ES2905227T3 - Composición para aliviar o tratar el dolor - Google Patents

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Yejin Kwon
Minjung Kim
Minju Kim
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Jongho Cho
Soondong Lee
Joonsung Kim
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Abstract

Una composición farmacéutica para el uso en el alivio o tratamiento del dolor que comprende dos o más que se seleccionan del grupo que consiste en un gen que codifica la glutamato descarboxilasa (GAD), un gen que codifica la interleucina 10 (IL-10) y un gen que codifica un factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF).

Description

DESCRIPCIÓN
Composición para aliviar o tratar el dolor
Campo técnico
La presente invención se refiere a una composición para aliviar o tratar el dolor y a un método para aliviar o tratar el dolor mediante el uso de la misma.
Antecedentes de la técnica
Dolor significa una experiencia de daño tisular real o potencial o sensaciones y sentimientos desagradables que se asocian con tal daño. El dolor protege las partes del cuerpo que han sido dañadas durante la curación de los tejidos dañados de la situación dañada y proporciona motivación para evitar experiencias similares en el futuro. La mayor parte del dolor se alivia lentamente cuando se elimina el estímulo causal, pero a veces el dolor persiste aunque los tejidos se hayan curado ya que el estímulo ha desaparecido y el daño se ha curado claramente, o el dolor se produce en un estado sin ninguna irritación, daño o enfermedad.
Para el tratamiento del dolor, principalmente, los analgésicos narcóticos como la morfina, que es un alcaloide opiáceo, o los analgésicos no narcóticos como los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) que tienen el ingrediente ácido acetilsalicílico, el ibuprofeno o el paracetamol se usan ampliamente.
Los analgésicos narcóticos tienen la ventaja de mostrar la dosis-respuesta y una alta eficacia, pero pueden provocar efectos secundarios en el sistema nervioso y, si se usan durante un período prolongado, pueden provocar resistencia y dependencia física, y el dolor puede empeorar.
Si la aspirina, un analgésico no narcótico que tiene ácido acetilsalicílico como ingrediente principal, se usa con fines analgésicos, debe administrarse en una dosis alta de al menos 500 mg. Sin embargo, la aspirina es un analgésico antiinflamatorio no esteroideo que bloquea la enzima (COX-1) que promueve la producción de prostaglandinas, que protegen el estómago, que evita de esta manera la formación de la mucosa gástrica. Por lo tanto, el estómago puede dañarse fácilmente por el ácido gástrico y puede producirse una hemorragia gastrointestinal. Además, el ibuprofeno también es un analgésico antiinflamatorio no esteroideo, que puede causar trastornos gástricos. También, en el caso de los analgésicos que tienen paracetamol como ingrediente principal, como el Tylenol, el paracetamol se metaboliza principalmente en el hígado y puede inducirse daño hepático.
Incluso si los analgésicos anteriores son efectivos en una etapa temprana, a menudo se vuelven ineficaces debido a la resistencia cuando se usan durante un período prolongado. Específicamente, en el caso del dolor neuropático, existe el problema de que el dolor no responde a la dosis máxima de un agente antiinflamatorio no esteroideo y, por lo tanto, se administra a una dosis alta durante un período corto.
Recientemente, se han desarrollado nuevos agentes terapéuticos para el dolor neuropático, pero todavía tienen efectos secundarios. Por ejemplo, los bloqueadores de los canales de sodio se encuentran principalmente en forma de moléculas pequeñas y muestran baja selectividad por las isoformas de proteínas. Además, muestran efectos secundarios como toxicidad cardíaca y trastornos del movimiento.
Por lo tanto, existe una necesidad imperiosa de desarrollar un nuevo analgésico para el dolor neuropático excelente en eficacia analgésica mientras reduce los efectos secundarios.
Descripción de la invención
Problema técnico
En consecuencia, los presentes inventores se han esforzado para desarrollar un nuevo analgésico para el dolor neuropático que exhibe una excelente eficacia analgésica incluso a una dosis baja. Como resultado, los presentes inventores han encontrado que cuando se usa una combinación de dos o más de glutamato descarboxilasa, una citocina antiinflamatoria y un factor neurotrófico derivado de la glía, el dolor puede aliviarse o tratarse significativamente en comparación con un uso individual, y han completado la presente invención.
Solución al problema
La presente invención proporciona una composición farmacéutica para aliviar o tratar el dolor que comprende dos o más que se seleccionan del grupo que consiste en un gen que codifica el glutamato descarboxilasa (GAD), un gen que codifica la interleucina 10 (IL-10) y un gen que codifica un factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF).
Efectos ventajosos de la invención
Una composición farmacéutica de la presente invención comprende dos o más que se seleccionan del grupo que consiste en genes que codifican GAD, IL-10 y GDNF. Por lo tanto, la composición farmacéutica de la presente invención exhibe una excelente eficacia analgésica a una dosis más baja a la de la administración individual, ya que los genes se coadministran y, por lo tanto, pueden reducirse los efectos secundarios y la toxicidad convencionales. Por lo tanto, la composición farmacéutica de la presente invención puede ser útil para aliviar o tratar el dolor.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el diagrama esquemático de los plásmidos pAAV-GAD65 y pAAV-GAD65-modi que se usaron para la construcción del virus adenoasociado recombinante:
(a) muestra el diagrama esquemático de pAAV-GAD65 y (b) muestra el diagrama esquemático de pAAV-GAD65-modi. La Figura 2 muestra el diagrama esquemático del plásmido pAAV-IL-10 que se usó para la construcción del virus adenoasociado recombinante.
La Figura 3 muestra el diagrama esquemático del plásmido pAAV-GDNF que se usó para la construcción del virus adenoasociado recombinante.
La Figura 4 es un diagrama esquemático que muestra el plásmido pAAV-GDNF-IL-10.
La Figura 5 muestra la expresión de cada gen que se introduce mediante el plásmido pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 o pAAV-GDNF:
(a) muestra la expresión de GAD65 mediante el plásmido pAAV-GAD65; (b) muestra la expresión de la IL-10 mediante el plásmido pAAV-IL-10; y (c) muestra la expresión del GDNF mediante el plásmido pAAV-GDNF.
La Figura 6 muestra la expresión del gen GDNF y el gen IL-10 mediante el plásmido pAAV-GDNF-IL-10:
(a) muestra la expresión de la IL-10 mediante el plásmido pAAV-GDNF-IL-10; (b) muestra la expresión del GDNF mediante el plásmido pAAV-GDNF-IL-10.
La Figura 7 muestra los resultados de transferencia Western que muestra la expresión de cada proteína después del tratamiento de las células 293T o HeLa con cada virus adenoasociado recombinante después de la construcción de los virus adenoasociados recombinantes en los que se introdujeron el gen GAD65, el gen IL-10 y el gen GDNF, respectivamente:
(a) muestra la expresión de GAD65 después del tratamiento de las células 293T o HeLa con el virus recombinante adenoasociado AAV-GAD65; (b) muestra la expresión de GAD65 después del tratamiento de las células 293T o HeLa con el virus recombinante adenoasociado AAV-GAD65-modi; (c) muestra la expresión de IL-10 después del tratamiento de las células 293T o HeLa con el virus adenoasociado recombinante AAV-IL-10; y (d) muestra la expresión de GDNF después del tratamiento de las células 293T o HeLa con el virus recombinante adenoasociado AAV-GDNF.
La Figura 8 muestra los niveles de expresión de GABA que se miden mediante ELISA después del tratamiento de las células 293T o HeLa con el virus adenoasociado recombinante AAV-GAD65 o AAV-GAD65-modi:
(a) es un gráfico que muestra el nivel de expresión de GABA después de tratar las células 293T o HeLa con el virus recombinante adenoasociado AAV-GAD65; y (b) es un gráfico que muestra el nivel de expresión de GABA después de tratar las células 293T o HeLa con el virus recombinante adenoasociado AAV-GAD65-modi.
La Figura 9 es un gráfico que muestra los resultados de comparar las eficacias para aliviar el dolor entre la administración individual de los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 o AAV-GDNF y la coadministración de los virus AAV-GAD65 y AAV-GDNF, o los virus AAV-IL-10 y AAV-GDNF.
La Figura 10 es un gráfico que muestra los resultados de comparar las eficacias para aliviar el dolor entre la administración individual de los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 o AAV-GDNF y la coadministración de los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 y AAV-GDNF.
La Figura 11 es un gráfico que muestra los resultados de comparar las eficacias para aliviar el dolor entre la coadministración de los virus AAV-GAD65 y AAV-GDNF, o los virus AAV-IL-10 y AAV-GDNF y la coadministración de todos los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 y AAV-GDNF.
La Figura 12 es un gráfico que muestra los resultados de comparar las eficacias para aliviar el dolor entre la administración individual de los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 o pAAV-GDNF y la coadministración de los plásmidos pAAV-GAD65 y pAAV-GDNF, o los plásmidos pAAV-IL-10 y pAAV-GDNF.
La Figura 13 es un gráfico que muestra los resultados de comparar las eficacias para aliviar el dolor entre la administración individual de los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, o pAAV-GDNF y la coadministración de todos los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 y pAAV-GDNF.
La Figura 14 es un gráfico que muestra los resultados de comparar las eficacias para aliviar el dolor entre la coadministración de los plásmidos pAAV-GAD65 y pAAV-GDNF, o los plásmidos pAAV-IL-10 y pAAV-GDNF y la coadministración de todos los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 y pAAV-GDNF.
La Figura 15 es un gráfico que muestra los resultados de comparar las eficacias para aliviar el dolor entre la coadministración de los virus AAV-GAD65-modi y AAV-GDNF-IL-10 y la coadministración de todos los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 y AAV-GDNF.
Mejor modo para llevar a cabo la invención
En lo adelante, la presente invención se describirá en detalle.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica para aliviar o tratar el dolor que comprende dos o más que se seleccionan del grupo que consiste en un gen que codifica el glutamato descarboxilasa (GAD), un gen que codifica la interleucina 10 (IL-10) y un gen que codifica un factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF).
En una modalidad, la combinación de dos o más puede ser GAD e IL-10, GAD y GDNF, IL-10 y GDNF o GAD, IL-10 y GDNF.
Dos o más genes que se seleccionan del grupo que consiste en un gen que codifica GAD, un gen que codifica IL-10 y un gen que codifica GDNF pueden estar una forma de contenerse en un portador. En la presente descripción, el portador puede ser un vector viral o un vector no viral como un plásmido, un liposoma, etc. Además, los genes pueden estar en una forma en la que algunos de los genes se contienen en un vector viral y los genes restantes se contienen en un vector no viral.
En una modalidad, los genes pueden estar en una forma en la que la GAD se contiene en un vector viral y la IL-10 se contiene en un vector no viral. Además, los genes pueden estar en una forma en la que la GAD se contiene en un vector viral y el GDNF se contiene en un vector no viral. Adicionalmente, los genes pueden estar en una forma en la que la IL-10 se contiene en un vector viral y el GDNF se contiene en un vector no viral. Además, los genes pueden estar en una forma en la que la GAD se contiene en un vector viral y la IL-10 y el GDNF se contienen en un vector no viral. Además, los genes pueden estar en una forma en la que la GAD y la IL-10 se contienen en un vector viral y el GDNF se contiene en un vector no viral. Además, los genes pueden estar en una forma en la que la GAD y el GDNF se contienen en un vector viral y la IL-10 se contiene en un vector no viral. Además, los genes pueden estar en una forma en la que la IL-10 se contiene en un vector viral y la GAD y el GDNF se contienen en un vector no viral. Además, los genes pueden estar en una forma en la que la IL-10 y el GDNf se contienen en un vectorviral y la GAD se contiene en un vector no viral. También, los genes pueden estar en una forma en la que el GDNF se contiene en un vectorviral, y la GAD y la IL-10 se contienen en un vector no viral.
Además, el gen puede estar en una forma contenida operativamente en un vector. Específicamente, el gen puede estar en una forma contenida operativamente en un vector viral o en un vector no viral.
El vectorviral puede ser al menos uno que se selecciona del grupo que consiste en adenovirus, virus adenoasociados (AAV), virus del herpes simple, lentivirus, retrovirus, citomegalovirus, baculovirus, poxvirus, etc. Específicamente, el vectorviral puede ser un virus adenoasociado.
En una modalidad, el gen que codifica la GAD puede contenerse operativamente en un portador 1 (por ejemplo, un primer vector), y el gen que codifica la IL-10 puede contenerse operativamente en un portador 2 (por ejemplo, un segundo vector), y el gen que codifica el GDNF puede contenerse operativamente en un portador 3 (por ejemplo, un tercer vector). Además, un portador puede contener dos o más genes.
El vector no viral puede ser al menos uno que se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, un liposoma, un polímero catiónico, una micela, una emulsión y nanopartículas lipídicas sólidas.
El término "plásmido", como se usa en la presente descripción, se refiere a un fragmento de ADN circular que existe por separado fuera del cromosoma de las bacterias. Los plásmidos no tienen genes esenciales para la supervivencia de las bacterias, pero contienen genes esenciales para la resistencia a ciertos antibióticos y para el intercambio de genes entre bacterias. Además, los plásmidos pueden crecer independientemente de los cromosomas y contener marcadores seleccionables.
El término "liposoma", como se usa en la presente descripción, se refiere a una pequeña vesícula que se produce mediante la formación de una bicapa debido a la porción hidrófila y la porción hidrófoba cuando una molécula que tiene ambas, una porción hidrófoba y una porción hidrófila en una molécula, como un fosfolípido, se suspende en una solución acuosa. El liposoma se aísla de la membrana externa por una membrana compuesta por una bicapa lipídica, y los liposomas que contienen ADN, ARNm, etc., pueden usarse como mediadores de la información genética.
El término "polímero catiónico", como se usa en la presente descripción, se refiere a un lípido catiónico o a un compuesto polimérico que es una sustancia que forma un complejo mediante un enlace iónico con el ADN aniónico y suministra el ADN a una célula.
El término "micela", como se usa en la presente descripción, se refiere a un agregado coloidal termodinámicamente estable que se forma a partir de moléculas que consisten en un grupo polar y un grupo hidrófobo no polar, como los tensioactivos y las moléculas de lípidos, a través de la asociación mediante una fuerza de van der Waals o similar en una solución. Además, las micelas que contienen ADN, ARNm y similares pueden usarse como mediadores de información genética.
El término "emulsión", como se usa en la presente descripción, significa que, cuando se mezclan dos soluciones de diferentes fases, un líquido forma partículas finas y se dispersa en otro líquido. El ADN, el ARNm y similares pueden contenerse en el centro de la partícula de emulsión para usarse como mediadores de la información genética.
Como se usa en la presente descripción, el término "nanopartícula lipídica sólida" se refiere a una preparación de una forma en la que un fármaco se contiene en una micropartícula de tamaño nanométrico que se compone de un lípido sólido en lugar de un lípido líquido.
Un portador 1 (por ejemplo, un primer vector) que comprende cualquier gen que se selecciona del grupo que consiste en GAD, IL-10 y GDNF, y un portador 2 (por ejemplo, un segundo vector) que comprende cualquier gen que se selecciona del grupo de genes restantes que no se incluyen en el portador 1 de acuerdo con la presente invención puede tener una relación de mezcla basada en el título del virus por unidad de volumen de 1: 1 a 100 o de 1 a 100: 1. Específicamente, la relación de mezcla basada en el título del virus por unidad de volumen del portador 1 y del portador 2 puede ser de 1: 1 a 10 o de 1 a 10: 1.
Un portador 1 (por ejemplo, un primer vector) que comprende un gen que codifica el GAD, un portador 2 (por ejemplo, un segundo vector) que comprende un gen que codifica la IL-10 y un portador 3 (por ejemplo, un tercer vector) que comprende un gen que codifica el GDNF de acuerdo con la presente invención puede tener una relación de mezcla basada en el título del virus por unidad de volumen de 1: 0,1 a 10: 0,1 a 10.
Como se usa en la presente descripción, el término "operativamente" significa que un gen que se introduce se une a una secuencia reguladora de tal manera que la expresión puede tener lugar en una célula huésped. La secuencia reguladora es una secuencia de ADN que regula la expresión del gen, y puede incluir otros elementos reguladores como promotores y potenciadores o poliadenilación. Además, la secuencia reguladora proporciona un sitio para la unión de un factor de transcripción que controla la expresión del gen que se introduce, y puede influir en la estructura del complejo con el factor de transcripción para determinar la función del factor de transcripción.
El término "GAD", como se usa en la presente descripción, se refiere a una enzima que descarboxila el glutamato para producir GABA (ácido gamma-aminobutírico). La GAD puede ser GAD65 o GAD67. Específicamente, la GAD65 puede derivarse de un ser humano, una rata, un perro, un gato o un caballo, pero no se limita a ellos. El gen que codifica la GAD puede ser la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 1, 4, 32, 34 o 36.
Además, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 1 puede ser la secuencia de ADN que se representa mediante la SEQ ID NO: 2 o 3, y puede ser la secuencia de ARNm que se muestra en la Secuencia de Referencia de NCBI: NM_000818.2. Además, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 4 puede ser la secuencia de nucleótidos que se optimizó por codones para ser adecuada para la secuencia de ADN que se representa mediante la SEQ ID NO: 5 o el gen que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 4, que puede ser la secuencia de ARNm que se muestra en la Secuencia de Referencia de NCBI: NM_000817.2. Además, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 32 puede ser la secuencia de a Dn que se representa mediante la SEQ ID NO: 33. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 34 puede ser la secuencia de ADN que se representa mediante la SEQ ID NO: 35, y la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 36 puede ser la secuencia de ADN que se representa mediante la s Eq ID NO: 37.
Además, el gen que codifica la GAD puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de GAD que puede retener la actividad de GAD y producir GABA. La variante de GAD incluye todas las secuencias que retienen las características de la GAD de producir GABA. Aunque no se limita a ninguna secuencia, la secuencia de nucleótidos que codifica la variante de GAD puede ser, preferentemente, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de secuencia de al menos el 60 % o más, el 70 % o más, el 80 % o más, o el 90 % o más, y a la secuencia de aminoácidos de GAD que se describió anteriormente, y con la máxima preferencia, puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de secuencia del 95 % o más.
Además, la secuencia de nucleótidos que codifica la variante de GAD puede ser una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de secuencia de al menos el 60 % o más, el 70 % o más, el 80 % o más, o el 90 % o más con la secuencia de nucleótidos de GAD que se describió anteriormente y con la máxima preferencia, puede ser una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de secuencia del 95 % o más.
E l"% de homología de secuencia" se determina al comparar las regiones de comparación en un estado en el que dos secuencias se alinean óptimamente. Además, algunas de las secuencias de nucleótidos en las regiones de comparación pueden incluir adiciones o deleciones (es decir, espacios) con relación a la secuencia de referencia (sin adición ni deleción) para la alineación óptima de las dos secuencias.
El término "IL-10", como se usa en la presente descripción, se refiere a una citocina antiinflamatoria que pertenece a la citocina de tipo II (Renauld, Nat Rev Immunol, 2003). La IL-10 está en una forma de un homodímero que consiste de dos subunidades, cada una que tiene la longitud de 178 aminoácidos. También se conoce como el factor inhibidor de la síntesis de citocinas (CSIF) en humanos. La IL-10 cumple la función de inhibir la actividad de las células NK (asesinas naturales) en la respuesta inmunitaria y forma un complejo con un receptor de IL-10 para participar en la transducción de señales. La IL-10 puede ser una proteína que se deriva de un ser humano, una rata, un perro, un gato o un caballo, pero no se limita a ellos. El gen que codifica la IL-10 puede ser la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 6, 9, 38, 40 o 42.
Específicamente, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 6 puede ser la secuencia de a Dn que se representa mediante la SEQ ID NO: 7 u 8, y puede ser la secuencia de ARNm que se muestra en la Secuencia de Referencia de NCBI: NM_012854.2. Además, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 9 puede ser la secuencia de a Dn que se representa mediante la SEQ ID NO: 10 o 14, y puede ser la secuencia de ARNm que se muestra en la Secuencia de Referencia de NCBI: NM_000572.2. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 38 puede ser la secuencia de ADN que se representa mediante la SEQ ID NO: 39. Además, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 40 puede ser la secuencia de ADN que se representa mediante la SEQ ID NO: 41, y la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 42 puede ser la secuencia de ADN que se representa mediante la SEQ ID NO: 43.
Además, el gen que codifica la IL-10 puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de IL-10 que retiene la actividad de la IL-10. La secuencia de nucleótidos que codifica la variante de IL-10 puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de secuencia de al menos el 60 % o más, el 70 % o más, el 80 % o más, el 90 % o más con la secuencia de aminoácidos de la IL-10 que se mostró anteriormente, y con la máxima preferencia, puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de secuencia del 95 % o más.
La secuencia de nucleótidos que codifica la variante de IL-10 puede ser una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de secuencia de al menos el 60 % o más, el 70 % o más, el 80 % o más, el 90 % o más con la secuencia de nucleótidos de IL-10 que se mostró anteriormente y con la máxima preferencia, puede ser una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de secuencia del 95 % o más.
El término "GDNF", como se usa en la presente descripción, se refiere a una proteína que constituye la familia de ligandos GDNF. La familia de ligandos GDNF consiste de GDNF, neurturina (NRTN), artemina (ARTn ) y persefina (PSPN). Además, el GDNF es una proteína que promueve la supervivencia de muchos tipos de neuronas y transmite señales a través del receptor GFRa1. El GDNF puede ser una proteína que se deriva de un ser humano, una rata, un perro, un gato o un caballo, pero no se limita a ellos. El gen que codifica el GDNF puede ser la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 11, 44, 46 o 48.
Específicamente, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 11 puede ser la secuencia de a Dn que se representa mediante la SEQ ID NO: 12 o 13, y puede ser la secuencia de ARNm que se muestra en la Secuencia de Referencia de NCBI: NM_199231.2. Además, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 44 puede ser la secuencia de ADN que se representa mediante la SEQ ID NO: 45. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 46 puede ser la secuencia de ADN que se representa mediante la SEQ ID NO: 47, y la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 48 puede ser la secuencia de ADN que se representa mediante la SEQ ID NO: 49.
Además, el gen que codifica el GDNF puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del GDNF que retiene la actividad del GDNF. La secuencia de nucleótidos que codifica la variante de GDNF puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de secuencia de al menos el 60 % o más, el 70 % o más, el 80 % o más, o el 90 % o más con la secuencia de aminoácidos de GDNF que se mostró anteriormente, y con la máxima preferencia, puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de secuencia del 95 % o más.
Además, la secuencia de nucleótidos que codifica la variante de GDNF puede ser una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de secuencia de al menos el 60 % o más, el 70 % o más, el 80 % o más, el 90 % o más con la secuencia de nucleótidos de GDNF que se mostró anteriormente, y con la máxima preferencia, puede ser una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de secuencia del 95 % o más.
El GABA, producto del gen GAD, tiene el efecto de bloquear la transducción de la señal del dolor, pero cantidades excesivas pueden causar síntomas como picazón, mareos, somnolencia, etc., así como también efectos secundarios como aumento de la frecuencia cardíaca o de la frecuencia respiratoria (Longo, Am Fam Physician, 2000).
Se sabe que la IL-10 es una citocina que muestra acciones antiinflamatorias, pero pueden producirse efectos secundarios como síntomas de gripe y similares (Friedrich, J Invest Dermatol, 2002).
Adicionalmente, se sabe que la expresión de GDNF exhibe eficacias analgésicas en una variedad de dolores como el dolor neuropático y similares, pero se ha informado en experimentos con monos que la administración en exceso causó daño neuronal del cerebro (Hovland, Toxicol Pathol, 2007).
Una composición farmacéutica de la presente invención puede exhibir acciones analgésicas con una pequeña cantidad de genes o portadores que contienen la misma. La composición de la presente invención consiste en un vector que contiene un gen que codifica la GAD, un vector que contiene un gen que codifica una citocina antiinflamatoria en tejidos nerviosos y/o un vector que contiene un gen que codifica el GDNF. Y mediante la coadministración de sustancias que tienen diferentes mecanismos analgésicos, es posible lograr los mismos o mejores efectos de alivio o tratamiento del dolor a una dosis más baja a la de la administración individual.
Particularmente, de acuerdo con la presente invención, cuando se coadministran dos o más genes que se seleccionan del grupo que consiste en genes que codifican GAD65, IL-10 y GDNF, tiene lugar un efecto sinérgico de alivio del dolor. Por lo tanto, la composición farmacéutica de la presente invención puede ser útil para aliviar o tratar el dolor.
De acuerdo con una modalidad de la presente invención, el primer vector, el segundo vector y/o el tercer vector pueden ser un virus adenoasociado. El virus adenoasociado no se limita a un serotipo particular, y preferentemente puede ser cualquiera de AAV1 aAAV9.
El dolor puede seleccionarse del grupo que consiste en dolor nociceptivo, dolor psicógeno, dolor inflamatorio, dolor patológico, dolor neuropático, dolor del cáncer, dolor posoperatorio, dolor de la neuralgia del trigémino, dolor idiopático, dolor de la neuropatía diabética o migraña. En un ejemplo específico, el dolor puede ser una radiculopatía lumbosacra (LSR).
El dolor inflamatorio se refiere al dolor que se asocia con un daño tisular y la infiltración de células inmunitarias. Además, el dolor patológico significa un estado de enfermedad en el que el dolor se causa mediante el daño a un tejido nervioso o su función anormal. También, el dolor patológico puede ser un dolor disfuncional, como la fibromialgia, el síndrome del intestino irritable o la cefalea tensional.
Además, el dolor puede incluir dolor de espalda que puede distinguirse anatómicamente: dolor de cuello, dolor de espalda media, dolor de espalda baja o dolor de coxis. Además, el dolor puede ser al menos uno que se selecciona del grupo que consiste en dolor neuropático, dolor del cáncer, dolor posoperatorio, dolor de la neuralgia del trigémino, dolor idiopático, dolor de la neuropatía diabética, migraña y similares. En un ejemplo específico, el dolor puede ser una radiculopatía lumbosacra.
El dolor neuropático puede causarse mediante un daño o enfermedad que afecta el sistema somatosensorial. El dolor neuropático puede ser una sensación anormal que se llama alodinia y disestesia. Además, las características generales del dolor neuropático incluyen la sensación de calor o frío, hormigueo, entumecimiento y picazón. Por el contrario, el dolor nociceptivo a menudo se expresa como un dolor.
Además, la migraña se asocia con una serie de síntomas del sistema nervioso autónomo y es un trastorno crónico que causa cefaleas de severidad normal a grave. Se sabe que la migraña se asocia con un aumento de la excitabilidad de la corteza cerebral y con una regulación anormal de las neuronas del dolor en el núcleo del trigémino del tronco encefálico (Noseda, Pain, 2013).
Específicamente, una composición farmacéutica de la presente invención puede usarse para aliviar o tratar el dolor neuropático y el dolor crónico del cáncer.
Como se usa en la presente descripción, el término "aliviar o tratar" significa cualquier acción que mejora o altera los síntomas del dolor de una manera beneficiosa mediante la administración de la composición de la presente invención.
La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un portador fisiológicamente aceptable. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender adicionalmente excipientes y diluyentes adecuados que se usan convencionalmente en la preparación de composiciones farmacéuticas. Además, las composiciones de la presente invención pueden usarse mediante su preparación como formulaciones orales como polvos, gránulos, tabletas, cápsulas, suspensiones, emulsiones, jarabes, aerosoles, etc., formulaciones externas, supositorios o inyecciones mediante métodos generales. Específicamente, la composición farmacéutica puede estar en forma de una inyección. En cuanto a las formulaciones adecuadas que se conocen en la técnica, las que se enumeran en Remington's Pharmaceutical Science (1985) pueden usarse.
Además, la composición farmacéutica puede comprender una sal (cloruro de sodio), lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidón, goma de acacia, alginato, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio, aceite mineral, etc. como portadores, excipientes y diluyentes. Para la formulación de la composición farmacéutica de la presente invención, pueden usarse diluyentes o excipientes que generalmente se usan, como rellenadores, extensores, aglutinantes, humectantes, desintegrantes, tensioactivos, etc.
Las formulaciones para la administración parenteral pueden incluir soluciones acuosas estériles, solventes no acuosos, suspensiones, emulsiones, formulaciones liofilizadas y supositorios. Para solventes no acuosos y suspensiones pueden usarse propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal como aceite de oliva, y ésteres inyectables como oleato de etilo, etc. Witepsol, macrogol, Tween 61, aceite de cacao, aceite de laurina, glicerogelatina, etc. pueden usarse para bases para supositorios.
El dolor es como se describió anteriormente con respecto a la composición farmacéutica.
El sujeto puede ser un mamífero, que incluye un ser humano, o una célula y/o tejido que se aísla de un mamífero, que incluye un ser humano. El término "animal no humano" como se usa en la presente descripción pretende incluir todos los animales vertebrados, que incluyen mamíferos y no mamíferos, como primates, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.
En cuanto a la vía de administración, la dosis y la frecuencia de administración, la composición farmacéutica puede administrarse a un sujeto de varias maneras y cantidades en dependencia de la condición del paciente y de la presencia o ausencia de efectos secundarios, y el intervalo de métodos de administración, las dosis y las frecuencias de administración óptimos pueden seleccionarse apropiadamente por los expertos en la técnica. Además, la composición farmacéutica puede administrarse en combinación con otro fármaco o una sustancia fisiológicamente activa que se sabe muestra una eficacia terapéutica en un trastorno a tratar. También, la composición farmacéutica puede prepararse en la forma de una formulación combinada.
Específicamente, la composición farmacéutica de la presente invención puede proporcionarse en forma de una inyección. Por ejemplo, pueden incluirse inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intravenosa, inyección epidural o inyección intratecal, y similares. Específicamente, la composición farmacéutica puede administrarse mediante inyección epidural o inyección intratecal y, más específicamente, puede administrarse mediante inyección epidural transforaminal o inyección intratecal.
Como se usa en la presente descripción, el término "inyección epidural transforaminal" se refiere a un método de inyección de un fármaco en el interior de un foramen intervertebral, que es un espacio donde los nervios emergen de la médula espinal a través del espacio entre los huesos de la columna, y en el espacio fuera de la duramadre que circunda la médula espinal y los nervios espinales. En una modalidad, si la composición farmacéutica de la presente invención se compone de virus, el fármaco puede administrarse en el interior del foramen intervertebral de un sujeto mediante la realización de una terapia de inyección epidural.
Como se usa en la presente descripción, el término "inyección intratecal" se refiere a un método de administración mediante la inyección de un fármaco en un espacio en el interior de la duramadre en el canal espinal. En una modalidad, si la composición farmacéutica de la presente invención se compone de plásmidos, el fármaco puede administrarse en el interior del canal espinal de un sujeto mediante la realización de una terapia de inyección intratecal.
Específicamente, si la composición farmacéutica se compone de vectores virales, puede administrarse en una cantidad de 1,0 x 106 a 1,0 * 1014 vg en base a un adulto. Además, cuando hay dos tipos de virus a administrar, cada tipo de virus puede administrarse en una cantidad de 5,0 * 105 a 5,0 * 1013 vg. Si hay tres tipos de virus a administrar, cada tipo de virus puede administrarse en una cantidad de 3,0 * 105 a 3,0 * 1013 vg.
Además, si la composición farmacéutica se compone de vectores no virales, puede administrarse en una concentración de 0,1 mg/mL a 10 mg/mL, en base a un adulto. También, si la composición farmacéutica se compone de vectores plasmídicos, la dosis puede ser de 0,1 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL o más, que incluye todos los valores e intervalos entre ellos.
En cuanto a la frecuencia de administración de un vector viral, puede administrarse una vez o más, o de 1 a 10 veces. También, puede administrarse en el intervalo de 1 día a 1 mes, o de 1 mes a 1 año en el caso de administración repetida. Además, si la composición farmacéutica se compone de vectores no virales, puede administrarse 1 o más, o de 1 a 10 veces. También, puede administrarse con un intervalo de 12 a 24 horas o de 1 a 14 días en el caso de administración repetida.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica para el uso para aliviar o tratar el dolor.
La presente invención proporciona un uso de la composición farmacéutica de la presente invención para la preparación de un agente terapéutico para aliviar o tratar el dolor.
Modos para llevar a cabo la invención
En lo adelante, la presente invención se describirá en detalle con referencia a ejemplos. Sin embargo, los siguientes ejemplos son solo para fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.
Ejemplo 1. Preparación y análisis de las propiedades del virus adenoasociado recombinante
Los virus adenoasociados que se requieren para la presente invención se construyeron y produjeron sobre la base del sistema sin AAV auxiliar (Agilent).
Ejemplo 1.1. Construcción del plásmido pAAV-GAD65
Para construir el plásmido pAAV-GAD65 de la Figura 1, la región promotora del CMV de pJDK-rGAD65 (Lee, Gene Ther, 2005) se amplificó mediante PCR y luego el resultante se introdujo en pGEM-T (Promega) para construir pGEM-T-CMV. Las secuencias de cebadores que se usaron para la amplificación del promotor de CMV son las siguientes:
F-JDK (SEQ ID NO: 15): 5'-TTCGGCCGTCGAGGAGCTTGGCCCATTG-3'
R-JDK (SEQ ID NO: 16): 5'-GACGTCGACCTAGCTAGCGAATTCGGGGCCGCGGAG-3'.
En cuanto al gen GAD65, el gen que se representa mediante la SEQ ID NO: 3 se diseñó mediante la optimización de codones para ser adecuado para humanos en base al GAD65 humano (NCBI NM_000818.2) que se representa mediante la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y se remitió a Bioneer para la síntesis de genes. El gen hGAD65 que se introdujo en pGEM-T se trató con NheI y SalI para preparar un fragmento de ADN de 1,7 Kb. Posteriormente, se sometió a ligadura con el fragmento de ADN de 3,7 Kb que se obtuvo al tratar pGEM-T-CMV con NheI y SalI, para completar la construcción del pGEM-T-CMV-hGAD65.
SV40pA se amplificó mediante la realización de una PCR mediante el uso de pCI (Invitrogen) como molde y, luego, el resultante se trató con ClaI y SalI para preparar un fragmento de ADN de 222 pb. El fragmento de ADN se sometió a ligadura con el fragmento de ADN de 5,4 Kb que se preparó al cortar pGEM-T-CMV-hGAD65 con ClaI y SalI, para finalmente preparar pGEM-T-CMV-hGAD65-SV40pA. Las secuencias de cebadores que se usaron para la amplificación de SV40pA son las siguientes:
F-SV40pA (SEQ ID NO: 17): 5'-CCATCGATCAGACATGATAAGATACATTGATGAG-3'
R-SV40pA (SEQ ID NO: 18): 5'-GACGTCGACGCGGCCGCTACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTG-3'.
Para construir un vector de virus adenoasociado, el gen de resistencia a la ampicilina en pAAV-MCS (Agilent) se reemplazó con el gen de resistencia a la kanamicina. El gen de resistencia a la kanamicina se amplificó mediante PCR mediante el uso de pET-28 (a) (Novagen) como molde. El gen de resistencia a la kanamicina de 816 pb que se amplificó se sometió a ligadura con pGEM-T para construir pGEM-T-Kanr. Las secuencias de cebadores que se usaron para la amplificación del gen de resistencia a la kanamicina son las siguientes:
F-Kan (SEQ ID NO: 19): 5-AGGCGCCATGAGCCATATTCAACGGGAA-3'
R-Kan (SEQ ID NO: 20): 5-TTCATGATTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3'.
Para introducir el gen de resistencia a la kanamicina, los sitios SpeI y EcoRV se generaron respectivamente mediante mutagénesis aguas arriba y aguas abajo del gen de resistencia a la ampicilina en pAAV-MCS, y luego el resultante se trató nuevamente con SpeI y EcoRV. El resultante se sometió a ligadura con el fragmento de ADN que se obtuvo al cortar el pGEM-T-Kanr que se construyó previamente con NheI y EcoRV, para construir pAAV-MCS-Kanr.
El pAAV-MCS-Kanr que se construyó se trató con NotI y BamHI, y luego se sometió a ligadura con el fragmento de ADN de 2,7 Kb que se obtuvo al cortar el pGEM-T-CMV-hGAD65-SV40pA con EagI y PvuI, para construir pssAAV-GAD65.
Para introducir el casete de expresión GAD65 en pVAXI (Invitrogen), el sitio BamHI se generó mediante mutagénesis aguas abajo del bGHpA. Luego, el resultante se cortó con MluI y NheI para preparar fragmentos de ADN. Las regiones promotoras de LITR y CMV se amplificaron mediante PCR mediante el uso de pssaAV-GAD65 como molde y se clonaron en pGEM-T easy (Promega). Posteriormente, el resultante se cortó con AscI y NheI y se sometió a ligadura con el vector pVAX1 que se preparó previamente para construir pVAX1-LITR-CMV. Las secuencias de cebadores que se usaron para la amplificación de la región promotora de LITR y CMV son las siguientes:
F-ITR (SEQ ID NO: 21): 5-ATGGCGCGCCCCTGGCCTTTTGCTGGCC-3',
R-JDK(SEQ ID NO: 16): 5-GACGTCGACCTAGCTAGCGAATTCGGGGCCGCGGAG-3'.
pVAX1-LITR-CMV se cortó nuevamente con NotI y NheI para preparar fragmentos de ADN. Se cortó PSSAAV-GAD65 con EagI y NheI y se sometió a ligadura con los fragmentos de ADN que se prepararon previamente para construir pVAX1-LITR-CMV-hGAD65-SV40pA.
El pVAX1-LITR-CMV-hGAD65-SV40pA se cortó con HpaI y BamHI para preparar fragmentos de ADN. Además, psA-SV40pA-RITR, que se había preparado mediante la amplificación a través de PCR mediante el uso de pssaAV-GAD65 como molde y al clonar en pGEM-T easy, se trató con HpaI y BamHI para preparar fragmentos de ADN. Los dos fragmentos de ADN se ligaron para completar pVAX1-LITR-CMV-hGAD65-SV40pA-RITR (que en lo adelante se abrevia como "pAAV-GAD65"). Las secuencias de cebadores que se usaron para la amplificación de la región SV40pA y RITR son las siguientes:
F-SV40pA (SEQ ID NO: 17): 5-CCATCGATCAGACATGATAAGATACATTGATGAG-3'
R-ITR (SEQ ID NO: 22): 5-ATGGATCCGCTAGTAAATACCGCATCAG-3'.
El diagrama esquemático del plásmido pAAV-GAD65 se muestra en la Figura 1.
Se llevó a cabo el siguiente procedimiento para construir pAAV-GAD65 modificado.
Primero, el vector se cortó con Nhe1 y luego se insertó una secuencia de nucleótidos aleatoria arbitraria entre el promotor de CMV y el gen GAD65 mediante un método de infusión. Las secuencias de nucleótidos que se insertaron son las siguientes:
Secuencia rellenadora aleatoria (SEQ ID NO: 29):
5'-GTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCC-3'
Stuffer_scramble_F (SEQ ID NO: 30):
5 '-C T A G G T C G A C G G T A T C G A T A A G C T T G A T A T C G A A T T C C T G C A G C C C -3'
Stuffer_scramble_R (SEQ ID NO: 31):
5’-CTAGGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGAC-3'.
A continuación, la secuencia de nucleótidos WPRE (Schambach, Gene Ther, 2006), de la que se eliminó la región de la proteína X que puede proporcionar un efecto oncogénico, se amplificó mediante PCR y se insertó en la parte posterior del gen GAD65 mediante el uso de las enzimas de restricción Pac1 y Hpa1. Al mismo tiempo, se eliminó alguna porción de SV40pA para construir un SV40pA modificado. Las secuencias de cebadores que se usaron para la amplificación de WPRE son las siguientes:
WPRE_Pac1_F (SEQ ID NO: 25):
5'-GGTGGTTTAATTAAAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTG-3'
WPRE_modi_Hpa1_R (SEQ ID NO: 26): 5-GGTGGTGTTAACGACAACACCACGGAATTG-3'.
El plásmido finalmente modificado fue pVAX1-LITR-CMV-secuencia rellenadora aleatoria-hGAD65-WPRE (modi)-SV40pA (modi)-RITR (que en lo adelante se abrevia como "pAAV-GAD65-modi"), y su diagrama esquemático se muestra en la Figura 1.
Ejemplo 1.2. Construcción del plásmido pAAV-IL-10
El plásmido pAAV-IL-10 se construyó mediante el mismo método que en el Ejemplo 1.1. En cuanto al gen de IL-10 de rata, el gen que se representa mediante la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 se diseñó mediante la optimización de codones para que sea adecuado para ratas en base a la IL-10 humana (NCBI NM-012854) que se representa mediante la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, y se remitió a Bioneer para la síntesis de genes. El gen rIL-10 se amplificó mediante la realización de una PCR mediante el uso del gen IL-10 de rata que se introdujo en pGEM-T easy como molde, y luego el resultante se trató con NheI y SalI para preparar un fragmento de ADN de 0,5 Kb. Además, se trató PGEM-T-CMV con NheI y SalI para preparar un fragmento de ADN de 3,7 Kb. Los dos fragmentos de ADN se ligaron para preparar pGEM-T-CMV-rIL-10. Las secuencias de cebadores que se usaron para la amplificación de rIL-10 son las siguientes:
F-rIL-10 (SEQ ID NO: 23): 5'-CCGCTAGCGCCACCATGCCT-3'
R-rIL-10 (SEQ ID NO: 24): 5'-GACGTCGACGCCATCGATGGCTTAATTAATCAATTCTTC-3'.
En cuanto al SV40pA, el gen se amplificó mediante la realización de una PCR mediante el uso del pCI como molde y luego se trató con NotI y SalI para preparar un fragmento de ADN de 222 pb. Además, el pGEM-T-CMV-rIL-10 se trató con ClaI y SalI para preparar un fragmento de ADN de 4,2 Kb. Los dos fragmentos de ADN se ligaron para construir pGEM-T-CMV-rIL-10-SV40pA. Las secuencias de cebadores que se usaron para la amplificación de SV40pA son las siguientes:
F-SV40pA (SEQ ID NO: 17): 5'-CCATCGATCAGACATGATAAGATACATTGATGAG-3'
R-SV40pA (SEQ ID NO: 18): 5'-GACGTCGACGCGGCCGCTACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTG-3'.
El pGEM-T-CMV-rIL-10-SV40pA se trató con EagI para preparar un fragmento de ADN de 1,6 kb. Además, pAAV-MCS-Kanr se trató con NotI y BamHI para preparar fragmentos de ADN. Posteriormente, los dos fragmentos de ADN se ligaron para construir pssAAV-CMV-rIL-10-SV40pA (que en lo adelante se abrevia como "pAAV-IL-10"). El diagrama esquemático del plásmido pAAV-IL-10 se muestra en la Figura 2.
Ejemplo 1.3. Construcción del plásmido pAAV-GDNF
En cuanto al gen GDNF humano, el gen que se representa mediante la SEQ ID NO: 13 se diseñó mediante la optimización de codones para sea adecuado para humanos en base al GDNF humano (NCBI NM_199231.2) que se representa mediante la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y se remitió a Bioneer para la síntesis de genes. El gen hGDNF que se introdujo en el plásmido pGEM-B1 se trató con NheI y PacI para preparar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,6 kb. El plásmido pGEM-T-CMV-rIL-10-SV40pA se trató con NheI y PacI para preparar un fragmento de 2,8 kb en el que se eliminó el gen rIL-10. Los dos fragmentos de ADN se ligaron para construir el plásmido pGEM-T-CMV-hGDNF-SV40pA.
Luego, el plásmido pGEM-T-CMV-hGDNF-SV40pA que se completó se trató con EagI para preparar un fragmento de ADN de 1,5 kb. Además, pAAV-MCS-Kanr se trató con NotI y BamHI para preparar un fragmento de ADN de 1,8 kb. Los dos fragmentos de ADN se ligaron para construir pssAAV-CMV-hGDNF-SV40pA-Kanr (que en lo adelante se abrevia como "pAAV-GDNF"). El diagrama esquemático del plásmido pAAV-GDNF se muestra en la Figura 3.
Ejemplo 1.4. Construcción del plásmido pAAV-GDNF-IL-10
El promotor CAG (potenciador de citomegalovirus, promotor de p-actina de pollo y señal de p-globina poli A de conejo) se sometió a amplificación por PCR mediante el uso de pAxCAwtit2 contenido en el kit de expresión de adenovirus dual (Takara), y se trató con ApaI y XbaI para mejorar la expresión, se retiró de esta manera aproximadamente el 80 % de la región de p-actina de pollo en el promotor CAG para producir un promotor CAG corto (sCAG) (Fagoe, Gene Ther, 2014). En cuanto al gen de la IL-10 humana, el gen que codifica la SEQ ID NO: 14 se diseñó mediante la optimización de codones del gen que codifica la SEQ ID NO: 9 para ser adecuado para humanos, y se remitió a Bioneer para la síntesis de genes. A continuación, se obtuvo el fragmento de ADN poli A para la hormona de crecimiento bovina (bGH) mediante amplificación por PCR. El pVAX1/sCAG-hIL-10-bGHpA se construyó mediante el uso de pVAX1 (Invitrogen) para contener el promotor y poli A y los genes de IL-10 humana.
A continuación, se preparó pVAX1/CMV-hGDNF-SV40pA mediante el mismo método que en el Ejemplo 1.1., mediante el uso del gen GDNF humano del Ejemplo 1.3. Posteriormente, el casete génico de SV40pA-hGDNF-CMV se amplificó mediante la realización de una PCR mediante el uso de pVAX1/CMV-hGDNF-SV40pA como molde, y se preparó un fragmento de ADN de 1,5 kb. Las secuencias de cebadores que se usaron para la amplificación del casete génico son las siguientes:
SV40-CMV-sCAG-bGHpA-Infu-F (SEQ ID NO: 27):
5'-CCTGCGGCCGGTCGACTACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGC-3'
SV40-CMV-sCAG-bGHpA-Infu-R (SEQ ID NO: 28):
5'-AATAATCAATGTCGACTCGAGGAGCTTGGCCCATT-3'
A continuación, se trató pVAX1/sCAG-hIL-10-bGHpA con SalI para preparar un fragmento de ADN de aproximadamente 3,9 kb, y el fragmento de ADN de 1,5 kb que se describió anteriormente se insertó en el fragmento de ADN de 3,9 kb mediante el uso de un kit de clonación In-Fusion HD (Clontech) para construir pVAX1/SV40pAhGDNF-CMV-sCAG-hIL-10-bGHpA (que en lo adelante se abrevia como "pAAV-GDNF-IL-10"). El plásmido pAAV-GDNF-IL-10 se muestra esquemáticamente en la Figura 4.
Ejemplo Experimental 1. Confirmación de la expresión de los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, pAAV-GDNF y pAAV-GDNF-IL-10
Los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, pAAV-GDNF o pAAV-GDNF-IL-10 que se prepararon en los Ejemplos 1.1. a 1.4. se transfectaron respectivamente en células de la línea celular embrionaria de riñón humano 293T mediante el uso de jetPRIME (Polyplus). Las células transfectadas se cultivaron en una incubadora a 37 °C durante 48 horas. Posteriormente, se recolectaron el medio de cultivo celular o las células que se cultivaron. Las células se disolvieron con un solvente y las muestras que se prepararon se trataron con cada uno de los anticuerpos contra GAD65 (Merck Millipore), IL-10 (Santa Cruz) y GDNF (R&D systems) y se sometieron a transferencia Western.
Específicamente, en el caso de pAAV-GAD65, las células de la línea celular embrionaria de riñón humano 293T se trataron con 2 |jg de plásmido pAAV-GAD65 y se cultivaron durante 48 horas. Posteriormente, las células que se cultivaron se disolvieron y la expresión de GAD65 en las células se confirmó a través de transferencia Western.
En el caso de los plásmidos pAAV-IL-10 y pAAV-GDNF, células de la línea celular embrionaria de riñón humano 293T se trataron con 1 jg de plásmido pAAV-IL-10 o pAAV-GDNF y se cultivaron durante 48 horas. Posteriormente, se recolectó el medio de cultivo y se confirmó la expresión de IL-10 o GDNF en el medio a través de transferencia Western.
En el caso del plásmido pAAV-GDNF-IL-10, las células de la línea celular embrionaria de riñón humano 293T se trataron con 1 jg del plásmido pAAV-GDNF-IL-10 y se cultivaron durante 48 horas. Posteriormente, las células que se cultivaron se disolvieron y la expresión intracelular de IL-10 y de GDNF se confirmó a través de transferencia Western.
Como resultado, se confirmó que se expresaba el plásmido pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, pAAV-GDNF o pAAV-GDNF-IL-10 que se transfectó (Figs. 5 y 6).
Ejemplo 2. Preparación del virus adenoasociado recombinante
El virus AAV-IL-10 que se usó en el experimento se produjo y purificó en Vector core de UNC. El método de producción es el siguiente. El pVax-rIL-10, pHelper y pRC5 se transfectaron en células de la línea celular embrionaria de riñón humano 293T. Posteriormente, el resultante se sometió a purificación mediante cromatografía en columna para asegurar el virus AAV5-IL-10. El título del virus que se produjo se midió mediante el uso de qPCR.
Los virus AAV-GAD65 y AAV-GDNF se produjeron y purificaron mediante KRcrogen. El método de producción es el siguiente. Los transgenes del AAV (plásmidos pAAV-GAD65 y pAAV-GDNF) se transfectaron respectivamente en las células de la línea celular embrionaria de riñón humano 293T mediante el uso del método de fosfato de calcio junto con pHelper y pRC. En el caso de GAD65, se usó pRC5 que se introdujo con el gen de la cápside del serotipo 5. En el caso de GDNf , se usó pRC1 que se introdujo con el gen de la cápside del serotipo 1 del AAV. Las células que se transfectaron se cultivaron en una incubadora a 37 °C y las células se recolectaron después de 48 horas.
Posteriormente, solo las bandas que contenían virus se aislaron y purificaron a través del método de centrifugación de ultra alta velocidad de acuerdo con el gradiente de concentración de cesio, para asegurar los virus AAV5-GAD65 y AAV1-GDNF. Los títulos de los virus que se produjeron se midieron mediante el uso de qPCR.
El virus AAV-GDNF-IL-10 se produjo y purificó mediante Cdmogen. El método de producción es el siguiente. El transgén de AAV (plásmido pAAV-GDNF-IL-10) se transfectó en células de la línea celular embrionaria de riñón humano 293T mediante el uso del método de fosfato de calcio junto con pHelper y pRC5. Las células que se transfectaron se cultivaron en una incubadora a 37 °C y las células se recolectaron después de 48 horas.
Posteriormente, solo las bandas que contenían virus se aislaron y purificaron a través de centrifugación a ultra alta velocidad de acuerdo con el gradiente de concentración de cesio, para asegurar el virus AAV5-GDNF-IL-10. El título del virus que se produjo se midió mediante el uso de qPCR.
El virus AAV-GAD65-modi se produjo y purificó mediante Cdmogen. El método de producción es el siguiente. El transgén de AAV (plásmido pAAV-hGAD65-modi) se transfectó en células de la línea celular embrionaria de riñón humano 293T mediante el uso del método de fosfato de calcio junto con pHelper y pRC5. Las células que se transfectaron se cultivaron en una incubadora a 37 °C y las células se recolectaron después de 48 horas.
Posteriormente, solo las bandas que contenían virus se aislaron y purificaron mediante centrifugación de ultra alta velocidad de acuerdo con el gradiente de concentración de cesio para asegurar el virus AAV5-GAD65-modi. El título del virus que se produjo se midió mediante el uso de qPCR.
Ejemplo Experimental 2. Análisis de las propiedades del virus adenoasociado recombinante
Con el fin de examinar la expresión de proteína del virus adenoasociado recombinante que se suministró a una célula, la línea celular embrionaria de riñón humano 293T o células HeLa se trataron con los virus AAV-GAD65, AAV-GAD65-modi, AAV-IL-10 o AAV-GDNF que se obtuvieron anteriormente, y la expresión de proteína se examinó mediante transferencia Western. Específicamente, se sembraron células 293T o HeLa a 5 * 105 células/pocillo en una placa de 6 pocillos. Y al día siguiente, las células se trataron respectivamente con 3 tipos de virus a 10.000 vg/pocillo y luego se cultivaron en una incubadora a 37 °C. Después de 48 horas, las células se recolectaron y se disolvieron con un solvente y el medio de cultivo se concentró mediante el uso del amicon (Merck Millipore). Luego, las muestras que se prepararon se trataron respectivamente con los anticuerpos contra GAD65 (Cell signaling), IL-10 (Santa Cruz) y GDNF (R&D systems) y se sometieron a transferencia Western.
Como resultado, se confirmó que cada proteína diana se expresó en el lisado celular de la línea celular embrionaria de riñón humano 293T o la línea celular HeLa que se trató con el virus AAV-GAD65, AAV-GAD65-modi, AAV-IL-10 o AAV-GDNF (Figura 7). Por lo tanto, se confirmó que no había anormalidad en las estructuras y propiedades de los virus adenoasociados recombinantes que se usaron en el experimento.
También, para confirmar que GABA se produce por el virus AAV-GAD65 o AAV-GAD65-modi, el medio de cultivo de las células que se trataron con el virus AAV-GAD65 o AAV-GAD65-modi se recolectó y se sometió a análisis GABA ELISA (LDN). Para cada grupo experimental, se prepararon por separado dos muestras idénticas para realizar el análisis, y el gráfico de barras muestra el valor de cada muestra.
Como resultado, se confirmó que GABA se secretó al medio de cultivo por el GAD65 que se introdujo en las células por el virus AAV-GAD65 o el AAv-GAD65-modi (Figura 8).
Ejemplo Experimental 3. Comparación de las eficacias analgésicas entre la administración individual de los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 o AAV-GDNF y la coadministración de los virus AAV-GAD65 y AAV-GDNF, o los virus AAV-IL-10 y AAV-GDNF
Ejemplo Experimental 3.1. Preparación de muestra de administración
Los virus que se prepararon en el Ejemplo 2 se usaron para la prueba. 30 minutos antes del experimento de administración animal, los reactivos que se almacenaron a -80 °C se descongelaron a temperatura ambiente y se prepararon mediante la mezcla mediante un agitador vorticial. Los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10, AAV-GDNF y Aa V-GFP se diluyeron en PBS para obtener los títulos que se muestran en la Tabla 1. El virus AAV-GFP se administró en la misma cantidad que otros virus adenoasociados recombinantes. La GFP es una proteína que no tiene eficacia analgésica. Los virus que se requirieron se mezclaron de acuerdo con los contenidos que se indican en la Tabla 1, y se administraron en una cantidad de 9,0 * 108 vg/5 pl por animal (vg: genoma del virus).
[Tabla 1]
Figure imgf000013_0001
Ejemplo Experimental 3.2. Construcción de ratas con dolor neuropático inducido y administración de muestras
Se sometieron ratas SD machos de 150 a 200 g a anestesia por inhalación. Y luego se hizo una incisión en la parte superior de la pantorrilla y se ataron ambos extremos del nervio peroneo común y del nervio tibial y se hicieron nudos a intervalos de 0,5 a 1 cm mediante sutura 7-0. Las regiones entre los nudos de los dos haces nerviosos se cortaron con una tijera y se suturó el sitio de la incisión. Posteriormente, las ratas se recuperaron para despertarlas de la anestesia y devolverlas a la jaula. Dos semanas después, se realizó una prueba de filamento Von Frey para examinar la inducción del dolor, y luego se administraron respectivamente las muestras que se prepararon en el Ejemplo 2.1 (Decosterd, Pain, 2000).
Las muestras se administraron mediante el método de inyección epidural transforaminal en una locación adyacente al ganglio de la raíz dorsal (GRD). La rata con dolor inducido se sometió a anestesia por inhalación, y las vértebras se expusieron mediante una incisión lineal en el lomo de la rata a los niveles de las vértebras lumbares L3 a L5. Al lateral del espacio que se expuso, se hizo visible el proceso transverso L4, una de las proyecciones espinales. La rata se acostó de lado de manera que su lateral fue visible desde arriba y el foramen intervertebral L4 fue visible.
Posteriormente, se insertó una aguja unida al catéter en la muestra preparada y se conectó una jeringa Hamilton al extremo opuesto del catéter y se tiró hasta la línea de marcado de 5 pl para inyectar la muestra en el catéter. Se retiró la jeringa Hamilton del catéter y luego se aseguró el catéter al sujetar la punta a 1 cm de la punta de la aguja mediante el uso de Halsted-Mosquito. Luego, mientras se sujetaba y tiraba de la vértebra L4 hacia arriba con unas pinzas, la punta de la aguja que se aseguró mediante Halstead Mosquito se tomó alrededor del foramen intervertebral L4 con la otra mano. La punta de la aguja se insertó en la región doblada en el interior del foramen intervertebral cuyo espacio se aseguró. Luego, se soltó la aguja que estaba sujeta.
Después de confirmar que la aguja estaba fija, se conectó una jeringa de 1 mL al catéter que se conectó al sitio opuesto de la aguja. Mediante presionar gentilmente el pistón de la jeringa, la muestra se inyectó lentamente alrededor del ganglio de la raíz dorsal de la rata. Posteriormente, se suturó el sitio de la incisión. 4 semanas después de la administración de la muestra, se observaron respuestas al dolor mediante el uso de la prueba de filamento von Frey. Ejemplo Experimental 3.3. Observación del dolor mediante el uso de la prueba de filamento Von Frey
El dolor se observó mediante el uso de la prueba de filamento Von Frey. El método es calcular el valor umbral de acuerdo con un patrón predeterminado de respuesta al dolor con un total de ocho filamentos de 0,4, 0,6, 1, 2, 4, 6, 8 y 15 g.
Las regiones que generan el dolor se buscaron mediante el cambio de la posición desde la porción inicial del dedo más exterior hasta el talón de la suela donde se genera el dolor. Ya que las ratas se quitaron repentinamente las suelas y encogieron o lamieron sus suelas con la boca cuando se generó dolor, pudieron encontrarse las regiones que generan dolor. Si habían reacciones tres veces o más cuando el área circundante se pinchaba cinco veces con el filamento de cada etapa, se consideraba una respuesta de dolor. Y se procedió a la prueba mediante el reemplazo del filamento con el de la siguiente etapa. De esta manera, se registró el patrón de cada etapa.
Los patrones de dolor se registraron en base a la tabla de patrones que se estableció por S.R. Chaplan, y los valores de umbral se calcularon mediante el uso de los patrones de dolor (Chaplan, J Neurosci Methods, 1994). En cuanto al análisis del comportamiento, los grupos de animales se cegaron en un momento específico y al menos 3 investigadores observaron, y los resultados de los patrones que se registraron se procesaron estadísticamente para analizar los resultados del dolor.
Como resultado, se encontró que el efecto de alivio del dolor fue más alto cuando se combinaron y coadministraron los virus AAV-GAD65 y AAV-GDNF, o AAV-IL-10 y AAV-GDNF, en comparación con la administración individual de los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 o AAV-GDNF (Figura 9).
Ejemplo Experimental 4. Comparación de las eficacias analgésicas entre la administración individual de los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 o AAV-GDNF y la coadministración de los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 y AAV-GDNF
Los virus que se prepararon en el Ejemplo 2 se usaron para la prueba. 30 minutos antes del experimento de administración animal, los reactivos que se almacenaron a -80 °C se descongelaron a temperatura ambiente y se prepararon mediante la mezcla mediante un agitador vorticial. Los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10, AAV-GDNF y Aa V-GFP se diluyeron en PBS para obtener los títulos que se muestran en la Tabla 2. El virus AAV-GFP se administró en la misma cantidad que otros virus adenoasociados recombinantes. La GFP es una proteína cuya eficacia analgésica no ha sido informada. Los virus se mezclaron de acuerdo con los contenidos que se muestran en la Tabla 2, y se administraron en una cantidad de 9,0 * 108 vg/5 pl por animal.
[Tabla 2]
Figure imgf000014_0001
(continuación)
Figure imgf000015_0001
Al modelo animal con dolor que se produjo mediante el mismo método que en el Ejemplo Experimental 3.2., se administraron muestras que se prepararon de acuerdo con los contenidos de virus que se muestran en la Tabla 2. Posteriormente, la prueba de filamento Von Frey se realizó mediante el mismo método que en el Ejemplo Experimental 3.3. para observar las respuestas al dolor.
Como resultado, se encontró que el efecto de alivio del dolor fue más alto cuando se coadministraron todos los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 y AAV-GDNF en comparación con la administración individual de los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 o AAV-GDNF (Figura 10).
Ejemplo Experimental 5. Comparación de las eficacias analgésicas entre la coadministración de los virus AAV-GAD65 y AAV-GDNF o AAV-IL-10 y AAV-GDNF y la coadministración de los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 y AAV-GDNF
Los virus adenoasociados que se prepararon en el Ejemplo 2 se usaron para la prueba. 30 minutos antes del experimento de administración animal, los reactivos que se almacenaron a -80 °C se descongelaron a temperatura ambiente y se prepararon mediante la mezcla mediante un agitador vorticial. Los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10, AAV-GDNF y AAV-GFP se diluyeron en PBS para obtener los títulos que se muestran en la Tabla 3. El AAV-GFP se administró en la misma cantidad que otros virus adenoasociados recombinantes. La GFP es una proteína que no tiene eficacia analgésica. Los virus que se requirieron se mezclaron de acuerdo con los contenidos que se muestran en la Tabla 3 y se administraron en una cantidad de 9,0 * 108 vg/5 pl por animal.
[Tabla 3]
Figure imgf000015_0002
Al modelo animal con dolor que se produjo mediante el mismo método que en el Ejemplo Experimental 3.2., se administraron muestras que se prepararon de acuerdo con los contenidos de virus que se muestran en la Tabla 3. Posteriormente, la prueba de filamento Von Frey se realizó mediante el mismo método que en el Ejemplo Experimental 3.3. para observar las respuestas al dolor.
Como resultado, se encontró que el efecto de alivio del dolor fue más alto cuando se coadministraron todos los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 y AAV-GDNF en comparación con la coadministración de los virus AAV-GAD65 y AAV-GDNF, o AAV-IL-10 y AAV-GDNF (Figura 11).
Ejemplo Experimental 6. Comparación de las eficacias analgésicas entre la administración individual de los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, o pAAV-GDNF y la coadministración de los plásmidos pAAV-GAD65 y pAAV-GDNF, o pAAV-IL-10 y pAAV-GDNF
Ejemplo Experimental 6.1. Preparación de muestras de administración
Los plásmidos que se prepararon en el Ejemplo 1 se usaron para la prueba. 30 minutos antes del experimento de administración animal, los reactivos que se almacenaron a -80 °C se descongelaron a temperatura ambiente y se prepararon mediante la mezcla mediante un agitador vorticial. Los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, pAAV-GDNF y pVAX1 se diluyeron en el tampón Tris-EDTA para obtener las concentraciones que se muestran en la Tabla 4. El plásmido pVAX1 se administró en la misma cantidad que los otros plásmidos. No se ha informado que el plásmido pVAX1 tiene una eficacia analgésica. Los plásmidos que se requirieron se mezclaron de acuerdo con los contenidos que se muestran en la Tabla 4 y se administraron en una cantidad de 30 pg/50 pl por animal.
[Tabla 4]
Figure imgf000016_0002
Ejemplo Experimental 6.2. Construcción del modelo animal con dolor neuropático y administración de muestra.
Se sometieron ratas SD machos de 150 a 200 g a anestesia por inhalación. Y luego se hizo una incisión en la parte superior de la pantorrilla y se ataron ambos extremos del nervio peroneo común y del nervio tibial y se hicieron nudos a intervalos de 0,5 a 1 cm mediante sutura 7-0. Las regiones entre los nudos de los dos haces nerviosos se cortaron con una tijera y se suturó el sitio de la incisión. Posteriormente, las ratas se recuperaron para despertarlas de la anestesia y devolverlas a la jaula. Dos semanas después, se realizó la prueba de filamento Von Frey para examinar la inducción del dolor, y luego se administraron las muestras que se prepararon en el Ejemplo 6.1 (Decosterd, Pain, 2000).
Las muestras se administraron mediante el método de inyección intratecal. La rata con dolor inducido se sometió a anestesia por inhalación, y el proceso espinoso se expuso mediante una incisión lineal en el lomo de la rata en la región de la vértebra lumbar L5. Se colocó un tubo de 50 mL debajo de la rata para ampliar el espacio entre L5 y L6, y se insertó una aguja de tamaño 27 G * 13 mm. Posteriormente, se conectó a la aguja una jeringa de 1 mL que se rellenó con 50 pl de la muestra. La muestra se inyectó lentamente mediante la presión ligera del pistón de la jeringa. Posteriormente, se suturó la incisión y se terminó esta etapa. Un día después de la administración de la sustancia, se observaron las respuestas al dolor mediante el uso de la prueba de filamento von Frey.
Ejemplo Experimental 6.3. Observación del dolor mediante el uso de la prueba de filamento Von Frey
La prueba de filamento Von Frey se llevó a cabo mediante el mismo método que en el Ejemplo Experimental 3.3. Como resultado, se encontró que el efecto de alivio del dolor fue más alto cuando los plásmidos pAAV-GAD65 y pAAV-GDNF, o pAAV-IL-10 y pAAV-GDNF se coadministraron en comparación con la administración individual de los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 o pAAV-GDNF (Figura 12).
Ejemplo Experimental 7. Comparación de las eficacias analgésicas entre la administración individual de los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, o pAAV-GDNF y la coadministración de los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 y pAAV-GDNF
Los plásmidos que se prepararon en el Ejemplo 1 se usaron para la prueba. 30 minutos antes del experimento de administración animal, los reactivos que se almacenaron a -80 °C se descongelaron a temperatura ambiente y se prepararon mediante la mezcla mediante un agitador vorticial. Los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, pAAV-GDNF y pVAX1 se diluyeron en el tampón Tris-EDTA para obtener las concentraciones que se muestran en la Tabla 5. El plásmido pVAX1 se administró en la misma cantidad que los otros plásmidos. No se ha informado que el plásmido pVAX1 tiene una eficacia analgésica. Los plásmidos que se requirieron se mezclaron de acuerdo con los contenidos que se muestran en la Tabla 5 y se administraron en una cantidad de 30 pg/50 pl por animal.
[Tabla 5]
Figure imgf000016_0001
(continuación)
Figure imgf000017_0002
Al modelo animal con dolor que se produjo mediante el mismo método que en el Ejemplo Experimental 6.2., se administraron muestras que se prepararon de acuerdo con los contenidos de virus que se muestran en la Tabla 5. Posteriormente, la prueba de filamento Von Frey se realizó mediante el mismo método que en el Ejemplo Experimental 3.3. para observar las respuestas al dolor.
Como resultado, se encontró que el efecto de alivio del dolor fue más alto cuando se coadministraron todos los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV5-IL-10 y pAAV5-GDNF en comparación con la administración individual de los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV- IL-10 o pAAV-GDNF (Figura 13).
Ejemplo Experimental 8. Comparación de las eficacias analgésicas entre la coadministración de plásmidos pAAV-GAD65 y pAAV-GDNF, o pAAV-IL-10 y pAAV-GDNF y la coadministración de los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 y pAAV-GDNF
Los plásmidos que se prepararon en el Ejemplo 1 se usaron para la prueba. 30 minutos antes del experimento de administración animal, los reactivos que se almacenaron a -80 °C se descongelaron a temperatura ambiente y se prepararon mediante la mezcla mediante un agitador vorticial. Los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, pAAV-GDNF y pVAX1 se diluyeron en el tampón Tris-EDTA para obtener las concentraciones que se muestran en la Tabla 6. El plásmido pVAX1 se administró en la misma concentración y cantidad que los otros plásmidos. No se ha informado que el plásmido pVAX1 tiene una eficacia analgésica. Los plásmidos que se requirieron se mezclaron de acuerdo con los contenidos que se muestran en la Tabla 6 y se administraron en una cantidad de 30 pg/50 pl por animal.
[Tabla 6]
Figure imgf000017_0001
Al modelo animal con dolor que se produjo mediante el mismo método que en el Ejemplo Experimental 6.2., se administraron muestras que se prepararon de acuerdo con los contenidos de plasma que se muestran en la Tabla 6. Posteriormente, la prueba de filamento Von Frey se realizó mediante el mismo método que en el Ejemplo Experimental 6.3. para observar las respuestas al dolor.
Como resultado, se encontró que el efecto de alivio del dolor fue más alto cuando se coadministraron todos los plásmidos pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 y pAAV-GDNF en comparación con la coadministración de los plásmidos pAAV-GAD65 y pAAV-GDNF o pAAV-IL-10 y pAAV-GDNF (Figura 14).
Ejemplo Experimental 9. Comparación de las eficacias analgésicas de la coadministración de los virus AAV-GAD65-modi y AAV-GDNF-IL-10 y la coadministración de los virus AAV-GAD65, AAV-IL-10 y AAV-GDNF
Los virus adenoasociados que se prepararon en el Ejemplo 2 se usaron para la prueba. 30 minutos antes del experimento de administración animal, los reactivos que se almacenaron a -80 °C se descongelaron a temperatura ambiente y se prepararon mediante la mezcla mediante un agitador vorticial. Los virus AAV-GAD65-modi, AAV-GDNF-IL-10, AAV-GAD65, AAV-IL-10 y AAV-GDNF se diluyeron en PBS para obtener los títulos que se muestran en la Tabla 7. Los virus que se requirieron se mezclaron de acuerdo con los contenidos que se muestran en la Tabla 7 y se administraron en una cantidad de 1,0 * 109 vg/5 pl o 1,5 * 109 vg/5 pl por animal.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica para el uso en el alivio o tratamiento del dolor que comprende dos o más que se seleccionan del grupo que consiste en un gen que codifica la glutamato descarboxilasa (GAD), un gen que codifica la interleucina 10 (IL-10) y un gen que codifica un factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF).
2. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen está en una forma contenida operativamente en un vector.
3. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el vector es al menos un vector viral que se selecciona del grupo que consiste en adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes simple, lentivirus, retrovirus y poxvirus; o en donde el vector es al menos un vector no viral que se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, un liposoma, un polímero catiónico, una micela, una emulsión y nanopartículas lipídicas sólidas.
4. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la GAD es GAD65 o GAD67.
5. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen que codifica GAD es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 34 o la SEQ ID NO: 36.
6. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen que codifica GAD es la secuencia de nucleótidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 35 o la SEQ ID NO: 37.
7. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen que codifica IL-10 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 40 o la SEQ ID NO: 42.
8. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen que codifica IL-10 es la secuencia de nucleótidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 41 o la SEQ ID NO: 43.
9. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen que codifica GDNF es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 46 o la SEQ ID NO: 48.
10. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen que codifica GDNF es la secuencia de nucleótidos que se representa mediante la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 47 o la SEQ ID NO: 49.
11. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el dolor es dolor nociceptivo, dolor psicógeno, dolor inflamatorio, dolor patológico, dolor neuropático, dolor del cáncer, dolor posoperatorio, dolor de la neuralgia del trigémino, dolor idiopático, dolor de la neuropatía diabética o migraña.
12. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica comprende adicionalmente un portador fisiológicamente aceptable; o en donde la composición farmacéutica es una inyección.
13. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica se formula para la administración mediante inyección epidural o inyección intratecal.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3112883A1 (en) 2018-10-25 2020-04-30 Baxalta Incorporated Aav triple-plasmid system
EP3927728A2 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Xencor, Inc. Untargeted and targeted il-10 fc-fusion proteins
CA3180304A1 (en) * 2020-05-28 2021-12-02 Kenan Christopher GARCIA Engineered interleukin-10 polypeptides and uses thereof
EP4306124A4 (en) * 2021-03-12 2025-03-12 Kolon Life Science, Inc. Composition for preventing or treating degenerative brain diseases

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7261882B2 (en) * 2003-06-23 2007-08-28 Reagents Of The University Of Colorado Methods for treating neuropathic pain by administering IL-10 polypeptides
AU2005302408B2 (en) * 2004-10-28 2012-08-09 The Government of the United States of America as represented by the Department of Veterans Affairs Peripherally delivered glutamic acid decarboxylase gene therapy for spinal cord injury pain
RU2433825C2 (ru) * 2004-12-06 2011-11-20 Медисинова, Инк. Способ лечения невропатической боли и связанных с ней синдромов
CA2610164A1 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 Neurologix, Inc. Novel glutamic acid decarboxylase (gad) chimera and methods of use
KR20080007968A (ko) * 2006-07-19 2008-01-23 연세대학교 산학협력단 Ｇａｄ65를 발현하는 재조합 벡터를 포함하는 신경병증성통증 완화용 조성물
WO2008010637A1 (en) * 2006-07-19 2008-01-24 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Composition for attenuating neuropathic pain comprising a recombinant vector expressing gad65
FI20070808A0 (fi) * 2007-10-25 2007-10-25 Mart Saarma GDNF:n silmukointivariantit ja niiden käytöt
CN101586096A (zh) * 2008-05-21 2009-11-25 王尚武 一种共表达人源谷氨酸脱羧酶和细胞因子的重组病毒
EP2457579A1 (en) * 2010-11-26 2012-05-30 Technische Universität Dresden Covalently linked interleukin -10
MX341578B (es) * 2011-02-08 2016-08-25 Abbvie Inc Tratamiento de la osteoartritis y del dolor.
KR20170034701A (ko) * 2015-09-21 2017-03-29 코오롱생명과학 주식회사 통증 치료용 조성물

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