ES2905686T3 - Control de mezclas de amplificación de recombinasa polimerasa - Google Patents

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Abstract

Procedimiento que comprende (A) proporcionar una mezcla que comprende (a) una primera población de estructuras microscópicas con la apariencia de partículas que comprenden una recombinasa, una proteína de unión a ADN de cadena única (SSB) y un primer oligonucleótido que comprende un primer marcador detectable ; y (b) una segunda población de estructuras microscópicas con apariencia de partículas que comprenden una recombinasa, una proteína de unión a ADN de cadena única (SSB) y un segundo oligonucleótido que comprende un segundo marcador detectable, en la que: el primero y el segundo oligonucleótidos son diferentes, el primero y el segundo marcadores detectables son diferentes, y la primera y segunda poblaciones de estructuras microscópicas con apariencia de partículas pueden detectarse independientemente en la mezcla, en la que la mezcla comprende un agente aglomerante y: i. UvsX y UvsY; o ii. UvsX y gp32; y (B) detectar estructuras microscópicas con apariencia de partículas en la mezcla.

Description

DESCRIPCIÓN
Control de mezclas de amplificación de recombinasa polimerasa
CAMPO TÉCNICO
[0001] Esta divulgación se refiere a procedimientos y composiciones para detección, amplificación y cuantificación de ácido nucleico.
ANTECEDENTES
[0002] Determinados procedimientos isotérmicos de amplificación son capaces de amplificar un ácido nucleico molde (diana) de una manera específica desde niveles de trazas hasta niveles muy altos y detectables en unos pocos minutos. Tales procedimientos isotérmicos, por ejemplo, Amplificación de la Recombinasa Polimerasa (RPA) puede ampliar la aplicación del diagnóstico basado en ácidos nucleicos en áreas emergentes, tales como prueba de “point of care” y prueba de campo y usuario. La naturaleza isotérmica y el rango amplio de temperaturas de las tecnologías pueden permitir a los usuarios evitar el uso de instrumentación compleja que necesita potencia.
CARACTERÍSTICAS
[0003] La presente divulgación se basa, al menos en parte, en la observación de partículas dentro de mezclas de RPA. En algunas realizaciones, estas partículas pueden incluir ácidos nucleicos (por ejemplo, oligonucleótidos) y/o componentes de proteínas de la reacción de RPA. Este descubrimiento proporciona nuevos procedimientos de control y detección relacionados con RPA.
[0004] En un aspecto, esta divulgación presenta procesos que incluyen: (a) proporcionar una mezcla que incluye uno o más de (por ejemplo, dos o más de, o todos de) una recombinasa, una proteína de unión a ADN de cadena única, y uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, oligonucleótidos) (en cualquier combinación); y (b) detectar partículas en la mezcla de reacción. En algunas realizaciones, la mezcla incluye un agente aglomerante, por ejemplo, uno o más de polietilenglicol (por ejemplo, PEG1450, PEG3000, PEG8000, PEG10000, PEG14000, PEG15000, PEG20000, PEG250000, p Eg 30000, PEG35000, PEG40000, compuesto PEG con peso molecular entre 15.000 y 20.000 daltons o combinaciones de los mismos), alcohol polivinílico, dextrano y ficol. En algunas realizaciones, el agente aglomerante está presente en la mezcla de reacción a una concentración entre 1 y 12 % en peso o en volumen de la mezcla de reacción, por ejemplo, entre cualquiera de dos valores de concentración seleccionados entre 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5%, 10,0%, 10,5%, 11,0%, 11,5% y 12,0%.
[0005] En algunas realizaciones de todos los aspectos, la recombinasa incluye una recombinasa RecA o UvsX. En algunas realizaciones de todos los aspectos, la proteína de unión a ADN de cadena única incluye una proteína SSB procariota o una proteína gp32. En algunas realizaciones de todos los aspectos, al menos uno de los uno o más de ácidos nucleicos (por ejemplo, oligonucleótidos) incluye un marcador detectable.
[0006] En algunas realizaciones de todos los aspectos, las partículas incluyen uno o más (por ejemplo, dos o más, o todos) de una recombinasa, una proteína de unión de cadena única y al menos uno del uno o más ácidos nucleicos (en cualquier combinación). En algunas realizaciones de todos los aspectos, la mezcla de reacción incluye una recombinasa, una proteína de unión de cadena única, una polimerasa, dNTPs, ATP, un cebador y un ácido nucleico molde.
[0007] En algunas realizaciones de todos los aspectos, la mezcla incluye uno o más (por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más o todos) de una recombinasa, una ADN polimerasa, una proteína de unión de cadena única, una proteína de carga de recombinasa, ATP, dNTPs o una mezcla de dNTPs y ddNTPs, un agente reductor, creatina quinasa, una nucleasa (por ejemplo, una exonucleasa III o endonucleasa IV), una transcriptasa inversa, un sonda de ácido nucleico, un cebador de ácido nucleico y un ácido nucleico molde (en cualquier combinación).
[0008] En algunas realizaciones de todos los aspectos, las partículas incluyen una polimerasa, dNTPs, ATP, un cebador y un ácido nucleico molde. En algunas realizaciones de todos los aspectos, las partículas incluyen una recombinasa, una polimerasa, dNTPs, ATP, un cebador y un ácido nucleico molde. En algunas realizaciones de todos los aspectos, las partículas incluyen una recombinasa, una proteína de unión de cadena única, una polimerasa, dNTPs, ATP, un cebador y un ácido nucleico molde. En algunas realizaciones de todos los aspectos, las partículas incluyen una polimerasa, dNTPs y ATP, y uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis) agentes adicionales seleccionados del grupo de una sonda, un cebador, una proteína de unión de cadena única, ddNTPs, un agente reductor, creatina quinasa, una nucleasa y una transcriptasa inversa. En algunas realizaciones de todos los aspectos, las partículas incluyen una recombinasa, una polimerasa, una transcriptasa inversa, dNTPs, ATP, un cebador y un ácido nucleico molde.
[0009] En algunas realizaciones de todos los aspectos, las partículas son de aproximadamente 0,5-20 |jm de tamaño, por ejemplo, entre aproximadamente cualquiera de dos tamaños seleccionados entre 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18 y 20 jm (por ejemplo, aproximadamente 1-10 jm de tamaño).
[0010] En algunas realizaciones de todos los aspectos, se detectan aproximadamente de 10 a 5000 partículas/nl, por ejemplo, entre cualquiera de dos números de partículas seleccionados entre 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 y 5000 partículas por nl.
[0011] En algunas realizaciones de los aspectos, la detección de partículas en la mezcla incluye el uso uno o más de microscopía, un dispositivo microfluídico, citometría de flujo y una cámara. En algunas realizaciones de todos los aspectos, las partículas se detectan utilizando detección por acoplamiento de carga (CCD).
[0012] En otro aspecto, la divulgación presenta un proceso que incluye: (a) proporcionar una mezcla de reacción de amplificación de recombinasa polimerasa; (b) mantener la mezcla de reacción bajo las condiciones que permiten la producción de productos de amplificación de ácido nucleico en la mezcla de reacción; y (c) detectar las partículas asociadas con los productos de amplificación de ácido nucleico en la mezcla de reacción. En algunas realizaciones, la detección se realiza dentro de 10 minutos (por ejemplo, dentro de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1,5 o 1 minuto) a partir de que empieza el mantenimiento.
[0013] En algunas realizaciones de todos los aspectos, la mezcla de reacción incluye un agente aglomerante, por ejemplo, uno o más de polietilenglicol (por ejemplo, PEG1450, PEG3000, PEG8000, PEG10000, PEG14000, PEG15000, PEG20000, PEG250000, PEG30000, p Eg 35000, PEG40000, compuesto PEG con peso molecular entre 15.000 y 20.000 daltons o combinaciones de los mismos), alcohol polivinílico, dextrano y ficol. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción contiene polietilenglicol como agente aglomerante (por ejemplo, cualquiera de los compuestos PEG descritos en el presente documento o conocidos en la técnica). En algunas realizaciones, la mezcla de reacción contiene alcohol polivinílico como un agente aglomerante. En algunas realizaciones, el agente aglomerante está presente en la mezcla de reacción a una concentración entre 1 y 12 % en peso o en volumen de la mezcla de reacción, por ejemplo, entre cualquiera de dos valores de concentración seleccionados entre 1,0 %, 1,5 %, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5%, 10.0 %, 10,5 %, 11,0 %, 11,5 % y 12,0 %. En algunas realizaciones, el agente aglomerante está presente en la mezcla de reacción a una concentración que es suficiente para aumentar la cantidad de amplificación en la mezcla de reacción.
[0014] En algunas realizaciones de todos los aspectos, las partículas incluyen uno o más (por ejemplo, dos o más, o todos) de la recombinasa, la proteína de unión de cadena única y al menos uno de uno o más ácidos nucleicos (en cualquier combinación).
[0015] En algunas realizaciones de todos los aspectos, la mezcla de reacción incluye uno o más (por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más o todos) de una ADN polimerasa, una proteína de carga de recombinasa, ATP, dNTPs o una mezcla de dNTPs y ddNTPs, un agente reductor, creatina quinasa, una nucleasa (por ejemplo, una exonucleasa III o endonucleasa IV), una proteína de unión de cadena única, un cebador de ácido nucleico, una sonda de ácido nucleico, transcriptasa inversa y un ácido nucleico molde (en cualquier combinación).
[0016] En algunas realizaciones de todos los aspectos, la mezcla de reacción contiene una recombinasa, una proteína de unión de cadena única y uno o más oligonucleótidos. En algunas realizaciones de todos los aspectos, la mezcla de reacción incluye una recombinasa, una proteína de unión de cadena única, una polimerasa, dNTPs, ATP, un cebador y un ácido nucleico molde.
[0017] En algunas realizaciones de todos los aspectos, la mezcla de reacción incluye una polimerasa, dNTPs, ATP, un cebador y un ácido nucleico molde. En algunas realizaciones de todos los aspectos, la mezcla de reacción incluye una recombinasa, una polimerasa, dNTPs, ATP, un cebador y un ácido nucleico molde. En algunas realizaciones de todos los aspectos, la mezcla de reacción incluye una recombinasa, una proteína de unión de cadena única, una polimerasa, dNTPs, ATP, un cebador y un ácido nucleico molde. En algunas realizaciones de todos los aspectos, la mezcla de reacción incluye una polimerasa, dNTPs y ATP, y uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis) agentes adicionales seleccionados del grupo de una sonda, un cebador, una proteína de unión de cadena única, ddNTPs, un agente reductor, creatina quinasa, una nucleasa y una transcriptasa inversa. En algunas realizaciones de todos los aspectos, la mezcla de reacción incluye una recombinasa, una polimerasa, una transcriptasa inversa, dNTPs, ATP, un cebador y un ácido nucleico molde. En algunas realizaciones de todos los aspectos, las partículas son de aproximadamente 0,5-20 jm de tamaño, por ejemplo, entre aproximadamente cualquiera de dos tamaños seleccionados entre 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18 y 20 jm (por ejemplo, aproximadamente 1-10 jm de tamaño).
[0018] En algunas realizaciones de todos los aspectos, se detectan aproximadamente de 10 a 5000 partículas/nl, por ejemplo, entre cualquiera de dos números de partículas seleccionados entre 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 y 5000 partículas por nl.
[0019] En algunas realizaciones de todos los aspectos, la detección incluye la determinación de un número o de una proporción de partículas asociadas con productos de amplificación de ácidos nucleicos en la mezcla de reacción y, opcionalmente, la determinación o la estimación de la concentración de ácido nucleico molde en la mezcla original mediante la misma. En algunas realizaciones, la detección incluye la detección de partículas únicas asociadas con dos o más productos distintos de amplificación de ácido nucleico.
[0020] En otro aspecto, la divulgación presenta composiciones que incluyen (a) una primera población de partículas que incluye una primera recombinasa, una primera proteína de unión a ADN de cadena única y un primer oligonucleótido; y (b) una segunda población de partículas que incluye una segunda recombinasa, una segunda proteína de unión a ADN de cadena única y un segundo oligonucleótido, en la que el primero y el segundo oligonucleótidos son diferentes. En algunas realizaciones, al menos uno del primero y segundo oligonucleótidos incluye un marcador detectable. En algunas realizaciones, el primero y el segundo oligonucleótidos incluyen el mismo o diferentes marcadores detectables. La primera y la segunda proteínas de unión a ADN de cadena única pueden ser la misma o distinta una de la otra. La primera y la segunda recombinasas pueden ser la misma o distinta una de la otra.
[0021] En algunas realizaciones de todos los aspectos, las partículas son de aproximadamente 0,5-20 pm de tamaño, por ejemplo, entre aproximadamente cualquiera de los tamaños seleccionados entre 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18 y 20 pm (por ejemplo, aproximadamente 1-10 pm de tamaño).
[0022] En algunas realizaciones de todos los aspectos, están presentes en las composiciones aproximadamente de 10 a 5000 partículas/nl, por ejemplo, entre cualquiera de dos números de partículas seleccionados entre 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 y 5000 partículas por nl. Las composiciones incluyen un agente aglomerante, por ejemplo, uno o más de polietilenglicoles (por ejemplo, PEG1450, p Eg 3000, PEG8000, PEG10000, PEG14000, PEG15000, PEG20000, PEG250000, PEG30000, PEG35000, PEG40000, compuesto PEG con peso molecular entre 15.000 y 20.000 daltons o combinaciones de los mismos), alcohol polivinílico, dextrano y ficol. En algunas realizaciones, el agente aglomerante está presente en la composición a una concentración entre 1 y 12 % en peso o en volumen de la mezcla de reacción, por ejemplo, entre cualquiera de dos valores de concentración seleccionados entre 1,0 %, 1,5 %, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5%, 10.0 %, 10,5 %, 11,0 %, 11,5 % y 12,0 %.
[0023] En algunas realizaciones de todos los aspectos, las composiciones incluyen además uno o más (por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más o todos) de una ADN polimerasa, una proteína de carga de recombinasa, ATP, dNTP o una mezcla de dNTP y ddNTP, un agente reductor, creatina quinasa, una nucleasa (por ejemplo, una exonucleasa III o endonucleasa IV), una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico molde (en cualquier combinación).
[0024] En algunos aspectos, la divulgación presenta composiciones que incluyen uno o más oligonucleótidos descritos en el presente documento y variantes de los mismos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden utilizarse como cebadores y/o sondas de detección en procedimientos de amplificaciones de ácido nucleico (por ejemplo, amplificaciones isotérmicas de ácido nucleico, tales como RPA). Los oligonucleótidos descritos en el presente documento pueden incluir uno o más marcadores detectables. Cuando un oligonucleótido se describe como el que incluye uno o más marcadores detectables, pueden utilizarse marcadores alternativos en las mismas posiciones o en posiciones diferentes dentro del oligonucleótido (por ejemplo, en un posición dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o 30 bases 5' o 3' de la posición descrita). En algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden incluir uno o más miméticos de sitios abásicos. Cuando un oligonucleótido incluye uno o más miméticos de sitos abásicos, pueden incluirse miméticos de sitios abásicos alternativos en la misma posición o en posiciones diferentes dentro del oligonucleótido (por ejemplo, en una posición dentro de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o 30 bases 5' o 3' de la posición descrita). En algunas realizaciones, una variante de un oligonucleótido descrita en el presente documento tiene doce o menos (por ejemplo, once o menos, diez o menos, nueve o menos, ocho o menos, siete o menos, seis o menos, cinco o menos, cuatro o menos, tres o menos, dos o menos o uno o menos) inserciones, eliminaciones, sustituciones y/o adiciones en comparación con la secuencia de oligonucleótidos descrita. En algunas realizaciones, una variante de un oligonucleótido descrita en el presente documento tiene una secuencia de al menos 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, o 95 %) idéntica a la secuencia de oligonucleótido descrita.
[0025] En algunas realizaciones, las partículas se detectan utilizando fluorescencia de las partículas.
[0026] En algunas realizaciones, las partículas se detectan sin utilizar fluorescencia de las partículas.
[0027] En algunas realizaciones, las partículas se detectan utilizando fluorescencia de las partículas, microscopía de contraste de fases, detección luminiscente, detección espectral (color), detección magnética, detección radioisotópica y/o detección electroquímica. En algunas realizaciones, las partículas pueden detectarse utilizando una combinación de dos o más (por ejemplo, dos, tres o cuatro) de fluorescencia de las partículas, microscopía de contraste de fases, detección luminiscente, detección espectral (color), detección magnética, detección radioisotópica y detección electroquímica.
[0028] En algunas realizaciones, algunas de las partículas se detectan utilizando fluorescencia de esas partículas y otras de las partículas se detectan sin utilizar fluorescencia de esas otras partículas. Por ejemplo, las partículas incluyen un primer subconjunto de partículas y un segundo subconjunto de partículas. El primer subconjunto de partículas se detecta utilizando fluorescencia del primer subconjunto de partículas y el segundo subconjunto de partículas se detecta sin utilizar fluorescencia del segundo subconjunto de partículas (por ejemplo, microscopía de contraste de fases, detección luminiscente, detección espectral (color), detección magnética, detección radioisotópica y/o detección electroquímica).
[0029] En otro aspecto, la divulgación presenta una población de partículas que incluye una recombinasa, una proteína de unión a ADN de cadena única y un oligonucleótido, en la que algunas de las partículas se detectan utilizando fluorescencia de esas partículas y otra de las partículas se detecta sin utilizar fluorescencia de esas otras partículas.
[0030] También se proporcionan equipos que incluyen una recombinasa, una proteína de unión a ADN de cadena única y un oligonucleótido para su uso en cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. También se proporcionan equipos que incluyen cualquiera de las partículas o las composiciones descritas en el presente documento y las instrucciones para realizar cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
[0031] Los procesos y las composiciones descritas en el presente documento pueden utilizarse para la detección de ácidos nucleicos, por ejemplo, ácidos nucleicos bacterianos, ácidos nucleicos de mamíferos, ácidos nucleicos de virus, ácidos nucleicos fúngicos o ácidos nucleicos protozoarios y para el diagnóstico de trastornos o enfermedades asociados con tales ácidos nucleicos.
[0032] Tal como se utiliza en el presente documento, el "tamaño" de una partícula hace referencia a la dimensión en la sección transversal más grande de la partícula.
[0033] Tal como se utiliza en el presente documento, un "oligonucleótido" hace referencia a un polímero de ácido nucleico que contiene al menos 10 (por ejemplo, al menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100) unidades de bases. En algunas realizaciones, el oligonucleótido contiene un total de menos de 1 kb, 900 unidades de bases, 800 unidades de bases, 700 unidades de bases, 600 unidades de bases, 500 unidades de bases, 400 unidades de bases, 300 unidades de bases, 200 unidades de bases o 100 unidades de bases. En algunas realizaciones, un oligonucleótido puede tener 90 o menos, 80 o menos, 70 o menos, 60 o menos, 50 o menos, 40 o menos, 30 o menos o 20 o menos unidades de bases. En algunas realizaciones, un oligonucleótido tiene al menos 10, 12, 14, 16, 18 o 20 unidades de bases.
[0034] Tal como se utiliza en el presente documento, "citometría" hace referencia a procedimientos y composiciones para detectar, visualizar y analizar las propiedades de partículas. El término tal como se utiliza en el presente documento no indica la presencia de células. Sin embargo, los procedimientos y las composiciones utilizados para detectar, visualizar y analizar las propiedades de células pueden aplicarse a las partículas descritas en el presente documento.
[0035] Tal como se utiliza en el presente documento, un "mimético de sitio abásico" hace referencia a una posición de subunidad dentro de un polímero de ácido nucleico en el que está presente un azúcar o un resto de azúcar modificado (por ejemplo, glucosa o desoxiglucosa) y el carbono 1' del azúcar o el resto de azúcar modificado no está unido de manera covalente a una estructura con base cíclica (por ejemplo, adenina, guanina, citosina, timina, uracilo o versiones modificadas de los mismos). En algunas realizaciones, el carbono 1' del azúcar o el resto de azúcar modificado está unido de manera covalente a un hidrógeno (por ejemplo, tetrahidrofurano). En algunas realizaciones, el carbono 1' del azúcar o el resto de azúcar modificado está unido de manera covalente a otro carbono que no está presente en una estructura con base cíclica. En algunas realizaciones, el carbono 1' del azúcar o el resto de azúcar modificado está unido de manera covalente a una estructura con enlazador no cíclico. En algunas realizaciones, un mimético de sitio abásico es reconocido por una enzima que procesa y modifica miméticos de sitios abásicos debido a la similitud estructural con un sitio abásico (es decir, falta de un grupo base voluminoso unido al azúcar).
[0036] Aunque se puede utilizar cualquier procedimiento y material similar o equivalente a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o la prueba de la presente invención, se describen a continuación los procedimientos y los materiales adecuados. Adicionalmente, los materiales, procedimientos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
[0037] Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0038]
Las Figuras 1A-1C son micrografías que muestran un campo único de una mezcla que incluye partículas. La barra de escala indica 100 pm. 1A, contraste de interferencia diferencial (DIC). 1B, fluorescencia. 1C, fusión.
Las Figuras 2A-2C son micrografías que muestran un campo único de una mezcla que incluye partículas y un ácido nucleico molde. La barra de escala indica 100 pm. 2A, DIC. 2B, fluorescencia. 2C, fusión.
Las Figuras 3A-3H son micrografías de fluorescencia que muestran mezclas que incluyen las concentraciones indicadas de polietilenglicol (PEG).
Las Figuras 4A-4F son micrografías que muestran mezclas que incluyen partículas. 4A y 4B son una mezcla estándar.
4C y 4D son la mezcla estándar que excluye UvsX. 4E y 4F son la mezcla estándar que excluye gp32. 4A, 4C, 4E, DIC. 4B, 4D, 4F, fluorescencia.
Las Figuras 5A-5H son micrografías que muestran mezclas que incluyen partículas. 5A y 5B son la mezcla estándar como en 4A y 4B, pero excluyendo UvsY. 5C y 5D son la mezcla estándar que excluye polimerasa. 5E y 5F son la mezcla estándar que excluye creatina quinasa. 5G y 5H son la mezcla estándar que excluye exonucleasa III. 5A, 5C, 5E, 5G. DIC. 5B, 5d , 5F, 5H, fluorescencia.
Las Figuras 6A-6C son conjuntos de micrografías que muestran mezclas. 6A, dos campos que muestran mezcla completa. 6B, dos campos que muestran mezcla completa, que excluye gp32 y UvsY 6C, dos campos que muestran mezcla completa que excluye gp32, UvsY y Emix (50 mM de Fosfocreatina, 2,5 mM deATP). Para cada conjunto: la parte superior, DIC; la parte inferior, fluorescencia.
Las Figuras 7A-7F son micrografías que muestran una mezcla que incluye partículas preparadas con dos oligonucleótidos marcados. 7A, Fluorescencia con rojo Texas. 7B, fusión de DIC y rojo Texas. 7C, fluorescencia de FAM. 7D, fusión de DIC y FAM. 7E, DIC. 7F, fusión de rojo Texas y FAM.
Las Figuras 8A-8F son micrografías que muestran una mezcla que incluye dos conjuntos de partículas con dos oligonucleótidos marcados preparados de manera independiente y, a continuación, se mezclan. 8A, Fluorescencia con rojo Texas. 8B, fusión de DIC y rojo Texas. 8C, fluorescencia de FAM. 8D, fusión de DIC y FAM. 8E, DIC. 8F, fusión de rojo Texas y FAM.
La Figura 9 es una línea de tiempo de micrografías que muestran partículas durante una reacción de amplificación. La Figura 10 es una línea de tiempo de micrografías que muestran partículas durante una reacción de amplificación. La Figura 11 es una línea de tiempo de micrografías que muestran partículas durante una reacción de amplificación visualizada mediante DIC/FAM y DIC/rojo Texas.
Las Figuras 12A-12D son conjuntos de micrografías que muestran mezclas que incluyen partículas con un aumento de 20x. 12A, mezcla que incluye T6 H66S UvsX y UvsY. 12A, mezcla que incluye T6 H66S UvsX sin UvsY. 12C, mezcla que incluye T6 UvsX y UvsY. 12D, mezcla que incluye T6 UvsX sin UvsY. Para cada conjunto en la parte superior, DIC; la parte inferior, fluorescencia.
Las Figuras 13A-13D son conjuntos de micrografías que muestran mezclas que incluyen partículas con un aumento de 40x. 13A, mezcla que incluye T6 H66S UvsX y UvsY. 13B, mezcla que incluye T6 H66S UvsX sin UvsY. 13C, mezcla que incluye T6 UvsX y UvsY. 13D, mezcla que incluye T6 UvsX sin UvsY. Para cada conjunto: la parte superior, DIC; la parte inferior, fluorescencia.
Las Figuras 14A-14B son gráficos de líneas que muestran reacciones de amplificación en mezclas que incluyen T6 H66S UvsX y UvsY (std UvsX UvsY), T6 H66S UvsX sin UvsY (std UvsX - UvsY), T6 UvsX y UvsY (T6 UvsX UvsY) y T6 UvsX sin UvsY (T6 UvsX -UvsY). 14A, 500 copias de molde. 14B, 50 copias de molde.
La Figura 15 es un gráfico de líneas que muestra reacciones de amplificación en las mezclas que incluyen T6 H66S UvsX y UvsY (std UvsX UvsY), T6 H66S UvsX sin UvsY (std UvsX - UvsY), T6 UvsX y UvsY (T6 UvsX UvsY) y T6 UvsX sin UvsY (T6 UvsX -UvsY).
Las Figuras 16A-16B son gráficos de líneas que muestran reacciones de amplificación en las mezclas que incluyen T6 H66S UvsX y UvsY (std UvsX UvsY), T6 H66S UvsX sin UvsY (std UvsX - UvsY), T6 UvsX y UvsY (T6 UvsX UvsY) y T6 UvsX sin UvsY (T6 UvsX -UvsY).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0039] Bajo la inspección microscópica, se observaron estructuras con la apariencia de partículas en las mezclas de RPA. Durante el progreso de la reacción de amplificación de ácido nucleico de RPA, las partículas se asocian con los puntos de amplificación activa.
[0040] Las partículas observadas estaban típicamente en el intrvalo de 1-10 pm de tamaño y estaban presentes a una concentración de aproximadamente 100-500 partículas/nl. Se encontró que las partículas contenían oligonucleótidos presentes en las mezclas. La formación de partículas no requería la presencia de magnesio. Sin embargo, las partículas formadas en ausencia de una recombinasa o una proteína de unión a ADN de cadena única tenían una morfología alterada. La formación de las partículas en ausencia de otros agentes, tales como proteína de carga de recombinasa, ADN polimerasa, creatina quinasa o exonucleasas, no afectan de manera significativa la morfología de partículas. Adicionalmente, la formación de partícula fue más eficaz en presencia de agentes aglomerantes.
[0041] Se observó que las partículas eran relativamente estables en solución. Las poblaciones separadas de partículas podían mezclarse y permanecían separadas durante un periodo de tiempo después del mezclado.
Amplificación de recombinasa Polimerasa
[0042] La RPA es un procedimiento de amplificación (por ejemplo, amplificación isotérmica) de ácidos nucleicos. Por lo general, durante una primera etapa de la RPA una recombinasa entra en contacto con un primero y un segundo cebador de ácido nucleico para formar primeros y segundos cebadores de nucleoproteínas. Por lo general, durante una segunda etapa el primero y el segundo cebadores de nucleoproteínas entran en contacto con un ácido nucleico molde de doble cadena para formar una primera estructura de doble cadena en una primera parte de la primera cadena del ácido nucleico molde, y una segunda estructura de doble cadena en una segunda parte de la segunda cadena del ácido nucleico molde, de tal modo que los extremos 3' del primer cebador de ácido nucleico y el segundo cebador de ácido nucleico se orientan uno hacia el otro en una molécula de ADN determinada. Por lo general, durante una tercera etapa el extremo 3' del primero y el segundo cebadores de nucleoproteínas se extienden mediante ADN polimerasas para generar primeros y segundos ácidos nucleicos de doble cadena y la primera y la segunda cadenas desplazadas de ácido nucleico. Generalmente, la segunda y la tercera etapas pueden repetirse hasta que se alcance un grado deseado de amplificación.
[0043] Tal como se describe en el presente documento, la RPA utiliza enzimas, conocidas como recombinasas, que son capaces de emparejar cebadores de oligonucleótidos con secuencias homólogas en un ADN de doble cadena molde. De este modo, la síntesis de ADN está dirigida para definir los puntos en un ADN de doble cadena molde. Utilizando dos o más cebadores específicos de secuencias (por ejemplo, específicos de genes), de inicia una reacción de amplificación exponencial si está presente el ácido nucleico molde. La reacción avanza con rapidez y da lugar a una amplificación específica de una secuencia presente dentro del ADN de doble cadena molde a partir de solamente unas pocas copias del ADN molde hasta niveles detectables de los productos amplificados en minutos. Los procedimientos de RPA se dan a conocer, por ejemplo, en los documentos US 7.270.981; US 7.399.590; US 7.666.598; US 7.435.561; US 2009/0029421; y WO 2010/141940.
[0044] Las reacciones de RPA contienen una mezcla de proteínas y otros factores que apoyan tanto la actividad del elemento de recombinación del sistema, como aquellos que apoyan la síntesis de ADN desde los extremos 3' de oligonucleótidos emparejados con sustratos complementarios. En algunas realizaciones, la reacción de RPA contiene una mezcla de una recombinasa, una proteína de unión de cadena única, una polimerasa, dNTPs, ATP, un cebador y un ácido nucleico molde. En algunas realizaciones, una reacción de RPA puede incluir uno o más de los siguientes (en cualquier combinación): al menos una recombinasa; al menos una proteína de unión a ADN de cadena única; al menos una ADN polimerasa; dNTPs o una mezcla de dNTPs y ddNTPs; un agente aglomerante; un tampón; un agente reductor; ATP o análogo de ATP; al menos una proteína de carga de recombinasa; un primer cebador y, opcionalmente, un segundo cebador; una sonda; una transcriptasa inversa; y una molécula de ácido nucleico diana, por ejemplo, un ácido nucleico de cadena única (por ejemplo, ARN) o de doble cadena. En algunas realizaciones, las reacciones de RPA pueden contener, por ejemplo, una transcriptasa inversa. Los ejemplos no limitativos adicionales de mezclas de reacción de RPA se describen en el presente documento.
[0045] En algunas realizaciones, las reacciones de RPA pueden contener una proteína UvsX, una proteína gp32 y una proteína UvsY. Cualquiera de los procesos, las composiciones o las partículas descritas en el presente documento puede contener, en parte, por ejemplo, una proteína UvsX, una proteína gp32 y una proteína UvsY. Por ejemplo, cualquiera de los procesos, las composiciones o las partículas descritas en el presente documento puede contener, en parte, T6H66S UvsX, Rb69 gp32, y Rb69 UvsY.
[0046] En algunas realizaciones, las reacciones de RPA pueden contener una proteína UvsX y una proteína gp32. Por ejemplo, cualquiera de los procesos, las composiciones o las partículas descritos en el presente documento puede contener, en parte, por ejemplo, una proteína UvsX y una proteína gp32.
[0047] Un componente de proteína de una reacción de RPA es una recombinasa, que puede tener un origen procariota, vírico o eucariota. Las recombinasas de ejemplo incluyen RecA y UvsX (por ejemplo, una proteína RecA o una proteína UvsX obtenidas de cualquier especie) y fragmentos o mutantes de las mismas y combinaciones de las mismas. Las proteínas RecA y UvsX pueden obtenerse de cualquier especie. Los fragmentos RecA y UvsX o proteínas mutantes pueden también producirse utilizando la proteína RecA y UvsS disponible y secuencias de ácidos nucleicos y técnicas de biología molecular (véanse, por ejemplo, las formas mutantes de UvsX descritas en la Patente de Estados Unidos Número 8.071.308). Las proteínas UvsX de ejemplo incluyen aquellas derivadas de fagos myoviridae, tales como T4, T2, T6, Rb69, Aehl, KVP40, fago 133 de Acinetobacter, fago 65 de Aeromonas, cianófago P-SSM2, cianófago PSSM4, cianófago S-PM2, Rbl4, Rb32, fago 25 de Aeromonas, fago Vibrio nt-1, phi-1, Rb16, Rb43, Fago 31, fago 44RR2.8t, Rb49, fago Rb3 y fago LZ2. Las proteínas de recombinasa de ejemplo adicionales incluyen proteínas RADA y RADB arqueobacterianas y proteínas Rad51 eucariotas (por ejemplo, de planta, mamífero y hongo) (por ejemplo, RAD51, RAD51B, RAD51C, rAD51D, DMC1, XRCC2, XRc C3, y recA) (véanse, por ejemplo, Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:10328-10333, 2006).
[0048] En cualquier proceso de esta divulgación, la recombinasa (por ejemplo, UvsX) puede ser una recombinasa mutante o híbrida. En algunas realizaciones, la UvsX mutante es una UvsX Rb69 que incluye al menos una mutación en la secuencia de aminoácidos de UvsX Rb69, en la que la mutación se selecciona del grupo que consiste en (a) un aminoácido que no es histidina en posición 64, una serina en posición 64, la adición de uno o más residuos de ácido glutámico en el extremo C-terminal, la adición de uno o más residuos de ácido aspártico en el extremo C-terminal y una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la UvsX mutante es una UvsX T6 que tiene al menos una mutación en la secuencia de aminoácidos de UvsX T6, en la que la mutación selecciona del grupo que consiste en (a) un aminoácido que no es histidina en posición 66; (b) una serina en posición 66; (c) la adición de uno o más residuos de ácido glutámico en el extremo C-terminal; (d) la adición de uno o más residuos de ácido aspártico en el extremo C-terminal; y (e) una combinación de los mismos. Cuando se utiliza una proteína híbrida de recombinasa, la proteína híbrida puede, por ejemplo, ser una proteína UvsX que incluye al menos una región que incluye una secuencia de aminoácidos derivada de una especie diferente de UvsX. La región puede ser, por ejemplo, la región 2 de bucle que se une a ADN de UvsX.
[0049] Adicionalmente, pueden utilizarse una o más proteínas de unión a ADN de cadena única para estabilizar ácidos nucleicos durante diferentes reacciones de intercambio que suceden en la reacción. La una o más proteínas de unión a ADN de cadena única pueden provenir u obtenerse a partir de cualquier especie, por ejemplo, de una especie procariota, vírica o eucariota. Las proteínas de unión a ADN de cadena única de ejemplo incluyen E. coli SSB y aquellas obtenidas de fagos myoviridae, tales como T4, T2, T6, Rb69, Aehl, KVP40, fago 133 de Acinetobacter, fago 65 de Aeromonas, cianófago P-SSM2, cianófago PSSM4, cianófago S-PM2, Rbl4, Rb32, fago 25 de Aeromonas, fago de Vibrio nt-1, phi-1, Rb16, Rb43, Fago 31, fago 44RR2,8t, Rb49, fago Rb3 y fago LZ2. Los ejemplos adicionales de proteínas de unión a ADN de cadena única incluyen Alide_2047 de A. denitrificans, BthaB_33951 de Burkholderia thailandensis, HMPREF9144_0124 de Prevotella pallens, y proteína de replicación A como proteína de unión a ADN de cadena única eucariota.
[0050] La ADN polimerasa puede ser una polimerasa eucariota o procariota. Los ejemplos de polimerasas eucariotas incluyen pol-alfa, pol-beta, pol-delta, pol-épsilon y mutaciones o fragmentos de las mismas o combinaciones de las mismas. Los ejemplos de polimerasa procariota incluyen ADN polimerasa I de E. coli (por ejemplo, fragmento Klenow), ADN polimerasa de bacteriófago T4 gp43, fragmento grande de polimerasa I de Bacillus stearothermophilus, ADN polimerasa Phi-29, ADN polimerasa de T7, Pol I de Bacillus subtilis, Pol I de Staphylococcus aureus, ADN polimerasa I de E. coli, ADN polimerasa II de E. coli, ADN polimerasa III de E. coli, ADN polimerasa IV de E. coli, ADN polimerasa V de E. coli, y mutantes o fragmentos de los mismos o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa carece de actividad de exonucleasa en el extremo 3'-5'. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa tiene propiedades de desplazamiento de cadenas, por ejemplo, grandes fragmentos de polimerasas procariotas de clase I o pol V.
[0051] El proceso de esta divulgación se realiza en presencia de un agente aglomerante. En algunas realizaciones, el agente aglomerante puede incluir uno o más de polietilenglicol, óxido de polietileno, alcohol polivinílico, poliestireno, Ficoll, dextrano, poli(vinilpirrolidona) (PVP) y albúmina. En algunas realizaciones, el agente aglomerante tiene un peso molecular inferior a 200.000 daltons. Además, el agente aglomerante puede estar presente, por ejemplo, en una cantidad de aproximadamente 0,5 % en peso por volumen (p/v).
[0052] Si se utiliza una proteína de carga de recombinasa, la proteína de carga de recombinasa puede ser de origen procariota, vírico o eucariota. Las proteínas de carga de recombinasa de ejemplo incluyen RecO de E. coli, RecR de E. coli, UvsY y mutantes o fragmentos de las mismas o combinaciones de las mismas. Las proteínas UvsX de ejemplo incluyen aquellas obtenidas de fagos myoviridae, tales como T4, T2, T6, Rb69, Aehl, KVP40, fago 133 de Acinetobacter, fago 65 de Aeromonas, cianófago P-SSM2, cianófago PSSM4, cianófago S- PM2, Rb14, Rb32, fago 25 de Aeromonas, fago Vibrio nt-1, phi-1, Rb16, Rb43, Fago 31, fago 44RR2,8t, Rb49, fago Rb3 y fago LZ2. En cualquiera de los procesos de esta divulgación, el agente de carga de recombinasa puede obtenerse de un fago myoviridae. El fago myoviridae de ejemplo puede ser, por ejemplo, T4, T2, T6, Rb69, Aehl, KVP40, fago 133 de Acinetobacter, fago 65 de Aeromonas, cianófago P-SSM2, cianófago PSSM4, cianófago S-PM2, Rbl4, Rb32, fago 25 de Aeromonas, fago Vibrio nt-1, phi-1, Rb16, Rb43, Fago 31, fago 44RR2,8t, Rb49, fago Rb3 y fago LZ2.
[0053] Además, cualquiera de los procesos de esta divulgación puede llevarse a cabo con un cebador bloqueado. Un cebador bloqueado es un cebador que no permite el alargamiento con una polimerasa. Cuando se utiliza un cebador bloqueado, se puede utilizar un agente de desbloqueo para desbloquear al cebador para permitir el alargamiento. El agente de desbloqueo puede ser una endonucleasa o exonucleasa que separa el grupo de bloqueo del cebador. Los agentes de desbloqueo de ejemplo incluyen exonucleasa III de E. coli y endonucleasa IV de E. coli.
[0054] En algunas realizaciones, los procesos de esta divulgación pueden incluir: poner en contacto una recombinasa con un primero y un segundo cebadores de ácido nucleico y un tercer cebador bloqueado para la extensión que contiene uno o más residuos internos no complementarios o modificados para formar un primero, segundo y tercero cebadores de nucleoproteínas; poner en contacto el primero y el segundo cebadores de nucleoproteínas con ácido nucleico diana de doble cadena para formar una primera estructura de doble cadena entre el primer cebador de nucleoproteínas y la primera cadena de ADN en una primera parte de la primera cadena (formando un bucle D) y una segunda estructura de doble cadena entre el segundo cebador de nucleoproteínas y la segunda cadena de ADN en una segunda parte de la segunda cadena (formando un bucle D) de tal modo que los extremos 3' del primer cebador de nucleoproteínas y el segundo cebador de nucleoproteínas se orientan uno hacia el otro en la misma molécula de ácido nucleico diana con una tercera parte de ácido nucleico diana presente entre los extremos 5' del primero y el segundo cebadores; y extender el extremo 3' del primer cebador de nucleoproteínas y el segundo cebador de nucleoproteínas con una o más polimerasas y dNTPs para generar un primer ácido nucleico diana amplificado; poner en contacto el primer ácido nucleico diana amplificado con el tercer cebador de nucleoproteínas para formar una tercera estructura de doble cadena en el primer ácido nucleico diana amplificado (formando un bucle D) en presencia de una nucleasa, en el que la nucleasa separa de manera específica el residuo interno no complementario solamente después de la formación de la tercera estructura de doble cadena para formar un tercer cebador 5' y un tercer cebador bloqueado para la extensión en 3'; y extender el extremo 3' del tercer cebador 5' con una o más polimerasas y dNTP para generar un segundo ácido nucleico amplificado de doble cadena.
[0055] En algunas realizaciones, los procesos incluyen un primero y un segundo cebadores para amplificar una primera parte presente dentro de un ácido nucleico diana de doble cadena para generar un primer producto amplificado, y al menos un cebador adicional que puede utilizarse para amplificar una secuencia contigua presente dentro del primer producto amplificado (por ejemplo, un tercer cebador adicional que se puede utilizar en combinación con, por ejemplo, el primero y el segundo cebadores, para amplificar una secuencia contigua presente dentro del primer producto amplificado). En algunas realizaciones, los procesos incluyen un primero y un segundo cebadores para amplificar una primera parte presente dentro de un ácido nucleico diana de doble cadena para generar un primer producto amplificado, y un tercero y un cuarto cebadores que se pueden utilizar para amplificar una secuencia contigua presente dentro del primer producto amplificado.
[0056] En algunas realizaciones, los procesos pueden incluir, por ejemplo, un cebador directo y un cebador inverso. En algunas realizaciones, los procesos pueden incluir al menos un cebador bloqueado que comprende uno o más residuos internos no complementarios o modificados (por ejemplo, uno o más residuos internos no complementarios o modificados que pueden reconocerse y escindirse por una nucleasa, por ejemplo, ADN glicosilasa, AP endonucleasa, fpg, Nth, MutY, MutS, MutM, E. coli. MUG, MUG humano, Oggl humano, una glicosilasa similar a Nei (Neil) de vertebrado, Nfo, exonucleasa III o uracil glicosilasa). Los ejemplos no limitativos adicionales de ácidos nucleicos (por ejemplo, cebadores y sondas) que pueden incluirse en un proceso se describen en el presente documento.
[0057] En algunas realizaciones, los procesos pueden incluir un cebador o una sonda que es resistente a nucleasa, por ejemplo, un cebador o una sonda que contiene al menos (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho) enlaces fosforotioato.
[0058] Cualquiera de los procesos de esta divulgación puede llevarse a cabo en presencia de heparina. La heparina puede servir como un agente para reducir el nivel de ruido de cebador no específico y para aumentar la capacidad de la exonucleasa III de E. coli y endonucleasa IV de E. coli para limpiar rápidamente los grupos de bloqueo o residuos de terminal del extremo 3' de intermedios de recombinación.
[0059] Basándose en el tipo particular de reacción, la mezcla puede contener también uno o más tampones, sales y nucleótidos. La mezcla de reacción puede mantenerse a una temperatura específica o un intervalo de temperaturas apropiado para la reacción. En algunas realizaciones, la temperatura se mantiene a o inferior a 80 °C, por ejemplo, a o inferior a 70 °C, a o inferior a 60 °C, a o inferior a 50 °C, a o inferior a 40 °C, a o inferior a 37 °C, a o inferior a 30 °C, a o inferior a temperatura ambiente. En algunas realizaciones, la temperatura se mantiene a o superior a 4 °C, a o superior a 10 °C, a o superior a 15 °C, a o superior a 20 °C, a o superior a temperatura ambiente, a o superior a 25 °C, a o superior a 30 °C, a o superior a 37 °C, a o superior a 40 °C, a o superior a 50 °C, a o superior a 60 °C, a o superior a 70 °C. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción se mantiene a temperatura ambiente. En algunas realizaciones, la temperatura en escala Celsius de la mezcla se varía en menos del 25 % (por ejemplo, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, o menos del 5 %) durante el tiempo de reacción y/o la temperatura de la mezcla se varía en menos de 15 °C (por ejemplo, menos de 10 °C, menos de 5 °C, menos de 2 °C, o menos de 1 °C) durante el tiempo de reacción.
[0060] La detección de amplificación, por ejemplo, en tiempo real, puede llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. En algunas realizaciones, uno o más cebadores o sondas (por ejemplo, sondas con baliza molecular) están marcados con una o más marcadores detectables. Los marcadores detectables de ejemplo incluyen enzimas, sustratos de enzimas, coenzimas, inhibidores de enzimas, marcadores fluorescentes, inactivadores (“quenchers”), cromóforos, partículas o microesferas magnéticas, restos sensibles a redox (por ejemplo, estos activos electroquímicamente), marcadores luminiscentes, radioisótopos (que incluyen radionucleótidos) y miembros de pares de unión. Los ejemplos más específicos incluyen fluoresceína, ficobiliproteína, tetraetilrodamina y beta-galactosidasa. Los pares de unión pueden incluir biotina/avidina, biotina/estreptavidina, antígeno/anticuerpo, ligando/receptor y análogos y mutantes de los pares de unión.
[0061] Debe señalarse que un inactivador fluorescente también se considera un marcador detectable. Por ejemplo, se puede poner en contacto el inactivador fluorescente con un colorante fluorescente y se detecta la cantidad de inactivación.
Detección de Partículas
[0062] La detección y el control de las partículas se puede llevar a cabo utilizando cualquier procedimiento adecuado. Los procedimientos de ejemplo incluyen microscopía, dispersión de luz, citometría de flujo y procedimientos microfluídicos.
[0063] En algunas realizaciones, las partículas pueden detectarse utilizando microscopía, por ejemplo, microscopía de contraste de interferencia diferencial o fluorescente, para observar de manera directa las partículas con ampliación elevada. Con la ayuda de un ordenador, se pueden obtener y analizar de manera automática las imágenes de microscopio. Adicionalmente, el microscopio puede permitir el control continuo o frecuente de al menos una parte de una mezcla que contiene partículas.
[0064] En algunas realizaciones, se puede detectar las partículas utilizando citometría de flujo. En la citometría de flujo, uno o más haces de luz, por ejemplo, cada uno de una única longitud de onda, se dirigen sobre un flujo centrado hidrodinámicamente de fluido. Las partículas suspendidas que pasan a través de haces dispersan la luz, y los productos químicos fluorescentes que se encuentran en la partícula o se acoplan a la partícula pueden excitarse. La luz dispersada y/o fluorescente se recoge utilizando detectores dentro del dispositivo, a partir de los cuales se puede determinar la información sobre el tamaño de la partícula y la fluorescencia. Los citómetros de flujo modernos pueden analizar varios miles de partículas cada segundo, en “tiempo real”, y pueden separar y aislar de manera activa las partículas que tienen propiedades específicas.
[0065] En algunas realizaciones, se pueden detectar partículas utilizando procedimientos, dispositivos y sistemas de citometría, tal como se da a conocer en los documentos US 2009/0079963, US 2010/0179068 y WO 2009/112594.
[0066] En algunas realizaciones, se pueden detectar las partículas utilizando procedimientos, dispositivos y sistemas microfluídicos. Por ejemplo, las partículas pueden detectarse utilizando un dispositivo o un sistema “lab on a chip” o similares. Véanse, por ejemplo, Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos Números 2009/0326903 y 2009/0297733.
[0067] En algunas realizaciones, las partículas pueden detectarse utilizando un dispositivo o un sistema adecuado para el uso en “point-of-care”, campo o consumidor. Por ejemplo, un dispositivo (por ejemplo, un dispositivo “ lab on a chip”) puede incluir una recombinasa, una polimerasa, una proteína de unión de cadena única, ATP, dNTPs y un cebador o una sonda. En algunas realizaciones, se puede proporcionar un dispositivo que contiene una recombinasa, una polimerasa, una proteína de unión de cadena única, ATP, dNTPs y un cebador o una sonda, donde uno de la recombinasa, la polimerasa, el cebador o la sonda o recombinasa está unido de manera covalente o está unido de manera no covalente (por ejemplo, a través del uso de una etiqueta de afinidad) a una superficie. En algunas realizaciones, las partículas pueden colocarse en múltiples pocillos individuales en una placa con numerosos pocillos.
[0068] En cualquiera de los procedimientos divulgados, cuando se desee, las partículas pueden fijarse antes de la detección. Por ejemplo, las partículas pueden fijarse mediante un tratamiento con un aldehído (por ejemplo, formaldehído, paraformaldehído o glutaraldehído) para reticular proteínas y ácidos nucleicos en la muestra, parando de manera eficaz el progreso de reacciones en la mezcla y permitiendo la observación de las partículas en el estado en el cual la reacción se detuvo. Mediante la fijación de las mezclas, se pueden detectar las partículas en un punto posterior de tiempo, simplificando potencialmente el procesamiento y la detección.
Oligonucleótidos
[0069] Los oligonucleótidos tal como se dan a conocer en el presente documento pueden servir como cebadores de amplificación y/o sondas de detección. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos se proporcionan como un conjunto de dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) oligonucleótidos, por ejemplo, para su uso en un procedimiento de amplificación (por ejemplo, tal como se describe en el presente documento).
[0070] Los oligonucleótidos pueden sintetizarse de acuerdo con la química estándar de fosforoamidato o de otra manera. Las químicas de estructuras modificadas de bases y/o los enlazadores pueden ser deseables y funcionales en algunos casos y pueden incorporarse durante la síntesis. Adicionalmente, los oligonucleótidos pueden modificarse con grupos que sirven para varios objetivos, por ejemplo, grupos fluorescentes, inactivadores, grupos protectores (bloqueadores) (reversibles o no), etiquetas magnéticas, proteínas, etc.
[0071] En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados en el presente documento pueden contener una secuencia contigua (por ejemplo, al menos 10 unidades de bases) que es al menos 90 % idéntica (por ejemplo, al menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %) con una secuencia contigua presente dentro de un ácido nucleico diana. El porcentaje de identidad u homología entre dos secuencias puede determinarse utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-68, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90:5873-77. Tal algoritmo se incorpora en el programa NBLAST de Altschul, et al., (1990); J. Mol. Biol. 215:403-410. Para obtener los alineamientos con huecos con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST, tal como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res.
25:3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros preestablecidos del programa BLAST. Véase en línea ncbi.nlm.nih.gov.
[0072] Los oligonucleótidos pueden incluir una o más marcadores detectables. Los marcadores detectables pueden ser un fluoróforo, una enzima, un inactivador, un inhibidor de enzimas, un marcador radioactivo, un resto sensible a redox (por ejemplo, un resto electroquímicamente activo), un miembro de un par de unión o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden incluir tanto un fluoróforo como un inactivador. El inactivador puede estar cerca del fluoróforo para suprimir la fluorescencia del fluoróforo. Por ejemplo, la separación entre el fluoróforo y el inactivador puede ser de 0 a 2 bases, de 0 a 5 bases, de 0 a 8 bases, de 0 a 10 bases, de 3 a 5 bases, de 6 a 8 bases y de 8 a 10 bases. El fluoróforo y el inactivador pueden ser cualquier fluoróforo e inactivador conocido para trabajar conjuntamente que incluyen, pero no se limitan a, el fluoróforo y el inactivador de cualquier fluoróforo descrito en esta divulgación. Cuando el marcador detectable es un fluoróforo o un inactivador, puede acoplarse al oligonucleótido utilizando un residuo de amidito de fluoróforo dT o residuo de amidito de inactivador dT, respectivamente. Otros acoplamientos son posibles y son muy conocidos.
[0073] En otro aspecto, o el fluoróforo o el inactivador pueden acoplarse a un residuo interno modificado y el fluorófo y el inactivador pueden separarse después de la escisión del residuo interno modificado por la nucleasa.
[0074] Aunque cualquier fluoróforo puede servir para los procedimientos de la presente invención, la fluoresceína, FAM, TAMRA y rojo Texas son fluoróforos de ejemplo. Los inactivadores de ejemplo incluyen un inactivador dark que puede ser, por ejemplo inactivador Dark 1, inactivador Dark 2, inactivador Black Hole 1 o inactivador Black Hole 2.
[0075] En algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden incluir un residuo interno modificado. El residuo interno modificado puede ser cualquier estructura (residuo) química que no pueda formar una estructura de pares de bases de Watson-Crick con su base correspondiente en una estructura de ácido nucleico de doble cadena. El término “residuo interno modificado” incluye también, al menos, cualquier residuo que no se encuentra normalmente en ADN - es decir, cualquier residuo que no sea un "A", "G", "C" o "T", tal como, por ejemplo, uracilo o inosina. En algunas realizaciones, el residuo interno modificado es inosina, uracilo, 8-oxoguanina, timina glicol o un mimético de sitio abásico. Los miméticos de sitio abásico preferidos incluyen un residuo de tetrahidrofurano o espaciador D (que se puede producir como un producto de emplear una 5'-O-Dimetoxitritil-1',2'-Didesoxiribosa-3'-[(2-cianoetil)-(NN-diisopropil)]-fosforamidita durante la síntesis de oligonucleótidos.
[0076] En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen extensión bloqueada. Un oligonucleótido con extensión bloqueada se bloquea en su extremo 3' de tal modo que no puede alargarse normalmente utilizando polimerasa y dNTP, ni siquiera en presencia de un molde complementario. Los procedimientos de bloqueo de un oligonucleótido se conocen bien e incluyen, al menos, la inclusión de un nucleótido en el extremo 3' bloqueado. El nucleótido en el extremo 3' bloqueado puede contener, por ejemplo, un grupo bloqueador que impide la extensión por polimerasa. Generalmente, los grupos de bloqueo se acoplan al sitio 3' o 2' del residuo de azúcar de extremo 3', pero otros sitios de acoplamiento son viables. Uno de los procedimientos más comunes de bloqueo de 3' es colocar un azúcar didesoxi en el extremo 3' de un oligonucleótido. El grupo de bloque puede ser, por ejemplo, un marcador detectable.
[0077] En algunas realizaciones, los oligonucleótidos descritos en el presente documento pueden modificarse por la incorporación de uno o más marcadores detectables, residuos modificados (por ejemplo, residuos internos modificados) y grupos de bloqueo. Cuando el oligonucleótido descrito en el presente documento incluye uno o más marcadores detectables, residuos modificados (por ejemplo, residuos internos modificados) y grupos de bloqueo, el oligonucleótido sin tales modificaciones o con modificaciones adicionales se incluye también en la divulgación. Adicionalmente, un oligonucleótido tal como se describe en el presente documento que incluye uno o más marcadores detectables, residuos modificados (por ejemplo, residuos internos modificados) y grupos de bloqueo puede tener dicha fracción sustituida por otro marcador detectable, residuo modificado (por ejemplo, residuo interno modificado) o grupo de bloqueo, por ejemplo, un marcador detectable, residuo modificado (por ejemplo residuo interno modificado) o grupo de bloqueo tal como se describe en el presente documento.
Aplicaciones
[0078] Los procedimientos y las composiciones descritas en el presente documento pueden utilizarse, por ejemplo, para detectar el número de copias de un ácido nucleico diana y para controlar la amplificación de una secuencia presente dentro de un ácido nucleico diana. En algunas realizaciones de los presentes procedimientos, los ácidos nucleicos diana pueden detectarse con números de copias bajos y en muestras relativamente sin procesar. En algunas realizaciones, el ácido nucleico detectable es un ácido nucleico bacteriano, por ejemplo, de una bacteria seleccionada de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhea, Streptococcus Grupo A, Streptococcus Grupo B, Clostridium difficile, Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Mobiluncus spp., Prevotella spp. y Porphyromonas spp o de otra bacteria descrita en el presente documento o conocida en la técnica. En algunas realizaciones, el ácido nucleico detectado es un ácido nucleico de mamífero, por ejemplo, un ácido nucleico asociado con células tumorales. En algunas realizaciones, el ácido nucleico detectado es un ácido nucleico vírico, por ejemplo, de VIH, virus de gripe o virus dengue o de otro virus. En algunas realizaciones, el ácido nucleico detectado es un ácido nucleico fúngico, por ejemplo, de Candida albicans u otros hongos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico detectado es un ácido nucleico protozoario, por ejemplo, de Trichomonas u otro protozoo. Los procedimientos y las composiciones descritos en el presente documento pueden utilizarse en el diagnóstico de un trastorno o una afección asociada con un ácido nucleico detectado, por ejemplo, un ácido nucleico bacteriano, ácido nucleico de mamífero, ácido nucleico vírico, ácido nucleico fúngico o ácido nucleico protozoario (por ejemplo, tal como se describe en el presente documento). Por ejemplo, los procedimientos y las composiciones proporcionados en el presente documento pueden utilizarse para diagnosticar una infección bacteriana, una infección vírica, una infección fúngica o una infección por parásitos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico detectado es un ácido nucleico de: gripe A o una variante de la misma, gripe B o una variante de la misma, Staphlococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), especies de C. diffidle, M. tuberculosis, Chlamydia (por ejemplo, Chlamydia trachomatis), N. gonorrhoeae, Treponema pallidum, virus de papiloma humano (VPH) (por ejemplo, variantes de VPH de tipo 16 y tipo 18), virus de hepatitis (por ejemplo, hepatitis A, B y C), o una célula cancerígena circulante. En algunas realizaciones, los procedimientos y las composiciones proporcionados en el presente documento pueden utilizarse para diagnosticar infección por MRSA, infección por C. difficile, tuberculosis, infección por clamidia, gonorrea, sífilis, infección por VPH, infección vírica por hepatitis o infección por VPH. Los procedimientos y las composiciones descritos en el presente documento pueden utilizarse en la cuantificación de ácidos nucleicos. "Digitalización" de reacciones de amplificación/detección de ácido nucleico es un enfoque reciente para permitir el recuento preciso de moléculas molde (véase, por ejemplo, Vogelstein, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96:9236). Típicamente en estos procedimientos, la separación espacial de la mezcla de reacción en los microcompartimentos requeridos (típicamente en el rango de nanolitro) se logra mediante la separación física de una reacción de amplificación, por ejemplo, presionándola bajo presión en bandejas adecuadas de microfluidos o dispersándola en una emulsión adecuada. Aunque no se desea ceñirse a la teoría, si las partículas descritas en el presente documento son centros activos de amplificación, entonces, la presencia de las partículas constituye una compartimentalización intrínseca de la mezcla de reacción, que puede utilizarse en la cuantificación. Por ejemplo, contando el número de partículas de RPA “activas” (por ejemplo, aquellas asociadas con la generación de una señal fluorescente), se puede medir o evaluar el número de moléculas de ácido nucleico molde presentes en la mezcla de reacción.
[0079] Los procedimientos pueden utilizarse también para detectar el enlace físico de dos o más ácidos nucleicos. En muchas aplicaciones de biología molecular, la detección del enlace físico de dos marcadores genéticos distintos presentes en una muestra determinada es importante. Por ejemplo, la mera presencia de un marcador de especie bacteriana y un marcador resistente a antibiótico en una muestra determinada no transmite información acerca de si ambos marcadores están presentes en la misma bacteria (por ejemplo, en el mismo ácido nucleico) o si los marcadores están presentes en especies distintas de bacterias de colonización conjunta. La demostración de que los dos marcadores se unen sobre una única pieza de ADN genómico asocia la resistencia antibiótica con un patógeno particular. La colocalización de los dos marcadores puede transmitir información de diagnóstico vital en este escenario.
[0080] Los procedimientos y las composiciones descritos en el presente documento pueden utilizarse para demostrar que los sitios o las localizaciones de dos eventos de amplificación para dos ácidos nucleicos se solapan, proporcionando la información sobre el enlace físico de los ácidos nucleicos. En cambio, los eventos de amplificación separable pueden indicar la presencia de ambos ácidos nucleicos, pero en segmentos separados de ADN (por ejemplo, en dos especies de colonización conjunta de bacterias). En algunas realizaciones, el enlace de dos secuencias de ácidos nucleicos puede detectarse observando los productos de amplificación activos de ambos localizados en una única partícula en una mezcla de reacción. En otras realizaciones, el enlace de dos secuencias de ácidos nucleicos en un único segmento de ADN puede detectarse observando el “agarre” (“tethering”) de dos partículas, cada una amplificando uno de los ácidos nucleicos, por el segmento de ADN.
[0081] En algunas realizaciones, la observación de las partículas descritas en el presente documento puede utilizarse en los procedimientos de control de calidad. Por ejemplo, una relación entre la apariencia de partícula (número, tamaño, densidad) y la realización de RPA puede utilizarse para generar un parámetro analítico para predecir la calidad de reacción de RPA antes de amplificación. Esto se puede utilizar con fines de control de calidad general (por ejemplo, para comprobar qué tipo/número de partículas están presentes en una mezcla de reacción determinada) o para controlar el efecto de cambios en procedimientos de producción (por ejemplo, procedimientos de estabilización) o en condiciones de almacenamiento, etc.
[0082] En algunas realizaciones, los procedimientos y las composiciones descritos en el presente documento pueden utilizarse para obtener resultados de reacciones de amplificación en minutos (por ejemplo, en 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1,5 o 1 minuto) desde el comienzo de la reacción. Típicamente, el control de reacciones de amplificación mediante la detección de la acumulación de señal de fluorescencia se lleva a cabo “en volumen”, es decir, las señales generadas por las moléculas de molde individuales se integran en el volumen de reacción determinado completo, produciendo una respuesta de fluorescencia detectable en 5-8 minutos. En cambio, la observación de la señal de fluorescencia generada en partículas de RPA puede utilizarse también, en principio, para acortar el tiempo para causar una reacción. Este resultado se debe, al menos en parte, a una mayor sensibilidad de detección con una ampliación elevado en locus o puntos definidos (por ejemplo, partículas).
[0083] La fuerza de señal de fluorescencia de reacciones de RPA estándar, realizadas y controladas típicamente “en volumen”, se beneficia de etapas mixtas realizadas durante la incubación, específicamente si se utilizan cantidades muy bajas de material de molde de partida. La observación de reacciones de amplificación directamente en partículas puede reducir cualquier variación introducida por la mezcla.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Partículas en Mezclas de Amplificación de recombinasa Polimerasa
[0084] Este ejemplo describe la observación de partículas que contienen oligonucleótidos dentro de mezclas RPA. Las mezclas liofilizadas de componentes de reacción de RPA que incluyen oligonucleótidos marcados con FAM se obtuvieron preparando una mezcla que contenía 2,96 |jg de Creatina quinasa, 13,1 |jg de gp32 Rb69, 18,1 |jg de UvsX T6 H66S, 5,15 jg de UvsY Rb69, 5,38 jg de Exonucleasa III y 5,0 jg de ADN Polimerasa (fragmento grande de polimerasa I de S. aureus) en 80 j l de Tris Acetato 9,38 mM, pH 8,3, 3,13 mM de DTT, 2,5 % de PEG, 3,75 % de trehalosa, 31,3 mM de fosfocreatina, 1,56 mM de ATP, 750 jiM de dNTPmix (188 jiM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP), 388 nM de Spyl258F2 (CACA- GACACTCGACAAG TCCTCAATCAAACCTTG; SEQ ID NO: 1), 363 nM de Spy1258R2 (CAGAAATCCT TGATGAGTTGCGGAAATTTGAGGT; SEQ ID NO: 2) y 75 nM de Spy1258exoP1 (CCTTGTCCTACCTTATAGAACATAGAGAATQTIIFAACCGCACTCGCTAC; F=FAM- dT, H=THF (inhibidor de sitio abásico), Q=BHQ-1-dT, 3' = espaciador de block c3; SEQ ID NO:3) y liofilizando la mezcla en tubos de 0,2 ml. Los reactivos secos se volvieron a suspender en 46,5 j l de tampón de rehidratación (48 mM de Tris acetato, 133,8 mM de KOAc, 2 % de PEG) 3,5 j l de agua y se agitaron en vórtice. Estas mezclas no contenían ácido nucleico molde o magnesio. Se transfirieron diez microlitros de la mezcla a un portaobjetos de microscopio y se visualizaron utilizando contraste de interferencia diferencial (DIC) y microscopia fluorescente con un aumento de 40x (Figuras 1A-1C). Las partículas de aproximadamente 1-10 micras en tamaño se observaron utilizando DIC (Figura 1A) o fluorescencia (Figura 1B), y cuando las dos imágenes se unieron (Figura 1C). Se observaron aproximadamente 100-500 partículas/nl (campo de visión con un aumento de 40x era equivalente a 1,55 nl de la mezcla).
[0085] En un experimento separado, se prepararon mezclas como anteriormente, pero sustituyendo 2,5 j l de agua y 1 j l de una preparación de ADN genómico de Streptococcus pyogenes (100 copias/jl) por los 3,5 j l de agua. La mezcla se agitó en vórtice y se visualizó como anteriormente (Figuras 2A-2C). Se observaron partículas similares como anteriormente utilizando DIC (Figura 2A) o fluorescencia (Figura 2B), y cuando las dos imágenes se fusionaron (Figura 2C).
[0086] Este ejemplo demuestra que las partículas se forman en mezclas de RPA y que las partículas no dependen de la inclusión de molde o magnesio.
Ejemplo 2. Agentes Aglomerantes Estimulan la Formación de Partículas
[0087] Para determinar los efectos de agentes aglomerantes sobre la formación de partículas, se prepararon mezclas de RPA nuevas que contenían 2,96 jg de Creatina Quinasa, 13,1 jg de gp32 Rb69, 18,8 jg de UvsX T6 H66S, 2,5 jg de UvsY Rb69, 5,38 jg de Exonucleasa III y 5,0 jg de Polimerasa da a Dn en 50 mM de Tris Acetato, pH 8,3, 100 mM de KOAc, 5 mM de DTT, 1,2 mM de mezcla de dNTP (300 jM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP), 50 mM de fosfocreatina, 2,5 mM de ATP, 6 % de trehalosa, 14 mM de MgAc, 30 nM de VIH p2LFtexas (oligonucleótido marcado con rojo Texas AGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCA5AATTTTCGGGTTT; 3' dA bloqueado, 5' rojo Texas, 5= espaciador d; SEQ ID NO:4), 420 nM de Spyl258F2 (CACAGACACTC- GACAAGTCCTCAATCAAACCTTG; SEQ ID NO:5), y 390 nM de Spy1258R2 (CAGAAATCCTTGATGAGTT- GCGGAAATTTGAGGT; SEQ ID NO:6). PEG se incluyó en cada mezcla con 0 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 %, 5,5 % o 8 %. Las mezclas se mezclaron con pipeta y se transfirieron 10 j l de cada uno a un portaobjetos de microscopio. La visualización se realizó utilizando contraste de interferencia diferencial (DIC) y microscopia fluorescente con un aumento de 40x. El número de partículas observadas aumentó con el aumento de concentración de PEG hasta 5,5 % (Figuras 3A-3G). Se observaron pocas partículas al 8 % de PEG (Figura 3H).
[0088] Este ejemplo demuestra que PEG puede potenciar la formación de partículas en mezclas de RPA.
Ejemplo 3. Contribución de Componentes de Mezcla a la Formación de Partículas
[0089] Para determinar la contribución de componentes de la mezcla de RPA en la formación de partículas, se prepararon las mezclas como en el Ejemplo 2 con 5,5 % de PEG, a excepción de que se excluyeron los componentes individuales en cada reacción. Las mezclas se visualizaron como anteriormente utilizando DIC y microscopia fluorescente. Cuando estaban presentes todos los componentes, las partículas se formaron en la mezcla tal como se describe anteriormente (Figuras 4A-4B). Las partículas formadas en ausencia de UvsX parecían diferentes en tamaño de aquellas formadas en presencia de UvsX y no se observaron con facilidad utilizando DIC (Figuras 4C-4D). Las partículas formadas en ausencia de gp32 parecían diferentes en forma y tamaño de aquellas formadas en presencia de gp32 (Figuras 4E-4F). Las estructuras formadas en ausencia de otros componentes de RPA (UvsY, ADN polimerasa, creatina quinasa o exonucleasa III) parecían similares a aquellas formadas en una reacción de RPA completa (Figuras 5A-5H). La ausencia de UvsY parecía conducir a una disminución leve en el número de partículas y un aumento en el tamaño de partículas (Figuras 5A-5B).
[0090] Las mezclas adicionales se prepararon excluyendo dos o tres componentes de reacción. Se preparó una mezcla de RPA de control que contenía 2,96 jg de Creatina Quinasa, 13,1 jg de gp32Rb69, 18,8 jg de UvsX T6 H66S, 5,15 jg de UvsY, 8,26 jg de Exonucleasa III y 5,0 jg de ADN Polimerasa en 50 mM de Tris Acetato, pH 8,3, 100 mM de KOAc, 5 mM de DTT, 1,2 mM de mezcla de dNTP (300 jM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP), 50 mM de fosfocreatina, 2,5 mM de ATP, 6 % de trehalosa, 14 mM de MgAc, 5,5 % de PEG, 120 nM de M2intFAM (sonda marcada con FAM 5'-tcctcatatccattctgTcgaatatcat- caaaagc-3'; T = carboxifluoresceína-dT; SEQ ID NO: 19), 420 nM de cada uno SpaF3 (CGCTTTGTTGATCTTTGTTGAAGTTATTTTGTTGC; SEQ ID NO: 7) y SpaR10+l (TTAAAGATGATCCAAGCCAAAGTCCTAACGTTTTA; SEQ ID NO: 8). Se prepararon las mezclas paralelas que carecían de (i) gp32 y UvsY; (ii) UvsX y UvsY; (iii) UvsX y gp32; (iv) UvsX, UvsY, y gp32; o (iv) gp32, UvsY, y Emix (fosfocreatina y ATP). No se observaron partículas en las mezclas que carecían de UvsX y al menos uno de otro componente. En las mezclas que carecían de gp32 y UvsY, se observaron cuerpos grandes, fluorescentes irregulares (Figuras 6A-6C).
[0091] Este ejemplo demuestra que la exclusión de UvsX o gp32 tiene el efecto más grande sobre la morfología de la partícula, seguido de un efecto intermedio de exclusión de UvsY, sin ningún efecto importante observado sobre la exclusión de ADN polimerasa, creatina quinasa o exonucleasa III. La exclusión de dos o más componentes había aumentado los efectos.
Ejemplo 4. Poblaciones Separadas de Partículas que Permanecen Diferentes Cuando Se Mezclan
[0092] Se prepararon dos mezclas liofilizadas, tal como se describe en el Ejemplo 1, con la excepción de que cada mezcla incluía diferentes oligonucleótidos y 18,8 |jg de UvsX. La Mezcla de Reactivo 1 contenía 296 nM de SpaF3 (SEQ ID NO: 7), 298 nM de SpaR10+l (SEQ ID NO: 8) y 149 nM de SpaSonda1 (CATCAGCTTTTGGAGCTTGAGAGTCAT9 A8G6TTTTGAGCTTCAC; 3' biotina, 6=BHQ-2 dT, 8=Espaciador d, 9=TMR dT; SEQ ID NO: 9). La Mezcla de Reactivo 2 contenía 299 nM de MecF9-8+2 (CCCTCAAACAGGTGAA TTATTAGCACTTGT; SEQ ID NO: 10), 300 nM de MecRla(CTTGTTGAGCAGAGG TTCTTTTTTATCTTC; SEQ ID NO: 11) y 150 nM de MecProbel (ATGACGTCTAT CCATTTATGTATGGCAFGHGQAACGAAGAATATA; 3' biotina TEG, Q=BHQ -1 dT, H= THF (inhibidor de sitio abásico), F=FAM-dT; SEQ ID NO: 12). Los volúmenes iguales de las dos mezclas de reacción se combinaron y se dispensaron 80 j l en tubos de 0,2 ml y se liofilizaron. Las mezclas secas se volvieron a suspender en 46,5 j l de un tampón de rehidratación (véase el Ejemplo 1), 1 j l de agua y 2,5 j l de MgAc 280 mM. La mezcla se agitó en vórtice y se transfirieron 10 j l a un portaobjetos de microscopio para visualización utilizando DIC y fluorescencia. Las partículas observadas contenían tanto fluorescencia roja (TMR) como verde (FAM), lo que indica que ambos oligonucleótidos marcados estaban presentes en las partículas (Figuras 7A-7F).
[0093] En otro experimento, se prepararon dos mezclas liofilizadas separadas como anteriormente, una incluía solamente la sonda de Spa RPA marcada con TMR (Mezcla de Reactivo 1, anteriormente), y la otra incluía solamente la sonda MecA RPA marcada con FAM (Mezcla de Reactivo 2, anteriormente). Después de la reconstrucción, las dos mezclas reconstruidas se combinaron y se visualizaron utilizando DIC y fluorescencia. Se observaron en la mezcla partículas diferentes que contenían de manera predominante un fluoróforo o el otro (figuras 8A-8F). Esto indica que las partículas que incluyen cada sonda pueden permanecer diferentes una de la otra después de la mezcla.
[0094] Para determinar la estabilidad de poblaciones mezcladas de partículas con el tiempo, dos reacciones liofilizadas sin cebadores se reconstituyeron en un tampón de rehidratación con MgAc y oligonucleótidos, tal como se indica a continuación. Una mezcla incluía 30 nM de VIH p2LFtexas (marcado con rojo Texas), 420 nM de Spyl258F2 (SEQ ID NO: 1, no marcado) y 390 nM de Spy1258R2 (SEQ ID NO: 2, no marcado). La otra mezcla incluía 50 nM de M2intFAM de oligonucleótido (Se Q ID NO: 19, marcado con FAM), 420 nM de Spyl258F2 (SEQ ID NO: 1, no marcado), y 390 nM de Spy1258R2 (SEQ ID NO: 2, no marcado). Se transfirieron con pipeta cinco microlitros de cada mezcla sobre un portaobjetos de microscopio y se mezclaron, y la combinación se visualizó en 2, 7 y 13 minutos (Figura 9). Las imágenes de la mezcla después de un periodo de 12 minutos se muestran en la Figura 9. Después de 13 minutos, se observaron las partículas que incluían de manera predominante fluorescencia rojo Texas o FAM.
[0095] Este ejemplo demuestra que las partículas permanecen relativamente estables en solución y pueden marcarse de manera independiente. Esta observación puede ser útil en el control simultáneo de dos o más reacciones de RPA que tienen lugar en subconjuntos diferentes de partículas.
Ejemplo 5. Reacciones de RPA Se Observan Localizadas en Partículas
[0096] Las mezclas liofilizadas de componentes de reacción de RPA que incluían una sonda de oligonucleótidos con marcador FAM, como en el Ejemplo 1, se reconstituyeron con 46,5 j l de tampón de rehidratación y se inició una reacción de amplificación añadiendo 1 j l de 50.000 copias/jl de ADN genómico de S. pyogenes y 2,5 j l de 280 mM de MgAc. La reacción se mezcló con pipeta y se transfirió a un portaobjetos de microscopio para visualización utilizando DIC y fluorescencia que empezó en aproximadamente 2 minutos, 40 segundos después del comienzo y a continuación en 8, 12, 14, 15, 16, 18, 20 y 22 minutos (Figura 10). Se observó un aumento en fluorescencia (indicando la amplificación) que al menos inicialmente se localizaba en partículas individuales.
[0097] En otro experimento, las mezclas libres de cebadores liofilizadas de componentes de reacción (preparadas mezclando un volumen de 50 j l de 2,96 jg de Creatina quinasa, 9,88 jg de gp32 Rb69, 18,8 jg de UvsX t 6 H66S, 5,38 jg de UvsY, 5,38 jg de Exonucleasa III y 5,34 jg de ADN Polimerasa en 25 mM de Tris Acetato, pH 8,3, 5 mM de d Tt , 2,28 % de Pe G, 5,7 % de trehalosa, 50 mM de fosfocreatina, 2,5 mM de ATP, 1200 jM de mezcla de dNTP (300 jM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP y liofilizados en tubos de 0,2 ml) se reconstituyeron con 29,5 j l de tampón de rehidratación libre de cebador (41,7 mM de Tris Acetato, 167,5 mM de Acetato de Potasio, 5,4 % de PEG, pH 8,3), 3,5 pl de 6 pM de Spa F3 (SEQ ID NO: 7), 3,5 pl de 6 pM de Spa R10+1 (SEQ ID NO: 8), 1 pl de 6 pM de Spa Probe 1 con marcador TMR (SEQ ID NO: 9), 1 pl de 0,6 pM de oligonucleótido M2intFAM (s Eq ID NO: 19, utilizado como marcador fluorescente de partículas y no involucrado en la reacción de PRA) y 8 pl de agua. La reacción comenzó al añadir 1 pl de 50.000 copias/ttL de ADN molde genómico purificado de Streptococcus de Grupo A y 2,5 pl de 280 mM de MgAc y mezcla con pipeta. Diez microlitros de la mezcla se transfirieron a un portaobjetos de microscopio y se inició la visualizaron aproximadamente 3 minutos después del inicio de la reacción. La evolución con el tiempo de la mezcla de reacción a los 3, 8, 15, 18, 22 y 26 minutos (Figura 11) mostró un aumento en fluorescencia roja (indicando amplificación) que al menos inicialmente se localizaba en partículas individuales.
[0098] Este ejemplo demuestra que los productos de amplificación de ácido nucleico pueden observarse localizados conjuntamente con las partículas.
Ejemplo 6. Efectos de Variantes de UvsX
[0099] Para investigar los efectos de diferentes variantes de UvsX, se establecieron mezclas a temperatura ambiente que contenían 2,96 pg Creatina quinasa, 13,1 pg de gp32 Rb69, 8,26 pg de Exonucleasa III, 5,0 pg de Polimerasa en 50 mM de Tris Acetato, pH 8,3, 100 mM de k Oa c , 5 mM de DTT, 1,2 mM de mezcla de dNTP (300 pM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP), 50 mM de fosfocreatina, 2,5 mM de ATP, 6 % de trehalosa, 14 mM de MgAc, 5,5 % de PEG, 120 nM de M2intFAM (SEQ ID NO: 19), 420 nM de cada uno de SpaF3 y SpaR10+l (50 pl de volumen final). Se prepararon cuatro mezclas diferentes que contenían 18,8 pg de UvsX T6H66S o 17,6 pg de UvsX T6, y con o sin 5,15 pg de UvsY Rb69. Diez microlitros de cada mezcla se transfirieron a un portaobjetos de microscopio y se visualizaron con un aumento de 20x aproximadamente 5-20 minutos después del establecimiento (Figuras 12A-12D) y también con un aumento de 40x aproximadamente 50-60 minutos después del establecimiento (Figuras 13A-13D). En general, se observaron más partículas en la mezcla con UvsX T6H66S que con UvsX T6. Adicionalmente las partículas con UvsX T6H66S a menudo eran diferentes en forma y aquellas con UvsX T6, que incluían formas parecidas a cometas, mientras que las partículas con UvsX T6 eran más esféricas. Las mezclas con UvsX T6H66S que carecían de UvsY tenían más partículas difusas y "halos" o "rosquillas" difusos que carecían de la señal en la parte central. Con UvsXT6 a menudo se observaba el efecto opuesto. Sin UvsY, las partículas eran esferas pequeñas brillantes, pero con UvsY eran menos brillantes y más manchadas y pequeñas.
[0100] Se investigó el efecto de UvsY sobre la cinética de reacción de RPA utilizando UvsX T6H66S y UvsX T6. Las reacciones se prepararon como anteriormente, con UvsX T6H66S o UvsX T6, y con o sin UvsY Rb69. Se llevaron a cabo tres experimentos separados utilizando conjuntos de cebadores y moldes diferentes. En el primer experimento, los cebadores fueron 420 nM de FluAPAFNA507 (AACCTGGGACCTTTGATCTTGGGGGGCTATATG; SEQ ID NO: 13) y FluAPARNA106 (ATGTGTTAGGAAGGAGTTGAACCAAGAAGCATT; SEQ ID NO: 14), con 120 nM de sonda FluAPAexoP2,2 (GATCTTGGGGGGCTATATGAA GCAATYGAGGAGFHCQTGATTAATGAT; F=FAM-dT, H=THF (inhibidor de sitio abásico), Q=BHQ-1-dT, 3' = espaciador block c3; SEQ ID NO: 15). Quinientas o 50 copias de ARN molde de gripe A se utilizaron en cada reacción. Las reacciones de RPA se agruparon conteniendo 2,96 pg de Creatina quinasa, 13,1 pg de gp32 Rb69, 18,8 pg de UvsX T6H66S o 17,6 pg de UvsX T6, 8,26 pg de Exonucleasa III, 5,0 pg de Polimerasa, 1,79 pg de Transcriptasa Inversa, 5,15 pg de UvsY (cuando está presente) en 50 mM de Tris Acetato, pH 8,3, 100 mM de KOAc, 5 mM de DTT, 0,2 unidades/pl de Inhibidor de ARNasa Ribolock™ (Fermentas), 1,2 mM de mezcla de dNTP (300 pM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP), 50 mM de fosfocreatina, 2,5 mM de ATP, 6 % de trehalosa, 5,5 % de PEG. Los componentes anteriores se agruparon en un volumen de 46,5 pl en un tubo de 0,2 ml, y las reacciones comenzaron al añadir 2,5 pl de 280 mM de MgOAc y 1 pl de 500 o 50 copias/pl de ARN molde de gripe A. Las reacciones se agitaron en vórtice, se centrifugaron brevemente y se transfirieron a un instrumento Twista (ESE) y se controló la fluorescencia cada 20 segundos durante 20 minutos a 40 °C con una etapa de mezclado (agitar en vórtice y centrifugación breve) a los 5 minutos. La incorporación de UvsY con UvsX T6H66S condujo a un retraso en la amplificación con respecto a la reacción sin UvsY, y se observó lo contrario para UvsX T6 (Figuras 14A-14B). Cuando estaban presentes solamente 50 copias del molde, las reacciones que carecían de UvsY generaron menos señales en general (Figuras 14A-14B). Un efecto similar sobre la cinética de reacción se observó en un segundo experimento utilizando como cebadores a 420 nM de SpaF3 y SpaR10, con 120 nM de Spa probe 1,2 y 1000 copias de ADN molde genómico de streptococcus de grupo A (Figura 15).
[0101] En el segundo experimento, los cebadores utilizados fueron 420 nM de FluBNSF1007 (CATCGGATCCTCAACTCACTCTTCGAGCGT; SEQ ID NO: 16) y FluBNSR705 (GACCAAATTGGGATAAGACTCCCACCGCAGTTTC; SEQ ID NO: 17), con 120 nM de sonda FluBNSexoPl (CATCGGATCCTCAAYTCACTCTTCGAGCGFHTQAATGAAGGACATTC; F=FAM-dT, H=THF (inhibidor de sitio abásico), Q=BHQ-1-dT, 3' = espaciador block c3; SEQ ID NO: 18). Quinientas copias de ADN molde de gripe B amplificados con PCR se utilizaron en cada reacción. En estas reacciones, no se observó ninguna amplificación con UvsX T6H66S que carecía de UvsY (Figuras 16A-16B). Se observó el efecto contrario con UvsXT6 (Figuras 16A-16B).
[0102] Este ejemplo demuestra que diferentes variantes de UvsX pueden tener diferentes requisitos para UvsY con respecto a la morfología de partículas y la cinética de reacciones de amplificación. Adicionalmente, la morfología de partículas parece estar relacionada con la cinética y/o el progreso de la reacción de amplificación.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento que comprende
(A) proporcionar una mezcla que comprende
(a) una primera población de estructuras microscópicas con la apariencia de partículas que comprenden una recombinasa, una proteína de unión a ADN de cadena única (SSB) y un primer oligonucleótido que comprende un primer marcador detectable ; y
(b) una segunda población de estructuras microscópicas con apariencia de partículas que comprenden una recombinasa, una proteína de unión a ADN de cadena única (SSB) y un segundo oligonucleótido que comprende un segundo marcador detectable, en la que:
el primero y el segundo oligonucleótidos son diferentes,
el primero y el segundo marcadores detectables son diferentes, y
la primera y segunda poblaciones de estructuras microscópicas con apariencia de partículas pueden detectarse independientemente en la mezcla,
en la que la mezcla comprende un agente aglomerante y:
i. UvsX y UvsY; o
ii. UvsX y gp32;
y (B) detectar estructuras microscópicas con apariencia de partículas en la mezcla.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la UvsX es una recombinasa mutante, en la que la recombinasa mutante es:
a) una UvsX Rb69 que incluye al menos una mutación en la secuencia de aminoácidos de UvsX Rb69, en la que la mutación se selecciona del grupo que consiste en un aminoácido que no es histidina en la posición 64, una serina en la posición 64, la adición de uno o más residuos de ácido glutámico en el extremo C-terminal, la adición de uno o más residuos de ácido aspártico en el extremo C-terminal y una combinación de los mismos; o
b) una UvsX T6 que incluye al menos una mutación en la secuencia de aminoácidos de UvsX T6, en la que la mutación se selecciona del grupo que consiste en un aminoácido que no es histidina en la posición 66, una serina en la posición 66, la adición de una o más residuos de ácido glutámico en el extremo C-terminal, la adición de uno o más residuos de ácido aspártico en el extremo C-terminal y una combinación de los mismos.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que UvsX es la recombinasa mutante T6 H66S.
4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la mezcla comprende UvsX T6 H66S, gp32 Rb69 y UvsY Rb69.
5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el agente aglomerante es polietilenglicol (PEG) y se incluye en un 2,5 % o más, y en el que las estructuras microscópicas con apariencia de partículas son de aproximadamente 0,5-20 |jm de tamaño, por ejemplo, en el que las partículas tienen un tamaño de aproximadamente 1-10 jm .
6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las estructuras microscópicas con apariencia de partículas están presentes en el intervalo de 10 a 5000 partículas/nl, por ejemplo, en el que las partículas están presentes en el intervalo de 100 a 2000 partículas/nl.
7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el primero y segundo marcadores detectables son marcadores fluorescentes y las estructuras microscópicas con la apariencia de partículas pueden detectarse utilizando la fluorescencia de las partículas, por ejemplo, en el que el primero y la segundo marcadores detectables son marcadores fluorescentes seleccionados del grupo que consiste en fluoresceína, FAM, TAMRA (tetrametilrodamina) y rojo Texas.
8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las estructuras microscópicas con apariencia de partículas pueden detectarse sin usar la fluorescencia de las partículas.
9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las estructuras microscópicas con apariencia de partículas pueden detectarse mediante microscopía, un dispositivo de microfluidos, citometría de flujo, una cámara o un dispositivo acoplado de carga.
10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las estructuras microscópicas con apariencia de partículas comprenden un primer subconjunto de estructuras microscópicas con apariencia de partículas y un segundo subconjunto de estructuras microscópicas con apariencia de partículas, el primer subconjunto de estructuras microscópicas con apariencia de partículas se puede detectar usando la fluorescencia del primer subconjunto de estructuras microscópicas con apariencia de partículas, y el segundo subconjunto de estructuras microscópicas con apariencia de partículas se puede detectar sin usar la fluorescencia del segundo subconjunto de estructuras microscópicas con apariencia de partículas.
11. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la mezcla comprende además uno o más de una ADN polimerasa, una proteína de carga de recombinasa, dNTP o una mezcla de dNTP y ddNTP, un agente reductor, creatina quinasa, una nucleasa, una sonda de ácido nucleico, una transcriptasa inversa y un ácido nucleico molde.
12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente aglomerante es polietilenglicol y se selecciona del grupo que consiste en PEG35000 y PEG40000.
13. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la mezcla comprende además un ácido nucleico molde.
14. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las estructuras microscópicas con apariencia de partículas comprenden una o más de la recombinasa, la proteína de unión de cadena única, al menos uno de los uno o más oligonucleótidos, y un ácido nucleico molde.
15. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el primer marcador detectable o el segundo marcador detectable comprende una enzima, un sustrato enzimático, una coenzima, un inhibidor enzimático, un marcador fluorescente, un inactivador (“quencher”), un cromóforo, una partícula o microesfera magnética, un resto sensible a redox, un marcador luminiscente, un radioisótopo y miembros de pares de unión.
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