ES2904301T3 - Receptores de células T dirigidos contra Bob1 y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende un promotor operativamente unido a un polinucleótido que codifica un receptor de células T que comprende una región CDR3 que se une específicamente a Bob1, que comprende: a) un primer polinucleótido que codifica un primer polipéptido que comprende las regiones VJ de un polipéptido TCRα, cuyas regiones VJ comprenden la región CDR3 del polipéptido TCRα; y b) un segundo polinucleótido que codifica un segundo polipéptido que comprende las regiones VDJ de un polipéptido TCRβ, cuyas regiones VDJ comprenden la región CDR3 del polipéptido TCRβ, en el que la región CDR3 del polipéptido TCRα y la región CDR3 del polipéptido TCRβ se unen juntas específicamente a Bob1, en la que i) la región CDR3 del polipéptido TCRα comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y la región CDR3 del polipéptido TCRβ comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, o ii) la región CDR3 del polipéptido TCRα comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 y la región CDR3 del polipéptido TCRβ comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de células T dirigidos contra Bob1 y usos de los mismos

Campo

La tecnología se refiere en parte a composiciones para inducir una respuesta inmune contra un antígeno Bob1. Se proporcionan composiciones para tratar enfermedades hiperproliferativas mediante la inducción de una respuesta inmune contra un antígeno Bob1; la respuesta inmune puede inducirse direccionando específicamente células que expresan Bob1 utilizando receptores de células T dirigidos contra Bob1.

Antecedentes

La activación de las células T es una etapa importante en la inmunidad protectora contra microorganismos patógenos (por ejemplo, virus, bacterias y parásitos), proteínas extrañas y sustancias químicas nocivas en el medio ambiente, y también como inmunidad contra el cáncer y otras enfermedades hiperproliferativas. Las células T expresan receptores en sus superficies (es decir, receptores de células T) que reconocen los antígenos presentados en la superficie de las células. Durante una respuesta inmune normal, la unión de estos antígenos al receptor de células T, en el contexto de la presentación del antígeno del MHC, inicia cambios intracelulares que conducen a la activación de las células T.

La terapia de células T adoptivas se ha utilizado para tratar enfermedades hiperproliferativas, incluidos tumores, proporcionando una respuesta inmune específica de antígeno. Un método implica el uso de células T genéticamente modificadas que expresan una proteína específica de antígeno que tiene un dominio extracelular que se une a un antígeno.

Resumen

La proteína 1 de unión a Oct de células B (Bob1) del factor de transcripción intracelular codificada por el gen POU2AF1 se identificó como una diana adecuada para inmunoterapias basadas en TCR de neoplasias malignas de células B y mieloma múltiple. Los polipéptidos Bob1 pueden usarse como inmunógenos o dianas para inmunoterapia. Se identificaron clones de células T específicos de Bob1 que reconocían neoplasias malignas primarias de linfocitos B y mieloma múltiple. Los enfoques de transferencia de genes de TCR que utilizan TCR específicos de Bob1 pueden brindar nuevas modalidades de tratamiento para pacientes con neoplasias malignas de células B o mieloma múltiple, entre otras enfermedades

En el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden receptores de células T, ácidos nucleicos que codifican receptores de células T y células que expresan receptores de células T que reconocen un antígeno Bob1. Las células también pueden expresar un polipéptido adicional añadiendo un mecanismo de seguridad, tal como, por ejemplo, un polipéptido Caspasa-9 inducible.

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas

Ciertas realizaciones se describen adicionalmente en la siguiente descripción, ejemplos, reivindicaciones y dibujos.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos ilustran determinadas realizaciones de la tecnología y no son limitantes. Para mayor claridad y facilidad de ilustración, los dibujos no están hechos a escala y, en algunos casos, varios aspectos pueden mostrarse exagerados o ampliados para facilitar la comprensión de realizaciones particulares.

La Fig. 1A proporciona un esquema de la terapia de células T adoptivas, la Fig. 1B proporciona un esquema de un gráfico de un ejemplo de terapia de células T adoptivas dirigida contra un tumor.

La Fig. 2 proporciona una ilustración esquemática y un ejemplo de un método utilizado para generar una biblioteca de clones de células T.

La Fig. 3 es un análisis de microarreglos de subconjuntos de células hematopoyéticas malignas y no malignas y células no hematopoyéticas sanas.

La Fig. 4A es un gráfico de barras y la Fig. 4B es un gráfico en forma de torta del cribado de alto rendimiento de clones de células T positivas para tetrámeros clasificados de una sola célula.

La Fig. 5A es un gráfico de líneas y la Fig. 5B es un gráfico de barras de la avidez variable de los clones de células T específicos de Bob1.

La Fig. 6 es un gráfico de barras del reconocimiento de neoplasias malignas de células B por el clon 3C10.

La Fig. 7A es un gráfico de barras, la Fig. 7B es un gráfico de barras y la Fig. 7C es un análisis de microarreglos, que muestra los resultados de la RT-PCR cuantitativa que muestra que el clon 4G11 reactivo con Bob1 reconoce eficazmente las neoplasias malignas de células B primarias.

La Fig. 8A proporciona un diagrama esquemático que incluye una secuencia de aminoácidos del polipéptido TCRa del clon 3C10 AV13-1*01 POU2AF1/Bob1. La Fig. 8B proporciona un diagrama esquemático que incluye una secuencia de aminoácidos del polipéptido TCRp del clon 3C l0 BVl2-4*01 POU2AF1/Bob1.

La Fig. 9A proporciona un diagrama esquemático que incluye secuencias de aminoácidos del polipéptido TCRa del clon 4G11 TRAV13-1*01 POU2AF1/Bob1. La Fig. 9B proporciona un diagrama esquemático que incluye una secuencia de aminoácidos del polipéptido TCRp del clon 4G11 TRBV4-1*-1 POU2AF1/Bob1.

La Fig. 10A proporciona cuatro gráficos de FACS y la Fig. 10B proporciona dos gráficos de barras, que muestran que las células T CD8+ transducidas con Bob1-TCR derivadas de sangre periférica tienen un patrón de reconocimiento específico de Bob1.

Las Figs. 11A y 11B proporcionan la secuencia de un ejemplo de un vector retroviral que puede usarse para expresar Bob1-TCR.

La Fig. 12A proporciona cuatro gráficos de FACS de células T transducidas después del enriquecimiento mediante la expresión del gen marcador NGF-R y el aislamiento de MACS. Los números en el cuadrante indican el porcentaje de células. Los gráficos de FACS se muestran con ejes biexponenciales. La Fig. 12B proporciona tres gráficos de barras de la concentración de IFN-y evaluada después de 18 h de cultivo conjunto del clon 4G11 de células T CD8+ o CD4+ transducidas purificadas con varias líneas celulares HLA-B7pos.

Las Figs. 13A y 13B proporcionan gráficos de barras del porcentaje de supervivencia de las células diana vivas, evaluadas por citometría de flujo, después de la incubación con el clon 4G11 de células T o células T CD8+ transducidas con células TCR purificadas o transducidas en forma simulada.

Las Figs. 14A y 14B proporcionan histogramas de células T CD8+ transducidas con TCR (línea negra) o transducidas en forma simulada (área gris) después de 5 días de cultivo conjunto con estimulador o células de control negativas.

La Fig. 15 es un mapa de plásmido de un plásmido pBP0954-pSFG-iC9.T2A-Bob-1 que codifica un TCR de Bob1 y un polipéptido Caspasa-9 inducible, unidos por un enlazador escindible 2A. El plásmido comprende un polipéptido Caspasa-9 truncado modificado (N405Q).

Descripción detallada

La terapia con células T adoptivas se ha utilizado para tratar enfermedades hiperproliferativas, incluidos los tumores, proporcionando una respuesta inmune específica de antígeno. Un método implica el uso de células T genéticamente modificadas que expresan una proteína específica de antígeno que tiene un dominio extracelular que se une a un antígeno. Se han utilizado receptores de células T recombinantes para proporcionar especificidad a las células T. En otros métodos, los receptores de células T heterólogos, específicos para un antígeno particular, se han expresado en células T para proporcionar una respuesta inmune específica de antígeno. Los métodos de terapia con células T adoptivas se proporcionan como un diagrama esquemático en la Figura 1.

Los métodos de terapia con células T adoptivas a menudo se han dirigido a antígenos extracelulares. Por ejemplo, CD19, un antígeno extracelular en la superficie de las neoplasias malignas de células B, ha sido una diana para la terapia de células T. Esta terapia de linfocitos T adoptivas a menudo proporcionada utilizando una célula T transducida por receptor de antígeno específico de CD19 puede no ser tan eficaz cuando la neoplasia maligna de células B pierde la expresión del antígeno CD19. Por lo tanto, cuando, por ejemplo, las células T se modifican para reconocer CD20 o CD19, la pérdida de expresión de CD20 y CD19 o la ausencia de estas moléculas en otras neoplasias malignas tales como el mieloma múltiple restringe su aplicación.

Ahora se ha descubierto que un factor de transcripción intracelular Bob1, codificado por el gen POU2AF1, es una diana adecuada para la inmunoterapia. Bob1 está altamente expresado en células B CD19+, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma de células del manto (LCM), linfoma folicular, linfoma de células B grandes y mieloma múltiple (MM) y está ausente en los linajes no B, incluido las células progenitoras hematopoyéticas (CPH) CD34+, células T, fibroblastos, queratinocitos y tracto gastrointestinal.

Bob1 se localiza intracelularmente, pero los polipéptidos derivados de Bob1 presentados por HLA son accesibles en la superficie celular a los receptores de células T (TCR) y, por lo tanto, pueden ser reconocidos por las células T. A partir del ligandoma presentado por HLA (Mol Cell Proteomics, 2013; 12: 1829) se han identificado polipéptidos derivados de Bob1 procesados naturalmente que se muestran en HLA-A*0201 (HLA-A2), HLA-B*0702 (h La -B7) y otras moléculas de HLA de clase I (Tablas 1 y 2). Dado que la autorreactividad hacia autoantígenos tales como Bob1 se previene agotando las células T de alta avidez que reconocen autoantígenos en auto-HLA, se aprovechó la inmunogenicidad de estos polipéptidos presentados en HLA alogénico. De un total de 3 * 109 células mononucleares de sangre periférica de 6 donantes sanos negativos para HLA-A2/B7 diferentes, más de 1000 células T CD8+ que se unen a tetrámeros de polipéptidos-MHC compuestos por polipéptidos derivados de Bob1 unidos a HLA-A2 o HLA-B7 se aislaron y expandieron clonalmente (Figura 2). Los clones de células T se ensayaron para determinar la rigurosa especificidad de polipéptidos mediante estimulación con células K562 negativas para Bob1 que expresaban HLA-A2 o B7 descargadas o pulsadas con polipéptidos derivados de Bob1. Esto dio como resultado la selección de 15 clones de células T altamente específicas para Bob1. Para identificar los clones de células T de mayor avidez, se compararon los clones de células T para determinar la sensibilidad a los polipéptidos probando el reconocimiento de células estimuladoras cargadas con cantidades tituladas de polipéptidos derivados de Bob1 y células B transformadas con EBV positivas para HLA-A2/B7 que expresan Bob1.

El clon 4G11 de células T se seleccionó debido a su alta sensibilidad y especificidad para el polipéptido Bob144 derivado de Bob1 presentado en HLA-B7 y el clon 3C10 de células T reconoció específicamente el polipéptido Bob1245 unido a HLA-A2. El reconocimiento dependiente de Bob1 se demostró mediante la transducción de Bob1 en líneas celulares que de otro modo carecen de expresión de Bob1. Para investigar si estos clones de células T podrían causar toxicidades nocivas, se probó su reactividad frente a un amplio panel de células estimuladoras negativas a Bob1 que demostraron la ausencia de reconocimiento de HPC CD34+ positivas para HLA-B7, células T, monocitos, células dendríticas maduras e inmaduras y fibroblastos incluso en condiciones inflamadas simuladas. Se observó un estricto reconocimiento restringido por HLA-B7 para el clon 4G11 cuando se probó contra un panel estimulador que expresaba una amplia gama de moléculas de HLA de clase I y II comunes y raras. Estos datos ilustran un perfil de reactividad seguro con pocas posibilidades de toxicidad fuera de la diana. Para probar su aplicabilidad clínica, se probaron los clones 4G11 y 3C10 para el reconocimiento de diversas neoplasias malignas de células B primarias. El clon 4G11 reconoció eficazmente la ALL, CLL y el linfoma de células del manto, primarios positivos para HLA-B7, mientras que el clon 3C10 reconoció las neoplasias malignas de células B primarias positivas para HLA-A2, aunque en menor grado. Además, se pudo demostrar un fuerte reconocimiento reproducible de mieloma múltiple primario positivo para HLA-B7 purificado para el clon 4G11. Por lo tanto, el TCR del clon 4G11 de células T puede usarse para inmunoterapia administrando células T transducidas con TCR a pacientes con mieloma múltiple. Para probar si la introducción del TCR de 4G11 confiere reactividad a Bob1 en las células receptoras; el TCR se clonó en un vector retroviral. Se podría instalar una reactividad altamente específica contra células diana que expresan Bob1 positivas para HLA-B7 en células T receptoras transducidas con TCR.

En resumen, el factor de transcripción intracelular Bob1 codificado por el gen POU2AF1 se identificó como una diana adecuada para inmunoterapias basadas en TCR de neoplasias malignas de células B y mieloma múltiple. El clon 4G11 de células T específico de Bob1 reconoció eficazmente la leucemia de células B primaria y el mieloma múltiple. Los enfoques de transferencia de genes de TCR que utilizan TCR específicos de Bob1 pueden brindar nuevas modalidades de tratamiento para pacientes con neoplasias malignas de células B o mieloma múltiple.

Por lo tanto, en algunas realizaciones se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende un promotor operativamente unido a un polinucleótido que codifica la región CDR3 de un receptor de células T que se une específicamente a Bob1, que comprende un primer polinucleótido que codifica un primer polipéptido que comprende la región CDR3 de un polipéptido TCRa; y un segundo polinucleótido que codifica un segundo polipéptido que comprende la región CDR3 de un polipéptido TCRp, en el que la región c DR3 del polipéptido TCRa y el polipéptido TCRp juntos se unen específicamente a Bob1, en el que la molécula de ácido nucleico está de acuerdo con la reivindicación 1. En algunas realizaciones, la región CDR3 del receptor de células T se une específicamente a un polipéptido Bob1 que comprende la secuencia de aminoácidos APAPTAWL o la secuencia de aminoácidos YALNHTLSV. En algunas realizaciones, el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o la SEQ ID NO: 25 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el primer polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3, o un derivado del mismo y el segundo polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6, o un derivado del mismo; o el primer polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 26 o la SEQ ID NO: 27, o un derivado del mismo y el segundo polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 29 o la SEQ ID NO: 30, o un derivado del mismo.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que comprende el polinucleótido que codifica la región CDR3 del receptor de células T que se une específicamente a Bob1 comprende un primer polinucleótido que codifica un primer polipéptido que comprende las regiones VJ de un polipéptido TCRa; y un segundo polinucleótido codifica un segundo polipéptido que comprende las regiones VDJ de un polipéptido TCRp. En algunas realizaciones, el primer polipéptido comprende además la región constante del polipéptido TCRa y el segundo polipéptido comprende además la región constante del polipéptido TCRp. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica un receptor de células T. En algunas realizaciones, la región CDR3 del receptor de células T se une específicamente a un polipéptido Bob1 que comprende la secuencia de aminoácidos APAPTAVVL. En algunas realizaciones, la región constante del primer o segundo polipéptido es una región constante heteróloga. En algunas realizaciones, la regiones constantes del primero y segundo polipéptidos se derivan de las regiones constantes TCR murinas. En algunas realizaciones, el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el primer polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, en las que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el segundo polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el primer polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, el segundo polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 13 o 14. En algunas realizaciones, el primer polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 15, 16 o 18. En algunas realizaciones, en las que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 19 o 20. En algunas realizaciones, el segundo polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 21,22 o 24.

En algunas realizaciones, la región CDR3 del receptor de células T se une específicamente a un polipéptido Bob1 que comprende la secuencia de aminoácidos YALNHTLSV. En algunas realizaciones, el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el primer polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 26 o la SEQ ID NO: 27, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el segundo polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 29 o la SEQ ID NO: 30, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31. En algunas realizaciones, el primer polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 32 o la SEQ ID NO: 33, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el segundo polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 35 o la SEQ ID NO: 36, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 37 o 38. En algunas realizaciones, el primer polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 39, 40, 41 o 42. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 43 o 44. En algunas realizaciones, el segundo polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 45, 46, 47 o 48.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico Caspasa-9 que comprende una región de unión al ligando multimérico y un polipéptido Caspasa-9. En algunas realizaciones, se proporciona un plásmido o vector viral que comprende la molécula de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula modificada transfectada o transducida con la molécula de ácido nucleico, el plásmido o el vector viral. En algunas realizaciones, la célula comprende además una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico Caspasa-9 que comprende una región de unión al ligando multimérico y un polipéptido Caspasa-9. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden la célula modificada y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el ácido nucleico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos ejemplos, se proporcionan métodos para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto diagnosticado con una enfermedad o afección hiperproliferativa, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de las células modificadas al sujeto. En algunos ejemplos, se proporcionan métodos para estimular una respuesta inmune mediada por células a una población de células diana o tejido en un sujeto, que comprenden administrar las células modificadas al sujeto. En algunos ejemplos, en los que el número o la concentración de células diana en el sujeto se reduce tras la administración de la célula modificada. En algunas realizaciones, la célula modificada comprende un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico Caspasa-9 que comprende una región de unión al ligando multimérico y un polipéptido Caspasa-9. En algunos ejemplos, el método comprende además administrar un ligando multimérico que se une a la región de unión del ligando multimérico al sujeto después de la administración de las células modificadas al sujeto. En algunos ejemplos, después de la administración del ligando multimérico, el número o concentración de células modificadas que comprenden el polipéptido quimérico Caspasa-9 se reduce en una muestra obtenida del sujeto después de administrar el ligando multimérico en comparación con el número o concentración de células modificadas que comprenden el polipéptido quimérico Caspasa-9 en una muestra obtenida del sujeto antes de administrar el ligando multimérico.

También se proporcionan métodos para expresar un receptor de células T que se une específicamente a Bob1 en una célula, que comprenden poner en contacto el ácido nucleico con una célula en condiciones en las que el ácido nucleico se incorpora a la célula, por lo que la célula expresa el receptor de células T del ácido nucleico incorporado.

También se describen epítopos de péptidos inmunogénicos de Bob1. En algunas divulgaciones, el epítopo de péptido inmunogénico comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los polipéptidos Bob1 de la Tabla 1. En algunas divulgaciones, el epítopo de péptido inmunogénico comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos APAPTAWL o que tiene la secuencia de aminoácidos YALNHTLS. En algunas divulgaciones, se proporciona una célula modificada que se transduce o transfecta con un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica el epítopo de péptido inmunogénico. También se describen métodos para expresar un epítopo de péptido inmunogénico Bob1 en una célula, que comprende poner en contacto el ácido nucleico con una célula en condiciones en las que el ácido nucleico se incorpora a la célula, por lo que la célula expresa el epítopo inmunogénico Bob1 a partir del ácido nucleico incorporado.

En algunas divulgaciones, se proporciona un método para potenciar una respuesta inmune en un sujeto diagnosticado con una enfermedad o afección hiperproliferativa, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del epítopo del péptido inmunogénico al sujeto. En algunas divulgaciones, se proporciona un método para estimular una respuesta inmune mediada por células a una población de células diana o tejido en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del epítopo del péptido inmunogénico al sujeto. En algunas divulgaciones, se proporciona un método para proporcionar inmunidad antitumoral a un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del epítopo peptídico inmunogénico al sujeto.

Como se usa en este documento, el uso de la palabra "un" o "uno, una" cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación puede significar "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más, "al menos uno" y "uno o más de uno". Además, los términos "que tiene", "que incluye", "que contiene" y "que comprende" son intercambiables y un experto en la técnica es consciente de que estos términos son términos abiertos.

El término "alogénico", como se usa en el presente documento, se refiere al loci de HLA o MHC que son antigénicamente distintos entre las células del huésped y las del donante.

Por lo tanto, las células o tejidos transferidos de la misma especie pueden ser antigénicamente distintos. Los ratones singénicos pueden diferir en uno o más loci (congénitos) y los ratones alogénicos pueden tener el mismo origen.

El término "antígeno", como se usa en este documento, se define como una molécula que provoca una respuesta inmune. Esta respuesta inmune puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. Un antígeno puede derivarse de organismos, subunidades de proteínas/antígenos, células completas muertas o inactivadas o lisados. Los ejemplos de organismos incluyen, pero no se limitan a, Helicobacter, Campylobacter, Clostridium, Corynebacterium diphtheriae, Bordetella pertussis, virus de la influenza, virus de la parainfluenza, virus sincitial respiratorio, Borrelia burgdorfei, Plasmodium, virus del herpes simple, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del papiloma, vibrio cólera, E. coli, virus del sarampión, rotavirus, shigella, Salmonella typhi, Neisseria gonorrhea. Por lo tanto, cualquier macromolécula, incluidas prácticamente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígenos. Además, los antígenos pueden derivarse de ADN genómico o recombinante. Cualquier ADN que contenga secuencias de nucleótidos o secuencias de nucleótidos parciales de un genoma patógeno o un gen o un fragmento de un gen para una proteína que provoque una respuesta inmune da como resultado la síntesis de un antígeno. Además, los presentes métodos no se limitan al uso de la secuencia completa de ácido nucleico de un gen o genoma. Las presentes composiciones y métodos incluyen, pero no se limitan a, el uso de secuencias parciales de ácido nucleico de más de un gen o genoma y que estas secuencias de ácido nucleico están dispuestas en diversas combinaciones para provocar la respuesta inmune deseada.

El término "célula presentadora de antígeno" es cualquiera de una variedad de células capaces de exhibir, adquirir o presentar al menos un antígeno o fragmento antigénico en (o en) su superficie celular. En general, el término "célula" puede ser cualquier célula que logre el objetivo de ayudar a mejorar una respuesta inmune (es decir, de los brazos de células T o células B del sistema inmune) contra un antígeno o composición antigénica. Como se discutió en Kuby, 2000, Immunology, suplemento 4ta edición, W.H. Freeman and Company, por ejemplo, y utilizado en el presente documento en determinadas realizaciones, una célula que muestra o presenta un antígeno normalmente o con una molécula o complejo de histocompatibilidad principal de clase II con una célula inmunitaria es una "célula presentadora de antígeno". En ciertos aspectos, una célula (por ejemplo, una célula APC) puede fusionarse con otra célula, tal como una célula recombinante o una célula tumoral que expresa el antígeno deseado. Los métodos para preparar una fusión de dos o más células se tratan, por ejemplo, en Goding, J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 65­ 66, 71-74 (Academic Press, 1986); Campbell, en: Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burden & Von Knippenberg, Ámsterdam, Elsevier, páginas 75-83, 1984; Kohler & Milstein, Nature, 256: 495-497, 1975; Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511-519, 1976, Gefter et al., Somatic Cell Genet., 3: 231-236, 1977. En algunos casos, la célula inmunitaria a la que una célula muestra o presenta un antígeno es un célula TH CD4+. Las moléculas adicionales expresadas en la APC u otras células inmunes pueden ayudar o mejorar la potenciación de una respuesta inmune. Las moléculas secretadas o solubles, como por ejemplo, citocinas y adyuvantes, también pueden ayudar o potenciar la respuesta inmune contra un antígeno. En este documento se discuten varios ejemplos.

Una "fracción de reconocimiento de antígeno" puede ser cualquier polipéptido o fragmento del mismo, tal como, por ejemplo, un dominio variable de fragmento de anticuerpo, ya sea de origen natural o sintético, que se une a un antígeno. Los ejemplos de fracciones de reconocimiento de antígenos incluyen, entre otros, polipéptidos derivados de anticuerpos, tales como, por ejemplo, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), Fab, Fab', F(ab')² y fragmentos Fv; polipéptidos derivados de receptores de células T, tales como, por ejemplo, dominios variables de TCR; factores secretados (por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento) que pueden fusionarse artificialmente con dominios de señalización (por ejemplo, "citocinas") y cualquier fragmento de ligando o receptor (por ejemplo, CD27, NKG2D) que se una a la proteína análoga extracelular. También podrían usarse bibliotecas combinatorias para identificar péptidos que se unen con alta afinidad a dianas asociadas a tumores.

El término "autólogo" significa una célula, ácido nucleico, proteína, polipéptido o similar derivado del mismo individuo al que se administra posteriormente. Las células modificadas de los presentes métodos pueden ser, por ejemplo, células autólogas, tales como, por ejemplo, células T autólogas.

El término "cáncer", como se usa en el presente documento, se define como una hiperproliferación de células cuyo rasgo único, pérdida de controles normales, da como resultado un crecimiento no regulado, falta de diferenciación, invasión tisular local y metástasis. Los ejemplos incluyen, entre otros, melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón, hepatocarcinoma, leucemia, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, cáncer de encía, lengua, neuroblastoma, cáncer de cabeza, cuello, mama, páncreas, próstata, renal, óseo, testicular, ovárico, mesotelioma, cervical, gastrointestinal, linfoma, cerebro, colon, sarcoma o vejiga.

Los términos "célula", "línea celular" y "cultivo celular", como se usan en este documento, pueden usarse indistintamente. Todos estos términos también incluyen su progenie, que son todas y cada una de las generaciones posteriores. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas.

Como se usa en el presente documento, el término "ADNc" pretende hacer referencia al ADN preparado usando ARN mensajero (ARNm) como plantilla. La ventaja de usar un ADNc, en contraposición al Ad N genómico o ADN polimerizado a partir de una plantilla de ARN genómico, no procesado o parcialmente procesado, es que el ADNc contiene principalmente secuencias codificantes de la proteína correspondiente. Hay ocasiones en las que se usa la secuencia genómica completa o parcial, como cuando se requieren regiones no codificantes para una expresión óptima o cuando las regiones no codificantes, como los intrones, deben dirigirse en una estrategia antisentido.

Como se usa en este documento, el término "constructo de expresión" o "transgén" se define como cualquier tipo de constructo genético que contiene un ácido nucleico que codifica productos génicos en el que parte o toda la secuencia que codifica el ácido nucleico es capaz de ser transcrita puede se insertado en el vector. El transcrito se traduce en una proteína, pero no es necesario. En determinadas realizaciones, la expresión incluye tanto la transcripción de un gen como la traducción de ARNm en un producto génico. En otras realizaciones, la expresión solo incluye la transcripción del ácido nucleico que codifica genes de interés. El término "constructo terapéutico" también puede usarse para referirse al constructo de expresión o transgén. El constructo de expresión o transgén puede usarse, por ejemplo, como terapia para tratar enfermedades o trastornos hiperproliferativos, tales como cáncer, por lo que el constructo de expresión o transgén es un constructo terapéutico o un constructo profiláctico.

Como se usa en este documento, el término "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico capaz de ser transcrito. En algunos casos, las moléculas de ARN se traducen luego en una proteína, polipéptido o péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de secuencias de control, que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Además de las secuencias de control que gobiernan la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que también sirven para otras funciones y se comentan más adelante.

Como se usa en este documento, el término "ex vivo" se refiere a "fuera" del cuerpo. Los términos "ex vivo" e "in vitro" pueden usarse indistintamente en este documento.

Los receptores de células T (TCR) son proteínas inmunes que se unen específicamente a moléculas antigénicas. Los TCR están compuestos por dos polipéptidos diferentes que se encuentran en la superficie de las células T. Reconocen, o se unen específicamente a, antígenos unidos a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad; tras la unión al antígeno, la célula T se activa. Los TCR pueden comprender polipéptidos a y p, o cadenas. Los polipéptidos a y p incluyen dos dominios extracelulares, los dominios variable y constante. El dominio variable de los polipéptidos a y p tiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR); se considera que CDR3 es la principal CDR responsable de reconocer el epítopo. El polipéptido a incluye las regiones V y J, generadas por recombinación de VJ, y el polipéptido p incluye las regiones V, D y J, generadas por recombinación de VDJ. La intersección de las regiones VJ y las regiones VDJ corresponde a la región CDR3. Los TCR a menudo se nombran utilizando la nomenclatura de TCR de International Immunogenetics (IMGT) (Base de datos de IMGT, www.IMGT.org; Giudicelli, V., et al., IMGT/LIGM-DB, the IMGT® comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor Nucleotide sequences, Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006). PMID: 16381979; T Cell Receptor Factsbook, LeFranc y LeFranc, Academic Press ISBN 0-12-441352-8).

Por "se une o se unen específicamente a" en lo que se refiere a un receptor de células T, o en lo que se refiere a un receptor de células T recombinante, fragmento de ácido nucleico, variante o análogo, o una célula modificada, tal como, por ejemplo, los receptores de células T de Bob1, y células modificadas que expresan Bob1 en este documento, se entiende que el receptor de células T, o un fragmento del mismo, reconoce o se une selectivamente al antígeno Bob1. Bajo ciertas condiciones, por ejemplo, en un inmunoensayo, por ejemplo un inmunoensayo discutido en este documento, el receptor de células T se une a Bob1 y no se une en una cantidad significativa a otros polipéptidos. Por lo tanto, el receptor de células T se une a Bob 1 con al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 veces más afinidad que a un polipéptido antigénico de control. Esta unión también se puede determinar indirectamente en el contexto de una célula T modificada que expresa un TCR de Bob1. En ensayos tales como, por ejemplo, un ensayo discutido en el presente documento, la célula T modificada es específicamente reactiva contra una línea celular de mieloma múltiple y al menos líneas de células B malignas tales como, por ejemplo, ALL, CLL y líneas celulares de linfoma de células del manto.

Por lo tanto, la célula T modificada que expresa Bob1 se une a una línea celular de mieloma múltiple o una línea de células B malignas con al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 veces más reactividad en comparación con su reactividad frente a una línea celular de control que no es una línea de células de mieloma múltiple o una línea de células B malignas.

Como se usa en el presente documento, el término "funcionalmente equivalente", en lo que se refiere a un receptor de células T, por ejemplo, o en lo que se refiere a un fragmento, variante o análogo de ácido nucleico del receptor de células T, se refiere a un ácido nucleico que codifica un receptor de células T o polipéptido del receptor de células T, que estimula una respuesta inmune contra un antígeno o célula. "Funcionalmente equivalente" o "un fragmento funcional" de un polipéptido receptor de células T se refiere, por ejemplo, a un receptor de células T que carece de un dominio receptor de células T, tal como una región constante, pero que es capaz de estimular una respuesta inmune típica para una célula T. Un fragmento de receptor de células T funcionalmente equivalente puede, por ejemplo, unirse específicamente a un antígeno o reconocerlo y, tras el reconocimiento, activar el linfocito T. Cuando el término "funcionalmente equivalente" se aplica a otros ácidos nucleicos o polipéptidos, tales como, por ejemplo, Caspasa-9 o Caspasa-9 truncada, se refiere a fragmentos, variantes y similares que tienen la misma o similar actividad que los polipéptidos de referencia de los métodos de la presente invención. Por ejemplo, un fragmento funcional de un polipéptido de antígeno tumoral, tal como, por ejemplo, PSMA, puede ser antigénico, lo que permite la producción de anticuerpos que reconocen el antígeno tumoral particular. Un fragmento funcional de una región de unión al ligando, por ejemplo, Fvls, incluiría una porción suficiente del polipéptido de la región de unión al ligando para unirse al ligando apropiado. "Funcionalmente equivalente" se refiere, por ejemplo, a un polipéptido coestimulador que carece del dominio extracelular, pero es capaz de amplificar la respuesta de destrucción de tumores mediada por células T cuando se expresa en células T.

El término "enfermedad hiperproliferativa" se define como una enfermedad que resulta de una hiperproliferación de células. Los ejemplos de enfermedades hiperproliferativas incluyen, pero no se limitan a, cáncer o enfermedades autoinmunes. Otras enfermedades hiperproliferativas pueden incluir oclusión vascular, reestenosis, aterosclerosis o enfermedad inflamatoria intestinal.

Como se usa en el presente documento, el término "gen" se define como una proteína funcional, un polipéptido o una unidad que codifica un péptido. Como se entenderá, este término funcional incluye secuencias genómicas, secuencias de ADNc y segmentos génicos más pequeños modificados que expresan, o están adaptados para expresar, proteínas, polipéptidos, dominios, péptidos, proteínas de fusión y mutantes.

El término "composición inmunogénica" o "inmunógeno" se refiere a una sustancia que es capaz de provocar una respuesta inmune. Los ejemplos de inmunógenos incluyen, por ejemplo, antígenos, autoantígenos que juegan un papel en la inducción de enfermedades autoinmunes y antígenos asociados a tumores expresados en células cancerosas.

El término "inmunodeprimido" como se usa en este documento se define como un sujeto que tiene un sistema inmunológico reducido o debilitado. La condición inmunodeprimida puede deberse a un defecto o disfunción del sistema inmunológico u otros factores que aumentan la susceptibilidad a infecciones y/o enfermedades. Aunque tal categorización permite una base conceptual para la evaluación, los individuos inmunodeprimidos a menudo no encajan completamente en uno u otro grupo. Puede verse afectado más de un defecto en los mecanismos de defensa del organismo. Por ejemplo, las personas con un defecto específico de los linfocitos T causado por el VIH también pueden tener neutropenia causada por medicamentos utilizados para la terapia antiviral o estar inmunodeprimidos debido a una ruptura de la integridad de la piel y las membranas mucosas. Un estado inmunodeprimido puede resultar de vías centrales permanentes u otros tipos de deterioro debido al abuso de drogas intravenosas; o ser causado por una neoplasia maligna secundaria, desnutrición o haber sido infectado con otros agentes infecciosos tales como tuberculosis o enfermedades de transmisión sexual, por ejemplo, sífilis o hepatitis.

Como se usa en este documento, el término "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran a un animal o un ser humano.

Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los vectores o células presentadas en el presente documento, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar a las composiciones ingredientes activos suplementarios. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.

Como se usa en este documento, el término "polinucleótido" se define como una cadena de nucleótidos. Además, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Por lo tanto, los ácidos nucleicos y polinucleótidos como se usan en este documento son intercambiables. Los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que pueden hidrolizarse en los "nucleótidos" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos se pueden hidrolizar en nucleósidos. Como se usa en este documento, los polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, todas las secuencias de ácido nucleico que se obtienen por cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, sin limitación, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácido nucleico a partir de una biblioteca recombinante o un genoma celular, utilizando tecnología de clonación ordinaria y PCRMR, y similares, y por medios sintéticos. Además, los polinucleótidos incluyen mutaciones de los polinucleótidos, incluyen, pero no se limitan a, mutación de los nucleótidos o nucleósidos por métodos bien conocidos en la técnica. Un ácido nucleico puede comprender uno o más polinucleótidos.

Como se usa en este documento, el término "polipéptido" se define como una cadena de residuos de aminoácidos, que normalmente tienen una secuencia definida. Como se usa en el presente documento, el término polipéptido puede ser intercambiable con el término "proteínas".

Como se usa en este documento, el término "promotor" se define como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de un gen.

Como se usa en este documento, los términos "regular una respuesta inmune", "modular una respuesta inmune" o "controlar una respuesta inmune", se refieren a la capacidad de modificar la respuesta inmune. Por ejemplo, la composición es capaz de potenciar y/o activar la respuesta inmune. Además, la composición también es capaz de inhibir la respuesta inmune. La forma de regulación está determinada por el ligando que se usa con la composición. Por ejemplo, un análogo dimérico de la sustancia química da como resultado la dimerización del polipéptido coestimulante que conduce a la activación de la célula T, sin embargo, un análogo monomérico de la sustancia química no da como resultado la dimerización del polipéptido coestimulante, que no activaría las células T.

El término "transfección" y "transducción" son intercambiables y se refieren al proceso mediante el cual se introduce una secuencia de ADN exógena en una célula huésped eucariota. La transfección (o transducción) se puede lograr por cualquiera de varios medios que incluyen electroporación, microinyección, administración con pistola de genes, infección retroviral, lipofección, superfección y similares.

Como se usa en este documento, el término "singénico" se refiere a células, tejidos o animales que tienen genotipos que son idénticos o lo suficientemente estrechamente relacionados para permitir el trasplante de tejido, o que son inmunológicamente compatibles. Por ejemplo, gemelos idénticos o animales de la misma cepa consanguínea. Singénicos e isogénicos se pueden utilizar indistintamente.

El término "paciente" o "sujeto" son intercambiables y, como se usan en este documento, incluyen, pero no se limitan a, un organismo o animal; un mamífero, que incluye, por ejemplo, un ser humano, un primate no humano (por ejemplo, un mono), un ratón, un cerdo, una vaca, una cabra, un conejo, una rata, un conejillo de indias, un hámster, un caballo, un mono, una oveja u otro mamífero no humano; un no mamífero, que incluye, por ejemplo, un vertebrado no mamífero, tal como un ave (por ejemplo, un pollo o un pato) o un pez, y un invertebrado no mamífero.

Como se usa en este documento, el término "vacuna" se refiere a una formulación que contiene una composición presentada en este documento que está en una forma que se puede administrar a un animal. Normalmente, la vacuna comprende una solución salina convencional o un medio de solución acuosa tamponada en el que la composición se suspende o se disuelve. En esta forma, la composición se puede usar convenientemente para prevenir, mejorar o bien tratar de otro modo una afección. Tras la introducción en un sujeto, la vacuna puede provocar una respuesta inmune que incluye, pero no se limita a, la producción de anticuerpos, citocinas y/u otras respuestas celulares.

Como se usa en el presente documento, los términos "bajo control transcripcional" o "unido operativamente" se define como que el promotor está en la ubicación y orientación correctas en relación con el ácido nucleico para controlar la iniciación de la ARN polimerasa y la expresión del gen.

Como se usa en este documento, los términos "tratamiento", "tratar", "tratado" o "que se trata" se refieren a profilaxis y/o terapia. Cuando se usa con respecto a un tumor sólido, tal como un tumor sólido canceroso, por ejemplo, el término se refiere a la prevención mediante tratamiento profiláctico, que aumenta la resistencia del sujeto a tumores sólidos o cáncer. En algunos ejemplos, el sujeto puede tratarse para prevenir el cáncer, cuando el cáncer es familiar o está genéticamente asociado. Cuando se usa con respecto a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, el término se refiere a un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia de un sujeto a la infección por un patógeno o, en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el sujeto se infecte con el patógeno o mostrará signos de enfermedad atribuibles a la infección, así como un tratamiento después de que el sujeto se haya infectado para combatir la infección, por ejemplo, reducir o eliminar la infección o evitar que empeore.

Las composiciones proporcionadas en este documento se pueden usar, por ejemplo, para tratar un trastorno de enfermedad o afección en la que hay una expresión elevada de un antígeno tumoral.

Como se usa en este documento, el término "vacuna" se refiere a una formulación que contiene una composición presentada en este documento que está en una forma que se puede administrar a un animal. Normalmente, la vacuna comprende una solución salina convencional o un medio de solución acuosa tamponada en el que la composición se suspende o se disuelve. En esta forma, la composición se puede usar convenientemente para prevenir, mejorar o tratar de otro modo una afección. Tras la introducción en un sujeto, la vacuna puede provocar una respuesta inmune que incluye, pero no se limita a, la producción de anticuerpos, citocinas y/u otras respuestas celulares.

Enfermedad de la sangre: Los términos "enfermedad de la sangre", "enfermedad sanguínea" y/o "enfermedades de la sangre" como se usan en este documento, se refieren a afecciones que afectan la producción de sangre y sus componentes, que incluyen, entre otras, glóbulos, hemoglobina, proteínas sanguíneas, el mecanismo de coagulación, producción de sangre, producción de proteínas sanguíneas, similares y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de enfermedades de la sangre incluyen anemias, leucemias, linfomas, neoplasias hematológicas, albuminemias, hemofilias y similares.

Enfermedad de la médula ósea: El término "enfermedad de la médula ósea" como se usa en este documento, se refiere a condiciones que conducen a una disminución en la producción de células sanguíneas y plaquetas sanguíneas. En algunas enfermedades de la médula ósea, la arquitectura normal de la médula ósea puede verse desplazada por infecciones (por ejemplo, tuberculosis) o neoplasias malignas, que a su vez pueden conducir a la disminución de la producción de células sanguíneas y plaquetas sanguíneas. Los ejemplos no limitantes de enfermedades de la médula ósea incluyen leucemias, infecciones bacterianas (por ejemplo, tuberculosis), enfermedad o envenenamiento por radiación, apnocitopenia, anemia, mieloma múltiple y similares.

Células T y células T activadas: Las células T CD3+ (también denominadas linfocitos T) pertenecen a un grupo de glóbulos blancos denominados linfocitos. Los linfocitos generalmente participan en la inmunidad mediada por células. La "T" en "células T" se refiere a células derivadas del timo o cuya maduración está influenciada por él. Las células T se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos como las células B y las células asesinas naturales (NK) por la presencia de proteínas de la superficie celular conocidas como receptores de células T. El término "células T activadas", como se usa en este documento, se refiere a células T que han sido estimuladas para producir una respuesta inmune (por ejemplo, expansión clonal de células T activadas) mediante el reconocimiento de un determinante antigénico presentado en el contexto de un marcador de histocompatibilidad principal (MHC) de clase I y II. Las células T se activan por la presencia de un determinante antigénico, citocinas y/o linfocinas y grupos de proteínas de la superficie celular de diferenciación (por ejemplo, CD3, CD4, CD8, similares y combinaciones de los mismos). Las células que expresan un grupo de proteína diferencial a menudo se dice que son "positivas" para la expresión de esa proteína en la superficie de las células T (por ejemplo, las células positivas para la expresión de CD3 o CD4 se denominan CD3+ o CD4+). Las proteínas CD3, CD4 y CD8 son receptores o correceptores de la superficie celular que pueden participar directa y/o indirectamente en la transducción de señales en las células T.

Sangre periférica: El término "sangre periférica", como se usa en este documento, se refiere a componentes celulares de la sangre (por ejemplo, glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas), que se obtienen o preparan a partir del conjunto de sangre circulante y no secuestrados dentro del sistema linfático, bazo, hígado o médula ósea.

Sangre del cordón umbilical: La sangre del cordón umbilical es distinta de la sangre periférica y la sangre secuestrada en el sistema linfático, el bazo, el hígado o la médula ósea. Los términos "sangre del cordón umbilical", "sangre del cordón umbilical" o "sangre del cordón umbilical", que pueden usarse indistintamente, se refieren a la sangre que permanece en la placenta y en el cordón umbilical adherido después del parto. La sangre del cordón a menudo contiene células madre, incluidas las células hematopoyéticas.

Por "obtenido o preparado" como, por ejemplo, en el caso de las células, se entiende que las células o el cultivo celular se aíslan, purifican o purifican parcialmente de la fuente, en la que la fuente puede ser, por ejemplo, sangre de cordón umbilical, médula ósea o sangre periférica. Los términos también pueden aplicarse al caso en el que la fuente original, o un cultivo celular, se ha cultivado y las células se han replicado, y en las que las células de la progenie ahora se derivan de la fuente original.

Por "matar" o "que mata" como en un porcentaje de células muertas, se entiende la muerte de una célula por apoptosis, medida usando cualquier método conocido para medir la apoptosis. El término también puede referirse a la ablación celular.

Célula T donante: El término "célula T del donante", como se usa en el presente documento, se refiere a células T que a menudo se administran a un receptor para conferir inmunidad antiviral y/o antitumoral después del trasplante alogénico de células madre. Las células T del donante a menudo se utilizan para inhibir el rechazo del injerto de médula ósea y aumentar el éxito del aloinjerto; sin embargo, las mismas células T del donante pueden provocar una respuesta aloagresiva contra los antígenos del huésped, lo que a su vez puede provocar la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD). Ciertas células T de donantes activadas pueden causar una respuesta de GvHD más alta o más baja que otras células T activadas. Las células T del donante también pueden ser reactivas contra las células tumorales del receptor, lo que provoca un efecto beneficioso de injerto contra tumor.

Las variantes de función conservadora son proteínas o enzimas en las que se ha cambiado un residuo de aminoácido determinado sin alterar la conformación y función generales de la proteína o enzima, que incluyen, entre otros, el reemplazo de un aminoácido por uno que tiene propiedades similares, incluido el carácter polar o no polar, el tamaño, la forma y la carga. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos para muchos de los aminoácidos no codificados genéticamente conocidos comúnmente son bien conocidas en la técnica. Las sustituciones conservadoras de otros aminoácidos no codificados se pueden determinar basándose en sus propiedades físicas en comparación con las propiedades de los aminoácidos codificados genéticamente.

Los aminoácidos distintos de los indicados como conservados pueden diferir en una proteína o enzima, de modo que el porcentaje de similitud de la secuencia de proteínas o aminoácidos entre dos proteínas cualesquiera de función similar puede variar y puede ser, por ejemplo, al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, y lo más preferiblemente al menos el 95%, según se determina de acuerdo con un esquema de alineación. Como se menciona en el presente documento, "similitud de secuencia" significa el grado en que están relacionadas las secuencias de nucleótidos o proteínas. El grado de similitud entre dos secuencias puede basarse en el porcentaje de identidad y/o conservación de la secuencia. En el presente documento, "identidad de secuencia" significa el grado en el que dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos son invariantes. "Alineación de secuencias" significa el proceso de alinear dos o más secuencias para lograr niveles máximos de identidad (y, en el caso de secuencias de aminoácidos, conservación) con el fin de evaluar el grado de similitud. Se conocen en la técnica numerosos métodos para alinear secuencias y evaluar similitud/identidad tales como, por ejemplo, el Método de Agrupación, en el que la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN, así como BLASTN, BlAs Tp y FASTA. Al utilizar cualquiera de estos programas, las configuraciones preferidas son aquellas que dan como resultado la mayor similitud de secuencia.

Célula estromal mesenquimatosa: Los términos "célula estromal mesenquimatosa" o "célula estromal mesenquimatosa derivada de la médula ósea" como se usan en el presente documento, se refieren a células madre multipotentes que pueden diferenciarse ex vivo, in vitro e in vivo en adipocitos, osteoblastos y condroblastos, y pueden definirse además como una fracción de células de médula ósea mononucleares que se adhieren a placas de cultivo de plástico en condiciones de cultivo estándar, son negativas para marcadores de linaje hematopoyético y son positivas para CD73, CD90 y CD105.

Células madre embrionarias: El término "célula madre embrionaria", como se usa en este documento, se refiere a células madre pluripotentes derivadas de la masa celular interna del blastocisto, un embrión en etapa temprana de entre 50 y 150 células. Las células madre embrionarias se caracterizan por su capacidad para renovarse indefinidamente y por su capacidad para diferenciarse en derivados de las tres capas germinales primarias, ectodermo, endodermo y mesodermo. Pluripotente se distingue de multipotente en que las células pluripotentes pueden generar todos los tipos de células, mientras que las células multipotentes (por ejemplo, células madre adultas) solo pueden producir un número limitado de tipos de células.

Célula madre pluripotente inducible: Los términos "célula madre pluripotente inducible" o "célula madre pluripotente inducida" como se usa en este documento se refieren a células adultas o diferenciadas, que son "reprogramadas" o inducidas por manipulación genética (por ejemplo, expresión de genes que a su vez activa la pluripotencia), biológica (por ejemplo, virus de tratamiento o retrovirus) y/o química (por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos y similares) para generar células que sean capaces de diferenciarse en muchos, si no en todos los tipos de células, como células madre embrionarias. Las células madre pluripotentes inducibles se distinguen de las células madre embrionarias en que alcanzan un estado diferenciado intermedio o terminal (por ejemplo, células de la piel, células óseas, fibroblastos y similares) y luego se inducen a desdiferenciarse, recuperando así parte o la totalidad de la capacidad para generar células multipotentes o pluripotentes.

Célula CD34+: El término célula "CD34+", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que expresa la proteína CD34 en su superficie celular. "CD34", como se usa en este documento, se refiere a una glicoproteína de la superficie celular (por ejemplo, proteína de sialomucina) que a menudo actúa como un factor de adhesión célulacélula y está involucrada en la entrada de células T en los ganglios linfáticos, y es un miembro de la familia de genes del "grupo de diferenciación". La CD34 también puede mediar en la unión de las células madre a la médula ósea, la matriz extracelular o directamente a las células estromales. Las células CD34+ a menudo se encuentran en el cordón umbilical y la médula ósea como células hematopoyéticas, un subconjunto de células madre mesenquimales, células progenitoras endoteliales, células endoteliales de vasos sanguíneos pero no linfáticos (excepto linfáticos pleurales), mastocitos, una subpoblación de células dendríticas (que son negativas para el factor XIIIa) en el intersticio y alrededor de los anexos de la dermis de la piel, así como en las células de ciertos tumores de tejidos blandos (por ejemplo, sarcoma alveolar de partes blandas, leucemia linfoblástica aguda pre-B (Pre-B-ALL), leucemia mielógena aguda (LMA), LMA-M7, dermatofibrosarcoma protuberante, tumores del estroma gastrointestinal, fibroblastoma de células gigantes, sarcoma granulocítico, sarcoma de Kaposi, liposarcoma, histiocitoma fibroso maligno, tumores malignos de la vaina del nervio periférico, hemangiopericitomas meningeales y meningiomas, neurofibromas, schwanomas, y carcinoma papilar de tiroides).

Los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) se refieren a las células T que tienen varios receptores que se infiltran en los tumores y destruyen las células tumorales en una forma dirigida. La regulación de la actividad de los TIL utilizando los métodos de la presente solicitud permitiría un control más directo de la eliminación de las células tumorales.

Vector de expresión génica: Los términos "vector de expresión génica", "vector de expresión de ácido nucleico" o "vector de expresión" como se usa en este documento, que se pueden usar indistintamente en todo el documento, generalmente se refieren a una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido, fago, que se replica de forma autónoma secuencia (ARS), cromosoma artificial, cromosoma artificial de levadura (por ejemplo, YAC)) que puede replicarse en una célula huésped y utilizarse para introducir un gen o genes en una célula huésped. Los genes introducidos en el vector de expresión pueden ser genes endógenos (por ejemplo, un gen que normalmente se encuentra en la célula u organismo huésped) o genes heterólogos (por ejemplo, genes que normalmente no se encuentran en el genoma o en ácidos nucleicos extracromosómicos de la célula huésped o organismo). Los genes introducidos en una célula por un vector de expresión pueden ser genes nativos o genes que han sido modificados o manipulados. El vector de expresión génica también se puede diseñar para que contenga secuencias reguladoras no traducidas 5' y 3' que a veces pueden funcionar como secuencias potenciadoras, regiones promotoras y/o secuencias terminadoras que pueden facilitar o mejorar la transcripción eficiente del gen o genes transportados en el vector de expresión. En ocasiones, un vector de expresión génica también se modifica para la funcionalidad de replicación y/o expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) en un tipo de célula, ubicación celular o tipo de tejido en particular. Los vectores de expresión a veces incluyen un marcador seleccionable para el mantenimiento del vector en la célula huésped o receptora.

Promotor regulado por el desarrollo: El término "promotor regulado por el desarrollo" como se usa en este documento se refiere a un promotor que actúa como el sitio de unión inicial para la ARN polimerasa para transcribir un gen que se expresa bajo ciertas condiciones que están controladas, iniciadas o influenciadas por un programa o ruta de desarrollo. Los promotores regulados por el desarrollo a menudo tienen regiones de control adicionales en o cerca de la región promotora para los activadores de unión o represores de la transcripción que pueden influir en la transcripción de un gen que es parte de un programa o ruta de desarrollo. Los promotores regulados por el desarrollo a veces participan en la transcripción de genes cuyos productos génicos influyen en la diferenciación del desarrollo de las células.

Células diferenciadas por el desarrollo: El término "células diferenciadas por el desarrollo", como se usa en este documento, se refiere a células que se han sometido a un proceso, que a menudo implica la expresión de genes específicos regulados por el desarrollo, mediante los cuales la célula evoluciona de una forma menos especializada a una más especializada para realizar una función específica. Los ejemplos no limitantes de células diferenciadas por el desarrollo son células hepáticas, células pulmonares, células cutáneas, células nerviosas, células sanguíneas y similares. Los cambios en la diferenciación del desarrollo generalmente involucran cambios en la expresión génica (por ejemplo, cambios en los patrones de expresión génica), reorganización genética (por ejemplo, remodelación o cromatina para ocultar o exponer genes que serán silenciados o expresados, respectivamente) y ocasionalmente involucran cambios en secuencias de ADN (por ejemplo, diferenciación por diversidad inmunitaria). La diferenciación celular durante el desarrollo puede entenderse como el resultado de una red reguladora de genes. Un gen regulador y sus módulos reguladores en cis son nodos en una red reguladora de genes que reciben información (por ejemplo, proteína expresada secuencia arriba en una ruta o programa de desarrollo) y crean resultados en otra parte de la red (por ejemplo, el producto génico expresado actúa sobre otros genes secuencia abajo en la ruta o programa de desarrollo).

En algunas realizaciones, el ácido nucleico está contenido dentro de un vector viral. En determinadas realizaciones, el vector viral es un vector adenoviral o un vector retroviral o lentiviral. Se entiende que en algunas realizaciones, la célula se pone en contacto con el vector viral ex vivo, y en algunas realizaciones, la célula se pone en contacto con el vector viral in vivo.

En determinadas formas de realización, la célula también se pone en contacto con un antígeno. A menudo, la célula se pone en contacto con el antígeno ex vivo. A veces, la célula se pone en contacto con el antígeno in vivo. En algunas realizaciones, la célula está en un sujeto y se genera una respuesta inmune contra el antígeno. A veces, la respuesta inmune es una respuesta inmune de linfocitos T citotóxicos (CTL). A veces, la respuesta inmune se genera contra un antígeno tumoral. En determinadas formas de realización, la célula se activa sin la adición de un adyuvante.

En algunas divulgaciones, la célula se transduce con el ácido nucleico ex vivo y se administra al sujeto mediante administración intradérmica. En algunas divulgaciones, la célula se transduce con el ácido nucleico ex vivo y se administra al sujeto mediante administración subcutánea. A veces, la célula se transduce con el ácido nucleico ex vivo. A veces, la célula se transduce con el ácido nucleico in vivo.

En algunas realizaciones, la célula se pone en contacto con un antígeno, a veces ex vivo. En ciertas divulgaciones la célula está en un sujeto y se genera una respuesta inmune contra el antígeno, tal como una respuesta inmune de linfocitos T citotóxicos (CTL). En ciertas divulgaciones, se genera una respuesta inmune contra un antígeno tumoral (por ejemplo, PSMA). En algunas divulgaciones, el ácido nucleico se prepara ex vivo y se administra al sujeto mediante administración intradérmica o mediante administración subcutánea, por ejemplo. A veces, la célula se transduce o transfecta con el ácido nucleico ex vivo o in vivo.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende una secuencia promotora unida operativamente a la secuencia polinucleotídica. Alternativamente, el ácido nucleico comprende un ARN transcrito ex vivo, que contiene la región codificante de proteína de la proteína quimérica.

Por "reducción del tamaño del tumor" o "inhibición del crecimiento del tumor" de un tumor sólido se entiende una respuesta al tratamiento, o la estabilización de la enfermedad, de acuerdo con las pautas estándar, como, por ejemplo, los criterios de Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST). Por ejemplo, esto puede incluir una reducción en el diámetro de un tumor sólido de aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%, o la reducción en el número de tumores, células tumorales circulantes o marcadores tumorales, de aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100%. El tamaño de los tumores se puede analizar mediante cualquier método, que incluye, por ejemplo, tomografía computarizada, resonancia magnética, por ejemplo, tomografía computarizada por resonancia magnética, radiografía de tórax (para tumores de pulmón) o imágenes moleculares, por ejemplo, tomografía por emisión de positrones, tal como, por ejemplo, una exploración por PET después de administrar un PSA marcado con yodo 123, por ejemplo, ligando de PSMA, como, por ejemplo, cuando el inhibidor es TROFEX™/MlP-1072/1095, o formación de imágenes moleculares, por ejemplo, SPECT, o una exploración PET utilizando PSA, por ejemplo, anticuerpo PSMA, como, por ejemplo, pendetida capromad (Prostascint), un anticuerpo PSMA marcado con iridio 111.

Por "reducir, ralentizar o inhibir la vascularización del tumor" se entiende una reducción en la vascularización del tumor de aproximadamente el 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100%, o una reducción en la aparición de nueva vasculatura de aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%, cuando se compara con la cantidad de vascularización del tumor antes del tratamiento. La reducción puede referirse a un tumor o puede ser una suma o un promedio de la vascularización en más de un tumor. Los métodos para medir la vascularización del tumor incluyen, por ejemplo, TAC, MRI, por ejemplo, CT-MRI, o imágenes moleculares, por ejemplo, SPECT, o una PET, como, por ejemplo, una PET después de administrar PSA marcado con yodo 123, por ejemplo, ligando de PSMA, como, por ejemplo, cuando el inhibidor es TROFEX™/MIP-1072/1095, o una exploración PET usando PSA, por ejemplo, anticuerpo PSMA, tal como, por ejemplo, pendetida capromad (Prostascint), un anticuerpo PSMA marcado con iridio 111.

Un tumor se clasifica o se nombra como parte de un órgano, tal como un tumor de cáncer de próstata cuando, por ejemplo, el tumor está presente en la glándula prostática, o se ha derivado o ha hecho metástasis de un tumor en la glándula prostática, o produce PSA. Un tumor ha hecho metástasis a partir de un tumor en la glándula prostática cuando, por ejemplo, se determina que el tumor tiene puntos de ruptura cromosómicos que son iguales o similares a un tumor en la glándula prostática del sujeto.

Para las neoplasias hematológicas, por "reducir, ralentizar o inhibir una neoplasia hematológica" se entiende una reducción, ralentización o inhibición de la cantidad o concentración de células malignas, por ejemplo, medida en una muestra obtenida del sujeto, de aproximadamente el 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%, en comparación con la cantidad o concentración de células malignas antes del tratamiento. Los métodos para medir la cantidad o concentración de células malignas o la carga tumoral incluyen, por ejemplo, qRT-PCR y secuenciación de todo el genoma.

Para los tumores hematológicos, por "reducir, ralentizar o inhibir una carga tumoral" se entiende una reducción, ralentización o inhibición de la cantidad o concentración de células tumorales, por ejemplo, medida en una muestra obtenida del sujeto, de aproximadamente el 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%, en comparación con la cantidad o concentración de células tumorales antes del tratamiento. Métodos para medir la cantidad o concentración de células tumorales, por ejemplo, qRT-PCR y secuenciación amplia del genoma.

Modificación de los constructos de expresión

Los constructos de expresión que expresan los presentes TCR o polipéptidos quiméricos comprenden el TCR o la región codificante del polipéptido y una secuencia promotora, todos unidos operativamente. En general, el término "operativamente enlazado" pretende indicar que la secuencia promotora está funcionalmente enlazada a una segunda secuencia, en la que la secuencia promotora inicia y media la transcripción del ADN correspondiente a la segunda secuencia.

En ciertos ejemplos, el polinucleótido que codifica el TCR u otro polipéptido se incluye en el mismo vector, tal como, por ejemplo, un vector viral o plasmídico, como polinucleótido que codifica el segundo polipéptido. Este segundo polipéptido puede ser, por ejemplo, un polipéptido caspasa, como se discute en el presente documento, o un polipéptido marcador. En estos ejemplos, el constructo puede diseñarse con un promotor operativamente unido a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica los dos polipéptidos, unido por un polipéptido 2A escindible. En este ejemplo, el primer y segundo polipéptidos se separan durante la traducción, lo que da como resultado un TCR y un polipéptido adicional. En otros ejemplos, los dos polipéptidos pueden expresarse por separado del mismo vector, en los que cada ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica uno de los polipéptidos está operativamente unido a un promotor separado. En otros ejemplos más, un promotor puede estar unido operativamente a los dos polinucleótidos, dirigiendo la producción de dos transcritos de ARN separados y, por lo tanto, dos polipéptidos; en un ejemplo, el promotor puede ser bidireccional y las regiones codificantes pueden estar en direcciones opuestas 5'-3'. Por lo tanto, los constructos de expresión discutidos en este documento pueden comprender al menos uno o al menos dos promotores.

En otros ejemplos más, dos polipéptidos, tales como, por ejemplo, el TCR y un polipéptido caspasa pueden expresarse en la célula usando dos vectores separados. Las células se pueden cotransfectar o cotransformar con los vectores, o los vectores se pueden introducir en las células en diferentes momentos.

Los polipéptidos pueden variar en su orden, desde el extremo terminal amino hasta el extremo terminal carboxilo. El orden de los diversos dominios puede ensayarse usando métodos tales como, por ejemplo, los discutidos en este documento, para obtener la expresión y actividad óptimas.

Marcadores seleccionables

En determinadas realizaciones, los constructos de expresión contienen constructos de ácido nucleico cuya expresión se identifica in vitro o in vivo mediante la inclusión de un marcador en el constructo de expresión. Dichos marcadores conferirían un cambio identificable a la célula, lo que permitiría una fácil identificación de las células que contienen el constructo de expresión. Normalmente, la inclusión de un marcador de selección de fármacos ayuda en la clonación y en la selección de transformantes. Por ejemplo, los genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores seleccionables útiles. Alternativamente, se emplean enzimas tales como la timidina quinasa (tk) del virus del herpes simple. También se pueden emplear marcadores inmunológicos de superficie que contienen los dominios extracelulares no señalizadores o varias proteínas (por ejemplo, CD34, CD19, LNGFR), lo que permite un método sencillo para la clasificación mediada por anticuerpos magnéticos o de fluorescencia. No se cree que el marcador seleccionable empleado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Otros ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, por ejemplo, indicadores tales como GFP, EGFP, p-gal o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). En determinadas realizaciones, la proteína marcadora, tal como, por ejemplo, CD19 se usa para la selección de las células para transfusión, tal como, por ejemplo, en la selección inmunomagnética. Como se analiza en el presente documento, un marcador CD19 se distingue de un anticuerpo anti-CD19 o, por ejemplo, un scFv, TCR u otra fracción de reconocimiento de antígeno que se une a CD19.

En determinadas realizaciones, el polipéptido marcador está unido a la molécula de señalización quimérica inducible. Por ejemplo, el polipéptido marcador puede unirse a la molécula de señalización quimérica inducible mediante una secuencia polipeptídica, tal como, por ejemplo, una secuencia de tipo 2A escindible. El polipéptido marcador puede ser, por ejemplo, CD19, ACD19, o puede ser, por ejemplo, una proteína heteróloga, seleccionada para no afectar la actividad de la molécula de señalización quimérica inducible.

Las secuencias de tipo 2A, o secuencias 2A de "salto de enlace peptídico", se derivan de, por ejemplo, muchos virus diferentes, incluidos, por ejemplo, de Thosea asigna. Estas secuencias a veces también se conocen como "secuencias de salto de péptidos". Cuando este tipo de secuencia se coloca dentro de un cistrón, entre dos péptidos que están destinados a separarse, el ribosoma parece omitir un enlace peptídico, en el caso de la secuencia de Thosea asigna; se omite el enlace entre los aminoácidos Gly y Pro en el extremo terminal carboxilo "P-G-P". Cuando se usa esta secuencia, el péptido que está codificado en 5' de la secuencia 2A puede terminar con aminoácidos adicionales en el extremo terminal carboxilo, incluido el residuo Gly y cualquier residuo secuencia arriba en la secuencia 2A. El péptido que está codificado en 3' de la secuencia 2A puede terminar con aminoácidos adicionales en el extremo terminal amino, incluido el residuo Pro y cualquier residuo secuencia abajo que siga a la secuencia 2A.

En algunas realizaciones, se puede incluir un polipéptido en el vector de expresión para ayudar a clasificar las células. Por ejemplo, el epítopo mínimo de CD34 puede incorporarse al vector. En algunas realizaciones, los vectores de expresión usados para expresar los TCR proporcionados en el presente documento comprenden además un polinucleótido que codifica el epítopo mínimo de CD34 de 16 aminoácidos. En algunas realizaciones, tales como ciertas realizaciones proporcionadas en los ejemplos de este documento, el epítopo mínimo de CD34 se incorpora en la posición del extremo terminal amino del tallo de CD8.

Regiones de unión al ligando

Las regiones de unión al ligando pueden incluirse en los polipéptidos quiméricos discutidos en este documento, por ejemplo, como parte de los polipéptidos caspasa inducibles. El dominio de unión al ligando ("dimerización") del constructo de expresión puede ser cualquier dominio conveniente que permita la inducción usando un ligando natural o no natural, por ejemplo, un ligando sintético no natural. La región multimerizante o el dominio de unión al ligando puede ser interno o externo a la membrana celular, dependiendo de la naturaleza del constructo y la elección del ligando. Se conoce una amplia variedad de proteínas de unión al ligando, incluidos receptores, que incluyen proteínas de unión al ligando asociadas con las regiones citoplasmáticas indicadas anteriormente. Como se usa en este documento, el término "dominio de unión al ligando" puede ser intercambiable con el término "receptor". Son de particular interés las proteínas de unión al ligando para las que se conocen ligandos (por ejemplo, ligandos orgánicos pequeños) o se pueden producir fácilmente. Estos dominios o receptores de unión al ligando incluyen los receptores de FKBP y ciclofilina, los receptores de esteroides, el receptor de tetraciclina, los otros receptores indicados anteriormente y similares, así como los receptores "no naturales", que pueden obtenerse a partir de anticuerpos, particularmente la subunidad de cadena pesada o ligera, secuencias mutadas de las mismas, secuencias de aminoácidos aleatorias obtenidas mediante procedimientos estocásticos, síntesis combinatoria y similares. En determinadas realizaciones, la región de unión al ligando se selecciona del grupo que consiste en la región de unión al ligando FKBP, la región de unión al ligando del receptor de ciclofilina, la región de unión al ligando del receptor de esteroides, la región de unión al ligando de los receptores de ciclofilina y la región de unión al ligando del receptor de tetraciclina. A menudo, la región de unión al ligando comprende una secuencia de FvFvls. A veces, la secuencia de FvFvls comprende además una secuencia de Fv' adicional. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, los discutidos en Kopytek, SJ, et al., Chemistry & Biology 7: 313-321 (2000) y en Gestwicki, JE et al., Combinatorial Chem. & High Throughput Screening 10: 667-675 (2007); Clackson T (2006) Chem Biol Drug Des 67: 440-2; Clackson, T., en Chemical Biology: From Small Molecules to Systems Biology and Drug Design (Schreiber, s., et al., Eds., Wiley, 2007)).

En su mayor parte, los dominios de unión al ligando o los dominios del receptor serán al menos aproximadamente 50 aminoácidos y menos de aproximadamente 350 aminoácidos, normalmente menos de 200 aminoácidos, ya sea como dominio natural o como parte activa truncada del mismo. El dominio de unión puede, por ejemplo, ser pequeño (<25 kDa, para permitir una transfección eficaz en vectores virales), monomérico, no inmunogénico, tener ligandos no tóxicos, permeables a las células y accesibles sintéticamente que pueden ser configurados para dimerización.

El dominio del receptor puede ser intracelular o extracelular dependiendo del diseño del constructo de expresión y la disponibilidad de un ligando apropiado. Para los ligandos hidrófobos, el dominio de unión puede estar en cualquier lado de la membrana, pero para los ligandos hidrofílicos, particularmente los ligandos de proteínas, el dominio de unión será normalmente externo a la membrana celular, a menos que exista un sistema de transporte para internalizar el ligando en una forma en la que este disponible para unión. Para un receptor intracelular, el constructo puede codificar un péptido señal y un dominio transmembrana 5' o 3' de la secuencia del dominio receptor o puede tener una secuencia señal de unión a lípidos 5' de la secuencia del dominio receptor. Cuando el dominio del receptor está entre el péptido señal y el dominio transmembrana, el dominio del receptor será extracelular.

La parte del constructo de expresión que codifica el receptor puede someterse a mutagénesis por diversas razones. La proteína mutagenizada puede proporcionar una mayor afinidad de unión, permitir la discriminación por el ligando del receptor natural y el receptor mutagenizado, proporcionar oportunidades para diseñar un par receptor-ligando, o similares. El cambio en el receptor puede implicar cambios en los aminoácidos que se sabe que están en el sitio de unión, mutagénesis aleatoria utilizando técnicas combinatorias, en las que los codones para los aminoácidos asociados con el sitio de unión u otros aminoácidos asociados con cambios conformacionales pueden estar sujetos a mutagénesis cambiando el codón o codones para el aminoácido particular, ya sea con cambios conocidos o al azar, expresando las proteínas resultantes en un huésped procariota apropiado y luego seleccionando las proteínas resultantes para la unión.

Como dominio de unión se pueden usar anticuerpos y subunidades de anticuerpos, por ejemplo, cadena pesada o ligera, particularmente fragmentos, más particularmente toda o parte de la región variable, o fusiones de cadena pesada y ligera para crear unión de alta afinidad. Los anticuerpos que se contemplan incluyen los que son un producto humano expresado ectópicamente, tal como un dominio extracelular que no desencadenaría una respuesta inmune y generalmente no se expresa en la periferia (es decir, fuera del área del SNC/cerebro). Dichos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR) y proteínas de superficie embrionaria (es decir, antígeno carcinoembrionario).

Además, se pueden preparar anticuerpos contra moléculas hapténicas, que son fisiológicamente aceptables, y las subunidades de anticuerpos individuales se pueden cribar para determinar la afinidad de unión. El ADNc que codifica las subunidades puede aislarse y modificarse mediante eliminación de la región constante, porciones de la región variable, mutagénesis de la región variable o similares, para obtener un dominio de proteína de unión que tenga la afinidad apropiada por el ligando. De esta forma, se puede emplear casi cualquier compuesto hapténico fisiológicamente aceptable como ligando o para proporcionar un epítopo para el ligando. En lugar de unidades de anticuerpo, se pueden emplear receptores naturales, cuando se conoce el dominio de unión y hay un ligando útil para la unión.

Oligomerización

La señal transducida normalmente resultará de la oligomerización mediada por ligando de las moléculas de proteína quimérica, es decir, como resultado de la oligomerización después de la unión del ligando, aunque se pueden emplear otros eventos de unión, por ejemplo, activación alostérica, para iniciar una señal. El constructo de la proteína quimérica variará en cuanto al orden de los diversos dominios y al número de repeticiones de un dominio individual.

Para multimerizar el polipéptido Caspasa-9, el ligando para los dominios de unión al ligando/dominios receptores de los polipéptidos quiméricos inducibles de Caspasa-9 será usualmente multimérico en el sentido de que tendrá al menos dos sitios de unión, con cada uno de los puntos de unión capaces de unirse al dominio receptor del ligando. Por "región de unión al ligando multimérico" se entiende una región de unión al ligando que se une a un ligando multimérico. El término "ligandos multiméricos" incluye ligandos diméricos. Un ligando dimérico tendrá dos sitios de unión capaces de unirse al dominio receptor del ligando. Deseablemente, los ligandos en cuestión serán un dímero u oligómero de orden superior, normalmente no mayor que aproximadamente tetramérico, de pequeñas moléculas orgánicas sintéticas, siendo las moléculas individuales típicamente al menos aproximadamente de 150 Da y menos de aproximadamente 5 kDa, usualmente menos de aproximadamente 3 kDa. Puede emplearse una variedad de pares de ligandos y receptores sintéticos. Por ejemplo, en realizaciones que involucran receptores naturales, se puede usar FK506 dimérico con un receptor FKBP12, se puede usar ciclosporina A dimerizada con el receptor de ciclofilina, estrógeno dimerizado con un receptor de estrógeno, glucocorticoides dimerizados con un receptor de glucocorticoide, tetraciclina dimerizada con el receptor de tetraciclina, vitamina D dimerizada con el receptor de vitamina D y similares. Alternativamente, pueden usarse órdenes superiores de ligandos, por ejemplo, triméricos. Para realizaciones que implican receptores no naturales, por ejemplo, subunidades de anticuerpos, pueden usarse subunidades de anticuerpos modificadas, anticuerpos de cadena sencilla compuestos por regiones variables de cadena pesada y ligera en tándem, separados por un dominio enlazador flexible, o receptores modificados y secuencias mutadas de los mismos, y similares, cualquier de una gran variedad de compuestos. Una característica significativa de estas unidades de ligando es que cada sitio de unión puede unirse al receptor con alta afinidad y pueden dimerizarse químicamente. Además, existen métodos para equilibrar la hidrofobicidad/hidrofilicidad de los ligandos de modo que puedan disolverse en suero a niveles funcionales, pero difundirse a través de las membranas plasmáticas para la mayoría de las aplicaciones.

En determinadas realizaciones, los presentes métodos utilizan la técnica de dimerización inducida químicamente (CID) para producir una proteína o polipéptido controlado condicionalmente. Además de que esta técnica es inducible, también es reversible, debido a la degradación del agente dimerizante lábil o la administración de un inhibidor competitivo monomérico.

El sistema CID utiliza ligandos bivalentes sintéticos para entrecruzar rápidamente moléculas de señalización que se fusionan con dominios de unión al ligando. Este sistema se ha utilizado para desencadenar la oligomerización y activación de la superficie celular (Spencer, DM et al., Science, 1993. 262: pág. 1019-1024; Spencer DM et al., Curr Biol 1996, 6: 839-847; Blau, CA et al., Proc Natl Acad. Sci. EE. UU. 1997, 94: 3076-3081), o proteínas citosólicas (Luo, Z. et al., Nature 1996, 383: 181-185; MacCorkle, RA et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 1998, 95: 3655-3660), el reclutamiento de factores de transcripción a elementos de ADN para modular la transcripción (Ho, SN et al., Nature 1996, 382: 822-826.; Rivera, VM et al., Nat. Med. 1996, 2: 1028-1032) o el reclutamiento de moléculas de señalización a la membrana plasmática para estimular la señalización (Spencer DM et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 1995, 92: 9805-9809; Holsinger, LJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 1995, 95: 9810-9814).

El sistema CID se basa en la noción de que la agregación de receptores de superficie activa eficazmente las cascadas de señalización secuencia abajo. En la realización más simple, el sistema CID usa un análogo dimérico del fármaco inmunosupresor permeable a los lípidos, FK506, que pierde su bioactividad normal mientras gana la capacidad de entrecruzar moléculas fusionadas genéticamente a la proteína de unión a FK506, FKBP12. Al fusionar una o más FKBP y una secuencia de miristoilación al dominio de señalización citoplásmico de un receptor diana, se puede estimular la señalización de una manera dependiente del fármaco dimerizador, pero independiente del ligando y del ectodominio. Esto proporciona al sistema control temporal, reversibilidad mediante el uso de análogos de fármacos monoméricos y mayor especificidad. La alta afinidad de los CID AP20187/AP1903 de tercera generación por su dominio de unión, FKBP12, permite la activación específica del receptor recombinante in vivo sin la inducción de efectos secundarios inespecíficos a través de FKBP12 endógeno. Variantes de FKBP12 que tienen sustituciones y eliminaciones de aminoácidos, como FKBP12v36, que se une a un fármaco dimerizador, también pueden usarse. Además, los ligandos sintéticos son resistentes a la degradación de las proteasas, lo que los hace más eficaces para activar receptores in vivo que la mayoría de los agentes proteicos administrados.

Los ligandos usados son capaces de unirse a dos o más de los dominios de unión al ligando. Las proteínas quiméricas pueden unirse a más de un ligando cuando contienen más de un dominio de unión al ligando. El ligando es típicamente una no proteína o una sustancia química. Los ejemplos de ligandos incluyen, pero no se limitan a, FK506 dimérico (por ejemplo, FK1012).

Otras regiones de unión al ligando pueden ser, por ejemplo, regiones diméricas o regiones de unión al ligando modificadas con una sustitución de oscilación, tal como, por ejemplo, FKBP12(V36): La proteína de unión a FK506 humana de 12 kDa con una sustitución de F36 por V, la secuencia codificante madura completa (aminoácidos 1-107), proporciona un sitio de unión para el fármaco dimerizador sintético AP1903 (Jemal, A. et al., CA Cancer J. Clinic. 58, 71-96 (2008); Scher, HI y Kelly, WK, Journal of Clinical Oncology 11, 1566-72 (1993)). También pueden usarse dos copias en tándem de la proteína en el constructo de modo que se induzcan oligómeros de orden superior tras el entrecruzamiento por AP1903.

F36V'-FKBP: F36V'-FKBP es una versión de codón oscilante de F36V-FKBP. Codifica la secuencia polipeptídica idéntica a F36V-FKPB pero tiene solo un 62% de homología a nivel de nucleótidos. F36V'-FKBP fue diseñado para reducir la recombinación en vectores retrovirales (Schellhammer, PF et al., J. Urol. 157, 1731-5 (1997))). Se construyó F36V'-FKBP mediante un procedimiento de ensamblaje por PCR. El transgén contiene una copia de F36V'-FKBp enlazada directamente a una copia de F36V-FKBP.

En algunas realizaciones, el ligando es una molécula pequeña. Puede seleccionarse el ligando apropiado para la región de unión al ligando seleccionada. A menudo, el ligando es dimérico, a veces, el ligando es un FK506 dimérico o un análogo de FK506 dimérico. En determinadas realizaciones, el ligando es AP1903 (Nombre del índice CAS: Ácido 2-piperidincarboxílico, 1-[(2S)-1-oxo-2-(3,4,5-trimetoxifenil)butil]-, 1,2-etanodiilbis[imino(2-oxo-2,1-etanodiil)oxi-3,1-fenilen[(1R)-3-(3,4-dimetoxifenil)propiliden]]éster, [2S-[1(R*), 2R*[S*[S*[1(R*), 2R*]]]]]-(9Cl) Número de registro CAS: 195514-63-7; fórmula molecular: C78H98N4O20, peso molecular: 1411,65). En determinadas realizaciones, el ligando es AP20187. En determinadas realizaciones, el ligando es un análogo de AP20187, tal como, por ejemplo, AP1510. En algunas realizaciones, ciertos análogos serán apropiados para la FKBP12, y ciertos análogos serán apropiados para la versión mutante (V36) de FKBP12. En determinadas realizaciones, se incluye una región de unión al ligando en la proteína quimérica. En otras realizaciones, se incluyen dos o más regiones de unión al ligando. Cuando, por ejemplo, la región de unión al ligando es FKBP12, en la que se incluyen dos de estas regiones, una puede ser, por ejemplo, la versión oscilante.

Otros sistemas de dimerización contemplados incluyen el sistema cumermicina/ADN girasa B. La dimerización inducida por cumermicina activa una proteína Raf modificada y estimula la cascada de MAP quinasa. Véase Farrar et al., 1996.

AP1903 API es fabricado por Alphora Research Inc. y el producto farmacológico para inyección AP1903 es elaborado por AAI Pharma Services Corp. Está formulado como una solución de 5 mg/ml de AP1903 en una solución al 25% del solubilizador no iónico Solutol HS 15 ( 250 mg/ml, BASF). A temperatura ambiente, esta formulación es una solución transparente. Tras la refrigeración, esta formulación sufre una transición de fase reversible en un almacenamiento prolongado, lo que da como resultado una solución lechosa. Esta transición de fase se invierte al recalentar a temperatura ambiente. El llenado es de 8 ml en un vial de vidrio de 10 ml (-40 mg de AP1903 para inyección total por vial).

Para su uso, el AP1903 se calentará a temperatura ambiente y se diluirá antes de la administración. Al determinar la necesidad de administrar AP1903 y activar la Caspasa-9 para inducir la apoptosis de las células T que expresan TCR modificadas genéticamente, se puede administrar a los pacientes, por ejemplo, una única dosis fija de AP1903 para inyección (0.4 mg/kg) por vía de infusión intravenosa durante 2 horas, utilizando un equipo de infusión esterilizado sin óxido de etileno y sin DEHP. La dosis de AP1903 se calcula individualmente para todos los pacientes y no se vuelve a calcular a menos que el peso corporal fluctúe en >10%. La dosis calculada se diluye en 100 ml en solución salina normal al 0.9% antes de la infusión. Todos los medicamentos del estudio se mantienen a una temperatura entre 2 grados C y 8 grados C, se protegen de la luz y el calor excesivos y se almacenan en un área cerrada con acceso restringido.

En un estudio previo de fase I de AP1903, 24 voluntarios sanos fueron tratados con dosis únicas de AP1903 para inyección a niveles de dosis de 0.011, 0.015, 0.1, 0.5 y 1.0 mg/kg infundidos IV durante 2 horas. Los niveles en plasma de AP1903 fueron directamente proporcionales a la dosis, con valores medios de Cmáx. que oscilan entre aproximadamente 10 y 1275 ng/ml en el intervalo de dosis de 0.011 a 1.0 mg/kg. Después del período de infusión inicial, las concentraciones en sangre demostraron una fase de distribución rápida, con niveles en plasma reducidos a aproximadamente el 18, 7 y 1% de la concentración máxima a las 0.5, 2 y 10 horas después de la dosis, respectivamente. Se demostró que AP1903 para inyección es seguro y bien tolerado en todos los niveles de dosis y demostró un perfil farmacocinético favorable. luliucci JD et al., J Clin Pharmacol. 41: 870-9, 2001.

La dosis fija de AP1903 inyectable utilizada, por ejemplo, puede ser de 0.4 mg/kg infundidos por vía intravenosa durante 2 horas. La cantidad de AP1903 necesaria in vitro para la señalización eficaz de las células es de aproximadamente 10-100 nM (PM: 1412 Da). Esto equivale a 14 -140 pg/l o 0.0114 - 0.14 mg/kg (1.4 -140 pg/kg). La dosificación puede variar según la aplicación y, en ciertos ejemplos, puede estar más en el intervalo de 0.1 a 10 nM, o en el intervalo de 50 a 150 nM, 10 a 200 nM, 75 a 125 nM, 100 a 500 nM, 100-600 nM, 100-700 nM, 100-800 nM o 100-900 nM. En el estudio de fase I de AP1903 descrito anteriormente se toleraron bien dosis de hasta 1 mg/kg.

Direccionamiento a la membrana

Una secuencia dirigida a la membrana proporciona el transporte de la proteína quimérica a la membrana de la superficie celular, en la que la misma u otras secuencias pueden codificar la unión de la proteína quimérica a la membrana de la superficie celular. Las moléculas en asociación con membranas celulares contienen ciertas regiones que facilitan la asociación de membranas, y tales regiones pueden incorporarse en una molécula de proteína quimérica para generar moléculas dirigidas a la membrana. Por ejemplo, algunas proteínas contienen secuencias en el extremo terminal N o terminal C que están aciladas, y estas fracciones acilo facilitan la asociación con la membrana. Tales secuencias son reconocidas por aciltransferasas y a menudo se ajustan a un motivo de secuencia particular. Ciertos motivos de acilación pueden modificarse con una sola fracción acilo (a menudo seguido de varios residuos cargados positivamente (por ejemplo, c-Src humano: M-G-S-N-K-S-K-P-K-D-A-S-Q-R-R-R) para mejorar la asociación con grupos de cabeza lipídica) y otros son capaces de modificarse con múltiples fracciones acilo. Por ejemplo, la secuencia del extremo terminal N de la proteína tirosina quinasa Src puede comprender una única fracción miristoílo. Las regiones de acilación dual están ubicadas dentro de las regiones del extremo terminal N de ciertas proteína quinasas, tales como un subconjunto de miembros de la familia de Src (por ejemplo, Yes, Fyn, Lck) y subunidades alfa de proteína G. Tales regiones de acilación dual a menudo se encuentran dentro de los primeros dieciocho aminoácidos de tales proteínas, y se ajustan al motivo de secuencia Met-Gly-Cys-Xaa-Cys, en la que Met se escinde, Gly se acila en N y uno de los residuos Cys se acila en S. Gly a menudo está miristoilado y Cys puede palmitoilarse. Regiones de acilación que se ajustan al motivo de secuencia Cys-Ala-Ala-Xaa (las llamadas "cajas CAAX"), que pueden modificarse con fracciones isoprenilo C15 o C10, desde el extremo terminal C de las subunidades gamma de la proteína G y también pueden utilizarse otras proteínas (por ejemplo, www.ebi.ac.uk/interpro/DisplaylproEntry?ac=IPR001230). Estos y otros motivos de acilación incluyen, por ejemplo, los discutidos en Gauthier-Campbell et al., Molecular Biology of the Cell 15: 2205-2217 (2004) Glabati et al., Biochem. J. 303: 697-700 (1994) y Zlakine et al., J. Cell Science 110: 673-679 (1997), y puede incorporarse en moléculas quiméricas para inducir la localización de la membrana. En determinadas realizaciones, una secuencia nativa de una proteína que contiene un motivo de acilación se incorpora a una proteína quimérica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una porción del extremo terminal N de Lck, Fyn o Yes o una subunidad alfa de proteína G, como los primeros veinticinco aminoácidos del extremo terminal N o menos de tales proteínas (por ejemplo, aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, aproximadamente 10 a aproximadamente 19 aminoácidos, o aproximadamente 15 a aproximadamente 19 aminoácidos de la secuencia nativa con mutaciones opcionales) puede incorporarse dentro del extremo terminal N de una proteína quimérica. En ciertas realizaciones, una secuencia del extremo terminal C de aproximadamente 25 aminoácidos o menos de una subunidad gamma de proteína G que contiene una secuencia del motivo de caja CAAX (por ejemplo, aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, aproximadamente 10 a aproximadamente 18 aminoácidos, o aproximadamente 15 a aproximadamente 18 aminoácidos de la secuencia nativa con mutaciones opcionales) se puede unir al extremo terminal C de una proteína quimérica.

En algunas realizaciones, una fracción acilo tiene un valor de log p de 1 a 6, y algunas veces tiene un valor de log p de 3 a 4,5. Los valores de log p son una medida de hidrofobicidad y, a menudo, se derivan de estudios de reparto entre octanol/agua, en los que las moléculas con mayor hidrofobicidad se reparten en octanol con mayor frecuencia y se caracterizan por tener un valor de log p más alto. Los valores de log p se publican para varias moléculas lipofílicas y los valores de log p se pueden calcular utilizando procesos de repartición conocidos (por ejemplo, Chemical Reviews, vol. 71, número 6, página 599, en la que la entrada 4493 muestra el ácido láurico con un valor de log p de 4,2). Cualquier fracción acilo puede unirse a una composición de péptidos discutida anteriormente y ensayarse para determinar la actividad antimicrobiana usando métodos conocidos y los discutidos a continuación. La fracción acilo a veces es un alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20, alquinilo C2-C20, cicloalquilo C3-C6, haloalquilo C1-C4, cicloalquilalquilo C4-C12, arilo, arilo sustituido o aril-alquilo (C1-C4), por ejemplo. Cualquier fracción que contenga acilo a veces es un ácido graso, y ejemplos de fracciones de ácido graso son propilo (C3), butilo (C4), pentilo (C5), hexilo (C6), heptilo (C7), octilo (C8), nonilo (C9), decilo (C10), undecilo (C11), laurilo (C12), miristilo (C14), palmitilo (C16), estearilo (C18), araquidilo (C20), behenilo (C22) y lignocerilo (C24), y cada fracción puede contener 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 insaturaciones (es decir, dobles enlaces). Una fracción acilo a veces es una molécula lipídica, como un lípido fosfatidilo (por ejemplo, fosfatidil serina, fosfatidil inositol, fosfatidil etanolamina, fosfatidil colina), esfingolípido (por ejemplo, esfingomielina, esfingosina, ceramida, gangliósido, cerebrósido). En determinadas formas de realización, una, dos, tres, cuatro o cinco o más fracciones acilo están unidas a una región de asociación de membrana. Puede emplearse cualquier secuencia dirigida a la membrana que sea funcional en el huésped y pueda, o no, estar asociada con uno de los otros dominios de la proteína quimérica. En algunas realizaciones, tales secuencias incluyen, pero no se limitan a, secuencia dirigida a miristoilación, secuencia dirigida a palmitoilación, secuencias de prenilación (es decir, farnesilación, geranil-geranilación, caja CAAX), motivos de interacción proteína-proteína o secuencias transmembrana (que utilizan péptidos señal) de los receptores. Los ejemplos incluyen los discutidos en, por ejemplo, ten Klooster JP et al, Biology of the Cell (2007) 99, 1-12, Vincent, S., et al., Nature Biotechnology 21: 936-40, 1098 (2003).

Existen dominios proteicos adicionales que pueden aumentar la retención de proteínas en varias membranas. Por ejemplo, un dominio de homología de pleckstrina (PH) de ~ 120 aminoácidos se encuentran en más de 200 proteínas humanas que típicamente están involucradas en la señalización intracelular. Los dominios de PH pueden unirse a varios lípidos de fosfatidilinositol (PI) dentro de las membranas (por ejemplo, PI (3, 4,5)-P3, PI (3,4)-P2, PI (4,5)-P2) y, por lo tanto, desempeñan un papel clave en reclutar proteínas a diferentes compartimentos celulares o de membrana. A menudo, el estado de fosforilación de los lípidos PI está regulado, tal como por la quinasa PI-3 o PTEN, y por lo tanto, la interacción de las membranas con los dominios de PH no es tan estable como por los lípidos acilo.

Regiones de control

1. Promotores

No se cree que el promotor particular empleado para controlar la expresión de una secuencia de polinucleótidos de interés sea importante, siempre que sea capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula diana. Por lo tanto, cuando se dirige a una célula humana, la región codificante de la secuencia de polinucleótidos puede, por ejemplo, colocarse adyacente y bajo el control de un promotor que es capaz de expresarse en una célula humana. En términos generales, dicho promotor podría incluir un promotor humano o viral.

En diversas realizaciones, el promotor del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV), el promotor temprano de SV40, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, la p-actina, el promotor de insulina de rata y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa pueden usarse para obtener niveles altos de expresión de la secuencia codificante de interés. También se contempla el uso de otros promotores de fagos bacterianos o celulares virales o de mamíferos que son bien conocidos en la técnica para lograr la expresión de una secuencia codificante de interés, siempre que los niveles de expresión sean suficientes para un propósito dado. Empleando un promotor con propiedades bien conocidas, se puede optimizar el nivel y patrón de expresión de la proteína de interés después de la transfección o transformación.

La selección de un promotor regulado en respuesta a señales fisiológicas o sintéticas específicas puede permitir la expresión inducible del producto génico. Por ejemplo, en el caso en el que la expresión de un transgén, o transgenes cuando se utiliza un vector multicistrónico, sea tóxica para las células en las que se produce el vector, es deseable prohibir o reducir la expresión de uno o más de los transgenes. Ejemplos de transgenes que son tóxicos para la línea celular productora son genes proapoptóticos y de citocinas. Se encuentran disponibles varios sistemas de promotores inducibles para la producción de vectores virales en los que los productos transgénicos son tóxicos (agregar más promotores inducibles).

El sistema de ecdisona (Invitrogen, Carlsbad, CA) es uno de esos sistemas. Este sistema está diseñado para permitir la expresión regulada de un gen de interés en células de mamíferos. Consiste en un mecanismo de expresión estrictamente regulado que prácticamente no permite la expresión a nivel basal del transgén, pero tiene una inducibilidad superior a 200 veces. El sistema se basa en el receptor heterodimérico de ecdisona de Drosophila, y cuando la ecdisona o un análogo tal como muristerona A se une al receptor, el receptor activa un promotor para activar la expresión del transgén secuencia abajo, se alcanzan niveles elevados de transcritos de ARNm. En este sistema, ambos monómeros del receptor heterodimérico se expresan constitutivamente a partir de un vector, mientras que el promotor que responde a ecdisona, que dirige la expresión del gen de interés, se encuentra en otro plásmido. Por lo tanto, sería útil la modificación de este tipo de sistema en el vector de transferencia de genes de interés. La cotransfección de plásmidos que contienen el gen de interés y los monómeros del receptor en la línea celular productora permitiría entonces la producción del vector de transferencia génica sin expresión de un transgén potencialmente tóxico. En el momento apropiado, la expresión del transgén podría activarse con ecdisona o muristerona A.

Otro sistema inducible que puede resultar útil es el Tet-OffMR o Tet-OnMR (Clontech, Palo Alto, CA) desarrollado originalmente por Gossen y Bujard (Gossen y Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 89: 5547-5551, 1992; Gossen et al., Science, 268: 1766-1769, 1995). Este sistema también permite regular altos niveles de expresión génica en respuesta a tetraciclina o derivados de tetraciclina como la doxiciclina. En el sistema Tet-OnMR, la expresión génica se activa en presencia de doxiciclina, mientras que en el sistema Tet-OffMR, la expresión génica se activa en ausencia de doxiciclina. Estos sistemas se basan en dos elementos reguladores derivados del operón de resistencia a la tetraciclina de E. coli. La secuencia del operador de tetraciclina a la que se une el represor de tetraciclina y la proteína represora de tetraciclina. El gen de interés se clona en un plásmido detrás de un promotor que tiene elementos que responden a la tetraciclina. Un segundo plásmido contiene un elemento regulador llamado transactivador controlado por tetraciclina, que está compuesto, en el sistema Tet-OffMR, del dominio VP16 del virus del herpes simple y el represor de tetraciclina de tipo silvestre. Por lo tanto, en ausencia de doxiciclina, la transcripción está activada constitutivamente. En el sistema Tet-OnMR, el represor de tetraciclina no es de tipo silvestre y en presencia de doxiciclina activa la transcripción. Para la producción de vectores de terapia génica, el sistema Tet-OffMR se puede usar para que las células productoras puedan cultivarse en presencia de tetraciclina o doxiciclina y evitar la expresión de un transgén potencialmente tóxico, pero cuando el vector se introduce en el paciente, la expresión génica estaría activa de forma constitutiva.

En algunas circunstancias, es deseable regular la expresión de un transgén en un vector de terapia génica. Por ejemplo, se utilizan diferentes promotores virales con diferentes fuerzas de actividad dependiendo del nivel de expresión deseado. En células de mamíferos, el promotor temprano inmediato del CMV se usa a menudo para proporcionar una fuerte activación transcripcional. El promotor del CMV se revisa en Donnelly, JJ et al., 1997. Annu. Rev. Immunol. 15: 617-48. También se han usado versiones modificadas del promotor del CMV que son menos potentes cuando se desean niveles reducidos de expresión del transgén. Cuando se desea la expresión de un transgén en células hematopoyéticas, a menudo se utilizan promotores retrovirales tales como los LTR del MLV o MMTV. Otros promotores virales que se utilizan dependiendo del efecto deseado incluyen SV40, RSV LTR, HIV-1 y HIV-2 LTR, promotores de adenovirus como los de la región E1A, E2A o MLP, AAV LTR, HSV-TK y virus del sarcoma aviar.

De manera similar, se usan promotores específicos de tejido para efectuar la transcripción en tejidos o células específicos para reducir la toxicidad potencial o los efectos indeseables en tejidos no diana. Estos promotores pueden dar como resultado una expresión reducida en comparación con un promotor más fuerte como el promotor del CMV, pero también pueden dar como resultado una expresión e inmunogenicidad más limitadas (Bojak, A., et al.,2002. Vacuna. 20: 1975-79; Cazeaux, N., et al., 2002. Vaccine 20: 3322-31). Por ejemplo, los promotores específicos de tejido tales como el promotor asociado a PSA o la calicreína glandular específica de la próstata, o el gen de la creatina quinasa muscular pueden usarse cuando sea apropiado.

Los ejemplos de promotores específicos de diferenciación o específicos de tejido incluyen, entre otros, los siguientes: B29/CD79b (células B); CD14 (células monocíticas); CD43 (leucocitos y plaquetas); c D45 (células hematopoyéticas); CD68 (macrófagos); desmina (músculo); elastasa-1 (células acinares pancreáticas); endoglina (células endoteliales); fibronectina (células diferenciadoras, tejidos curativos); y Flt-1 (células endoteliales); GFAP (astrocitos).

En determinadas indicaciones, es deseable activar la transcripción en momentos específicos después de la administración del vector de terapia génica. Esto se hace con promotores como los que son regulables por hormonas o citocinas. Los promotores sensibles a citocinas y proteínas inflamatorias que se pueden usar incluyen el cininógeno K y T (Kageyama et al., (1987) J. Biol. Chem., 262,2345-2351), c-fos, TNF-a, proteína C reactiva (Arcone et al., (1988) Nucl. Acids Res., 16 (8), 3195-3207), haptoglobina (Oliviero et al., (1987) EMBO J., 6, 1905-1912), suero amiloide A2, C/EBP a, IL-1, IL-6 (Poli y Cortese, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU., 86,8202-8206), Complemento C3 (Wilson et al., (1990) Mol. Celda. Biol., 6181-6191), IL-8, glucoproteína ácida a-1 (Prowse y Baumann, (1988) Mol Cell Biol, 8, 42-51), a-1 antitripsina, lipoproteína lipasa (Zechner et al., Mol. Cell Biol., 2394-2401, 1988), angiotensinógeno (Ron et al., (1991) Mol. Cell Biol., 2887-2895), fibrinógeno, c-jun (inducible por ésteres de forbol, TNF-a, radiación UV, ácido retinoico y peróxido de hidrógeno), colagenasa (inducida por ésteres de forbol y ácido retinoico), metalotioneína (inducible por metales pesados y glucocorticoides), estromelisina (inducible por éster de forbol, interleucina-1 y EGF), a-2 macroglobulina y a-1 anti-quimotripsina. Otros promotores incluyen, por ejemplo, SV40, MMTV, virus de inmunodeficiencia humana (MV), virus de Moloney, ALV, virus de Epstein Barr, virus del sarcoma de Rous, actina humana, miosina, hemoglobina y creatina.

Se prevé que cualquiera de los promotores anteriores solo o en combinación con otro puede ser útil dependiendo de la acción deseada. Los promotores y otros elementos reguladores se seleccionan de manera que sean funcionales en las células o tejidos deseados. Además, esta lista de promotores no debe interpretarse como exhaustiva o limitante; otros promotores que se usan junto con los promotores y métodos descritos en este documento.

2. Potenciadores

Los potenciadores son elementos genéticos que aumentan la transcripción de un promotor ubicado en una posición distante en la misma molécula de ADN. Los primeros ejemplos incluyen los potenciadores asociados con inmunoglobulina y receptores de células T que flanquean la secuencia codificante y se encuentran dentro de varios intrones. Muchos promotores virales, tales como CMV, SV40 y LTR retrovirales, están estrechamente asociados con la actividad potenciadora y, a menudo, se tratan como elementos únicos. Los potenciadores se organizan de forma muy similar a los promotores. Es decir, están compuestos por muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se une a una o más proteínas transcripcionales. La distinción básica entre potenciadores y promotores es operativa. Una región potenciadora en su conjunto estimula la transcripción a distancia y, a menudo, independientemente de la orientación; esto no tiene por qué ser cierto para una región promotora o sus elementos componentes. Por otro lado, un promotor tiene uno o más elementos que dirigen el inicio de la síntesis de ARN en un sitio particular y en una orientación particular, mientras que los potenciadores carecen de estas especificidades. Los promotores y potenciadores a menudo se superponen y son contiguos, y a menudo parecen tener una organización modular muy similar. Un subconjunto de potenciadores incluye regiones de control de locus (LCR) que no solo pueden aumentar la actividad transcripcional, sino que (junto con los elementos aislantes) también pueden ayudar a aislar el elemento transcripcional de las secuencias adyacentes cuando se integran en el genoma.

Puede usarse cualquier combinación de promotor/potenciador (de acuerdo con la base de datos de promotores eucariotas EPDB) para impulsar la expresión del gen, aunque muchos restringirán la expresión a un tipo de tejido particular o subconjunto de tejidos (revisado en, por ejemplo, Kutzler, MA y Weiner, Db , 2008. Nature Reviews Genetics 9: 776-88). Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, potenciadores de la actina humana, miosina, hemoglobina, creatina quinasa muscular, secuencias y de virus CMV, RSV y EBV. Pueden seleccionarse potenciadores apropiados para aplicaciones particulares. Las células eucariotas pueden soportar la transcripción citoplásmica de ciertos promotores bacterianos si se proporciona la polimerasa bacteriana apropiada, ya sea como parte del complejo de administración o como un constructo de expresión genética adicional.

3. Señales de poliadenilación

Cuando se emplea un inserto de ADNc, normalmente se deseará incluir una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación adecuada del transcrito del gen. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica satisfactoria de los presentes métodos, y se emplea cualquier secuencia tal como la hormona del crecimiento humana o bovina y las señales de poliadenilación de SV40 y las señales de poliadenilación de LTR. Un ejemplo no limitante es la señal de poliadenilación de SV40 presente en el plásmido pCEP3 (Invitrogen, Carlsbad, California). También se contempla como un elemento del casete de expresión un terminador. Estos elementos pueden servir para mejorar los niveles de mensajes y minimizar la lectura del casete en otras secuencias. Las secuencias señal de terminación o poli(A) pueden estar, por ejemplo, situadas a aproximadamente 11-30 nucleótidos secuencia abajo de una secuencia conservada (AAUAAA) en el extremo 3' del ARNm (Montgomery, DL et al., 1993. DNA Cell Biol. 12: 777-83; Kutzler, MAy Weiner, DB, 2008. Nature Rev. Gen. 9: 776-88).

4. Señales de iniciación y sitios de unión de ribosomas internos

También puede ser necesaria una señal de iniciación específica para una traducción eficaz de las secuencias codificantes. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales exógenas de control de la traducción, incluido el codón de iniciación ATG. El codón de iniciación se coloca en marco con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción de todo el inserto. Las señales exógenas de control de la traducción y los codones de iniciación pueden ser naturales o sintéticos. La eficacia de la expresión puede mejorarse mediante la inclusión de elementos potenciadores apropiados de la transcripción.

En ciertas realizaciones, el uso de elementos de sitios de entrada de ribosomas internos (IRES) se usa para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos de IRES pueden eludir el modelo de exploración de ribosomas de la traducción dependiente del casquete metilado en 5' y comenzar la traducción en los sitios internos (Pelletier y Sonenberg, Nature, 334: 320-325, 1988). Se han discutido elementos de IRES de dos miembros de la familia de los picornavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988), así como un IRES de un mensaje de mamífero (Macejak y Sarnow, Nature, 353: 90-94, 1991). Los elementos de IRES se pueden vincular a marcos de lectura abiertos heterólogos. Se pueden transcribir juntos múltiples marcos de lectura abiertos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento de IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a los ribosomas para una traducción eficiente. Se pueden expresar de manera eficiente múltiples genes usando un solo promotor/potenciador para transcribir un solo mensaje (véanse las patentes de Estados Unidos Nos. 5.925.565 y 5.935.819).

Optimización de secuencia

La producción de proteínas también se puede incrementar optimizando los codones en el transgén. Se pueden usar cambios de codones específicos de la especie para aumentar la producción de proteínas. Además, los codones se pueden optimizar para producir un ARN optimizado, lo que puede resultar en una traducción más eficiente. Al optimizar los codones que se incorporarán en el ARN, se pueden eliminar elementos tales como los que dan como resultado una estructura secundaria que causa inestabilidad, estructuras secundarias de ARNm que pueden, por ejemplo, inhibir la unión ribosómica, o secuencias crípticas que pueden inhibir la exportación nuclear de ARNm (Kutzler, MA y Weiner, DB, 2008. Nature Rev. Gen. 9: 776-88; Yan, J. et al., 2007. Mol. Ther. 15: 411-21; Cheung, YK, et al., 2004. Vaccine 23: 629-38; Narum, DL et al., 2001 69: 7250-55; Yadava, A. y Ockenhouse, CF, 2003. Infect. Immun. 71: 4962-69; Smith, JM et al., 2004. AIDS Res. Hum. Retroviruses 20: 1335-47; Zhou, W. et al., 2002. Vet. Microbiol. 88: 127-51; Wu, X., et al., 2004. Biochem. Biophys. Res. Commun. 313: 89-96; Zhang, W., et al., 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 349: 69-78; Deml, LA, et al., 2001. J. Virol. 75: 1099-11001; Schneider, RM et al., 1997. J. Virol. 71: 4892­ 4903; Wang, SD, et al., 2006. Vaccine 24: 4531-40; zur Megede, J. et al., 2000. J. Virol. 74: 2628-2635).

Secuencias guía

Se pueden agregar secuencias guía para mejorar la estabilidad del ARNm y dar como resultado una traducción más eficiente. La secuencia guía suele participar en el direccionamiento del ARNm hacia el retículo endoplásmico. Los ejemplos incluyen la secuencia señal para la glicoproteína de la envoltura del VIH-1 (Env), que retrasa su propia escisión, y la secuencia guía del gen de IgE (Kutzler, MA y Weiner, DB, 2008. Nature Rev. Gen. 9:776-88; Li, V., et al., 2000. Virology 272: 417-28; Xu, ZL et al. 2001. Gene 272: 149-56; Malin, AS et al., 2000. Microbes Infect. 2: 1677­ 85; Kutzler, MA et al., 2005. J. Immunol. 175: 112-125; Yang, JS, et al., 2002. Emerg. Infect. Dis. 8: 1379-84; Kumar, S., et al., 2006. DNA Cell Biol. 25: 383-92; Wang, S., et al, 2006. Vaccine 24: 4531-40). La guía de IgE se puede utilizar para mejorar la inserción en el retículo endoplásmico (Tepler, I et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 5912).

La expresión de los transgenes se puede optimizar y/o controlar mediante la selección de métodos apropiados para optimizar la expresión. Estos métodos incluyen, por ejemplo, la optimización de promotores, métodos de suministro y secuencias de genes (por ejemplo, como se presenta en Laddy, DJ et al., 2008. PLoS.ONE 3 e2517; Kutzler, MA y Weiner, DB, 2008. Nature Rev. Gen. 9: 776-88).

Ácidos nucleicos

Un "ácido nucleico" como se usa en este documento generalmente se refiere a una molécula (una, dos o más cadenas) de ADN, ARN o un derivado o análogo del mismo, que comprende una nucleobase. Una nucleobase incluye, por ejemplo, una base de purina o pirimidina de origen natural que se encuentra en el ADN (por ejemplo, una adenina "A", una guanina "G", una timina "T" o una citosina "C") o ARN (por ejemplo, una A, una G, un uracilo "U" o una C). El término "ácido nucleico" abarca los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido", cada uno como un subgénero del término "ácido nucleico". Los ácidos nucleicos pueden ser, al menos, como máximo, o ser aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000 nucleótidos, o cualquier intervalo que se derive de ellos, en longitud.

Los ácidos nucleicos proporcionados en este documento pueden tener regiones de identidad o complementariedad con otro ácido nucleico. Se contempla que la región de complementariedad o identidad puede ser al menos de 5 residuos contiguos, aunque se contempla específicamente que la región es, al menos, como máximo, o es aproximadamente de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000 nucleótidos contiguos.

Como se usa en este documento, "hibridación", "hibrida" o "capaz de hibridar" se entiende que significa formar una molécula de doble o triple cadena o una molécula con naturaleza de doble o triple cadena parcial. El término "acoplar", como se usa en el presente documento, es sinónimo de "hibridar". El término "hibridación", "hibridar" o "capaz de hibridar" abarca los términos "condición o condiciones rigurosas" o "alta rigurosidad" y los términos "baja rigurosidad" o "condición o condiciones de baja rigurosidad".

Como se usa en el presente documento, "condición o condiciones rigurosas" o "alta rigurosidad" son aquellas condiciones que permiten la hibridación entre o dentro de una o más cadena o cadenas de ácido nucleico que contienen secuencias complementarias, pero excluyen la hibridación de secuencias aleatorias. Las condiciones rigurosas toleran poco o ningún desajuste entre un ácido nucleico y una cadena diana. Estas condiciones son conocidas y se utilizan a menudo para aplicaciones que requieren una alta selectividad. Las aplicaciones no limitantes incluyen aislar un ácido nucleico, tal como un gen o un segmento de ácido nucleico del mismo, o detectar al menos un transcrito de ARNm específico o un segmento de ácido nucleico del mismo, y similares.

Las condiciones rigurosas pueden comprender condiciones de baja salinidad y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por aproximadamente 0.012 M a aproximadamente 0.5 M de NaCl a temperaturas de aproximadamente 42 grados C a aproximadamente 70 grados C. Se entiende que la temperatura y la fuerza iónica de una rigurosidad deseada se determinan en parte por la longitud del ácido o ácidos nucleicos particulares, la longitud y el contenido de nucleobases de la secuencia o secuencias diana, la composición de carga del ácido o ácidos nucleicos y la presencia o concentración de formamida, cloruro de tetrametilamonio y otro u otros disolventes en una mezcla de hibridación.

Se entiende que estos intervalos, composiciones y condiciones para la hibridación se mencionan únicamente a modo de ejemplos no limitantes, y que la rigurosidad deseada para una reacción de hibridación particular a menudo se determina empíricamente en comparación con uno o más controles positivos o negativos. Dependiendo de la aplicación prevista, se pueden emplear diversas condiciones de hibridación para lograr grados variables de selectividad de un ácido nucleico hacia una secuencia diana. En un ejemplo no limitante, la identificación o aislamiento de un ácido nucleico diana relacionado que no hibrida con un ácido nucleico en condiciones rigurosas puede lograrse mediante hibridación a baja temperatura y/o alta fuerza iónica. Tales condiciones se denominan "rigurosidad baja" o "condiciones de rigurosidad baja", y los ejemplos no limitantes de rigurosidad baja incluyen la hibridación realizada de aproximadamente 0.15 M a aproximadamente 0.9 M de NaCl en un intervalo de temperatura de aproximadamente 20 grados C a aproximadamente 50 grados C. Las condiciones de rigurosidad baja o alta pueden modificarse aún más para adaptarse a una aplicación particular.

Las "variantes de función conservadora" son proteínas o enzimas en las que se ha cambiado un residuo de aminoácido dado sin alterar la conformación y función generales de la proteína o enzima, que incluyen, entre otros, el reemplazo de un aminoácido por uno que tiene propiedades similares, incluyendo carácter polar o no polar, tamaño, forma y carga. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos para muchos de los aminoácidos no codificados genéticamente conocidos comúnmente son bien conocidas en la técnica. Las sustituciones conservadoras de otros aminoácidos no codificados se pueden determinar con base en sus propiedades físicas en comparación con las propiedades de los aminoácidos codificados genéticamente.

Modificación de ácidos nucleicos

Cualquiera de las modificaciones discutidas a continuación se puede aplicar a un ácido nucleico. Los ejemplos de modificaciones incluyen alteraciones de la cadena principal de a Rn o ADN, azúcar o base, y varias combinaciones de los mismos. Se puede modificar cualquier número adecuado de enlaces de cadena principal, azúcares y/o bases en un ácido nucleico (por ejemplo, independientemente aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, hasta 100%). Un nucleósido no modificado es cualquiera de las bases adenina, citosina, guanina, timina o uracilo unidas al carbono 1' de la p-D-ribofuranosa.

Una base modificada es una base de nucleótidos distinta de adenina, guanina, citosina y uracilo en la posición 1'. Los ejemplos no limitantes de bases modificadas incluyen inosina, purina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2,4,6-trimetoxibenceno, 3-metil uracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidinas (por ejemplo, 5-metilcitidina), 5-alquiluridinas (por ejemplo, ribotimidina), 5-halouridina (por ejemplo, 5-bromouridina) o 6-azapirimidinas o 6-alquilpirimidinas (por ejemplo, 6-metiluridina), propino y similares. Otros ejemplos no limitantes de bases modificadas incluyen nitropirrolilo (por ejemplo, 3-nitropirrolilo), nitroindolilo (por ejemplo, 4-, 5-, 6-nitroindolilo), hipoxantinilo, isoinosinilo, 2-aza-inosinilo, 7-deaza-inosinilo, nitroimidazolilo, nitropirazolilo, nitrobencimidazolilo, nitroindazolilo, aminoindolilo, pirrolopirimidinilo, difluorotolilo, 4-fluoro-6-metilbencimidazol, 4-metilbencimidazol, 3-metil isocarboestirililo, 5-metil isocarboestirililo, 3-metil-7-propinil isocarboestirililo, 7-azaindolilo, 6-metil-7-azaindolilo, imidizopiridinilo, 9-metil-imidizopiridinilo, pirrolopirizinilo, isocarboestirililo, 7-propinil isocarboestirililo, propinil-7-azaindolilo, 2,4,5-trimetilfenilo, 4-metilindolilo, 4,6-dimetilindolilo, fenilo, naftalenilo, antracenilo, fenantracenilo, pirenilo, estilbenilo, tetracenilo, pentacenilo y similares.

En algunas realizaciones, por ejemplo, un ácido nucleico puede comprender moléculas de ácido nucleico modificadas, con modificaciones en la cadena principal de fosfato. Los ejemplos no limitantes de modificaciones de la cadena principal incluyen modificaciones de fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosfotriéster, morfolino, carbamato amidato, carboximetilo, acetamidato, poliamida, sulfonato, sulfonamida, sulfamato, formacetal, tioformacetal y/o modificaciones de alquilsililo. En ciertos casos, una fracción de azúcar ribosa que se encuentra naturalmente en un nucleósido se reemplaza con un azúcar hexosa, un anillo heteroalquilo policíclico o un grupo ciclohexenilo. En ciertos casos, el azúcar hexosa es una alosa, altrosa, glucosa, mañosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa o un derivado de las mismas. La hexosa puede ser una D-hexosa, glucosa o mañosa. En ciertos casos, el grupo heteroalquilo policíclico puede ser un anillo bicíclico que contiene un átomo de oxígeno en el anillo. En ciertos casos, el grupo heteroalquilo policíclico es un biciclo[2.2.1]heptano, un biciclo[3.2.1]octano o un biciclo[3.3.1]nonano.

Las nucleobases de nitropirrolilo y nitroindolilo son miembros de una clase de compuestos conocidos como bases universales. Las bases universales son aquellos compuestos que pueden reemplazar cualquiera de las cuatro bases naturales sin afectar sustancialmente el comportamiento o actividad de fusión del dúplex de oligonucleótidos. En contraste con las interacciones estabilizadoras de enlace de hidrógeno asociadas con nucleobases de origen natural, los dúplex de oligonucleótidos que contienen nucleobases de 3-nitropirrolilo pueden estabilizarse únicamente mediante interacciones de apilamiento. La ausencia de interacciones significativas de enlaces de hidrógeno con nucleobases de nitropirrolilo obvia la especificidad por una base complementaria específica. Además, el 4, 5 y 6-nitroindolilo muestran muy poca especificidad por las cuatro bases naturales. Los procedimientos para la preparación de 1-(2'-O-metil-p-D-ribofuranosil)-5-nitroindol se discuten en Gaubert, G .; Wengel, J. Tetrahedron Letters 2004, 45, 5629. Otras bases universales incluyen hipoxantinilo, isoinosinilo, 2-aza-inosinilo, 7-deaza-inosinilo, nitroimidazolilo, nitropirazolilo, nitrobencimidazolilo, nitroindazolilo, aminoindolilo, pirrolopirimidinilo y derivados estructurales de los mismos.

El difluorotolilo es una nucleobase no natural que funciona como base universal. El difluorotolilo es un isóstero de la nucleobase natural timina. Pero a diferencia de la timina, el difluorotolilo no muestra una selectividad apreciable por ninguna de las bases naturales. Otros compuestos aromáticos que funcionan como bases universales son 4-fluoro-6-metilbencimidazol y 4-metilbencimidazol. Además, los derivados de isocarboestirililo relativamente hidrófobos 3-metil isocarboestirililo, 5-metil isocarboestirililo y 3-metil-7-propinil isocarboestirililo son bases universales que causan solo una ligera desestabilización de los dúplex de oligonucleótidos en comparación con la secuencia de oligonucleótidos que contiene solo bases naturales. Otras nucleobases no naturales incluyen 7-azaindolilo, 6-metil-7-azaindolilo, imidizopiridinilo, 9-metil-imidizopiridinilo, pirrolopirizinilo, isocarboestirililo, 7-propinil isocarboestirililo, propinil-7-azaindolilo, 2,4,5-trimetilfenilo 4-metilindolilo, 4,6-dimetilindolilo, fenilo, naftalenilo, antracenilo, fenantracenilo, pirenilo, estilbenilo, tetracenilo, pentacenilo y derivados estructurales de los mismos. Para una discusión más detallada, incluidos los procedimientos sintéticos, de difluorotolilo, 4-fluoro-6-metilbencimidazol, 4-metilbencimidazol y otras bases no naturales mencionadas anteriormente, véase: Schweitzer et al., J. Org. Chem. 59: 7238 - 7242 (1994).

Además, se pueden usar sustituyentes químicos, por ejemplo, agentes de entrecruzamiento, para añadir estabilidad o irreversibilidad adicional a la reacción. Los ejemplos no limitantes de agentes de entrecruzamiento incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Un análogo de nucleótido también puede incluir un ácido nucleico "bloqueado". Ciertas composiciones pueden usarse para "anclar" o "bloquear" esencialmente un ácido nucleico endógeno en una estructura particular. Las secuencias de anclaje sirven para prevenir la disociación de un complejo de ácido nucleico y, por lo tanto, no solo pueden evitar la copia, sino que también pueden permitir la marcación, la modificación y/o la clonación de la secuencia endógena. La estructura bloqueada puede regular la expresión génica (es decir, inhibir o mejorar la transcripción o replicación), o puede usarse como una estructura estable que puede usarse para marcar o bien modificar la secuencia de ácido nucleico endógena, o puede usarse para aislar la secuencia endógena, es decir, para clonación.

Las moléculas de ácido nucleico no necesitan limitarse a aquellas moléculas que contienen solo ARN o ADN, sino que abarcan además nucleótidos y no nucleótidos modificados químicamente. El porcentaje de no nucleótidos o nucleótidos modificados puede ser del 1% al 100% (por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95%).

Preparación de ácidos nucleicos

En algunas realizaciones, se proporciona un ácido nucleico para su uso como control o estándar en un ensayo, o proceso terapéutico, por ejemplo. Se puede preparar un ácido nucleico mediante cualquier técnica conocida en la técnica, como por ejemplo, síntesis química, producción enzimática o producción biológica. Los ácidos nucleicos se pueden recuperar o aislar de una muestra biológica. El ácido nucleico puede ser recombinante o puede ser natural o endógeno a la célula (producido a partir del genoma de la célula). Se contempla que una muestra biológica se pueda tratar de una manera que mejore la recuperación de pequeñas moléculas de ácido nucleico. Generalmente, los métodos pueden implicar la lisis de células con una solución que contiene guanidinio y un detergente.

La síntesis de ácidos nucleicos también se puede realizar de acuerdo con métodos estándar. Los ejemplos no limitantes de un ácido nucleico sintético (por ejemplo, un oligonucleótido sintético) incluyen un ácido nucleico elaborado mediante síntesis química in vitro usando química de fosfotriéster, fosfito o fosforamidita y técnicas de fase sólida o mediante compuestos intermedios de H-fosfonato desoxinucleósido. Se han descrito varios mecanismos diferentes de síntesis de oligonucleótidos en otra parte.

Los ácidos nucleicos se pueden aislar usando técnicas conocidas. En realizaciones particulares, pueden emplearse métodos para aislar moléculas pequeñas de ácido nucleico y/o aislar moléculas de ARN. La cromatografía es un proceso que se utiliza para separar o aislar ácidos nucleicos de proteínas o de otros ácidos nucleicos. Dichos métodos pueden implicar electroforesis con una matriz de gel, columnas de filtro, precipitación con alcohol y/u otra cromatografía. Si se va a utilizar o evaluar un ácido nucleico de las células, los métodos generalmente implican lisar las células con un caotrópico (por ejemplo, isotiocianato de guanidinio) y/o detergente (por ejemplo, N-lauroil sarcosina) antes de implementar procesos para aislar poblaciones particulares de ARN.

Los métodos pueden implicar el uso de disolventes orgánicos y/o alcohol para aislar ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la cantidad de alcohol añadida a un lisado celular alcanza una concentración de alcohol de aproximadamente 55% a 60%. Si bien se pueden emplear diferentes alcoholes, el etanol funciona bien. Un soporte sólido puede ser de cualquier estructura e incluye perlas, filtros y columnas, que pueden incluir un soporte mineral o polimérico con grupos electronegativos. Un filtro o columna de fibra de vidrio es eficaz para tales procedimientos de aislamiento.

Un proceso de aislamiento de ácido nucleico puede incluir a veces: a) lisar células en la muestra con una solución de lisis que comprende guanidinio, en el que se produce un lisado con una concentración de al menos aproximadamente 1 M de guanidinio; b) extraer moléculas de ácido nucleico del lisado con una solución de extracción que comprende fenol; c) añadir al lisado una solución de alcohol para formar una mezcla de lisado/alcohol, en la que la concentración de alcohol en la mezcla está entre aproximadamente el 35% y aproximadamente el 70%; d) aplicar la mezcla de lisado/alcohol a un soporte sólido; e) eluir las moléculas de ácido nucleico del soporte sólido con una solución iónica; y, f) capturar las moléculas de ácido nucleico. La muestra se puede secar y resuspender en un líquido y un volumen apropiado para su posterior manipulación.

Métodos de transferencia de genes

Para mediar el efecto de la expresión del transgén en una célula, será necesario transferir los constructos de expresión a una célula. Tal transferencia puede emplear métodos de transferencia de genes virales o no virales. Esta sección proporciona una discusión de los métodos y composiciones de la transferencia de genes.

Se genera una célula transformada que comprende un vector de expresión introduciendo en la célula el vector de expresión. Los métodos adecuados para la administración de polinucleótidos para la transformación de un orgánulo, una célula, un tejido u organismo para su uso con los métodos actuales incluyen prácticamente cualquier método mediante el cual un polinucleótido (por ejemplo, ADN) puede introducirse en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo.

Una célula huésped puede, y se ha utilizado, como receptora de vectores. Las células huésped pueden derivar de procariotas o eucariotas, dependiendo de si el resultado deseado es la replicación del vector o la expresión de parte o todas las secuencias de polinucleótidos codificadas por el vector. Numerosas líneas celulares y cultivos están disponibles para su uso como célula huésped, y pueden obtenerse a través de la American Type Culture Collection (ATCC), que es una organización que sirve como archivo de cultivos vivos y materiales genéticos. En realizaciones específicas, la célula huésped es una célula T, un linfocito infiltrante de tumor, una célula asesina natural o una célula T asesina natural.

Puede determinarse un huésped apropiado. Generalmente, esto se basa en la estructura del vector y el resultado deseado. Un plásmido o cósmido, por ejemplo, puede introducirse en una célula huésped procariota para la replicación de muchos vectores. Las células bacterianas utilizadas como células huésped para la replicación y/o expresión del vector incluyen DH5a, JM109 y KC8, así como una serie de huéspedes bacterianos disponibles comercialmente tales como células competentes SURE@ y células SOLOPACK Gold (STRATAGENE®, La Jolla, CA). Alternativamente, se podrían usar células bacterianas tales como E. coli LE392 como células huésped de virus de fagos. Las células eucariotas que pueden usarse como células huésped incluyen, pero no se limitan a, levaduras, insectos y mamíferos. Los ejemplos de células huésped eucariotas de mamífero para la replicación y/o expresión de un vector incluyen, pero no se limitan a, HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, COS, CHO, Saos y PC12. Los ejemplos de cepas de levadura incluyen, pero no se limitan a, YPH499, YPH500 e YPH501.

Las vacunas de ácido nucleico pueden incluir, por ejemplo, vectores de ADN no virales, ADN y ARN "desnudos" y vectores virales. Los métodos para transformar células con estas vacunas y para optimizar la expresión de genes incluidos en estas vacunas son conocidos y también se describen en este documento.

Ejemplos de métodos de transferencia de ácidos nucleicos o vectores virales

Puede usarse cualquier método apropiado para transfectar o transformar las células, por ejemplo, las células T, o para administrar las secuencias de nucleótidos o composiciones de los presentes métodos. En el presente documento se presentan ciertos ejemplos e incluyen además métodos tales como administración usando polímeros catiónicos, moléculas similares a lípidos y ciertos productos comerciales tales como, por ejemplo, IN-VIVO-JET PEI.

1. Transformación ex vivo

Están disponibles varios métodos para transfectar células vasculares y tejidos extraídos de un organismo en un entorno ex vivo. Por ejemplo, las células endoteliales caninas se han alterado genéticamente mediante la transferencia de genes retrovirales in vitro y se han trasplantado a un canino (Wilson et al., Science, 244: 1344-1346, 1989). En otro ejemplo, células endoteliales de cerdo miniatura de Yucatán fueron transfectadas por retrovirus in vitro y trasplantadas a una arteria usando un catéter de doble balón (Nabel et al., Science, 244 (4910): 1342-1344, 1989). Por lo tanto, se contempla que las células o tejidos se puedan eliminar y transfectar ex vivo usando los polinucleótidos presentados en el presente documento. En aspectos particulares, las células o tejidos trasplantados pueden colocarse en un organismo. Por ejemplo, las células T pueden obtenerse de un animal, las células pueden transfectarse o transformarse con el vector de expresión y luego administrarse de nuevo al animal.

2. Inyección

En determinadas realizaciones, una célula o un ácido nucleico o un vector viral se puede administrar a un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo mediante una o más inyecciones (es decir, una inyección con aguja), tal como, por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraprotática, intratumoral, intraperitoneal, etc. Los métodos de inyección incluyen, por ejemplo, la inyección de una composición que comprende una solución salina. Otras realizaciones incluyen la introducción de un polinucleótido mediante microinyección directa. La cantidad del vector de expresión usado puede variar según la naturaleza del antígeno así como el orgánulo, célula, tejido u organismo usado.

Las inyecciones intradérmicas, intranodales o intralinfáticas son algunos de los métodos de administración de DC más utilizados. La inyección intradérmica se caracteriza por una baja tasa de absorción en el torrente sanguíneo pero una rápida absorción en el sistema linfático. La presencia de un gran número de células dendríticas de Langerhans en la dermis transportará el antígeno intacto y procesado a los ganglios linfáticos de drenaje. Es necesaria una preparación adecuada del sitio para realizar esto correctamente (es decir, se recorta el pelo para observar la colocación adecuada de la aguja). La inyección intranodal permite la administración directa de antígeno a los tejidos linfoides. La inyección intralinfática permite la administración directa de CD.

3. Electroporación

En determinadas realizaciones, se introduce un polinucleótido en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo mediante electroporación. La electroporación implica la exposición de una suspensión de células y ADN a una descarga eléctrica de alto voltaje. En algunas variantes de este método, se emplean ciertas enzimas que degradan la pared celular, tales como las enzimas que degradan la pectina, para hacer que las células receptoras diana sean más susceptibles a la transformación por electroporación que las células no tratadas (patente de los Estados Unidos No.

5,384,253).

La transfección de células eucariotas mediante electroporación ha tenido bastante éxito. Se han transfectado linfocitos pre-B de ratón con genes de inmunoglobulina k humana (Potter et al., (1984) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU., 81, 7161­ 7165), y los hepatocitos de rata se han transfectado con el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (Tur-Kaspa et al., (1986) Mol. Cell Biol., 6,716-718) de esta forma.

La electroporación in vivo para vacunas, o eVac, se implementa clínicamente mediante una técnica de inyección simple. Un vector de ADN que codifica el antígeno tumoral se inyecta por vía intradérmica en un paciente. Luego, los electrodos aplican pulsos eléctricos al espacio intradérmico haciendo que las células localizadas allí, especialmente las células dendríticas dérmicas residentes, tomen el vector de ADN y expresen el antígeno tumoral codificado. Estas células dendríticas que expresan antígenos tumorales activadas por inflamación local pueden luego migrar a los ganglios linfáticos, presentando antígenos tumorales y cebando las células T específicas de antígenos tumorales. Un ácido nucleico se administra electroporéticamente cuando se administra usando electroporación, siguiendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, la inyección del ácido nucleico o cualquier otro medio de administración en el que el ácido nucleico pueda administrarse a las células mediante electroporación.

Los métodos de electroporación se discuten en, por ejemplo, Sardesai, N.Y. y Weiner, D.B., Current Opinion in Immunotherapy 23: 421-9 (2011) y Ferraro, B. et al., Human Vaccines 7: 120-127 (2011).

4. Fosfato de calcio

En otras realizaciones, se introduce un polinucleótido en las células usando precipitación con fosfato de calcio. Se han transfectado células KB humanas con ADN de adenovirus 5 (Graham y van der Eb, (1973) Virology, 52,456-467) utilizando esta técnica. También de esta manera, se transfectaron células L(A9) de ratón, C127 de ratón, células CHO, CV-1, BHK, NIH3T3 y HeLa con un gen marcador de neomicina (Chen y Okayama, Mol. Cell Biol., 7 (8): 2745-2752, 1987), y los hepatocitos de rata se transfectaron con una variedad de genes marcadores (Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10: 689-695, 1990).

5. DEAE-Dextrano

En otra realización, se administra un polinucleótido a una célula usando DEAE-dextrano seguido de polietilenglicol. De esta manera, se introdujeron plásmidos informadores en células de mieloma de ratón y eritroleucemia (Gopal, TV, Mol Cell Biol. Mayo de 1985; 5 (5): 1188-90).

6. Carga de sonicación

Realizaciones adicionales incluyen la introducción de un polinucleótido mediante carga sónica directa. Los fibroblastos LTK- se han transfectado con el gen de la timidina quinasa mediante carga de sonicación (Fechheimer et al., (1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU., 84, 8463-8467).

7. Transfección mediada por liposomas

En una realización adicional, se puede atrapar un polinucleótido en un complejo lipídico tal como, por ejemplo, un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilaminares tienen múltiples capas de lípidos separadas por medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se reorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan el agua y los solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, (1991) En: Liver Diseases, Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands. págs. 87-104). También se contempla un polinucleótido complejado con Lipofectamina (Gibco BRL) o Superfect (Qiagen).

8. Transfección mediada por receptores

Además, se puede administrar un polinucleótido a una célula diana mediante vehículos de administración mediados por receptor. Estos se aprovechan de la captación selectiva de macromoléculas por endocitosis mediada por receptores que se producirá en una célula diana. En vista de la distribución específica del tipo celular de varios receptores, este método de administración agrega otro grado de especificidad.

Ciertos vehículos dirigidos a genes mediados por receptores comprenden un ligando específico de receptor celular y un agente de unión a polinucleótidos. Otros comprenden un ligando específico del receptor celular al que se ha unido operativamente el polinucleótido que se va a administrar. Se han utilizado varios ligandos para la transferencia de genes mediada por receptores (Wu y Wu, (1987) J. Biol. Chem., 262, 4429-4432; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(9): 3410-3414, 1990; Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 91: 4086-4090, 1994; Myers, EPO 0273085), que establece la operatividad de la técnica. Se ha discutido la administración específica en el contexto de otro tipo de células de mamíferos (Wu y Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12: 159-167, 1993).

En ciertos aspectos, se elige un ligando para que corresponda a un receptor expresado específicamente en la población de células diana.

En otras realizaciones, un componente de vehículo de administración de polinucleótidos de un vehículo de direccionamiento de polinucleótidos específico de la célula puede comprender un ligando de unión específico en combinación con un liposoma. El polinucleótido o polinucleótidos que se van a administrar se alojan dentro del liposoma y el ligando de unión específico se incorpora funcionalmente en la membrana del liposoma. Por lo tanto, el liposoma se unirá específicamente al receptor o receptores de una célula diana y entregará el contenido a una célula. Se ha demostrado que tales sistemas son funcionales usando sistemas en los que, por ejemplo, se usa el factor de crecimiento epidérmico (EGF) en el suministro mediado por receptor de un polinucleótido a las células que exhiben una sobrerregulación del receptor de EGF.

En otras realizaciones más, el componente de vehículo de administración de polinucleótidos de un vehículo de administración dirigido puede ser un liposoma en sí mismo, que puede comprender, por ejemplo, uno o más lípidos o glicoproteínas que dirigen la unión específica de células. Por ejemplo, la lactosil-ceramida, un asialogangliósido terminal de galactosa, se ha incorporado a los liposomas y se ha observado un aumento en la captación del gen de la insulina por los hepatocitos (Nicolau et al., (1987) Methods Enzymol., 149,157-176). Se contempla que los constructos transformadores específicos de tejido pueden administrarse específicamente a una célula diana de una manera similar.

9. Bombardeo con microproyectiles

Se pueden utilizar técnicas de bombardeo con microproyectiles para introducir un polinucleótido en al menos un orgánulo, célula, tejido u organismo (patente de los Estados Unidos No. 5,550,318; patente de los Estados Unidos No.

5,538,880; patente de los Estados Unidos No. 5,610,0142; y solicitud PCT WO 94/09699).

Este método depende de la capacidad de acelerar microproyectiles recubiertos de ADN a una alta velocidad, lo que les permite perforar las membranas celulares y entrar en las células sin matarlas (Klein et al., (1987) Nature, 327, 70­ 73.). Existe una amplia variedad de técnicas de bombardeo con microproyectiles conocidas en la técnica, muchas de las cuales son aplicables a los presentes métodos.

En este bombardeo con microproyectiles, una o más partículas pueden recubrirse con al menos un polinucleótido y administrarse a las células mediante una fuerza propulsora. Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar partículas pequeñas. Uno de estos dispositivos se basa en una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, que a su vez proporciona la fuerza motriz (Yang et al., (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU., 87, 9568-9572). Los microproyectiles utilizados han consistido en sustancias biológicamente inertes tales como tungsteno o partículas o perlas de oro. Los ejemplos de partículas incluyen aquellas compuestas por tungsteno, platino y, en ciertos ejemplos, oro, incluidas, por ejemplo, nanopartículas. Se contempla que, en algunos casos, la precipitación de ADN sobre partículas metálicas no sería necesaria para el suministro de ADN a una célula receptora usando bombardeo con microproyectiles. Sin embargo, se contempla que las partículas pueden contener ADN en lugar de estar recubiertas con ADN. Las partículas recubiertas de ADN pueden aumentar el nivel de suministro de ADN a través del bombardeo con partículas, pero no son, en sí mismas, necesarias.

10. Transferencia mediada por transposones

También se pueden emplear métodos de transferencia mediada por transposones usando, por ejemplo, el sistema de transferencia de genes piggy/Bac. Sato, M., et al., Biotechnol J. 24 de octubre de 2014. doi: 10.1002/biot.201400283.

[Publicación electrónica antes de la impresión].

Ejemplos de métodos de transferencia mediada por vectores virales

En los presentes métodos puede emplearse cualquier vector viral adecuado para administrar secuencias de nucleótidos, o composiciones que comprenden secuencias de nucleótidos, a una célula o a un sujeto, de manera que la célula o células del sujeto puedan expresar los genes codificados por las secuencias de nucleótidos. En determinadas realizaciones, se incorpora un transgén en una partícula viral para mediar en la transferencia de genes a una célula. Normalmente, el virus simplemente se expondrá a la célula huésped adecuada en condiciones fisiológicas, lo que permitirá la captación del virus. Los presentes métodos se emplean ventajosamente usando una variedad de vectores virales, como se describe a continuación.

1. Adenovirus

El adenovirus es particularmente adecuado para su uso como vector de transferencia de genes debido a su genoma de ADN de tamaño medio, facilidad de manipulación, título alto, intervalo amplio de células diana y alta infectividad. El genoma viral de aproximadamente 36 kb está delimitado por repeticiones terminales invertidas (ITR) de 100-200 pares de bases (pb), en las que están contenidos elementos que actúan en cis necesarios para la replicación y el empaquetamiento del ADN viral. Las regiones temprana (E) y tardía (L) del genoma que contienen diferentes unidades de transcripción se dividen por el inicio de la replicación del ADN viral.

La región E1 (E1A y E1B) codifica proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma viral y algunos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) da como resultado la síntesis de proteínas para la replicación del ADN viral. Estas proteínas están involucradas en la replicación del ADN, la expresión génica tardía y el cierre de la célula huésped (Renan, M.J. (1990) Radiother Oncol., 19, 197-218). Los productos de los genes tardíos (L1, L2, L3, L4 y L5), incluida la mayoría de las proteínas de la cápside viral, se expresan solo después de un procesamiento significativo de una única transcripción primaria emitida por el promotor tardío principal (MLP). El MLP (ubicado en 16.8 unidades de mapa) es particularmente eficiente durante la fase tardía de la infección, y todos los ARNm emitidos por este promotor poseen una secuencia guía tripartita (TL) 5', lo que los hace útiles para la traducción.

Para optimizar el adenovirus para la terapia génica, es necesario maximizar la capacidad de carga de modo que se puedan incluir grandes segmentos de ADN. También es muy deseable reducir la toxicidad y la reacción inmunológica asociadas con ciertos productos adenovirales. Los dos objetivos son, hasta cierto punto, coincidentes en el sentido de que la eliminación de genes adenovirales sirve a ambos fines. Mediante la práctica de los presentes métodos, es posible lograr ambos objetivos al tiempo que se conserva la capacidad de manipular los constructos terapéuticos con relativa facilidad.

El gran desplazamiento del ADN es posible porque los elementos cis necesarios para la replicación del ADN viral están todos localizados en las repeticiones terminales invertidas (ITR) (100-200 pb) en cualquier extremo del genoma viral lineal. Los plásmidos que contienen ITR pueden replicarse en presencia de un adenovirus no defectuoso (Hay, R.T. et al., J Mol Biol. 5 de junio de 1984; 175 (4): 493-510). Por tanto, la inclusión de estos elementos en un vector adenoviral puede permitir la replicación.

Además, la señal de empaquetamiento para la encapsulación viral se localiza entre 194-385 pb (0.5-1.1 unidades de mapa) en el extremo izquierdo del genoma viral (Hearing et al., J. (1987) Virol., 67, 2555-2558). Esta señal imita el sitio de reconocimiento de proteínas en el ADN del bacteriófago lambda, en el que una secuencia específica cercana al extremo izquierdo, pero fuera de la secuencia del extremo cohesivo, media la unión a las proteínas necesarias para la inserción del ADN en la estructura de la cabeza. Los vectores de sustitución E1 de Ad han demostrado que un fragmento de 450 pb (0-1,25 unidades de mapa) en el extremo izquierdo del genoma viral podría dirigir el empaquetamiento en 293 células (Levrero et al., Gene, 101: 195-202, 1991).

Previamente, se ha demostrado que ciertas regiones del genoma adenoviral pueden incorporarse al genoma de células de mamíferos y los genes codificados de ese modo pueden expresarse. Estas líneas celulares son capaces de soportar la replicación de un vector adenoviral que es deficiente en la función adenoviral codificada por la línea celular. También ha habido informes de complementación de vectores adenovirales de replicación deficiente mediante vectores "auxiliares", por ejemplo, virus de tipo silvestre o mutantes condicionalmente defectuosos.

Los vectores adenovirales de replicación deficiente pueden complementarse, en trans, con virus auxiliares. Sin embargo, esta observación por sí sola no permite el aislamiento de los vectores de replicación deficiente, ya que la presencia del virus auxiliar, necesario para proporcionar funciones de replicación, contaminaría cualquier preparación. Por lo tanto, se necesitaba un elemento adicional que agregara especificidad a la replicación y/o empaquetamiento del vector de replicación deficiente. Ese elemento se deriva de la función de empaquetado del adenovirus.

Se ha demostrado que existe una señal de empaquetamiento para adenovirus en el extremo izquierdo del mapa de adenovirus convencional (Tibbetts et. al. (1977) Cell, 12, 243-249). Estudios posteriores demostraron que un mutante con una eliminación en la región E1A (194-358 pb) del genoma crecía mal incluso en una línea celular que complementaba la función temprana (E1A) (Hearing y Shenk, (1983) J. Mol. Biol. 167, 809-822). Cuando se recombinó un ADN adenoviral compensador (0-353 pb) en el extremo derecho del mutante, el virus se empaquetó normalmente. Un análisis mutacional adicional identificó un elemento corto, repetido y dependiente de la posición en el extremo izquierdo del genoma de Ad5. Se encontró que una copia de la repetición era suficiente para un empaquetamiento eficiente si estaba presente en cualquier extremo del genoma, pero no cuando se movía hacia el interior de la molécula de ADN de Ad5 (Hearing et al., J. (1987) Virol., 67, 2555-2558).

Mediante el uso de versiones mutadas de la señal de empaquetado, es posible crear virus auxiliares empaquetados con diferentes eficiencias. Normalmente, las mutaciones son mutaciones puntuales o eliminaciones. Cuando se cultivan virus auxiliares con empaquetamiento de baja eficacia en células auxiliares, el virus se empaqueta, aunque a tasas reducidas en comparación con el virus de tipo silvestre, lo que permite la propagación del auxiliar. Sin embargo, cuando estos virus auxiliares se cultivan en células junto con virus que contienen señales de empaquetamiento de tipo silvestre, las señales de empaquetamiento de tipo silvestre se reconocen preferentemente sobre las versiones mutadas. Dada una cantidad limitante de factor de empaquetamiento, el virus que contiene las señales de tipo silvestre se empaqueta selectivamente en comparación con los auxiliares. Si la preferencia es lo suficientemente grande, se pueden lograr valores próximos a la homogeneidad.

Para mejorar el tropismo de los constructos de ADV para tejidos o especies particulares, las secuencias de fibras de unión al receptor a menudo pueden sustituirse entre aislados adenovirales. Por ejemplo, el ligando del receptor de adenovirus de Coxsackie (CAR) que se encuentra en el adenovirus 5 puede sustituirse por la secuencia de fibras de unión a CD46 del adenovirus 35, lo que produce un virus con una afinidad de unión muy mejorada por las células hematopoyéticas humanas. El virus "pseudotipado" resultante, Ad5f35, ha sido la base de varios aislados virales desarrollados clínicamente. Además, existen varios métodos bioquímicos para modificar la fibra para permitir el redireccionamiento del virus a las células diana, tal como, por ejemplo, las células T. Los métodos incluyen el uso de anticuerpos bifuncionales (con un extremo que se une al ligando c A r y un extremo que se une a la secuencia diana) y la biotinilación metabólica de la fibra para permitir la asociación con ligandos quiméricos personalizados basados en avidina. Alternativamente, se podrían unir ligandos (por ejemplo, anti-CD205 mediante enlazadores heterobifuncionales (por ejemplo, que contienen PEG) a la partícula de adenovirus.

2. Retrovirus

Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenario que se caracterizan por la capacidad de convertir su ARN en ADN bicatenario en células infectadas mediante un proceso de transcripción inversa (Coffin, (1990) en: Virology, ed., Nueva York: Raven Press, págs. 1437-1500). El ADN resultante luego se integra de manera estable en los cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de proteínas virales. La integración da como resultado la retención de las secuencias de genes virales en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes, gag, pol y env, que codifican las proteínas de la cápside, la enzima polimerasa y los componentes de la envoltura, respectivamente. Una secuencia que se encuentra secuencia arriba del gen gag, denominada psi, funciona como una señal para el empaquetamiento del genoma en viriones. Dos secuencias de repetición terminal larga (LTR) están presentes en los extremos 5' y 3' del genoma viral. Estos contienen secuencias promotoras y potenciadoras fuertes y también son necesarias para la integración en el genoma de la célula huésped (Coffin, 1990). Así, por ejemplo, la presente tecnología incluye, por ejemplo, células mediante las cuales el polinucleótido usado para transducir la célula se integra en el genoma de la célula.

Para construir un vector retroviral, se inserta un ácido nucleico que codifica un promotor en el genoma viral en lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que es de replicación defectuosa. Para producir viriones, se construye una línea celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y env pero sin los componentes de LTR y psi (Mann et al., (1983) Cell, 33,153-159). Cuando un plásmido recombinante que contiene un ADNc humano, junto con las secuencias retrovirales de LTR y psi se introduce en esta línea celular (por precipitación con fosfato de calcio, por ejemplo), la secuencia psi permite empaquetar la transcripción de ARN del plásmido recombinante en partículas virales, que luego se secretan en los medios de cultivo (Nicolas, J.F. y Rubenstein, J.L.R., (1988) En: Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Rodríguez y Denhardt, Eds.). Nicolas y Rubenstein; Temin et al., (1986) En: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), Nueva York: Plenum Press, págs. 149-188; Mann et al., 1983). El medio que contiene los retrovirus recombinantes se recolecta, opcionalmente se concentra y se usa para la transferencia de genes. Los vectores retrovirales pueden infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la integración y la expresión estable de muchos tipos de retrovirus requieren la división de las células huésped (Paskind et al., (1975) Virology, 67, 242-248).

Recientemente se desarrolló un enfoque diseñado para permitir el direccionamiento específico de vectores retrovirales con base en la modificación química de un retrovirus mediante la adición química de residuos de galactosa a la envoltura viral. Esta modificación podría permitir la infección específica de células tales como hepatocitos a través de receptores de asialoglicoproteína, si se desea.

Se diseñó un enfoque diferente para el direccionamiento de retrovirus recombinantes, que usaba anticuerpos biotinilados contra una proteína de la envoltura retroviral y contra un receptor celular específico. Los anticuerpos se acoplaron a través de los componentes de biotina mediante el uso de estreptavidina (Roux et al., (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU., 86, 9079-9083). Usando anticuerpos contra antígenos del complejo principal de histocompatibilidad de clase I y clase II, se demostró la infección de una variedad de células humanas que portaban esos antígenos de superficie con un virus ecotrópico in vitro (Roux et al., 1989).

3. Lentivirus

Los vectores lentivirales usados en los presentes métodos pueden derivarse de cualquier lentivirus apropiado. Los vectores lentivirales son un tipo de vector retroviral, que incluye grupos de primates y no primates. Se discuten ejemplos de vectores lentivirales en, por ejemplo, Coffin et al. (1997) "Retroviruses" Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus, páginas 758-763). Los ejemplos de lentivirus de primates incluyen, pero no se limitan a: el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el agente causante del síndrome de autoinmunodeficiencia humana (SIDA) y el virus de inmunodeficiencia de simios (VIS). El grupo de lentivirales de no primates incluye el prototipo de "virus lento" virus visna/maedi (VMV), el virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV), el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV) y el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y el virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV). Los lentivirus son capaces de infectar células que se dividen y que no se dividen (Lewis et al. (1992); Lewis y Emerman (1994)).

Un vector lentiviral, como se usa en este documento, es un vector que comprende al menos una parte componente, en la que la parte componente está involucrada en los mecanismos biológicos por los cuales el vector infecta células, expresa genes o se replica, derivable de un lentivirus.

La estructura básica de los genomas de retrovirus y lentivirus comparten muchas características comunes, tales como una LTR 5' y una LTR 3', entre las cuales se encuentra una señal de empaquetamiento que permite empaquetar el genoma, un sitio de unión del cebador, sitios de integración para permitir integración en el genoma de una célula huésped y genes gag, pol y env que codifican los componentes de empaquetamiento. Los lentivirus también comprenden características adicionales, tales como las secuencias rev y RRE en el VIH, que permiten la exportación eficiente de transcripciones de ARN del provirus integrado desde el núcleo al citoplasma de una célula diana infectada.

En el provirus, los genes virales están flanqueados en ambos extremos por regiones llamadas repeticiones terminales largas (LTR). Las LTR son responsables de la integración proviral y la transcripción. Las LTR también sirven como secuencias potenciadoras-promotoras y pueden controlar la expresión de los genes virales.

Las LTR en sí mismas son secuencias idénticas que se pueden dividir en tres elementos, que se denominan U3, R y U5. U3 se deriva de la secuencia única del extremo 3' del ARN. R se deriva de una secuencia repetida en ambos extremos del ARN y U5 se deriva de la secuencia única del extremo 5' del ARN. Los tamaños de los tres elementos pueden variar considerablemente entre diferentes virus.

En los ejemplos de los vectores lentivirales discutidos en el presente documento, al menos parte de una o más regiones codificantes de proteínas esenciales para la replicación pueden eliminarse del virus. Esto hace que el vector viral sea defectuoso en la replicación. También se pueden reemplazar partes del genoma viral por un NOI para generar un vector que comprenda un NOI que sea capaz de transducir una célula huésped diana que no se esté dividiendo y/o integrar su genoma en un genoma huésped.

En una realización, los vectores retrovirales son vectores no integrantes, como se describe en los documentos WO 2007/071994, WO 2007/072056, patente de los Estados Unidos con serial No. 9,169,491, patente de los Estados Unidos con serial No. 8,084,249, o patente de los Estados Unidos No. 7,531,648. En algunos ejemplos, el vector lentiviral es un vector retroviral autoinactivante, en el que se han eliminado los potenciadores de la transcripción, o los potenciadores y el promotor en la región U3 de la LTR 3' (véase, por ejemplo. Yu et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci.

83: 3194-3198; Dougherty y Temin (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 1197-1201; Hawley et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 2406-2410; Yee et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 9564-9568).

El vector plasmídico lentiviral usado para producir el genoma viral dentro de una célula huésped/célula de empaquetamiento también incluirá secuencias de control reguladoras de la transcripción unidas operativamente al genoma lentiviral para dirigir la transcripción del genoma en una célula huésped/célula de empaquetamiento. Estas secuencias reguladoras pueden ser las secuencias naturales asociadas con la secuencia lentiviral transcrita, es decir, la región 5' U3, o pueden ser un promotor heterólogo tal como otro promotor viral, por ejemplo el promotor del CMV.

4. Virus adenoasociado

El AAV utiliza un ADN monocatenario lineal de aproximadamente 4700 pares de bases. Las repeticiones terminales invertidas flanquean el genoma. Hay dos genes presentes dentro del genoma, lo que da lugar a una serie de productos génicos distintos. El primero, el gen cap, produce tres proteínas de virión (VP) diferentes, denominadas VP-1, VP-2 y VP-3. El segundo, el gen rep, codifica cuatro proteínas no estructurales (NS). Uno o más de estos productos del gen rep es responsable de transactivar la transcripción del AAV.

Los tres promotores en el AAV se designan por su ubicación, en unidades de mapa, en el genoma. Estos son, de izquierda a derecha, p5, p19 y p40. La transcripción da lugar a seis transcripciones, dos iniciadas en cada uno de los tres promotores, y uno de cada par se empalma. El sitio de empalme, derivado de las unidades de mapa 42-46, es el mismo para cada transcripción. Las cuatro proteínas no estructurales aparentemente se derivan de la transcripción más larga, y las tres proteínas del virión surgen todas de la transcripción más pequeña.

El AAV no está asociado con ningún estado patológico en humanos. Curiosamente, para una replicación eficaz, el AAV requiere funciones de "ayuda" de virus como el virus del herpes simple I y II, el citomegalovirus, el virus de la pseudorrabia y, por supuesto, el adenovirus. El mejor caracterizado de los auxiliares es el adenovirus, y se ha demostrado que muchas funciones "tempranas" de este virus ayudan a la replicación del AAV. Se cree que la expresión de bajo nivel de las proteínas rep de AAV mantiene bajo control la expresión estructural de AAV, y se cree que la infección por el virus auxiliar elimina este bloqueo.

Las repeticiones terminales del vector del AAV se pueden obtener mediante digestión con endonucleasas de restricción del AAV o un plásmido tal como p201, que contiene un genoma del AAV modificado (Samulski et al., J. Virol., 61: 3096-3101 (1987)), o por otros métodos, que incluyen, entre otros, la síntesis química o enzimática de las repeticiones terminales basadas en la secuencia publicada del AAV. Puede determinarse, por ejemplo, mediante análisis de eliminación, la secuencia mínima o parte de las ITR del AAV que se requiere para permitir la función, es decir, la integración estable y específica del sitio. También se puede determinar qué modificaciones menores de la secuencia se pueden tolerar mientras se mantiene la capacidad de las repeticiones terminales para dirigir la integración estable específica del sitio.

Los vectores basados en AAV han demostrado ser vehículos seguros y eficaces para la administración de genes in vitro, y estos vectores se están desarrollando y probando en etapas preclínicas y clínicas para una amplia gama de aplicaciones en la terapia génica potencial, tanto ex vivo como in vivo (Carter y Flotte, (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci., 770; 79-90; Chatteijee et al., (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci., 770, 79-90; Ferrari et al., (1996) J. Virol., 70, 3227-3234; Fisher et al., (1996) J. Virol., 70, 520-532; Fleet et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU., 90, 10613-10617, (1993); Goodman et al. (1994), Blood, 84, 1492-1500; Kaplitt et al., (1994) Nat'l Genet., 8, 148-153; Kaplitt, MG et al., Ann Thorac Surg. Diciembre de 1996; 62(6): 1669-76; Kessler et al., (1996) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU., 93, 14082­ 14087; Koeberl et al., (1997) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU., 94,1426-1431; Mizukami et al., (1996) Virology, 217, 124­ 130).

La transferencia y expresión génica eficaz mediada por AAV en el pulmón ha dado lugar a ensayos clínicos para el tratamiento de la fibrosis quística (Carter y Flotte, 1995; Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU., 90, 10613-10617, (1993)). De manera similar, las perspectivas para el tratamiento de la distrofia muscular mediante el suministro del gen de la distrofina al músculo esquelético mediada por el AAV, de la enfermedad de Parkinson mediante el suministro del gen de la tirosina hidroxilasa al cerebro, de la hemofilia B mediante la entrega del gen del factor IX al hígado, y potencialmente de infarto de miocardio por el gen del factor de crecimiento endotelial vascular en el corazón, parecen prometedoras ya que recientemente se ha demostrado que la expresión del transgén mediada por AAV en estos órganos es altamente eficiente (Fisher et al., (1996) J. Virol., 70, 520-532; Flotte et al., 1993; Kaplitt et al., 1994; 1996; Koeberl et al., 1997; McCown et al., (1996) Brain Res., 713, 99-107; Ping et al., (1996) Microcirculation, 3, 225-228; Xiao et al., (1996) J. Virol., 70, 8098-8108).

5. Otros vectores virales

Se emplean otros vectores virales como constructos de expresión en los presentes métodos y composiciones. Vectores derivados de virus como el virus vaccinia (Ridgeway, (1988) en: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, págs. 467-492; Baichwal y Sugden, (1986) En, Gene Transfer, págs. 117-148; Coupar et al., Gene, 68: 1-10, 1988) se emplean poxvirus de canario y virus del herpes. Estos virus ofrecen varias características para su uso en la transferencia de genes a diversas células de mamíferos.

Una vez que el constructo se ha administrado en la célula, el ácido nucleico que codifica el transgén se coloca y se expresa en diferentes sitios. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el transgén se integra de forma estable en el genoma de la célula. Esta integración se encuentra en la ubicación y orientación afines a través de la recombinación homóloga (reemplazo de genes) o está integrada en una ubicación aleatoria no específica (aumento de genes). En otras realizaciones más, el ácido nucleico se mantiene de forma estable en la célula como un segmento episómico separado de ADN. Dichos segmentos de ácido nucleico o "episomas" codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación independientemente o en sincronización con el ciclo de la célula huésped. La forma en que se suministra el constructo de expresión a una célula y en qué parte de la célula permanece el ácido nucleico depende del tipo de construcción de expresión empleada.

Métodos para modificar células T y evaluación de las células T modificadas

En este documento se proporcionan ejemplos de métodos para manipular células T y evaluar las células T modificadas. Construcciones retrovirales y lentivirales

Transducción de retrovirus

Para la producción transitoria de retrovirus, las células 293T se transfectan con los constructos polipeptídicos quiméricos, junto con los plásmidos que codifican gag-pol y la envoltura de RD 114 usando el reactivo de transfección GeneJuice (Novagen, Madison, WI). El virus se recolecta de 48 a 72 horas después de la transfección, se congela rápidamente y se almacena a ~ 80 °C hasta su uso. Para la producción transitoria de lentivirus, las células 293T se transfectan con los constructos junto con los plásmidos pLP1 (gag/pol), pLP2 (rev) y pLP/VSVG (VSVG env) usando GeneJuice. El virus se recolecta de 48 a 72 horas después de la transfección, se congela rápidamente y se almacena a ~ 80 °C hasta su uso. Para la producción de retrovirus a gran escala, se genera una línea estable productora de retrovirus derivados de FLYRD 18 mediante múltiples transducciones con sobrenadante retroviral transitorio pseudotipado de VSV-G. Las células FLYRD18 con la expresión transgénica más alta se clasifican en una sola célula, y el clon que produce el título de virus más alto se expande y se usa para producir virus para la transducción de linfocitos. La expresión transgénica, la función y el título retroviral este clon se mantienen durante el cultivo continuo durante más de 8 semanas. Las placas de 24 pocillos no tratadas con cultivo de tejido se recubren con 7 pg/ml de Retronectina (Takara Bio, Otsu, Shiga, Japón) durante 1 hora a 37 °C o durante la noche a 4 °C. Los pocillos se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se recubren con sobrenadante retroviral incubando la placa con 1,5 ml de sobrenadante durante 30 minutos a 37 °C. Posteriormente, los blastos de células T se colocan en placas a razón de 5 * 105 células por pocillo en sobrenadante viral suplementado con 100 U/ml de IL-2. La transducción se realiza durante un período de 60 horas. Después de la transducción, las células se recolectan y se fenotipifican para la expresión de CD19 o GFP mediante citometría de flujo.

Citotoxicidad de las células T transducidas

La actividad citotóxica de cada línea de células T transducidas se evalúa en un ensayo estándar de liberación de 51Cr de 4 horas, como se presentó anteriormente. Las células T transducidas con retrovirus o lentivirus y comparadas con células diana marcadas con Cr51, incluidos linfocitos autólogos estimulados con fitohemaglutinina (PHA) (blastos PHA), líneas celulares cancerosas LNCaP, PC3 o DU145 y A549, y líneas celulares cancerosas A549 transgénicas que expresan PSMA (A549-PSMA). Se utilizan células diana incubadas en medio completo o Triton X-100 al 1% (Sigma, St Louis, MO) para determinar la liberación espontánea y máxima de 51Cr, respectivamente. El porcentaje medio de lisis específica de pocillos por triplicado se calculó como 100 X (liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea). Además de los ensayos de liberación de cromo, se realizan experimentos de cocultivo. En el presente documento, las líneas celulares LNCaP, PC3, DU145, A549 y A549-PSMA se transducen para expresar mOrange fluorescente y se utilizan como células diana. Las células tumorales que expresan mOrange se cultivan conjuntamente con células T no transducidas o modificadas en una proporción de 1:10 de células tumorales a células T en presencia de IL-2 (50 U/ml) en medio completo. Después de 24 horas, las células T se estimulan con AP1903 100 nM. Después de 72 horas, las células se recogen, se cuentan y se marcan con CD3 para detectar células T y se analiza el porcentaje de células tumorales mOrange mediante citometría de flujo (LSRII; BD).

Fenotipado y estado de activación de las células T transducidas

El fenotipo de la superficie celular de las células T transducidas se investiga utilizando los siguientes anticuerpos monoclonales: CD3, CD4, CD8, CD19, CD25, CD27, CD28, CD44, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD80, CD83, CD86, CD95, CD127, CD134, CD137, HLA-ABC y HLA-DR. El fenotipado se realiza con y sin AP1903 100 nM. En cada experimento se utilizan controles de isotipo emparejados apropiados y las células se analizan con un citómetro de flujo LSRII (BD). La expresión del polipéptido quimérico se evalúa usando anti-F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA).

Análisis de la producción de citocinas de células T transducidas

La concentración de interferón-y (IFN-y), IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 y factor de necrosis tumoral-a (TNFa) en sobrenadantes de cultivos de células T antes y después (24 horas) de estimulación con AP1903 100 nM se mide usando la matriz de perlas citométricas de citocinas Th1/Th2 humana (BD Pharmingen). La producción de citocinas inducida en los sobrenadantes del cultivo se valida mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA; R&D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Proliferación de células T transducidas

El efecto proliferativo de la activación inducida por AP1903 se evalúa midiendo el crecimiento celular de células T transducidas y no transducidas después de la exposición a AP1903. Las células T se marcan con diacetato de carboxifluoresceína 10 j M, éster succinimidílico (CFSE) durante 10 minutos a 37 °C. Después de la incubación, las células se lavan en PBS y luego se resuspenden en medio Cellgenix DC. Se cultivan posteriormente 1 * 106 células T modificadas o no transducidas marcadas con CFSE en medio Cellgenix DC solo o se estimulan con AP1903 100 nM. Después de 5 días, las células se recolectan y marcan con CD3-PerCP.Cy5.5 y CD19-PE y se analizan mediante citometría de flujo para dilución de CFSE.

Para evaluar si las inmunoglobulinas solubles afectan la proliferación y expansión de los linfocitos T transducidos, las células se cultivan a razón de 1 * 105 células/pocillo con dilución en serie de plasma humano obtenido de donantes sanos o con dilución en serie de inmunoglobulinas humanas purificadas (Jackson ImmunoResearch) sin adición de citocinas exógenas. Después de 72 horas, las células se pulsan con 1 jC i (0.0137 MBq) de metil-3[H]timidina (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y se cultivan durante 15 horas más. A continuación, las células se recogieron en filtros y se secaron, y se midieron los recuentos por minuto en un contador de centelleo p (TriCarb 2500 TR; Packard BioScience, Meridien, CT). Los experimentos se realizan por triplicado. En otros experimentos, los linfocitos T de control y modificados se cultivan con medio solo o con medio en el que se añaden diluciones seriadas de plasma o inmunoglobulinas purificadas cada dos días. Luego, las células se cuentan cada tres días usando exclusión de azul de tripano.

Activación de células T ex vivo y administración a un sujeto humano.

En este ejemplo se presentan métodos para usar células T modificadas, tales como células T modificadas con Bob1, que pueden o no comprender también polinucleótidos que codifican polipéptidos quiméricos adicionales, tales como los polipéptidos quiméricos Caspasa-9 discutidos en este documento, para terapia humana.

Materiales y métodos

Generación a gran escala de células T genéticamente modificadas

Las células T se generan a partir de voluntarios sanos, utilizando métodos estándar. Brevemente, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos o pacientes con cáncer se activan para la expansión y transducción utilizando aCD3 y aCD28 solubles (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Las PBMC se resuspenden en medio Cellgenix DC suplementado con 100 U/ml de IL-2 (Cellgenix) a razón de 1 * 106 células/ml y estimuladas con 0.2 jg/m l de anticuerpo soluble aCD3 y 0.5 jg/m l de anticuerpo soluble aCD28. A continuación, las células se cultivan a 37 °C, CO² al 5% durante 4 días. El día cuatro, se agrega 1 ml de medio fresco que contiene IL-2. El día 7, las células se recogen y se resuspenden en medio Cellgenix DC para la transducción.

Plásmido y retrovirus

Las composiciones y métodos del presente ejemplo pueden modificarse para incluir vectores lentivirales que codifican Bob1 como se describe en el presente documento. El plásmido SFG consta de polipéptido quimérico inducible unido, mediante una secuencia escindible similar a 2A, a CD19 humano truncado. El polipéptido quimérico inducible consiste en una proteína de unión a FK506 humana (FKBP12; GenBank AH002 818) con una mutación F36V, conectada mediante un enlazador Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly al polipéptido quimérico humano. La mutación F36V aumenta la afinidad de unión de FKBP12 al homodimerizador sintético, AP20187 o AP1903. La secuencia similar a 2A, "T2A", codifica un péptido de 20 aminoácidos del virus del insecto Thosea asigna, que media > 99% de escisión entre un residuo de glicina y prolina terminal, lo que da como resultado 19 aminoácidos adicionales en el extremo terminal C del polipéptido quimérico inducible y un residuo de prolina adicional en el extremo terminal N de CD19. CD19 consta de Cd 19 de longitud completa (GenBank NM 001770) truncado en el aminoácido 333 (TDPTRRF), que acorta el dominio intracitoplasmático de 242 a 19 aminoácidos y elimina todos los residuos de tirosina conservados que son sitios potenciales para la fosforilación.

Se prepara un clon PG13 estable que produce retrovirus pseudotipado del virus de la leucemia del mono Gibbon (Gal-V) transfectando transitoriamente la línea celular Phoenix Eco (producto ATCC # SD3444; ATCC, Manassas, VA) con el plásmido SFG. Esto produce retrovirus eco-pseudotipado. La línea celular de empaquetamiento PG13 (ATCC) se transduce tres veces con retrovirus Eco-pseudotipado para generar una línea productora que contiene múltiples integrantes provirales de plásmido SFG por célula. Se realiza la clonación de células individuales y el clon PG13 que produjo el título más alto se expande y se usa para la producción de vectores.

Transducción retroviral

El medio de cultivo para la activación y expansión de células T es medio Cellgenix DC sin suero (Cellgenix) suplementado con 100 U/ml de IL-2 (Cellgenix). Las células T se activan mediante anti-CD3 y anti-CD28 solubles (Miltenyi Biotec) durante 7 días antes de la transducción con el vector retroviral. La selección inmunomagnética de ACD19, si es necesario, se realiza el día 4 después de la transducción; la fracción positiva se expandió durante 2 días más y se crioconservó.

Aumento de la producción de células aloagotadas genéticamente modificadas

Para el aumento de producción del proceso de transducción para aplicaciones clínicas, se utilizan matraces T75 no tratados con cultivo de tejidos (Nunc, Rochester, NY), que se recubren con 10 ml anti-CD3 a razón de 0.5 pg/ml y anti-CD28 a razón de 0.2 pg/ml o 10 ml de fibronectina a razón de 7 pg/ml a 4 °C durante la noche. También se utilizan bolsas de etileno propileno fluoradas tratadas en corona para una mayor adherencia celular (2PF-0072AC, American Fluoroseal Corporation, Gaithersburg, MD). Las PBMC se siembran en matraces recubiertos con anti-CD3 y anti-CD28 a razón de 1 x 10⁶ células/ml en medio suplementado con 100 U/ml de IL-2. Para la transducción retroviral, los matraces o bolsas recubiertos con retronectina se cargan una vez con ^{1 0} ml de sobrenadante que contiene retrovirus durante 2 a 3 horas. Las células T activadas se siembran a razón de 1 x 10⁶ células/ml en medio fresco que contiene vector retroviral y medio de cultivo de células T en una proporción de 3:1, suplementado con 100 U/ml de IL-2. Las células se recolectan a la mañana siguiente y se expanden en matraces T75 o T175 tratados con cultivo de tejidos en medio de cultivo suplementado con 100 U/ml de IL-2 a una densidad de siembra de entre aproximadamente 5 x 10⁵ células/ml a ⁸ x ^{1 0 5} células/ml.

Selección inmunomagnética de CD19

En el presente ejemplo, las células modificadas expresan una proteína marcadora CD19; se entiende que las células modificadas pueden seleccionarse usando marcadores distintos de CD19, o por otros métodos. La selección inmunomagnética para CD19 puede realizarse, en un ejemplo, 4 días después de la transducción. Las células se marcan con microperlas paramagnéticas conjugadas con anticuerpos monoclonales de ratón anti-CD19 humanos (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) y se seleccionan en columnas MS o LS en experimentos a pequeña escala y en un dispositivo de selección automatizado CliniMacs Plus en experimentos a gran escala. Las células seleccionadas con CD19 se expanden durante 4 días más y se criopreservan el día ⁸ después de la transducción. Estas células se denominan "células modificadas genéticamente".

Inmunofenotipado y análisis de pentámeros

El análisis de citometría de flujo (software FACSCalibur y CellQuest; Becton Dickinson) se realiza utilizando los siguientes anticuerpos: CD3, CD4, CD⁸ , CD19, CD25, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD56 y CD62L. Se encontró que CD19-PE (Clon 4G7; Becton Dickinson) proporciona una tinción óptima y se usó en todos los análisis posteriores. Se utiliza un control no transducido para configurar el cuadrante negativo para CD19.

Análisis estadístico

Se utiliza la prueba t de Student de dos colas pareadas para determinar la significancia estadística de las diferencias entre las muestras. Todos los datos se representan como media ± 1 desviación estándar.

Métodos para tratar una enfermedad

Los presentes métodos también abarcan métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad en los que la administración de células mediante, por ejemplo, infusión, puede ser beneficiosa.

Células, tales como, por ejemplo, células T, linfocitos infiltrantes de tumores, células asesinas naturales, células T asesinas naturales o células progenitoras, tales como, por ejemplo, células madre hematopoyéticas, células estromales mesenquimales, células madre, células madre pluripotentes y células madre embrionarias pueden usarse para terapia celular. Las células pueden ser de un donante o pueden ser células obtenidas del paciente. Las células pueden, por ejemplo, usarse en regeneración, por ejemplo, para reemplazar la función de células enfermas. Las células también pueden modificarse para expresar un gen heterólogo de modo que los agentes biológicos puedan administrarse a microambientes específicos tales como, por ejemplo, médula ósea enferma o depósitos metastásicos. Las células estromales mesenquimales también se han utilizado, por ejemplo, para proporcionar actividad inmunosupresora, y se pueden utilizar en el tratamiento de enfermedades de injerto contra huésped y trastornos autoinmunes. Las células proporcionadas en la presente solicitud contienen un interruptor de seguridad que puede ser valioso en una situación en la que después de la terapia celular, es necesario aumentar o disminuir la actividad de las células terapéuticas. Por ejemplo, cuando se proporcionan al paciente células T que expresan un receptor de células T, tal como un TCR dirigido a Bob1, en algunas situaciones puede haber un evento adverso, tal como toxicidad fuera de la diana. El cese de la administración del ligando devolvería las células T terapéuticas a un estado no activado, permaneciendo en un nivel de expresión bajo, no tóxico. O, por ejemplo, la célula terapéutica puede funcionar para disminuir la célula tumoral, o el tamaño del tumor, y puede que ya no sea necesaria. En esta situación, la administración del ligando puede cesar y las células terapéuticas ya no estarían activadas. Si las células tumorales regresan, o el tamaño del tumor aumenta después de la terapia inicial, el ligando puede administrarse de nuevo para activar más las células T que expresan TCR y volver a tratar al paciente.

Por "célula terapéutica" se entiende una célula utilizada para terapia celular, es decir, una célula administrada a un sujeto para tratar o prevenir una afección o enfermedad.

El término "dosis unitaria" en lo que respecta al inóculo se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para mamíferos, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de composición farmacéutica calculada para producir el efecto inmunoestimulante deseado en asociación con el diluyente requerido. Las especificaciones para la dosis unitaria de un inóculo están dictadas y dependen de las características únicas de la composición farmacéutica y del efecto inmunológico particular que se desea lograr.

Una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, tal como el ligando multimérico presentado en este documento, sería la cantidad que logra este resultado seleccionado de inducir apoptosis en las células T que expresan caspasa-9, de manera que más del 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 97%, o que mueran menos del 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% o 10% de las células terapéuticas. El término también es sinónimo de "cantidad suficiente". La cantidad eficaz en la que la composición farmacéutica es la célula T modificada también puede ser la cantidad que logre la respuesta terapéutica deseada, tal como la reducción del tamaño del tumor, la disminución del nivel de células tumorales o la disminución del nivel de células leucémicas, en comparación con el tiempo antes de que se administre el inductor del ligando.

La cantidad eficaz para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o afección que se está tratando, la composición particular que se administra, el tamaño del sujeto y/o la gravedad de la enfermedad o afección. Se puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de una composición particular presentada en este documento sin necesidad de una experimentación indebida.

Los términos "contactado" y "expuesto", cuando se aplican a una célula, tejido u organismo, se utilizan en este documento para describir el proceso mediante el cual se administra la composición farmacéutica y/u otro agente, tal como por ejemplo un agente quimioterapéutico o radioterapéutico a una célula, tejido u organismo diana o se colocan en yuxtaposición directa con la célula, tejido u organismo diana. Para lograr la muerte o estasis celular, la composición farmacéutica y/o el agente o agentes adicionales se administran a una o más células en una cantidad combinada eficaz para matar la célula o células o evitar que se dividan.

La administración de la composición farmacéutica puede preceder, ser concurrente y/o seguir al otro agente o agentes en intervalos que varían de minutos a semanas. En las realizaciones en las que la composición farmacéutica y otro agente o agentes se aplican por separado a una célula, tejido u organismo, generalmente se aseguraría que no transcurriera un período de tiempo significativo entre los momentos de cada administración, de modo que la composición y el agente o agentes farmacéuticos aún podrían ejercer un efecto combinado ventajoso sobre la célula, tejido u organismo. Por ejemplo, en tales casos, se contempla que se pueda poner en contacto la célula, tejido u organismo con dos, tres, cuatro o más modalidades sustancialmente simultáneamente (es decir, en menos de aproximadamente un minuto) con la composición farmacéutica. En otros aspectos, uno o más agentes pueden administrarse dentro de sustancialmente simultáneamente, aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 7 días, a aproximadamente 1 a aproximadamente ⁸ semanas o más, y cualquier intervalo derivado entre ellos, antes y/o después de administrar el vector de expresión. Además, se pueden emplear varios regímenes de combinación de la composición farmacéutica presentada en este documento y uno o más agentes.

Tratamiento terapéutico optimizado y personalizado

El programa de dosificación y administración de las células modificadas puede optimizarse determinando el nivel de la enfermedad o afección a tratar. Por ejemplo, se puede determinar el tamaño de cualquier tumor sólido restante o el nivel de células diana como, por ejemplo, células tumorales o células leucémicas, que permanecen en el paciente.

Por ejemplo, determinar que un paciente tiene niveles clínicamente relevantes de células tumorales, o un tumor sólido, después de la terapia inicial, proporciona una indicación al médico de que puede ser necesario administrar las células T modificadas. En otro ejemplo, determinar que un paciente tiene un nivel reducido de células tumorales o un tamaño tumoral reducido después del tratamiento con las células modificadas puede indicar al médico que no se necesita una dosis adicional de las células modificadas. De manera similar, después del tratamiento con las células modificadas, la determinación de que el paciente continúa presentando síntomas de enfermedad o afección, o sufre una recaída de los síntomas, puede indicar al médico que puede ser necesario administrar al menos una dosis adicional de células modificadas.

El término "dosificación" pretende incluir tanto la cantidad de la dosis como la frecuencia de administración, tal como, por ejemplo, el momento de la siguiente dosis. El término "nivel de dosificación" se refiere a la cantidad de células modificadas administradas en relación con el peso corporal del sujeto.

En ciertas divulgaciones, las células están en un animal, tal como un ser humano, un primate no humano, una vaca, un caballo, un cerdo, una oveja, una cabra, un perro, un gato o un roedor. El sujeto puede ser, por ejemplo, un animal, tal como un mamífero, por ejemplo, un ser humano, un primate no humano, una vaca, un caballo, un cerdo, una oveja, una cabra, un perro, un gato o un roedor. El sujeto puede ser, por ejemplo, un ser humano, por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad infecciosa y/o un sujeto que está inmunodeprimido o que padece una enfermedad hiperproliferativa.

Por lo tanto, por ejemplo, en ciertas divulgaciones, los métodos comprenden determinar la presencia o ausencia de un aumento del tamaño del tumor y/o aumento en el número de células tumorales en un sujeto en relación con el tamaño del tumor y/o el número de células tumorales después de la administración de las células modificadas o del ácido nucleico, y la administración de una dosis adicional de las células modificadas o del ácido nucleico al sujeto en el caso de que se determine la presencia de un aumento del tamaño del tumor y/o un aumento en el número de células tumorales. Los métodos también comprenden, por ejemplo, determinar la presencia o ausencia de un aumento en las células leucémicas en el sujeto en relación con el nivel de células leucémicas después de la administración de las células modificadas o del ácido nucleico, y administrar una dosis adicional de las células modificadas o del ácido nucleico al sujeto en el caso de que se determine la presencia de un aumento de células leucémicas en el sujeto. En estas divulgaciones, por ejemplo, el paciente se trata inicialmente con las células terapéuticas o el ácido nucleico de acuerdo con los métodos descritos en este documento. Después del tratamiento inicial, el tamaño del tumor, el número de células tumorales o el número de células leucémicas, por ejemplo, pueden disminuir en relación con el tiempo anterior al tratamiento inicial. En un momento determinado después de este tratamiento inicial, se vuelve a examinar al paciente o se puede controlar continuamente al paciente para detectar síntomas de la enfermedad. Si se determina que el tamaño del tumor, el número de células tumorales o el número de células leucémicas, por ejemplo, aumenta en relación con el tiempo inmediatamente posterior al tratamiento inicial, entonces las células modificadas o el ácido nucleico se pueden administrar durante una dosis adicional. Este programa de seguimiento y tratamiento puede continuar mientras se observa que las células terapéuticas que expresan los receptores de células T dirigidas a Bob1 permanecen en el paciente.

En otras divulgaciones, después de la administración de células modificadas o ácido nucleico, en las que las células modificadas o ácido nucleico expresan el polipéptido Caspasa-9 inducible, en caso de necesidad de reducir el número de células modificadas o células modificadas in vivo, puede administrarse el ligando multimérico al paciente. En estas descripciones, los métodos comprenden determinar la presencia o ausencia de un síntoma o afección negativos, tal como enfermedad de injerto contra huésped, o toxicidad fuera del objetivo, y administrar una dosis del ligando multimérico. Los métodos pueden comprender además monitorear el síntoma o condición y administrar una dosis adicional del ligando multimérico en el caso de que el síntoma o condición persista. Este programa de seguimiento y tratamiento puede continuar mientras las células terapéuticas que expresan los TCR dirigidos a Bob1 permanezcan en el paciente.

Se puede proporcionar una indicación de ajustar o mantener una dosis de fármaco posterior, tal como, por ejemplo, una dosis posterior de las células modificadas o del ácido nucleico, y/o la dosificación de fármaco posterior, de cualquier manera conveniente. Se puede proporcionar una indicación en forma de tabla (por ejemplo, en un medio físico o electrónico) en algunas realizaciones. Por ejemplo, el tamaño de la célula tumoral o el número o el nivel de células tumorales en una muestra se pueden proporcionar en una tabla, y un médico puede comparar los síntomas con una lista o tabla de etapas de la enfermedad. A continuación, el médico puede identificar en la tabla una indicación para la dosis de fármaco posterior. En ciertas divulgaciones, una indicación puede ser presentada (por ejemplo, mostrada) por un ordenador, después de que los síntomas se hayan proporcionado al ordenador (por ejemplo, ingresados en la memoria del ordenador). Por ejemplo, esta información puede ser proporcionada a un ordenador (por ejemplo, ingresada en la memoria del ordenador por un usuario o transmitida a un ordenador a través de un dispositivo remoto en una red informática), y el software en el ordenador puede generar una indicación para ajustar o mantener una dosis de fármaco posterior y/o proporcionar la cantidad de dosis de fármaco posterior.

Una vez que se determina una dosis posterior en función de la indicación, un médico puede administrar la dosis posterior o proporcionar instrucciones para ajustar la dosis a otra persona o entidad. El término "médico", como se usa en este documento, se refiere a un tomador de decisiones, y un médico es un profesional médico en ciertos ejemplos. Un tomador de decisiones puede ser un ordenador o una salida de programa de ordenador mostrada en algunos ejemplos, y un proveedor de servicios de salud puede actuar sobre la indicación o la dosis de medicamento subsiguiente mostrada por el ordenador. Un responsable de la toma de decisiones puede administrar la dosis posterior directamente (por ejemplo, infundir la dosis posterior en el sujeto) o de forma remota (por ejemplo, un responsable de la toma de decisiones puede cambiar los parámetros de la bomba de forma remota).

Los métodos que se describen en el presente documento incluyen, sin limitación, el suministro de una cantidad eficaz de una célula activada, un ácido nucleico o un constructo de expresión que lo codifique. Una "cantidad eficaz" de la célula activada, el ácido nucleico o el constructo de expresión, generalmente, se define como la cantidad suficiente para lograr de forma detectable y repetida el resultado deseado indicado, por ejemplo, para mejorar, reducir, minimizar o limitar el grado de la enfermedad o sus síntomas. Pueden aplicarse otras definiciones más rigurosas, incluida la eliminación, erradicación o curación de enfermedades. En algunas divulgaciones puede haber una etapa de seguimiento de los biomarcadores u otros síntomas de la enfermedad, tal como el tamaño del tumor o la expresión del antígeno tumoral, para evaluar la eficacia del tratamiento y controlar la toxicidad.

En realizaciones adicionales, el constructo de expresión y/o el vector de expresión se pueden utilizar como una composición o sustancia que activa las células. Tal composición que "activa células" o "mejora la actividad de las células" se refiere a la capacidad de estimular una o más actividades asociadas con las células. Por ejemplo, una composición, tal como el constructo de expresión o el vector de los presentes métodos, puede estimular la sobrerregulación de moléculas coestimulantes en las células, inducir la translocación nuclear de NF-kB en las células, activar receptores tipo toll en las células u otras actividades que involucran citocinas o quimiocinas.

El constructo de expresión, el vector de expresión y/o las células transducidas pueden mejorar o contribuir a la efectividad de una vacuna, por ejemplo, mejorando la inmunogenicidad de antígenos más débiles, tal como antígenos altamente purificados o recombinantes, reduciendo la cantidad de antígeno requerido para una respuesta inmune, reduciendo la frecuencia de inmunización requerida para proporcionar inmunidad protectora, mejorando la eficacia de las vacunas en sujetos con respuestas inmunes reducidas o debilitadas, tal como recién nacidos, ancianos e individuos inmunodeprimidos, y mejorando la inmunidad en un tejido diana, tal como la inmunidad de las mucosas, o promover la inmunidad humoral o mediada por células provocando un perfil de citocinas particular.

En determinadas formas de realización, la célula también se pone en contacto con un antígeno. A menudo, la célula se pone en contacto con el antígeno ex vivo. A veces, la célula se pone en contacto con el antígeno in vivo. En algunas realizaciones, la célula está en un sujeto y se genera una respuesta inmune contra el antígeno. A veces, la respuesta inmune es una respuesta inmune de linfocitos T citotóxicos (CTL). A veces, la respuesta inmune se genera contra un antígeno tumoral. En determinadas formas de realización, la célula se activa sin la adición de un adyuvante.

En ciertas divulgaciones, la célula se transduce con el ácido nucleico ex vivo y se administra al sujeto mediante administración intravenosa. En otras divulgaciones, la célula se administra mediante administración intradérmica. En algunas divulgaciones, la célula se transduce con el ácido nucleico ex vivo y se administra al sujeto mediante administración subcutánea. A veces, la célula se transduce con el ácido nucleico ex vivo. A veces, la célula se transduce con el ácido nucleico in vivo.

En determinadas divulgaciones, la célula se transduce con el ácido nucleico ex vivo y se administra al sujeto mediante administración intradérmica y, a veces, la célula se transduce con el ácido nucleico ex vivo y se administra al sujeto mediante administración subcutánea. El antígeno puede ser un antígeno tumoral y la respuesta inmune CTL puede inducirse mediante la migración de la célula a un ganglio linfático de drenaje. Un antígeno tumoral es cualquier antígeno tal como, por ejemplo, un péptido o polipéptido, que desencadena una respuesta inmune en un huésped. El antígeno tumoral puede ser un antígeno asociado a un tumor, que está asociado con una célula tumoral neoplásica.

En algunas realizaciones, un individuo o sujeto inmunodeprimido es un sujeto que tiene una respuesta inmune reducida o debilitada. Dichos individuos también pueden incluir un sujeto que se ha sometido a quimioterapia o cualquier otra terapia que dé como resultado un sistema inmunológico debilitado, un receptor de trasplante, un sujeto que actualmente toma inmunosupresores, un individuo que envejece o cualquier individuo que tenga células T reducidas y/o deterioradas. Se contempla que los presentes métodos se pueden utilizar para mejorar la cantidad y/o la actividad de las células T en un sujeto inmunodeprimido.

Antígenos

Los receptores de células T se unen a antígenos diana. Cuando se analiza la activación de células T in vitro o ex vivo, los antígenos diana pueden obtenerse o aislarse de diversas fuentes. El antígeno diana, como se usa en este documento, es un antígeno o epítopo inmunológico en el antígeno, que es crucial en el reconocimiento inmunológico y la eliminación o el control final del agente causante de la enfermedad o el estado patológico en un mamífero. El reconocimiento inmunológico puede ser celular y/o humoral. En el caso de patógenos intracelulares y cáncer, el reconocimiento inmunológico puede ser, por ejemplo, una respuesta de linfocitos T.

El antígeno diana puede derivarse o aislarse de, por ejemplo, un microorganismo patógeno tal como virus, incluido el VIH, (Korber et al, eds. HIV Molecular Immunology Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, Nuevo Méjico 1977), influenza, herpes simple, virus del papiloma humano (patente de los Estados Unidos No. 5,719,054), Hepatitis B (patente de los Estados Unidos No. 5,780,036), Hepatitis C (patente de los Estados Unidos No. 5,709,995), EBV, Citomegalovirus (CMV) y similares. El antígeno diana puede derivarse o aislarse de bacterias patógenas tales como, por ejemplo, de clamidia (patente de los Estados Unidos No. 5,869,608), micobacterias, Legionella, meningococos, estreptococos del grupo A, Salmonella, Listeria, Hemophilus influenzae (patente de los Estados Unidos No. 5,955,596) y similares.

El antígeno diana puede derivarse o aislarse de, por ejemplo, levadura patógena que incluye Aspergillus, Candida invasora (patente de los Estados Unidos No. 5,645,992), Nocardia, Histoplasmosis, Criptosporidia y similares.

El antígeno diana puede derivarse o aislarse de, por ejemplo, un protozoo patógeno y parásitos patógenos que incluyen, entre otros, Pneumocystis carinii, Tripanosoma, Leishmania (patente de los Estados Unidos No. 5,965,242), Plasmodio (patente de los Estados Unidos No. 5,589,343) y Toxoplasma gondii.

El antígeno diana incluye un antígeno asociado con un estado preneoplásico o hiperplásico. El antígeno diana también puede estar asociado o ser causante del cáncer. Tal antígeno diana puede ser, por ejemplo, antígeno específico de tumor, antígeno asociado a tumor (TAA) o antígeno específico de tejido, epítopo del mismo y agonista de epítopo del mismo. Dichos antígenos diana incluyen, pero no se limitan a, antígeno carcinoembrionario (CEA) y epítopos del mismo tales como CAP-1, CAP-1-6D y similares (GenBank acceso No. M29540), MART-1 (Kawakarni et al., J. Exp. Con. 180: 347-352, 1994), MAGE-1 (patente de los Estados Unidos No. 5,750,395), MAGE-3, GAGE (patente de los Estados Unidos No. 5,648,226), GP-100 (Kawakami et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU. 91: 6458-6462, 1992), MUC-1, MUC-2, oncogén ras con mutación puntual, oncogenes p53 normales y con mutación puntual (Hollstein et al., Nucleic Acids Res. 22:3551-3555, 1994), PSMA (Israeli et al., Cancer Res. 53: 227-230, 1993), tirosinasa (Kwon et al., PNAS 84: 7473-7477, 1987), TRP-1 (gp75) (Cohen et al., Nucleic Acid Res. 18: 2807-2808, 1990; patente de los Estados Unidos No. 5,840,839), NY-ESO-1 (Chen et al., PNAS 94: 1914-1918, 1997), TRP-2 (Jackson et al., EMBOJ, 11: 527-535, 1992), TAG72, KSA, CA-125, PSA, HER-2/nieve/c-erbo/B2, (patente de los Estados Unidos No.

5,550,214), BRC-I, BRC-II, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, modificaciones de TAA y antígeno específico de tejido, variantes de empalme de TAA, agonistas de epítopos y similares. Se pueden identificar, aislar y clonar otros TAA mediante métodos conocidos en la técnica tales como los divulgados en la patente de los Estados Unidos No.

4,514,506. El antígeno diana también puede incluir uno o más factores de crecimiento y variantes de empalme de cada uno.

Un antígeno puede expresarse con más frecuencia en células cancerosas que en células no cancerosas. El antígeno puede resultar del contacto de la célula modificada con un antígeno de membrana específico de la próstata, por ejemplo, un antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) o un fragmento del mismo.

El antígeno prostático (PA001) es una proteína recombinante que consta de la porción extracelular del antígeno PSMA. PSMA es una proteína de membrana de tipo II de ~ 100 kDa (84 kDa antes de la glicosilación, ~ 180 kDa como dímero) con actividades de neuropeptidasa y folato hidrolasa, pero actualmente no está clara la verdadera función de PSMA. Carter RE, et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 93: 749-53, 1996; Israeli RS, et al., Cancer Nada. 53: 227-30, 1993; Pinto JT, et al., Clin Cancer Res. 2: 1445-51, 1996.

La célula puede ponerse en contacto con antígeno tumoral, tal como PSA, por ejemplo, polipéptido PSMA, mediante varios métodos, que incluyen, por ejemplo, CD inmaduras pulsantes con lisados tumorales no fraccionados, péptidos eluidos por MHC, proteínas de choque térmico (HSP) derivadas de tumores, antígenos asociados a tumores (TAA (péptidos o proteínas)), o CD transfectantes con ARNm tumoral en masa, o ARNm que codifica TAA (revisado en Gilboa, E. y Vieweg, J., Immunol Rev 199, 251-63 (2004); Gilboa, E, Nat Rev Cancer 4, 401-11 (2004)).

Para los organismos que contienen un genoma de ADN, un gen que codifica un antígeno diana o un epítopo inmunológico del mismo de interés se aísla del ADN genómico. Para organismos con genomas de ARN, el gen deseado puede aislarse de copias de ADNc del genoma. Si se dispone de mapas de restricción del genoma, el fragmento de ADN que contiene el gen de interés se escinde mediante digestión con endonucleasas de restricción mediante métodos de rutina. En los casos en los que el gen deseado se haya clonado previamente, los genes pueden obtenerse fácilmente a partir de los clones disponibles. Alternativamente, si se conoce la secuencia de ADN del gen, el gen puede sintetizarse mediante cualquiera de las técnicas convencionales para la síntesis de ácidos desoxirribonucleicos.

Los genes que codifican un antígeno de interés pueden amplificarse, por ejemplo, clonando el gen en un huésped bacteriano. Para este propósito, se pueden utilizar varios vectores de clonación procariotas. Los ejemplos son los plásmidos pBR322, pUC y pEMBL.

Los genes que codifican al menos un antígeno diana o un epítopo inmunológico del mismo pueden prepararse para su inserción en los vectores plasmídicos diseñados para la recombinación con un virus mediante técnicas estándar. En general, los genes clonados pueden escindirse del vector de clonación procariota mediante digestión con enzimas de restricción. En la mayoría de los casos, el fragmento extirpado contendrá la región codificante completa del gen. El fragmento de ADN que porta el gen clonado puede modificarse según sea necesario, por ejemplo, para hacer que los extremos del fragmento sean compatibles con los sitios de inserción de los vectores de ADN utilizados para la recombinación con un virus, y luego purificarse antes de la inserción en los vectores en los sitios de escisión con endonucleasa de restricción (sitios de clonación).

La carga de antígenos de células, tales como, por ejemplo, células dendríticas, con antígenos, tales como, por ejemplo, un polipéptido epítopo Bob1, se puede lograr, por ejemplo, mediante el contacto de células, tales como, por ejemplo, células dendríticas o células progenitoras, con un antígeno, por ejemplo, incubando las células con el antígeno. La carga también se puede lograr, por ejemplo, incubando ADN (desnudo o dentro de un vector plasmídico) o ARN que codifica el antígeno; o con bacterias o virus recombinantes que expresan antígenos (por ejemplo, vectores de vaccinia, viruela aviar, adenovirus o lentivirus). Antes de la carga, el antígeno puede conjugarse covalentemente con un compañero inmunológico que proporcione ayuda a las células T (por ejemplo, una molécula portadora). Alternativamente, una célula dendrítica puede pulsarse con un compañero inmunológico no conjugado, por separado o en presencia del polipéptido. Los antígenos de células o moléculas del MHC pueden obtenerse por elución ácida u otros métodos (véase Zitvogel L et al., J Exp Med 1996. 183: 87-97). Las células pueden transducirse o transfectarse con la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica de acuerdo con los presentes métodos antes, después o al mismo tiempo que las células se cargan con el antígeno. En realizaciones particulares, la carga de antígeno es posterior a la transducción o transfección.

En realizaciones adicionales, la célula transducida se transfecta con ARNm de células tumorales. La célula transducida transfectada se administra a un animal para efectuar los linfocitos T citotóxicos y la respuesta inmune del antígeno antitumoral de las células asesinas naturales y se regula utilizando FK506 dimérico y análogos de FK506 dimérico. El ARNm de la célula tumoral puede ser, por ejemplo, ARNm de una célula tumoral de próstata.

En algunas realizaciones, la célula transducida puede cargarse pulsando con lisados de células tumorales. Las células transducidas pulsadas se administran a un animal para efectuar la respuesta inmune de los linfocitos T citotóxicos y del antígeno antitumoral de las células asesinas naturales y se regulan usando FK506 dimérico y análogos de FK506 dimérico. El lisado de células tumorales puede ser, por ejemplo, un lisado de células tumorales de próstata.

Respuesta de células inmunes y linfocitos T citotóxicos

Los linfocitos T pueden activarse por contacto con la célula que comprende el vector de expresión discutido en este documento, en el que la célula ha sido desafiada, transfectada, pulsada o electrofusionada con un antígeno.

Las células T expresan un receptor de unión a antígeno único en su membrana (receptor de células T), que solo puede reconocer el antígeno en asociación con moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de otras células. Hay varias poblaciones de células T, tales como las células T colaboradoras y las células T citotóxicas. Las células T colaboradoras y las células T citotóxicas se distinguen principalmente por su presentación de las glicoproteínas CD4 y CD⁸ unidas a la membrana, respectivamente. Las células T colaboradoras secretan varias linfocinas, que son cruciales para la activación de las células B, las células T citotóxicas, los macrófagos y otras células del sistema inmunológico. Por el contrario, una célula T CD⁸ sin tratamiento previo que reconoce un complejo antígeno-MHC prolifera y se diferencia en una célula efectora llamada linfocito T CD⁸ citotóxico (CTL). Los c Tl eliminan las células del cuerpo que exhiben antígenos, tales como las células infectadas por virus y las células tumorales, mediante la producción de sustancias que provocan la lisis celular.

La actividad de CTL se puede evaluar mediante los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo. Por ejemplo, los CTL se pueden evaluar en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién aisladas, en una línea celular expandida de IL-2 estimulada por fitohemaglutinina establecida a partir de PBMC (Bernard et al., AIDS, 12 (16): 2125-2139, 1998) o por células T aisladas de un sujeto previamente inmunizado y reestimuladas durante ⁶ días con CD infectadas con un vector de adenovirus que contiene antígeno usando ensayos estándar de microtoxicidad de liberación de 51Cr durante 4 horas. Un tipo de ensayo utiliza células T clonadas. Se ha probado la capacidad de las células T clonadas para mediar en la destrucción dependiente del ligando Fas y de la perforina en ensayos de citotoxicidad redirigida (Simpson et al., Gastroenterology, 115 (4): 849-855, 1998). Los linfocitos T citotóxicos clonados mostraron destrucción dependiente de Fas y de perforina. Recientemente, se ha desarrollado un ensayo de liberación de deshidrogenasa in vitro que aprovecha un nuevo sistema de amplificación fluorescente (Page, B. et al., Anticancer Res. Julio-agosto de 1998; 18 (4a ): 2313-6). Este enfoque es sensible, rápido y reproducible y puede usarse ventajosamente para la reacción de linfocitos mixtos (MLR). Puede automatizarse aún más fácilmente para pruebas de citotoxicidad a gran escala utilizando la integridad de la membrana celular y, por lo tanto, así se considera. En otro ensayo fluorométrico desarrollado para detectar citotoxicidad mediada por células, el fluoróforo utilizado es la molécula no tóxica AlamarBlue (Nociari et al., J. Immunol. Methods, 213 (2): 157-167, 1998). Se inactiva la fluorescencia de AlamarBlue (es decir, rendimiento bajo de cuantos) hasta que se produce la reducción mitocondrial, que luego da como resultado un aumento dramático en la intensidad de fluorescencia de AlamarBlue (es decir, aumento en el rendimiento de cuantos). Se informa que este ensayo es extremadamente sensible, específico y requiere un número significativamente menor de células efectoras que el ensayo estándar de liberación de ⁵¹Cr.

Otras células inmunes que pueden inducirse mediante los presentes métodos incluyen las células asesinas naturales (NK). Las NK son células linfoides que carecen de receptores específicos de antígeno y forman parte del sistema inmunológico innato. Por lo general, las células infectadas suelen ser destruidas por las células T alertadas por partículas extrañas unidas al MHC de la superficie celular. Sin embargo, las células infectadas por virus señalan la infección al expresar proteínas virales que son reconocidas por anticuerpos. Estas células pueden ser destruidas por las NK. En las células tumorales, si las células tumorales pierden la expresión de las moléculas del MHC clase I, entonces pueden ser susceptibles a las NK.

Formulaciones y rutas de administración a pacientes

Cuando se contemplen aplicaciones clínicas, será necesario preparar composiciones farmacéuticas (constructos de expresión, vectores de expresión, proteínas fusionadas, células transducidas, células T activadas, células T transducidas y cargadas) en una forma apropiada para la aplicación pretendida. Generalmente, esto implicará preparar composiciones que estén esencialmente libres de pirógenos, así como de otras impurezas que podrían ser dañinas para humanos o animales.

El ligando multimérico, tal como, por ejemplo, AP1903, puede administrarse, por ejemplo, a dosis de aproximadamente 0.011 a 1 mg/kg de peso del sujeto, de aproximadamente 0.015 a 0.5 mg/kg de peso del sujeto, de 0.1 a 2 mg/kg de peso del sujeto, de aproximadamente 0.015 a ^{1 . 0} mg/kg de peso del sujeto, de aproximadamente ^{0 .1} a 5 mg/kg de peso del sujeto, de aproximadamente 0.2 a 4 mg/kg de peso del sujeto, de aproximadamente 0.3 a 3 mg/kg de peso del sujeto, de aproximadamente 0.3 a 2 mg/kg de peso del sujeto, o aproximadamente de 0.3 a 1 mg/kg de peso del sujeto, por ejemplo, aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, ⁶ , 7, ⁸ , 9 o 10 mg/kg de peso del sujeto. En algunas realizaciones, el ligando se proporciona a razón de 0.4 mg/kg por dosis, por ejemplo, a una concentración de 5 mg/ml. Pueden proporcionarse viales u otros recipientes que contengan el ligando en, por ejemplo, un volumen por vial de aproximadamente 0.25 ml a aproximadamente 10 ml, por ejemplo, aproximadamente 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, ⁶ , 6.5, 7, 7.5, ⁸ , 8.5, 9, 9.5 o 10 ml, por ejemplo, aproximadamente ² ml.

En general, se puede desear emplear sales y tampones apropiados para hacer que los vectores de administración sean estables y permitan la absorción por las células diana. También se pueden emplear tampones cuando se introducen células recombinantes en un paciente. Las composiciones acuosas comprenden una cantidad eficaz del vector para las células, disuelto o disperso en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones también se denominan inóculos. La frase "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran a un animal o un ser humano. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. Se conoce el uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los vectores o células, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar a las composiciones ingredientes activos suplementarios.

Las composiciones activas pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de estas composiciones se realizará a través de cualquier ruta común siempre que el tejido diana esté disponible a través de esa ruta. Esto incluye, por ejemplo, oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. Alternativamente, la administración puede ser por inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Tales composiciones normalmente se administrarían como composiciones farmacéuticamente aceptables, discutidas en este documento.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma es estéril y es fluida en la medida en que sea fácil de inyectar. Es estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conserva frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En ciertos ejemplos, se pueden incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para la administración oral, las composiciones pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de enjuagues bucales y dentífricos no ingeribles. Se puede preparar un enjuague bucal incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado, tal como una solución de borato de sodio (solución de Dobell). Alternativamente, el ingrediente activo puede incorporarse en un lavado antiséptico que contenga borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio. El ingrediente activo también se puede dispersar en dentífricos, que incluyen, por ejemplo: geles, pastas, polvos y lechadas. El ingrediente activo se puede añadir en una cantidad terapéuticamente eficaz a un dentífrico en pasta que puede incluir, por ejemplo, agua, aglutinantes, abrasivos, agentes saborizantes, agentes espumantes y humectantes.

Las composiciones se pueden formular en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares. Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución puede tamponarse de manera adecuada si es necesario y el diluyente líquido primero se vuelve isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, se pueden emplear medios acuosos estériles. Por ejemplo, una dosis podría disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y agregarse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el lugar de infusión propuesto (vease, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" decimo quinta edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente se producirá alguna variación en la dosificación dependiendo del estado del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para la administración humana, las preparaciones pueden cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad y seguridad general y pureza, según lo exigen los estándares de la Oficina de Productos Biológicos de la FDA.

El programa de administración puede determinarse según sea apropiado para el paciente y puede, por ejemplo, comprender un programa de dosificación en el que el ácido nucleico se administra en la semana ⁰ , seguido de inducción mediante la administración del inductor químico de dimerización, seguido de la administración de inductor adicional cuando se necesite para obtener un resultado terapéutico eficaz o, por ejemplo, en intervalos de 2, 4, ⁶ , ⁸ , 10, 12, 14, 16, 18, 20 a partir de entonces para un total de, por ejemplo, 2, 4, ⁶ , ⁸ , 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 o 30, 40, 50, 60, 70, ^{8 0} , 90 o 100 semanas.

El programa de administración puede determinarse según sea apropiado para el paciente y puede, por ejemplo, comprender un programa de dosificación en el que la célula T transducida con ácido nucleico u otra célula se administra en la semana ⁰ , seguida de inducción mediante la administración del inductor químico de dimerización, seguido de la administración de inductor adicional cuando sea necesario para obtener un resultado terapéutico eficaz o, por ejemplo, en intervalos de 2, 4, ⁶ , ⁸ , 10, 12, 14, 16, 18, 20 a partir de entonces para un total de, por ejemplo, 2, 4, ⁶ , ⁸ , 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 o 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 semanas.

Si es necesario, el método puede incluir además leucaféresis adicional para obtener más células que se utilizarán en el tratamiento.

Métodos para tratar una enfermedad

Los métodos divulgados también abarcan métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad causada por una enfermedad hiperproliferativa.

Los estados preneoplásicos o hiperplásicos que pueden tratarse o prevenirse usando la composición farmacéutica (células T transducidas, vector de expresión, constructo de expresión, etc.) incluyen, entre otros, estados preneoplásicos o hiperplásicos tales como pólipos de colon, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lesiones de mama y similares.

Los cánceres, incluidos los tumores sólidos, que pueden tratarse usando la composición farmacéutica incluyen, pero no se limitan a, melanoma primario o metastásico, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células adenoescamosas, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias, cáncer de útero, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de colon, mieloma múltiple, neuroblastoma, NPC, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino y similares.

Otras enfermedades hiperproliferativas, incluidos los tumores sólidos, que pueden tratarse usando las células T y otro sistema de activación de células terapéuticas presentado en este documento incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, osteoartritis, leiomiomas, adenomas, lipomas, hemangiomas, fibromas, oclusión vascular, reestenosis, aterosclerosis, lesiones preneoplásicas (tales como hiperplasia adenomatosa y neoplasia intraepitelial prostática), carcinoma in situ, leucoplaquia pilosa oral o psoriasis.

La administración de la composición farmacéutica (constructo de expresión, vector de expresión, proteína fusionada, células transducidas y células T activadas, células T transducidas y cargadas) puede ser con fines "profilácticos" o "terapéuticos". Cuando se proporciona de forma profiláctica, la composición farmacéutica se proporciona antes de cualquier síntoma. La administración profiláctica de la composición farmacéutica sirve para prevenir o mejorar cualquier infección o enfermedad posterior. Cuando se proporciona terapéuticamente, la composición farmacéutica se proporciona en o después del inicio de un síntoma de infección o enfermedad. Por lo tanto, las composiciones aquí presentadas en este documento pueden proporcionarse antes de la exposición anticipada a un agente causante de enfermedad o estado patológico o después del inicio de la infección o enfermedad. Por lo tanto, se divulgan en el presente documento métodos para el tratamiento profiláctico de tumores sólidos tales como los que se encuentran en el cáncer, o por ejemplo, pero sin limitarse a, cáncer de próstata, usando los ácidos nucleicos y las células discutidas en el presente documento. Por ejemplo, se describen métodos para prevenir o reducir profilácticamente el tamaño de un tumor en un sujeto, que comprenden la administración de los ácidos nucleicos o las células discutidas en este documento, por lo que los ácidos nucleicos o las células se administran en una cantidad eficaz para prevenir o reducir el tamaño de un tumor en un sujeto.

Los tumores sólidos de cualquier tejido u órgano pueden tratarse usando los métodos descritos, incluyendo, por ejemplo, cualquier tumor que exprese PSA, por ejemplo, PSMA, en la vasculatura, por ejemplo, tumores sólidos presentes en, por ejemplo, pulmones, huesos, hígado, próstata o cerebro, y también, por ejemplo, en mama, ovario, intestino, testículos, colon, páncreas, riñón, vejiga, sistema neuroendocrino, tejido blando, masa ósea y sistema linfático. Otros tumores sólidos que pueden tratarse incluyen, por ejemplo, glioblastoma y mieloma maligno.

El término "dosis unitaria" en lo que respecta al inóculo se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de composición farmacéutica calculada para producir el efecto inmunogénico deseado en asociación con el diluyente requerido. Las especificaciones para la dosis unitaria de un inóculo están dictadas y dependen de las características únicas de la composición farmacéutica y del efecto inmunológico particular que se desea lograr.

Una cantidad eficaz de la composición farmacéutica sería la cantidad que logra este resultado seleccionado de potenciar la respuesta inmune, y tal cantidad podría determinarse. Por ejemplo, una cantidad eficaz para tratar una deficiencia del sistema inmunológico podría ser la cantidad necesaria para provocar la activación del sistema inmunológico, dando como resultado el desarrollo de una respuesta inmunitaria específica de antígeno tras la exposición al antígeno. El término también es sinónimo de "cantidad suficiente".

La cantidad eficaz para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o afección que se está tratando, la composición particular que se administra, el tamaño del sujeto y/o la gravedad de la enfermedad o afección. Se puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de una composición particular presentada en este documento sin necesidad de una experimentación indebida. Por lo tanto, por ejemplo, en un ejemplo, las células T transducidas u otras células se administran a un sujeto en una cantidad eficaz para, por ejemplo, inducir una respuesta inmune o, por ejemplo, para reducir el tamaño de un tumor o reducir el cantidad de vasculatura tumoral.

A. Terapias de base genética

En determinadas realizaciones, se proporciona a una célula un constructo de expresión capaz de proporcionar un polipéptido TCR recombinante, tal como los polipéptidos TCR de Bob1, en una célula T. La extensa discusión de los vectores de expresión y los elementos genéticos empleados en ellos se incorporan en esta sección como referencia. En ciertos ejemplos, los vectores de expresión pueden ser vectores virales, tales como adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus vacuna, lentivirus y retrovirus. En otro ejemplo, el vector puede ser un vector de expresión encapsulado en lisosoma.

El suministro de genes se puede realizar tanto en situaciones in vivo como ex vivo. Para los vectores virales, generalmente se preparará una reserva de vector viral. En la presente solicitud se presentan ejemplos de administración de genes mediada por vectores virales ex vivo e in vivo. Para la administración in vivo, dependiendo del tipo de virus y el título alcanzable, se administrará, por ejemplo, aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ o 9 * 104, 1,2, 3, 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ o 9 * 105, 1, 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ o 9 * 106, 1, 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ o 9 * 107, 1, 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ o 9 * 108, 1, 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ o 9 * 109, 1, 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ o 9 * 1010, 1, 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ o 9 * 10¹¹ o 1, 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ o 9 * 10¹² partículas infecciosas al paciente. Se pueden extrapolar cifras similares para formulaciones liposomales u otras formulaciones no virales comparando las eficiencias relativas de absorción. La formulación como una composición farmacéuticamente aceptable se discute a continuación. El ligando multimérico, tal como, por ejemplo, AP1903, puede administrarse, por ejemplo, a dosis de aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, ⁶ , 7, ⁸ , 9 o 10 mg/kg de peso del sujeto.

B. Terapia basada en células

Otra terapia que se contempla es la administración de células T modificadas, tales como, por ejemplo, la administración de células T transducidas. Las células T pueden modificarse in vitro. En este documento se analiza la formulación como una composición farmacéuticamente aceptable.

En terapias basadas en células, las células modificadas pueden, por ejemplo, transducirse con vectores retrovirales o lentivirales que codifican ácidos nucleicos de antígenos diana o transfectarse con ácidos nucleicos de antígenos diana, tales como ARNm o ADN o proteínas; pulsarse con lisados celulares, proteínas o ácidos nucleicos; o electrofusionarse con células. Las células, proteínas, lisados celulares o ácido nucleico pueden derivarse de células, tales como células tumorales u otros microorganismos patógenos, por ejemplo, virus, bacterias, protozoos, etc.

C. Terapias de combinación

Para aumentar la eficacia de los vectores de expresión presentados en este documento, puede ser deseable combinar estas composiciones y métodos con un agente eficaz en el tratamiento de la enfermedad.

En ciertas divulgaciones, se pueden usar agentes anticancerígenos en combinación con los presentes métodos. Un agente "anticancerígeno" es capaz de afectar negativamente al cáncer en un sujeto, por ejemplo, al matar una o más células cancerosas, inducir apoptosis en una o más células cancerosas, reducir la tasa de crecimiento de una o más células cancerosas, reducir la incidencia o número de metástasis, reducir el tamaño de un tumor, inhibir el crecimiento de un tumor, reducir el suministro de sangre a un tumor o una o más células cancerosas, promover una respuesta inmune contra una o más células cancerosas o un tumor, prevenir o inhibir la progresión de un cáncer, o aumentar la esperanza de vida de un sujeto con cáncer. Los agentes contra el cáncer incluyen, por ejemplo, agentes de quimioterapia (quimioterapia), agentes de radioterapia (radioterapia), un procedimiento quirúrgico (cirugía), agentes de inmunoterapia (inmunoterapia), agentes de terapia genética (terapia génica), terapia hormonal, otros agentes biológicos (bioterapia) y/o terapias alternativas.

En realizaciones adicionales, se pueden usar antibióticos en combinación con la composición farmacéutica para tratar y/o prevenir una enfermedad infecciosa. Dichos antibióticos incluyen, entre otros, amikacina, aminoglucósidos (por ejemplo, gentamicina), amoxicilina, anfotericina B, ampicilina, antimoniales, atovacuona, estibogluconato sódico, azitromicina, capreomicina, cefotaxima, cefoxitina, ceftriaxona, cloranfenicol, claritromicina, clindamicina, clofazimina cicloserina, dapsona, doxiciclina, etambutol, etionamida, fluconazol, fluoroquinolonas, isoniazida, itraconazol, kanamicina, ketoconazol, minociclina, ofloxacina), ácido para-aminosalicílico, pentamidina, polimixin defensinas protionamida, pirazinamida, pirimetamina sulfadiazina quinolonas (por ejemplo, ciprofloxacina) rifabutina, rifampina, esparfloxacina, estreptomicina, sulfonamidas, tetraciclinas, tiacetazona, trimetaprim-sulfametoxazol, viomicina o combinaciones de los mismos. Más generalmente, tal agente se proporcionaría en una cantidad combinada con el vector de expresión eficaz para matar o inhibir la proliferación de una célula cancerosa y/o un microorganismo. Este proceso puede implicar poner en contacto la célula o células con un agente o agentes y la composición farmacéutica al mismo tiempo o dentro de un período de tiempo en el que la administración separada de la composición farmacéutica y un agente a una célula, tejido u organismo produce un deseado beneficio terapéutico. Esto se puede lograr poniendo en contacto la célula, tejido u organismo con una única composición o formulación farmacológica que incluya tanto la composición farmacéutica como uno o más agentes, o poniendo en contacto la célula con dos o más composiciones o formulaciones distintas, en las que una composición incluye la composición farmacéutica y el otro incluye uno o más agentes.

Los términos "contactado" y "expuesto", cuando se aplican a una célula, tejido u organismo, se utilizan en este documento para describir el proceso mediante el cual se administra la composición farmacéutica y/u otro agente, como por ejemplo un agente quimioterapéutico o radioterapéutico a una célula, tejido u organismo diana o se colocan en yuxtaposición directa con la célula, tejido u organismo diana. Para lograr la muerte o estasis celular, la composición farmacéutica y/o el agente o agentes adicionales se administran a una o más células en una cantidad combinada eficaz para matar la célula o células o evitar que se dividan.

La administración de la composición farmacéutica puede preceder, ser concurrente con y/o seguir al otro agente u agentes en intervalos que varían de minutos a semanas. En los ejemplos en los que la composición farmacéutica y otro agente o agentes se aplican por separado a una célula, tejido u organismo, generalmente se aseguraría que no expira un período de tiempo significativo entre los tiempos de cada administración, de modo que la composición farmacéutica y el agente o agentes aún podrían ejercer un efecto combinado ventajoso sobre la célula, tejido u organismo. Por ejemplo, en tales casos, se contempla que se pueda poner en contacto la célula, tejido u organismo con dos, tres, cuatro o más modalidades sustancialmente simultáneamente (es decir, en menos de aproximadamente un minuto) con la composición farmacéutica. En otros aspectos, se pueden administrar uno o más agentes dentro de sustancialmente simultáneamente, aproximadamente 1 minuto, a aproximadamente 24 horas, a aproximadamente 7 días a aproximadamente ¹ a aproximadamente ⁸ semanas o más, y cualquier intervalo derivable del mismo, antes y/o después de administrar el vector de expresión. Además, se pueden emplear varios regímenes de combinación de la composición farmacéutica presentada en este documento y uno o más agentes.

En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico puede ser un compuesto quimioterapéutico que agota los linfoides. En otros ejemplos, el agente quimioterapéutico puede ser Taxotere (docetaxel) u otro taxano, tal como, por ejemplo, cabazitaxel. El agente quimioterapéutico se puede administrar antes, durante o después del tratamiento con las células y el inductor. Por ejemplo, el agente quimioterapéutico se puede administrar aproximadamente 1 año, 11, 10, 9, ⁸ , 7, ⁶ , 5 o 4 meses, o 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, ⁸ , 7, ⁶ , 5, 4, 3, 2, semanas o 1 semana antes de administrar la primera dosis de ácido nucleico activado. O, por ejemplo, el agente quimioterapéutico se puede administrar aproximadamente 1 semana o 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 semanas o 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ , 9, 10 o 11 meses o 1 año después de administrar la primera dosis de células o inductor.

La administración de un agente quimioterapéutico puede comprender la administración de más de un agente quimioterapéutico. Por ejemplo, el cisplatino se puede administrar además de Taxotere u otro taxano, como, por ejemplo, cabazitaxel.

Los métodos que se describen en el presente documento incluyen, sin limitación, el suministro de una cantidad eficaz de una célula activada, un ácido nucleico o un constructo de expresión que lo codifique. Una "cantidad eficaz" de la composición farmacéutica, generalmente, se define como la cantidad suficiente para lograr de forma detectable y repetida el resultado deseado indicado, por ejemplo, para mejorar, reducir, minimizar o limitar la extensión de la enfermedad o sus síntomas. Pueden aplicarse otras definiciones más rigurosas, incluida la eliminación, erradicación o curación de enfermedades. En algunas realizaciones, puede haber una etapa de seguimiento de los biomarcadores para evaluar la eficacia del tratamiento y controlar la toxicidad.

Un médico puede determinar una cantidad eficaz de la célula modificada, considerando al paciente individual. Los factores a considerar pueden incluir, por ejemplo, la extensión de la enfermedad o afección, el tamaño del tumor, la extensión de la infección, la metástasis, la edad y el peso. La dosis y el número de administraciones pueden ser determinados por el médico u otro especialista, controlando al paciente en busca de síntomas de enfermedad o afección, y de las respuestas a dosis anteriores, por ejemplo, controlando el tamaño del tumor o el nivel o concentración de antígeno tumoral. En ciertos ejemplos, las células modificadas se pueden administrar en una dosis de ^{1 0 4} a ^{1 0 9} células modificadas/kg de peso corporal, ^{1 0 5} a ^{1 0}6, ^{1 0 9}-^{1 0}11, o ^{1 0 10}- ^{1 0 11} células modificadas/kg de peso corporal.

Ejemplos

Los ejemplos que se exponen a continuación ilustran determinadas realizaciones y no limitan la tecnología.

Ejemplo 1: Materiales y métodos

Aislamiento de clones de células T específicas de Bob1 usando el tetrámero de pMHC

Las células T que se unen al tetrámero de pMHC que contienen péptidos Bob1 se aislaron de PBMC criopreservadas de individuos sanos negativos para HLA-A*02:01 y HLA-B*07:02 siguiendo esencialmente el protocolo proporcionado en (1). Se incubaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con tetrámeros de pMHC marcados con PE durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron dos veces y se incubaron con microperlas magnéticas anti-PE (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Las células marcadas con PE se aislaron mediante MACS en una columna LS (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para obtener clones de linfocitos T específicos de Bob1, las fracciones positivas se clasificaron mediante tinción con tetrámeros de pMHC marcados con PE que contienen péptidos Bob1 y un anticuerpo contra CD⁸ (Invitrogen/Caltag, Buckingham, RU) combinado con anticuerpos contra CD4, CD14 y CD19 (BD Pharmingen, San José, CA, EE. UU.). Las células se tiñeron primero con tetrámeros de pMHC marcados con PE durante 1 ha 4 °C antes de que se añadieran los anticuerpos durante 15 min más a 4 ° C. Se clasificaron células T CD⁸ con tetrámero de pMHC+ individuales en placas de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos que contenían 5 x 10⁴ PBMC alogénicas irradiadas en 100 j l de medio de células T suplementado con 0.8 |jg/ml de PHA. La clasificación de células se realizó en un FACSAria III (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.). Dos semanas después de la expansión, los clones se seleccionaron para determinar la reactividad específica del péptido midiendo la producción de GM-CSF e IFN-y después de la estimulación.

Análisis funcional

Las células estimuladoras se sometieron a pulsos de péptidos a diversas concentraciones de péptidos durante 30 min a 37 °C. Las células T respondedoras y las células estimuladoras no cargadas o pulsadas con péptidos se incubaron conjuntamente a diversas proporciones de respondedor con respecto a estimulador. Después de 18 h de incubación conjunta, se recogieron los sobrenadantes y se midió la producción de IFN-y mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, Sanquin Reagents, Ámsterdam, Países Bajos). Además, las células T respondedoras se estimularon con diferentes neoplasias malignas de células B primarias y diferentes subconjuntos de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas. La leucemia linfocítica crónica (CLL), la leucemia linfoblástica aguda (ALL), el linfoma de células del manto (MCL) y el mieloma múltiple (MM) primarios positivos para HLA-A*0201 y HLA-B*0702 se clasificaron por FACS con base en su fenotipo maligno de PBMC criopreservadas de pacientes positivos para HLA-A*02:01 y HLA-B*07:02 en el momento del diagnóstico y se utilizaron poblaciones altamente purificadas (> 99%) en el ensayo de estimulación. Se purificaron subconjuntos de células hematopoyéticas primarias a partir de PBMC criopreservadas de donantes sanos positivos para HLA-A*02:01 y B*07:02 utilizando microperlas magnéticas anti-CD4, anti-CD14, anti-CD19 o anti-CD34 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La pureza de las células aisladas se evaluó usando análisis FACS y las células solo se usaron en experimentos si la pureza excedía el 95%. Las células dendríticas (DC) inmaduras y maduras se diferenciaron in vitro de las poblaciones de células CD14+ aisladas como se describió anteriormente (2). Se generaron células T CD4+ activadas estimulando células T CD4+ purificadas con PBMC irradiadas (35 Gy) en una proporción de 1:5 en medio de células T suplementado con 0.8 jg/m l de fitohemaglutinina (PHA, Remel, Lenexa, KS, EE. UU.) durante 10 días. Se generaron células B CD19+ activadas mediante el cocultivo de células CD19+ en fibroblastos de ratón irradiados (70 Gy) transducidos con CD40L durante 7 días en IMDM suplementado con 2 ng/ml de IL-4 (Schering-Plough, Kenilworth, NJ, EE. UU.) y suero humano al 10%. Las células K562 que expresan HLA-A2 (K562-A2) se describieron previamente (3). Las células K562 que expresan HLA-B7 (K562-B7) se generaron mediante transducción retroviral con HLA-B7. Los fibroblastos se aislaron y cultivaron como se describió previamente (2). Los fibroblastos se cultivaron en presencia o ausencia de 200 IU/ml de IFN-y durante cuatro días.

Construcción de vectores retrovirales que codifican Bob1 o que codifican Bob1-TCR y generación de sobrenadante retroviral

El gen POU2AF1 que codifica la proteína Bob1 se optimizó por codones (GeneArt, Life Technologies) y se expresó en una cadena principal retroviral MP71 en combinación con NGF-R (véase Ruggieri L et al., Hum Gene Ther. 1997; ⁸ : 1611-1623).

A partir de los clones de células T específicas de Bob1, se purificó el ARNm y se sintetizó el ADNc usando oligos específicos de la región constante de TCRa y TCRp. Mediante cambio de plantilla, se ancló un oligo a cada extremo del ADNc 5', lo que permitió la posterior amplificación independiente del gen V de TCR de los transcritos de TCRa y TCRp. Los productos de PCR de clones de células T individuales se codificaron con barras, se agruparon y se generaron lecturas de longitud completa en un único procedimiento de NGS PacBio. Las secuencias de cadena de Bob1-TCRa y TCRp modificadas con cisteína optimizadas con codones se clonaron en un constructo retroviral MP71, unidas por una secuencia 2A y acopladas al receptor del factor de crecimiento nervioso truncado (NGF-R) por la secuencia de entrada ribosómica interna (secuencia IRES), lo que resultó en la expresión estequiométrica concordante de ambas cadenas TCRap y NGF-R. La modificación de la cisteína de Bob1-TCR se realizó mediante la introducción de un residuo de cisteína en los dominios constantes de las cadenas a y p de TCR en las posiciones 48 y 57, respectivamente. La optimización de codones (CO) de Bob1-TCR fue realizada por GENESCRIPT®. La misma cadena principal del vector retroviral MP71 que codifica HA1-TCR se utiliza en nuestro reciente estudio clínico (4).

Para la producción de retrovirus, las células Phoenix-A se sembraron a razón de 4 * 10⁴ células/cm² en matraces T25. Después de 24 h, las células se transfectaron con 4 jg de ADN de vector retroviral y 2 jg de ADN de vector M57 usando reactivo de transfección Fugene HD (Roche, Basilea, Suiza). El sobrenadante que contenía partículas retrovirales se recogió a las 48 h y 72 h después de la transfección y se almacenó a -80 °C.

Para la transducción, se cargó el sobrenadante retroviral en placas de 24 pocillos tratadas sin cultivo de tejido que se habían recubierto con 30 jg/ml de retronectina (Takara, Shiga, Japón) y se bloquearon con albúmina de suero humano al 2% (Sanquin Reagents). El sobrenadante viral se centrifugó a 2.000 g durante 20 min a 4 °C. Se añadieron 1 * 10⁵ -3 * 10⁵ células al sobrenadante retroviral y se incubaron durante 18 h. Se obtuvieron poblaciones de células K562-A2 y K562-B7 transducidas con Bob1 en masa de alta pureza clasificando las células teñidas con un anticuerpo contra NGF-R. Se analizaron las células T CD⁸ + transducidas con Bob1-TCR para determinar la tinción del tetrámero y la actividad funcional sin clasificación adicional.

Líneas celulares

Las líneas celulares de mieloma múltiple UM9 y U266, B-LCL-JY y dos líneas celulares de ALL, ALL-BV y ALL-VG, como se describe en este documento, pueden usarse para determinar si las células modificadas reaccionan contra Bob1 en ensayos de secreción de citocinas y ensayos de citotoxicidad.

Las células se mantienen en IMDM completo (Sigma, St Louis, MO) que contiene suero bovino fetal al 10% (Hyclone, Waltham, MA) y L-glutamina 2 mM en una atmósfera humidificada que contiene dióxido de carbono (CO2) al 5% a 37 °C. Las células T transducidas con Bob1-TCR y los blastos de PHA se mantienen en medio Cellgenix DC (Cellgenix) suplementado con 100 U/ml de IL-2 (Cellgenix)

Activación de células T

La activación de las células T para la expansión y transducción se realiza utilizando aCD3 y aCD28 solubles (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Las PBMC se resuspenden en medio Cellgenix DC suplementado con 100 U/ml de IL-2 (Cellgenix) a razón de 1 * 10⁶ células/ml y estimuladas con 0.2 pg/ml de anticuerpo soluble aCD3 y 0.5 pg/ml de anticuerpo soluble aCD28. A continuación, las células se cultivan a 37 °C, CO2 al 5% durante 4 días. El día cuatro, se agrega 1 ml de medio fresco que contiene IL-2. El día 7, las células se recogen y se resuspenden en medio Cellgenix DC para la transducción.

Listado de referencias

1. Hombrink, P., C. Hassan, M.G. Kester, A.H. de Ru, C.A. van Bergen, H. Nijveen, J.W. Drijfhout, J.H. Falkenburg, M.H. Heemskerk, y P.A. van Veelen. 2013. Discovery of T cell epitopes implementing HLA-peptidomics into a reverse immunology approach. J. Immunol. 190: 3869-3877.

2. Amir, A.L., D.M. van der Steen, M.M. van Loenen, R.S. Hagedoorn, B.R. de, M.D. Kester, A.H. de Ru, G.J. Lugthart, K.C. van, P.S. Hiemstra, I. Jedema, M. Griffioen, P.A. van Veelen, J.H. Falkenburg, y M.H. Heemskerk. 2011. PRAME-specific Allo-HLA-restricted T cells with potent antitumor reactivity useful for therapeutic T-cell receptor gene transfer. Clin. Cancer Res. 17: 5615-5625.

3. Heemskerk, M.H., R.A. de Paus, E.G. Lurvink, F. Koning, A. Mulder, R. Willemze, J.J. van Rood, y J.H. Falkenburg.

2001. Dual HLA class I and class II restricted recognition of alloreactive T lymphocytes mediated by a single T cell receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 98: 6806-6811.

4. van Loenen, M.M., B.R. de, L.E. van, P. Meij, I. Jedema, J.H. Falkenburg, y M.H. Heemskerk. 2014. A Good Manufacturing Practice procedure to engineer donor virus-specific T cells into potent anti-leukemic effector cells. Haematologica 99: 759-768.

Ejemplo 2: Aislamiento de TCR específicos de Bob1 de alta afinidad del repertorio de alo-HLA

El aislamiento de células T de alta avidez específicas para autoantígenos no polimórficos asociados a tumores o específicos de tejido es un desafío debido a la autotolerancia. Las células T que exhiben una gran avidez por los autoantígenos presentados por el auto-HLA se eliminan mediante selección negativa durante el desarrollo tímico para prevenir la autoinmunidad. Como la inducción de tolerancia requiere la presentación de un autopolipéptido dado por auto-HLA, cualquier polipéptido es un inmunógeno potencial cuando se presenta en el contexto de una molécula de HLA extraña. Por lo tanto, un complejo de una molécula de HLA común y un polipéptido derivado de una proteína con expresión específica de tumor o restringida por tipo celular podría ser una diana terapéutica útil compartida por muchos individuos. Los presentes ejemplos proporcionan una estrategia que permite el aislamiento de células T específicas de antígeno del repertorio alo-HLA.

El locus del gen Bob1 (POU2AF1) es una diana de amplificación en el mieloma múltiple, que proporciona beneficios para el crecimiento y la supervivencia. El direccionamiento a un gen esencial para la proliferación maligna podría prevenir la aparición de variantes de escape. En los siguientes ejemplos se desarrolla un protocolo para identificar TCR de alta afinidad de relevancia terapéutica dirigidos a antígenos específicos de células B. El uso de un Bob1-TCR podría ampliar la aplicación de inmunoterapias dirigidas al mieloma múltiple, así como a otras neoplasias malignas de células B malignas.

Un conjunto de 15.000 polipéptidos eluidos presentes en una base de datos de elución de polipéptidos HLA, derivados de 4 EBV-LCL de tipo HLA diferentes, se combinó con un sistema de análisis de expresión de microarreglos establecido recientemente para generar un conjunto de epítopos específicos de células B genuinos derivados de ambas proteínas extracelulares e intracelulares, y se seleccionaron los 18 principales candidatos de unión a HLA-A* 02:01 y B*07:02 de alta afinidad para una evaluación adicional. En la Figura 3 se muestra el análisis de microarreglos de una proteína extracelular representativa (CD19) y una proteína intracelular (Bob1). Análisis de microarreglos de subconjuntos de células hematopoyéticas malignas y no malignas altamente purificadas, así como células no hematopoyéticas sanas. Figura 3 (izquierda) Matriz de expresión HT-12 de Illumina del gen POU2AF1 que codifica el factor de transcripción Bob1. Figura 3 (derecha) Matriz de expresión HT-12 de Illumina de CD19.

El conjunto de epítopos específicos de células B incluía 4 epítopos derivados de Bob1, 3 de unión a HLA-B*0702 y 1 de unión a HLA-A*0201 (Tabla 1).

Tabla 1. Secuencias y propiedades de péptidos derivados de BOB1.

Secuencia del péptido Restricción de HLA afinidad de netMHC (nM)

BOB1245 YALNHTLSV A*0201 15

BOB¹¹⁹⁷ APALPGPQF B*0702 23

BOB144 APAPTAVVL B*0702 15

BOB114 APARPYQGV B*0702 49

* servidor netMHC 3.4

El conjunto de polipéptidos se utilizó por primera vez para la generación de tetrámeros de HLA mediante tecnología de intercambio mediada por UV. Se incubaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (0.5-1 * 10⁹ células) de seis donantes sanos diferentes negativos para HLA-A*02:01 y B*07:02 con la mezcla de tetrámeros de HLA, y mediante clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) se aislaron las células T positivas para el tetrámero de HLA. Posteriormente, se generaron miles de clones de células T clasificando las células T positivas para el tetrámero de HLA mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de una sola célula por pocillo.

Mediante un método de alto rendimiento, se analizaron aproximadamente 5000 clones de células T en expansión para determinar la reactividad del polipéptido específico de células B estimulando todos los clones de células T con K562-A2 sin cargar o cargado con la mezcla de polipéptidos de unión A2 y K562-B7 sin cargar o cargado con mezcla de polipéptidos de unión a B7. Se seleccionaron y congelaron todos los clones de células T que exhibieron un patrón de reactividad específico de polipéptido, ya sea reactivo contra el polipéptido cargado K562-A2 o el polipéptido cargado K562-B7, y no reactivo contra K562-A2/B7 no cargado (Figura 4A). De los 5000 clones de células T en expansión, aproximadamente 350 clones exhibieron un patrón de reconocimiento específico de polipéptido, y se demostró una alta diversidad en el repertorio de TCR de estos clones seleccionados de células T positivos para el tetrámero de HLA. Los otros 4650 clones de células T no fueron reactivos o demostraron un reconocimiento independiente del polipéptido de K562-A2 o K562-B7 (Figura 4B). Dentro del grupo de 350 clones de células T restringidos por alo-HLA, se identificaron clones de células T específicos de polipéptido para casi todos los polipéptidos específicos de linaje B. El número de clones de células T diferentes contra un polipéptido específico varió desde dos clones de células T específicos para uno de los polipéptidos de unión de HLA-B*07:02 hasta 217 clones de células T específicos para un polipéptido de unión a HLA-A*02:01.

Dentro del grupo de clones de células T, se identificaron clones de células T de alta avidez que estaban dirigidos contra dos epítopos diferentes derivados del factor de transcripción expresado intracelular Bob1, que está codificado por el gen POU2AF1. Los clones de células T derivados de 4 individuos sanos diferentes y con un repertorio diverso de TCRap se probaron contra K562-A2 cargados con concentraciones tituladas de polipéptido Bob1. Se identificaron clones de células T con avidez variable que estaban dirigidos contra el epítopo de HLA-A*0201 YALNHTLSV de Bob1 (Figura 5A). Los siete clones de células T positivos para el tetrámero Bob1 se probaron contra K562-A2, K562-B7 sin cargar o cargado con polipéptido Bob1 y tres EBV-Lc L positivos para HLA-A*0201 (JY-EBV, HHC-EBV y ALY-EBV). Los clones de alta avidez 3C10 y 7D1 ejercieron reactividad específica contra los EBV-LCL que presentan endógenamente el Bob1 en el contexto de HLA-A*0201. El clon 3C10 ejerció la mayor reactividad contra los tres EBV-LCL que procesaron endógenamente y presentaron el polipéptido Bob1 en el contexto de HLA-A*0201 (Figura 5B). Este clon de células T se probó contra diferentes neoplasias malignas primarias de células B positivas para HLA-A* 0201, incluida la leucemia linfoblástica aguda (ALL), la leucemia linfoblástica crónica (CLL), el linfoma de células del manto (MCL) y el mieloma múltiple (MM). La Figura ⁶ muestra el reconocimiento de neoplasias malignas de células B por el clon 3C10. El clon 3C10 de células T específico de Bob1 restringido por HLA-A2 se probó contra leucemia linfocítica crónica (CLL) positiva para HLA-A*0201, leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma de células del manto (MCL) y mieloma múltiple (MM) primarios diferente, y EBV-LCL positivos para HLA-A*0201 como control positivo, y como control negativo K562 positivo para HLA-A*0201 que es negativo para Bob1. Diez y ocho horas después de la estimulación se midió la producción de IFN-y. Las neoplasias malignas de células B se clasificaron mediante FACS sobre la base de su fenotipo maligno y se utilizaron poblaciones altamente purificadas (> 99%) en el ensayo de estimulación. Estos resultados indican que la avidez de estos clones de células T era lo suficientemente alta como para mostrar reactividad hacia estas células malignas primarias.

A continuación, se aislaron tres clones de células T diferentes basándose en la diferencia en TCR Vp que eran específicos para el polipéptido Bob1 APAPTAVVL presentado en HLA-B*07:02. La Figura 7 evalúa si el clon reactivo con Bob1 reconoce eficazmente varias neoplasias malignas primarias de células B, con un patrón de reconocimiento específico estricto de células B. A) El clon de células T específico de Bob1 de alta avidez (4G11) se probó contra leucemia linfocítica crónica (CLL) primaria positiva para HLA-B*0702, leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma de células del manto (MCL) y mieloma múltiple, y EBV-LCL como control positivo, 18 h después de la estimulación se midió la producción de IFN-y. Las neoplasias malignas de células B se clasificaron por FACS sobre la base de su fenotipo maligno y se utilizaron poblaciones altamente purificadas (> 99%) en el ensayo de estimulación. B) El clon 4G11 se probó contra subconjuntos de células CD3+, CD14+, CD19+ y CD34+ purificadas, así como células CD3+ y células CD14+ activadas diferenciadas en DC inmaduras y maduras derivadas de 2 individuos sanos diferentes positivos para HLA-A*02. Los fibroblastos se analizaron con o sin tratamiento con IFN-y. C) Se realizó RT-PCR cuantitativa en las mismas poblaciones de células que se indica en B. Todos estos subconjuntos de células se derivan de un mínimo de 3 individuos sanos diferentes. De estos 3 clones de células T, el clon 4G11 exhibió un perfil de reactividad específico de Bob1 de alta avidez, demostrado por titulación de polipéptidos y reconocimiento de EBV-LCL positivos para HLA-B*0702. Además, el clon 4G11 ejerció una alta reactividad hacia c Ll , ALL, MCL y MM primarios positivos para HLA-B*0702 (Figura 7A). Todas las diferentes poblaciones de células malignas se clasificaron sobre la base de su fenotipo maligno, para excluir que las células B contaminantes fueran responsables de la activación de las células T. Para investigar el perfil de seguridad del clon de células T específico de Bob1, se probó el clon 4G11 frente a subconjuntos de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas sanas positivas para HLA-B*0702. Como se demuestra en la Figura 7B, el clon 4G11 no es reactivo contra los linajes de células no B sanas, que incluyen células T activadas y no activadas, monocitos, DC y células madre hematopoyéticas CD34+. Además, estuvo ausente la reactividad hacia los fibroblastos incluso en condiciones inflamadas (Figura 7B). El patrón de reconocimiento del clon 4G11 siguió estrictamente la expresión del gen Bob1 medida por RT-PCR cuantitativa (Figura 7C).

Los epítopos Bob1 que se unen a otros alelos de HLA se identifican realizando experimentos de elución adicionales. Los epítopos se confirman comparando los patrones de espectrometría de masas con los respectivos polipéptidos sintéticos (Tabla 2).

Tabla 2. Secuencias y propiedades de polipéptidos derivados de Bob1

Secuencia del

Ubicación polipéptido Restricción de HLA Afinidad netMHC (nM) Bob1 44 APAPTAVVL B*3501 196 Bob152 LPHQPLATY B*3501 ⁶ Bob1 133 YVQPVcPSY A*2902 7 Bob1 12 APAPARPYQGV 27

Bob1 168

TPAVGPPL

410

Ejemplo 3: Clonación de TCR de Bob1

Se secuenciaron los receptores de células T expresados por los clones 3C10 y 4G11. La secuencia del TCR derivada del clon 3C10 de células T de mayor avidez específica para el polipéptido Bob1 presentado en el contexto de HLA-A *0201 se presenta en la Figura ⁸. AV13-1*01 representa el polipéptido TCRa completo. BV12-4*01 representa el polipéptido TCRp completo. La secuencia del TCR derivada del clon de células T restringidas por HLA-B*0702 específico de Bob1 de alta avidez se muestra en la Figura 9. TRAV13-1*01 representa el polipéptido TCRa completo. TRBV4-1*-1 representa el polipéptido TCRp completo.

Debido a que los experimentos de clonación de células T demostraron que el clon 4G11 de células T restringida por HLA-B7 ejerce la reactividad más potente contra las neoplasias malignas de células B primarias, se construyó un vector retroviral que codificaba el TCR de 4G11 restringido por HLA-B7 específico de Bob1, y se usó para transducir células T de sangre periférica. En la Figura 10, la transferencia génica de un TCR específico de Bob1 modificado con cisteína con codón demuestra la tinción con tetrámero Bob1 específico de las células T CD⁸ + transducidas (Figura 10A) y, además, las células T transducidas ejercen un patrón de reconocimiento específico del polipéptido Bob1 (Figura 10B). Figura 10. Las células T CD⁸ + transducidas con Bob1-TCR derivadas de sangre periférica tienen un patrón de reconocimiento específico de Bob1. A) Se transdujeron células T periféricas con sobrenadante retroviral que codifica Bob1-TCR en combinación con NGFR truncado o con un sobrenadante retroviral que codifica sólo NGFR truncado (simulado) como control. Después de ⁸ días, las células T se tiñeron con anti-NGFR, anti-CD⁸ y el tetrámero de Bob1 o un tetrámero de control pp65. Las células T CD⁸ + se clasifican en un cuadrante y se muestran en los gráficos de puntos. B). Las células T transducidas se probaron contra K562 transducido con HLA-B7 (K562-B7) y K562-B7 cargado con el polipéptido Bob1. Además, las células T transducidas se probaron frente a los EBV-LCL positivos para HLA-B*0702 (JY-EBV, HHC-EBV y ALY-EBV) de los que se eluyeron los diferentes polipéptidos Bob1. Las Figuras 11a y 11b proporcionan la secuencia de un ejemplo de un vector de sitio de clonación múltiple retroviral (MP71) (SEQ ID NO: 49). El ADN que codifica TCR de Bob1 puede insertarse en aproximadamente los nucleótidos 1106 hasta 1130.

Ejemplo 4: Ejemplos de secuencias de Bob1

En el presente documento se proporcionan secuencias de aminoácidos y nucleótidos de clones TCR de Bob1.

4G11 de Bob1

SEQ ID NO: 1 a CDR3 AA

CAASKGSSNTGKLIFGQGTTLQVKP

S E Q ID NO: 2 a C D R 3 NT

TGTGCAGCAAGTAAGGGCTCTAGCAACACAGGCAAACTAATCTTTGGGCAAGGGA CAACTTTACAAGTAAAACCA SEQ ID NO: 3 a CDR3 NT de codón optimizado*

T G CGCCGCTT CT AAGGGGT C CT CT AACACCGGAAAACT GAT CTTCGGCCAGGGGA CCACACTGCAGGTGAAGCCT SEQ ID NO: 4 p CDR3 AA

CASSHGPASYEQYFGPGTRLTVT SEQ ID NO: 5 p CDR3 NT

TGCGCCAGCAGCCACGGCCCTGCTTCCTACGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCACC AGGCTCACGGTCACA SEQ ID NO: ⁶ p CDR3 NT de codón optimizado

TGCGCCTCTAGTCACGGGCCAGCCTCTTACGAGCAGTATTTTGGACCCGGCACCA GACTGACTGTGACC SEQ ID NO: 7 a VJ AA

MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQEL GKGPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAASKGSSNTGKLIFG QGTTLQVKP SEQ ID NO: ⁸ a VJ NT

AT GACATCCATT CGAGCT GT ATTT AT ATTCCT GTGGCTGCAGCT GGACTTGGT GAAT GGAGAGAATGTGGAGCAGCATCCTTCAACCCTGAGTGTCCAGGAGGGAGACAGCGCTGT T AT CAAGTGT ACTT ATTCAGACAGT GCCT CAAACT ACTT CCCTT GGT AT AAGCAAGAACTT G GAAAAGGACCT CAGCTT ATT AT AG ACATT CGTTCAAAT GT GGGCG AAAAGAAAG ACCAACG AATT GCT GTTACATT G AACAAGAC AGCCAAACATTTCTCCCTGCACAT CACAGAG ACCCAA CCTGAAG ACT CGGCT GT CT ACTTCT GT GCAGCAAGTAAGGGCT CT AGCAACACAGGCAAA CTAATCTTTGGGCAAGGGACAACTTTACAAGTAAAACCA SEQ ID NO: 9 a VJ NT de codón optimizado

AT GACAAGCAT CAGAGCCGTGTT CATTTTT CTGT GGCTGCAGCTGGAT CTGGT GAA CGGAGAGAATGTCGAACAGCATCCTTCAACTCTGAGCGTGCAGGAGGGCGATTCCGCAGT CATCAAGTGTACCT ACT CAG ACAGCGCCT CCAATT ACTTTCCTT GGT AT AAGCAGGAGCTG GGGAAAGGACCACAGCTGATCATTGATATCAGAAGCAACGTGGGCGAAAAGAAAGACCAG AGGATT GCTGT C ACACT GAAT AAGACTGCAAAACACTT CAGCCT GCAT ATT ACAGAGACT C AGCCCGAAGACTCCGCCGTGTATTTTTGCGCCGCTTCTAAGGGGTCCTCTAACACCGGAA AACTGATCTTCGGCCAGGGGACCACACTGCAGGTGAAGCCT SEQ ID NO: 10 p VDJ AA

MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQ KAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSHGPASYE QYFGPGTRLTVT SEQ ID NO: 11 p VDJ NT

ATGGGCTGCAGGCTGCTCT GCTGT GCGGTTCTCTGTCTCCT GGGAGCAGTT CCCA T AGACACTG AAGTT ACCCAG ACACCAAAAC ACCTGGTC ATGGGAATGACAAAT AAGAAGTC TTT GAAATGT GAACAACATAT GGGGCACAGGGCTAT GT ATTGGT ACAAGCAG AAAGCT AAG AAGCCACCGGAGCTCATGTTTGTCTACAGCTATGAGAAACTCTCTATAAATGAAAGTGTGC CAAGT CGCTTCT CACCTGAATGCCCCAACAGCT CT CTCTTAAACCTTCACCT AC ACGCCCT GCAGCCAGAAGACT CAGCCCT GT AT CT CTGCGCCAGCAGCCACGGCCCTGCTT CCTACGA GCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACA

S E Q ID NO: 12 p V D J N T de codón o p tim iza do

ATGGGATGTAGACTGCTGTGCTGTGCTGTGCTGTGCCTGCTGGGGGCTGTGCCTA TT G AT ACCGAAGTG ACT CAG ACTCCAAAGCACCTGGT CATGGGCAT GACCAACAAGAAAA GCCTGAAATGCGAGCAGCACATGGGGCATAGGGCCATGTACTGGTATAAGCAGAAAGCTA AGAAACCCCCT GAACT GAT GTT CGT GT ACAGCTAT GAG AAGCT GT CC AT CAAT GAAT CCGT CCCCTCTCGCTTCAGTCCCGAGTGCCCTAACAGCTCCCTGCTGAATCTGCACCTGCATGC TCTGCAGCCTGAAGACTCCGCACTGTACCTGTGCGCCTCTAGTCACGGGCCAGCCTCTTA CGAGCAGTATTTTGGACCCGGCACCAGACT GACT GT GACC

SEQ ID NO: 13 a VJ y AA constante

MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQEL GKGPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAASKGSSNTGKLIFG QGTTLQVKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRS MDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVI GFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO: 14 a VJ y AA constante (murina)

MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQEL

GKGPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAASKGSSNTGKLIFG QGTTLQVKPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKA MDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLR ILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO: 15 a VJ y NT constante

AT GACATCCATT CGAGCT GT ATTT AT ATTCCT GTGGCTGCAGCT GGACTT GGT GAAT GGAG AG AAT GT GGAGCAGC AT CCTT CAACCCT GAGT GTCCAGGAGGG AGACAGCGCT GT T AT CAAGTGT ACTT ATTCAGACAGT GCCT CAAACT ACTTCCCTT GGT AT AAGCAAGAACTT G GAAAAGGACCT CAGCTT ATT AT AG ACATT CGTTCAAAT GT GGGCG AAAAGAAAG ACCAACG AATTGCTGTTACATTGAACAAGACAGCCAAACATTTCTCCCTGCACATCACAGAGACCCAA CCTGAAG ACT CGGCT GT CT ACTTCT GT GCAGCAAGTAAGGGCT CT AGCAACACAGGCAAA CTAATCTTTGGGCAAGGGACAACTTTACAAGTAAAACCAGATATCCAGAACCCTGACCCTG CCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTT T GATT CT C AAAC AAAT GT GT CAC AAAGT AAGG ATT CT GAT GTGTATAT C AC AG AC AAAT G CG T GCT AGACAT GAGGT CT AT GGACTT CAAGAGCAACAGT G CTGT GGCCTGGAGCAACAAAT CTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCC CAGCCCAGAAAGTTCCT GT GAT GT CAAGCT GGT CGAGAAAAGCTTT GAAACAGAT ACG AA CCT AAACTTT CAAAACCT GT CAGT GATT GGGTTCCGAATCCT CCT CCT GAAAGT GGCCGGG TTTAATCT GCT CAT GACGCT GCGGTTGT GGTCCAGC

SEQ ID NO: 16 a VJ y NT constante de codón optimizado

ATGACAAGCATCAGAGCCGTGTTCATTTTTCTGTGGCTGCAGCTGGATCTGGTGAA CGG AG AGAAT GTCGAACAGCAT CCTT CAACT CT GAGCGTGCAGGAGGGCGATTCCGCAGT CATCAAGTGTACCTACTCAGACAGCGCCTCCAATTACTTTCCTTGGTATAAGCAGGAGCTG GGGAAAGGACCACAGCTG AT CATT GAT AT CAGAAGCAACGTGGGCGAAAAGAAAGACCAG AGG ATT GCTGT C ACACT GAAT AAGACT G CAAAAC ACTT C AG CCTGCAT ATT AC AG AG ACT C AGCCCGAAGACTCCGCCGTGTATTTTTGCGCCGCTTCTAAGGGGTCCTCTAACACCGGAA AACTGATCTTCGGCCAGGGGACCACACTGCAGGTGAAGCCTGACATTCAGAATCCAGATC CCGCCGTCTACCAGCTGCGAGACTCAAAGAGTTCAGATAAAAGCGTGTGCCTGTTCACCG ACTTTGATAGCCAGACAAACGTGTCTCAGAGTAAGGACTCCGACGTGTACATCACCGACAA ATGCGTGCT GGAT AT GCGCAGC AT GGACTT CAAGAGCAACAGCGCCGT GGCATGGT CCAA CAAGT CT GATTT CGCCTGCG CT AACGCCTT CAACAATT CTAT CATT CCCG AGG AT ACATT CT TTCCTAGTCCAGAAAGCTCCTGTGACGTGAAGCTGGTCGAGAAAAGTTTCGAAACCGATAC AAACCT GAATTTTCAGAAT CT GT CCGT GAT CGGCTT CCGGATT CTGCTGCT GAAAGTGGCT GGGTTTAATCTGCTGATGACTCTGAGACTGTGGTCCTCC

S E Q ID NO: 17 R e se rva da

S E Q ID NO: 18 a V J y N T co n s ta n te (m u rina ) de codón o p tim iza do

AT GACAAGCATCAGAGCCGTGTT CATTTTT CTGTGGCTGCAGCTGGAT CTGGT GAA CGGAGAGAATGTCGAACAGCATCCTTCAACTCTGAGGGTGCAGGAGGGCGATTCCGCAGT CATCAAGTGTACCTACTCAGACAGCGCCTCCAATTACTTTCCTTGGTATAAGCAGGAGCTG GGGAAAGGACCACAGCTGATCATTGATATCAGAAGCAACGTGGGCGAAAAGAAAGACCAG AGGATT GCTGT C ACACTG AAT AAGACTGCAAAACACTT CAGCCT GCAT ATT ACAGAG ACT C AGCCCGAAGACTCCGCCGTGTATTTTTGCGCCGCTTCTAAGGGGTCCTCTAACACCGGAA AACTGATCTTCGGCCAGGGGACCACACTGCAGGTGAAGCCTGACATTCAGAACCCGGAAC CGGCTGTATACCAGCTGAAGGACCCCCGATCTCAGGATAGTACTCTGTGCCTGTTCACCG ACTTTGATAGTCAGATCAATGTGCCTAAAACCATGGAATCCGGAACTTTTATTACCGACAAG

TGCGTGCTGGATATGAAAGCCATGGACAGTAAGTCAAACGGCGCCATCGCTTGGAGCAAT CAGACATCCTTCACTTGCCAGGATATCTTCAAGGAGACCAACGCAACATACCCATCCTCTG ACGT GCCCTGTGAT GCCACCCT GACAGAGAAGT CTTT CGAAACAGACATGAACCTGAATTT TCAGAATCTGAGCGTGATGGGCCTGAGAATCCTGCTGCTGAAGGTCGCTGGGTTTAATCT GCTGATGACACTGCGGCTGTGGTCCTCA

SEQ ID NO: 19 p VJ y AA constante

MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQ KAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALGPEDSALYLCASSHGPASYE QYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKE VHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQD RAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKD SRG

SEQ ID NO: 20 p VJ y AA constante (murina)

MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQ KAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSHGPASYE QYFGPGTRLTVTEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWVWNGKE VHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKP VTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS

SEQ ID NO: 21 p VJ y NT constante

ATGGGCTGCAGGCTGCTCT GCTGT GCGGTTCTCTGTCTCCT GGGAGCAGTT CCCA T AGACACTG AAGTT ACCCAG ACACCAAAAC ACCT GGTC AT GGGAATGACAAAT AAGAAGTC TTT GAAAT GT G AACAACAT AT GGGGCACAGGGCT AT GT ATTGGT ACAAGCAG AAAGCT AAG AAGCCACCGGAGCT C AT GTTT GT CTAC AGCTAT G AGAAACT CT CT ATAAAT GAAAGT GTGC CAAGTCGCTTCTCACCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTCTTAAACCTTCACCTACACGCCCT GCAGCCAGAAGACT CAGCCCT GT AT CT CTGCGCCAGCAGCCACGGCCCTGCTT CCTACGA GCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCC CACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCA CACT GGTAT GCCTGGCCACAGGCTT CT ACCCCGAC CACGT GGAGCTG AGCTGGTGGGT G AATGGGAAGGAGGT GCACAGT GGGGT CTGCACAGACCCGCAGCCCCT CAAGGAGCAG CC CG CCCT CAAT GACT CCAGAT ACT GCCTGAGCAGCCGCCT GAGGGTCT CGGCCACCTTCTG GCAGAACCCCCGCAACCACTT CCGCT GT CAAGTCCAGTT CT ACGGGCT CTCGGAGAAT G A CGAGT GGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGAT CGT CAGCGCCGAGGCCT GGG GTAGAGCAGACT GTGGCTTCACCT CCGAGTCTT ACCAGCAAGGGGT CCTGTCT GCCACCA T CCT CT AT GAGAT CTT GCT AGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGT CAGTGCCCT CG T GCT G AT GGCCATGGTCAAG AGAAAGGATTCCAGAGGC

SEQ ID NO: 22 p VJ y NT constante de codón optimizado

ATGGGATGTAGACTGCTGTGCTGTGCTGTGCTGTGCCTGCTGGGGGCTGTGCCTA TT GAT ACCGAAGTG ACT CAG ACT CCAAAGCACCT GGT CATGGGCAT G ACCAACAAGAAAA GCCTGAAATGCGAGCAGCACATGGGGCATAGGGCCATGTACTGGTATAAGCAGAAAGCTA AGAAACCCCCT GAACTGAT GTT CGT GT ACAGCT AT GAGAAGCTGTCCATC AAT GAAT CCGT CCCCTCTCGCTTCAGTCCCGAGTGCCCTAACAGCTCCCTGCTGAATCTGCACCTGCATGC TCTGCAGCCTGAAGACTCCGCACTGTACCTGTGCGCCTCTAGTCACGGGCCAGCCTCTTA CGAGCAGTATTTTGGACCCGGCACCAGACTGACTGTGACCGAAGATCTGAAGAACGTCTT CCCACCCGAGGTGGC AGT CTTT G AACCATCT G AGGC CGAAATT AGT CAT ACT CAG AAAGC CACCCTGGTGTGCCTGGCTACAGGCTTCTATCCCGACCACGTGGAGCTGAGTTGGTGGGT

CAACGGCAAGGAAGT GCATT CAGGGGT CT GCACT GACCCT CAGCC ACT GAAAGAGCAGC CT GCT CTG AAT GATT CAAGGT ACTGT CTGTCAAGCCGGCTGAGAGT GAG CGCC ACTTTTT G GC AGAACCCAAGGAAT CACTT CCGCTGCCAGGT GCAGTTTT AT GGCCT GAGCGAGAAT GA CGAATGGACTCAGGATCGCGCTAAGCCAGTGACCCAGATCGTCTCCGCAGAGGCCTGGG GACGAGCAGACT GTGGCTT CACAT CT GAAAGTT ACCAGCAGGGGGT GCT GT CTGCCACAA TCCT GT ACG AG ATT CT GCT GG GAAAGGCCACT CTGTACGCCGT GCT GGT GAGCGCCTT AG TCTTAATGGCCATGGTGAAAAGAAAGGATTCCAGAGGA

SEQ ID NO: 23 Reservada

SEQ ID NO: 24 p VJ y NT constante (murino) de codón optimizado

ATGGGAT GCAGACT GCT GTGCT GT GCTGTGCTGTGCCT GCT GGGGGCTGTGCCTA TT GAT ACCGAAGTGACT CAG ACTCCAAAGCACCT GGT CATGGGCAT G ACCAACAAGAAAA GCCTGAAATGCGAGCAGCACATGGGGCATAGGGCCATGTACTGGTATAAGCAGAAAGCTA AGAAACCCCCT GAACT GAT GTT CGT GT ACAGCTAT GAGAAGCT GT CCAT CAAT GAAT CCGT CCCCTCTCGCTTCAGTCCCGAGTGCCCTAACAGCTCCCTGCTGAATCTGCACCTGCATGC TCTGCAGCCTGAAGACTCCGCACTGTACCTGTGCGCCTCTAGTCACGGGCCAGCCTCTTA CGAGCAGTATTTTGGACCCGGCACCAGACTGACTGTGACCGAAGATCTACGTAACGTGAC ACCACCCAAAGTCTCACTGTTTGAGCCTAGCAAGGCAGAAATTGCCAACAAGCAGAAGGC CACCCTGGTGTGCCTGGCAAGAGGGTTCTTTCCAGATCACGTGGAGCTGTCCTGGTGGGT CAACGGCAAAGAAGTGCATTCTGGGGTCTGCACCGACCCCCAGGCTTACAAGGAGAGTAA TTACTCATATTGTCTGTCAAGCCGGCTGAGAGTGTCCGCCACATTCTGGCACAACCCTAGG AAT CATTT CCGCTGCCAGGT CCAGTTTCACGGCCT GAGT GAGGAAGAT AAAT GGCCAGAG GGGTCACCTAAGCCAGTGACACAGAACATCAGCGCAGAAGCCTGGGGACGAGCAGACTG T GGCATT ACT AGCGCCT CCTAT CAT CAGGGCGT GCT GAGCGCCACT ATCCT GT ACGAGAT TCTGCTGGGAAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCTCCGGCCTGGTGCTGATGGCCAT GGT CAAGAAAAAGAACTCT

3C10 de Bob1

SEQ ID NO: 25 a CDR3 AA

CAASTGGGYSTLTFGKGTMLLVSP SEQ ID NO: 26 a CDR3 NT

TGTGCAGCAAGTACGGGGGGAGGATACAGCACCCTCACCTTTGGGAAGGGGACTA TGCTTCTAGTCTCTCCA

SEQ ID NO: 27 a CDR3 NT de codón optimizado *

TGTGCCGCCTCTACCGGCGGAGGCTACTCCACCCTGACATTCGGCAAGGGCACCA TGCTGCTGGTGTCCCCC

SEQ ID NO: 28 p CDR3 AA CASSGQGITLAGANVLTFGAGSRLTVL

SEQ ID NO: 29 p CDR3 NT

TGTGCCAGCAGTGGACAGGGAATTACCCT GGCT GGGGCCAACGT CCT GACTTTCG GGGCCGGCAGCAGGCTGACCGT GCT G

SEQ ID NO: 30 p CDR3 NT de codón optimizado

TGTGCCAGCAGCGGCCAGGGCATCACACTGGCTGGCGCCAATGTGCTGACCTTC GGAGCCGG CAGCAGACTG ACCGTGCTG

S E Q ID NO: 31 a V J A A MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQEL GKGPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCMSTGGGYSTLTFGK GTMLLVSP SEQ ID NO: 32 a VJ NT

AT GACATCCATT CGAGCT GT ATTT AT ATTCCT GTGGCTGCAGCT GGACTTGGT GAAT GGAGAGAATGTGGAGCAGCATCCTTCAACCCTGAGTGTCCAGGAGGGAGACAGCGCTGT T AT CAAGTGT ACTT ATTCAGACAGT GCCT CAAACT ACTT CCCTT GGT AT AAGCAAGAACTT G GAAAAGGACCT CAGCTT ATT AT AG ACATT CGTTCAAAT GT GGGCG AAAAGAAAG ACCAACG AATTGCTGTTACATTGAACAAGACAGCCAAACATTTCTCCCTGCACATCACAGAGACCCAA CCTGAAGACTCGGCTGTCTACTTCTGTGCAGCAAGTACGGGGGGAGGATACAGCACCCTC ACCTTT GGGAAG GGG ACTATGCTT CT AGTCTCTCCA SEQ ID NO: 33 a VJ NT de codón optimizado

AT GACCAGCAT CCGGGCCGT GTT CAT CTT CCT GT GGCTGCAGCT GG ACCT CGT GA ACGGCGAGAACGTGGAACAGCACCCCAGCACCCTGAGCGTGCAGGAAGGCGATAGCGC CGTGATCAAGTGCACCTACAGCGACAGCGCCAGCAACTACTTCCCCTGGTACAAGCAGGA ACTGGGCAAGGGCCCCCAGCTGATCATCGACATCAGATCCAACGTGGGCGAGAAGAAGG ACCAGCGGATCGCCGTGACCCTGAACAAGACCGCCAAGCACTTCAGCCTGCACATCACC GAGACACAGCCCGAGGACAGCGCCGTGTACTTTTGTGCCGCCTCTACCGGCGGAGGCTA CTCCACCCTGACATTCGGCAAGGGCACCAT GCTGCTGGTGTCCCCC SEQ ID NO: 34 p VDJ AA MGSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQT MMRGLELUYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSGQGITLA GANVLTFGAGSRLTVL SEQ ID NO: 35 p VDJ NT ATGGGCTCCTGGACCCTCTGCTGTGTGTCCCTTTGCATCCTGGTAGCAAAGCACAC AGATGCTGGAGTTATCCAGTCACCCCGGCACGAGGTGACAGAGATGGGACAAGAAGTGA CT CT G AGATGTAAACCAATTT CAGGACACGACTACCTTTT CT GGT ACAG ACAGACCAT G AT GCGGGGACT GG AGTT GCT CATTT ACTTT AACAAC AACGTTCCG AT AGATGATT CAGGGAT G CCCGAGGAT CG ATT CTCAGCTAAGAT G CCT AATGCAT CATT CT CCACTCT GAAGAT CCAGC CCTCAGAACCCAGGGACT CAGCT GT GT ACTTCT GTGCCAGCAGT GGACAGGGAATT ACCC TGGCTGGGGCCAACGTCCTGACTTTCGGGGCCGGCAGCAGGCTGACCGTGCTG SEQ ID NO: 36 p VDJ NT de codón optimizado

AT GGGCAGCTGGACCCT GT GCTGCGTGT CCCT GT GT AT CCTGGT GGCCAAGCACA CCGATGCCGGCGTGATCCAGAGCCCCAGACACGAAGTGACCGAGATGGGCCAGGAAGTG ACCCTGCGCTGCAAGCCTATCAGCGGCCACGACTACCTGTTCTGGTACAGACAGACCATG ATGCGGG GCCTGGAACT GCT GAT CT ACTTC AACAACAACGT GCCCAT CGACGACAGCGGC ATGCCCGAGGATAGATTCAGCGCCAAGATGCCCAACGCCAGCTTCAGCACCCTGAAGATC CAGCCCAGCGAGCCCAGAGACAGCGCCGTGTACTTTTGTGCCAGCAGCGGCCAGGGCAT CACACT GGCTGGCGCCAAT GTGCT GACCTT CGGAGCCGGCAGCAGACT GACCGTGCT G SEQ ID NO: 37 a VJ y AA constante MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQEL GKGPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAASTGGGYSTLTFGK GTMLLVSPDIQNPDPAVYGLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSM DFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIG FRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS S E Q ID NO: 38 a V J y A A co n s ta n te (m u rina )

MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQEL GKGPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAASTGGGYSTLTFGK GTMLLVSPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAM DSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRIL LLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO: 39 a VJ y NT constante

AT GACATCCATTCGAGCT GT ATTT AT ATTCCT GTGGCT GCAGCT GGACTTGGT GAAT GGAG AG AAT GT GGAGCAGC AT CCTT CAACCCTGAGTGTCCAGGAGGG AGACAGCGCTGT T AT CAAGTGT ACTT ATTCAGACAGT GCCT CAAACT ACTT CCCTT GGT AT AAGCAAGAACTT G GAAAAGGACCT CAGCTT ATT AT AG ACATT CGTTCAAAT GT GGGCG AAAAGAAAG ACCAACG AATTGCTGTTACATTGAACAAGACAGCCAAACATTTCTCCCTGCACATCACAGAGACCCAA CCTGAAGACTCGGCTGTCTACTTCTGTGCAGCAAGTACGGGGGGAGGATACAGCACCCTC ACCTTTGGGAAGGGGACTATGCTTCTAGTCTCTCCAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCC GTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTG ATT CT CAAACAAAT GTGT C AC AAAGT AAGGATT CT G AT GT GT AT AT C AC AG AC AAAACT GT G CT AGACAT G AGGT CT AT GG ACTT CAAGAGCAACAGT GCTGTGGCCT GGAGCAAC AAAT CT GACTTT GCAT GT GCAAACGCCTT CAACAACAGCATT ATTCCAGAAGACACCTTCTT CCCCA GCCCAGAAAGTTCCT GT GAT GTCAAGCT GGT CGAGAAAAGCTTTGAAACAGAT ACGAACCT AAACTTT CAAAACCT GT CAGTG ATT GGGTTCCGAAT CCTCCT CCTGAAAGT GGCCGGGTTT AATCTGCTCATGACGCTGCGGTTGTGGTCCAGC

SEQ ID NO: 40 a VJ y NT constante de codón optimizado

AT GACCAGCAT CCGGGCCGT GTTCAT CTT CCT GT GGCT GCAGCTGGACCT CGT G A ACGGCGAGAACGTGGAACAGCACCCCAGCACCCTGAGCGTGCAGGAAGGCGATAGCGC CGTGATCAAGTGCACCTACAGCGACAGCGCCAGCAACTACTTCCCCTGGTACAAGCAGGA ACTGGGCAAGGGCCCCCAGCTGATCATCGACATCAGATCCAACGTGGGCGAGAAGAAGG ACCAGCGGATCGCCGTGACCCTGAACAAGACCGCCAAGCACTTCAGCCTGCACATCACC G AGACACAGCCCGAGGACAGCGCCGTGT ACTTTT GT GCCGCCT CT ACCGGCGGAGGCT A CTCCACCCTGACATTCGGCAAGGGCACCATGCTGCTGGTGTCCCCCGACATCCAGAACCC CGATCCTGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGT TCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACTCCGACGTGTACATCA CAGACAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACTCCGCCGTGGCC T GGT CCAACAAGAGCGATTT CG CCT G CGCCAACGCCTT CAACAACAGCATT ATCCCT GAG GACACATTCTTCCCAAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAGCTGGTGGAAAAGAGCTTC GAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTGTCCGTGATCGGCTTCCGGATCCTGCTG CTGAAGGTGGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTGAGACTGTGGTCCTCC

SEQ ID NO: 41 a VJ y NT constante (murina)

AT GACATCCATT CGAGCT GT ATTT AT ATTCCT GTGGCTGCAGCT GGACTT GGT GAAT GGAG AG AAT GT GGAGCAGC AT CCTT CAACCCTG AGT GTCCAGGAGGGAGACAGCGCT GT T AT CAAGTGT ACTT ATTCAGACAGT GCCT CAAACT ACTTCCCTT GGTAT AAGCAAGAACTT G GAAAAGGACCT CAGCTT ATT AT AG ACATT CGTTCAAAT GT GGGCG AAAAGAAAG ACCAACG AATT GCT GTTACATTG AACAAGAC AGCCAAACATTT CTCCCT GCACAT CACAGAG ACCC AA CCTGAAGACTCGGCTGTCTACTTCTGTGCAGCAAGTACGGGGGGAGGATACAGCACCCTC

ACCTTTGGGAAGGGGACTATGCTTCTAGTCTCTCCAGACATTCAGAACCCGGAACCGGCT GTATACCAGCTGAAGGACCCCCGATCTCAGGATAGTACTCTGTGCCTGTTCACCGACTTTG AT AGTCAG AT CAAT GT GCCT AAAACCAT GGAAT CCGGAACTTTT ATT ACCGACAAGT GCGT GCTGGATATGAAAGCCATGGACAGTAAGTCAAACGGCGCCATCGCTTGGAGCAATCAGAC ATCCTTCACTTGCCAGG AT AT CTT CAAGGAGACCAACGCAAC AT ACCCAT CCT CT GACGT G CCCT GTG AT GCCACCCT GACAGAGAAGT CTTT CGAAACAGACAT GAACCT GAATTTT CAGA ATCTGAGCGTGATGGGCCTGAGAATCCTGCTGCTGAAGGTCGCTGGGTTTAATCTGCTGA T GACACT GCGGCTGTGGT CCT CA

S E Q ID NO: 42 a V J y de N T co n s ta n te de codón o p tim iza d o (m u rina )

AT GACCAGCAT CCGGGCCGTGTTCAT CTTCCT GT GGCTGCAGCTGGACCTCGT GA ACGGCGAGAACGTGGAACAGCACCCCAGCACCCTGAGCGTGCAGGAAGGCGATAGCGC CGTGATCAAGTGCACCTACAGCGACAGCGCCAGCAACTACTTCCCCTGGTACAAGCAGGA ACT GGGCAAGGGCCCCC AGCT G AT CAT CGACAT CAGAT CCAACGTGGG CG AGAAGAAGG ACCAGCGGATCGCCGTGACCCTGAACAAGACCGCCAAGCACTTCAGCCTGCACATCACC GAGACACAGCCCGAGGACAGCGCCGTGTACTTTTGTGCCGCCTCTACCGGCGGAGGCTA CT CCACCCT GACATT CGGCAAGGGCACCAT GCT GCT GGT GTCCCCCGAC ATCCAGAAT CC CGAGCCT GCCGTGTACCAGCT GAAGGACCCCAGAAGCCAGGATAG CACCCTGT GCCT GT T CACCGACTT GG ACAGCCAGAT CAAG GT GCCGAAGACCATGG AAAGCGGCACCTT CAT CA CCGATAAGTGCGTGCTGGACATGAAGGCCATGGACAGCAAGAGCAACGGCGCCATTGCC T GGT CCAACCAGACCAGCTT CACATGCCAGGACAT CTT CAAAGAGACAAACGCCACCT AC CCCAGCAGCGACGTGCCCTGTGATGCCACACTGACCGAGAAGTCCTTCGAGACAGACAT GAACCTGAACTTCCAGAACCTGTCCGTGATGGGCCTGCGGATCCTGCTGCTGAAGGTGGC CGGCTTCAACCT GCT GATGACCCT GAGACTGTGGTCCT CC

SEQ ID NO: 43 p VJ y AA constante

MGSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQT MMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSGQGITLA GANVLTFGAGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWV NGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDE WTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAM VKRKDSRG

SEQ ID NO: 44 p VJ y AA constante (murina)

MGSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQT MMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSGQGITLA GANVLTFGAGSRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWV NGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEG SPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKN S

SEQ ID NO: 45 p VJ y NT constante

ATGGGCTCCTGGACCCTCTGCTGTGTGTCCCTTTGCATCCTGGTAGCAAAGCACAC AGATGCTGGAGTTATCCAGTCACCCCGGCACGAGGTGACAGAGATGGGACAAGAAGTGA CT CT G AGATGTAAACCAATTT CAGGACACGACTACCTTTT CT GGT ACAG ACAGACCAT G AT GCGGGGACT GG AGTT GCT CATTT ACTTT AACAAC AACGTTCCG AT AGATGATT CAGGGAT G CCCGAGGAT CG ATT CTCAGCTAAGAT G CCT AATGCAT CATT CT CCACTCT GAAGAT CCAGC CCTCAGAACCCAGGGACT CAGCT GT GT ACTTCT GTGCCAGCAGT GGACAGGGAATT ACCC TGGCTGGGGCCAACGTCCTGACTTTCGGGGCCGGCAGCAGGCTGACCGTGCTGGAGGA

CCTG AAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCT GT GTTTGAGCCAT CAGAAGC AGAGAT CT C CCACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGA GCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAG CCCCT CAAGGAGCAGCCCGCCCT CAAT GACT CCAGAT ACTGCCTG AGCAGCCGCCT G AG GGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTA CGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCG TCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAA GGGGT CCTGT CT GCCACCAT CCT CT AT GAG AT CTT GCT AGGGAAGGCCACCTT GT AT GCC GTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC

SEQ ID NO: 46 p VJ y NT constante de codón optimizado

ATGGGCAGCTGGACCCTGTGCTGCGTGTCCCTGTGTATCCTGGTGGCCAAGCACA CCGATGCCGGCGT GATCCAGAGCCCCAGACACGAAGT GACCGAGAT GGGCCAGGAAGT G ACCCT GCGCT GCAAGCCT AT CAGC GGCCACGACT ACCTGTT CTGGT ACAGACAGACCAT G AT GCGGGGCCTGGAACT GCT GAT CT ACTT CAACAACAACGTGCCCAT CGACG ACAGCGGC ATGCCCGAGGATAGATTCAGCGCCAAGATGCCCAACGCCAGCTTCAGCACCCTGAAGATC CAGCCCAGCGAGCCCAGAGACAGCGCCGTGTACTTTTGTGCCAGCAGCGGCCAGGGCAT CACACT GGCTGGCGCCAAT GTGCT GACCTTCGGAGCCGGCAGCAGACT GACCGTGCT GG AAGATCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTTCTGAGGCCGAGA T CAGCCACACCCAGAAAGCCACCCT CGTGTGTCT GGCCACCGGCTT CTACCCCGACCACG T GGAACT GT CTTGGT GGGT CAACGGCAAAGAGGT GC ACAG CGGCGT GT CCACCG AT CCC CAGCCT CT GAAAGAACAGCC CGCCCTGAACGACAGCCGGT ACTGCCT GT CCAGCAGGCT G AGAGTGTCCGCCACCTT CTGGCAGAACCCCCGGAACCACTT CAGAT GCCAGGT GCAGTT CTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACAGAGCCAAGCCCGTGACCCAGA TCGTGTCTGCCGAAGCCTGGGGCAGAGCCGATTGCGGCTTTACCAGCGAGAGCTACCAG CAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTA CGCCGTGCTGGT GTCTGCCCT GGT GCT GAT GGCCATGGTCAAGCGGAAGGACAGCCGGG GC

SEQ ID NO: 47 p VJ y NT constante (murina)

ATGGGCTCCT GG ACCCT CT GCT GT GT GTCCCTTT GCAT C CTGGT AGCAAAGCACAC AGATGCTGGAGTTATCCAGTCACCCCGGCACGAGGTGACAGAGATGGGACAAGAAGTGA CTCTGAGATGTAAACCAATTTCAGGACACGACTACCTTTTCTGGTACAGACAGACCATGAT GCGGGGACT GG AGTTGCT CATTT ACTTT AACAACAACGTTCCGAT AG ATGATT C AGGGAT G CCCGAGGAT CGATT CTCAGCTAAGATGCCT AAT GCAT CATT CTCCACTCTGAAGAT CCAGC CCTCAGAACCCAGGGACTCAGCTGTGTACTTCTGTGCCAGCAGTGGACAGGGAATTACCC TGGCTGGGGCCAACGTCCTGACTTTCGGGGCCGGCAGCAGGCTGACCGTGCTGGAAGAT CTACGTAACGTGACACCACCCAAAGT CT CACTGTTT GAGCCT AGCAAGGCAGAAATT GCCA ACAAGCAGAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGGCAAGAGGGTTCTTTCCAGATCACGTGGAG CT GT CCTGGT GGGT CAACGGCAAAGAAGTGCATT CTGGGG T CTGCACCGACCCCCAGGC TT ACAAGG AGAGT AATT ACTCAT ATT GT CT GT CAAGCCGGCT GAG AGTGT CCGCCACATT C TGGCACAACCCTAGGAATCATTTCCGCTGCCAGGTCCAGTTTCACGGCCTGAGTGAGGAA GATAAATGGCCAGAGGGGTCACCTAAGCCAGTGACACAGAACATCAGCGCAGAAGCCTG GGGACGAGCAGACTGTGGCATTACTAGCGCCTCCTATCATCAGGGCGTGCTGAGCGCCA CT ATCCT GTACGAGATT CTGCTGGG AAAGGCCACCCT GT AT GCT GT GCT GGT CTCCGGCC TGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAAAAAGAACTCT

SEQ ID NO: 48 p VJ y NT constante de codón optimizado (murino)

ATGGGCAGCTGGACCCTGTGCTGCGTGTCCCTGTGTATCCTGGTGGCCAAGCACA

CCGATGCCGGCGTGATCCAGAGCCCCAGACACGAAGTGACCGAGATGGGCCAGGAAGTG ACCCTGCGCTGCAAGCCTATCAGCGGCCACGACTACCTGTTCTGGTACAGACAGACCATG ATGCGGG GCCTGGAACTGCTGAT CTACTTC AACAACAACGTGCCCATCGACGACAGCGGC ATGCCCGAGG ATAGATT CAGCGCCAAGAT G CCCAACGCCAG CTT CAGCACCCT GAAGAT C CAGCCCAGCGAGCCCAGAGACAGCGCCGTGTACTTTTGTGCCAGCAGCGGCCAGGGCAT CACACT GGCTGGCGCCAAT GTGCT GACCTT CGGAGCCGGCAGCAGACT GACCGTGCT GG AAGAT CTGCGG AACGT GACCCCCCCCAAAGT GT CT CT GTT CGAGCCCAGCAAGGCCG AG AT CGCCAACAAGCAGAAAGCCACCCT CGTG TGCCT GGCCAGAGGCTT CTTCCCCGACCAC GTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACTCCGGCGTGTGCACCGATCC CCAGGCCTACAAAGAGAGCAACTACAGCTACTGCCTGAGCAGCAGGCTGCGGGTGTCCG CCACCTTCTGGCACAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTTCACGGCCTGA GCGAAGAGGACAAGTGGCCCG AGGGCAGCCCT AAGCCCGT GACCCAGAAT ATCTCTGCC GAAGCCTGGGGCAGAGCCGACTGTGGCATTACCAGCGCCAGCTACCATCAGGGCGTGCT GAGCGCCACCAT CCT GT ACGAGAT CCT GCT GGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGG T GT CT GGCCT GGTGCT GATGGCCAT GGT CAAGAAGAAGAACAGC

Ejemplo 5: La transferencia del gen de TCR instala la reactividad de Bob1 en células T receptoras e induce una lisis eficiente de neoplasias malignas primarias

Se probó el TCR del clon 4G11 (TCR-4G11) para determinar su capacidad para instalar la reactividad de Bob1 en las células receptoras mediante transferencia de genes. Se secuenció TCR-4G11, se optimizó el codón, se modificó con un enlace disulfuro para aumentar el emparejamiento preferencial de la cadena TCRa y TCRp, y se clonó en el vector MP71 que expresa NGF-R como gen marcador. La expresión de NGF-R se utilizó para enriquecer las células T transducidas con TCR hasta una alta pureza mediante el aislamiento guiado por MACS de las células que expresan NGF-R. Las células T CD8+ transducidas retroviralmente de un individuo sano HLA-B7pos expresó TCR-4G11 en la superficie celular indicado por su capacidad para unirse al tetrámero de pMHC B obW B7 (Fig. 12a). La tinción más intensa con tetrámero de pMHC se correlacionó con una mayor expresión de NGF-R, lo que sugiere que las células que expresan mayores cantidades de tetrámero de pMHC introducido se unen a TCR de manera más eficiente. No se observó unión de tetrámero para las células T transducidas de forma simulada. Las células T CD4+ podrían transducirse según lo indicado por la expresión de NGF-R, sin embargo, no se observó unión al tetrámero B o b w B7 (Fig. 12a). Las células T CD8+ transducidas con TCR reconocieron fácilmente células estimuladoras HLA-B7pos que expresan Bob1 tal como líneas celulares de mieloma múltiple UM9 y U266, B-LCL-JY y dos líneas celulares de ALL ALL-BV y ALL-VG que reflejan el perfil de reactividad del clon 4G11 de células T (Fig. 12b). Por el contrario, las células T CD4+ transducidas con TCR no reconocieron ninguna de estas líneas celulares. No se observó reconocimiento de células T CD8+ transducidas en forma simulada lo que indica que el reconocimiento se debió a la introducción de TCR-4G11.

Figura 12. La transferencia de TCR-4G11 instala la reactividad de Bob1 en células T CD8+ del receptor. Las células T CD4+ y CD8+ se aislaron de un individuo HLA-B7pos sano y se transdujeron con sobrenadante retroviral para expresar TCR-4G11 junto con NGF-R. La transducción con un vector vacío (Simulado) que contiene solo el gen marcador NGF-R sirvió como control. Para la Figura 12A, los gráficos FACS de células T transducidas después del enriquecimiento mediante la expresión del gen marcador NGF-R y el aislamiento de MACS. Las células T c D8+ (fila superior) o CD4+ (fila inferior) aisladas se tiñeron con tetrámero de pMHC BobW B7 y un anticuerpo contra NGF-R. Los números en el cuadrante indican el porcentaje de células. Los gráficos de FACS se muestran con ejes biexponenciales. Para la Figura 12B, clon 4G11 de células T o las células T CD8+ o CD4+transducidas purificadas se incubaron junto con varios líneas celulares HLA-B7pos. Las líneas celulares incluyeron K562-B7 transducidas para expresar Bob1 (K562-B7+ Bob1), dos líneas celulares de mieloma múltiple UM9 y U^{2 6 6} , B-LCL-JY y dos líneas celulares de ALL A lL-BV y ALL-VG. La concentración de IFN-y se evaluó después de 18 h de cocultivo.

Además, Las células T CD8+transducidas con TCR lisaron eficazmente muestras de células malignas primarias HLA-B7pos (Fig. 13a). Se observó una lisis completa o casi completa para las muestras primarias de ALL y MCL y líneas celulares de mieloma múltiple en una proporción igual entre efector y diana, incluso cuando las células diana excedían el triple de las células efectoras. También se pudo observar una lisis eficaz por células T transducidas con TCR tanto para las muestras primarias de CLL probadas como para 2 de las líneas celulares de ALL. Además, ambas muestras de mieloma múltiple primario positivas para HLA-B7 purificadas se lisaron fácilmente por células T transducidas con TCR en proporciones bajas entre efector y diana. En todos los casos, no se observó lisis para las células T transducidas de forma simulada, lo que indica que la lisis se debió a la introducción de TCR-4G11. La expresión de Bob1 en células B sanas también condujo a su lisis por células T CD8+ transducidas con TCR autólogas (Fig. 13b). La lisis fue específica ya que la línea celular K562-B7 negativa para Bob1 no se lisó (Fig. 13a). Además, las células T CD8+ transducidas con TCR no lisaron las células T activadas autólogas o monocitos CD14+ lo que indica un perfil de reactividad seguro (Fig. 13b).

Figura 13. Las células T CD8+ transducidas con TCR lisan eficazmente las neoplasias malignas primarias de células B y el mieloma múltiple. Para las Figuras 13A y 13B, clon 4G11 de células T o las células T CD8+ purificadas transducidas con TCR o en forma simulada se analizaron para determinar su capacidad lítica de células diana HLA-B7pos. Las células diana marcadas con PKH se cocultivaron en diversas relaciones de efector: diana con células T efectoras. Después de 18 h de cocultivo, se evaluó el número de células diana vivas mediante citometría de flujo y se calculó el porcentaje de supervivencia. Figura 13A: Las muestras de células malignas incluyeron la línea celular de mieloma múltiple UM9, mieloma múltiple primario (MM), linfoma de células del manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda (ALL) y leucemia linfocítica crónica (CLL). Los controles incluyeron la línea celular negativa para Bob1 K562-B7. Figura 13B: Las células hematopoyéticas sanas tenían el mismo origen que las células T transducidas (configuración autóloga) e incluían células T activadas por PHA, monocitos CD14+, células B primarias CD19+ y células B activadas por CD40L.

Las células T CD8+ transducidas con TCR proliferaron tras la estimulación con varios muestras primarias que expresan Bob1 HLA-B7pos que incluyen ALL, CLL, MCL, líneas celulares de mieloma múltiple y células B activadas autólogas (Figura 14a, b). Por el contrario, la estimulación con la línea celular negativa para antígeno K562-B7 o células T activadas autólogas no condujo a la proliferación de células T transducidas con TCR.

Figura 14. Las células T CD8+ transducidas con TCR proliferan tras el encuentro con el antígeno. Para las Figuras 14A y 14B, las células T CD8+transducidas marcadas con PKH se cultivaron conjuntamente con células estimuladoras HLA-B7pos irradiadas. Los histogramas muestran células T CD8+ transducidas con TCR (línea negra) o transducidas de forma simulada (área gris) después de 5 días de cocultivo. Figura 14A: Las células estimuladoras incluían la línea celular UM9 y ALL, CLL y MCL primarias. Los controles negativos incluyeron cultivo en ausencia de células estimuladoras (sin estimuladores) o cocultivo con células K562-B7 negativas para Bob1. El control positivo incluyó estimulación en presencia de perlas activadoras de células T CD3/CD28 (perlas CD3/CD28). Figura 14B: Las células B autólogas estimuladas con CD40L o células T activadas con PHA se utilizaron como células estimuladoras.

Pueden usarse modelos de ratón para analizar adicionalmente las células T modificadas que expresan Bob1-TCR in vivo. En modelos de ratón de mieloma múltiple (MM) humanizado en los que se pueden inyectar células UM9 de la línea celular MM positivas luciferasa en las articulaciones de ratones, se puede monitorizar la potencia de las células T modificadas con Bob1-TCR. Además, se puede utilizar ratones RAG2'/'Y^c'/' implantados con estructuras híbridas que consisten de tres partículas de fosfato de calcio bifásicas de 2 a 3 mm recubiertas con células estromales mesenquimales humanas (MSC) y cargadas con la línea celular de MM Luc+ LUM9 o U266 para monitorear la potencia de las células T (Groen r W, et al., Blood ^{2 0 1 2} ; ^{1 2 0} : e9 - e16).

En resumen, la transferencia del gen de TCR de TCR-4G11 instaló la reactividad de Bob1 en células T CD⁸ + del receptor. Las células T transducidas con TCR lisaron eficazmente la ALL, la CLL, el MCL y el mieloma múltiple primarios lisados con relaciones bajas de efector a diana, sin afectar a las células no B. Además, las células T transducidas con TCR proliferaron fácilmente tras el encuentro con el antígeno.

Ejemplo ⁶ : Además de un gen suicida - Apoptosis selectiva de las células modificadas

Las células modificadas que expresan TCR dirigido a Bob1 pueden estar provistas de un mecanismo para eliminar algunas o todas las células si el paciente experimenta efectos negativos, o si es necesario reducir o detener el tratamiento. En algunos ejemplos, el mecanismo del gen suicida se proporciona para reducir el nivel de toxicidad en la diana, fuera del órgano, cuando existe la necesidad de una opción para terminar rápidamente la terapia.

En los presentes ejemplos se proporciona un ejemplo de un polipéptido quimérico que puede expresarse en las células modificadas. En algunos ejemplos, las células modificadas comprenden un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico Caspasa-9 y un polinucleótido que codifica TCR de Bob1. En otros ejemplos, el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica tanto el polipéptido quimérico Caspasa-9 como TCR de Bob1; el polipéptido inducible Caspasa-9 se separa del polipéptido TCR de Bob1 durante la traducción, debido a la omisión de un enlace peptídico (véase, por ejemplo, Donnelly, m L 2001, J. Gen. Virol. 82: 1013-25). Los métodos para inducir apoptosis selectiva de células que comprenden un acido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico Caspasa-9 se discuten en la patente de los EE. UU. 9.089.520, titulada, "Methods for Inducing Selective Apoptosis” emitida el 28 de julio de 2015; los métodos para la coexpresión de un polipéptido quimérico Caspasa-9 y otro polipéptido en células T se analizan la solicitud internacional de patente con serial No Pc T/US2015/015829, publicada como WO2015/123527 el 20 de agosto de 2015, titulada "Methods for Activating T cells Using an Inducible Chimeric Polypeptide".

Los polipéptidos quiméricos caspasa-9 adicionales que pueden usarse en los constructos TCR de Bob1 también incluyen, por ejemplo, los discutidos en la solicitud internacional de patente con serial No. PCT/US2014/022004, publicada como WO2014/164348 el 5 de marzo de 2015, titulada "Modified Caspase Polypeptides and Uses Thereof', y en la solicitud internacional de patente con serial No. PCT/US2015/019186, publicada como WO2015/134877 el 11 de septiembre de 2015, y titulado "Caspase Polypeptides having Modified Activity and Uses Thereof'. El ejemplo proporcionado en el presente documento analiza la administración de células T modificadas que expresan un polipéptido quimérico Caspasa-9 a un sujeto, y el aloagotamiento de células T modificadas después del desarrollo de enfermedad de injerto contra huésped en el sujeto mediante administración del CID AP1903 (rimiducid) o AP20187). Este método puede adaptarse para su uso en las células modificadas con Bob1TCR discutidas en el presente documento.

Construcción de vectores y confirmación de expresión.

En este documento se presenta un interruptor de seguridad que puede expresarse de manera estable y eficiente en células T humanas. Se construyeron vectores de expresión adecuados para su uso como agente terapéutico que incluían una actividad Caspasa-9 humana modificada fusionada con una proteína de unión a FK506 humana (FKBP), tal como, por ejemplo, FKBP12v36. La actividad híbrida de Caspasa-9/FK506 se puede dimerizar usando un fármaco de molécula pequeña. Se fusionaron versiones completas, truncadas y modificadas de la actividad Caspasa-9 al dominio de unión al ligando, o región de multimerización, y se insertaron en el vector retroviral MSCV.IRES.GRP, que también permite la expresión del marcador fluorescente, GFP.

La molécula de Caspasa-9 inducible de longitud completa (F'-F-C-Casp9) incluye 2, 3 o más proteínas de unión a FK506 (FKBP, por ejemplo, variantes de FKBP12v36) enlazadas con un enlazador Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser a la subunidad pequeña y grande de la molécula de caspasa. La caspasa-9 inducible de longitud completa (F'F-C-Casp9.I.GFP) tiene una caspasa-9 de longitud completa, también incluye un dominio de reclutamiento de caspasa (CARD; GenBank NM001 229) enlazado a 2 proteínas de unión a FK506 humanas de 12 kDa (FKBP12; GenBank AH002818) que contienen una mutación F36V. La secuencia de aminoácidos de una o más de las FKBP (F') fue de codón oscilante (por ejemplo, El tercer nucleótido de cada codón de aminoácido fue alterado mediante una mutación silenciosa que mantuvo el aminoácido originalmente codificado) para prevenir la recombinación homóloga cuando se expresa en un retrovirus. F'F-C-Casp9C3S incluye una mutación de cisteína por serina en la posición 287 que interrumpe su sitio de activación. En los constructos F'F-Casp9, F-C-Casp9 y F'-Casp9, se eliminaron o bien el dominio de activación de caspasa (CARD), una FKBP o ambos, respectivamente. Todos los constructos se clonaron en MSCV.IRES.GFP como fragmentos EcoRI-Xhol.

La coexpresión de los constructos de Caspasa-9 inducibles del tamaño esperado con el gen marcador GFP en células 293T transfectadas se demostró mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo de Caspasa-9 específico para los residuos de aminoácidos 299-318, presentes tanto en las moléculas de caspasa de longitud completa como en las truncadas, así como un anticuerpo específico para GFP.

Un cribado inicial indicó que la iCasp9 de longitud completa no se podía mantener estable a niveles altos en las células T, posiblemente debido a que las células transducidas son eliminadas por la actividad basal del transgén. El dominio CARD está involucrado en la dimerización fisiológica de las moléculas de Caspasa-9, mediante una interacción impulsada por el citocromo C y el trifosfato de adenosina (ATP) con el factor activador de proteasa apoptótico 1 (Apaf-1). Debido al uso de un CID para inducir la dimerización y activación del interruptor suicida, la función del dominio CARD es superflua en este contexto y se investigó la eliminación del dominio CARd como un método para reducir la actividad basal.

Uso del gen suicida iCasp9 para mejorar la seguridad de las células T aloagotadas después del trasplante de células madre haploidénticas

En este ejemplo se presentan constructos de expresión y métodos de uso de los constructos de expresión para mejorar la seguridad de las células T aloagotadas después del trasplante de células madre haploidénticas. Pueden usarse métodos similares para expresar los constructos de expresión de Caspasa-9 en células no aloagotadas. Estos métodos también pueden usarse para expresar el polipéptido quimérico Caspasa-9 en células que expresan TCR de Bob1. Se generó un vector retroviral que codifica iCasp9 y un marcador seleccionable (CD19 truncado) como interruptor de seguridad para las células T del donante. Incluso después del aloagotamiento (usando inmunotoxina anti-CD25), las células T del donante podrían transducirse, expandirse y posteriormente enriquecerse de manera eficiente mediante la selección inmunomagnética de CD19 hasta una pureza > 90%. Las células modificadas conservaron la especificidad y funcionalidad antivirales y contenían un subconjunto con fenotipo y función reguladores. La activación de iCasp9 con un dimerizador de molécula pequeña produjo rápidamente > 90% de apoptosis. Aunque la expresión transgénica se subreguló en las células T inactivas, iCasp9 siguió siendo un gen suicida eficaz, ya que la expresión se sobrerreguló rápidamente en las células T activadas (alorreactivas).

Materiales y métodos

Generación de células T aloagotadas

Las células aloagotadas se generaron a partir de voluntarios sanos como se presentó anteriormente. Brevemente, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos se cultivaron conjuntamente con líneas de celulares linfoblastoides (LCL) transformadas con el virus de Epstein Barr (EBV) del receptor irradiadas a una relación de respondedor a estimulador de 40: 1 en medio sin suero (AIM V; Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 72 horas, las células T activadas que expresaban CD25 se agotaron del cocultivo mediante incubación durante la noche en inmunotoxina RFT5-SMPT-dgA. El aloagotamiento se consideró adecuado si la población de CD3 CD25 residual era <1% y la proliferación residual por incorporación de 3H-timidina era <10%.

Plásmido y retrovirus

SFG.iCasp9.2A.CD19 consiste en caspasa-9 inducible (iCasp9) unida, mediante una secuencia escindible similar a 2A, a CD19 humano truncado. iCasp9 consiste en una proteína de unión a FK506 humana (FKBP12; GenBank AH002 818) con una mutación F36V, conectada mediante un enlazador Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly a la caspasa-9 humana (CASP9; GenBank NM 001229). La mutación F36V aumenta la afinidad de unión de FKBP12 al homodimerizador sintético, AP20187 o AP1903. El dominio de reclutamiento de caspasa (CARD) se ha eliminado de la secuencia de Caspasa-9 humana porque su función fisiológica ha sido reemplazada por FKBP12, y su eliminación aumenta la expresión y función del transgén. La secuencia similar a 2A codifica un péptido de 20 aminoácidos del virus del insecto Thosea asigna, que media > 99% de escisión entre una glicina y un residuo de prolina terminal, lo que da como resultado 19 aminoácidos adicionales en el extremo terminal C de iCasp9 y un residuo de prolina adicional en el extremo terminal N de CD19. CD19 consta de CD19 de longitud completa (GenBank NM 001770) truncado en el aminoácido 333 (TDPTRRF), que acorta el dominio intracitoplasmático de 242 a 19 aminoácidos y elimina todos los residuos de tirosina conservados que son sitios potenciales para la fosforilación.

Se preparó un clon estable de PG13 que produce retrovirus pseudotipado del virus de la leucemia del mono Gibbon (Gal-V) transfectando transitoriamente la línea celular Phoenix Eco (producto ATCC # SD3444; ATCC, Manassas, VA) con SFG.iCasp9.2A.CD19. Esto produjo retrovirus eco-pseudotipado. La línea celular de empaquetamiento PG13 (ATCC) se transdujo tres veces con Eco-pseudotipado o retrovirus para generar una línea productora que contenía múltiples integrantes provirales SFG.iCasp9.2A.CD19 por célula. Se realizó la clonación de células individuales y el clon PG13 que produjo el título más alto se expandió y se usó para la producción de vectores.

Transducción retroviral

El medio de cultivo para la activación y expansión de las células T consistió en RPMI 1640 al 45% (Hyclone, Logan, UT), Clicks al 45% (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) y suero bovino fetal al 10% (FBS; Hyclone). Las células aloagotadas se activaron mediante anti-CD3 inmovilizado (OKT3; Ortho Biotech, Bridgewater, NJ) durante 48 horas antes de la transducción con vector retroviral. EL aloagotamiento selectivo se realizó mediante el cocultivo de PBMC del donante con el EBV-LCL del receptor para activar las células alorreactivas: las células activadas expresaron CD25 y posteriormente se eliminaron mediante inmunotoxina anti-CD25. Las células aloagotadas fueron activadas por OKT3 y transducidas con el vector retroviral 48 horas después. La selección inmunomagnética se realizó el día 4 de la transducción; la fracción positiva se expandió durante 4 días más y se crioconservó.

En experimentos a pequeña escala, se recubrieron placas de 24 pocillos no tratadas con cultivo de tejido (Becton Dickinson, San José, CA) con 1 pg/ml de OKT3 durante 2 a 4 horas a 37 °C. Las células aloagotadas se agregaron a razón de 1 * 10⁶ células por pocillo. A las 24 horas, se añadieron 100 U/ml de interleucina-2 humana recombinante (IL-2) (Proleukin; Chiron, Emeryville, CA). La transducción retroviral se realizó 48 horas después de la activación. Las placas de 24 pocillos no tratadas con cultivo de tejidos se recubrieron con 3,5 pg/cm² de fragmento de fibronectina recombinante (CH-296; Retronectin; Takara Mirus Bio, Madison, WI) y los pocillos se cargaron dos veces con sobrenadante que contenía vector retroviral a 0.5 ml por pocillo durante 30 minutos a 37 °C, después de lo cual se sembraron en placas células activadas con OKT3 a razón de 5 * 10⁵ células por pocillo en sobrenadante fresco que contiene vector retroviral y medio de cultivo de células T en una proporción de 3: 1, suplementado con 100 U/ml de IL-2. Las células se recolectaron después de 2 a 3 días y se expandieron en presencia de 50 U/ml de IL-2. Pueden usarse métodos similares, como se describe en el presente documento, para la expresión lentiviral de los polipéptidos Bob1TCR y caspasa-9 quimérica.

Ampliación de la producción de células aloagotadas genéticamente modificadas

La ampliación del proceso de transducción para aplicación clínica utilizó matraces T75 no tratados con cultivo de tejidos (Nunc, Rochester, NY), que se recubrieron con 10 ml de OKT3 1 pg/ml o 10 ml de fibronectina 7 pg/ml a 4 °C durante la noche. También se utilizaron bolsas de etileno propileno fluorado tratadas en corona para una mayor adherencia celular (2PF-0072AC, American Fluoroseal Corporation, Gaithersburg, MD). Las células aloagotadas se sembraron en matraces recubiertos con OKT3 a razón de 1 x 10⁶ células/ml. Se añadieron 100 U/ml de IL-2 al día siguiente. Para la transducción retroviral, se cargaron matraces o bolsas recubiertas con retronectina una vez con 10 ml de sobrenadante que contenía retrovirus durante 2 a 3 horas. Se sembraron células T activadas con OKT3 a razón de 1 x 10⁶ células/ml en medio que contenía vector retroviral reciente y medio de cultivo de células T en una proporción de 3: 1, suplementado con 100 U/ml de IL-2. Las células se recolectaron a la mañana siguiente y se expandieron en matraces T75 o T175 tratados con cultivo de tejidos en medio de cultivo suplementado con entre aproximadamente 50 y 100 U/ml de IL-2 a una densidad de siembra de entre aproximadamente 5 * 10⁵ células/ml a ⁸ * 10⁵ células/ml.

Selección inmunomagnética de CD19

Se utilizó CD19 como marcador; se pueden usar otros marcadores adecuados para la selección inmunomagnética. La selección inmunomagnética para CD19 se realizó 4 días después de la transducción. Las células se marcaron con microperlas paramagnéticas conjugadas con anticuerpos monoclonales de ratón anti-CD19 humano (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) y se seleccionaron en columnas MS o LS en experimentos a pequeña escala y en un dispositivo de selección automatizado CliniMacs Plus en experimentos a gran escala. Las células seleccionadas con CD19 se expandieron durante 4 días más y se criopreservaron el día ⁸ después de la transducción. Estas células se denominaron "células aloagotadas genéticamente modificadas".

Inmunofenotipado y análisis de pentámeros

El análisis de citometría de flujo (software FACSCalibur y CellQuest; Becton Dickinson) se realizó utilizando los siguientes anticuerpos: CD3, CD4, CD⁸ , CD19, CD25, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD56 y CD62L. Se encontró que CD19-PE (Clon 4G7; Becton Dickinson) proporciona una tinción óptima y se usó en todos los análisis posteriores. Se utilizó un control no transducido para establecer el cuadrante negativo para CD19. Se usó un pentámero HLA, HLA-B⁸ -RAKFKQLL (Proimmune, Springfield, VA) para detectar células T que reconocen un epítopo del antígeno lítico del EBV (BZLF1). Se usó el pentámero HLA-A2-NLVPMVATV para detectar células T que reconocen un epítopo del antígeno CMV-pp65.

Inducción de apoptosis con inductor químico de dimerización, AP20187

La funcionalidad del gen suicida se evaluó agregando un homodimerizador sintético de molécula pequeña, AP20187 (Ariad Pharmaceuticals; Cambridge, MA), a una concentración final de 10 nM el día siguiente a la selección inmunomagnética de CD19. También se puede utilizar AP1903. Las células se tiñeron con anexina V y 7-aminoactinomicina (7-AAD) (BD Pharmingen) a las 24 horas y se analizaron mediante citometría de flujo. Las células negativas para anexina V y 7-AAD se consideraron viables, las células que fueron positivas para anexina V fueron apoptóticas y las células que fueron positivas para anexina V y 7-AAD fueron necróticas. El porcentaje de muerte inducida por dimerización se corrigió para la viabilidad inicial de la siguiente manera: Porcentaje de muerte = 100% -(% de viabilidad en células tratadas con AP20187 % de viabilidad en células no tratadas).

Evaluación de la expresión transgénica después de un cultivo extendido y reactivación.

Las células se mantuvieron en medio de células T que contenía 50 U/ml de IL-2 hasta 22 días después de la transducción. Una parte de las células se reactivó en placas de 24 pocillos recubiertas con 1 pg/ml de OKT3 y 1 pg/ml de anti-CD28 (Clon CD28.2, BD Pharmingen, San José, CA) durante 48 a 72 horas. La expresión de CD19 y la función del gen suicida en células tanto reactivas como no reactivas se midieron el día 24 o 25 después de la transducción.

En algunos experimentos, las células también se cultivaron durante 3 semanas después de la transducción y se estimularon con PBMC alogénicas irradiadas con 30G a una relación respondedor: estimulador de 1: 1. Después de 4 días de cocultivo, una parte de las células se trató con AP20187 10 nM. La muerte se midió mediante tinción con anexina V/7-AAD a las 24 horas, y se evaluó el efecto del dimerizador sobre las células T específicas del virus espectador mediante análisis de pentámeros en células tratadas y no tratadas con AP20187.

Se deben determinar y definir las condiciones óptimas de cultivo para mantener la competencia inmunológica de las células T modificadas con genes suicidas para cada combinación de interruptor de seguridad, marcador seleccionable y tipo de célula, ya que el fenotipo, el repertorio y la funcionalidad pueden verse afectados por la estimulación utilizada para la activación de células T policlonales, método de selección de células transducidas y duración del cultivo.

Ensayo clínico de fase I de células T aloagotadas transducidas con el gen suicida de caspasa-9 inducible después de un trasplante de células madre haploidénticas

Este ejemplo presenta los resultados de un ensayo clínico de fase 1 que utiliza una estrategia alternativa de genes suicidas. Brevemente, las células mononucleares de sangre periférica del donante se cultivaron conjuntamente con células linfoblastoides transformadas con EBV irradiadas del receptor (40: 1) durante 72 horas, aloagotadas con una inmunotoxina CD25 y luego se transdujeron con un sobrenadante retroviral que porta el gen suicida iCasp9 y un marcador de selección (ACD19); ACD19 permitió el enriquecimiento a > 90% de pureza mediante selección inmunomagnética.

En este documento se proporciona un ejemplo de un protocolo para la generación de un producto de terapia de células T que comprende un ácido nucleico quimérico que codifica Caspasa-9. Este ejemplo puede modificarse para el uso de un vector Bob1, como se describe en el presente documento. En determinadas formas de realización, se pueden usar células T autólogas para este enfoque, o células T después de SCT alogénico (origen del donante pero tolerado) o células T del donante. Este ejemplo analiza el uso de células aloagotadas, sin embargo, pueden utilizarse células T del donante aloagotadas o células T del donante no aloagotadas. Pueden usarse, como se describe en el presente documento las células modificadas que comprenden el vector Bob1 pueden comprender además un ácido nucleico que codifica Caspasa-9 quimérico, u otro ácido nucleico que codifica polipéptidos, tales como los polipéptidos estimulantes quiméricos descritos en el presente documento.

En algunas composiciones y métodos, el TCR específico de Bob1 puede expresarse en células T junto con un polipéptido quimérico Caspasa-9, proporcionando así células T modificadas que comprenden un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un TCR de Bob1 y un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico Caspasa-9. Los polinucleótidos que codifican el polipéptido quimérico Caspasa-9 y los polinucleótidos que codifican TCR de Bob1 se pueden transfectar o transducir en las células en el mismo vector, en cis, o en vectores separados, en trans. Por lo tanto, los dos polipéptidos pueden expresarse usando dos ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, dos plásmidos o dos virus, y las células T pueden ser, por ejemplo, transfectadas dos veces, o en realizaciones particulares, los dos ácidos nucleicos pueden ser transfectados conjuntamente. En otras realizaciones, los dos polipéptidos pueden expresarse en un ácido nucleico, tal como, por ejemplo, en el mismo plásmido o virus. El ácido nucleico puede expresar los dos polipéptidos usando dos promotores separados, uno para el TCR y otro para el polipéptido quimérico Caspasa-9. O, en otras realizaciones, los dos polipéptidos se pueden expresar usando el mismo promotor. En esta realización, los dos polipéptidos pueden estar separados por un polipéptido escindible, tal como, por ejemplo, una secuencia 2A.

Material de origen

Se obtuvieron hasta 240 ml (en 2 colecciones) de sangre periférica del donante del trasplante de acuerdo con los protocolos establecidos. En algunos casos, dependiendo del tamaño del donante y del receptor, se realizó una leucaféresis para aislar suficientes células T. También se extrajeron 10-30 cc de sangre del receptor y se usaron para generar la línea celular linfoblastoide transformada con el virus de Epstein Barr (EBV) usada como células estimuladoras. En algunos casos, según el historial médico y/o la indicación de un recuento bajo de células B, los LCL se generaron utilizando células mononucleares de sangre periférica de parientes de primer grado (por ejemplo, padres, hermanos o descendientes).

Generación de células aloagotadas

Se generaron células aloagotadas a partir de los donantes de trasplante como se presenta en el presente documento. Se cocultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos con líneas de células linfoblastoides (LCL) transformadas con el virus de Epstein Barr (EBV) del receptor irradiado a una proporción de respondedor a estimulador de 40: 1 en medio sin suero (AIM V; Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 72 horas, las células T activadas que expresan CD25 se agotaron del cocultivo mediante incubación durante la noche en inmunotoxina RFT5-SMPT-dgA. El aloagotamiento se considera adecuado si la población de CD3+CD25+ residual era <1% y la proliferación residual por incorporación de 3H-timidina era < 10%.

Para los métodos discutidos en estos ejemplos, también se pueden usar células T autólogas, obtenidas del paciente.

Producción retroviral

Se generó un clon de la línea productora retroviral para el constructo iCasp9-ACD19. También se generó un banco de células maestras del productor. Se realizaron pruebas del banco de células maestras para excluir la generación de retrovirus competentes para la replicación y la infección por Mycoplasma, VIH, VHB, VHC y similares. La línea productora se hizo crecer hasta confluencia, el sobrenadante se recogió, se filtró, se dividió en alícuotas y se congeló rápidamente y se almacenó a -80 °C. Se realizaron pruebas adicionales en todos los lotes de sobrenadante retroviral para excluir el retrovirus competente para replicación (RCR) y se emitieron con un certificado de análisis, según el protocolo.

Transducción de células aloagotadas

Los linfocitos T aloagotadas se transdujeron usando fibronectina. Se recubrieron placas o bolsas con fragmento de fibronectina recombinante CH-296 (RetronectinMR, Takara Shuzo, Otsu, Japón). El virus se unió a la retronectina incubando el sobrenadante del productor en placas o bolsas recubiertas. A continuación, las células se transfirieron a placas o bolsas recubiertas con virus. Después de la transducción, se expandieron las células T aloagotadas, alimentándolas con IL-2 dos veces por semana para alcanzar la cantidad suficiente de células de acuerdo con el protocolo.

Selección inmunomagnética de CD19

La selección inmunomagnética para CD19 se realizó 4 días después de la transducción. Las células se marcan con microperlas paramagnéticas conjugadas con anticuerpos anti-CD19 humanos monoclonales de ratón (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) y se seleccionan en un dispositivo de selección automática CliniMacs Plus. Dependiendo del número de células requeridas para la infusión clínica, las células se criopreservaron después de la selección de CliniMacs o se expandieron más con IL-2 y se criopreservaron el día ⁶ o el día ⁸ después de la transducción.

Congelación

Se extrajeron alícuotas de células para probar la eficacia de la transducción, la identidad, el fenotipo y el cultivo microbiológico, según lo requiera la FDA para las pruebas de liberación final. Las células se crioconservaron antes de la administración de acuerdo con el protocolo.

Fármacos para estudio

RFT5-SMPT-dgA

RFT5-SMPT-dgA es un IgG1 murino anti-CD25 (cadena a del receptor de IL-2) conjugado mediante un entrecruzador heterobifuncional [N-succinimidiloxicarbonil-a-metil-d-(2-piridiltio)tolueno] (SMPT) para desglicosilar químicamente la cadena A de ricino (dgA). RFT5-SMPT-dgA se formula como una solución estéril a razón de 0.5 mg/ml.

Homodimerizador sintético, AP1903

Mecanismo de acción: La muerte celular inducible por AP1903 se logra expresando una proteína quimérica que comprende la porción intracelular del receptor humano (proteína Caspasa-9), que indica la muerte celular apoptótica, fusionada a un dominio de unión a fármaco derivado de la proteína de unión a FK506 humana (FKBP). Esta proteína quimérica permanece inactiva dentro de las células hasta la administración de AP1903, que entrecruza los dominios de FKBP, iniciando la señalización de caspasa y la apoptosis.

Toxicología: AP1903 ha sido evaluado como un nuevo fármaco en investigación (IND) por la FDA y ha completado con éxito un estudio de seguridad clínica de fase I. No se observaron efectos adversos significativos cuando se administró AP1903 en un intervalo de dosis de 0.011 mg/kg a 1.0 mg/kg.

Farmacología/Farmacocinética: Los pacientes recibieron 0.4 mg/kg de AP1903 como una infusión de 2 h, según los datos de Pk publicados que muestran concentraciones plasmáticas de 10 ng/ml, en el intervalo de dosis de 0.011 mg/kg a 1.0 mg/kg con niveles en plasma que caen al 18% y 7% del máximo a las 0.5 y 2 horas después de la dosis (véase, por ejemplo, luliucci, JD et al., J. Clin. Pharmacol. 2001,41: 870-9).

Perfil de efectos secundarios en humanos: No se produjeron efectos adversos graves durante el estudio de fase 1 en voluntarios. La incidencia de eventos adversos fue muy baja después de cada tratamiento, y todos los eventos adversos fueron de gravedad leve. Solo un evento adverso se consideró posiblemente relacionado con AP1903. Este fue un episodio de vasodilatación, presentado como "enrojecimiento facial" para 1 voluntario a la dosis de AP1903 de 1.0 mg/kg. Este evento ocurrió 3 minutos después del inicio de la perfusión y se resolvió después de 32 minutos de duración. El investigador consideró que todos los demás eventos adversos informados durante el estudio no estaban relacionados o tenían una relación improbable con el fármaco del estudio. Estos eventos incluyeron dolor en el pecho, síndrome gripal, halitosis, dolor de cabeza, dolor en el lugar de la inyección, vasodilatación, aumento de la tos, rinitis, erupción cutánea, hemorragia de las encías y equimosis.

Los pacientes que desarrollaron GvHD de grado I se trataron con 0.4 mg/kg de AP1903 en una infusión de 2 horas. Los protocolos para la administración de AP1903 a pacientes que desarrollan GvHD de Grado I se establecieron como sigue. Los pacientes que desarrollan GvHD después de la infusión de células T aloagotadas se someten a una biopsia para confirmar el diagnóstico y reciben 0.4 mg/kg de AP1903 en una infusión de 2 h. Los pacientes con GvHD de Grado I no recibieron ninguna otra terapia inicialmente, sin embargo, si mostraban progresión de la GvHD, la terapia convencional de GvHD se administró según las pautas institucionales. A los pacientes que desarrollaron GvHD de grados 2 a 4 se les administró terapia inmunosupresora sistémica estándar según las pautas institucionales, además del fármaco dimerizador AP1903.

Instrucciones de preparación e infusión: AP1903 inyectable se obtiene como una solución concentrada de 2,33 ml en un vial de 3 ml, a una concentración de 5 mg/ml, (es decir, 10.66 mg por vial). Antes de la administración, la dosis calculada se diluyó a 100 ml en solución salina normal al 0.9% para infusión. Se administró AP1903 inyectable (0.4 mg/kg) en un volumen de ^{1 0 0} ml mediante infusión intravenosa durante ² horas, utilizando un equipo de infusión esterilizado sin DEHP y sin óxido de etileno y una bomba de infusión.

El constructo de expresión del gen suicida iCasp9 (por ejemplo, SFG.iCasp9.2A.ACD19) consiste en caspasa-9 inducible (iCasp9) unida, mediante una secuencia escindible similar a 2A, a CD19 humana truncado (ACD19). iCasp9 incluye una proteína de unión a FK506 humana (FKBP12; GenBank AH002 818) con una mutación F36V, conectada mediante un enlazador Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly a Caspasa-9 humana (CASP9; GenBank NM 001229). La mutación F36V puede aumentar la afinidad de unión de FKBP12 al homodimerizador sintético, AP20187 o AP1903. El dominio de reclutamiento de caspasa (CARD) se ha eliminado de la secuencia de Caspasa-9 humana y su función fisiológica se ha reemplazado por FKBP12. El reemplazo de CARD por FKBP12 aumenta la expresión y función del transgén. La secuencia de tipo 2A codifica un péptido de 18 aminoácidos del virus del insecto Thosea Asigna, que media > 99% de escisión entre un residuo de glicina y prolina terminal, lo que da como resultado 17 aminoácidos adicionales en el extremo terminal C de iCasp9 y un residuo de prolina adicional en el extremo terminal N de CD19. ACD19 consta de CD19 de longitud completa (GenBank NM 001770) truncado en el aminoácido 333 (TDPTRRF), que acorta el dominio intracitoplasmático de 242 a 19 aminoácidos y elimina todos los residuos de tirosina conservados que son sitios potenciales para la fosforilación.

Estudios in vivo

Tres pacientes recibieron células T iCasp9+ después del trasplante de células madre haplo-CD34+ (SCT), a niveles de dosis entre aproximadamente 1 * 10⁶ a aproximadamente 3 * 10⁶ células/kg.

Las células T infundidas se detectaron in vivo mediante citometría de flujo (CD3+ ACD19+) o qPCR tan pronto como el día 7 después de la infusión, con una expansión máxima de 170 ± 5 (día 29 ± 9 después de la infusión). Dos pacientes desarrollaron aGvHD de grado l/ll y la administración de AP1903 provocó una ablación > 90% de las células CD3+ ACD19+, dentro de los 30 minutos de la infusión, con una reducción logarítmica adicional dentro de las 24 horas, y la resolución de la aGvHD en la piel y el hígado dentro de las 24 horas, lo que demuestra que el transgén iCasp9 era funcional in vivo.

Los experimentos ex vivo confirmaron estos datos. Además, las células T aloagotadas residuales pudieron expandirse y fueron reactivas a virus (CMV) y hongos (Aspergillus fumigatus) (producción de IFN-y). Estos estudios in vivo encontraron que una sola dosis de fármaco dimerizador puede reducir o eliminar la subpoblación de células T que causan la GvHD, pero puede ahorrar CTL específicos del virus, que luego pueden volver a expandirse.

Reconstitución inmunológica

Dependiendo de la disponibilidad de células y reactivos del paciente, se pueden obtener estudios de reconstitución inmunológica (inmunofenotipificación, función de células T y B) a intervalos seriados después del trasplante. Se analizarán varios parámetros que miden la reconstitución inmune resultante de células T aloagotadas transducidas con iCaspasa. El análisis incluye mediciones repetidas del recuento total de linfocitos, número de células T y B CD19 y análisis FACS de subconjuntos de células T (CD3, CD4, CD⁸ , CD16, CD19, CD27, CD28, CD44, CD62L, CCR7, CD56, CD45RA, CD45RO, receptores de células T alfa/beta y gamma/delta). Dependiendo de la disponibilidad de las células T de un paciente, también se analizan marcadores de células T reguladoras tales como CD41CD251 FoxP3. Se extraen aproximadamente 10-60 ml de sangre del paciente, cuando es posible, 4 horas después de la infusión, semanalmente durante 1 mes, mensualmente x 9 meses y luego a los 1 y 2 años. La cantidad de sangre extraída depende del tamaño del receptor y no excede de ¹ a ² cc/kg en total (lo que permite la extracción de sangre para la atención clínica y la evaluación del estudio) en cualquier extracción de sangre.

Polipéptidos caspasa-9 modificados con menor actividad basal y mínima pérdida de IC50 del ligando

La señalización basal, la señalización en ausencia de agonista o agente activador, prevalece en una multitud de biomoléculas. Por ejemplo, se ha observado en más de 60 receptores acoplados a proteína G de tipo silvestre (GPCR) de múltiples subfamilias [1], quinasas, tales como ERK y abl [2], inmunoglobulinas de superficie [3] y proteasas. Se ha planteado la hipótesis de que la señalización basal contribuye a una amplia variedad de eventos biológicos, desde el mantenimiento de la pluripotencia de las células madre embrionarias, el desarrollo y diferenciación de las células B [4­ ⁶ ], la diferenciación de las células T [2, 7], el desarrollo de los timocitos [⁸ ], la endocitosis y tolerancia a fármacos [9], autoinmunidad [10], al crecimiento y desarrollo de las plantas [11]. Si bien su significado biológico no siempre se comprende por completo o es evidente, la señalización basal defectuosa puede tener consecuencias graves. La señalización defectuosa de la proteína G basal ha dado lugar a enfermedades tales como retinosis pigmentaria, daltonismo, diabetes insípida nefrogénica, resistencia familiar a ACTH e hipercalcemia hipocalciúrica familiar [12, 13]. A pesar de que la homo-dimerización del iniciador de tipo silvestre Caspasa-9 es energéticamente desfavorable, lo que los convierte en su mayoría en monómeros en solución [14-16], la actividad basal inherente de bajo nivel de la Caspasa-9 sin procesar [15, 17] se mejora en la presencia del "apoptosoma" basado en Apaf-¹ , su regulador alostérico natural [⁶ ]. Además, los niveles de expresión suprafisiológica y/o la co-localización podrían conducir a la dimerización impulsada por la proximidad, mejorando aún más la activación basal. Las células modificadas de la presente solicitud pueden comprender ácidos nucleicos que codifican un polipéptido quimérico Caspasa-9 que tiene una menor actividad de señalización basal. En la siguiente tabla se proporcionan ejemplos de mutantes de Caspasa-9 con menor señalización basal. Los polinucleótidos que comprenden mutantes de Caspasa-9 con menor señalización basal pueden expresarse en las células modificadas utilizadas para la terapia celular en este documento. En estos ejemplos, las células modificadas pueden incluir un interruptor de seguridad, que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido Caspasa-9 quimérico de señalización basal inferior. En el caso de un evento adverso después de la administración de las células modificadas que comprenden los TCR de Bob1 en este documento, la actividad de Caspasa-9 puede inducirse administrando el dimerizador al paciente, induciendo así la apoptosis y la eliminación de algunas o todas las células modificadas. En algunos ejemplos, la cantidad de dimerizador administrada puede determinarse como una cantidad diseñada para eliminar la mayor cantidad, al menos el 80% o el 90% de las células modificadas. En otros ejemplos, la cantidad de dimerizador administrada puede determinarse como una cantidad diseñada para eliminar solo una porción de las células modificadas, con el fin de aliviar los síntomas o condiciones negativos, dejando una cantidad suficiente de células terapéuticas modificadas en el paciente, con el fin de continuar con la terapia. Los métodos para usar polipéptidos quiméricos de Caspasa-9 para inducir apoptosis se discuten en la solicitud PCT PCT/US2011/037381 de Malcolm K. Brenner et al., titulada Methods for Inducing Selective Apoptosis, presentada el 20 de mayo de 2011, y en la solicitud de patente de los Estados Unidos serial número 13/112,739 de Malcolm K. Brenner et al., Titulada Methods for Inducing Selective Apoptosis, presentada el 20 de mayo de 2011, ahora la patente de los Estados Unidos No. 9,089,520. Los polipéptidos de caspasa quiméricos que tienen actividad basal modificada se discuten en la solicitud internacional de patente serial No. PCT/US2014/022004, publicada como WO2014/164348 el 5 de marzo de 2015, titulado "Modified Caspase Polypeptides and Uses Thereof', y en la solicitud internacional de patente con serial No. PCT/US2015/019186, publicado como WO2015/134877 el 11 de septiembre de 2015 y titulada "Caspase Polypeptides having Modified Activity and Uses Thereof'. Los métodos para inducir la apoptosis parcial de las células modificadas terapéuticas se discuten en solicitud PCT No. PCT/US14/40964, publicado como WO2014/197638 el 11 de diciembre de 2014, por Kevin Slawin et al., titulada Methods for Inducing Partial Apoptosis Using Caspase Polypeptides.

Tabla 3: Clases de mutantes de cas asa activdad basal

En la Figura 15 se proporciona un ejemplo de un plásmido, pBP0954-pSFG-iC9.T2A-Bob-1, que puede usarse para expresar un ácido nucleico de la presente solicitud, que comprende polinucleótidos que codifican un TCR de Bob1 y un polipéptido quimérico caspasa9 inducible. En este ejemplo, el polipéptido Caspasa-9 truncado incluye la mutación N405Q; otros polipéptidos de Caspasa-9 truncados, por ejemplo, los polipéptidos de Caspasa-9 truncados proporcionados en este documento, por ejemplo, los que tienen secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs: 58, 108, 110, 112 o 116, por ejemplo, los codificados por secuencias de nucleótidos SEQ ID NOs: 57, 107, 109, 111 o 115, pueden sustituirse por el polinucleótido que codifica el polipéptido Caspasa-9 N405Q usado en el plásmido. Además, se entiende que el orden de los polipéptidos, separados por polinucleótidos que codifican el enlazador escindible del polipéptido 2A, puede variar. En este ejemplo, el polinucleótido que codifica el polipéptido quimérico inducible de Caspasa-9 está ubicado junto a un polinucleótido que codifica el polipéptido 2A y está separado por el polipéptido Bob1TCRp. En otras realizaciones, el polinucleótido que codifica el polipéptido quimérico inducible de Caspasa-9 puede estar ubicado adyacente a un polinucleótido que codifica el polipéptido 2A y separado por el polipéptido Bob1TCRa. En otras realizaciones más, el polinucleótido que codifica el polipéptido Caspasa09 quimérico inducible puede ubicarse entre los polipéptidos TCRa de Bob1 y TCRp de Bob1, separados a cada lado del polinucleótido inducible que codifica Caspasa-9 por dos polinucleótidos, cada uno de los cuales codifica polipéptidos 2A. Las secuencias apropiadas enlazadoras de polinucleótidos, por ejemplo, las proporcionadas en este documento, también pueden ubicarse directamente adyacentes a cualquiera de los polinucleótidos discutidos en este documento.

Referencias bibliográficas citadas o que brindan apoyo adicional al ejemplo actual

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Los ejemplos de secuencias que pueden usarse para expresar polipéptidos quiméricos Caspasa-9 incluyen las siguientes secuencias. Las secuencias de la presente invención pueden seleccionarse para su inclusión en el vector de expresión apropiado como se describe en el presente documento.

SEQ ID NO: 50 secuencia de nucleótidos de la secuencia 5' LTR

TG AAAG ACCCC AC C TG T AG G TTTG G CAAGCT AG CTT AAG T AACG CC ATTTT G CAAGGCATG G AAAAAT ACAT AAC T GAG AAT AG AAAAG TT CAG AT C AAG G TCAG G AAC AG AT GG AACAG CT G AATATG G G C CAAAC AG G ATATCTG TG G TAAG CAG TTCC TG C C C CG G C TC AG G G C C AAG A ACAG ATG G AACAG CT GAAT AT GG GCC AAACAG G AT AT CT G TGG T AAGC AG TT CCTGCCCC G G CT C AG GGCC AAG AAC AG AT GGT CCCC AG AT G CG G TCCAG CCCT CAGC AG TTT CT AG A G AACCAT CAGAT G TTT CCAGGG T G CCCCAAG G ACCTG AAATG AC C C TG TG C CTT ATTT GAA CT AAC CAATC AG TT CGCTT CT CG CTT CT G TTC G C G C G C TT AT GCT CCCCG AG CT CAATAAA AG AG C C C AC AAC C C C TC ACTC G G G G C G C CAG TC CTC C G ATTG ACTG AG TC G C C CG G G TA CCCG T GT AT CCAAT AAACCCT CTT GC AG TT GCAT CCG ACTT GT GGT CT CGCT G TTCCTTGG G AG G G T CT CCT CT G AGT G ATTG AC TAC CC G T CAG CG G G G G T CTTT CA SEQ ID NO: 51 secuencia de nucleótidos de Fv (FKBP12v36 humano)

G G AG TG C AG G TG G AAAC C ATC TCC C C AG G AG ACG G G C G C AC C TTC C C CAAG C G C G G CC A G AC C TG C G TG G TG CAC TAC AC CG G G ATG CTTG AAG ATG G AAAG AAAG TTG ATTC CTC C CG G G AC AG AAAC AAG C C CTTTAAG TTTATG C TAG G C AAG C AG G AG G TG ATC C G AG G CTG G G A AG AAG GGG TT G CCCAG AT G AG T GTGG GT CAGAG AG CC AAAC T G ACT AT AT CT CCAG ATT A T GCCT AT GGT GCCACT G G G CACCCAG G CAT CAT CCCACCACAT GCCACT CT CGT CTT CGA TG TG G AG C TTC TAAAACTG G AA SEQ ID NO: 52. Secuencia de aminoácidos de Fv (FKBP12v36 humano)

G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K V D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E SEQ ID NO: 53. Secuencia de nucleótidos del enlazador GS

TCTGGCGGTGGATCCGGA SEQ ID NO: 54. Secuencia de aminoácidos del enlazador GS

S G G G S G SEQ ID NO: 55. Secuencia de nucleótidos del enlazador (entre el enlazador GS y Casp 9)

GTCGAC SEQ ID NO: 56. Secuencia de aminoácidos del enlazador (entre el enlazador GS y Casp 9)

VD SEQ ID NO: 57. Secuencia de nucleótidos de Casp 9 (truncada)

GG ATTTGGTG ATGTCGGTGCTCTTG AG AGTTTG AGG GG AAATG CAG ATTTG GCTTACATC C TG AGC AT GGAGCCCTGTGGCCACT GCCT CATT AT CAAC AAT GT GAACTTCTGCCGT GAGT CCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTC TCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTG GCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCAT T CTCT CT CACGGCT GTCAGGCCAGCCACCT GCAGTTCCCAGGGGCT GT CT ACGGCACAGA TGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAG CCTGGG AGGG AAGCCC AAGCT CTTTTT CAT CCAGG CCT GT GGT GGGGAGCAG AAAG ACC ATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGC CAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTA GTTT GCCCACACCC AGT GACATCTTT GT GT CCT ACT CTACTTT CCC AG GTTTT GTTT CCTGG AGGG ACCCCAAG AGTG GCTCCTG GT AC GTT GAGACCCT GG ACGACAT CTTT GAGCAGTG GGCTC ACT CT GAAG ACCT GC AGT CCCT CCT GCTT AGG GT CGCT AATGCTGTTTC GGT G AA AGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAA CATCA SEQ ID NO: 58. Secuencia de aminoácidos de caspasa 9 (truncada): dominio de CARD eliminado

G F G D V G A L E S L R G N A D L A Y I L S M E P C G H C L I I N N V N F C R E S G L R T R T G S N I D C E K L R R R F S S L H F M V E V K G D L T A K K M V L A L L E L A Q Q D H G A L D C C V V V I L S H G C Q A S H L Q F P G A V Y G T D G C P V S V E K I V N I F N G T S C P S L G G K P K L F F I Q A C G G E Q K D H G F E V A S T S P E D E S P G S N P E P D A T P F Q E G L R T F D Q L D A I S S L P T P S D I F V S Y S T F P G F V S W R D P K S G S W Y V E T L D D I F E Q W A H S

SEQ ID NO: 59. Secuencia enlazadora de nucleótidos (entre caspasa 9 y 2A)

GCTAGCAGA SEQ ID NO: 60. Secuencia enlazadora de aminoácidos (entre caspasa 9 y 2A)

ASR SEQ ID NO: 61. virus-2A de Thosea asigna de la secuencia de nucleótidos precursora de la proteína de la cápside GCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCC SEQ ID NO: 62 virus-2A de Thosea asigna de la secuencia de aminoácidos precursora de la proteína de la cápside AEGRGSLLTCGDVEENPGP SEQ ID NO: 63. Secuencia de nucleótidos de CD19 humano (dominio citoplásmico A) (dominio transmembrana en negrita)

ATGCCACCT CCT CGCCTCCT CTT CTT CCT CCT CTT CCT CACCCCC AT GG AAGT CAGGCCCG AGGAACCTCT AGTGGT GAAGGT GGAAGAGGGAGAT AACGCT GTGCT GCAGTGCCT CAAG GGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACC CTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCAT CTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGG GCCCCCCTCTGAGAAGGCCT GGCAGCCTGGCT GGACAGT CAAT GTGGAGGGCAGCGGG GAGCT GTT CCGGT GG AAT GTTT CGGACCT AGGT GGCCTGGGCTGT GGCCT G AAGAACAG GT CCT CAGAGGGCCCCAGCT CCCCTT CCGGG AAGCT CAT GAGCCCCAAGCT GT AT GT GT GGGCC AAAG ACCGCCCTG AGATCT GG G AGGG AGAGCCT CCGT GT CT CCCACCG AGGGAC AGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCT GT CCT GT GGGGT ACCCCCTGACT CT GT GT CCAGGGGCCCCCT CT CCTGGACCCATGT GC ACCCCAAGGGGCCT AAGT CATT GCT GAGCCT AGAGCTG AAG G ACG AT CGCCCGGCC AG A GATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGG AAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGG CCAGT ACT AT GGCACT GGCT GCT GAGGACT GGT GGCTGGAAGGT CTCAGCTGTG ACTTTG GCTTATCTGATCTTCTGCCTGTGTTCCCTTGTGGGCATTCTTCATCTTCAAAGAGCCCTGG T CCT G AGG AGGAAAAGAAAGCG AAT G ACT G ACCCC ACC AGG AG ATT C SEQ ID NO: 64. Secuencia de aminoácidos de CD19 humano (dominio citoplásmico A)

M P P P R L L F F L L F L T P M E V R P E E P L V V K V E E G D N A V L Q C L K G T S D G P T Q Q L T W S R E S P L K P F L K L S L G L P G L G I H M R P L A I W L F I F N V S Q Q M G G F Y L C Q P G P P S E K A W Q P G W T V N V E G S G E L F R W N V S D L G G L G C G L K N R S S E G P S S P S G K L M S P K L Y V W A K D R P E I W E G E P P C L P P R D S L N Q S L S Q D L T M A P G S T L W L S C G V P P D S V S R G P L S W T H V H P K G P K S L L S L E L K D D R P A R D M W V M E T G L L L P R A T A Q D A G K Y Y C H R G N L T M S F H L E I T A R P V L W H W L L R T G G W K V S A V T L A Y L I F C L C S L V G I L H L Q R A L V L R R K R K R M T D P T R R F SEQ ID NO: 65. Secuencia de nucleótidos de 3'LTR TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATG GAAAAAT ACAT AACT GAGAAT AG AG AAGTT C AG AT CAAGGT CAG G AACAG AT GG AAC AGCT GAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGA AC AG ATGG AAC AGCTGA AT ATGG GCC AAACAG GATATCTGTG GTAAG C AGTTCCTG CCCC GGCT CAGGGCC AAGAACAG AT GGT CCCCAG AT GCGGT CCAG CCCT C AGC AGTTT CT AG A GAACCAT CAG AT GTTT CCAGGGTGCCCCAAGG ACCT G AAAT GACCCTGT GCCTT ATTT G AA CTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAA AGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTA CCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG GAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCA

Ejemplo 7: Adición de un polipolipéptido coestimulante quimérico inducible

La señalización del receptor de células T se puede inducir utilizando un inductor químico de dimerización (CID) en combinación con un polipéptido coestimulante quimérico que incluye una región de multimerización que se une al CID, las células T se modificaron para expresar el polipéptido coestimulante quimérico inducible, que estaba enlazado con 1, 2 o 3 fragmentos de FKBP. Las células expresaron el receptor quimérico y demostraron activación de células T dependiente de CID (Spencer, D.M. et al., Science, 1993. 262: pág. 1019-1024). Los métodos y composiciones para la coexpresión de un polipéptido que tiene una región de reconocimiento de antígenos, tal como, por ejemplo, receptores de antígenos quiméricos o TCR en células T, se describen, por ejemplo, en la solicitud internacional de patente serial No. PCT/US2014/026734, publicado como WO2014/151960 el 25 de septiembre de 2014, titulado "Methods for Controlling T Cell Proliferation" y en la solicitud internacional de patente serial No. PCT/US2015/015829, publicado como WO2015/123527 el 20 de agosto de 2015, titulada "Methods for Activating T cells Using an Inducible Chimeric Polypeptide").

Ejemplo 8: Ejemplos de secuencias particulares de ácidos nucleicos y aminoácidos

Las siguientes secuencias adicionales pueden usarse en el diseño de vectores de expresión que codifican los TCR de Bob1 y los polipéptidos quiméricos Caspasa-9 proporcionados en este documento.

SEQ ID NO: 66. Secuencia de nucleótidos de la secuencia 5'LTR

T GAAAGACCCCACCTGT AGGTTT GGCAAGCT AGCTT AAGT AACGCCATTTTGCAAGGCAT G GAAAAATACAT AACT G AG AAT AGAAAAGTT CAG AT CAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCT GAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGA ACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCC GGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCGAGATGCGGTCCAGCCGTCAGCAGTTTCTAGA GAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAA CTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTATGCTCCCCGAGCTCAATAAA AGAGCCCACAACCCCT CACT CGGGGCGCCAGTCCT CCGATT GACT GAGT CGCCCGGGTA CCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG GAGGGT CTCCT CTGAGTGATT GACTACCCGTCAGCGGGGGT CTTT CA SEQ ID NO: 67. virus-2A de Thosea asigna de la secuencia de nucleótidos precursora de la proteína de la cápside GCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCC

SEQ ID NO: 68. virus-2A de Thosea asigna de la secuencia de aminoácidos precursora de la proteína de la cápside AEGRGSLLTCGDVEENPGP

SEQ ID NO: 69. Secuencia de nucleótidos 3'LTR

TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATG

GAAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCT

GAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGA

ACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCC

GGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGA

GAACCAT CAGAT GTTT CC AGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCT GT G CCTT ATTTGAA

CT AACCAATCAGTT CGCTT CT CGCTT CTGTTCGCGCGCTT CTGCT CCCCG AGCT CAAT AAA

AGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTA

CCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG

GAGGGT CT CCT CT GAGTGATT GACTACCCGT C AGCGGGGGT CTTTCA SEQ ID NO: 70. (Secuencia de nucleótidos de enlazador-Fv1-Fv2-enlazador con sitios Xhol/Sall, (codones oscilantes en minúsculas en Fv2'))

CTCGAGTCTGGCGGTGGATCCGGAGGCGTTCAAGTAGAAACAATCAGCCCAGGAGACGG AAGGACTTTCCCCAAACGAGGCCAAACATGCGT AGTTCATT AT ACTGGGAT GCT CGAAGAT GGAAAAAAAGT AGAT AGT AGT AG AGACCGAAACAAACCATTT AAATTTAT GTT GGGAAAAC AAGAAGTAATAAGGGGCTGGGAAGAAGGTGTAGCACAAATGTCTGTTGGCCAGCGCGCAA AACT CACAATTT CTCCT GATT AT GCTTACGG AGCT ACCGGCCACCCCGGCAT CAT ACCCCC TCATGCCACACTGGTGTTTGACGTCGAATTGCTCAAACTGGAAGTCGAGGGaGTgCAgGTg GAgACgATtAGtCCtGGgGAtGGgAGaACcTTtCCaAAgCGcGGtCAgACcTGtGTIGTcCAcTAcAC cGGtATGCTgGAgGAcGGgAAgAAgGTgGActcTtcacGcGAtCGcAAtAAgCCtTTcAAgTTcATGcT cGGcAAgCAgGAgGTgATccGGGGgTGGGAgGAgGGcGTgGCtCAgATGTCgGTcGGgCAaCGa GCgAAgCTtACcATcTCaCCcGAcTAcGCgTAtGGgGCaACgGGgCAtCCgGGaATtATcCCtCCcC AcGCtACgCT cGT aTT cGAtGT g GAgcT cttg AAgCTtGagTCT GGCGGT GGATCCGGAGT CGAC

SEQ ID NO: 71. (Secuencia de aminoácidos de FV'FVLS) LESGGGSGGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCWHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQ EVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEVEGVQVETIS PGDGRTFPKRGQTCWHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSV GQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVD SEQ ID NO: 72. Secuencia de nucleótidos de FKBPv36 (Fv1) GGCGTTCAAGTAGAAACAATCAGCCCAGGAGACGGAAGGACTTTCCCCAAACGAGGCCAA ACAT G CGT AGTT C ATTATACT GGG AT G CTCG AAG AT GGAAAAAAAGTAGAT AGT AGTAG AG ACCGAAACAAACCATTTAAATTTATGTTGGGAAAACAAGAAGTAATAAGGGGCTGGGAAGA AGGT GT AGCACAAATGTCT GTT GGCCAGCGCGCAAAACTCACAATTTCTCCTGATT ATGCT T ACGGAGCT ACCGGCCACCCCGGCAT CAT ACCCCCT CATGCCAC ACT GGTGTTT GACGT C G AATT G CT C AAACT G GAA SEQ ID NO: 73. Secuencia de aminoácidos de FKBPv36 (Fv1) GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCWHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEE GVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE SEQ ID NO: 74. Secuencia de nucleótidos de FKBPv36 (Fv2) GGaGTgCAgGTgGAgACgATtAGtCCtGGgGAtGGgAGaACcTTtCCaAAgCGcGGtCAgACcTGtG TtGTcCAcTAcACcGGtATGCTgGAgGAcGGgAAgAAgGTgGActcTtcacGcGAtCGcAAtAAgCCtT TcAAgTTcATGcTcGGcAAgCAgGAgGTgATccGGGGgTGGGAgGAgGGcGTgGCtCAgATGTCg GTcGGgCAaCGaGCgAAgCTtACcATcTCaCCcGAcTAcGCgTAtGGgGCaACgGGgCAtCCgGG aATtAT cCCtCCcCAcG CtACgCT cGT aTT cGAtGTgGAgcTcttg AAgCT tGag

SEQ ID NO: 75. Secuencia de aminoácidos de FKBPv36 (Fv2) GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCWHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEE GVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE SEQ ID NO: 76. Secuencia de nucleótidos del enlazador (enlazador 1)

CTCGAG

SEQ ID NO: 77. Secuencia de aminoácidos del enlazador (enlazador 1)

LE

SEQ ID NO: 78. Secuencia de nucleótidos del enlazador (enlazador 2)

GTCGAGTCTGGCGGTGGATCCGGA

SEQ ID NO: 79. Secuencia de aminoácidos del enlazador (enlazador 2)

VESGGGSG

SEQ ID NO: 80. Secuencia de nucleótidos de FKBPv36 (Fv1) GGCGTTCAAGTAGAAACAATCAGCCCAGGAGACGGAAGGACTTTCCCCAAACGAGGCCAA ACAT G CGT AGTT C ATTAT ACTGGG AT G CT CG AAG AT GG AAAAAAAGT AG AT AGT AGT AG AG ACC GAAACAAAC CATTT AAATTT ATGTTG GG AAAACAAGAAGT AAT AAGGGGCTGGG AAG A AGGTGTAGCACAAATGTCTGTTGGCCAGCGCGCAAAACTCACAATTTCTCCTGATTATGCT T ACGGAGCT ACCGGCCACCCCGGCAT CAT ACCCCCT CATGCCAC ACTGGTGTTT GACGT C GAATTGCTCAAACTG GAA SEQ ID NO: 81. Secuencia de aminoácidos de FKBPv36 (Fv1) GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEE GVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE SEQ ID NO: 82. Secuencia de nucleótidos del enlazador (enlazador 3)

GTCGAG

SEQ ID NO: 83. Secuencia de aminoácidos del enlazador (enlazador 3)

VE SEQ ID NO: 84. Secuencia de nucleótidos FKBPv36 (Fv2) GGaGTgCAgGTgGAgACgATtAGtCCtGGgGAtGGgAGaACcTTtCCaAAgCGcGGtCAgACcTGtG TtGTcCAcTAcACcGGtATGCTgGAgGAcGGgAAgAAgGTgGActcTtcacGcGAtCGcAAtAAgCCtT TcAAgTTcATGcTcGGcAAgCAgGAgGTgATccGGGGgTGGGAgGAgGGcGTgGCtCAgATGTCg GTcGGgCAaCGaGCgAAgCTtACcATcTCaCCcGAcTAcGCgTAtGGgGCaACgGGgCAtCCgGG aATtAT cCCtCCcCAcG CtACgCT cGT aTT cGAtGTgGAgcTcttg AAgGT tGag

SEQ ID NO: 85. Secuencia de aminoácidos de FKBPv36 (Fv2) GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCWHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEE GVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE SEQ ID NO: 86. Secuencia de nucleótidos del enlazador (enlazador 4) TCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGAC

SEQ ID NO: 87. Secuencia de aminoácidos del enlazador (enlazador 4)

SGGGSGVD

SEQ ID NO: 88. Secuencia de nucleótidos del sitio de escisión consenso de la proteasa furina CGCGCAAAGCGT

SEQ ID NO: 89. Secuencia de aminoácidos del sitio de escisión consenso de la proteasa furina RAKR

SEQ ID NO: 90. Secuencia de nucleótidos del epítopo V5 GGAAAACCTATACCTAATCCATTGCTGGGCTTAGACTCAACA

SEQ ID NO: 91. Secuencia de nucleótidos del epítopo V5

GKPIPNPLLGLDST

SEQ ID NO: 92. Secuencia de nucleótidos del enlazador (enlazador 5) GGCAGCGGAAGC

SEQ ID NO: 93. Secuencia de aminoácidos del enlazador (enlazador 5)

GSGS

SEQ ID NO: 94. Secuencia de nucleótidos de P2A

GCAACGAATTTTTCCCTGCTGAAACAGGCAGGGGACGTAGAGGAAAATCCTGGTCCT SEQ ID NO: 95. Secuencia de aminoácidos de P2A

ATNFSLLKQAGDVEENPGP

SEQ ID NO 96. Secuencia de nucleótidos del enlazador (enlazador 6)

ACGCGT

SEQ ID NO: 97. Secuencia de aminoácidos del enlazador (enlazador 6)

TR

SEQ ID NO: 98. Secuencia de nucleótidos de ACD19

ATGCCCCCTCCTAGACT GCT GTTTTT CCT GCT CTTTCT CACCCCAAT GGAAGTT AGACCT G AGGAACCACTGGTCGTT AAAGT GGAAGAAGGT GATAAT GCT GTCCTCCAATGCCTT AAAG GGACCAGCGACGGACCAACGCAGCAACTGACTTGGAGCCGGGAGTCCCCTCTCAAGCCG TTTCTCAAGCTGTCACTTGGCCTGCCAGGTCTTGGTATTCACATGCGCCCCCTTGCCATTT GGCTCTTCATATTCAATGTGTCTCAACAAATGGGTGGATTCTACCTTTGCCAGCCCGGCCC CCCTTCTGAGAAAGCTTGGCAGCCTGGATGGACCGTCAATGTTGAAGGCTCCGGTGAGCT GTTTAGATGGAATGTGAGCGACCTTGGCGGACTCGGTTGCGGACTGAAAAATAGGAGCTC T GAAGGACCCT CTTCT CCCT CCGGT AAGTT GAT GT CACCT AAGCT GT ACGTGTGGGCCAA GGACCGCCCCGAAATCTGGGAGGGCGAGCCTCCATGCCTGCCGCCTCGCGATTCACTGA ACCAGT CT CT GT CCCAGGAT CT CACT ATGGCGCCCGGAT CT ACTCTTTGGCT GT CTTGCG GCGTTCCCCCAGATAGCGTGTCAAGAGGACCTCTGAGCTGGACCCACGTACACCCTAAGG GCCCTAAGAGCTTGTTGAGCCTGGAACTGAAGGACGACAGACCCGCACGCGATATGTGG GTAATGGAGACCGGCCTTCTGCTCCCTCGCGCTACCGCACAGGATGCAGGGAAATACTAC T GTCAT AGAGGGAAT CTGACT AT GAGCTTT CAT CT CGAAATTACAGCACGGCCCGTT CTTT GGCATTGGCT CCT CCGGACTGGAGGCT GGAAGGT GTCT GCCGTAACACTCGCTT ACTT GA TTTTTTGCCTGTGTAGCCTGGTTGGGATCCTGCATCTTCAGCGAGCCCTTGTATTGCGCCG AAAAAGAAAACGAAT G ACT GACCCT ACACG ACG ATT CT GA SEQ ID NO: 99. Secuencia de aminoácidos de ACD19 MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLWKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLK LSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWN VSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQ DLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLL LPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGIL HLQRALVLRRKRKRMTDPTRRF*

SEQ ID NO: 100 Fv' GGcGTcCAaGTcGAaACcATtagtCCcGGcGAtGGcaGaACaTTtCCtAAaaGgGGaCAaACaTGtGT cGTcCAtTAtACaGGcATGtTgGAgGAcGGcAAaAAgGTgGAcagtagtaGaGAtcGcAAtAAaCCtTTc AAaTTcATGtTgGGaAAaCAaGAaGTcATtaGgGGaTGGGAgGAgGGcGTgGCtCAaATGtccGTc GGcCAacGcGCtAAgCT cACcAT cag cCCcG AcT AcGCaT AcGGcGCtACcGGaCAtCCcGGaATtA TtCCcCCtCAcGCtACctTgGTgTTtGAcGTcGAaCTgtTgAAgCTc

SEQ ID NO: 101: Fv' GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCWHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEE GVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKL

SEQ ID NO: 102 Fv ggagtgcaggtggagactatctccccaggagacgggcgcaccttccccaagcgcggccagacctgcgtggtgcactacaccggg atgcttgaagatggaaagaaagttgattcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatgctaggcaagcaggaggtgatccga ggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaactgactatatctccagattatgcctatggtgccactggg cacccaggcatcatcccaccacatgccactctcgtcttcgatgtggagcttctaaaactggaa

SEQ ID NO: 103 Fv

GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCWHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEE GVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE SEQ ID NO: 104 P2A GCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT

SEQ ID NO: 105 P2A

ATNFSLLKQAGDVEENPGP

SEQ ID NO: 106. ACasp9 (res. 135—416)

SEQ ID NO: 107. ACasp9 (res. 135-416) D330A, secuencia de nucleótidos GGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCC TGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGT CCGGGCT CCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACT GTGAGAAGTT GCGGCGT CGCTT C TCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTG GCTTTGCTGGAGCTGGCGCgGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCAT TCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGA T GG AT GCCCT GTGTCGGT CGAGAAGATT GT GAACAT CTTCAAT GGGACCAGCTGCCCCAG CCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACC ATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGC CAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGCCGCCATATCTA GTTT GCCCACACCCAGT GACATCTTT GT GT CCT ACT CT ACTTT CCCAGGTTTT GTTT CCTGG AGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTG GGCT C ACT CT GAAGACCT GC AGTCCCT CCT GCTT AGGGT CGCT AATGCT GTTTCGGT GAA AGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAA CATCA

SEQ ID NO: 108. ACasp9 (res. 135-416) D330A, secuencia de aminoácidos

G F G D V G A L E S L R G N A D L A Y I L S M E P C G H C L I I N N V N F C R E S G L R T R T G S N I D C E K L R R R F S S L H F M V E V K G D L T A K K M V L A L L E L A R Q D H G A L D C C V V V I L S H G C Q A S H L Q F P G A V Y G T D G C P V S V E K I V N I F N G T S C P S L G G K P K L F F I Q A C G G E Q K D H G F E V A S T S P E D E S P G S N P E P D A T P F Q E G L R T F D Q L A A I S S L P T P S D I F V S Y S T F P G F V S W R D P K S G S W Y V E T L D D I F E Q W A H S E D L Q S L L L R V A N A V S V K G I Y K Q M P G C F N F L R K K L F F K T S SEQ ID NO: 109. ACasp9 (res. 135-416) N405Q, secuencia de nucleótidos GGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCC TGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGT CCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTC T CCT CGCT GCATTTCATGGT GGAGGT GAAGGGCGACCT GACT GCCAAGAAAAT GGTGCTG GCTTTGCTGGAGCTGGCGCgGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCAT TCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGA T GGAT GCCCTGTGTCGGT CGAGAAGATTGT GAACAT CTT CAAT GGGACCAGCT GCCCCAG CCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACC ATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGC CAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTA GTTT GCCCACACCCAGT GACATCTTT GT GT CCT ACT CT ACTTT CCCAGGTTTT GTTT CCTGG AGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTG GGCT C ACT CT GAAGACCT GC AGTCCCT CCT GCTT AGGGT CGCT AATGCT GTTTCGGT GAA AGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTCAGTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAA CATCA SEQ ID NO: 110. ACasp9 (res. 135-416) N405Q, secuencia de aminoácidos

G F G D V G A L E S L R G N A D L A Y I L S M E P C G H C L I I N N V N F C R E S G L R T R T G S N I D C E K L R R R F S S L H F M V E V K G D L T A K K M V L A L L E L A R Q D H G A L D C C V V V I L S H G C Q A S H L Q F P G A V Y G T D G C P V S V E K I V N I F N G T S C P S L G G K P K L F F I Q A C G G E Q K D H G F E V A S T S P E D E S P G S N P E P D A T P F Q E G L R T F D Q L D A I S S L P T P S D I F V S Y S T F P G F V S W R D P K S G S W Y V E T L D D I F E Q W A H S

SEQ ID NO: 111. ACasp9 (res. 135-416) D330A N405Q, secuencia de nucleótidos GGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCC TGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGT CCGGGCT CCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACT GTGAGAAGTT GCGGCGT CGCTT C T CCT CGCT GCATTTCATGGT GGAGGT GAAGGGCGACCT GACT GCCAAGAAAAT GGT GCT G GCTTTGCTGGAGCTGGCGCgGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCAT TCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGA T GG AT GCCCT GTGTCGGT CGAGAAGATT GT GAACAT CTTCAAT GGGACCAGCTGCCCCAG CCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACC ATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGC CAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGCCGCCATATCTA GTTTGCCCACACCCAGT GACATCTTT GT GT CCT ACT CT ACTTT CCCAGGTTTT GTTT CCTGG AGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTG GGCT C ACT CT GAAGACCT GC AGT CCCT CCT GCTT AGGGT CGCT AAT GCT GTTTCGGT GAA AGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTCAGTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAA CATCA SEQ ID NO: 112. ACasp9 (res. 135-416) D330A N405Q, secuencia de aminoácidos

G F G D V G A L E S L R G N A D L A Y I L S M E P C G H C L I I N N V N F C R E S G L R T R T G S N I D C E K L R R R F S S L H F M V E V K G D L T A K K M V L A L L E L A R Q D H G A L D C C V V V I L S H G C Q A S H L Q F P G A V Y G T D G C P V S V E K I V N I F N G T S C P S

SEQ ID NO: 113: Secuencia de nucleótidos de Caspasa-9.co GTGGACGGGTTTGGAGAT GT GGGAGCCCT GGAAT CCCTGCGGGGCAAT GCCGAT CTGGC TTACATCCTGTCTATGGAGCCTTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGC AGAGAGAGCGG GCT GC GGACCAGAAC AGGAT CCAAT ATTGACT GT GAAAAGCT GCGG AG AAGGTT CTCT AGT CT GCACTTT ATGGT CGAGGT GAAAGGCGAT CT GACC GCT AAGAAAAT G GTGCTGGCCCTGCTGGAACTGGCTCGGCAGGACCATGGGGCACTGGATTGCTGCGTGGT CGTGAT CCT GAGTCACGGCTGCCAGGCTTCACAT CTGCAGTTCCCTGGGGCAGT CT AT GG AACT G ACGGCT GTCCAGTCAGCGT G GAGAAGAT CGT GAACAT CTT CAACG GCACCT CTT G CCCAAGTCTGGGCGGGAAGCCCAAACTGTTCTTTATTCAGGCCTGTGGAGGCGAGCAGAA AGATCACGGCTTCGAAGTGGCTAGCACCTCCCCCGAGGACGAATCACCTGGAAGCAACC CTGAGCCAGATGCAACCCCCTTCCAGGAAGGCCTGAGGACATTTGACCAGCTGGATGCCA T CT CAAGCCTGCCC ACACCTT CT GAC ATTTTCGT CT CTT ACAGTACTTTCCCTGGATTT GT G AGCT GGCGCGATCCAAAGT CAGGCAGCTGGT AC GT GGAGACACT GG ACGAT AT CTTT GAG CAGT GGGCCC ATT CTG AAGACCTG CAGAGT CTGCT GCTGCGAGTGGCC AAT GCT GT CT CT GTGAAGGGGAT CT ACAAACAGAT GCCAGGAT GCTT CCAGTTT CT GAGAAAGAAACT GTT CT TT AAG ACCT C CGC AT CTAG G G C C SEQ ID NO: 114: Secuencia de aminoácidos de Caspasa-9.co

VDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSS LHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVWILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPV SVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQE GLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLL RVANAVSVKGIYKQMPGCFQFLRKKLFFKTSASRA SEQ ID NO: 115: Secuencia de nucleótidos de Caspasa9 D330E

GTCG ACGGATTT GGT G AT GT CGGTGCT CTT GAG AGTTT GAGGGGAAATGCAGATTT GGCT T ACATCCT GAGCAT GGAGCCCT GT GGCCACTGCCT CATTATCAACAAT GT GAACTT CT GCC GTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGT CGCTT CT CCTCGCTGCATTT CAT GGT GGAGGT GAAGGG CGACCT GACTGCCAAGAAAAT G GTGCTGGCTTT GCT GGAGCT GGCGCGGCAGGACCACGGT GCTCTGGACT GCT GCGTGGT GGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGG CACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTG CCCCAGCCT GGGAGGGAAG CCCAAGCT CTTTTT CATCCAGGCCT GT GGTGGGGAGC AG A AAGACCATGGGTTTG AG GT GGCCT CCACTTCCCCTGAAGACGAGT CCCCTGGCAGT AACC CCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGcCGCC ATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGT TTCCTGG AGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTG GT ACGTT GAG ACCCTGGACGACATCTTT GA G CAGT GG GCTCACTCTGAAGACCT G CAGTCCCTCCTGCTT AG GGTCGCTAATG CTGTTTC GGT GAAAGGGATTT AT AAACAGATGCCT GGTT GCTTT AATTT CCT CCGGAAAAAACTTTT CT TTAAAACATCAGCTAGCAGAGCC SEQ ID NO: 116: Secuencia de aminoácidos de Caspasa9 D330E VDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSS LHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVWILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGC PVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIGACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDA TPFQEGLRTFDQLeAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEGWAH SEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSASRA SEQ ID NO: 117: secuencia de nucleótidos del plásmido pBP0954-pSFG-iC9.T2A-Bob-1 TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATG G AAAAAT ACAT AACTG AG AAT AGAAAAGTT CAG AT C AAGGT C AGG AACAGAT G GAACAG CT GAAT AT GGGCCAAACAGGAT AT CTGTGGT AAGCAGTT CCTGCCCCGGCT CAGGGCCAAGA ACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCC GGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGA GAACCAT CAGAT GTTT CC AGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCT GT G CCTT ATTTGAA CT AACCAAT CAGTT CGCTT CT CGCTT CTGTT CGCGCGCTT AT GCTCCCCG AGCT CAAT AAA AGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTA CCCGT GT AT CCAATAAACCCT CTTGCAGTT GCATCCGACTTGTGGT CT CGCTGTTCCTTGG GAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGT CCGG GATCGGGAGACCCCTGCCCAG GGACCACCGACCCACCACCG GGAGGTAAGCTGG CCAGCAACTTATCTGTGTCTGTCCGATTGTCTAGTGTCTATGACTGATTTTATGCGCCTGC GTCGGT ACTAGTTAGCTAACT AGCT CTGTATCTG GC GGACCCGT GGT G GAACT GACGAGT TCGGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTCGGGGGCCGTTTTTGT GGCCCGACCT GAGT CCT AAAAT CCCGAT CGTTT AGGACT CTTT GGTGCACCCCCCTT AGA GGAG GGAT AT GT GGTT CTGGT AGGAG ACGAGAACCTAAAACAGTT CCCGCCT CCGT CT GA ATTTTTGCTTTCGGTTT GGGACCGAAGCCGCGCCGCGCGT CTT GT CTGCTGCAGCATCGT T CT GT GTTGT CT CT GTCT GACT GTGTTT CT GT ATTT GT CT GAAAAT ATGGGCCCGGGCT AG CCT GTTACCACT CCCTT AAGTTTG ACCTT AGGT CACTGGAAAG AT GTCGAGCGGAT CGCTC ACAACCAGT CGGT AGAT GTCAAGAAGAGACGTT GGGTT ACCTT CT GCT CTGCAGAATGGC CAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGG TT AAGAT CAAGGT CTTTTCACCT GGCCCGCAT GGACAC CCAGACCAGGTGGGGT ACAT CG TGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTT G ACCCCCCT CCCTGGGT CAAGCCCTTTGT ACACCCT A AGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGA CCCCGCCT CGAT CCT CCCTTTAT CCAGCCCT CACTCCTT CTCTAGGCGCCCCCATATGGC CATATGAGATCTTATATGGGGCACCCCCGCCCCTTGTAAACTTCCCTGACCCTGACATGAC AAGAGTT ACT AACAGCCCCT CT CT CCAAGCT CACTT ACAGG CT CT CTACTTAGTCCAG CAC GAAGTCTGGAGACCTCTGGCGGCAGCCTACCAAGAACAACTGGACCGACCGGTGGTACC T CACCCTT ACCGAGT CGGCG ACACAGT GTGGGTCCGCCG ACACCAGACT AAGAACCTAGA ACCTCGCTGGAAAGGACCTTACACAGTCCTGCTGACCACCCCCACCGCCCTCAAAGTAGA CGGCATCGCAGCTTGGATACACGCCGCCCACGTGAAGGCTGCCGACCCCGGGGGTGGA CCAT CCTCT AGACT GCCATGCT CGAG ATGCT GG AGGGAGTGCAGGT GGAGACT ATT AGCC CCGG AGATGGCAGAACATT CCCCAAAAGAGG ACAGACTT GCGTCGT GCATT AT ACT G GAA TGCTGGAAGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCCGGGACCGAAACAAGCCCTTCAAGTTC ATGCTGGGGAAGCAGGAAGTGATCCGGGGCTGGGAGGAAGGAGTCGCACAGATGTCAGT GGGACAGAGGGCCAAACTGACTATTAGCCCAGACTACGCTTATGGAGCAACCGGCCACC CCGGGATCATTCCCCCTCATGCTACACTGGTCTTCGATGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAAA GCGGAGGAGGATCCGGAGTGGACGGGTTTGGAGATGTGGGAGCCCTGGAATCCCTGCG GGGCAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGTCTATGGAGCCTTGCGGCCACTGTCTGATCAT TAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGGCTGCGGACCAGAACAGGATCCAATATTGA CT GT GAAAAGCTGCGG AG AAGGTTCTCT AGT CTGCACTTT ATGGT CGAGGT GAAAGGCGA TCTGACCGCTAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAACTGGCTCGGCAGGACCATGGGG CACTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGAGTCACGGCTGCCAGGCTTCACATCTGCAGT TCCCTGGGGCAGTCTATGGAACTGACGGCTGTCCAGTCAGCGTGGAGAAGATCGTGAACA TCTTCAACGGCACCTCTTGCCCAAGTCTGGGCGGGAAGCCCAAACTGTTCTTTATTCAGG CCTGTGGAGGCGAGCAGAAAGATCACGGCTTCGAAGTGGCTAGCACCTCCCCCGAGGAC GAATCACCTGGAAGCAACCCTGAGCCAGATGCAACCCCCTTCCAGGAAGGCCTGAGGAC ATTTGACCAGCT GGAT GCCAT CT CAAGCCTGCCCACACCTT CT GAC ATTTTCGT CT CTT AC AGTACTTT CCCT GG ATTT GT GAGCTGGCGCGATCCAAAGTC AG GC AGCT GGT ACGTGGAG ACACT GG ACGAT AT CTTT GAGC AGTGGGCCCATT CT GAAGACCT GCAG AGT CT GCTGCT G CGAGT GGCCAATGCTGT CTCTGT GAAGGGGATCT ACAAACAGATGCCAGGATGCTT CAAC TTT CT GAGAAAG AAACT GTT CTTT AAGACCTCCGCATCT AGGGCCCCGCGGGAAGGT AGA GGGAGCCTGCTGACATGTGGCGATGTCGAGGAGAATCCGGGACCTATGGGATGTAGACT GCTGTGCTGTGCTGTGCTGTGCCTGCTGGGGGCTGTGCCTATTGATACCGAAGTGACTCA GACTCCAAAGCACCTGGTCATGGGCATGACCAACAAGAAAAGCCTGAAATGCGAGCAGCA CATGGGGCATAGGGCCATGTACTGGTATAAGCAGAAAGCTAAGAAACCCCCTGAACTGAT GTTCGTGTACAGCTATGAGAAGCTGTCCATCAATGAATCCGTCCCCTCTCGCTTCAGTCCC GAGTGCCCTAACAGCTCCCTGCTGAATCTGCACCTGCATGCTCTGCAGCCTGAAGACTCC GCACTGTACCTGTGCGCCTCTAGTCACGGGCCAGCCTCTTACGAGCAGTATTTTGGACCC GGCACCAGACTGACTGTGACCGAAGATCTGAAGAACGTCTTCCCACCCGAGGTGGCAGTC TTTGAACCATCTGAGGCCGAAATTAGTCATACTCAGAAAGCCACCCTGGTGTGCCTGGCTA CAGGCTT CT ATCCCGACCACGT GGAGCT GAGTTGGT GGGT CAACGGCAAGGAAGT GCATT CAGGGGT CTGCACT G ACCCTCAGCC ACT GAAAGAGCAGCCT GCT CT GAAT GATT CAAGGT ACTGTCTGTCAAGCCGGCTGAGAGTGAGCGCCACTTTTTGGCAGAACCCAAGGAATCACT T CCGCTGCCAGGT GCAGTTTT ATGGCCTGAGCGAGAAT GACGAAT GGACT CAGGAT CG CG CT AAGCCAGT GACCCAGAT CGT CTCCGCAG AGGCCT GGG GACGAGCAGACT GT GGCTT C ACATCTGAAAGTTACCAGCAGGGGGTGCTGTCTGCCACAATCCTGTACGAGATTCTGCTG GGAAAGGCCACTCTGTACGCCGTGCTGGTGAGCGCCTTAGTCTTAATGGCCATGGTGAAA AGAAAGGATTCCAGAGGAGGATCCGGCGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGA CGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGACAAGCATCAGAGCCGTGTTCATTTTTCTGTGGCT GCAGCTGGATCT GGTGAACGGAGAGAAT GTCGAACAGCAT CCTT CAACTCTGAGCGT GCA GGAGGGCGATTCCGCAGTCATCAAGTGTACCTACTCAGACAGCGCCTCCAATTACTTTCCT TGGTATAAGCAGGAGCTGGGGAAAGGACCACAGCTGATCATTGATATCAGAAGCAACGTG GGCGAAAAGAAAG ACCAGAGG ATTGCTGTCACACT GAAT AAGACT GCAAAACACTTCAGC CT GCAT ATT ACAGAG ACT CAGC CCGAAGACT CCGCCGT GT ATTTTT GCGCCGCTT CT AAGG GGTCCTCTAACACCGGAAAACTGATCTTCGGCCAGGGGACCACACTGCAGGTGAAGCCTG ACATTCAGAATCCAGATCCCGCCGTCTACCAGCTGCGAGACTCAAAGAGTTCAGATAAAAG CGTGTGCCTGTTCACCGACTTTGATAGCCAGACAAACGTGTCTCAGAGTAAGGACTCCGA CGTGTACATCACCGACAAATGCGTGCTGGATATGCGCAGCATGGACTTCAAGAGCAACAG CGCCGTGGCATGGT CCAACAAGT CT GATTT CGCCT GCGCT AACGCCTT CAACAATT CTAT C ATTCCCGAGGATACATTCTTTCCTAGTCCAGAAAGCTCCTGTGACGTGAAGCTGGTCGAGA AAAGTTT C GAAACCG ATAC AAACCTGAATTTT C AG AAT CTGTCCGTG AT CGGCTT C CG GAT TCTGCTGCTGAAAGTGGCTGGGTTTAATCTGCTGATGACTCTGAGACTGTGGTCCTCCTGA ACGCGTCATCATCGATCCGGATTAGTCCAATTTGTTAAAGACAGGATATCAGTGGTCCAGG CT CT AGTTTT GACT CAACAAT AT CACCAGCT GAAGCCT AT AGAGTACGAGC CAT AG AT AAA AT AAAAGATTTT ATTT AGT CTCCAGAAAAAGGGGGGAAT GAAAG ACCCCACCT GT AGGTTT GGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAG AGAAGTTCAGAT CAAGGT CAGGAACAGAT G GAACAGCT GAAT ATGGGCCAAACAGGAT AT CTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATG GGCCAAACAGGAT AT CT GT GGT AAG CAGTT CCTGCCCCGGCT CAGGGCCAAGAACAGATG GTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGT GCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCG CTT CT GTT CGCGCG CTT CTGCT CCCCGAGCT CAATAAAAG AGCCCACAACCCCT CACT CG GGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCT T GCAGTTGCATCCG ACTT GT GGT CT CGCTGTT CCTTGGGAGGGT CT CCTCT GAGTGATT G ACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCACACATGCAGCATGTATCAAAATTAATTTGGTTTTTTT TCTTAAGTATTTACATTAAATGGCCATAGTACTTAAAGTTACATTGGCTTCCTTGAAATAAAC ATGG AGT ATT CAG AAT GTGT CAT AAAT ATTT CT AATTTT AAGATAGTATCTCCATTGGCTTTC T ACTTTTT CTTTT ATTTTTTTTT GTCCT CT GT CTT CC ATTT GTT GTT GTT GTTGTTT GTTTGTTT GTTTGTTGGTTGGTTGGTT AATTTTTTTTT AAAGAT CCT ACACT AT AGTT C AAGCT AG ACTAT TAGCTACTCTGTAACCCAGGGTGACCTTGAAGTCATGGGTAGCCTGCTGTTTTAGCCTTCC C AC AT CT AAG ATT AC AGGT AT GAG CTAT C ATTTTT GGTATATT GATT G ATT G ATT G ATT G ATG TGTGTGTGTGTGATTGTGTTTGTGTGTGTGACTGTGAAAATGTGTGTATGGGTGTGTGTGA ATGTGTGTATGTATGTGTGTGTGTGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCATGTGTGTGTGTGTG ACTGTGTCTATGTGTATGACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGT GTT GT GAAAAAAT ATTCTATGGT AGT GAGAGCCAACGCT CCGGCT CAGGTGT CAGG TTGGTTTTTGAGACAGAGTCTTTCACTTAGCTTGGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGT CGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTC GCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAG CCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGT ATTTT CT CCTT ACG CAT CT GT GCGGT ATTT CA CACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCC CGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGC TT ACAGACAAGCTGT GACCGT CTCCGGGAGCT GC ATGT GT CAG AGGTTTTCACCGTCAT C ACCGAAACGCGCGATGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCAT GATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCC T ATTT GTTT ATTTTT CT AAATACATT CAAATATGTAT CCGCT CAT G AGACAATAACCCT GAT A AATGCTT CAAT AAT ATTGAAAAAGGAAGAGT AT GAGTATTCAACATTT CCGT GTCGCCCTT A TTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTA AAAGATGCTGAAGAT CAGTT GGGT GCACG AGTGGGTT ACATCGAACTGGAT CT C AACAGC GGT AAGAT CCTT G AG AGTTTT CGCCCCGAAG AACGTTTT CC AAT GAT GAGCACTTTT AAAG TT CT GCT ATGT GGCGCGGTATT AT CCCGT ATT GACGCCGGGCAAGAGCAACT CGGTCGCC G CAT ACACT ATTCT CAG AAT G ACTT GGTT G AGT ACT CACCAG T CACAG AAAAGCAT CTT AC GGATGGC AT GACAGT AAGAGAATT ATGCAGTGCT GCCATAACCAT GAGT GAT AACACTGC GGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAA CATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACC AAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATT AACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGAT AAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAAT CTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAG CCCT CCCGTATCGTAGTTAT CT ACACGACGGGGAGT CAGGCAACTATGGATGAACGAAAT AGACAGATCGCT GAGAT AGGTGCCT CACT GATTAAGCATT GGT AAC T GT CAGACCAAGTTT ACT CAT ATATACTTT AG ATT G ATTT AAAACTT CATTTTT AATTT AAAAGG AT CT AGGTG AAG A T CCTTTTT GAT AAT CT CATG ACCAAAATCCCTT AACGT GAGTTTT CGTTCCACT GAGCGTCA G ACCCCGT AGAAAAG AT CAAAGG AT CTT CTT GAGAT CCTTTTTTTCTGCGCGT AATCTGCT GCTT GCAAACAAAAAAACCACC GCT ACCAGCGGTGGTTTGTTT GCCGG ATC AAG AGCT AC CAACT CTTTTTCCGAAGGT AACTGGCTT CAGC AGAGCGCAGAT ACC AAAT ACT GT CCTT CT AGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCT

CT GCT AAT CCT GTT ACCAGTGGCT GCT GCCAGT GGCGATAAGTCGT GTCTT ACCGGGTTG

GACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTG

CACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCA

TT GAGAAAGCGCCACGCTT CCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTAT CCGGT AAGCGGCA

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ATT AGTT G ATTTTT ATTTTT G ACAT AT ACAT G TG A

Ejemplo 9: Referencias adicionales

Las siguientes referencias se citan en los presentes ejemplos o proporcionan información general adicional.

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2. Pule MA, Savoldo B, Myers GD, et al: Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med 14: 1264-70, 2008.

3. Kershaw MH, Westwood JA, Parker LL, et al: A phase I study on adoptive immunotherapy using gene-modified T cells for ovarian cancer. Clin Cancer Res 12: 6106-15, 2006.

4. Carpenito C, Milone MC, Hassan R, et al: Control of large, established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 3360-5, 2009.

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32. Kalinski P, Hilkens CM, Wierenga EA, et al: T-cell priming by type-1 and type-2 polarized dendritic cells: the concept of a third signal. Immunol Today 20: 561-7, 1999.

33. Kemnade JO, Seethammagari M, Narayanan P, et al: Off-the-shelf Adenoviralmediated Immunotherapy via Bicistronic Expression of Tumor Antigen and iMyD88/CD40 Adjuvant. Mol Ther, 2012.

34. Schenten D, Nish SA, Yu S, et al: Signaling through the adaptor molecule MyD88 in CD4+ T cells is required to overcome suppression by regulatory T cells. Immunity 40: 78-90, 2014.

35. Martin S, Pahari S, Sudan R, et al: CD40 signaling in CD8+CD40+ T cells turns on contra-T regulatory cell functions. J Immunol 184: 5510-8, 2010.

La citación de las patentes, solicitudes de patente, publicaciones y documentos anteriores no es una admisión de que cualquiera de los anteriores sea un estado de la técnica pertinente, ni constituye una admisión en cuanto al contenido o la fecha de estas publicaciones o documentos. Su cita no es una indicación de una búsqueda de divulgaciones relevantes. Todas las declaraciones con respecto a la fecha fechas o el contenido de los documentos se basan en la información disponible y no son una admisión en cuanto a su exactitud o corrección.

Se pueden realizar modificaciones a lo anterior sin apartarse de los aspectos básicos de la tecnología.

La tecnología descrita ilustrativamente en el presente documento se puede poner en práctica de manera adecuada en ausencia de cualquier elemento no descrito específicamente en el presente documento. Así, por ejemplo, en cada caso de la presente memoria, cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" puede reemplazarse por cualquiera de los otros dos términos.

El término "un" o "uno, una" puede referirse a uno o una pluralidad de los elementos que modifica (por ejemplo, "un reactivo" puede significar uno o más reactivos) a menos que sea contextualmente claro se describe uno de los elementos o más de uno de los elementos. El término "aproximadamente" como se usa en este documento se refiere a un valor dentro del 10% del parámetro subyacente (es decir, más o menos 10%), y el uso del término "aproximadamente" al comienzo de una cadena de valores modifica cada uno de los valores (es decir, "aproximadamente 1, 2 y 3" se refiere a aproximadamente 1, aproximadamente 2 y aproximadamente 3). Por ejemplo, un peso de "aproximadamente 100 gramos" puede incluir pesos entre 90 gramos y 110 gramos. Además, cuando se describe en el presente documento una lista de valores (por ejemplo, aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o 86%), el listado incluye todos los valores intermedios y fraccionarios de los mismos (por ejemplo, 54%, 85.4%).

Ciertas realizaciones de la tecnología se establecen en la reivindicación o reivindicaciones que vienen a continuación.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende un promotor operativamente unido a un polinucleótido que codifica un receptor de células T que comprende una región CDR3 que se une específicamente a Bob1, que comprende:

a) un primer polinucleótido que codifica un primer polipéptido que comprende las regiones VJ de un polipéptido TCRa, cuyas regiones VJ comprenden la región CDR3 del polipéptido TCRa; y

b) un segundo polinucleótido que codifica un segundo polipéptido que comprende las regiones VDJ de un polipéptido TCRp, cuyas regiones VDJ comprenden la región CDR3 del polipéptido TCRp, en el que la región CDR3 del polipéptido TCRa y la región CDR3 del polipéptido TCRp se unen juntas específicamente a Bobl,

en la que

i) la región CDR3 del polipéptido TCRa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y la región CDR3 del polipéptido TCRp comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, o

ii) la región CDR3 del polipéptido TCRa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 y la región CDR3 del polipéptido TCRp comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la región CDR3 del receptor de células T se une específicamente a un polipéptido Bobl que comprende la secuencia de aminoácidos APAPTAVVL o la secuencia de aminoácidos YALNHTLs V.

3. La molécula de ácido nucleico

i) de la reivindicación 1, parte (i), en la que la región CDR3 del polipéptido TCRa está codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3 y la región Cd R3 del polipéptido TCRp está codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 o la Se Q ID NO: 6; o

ii) de la reivindicación 1, parte (ii), en la que la región CDR3 del polipéptido TCRa está codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ iD NO: ^{2 6} o la s Eq ID NO: 27 y la región CDR³ del polipéptido TCR p está codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 29 o la SEQ ID NO: 30.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, en la que

i) el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; o

ii) el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31 y/o el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34.

5. La molécula de ácido nucleico

i) de la reivindicación 4, parte (i), en la que el primer polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9, y el segundo polipéptido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; o

ii) de la reivindicación 4, parte (ii), en la que el primer polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 32 o la SEQ ID NO: 33, y el segundo polipéptido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 35 o la SEQ ID NO: 36.

6. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico Caspasa-9 que comprende una región de unión al ligando multimérico y un polipéptido Caspasa-9.

7. Un vector plasmídico o vector viral que comprende una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una célula modificada transfectada o transducida con una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un vector de la reivindicación 7.

9. Una composición farmacéutica que comprende una célula modificada de la reivindicación 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el vector de la reivindicación 7, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 o 10 para su uso en la mejora de una respuesta inmune en un sujeto diagnosticado con una enfermedad o afección hiperproliferativa.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 o 10 para su uso en la estimulación de una respuesta inmune mediada por células a una población de células diana o tejido en un sujeto.

13. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en la que la célula modificada es una célula autóloga o una célula alogénica.

14. Un método in vitro o ex vivo para expresar un receptor de células T que se une específicamente a Bob1 en una célula, que comprende poner en contacto una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 con una célula bajo condiciones en las que la molécula de ácido nucleico se incorpora en la célula, por lo que la célula expresa el receptor de células T a partir de la molécula de ácido nucleico incorporada.