ES2905123T3 - Citocromo P450 de plantas - Google Patents

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Thilo Winzer
Ian Alexander Graham
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido del citocromo P450 en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: i) una secuencia de nucleótidos como la representada por la secuencia en la Figura 1a o 3a; ii) una secuencia de nucleótidos en donde dicha secuencia está degenerada como resultado del código genético con respecto a la secuencia de nucleótidos definida en (i); iii) una molécula de ácido nucleico cuya hebra complementaria se hibrida a secuencias de nucleótidos con al menos 90 % de identidad en condiciones de hibridación muy estrictas a la secuencia en la Figura 1a o 3a, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido del citocromo P450; iv)una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la representada en la Figura 4a; v)una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en donde dicha secuencia de aminoácidos se modifica mediante la adición, eliminación o sustitución de al menos un residuo de aminoácido como la representada en iv) anterior y tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de longitud completa representada en la Figura 4a que conserva la actividad del citocromo P450.

Description

DESCRIPCIÓN
Citocromo P450 de plantas
Introducción
Esta descripción se relaciona con el aislamiento y la secuenciación de moléculas de ácido nucleico que codifican citocromos P450 novedosos a partir de un cultivar de Papaver somniferum, [planta de amapola]; células transgénicas transformadas con dichas moléculas de ácido nucleico, variantes de secuencia del gen; el uso de dichos genes/proteínas en la producción de noscapina y el uso de los genes como marcador de plantas de amapola que sintetizan noscapina.
Antecedentes
Los citocromos P450 de plantas son una familia muy grande de enzimas responsables de la oxidación, peroxidación y reducción de un gran número de metabolitos intermedios de plantas como alcaloides, terpenoides, lípidos, glucósidos y glucosinolatos. Se sabe que los P450 participan en el metabolismo y la desintoxicación de pesticidas, así como también en la biosíntesis de metabolitos primarios y secundarios.
Los citocromos P450 de plantas se conocen en la técnica y se han clonado, expresado y caracterizado con éxito. Por ejemplo, los documentos WO2009/064771 y WO2008/070274, cada uno describe genes del citocromo P450 y su uso en la alteración del contenido de alcaloides en Nicotiana tabacum. Estas solicitudes de patente describen cómo la inhibición de P450 específicos reduce la cantidad de N' nitrosonornicotina, un carcinógeno conocido, in planta. El documento WO2008/150473 describe la sobreexpresión de citocromo P450 para conferir resistividad o tolerancia a herbicidas, en particular, benzotiadiazonas y sulfonilureas. En el documento WO2008/088161 se describen plantas transgénicas que sobreexpresan un citocromo P450 que da como resultado un aumento del tamaño de la semilla o del contenido de proteína de almacenamiento de las semillas. La sobreexpresión también confiere una mayor resistividad al estrés hídrico. Lo que es evidente es que los citocromos P450 de las plantas tienen diversas funciones en la regulación de las actividades bioquímicas en las células vegetales y son conocidos en la técnica.
La amapola P. somniferum es la planta de la que se extrae el opio. La amapola es la única amapola de la familia Papaveraceae explotada comercialmente y es la principal fuente de opiáceos naturales. El opio se extrae del látex recolectado de las vainas de semillas verdes. Una fuente adicional de alcaloides opiáceos es la paja de amapola, que es la planta madura seca. P. somniferum es una fuente de alcaloides opiáceos clínicamente útiles tales como morfina, codeína, tebaína, noscapina [también conocida como narcotina] y papaverina. La aplicación clínica de estos alcaloides opiáceos y sus derivados es amplia, tienen uso como analgésicos, supresores de la tos y antiespasmódicos. Aunque no se usa como agente farmacológico por derecho propio, la tebaína es un opiáceo particularmente útil que puede convertirse en una variedad de compuestos como hidrocodona, oxicodona, oximorfona, nalbufina, naltrexona, buprenorfina y etorfina. Estos intermedios también tienen amplias aplicaciones farmacéuticas. Por ejemplo, la oxicodona, la oximorfona y la etorfina se usan ampliamente como analgésicos para el dolor de moderado a intenso y, a menudo, se combinan con otros analgésicos como el ibuprofeno. La buprenorfina se usa en el tratamiento de la adicción a la heroína y el dolor crónico. La naltrexona se usa en el tratamiento de la adicción al alcohol y a los opiáceos.
Esta descripción se relaciona con la identificación y caracterización de citocromos P450 aislados de un cultivar de Papaver somniferum que llamamos PSCYP1, Ps Cy P2 y PSCYP3. La proteína predicha codificada por PSCYP1 exhibe la mayor identidad de secuencia con un citocromo P450 de Coptis japonica (núm. de acceso de GenBank BAF98472.1, 46 % de identidad). El homólogo más cercano con una asignación a una subfamilia del citocromo P450 es CYP82C4 de Arabidopsis lyrata (núm. de secuencia de referencia de NCBI XP_002869304.1, 44 % de identidad). Se ha demostrado que la proteína CYP82C4 de Arabidopsis thaliana añade un grupo hidroxilo a la posición 5 del 8-metoxipsoraleno, una furocumarina, lo que crea 5-hidroxi-8-metoxipsoraleno (Kruse y otros (2008) Chemistry & Biology 15: 149-156). Los homólogos más cercanos de la proteína predicha codificada por PSCYP2 se anotan como estilopina sintasas de Argemone mexicana (número de acceso de GenBank ABR14721, 77 % de identidad), Papaver somniferum (número de acceso de GenBank ADB89214, 76 % de identidad) y Eschscholzia californica (núm. de acceso de GenBank BAD98250, 72 % de identidad). Pertenecen a la subfamilia CYP719A de citocromos P450 que solo se han encontrado en especies de plantas productoras de alcaloides de isoquinolina donde catalizan la formación de puentes metilendioxi (Ikezawa y otros (2009) Plant Cell Rep. 28:123-133). El homólogo más cercano de la proteína predicha codificada por PSCYP3 se anota como protopina 6-hidroxilasa de Eschscholzia californica (núm. de acceso de GenBank BAK20464, 44 % de identidad). El homólogo más cercano con una asignación a una subfamilia del citocromo P450 es CYP82C4 de Arabidopsis lyrata mencionado anteriormente (42 % de identidad). Asombrosamente PSCYP1, PSCYP2 y PSCYP3 son exclusivos de cultivares de Papaver somniferum que producen noscapina. Aquellos cultivares que no producen noscapina no incluyen este gen.
Declaraciones de la invención
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido del citocromo P450, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
i) una secuencia de nucleótidos como la representada por la secuencia en la Figura 1a o 3a;
ii) una secuencia de nucleótidos en donde dicha secuencia está degenerada como resultado del código genético con respecto a la secuencia de nucleótidos definida en (i);
iii) una molécula de ácido nucleico cuya hebra complementaria se hibrida a secuencias de nucleótidos con al menos 90 % de identidad en condiciones de hibridación muy estrictas a la secuencia en la Figura 1a o 3a, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido del citocromo P450;
iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la representada en la Figura 4a;
v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en donde dicha secuencia de aminoácidos se modifica mediante la adición, eliminación o sustitución de al menos un residuo de aminoácido como la representada en iv) anterior y tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de longitud completa representada en la Figura 4a que conserva la actividad del citocromo P450.
La hibridación de una molécula de ácido nucleico ocurre cuando dos moléculas de ácido nucleico complementarias experimentan una cantidad de enlaces de hidrógeno entre sí. La rigurosidad de la hibridación puede variar de acuerdo con las condiciones ambientales que rodean a los ácidos nucleicos, la naturaleza del método de hibridación y la composición y longitud de las moléculas de ácido nucleico usadas. Los cálculos relacionados con las condiciones de hibridación requeridas para lograr grados particulares de rigurosidad se analizan en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); y Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York, 1993). La Tm es la temperatura a la que el 50 % de una hebra dada de una molécula de ácido nucleico se hibrida con su hebra complementaria. El siguiente es un conjunto ilustrativo de condiciones de hibridación y no es limitativo:
Muy alta rigurosidad (permite la hibridación de secuencias que comparten al menos 90 % de identidad) Hibridación: SSC 5 x a 65 °C durante 16 horas
Lavar dos veces: SSC 2 x a temperatura ambiente (RT) durante 15 minutos cada vez
Lavar dos veces: SSC 0,5 x a 65 °C durante 20 minutos cada vez
Alta rigurosidad (permite la hibridación de secuencias que comparten al menos 80 % de identidad) Hibridación: SSC 5 x-6 x a 65 °C-70 °C durante 16-20 horas
Lavar dos veces: SSC 2 x a RT durante 5-20 minutos cada vez
Lavar dos veces: SSC 1 x a 55 °C-70 °C durante 30 minutos cada vez
Baja rigurosidad (permite la hibridación de secuencias que comparten al menos 50 % de identidad) Hibridación: SSC 6 x a RT a 55 °C durante 16-20 horas
Lavar al menos dos veces: SSC 2 x-3 x a RT a 55 °C durante 20-30 minutos cada vez
En una modalidad preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos como la representada en la Figura 1a.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste en:
i) un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como la representada en la Figura 4a; o
ii) un polipéptido modificado en donde las variantes de polipéptidos tienen al menos 85 % de identidad con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 4a y que conserva la actividad del citocromo P450.
En una modalidad preferida de la invención, dicho polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en 85 % a la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la figura 4a y que ha conservado la actividad del citocromo P450.
Un polipéptido modificado como se describe en la presente puede diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, deleciones, truncamientos que pueden estar presentes en cualquier combinación. Entre las variantes preferidas están aquellas que varían a partir de un polipéptido de referencia por sustituciones conservativas de aminoácidos. Tales sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado por otro aminoácido de características similares. El listado de aminoácidos siguiente no limitativo se consideran reemplazos conservativos (similares): a) alanina, serina y treonina; b) ácido glutámico y ácido aspártico; c) asparagina y glutamina d) arginina y lisina; e) isoleucina, leucina, metionina y valina y f) fenilalanina, tirosina y triptófano. Las más altamente preferidas son las variantes que conservan o mejoran la misma función y actividad biológica que el polipéptido de referencia del que varía.
En una modalidad, las variantes de polipéptidos tienen al menos 85 %, 90 %, 95 % de identidad y al menos 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa ilustrada en la presente descripción.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido del citocromo P450 de acuerdo con la invención, en donde dicha molécula de ácido nucleico está unida operativamente a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia promotora.
En una modalidad preferida de la invención, dicha secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor confiere expresión constitutiva a dicho polipéptido del citocromo P450.
En una modalidad preferida alternativa de la invención, dicha molécula de ácido nucleico que comprende un promotor confiere una expresión regulada a dicho polipéptido del citocromo P450.
En una modalidad preferida de la invención, dicha expresión regulada es una expresión regulada por el tejido o por el desarrollo.
En una modalidad de la invención alternativa adicional, dicha expresión regulada es una expresión inducible.
En una modalidad alternativa de la invención, un vector que incluye una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención no necesita incluir un promotor u otra secuencia reguladora, particularmente si el vector se va a usar para introducir la molécula de ácido nucleico en las células para su recombinación en el gen.
Preferentemente, la molécula de ácido nucleico en el vector está bajo el control de, y operativamente unida a, un promotor apropiado u otros elementos reguladores para la transcripción en una célula huésped tal como una célula microbiana (por ejemplo, bacteriana, de levadura) o vegetal. El vector puede ser un vector de expresión bifuncional que funcione en múltiples huéspedes. En el caso del ADN genómico del citocromo P450, este puede contener su propio promotor u otros elementos reguladores y, en el caso del cDNA, puede estar bajo el control de un promotor apropiado u otros elementos reguladores para la expresión en la célula huésped.
Por "promotor" se entiende una secuencia de nucleótidos aguas arriba del sitio de iniciación de la transcripción y que contiene todas las regiones reguladoras requeridas para la transcripción. Los promotores adecuados incluyen promotores constitutivos, específicos de tejido, inducibles, de desarrollo u otros para la expresión en células vegetales comprendidas en plantas en dependencia del diseño. Dichos promotores incluyen promotores virales, fúngicos, bacterianos, animales y derivados de plantas capaces de funcionar en células vegetales.
Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor CaMV 35S (Odell y otros (1985) Nature 313, 9810­ 812); actina de arroz (McElroy y otros (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christian y otros (1989) Plant Mol. Biol.
18: (675-689); pEMU (Last y otros (1991) Theor Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten y otros (1984) EMBO J. 3.
2723-2730); promotor de a Ls (Solicitud de Estados Unidos núm. de serie 08/409,297) y similares. Otros promotores constitutivos incluyen los de las Patentes de Estados Unidos núms. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680, 5,268,463; y 5,608,142.
Los promotores regulados químicamente pueden usarse para modular la expresión de un gen en una planta mediante la aplicación de un regulador químico exógeno. En dependencia del objetivo, el promotor puede ser un promotor inducible químicamente, donde la aplicación de la expresión génica inducida químicamente, o un promotor reprimible químicamente, donde la aplicación de la sustancia química reprime la expresión génica. Los promotores inducibles químicamente se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan al promotor In2-2 de maíz, que se activa con protectores de herbicidas de bencenosulfonamida, el promotor GST de maíz, que se activa con compuestos electrofílicos hidrófobos que se usan como herbicidas preemergentes, y el promotor PR-1a del tabaco, que se activa por el ácido salicílico. Otros promotores regulados químicamente de interés incluyen promotores sensibles a esteroides (véase, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides en Schena y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421-10425 y McNellis y otros (1998) Plant J. 14(2): 247-257) y promotores inducibles por tetraciclina y reprimibles por tetraciclina (véase, por ejemplo, Gatz y otros (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229-237, y las patentes de Estados Unidos núms. 5,814,618 y 5,789,156.
Cuando se desea una expresión mejorada en tejidos particulares, pueden utilizarse promotores específicos de tejido. Los promotores específicos de tejido incluyen los descritos por Yamamoto y otros (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata y otros (1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792-803; Hansen y otros (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3): 337-343; Russel y otros (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinhart y otros (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341; Van Camp y otros (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535; Canevascni y otros (1996) Plant Physiol. 112(2): 513-524; Yamamoto y otros (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozco y otros (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; Mutsuoka y otros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (20): 9586­ 9590; y Guevara-Garcia y otros (1993) Plant J. 4(3): 495-50.
"Unido operativamente" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, adecuadamente posicionado y orientado para que la transcripción se inicie desde el promotor. El ADN unido operativamente a un promotor está "bajo la regulación de iniciación transcripcional" del promotor. En un aspecto preferido, el promotor es un promotor específico de tejido, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo.
Particularmente de interés en el presente contexto son las construcciones de ácido nucleico que funcionan como vectores de plantas. Los procedimientos y vectores específicos usados anteriormente con gran éxito en plantas se describieron por Guerineau y Mullineaux (1993) (Plant transformation and expression vectors. En: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148. Los vectores adecuados pueden incluir vectores derivados de virus de plantas (véase, por ejemplo, el documento EP194809).
Si se desea, pueden incluirse en la construcción marcadores genéticos seleccionables, como los que confieren fenotipos seleccionables, tales como resistividad a herbicidas (por ejemplo, kanamicina, higromicina, fosfinotricina, clorsulfurón, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas y glifosato).
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una célula transgénica transformada o transfectada con una molécula de ácido nucleico o un vector de acuerdo con la invención.
En una modalidad preferida de la invención dicha célula es una célula vegetal.
En una modalidad preferida de la invención dicha célula vegetal es de la familia Papaveraceae.
En una modalidad preferida de la invención dicha célula vegetal es una célula de Papaver somniferum.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una planta que comprende una célula vegetal de acuerdo con la invención.
En una modalidad preferida de la invención dicha planta es de la familia Papaveraceae; preferentemente Papaver somniferum.
En una modalidad preferida alternativa de la invención, dicha célula es una célula microbiana; preferentemente una célula bacteriana o fúngica [por ejemplo, de levadura, Saccharomyces cerevisiae].
En una modalidad preferida de la invención, dicha célula se adapta de manera que la molécula de ácido nucleico que codifica el citocromo P450 se sobreexpresa en comparación con una célula no transgénica de la misma especie.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención que comprende un casete de transcripción seleccionado del grupo que consiste en
i) un casete que se adapta de manera que ambas moléculas de ácido ribonucleico sentido y antisentido se transcriben a partir de dicho casete en donde dichas moléculas de ácido nucleico sentido y antisentido se adaptan para hibridarse en al menos una parte o la totalidad de su longitud para formar un siARN o shARN,
ii) un casete como se define en (i) anterior que se proporciona con al menos dos promotores adaptados para transcribir hebras sentido y antisentido de dicha molécula de ácido ribonucleico,
iii) un casete como se define en (i) anterior que comprende una molécula de ácido nucleico en donde dicha molécula comprende una primera parte unida a una segunda parte en donde dichas partes primera y segunda son complementarias en al menos parte de su secuencia y además en donde la transcripción de dicha molécula de ácido nucleico produce una molécula de ácido ribonucleico que forma una región de doble hebra mediante el apareamiento de bases complementarias de dichas partes primera y segunda lo que forma de esta manera un shARN.
iv) un casete de acuerdo con una cualquiera de i) a iii) que comprende una molécula de ácido nucleico que forma parte de un vector adaptado para la expresión en una célula vegetal.
Una técnica para eliminar específicamente la función del gen es a través de la introducción de ARN de doble hebra, también conocido como ARN inhibidor/interferente pequeño (siARN) o ARN de horquilla corta [shARN], en una célula que da como resultado la destrucción del mRNA complementario a la secuencia que se incluye en la molécula de siARN/shARN. La molécula de siARN comprende dos hebras complementarias de ARN (una hebra sentido y una hebra antisentido) hibridadas entre sí para formar una molécula de ARN de doble hebra. La molécula de siARN típicamente se deriva de los exones del gen a eliminar. Se está dilucidando el mecanismo de la interferencia del ARN. Muchos organismos responden a la presencia de ARN de doble hebra tras activar una cascada que conduce a la formación de siARN. La presencia de ARN de doble hebra activa un complejo proteico que comprende la RNasa III que procesa el ARN de doble hebra en fragmentos más pequeños (siARN, de aproximadamente 21-29 nucleótidos de longitud) que pasan a formar parte de un complejo de ribonucleoproteínas. El siARN actúa como una guía para que el complejo RNasa escinda el mRNA complementario a la hebra antisentido del siARN, lo que da como resultado de esta manera la destrucción del mRNA.
En una modalidad preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico es parte de un vector adaptado para la expresión en una célula vegetal.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una célula vegetal transfectada con una molécula de ácido nucleico o un vector de acuerdo con la invención, en donde dicha célula tiene una expresión reducida de dicho polipéptido del citocromo P450.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un proceso para la modificación de un alcaloide opiáceo que comprende:
i) proporcionar una célula vegetal transgénica de acuerdo con la invención;
ii) cultivar dicha célula vegetal para producir una planta transgénica; y opcionalmente
i) recolectar dicha planta transgénica, o parte de esta.
En un método preferido de la invención, dicho material vegetal recolectado es paja seca y se extrae dicho alcaloide opiáceo.
De acuerdo con un aspecto alternativo de la invención, se proporciona un proceso para la modificación de un alcaloide opiáceo que comprende:
i) proporcionar una célula microbiana transgénica de acuerdo con la invención que expresa un citocromo P450 de acuerdo con la invención en cultivo con al menos un alcaloide opiáceo;
ii) cultivar la célula microbiana en condiciones que modifican uno o más alcaloides opiáceos; y opcionalmente iii) aislar dicho alcaloide modificado de la célula microbiana o cultivo celular.
En un método preferido de la invención, dicha célula microbiana es una célula bacteriana o una célula fúngica/de levadura.
Si se usan células microbianas como organismos en el proceso de acuerdo con la invención, se hacen crecer o se cultivan de la manera con la que el experto en la técnica está familiarizado, en dependencia del organismo huésped. Por regla general, los microorganismos se cultivan en un medio líquido que comprende una fuente de carbono, habitualmente en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, habitualmente en forma de fuentes orgánicas de nitrógeno como extracto de levadura o sales como sulfato de amonio, oligoelementos como sales de hierro, manganeso y magnesio y, si es apropiado, vitaminas, a temperaturas comprendidas entre 0 °C y 100 °C, preferentemente entre 10 °C y 60 °C, mientras se gasifica en oxígeno.
El pH del medio líquido puede mantenerse constante, es decir, regularse durante el período de cultivo, o no. Los cultivos pueden cultivarse por lotes, semilotes o continuamente. Los nutrientes pueden proporcionarse al comienzo de la fermentación o pueden darse semicontinuamente o continuamente. Los alcaloides opiáceos metilados producidos pueden aislarse de los organismos como se describió anteriormente mediante procesos conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, mediante extracción, destilación, cristalización, si es apropiado precipitación con sal y/o cromatografía. Con este fin, los organismos pueden disociarse ventajosamente de antemano. En este proceso, el valor del pH se mantiene ventajosamente entre pH 4 y 12, preferentemente entre pH 6 y 9, especialmente preferentemente entre pH 7 y 8.
El medio de cultivo a usar debe cumplir adecuadamente con los requisitos de las cepas en cuestión. En el libro de texto "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington DC, Estados Unidos, 1981) pueden encontrarse descripciones de medios de cultivo para varios microorganismos.
Como se describió anteriormente, estos medios que pueden emplearse de acuerdo con la invención comprenden habitualmente una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/o oligoelementos.
Las fuentes de carbono preferidas son azúcares, tales como mono-, di- o polisacáridos. Los ejemplos de fuentes de carbono son glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidón o celulosa. Los azúcares también pueden añadirse a los medios a través de compuestos complejos como la melaza u otros subproductos del refinado del azúcar. También puede ser ventajosa la adición de mezclas de una variedad de fuentes de carbono. Otras posibles fuentes de carbono son aceites y grasas como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y/o grasa de coco, ácidos grasos como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y/o ácido linoleico, alcoholes y/o o polialcoholes como, por ejemplo, glicerol, metanol y/o etanol, y/o ácidos orgánicos como, por ejemplo, ácido acético y/o ácido láctico.
Las fuentes de nitrógeno son habitualmente compuestos de nitrógeno orgánicos o inorgánicos o materiales que comprenden estos compuestos. Los ejemplos de fuentes de nitrógeno comprenden amoníaco en forma líquida o gaseosa o sales de amonio como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoácidos o fuentes de nitrógeno complejas como licor de maíz, harina de soja, proteína de soja, extracto de levadura, extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrógeno pueden usarse individualmente o como una mezcla.
Los compuestos de sales inorgánicas que pueden estar presentes en los medios comprenden las sales de cloruro, fósforo y sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, zinc, cobre y hierro.
Los compuestos inorgánicos que contienen azufre como, por ejemplo, sulfatos, sulfitos, ditionitas, tetrationatos, tiosulfatos, sulfuros, o también compuestos orgánicos de azufre como mercaptanos y tioles pueden usarse como fuentes de azufre para la producción de productos químicos finos que contienen azufre, en particular de metionina.
Como fuentes de fósforo puede usarse ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato de dipotasio o las sales correspondientes que contienen sodio.
Pueden añadirse agentes quelantes al medio para mantener los iones metálicos en solución. Los agentes quelantes particularmente adecuados comprenden dihidroxifenoles tales como catecol o protocatecuato y ácidos orgánicos tales como ácido cítrico.
Los medios de fermentación usados de acuerdo con la invención para el cultivo de microorganismos habitualmente comprenden además otros factores de crecimiento como vitaminas o promotores del crecimiento, que incluyen, por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales se derivan con frecuencia de componentes de medios complejos tales como extracto de levadura, melaza, licor de maíz y similares. Además, es posible añadir precursores adecuados al medio de cultivo. La composición exacta de los compuestos del medio depende en gran medida del experimento particular y se decide individualmente para cada caso específico. Puede encontrarse información sobre la optimización de los medios en el libro de texto "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Editores P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) págs. 53-73, ISBN 0199635773). Los medios de crecimiento también pueden obtenerse a partir de proveedores comerciales, por ejemplo, Standard 1 (Merck) o BHI (infusión de cerebro y corazón, DIFCO) y similares.
Todos los componentes de los medios se esterilizan, ya sea por calor (20 min a 1,5 bar y 121 °C) o por esterilización por filtración. Los componentes pueden esterilizarse juntos o, si es necesario, por separado. Todos los componentes de los medios pueden estar presentes al comienzo del cultivo o añadirse continuamente o por lotes, según se desee.
La temperatura de cultivo está normalmente entre 15 °C y 45 °C, preferentemente de 25 °C a 40 °C, y puede mantenerse constante o puede alterarse durante el experimento. El pH del medio debe estar en el intervalo de 5 a 8,5, preferentemente aproximadamente 7,0. El pH para el cultivo puede controlarse durante el cultivo tras añadir compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco y amoníaco acuoso o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. La formación de espuma puede controlarse tras emplear antiespumantes tales como, por ejemplo, ésteres de poliglicol de ácidos grasos. Para mantener la estabilidad de los plásmidos es posible añadir al medio sustancias adecuadas que tengan un efecto selectivo, por ejemplo, antibióticos. Las condiciones aerobias se mantienen tras introducir en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno como, por ejemplo, aire ambiental. La temperatura del cultivo es normalmente de 20 °C a 45 °C y preferentemente de 25 °C a 40 °C. El cultivo continúa hasta que la formación del producto deseado es máxima. Este objetivo normalmente se logra dentro de 10 a 160 horas.
El caldo de fermentación puede procesarse después adicionalmente. La biomasa puede, de acuerdo con lo requerido, eliminarse total o parcialmente del caldo de fermentación por métodos de separación tales como, por ejemplo, centrifugación, filtración, decantación o una combinación de estos métodos o dejarse completamente en dicho caldo. Es ventajoso procesar la biomasa después de su separación.
Sin embargo, el caldo de fermentación también puede espesarse o concentrarse sin separar las células, mediante el uso de métodos conocidos tales como, por ejemplo, con la ayuda de un evaporador rotatorio, evaporador de película delgada, evaporador de película descendente, por ósmosis inversa o por nanofiltración. Finalmente, este caldo de fermentación concentrado puede procesarse para obtener los alcaloides opiáceos presentes en el mismo.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un gen codificado por una molécula de ácido nucleico como la representada por la secuencia de ácido nucleico en la Figura 3a, o una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones de hibridación estrictas con la secuencia de nucleótidos en la Figura 3a y codifica un polipéptido con actividad de citocromo P450, como medio para identificar la presencia o ausencia de un gen que codifica dicho citocromo P450 o como medio para identificar un locus en donde dicho locus se asocia con alteración de la expresión o actividad de dicho citocromo P450 en una planta de Papaveraceae
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para determinar la presencia o ausencia de un gen de acuerdo con la invención en una variedad de Papaveraceae que comprende:
i) obtener una muestra de una planta de Papaveraceae;
ii) extraer el ADN genómico de la planta; y
iii) analizar el ADN genómico para determinar la presencia de un gen que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos como la representada en la Figura 3a.
Los métodos para analizar el ADN genómico se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, los métodos de reacción en cadena de la polimerasa que usan cebadores de oligonucleótidos específicos de secuencia para amplificar regiones específicas del gen de acuerdo con la invención. El análisis de extracción, aislamiento y restricción mediante el uso de endonucleasas de restricción específicas de secuencia seguidas de separación y transferencia de Southern para analizar la estructura genómica se ha establecido durante más de treinta años. El análisis puede estar dirigido a la estructura del intrón o del exón o a las regiones aguas arriba o aguas abajo del gen; por ejemplo, regiones promotoras.
La mutagénesis como medio para inducir cambios fenotípicos en los organismos se conoce bien en la técnica e incluye, pero no se limita al uso de agentes mutagénicos tales como mutágenos químicos [por ejemplo, análogos de bases, agentes desaminantes, agentes intercalantes de ADN, agentes alquilantes, transposones, bromo, azida de sodio] y mutágenos físicos [por ejemplo, radiación ionizante, exposición a psoraleno combinada con radiación UV].
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una planta de Papaveraceae en donde dicha planta se mutageniza en un gen que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención en donde el gen mutagenizado codifica un polipéptido del citocromo P450 que tiene alteración de la expresión y/o actividad del citocromo P450.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para el análisis de una planta que comprende:
i) obtener una muestra a partir de la planta de acuerdo con la reivindicación 13 y analizar la secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:
a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como la representada en la Figura 3a;
b) una molécula de ácido nucleico que se hibrida a la molécula de ácido nucleico en a) en condiciones de hibridación estrictas y que codifica un polipéptido con actividad polipeptídica del citocromo P450; y opcionalmente
ii) comparar la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico en dicha muestra con una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de la planta de tipo salvaje original, opcionalmente dicho método comprende además las etapas de:
i) extraer el ácido nucleico de dichas plantas mutadas;
ii) amplificación de una parte de dicha molécula de ácido nucleico mediante una reacción en cadena de la polimerasa;
iii) formar una preparación que comprenda el ácido nucleico amplificado y el ácido nucleico extraído de la semilla de tipo salvaje para formar un ácido nucleico heterodúplex;
iv) incubar dicha preparación con una nucleasa de una hebra que corta en una región del ácido nucleico heterodúplex para identificar el error de apareamiento en dicho heterodúplex; y
v) determinar el sitio del error de apareamiento en dicho heterodúplex de ácido nucleico.
En un método preferido de la invención dicha variedad de planta de Papaveraceae mejora la expresión y/o actividad del polipéptido citocromo P450.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una planta en donde dicha planta comprende un vector viral que incluye todo o parte de un gen que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
En una modalidad preferida de la invención, dicho gen está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:
i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como la representada en la Figura 1a;
ii) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de hibridación estrictas con una molécula de ácido nucleico en (i) y que codifica un polipéptido del citocromo p450; iii) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido variante que varía de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como la representada en la Figura 4a.
En una modalidad preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos como la representada en la Figura 1a.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un vector viral que comprende la totalidad o parte de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un vector viral de acuerdo con la invención en el silenciamiento génico inducido por virus en una planta
En una modalidad preferida de la invención, dicha planta es de la familia Papaveraceae.
El silenciamiento génico inducido por virus [VIGS] se conoce en la técnica y explota un mecanismo de defensa antiviral mediado por ARN. Las plantas que se infectan con un virus no modificado inducen un mecanismo que se dirige específicamente al genoma viral. Sin embargo, los vectores virales que se modifican genéticamente para incluir moléculas de ácido nucleico derivadas de genes de la planta huésped también inducen la inhibición específica de la expresión del vector viral y, además, se dirigen al mRNA del huésped. Esto permite el silenciamiento de genes específicos de genes sin modificación genética del genoma de la planta y es esencialmente una modificación no transgénica.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de esta descripción, las palabras "comprende" y "que contiene" y las variaciones de las palabras, por ejemplo "que comprende" y "comprende", significan "que incluye pero no se limita a", y no pretende (ni lo hace) excluir otras porciones, aditivos, componentes, enteros o etapas.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de esta descripción, el singular abarca el plural a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera. En particular, donde se usa el artículo indefinido, la descripción debe entenderse que contempla la pluralidad así como también la singularidad, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera.
Debe entenderse que las particularidades, enteros, características, compuestos, porciones o grupos químicos descritos junto con un aspecto, modalidad o ejemplo particular de la invención son aplicables a cualquier otro aspecto, modalidad o ejemplo descrito en la presente a menos que sea incompatible con el mismo.
A continuación se describirá una modalidad de la invención únicamente a modo de ejemplo y con referencia a las siguientes figuras:
La Figura 1a es la secuencia de nucleótidos de un cDNA que codifica a PSCYP1, la Figura 1b es la secuencia de nucleótidos de un cDNA que codifica a PSCYP2, la Figura 1c es la secuencia de nucleótidos de un cDNA que codifica a PSCYP3; la Figura 1d es la secuencia de nucleótidos de otra modalidad de un cDNA que codifica a PSCYP3;
La Figura 2a ilustra la frecuencia de los EST del gen PSCYP1 en bibliotecas de EST derivadas a partir de la secuenciación 454 de tejidos de tallo y cápsula de los cultivares GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1. Las 16 bibliotecas de EST se generaron mediante pirosecuenciación mediante el uso de bibliotecas de cDNA preparadas a partir de tallos (S) y cápsulas (C) en dos etapas de desarrollo: "recolección temprana" (EH, 1-3 días después de la caída de los pétalos) y "recolección tardía" (LH, 4-6 días después de la caída de los pétalos) a partir de cada uno de los cuatro cultivares de P. somniferum; la Figura 2b ilustra la frecuencia de EST del gen PSCYP2; la Figura 2c ilustra la frecuencia de EST del gen PSCYP3;
La Figura 3a es la secuencia de nucleótidos del gen que codifica a PSCYP1; la Figura 3b es la secuencia de nucleótidos del gen que codifica a PSCYP2, la Figura 3c es la secuencia de nucleótidos del gen que codifica a PSCYP3;
La Figura 4a es la secuencia de aminoácidos deducida de PSCYP1; la Figura 4b es la secuencia de aminoácidos deducida de PSCYP2; la Figura 4c es la secuencia de aminoácidos deducida de PSCYP3; la Figura 4d es la secuencia de aminoácidos deducida de PSCYP3;
La Figura 5 ilustra que la secuencia del gen PSCYP1 solo está presente en el cultivar GSK NOSCAPINA CVS1 y está ausente en los cultivares GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2 y GSK TEBAÍNA CVS1;
La Figura 6 ilustra que la secuencia del gen PSCYP2 solo está presente en el cultivar GSK NOSCAPINA CVS1 y está ausente en los cultivares GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2 y GSK TEBAÍNA CVS1;
La Figura 7 ilustra que la secuencia del gen PSCYP3 solo está presente en el cultivar GSK NOSCAPINA CVS1 y está ausente en los cultivares GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2 y GSK TEBAÍNA CVS1;
La Figura 8a es una representación tabular de la segregación del gen PSCYP1 en una población de mapeo F2 derivada de un cruce parental de cultivares GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1 junto con la segregación conjunta de PSCYP1 y la acumulación de noscapina en plantas F2 individuales, la Figura 8b es la representación equivalente de la segregación del gen PSCYP2, la Figura 8c es la representación equivalente de la segregación del gen PSCYP3, el ensayo de genotipado de PSCYP3 falló en 16 muestras (como lo indica la falta de amplificación del control positivo interno), estas muestras se excluyeron del análisis de segregación conjunta de PSCYP3;
la Figura 9 ilustra un cromatograma UPLC típico para una solución estándar;
la Figura 10 ilustra un cromatograma UPLC típico para una variedad de amapola que contiene noscapina; la Figura 11 es la parte de 622 bases de longitud de la secuencia del gen de la fitoeno desaturasa amplificada a partir del cDNA de GSK NOSCAPINA CVS1. El tramo de secuencia de 129 bases usado para silenciar el gen de la fitoeno desaturasa está subrayado;
la Figura 12 es la parte de la secuencia de cDNA usada para silenciar a PSCYP2; y
la Figura 13 es la parte de la secuencia de cDNA usada para silenciar a PSCYP3;
la Figura 14 muestra el área máxima normalizada de tetrahidrocolumbamina supuesta en los cromatogramas de UPLC obtenidos a partir de látex y cápsulas maduras de plantas que mostraron el fenotipo de fotoblanqueo después de la infección con las construcciones de silenciamiento pTRV2-PDS-PSCYP2, pTRV2-PDS-PSCYP3 o pTRV2-PDS, respectivamente. También se muestra el área máxima de tetrahidrocolumbamina supuesta obtenida a partir de plantas no infectadas;
la Figura 15 muestra el área máxima normalizada de un alcaloide de secoberbina supuesto (en los cromatogramas de UPLC obtenidos a partir de látex y cápsulas maduras de plantas que mostraron el fenotipo de fotoblanqueo después de la infección con las construcciones de silenciamiento pTRV2-PDS-PSCYP2, pTRV2-PDS-PSCYP3 o pTRV2-PDS, respectivamente. También se muestra el área máxima de secoberbina supuesta obtenida a partir de plantas no infectadas. La masa, la fórmula molecular y el patrón de fragmentación del compuesto son consistentes con demetoxihidroximacrantaldehído o demetoximacrantoridina; y
la Figura 16 muestra el área máxima normalizada de otro alcaloide de secoberbina supuesto en los cromatogramas de UPLC obtenidos a partir de látex y cápsulas maduras de plantas que mostraron el fenotipo de fotoblanqueo después de la infección con las construcciones de silenciamiento pTRV2-PDS-PSCYP2, pTRV2-PDS-PSCYp3 o pTRV2-PDS, respectivamente. También se muestra el área máxima de secoberbina supuesta obtenida a partir de plantas no infectadas. La masa, la fórmula molecular y el patrón de fragmentación del compuesto son consistentes con demetoxinarcotinediol o narctololinol.
Materiales y métodos
Generación de bibliotecas de EST
a) Aislamiento de ARN y síntesis de cDNA
El material se recolectó de tallos y cápsulas en dos etapas de desarrollo de cuatro cultivares de amapola. El ARN se preparó individualmente a partir de cinco plantas por cultivar, etapa de desarrollo y órgano. El material recolectado se molió en nitrógeno líquido mediante el uso de un mortero y la mano. El ARN se aisló de las preparaciones del tallo o la cápsula molidos mediante el uso de un método basado en CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) como se describió en Chang y otros (1993) Plant Molecular Rep. 11: 113-116 con ligeras modificaciones (tres extracciones con cloroformo:alcohol isoamílico, precipitación de ARN con cloruro de litio a -20 °C durante una noche). El ARN se cuantificó espectrofotométricamente antes de agrupar cantidades iguales de ARN de cinco plantas por cultivar, etapa y órgano. Las muestras agrupadas se sometieron a una etapa de purificación final mediante el uso de un RNeasy Plus MicroKit (Qiagen, Crawley, Reino Unido) para eliminar cualquier resto de ADN genómico de las preparaciones. El ARN se eluyó típicamente en 30-100 ml de agua. El cDNA se preparó mediante el uso de SMART cDNA Library Construction Kit (Clontech, Saint-Germainen-Laye, France) de acuerdo con las instrucciones del fabricante pero mediante el uso de SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Paisley, UK) para la síntesis de la primera hebra. El cebador de PCR CDSIII se modificó para: 5' ATT CTA GAT CCR ACA TGT TTT TVN 3' donde R = A o G, V = A, C o G; N = A/T o C/G. El cDNA se digirió con Mmel (New England Biolabs Inc., Hitchin, Reino Unido) seguido de una purificación final mediante el uso de un kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen, Crawley, Reino Unido).
b) Pirosecuenciación de cDNA
Se usó la plataforma de secuenciación Roche 454 GS-FLX (Branford, CT, Estados Unidos) para realizar la pirosecuenciación en muestras de cDNA preparadas a partir de los siguientes materiales para cada uno de los cuatro cultivares de P. somniferum: GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAINA CVS1.
1. Tallo, 1-3 días después de la caída de los pétalos (recolección temprana)
2. Tallo, 4 -6 días después de la caída de los pétalos (recolección tardía)
3. Cápsula, 1-3 días después de la caída de los pétalos (recolección temprana)
4. Cápsula, 4 -6 días después de la caída de los pétalos (recolección tardía)
c) Análisis de secuencias sin procesar, ensamblaje de secuencias contiguas y anotación
Los conjuntos de datos de secuencia sin procesar se derivaron de la secuenciación etiquetada en paralelo en la plataforma de secuenciación 454 (Meyer y otros (2008) Nature Protocols 3: 267-278). Las secuencias de cebadores y etiquetas se eliminaron primero de todas las lecturas de secuencias individuales. El ensamblaje de secuencias contiguas solo se realizó en secuencias de más de 40 nucleótidos y que contenían menos del 3 % de residuos desconocidos (N). Estas secuencias de EST de alta calidad se ensamblaron en secuencias contiguas distintivas con el Programa de ensamblaje de secuencias CAP3 (Huang y Madan (1999) Genome Research 9: 868-877), y los cóntigos resultantes se anotaron localmente mediante el uso del programa BLAST2 (Altschul y otros (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) contra la base de datos de péptidos no redundantes descargada del NCBI.
d) Perfil de expresión de los genes del citocromo P450
Se contó el número de EST asociados con las respectivas secuencias de consenso del gen del citocromo P450 en cada una de las 16 bibliotecas de EST. Los valores obtenidos se normalizaron sobre la base del número total de EST obtenidos por biblioteca.
Amplificación y secuenciación de los genes del citocromo P450 a partir del ADN genómico de GSK NOSCAPINA CVS1.
a) Preparación de ADN genómico
Preparación de ADN: Se recolectaron muestras de hojas (30-50 mg) para la extracción de ADN de plantas de GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2 GSK NOSCAPINA CVS1, GSK TEBAÍNA CVS1 cultivadas en invernadero. El ADN se extrajo mediante el uso de Qiagen BioSprint 96. El ADN extraído se cuantificó mediante el uso de Hoescht 33258 y se normalizó a 10 ng/ul.
b) Amplificación y secuenciación de los genes del citocromo P450 a partir del ADN de GSK NOSCAPINA CVS1 Los cebadores y las combinaciones de cebadores usados para la amplificación de los respectivos genes del citocromo P450 a partir del ADN genómico extraído se muestran en la Tabla 1. Los cebadores se diseñaron sobre la base de los cóntigos de citocromo P450 respectivos ensamblados a partir de EST exclusivos del cultivar GSK NOSCAPINA CVS1. Los cóntigos de PSCYP1 y PSCYP2 contenían el marco de lectura abierto completo, así como también las regiones no traducidas 5' y 3'. PSCYP3 estuvo representado por dos cóntigos que cubren los extremos 5' y 3' del marco de lectura abierto con 200 bases faltantes desde el centro del marco de lectura abierto. Este tramo faltante de la secuencia de codificación se amplificó y confirmó mediante la amplificación y la secuenciación del cDNA (preparado como se describió anteriormente) además del ADN genómico para determinar la posición precisa y del intrón 1 (Figura 3c). La amplificación se realizó en grupos de ADN que comprendían el ADN de al menos cuatro individuos y las combinaciones de cebadores que se muestran en la Tabla 2. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes:
Mezcla de reacción:
Tampón 5*HF (Finnzymes) 5 pl
dNTP (20 mM cada uno) 0,25 pl
Cebador de avance (10 pM) 2,5 pl
Cebador Rev (10 pM) 2,5 pl
ADN (10 ng/pl) 5 pl
Inicio en caliente de Phusion (Finnzymes) 0,25 pl
dH2O 9,5 pl
Volumen de reacción: 25 pl
Phusion Hot Start de Finnzymes se adquirió a través de New England Biolabs (Bishops Stortford, Reino Unido).
Programa del PCR:
desnaturalización inicial 98 °C 1 minuto
30 ciclos de: desnaturalización 98 °C 30
segundo
s
temperatura de Tabla 2&3 30
hibridación segundo
s
extensión 72 °C 40
segundo
s
extensión final 72 °C 10
minutos
incubación 4 °C almacen
amiento
El extremo 5' y parte de la región promotora de PSCYP3 se amplificó a partir de ADN genómico a través de una configuración de PCR de largo alcance mediante el uso de los cebadores PSCYP1_LA_R1 y PSCYP3_LA_R1:
Mezcla de reacción de PCR de largo alcance:
Tampón 5* LongAmp (New England Biolabs) 10 j l
dNTP (10 mM cada uno) 1,5 j l
Cebador de avance (10 jM ) 2 j l
Cebador Rev (10 jM ) 2 j l
gDNA (100 ng/jl) 2 j l
LongAmp Taq (New England Biolabs) 2 j l
dH2O 30,5 j l
Volumen de reacción: 50 j l
Programa del PCR de largo alcance:
desnaturalización inicial 94 °C 30 segundos
30 ciclos de: desnaturalización 94 °C 30 segundos
temperatura de hibridación 65 °C 13,5 minutos
extensión final 65 °C 10 minutos
incubación 4 °C almacenamiento
Los productos resultantes de las distintas PCR se purificaron mediante el uso del kit de purificación Agencourt AMPure (Beckman Coulter LTD, Bromley, UK). 30-50 ng de los respectivos productos de PCR purificados se sometieron a secuenciación de Sanger mediante el uso de los cebadores que se muestran en la Tabla 2 como cebadores de secuenciación. Dado que la combinación de cebadores PSCYPl_F4/R7 dio como resultado la amplificación de un producto inespecífico más pequeño además del amplicón esperado (véase también la Figura 4d), este último se extirpó y purificó a partir del gel mediante el uso del kit de extracción de gel QIAEX II (Qiagen, Hilden, Alemania) antes de la secuenciación.
Las secuencias de aminoácidos de los respectivos citocromos P450, predichas a partir de las secuencias de marco de lectura abierto confirmadas por la secuencia de Sanger, se compararon con las secuencias de proteínas depositadas en la base de datos de proteínas no redundantes mediante el uso del programa Standard Protein BLAST (blastp).
c) Análisis de ADN genómico de GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1 para la presencia de genes del citocromo P450
Para investigar si los genes del citocromo P450 estaban presentes en los cuatro cultivares, se realizó la amplificación del ADN genómico (grupos de cuatro individuos por cultivar) de GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA c Vs 2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1 en una serie de fragmentos superpuestos mediante el uso de combinaciones de cebadores que se muestran en la Tabla 3. Se usaron exactamente las mismas condiciones de PCR como se describió anteriormente para obtener las secuencias genómicas completas de GSK NOSCAPINA CVS1. Se resolvieron 5 j l de cada reacción de PCR en agarosa al 1 % junto con un estándar de tamaño apropiado.
Generación de un mapeo poblacional, extracción y análisis de ADN genómico a partir de material foliar más extracción y análisis de alcaloides a partir de paja de amapola
a) Extracción de ADN de plantas F2
Se recolectaron 40-50 mg de tejido foliar, por duplicado, a partir de todas las plantas de amapola dentro de la población de mapeo GSK NOSCAPINA Cv S1 X GSK TEBAÍNA c Vs 1 F2 y plantas parentales) en la etapa de crecimiento de 'roseta pequeña' (~10 hojas presentes en cada planta).
Se recolectó tejido foliar (40 - 50 mg de peso húmedo) en tubos de muestra de 1,2 ml en formato 8 x 12 (Número de parte 1760-00, Scientific Specialties Inc, 130 Thurman St, Lodi, CA 95240, Estados Unidos), cerrados con tiras de tapas (Número de parte 1702-00, Scientific Specialties Inc) y se envió a AGRF (Australian Genome Research Facility) Adelaide en paquetes de hielo seco Techni-Ice por mensajería nocturna
En el momento de la recepción, se quitaron las tiras de tapas y se añadió una perla de carburo de tungsteno de 3 mm a cada tubo (Número de parte 69997, Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Las muestras se colocaron a -80 °C (modelo del Freezer; Sanyo MDF-U73V) durante un mínimo de dos horas antes de liofilizarlas durante 18 h (Christ modelo Alpha 2-4 LSC).
Después de la liofilización, los tubos se sellaron con tiras de tapas nuevas (como se indicó anteriormente) y las muestras se pulverizaron mediante molienda de perlas (modelo "Tissue Lyser", número de parte 85300; Qiagen) a 3000 RPM durante 2 x 60 segundos separados por inversión de placa. La extracción de ADN se realizó mediante el uso del sistema "Nucleospin Plant II" (Macherey-Nagel, GmbH & Co. KG Neumann-Neander-StralJe 6-8, 52355 Düren, Alemania).
La lisis celular se realizó mediante el uso del tampón Set PL2/3 suministrado. Se siguió el protocolo del fabricante para la extracción centrífuga (modelo de la centrífuga 4-K 15; Sigma Laborzentrifugen GmbH, 37520 Osterode am Harz, Alemania).
Se verificó la calidad y la cantidad del ADN recuperado (12/96 muestras, una muestra por columna de placa) mediante espectroscopia ultravioleta (Modelo Nanodrop-8000; productos NanoDrop, 3411 Silverside Rd, Bancroft Building; Wilmington, DE 19810, Estados Unidos) en 230, 260 y 280 nM.
b) Genotipado de muestras de ADN F2 para determinar la presencia o ausencia de los genes del citocromo P450
Las muestras de ADN a partir de un total de 275 plantas F2 se genotiparon para determinar la presencia o ausencia de PSCYP1, PSCYP2 y PSCYP3, respectivamente, mediante la amplificación de un fragmento corto de cada uno de los genes. Con el fin de marcar con fluorescencia los fragmentos de PCR resultantes, los cebadores directos llevaban una marca VIC (Applied Biosystems, Reino Unido) en sus extremos 5' de cebado. Los análisis de fragmentos se llevaron a cabo en el analizador de ADN por electroforesis de 96 capilares 37303l (Applied Biosystems, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Además de los respectivos fragmentos de citocromo P450, se amplificó un control positivo interno en cada ensayo de PCR para distinguir la falta de amplificación debido a la ausencia de los genes del citocromo P450 en las muestras de ADN de la falta de amplificación causada por fallas en el ensayo de PCR. Las muestras en las que el ensayo de PCR había fallado se excluyeron de los análisis de segregación conjunta de los genes con el rasgo de noscapina.
Se usaron los siguientes cebadores (las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 1; los cebadores directos se marcaron en el extremo 5' con VIC):
PSCYP1: VIC-PSCYP1_F3/ PSCYP1_R2; tamaño del fragmento amplificado: 166 pb
PSCYP2: VIC-PSCYP2_F2/ PSCYP2_R1; tamaño del fragmento amplificado: 226 pb
PSCYP3: VIC-PSCYP3_F3/ PSCYP3_R1; tamaño del fragmento amplificado: 638 pb
El fragmento PSCYP1 se amplificó con las siguientes condiciones de PCR:
Mezcla de reacción:
tampón GoTaq 5* (Promega) 2 pl
dNTP (mezcla de 2,5 mM) 0,5 pl
MgCl2 (25 mm) 0,6 pl
Cebador directo (10 pM) 0,5 pl
Cebador inverso (10 pM) 0,5 pl
gDNA (5 ng/pl) 2 pl
Go Taq (Promega) 0,2 pl
dH2O 3,7 pl
Volumen de reacción: 10 pl
Programa del PCR:
desnaturalización inicial 94 °C 1 minuto
30 ciclos de: desnaturalización 94 °C 30 segundos
temperatura de hibridación 62 °C 30 segundos
extensión 72 °C 20-30 segundos
extensión final 72 °C 5 minutos
incubación 4 °C almacenamiento
Los fragmentos de PSCYP2- y PSCYP3 se amplificaron con las siguientes condiciones de PCR:
Mezcla de reacción:
Mezclas de PCR multiplex Type-it 5 x (Qiagen) 5 pl
Cebador directo (10 pM) 0,5 pl
Cebador inverso (10 pM) 0,5 pl
gDNA (5 ng/pl) 2 pl
dH2O 2 pl
Volumen de reacción: 10 |jl
Programa del PCR:
desnaturalización inicial 95 °C 15 minutos
30 ciclos de: desnaturalización 95 °C 15 segundos
temperatura de hibridación 60 °C 30 segundos
extensión 72 °C 30 segundos
extensión final 72 °C 5 minutos
incubación 4 °C almacenamiento
c) Análisis de paja de amapola
Las cápsulas de amapola se recolectaron a mano a partir de la población mapeada una vez que las cápsulas se secaron hasta aproximadamente 10 % de humedad en la planta. La semilla se separó manualmente de la cápsula y el material de paja de la cápsula (paja de amapola) se envió después a las instalaciones de extracción de GSK en Port Fairy, Australia.
A continuación, las muestras de paja de amapola se molieron en un molino de bolas Retsch Modelo MM04 hasta obtener un polvo fino. A continuación, se pesaron con precisión muestras de dos gramos de paja de amapola molida (2 ± 0,003 g) y se extrajo en 50 ml de una solución de ácido acético al 10 %. La suspensión de extracción se agitó en un agitador orbital a 200 rpm durante un mínimo de 10 minutos y después se filtró para proporcionar un filtrado transparente. El filtrado final se pasó a través de un filtro de 0,22 jm antes del análisis.
Las soluciones se analizaron mediante el uso de un sistema Waters Acquity UPLC equipado con una columna Waters Acquity BEH C18, 2,1 mm * 100 mm con embalaje de 1,7 micras. La fase móvil usó un perfil de gradiente con el eluyente A que consiste en ácido trifluoroacético 0,1 % en agua desionizada y el eluyente B que consiste en acetonitrilo 100 %. Las condiciones de gradiente de fase móvil usadas se enumeran en la Tabla 2, el número de curva de gradiente se determina mediante el uso de un paquete de programas de cromatografía Waters Empower. El régimen de flujo fue de 0,6 ml por minuto y la columna se mantuvo a 45 °C. El volumen de inyección fue de 1 j l de volumen de inyección y los alcaloides se detectaron mediante el uso de un detector UV a 285 nm.
La pérdida por secado (LOD) de la paja se determinó mediante secado en un horno a 105 grados centígrados durante 3 horas.
Programa de gradiente de flujo
Figure imgf000014_0001
Las concentraciones de alcaloides para morfina, codeína, tebaína, oripavina y noscapina se determinaron mediante comparación con soluciones estándar y los resultados se calcularon sobre la base del peso en seco.
Los tiempos de retención típicos son los siguientes:
Figure imgf000015_0001
Silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) de PSCYP3 y PSCYP3
a) Generación de construcciones de silenciamiento
Un sistema de silenciamiento génico inducido por virus basado en el virus del cascabel del tabaco (TRV) desarrollado y descrito por Liu y otros (2002) Plant J. 30(4): 415-429 se usó para investigar la función génica de PSCYP2 y PSCYP3. Los fragmentos de ADN seleccionados para silenciar a PSCYP2 y PSCYP3, respectivamente, se amplificaron por PCR y se clonaron en el vector de silenciamiento pTRV2 (número de acceso de GenBank AF406991; Liu y otros (2002) Plant J. 30(4): 415-429). Estaban unidos a un fragmento de 129 pb de longitud del gen de la fitoeno desaturasa de P. somniferum (PsPDS) para silenciar los respectivos genes del citocromo P450 y PsPDS simultáneamente. Las plantas que muestran el fenotipo de fotoblanqueo como resultado del silenciamiento de PsPDS (Hileman y otros (2005) Plant J. 44(2): 334-341) se identificaron como plantas infectadas con éxito con las construcciones de silenciamiento respectivas y se seleccionaron para el análisis.
Generación de la construcción pTRV2-PDS: Un fragmento de 622 pb (Figura 11) de PsPDS se amplificó a partir de cDNA preparado a partir de GSK NOSCAPINA CVS1 como se describió anteriormente mediante el uso de los cebadores ps_pds_F y ps_pds_R4 (Tabla 4). La secuencia del cebador directo se basó en un contig de 412 pb de largo derivado de las bibliotecas de EST que compartían el 99 % de identidad en su extremo 3' con la secuencia de codificación parcial de la fitoeno desaturasa de P. somniferum (número de acceso de GenBank DQ116056). La secuencia del cebador inverso se diseñó sobre la base de la secuencia DQ116056. Las condiciones de la PCR fueron idénticas a las descritas anteriormente para la amplificación de los genes del citocromo P450 a partir de la secuencia genómica, excepto que la etapa de hibridación se llevó a cabo a 70 °C y el tiempo de extensión se incrementó a 60 segundos.
La digestión con Sau3AI del fragmento de PCR produjo, entre otros, dos fragmentos (280 pb y 129 pb de longitud) que portaban extremos cohesivos compatibles con BamHI en sus extremos 5' y 3'. El fragmento de 129 pb de longitud (tramo subrayado en la Figura 11) se clonó en el sitio BamHI del vector pTRV2. Debido a que se usó Sau3AI para producir extremos cohesivos compatibles con BamHI, el sitio de BamHI en el extremo 5 del inserto de PDS se eliminó en la construcción pYL156-PDS. Sin embargo, el sitio de reconocimiento de BamHI en su extremo 3' se mantuvo intacto debido a la naturaleza de la secuencia del inserto de PDS.
Una construcción de pTRV2-PDS de secuencia confirmada, con el fragmento de 129 pb en orientación sentido, se usó posteriormente como vector para generar las construcciones de silenciamiento de PSCYP2 y PSCYP3 y sirvió como control en los experimentos de VIGS.
Generación de construcciones de silenciamiento para PSCYP2 y PSCYP3 (pTRV2-PDS-PSCYP2 y pTRV2-PDS-PSCYP3): Los fragmentos de ADN seleccionados para silenciar a PSCYP2 y PSCYP3 se amplificaron a partir de cDNA de GSK NOSCAPINA CVS1 preparado como se describió anteriormente con el uso de las secuencias de cebadores que se muestran en la Tabla 4. Se añadieron sitios de restricción adicionales (cebadores directos: Xhol y HindIII para cebadores directos; sitio Kpnl para cebadores inversos) a los cebadores específicos de genes para facilitar la clonación. Las condiciones de amplificación fueron como se describió anteriormente para amplificar el fragmento de PDS, excepto que las temperaturas de hibridación fueron de 60,9 °C para PSCYP2 y de 66 °C para PSCYP3 y el tiempo de extensión fue de 30 segundos.
La secuencia seleccionada para silenciar a PSCYP2 (Figura 12) y a PSCYP3 (Figura 12), respectivamente, se clonaron en pTV00 (Ratcliff y otros (2001) Plant J. 25(2): 237-245) mediante el uso de HindIII y Kpnl y se subclonaron en pTRV2-PDS mediante el uso de BamHI y Kpnl. Se usaron construcciones pTRV2-PDS-PSCYP2 y pTRV2-PDS-PSCYP3 confirmadas por secuencia en los experimentos de VIGS.
b) Transformación de construcciones en Agrobacterium tumefaciens
La propagación de las construcciones de silenciamiento se llevó a cabo con E. coli cepa DH5ay, subsecuentemente, las respectivas construcciones de silenciamiento, así como también pTRV1 (número de acceso de GenBank AF406990; Liu y otros (2002) Plant J. 30(4): 415-429) se transformaron independientemente en Agrobacterium tumefaciens (cepa GV3101) electrocompetente.
c) Infiltración de plantas
Los cultivos líquidos de una noche de A. tumefaciens que contenían cada construcción de silenciamiento se usaron para inocular el medio Luria-Bertani (LB) que contenía MES 10 mM, acetosiringona 20 pM y kanamicina 50 pg/ml. Los cultivos se mantuvieron a 28 °C durante 24 horas, se recolectaron mediante centrifugación a 3000 g durante 20 min y se resuspendieron en una solución de infiltración (MES 10 mM, acetosiringona 200 pM, MgCl2 10 mM) a una OD600 de 2,5. A. tumefaciens que albergaban las construcciones respectivas (pTRV2-PDS-PSCYP2, pTRV2-PDS-PSCYP3 o, como control, pTRV2-PDS) se mezclaron 1:1 (v/v) con A. tumefaciens que contenía pTRV1 y se incubó durante dos horas a 22 °C antes de la infiltración. Se infiltraron plántulas de dos semanas de GSK NOSCAPINA CVS1 cultivadas en condiciones estándar de invernadero (22 °C, 16 h de fotoperíodo), con las primeras hojas emergentes, como se describió por Hagel y Facchini (2010) Nat. Chem. Biol. 6: 273-275.
d) Análisis de látex y cápsulas de plantas silenciadas
Se analizó el látex de hojas de plantas de amapola infiltradas que mostraban fotoblanqueo como marcador visual de infección exitosa y silenciamiento cuando emergían los primeros botones florales (plantas de ~7 semanas de edad). Se seleccionaron para el análisis las plantas que mostraban un grado similar de fotoblanqueo de las hojas
El látex se recogió a partir de los pecíolos cortados, con una sola gota dispersada en 500 pl de ácido acético 10 %. Esto se diluyó 10 x en ácido acético 1 % para dar una solución de alcaloide en ácido acético 2 % para su análisis posterior. Las cápsulas se recolectaron a mano a partir de cultivos de invernadero de las mismas plantas usadas para el análisis de látex y las cápsulas individuales se molieron en un molino de bolas Retsch modelo MM04 hasta obtener un polvo fino. A continuación, se pesaron con precisión muestras de diez mg de paja de amapola molida (10 ± 0,1 mg) y se extrajeron en 0,5 ml de una solución de ácido acético 10 % con agitación suave durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se clarificaron mediante centrifugación y una submuestra de 50 pl se diluyó 10 x en ácido acético 1 % para dar una solución de alcaloide en ácido acético 2 % para su análisis posterior.
Todas las soluciones se analizaron mediante el uso de un sistema Waters Acquity UPLC equipado con una columna Waters Acquity BEH C18 de 2,1 mm * 100 mm con embalaje de 1,7 micras. La fase móvil usó un perfil de gradiente con el eluyente A que consiste en bicarbonato de amonio 10 mM a pH 10,2 y el eluyente B metanol. Las condiciones de gradiente de fase móvil usadas se enumeran en la Tabla 1, con un gradiente lineal. El régimen de flujo fue de 0,5 ml por minuto y la columna se mantuvo a 60 °C. El volumen de inyección fue de 2 pl y los picos eluidos se ionizaron en modo APCI positivo y se detectaron dentro de una precisión de masa de ~3 ppm mediante el uso de un Thermo LTQ-Orbitrap. Las corridas se controlaron mediante el programa Thermo Xcalibur.
Programa de flujo de gradiente:
Figure imgf000016_0001
Todos los análisis de datos se llevaron a cabo en R. Los picos de alcaloides supuestos se cuantificaron por sus áreas de iones pseudomoleculares mediante el uso de secuencias de comandos personalizadas. Se compilaron los listados de picos y se identificaron las diferencias significativas en cuanto a picos entre las muestras mediante ANOVA de 1 vía con valores de p ajustados mediante el uso de la corrección de Bonferroni para el número de picos distintivos en el conjunto de datos. Para cualquier comparación de picos con valores de p ajustados < 0,05, se usó la prueba HSD de Tukey para identificar los picos que fueran significativamente diferentes entre cualquier muestra dada y el control. Los alcaloides se identificaron tras comparar los valores exactos de masa y tiempo de retención con los de los estándares. Donde los estándares no estaban disponibles, se usaron masas exactas neutras para generar aciertos de fórmulas moleculares dentro de las restricciones elementales de C = 1:100, H = 1:200, O = 0:200, N = 0:3 y precisión de masa < 20 ppm. El acierto con el error de ppm más bajo dentro de estas restricciones se usó para asignar una fórmula supuesta.
Ejemplo 1
Ensamblaje de la secuencia de cDNA de PSCYP1 de longitud completa a partir de EST y confirmación mediante secuenciación de ADN genómico.
El marco de lectura abierto de longitud completa de PSCYP1 (Figura 1a) se ensambló a partir de EST derivados de la plataforma de secuenciación 454 mediante el uso del programa de ensamblaje de secuencias CAP3. La secuencia de cDNA de longitud completa se confirmó mediante amplificación directa del cDNA de longitud completa a partir del ADN genómico de GSK NOSCAPINA CVS1.
Ejemplo 2
PSCYP1 se expresa exclusivamente en el cultivar de Papaver somniferum productor de noscapina GSK NOSCAPINA CVS1.
La Figura 2a muestra la distribución normalizada de los EST asociados con la secuencia de consenso PSCYP1 en cada una de las 16 bibliotecas de EST preparadas a partir de dos órganos (cápsulas y tallos) en dos etapas de desarrollo (recolección temprana y tardía) a partir de cada uno de los cuatro cultivares de amapola, GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1. Los EST correspondientes a PSCYP1 se encontraron exclusivamente en bibliotecas derivadas del cultivar productor de noscapina GSK NOSCAPINA CVS1 (Figura 2a). La expresión de PSCYP1 fue más fuerte en el tejido del tallo poco después de la floración.
Ejemplo 3
Amplificación por PCR de PSCYP1 a partir del ADN genómico de los cuatro cultivares de Papaver somniferum GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1.
Las amplificaciones por PCR de fragmentos de PSCYP1 se realizaron en ADN genómico a partir de los cuatro cultivares de amapola GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1 mediante el uso de las combinaciones
del cebador que se muestran en las Tablas 2 y 3.
La Figura 5 muestra la amplificación por PCR de PSCYP1 a partir del ADN genómico de los cuatro cultivares de Papaver somniferum GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1; La amplificación del ADN genómico produjo la secuencia del gen que se muestra en la Figura 3a.
Ejemplo 4
La proteína codificada por PSCYP1 supuesta muestra la mayor similitud de secuencia con un citocromo P450 de Coptis japonica y Thalictrum flavum.
Los homólogos más cercanos a la proteína codificada por el marco de lectura abierto de PSCYP1 supuesta (Figura 4a) son un citocromo P450 de Coptis japonica (número de acceso de GenBank BAF98472.1, 46 % idéntico a nivel de aminoácidos). El homólogo más cercano con una asignación a una subfamilia del citocromo P450 es CYP82C4 de Arabidopsis lyrata (número de acceso de GenBank XP_002869304.1,44 % idéntico a nivel de aminoácidos).
Ejemplo 5
PSCYP1 sólo está presente en el genoma del cultivar de P. somniferum productor de noscapina GSK NOSCAPINA CVS1.
La región transcrita recubierta por EST contenía la secuencia de codificación completa de PSCYP1 (que incluye las regiones no traducidas 5' y 3'), que se usó para el diseño de los cebadores (Tabla 1) para amplificar el gen PSCYP1 del ADN genómico en una serie de fragmentos de solapamiento para la secuenciación. Tras probar un subconjunto de combinaciones de cebadores (Tabla 3) en muestras de ADN genómico de los cuatro cultivares, se descubrió que los fragmentos de PSCYP1 solo pudieron amplificarse a partir del ADN genómico del cultivar productor de noscapina GSK NOSCAPINA CVS1, pero no del ADN genómico de los cultivares predominantemente productores de morfina (GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA) o tebaína (GSK TEBAÍNA CVS1) (Figura 5). Las amplificaciones por PCR se realizaron en grupos de ADN genómico que comprendían ADN de cuatro individuos por cultivo. Este descubrimiento explica por qué el PSCYP1 solo se expresa en el cultivar GSK NOSCAPINA CVS1 y está ausente del transcriptoma de los otros tres cultivares.
Ejemplo 6
Ensamblaje de la secuencia de cDNA de PSCYP2 de longitud completa a partir de EST y confirmación mediante secuenciación de ADN genómico.
Se ensambló el marco de lectura abierto de longitud completa de PSCYP2 (Figura 1b) a partir de EST derivados de la plataforma de secuenciación 454 mediante el uso del programa de ensamblaje de secuencias CAP3. La secuencia de cDNA de longitud completa se confirmó mediante amplificación directa del cDNA de longitud completa a partir del ADN genómico de GSK NOSCAPINA CVS1.
Ejemplo 7
PSCYP2 se expresa exclusivamente en el cultivar de Papaver somniferum productor de noscapina GSK NOSCAPINA CVS1.
Figura 2b muestra la distribución normalizada de EST asociados con la secuencia de consenso PSCYP2 en cada una de las 16 bibliotecas EST preparadas a partir de dos órganos (cápsulas y tallos) en dos etapas de desarrollo (recolección temprana y tardía) a partir de cada uno de los cuatro cultivares de amapola, GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1. Los EST correspondientes a PSCYP2 se encontraron exclusivamente en bibliotecas derivadas del cultivar productor de noscapina GSK NOSCAPINA CVS1 (Figura 2b). La expresión de PSCYP2 fue más fuerte en el tejido del tallo poco después de la floración.
Ejemplo 8
Amplificación por PCR de PSCYP2 a partir del ADN genómico de los cuatro cultivares de Papaver somniferum GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1.
Las amplificaciones por PCR de fragmentos de PSCYP2 se realizaron en ADN genómico de los cuatro cultivares de amapola GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1 mediante el uso de las combinaciones de cebadores que se muestran en las Tablas 2 y 3. La Figura 6 muestra la amplificación por PCR de PsCYP2 a partir del ADN genómico de los cuatro cultivares de Papaver somniferum GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1;
La amplificación del ADN genómico produjo la secuencia del gen que se muestra en la Figura 3b.
Ejemplo 9
La proteína codificada por PSCYP2 supuesta muestra la mayor similitud de secuencia con un citocromo P450 de Coptis japonica y Thalictrum flavum.
Los homólogos más cercanos a la proteína codificada por el marco de lectura abierto de PSCYP2 (Figura 4b) son citocromos P450 anotados como estilopina sintasa de Argemone mexicana (número de acceso de GenBank ABR14721, identidades: 366/475 (78 %)) y de Papaver somniferum (número de acceso de GenBank ADB89214, identidades = 373/491 (76 %)). Las comparaciones de secuencias se llevaron a cabo mediante el uso del algoritmo 'blastp' de NCBI (método: ajuste de matriz composicional).
Ejemplo 10
PSCYP2 sólo está presente en el genoma del cultivar de P. somniferum productor de noscapina GSK NOSCAPINA CVS1.
La región transcrita recubierta por EST contenía la secuencia de codificación completa de PSCYP2 (que incluye las regiones no traducidas 5' y 3'), que se usó para el diseño de los cebadores (Tabla 1) para amplificar el gen PSCYP2 del ADN genómico en una serie de fragmentos de solapamiento para la secuenciación. Tras probar un subconjunto de combinaciones de cebadores (Tabla 3) en muestras de ADN genómico de los cuatro cultivares, se descubrió que los fragmentos de PSCYP2 solo pudieron amplificarse a partir del ADN genómico del cultivar productor de noscapina GSK NOSCAPINA CVS1, pero no del ADN genómico de los cultivares predominantemente productores de morfina (GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA) o tebaína (GSK TEBAÍNA CVS1) (Figura 6). Las amplificaciones por PCR se realizaron en grupos de ADN genómico que comprendían ADN de cuatro individuos por cultivo. Este descubrimiento explica por qué el PSCYP2 solo se expresa en el cultivar GSK NOSCAPINA CVS1 y está ausente del transcriptoma de los otros tres cultivares.
Ejemplo 11
Ensamblaje de la secuencia de cDNA de PSCYP3 de longitud completa a partir de EST y mediante secuenciación de cDNA y ADN genómico.
Dos posibles marcos de lectura abiertos de longitud completa de PSCYP3 (Figuras 1c y 1d) se ensamblaron parcialmente a partir de EST derivados de la plataforma de secuenciación 454 mediante el uso del programa de ensamblaje de secuencias CAP3. Los EST recubrieron el área 5' y 3' de la secuencia con un tramo de 200 bases faltantes. El tramo faltante de bases se obtuvo mediante amplificación directa y secuenciación a partir de cDNA de GSK NOSCAPINA CVS1. Las secuencias de longitud completa se confirmaron además mediante amplificación directa y secuenciación de PSCYP3 a partir del ADN genómico de GSK NOSCAPINA CVS1. Se identificaron dos posibles codones de inicio ATG. Dado que estaban en marco y adyacentes entre sí, las secuencias de marco de lectura abierto de longitud completa resultantes que se muestran en las Figuras 1c y 1d, respectivamente, difieren solo en un codón ATG en el extremo 5'.
Ejemplo 12
PSCYP3 se expresa exclusivamente en el cultivar de Papaver somniferum productor de noscapina GSK NOSCAPINA CVS1.
La Figura 2c muestra la distribución normalizada de EST asociados con la secuencia de consenso PSCYP3 en cada una de las 16 bibliotecas de EST preparadas a partir de dos órganos (cápsulas y tallos) en dos etapas de desarrollo (recolección temprana y tardía) a partir de cada uno de los cuatro cultivares de amapola, GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1. Los EST correspondientes a PSCYP3 se encontraron exclusivamente en bibliotecas derivadas del cultivar productor de noscapina GSK NOSCAPINA CVS1 (Figura 2c). La expresión de PSCYP3 fue más fuerte en el tejido del tallo poco después de la floración.
Ejemplo 13
Amplificación por PCR de PSCYP3 a partir del ADN genómico de los cuatro cultivares de Papaver somniferum GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1.
Las amplificaciones por PCR de fragmentos de PSCYP3 se realizaron en ADN genómico de los cuatro cultivares de amapola GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1 mediante el uso de las combinaciones de cebadores que se muestran en las Tablas 2 y 3. La Figura 7 muestra la amplificación por PCR de PSCYP3 a partir del ADN genómico de los cuatro cultivares de Papaver somniferum GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA CVS2, GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1;
La amplificación del ADN genómico produjo la secuencia del gen que se muestra en la Figura 3c.
Ejemplo 14
La proteína codificada por PSCYP3 supuesta muestra la mayor similitud de secuencia con la protopina 6-hidroxilasa de Eschscholzia californica.
El homólogo más cercano a las proteínas codificadas por los dos posibles marcos de lectura abiertos de PSCYP3 supuestas (Figuras 1c y 1d) es un citocromo P450 anotado como protopina 6-hidroxilasa de Eschscholzia californica (número de acceso de GenBank BAK20464, identidades: 228/522 (44 %)) y un citocromo P450 de Coptis japonica (número de acceso de GenBank BAF98472, identidades = 230/539 (43 %)). Las comparaciones de secuencias se llevaron a cabo mediante el uso del algoritmo 'blastp' de NCBI (método: ajuste de matriz composicional).
Ejemplo 15
PSCYP3 sólo está presente en el genoma del cultivar de P. somniferum productor de noscapina GSK NOSCAPINA CVS1.
La región transcrita recubierta por EST contenía la secuencia de codificación parcial de PSCYP3 (que incluye las regiones no traducidas 5' y 3'), que se usó para el diseño de cebadores (Tabla 1) para amplificar el gen PSCYP3 a partir del ADN genómico en una serie de fragmentos de solapamiento para la secuenciación. Tras probar un subconjunto de combinaciones de cebadores en muestras de ADN genómico de los cuatro cultivares, se descubrió que los fragmentos de PsCYP3 solo pudieron amplificarse a partir del ADN genómico del cultivar productor de noscapina GSK NOSCAPINA CVS1, pero no del ADN genómico de los cultivares predominantemente productores de morfina (GSK MORFINA CVS1, GSK MORFINA) o tebaína (GSK TEBAÍNA CVS1) (Figura 7). Las amplificaciones por PCR se realizaron en grupos de ADN genómico que comprendían ADN de cuatro individuos por cultivar mediante el uso de las combinaciones de cebadores que se muestran en la Tabla 3. Este descubrimiento explica por qué el PSCYP3 solo se expresa en el cultivar GSK NOSCAPINA CVS1 y está ausente del transcriptoma de los otros tres cultivares.
Ejemplo 16
Análisis de segregación de PSCYP1 y producción de noscapina en una población de mapeo F2 derivada de un cruce entre GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1.
El cultivar GSK NOSCAPINA CVS1, que produce noscapina, se cruzó por polinización con el cultivar GSK TEBAÍNA CVS1, que produce cantidades insignificantes de noscapina. Las plantas F1 resultantes se cultivaron hasta la madurez y se recogieron las semillas de F2. Doscientos setenta y cinco individuos F2 del cruce 10 de GSK NOSCAPINA CVS1 y GSK TEBAÍNA CVS1 se cultivaron hasta la madurez en el campo. Se recogió material foliar de cada individuo y se usó para la extracción y el análisis del ADN. Se recogieron cápsulas maduras de cada individuo para extracción y análisis de alcaloides.
Las Figuras 8a-c presentan los resultados del análisis de población de mapeo F2. Los genes PSCYP1, PSCYP2 y PSCYP3 están unidos y se segregan con la producción de noscapina en la población de mapeo F2. Los datos demuestran que en la población de mapeo están presentes niveles de GSK NOSCAPINA CVS1 en 61 de 275 plantas F2 individuales. Se detectaron los genes PSCYP1, PSCYP2 y PSCYP3 en todas las plantas que contienen noscapina, lo que confirma que los genes PSCYP1, PSCYP2 y PSCYP3 y la producción de noscapina están relacionados. Además, todas las plantas en las que no se detectaron los genes PSCYP1, PSCYP2 y PSCYP3 carecían de noscapina (El ensayo de genotipado para PSCYP3 falló en 16 muestras como lo indica la falla del control positivo interno incluido en el ensayo; ya que estas muestras se excluyeron del análisis de segregación de PSCYP3 con el rasgo de noscapina). Estos datos son de gran relevancia estadística y confirman que los genes PSCYP1, PSCYP2 y PSCYP3 son necesarios para la producción de niveles de noscapina de GSK NOSCAPINA CVS1.
Ejemplo 17
La tetrahidrocolumbamina supuesta se acumula en plantas silenciadas para PSCYP2
El silenciamiento del gen inducido por el virus condujo a la acumulación de tetrahidrocolumbamina supuesta tanto en el látex como en las cápsulas maduras de plantas silenciadas para PSCYP2 pero no de plantas silenciadas para PSCYP3, plantas de control silenciadas para PDS o plantas no infectadas de GSK NOSCAPINA CVS1 (Figura 14). Los datos sugieren que PSCYP2 codifica una enzima que forma un puente metilendioxi que convierte la tetrahidrocolumbamina en canadina, lo que conduce a la formación del puente metilendioxi presente en C-3a'/C-9a' de la porción de isoquinolina de la noscapina.
Ejemplo 18
Las secoberbinas supuestas se acumulan en plantas silenciadas para PSCYP3
El silenciamiento génico inducido por virus condujo a la acumulación de alcaloides de secoberbina supuestos tanto en el látex como en cápsulas maduras de plantas silenciadas para PSCYP3, pero no de plantas silenciadas para PSCYP2, plantas de control silenciadas para p Ds o plantas no infectadas de GSK NOSCAPINA CVS1 (Figuras 15 y 16). La masa, la fórmula molecular asignada (C21H23NO6) y el patrón de fragmentación de la secoberbina supuesta que se muestra acumulada en la Figura 15 es consistente con demetoxihidroximacrantaldehído o demetoximacrantoridina. Ambas secoberbinas carecen de un grupo metoxi en el carbono de la porción de isoquinolina que es equivalente al C-4' de la noscapina. La masa, la fórmula molecular asignada (C21H25NO6) y el patrón de fragmentación del segundo compuesto que se acumula en plantas silenciadas para PSCYP3 (Figura 16) es consistente con dos secoberbinas, demetoxinarcotinediol y narcotolinol, respectivamente. El primer compuesto carece del grupo metoxi en el carbono equivalente al C-4' de la noscapina. Juntos, los datos sugieren que la proteína codificada por PSCYP3 hidroxila la porción de isoquinolina de las secoberbinas en una posición equivalente a C-4' de la noscapina, lo que permite la formación del grupo metoxi presente en la noscapina en esta posición mediante la subsecuente O-metilación. Los derivados metoxilados respectivos (metoxilados en el carbono equivalente a C-4' de la noscapina) de las secoberbinas supuestas que se acumulan en plantas silenciadas para PSCYP3 se han encontrado en varias especies de Papaver que producen noscapina (Sariyar y Phillipson (1977) Phytochem. 16: 2009-2013; Sariyar y Shamma (1986) Phytochem. 25: 2403-2406, Sariyar (2002) Pure Appl. Chem. 74: 557-574). Se han implicado, por motivos estructurales, en la conversión biosintética de protoberberinas en ftalideisoquinolinas como la noscapina (Sariyar y Shamma (1986) Phytochem. 25: 2403-2406, Sariyar y Phillipson (1977) Phytochem. 16: 2009-2013).

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido del citocromo P450 en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
i) una secuencia de nucleótidos como la representada por la secuencia en la Figura 1a o 3a;
ii) una secuencia de nucleótidos en donde dicha secuencia está degenerada como resultado del código genético con respecto a la secuencia de nucleótidos definida en (i);
iii) una molécula de ácido nucleico cuya hebra complementaria se hibrida a secuencias de nucleótidos con al menos 90 % de identidad en condiciones de hibridación muy estrictas a la secuencia en la Figura 1a o 3a, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido del citocromo P450;
iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la representada en la Figura 4a;
v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en donde dicha secuencia de aminoácidos se modifica mediante la adición, eliminación o sustitución de al menos un residuo de aminoácido como la representada en iv) anterior y tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de longitud completa representada en la Figura 4a que conserva la actividad del citocromo P450.
2. Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste en:
i) un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como la representada en la Figura 4a; o
ii) un polipéptido modificado en donde las variantes de polipéptidos tienen al menos 85 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa representada en la Figura 4a y que conserva la actividad del citocromo P450.
3. Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 2 en donde dicho polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en un 85% a la secuencia de aminoácidos de longitud completa en la Figura 4a y que conserva la actividad del citocromo P450.
4. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido del citocromo P450 de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha molécula de ácido nucleico está unida operativamente a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia promotora.
5. Una célula transgénica transformada o transfectada con una molécula de ácido nucleico o vector de acuerdo con la reivindicación 1 o 4.
6. Una célula transgénica de acuerdo con la reivindicación 4 en donde dicha célula es una célula vegetal en donde dicha célula vegetal es opcionalmente de la familia Papaveraceae.
7. Una planta que comprende una célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 5, opcionalmente dicha planta es de la familia Papaveraceae.
8. Una célula transgénica de acuerdo con la reivindicación 5 en donde dicha célula es una célula microbiana.
9. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende un casete de transcripción seleccionado del grupo que consiste en
i) un casete que se adapta de manera que ambas moléculas de ácido ribonucleico sentido y antisentido se transcriben a partir de dicho casete en donde dichas moléculas de ácido nucleico sentido y antisentido se adaptan para hibridarse en al menos una parte o la totalidad de su longitud para formar un siARN o shARN,
ii) un casete como se define en (i) anterior que se proporciona con al menos dos promotores adaptados para transcribir hebras sentido y antisentido de dicha molécula de ácido ribonucleico,
iii) un casete como se define en (i) anterior que comprende una molécula de ácido nucleico en donde dicha molécula comprende una primera parte unida a una segunda parte en donde dichas partes primera y segunda son complementarias en al menos parte de su secuencia y además en donde la transcripción de dicha molécula de ácido nucleico produce una molécula de ácido ribonucleico que forma una región de doble hebra mediante el apareamiento de bases complementarias de dichas partes primera y segunda lo que forma de esta manera un shARN.
v) un casete de acuerdo con cualquiera de i) a iii) que comprende una molécula de ácido nucleico que forma parte de un vector adaptado para la expresión en una célula vegetal.
10. Un proceso para la modificación de un alcaloide opiáceo que comprende:
i) proporcionar una célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha célula vegetal es de la familia Papaveraceae;
ii) cultivar dicha célula vegetal para producir una planta transgénica; y opcionalmente
i) recolectar dicha planta transgénica, o parte de esta, en donde opcionalmente dicho material vegetal recolectado es paja seca y se extrae dicho alcaloide opiáceo.
11. Un proceso para la modificación de un alcaloide opiáceo que comprende:
i) proporcionar una célula microbiana transgénica de acuerdo con la reivindicación 8 que expresa citocromo P450 de acuerdo con la invención en cultivo con al menos un alcaloide opiáceo;
ii) cultivar la célula microbiana en condiciones que modifican uno o más alcaloides opiáceos; y opcionalmente
iii) aislar dicho alcaloide modificado de la célula microbiana o cultivo celular.
12. El uso de un gen codificado por una molécula de ácido nucleico como la representada por la secuencia de ácido nucleico en la Figura 3a o una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones de hibridación estrictas a la secuencia de nucleótidos en la Figura 3a y codifica un polipéptido con actividad del citocromo P450 como un medio para identificar la presencia o ausencia de un gen que codifica dicho citocromo P450 o como un medio para identificar un locus en donde dicho locus se asocia con la alteración de la expresión o actividad de dicho citocromo P450 en una planta de Papaveraceae.
13. Un método para determinar la presencia o ausencia de un gen del citocromo P450 en una variedad de Papaveraceae que comprende:
i) obtener una muestra de una planta de Papaveraceae;
ii) extraer el ADN genómico de la planta; y
iii) analizar el ADN genómico para determinar la presencia de un gen que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos como la representada en la Figura 3a.
14. Una planta de Papaveraceae en donde dicha planta está mutagenizada en un gen que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen mutagenizado codifica un polipéptido del citocromo P450 que tiene una alteración de la expresión y/o actividad del citocromo P450.
15. Un método para el análisis de una planta que comprende:
i) obtener una muestra a partir de la planta de acuerdo con la reivindicación 13 y analizar la secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:
a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como la representada en la Figura 3a;
b) una molécula de ácido nucleico que se hibrida a la molécula de ácido nucleico en a) en condiciones de hibridación estrictas y que codifica un polipéptido con actividad polipeptídica del citocromo P450; y opcionalmente
ii) comparar la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico en dicha muestra con una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de la planta de tipo salvaje original, opcionalmente dicho método comprende además las etapas de:
i) extraer el ácido nucleico de dichas plantas mutadas;
ii) amplificación de una parte de dicha molécula de ácido nucleico mediante una reacción en cadena de la polimerasa;
iii) formar una preparación que comprenda el ácido nucleico amplificado y el ácido nucleico extraído de la semilla de tipo salvaje para formar un ácido nucleico heterodúplex;
iv) incubar dicha preparación con una nucleasa de una hebra que corta en una región del ácido nucleico heterodúplex para identificar el error de apareamiento en dicho heterodúplex; y
v) determinar el sitio del error de apareamiento en dicho heterodúplex de ácido nucleico.
16. Una planta en donde dicha planta comprende un vector viral que incluye todo o parte de un gen que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
17. Un vector viral que comprende toda o parte de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
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