrollo puede convertirse en una célula pluripotente.
El término "célula diferenciada", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una célula que ha pasado de un fenotipo precursor no especializado a un fenotipo especializado. Por ejemplo, una célula embrionaria puede diferenciarse en una célula epitelial de revestimiento del intestino. Por ejemplo, las células diferenciadas pueden aislarse de un feto o de un animal vivo.
Las "células madre pluripotentes inducidas" (iPSC), tal y como se utilizan en la presente memoria, representan un tipo de célula madre pluripotente derivada artificialmente de una célula no pluripotente, típicamente una célula somática adulta. Las células madre pluripotentes inducidas se consideran similares, si no idénticas, a las células madre pluripotentes naturales, incluidas las células madre embrionarias, por ejemplo, en cuanto a la expresión de ciertos genes y proteínas de las células madre, los patrones de metilación de la cromatina, el tiempo de duplicación, la formación de cuerpos embrionarios, la formación de teratomas, la formación de quimeras viables y la potencia y diferenciabilidad.
El término "células progenitoras neuronales" (NCP), tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a las células derivadas de las PSC que tienen la capacidad de experimentar una proliferación celular, de regenerar copias exactas de sí mismas (auto-renovación) y de generar una progenie celular de células singularmente diferenciadas. La progenie de las NPC puede ser tanto células neuronales (tal como precursores neuronales o neuronas maduras) como células gliales (tal como precursores gliales, astrocitos maduros u oligodendrocitos maduros). Normalmente, las NPC no producen progenie de otras capas germinales embrionarias cuando se cultivan por sí mismas in vitro, a menos que, por ejemplo, sean desdiferenciadas o reprogramadas de alguna manera. A diferencia de las células madre como las PSC, las NPC tienen una capacidad proliferativa limitada y, por lo tanto, no muestran una capacidad de automantenimiento.
El término "Matrigel", tal como se utiliza en la presente memoria, es una composición derivada de los sarcomas de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (Kleinman et al., Biochemistry, 1982). Matrigel es una mezcla que no está definida químicamente con precisión, pero que generalmente comprende laminina, colágeno IV, proteoglicanos de sulfato de heparina, entactina y factores de crecimiento. Matrigel se utiliza habitualmente como matriz para el cultivo de células.
Los términos "químicamente bien definida" o "bien definida", tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren a composiciones cuya composición química se conoce con un grado suficiente de precisión. Por ejemplo, como máximo el 10 %, preferentemente como máximo el 5 %, del contenido total de la composición no está químicamente caracterizado o varía en diferentes muestras de la composición.
Los "componentes de origen natural con una composición no definida", tal y como se utilizan en la presente memoria, se refieren a las composiciones que han sido aisladas de fuentes naturales (células o tejidos de animales, plantas, hongos y células protistas o virus) que no están químicamente definidas con precisión. Por ejemplo, al menos el 10 % del contenido total de la composición debe estar sin caracterizar o variar en diferentes muestras de la composición. Los ejemplos de componentes de origen natural que tienen una "composición no definida" incluyen sueros y Matrigel.
El término "factor de crecimiento de fibroblastos-2" (FGF-2), tal como se utiliza en la presente memoria, es un miembro de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos. FGF-2 está codificado por el gen FGF2. FGF-2 también se conoce como "factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF)" Los términos FGF-2 y bFGF se utilizan indistintamente en la presente memoria.
Una "red neuronal", tal como se utiliza en la presente memoria, representa un grupo de una o más neuronas interconectadas. La conexión entre las neuronas de una red neuronal permite la transmisión de información de una neurona a otras. En una red neuronal, la conexión entre las neuronas puede ser a través de sinapsis. La presencia de una red neuronal puede confirmarse fácilmente, por ejemplo, mediante el uso de imágenes de calcio de las neuronas.
La "organización de la red neuronal", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la organización de un grupo de neuronas como una red neuronal. Esta organización de las neuronas como red neuronal puede crear una red jerárquica.
Una "red neuronal funcional", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una red neuronal que muestra una transmisión de información electroquímica de una neurona a otra. Las redes neuronales funcionales requieren la formación de sinapsis funcionales. Las redes neuronales funcionales se caracterizan por los patrones de actividad de la red, que pueden incluir la actividad eléctrica sincronizada de más de una neurona de la red o los patrones que muestran las interdependencias funcionales entre las neuronas de la red, incluidos patrones de activación o inhibición de las neuronas. La presencia de una red neuronal puede confirmarse, por ejemplo, mediante imágenes de calcio de las neuronas. En particular, la reacción de un grupo de neuronas a las moléculas de señalización o la inhibición de los receptores de moléculas de señalización (por ejemplo, los receptores GABA) puede confirmar la presencia de una red neuronal funcional. Un ejemplo que evidencia una red neuronal funcional es cuando las neuronas de la red muestran señales de calcio sincronizadas (por ejemplo, picos de calcio), que se desincronizan tras la adición de un inhibidor del receptor que inhibe una molécula de señalización neuronal y que posteriormente se vuelven a sincronizar tras la eliminación del inhibidor. La "función de la red neuronal", tal como se utiliza en la presente memoria, es la transmisión de información electroquímica de una neurona a otra.
El término "inducir", tal y como se utiliza en la presente memoria, significa iniciar y/o potenciar un efecto fisiológico particular, tal como la proliferación o la diferenciación celular.
La "neurogénesis", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la diferenciación y/o proliferación de células hacia células neuronales completamente diferenciadas que no son capaces de diferenciarse más. Como tal, la neurogénesis incluye la diferenciación de las PSC a NPC, la proliferación de las NPC, la diferenciación de las NPC a células neuronales más diferenciadas, por ejemplo, células neuronales (tal como precursores neuronales o neuronas maduras) o células gliales (tal como precursores gliales, astrocitos maduros u oligodendrocitos maduros), o la proliferación de células neuronales más diferenciadas.
El término "neurodiferenciación", tal y como se utiliza en la presente memoria, significa la diferenciación de las células neuronales hacia células neuronales completamente diferenciadas que no son capaces de diferenciarse más. Como tal, la neurodiferenciación incluye la diferenciación de las NPC en células neuronales más diferenciadas, por ejemplo, células neuronales (tal como precursores neuronales o neuronas maduras) o células gliales (tal como precursores gliales, astrocitos maduros u oligodendrocitos maduros), o la diferenciación de células neuronales más diferenciadas en células neuronales aún más diferenciadas, por ejemplo, de precursores neuronales a neuronas maduras.
La "incrustación de células en una matriz", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la interacción de las células con una matriz y/o la adhesión de las células a la misma. Este procedimiento está regulado por la interacción célula-matriz, por ejemplo, a través de los receptores celulares, incluidas las integrinas.
El término "matriz", tal y como se utiliza en la presente memoria, significa un material que puede crear un entorno 3D adecuado para incrustar células. Preferentemente, la matriz de la presente invención forma una estructura de hidrogel. Las matrices de ejemplo adecuadas incluyen colágeno o imitadores sintéticos del colágeno.
El término "hidrogel", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una red de polímeros hidrófilos que contienen agua, pero que no son solubles en agua. Las moléculas de hidrogel están conectadas química y/o físicamente, por ejemplo, mediante enlaces covalentes o iónicos o entrelazadas para formar así un entorno 3D. Una red de hidrogel también puede ser una red polimérica natural o sintética.
El término "células estromales", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a las células neuronales que no son células neuronales. En particular, las células estromales ejemplares incluyen células gliales, tal como precursores gliales, astrocitos maduros u oligodendrocitos maduros.
El término "señalización", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la transmisión de información (señales) dentro de una célula o entre dos o más células. La transmisión de la señalización puede producirse por medios de reacción química (tal como la fosforilación, la escisión de proteínas), a través de una liberación de moléculas de señalización (incluidos los iones, el neurotransmisor), o alternativamente, a través de cambios en el potencial electroquímico inmediato.
Por "plataforma de ingeniería tisular", tal como se utiliza en la presente memoria, se entiende un conjunto in vitro de células que está diseñado para imitar las características estructurales y/o funcionales de un tejido, preferentemente humano.
El término "pruebas fenotípicas de fármacos", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere al pruebas de la aplicabilidad de fármacos nuevos o existentes en base a su efecto sobre un fenotipo de un sistema modelo.
Los términos "bioingeniería" y "de bioingeniería", tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren a procedimientos para manipulación de sistemas biológicos y material biológico. Los ejemplos de bioingeniería son la clonación molecular, la transfección, la transducción y la influencia sobre las células mediante productos químicos u otros materiales.
El término "modelado de la enfermedad", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere al procedimiento de generación de un modelo para una enfermedad que imita algunas o todas las características de la enfermedad, al menos parcialmente. Los modelos de enfermedades pueden utilizarse para evaluar la influencia de compuestos, tal como los fármacos, sobre las enfermedades o algunas de sus características. Los modelos de enfermedad ejemplares son los cultivos celulares, los organoides y los modelos de ratón.
Todos los términos que no se definen específicamente en la presente memoria deben entenderse de acuerdo con el significado habitual en los campos de la biología y la medicina, específicamente, en las áreas de investigación de células madre y organoides.
Principio de la invención
La presente invención proporciona procedimientos para producción de organoides neuronales de bioingeniería (BENO) bajo condiciones químicamente definidas, que son reproducibles y dan como resultado un producto consistente. La inhibición escalonada de SMAD y notch en presencia de ácido retinoico y FGF-2 para mejorar la neurogénesis con TGF-beta para apoyar la gliogénesis representa una combinación única de actividades biológicas para la neurogénesis en un entorno matricial, lo que resulta en la formación de redes neuronales funcionales. Una matriz ejemplar adecuada de la invención es un hidrogel de colágeno. Al momento de la presente invención, no se podía predecir si la neurogénesis y la gliogénesis podrían ser controladas utilizando factores definidos en un entorno de matriz que no está induciendo por sí mismo la neurogénesis; en contraste con, por ejemplo, una matriz de Matrigel, que es sabido induce la neurogénesis desde su introducción por Kleinman y sus colegas en la década de 1990 (por ejemplo, Jucker et al., J Neurosci Res. 1991)
Los procedimientos de la presente invención se desarrollaron a través de varias iteraciones, por ejemplo, como se desvela en el Ejemplo 1, dando como resultado estructuras que muestran una pronunciada organización y función de la red neuronal, que es apoyada por las células del estroma de co-desarrollo, como la glía. La organización y función de la red, por ejemplo, la formación de sinapsis funcionales entre diferentes células neuronales (y, por tanto, una jerarquía funcional como se describe en el Ejemplo 5) de los organoides neuronales en la presente memoria desvelados ofrecen una serie de ventajas sobre las estructuras organoides convencionales. En particular, los organoides neuronales desvelados en la presente memoria pueden producirse mostrando una alta consistencia debido a las condiciones de cultivo definidas, comprenden redes neuronales funcionales y pueden producirse en plazos cortos (por ejemplo, 29 días a partir de la mezcla de PSC y la matriz).
Los procedimientos de la invención desvelados en la presente memoria comprenden una serie de etapas para su implementación. Estas etapas son:
(A) cultivar PSC incrustadas en una matriz inmersa en un medio de cultivo celular sin suero;
(B) cultivar las PSC en dicha matriz de la etapa (A) en un medio de cultivo celular sin suero que comprenda un inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCKi) y FGF-2;
(C) cultivar el BENO en formación procedente de las PSC y la matriz de la etapa (B) en un medio de cultivo celular sin suero que comprenda ácido retinoico y uno o más inhibidores de la señalización SMAD para inducir la neurogénesis;
(D) cultivar el BENO en formación de la etapa (C) en un medio de cultivo celular sin suero que comprende TGF-beta y FGF-2 para potenciar la génesis de células gliales y la neurogénesis;
(E) cultivar el BENO en formación de la etapa (D) en un medio de cultivo celular sin suero que comprende TGF-beta y uno o más inhibidores de la señalización notch para potenciar la génesis de las células gliales y la neurodiferenciación.
La matriz comprende colágeno y el BENO se produce dentro de un entorno 3D definido inicialmente por la matriz.
Proporción de células madre pluripotentes (PSC)
La presente invención se refiere a la producción de organoides neuronales de bioingeniería (BENO) a partir de células madre pluripotentes (PSC). Las células madre pluripotentes pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes, incluyendo, pero sin limitación, las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) (que pueden ser generadas por una reprogramación de tipos de células, incluyendo fibroblastos, queratinocitos, células derivadas de la médula ósea o células derivadas de la sangre, como las células derivadas de la sangre del cordón umbilical), células madre partenogenéticas, células madre generadas por transferencia de núcleo, y células madre embrionarias y/o sus mezclas. Las PSC de la presente invención no se producen en un procedimiento que implique la modificación de la identidad genética de la línea germinal de un ser humano o que implique el uso de un embrión humano con fines industriales o comerciales. Los procedimientos de la invención también pueden realizarse utilizando líneas celulares PSC, por ejemplo, la línea celular iPSC-G1 descrita en Tiburcy et al, Circulation, 2017.
Las PSC se caracterizan por una abundante expresión de factores de crecimiento como Oct-3/4, SSEA-4 y TRA1-60 en un estado indiferenciado, una propiedad de auto-replicación y una propensión a diferenciarse en células de las tres capas germinales (endodermo, ectodermo y mesodermo). Las PSC también pueden ser PSC inducidas (iPSC).
Antes de su uso en los procedimientos reivindicados en la presente memoria, las PSC se cultivan en condiciones apropiadas conocidas en la técnica. Las PSC pueden ser, según sea necesario, cultivadas de acuerdo con un procedimiento de mantenimiento estándar, por ejemplo, el crecimiento en un soporte de mantenimiento tal como Matrigel. Las PSC se cultivan en cualquier medio de cultivo celular apropiado conocido en la técnica. Un medio de cultivo celular ejemplar es el medio basal TeSR-E8 (Stemcell), que comprende opcionalmente un inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCKi), por ejemplo, a una concentración de 5 pM o 10 pM. Los procedimientos de cultivo ejemplares para las PSC se encuentran en Stover and Schwartz, Methods Mol Biol. 2011.
Al utilizar PSC para la presente invención, las PSC se desprenden de su soporte de mantenimiento, por ejemplo, Matrigel, por ejemplo, mediante un tratamiento con EDTA. EDTA puede utilizarse en una concentración de 0,1-10 mM, preferentemente entre 0,5 y 2 mM. El tratamiento con EDTA se realiza durante 1-10 minutos, preferentemente entre 4-6 minutos. Las condiciones preferentes de tratamiento con EDTA son 0,5 mM de EDTA durante 5-10 minutos a temperatura ambiente y 2 mM de EDTA durante 5-8 minutos a temperatura ambiente.
Cultivo de las PSC incrustadas en una matriz inmersa en un medio de cultivo celular sin suero ("etapa A")
Las PSC proporcionadas descritas anteriormente se cultivan posteriormente con una matriz, que permite la incrustación de las PSC en un entorno 3D que está definido por la matriz. La incrustación y auto-organización de las PSC dentro de dicho entorno 3D proporciona la base para que se genere el organoide de la invención. Preferentemente, las células deben estar incrustadas en la matriz de forma homogénea.
La matriz de la invención constituye un entorno 3D que facilita la auto-organización y diferenciación de las PSC y de las células derivadas de las PSC. La estructura de la matriz se estabiliza gracias a las interacciones de las moléculas individuales de la matriz, por ejemplo, las interacciones proteína-proteína. Más preferentemente, la matriz de la invención forma una estructura de hidrogel.
Las matrices adecuadas ejemplares de la presente invención son colágenos, imitaciones de colágeno, alginato, fibrina, Matrigel y quitosano. Las matrices preferentes son el colágeno y los imitadores del colágeno. La mayoría de las matrices preferentes están basadas en el colágeno tipo I. Las matrices basadas en el colágeno tipo I pueden contener trazas de otros colágenos como el colágeno tipo III. preferentemente, las matrices basadas en colágeno tipo I contienen más del 80%, más del 85%, más del 90%, más del 95% o el 100% de colágeno tipo I. Las matrices de la presente invención comprenden colágeno.
En una realización preferente, la matriz de la presente invención no comprende Matrigel. En realizaciones más preferentes, la presente matriz no comprende Matrigel u otros componentes de origen natural que tengan una composición no definida, o mal definida, de uno o más componentes. Esto es especialmente importante, ya que el uso de una mezcla química no definida o mal definida, como Matrigel, da lugar inevitablemente a mayores variaciones fenotípicas de los organoides generados. Esta observación ha sido confirmada por, por ejemplo, Tiburcy et al., Circulation, 2017. Es bien sabido que Matrigel es una mezcla no definida que comprende laminina, colágeno IV, proteoglicanos de sulfato de heparina, entactina y componentes del factor de crecimiento que se derivan de sarcomas de ratón Engelbreth-Holm-Swarm, en los que los porcentajes de los componentes de un lote a otro muestran una gran variabilidad (Kleinman et al., Biochemistry, 1982).
Las PSC y los elementos de la matriz se mezclan en un medio de cultivo celular sin suero apropiado para el cultivo de PSC. Los ejemplos de estos medios de cultivo celular son el medio basal TeSR-E8 (Stemcell) y el medio StemFlex (Gibco). El medio de cultivo celular puede complementarse con componentes adicionales como f GF-2 y ROCKi. Estos componentes pueden aumentar la supervivencia y la proliferación de las células en la matriz. Un medio ejemplar es el medio basal TeSR-E8 complementado con 20 ng/ml de FGF-2 y 10 pM de ROCKi. Otros componentes que pueden añadirse al medio de cultivo celular son el medio de cultivo celular d Me M o el NaOH para neutralizar el pH.
La matriz (tal como una matriz de colágeno) se emplea en una concentración efectiva. En algunas realizaciones, la concentración de la matriz está entre 0,05 mg/ml y 50 mg/ml. En otras realizaciones preferentes, la concentración de la matriz está entre 0,1 mg/ml y 10 mg/ml. En realizaciones más preferentes, la concentración de la matriz está entre 0,5 mg/ml y 5 mg/ml. En una realización más preferente, la concentración de la matriz es de 1 mg/ml.
La densidad de las PSC tras la mezcla con el medio y la matriz puede estar en el intervalo de 0,1-10x106 células por ml. Un intervalo preferente es de 0,5-6 x106 células por ml. Un intervalo más preferente es el de 1-4 x106 células por ml. Un valor ejemplar adecuado es 3x106 células por ml.
La presente etapa de cultivo se realiza antes de la etapa de cultivo desvelada en la siguiente sección. Esta etapa de cultivo (en el que las PSC se incrustan en una matriz; "etapa A") se realiza antes de un etapa de cultivo en el que las células se cultivan en un medio de cultivo celular que comprende un inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCKi) y FGF-2 ("etapa B"). La transición de la etapa A a la etapa B se caracteriza típicamente por la adición de los componentes de la etapa B al medio de cultivo celular existente.
En algunas realizaciones, esta etapa de cultivo A se realiza durante un período de tiempo de entre 1 minuto y 1 día. En las realizaciones preferentes, la etapa A se realiza entre 5 minutos y 5 horas. En las realizaciones más preferentes, la etapa A se realiza entre 10 minutos y 1 hora. En realizaciones aún más preferentes, la etapa A se realiza entre 15 minutos y 30 minutos. En una realización más preferente, la etapa A se realiza durante 20 minutos.
El punto de tiempo de la etapa A se denomina "día -1" por el presente protocolo relativo a la producción de los organoides inventivos.
La etapa A se realiza en un recipiente de cultivo celular adecuado. Un recipiente de cultivo celular adecuado a modo de ejemplo es una placa de 96 pocillos con fondo en U y propiedades de baja fijación.
La etapa A se realiza en condiciones adecuadas para la supervivencia de las PSC. Unas condiciones ejemplares adecuadas son 37°C, 5% deCO2, por ejemplo, en una incubadora de cultivo celular.
Cultivo de las PSC en dicha matriz de la etapa (A) en un medio de cultivo celular libre de suero que comprende un inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCKi) y FGF-2 ("etapa B")
Las PSC en la matriz de la etapa A se cultivan en un medio que comprende un inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCKi) y el factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2).
Las variantes adecuadas de ROCKi incluyen Y27632 (Stemgent), Fasudil, Ripasudil, RKI-1447, GSK429286A, Y-30141, además de otros componentes revisados en Feng et al., J Med Chem., 2016). El ROCKi se emplea en una concentración efectiva. Un ROCKi preferente es Y27632. En algunas realizaciones, la concentración de Y27632 está entre 0,1 pM y 1 mM. En realizaciones preferentes, la concentración de Y27632 está entre 1 pM y 100 pM. En realizaciones más preferentes, la concentración de Y27632 está entre 5 pM y 50 pM. En una realización más preferente, la concentración de Y27632 es de 10 pM.
FGF-2 (también denominado bFGF) se emplea a una concentración efectiva. En algunas realizaciones, la concentración de FGF-2 está entre 0,1 ng/ml y 1 pg/ml. En las realizaciones preferentes, la concentración de FGF-2 está entre 1 ng/ml y 100 ng/ml. En realizaciones más preferentes, la concentración de FGF-2 está entre 5 ng/ml y 50 ng/ml. En una realización más preferente, la concentración de FGF-2 es de 10 ng/ml. Aunque la invención emplea preferentemente FGF-2, la invención también puede llevarse a cabo utilizando un mimético del FGF-2 que tenga una actividad de señalización igual o similar a la del FGF-2, que se caracteriza por unirse a los receptores del FGF para provocar así una señalización mediada por el receptor del FGF, en la que dicha actividad es al menos el 10% de la actividad de señalización del FGF-2 en cada receptor del FGF.
En esta etapa de cultivo B, las PSC se cultivan en un medio de cultivo celular que es apropiado para el cultivo de las PSC. Algunos ejemplos de medios de cultivo celular adecuados son el medio basal TeSR-E8 (Stemcell) y el medio StemFlex (Gibco).
Esta etapa de cultivo se realiza después de la etapa A descrita anteriormente. La transición de la etapa A a la etapa B se caracteriza típicamente por la adición de los componentes de la etapa B al medio de cultivo celular existente que comprende las PSC y la matriz de la etapa A. la etapa B se realiza antes de la etapa C, que se describe a continuación. La transición de la etapa B a la etapa C se caracteriza por un intercambio parcial o completo del medio de cultivo celular o, alternativamente, la adición de los componentes de la etapa C al medio de cultivo celular existente.
En algunas realizaciones, la etapa B se lleva a cabo durante un período de tiempo de entre 6 horas y 4 días. En algunas realizaciones preferentes, la etapa B se realiza entre 12 horas y 3 días. En realizaciones más preferentes, la etapa B se realiza entre 1 día y 2 días. En una realización más preferente, la etapa B se realiza durante 1 día.
La etapa B debe comenzar en el día -1 del protocolo de producción de organoides. Dependiendo de su duración, esta etapa puede extenderse al día 0, 1, 2 o 3 del protocolo instantáneo. En una realización más preferente, la etapa B se extiende al día 0 del protocolo.
La etapa B se realiza en un recipiente de cultivo celular adecuado. Un recipiente de cultivo celular adecuado a modo de ejemplo es una placa de 96 pocillos con fondo en U y propiedades de baja fijación. Generalmente, el recipiente de cultivo celular no cambiará cuando se realicen las etapas A y B desvelados en la presente memoria.
La etapa B se realiza en condiciones adecuadas para la supervivencia de la PSC. Unas condiciones ejemplares adecuadas incluyen 37°C, 5% deCO2, por ejemplo, en una incubadora de cultivo celular.
Cultivo de los BENO formados a partir de las PSC y la matriz de la etapa (B) en un medio de cultivo celular libre de suero que comprende ácido retinoico y uno o más inhibidores de la señalización SMAD para inducir la neurogénesis ("etapa C")
Las PSC tratadas de acuerdo con la etapa B en la matriz constituyen un BENO en formación. Este BENO en formación procedente de las PSC y la matriz de la etapa B se cultiva en un medio que comprende ácido retinoico y uno o más inhibidores de las vías de señalización SMAD. Este tratamiento induce la neurogénesis.
El ácido retinoico se emplea como molécula activadora de señales. Preferentemente, se utiliza el ácido alltrans retinoico [(2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilciclohexen-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenoico]. Sin embargo, la invención también puede llevarse a cabo utilizando derivados del ácido retinoico que tengan una actividad de señalización igual o similar a la del ácido all-trans retinoico, que se caracteriza típicamente por unirse al receptor del ácido retinoico para provocar así una señalización mediada por el receptor del ácido retinoico, en la que dicha actividad es al menos el 10% de la actividad de señalización del ácido all-trans retinoico. El ácido retinoico se emplea en una concentración eficaz. En algunas realizaciones, la concentración de ácido retinoico está entre 0,01 pM y 100 pM. En realizaciones preferentes, la concentración de ácido retinoico está entre 0,1 pM y 10 pM. En realizaciones más preferentes, la concentración de ácido retinoico está entre 0,5 pM y 5 pM. En una realización más preferente, la concentración de ácido retinoico es de 1 pM.
Los inhibidores de SMAD se emplean para inhibir la señalización mediada por las proteínas homólogas a decapentaplegic (SMAD) (por ejemplo, SMAD-1 - SMAD-9). La inhibición de la señalización mediada por SMAD induce la neurogénesis. Los inhibidores adecuados de SMAD incluyen la proteína nogina, SB 431542 (Tocris), dorsomorfina y LDN-193189 (Tocris). Los inhibidores de SMAD se emplean en una concentración eficaz. Por ejemplo, la nogina puede emplearse a una concentración de 0,1 ng/ml - 1 pg/ml, preferentemente 1 ng/ml - 500 ng/ml, más preferentemente 10 ng/ml - 200 ng/ml, lo más preferentemente 50 ng/ml. El SB 431542 puede utilizarse a una concentración de 0,1 pM -1 mM, preferentemente 1 pM -100 pM, más preferentemente entre 5 pM y 50 pM, lo más preferentemente 10 pM. El uso de más de un inhibidor de SMAd puede tener efectos positivos en la inducción de la neurogénesis (Ejemplo 1). Una combinación preferente de inhibidores de SMAD comprende nogina y SB 431542. Una combinación más preferente de inhibidores de SMAD consiste en nogina y SB 431542. Una combinación preferente de inhibidores de SMAD consiste en nogina (50 ng/ml) y SB 431542 (10 pM).
Los BENO en formación se cultivan en cualquier medio de cultivo celular apropiado para el cultivo de PSC. Los medios de cultivo celular ejemplares incluyen el medio de diferenciación neuronal Stemdiff (Stemcell), el medio Neurobasal (Gibco) y el medio utilizado en el Ejemplo 2.
La etapa C de los procedimientos desvelados se realiza típicamente después de la etapa B. La transición de la etapa B a la etapa C se caracteriza por un intercambio parcial o completo del medio de cultivo celular o, alternativamente, la adición de los componentes de la etapa C al medio de cultivo celular existente. La etapa C se realiza típicamente antes de la etapa D, como se describe en la presente memoria. La transición de la etapa C a la etapa D se caracteriza por un intercambio parcial o completo del medio de cultivo celular o, alternativamente, la adición de los componentes de la etapa D al medio de cultivo celular existente.
En algunas realizaciones, la etapa C se realiza durante un período de tiempo de entre 2 días y 16 días. En algunas realizaciones preferentes, la etapa C se realiza entre 4 días y 12 días. En realizaciones más preferentes, la etapa C se realiza entre 6 días y 10 días. En una realización más preferente, la etapa C se realiza durante 8 días. Se comprobó que realizar la etapa C durante 8 días es favorable en comparación con 3 o 6 días (véase el ejemplo 8). La realización de la etapa C durante 10 días es aún más favorable que la de 8 días, mientras que una mayor extensión de la etapa C no mejoró significativamente los resultados (véase el ejemplo 8). Por lo tanto, en otra realización particularmente preferente, la etapa C se realiza durante al menos 8 días o durante 10 días.
Las "designaciones" de días en la realización de esta etapa dependen de la duración de las etapas A, B y C realizados previamente. El final de la etapa C se sitúa generalmente entre el día 2 y el día 19. En una realización más preferente, la etapa C se extiende desde el día 0 hasta el día 8. En otra realización particularmente preferente, la etapa C se extiende desde el día 0 hasta el día 10.
La etapa C se realiza utilizando cualquier recipiente de cultivo celular adecuado. Los ejemplos de recipientes de cultivo celular adecuados incluyen una placa de 96 pocillos con fondo en forma de U y propiedades de baja fijación o una placa de 6 pocillos o un recipiente impreso en 3D o moldeado a medida para el cultivo de uno o varios organoides. El recipiente de cultivo celular no suele cambiar entre las etapas B y C. El recipiente de cultivo celular puede cambiarse al realizar la etapa C. Un ejemplo de cambio de recipiente es la ampliación de una placa de 96 pocillos a una placa de 6 pocillos.
La etapa C se lleva a cabo en condiciones propicias para la supervivencia del BENO en formación. Unas condiciones ejemplares adecuadas son 37°C, 5% deCO2, por ejemplo, en una incubadora de cultivo celular.
Cultivo de BENO en formación de la etapa C en un medio de cultivo celular sin suero que comprende TGF-beta y FGF-2 para potenciar la génesis de las células gliales y la neurogénesis ("etapa D")
El BENO en formación proporcionado tras la etapa C se cultiva en un medio que comprende el factor de crecimiento transformante (TGF) beta y el factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2). El tratamiento con TGF-beta potencia la génesis de las células estromales, mientras que el FGF-2 potencia la neurogénesis.
El tratamiento con TGF-beta mejora la génesis y la funcionalidad de las células estromales en el organoide emergente. Las células del estroma son células del estroma del tejido neuronal. Las células estromales ejemplares incluyen las células gliales. TGF-beta empleado en la presente invención puede ser TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, o sus mezclas. La invención también puede llevarse a cabo utilizando un mimético de TGF-beta que tenga una actividad de señalización igual o similar a la de TGF-beta, que se caracteriza por unirse a un receptor de TGF-beta para provocar así una señalización mediada por el receptor de TGF-beta, en la que dicha actividad es al menos el 10% de la actividad de señalización de TGF-beta 1. Preferentemente, TGF-beta empleado en la presente invención es TGF-beta 1. TGF-beta se emplea en una concentración efectiva. En algunas realizaciones, la concentración de TGF-beta está entre 0,1 ng/ml y 100 ng/ml. En las realizaciones preferentes, la concentración de TGF-beta está entre 0,3 ng/ml y 30 ng/ml. En realizaciones más preferentes, la concentración de TGF-beta está entre 1 ng/ml y 10 ng/ml. En una realización más preferente, la concentración de TGF-beta es de 5 ng/ml.
FGF-2 (también denominado bFGF) se emplea a una concentración efectiva. En algunas realizaciones, la concentración de FGF-2 está entre 0,1 ng/ml y 1 pg/ml. En algunas realizaciones preferentes, la concentración de FGF-2 está entre 1 ng/ml y 100 ng/ml. En realizaciones más preferentes, la concentración de FGF-2 está entre 5 ng/ml y 50 ng/ml. En una realización más preferente, la concentración de FGF-2 es de 10 ng/ml. Aunque la invención emplea preferentemente FGF-2, la invención también puede llevarse a cabo utilizando un mimético de FGF-2 que tenga una actividad de señalización igual o similar a la de FGF-2, que se caracteriza por unirse a los receptores de FGF para provocar así una señalización mediada por el receptor de FGF, en la que dicha actividad es al menos el 10% de la actividad de señalización de FGF-2 en cada receptor del FGF.
En esta etapa de los procedimientos desvelados, el BENO en formación se cultiva en un medio de cultivo celular apropiado para cultivar PSC. Los medios de cultivo celular ejemplares incluyen el medio de diferenciación neuronal Stemdiff (Stemcell), el medio Neurobasal (Gibco) y el medio utilizado en el Ejemplo 2.
La etapa D se realiza típicamente después de la etapa C. La transición de la etapa C a la etapa D se caracteriza por un intercambio parcial o completo del medio de cultivo celular o, alternativamente, la adición de los componentes de la etapa D al medio de cultivo celular existente. La etapa D suele realizarse antes de la etapa E, que se describe a continuación. La transición de la etapa D a la etapa E se caracteriza por un intercambio parcial o completo del medio de cultivo celular o, alternativamente, la adición de los componentes de la etapa E al medio de cultivo celular existente.
En algunas realizaciones, la etapa D se realiza durante un período de tiempo de entre 2 días y 16 días. En las realizaciones preferentes, la etapa D se lleva a cabo entre 4 y 12 días. En realizaciones más preferentes, la etapa D se realiza entre 6 días y 10 días. En una realización más preferente, la etapa D se realiza durante 7 días. Se comprobó que realizar la etapa D durante 5 días no es significativamente inferior en comparación con 7 días; por el contrario, realizar la etapa D durante 2 días dio lugar a una condensación de BENO inferior (véase el ejemplo 8). Por lo tanto, en otra realización particularmente preferente, la etapa D se realiza durante un máximo de 7 días o durante 5 días.
Las "designaciones" de días en la realización de esta etapa dependen de la duración de las etapas A, B, C y D realizados previamente. En general, el punto de partida de la etapa D está entre los días 3 y 15. El final de la etapa D se sitúa entre el día 5 y el día 20. En una realización más preferente, la etapa D se extiende desde el día 8 hasta el día 15. En otra realización particularmente preferente, la etapa D se realiza desde el día 10 hasta el día 15.
La etapa D se realiza utilizando cualquier recipiente de cultivo celular adecuado. Los ejemplos de recipientes de cultivo celular adecuados incluyen un recipiente de 6 pocillos o un recipiente impreso en 3D o moldeado a medida para el cultivo de uno o varios organoides. El recipiente de cultivo celular no suele cambiar entre las etapas C y D. El recipiente de cultivo celular puede cambiarse al realizar la etapa D.
La etapa D se lleva a cabo en condiciones propicias para la supervivencia del BENO en formación. Unas condiciones ejemplares adecuadas son 37°C, 5% deCO2, por ejemplo, en una incubadora de cultivo celular.
Cultivo del BENO en formación de la etapa D en un medio de cultivo celular libre de suero que comprende TGF-beta y uno o más inhibidores de la señalización notch para potenciar la génesis de las células gliales y la neurodiferenciación ("etapa E").
El BENO en formación proporcionado tras la etapa D se cultiva en un medio que comprende el factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) y uno o más inhibidores de la señalización notch. El tratamiento con TGF-beta potencia la génesis de las células estromales, mientras que la inhibición de la señalización notch potencia la neurodiferenciación.
El tratamiento con TGF-beta mejora la génesis y la funcionalidad de las células estromales en el organoide emergente. Las células del estroma son células del estroma del tejido neuronal. Las células estromales ejemplares incluyen las células gliales. TGF-beta empleado en la presente invención puede ser TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, o sus mezclas. La invención también puede llevarse a cabo utilizando un mimético de TGF-beta que tenga una actividad de señalización igual o similar a la de TGF-beta, que se caracteriza por unirse a un receptor de TGF-beta para provocar así una señalización mediada por el receptor de TGF-beta, en la que dicha actividad es al menos el 10% de la actividad de señalización de TGF-beta 1. TGF-beta se emplea en una concentración efectiva. En algunas realizaciones, la concentración de TGF-beta está entre 0,1 ng/ml y 100 ng/ml. En las realizaciones preferentes, la concentración de TGF-beta está entre 0,3 ng/ml y 30 ng/ml. En realizaciones más preferentes, la concentración de TGF-beta está entre 1 ng/ml y 10 ng/ml. En una realización más preferente, la concentración de TGF-beta es de 5 ng/ml.
Los inhibidores de la señalización Notch se emplean para inhibir la señalización celular mediada por un receptor Notch (por ejemplo, los receptores Notch 1 - Notch 4). La inhibición de la señalización de Notch aumenta la neurodiferenciación. Los inhibidores adecuados de la señalización notch incluyen el éster de N-[(3,5-Difluorofenil)acetil]-L-alanil-2-fenil]glicina-1,1-dimetiletil (DAPT), Compuesto E (Stemcell technologies) y los inhibidores de Y-secretasa como los descritos en Olsauskas-Kuprys et al., OncoTargets and Therapy, 2013. Los inhibidores de la señalización Notch se emplean en una concentración eficaz. Un inhibidor preferente de la señalización notch de la presente invención es el DAPT. En algunas realizaciones, la concentración de DAPT está entre 0,01 pM y 100 pM. En algunas realizaciones preferentes, la concentración de DAPT está entre 0,1 pM y 10 pM. En realizaciones más preferentes, la concentración de DAPT está entre 0,5 pM y 5 pM. En una realización más preferente, la concentración de DAPT es de 2,5 pM.
En esta etapa de los procedimientos desvelados, el BENO en formación se cultiva en un medio de cultivo celular apropiado para su cultivo. Los medios de cultivo celular ejemplares incluyen el medio de diferenciación neuronal Stemdiff (Stemcell), el medio Neurobasal (Gibco) y el medio utilizado en el Ejemplo 2.
La etapa E se realiza típicamente después de la etapa D. La transición de la etapa D a la etapa E se caracteriza por un intercambio parcial o completo del medio de cultivo celular o, alternativamente, la adición de los componentes de la etapa E al medio de cultivo celular existente.
En algunas realizaciones, la etapa E se realiza durante un periodo de tiempo de entre 5 días y 95 días. En las realizaciones preferentes, la etapa E se realiza entre 7 y 50 días. En las realizaciones más preferentes, la etapa E se realiza entre 10 y 20 días. En una realización más preferente, la etapa E se realiza durante 13 días.
Las "designaciones" de días en la realización de este etapa dependen de la duración de los etapas A, B, C, D y E realizados previamente. En general, el punto de partida de la etapa E está entre los días 4 y 35. El final de la etapa E se sitúa entre el día 9 y el día 100. En una realización más preferente, la etapa E se extiende desde el día 15 hasta el día 28.
La etapa E se realiza utilizando cualquier recipiente de cultivo celular adecuado. Un ejemplo de recipiente de cultivo celular adecuado es una placa de 6 pocillos o un recipiente impreso en 3D o moldeado a medida para el cultivo de uno o varios organoides. El recipiente de cultivo celular no suele cambiar entre las etapas D y E.
La etapa E se realiza en condiciones adecuadas para la formación de la supervivencia de BENO. Unas condiciones ejemplares adecuadas son 37 °C, 5% deCO2, por ejemplo, en una incubadora de cultivo celular.
La realización de la etapa E de los procedimientos en la presente memoria desvelados proporciona un BENO. Después de la etapa E, el BENO puede ser cultivado o expandido en condiciones adecuadas, dependiendo de la aplicación deseada del BENO. El cultivo adicional puede conducir al desarrollo de características adicionales del BENO y/u optimizar la neurogénesis.
Propiedades y ventajas de los organoides neuronales producidos de acuerdo con los procedimientos de la invención
Los organoides neuronales producidos por los procedimientos en la presente memoria desvelados (es decir, BENO) presentan desarrollo cortical, neurogénesis y gliogénesis. Los BENO comprenden células neuronales y células estromales. Las células estromales (tal como la glía) son importantes para proporcionar un entorno promotor de la neurogénesis que se crea al practicar los procedimientos desvelados. La neurogénesis y la gliogénesis concurrentes a través de los factores de crecimiento definidos y las pequeñas moléculas en la presente memoria desveladas reconstruyen eficazmente la complejidad multicelular del cerebro humano.
Los organoides neuronales producidos por los procedimientos desvelados desvelan características únicas que no han sido mostradas previamente. Por ejemplo, los BENO descritos en la presente memoria forman redes neuronales funcionales caracterizadas por la funcionalidad neuronal, incluyendo la formación de sinapsis funcionales, la formación de redes jerárquicas, redes GABAérgicas, y también la sincronización de neuronas (Ejemplo 5). Estas capacidades neuronales representan al menos una ventaja importante sobre los organoides neuronales convencionales. En particular, los BENO pueden comprender neuronas excitatorias e inhibitorias y redes neuronales excitatorias e inhibitorias.
Además, los BENO producidos por los procedimientos de la presente invención se producen preferentemente en condiciones totalmente definidas (por ejemplo, sin suero). Esto significa que los BENO son reproducibles de forma fiable, ya que se eliminan las variaciones originadas por componentes químicos no definidos o mal definidos.
Aplicación de BENO
Los BENO producidos por los procedimientos de la presente invención pueden utilizarse para las denominadas pruebas fenotípicas de fármacos. A diferencia de las técnicas de pruebas de fármacos específicos, las pruebas fenotípicas de fármacos no se centran en la unión de una molécula candidata a una diana específica, sino en el efecto que una molécula diana tiene sobre un fenotipo. Una condición previa para estas pruebas fenotípicas de fármacos es la presencia de un modelo apropiado que pueda imitar el fenotipo de la enfermedad investigada. Los BENO desvelados en la presente memoria pueden proporcionar un modelo de enfermedad de este tipo cuando se investigan diversas enfermedades relacionadas con los tejidos neuronales. Las enfermedades para las que la presente invención puede proporcionar un modelo adecuado para el pruebas de fármacos incluyen el ictus, los trastornos de inflamación cerebral, las enfermedades neurodegenerativas (tal como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, según el ejemplo 6), las enfermedades neuroinflamatorias (por ejemplo, la esclerosis múltiple), las lesiones traumáticas (por ejemplo, las lesiones inducidas por cirugías cerebrales), las canalopatías (por ejemplo, la epilepsia) y las enfermedades psiquiátricas (incluyendo el autismo y la esquizofrenia, según el ejemplo 7).
Los BENO pueden ser utilizados para el descubrimiento y perfeccionamiento de fármacos mediante las pruebas fenotípicas de fármacos. Este uso de los BENO incluye el descubrimiento y perfeccionamiento de fármacos que puedan inducir o mejorar la reparación, regeneración, protección y prevención de enfermedades en el tejido cerebral y neuronal.
Las PSC útiles para tales modelos de BENO pueden ser obtenidas de individuos sanos o de pacientes enfermos. Alternativamente, se puede aplicar la edición genética de las células madre pluripotentes para crear cualquier modificación genética y epigenética de interés. Después de producir composiciones BENO a partir de las PSC de acuerdo con los procedimientos desvelados en la presente memoria, los BENO permiten así las pruebas fenotípicas de tejidos con un alto valor predictivo. Debido al mayor grado de maduración, la complejidad celular y la función de red jerárquica de los tejidos neuronales, el uso de los BENO según la invención ofrece numerosas ventajas sobre los modelos convencionales. Además, la simplicidad de los procedimientos desvelados para la producción de BENO permite fácilmente las pruebas fenotípicas de alto rendimiento. Los BENO sanos y modelados por la enfermedad pueden ser sometidos a enfermedades simuladas (por ejemplo, hipoxia para inducir un daño similar al del accidente cerebrovascular). Las lecturas fenotípicas incluyen efectos en la formación de tejidos, la conectividad eléctrica, la muerte celular y la proliferación de células en tipos celulares específicos dentro de los BENO. Unas pruebas fenotípicas de fármacos pueden permitir la definición y validación de diversas dianas farmacológicas. Esto puede proporcionar una base para posteriores pruebas de compuestos para identificar, por ejemplo, compuestos con actividad biológica regenerativa, reparadora, modificadora de enfermedades o protectora.
Los BENO producidos de acuerdo con los procedimientos desvelados en la presente memoria también pueden ser utilizados para las pruebas de seguridad de fármacos para probar, por ejemplo, el potencial de una sustancia para inducir alteraciones eléctricas (convulsiones), degeneración, muerte celular, u otras anomalías celulares en el tejido neuronal.
Los BENO producidos por los procedimientos de la presente invención también pueden ser utilizados para estudios de modo de acción de medicamentos, por ejemplo, en ensayos preclínicos que se realizan en paralelo a los ensayos clínicos.
Los BENO producidos por los procedimientos de la presente invención también pueden utilizarse para fines de medicina personalizada. Por ejemplo, las iPSC derivadas de pacientes pueden utilizarse para simular enfermedades y probar terapias personalizadas. Los BENO de la presente invención podrían ser particularmente útiles en el ensayo de terapias para enfermedades relacionadas con los tejidos neuronales, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas o enfermedades neuroinflamatorias. Todas las opciones terapéuticas posibles podrían ser exploradas y probadas utilizando los BENO descritos, por ejemplo, terapias mediante fármacos, agentes biológicos como anticuerpos o ARN no codificantes, edición de genes, o una combinación de los mismos.
Los BENO también pueden ser aplicados para generar modelos de tejido cada vez más elaborados en co-cultivos de BENO con otras plataformas de ingeniería de tejidos. En algunas realizaciones, el co-cultivo con EHM (músculo cardíaco de ingeniería) y BSM (músculo esquelético de bioingeniería) puede ser utilizado para estudiar el desarrollo de la unión neuro-muscular. En particular, los cocultivos de BENO con EHM pueden utilizarse para estudiar las interacciones entre neuronas y marcapasos o entre neuronas y cardiomiocitos. Este modelo puede utilizarse para estudiar el desarrollo de arritmias. En otras realizaciones, los BENO son co-cultivados con ESM (músculo esquelético de ingeniería), ELT (tejido hepático de ingeniería), o ECT (tejido conector de ingeniería). En otras realizaciones, los modelos BENO-tumor se utilizan para estudiar las interacciones tumor-cerebro (por ejemplo, la invasión cerebral del tumor, la propagación de las metástasis) o los modelos BENO-infiltración de leucocitos se utilizan para estudiar la inflamación neuronal (por ejemplo, las enfermedades autoinmunes). En general, estos modelos de co-cultivo representan una etapa importante hacia las pruebas en paralelo de múltiples órganos para la acción e interacción de los fármacos. Los modelos de co-cultivo pueden utilizarse además como modelos para enfermedades como el Parkinson y otras enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo, para probar su eficacia como tratamiento personalizado.
Los BENO de la presente invención también pueden proporcionar tejido regenerativo con fines científicos o terapéuticos. Por ejemplo, los BENO pueden ser lesionados para estudiar la recuperación y regeneración bajo tratamiento farmacológico o biofísico (por ejemplo, acondicionamiento eléctrico). Alternativamente, los BENO pueden construirse con funciones cerebrales específicas, como la producción y liberación de dopamina para contrarrestar la enfermedad de Parkinson. Otros BENO pueden estar conectados a órganos o ser utilizados como interfaces máquinaórgano para permitir el control de órganos enervados (por ejemplo, el control del músculo esquelético).
Kits
Los kits de la presente invención incluyen componentes para la práctica de los procedimientos desvelados en la presente memoria. En algunas realizaciones, un kit contiene PSC; una matriz que comprende colágeno; medios adecuados y los suplementos necesarios (ROCKi; FGF-2; ácido retinoico; uno o más inhibidores de la señalización SMAD seleccionados de nogina, SB 431542 (Tocris), dorsomorfina y LDN-193189 (Tocris); TGF-beta, y uno o más inhibidores de la señalización notch seleccionados de A/-[(3,5-Difluorofenil)acetil]-L-alanil-2-fenil]glicina-1,1-dimetiletil éster (DAPT), Compuesto E (Stem Cell Technologies), e inhibidores Y-secretasa). En otras realizaciones, un kit contiene una matriz que comprende colágeno; medios adecuados y los suplementos necesarios (ROCKi; FGF-2; ácido retinoico; uno o más inhibidores de la señalización SMAD seleccionados de nogina, SB 431542 (Tocris), dorsomorfina y LDN-193189 (Tocris); TGF-beta; y uno o más inhibidores de la señalización notch seleccionados de N-[(3,5-Difluorofenil)acetil]-L-alanil-2-fenil]glicina-1,1-dimetiletil éster (DAPT), Compuesto E (Stem Cell Technologies), e inhibidores Y-secretasa ). En otras realizaciones, un kit contiene una matriz que comprende colágeno y los suplementos necesarios (ROCKi; FGF-2; ácido retinoico; uno o más inhibidores de la señalización SMAD seleccionados de nogina, SB 431542 (Tocris), dorsomorfina y LDN-193189 (Tocris); TGF-beta; y uno o más inhibidores de la señalización notch seleccionados de N-[(3,5-Difluorofenil)acetil]-L-alanil-2-fenil]glicina-1,1-dimetiletil éster (DAPT), Compuesto E (Stem Cell Technologies), e inhibidores Y-secretasa).
EJEMPLOS
Protocolo general para la producción de BENO
Los siguientes protocolos proporcionan etapas útiles para generar BENO a partir de una fuente de PSC.
MATERIALES
El siguiente listado de materiales se utilizó en los experimentos plasmados en los Ejemplos:
- Kit TeSR™-E8™, Stemcell Technologies #05940
- Solución de EDTA 0,5 M, pH 8, AppliChem #A4892.0500
- Matrigel (factor de crecimiento reducido), BD Bioscience #354230
- Neurobasal-A , Thermofischer # 10888-022
- 100X penicilina/estreptomicina (P/S), Thermofischer #15140-122
- 100x glutamina, Thermofischer #25030-024
- FGF-2, Miltenyi Biotech #130-093-841
- B27, Thermofischer #17504-044
- N2, Thermoscientific #17502-048
- DMSO, Sigma, # 276855
- Nogina, R&D systems #6057-NG-025
- Sal de sesquimagnesio hidrato ácido L-ascórbico 2 fosfato (ASC-2-P), Sigma #A8960-5G
- Ácido transretinoico, Sigma, R2625-50MG
- TGF-beta 1 (TGFB1), Peprotech, #100-21
- ROCKi (Y27632), Stemgent, #04-0012
- SB 431542, Tocris, #1614
- DAPT, Tocris, #2634
- Placa de 96 pocillos (fondo en U, fijación baja), Sarstedt #83.1837.500
- Matraz T25, Sarstedt #83.3910.002
- Placa de 6 pocillos, Greiner #657160
Soluciones madre (-20°C)
- Solución madre de FGF-2 a 10 pg/ml preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante - Solución madre de nogina a 250 pg/ml preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante - Solución madre de ASC-2-P a 200 mM en agua
- Solución madre de TGFB1 a 10 pg/ml preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante - Solución madre de ROCKi a 10 mM en DMSO
- SB 431542 solución madre a 10 mM en DMSO
- Solución madre de DAPT a 100 mM en DMSO
- Ácido retinoico 10 mM en DMSO
Soluciones de trabajo (4°C)
Solución de EDTA 0,5 mM
Añadir 500 |jl de la solución madre de EDTA 0,5 M (pH 8,0) a 500 ml de PBS sin calcio/magnesio, que contiene 0,45 g de NaCl. Filtrar por filtro estéril (0,22um), dividir en alícuotas y conservar a 4 °C durante 6 meses.
Solución de Matrigel 1:30
Diluir 1 ml de Matrigel en 29 ml de PBS helado utilizando puntas preenfriadas para proteger Matrigel de la polimerización. Si la solución no es clara, almacenar en el refrigerador durante toda la noche y volver a mezclar. Medio TeSR™-E8™
Preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, añadir 1% de P/S
Medio basal
Neurobasal-A complementado con:
1% de 100X glutamina, 1% de 100X P/S, 2% B27, 1% N2, 200 jM , ASC-2-P
Medio de compromiso neuronal (NCM)
Medio basal (50 ml) complementado con:
50 ng/ml de nogina (10 jl); en algunos experimentos se utilizó 10 jM de SB 431542 (50 jl), 1 jM de RA (5 jl). Medio de expansión de progenitores neuronales (NPEM)
Medio basal (50 ml) complementado con:
10 ng/ml de FGF-2 (50 jl); En algunos experimentos se utilizó 5 ng/ml de TGFB1; En algunos experimentos se utilizó BDNF (20 ng/ml) y GDNF (10 ng/ml).
Medio de diferenciación neuronal (NDM)
Medio basal (50 ml) complementado con: en algunos experimentos 2,5 jM DAPT (1,25 jl); en algunos experimentos 5 ng/ml TGFB1 (25 jl); en algunos experimentos 2,5 jM DAPT (1,25 j l) y 5 ng/ml TGFB1 (25 j l) PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Día -4 (cultivo de mantenimiento estándar de células madre pluripotentes, empleado como ejemplo para la preparación de células)
Revestimiento de Matrigel
Se diluyó Matrigel reducido en factor de crecimiento 1:120 en PBS helado y las placas se revistieron inmediatamente (150 jl/cm2). A continuación, las placas revestidas se almacenaron en un refrigerador durante un máximo de 2 semanas. Antes de utilizarlas, las placas revestidas se desinfectaron con etanol y se colocaron a 37°C en una incubadora durante 30-60 minutos.
Pasaje de EDTA (volúmenes indicados para matraz T-25)
Las células se lavaron dos veces con 2 ml (80 jl/cm2) de EDTA 0,5 mM antes de añadir 3 ml (120 jl/cm2) de EDTA 0,5 mM. Las células se incubaron entre 5 y 10 minutos a temperatura ambiente. Algunas líneas celulares pueden requerir un tratamiento con EDTA 2 mM durante 5-8 minutos cuando crecen en Matrigel. Tras la incubación, se aspiró cuidadosamente la solución de EDTA. A continuación, se añadieron 3 ml de medio de cultivo E8 fresco que contenía 10 jM de ROCKi a las células, que posteriormente se sembraron (50.000/cm2) en un nuevo matraz apropiado con 5 ml de medio que contenía 5 jM de ROCKi. Al día siguiente, se cambió el medio por uno sin ROCKi.
DÍA -1 (Moldeo BENO)
Lo siguiente representa una fórmula para 10 BENO de 30 j l de volumen/cada uno (más un 20% de volumen como reserva de pipeteo):
Comenzar con 50 j l de colágeno tipo I (a partir de una reserva de 6,9 mg/ml, concentración final de 1 mg/ml) con 50 j l de DMEM 2X, 9,5 j l de NaOH 0,1 M y 238 j l de suspensión celular en medio E8 complementado con 20 ng/ml de FGF y 10 jM de ROCKi que contiene 900.000 células madre pluripotentes indiferenciadas (por ejemplo, línea iPSC-G1 Tiburcy et al., Circulation, 2017). Las células se desprendieron por incubación con EDTA como se ha descrito anteriormente. A continuación, se pipetearon 30 |jl de la suspensión en un pocilio de una placa de 96 pocilios (fondo en U, de baja fijación) y se colocaron en una incubadora a 37°C durante 20 minutos para favorecer la consolidación del colágeno (atrapamiento celular homogéneo). Tras 20 minutos, se añadieron 250 j l de E8 con 10 ng/ml de FGF y 10 jM de ROCKi a cada pocillo y se devolvió a la incubadora.
DÍAS 0, 1 y 2 (Cambio de medio)
Se retiran 200 j l de medio y se añaden 200 j l de NCM/pocillo.
DÍA 3 (Cambio de medio y transferencia a BENO)
Se transfieren 10 BENO a una placa de 6 pozos que contiene 5 ml de NCM utilizando una pipeta de punta ancha. DÍA 6 (Cambio de medio)
Se retiran 4 ml de medio y se añaden 5 ml de NCM fresco por pocillo.
DÍAS 8, 10 y 13 (Cambio de medio)
Se retiran 4 ml de medio y se añaden 5 ml de NPEM fresco por pocillo cuando se utiliza NPEM en el protocolo experimental seleccionado. Si no se utiliza NPEM, las células se mantienen en medio basal.
DÍAS 15, 17. 20. 22. 24 y 27 (Cambio de medio)
Se retiran 4 ml de medio y se añaden 5 ml de NDM fresco por pocillo cuando se utiliza NDM en el protocolo experimental seleccionado. Si no se utiliza NPEM, las células se mantienen en medio basal. Las células se evalúan en el día 28. Si el cultivo se prolonga, las células se mantienen en medio basal, cambiando el medio cada dos días como se ha descrito anteriormente.
EJEMPLO 1: Optimización del protocolo de producción de BENO
Se realizaron los siguientes estudios para optimizar los protocolos desvelados para la inducción neuronal, la cantidad de NPC y la diferenciación neuronal. Los datos resultantes permitieron establecer un protocolo óptimo para producir BENO (Ejemplo 2).
Optimización de la inducción neuronal
En los intentos iniciales, se empleó la inhibición única de la vía SMAD (usando nogina) para provocar la inducción neuronal, junto con la adición de ácido retinoico (AR). En el presente estudio, se probó si la inhibición dual de la vía de señalización SMAD utilizando nogina y SB431542 durante la fase de inducción neuronal (días 0-8) podría mejorar aún más la neurogénesis, por ejemplo, en el día 28. En consecuencia, se investigó el NCM que contenía sólo nogina, o el NCM que contenía nogina y SB431542. Se observó claramente que la inhibición dual de SMAD era ventajosa en cuanto a la cantidad resultante de neuronas en maduración, como se demostró mediante el análisis de inmunofluorescencia (FIG. 2A) y el análisis de transcripción de PAX6 y MAP2 (FIG. 2B).
Aumento del número de PNJ
El aumento de la cantidad de células madre pluripotentes (PSC) de entrada en el momento de la fundición del tejido dio lugar a una cantidad significativamente mayor de neuronas (FIG. 3A). En consecuencia, parece ventajoso aumentar la cantidad de células progenitoras neuronales (NCP) dentro del tejido tratando los organoides con f GF-2 (días 8-15). Esto corresponde al uso de NPEM en el protocolo anterior. Para comprobar si el uso de FGF-2 es favorable, se trataron los tejidos (3000 células/jl) con 10 ng/ml de FGF-2 en dos puntos temporales diferentes; del día 2 al día 0 (antes de la inducción neuronal en la etapa de células madre), y del día 8 al día 15 en la etapa de NCP (FIG.
3B). El tratamiento con FGF-2 en el día -2-0 no pareció proporcionar ninguna ventaja en comparación con los tejidos no tratados. Sin embargo, el tratamiento de las células con FGF-2 en los días 8-15 (es decir, el uso de NPEM) indujo notablemente la proliferación de las células, incluidas las NPC, lo que dio lugar a redes neuronales más complejas en el día 28, como se visualizó mediante la tinción de montaje completo de neurofilamentos (FIG. 3B). El tratamiento doble (día -2-0 y días 8-15) no pareció ser ventajoso respecto al tratamiento único (días 8-15).
Optimización de la diferenciación neuronal
Numerosos protocolos convencionales en la literatura emplean los factores neurotróficos BDNF y GDNF para mejorar la supervivencia neuronal en las etapas de diferenciación y maduración. Por lo tanto, se probó si la adición de BDNF (20 ng/ml) y GDNF (10 ng/ml) a NPEm durante los días de cultivo 10-28 daría lugar a un mayor número de neuronas en maduración para el día 28 (FIG. 4).
Estos resultados demuestran que BDNF y GDNF no aumentan la cantidad del marcador neuronal PAX 6 ni del marcador de maduración MAP2. Por lo tanto, el tratamiento con BDNF o GDNF no se adoptó en el protocolo. Por otra parte, la adición del inhibidor notch DAPT al NDM (2,5 j M, día 15-28) produjo un aumento de los transcritos de PAX6, lo que sugiere un efecto positivo (FIG. 5).
Experimentos de optimización
En la etapa final de optimización, para identificar el protocolo más eficaz para la diferenciación neuronal, se probaron y compararon cinco protocolos diferentes. En todos los protocolos, la diferenciación se llevó a cabo en medio Neurobasal suplementado con B27 y N2. Las células hiPS fueron sometidas a la inducción del neuroectodermo (días 0-8) bajo la inhibición dual de SMAD (nogina y SB431542) y la suplementación adicional de ácido retinoico (AR) para imitar la señalización que se produce durante la neurogénesis embrionaria. En el protocolo 2, se probaron los efectos proliferativos del FGF-2 (día 8-15) en las células progenitoras neuronales (NCP). En el protocolo 3, se probó el efecto del inhibidor de Notch DAPT en el compromiso neuronal de las NPC (día 15-28). En el protocolo 4, se probaron los efectos proliferativos de TGF-beta 1 para las células de la glía (día 8-28). En el protocolo 5, se combinaron los tratamientos con TGF-beta 1 y DAPT para comprobar si se puede potenciar el desarrollo de la glía y las neuronas simultáneamente. Los diferentes protocolos se resumen en la FIG. 6A.
Para evaluar el potencial neurogénico y gliogénico que ofrecen los diferentes protocolos, se recogieron tejidos en los días -1,0, 3, 8, 15, 28 y 40 (3-6 tejidos / punto temporal). Dado que el tratamiento hasta el día 8 fue idéntico para todos los protocolos, los tejidos hasta ese punto temporal sólo se recogieron del protocolo 1. El tratamiento con FGF-2 (protocolo 2) no influyó significativamente en el nivel de los diferentes marcadores en ningún punto temporal, un resultado que fue inesperado. El tratamiento con DAPT (protocolos 3 y 5), sin embargo, aumentó significativamente la cantidad de los marcadores neuronales PAX6, MAP2, GRIN1 y GABBR2. El tratamiento con TGF-beta 1 (protocolos 4 y 5) mostró mayores cantidades del marcador de glía GFAP en el día 40 en comparación con los otros 3 protocolos (FIG. 6B). Dado que el tratamiento con DAPT (protocolos 3 y 5) apoyaba evidentemente la neurogénesis y el TGF-beta 1 parecía apoyar la gliogénesis, se amplió el análisis del curso temporal para el protocolo 3 (DAPT) y el protocolo 5 (DAPT y TGF-beta 1). En el día 50 y en el día 60 la expresión de los marcadores neuronales disminuyó con el tiempo en ambos protocolos, lo que sugiere que pueden surgir otros tipos de células, un resultado esperado ya que a partir del día 28 los tejidos ya no están sometidos a tratamiento. Curiosamente, el protocolo 5 apoyó claramente la gliogénesis, como lo demuestra un aumento de 10 veces de los transcritos de GFAP. En conjunto, el análisis del curso temporal transcripcional de los diferentes protocolos probados sugiere que el protocolo 5 es superior a los otros protocolos para producir eficazmente la neurogénesis y la gliogénesis.
Para validar los datos del análisis de transcripción, los tejidos del día 60 sometidos al protocolo 3 y al protocolo 5 se tiñeron utilizando anticuerpos contra el neurofilamento (neurona), GFAP (glía), sinaptofisina (sinapsis neuronal) y MAP2 (neuronas maduras) (FIG. 6C). Los tejidos derivados del protocolo 5 contenían más glía que los derivados del protocolo 3, mientras que la cantidad de neuronas maduras parecía ser la misma.
La presencia de la glía es importante para la actividad neuronal. Por lo tanto, la hipótesis inicial de que la actividad del BENO aumenta en el protocolo 5 se exploró más a fondo midiendo la actividad espontánea del calcio. Para analizar esto de forma sistemática, tras teñir los tejidos (n=3/grupo) con FURA-4, se visualizó la actividad del calcio mediante imágenes confocales en cinco regiones/tejidos diferentes (mostradas en la FIG. 6D). En el gráfico se representa la actividad de media del calcio observada en cada una de estas cinco áreas. Los tejidos tratados con TGF-beta 1 y DAPT (protocolo 5) revelaron un mayor número de zonas tisulares que mostraban actividad cálcica.
En resumen, los datos colectivos apoyan la conclusión de que, tras la inhibición dual de SMAD en presencia de AR, el tratamiento con FGF-2 mejora las NPC, y el DAPT apoya la neurogénesis mientras que el TGF-beta apoya la gliogénesis. En consecuencia, el protocolo de diferenciación optimizado (Ejemplo 2) incorpora el tratamiento con todos los factores descritos anteriormente (puntos de tiempo indicados en la FIG. 6A).
EJEMPLO 2: Protocolo optimizado para la generación de organoides neuronales humanos de bioingeniería (BENO)
Los siguientes estudios establecen un protocolo óptimo para producir organoides neuronales humanos de bioingeniería (BENO).
MATERIALES
Los materiales utilizados en estos experimentos son los mismos que los utilizados en el Ejemplo 1.
Soluciones madre (-20°C)
Las soluciones madre utilizadas en estos experimentos son las mismas que las utilizadas en el Ejemplo 1.
Soluciones de trabajo (4°C)
La solución de EDTA 0,5 mM, la solución de Matrigel 1:30, el medio TeSR™-E8™ y el medio Basal utilizados en estos experimentos son los mismos que los utilizados en el Ejemplo 1.
Medio de compromiso neuronal (NCM)
Medio basal (50 ml) complementado con 10 jM de SB 431542 (50 |jl), 50 ng/ml de nogina (10 |jl) y 1 jM de AR (5 |jl).
Medio de expansión de progenitores neuronales (NPEM)
Medio basal (50 ml) complementado con 10 ng/ml de FGF-2 (50 j l ) y 5 ng/ml de TGFB1.
Medio de diferenciación neuronal (NDM)
Medio basal (50 ml) complementado con 2,5 jiM de DAPT (1,25 j l) y 5 ng/ml de TGFB1 (25 jl).
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Día -4 (cultivo de mantenimiento estándar de células madre pluripotentes, empleado como ejemplo para la preparación de células)
El revestimiento de Matrigel y el pasaje de EDTA (para un matraz T-25) utilizados en estos experimentos son los mismos que los utilizados en el Ejemplo 1.
DÍA -1 (Moldeo BENO)
Igual que el protocolo utilizado en el ejemplo 1.
DÍAS 0, 1 y 2 (Cambio de medio)
Se retiran 200 j l de medio y se añaden 200 j l de NCM/pocillo.
DÍA 3 (Cambio de medio y transferencia a BENO)
Se transfieren 10 BENO a una placa de 6 pozos que contiene 5 ml de NCM utilizando una pipeta de punta ancha. DÍA 6 (Cambio de medio)
Se retiran 4 ml de medio y se añaden 5 ml de NCM fresco por pocillo.
DÍAS 8, 10 y 13 (Cambio de medio)
Se retiran 4 ml de medio y se añaden 5 ml de NPEM fresco por pocillo.
DÍAS 15, 17. 20. 22. 24 y 27 (Cambio de medio)
Se retiran 4 ml de medio y se añaden 5 ml de NDM fresco por pocillo. Las células se evalúan en el día 28. Si el cultivo se prolonga, las células se mantienen en medio basal, cambiando el medio cada dos días como se ha descrito anteriormente.
EJEMPLO 3: Análisis transcriptómico de alto rendimiento de BENO
Para caracterizar los tipos de células que surgen durante la producción de tejidos de BENO en diferentes puntos de tiempo (por ejemplo, días -1, 0, 3, 8, 15, 28, 40, 50 y 60), las células fueron sometidas a análisis de RNAseq; 3-6 tejidos por punto de tiempo).
En primer lugar, se comprobó el estado de diferenciación de las células durante el transcurso del cultivo celular. Como era de esperar, los marcadores de células madre NANOG y POUF5A1 se expresaron altamente en el día -1 y en el día 0, pero 3 días después de la inducción neuronal, la expresión de estos marcadores disminuyó significativamente. En cambio, SOX2, que es un marcador de células madre y también de NPC, no mostró ninguna disminución en estos puntos temporales, sino que alcanzó una expresión máxima en el día 15 junto con otros marcadores neuroectodérmicos y de NPC. Estos datos son coherentes con los efectos proliferativos conocidos del FGF-2. La mayoría de los marcadores estructurales neuronales (MAP2, MAPT, NFASC, TUBA1A) aumentaron significativamente en los días 28-40. Una vez completada la neurogénesis, se inició la gliogénesis (días 50-60). También se observó que el marcador de glía radial PDGFR-alfa se expresaba fuertemente en el día 8, momento en el que la mayoría de las células madre se convierten en células progenitoras (FIG. 7A).
Para caracterizar los diferentes tipos de células neuronales presentes en el cultivo celular, se investigaron marcadores específicos expresados en neuronas serotoninérgicas, GABAérgicas, glutamatérgicas, dopaminérgicas y colinérgicas, con los resultados mostrados en la FIG. 7B. Los marcadores de todos estos tipos neuronales se encontraron presentes en los tejidos neuronales a partir del día 28. Curiosamente, aunque los transcritos estructurales neuronales disminuyeron a partir del día 50, los marcadores neuronales individuales aumentaron o persistieron, lo que sugiere que la diferenciación neuronal puede estar completa en el día 40, aunque la maduración celular aún está en curso.
Del mismo modo, el análisis de los diferentes marcadores de la capa cortical reveló que las tres capas están presentes en los organoides (FIG. 7C).
Finalmente, para examinar el estado de maduración de las neuronas contenidas en los BENO durante el protocolo de diferenciación, se analizó la expresión de receptores neuronales (GABA, DOPA, Kainato, AMPA, NMDA), la expresión de canales iónicos (K+, Ca2+, Na+) y la expresión de proteínas sinápticas (SYN1, SYT4, SYP, SYNPO). Se observó que la expresión de los transcritos que codifican para estas proteínas aumentó en el día 28, y se mantuvo estable o siguió aumentando hasta el día 60. Este hallazgo apoya la conclusión de que, aunque la diferenciación cesa en el día 40, la maduración neuronal y la gliogénesis continuaron hasta el final del protocolo de diferenciación.
EJEMPLO 4: Validación de los hallazgos del análisis transcriptómico mediante el análisis de IF en montaje completo
Para verificar si el modelo BENO emulaba el desarrollo cortical normal, se analizaron los marcadores CTIP2 (neuronas de la capa V-VI), TBR2 (células precursoras de la zona subventricular) y SOX2 (células madre neuronales) mediante inmunotinción. En el día 40, no se detectaron células positivas para SOX2. Por otro lado, las células TBR2 y las células CTIP2 se distribuyeron de forma concéntrica entre sí, tal y como se observó durante la corticogénesis (FIG. 8).
Utilizando el análisis de IF, se validó la fuerte presencia de interneuronas GABAérgicas en los BENO. La tinción para el marcador GABAérgico GABA y el receptor GABBR2 respectivo (FIG. 9A, FIG. 9B). GABA se expresó fuertemente en los compartimentos del soma, así como en las botones sinápticos de los axones de las neuronas GABAérgicas. Se observó que GABBR2 se expresaba en la pericarion neuronal. Además, una red dopaminérgica elaborada fue sometida a inmunotinción con TH, indicando así una identidad del cerebro medio. Al igual que GABA, TH se detectó tanto en el soma como en los axones neuronales que se extienden en la periferia del organoide (FIG. 9C). Por último, la tinción con sinaptofisina indicó una abundancia de botones sinápticos en las neuronas, sugiriendo así la existencia de una red neuronal funcional (FIG. 9D).
EJEMPLO 5: Actividad neuronal: Red GABAérgica
Los datos desvelados en la presente memoria (por ejemplo, en los Ejemplos 1-4) demuestran que los BENO pueden imitar eficazmente el desarrollo normal de las capas corticales, y además contienen una variedad de neuronas y glía. La funcionalidad de estas neuronas producidas se investigó posteriormente mediante imágenes de calcio, que pueden identificar redes neuronales.
Para comprobar la actividad de la red neuronal, los BENO (días 30-60) fueron sometidos a imágenes de calcio bajo inhibición GABAérgica (realizada con picrotoxina, 58 pM; saclofen, 330 pM; n=3). La inhibición GABAR provocó una asincronía de las neuronas previamente sincronizadas de forma espontánea (4 pares de células). Tras el lavado del inhibidor, las mismas neuronas volvieron a sincronizarse, sugiriendo así la presencia de una red GABAérgica funcional (FIG. 10). Las redes neuronales funcionales no se desarrollaron en otros organoides neuronales, lo que indica que el protocolo de diferenciación dirigida por etapas (Ejemplo 2) para aumentar la complejidad celular imita el desarrollo del cerebro humano no sólo en un sentido estructural, sino también con respecto a la función jerárquica de la red.
En conjunto, los Ejemplos 1-5 de la presente invención demuestran de forma convincente nuevos procedimientos de diferenciación dirigida basados en colágeno, libres de suero y específicos para cada etapa, para la ingeniería de redes neuronales eléctricamente activas a partir de células madre pluripotentes humanas.
EJEMPLO 6: BENO como modelo de regeneración neuronal
Para estudiar las respuestas a las lesiones y los mecanismos de reparación de los tejidos, los BENO son expuestos a lesiones. Las lesiones globales o locales inducidas por la crioterapia, la mecánica, la hipoxia o las neurotoxinas pueden producirse, por ejemplo, mediante un perno metálico refrigerado por N2, la compresión o la disección, el cultivo en oxígeno subcrítico o al 0%, así como la exposición a las toxinas del glutamato, la dopamina, el etanol, la tetrodotoxina, el botulismo o el tétanos. Se estudia específicamente la recuperación de las lesiones, incluidas las respuestas específicas de las células (por ejemplo, de las neuronas y las células de la glía). Se estudian la reparación y la regeneración, por ejemplo, mediante la inducción de la proliferación neuronal y la protección contra las lesiones, por ejemplo, mediante la aplicación de antioxidantes o moduladores farmacológicos. Los BENO sirven como modelos para identificar y validar nuevas dianas para la modificación de enfermedades, incluyendo la protección, reparación y regeneración neuronal. Los BENO se utilizan en diferentes etapas de desarrollo, por ejemplo, como neuronas en proliferación (día 15, día 28 del protocolo del Ejemplo 2) y neuronas postmitóticas (día 40, día 60 del protocolo del Ejemplo 2).
EJEMPLO 7: BENO como modelo de enfermedad personalizado, por ejemplo, para la esquizofrenia
Los BENO se crean a partir de células madre pluripotentes, por ejemplo, derivadas de pacientes mediante reprogramación o modificadas genéticamente, por ejemplo, mediante tecnologías CRISPR/Cas o TALEN. Los BENO se fenotipan como se ha descrito anteriormente utilizando medios de evaluación de la actividad del calcio, análisis de inmunofluorescencia o medios electrofisiológicos (por ejemplo, mediciones de electrodos de empalamiento, matrices de electrodos múltiples/mediciones de potencial de campo). Paralelamente, se realiza la secuenciación del ARN y el análisis del proteoma para los estudios de asociación fenotipo-genotipo.
Un uso de los BENO es modelar aspectos de la esquizofrenia. Los BENO se crean a partir de células iPSC obtenidas de pacientes esquizofrénicos. Posteriormente, los BENO de estos pacientes se fenotipan para analizar las diferencias fenotípicas con los sujetos de control sanos. Otros estudios están diseñados para investigar los BENO derivados de pacientes que sufren de autismo, hemiplejia familiar y epilepsia.
EJEMPLO 8: Optimización adicional de la inducción y expansión neuronal en las etapas C y D
Para probar la duración óptima de las etapas C y D, se realizó el protocolo del ejemplo 2, variando únicamente la duración de las etapas C y D (Figura 11). Posteriormente, se evaluó el resultado de cada protocolo determinando la expresión de ARNm del marcador neuronal PAX6 como parámetro de compromiso neuronal.
Estos experimentos mostraron que el protocolo estándar del ejemplo 2, 8 días de incubación con NCM (etapa C), es superior a los tiempos de incubación más cortos como 3 o 6 días (Fig. 11A). La incubación con NCM durante 10 días produjo una expresión de ARNm de PAX6 ligeramente mayor que la incubación durante 8 días (Fig. 11B), mientras que una incubación más larga no aumentó más la expresión de ARNm de PAX6 (Fig. 11B). Este resultado sugiere que 10 días es la duración óptima para la incubación con NCM (etapa C).
Estos experimentos también revelaron que acortar la incubación con NPEM (etapa D) a 2 o 5 días no influyó negativamente en la expresión de ARNm de PAX6, en comparación con el estándar de 7 días como en el ejemplo 2 (Fig. 11A). Otras propiedades de los BENO sometidos a incubación de NPEM durante diferentes cantidades de tiempo fueron estudiadas mediante análisis de inmunofluorescencia (Fig. 11C). Se consideró preferente una incubación mínima de NPEM de 5 días porque los BENO mostraron una condensación tisular robusta y una proliferación neuronal sólo después de 5 días de incubación de NPEM. Este resultado sugiere que de 5 a 7 días es la duración óptima para la incubación con NPEM (etapa D).
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Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de producción de un organoide neuronal de bioingeniería (BENO) a partir de células madre pluripotentes (PSC), comprendiendo el procedimiento:
(A) cultivar PSC, incrustadas en una matriz inmersa en un medio de cultivo celular sin suero;
(B) cultivar las PSC en dicha matriz de la etapa (A) en un medio de cultivo celular sin suero que comprende un inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCKi) y FGF-2;
(C) cultivar el BENO en formación procedente de las PSC y la matriz de la etapa (B) en un medio de cultivo celular sin suero que comprende ácido retinoico y uno o más inhibidores de la señalización SMAD para inducir la neurogénesis;
(D) cultivar el BENO en formación de la etapa (C) en un medio de cultivo celular sin suero que comprende TGF-beta y FGF-2 para potenciar la génesis de células gliales y la neurogénesis;
(E) cultivar el BENO en formación de la etapa (D) en un medio de cultivo celular sin suero que comprende TGF-beta y uno o más inhibidores de la señalización notch para mejorar la génesis de las células gliales y la neurodiferenciación, en el que la matriz comprende colágeno y en el que el BENO se produce dentro de un entorno 3D, en el que el entorno 3D está definido inicialmente por la matriz.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la matriz no comprende Matrigel.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la matriz no comprende Matrigel u otros componentes de origen natural que tengan una composición no definida.
4. El procedimiento de la reivindicación 1-3, en el que la matriz comprende colágeno de tipo I.
5. El procedimiento de la reivindicación 1-4, en el que el medio de la etapa (D) comprende al menos dos inhibidores de la señalización de SMAD, preferentemente en el que los inhibidores de la señalización de SMAD comprenden nogina y SB 431542.
6. El procedimiento de la reivindicación 1-5, en el que el inhibidor de la señalización notch de la etapa (E) es DAPT.
7. El procedimiento de la reivindicación 1-6, en el que las PSC son PSC humanas.
8. El procedimiento de la reivindicación 1-7,
en el que la etapa (A) se realiza en el día -1,
en el que la etapa (B) se realiza desde el día -1 hasta el día 0,
en el que la etapa (C) se realiza desde el día 0 hasta el día 10,
en el que la etapa (D) se realiza entre el día 10 y el día 15,
en el que la etapa (E) se realiza desde el día 15 hasta al menos el día 28.
9. Un organoide neuronal de bioingeniería (BENO) producido por el procedimiento de la reivindicación 1, caracterizado porque el BENO está incrustado en una matriz que comprende colágeno y que las células neuronales del BENO están organizadas en una red neuronal funcional, y en el que la red neuronal está caracterizada por la sincronización de las neuronas.
10. Uso de un BENO de la reivindicación 9 como modelo para pruebas de una enfermedad y/o fármaco.
11. El uso de la reivindicación 10, en el que el BENO está en co-cultivo con otra plataforma de ingeniería de tejidos.
12. Un kit para la realización de un procedimiento de las reivindicaciones 1-7, que comprende una matriz que comprende colágeno; ROCKi; FGF-2; ácido retinoico; uno o más inhibidores de la señalización SMAD seleccionados de nogina, SB 431542 (Tocris), dorsomorfina y LDN-193189 (Tocris); TGF-beta, y uno o más inhibidores de la señalización notch seleccionados de A/-[(3,5-Difluorofenil)acetil]-L-alanil-2-fenil]glicina-1,1-dimetiletil éster (DAPT), Compuesto E (Stem Cell Technologies), e inhibidores Y-secretasa.
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