ES2905890T3

ES2905890T3 - Anticuerpos anti-4-1BB humano y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2905890T3
Application number: ES18736336T
Authority: ES
Inventors: Byoung S Kwon; Seoung-Joo Lee; Young Ho Kim; Ho-Sik Oh; Joong Won Lee
Original assignee: Eutilex Co Ltd
Current assignee: Eutilex Co Ltd
Priority date: 2017-01-06
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2038-01-05
Also published as: RU2725811C1; AU2019204847A1; US10774151B2; EP4032911A1; WO2018127787A1; KR102089072B1; SG11201903021WA; KR20190095919A; JP6609724B1; CN112210010A; JP2020503245A; US20210214455A1; RU2020120077A; US10919972B2; BR112019007714A2; BR112019007714B1; NZ753036A; US20180258177A1; KR20200029618A; RU2020120077A3

Abstract

Un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 14; y y un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 10.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-4-1BB humano y usos de los mismos

Referencia cruzada con las solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 62/443,281, presentada el 06 de enero de 2017.

Antecedentes de la invención

El cáncer es una de las causas principales de muerte en el mundo. Las estadísticas recientes informan que el 13 % de la población mundial muere de cáncer. De acuerdo con las estimaciones de la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC), en 2012 hubo 14,1 millones de nuevos casos de cáncer y 8,2 millones de muertes por cáncer en todo el mundo. Para 2030, se espera que la carga global aumente a 21,7 millones de nuevos casos de cáncer y 13 millones de muertes por cáncer debido al crecimiento y el envejecimiento de la población y la exposición a factores de riesgo tales como el tabaquismo, la dieta no saludable y la inactividad física. Además, el dolor y los gastos médicos por el tratamiento del cáncer reducen la calidad de vida tanto de los pacientes con cáncer como de sus familias. Es evidente que, sobre todo, el cáncer es una enfermedad para la que es necesario encontrar urgentemente mejores métodos de tratamiento.

El documento WO 2006/126835 describe anticuerpos anti-4-1BB que incluyen un anticuerpo denominado H4B4. Estos anticuerpos no comprenden las mutaciones específicas del dominio variable que están presentes en los anticuerpos de la presente invención. El documento WO 2006/126835 tampoco describe la afinidad mejorada que se proporciona por los anticuerpos de la presente invención.

Resumen de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:

un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 14; y

un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 10

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente invención.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de la presente invención.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped que comprende el vector recombinante y/o la molécula de ácido nucleico de la presente invención, en donde la célula huésped se selecciona de una célula bacteriana, de levadura, de insecto o de mamífero, más preferentemente en donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en E. coli, P. pastoris, Sf9, COS, HEK293, CHO y un linfocito de mamífero.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende:

(a) el anticuerpo anti-4-1BB o el fragmento de unión al antígeno, la molécula de ácido nucleico o el vector recombinante de la presente invención; y

(b) un portador farmacéuticamente aceptable.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno, un ácido nucleico o un vector recombinante de la presente invención para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto, el método comprende administrar dicha composición al sujeto.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar una dosis de un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno del mismo para el tratamiento terapéutico de un sujeto que lo necesita, que comprende;

(a) proporcionar u obtener una medición del IFN-gamma secretado en una muestra biológica del sujeto, en donde al sujeto se le ha administrado una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente invención; y

(b) comparar la medición del IFN-gamma secretado con un valor de referencia,

en donde si la medición del IFN-gamma secretado es mayor o menor que el valor de referencia, ajustar la cantidad de un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se administrará, de esta manera se determina una dosis para el tratamiento terapéutico de un sujeto, en donde el valor de referencia comprende un valor índice que incluye un valor derivado de uno o más sujetos sanos, un valor derivado de uno o más sujetos diagnosticados de cáncer o un valor derivado de un algoritmo de predicción del riesgo de cáncer; y opcionalmente además en donde

la muestra biológica es una muestra de sangre completa, plasma o suero; y/o

el sujeto tiene cáncer, preferentemente en donde el cáncer se selecciona de un cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de trompas de Falopio, cáncer de vesícula biliar, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hematológico, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer peritoneal primario, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un método para aumentar la secreción de IFN.y por una célula in vitro, el método comprende: poner en contacto la célula con un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente invención.

En un noveno aspecto, la presente invención proporciona un método para la proliferación o aislamiento ex vivo de células T activadas, el método comprende: poner en contacto una población de células T con un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente invención, lo que aumenta de esta manera la proliferación de células T activadas.

En un décimo aspecto, la presente invención proporciona un método para aislar células T activadas específicas del antígeno, el método comprende:

(a) cultivar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en un medio junto con un péptido de un epítopo de interés e IL-2;

(b) inducir la expresión de 4-1BB en las células cultivadas mediante la adición del péptido del epítopo de interés;

(c) poner en contacto las células cultivadas con una superficie revestida con un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente invención, en donde las células cultivadas que expresan 4-1BB se adhieren a la superficie revestida; y

(d) eliminar las células no unidas, lo que aísla de esta manera las células T activadas específicas del antígeno.

Cualquiera de las referencias en la descripción a los métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico),

La presente descripción proporciona, entre otras cosas, anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a un polipéptido 4-1BB humano. Descritos en la presente descripción, algunos anticuerpos anti-4-1BB humano y fragmentos de los mismos son variantes de un anticuerpo anti-4-1BB humano de referencia en el sentido de que contienen una o más características estructurales más particulares que no se encuentran en el anticuerpo anti-4-1BB humano de referencia. La presente descripción abarca un reconocimiento que proporcionó que los anticuerpos anti-4-1BB humano variantes tengan propiedades mejoradas con relación a un anticuerpo anti-4-1BB humano de referencia que carece de una o más características estructurales descritas en la presente descripción. Descritos en la presente descripción, algunos anticuerpos anti-4-1BB humano y fragmentos de los mismos tienen una o más propiedades mejoradas, tales como, por ejemplo, afinidad de unión mejorada, inducción mejorada de la proliferación de células T (por ejemplo, la proliferación de células T CD8+), capacidad aumentada para inducir la producción de IFN.y por las células T (por ejemplo, la proliferación de células T CD8+), capacidad mejorada para reducir y/o eliminar la proliferación del cáncer in vivo (por ejemplo, a una dosis más baja).

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno incluye 1, 2 o 3 secuencias de CDR de la cadena pesada que son o incluyen una secuencia de las SEQ ID NO: 5 a 8. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno incluye una o más de: una CDR1 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 7 u 8. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno incluye cada una de: una CDR1 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 7 u 8.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye 1, 2 o 3 secuencias de CDR de la cadena ligera que son o incluyen una secuencia de las SEQ ID NO: 1-4. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye una o más de: una c DR1 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 1, una CDR2 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 2 y una CDR3 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 3 o 4. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye cada una de: una CDR1 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 1, una CDR2 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 2 y una CDR3 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 3 o 4.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena pesada que incluye una CDR1 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 7 u 8, y/o un dominio variable de la cadena ligera que incluye una CDR1 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 1, una CDR2 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 2 y una CDR3 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 4.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno incluye un dominio variable de la cadena pesada que incluye una región del marco 1 de la cadena pesada (FR1) que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 16 o 17. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno incluye un dominio variable de la cadena pesada que incluye una región del marco 3 de la cadena pesada (FR3) que comprende una secuencia de cualquiera de las s Eq ID NO: 18-20. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno incluye un dominio variable de la cadena pesada que incluye una región del marco 1 de la cadena pesada (FR1) que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 16 o 17 y una región del marco 3 de la cadena pesada (FR3) que comprende una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 18-20.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye una homología sustancial con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que incluye un dominio variable de la cadena pesada que es o incluye una secuencia seleccionada de las SEQ ID nO: 11-14. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena pesada que es o incluye una secuencia al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 % o 99,5 % idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 11-14. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena pesada que es o incluye una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 11-14.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye una homología sustancial con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que incluye un dominio variable de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 9 o 10. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 % o 99,5 % idéntica a una secuencia de la SEQ ID NO: 9 o 10. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la s Eq ID NO: 9 o 10.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye una homología sustancial con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que incluye un dominio variable de la cadena pesada que es o incluye una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 11-14 y un dominio variable de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 10. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena pesada que es o incluye una secuencia al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 % o 99,5 % idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 11-14 y un dominio variable de la cadena ligera que es o incluye una secuencia al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 % o 99,5 % idéntica a una secuencia de la SEQ ID NO: 10. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno incluye un dominio variable de la cadena pesada que es o incluye una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 11-14 y un dominio variable de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 10.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo es un anticuerpo agonista. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo se caracteriza por tener una actividad agonista superior a un anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado 94G1 (es decir, un anticuerpo que incluye dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 9 y 11, respectivamente). En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo se caracteriza por tener una afinidad de unión mejorada que un anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado 94G1 (es decir, un anticuerpo que incluye dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 9 y 11, respectivamente).

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo es o comprende un anticuerpo humanizado. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo incluye un dominio constante de inmunoglobulina humana, en donde el dominio constante se selecciona de una IgG1 o una variante de la misma, una IgG2 o una variante de la misma, una IgG4 o una variante de la misma, una IgA o una variante de la misma, una IgE o una variante de la misma, una IgM o una variante de la misma y una IgD o una variante de la misma. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo es o comprende una IgG1 humana. En la presente descripción se describe que una IgG1 es o comprende una secuencia que es al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 22 o 23.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo es un anticuerpo monoclonal.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo es un anticuerpo de longitud completa. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento Fv unido por enlaces disulfuro, un fragmento scFv, un anticuerpo de dominio único, humacuerpo, nanocuerpo o un diacuerpo.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo tiene una afinidad de unión (K^d) para una molécula 4-1BB humana de 1x10-7 a 1x10-12 M. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo tiene una afinidad de unión (Kd) para una molécula 4-1BB humana de 1x10-8 a 1x10-12 M. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo tiene una afinidad de unión (K^d) para una molécula 4-1BB humana de 1x10-9 a 1x10-12 M. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo tiene una afinidad de unión (K^d) para una molécula 4-1BB humana de 1x10-10 a 1x10-12 M.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo se une a un epítopo dentro del dominio extracelular de un polipéptido 4-1BB humano. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo se une a un epítopo dentro del dominio extracelular del 4-1BB humano. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo es anulado por una o más mutaciones en las posiciones N30, D38, N39 y R41 de la SEQ ID NO: 44.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo no se une o se une débilmente a un polipéptido 4-1BB que no es de primate. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo no se une o se une débilmente a un polipéptido 4-1BB canino.

La presente descripción proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno. La presente descripción proporciona vectores que incluyen una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno. La presente descripción proporciona células huésped que incluyen un vector y/o una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno. En la presente descripción se describe que una célula huésped seleccionada de una célula bacteriana, de levadura, de insecto o de mamífero. En la presente descripción se describe que una célula huésped seleccionada del grupo que consiste en E.coli, P.pastoris, Sf9, COS, HEK293, CHO y un linfocito de mamífero.

La presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen un ácido nucleico y/o un vector que codifica un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente descripción proporciona métodos para tratar a un sujeto que lo necesita, el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende o suministra un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno. La presente descripción proporciona métodos para tratar a un sujeto que lo necesita, el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende o suministra un ácido nucleico y/o un vector que codifica un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno. En la presente descripción se describe que un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer.

La presente descripción proporciona métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita, el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende o suministra un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno. La presente descripción proporciona métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita, el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende o suministra un ácido nucleico y/o un vector que codifica un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno. En la presente descripción se describe que un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer.

La presente descripción proporciona métodos para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita, el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende o suministra un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno. La presente descripción proporciona métodos para mejorar una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita, el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende o suministra un ácido nucleico y/o un vector que codifica un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno. En la presente descripción se describe que un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer.

En la presente descripción se describe que un cáncer que se va a tratar mediante un método de la presente descripción en un sujeto se selecciona de un cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de las trompas de Falopio, cáncer de vesícula biliar, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hematológico, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer peritoneal primario, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

En la presente descripción se describe que una composición comprende o suministra un anticuerpo anti-4-1BB humano de la presente descripción o un fragmento de unión al antígeno del mismo en una dosis de 0,01 mg/kg a

100 mg/kg. En la presente descripción se describe que una composición comprende o suministra un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno del mismo en una dosis de alrededor de 0,01 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg,

4 mg/kg, 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg,

80 mg/kg, 90 mg/kg o 100 mg/kg.

Descritos en la presente descripción, los anticuerpos anti-4-1BB humanos y/o los fragmentos de los mismos y/o las composiciones que los comprenden se caracterizan por inducir la proliferación aumentada de células T (por ejemplo, proliferación de células T CD8+) y/o la secreción aumentada de IFNy por las células T (por ejemplo, células T CD8+) en un sujeto.

La presente descripción proporciona métodos que incluyen administrar al sujeto una composición que comprende o suministra un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una o más terapias anticancerígenas adicionales. La presente descripción proporciona métodos que incluyen administrar al sujeto una composición que comprende o suministra un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una o más de las radiaciones ionizantes, un agente quimioterapéutico, un agente tipo anticuerpo y una terapia basada en células, de manera que el sujeto reciba tratamiento con ambos.

La presente descripción proporciona métodos que incluyen administrar al sujeto una composición que comprende o suministra un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará uno o más de un inhibidor de punto de control inmunitario, IL-12, GM-CSF,

un agente anti-CD4, fluorouracilo, doxorrubicina, irinotecán, paclitaxel, cisplatino o ciclofosfamida.

La presente descripción proporciona métodos que incluyen administrar al sujeto una composición que comprende o suministra un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un inhibidor de punto de control inmunitario, de manera que el sujeto recibe tratamiento con ambos. En la presente descripción se describe que un inhibidor de punto de control inmunitario es un agente que inhibe la señalización de PD-1. En la presente descripción se describe que un agente que inhibe la señalización de PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-PD-1 es nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, durvalumab o avelumab.

La presente descripción proporciona métodos para determinar una dosis de un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno del mismo para el tratamiento terapéutico de un sujeto que lo necesite. En la presente descripción se describe que tal método incluye (i) proporcionar u obtener una medición de IFN-gamma secretado en una muestra biológica del sujeto, en donde al sujeto se le ha administrado una composición que comprende o suministra una cantidad de un anticuerpo anti-4- 1BB o un fragmento de unión al antígeno descrito en la presente descripción; y (ii) comparar la medición del IFN-gamma secretado con un valor de referencia, donde si la medición del IFN-gamma secretado es mayor o menor que el valor de referencia, ajustar la cantidad de un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno del mismo para ser administrado, de esta manera se determina una dosis para el tratamiento terapéutico de un sujeto. En la presente descripción se describe que un valor de referencia comprende un valor índice que incluye un valor derivado de uno o más sujetos sanos, un valor derivado de uno o más sujetos diagnosticados de cáncer o un valor derivado de un algoritmo de predicción del riesgo de cáncer. En la presente descripción se describe que una muestra biológica es una muestra de sangre completa, plasma o suero.

En la presente descripción se describe que un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer. En la presente descripción se describe que un cáncer seleccionado de un cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de trompas de Falopio, cáncer de vesícula biliar, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hematológico, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer peritoneal primario, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de páncreas y cáncer de próstata. La presente descripción proporciona métodos para aumentar la secreción de IFN-y por una célula in vivo o in vitro que incluyen: poner en contacto la célula con un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno descrito en la presente descripción.

La presente descripción proporciona métodos de proliferación o aislamiento de células T activadas ex vivo que incluyen: poner en contacto una población de células T con un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno en la presente descripción se describe que lo que de esta manera aumenta la proliferación de las células T activadas.

La presente descripción proporciona métodos para aislar células T activadas específicas del antígeno que incluyen una o más etapas de: (a) cultivar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en un medio junto con un péptido de un epítopo de interés e IL-2; (b) inducir la expresión de 4-1BB en las células cultivadas mediante la adición del péptido del epítopo de interés; (c) poner en contacto las células cultivadas con una superficie recubierta con un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno en la presente descripción se describe que en donde las células cultivadas que expresan 4-1BB se adhieren a la superficie recubierta; y (d) eliminar las células no unidas, lo que de esta manera aísla las células T activadas específicas del antígeno. En la presente descripción se describe que las células T activadas son células T CD8+.

La presente descripción proporciona métodos para tratar o prevenir el cáncer en un sujeto que lo necesite que incluye administrar al sujeto una composición que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de células T activadas producidas por cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción. En la presente descripción se describe que un cáncer seleccionado de un cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de trompas de Falopio, cáncer de vesícula biliar, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hematológico, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer peritoneal primario, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de páncreas y cáncer de próstata. En la presente descripción se describe que una composición incluye al menos 109, al menos 1010 células, o más de 1010 células T activadas. En la presente descripción se describe que las células T activadas son células T CD8+.

También se proporcionan, entre otras cosas, tecnologías para caracterizar anticuerpos anti 4-1BB humanos y/o un fragmento de los mismos como se describe en la presente descripción y/o composiciones que comprenden los mismos. En la presente descripción se describen métodos para caracterizar anticuerpos anti-4-1BB humano y/o un fragmento de los mismos y/o composiciones que comprenden la misma unión a las células de AML (por ejemplo, HL60). En la presente descripción se describen métodos para caracterizar anticuerpos anti-4-1BB humanos y/o un fragmento de los mismos y/o composiciones que los comprenden mediante ELISA, inmunohistoquímica, ensayos de unión Biacore, espectrometría de masas, cromatografía de enfoque isoeléctrico (IEF) y/o transferencia Western. La presente descripción proporciona diversas tecnologías relacionadas con la realización o fabricación de anticuerpos anti-4-1BB humano y/o un fragmento de los mismos como se describe en la presente descripción y/o composiciones que contienen dichos anticuerpos o un fragmento de los mismos.

Como se usa en esta solicitud, los términos “alrededor de” y “aproximadamente” se usan como equivalentes. Cualquier número usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente pretende abarcar cualquiera de las fluctuaciones normales apreciadas por un experto en la técnica en cuestión.

La presente invención es como se establece en las reivindicaciones. Otras características, objetos y ventajas son evidentes en la descripción detallada que sigue. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada se proporciona solo a modo de ilustración, no de limitación.

Breve descripción de los dibujos

El dibujo que se incluye en la presente descripción, compuesto por las siguientes Figuras, es solamente con propósitos de ilustración y no de limitación. Los anteriores y otros objetos, aspectos, características y ventajas de la presente descripción se harán más evidentes y se entenderán mejor al hacer referencia a la siguiente descripción tomada junto con las figuras adjuntas en las que:

La Figura 1A representa construcciones del dominio extracelular (ECD) de 4-1BB humano. En la parte superior hay un esquema de un ECD de 4-1BB de longitud completa (167 aminoácidos), y a continuación se muestran fragmentos de un ECD de 4-1BB: R1 (1-55 aa), R2 (56-110 aa), R3 (110-167 aa), R1.1 (1-45 aa), R1.2 (1-35 aa), R1.3 (11-55 aa), R1.4 (21-55 aa) R1.5 (1-25 aa) y R1.6 (1-30 aa). Cada una de estas construcciones ECD de 4-1BB se fusionó con GST. La Figura IB representa una transferencia Western que muestra la unión de un anticuerpo anti-4-1BB humanizado ilustrativo a construcciones de fusión ECD de 4-1BB como se describe en la Figura. 1A. Como se muestra, un anticuerpo anti-4-1BB humanizado ilustrativo se une a un polipéptido de fusión ECD de 4-1BB de longitud completa y al polipéptido de fusión R1, pero no a los polipéptidos de fusión R2 o R3. Los marcadores de tamaño molecular se indican en kDa a la izquierda.

La Figura 2A representa un gel SDS-PAGE de extractos de células completas de células que expresan las construcciones de fusión de un ECD de 4-1BB. Las construcciones de fusión como se describió anteriormente en la Figura 2A se expresaron en las células BL21 de E. coli inducidas con IPTG 1 mM y los extractos de células completas se resolvieron mediante SDS-PAGE al 12 %. Como se muestra, todas las construcciones de fusión (ECD, R1, R1.1, R1.2, R1.3, R1.4, R1.5 y R1.6) tienen una expresión de proteínas robusta. La Figura 2B representa una transferencia Western que muestra la unión de un anticuerpo anti-4-1BB humanizado ilustrativo al polipéptido de fusión ECD de 4-1BB de longitud completa, y a los polipéptidos de fusión R1.1, R1.2, R1.3 y R1.6, pero no a los polipéptidos de fusión R1.4 o R1.5. Se realizaron inmunotransferencias con un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo. Los marcadores de tamaño molecular se indican en kDa a la izquierda.

La Figura 3 representa la afinidad de unión de los anticuerpos monoclonales anti-4-1BB por el antígeno 4-1BB humano recombinante, medida por ELISA. Los valores de DO⁴⁵⁰nm se representan en el eje y, y las concentraciones crecientes de los anticuerpos anti-4-1BB (en pg/mL) a lo largo del eje x. BBK-4 (círculos) es un anticuerpo murino anti-4-1BB humano, 94G1 (cuadrados), 94K (triángulos que apuntan hacia arriba), 94KV (diamantes), 94KVT (estrellas) y EU101 (triángulos que apuntan hacia abajo) son anticuerpos anti-4-1BB variantes humanizados ilustrativos.

La Figura 4 representa la unión de anticuerpos monoclonales anti-4-1BB a células T Jurkat que expresan 4-1BB (Jurkat 8-1). Los valores de intensidad de fluorescencia media (MFI) se representan en el eje y y la concentración Log10 de anticuerpo (en pg/mL) a lo largo del eje x. BBK-4 (círculos) es un anticuerpo murino anti-4-1BB humano, 94G1 (cuadrados), 94K (triángulos que apuntan hacia arriba), 94KV (diamantes), 94KVT (estrellas) y EU101 (triángulos que apuntan hacia abajo) son anticuerpos anti-4-1BB variantes humanizados ilustrativos.

La Figura 5 proporciona una tabla que enumera las afinidades de unión in vitro de los anticuerpos anti-4-1BB variantes para 4-1BB. La afinidad de unión se midió mediante el uso de resonancia de plasmón superficial (SPR, Biacore 3000). 94G1 y EU101 son anticuerpos anti-4-1BB variantes humanizados ilustrativos.

La Figura 6 representa la unión de anticuerpos monoclonales anti-4-1BB a células T CD8+ que expresan 4-1BB. Las células T CD8+ se aislaron de PBMC humanas y se activaron mediante el anticuerpo anti-CD3 durante 2 días. 4-1BB-PE es un anticuerpo anti-4-1BB disponible comercialmente ilustrativo, BBK-4 es un anticuerpo murino anti-4-1BB humano, 94G1, 94K, 94KV, 94KVT y EU101 son anticuerpos anti-4-1BB variantes humanizados ilustrativos. El gráfico en el panel inferior refleja los valores mostrados para cada anticuerpo en los datos de FACS en los paneles superiores.

La Figura 7 representa un gráfico que cuantifica la proliferación in vitro de células T CD8+ tratadas con anticuerpos anti-4-1BB. Las células T CD8+ en proliferación se trataron sin anticuerpo, con IgG humana sola, BBK-4 o un anticuerpo anti-4-1BB variante humanizado ilustrativo: 94G1, 94K, 94KV, 94KVT y EU101 y tratadas con WST-1 (sal de tetrazolio soluble en agua) para teñir las células en proliferación (es decir, metabólicamente activas).

La Figura 8 representa un gráfico que cuantifica la secreción de IFNy in vitro por las células T CD8+ tratadas con anticuerpos anti-4-1BB. Las células T CD8+ se aislaron de PBMC humanas y se trataron sin anticuerpo, con IgG humana sola o 1 pg/mL de un anticuerpo anti-4-1BB: BBK-4, 94G1, 94K, 94KV, 94KVT y EU101. Se evaluó la secreción de IFNy los días 1,3 y 5.

La Figura 9 muestra gráficos que representan la secreción de IFN.y en (A) CD4+ y (B) CD8+. Después de aislarse de las PBMC de un donante sano, las células T activadas presentes en las PBMC se dejaron en reposo en un medio RPMI-1640 FBS al 2 % durante 24 horas, y las PBMC en reposo se trataron con un anticuerpo anti-CD4 unido a perlas de hierro o un anticuerpo anti-CD8 y las células CD4+ o las células CD8+ se aislaron mediante el uso de un separador magnético MACS. Las células T CD4+ o las células T CD8+ aisladas se trataron con un activador de células T, anti-CD3, para inducir la expresión de 4-1BB, y se trataron con EU101 a diferentes concentraciones (0,5, 1,0, 2,5 y 5,0 pg/mL) o una IgG humana de control (5,0 pg/mL) durante 3 días. Después de 3 días, se obtuvo un medio de cultivo que excluía las células y se evaluó la fluorescencia del IFN.y humano en el medio de cultivo mediante ELISA (ebioscience). Los resultados se compararon con una curva estándar proporcionada en un kit de ELISA de IFN-y.

La Figura 10A muestra un gráfico que representa la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) de los anticuerpos anti-4-1BB humano ilustrativos BBK4, 94G1, 94KVT y EU101. La Figura 10B muestra un gráfico que representa la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de los anticuerpos anti-4-1BB humano ilustrativos BBK4, 94G1 y EU101.

La Figura 11 muestra los efectos anticancerígenos in vivo de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) por concentración, que se miden como tamaños de tumores después de que se inyectaron por vía subcutánea células tumorales de cáncer de colon (HT29) en ratones humanizados, y cuando los tamaños de los tumores alcanzan de 100 a 200 mm3, se administró por vía intravenosa a ratones un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) a dosis de 1,0 mg, 5,0 mg y 10,0 mg por 1 kg de peso corporal una vez cada 5 días 3 veces (datos representativos).

La Figura 12 muestra los efectos anticancerígenos de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) y un anticuerpo anti-PD-1 ilustrativo (Keytruda, “KD”) por concentración. Los efectos anticancerígenos se midieron como tamaños de tumores después de la inyección subcutánea de células tumorales de cáncer de colon (HT29) en ratones humanizados y del tratamiento con anticuerpos. Cuando los tamaños de los tumores alcanzaron de 100 a 150 mm3, los ratones se trataron con un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) o un anticuerpo anti-PD-1 ilustrativo (Keytruda) mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 5,0 mg y 10,0 mg por 1 kg de peso corporal una vez cada 5 días tres veces.

La Figura 13 muestra los efectos anticancerígenos comparativos del tratamiento individual y la terapia de combinación de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) y un anticuerpo anti-PD-1 ilustrativo (Keytruda). Los efectos anticancerígenos se midieron como tamaños de tumores después de inyectar por vía subcutánea células tumorales de cáncer de colon (HT29) en ratones humanizados y del tratamiento con anticuerpos. Cuando los tamaños de los tumores alcanzan de 300 a 450 mm3, se administró un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) a 2,5 mpk para el tratamiento individual, se administró un anticuerpo anti-PD-1 ilustrativo (Keytruda) a 2,5 mpk para el tratamiento individual, y se administraron EU101, 2,5 mpk Keytruda, 2,5 mpk para la terapia de combinación. La administración se realizó mediante inyección intraperitoneal en ratones, una vez cada tres días, para un total de tres veces.

La Figura 14A muestra los números de células T CD4+ y células T CD8+ humanas que circularon en sangre de ratón 0 en 1 gramo de tejido tumoral a los 34 días después del tratamiento con un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) y un anticuerpo anti-PD-1 ilustrativo (Keytruda), individualmente y en combinación, en ratones humanizados con tumores implantados, como se describe en la Figura 13. El número de linfocitos infiltrantes de células T (TIL) en los tumores se midió mediante el cálculo de las relaciones proporcionales del número total de células mediante la medición de las relaciones (%) de células T CD4+ y células T CD8+ mediante el uso de un citómetro de flujo. Se realizó citometría de flujo para medir las relaciones (%) de células T CD4+ y células T CD8+ después de teñir las células con un anticuerpo CD4 marcado con FITC, un anticuerpo CD8 marcado con BV510 fluorescente y un anticuerpo CD45 marcado con APC-cy7 fluorescente, y un marcador de células sanguíneas humanas, se separaron las células positivas para CD45 de un programa de citometría de flujo (compuerta). La Figura 14B muestra una relación de Treg (células T CDd FoxpShigh) por relación de células T CD8+IFN.y+ medida mediante el cálculo de una relación proporcional entre la relación de células T CD8+IFN.y+ y la relación de Treg (células T CD4~Foxp3high) mediante el uso de un citómetro de flujo después de que las células se tiñeron con CD45 marcado con APC-cy7 fluorescente, un anticuerpo CD8 marcado con BV510 fluorescente, un anticuerpo CD4 marcado con FITC fluorescente, INFy marcado con PE fluorescente y anticuerpo Foxp3 marcado con APC fluorescente.

La Figura 15A y la Figura 15B muestran los resultados del análisis de IFN.y a través del suero y el fluido tumoral después del tratamiento individual y combinado de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) y un anticuerpo anti-PD-1 ilustrativo (Keytruda). Después de la disección realizada en todos los grupos tratados que se muestran en las Figuras 15A y 15B, se analizaron 10 pL de suero y 100 pL de fluido tumoral con kits de ELISA de IFN.y humano y TGF-B humano.

La Figura 16A muestra las relaciones de células T CD8+ específicas del antígeno (relación de células T 4-1BB+CD8+: 43,2 %, relación de células T CD8+: 58,6 %) medidos antes del cribado con un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101). La Figura 16B muestra las relaciones de células T CD8 específicas del antígeno (relación de células T pCMV+CD8+: 60,0 %, relación de células T CD8+: 79,3 %) medidas después del cribado con un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101).

Determinadas definiciones

En la descripción que sigue, se utilizan ampliamente diversos términos usados en ADN recombinante e inmunología. Con el objetivo de proporcionar una comprensión clara y consistente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se proporcionan las siguientes definiciones.

Alrededor de: El término “alrededor de”, cuando se usa en la presente descripción en referencia a un valor, se refiere a un valor que es similar, en contexto al valor referenciado. En general, los expertos en la técnica, familiarizados con el contexto, apreciarán el grado de variación relevante abarcado por “alrededor de” en ese contexto. Por ejemplo, en la presente descripción se describe que el término “alrededor de” puede abarcar un intervalo de valores dentro del 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2%, 1 % o menos del valor referido.

Administración: Como se usa en la presente descripción, el término “administración” se refiere típicamente a la administración de una composición a un sujeto o sistema para lograr el suministro de un agente que es o está incluido en la composición. Los expertos en la técnica conocerán una diversidad de vías que, en circunstancias apropiadas, pueden utilizarse para la administración a un sujeto, por ejemplo, un ser humano. Por ejemplo, en la presente descripción se describe que la administración puede ser ocular, oral, parenteral, tópica, etcétera. En la presente descripción se describe que la administración puede ser bronquial (por ejemplo, mediante instilación bronquial), bucal, dérmica (que puede ser o comprender, por ejemplo, uno o más de tópicos a la dermis, intradérmica, interdérmica, transdérmica, etcétera), enteral, intraarterial, intradérmica, intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intraventricular, dentro de un órgano específico (por ejemplo, intrahepática), mucosal, nasal, oral, rectal, subcutánea, sublingual, tópica, traqueal (por ejemplo, mediante instilación intratraqueal), vaginal, vítrea, etcétera. En la presente descripción se describe que la administración puede implicar solo una dosis única. En la presente descripción se describe que la administración puede implicar la aplicación de un número fijo de dosis. En la presente descripción se describe que la administración puede implicar una dosificación que es intermitente (por ejemplo, una pluralidad de dosis separadas en el tiempo) y/o una dosificación periódica (por ejemplo, dosis individuales separadas por un período de tiempo común). En la presente descripción se describe que la administración puede implicar una dosificación continua (por ejemplo, perfusión) durante al menos un período de tiempo seleccionado.

Afinidad. Como se conoce en la técnica, la “afinidad” es una medida de la fuerza con que un ligando particular se une a su pareja. Las afinidades pueden medirse de diferentes maneras. En la presente descripción se describe que la afinidad se mide mediante un ensayo cuantitativo. En la presente descripción se describe que la concentración de la pareja de unión puede fijarse para que esté en exceso de concentración del ligando para imitar las condiciones fisiológicas. Alternativa o adicionalmente, en la presente descripción se describe que la concentración de la pareja de unión y/o la concentración del ligando pueden variar. En la presente descripción se describe que la afinidad puede compararse con una referencia en condiciones comparables (por ejemplo, concentraciones).

Agonista. Los expertos en la técnica apreciarán que el término “agonista” puede usarse para referirse a una condición de un agente o evento cuya presencia, nivel, grado, tipo o forma se correlaciona con un nivel o actividad aumentada de otro agente (es decir, el agente agonizante). En general, un agonista puede ser o incluir un agente de cualquier clase química que incluye, por ejemplo, moléculas pequeñas, polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos, metales y/o cualquier otra entidad que muestre la actividad activadora relevante. En la presente descripción se describe que un agonista puede ser directo (en cuyo caso ejerce su influencia directamente sobre su diana); en la presente descripción se describe que un agonista puede ser indirecto (en cuyo caso ejerce su influencia de otra manera que no sea unido a su diana; por ejemplo, mediante la interacción con un regulador de la diana, de modo que se altere el nivel o la actividad de la diana).

Animal: como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier miembro del reino animal. En la presente descripción se describe que un “animal se refiere a seres humanos, de cualquier sexo y en cualquier etapa del desarrollo. En la presente descripción se describe que un “animal se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa del desarrollo. En la presente descripción se describe que el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado, un primate y/o un cerdo). En la presente descripción se describe que los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En la presente descripción se describe que un animal puede ser un animal transgénico, un animal modificado genéticamente y/o un clon.

Antagonista: Los expertos en la técnica apreciarán que el término “antagonista”, como se usa en la presente descripción, se puede usar para referirse a una condición del agente o evento cuya presencia, nivel, grado, tipo o forma se correlaciona con un nivel o actividad disminuida de otro agente (es decir, el agente inhibido o la diana). En general, un antagonista puede ser o incluir un agente de cualquier clase química que incluye, por ejemplo, moléculas pequeñas, polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos, metales y/o cualquier otra entidad que muestre la actividad inhibitoria relevante. En la presente descripción se describe que un antagonista puede ser directo (en cuyo caso ejerce su influencia directamente sobre su diana); en la presente descripción se describe que un antagonista puede ser indirecto (en cuyo caso ejerce su influencia de otra manera que no sea unido a su diana; por ejemplo, mediante la interacción con un regulador de la diana, de modo que se altere el nivel o la actividad de la diana).

Anticuerpo: Como se usa en la presente descripción, el término “anticuerpo” se refiere a un polipéptido que incluye elementos de secuencia de inmunoglobulina canónicos suficientes para conferir unión específica a un antígeno diana particular. Como se conoce en la técnica, los anticuerpos intactos producidos en la naturaleza son agentes tetraméricos de aproximadamente 150 kD que comprenden dos polipéptidos de la cadena pesada idénticos (alrededor de 50 kD cada uno) y dos polipéptidos de la cadena ligera idénticos (alrededor de 25 kD cada uno) que se asocian entre sí en lo que comúnmente se conoce como una estructura en “forma de Y”. Cada cadena pesada comprende al menos cuatro dominios (cada uno de alrededor de 110 aminoácidos de longitud): un dominio variable amino-terminal (VH) (situado en las puntas de la estructura Y), seguido de tres dominios constantes: CH1, CH2 y el CH3 carboxilo-terminal (situado en la base del tallo de la Y). Una región corta, conocida como el “interruptor”, conecta las regiones variable y constante de la cadena pesada. La “bisagra” conecta los dominios CH2 y CH3 con el resto del anticuerpo. Dos enlaces disulfuro en esta región de bisagra conectan los dos polipéptidos de la cadena pesada entre sí en un anticuerpo intacto. Cada cadena ligera comprende dos dominios: un dominio variable aminoterminal (VL), seguido de un dominio constante carboxilo-terminal (CL), separados entre sí por otro “interruptor”. Los tetrámeros de anticuerpos intactos comprenden dos dímeros de la cadena pesada-cadena ligera en los que las cadenas pesada y ligera están unidas entre sí mediante un único enlace disulfuro; otros dos enlaces disulfuro conectan las regiones de bisagra de la cadena pesada entre sí, de modo que los dímeros se conectan entre sí y se forma el tetrámero. Los anticuerpos producidos naturalmente también están glicosilados, típicamente en el dominio CH2. Cada dominio en un anticuerpo natural tiene una estructura caracterizada por un “pliegue de inmunoglobulina” formado a partir de dos láminas beta (por ejemplo, láminas de 3, 4 o 5 hebras) empaquetadas entre sí en un barril beta antiparalelo comprimido. Cada dominio variable contiene tres lazos hipervariables conocidos como “regiones determinantes de complementariedad” (CDR1, CDR2 y CDR3) y cuatro regiones “marco” algo invariantes (FR1, FR2, FR3 y FR4). Cuando los anticuerpos naturales se pliegan, las regiones FR forman las láminas beta que proporcionan el marco estructural para los dominios, y las regiones del lazo de las CDR de las cadenas pesada y ligera se unen en un espacio tridimensional para crear un único sitio de unión al antígeno hipervariable localizado en la punta de la estructura en Y. La región Fc de los anticuerpos de origen natural se une a elementos del sistema del complemento y también a los receptores de las células efectoras, que incluyen, por ejemplo, las células efectoras que median la citotoxicidad. Como se conoce en la técnica, la afinidad y/u otros atributos de unión de las regiones Fc por los receptores Fc se pueden modular mediante glicosilación u otra modificación. Descritos en la presente descripción, los anticuerpos producidos y/o utilizados incluyen dominios Fc glicosilados, que incluyen dominios Fc con tal glicosilación modificada o diseñada. En la presente descripción se describe que un polipéptido o complejo de polipéptidos que incluye suficientes secuencias del dominio de inmunoglobulina como se encuentran en anticuerpos naturales puede denominarse y/o usarse como un “anticuerpo”, ya sea que tal polipéptido se produzca naturalmente (por ejemplo, generado por un organismo que reacciona a un antígeno), o producido por ingeniería recombinante, síntesis química u otro sistema o metodología artificial. En la presente descripción se describe que un anticuerpo es policlonal; alternativamente en la presente descripción se describe que un anticuerpo es monoclonal. En la presente descripción se describe que un anticuerpo tiene secuencias de regiones constantes que son características de anticuerpos de ratón, conejo, primate o humano. Descritos en la presente descripción, los elementos de la secuencia de anticuerpos son humanizados, primatizados, quiméricos, etc., como se conoce en la técnica. Además, el término “anticuerpo”, como se usa en la presente descripción, puede referirse en partes apropiadas de la descripción (a menos que se indique lo contrario o sea claro por el contexto) a cualquiera de las construcciones o formatos desarrollados o conocidos en la técnica para utilizar las características estructurales y funcionales del anticuerpo en una presentación alternativa. Por ejemplo, como se describe en la presente descripción, un anticuerpo está en un formato seleccionado entre, pero no limitado a, anticuerpos IgA, IgG, IgE o IgM intactos; anticuerpos bi o multiespecíficos (por ejemplo, Zybodies®, etc.); fragmentos de anticuerpos tales como un fragmento Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd', fragmentos Fd y CDR aisladas o conjuntos de los mismos; Fvs monocatenarios; fusiones polipéptido-Fc; anticuerpos de dominio único (por ejemplo, anticuerpos de dominio único de tiburón tales como IgNAR o un fragmento de los mismos); anticuerpos de camélidos; anticuerpos enmascarados (por ejemplo, Probodies®); Inmunofarmacéuticos modulares pequeños (“SMIPs™ ); diacuerpos monocatenarios o en tándem (TandAb®); humacuerpos, VHH; Anticalins®; minicuerpos Nanobodies®; BiTE®s; proteínas de repetición de anquirina o DARPINs®; Avimers®; DARTs; anticuerpos de tipo TCR, Adnectins®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; Microproteínas; Fynomers®, Centyrins® y KALBITOR®s. En la presente descripción se describe que un anticuerpo puede perder una modificación covalente (por ejemplo, la unión de un glicano) que tendría si se produjera de forma natural. En la presente descripción se describe que un anticuerpo puede contener una modificación covalente (por ejemplo, la unión de un glicano, una carga útil [por ejemplo, un resto detectable, un resto terapéutico, un resto catalítico, etc.] u otro grupo pendiente [por ejemplo, polietilenglicol, etc.]

Fragmento de anticuerpo. Como se usa en la presente descripción, un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una porción de un anticuerpo o agente tipo anticuerpo como se describe en la presente descripción, y típicamente se refiere a una porción que incluye una porción de unión al antígeno o una región variable de la misma. Se puede producir un fragmento de anticuerpo por cualquier medio. Por ejemplo, en la presente descripción se describe que un fragmento de anticuerpo puede producirse enzimática o químicamente mediante la fragmentación de un anticuerpo o agente tipo anticuerpo intacto. Alternativamente, en la presente descripción se describe que un fragmento de anticuerpo se puede producir de forma recombinante (es decir, mediante la expresión de una secuencia de ácido nucleico modificada genéticamente. En la presente descripción se describe que un fragmento de anticuerpo puede producirse total o parcialmente de forma sintética. En la presente descripción se describe que un fragmento de anticuerpo (particularmente un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno) puede tener una longitud de al menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 aminoácidos o más, o al menos alrededor de 200 aminoácidos.

Unión: Se debe entender que el término “unión”, como se usa en la presente descripción, se refiere típicamente a una asociación no covalente entre dos o más entidades. La unión “directa” implica el contacto físico entre entidades o restos; la unión indirecta implica la interacción física por medio del contacto físico con una o más entidades intermedias. La unión entre dos o más entidades típicamente se puede evaluar en cualquiera de una diversidad de contextos, que incluyen cuando las entidades o restos que interactúan se estudian de forma aislada o en el contexto de sistemas más complejos (por ejemplo, mientras están asociados covalentemente o de cualquier otra manera con una entidad portadora y/o en un sistema biológico o célula).

Cáncer. Los términos “cáncer”, “malignidad”, “neoplasma”, “tumor” y “carcinoma” se usan en la presente descripción para referirse a células que exhiben un crecimiento relativamente anormal, incontrolado y/o autónomo, de modo que exhiben un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa del control de la proliferación celular. En la presente descripción se describe que un tumor puede ser o comprender células precancerígenas (por ejemplo, benignas), malignas, premetastásicas, metastásicas y/o no metastásicas. La presente descripción identifica específicamente determinados cánceres para los que sus enseñanzas pueden ser particularmente relevantes. En la presente descripción se describe que un cáncer relevante puede caracterizarse por un tumor sólido. En la presente descripción se describe que un cáncer relevante puede caracterizarse por un tumor hematológico. En general, los ejemplos de diferentes tipos de cánceres conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, cánceres hematopoyéticos que incluyen leucemias, linfomas (de Hodgkin y no Hodgkin), mielomas y trastornos mieloproliferativos; sarcomas, melanomas, adenomas, carcinomas de tejido sólido, carcinomas de células escamosas de la boca, garganta, laringe y pulmón, cáncer de hígado, cánceres genitourinarios tales como el cáncer de próstata, cuello uterino, vejiga, útero y endometrio y carcinomas de células renales, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de mama, cánceres gastrointestinales y cánceres del sistema nervioso, lesiones benignas tales como papilomas y similares.

CDR: como se usa en la presente descripción, se refiere a una región determinante de la complementariedad dentro de una región variable de un anticuerpo. Existen tres CDR en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, que se designan CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. Un “conjunto de CDR” o “conjunto CDR ” se refiere a un grupo de tres o seis CDR que están presentes en una región variable única capaz de unirse al antígeno o las CDR de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera cognadas capaces de unirse al antígeno. Se han establecido en la técnica determinados sistemas para definir los límites de las CDR (por ejemplo, Kabat, Chothia, etc.); los expertos en la técnica apreciarán las diferencias entre estos sistemas y son capaces de comprender los límites de las CDR en la medida necesaria para comprender y practicar la invención reivindicada.

Agente quimioterapéutico. El término “agente quimioterapéutico”, como se usa en la presente descripción, tiene su significado entendido en la técnica que se refiere a uno o más agentes proapoptóticos, citostáticos y/o citotóxicos, por ejemplo, que incluyen específicamente los agentes utilizados y/o recomendados para su uso en el tratamiento de una o más enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con la proliferación celular indeseable. Descritos en la presente descripción, los agentes quimioterapéuticos son útiles en el tratamiento del cáncer. En la presente descripción se describe que un agente quimioterapéutico puede ser o comprender uno o más agentes alquilantes, una o más antraciclinas, uno o más disruptores citoesqueléticos (por ejemplo, agentes dirigidos a microtúbulos tales como taxanos, maitansina y análogos de los mismos, de), una o más epotilonas, uno o más inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC), uno o más inhibidores de las topoisomerasas (por ejemplo, inhibidores de la topoisomerasa I y/o la topoisomerasa II), uno o más inhibidores de cinasas, uno o más análogos de nucleótidos o análogos de precursores de nucleótidos, uno o más antibióticos peptídicos, uno o más agentes basados en platino, uno o más retinoides, uno o más alcaloides de la vinca y/o uno o más análogos de uno o más de los siguientes (es decir, que comparten una actividad antiproliferativa relevante). En la presente descripción se describe que un agente quimioterapéutico puede ser o comprender uno o más de Actinomicina, Ácido retinoico todo-trans, una Auiristatina, Azacitidina, Azatioprina, Bleomicina, Bortezomib, Carboplatino, Capecitabina, Cisplatino, Clorambucil, Ciclofosfamida, Curcumina, Citarabina, Daunorrubicina, Docetaxel, Doxifluridina, Doxorrubicina, Epirubicina, Epotilona, Etopósido, Fluorouracilo, Gemcitabina, Hidroxiurea, Idarrubicina, Imatinib, Irinotecán, Maytansina y/o análogos de los mismos (por ejemplo, DM1) Mecloretamina, Mayreturina, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitoxantrona, un Maytansinoide, Oxaliplatino, Paclitaxel, Pemetrexed, Tenipósido, Tioguanina, Topotecán, Valrubicina, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina y combinaciones de los mismos. En la presente descripción se describe que se puede utilizar un agente quimioterapéutico en el contexto de un conjugado anticuerpo-fármaco. En la presente descripción se describe que un agente quimioterapéutico es uno que se encuentra en un conjugado anticuerpo-fármaco seleccionado del grupo que consiste en: hLL1-doxorrubicina, hRS7-SN-38, hMN-14-SN-38, hLL2-SN-38, hA20-SN-38, hPAM4-SN-38, hLL1-SN-38, hRS7-Pro-2-P-Dox, hMN-14-Pro-2-P-Dox, hLL2-Pro-2-P-Dox, hA20-Pro-2-P-Dox, hPAM4-Pro-2-P-Dox, hLL1- Pro-2-P-Dox, P4/D10-doxorubicina, gemtuzumab ozogamicina, glembatumomab vedotina, SAR3419, SAR566658, BIIB015, BT062, SGN-75, SGN-CD19A, AMG-172, AMG-595, BAY-94-9343, ASG-5ME, ASG-22ME, ASG-16M8F, MDX-1203, MLN-0264, anti-PSMA ADC, RG-7450, RG-7458, RG-7593, RG- 7596, RG-7598, RG-7599, RG-7600, RG-7636, ABT-414, IMGN-853, IMGN-529, vorsetuzumab mafodotina y lorvotuzumab mertansina.

Terapia de combinación: Como se usa en la presente descripción, el término “terapia de combinación” se refiere a aquellas situaciones en las que un sujeto se expone simultáneamente a dos o más regímenes terapéuticos (por ejemplo, dos o más agentes terapéuticos). En la presente descripción se describe que los dos o más regímenes terapéuticos se pueden administrar simultáneamente. En la presente descripción se describe que los dos o más regímenes terapéuticos se pueden administrar secuencialmente (por ejemplo, un primer régimen administrado antes de la administración de cualquier dosis de un segundo régimen). En la presente descripción se describe que los dos o más regímenes terapéuticos se administran en regímenes de dosificación superpuestos. En la presente descripción se describe que la administración de la terapia de combinación puede implicar la administración de uno o más agentes o modalidades terapéuticas a un sujeto que recibe el(los) otro(s) agente(s) o modalidad.

Que corresponde a: Como se usa en la presente descripción, el término “que corresponde a” puede usarse para designar la posición/identidad de un elemento estructural en un compuesto o composición mediante la comparación con un compuesto o composición de referencia apropiado. Por ejemplo, en la presente descripción se describe que un residuo monomérico en un polímero (por ejemplo, un residuo de aminoácido en un polipéptido o un residuo de ácido nucleico en un polinucleótido) puede identificarse como “que corresponde a” un residuo en un polímero de referencia apropiado. Por ejemplo, los expertos apreciarán que, con fines de simplicidad, los residuos en un polipéptido frecuentemente se designan mediante el uso de un sistema de numeración canónico basado en un polipéptido relacionado de referencia, de manera que un aminoácido “que corresponde a” un residuo en la posición 190, por ejemplo, no necesariamente es el aminoácido 190 en una cadena de aminoácidos particular sino que corresponde al residuo encontrado en 190 en el polipéptido de referencia; los expertos en la técnica apreciarán fácilmente cómo identificar los aminoácidos “correspondientes”. Por ejemplo, los expertos en la técnica conocerán varias estrategias de alineamiento de secuencias, que incluyen programas de software tales como, por ejemplo, BLAST, CS- BLAST, CUSASW++, DIAMOND, FASTA, GGSEARCH/GLSEARCH, Genoogle, HMMER, HHpred/HHsearch, IDF, Infernal, KLAST, USEARCH, parasail, PSI-BLAST, PSI-Search, ScalaBLAST, Sequilab, SAM, SSEARCH, SWAPHI, SWAPHLLS, SWIMM o ^sW ⁱPE que se pueden utilizar, por ejemplo, para identificar residuos “correspondientes” en polipéptidos y/o ácidos nucleicos de acuerdo con la presente descripción.

Modificado genéticamente: En general, el término “modificado genéticamente” se refiere al aspecto de haber sido manipulado por la mano del hombre. Por ejemplo, se considera que un polipéptido está “modificado genéticamente” cuando la secuencia polipeptídica es manipulada por la mano del hombre. Por ejemplo, en la presente descripción se describe que un polipéptido modificado genéticamente comprende una secuencia que incluye una o más mutaciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos que han sido introducidas por la mano del hombre en una secuencia polipeptídica de referencia. De manera similar, una célula u organismo se considera “modificado genéticamente” si ha sido manipulado de modo que se altere su información genética (por ejemplo, se ha introducido nuevo material genético que no estaba previamente presente, por ejemplo, mediante transformación, apareamiento, hibridación somática, transfección, transducción u otro mecanismo, o se altera o elimina el material genético previamente presente, por ejemplo, mediante sustitución o mutación por eliminación, o mediante protocolos de apareamiento). Como es práctica común y se entiende por los expertos en la técnica, los derivados y/o la progenie de un polipéptido o célula modificado genéticamente típicamente todavía se refieren como “modificado genéticamente” incluso aunque la manipulación real se realizara en una entidad anterior.

Epítopo: como se usa en la presente descripción, incluye cualquier resto que se reconozca específicamente por un componente de unión a una inmunoglobulina (por ejemplo, anticuerpo o receptor). En la presente descripción se describe que un epítopo está comprendido por una pluralidad de átomos o grupos químicos en un antígeno. En la presente descripción se describe que tales átomos o grupos químicos se exponen en la superficie cuando el antígeno adopta una conformación tridimensional relevante. En la presente descripción se describe que tales átomos o grupos químicos están cerca físicamente entre sí en el espacio cuando el antígeno adopta una conformación tal. En la presente descripción se describe que al menos algunos de tales átomos o grupos químicos están separados físicamente entre sí cuando el antígeno adopta una conformación alternativa (por ejemplo, se linealiza).

Ex vivo: como se usa en la presente descripción se refiere a eventos biológicos que ocurren fuera del contexto de un organismo multicelular. Por ejemplo, en el contexto de sistemas basados en células, el término puede usarse para referirse a eventos que ocurren entre una población de células (por ejemplo, proliferación celular, secreción de citocinas, etc.) en un ambiente artificial.

Marco o región del marco, como se usa en la presente descripción, se refiere a las secuencias de una región variable menos las CDR. Debido a que una secuencia de CDR puede determinarse mediante diferentes sistemas, igualmente una secuencia del marco se somete a diferentes interpretaciones correspondientes. Las seis CDR dividen las regiones del marco en las cadenas pesadas y ligeras en cuatro subregiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en la cual la CDR1 se ubica entre FR1 y FR2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las subregiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región del marco, como se refiere por otros, representa las FR combinadas dentro de la región variable de una cadena de inmunoglobulina única, de origen natural. Como se usa en la presente descripción, una FR representa una de las cuatro subregiones, FR1, por ejemplo, representa la primera región del marco más cercana al extremo amino terminal de la región variable y 5' con respecto a CDR1, y las FR representan dos o más de las subregiones que constituyen una región del marco.

Humanizado: como se conoce en la técnica, el término “humanizado" se usa comúnmente para referirse a anticuerpos (o componentes de anticuerpos) cuya secuencia de aminoácidos incluye secuencias de las regiones Vh y V^lde un anticuerpo de referencia producido en una especie no humana (por ejemplo, un ratón), pero además incluye modificaciones en aquellas secuencias con relación al anticuerpo de referencia que se pretende volver más "humano \es decir, más similar a las secuencias variables de la línea germinal humana. En la presente descripción se describe que un anticuerpo “humanizado" (o componente de anticuerpo) es uno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés y que tiene una región del marco (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos como las de un anticuerpo humano, y una región determinante de la complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos como las de un anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')², FabC, Fv) en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, inmunoglobulina donante) y todas o sustancialmente todas las regiones del marco son las de una secuencia consenso de una inmunoglobulina humana. En la presente descripción se describe que un anticuerpo humanizado comprende, además, al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una región constante de una inmunoglobulina humana. En la presente descripción se describe que un anticuerpo humanizado contiene la cadena ligera así como también al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo puede incluir, además, una región Ch1, de bisagra, C^h2, Ch3, y, opcionalmente, una región C^H4 de una región constante de una cadena pesada.

In vitro'. El término “in vitro”: como se usa en la presente descripción, se refiere a eventos que ocurren en un ambiente artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etcétera, en vez de en el interior de un organismo pluricelular.

In vivo: como se usa en la presente descripción, se refiere a eventos que ocurren dentro de un organismo pluricelular, tal como un ser humano y un animal no humano. En el contexto de los sistemas basados en células, el término puede usarse para referirse a eventos que ocurren dentro de una célula viva (a diferencia, por ejemplo, de los sistemas in vitro).

Aislado: como se usa en la presente descripción, se refiere a una sustancia y/o entidad que (1) se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente (en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) se ha diseñado, producido, preparado, y/o fabricado por la acción del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de alrededor de 10 %, alrededor de 20 %, alrededor de 30 %, alrededor de 40 %, alrededor de 50 %, alrededor de 60 %, alrededor de 70 %, alrededor de 80 %, alrededor de 90 %, alrededor de 91 %, alrededor de 92 %, alrededor de 93 %, alrededor de 94 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de 99 %, o más de alrededor de 99 % de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En la presente descripción se describe que los agentes aislados son alrededor de 80 %, alrededor de 85 %, alrededor de 90 %, alrededor de 91 %, alrededor de 92 %, alrededor de 93 %, alrededor de 94 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de 99 % o más de alrededor de 99 % puros. Como se usa en la presente descripción, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. En la presente descripción se describe que como comprenderán los expertos en la técnica, una sustancia aún puede considerarse “aislada' o incluso “pura”, después de haberse combinado con otros determinados componentes tales como, por ejemplo, uno o más portadores o excipientes (por ejemplo, tampón, solvente, agua, etc.); en la presente descripción se describe que un porcentaje de aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir tales portadores o excipientes. Solo para dar un ejemplo descrito en la presente descripción un polipéptido o polinucleótido de origen natural se considera “aislado” cuando, a) en virtud de su origen o fuente de derivación no se asocia con algunos o todos los componentes que lo acompañan en su estado nativo en la naturaleza; b) está sustancialmente libre de otros polipéptidos o ácidos nucleicos de la misma especie de la especie que se produce en la naturaleza; c) se expresa o se asocia de cualquier otra manera con componentes de una célula u otro sistema de expresión que no es de la especie que lo produce en la naturaleza. Por lo tanto, por ejemplo, en la presente descripción se describe que un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente del que lo produce en la naturaleza se considera un polipéptido “aislado”. Alternativamente o adicionalmente, en la presente descripción se describe que un polipéptido que se ha sometido a una o más técnicas de purificación puede considerarse un polipéptido “aislado” en la medida que se ha separado de otros componentes: a) con los que se asocia en la naturaleza; y/o b) con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente.

K^d: como se usa en la presente descripción, se refiere a la constante de disociación de un agente de unión (por ejemplo, un anticuerpo o componente de unión del mismo) de un complejo con su pareja (por ejemplo, el epítopo al que se une el anticuerpo o componente de unión del mismo que se une).

Unido operativamente: como se usa en la presente descripción, se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Un elemento de control "unido operativamente" a un elemento funcional se asocia de tal manera que la expresión y/o actividad del elemento funcional se consigue en condiciones compatibles con el elemento de control. En la presente descripción se describe que "unido operativamente" los elementos de control son contiguos (por ejemplo, unidos covalentemente) con los elementos de codificación de interés; descritos en la presente descripción, los elementos de control actúan en trans hacia o de cualquier otra manera en a desde el elemento funcional de interés.

Composición farmacéutica . Como se usa en la presente descripción, el término “composición farmacéutica” se refiere a una composición en la que se formula un agente activo junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. En la presente descripción se describe que una composición es adecuada para la administración a un sujeto humano o animal. En la presente descripción se describe que el agente activo está presente en una cantidad de dosis unitaria apropiada para la administración en un régimen terapéutico que muestra una probabilidad estadísticamente significativa de lograr un efecto terapéutico predeterminado cuando se administra a una población relevante.

Polipéptido: El término “polipéptido”, como se usa en la presente descripción, generalmente tiene su significado reconocido en la técnica de un polímero de al menos tres aminoácidos. Los expertos en la técnica apreciarán que el término “polipéptido” pretende ser lo suficientemente general como para abarcar no solo los polipéptidos que tienen una secuencia completa mencionada en la presente descripción, sino también para abarcar polipéptidos que representan fragmentos funcionales (es decir, fragmentos que retienen al menos una actividad) de tales polipéptidos completos. Además, los expertos en la técnica comprenden que las secuencias de proteínas generalmente toleran alguna sustitución sin destruir la actividad. Por lo tanto, cualquier polipéptido que retenga actividad y comparta al menos alrededor de 30-40 % de identidad de secuencia general, a menudo mayor que alrededor de 50 %, 60 %, 70 % u 80 %, y además usualmente incluye al menos una región de identidad mucho mayor, a menudo más del 90 % o incluso del 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en una o más regiones altamente conservadas, que usualmente abarcan al menos 3-4 y, a menudo, hasta 20 o más aminoácidos, con otro polipéptido de la misma clase, se engloba dentro del término relevante “polipéptido” como se usa en la presente descripción. Los polipéptidos pueden contener L-aminoácidos, D-aminoácidos o ambos y pueden contener cualquiera de una diversidad de modificaciones de aminoácidos o análogos conocidos en la técnica. Las modificaciones útiles incluyen, por ejemplo, acetilación terminal, amidación, metilación, etc. En la presente descripción se describe que las proteínas pueden comprender aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, aminoácidos sintéticos y combinaciones de los mismos. El término “péptido” se usa generalmente para referirse a un polipéptido que tiene una longitud de menos de alrededor de 100 aminoácidos, menos de alrededor de 50 aminoácidos, menos de 20 aminoácidos o menos de 10 aminoácidos. En la presente descripción se describe que las proteínas son anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, porciones biológicamente activas de los mismos y/o porciones características de los mismos.

Prevenir o prevención, como se usa en la presente descripción cuando se usa en relación con la ocurrencia de una enfermedad, trastorno, y/o afección, se refiere a reducir el riesgo de desarrollar la enfermedad, trastorno y/o afección y/o a retrasar la aparición y/o la gravedad de una o más características o síntomas de la enfermedad, trastorno o afección. En la presente descripción se describe que la prevención se evalúa sobre una base poblacional de manera que se considera que un agente se considera “que previene” una enfermedad, trastorno o afección particular si se observa una disminución estadísticamente significativa en el desarrollo, frecuencia, y/o intensidad de uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno o afección en una población susceptible a la enfermedad, trastorno o afección.

Recombinante como se usa en la presente descripción, pretende hacer referencia a polipéptidos que se diseñan, modifican genéticamente, preparan, expresan, crean, fabrican y/o aíslan por medios recombinantes, tales como polipéptidos expresados mediante el uso de un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped; polipéptidos aislados de una biblioteca de polipéptidos humanos combinatorios recombinante; polipéptidos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón, conejo, oveja, pez, etc) que es transgénico o que ha sido manipulado para expresar un gen o genes, o componentes genéticos que codifican y/o la expresión directa del polipéptido o uno o más componente(s), parte(s), elemento(s) o dominio(s) de los mismos; y/o polipéptidos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique empalmar o ligar elementos de secuencia de ácido nucleico seleccionados entre sí, sintetizar químicamente elementos de secuencia seleccionados y/o generar de cualquier otra manera un ácido nucleico que codifique y/o dirija la expresión del polipéptido o uno o más componente(s), parte(s), elemento(s) o dominio(s) del mismo. En la presente descripción se describe que uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados se encuentran en la naturaleza. En la presente descripción se describe que uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados se diseñan in silico. En la presente descripción se describe que uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados resultan de mutagénesis (por ejemplo, in vivo o in vitro) de un elemento de secuencia conocido, por ejemplo, de una fuente natural o sintética tal como, por ejemplo, en la línea germinal de un organismo fuente de interés (por ejemplo, de un ser humano, un ratón, etc).

Unión específica: Como se usa en la presente descripción, el término “unión específica” se refiere a una capacidad para discriminar entre posibles parejas de unión en el ambiente en el que se va a producir la unión. Un agente de unión que interactúa con una diana particular cuando están presentes otras dianas potenciales se dice que “se une específicamente" a la diana con la que interactúa. En la presente descripción se describe que una unión específica particular se evalúa mediante la detección o determinación del grado de asociación entre el agente de unión y su pareja; una unión específica particular se evalúa mediante la detección o determinación del grado de disociación de un complejo entre el agente de unión y su pareja; una unión específica particular se evalúa mediante la detección o determinación de la capacidad del agente de unión para competir con una interacción alternativa entre su pareja y otra entidad. En la presente descripción se describe que una unión específica particular se evalúa mediante la realización de tales detecciones o determinaciones en un intervalo de concentraciones.

Sujeto: Como se usa en la presente descripción, el término “sujeto” se refiere a un organismo, típicamente un mamífero (por ejemplo, un ser humano, que incluye las formas humanas prenatales). En la presente descripción se describe que un sujeto padece de una enfermedad, trastorno o afección relevante. En la presente descripción se describe que un sujeto es susceptible a una enfermedad, trastorno o afección. En la presente descripción se describe que un sujeto muestra uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno o afección. En la presente descripción se describe que un sujeto no muestra ningún síntoma o característica de una enfermedad, trastorno o afección. En la presente descripción se describe que un sujeto tiene una o más características de susceptibilidad o riesgo de una enfermedad, trastorno, o afección. En la presente descripción se describe que un sujeto es un paciente. En la presente descripción se describe que un sujeto es un individuo al que el diagnóstico y/o la terapia es y/o se ha administrado.

Agente terapéutico: Como se usa en la presente descripción, la frase “agente terapéutico” en general se refiere a cualquier agente que provoca un efecto farmacológico deseado cuando se administra a un organismo. En la presente descripción se describe que un agente se considera un agente terapéutico si demuestra un efecto estadísticamente significativo en una población apropiada. En la presente descripción se describe que la población apropiada puede ser una población de organismos modelo. En la presente descripción se describe que una población apropiada puede definirse mediante diversos criterios, tales como un determinado grupo de edad, sexo, antecedentes genéticos, condiciones clínicas preexistentes, etc. En la presente descripción se describe que un agente terapéutico es una sustancia que puede usarse para aliviar, mejorar, aminorar, inhibir, prevenir, retrasar la aparición, reducir la gravedad de y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o condición. En la presente descripción se describe que un “agente terapéutico” es un agente que ha sido o debe ser aprobado por una agencia gubernamental antes de que pueda comercializarse para su administración a seres humanos. En la presente descripción se describe que un “agente terapéutico” es un agente para el que se requiere una prescripción médica para su administración a seres humanos.

Cantidad terapéuticamente efectiva: Como se usa en la presente descripción, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” significa una cantidad que es suficiente, cuando se administra a una población que padece de una enfermedad, trastorno y/o afección de acuerdo con un régimen de dosificación terapéutica, para tratar la enfermedad, trastorno y/o afección. En la presente descripción se describe que una cantidad terapéuticamente efectiva es una que reduce la incidencia y/o gravedad de, estabiliza una o más características de, y/o retrasa la aparición de uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección. Los expertos en la técnica apreciarán que el término “cantidad terapéuticamente efectiva” de hecho no requiere que se logre un tratamiento exitoso en un individuo particular. Más bien, una cantidad terapéuticamente efectiva puede ser la cantidad que proporcione una respuesta farmacológica deseada particular en una cantidad significativa de sujetos cuando se administra a pacientes con necesidad de tal tratamiento. Por ejemplo, como se describe en la presente descripción, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a una cantidad que, cuando se administra a un individuo que lo necesita en el contexto de la terapia de la invención, bloqueará, estabilizará, atenuará o revertirá un proceso de apoyo al cáncer que se produce en dicho individuo, o potenciará o aumentará un proceso supresor del cáncer en dicho individuo. En el contexto del tratamiento del cáncer, una “cantidad terapéuticamente efectiva” es una cantidad que, cuando se administra a un individuo diagnosticado con un cáncer, evitará, estabilizará, inhibirá o reducirá el desarrollo adicional del cáncer en el individuo. Una “cantidad terapéuticamente efectiva” particularmente preferida de una composición descrita en la presente descripción revierte (en un tratamiento terapéutico) el desarrollo de una neoplasia maligna tal como un carcinoma pancreático o ayuda a lograr o prolongar la remisión de una neoplasia maligna. Una cantidad terapéuticamente efectiva administrada a un individuo para tratar un cáncer en ese individuo puede ser igual o diferente de una cantidad terapéuticamente efectiva administrada para promover la remisión o inhibir la metástasis. Como ocurre con la mayoría de las terapias contra el cáncer, los métodos terapéuticos descritos en la presente descripción no deben interpretarse como, restringirse a o limitarse de cualquier otra manera a una “cura” para el cáncer; más bien, los métodos de tratamiento están dirigidos al uso de las composiciones descritas para “tratar” un cáncer, es decir, para efectuar un cambio deseable o beneficioso en la salud de un individuo que tiene cáncer. Tales beneficios son reconocidos por proveedores de atención médica expertos en el campo de la oncología e incluyen, pero no se limitan a, una estabilización de la condición del paciente, una disminución en el tamaño del tumor (regresión del tumor), una mejora en las funciones vitales (por ejemplo, función mejorada de tejidos cancerígenos u órganos), una disminución o inhibición de metástasis adicional, una disminución de las infecciones oportunistas, una supervivencia aumentada, una disminución del dolor, función motora mejorada, función cognitiva mejorada, sensación de energía mejorada (vitalidad, malestar disminuido), sensación de bienestar mejorada, restauración del apetito normal, restauración de un aumento de peso saludable y combinaciones de los mismos. Además, la regresión de un tumor particular en un individuo (por ejemplo, como resultado de los tratamientos descritos en la presente descripción) también se puede evaluar al tomar muestras de células cancerígenas del sitio de un tumor tal como un adenocarcinoma pancreático (por ejemplo, durante el transcurso de tratamiento) y probar las células cancerígenas para determinar el nivel de marcadores metabólicos y de señalización para monitorear el estado de las células cancerígenas para verificar a nivel molecular la regresión de las células cancerígenas a un fenotipo menos maligno. Por ejemplo, la regresión tumoral inducida mediante el empleo de los métodos en la presente descripción se indicaría al encontrar una disminución en cualquiera de los marcadores proangiogénicos discutidos anteriormente, un aumento en los marcadores antiangiogénicos descritos en la presente descripción, la normalización (es decir, la alteración hacia un estado encontrado en individuos normales que no padecen cáncer) de vías metabólicas, vías de señalización intercelular o vías de señalización intracelular que exhiben actividad anormal en individuos diagnosticados con cáncer. Los expertos en la técnica apreciarán que, en la presente descripción se describe que una cantidad con terapéuticamente efectiva puede formularse y/o administrarse en una dosis única. En la presente descripción se describe que una cantidad con terapéuticamente efectiva puede formularse y/o administrarse en una pluralidad de dosis, por ejemplo, como parte de un régimen de dosificación.

Variante: Como se usa en la presente descripción en el contexto de moléculas, por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas o moléculas pequeñas, el término “variante” se refiere a una molécula que muestra una identidad estructural significativa con una molécula de referencia pero difiere estructuralmente de la molécula de referencia, por ejemplo, en la presencia o ausencia o en el nivel de uno o más restos químicos en comparación con la entidad de referencia. En la presente descripción se describe que una variante también difiere funcionalmente de su molécula de referencia. En general, el hecho de que una molécula particular se considere adecuadamente como una “variante” de una molécula de referencia se basa en su grado de identidad estructural con la molécula de referencia. Como se apreciará por los expertos en la técnica, cualquier molécula de referencia biológica o química tiene determinados elementos estructurales característicos. Una variante, por definición, es una molécula distinta que comparte uno o más de tales elementos estructurales característicos pero difiere en al menos un aspecto de la molécula de referencia. Para dar solo algunos ejemplos, un polipéptido puede tener un elemento de secuencia característico que comprende una pluralidad de aminoácidos que tienen posiciones designadas entre sí en un espacio lineal o tridimensional y/o que contribuyen a un motivo estructural particular y/o función biológica; un ácido nucleico puede tener un elemento de secuencia característico que comprende una pluralidad de residuos de nucleótidos que tienen posiciones designadas con relación a otro en un espacio lineal o tridimensional. En la presente descripción se describe que un polipéptido o ácido nucleico variante puede diferir de un polipéptido o ácido nucleico de referencia como resultado de una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos. En la presente descripción se describe que un polipéptido o ácido nucleico variante muestra una identidad de secuencia general con un polipéptido o ácido nucleico de referencia que es al menos de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 99 %. En la presente descripción se describe que un polipéptido o ácido nucleico variante no comparte al menos un elemento de secuencia característico con un polipéptido o ácido nucleico de referencia. En la presente descripción se describe que un polipéptido o ácido nucleico de referencia tiene una o más actividades biológicas. En la presente descripción se describe que un polipéptido o ácido nucleico variante comparte una o más de las actividades biológicas del polipéptido o ácido nucleico de referencia.

Vector, como se usa en la presente descripción, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido” que se refiere a un lazo de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Determinados vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y de esta manera se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se unen operativamente. Tales vectores se refieren en la presente descripción como “vectores de expresión” Las técnicas estándar pueden usarse para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos, y el cultivo de tejidos y la transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación pueden realizarse de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en la presente descripción. Las técnicas y procedimientos anteriores generalmente pueden realizarse de acuerdo con los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se mencionan y analizan a lo largo de la presente descripción. Ver por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

Descripción detallada de las modalidades ilustrativas

La presente descripción se refiere, entre otros, a 4-1BB, que es una molécula coestimuladora inducible, y anticuerpos terapéuticos que se unen a la misma que han sido modificados genéticamente para tener características mejoradas sobre un anticuerpo anti-4-1BB de referencia. Por ejemplo, los anticuerpos modificados genéticamente proporcionados en la presente descripción se han modificado para potenciar la afinidad del antígeno con relación a la de un anticuerpo agonista de referencia que reconoce específicamente un epítopo dentro del dominio extracelular del 4-1BB humano (Patente coreana No. 10-0500286, No. de acceso: KCTC 0952BP). Específicamente, como se describe en la presente descripción, los inventores modificaron genéticamente un anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado de referencia, 94G1 (patente de Estados Unidos No. 7,932,045). Como se describe en los ejemplos en la presente descripción, las secuencias de CDR de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de referencia 94G1 se modificaron genéticamente por separado para mejorar la afinidad de cada cadena. Además, como se describe en la presente descripción, los anticuerpos anti-4-1BB modificados genéticamente ilustrativos pueden inducir efectivamente la proliferación de las células T activadas. Notablemente, los anticuerpos anti-4-1BB modificados genéticamente ilustrativos son capaces de inducir una actividad sorprendentemente mejorada de células T CD8+ debido a la estimulación provocada por la unión del anticuerpo humanizado 4-1BB a una molécula 4-1BB y a la inhibición la muerte celular inducida por activación (AICD). Por tanto, la presente descripción proporciona anticuerpos anti-4-1BB humano modificados genéticamente con propiedades mejoradas sobre un anticuerpo de referencia y, además, demuestra que estos anticuerpos tienen una actividad sorprendentemente beneficiosa in vitro e in vivo.

4-1BB

4-1BB (también conocido como CD 137, TNFRSF9, etc) es un receptor que pertenece a la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR). 4-1BB es una molécula coestimuladora generalmente expresada en linfocitos T activados e implicada en enfermedades inmunitarias y autoinmunitarias (Kwon y otros PNAS 84:2896,1987; Kwon y otros PNAS (1989) 86:1963; Son y otros Journal of Immunological Methods (2004) 286(1-2): 187-201). El 4-1BB humano es una proteína de 255 aminoácidos (No. de acceso NM_001561; NP_001552). La secuencia de aminoácidos de 4-1BB humana completa se proporciona en la SEQ ID NO: 44. 4-1BB se expresa en la superficie celular en formas de monómero (30 kDa) y dímero (55 kDa) y probablemente se trimeriza con el ligando 4-1BB para señalizar.

El conocimiento actual de 4-1BB sugiere que se expresa constitutivamente en varias células, aunque en niveles bajos, que incluyen Treg Foxp3+ y células dendríticas (DC). (Ver, Vinay and Kwon (2014) BMB Rep. 47(3): 122-129.) La activación con diversos agonistas, tales como citocinas (por ejemplo, IL-2, IL-4), activadores policlonales (por ejemplo., Con A y PHA), moléculas de la superficie celular (por ejemplo, anti-CD3 y anti-CD28) y promotores de Ca2+ la inducción y la actividad de PKC (por ejemplo, ionomicina y acetato de miristato de forbol) potencian aún más la expresión de 4-1BB. Id.

Numerosos estudios de células T murinas y humanas indican que el 4-1BB promueve una proliferación celular potenciada, supervivencia y producción de citocinas (Croft, 2009, Nat. Rev. Immunol. 9:271-285). Los estudios han indicado que algunos anticuerpos monoclonales agonistas de 4-1BB pueden aumentar la expresión de moléculas coestimuladoras y potenciar marcadamente las respuestas de los linfocitos T citolíticos, lo que da como resultado una eficacia antitumoral en diversos modelos. Los anticuerpos monoclonales agonistas de 4-1BB han demostrado eficacia en entornos profilácticos y terapéuticos. Además, los modelos tumorales de terapia de combinación y monoterapia de 4-1BB han establecido respuestas de memoria de células T protectoras antitumorales duraderas (Lynch (2008) Immunol. Rev. 22: 277-286). También se ha demostrado que los agonistas 4-1BB inhiben las reacciones autoinmunitarias en una diversidad de modelos de autoinmunidad reconocidos en la técnica (Vinay (2006) J. Mol. Med. 84:726-736). Esta actividad dual de 4-1BB ofrece el potencial de proporcionar actividad antitumoral al tiempo que atenúa los efectos secundarios autoinmunitarios que pueden asociarse con los enfoques de la inmunoterapia.

Anticuerpos 4-1BB y fragmentos de los mismos

La presente descripción proporciona, al menos en parte, anticuerpos anti-4-1BB humano modificados genéticamente y fragmentos de los mismos que exhiben características superiores marcadamente e inesperadamente in vitro y/o in vivo. Por ejemplo, determinados anticuerpos proporcionados tienen mayor afinidad con relación a un anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado de referencia.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye 1, 2 o 3 secuencias de la CDR de la cadena pesada que son o incluyen una secuencia de las SEQ ID NO: 5 a 8. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno incluye una o más de: una CDR1 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 7 u 8. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno incluye cada una de: una CDR1 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 7 u 8.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye 1, 2 o 3 secuencias de la CDR de la cadena ligera que son o incluyen una secuencia de las SEQ ID NO: 1-4. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye una o más de: una CDR1 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 1, una c DR2 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 2 y una CDR3 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 3 o 4. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye cada una de: una CDR1 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 1, una CDR2 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 2 y una CDR3 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 3 o 4.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena pesada que incluye una CDR1 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 7 u 8 y/o un dominio variable de la cadena ligera que incluye una CDR1 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 1, una CDR2 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 2 y una CDR3 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 4.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena pesada que incluye una CDR2 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 6 donde el 5to aminoácido asparagina (N) se sustituyó con glutamina (Q), ácido glutámico (E) o serina (S). En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena pesada que incluye una CDR2 de la cadena pesada que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 6 donde el 5to aminoácido asparagina (N) se sustituyó con valina (V), glicina (G) o prolina (P).

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena ligera que incluye una CDR3 de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 3 o 4 donde la 6to posición de aminoácido de LCDR3 está mutada.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena pesada que incluye una región del marco 1 de la cadena pesada (FR1) que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 16 o 17. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-lBB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno incluye un dominio variable de la cadena pesada que incluye una región del marco 3 de la cadena pesada (FR3) que comprende una secuencia de cualquiera de las ^sE^qID NO: 18-20. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena pesada que incluye una región del marco 1 de la cadena pesada (FR1) que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 16 o 17 y una región del marco 3 de la cadena pesada (FR3) que comprende una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 18-20.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye una homología sustancial con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que incluye un dominio variable de la cadena pesada que es o incluye una secuencia seleccionada de las SEQ ID ⁿO: 11-14. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena pesada que es o incluye una secuencia al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 % o 99,5 % idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 11-14. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena pesada que es o incluye una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 11-14.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno incluye homología sustancial con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que incluye un dominio variable de la cadena ligera que tiene o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 9 o 10. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 % o 99,5 % idéntica a una secuencia de la SEQ ID NO: 9 o 10. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 9 o 10.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno incluye una homología sustancial con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que incluye un dominio variable de la cadena pesada que es o incluye una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 11-14 y un dominio variable de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 10. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno que incluye un dominio variable de la cadena pesada que es o incluye una secuencia al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 % o 99,5 % idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 11-14 y un dominio variable de la cadena ligera que es o incluye una secuencia al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 % o 99,5 % idéntica a una secuencia de la SEQ ID NO: 10. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-lBB o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno incluye un dominio variable de la cadena pesada que es o incluye una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 11-14 y un dominio variable de la cadena ligera que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 10.

Las secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-4-1BB humano o las uniones de fragmentos de unión al antígeno de la presente descripción pueden sustituirse mediante sustitución conservativa. El término “sustitución conservativa” usado en la presente descripción se refiere a la modificación de un polipéptido en el que uno o más aminoácidos están sustituidos con un aminoácido que tiene una propiedad bioquímica similar para no provocar la pérdida de una función biológica o bioquímica del polipéptido correspondiente. El término “variante de secuencia conservativa” o “sustitución de aminoácidos conservativa” usado en la presente descripción es la sustitución de un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Los residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se definen en la técnica. Esos residuos abarcan aminoácidos con una cadena lateral básica (por m, lisina, arginina e histidina), aminoácidos con una cadena lateral ácida (por ejemplo, ácido aspártico y glutamato), aminoácidos con una cadena lateral polar no cargada (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y cisteína), aminoácidos con una cadena lateral no polar (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano), aminoácidos con una cadena lateral beta ramificada (por ejemplo, treonina, valina e isoleucina) y aminoácidos con una cadena lateral aromática (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina). Por lo tanto, se espera que el anticuerpo pueda tener una sustitución de aminoácidos conservativa y aun así asegurar una actividad.

Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción puede incluir una región constante seleccionada de un dominio constante IgG1, un dominio constante IgG2, un dominio constante híbrido IgG1/IgG2, un dominio constante IgG4 humano, un dominio constante IgA, un dominio constante IgE, un dominio constante IgM y un dominio constante IgD.

Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción es o incluye una IgA, IgD, IgE, IgM, IgG o variantes de las mismas.

Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular de la presente descripción incluye una región Fc variante que tiene mutaciones y/o sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones de 234, 235, 236, 237, 238, 239, 253, 254, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 288, 297, 298, 299, 307, 311, 322, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 434 y 435.

Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción es el isotipo IgGl humano. Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción incluye una IgG1 variante. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno incluye un polipéptido IgG1 que tiene una mutación de aminoácidos en una o más posiciones de 233, 234, 235, 236, 265, 297, 329, 331 y 322.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno incluye un polipéptido IgG1 que contiene una o más mutaciones en L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno incluye un polipéptido IgG1 que contiene dos, tres, cuatro o más mutaciones en L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, ^p331 y P329. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno incluye un polipéptido IgG1 con mutaciones en L234Ay L235A.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno incluye una región constante de la cadena ligera. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno incluye una cadena ligera kappa (^k) y/o lambda (A) y/o una variante de la misma.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno es un anticuerpo monoclonal. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento Fv unido por enlaces disulfuro, un fragmento scFv, un anticuerpo de dominio único, humacuerpo, nanocuerpo y/o diacuerpo. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno es un anticuerpo monovalente. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno es un anticuerpo multivalente. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno es un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico).

La presente descripción abarca métodos para modificar el contenido de carbohidratos de un anticuerpo de la descripción mediante la adición o eliminación de un sitio de glicosilación. Los métodos para modificar el contenido de carbohidratos de los anticuerpos se conocen bien en la técnica y se incluyen en la descripción, ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 6,218,149; EP 0359096 B1; la publicación de Estados Unidos No. US 2002/0028486; WO 03/035835; la publicación de Estados Unidos No. 2003/0115614; la patente de Estados Unidos No. 6,218,149; la patente de Estados Unidos No. 6,472,511. La presente descripción abarca métodos para modificar el contenido de carbohidratos de un anticuerpo de la presente descripción mediante la eliminación de uno o más restos de carbohidratos endógenos del anticuerpo. La presente descripción abarca eliminar el sitio de glicosilación de la región Fc de un anticuerpo, mediante la modificación de la posición 297 de asparagina a alanina. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno comprende una mutación N297A en el dominio CH2. En la presente descripción se describe que una mutación N297A da como resultado la aglicosilación, que reduce la unión de FcR o C1q. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno comprende una cadena pesada que comprende una región Fc que comprende una mutación N297A y una mutación K322A. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno comprende una cadena pesada que comprende una región Fc que comprende una mutación N297A y una mutación D265A. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno comprende una cadena pesada que comprende una región Fc que comprende una mutación N297A, una mutación D265A y una mutación K322A. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno comprende una región Fc con una mutación L234A y/o una mutación L235A. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno comprende una región Fc con una o más mutaciones seleccionadas entre L234A, L235A, N297A, D265A y K322A.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno comprende una región Fc con dos o más mutaciones seleccionadas entre L234A, L235A, N297A, D265A y K322A. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno comprende una región Fc con tres, cuatro o cinco mutaciones seleccionadas entre L234A, L235A, N297A, D265A y K322A.

Las glicoformas modificadas genéticamente pueden ser útiles para una diversidad de propósitos, que incluyen pero no se limitan a potenciar o reducir la función efectora. Las glicoformas modificadas genéticamente pueden generarse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, por ejemplo mediante el uso de cepas de expresión modificadas genéticamente o variantes, mediante la coexpresión con una o más enzimas, por ejemplo DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTI11), mediante la expresión de una molécula que comprende una región Fc en diversos organismos o líneas celulares a partir de diversos organismos, o mediante la modificación de carbohidrato(s) después que la molécula que comprende la región Fc se ha expresado. Los métodos para generar glicoformas modificadas genéticamente se conocen en la técnica, e incluyen pero no se limitan a las descritas en Umana y otros, 1999,Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies y otros, 20017 BiotechnoIBioeng 74:288-294; Shields y otros, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa y otros, 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) la patente de Estados Unidos No. 6,602,684; No. de serie de Estados Unidos 10/277,370; No. de serie de Estados Unidos 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnología POTILLEGENT™(Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnología de modificación genética por glicosilación GLYCOMAB™(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza). Ver, por ejemplo, los documentos WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki y otros, 2004, JMB, 336: 1239-49.

Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción es como un agonista del 4-1BB humano.

Un anticuerpo anti-4-1 BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se une a una molécula 4-1BB humana. Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se une específicamente a una molécula 4-1BB humana.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno se une a una secuencia que es o incluye la de la SEQ ID NO: 15. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno se une a un epítopo del dominio extracelular de 4-1BB que es o incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 15.

Una unión particular de un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción con el dominio extracelular de 4-1BB humano se anula por una o más mutaciones de la SEQ ID NO: 44 seleccionado entre N30, D38, N39, R41, A56, G57, R60 o T61.

Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se une a una molécula 4-1BB humana con una afinidad de unión(KD) de 1x10'7 a 1x10'12 M. Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se une a una molécula 4-1BB humana con una afinidad de unión (K^d) de 1x10'8 a 1x10'12 M. la afinidad de unión (K^d) puede medirse, por ejemplo, mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, mediante el uso de un sistema BIACORE.

Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se une a una molécula 4-1BB humana o un fragmento de la misma con una afinidad de unión (Kd) de menos de 1,0x 10'8 M. Un anticuerpo anti-4-1BB humanizado particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se une a una molécula 4-1BB humana o un fragmento de la misma con una afinidad de unión (Kd) de menos de 1,0 x 10'9 M. Un anticuerpo anti-4-1BB humanizado particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se une a una molécula 4-1BB humana o un fragmento de la misma con una afinidad de unión (K^d) de menos de 1,0 x 10'1° M.

Un anticuerpo anti-4-1BB particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción no se une o se une débilmente a un polipéptido 4-1BB que no es de primate (por ejemplo, un polipéptido 4-1B^bcanino, de ratón y de rata). Un anticuerpo anti-4-1BB particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se une eficientemente al 4-1BB humano o de mono. Esta afinidad de unión sugiere que la estructura y/o la secuencia del epítopo para un anticuerpo 4-1BB de primate puede ser bastante diferente de la de canino, ratón y rata.

Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción es un anticuerpo agonista. Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción media la activación de las células T. Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se une a células T CD8+ y/o CD4+que expresan 4-1BB humano.

Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción no tiene o tiene una baja actividad de ADCC. Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción no tiene o tiene una baja actividad de CDC. Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción no tiene o tiene una actividad de ADCC y una actividad de CDC bajas. Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción tiene una actividad de muerte celular ADCC de menos de alrededor de menos de alrededor de 20 %, menos de alrededor de 10 %, menos de alrededor de 8 % o menos de alrededor de 5 %. Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción tiene una actividad de muerte celular ADCC de menos de alrededor de 10 %. Un anticuerpo anti 4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción tiene una actividad de muerte celular CDC de menos de alrededor de 30 %, menos de alrededor de 20 %, menos de alrededor de 10 %, menos de alrededor de 8 % o menos de como 5 %. Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción tiene una actividad de muerte celular CDC de menos de alrededor del 20 %.

Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se caracteriza por una baja toxicidad (por ejemplo, un bajo grado de muerte celular después de la administración). Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se caracteriza por una baja hepatoxicidad. En la presente descripción se describe que un sujeto al que se le ha administrado un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción a una dosis terapéutica tiene niveles de uno o más de ALT, AST y bilirrubina total en un intervalo normal. Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se caracteriza por una capacidad de tratar a los pacientes durante períodos prolongados con un alivio medible de los síntomas y una toxicidad baja y/o aceptable. Una inmunogenicidad baja o aceptable y/o una alta afinidad, así como otras propiedades adecuadas, pueden contribuir a los resultados terapéuticos conseguidos. "Baja inmunogenicidad" se define en la presente descripción como el aumento de respuestas HAHA, HACA o HAMA significativas en menos de alrededor del 75 %, o preferentemente menos de alrededor del 50 % de los pacientes tratados y/o mediante el aumento de los títulos bajos en el paciente tratado (Elliott y otros, Lancet 344:1125-1127 (1994)).

Ácidos nucleicos

La descripción proporciona polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica anticuerpos anti-4-1BB humano de la presente descripción y fragmentos de la misma. Los anticuerpos anti-4-1BB humano y los fragmentos de los mismos, como se describe en la presente descripción, pueden producirse a partir de moléculas de ácido nucleico mediante el uso de métodos de biología molecular conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos de la presente descripción incluyen, por ejemplo, ADN y/o ARN.

En la presente descripción se describe que las construcciones de ácidos nucleicos incluyen regiones que codifican un anticuerpo anti 4-1BB humano o un fragmento del mismo (por ejemplo, 94K, 94KV, 94KVT, EU101). Descritos en la presente descripción, tales anticuerpos o un fragmento de los mismos incluirán las regiones V^hy/o V^l. Un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo puede identificarse y/o seleccionarse para una unión deseada y/o propiedades funcionales, y las regiones variables de dicho anticuerpo pueden aislarse, amplificarse, clonarse y/o secuenciarse. Las modificaciones que se pueden hacer a las secuencias de nucleótidos de V^hy V^l, que incluyen adiciones de secuencias de nucleótidos que codifican aminoácidos y/o portan sitios de restricción, y/o sustituciones de secuencias de nucleótidos que codifican aminoácidos. En la presente descripción se describe que una secuencia de ácido nucleico puede incluir o no una secuencia de intrón.

Cuando sea apropiado, las secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-4-1BB humano y fragmentos de los mismos (por ejemplo, 94K, 94KV, 94KVT, EU101) pueden modificarse para incluir codones que están optimizados para la expresión en un tipo de célula u organismo particular (por ejemplo, ver la patente de Estados Unidos No. 5,670,356 y la patente de Estados Unidos No. 5,874,304). Las secuencias con optimización de codones son secuencias sintéticas, y, preferentemente, codifican el polipéptido idéntico (o un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de longitud completa que tiene sustancialmente la misma actividad que el polipéptido de longitud completa) codificado por el polinucleótido original sin optimización de codones. En la presente descripción se describe que la región codificante del material genético que codifica componentes de anticuerpos, en su totalidad o en parte, puede incluir una secuencia alterada para optimizar el uso de codones para un tipo celular particular (por ejemplo, una célula eucariota o procariota). Por ejemplo, la secuencia codificante para una región variable de la cadena pesada (o ligera) humanizada como se describe en la presente descripción puede optimizarse para la expresión en una células bacteriana. Alternativamente, la secuencia codificante puede optimizarse para la expresión en una célula de mamífero (por ejemplo, una célula CHO). Una secuencia de este tipo puede describirse como una secuencia con optimización de codones.

Las construcciones de ácidos nucleicos de la presente descripción se pueden insertar en un vector de expresión o vector viral mediante métodos conocidos en la técnica, y las moléculas de ácidos nucleicos se pueden unir operativamente a una secuencia de control de la expresión. La presente descripción proporciona además un vector que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, o un fragmento de las mismas. Cualquiera de las moléculas de ácido nucleico anteriores, o un fragmento de las mismas, puede clonarse en cualquier vector adecuado y puede usarse para transformar o transfectar cualquier huésped adecuado. La selección de vectores y los métodos para construirlos son comúnmente conocidos por los expertos en la técnica y se describen en referencias técnicas generales (ver, en general, “Recombinant DNA Part D,” Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press (1987)).

En la presente descripción se describe que se pueden usar técnicas usadas convencionalmente, tales como, por ejemplo, electroforesis, precipitación con fosfato cálcico, transfección DEAE-dextrano, lipofección, etc, para introducir un ácido nucleico extraño (ADN o ARN) en una célula huésped procariota o eucariota. Deseablemente, un vector puede incluir secuencias reguladoras, tales como codones de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, que son específicas del tipo de huésped (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir el vector, según corresponda y teniendo en cuenta si el vector es ADN o ARN. En la presente descripción se describe que un vector comprende secuencias reguladoras que son específicas del género del huésped. Preferentemente, un vector comprende secuencias reguladoras que son específicas de la especie del huésped.

Además del sistema de replicación y el ácido nucleico insertado, una construcción de ácido nucleico puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de huéspedes transformados o transfectados. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un huésped auxotrófico para proporcionar prototrofia y similares.

Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o ambos. Por ejemplo, se selecciona un vector de clonación del grupo que consiste en las series pUC, las series pBluescript (Stratagene, LaJolla, California), las series pET (Novagen, Madison, Wis.), las series pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y las series pEX (Clontech, Palo Alto, California). También se pueden usar vectores de bacteriófagos, tales como A.GT10, Agt11, AZapII (Stratagene), A.EMBL4 y A.NM1149. Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen pBI110, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión animal incluyen pEUK-C1, pMAM y pMAMneo (Clontech). El sistema de clonación TOPO (Invitrogen, Carlsbad, California) también se puede usar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Un vector de expresión puede comprender un promotor nativo o no nativo unido operativamente a una molécula de ácido nucleico aislada o purificada como se describió anteriormente. La selección de los promotores, por ejemplo, fuerte, débil, inducible, específico de tejido y específico del desarrollo, está dentro del conocimiento de la técnica. De manera similar, la combinación de una molécula de ácido nucleico, o un fragmento de la misma, como se describió anteriormente con un promotor, también está dentro del conocimiento de la técnica.

Los vectores virales adecuados incluyen, por ejemplo, vectores retrovirales, vectores basados en parvovirus, por ejemplo, vectores basados en virus adenoasociados (AAV), vectores quiméricos adenovirales de Aa V y vectores basados en adenovirus, y vectores lentivirales tales como vectores basados en el herpes simple (HSV). Estos vectores virales se pueden preparar mediante el uso de técnicas estándar de ADN recombinante que se describen en, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2da edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); y Ausubel y otros,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (1994).

Un vector retroviral se deriva de un retrovirus. El retrovirus es un virus de ARN capaz de infectar una amplia diversidad de células huésped. Tras la infección, el genoma retroviral se integra en el genoma de su célula huésped y se replica junto con el ADN de la célula huésped, lo que produce de esta manera constantemente ARN viral y cualquier secuencia de ácido nucleico incorporada en el genoma retroviral. Como tal, la expresión a largo plazo de un(unos) factor(es) terapéutico(s) se puede lograr cuando se usan retrovirus. Los retrovirus contemplados para su uso en la terapia génica son relativamente no patógenos, aunque existen retrovirus patógenos. Cuando se emplean retrovirus patógenos, por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana (VIH) o virus linfotróficos de células T humanas (HTLV), se debe tener cuidado al alterar el genoma viral para eliminar la toxicidad para el huésped. Se puede manipular un vector retroviral adicionalmente para hacer que el virus tenga una replicación deficiente. Como tales, los vectores retrovirales se consideran particularmente útiles para la transferencia de genes estable in vivo. Los vectores lentivirales, tales como los vectores basados en el VIH, son ejemplos de vectores retrovirales usados para el suministro de genes. A diferencia de otros retrovirus, se sabe que los vectores basados en el VIH incorporan sus genes pasajeros en células que no se dividen y, por lo tanto, se pueden usar en el tratamiento de formas persistentes de la enfermedad.

Pueden añadirse secuencias adicionales a tales secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar en el aislamiento del polinucleótido o para mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y enlazadores es bien conocido en la técnica. (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra, o Sambrook, supra).

Los ácidos nucleicos y vectores particulares de la presente descripción pueden aislarse y/o purificarse. La presente descripción también proporciona una composición que comprende una molécula de ácido nucleico aislada o purificada descrita anteriormente, opcionalmente en forma de un vector. Pueden prepararse ácidos nucleicos y vectores aislados mediante el uso de técnicas estándar conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, tratamiento con álcali/SDS, unión de CsC1, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras técnicas bien conocidas en la técnica. La composición puede comprender otros componentes como se describe más en la presente descripción.

En la presente descripción se describe que las moléculas de ácido nucleico se insertan en un vector que es capaz de expresar un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo cuando se introduce en una célula huésped apropiada. Las células huésped apropiadas incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, de levadura, de insectos, y de mamíferos. Las células huésped ilustrativas incluyen procariotas (por ejemplo, E. coli) y eucariotas (por ejemplo, una célula COS o CHO). Las células huésped de mamíferos que podrían usarse incluyen células humanas Hela 293, H9 y Jurkat, células NIH3T3 y C127 de ratón, Cos 1, Cos 7 y CV 1, células QC1-3 de codorniz, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, células DG44). En la presente descripción se describe que una célula huésped de mamífero adecuada para la expresión del anticuerpo puede ser una célula de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, puede incluir las células DHFR-CHO usadas junto con un marcador seleccionable por DHFR), una célula de mieloma NSO, una célula COS o una célula SP2.

Cualquier(a) método(s) conocido(s) por un experto en la técnica para la inserción de fragmentos de ADN en un vector puede(n) usarse para construir vectores de expresión que codifican el anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento del mismo de la presente descripción bajo el control de señales de control transcripcional/ traduccional. Estos métodos pueden incluir ADN recombinante in vitro y técnicas sintéticas y recombinación in vivo (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra, o Sambrook, supra).

Producción de Anticuerpos

Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno descritos en la presente descripción pueden prepararse y/o purificarse mediante cualquier técnica conocida en la técnica, que permita la formación subsecuente de un anticuerpo estable o un fragmento de anticuerpo.

Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-4-1BB humano y/o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción puede aislarse y secuenciarse fácilmente mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, puede usarse un cebador oligonucleotídico diseñado para amplificar específicamente las regiones codificantes de la cadena pesada y cadena ligera correspondientes de un ADN molde de fago o hibridoma. Pueden insertarse ácidos nucleicos aislados en un vector de expresión, y luego pueden producirse los anticuerpos monoclonales deseados a partir de una célula huésped adecuada (es decir, transformante) transformada mediante la introducción del vector de expresión en la célula huésped. Un método particular para preparar un anticuerpo anti-4-1BB humano y/o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción puede incluir amplificar un vector de expresión que incluye un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, pero no se limita al mismo.

En la presente descripción se describe que una célula huésped es una célula huésped eucariota, que incluye, por ejemplo, células de levadura, plantas superiores, insectos y mamíferos. En dependencia del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente descripción pueden glicosilarse o no glicosilarse. En la presente descripción se describe que un vector de expresión recombinante que codifica un anticuerpo anti-4-1BB humano y/o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se introduce en una célula huésped de mamífero y se puede preparar un anticuerpo mediante el cultivo de la célula huésped durante un tiempo suficiente para expresar el anticuerpo. En la presente descripción se describe que una célula huésped de mamífero se cultiva durante un tiempo suficiente para secretar un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de la presente descripción en un medio de cultivo.

Un anticuerpo expresado particular de la presente descripción puede purificarse uniformemente después de aislarse de la célula huésped. El aislamiento y/o purificación de un anticuerpo de la presente descripción se puede realizar mediante un método convencional para aislar y purificar una proteína. Por ejemplo, sin desear estar ligado a la teoría, un anticuerpo anti-4-1BB humano y/o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos que incluyen, pero no se limitan a, purificación de proteína A, purificación de proteína G, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. La cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") también se puede emplear para la purificación. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), por ejemplo, capítulos 1, 4, 6, 8, 9 y 10. Un anticuerpo particular de la presente descripción puede aislarse y/o purificarse mediante la combinación adicionalmente de filtración, superfiltración, desalado, diálisis, etc. Los anticuerpos anti-4-1BB humano y/o los fragmentos de unión al antígeno purificados de la presente descripción se pueden caracterizar mediante, por ejemplo, ELISA, ELISPOT, citometría de flujo, inmunocitología, análisis BIACORE™, ensayo de exclusión cinética ^sA^pIDYNE KINEXA™, SDS-PAGE y transferencia western, o mediante análisis de HPLC así como mediante un número de otros ensayos funcionales descritos en la presente descripción. Aplicaciones Terapéuticas

La presente descripción abarca el reconocimiento de que los anticuerpos anti-4-1BB humanos y los fragmentos de unión al antígeno modificados genéticamente pueden ser útiles para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de determinadas enfermedades tales como, por ejemplo, el cáncer. Cualquiera de los anticuerpos anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno proporcionados en la presente descripción puede usarse en métodos terapéuticos. Por ejemplo, un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se puede usar como agente inmunoterapéutico, por ejemplo, en el tratamiento de una enfermedad maligna (por ejemplo, cáncer).

La presente descripción proporciona métodos para tratar y/o prevenir una enfermedad maligna, dichos métodos incluyen la administración de un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción a un sujeto. Los métodos para modular o tratar al menos una enfermedad maligna en una célula, tejido, órgano, animal o paciente incluyen, pero no se limitan a, cáncer y/o el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Los tratamientos contra el cáncer en el contexto de la presente descripción pueden estar mediados por el aumento de células T citotóxicas y citocinas anticancerígenas. Generalmente, la inmunidad mediada por células específicas del antígeno es causada por células T citotóxicas e incluye dos eventos de señalización: un primer evento de señalización se induce cuando una célula T reconoce un antígeno de una célula presentadora de antígeno vía un receptor, y una segunda señalización es inducida por moléculas coestimuladoras. Debido al primer y segundo estímulo, la actividad de las células T y los factores relacionados aumentan, de esta manera forman células T que funcionan específicamente en el tratamiento del cáncer, y las células T formadas aumentan en citotoxicidad, división celular, viabilidad celular y secreción de citocinas anticancerígenas debido a la estimulación con las moléculas coestimuladoras.

Específicamente, se ha demostrado que la estimulación por 4-1BB puede potenciar la actividad de las células T CD8+ aumentar la secreción de citocinas anticancerígenas tales como el interferón gamma (IFNy), aumentar la expresión de moléculas antiapoptóticas tales como Bcl-2, BclXL y Bfl-1 y/o inhibir la muerte celular inducida por activación (AICD). Un anticuerpo anti-4-1BB humano particular o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción puede potenciar o aumentar una o más de la actividad de las células T CD8+,la secreción de citocinas anticancerígenas tales como el interferón gamma (IFNy), la expresión de moléculas antiapoptóticas tales como Bcl-2, BclXL y Bfl-1, y la inhibición de la muerte celular inducida por activación (AICD). En la presente descripción se describe que el tratamiento terapéutico con un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción puede reducir y/o inhibir el crecimiento de las células cancerígenas.

La presente descripción proporciona un método para retrasar o inhibir el crecimiento tumoral, que comprende la regulación de la secreción de citocinas in vivo o in vitro al administrar un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción. La presente descripción proporciona un método para reducir la carga tumoral, que comprende la regulación de la secreción de citocinas in vivo o in vitro al administrar un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción.

La presente descripción proporciona un método para tratar cáncer o tumor mediante el seguimiento a un sujeto biológico del cáncer o tumor a tratar, que comprende: (i) administrar un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción a un sujeto, (ii) separar y luego aislar una muestra biológica del sujeto, (iii) medir una cantidad de secreción de INFy o TGFp de la muestra y estimar una relación proporcional y (iv) determinar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo al comparar las muestras de control que se administran o no con el anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

La presente descripción proporciona un método para tratar a un sujeto que lo necesita, el método comprende una etapa de administrar al sujeto una composición que comprende o suministra un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción y/o un ácido nucleico del mismo. En la presente descripción se describe que un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer. La presente descripción proporciona un método para prevenir o tratar el cáncer o el tumor de un paciente, que incluye administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo 4-1BB humanizado o el fragmento de unión al antígeno del mismo a un paciente con cáncer o tumor.

La presente descripción proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita, el método comprende una etapa de administrar al sujeto una composición que comprende o suministra un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción y/o un ácido nucleico del mismo. En la presente descripción se describe que un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer.

La presente descripción proporciona un método para potenciar una respuesta inmunitaria o aumentar la actividad de una célula inmunitaria en un sujeto que lo necesita, el método comprende una etapa de administrar al sujeto una composición que comprende o suministra un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción y/o un ácido nucleico del mismo. En la presente descripción se describe que un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer.

Los cánceres adecuados para el tratamiento con el método de la presente descripción pueden incluir, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de trompas de Falopio, cáncer de vesícula biliar, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y de cuello, cáncer hematológico, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer peritoneal primario, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de páncreas y cáncer de próstata. En la presente descripción se describe que un cáncer para el tratamiento con un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción puede incluir, pero no se limita a, carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfomas de Hodgkin y no Hodgkin), blastoma, sarcoma y leucemia. En la presente descripción se describe que el cáncer incluye carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer peritoneal, carcinoma hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos, y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.

Una composición que incluye un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se puede administrar en una cantidad farmacéuticamente efectiva para tratar células cancerígenas o metástasis de las mismas, o inhibir el crecimiento del cáncer. Para su uso en métodos terapéuticos, se formularía, dosificaría y administraría un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción de una manera coherente con las buenas prácticas médicas. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la afección clínica del paciente individual, la edad del paciente, el peso del paciente, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el programa de administración, y otros factores conocidos por el personal médico.

La presente descripción proporciona anticuerpos anti-4-1BB humano de alta afinidad que pueden tener propiedades superiores con relación a un anticuerpo de referencia. La presente descripción abarca el reconocimiento de que estos anticuerpos pueden tener una capacidad mejorada para inducir la activación de las células T y/o la secreción de citocinas tales como IFNy. Por consiguiente, la presente descripción abarca el reconocimiento de que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción puede administrarse en una dosis inferior a la del anticuerpo de referencia.

En la presente descripción se describe que una composición que incluye un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se puede administrar a un paciente como un bolo o mediante inyección continua cuando sea necesario. En la presente descripción se describe que una administración en bolo es de un Fab de anti-4-1BB de la presente descripción y puede administrarse a una dosis de 0,0025 a 100 mg/kg, 0,025 a 0,25 mg/kg, 0,010 a 0,10 mg/kg o 0,10 hasta 0,50 mg/kg. En el caso de la inyección continua, el anticuerpo de la presente invención presentado como un fragmento Fab se puede administrar a una dosis de 0,001 a 100 mg/kg/min, 0,0125 a 1,25 mg/kg/min, 0,010 a 0,75 mg/kg/min, 0,010 a 1,0 mg/kg/min o 0,10 a 0,50 mg/kg/min durante 1 a 24 horas, 1 a 12 horas, 2 a 12 horas, 6 a 12 horas, 2 a 8 horas o 1 a 2 horas. Un anticuerpo particular de la presente descripción es un anticuerpo de longitud completa (que tiene un dominio constante completo). En la presente descripción se describe que se administra un anticuerpo de longitud completa a una dosis de aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg, 1 a 8 mg/kg o 2 a 6 mg/kg. En la presente descripción se describe que se administra un anticuerpo de longitud completa mediante inyección durante 30 a 35 minutos. La frecuencia de administración puede variar en dependencia de la gravedad de una afección. Por ejemplo, la frecuencia puede ser una vez cada 2 a 7 días, una vez a la semana o una vez cada 1,2, 3 o 4 semanas.

Como se describe en la presente descripción, se puede administrar una composición a un paciente mediante inyección subcutánea. Específicamente, el anticuerpo se puede administrar a un paciente en una dosis de 0,1 a 100 mg mediante inyección subcutánea una vez cada 2 a 7 días, cada semana, una vez cada dos semanas o cada mes.

Terapias de combinación

La presente descripción proporciona métodos terapéuticos que incluyen la administración de un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción en combinación con una o más de otras terapias.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno se administra en combinación con una o más terapias que han sido aprobadas para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, se ha demostrado que el tratamiento de combinación con un anticuerpo anti-4-1BB y un quimioterapéutico convencional, cisplatino, tiene actividad sinérgica en la destrucción de tumores y la prevención de la toxicidad específica de órganos. (Kim y otros, Investigación sobre el cáncer (2008) 68(18):7264-9)

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se administra en combinación con una segunda terapia seleccionada de un inhibidor de punto de control inmunitario, Interleucina 12 (IL-12), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), un agente anti-CD4 y un agente quimioterapéutico, de modo que el sujeto reciba tratamiento con ambos.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se administra a un sujeto al que se le administró o se le administrará una composición que comprende un agente quimioterapéutico, de manera que el sujeto reciba tratamiento con ambos. Los métodos terapéuticos de la presente descripción pueden incluir la administración de cualquier agente quimioterapéutico conocido en la técnica. En la presente descripción se describe que se administra un agente quimioterapéutico a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende fluorouracilo. En la presente descripción se describe que el fluorouracilo se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende doxorrubicina. En la presente descripción se describe que la doxorrubicina se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende irinotecán. En la presente descripción se describe que el irinotecán se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende paclitaxel. En la presente descripción se describe que el paclitaxel se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende cisplatino. En la presente descripción se describe que el cisplatino se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende ciclofosfamida. En la presente descripción se describe que la ciclofosfamida se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende GM-CSF, de manera que el sujeto reciba tratamiento con ambos. En la presente descripción se describe que GM-CSF se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende IL-12, de manera que el sujeto reciba tratamiento con ambos. En la presente descripción se describe que IL-12 se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un agente anti-CD4, de manera que el sujeto reciba tratamiento con ambos. En la presente descripción se describe que se administra un agente anti-CD4 a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se administra a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un inhibidor de punto de control (por ejemplo, un inhibidor de punto de control inmunitario), de manera que el sujeto reciba tratamiento con ambos. En la presente descripción se describe que se administra un inhibidor de punto de control inmunitario a un sujeto al que se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno.

Un inhibidor de punto de control usado en combinación con un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción puede ser, por ejemplo, cualquier inhibidor de punto de control inmunitario. Ejemplos de moléculas inhibidoras de puntos de control incluyen A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, CD277, IDO, KIR, PD-1, LAG-3, TIM-3, ITGIT y VISTA. Un inhibidor de punto de control inmunitario puede referirse a cualquier compuesto que inhiba la función de una proteína inhibitoria de punto de control inmunitario. La inhibición incluye reducción de la función y bloqueo completo. En la presente descripción se describe que un inhibidor de punto de control inmunitario es un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína de punto de control inmunitario. Se conocen diversos inhibidores de puntos de control inmunitarios y, en analogía con estos inhibidores de proteínas de puntos de control inmunitarios conocidos, se pueden desarrollar inhibidores de puntos de control inmunitarios alternativos en un futuro (próximo). Los inhibidores de puntos de control inmunitario incluyen, pero no se limitan a, péptidos, anticuerpos, moléculas de ácido nucleico y moléculas pequeñas.

En la presente descripción se describe que un inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de CTLA-4. En la presente descripción se describe que un inhibidor de punto de control es un anticuerpo que se dirige a CTLA-4, tal como, por ejemplo, ipilimumab. En la presente descripción se describe que un inhibidor de punto de control se dirige a CD366, que es una proteína transmembrana también conocida como proteína-3 que contiene inmunoglobulina de células T y dominio de mucina (TIM-3). En la presente descripción se describe que un inhibidor de punto de control inmunitario es un agente que inhibe la señalización de PD-1.

La PD-1 (es decir, la proteína 1 de muerte celular programada) es una proteína que se distribuye en la superficie de una célula inmunitaria, como una célula T o B, y también se conoce como CD279. En un ser humano, PD-1 se expresa mediante el gen PDCD1 localizado en la posición 2p37,3 en el cromosoma 2. Se sabe que PD-1 se une a dos ligandos, PD-L1 y PD-L2.

En la presente descripción se describe que se administra un agente anti-PD-1 a un paciente que recibe, ha recibido o recibirá tratamiento con un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión a antígeno de la presente descripción se administra a un paciente que recibe, ha recibido o recibirá tratamiento con un agente anti-PD-1.

En la presente descripción se describe que se administra un agente anti-PD-L1 a un paciente que recibe, ha recibido o recibirá tratamiento con un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se administra a un paciente que recibe, ha recibido o recibirá tratamiento con un agente anti-PD-L1. Descritos en la presente descripción, los agentes que inhiben PD-L1 incluyen, por ejemplo, AMP-244, MEDI-4736, MPDL328 OA, MIH1.

En la presente descripción se describe que un agente anti-PD-1 es un agente que inhibe PD-1. En la presente descripción se describe que un agente anti-PD-1 es un agente que inhibe PD-L1 y/o PD-L2. En la presente descripción se describe que un agente tipo anticuerpo que inhibe la señalización de PD-1 es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo. En la presente descripción se describe que un agente tipo anticuerpo que inhibe la señalización de PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 o un fragmento del mismo.

En la presente descripción se describe que se administra un anticuerpo anti-PD-1 a un paciente que recibe, ha recibido o recibirá tratamiento con un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se administra a un paciente que recibe, ha recibido o recibirá tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1. Los anticuerpos anti-PD-1 incluyen, por ejemplo, nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, durvalumab y avelumab. Pembrolizumab (Keytruda, Merck) es un anticuerpo terapéutico que inhibe la actividad de PD-1.

Como se describe en los Ejemplos de la presente solicitud, la administración de un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 puede mejorar la eficacia en relación con cualquier tratamiento solo, y además también puede reducir los efectos secundarios conocidos convencionalmente.

En la presente descripción se describe que pembrolizumab se administra a un paciente que recibe, ha recibido o recibirá tratamiento con un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción se administra a un paciente que recibe, ha recibido o recibirá tratamiento con pembrolizumab.

En la presente descripción se describe que se administra un inhibidor de punto de control inmunitario (por ejemplo, un agente anti-PD-1) a un paciente en una cantidad de alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 100 mg/kg. En la presente descripción se describe que un inhibidor de punto de control inmunitario (por ejemplo, un agente anti-PD-1) se administra a un paciente en una cantidad dentro de un intervalo delimitado por un límite inferior y un límite superior, siendo el límite superior mayor que el límite inferior. En la presente descripción se describe que el límite inferior puede ser de alrededor de 0,01 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg o 90 mg/kg. En la presente descripción se describe que el límite superior puede ser de alrededor de 0,025 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg o 100 mg/kg. En la presente descripción se describe que se puede administrar un inhibidor de punto de control inmunitario (por ejemplo, un agente anti-PD-1) a un paciente en una cantidad de alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg, de alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg, de alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 5 mg/kg, de alrededor de 2 mg/kg a alrededor de 5 mg/kg, de alrededor de 2 mg/kg a alrededor de 4 mg/kg, de alrededor de 3 mg/kg a alrededor de 5 mg/kg, o de alrededor de 3 mg/kg a alrededor de 4 mg/kg. En la presente descripción se describe que un inhibidor de punto de control inmunitario (por ejemplo, un agente anti-PD-1) se puede administrar a un paciente en una cantidad de alrededor de 1 mg/kg, alrededor de 2 mg/kg, alrededor de 3 mg/kg, alrededor de 4 mg/kg, o alrededor de 5 mg/kg.

En la presente descripción se describe que el tratamiento con una combinación de un inhibidor de punto de control inmunitario y un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción puede mejorar la proliferación, migración, persistencia y/o actividad citotóxica de células T CD8+ en un sujeto.

Aplicaciones basadas en células

Otro objetivo más descrito en la presente descripción es proporcionar un método para la proliferación de células T activadas ex vivo administrando el anticuerpo humanizado 4-1BB o su fragmento de unión al antígeno.

En la presente descripción se describe que un método para la proliferación y/o aislamiento ex vivo de células T activadas incluye poner en contacto una población de células T con un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción, lo que de esta manera aumenta la proliferación de células T activadas. En la presente descripción se describe que un método para la proliferación de células T activadas ex vivo incluye administrar un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción. En la presente descripción se describe que las células T activadas proliferan y/o se aíslan de una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las PBMC se pueden obtener/aislar usando métodos conocidos en la técnica.

En la presente descripción se describe que un método para la proliferación y/o aislamiento ex vivo de células T activadas incluye la administración de un anticuerpo monoclonal anti-CD3 al medio de cultivo (por ejemplo, a una concentración de al menos alrededor de 0,5 ng/mL). En la presente descripción se describe que un método para la proliferación y/o aislamiento ex vivo de células T activadas incluye la administración de IL-2 y/o IL-15 al medio de cultivo (por ejemplo, a una concentración que es al menos alrededor de 10 unidades/mL).

En la presente descripción se describe que un método para aislar células T activadas antígeno específicas incluye (a) cultivar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en un medio junto con un péptido de un epítopo de interés e IL-2; (b) inducir la expresión de 4-1BB en las células cultivadas añadiendo el péptido del epítopo de interés; (c) poner en contacto las células cultivadas con una superficie recubierta con un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno, en donde las células cultivadas que expresan 4-1BB se adhieren a la superficie recubierta; y (d) eliminar las células no unidas, lo que de esta manera aísla las células T activadas antígeno específicas.

En la presente descripción se describe que las células T activadas son células T CD8+.

En la presente descripción se describe que los linfocitos (por ejemplo, células T) se cultivan a una temperatura de al menos alrededor de 25 °C, preferentemente al menos alrededor de 30 °C, más preferentemente alrededor de 37 °C. La presente descripción abarca el reconocimiento de que las células T activadas (por ejemplo, células T CD8+), generadas por los métodos descritos en la presente descripción, pueden ser terapéuticamente útiles (por ejemplo, para el tratamiento del cáncer).

Terapias basadas en células

La presente descripción proporciona métodos para aislar selectivamente y cultivar en masa células T CD8+ que reconocen un antígeno de cáncer autólogo (antígeno de tumor propio), por ejemplo, un antígeno de cáncer autólogo que se sobreexpresa en células cancerígenas mientras está presente en una proporción baja en células normales. La presente descripción de que las células (por ejemplo, T ^cD8+) aisladas por estos métodos puede ser útil para el tratamiento del cáncer.

En la presente descripción se describe que un método para tratar y/o prevenir el cáncer en un sujeto que lo necesita incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de células T activadas producidas por un método ex vivo como los descritos en la presente descripción.

Tras la reactivación apropiada, las células T antígeno tumoral específicas pueden reconocer y eliminar las células tumorales autólogas. Por ejemplo, se pueden generar células T antígeno tumoral específicas ex vivo mediante el uso de métodos como se describen en la presente descripción. Tras la transferencia adoptiva, las células T específicamente reactivas de pacientes con cáncer pueden rechazar eficientemente los tumores humanos autólogos in vivo.

La presente descripción proporciona métodos para prevenir y/o tratar el cáncer y/o el tumor de un paciente, que incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de células T activadas preparadas ex vivo al administrar un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción.

En la presente descripción se describe que las células T para usar en un método terapéutico son alogénicas (de la misma especie pero de un donante diferente) que el sujeto receptor. En la presente descripción se describe que las células T para usar en un método terapéutico son autólogas (el donante y el receptor son el mismo). En la presente descripción se describe que las células T para usar en un método terapéutico son singénicas (el donante y los receptores son diferentes pero son gemelos idénticos).

En la presente descripción se describe que las células se formulan en primer lugar al cosecharlas de su medio de cultivo, y después lavar y concentrar las células en un medio y un sistema contenedor adecuado para una administración (un portador "farmacéuticamente aceptable") en una cantidad efectiva para el tratamiento. El medio de infusión adecuado puede ser cualquier formulación de medio isotónico, típicamente solución salina normal, Normosol R (Abbott) o Plasma-Lyte A (Baxter), pero también puede utilizarse dextrosa al 5 % en agua o lactato de Ringer. El medio de infusión puede suplementarse con albúmina de suero humano.

Una cantidad de células efectiva para el tratamiento en la composición es de al menos 108, normalmente mayor de 108, al menos 109 células, y generalmente más de 1010 El número de células dependerá del uso final para el que esté destinada la composición, así como del tipo de células incluidas en la misma. Por ejemplo, si se desean células que son específicas para un antígeno en particular, entonces la población contendrá más del 70 %, generalmente más del 80 %, 85 % y 90-95 % de tales células. Para los usos proporcionados en la presente descripción, las células están generalmente en un volumen de un litro o menos. En la presente descripción se describe que las células para la administración están en un volumen de menos de 500 mL, menos de 250 mL o 100 mL o menos. En la presente descripción se describe que la densidad de las células deseadas es típicamente mayor que 106 células/mL y generalmente es mayor que 107 células/mL, generalmente 108 células/mL o mayor. El número clínicamente relevante de células inmunitarias puede distribuirse en múltiples infusiones que acumulativamente igualan o exceden 108 células, 109 células, 1010 células, 1011 células o 1012 células.

Composiciones

En la presente descripción se proporcionan composiciones que comprenden anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que se unen específicamente a un epítopo de un polipéptido 4-1BB humano. Las composiciones de la presente descripción (por ejemplo, composiciones que suministran un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo anti-4-1BB humano) pueden incluir cualquier cantidad adecuada y efectiva de una composición para su uso en la suministración de un fragmento de anticuerpo o anticuerpo anti-4-1BB humano proporcionado a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite tal modulación, tratamiento o terapia. También se proporcionan en la presente descripción composiciones que incluyen poblaciones de células activadas (por ejemplo, población de células T activadas) que se han generado vía un método de la presente descripción (por ejemplo, un método que incluye una etapa de poner en contacto una célula con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo anti-4-1BB humano).

Las composiciones de la presente descripción incluyen composiciones farmacéuticas que incluyen un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión a antígeno descrito en la presente descripción y/o una población celular obtenida mediante un método descrito en la presente descripción. En la presente descripción se describe que una composición farmacéutica puede incluir un tampón, un diluyente, un excipiente o cualquier combinación de los mismos. En la presente descripción se describe que la composición, si se desea, puede contener, además, una o más sustancias terapéuticamente activas adicionales.

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB, un fragmento de unión al antígeno y/o una población celular de la presente descripción son adecuados para la administración a un mamífero (por ejemplo, un ser humano). Aunque las descripciones de composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente descripción se dirigen principalmente a composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración ética a seres humanos, el experto comprenderá que tales composiciones son adecuadas generalmente para la administración en animales de todo tipo. La modificación de composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a seres humanos para hacer que las composiciones sean adecuadas para la administración a diversos animales se entiende bien, y el farmacólogo veterinario experto puede diseñar y/o realizar dicha modificación con mera experimentación habitual, en caso de ser necesaria.

En la presente descripción se describe que las composiciones se formulan para administración parenteral. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente descripción pueden proporcionarse en una forma inyectable estéril (por ejemplo, una forma que es adecuada para la inyección subcutánea o infusión intravenosa). Por ejemplo, en la presente descripción se describe que las composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma de dosificación líquida que es adecuada para la inyección. En la presente descripción se describe que las composiciones farmacéuticas se proporcionan como polvos (por ejemplo, liofilizados y/o esterilizados), opcionalmente al vacío, que se reconstituyen con un diluyente acuoso (por ejemplo, agua, tampón, solución salina, etcétera) antes de la inyección. En la presente descripción se describe que las composiciones farmacéuticas se diluyen y/o reconstituyen en agua, solución de cloruro de sodio, solución de acetato de sodio, solución de alcohol bencílico, solución salina tamponada con fosfato, etcétera. En la presente descripción se describe que el polvo debe mezclarse suavemente con el diluyente acuoso (por ejemplo, no agitarse).

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB, un fragmento de unión al antígeno y/o una población celular de la presente descripción se formula con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de tales vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina de suero humano al 1-10 %. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. Un vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y la estabilidad química (por ejemplo, tampones y conservantes). En la presente descripción se describe que una formulación se esteriliza mediante técnicas conocidas o adecuadas.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción pueden prepararse mediante cualquier método conocido o desarrollado de aquí en lo adelante en la materia de farmacología. En general, tales métodos de preparación incluyen la etapa de poner en asociación el ingrediente activo con un diluyente u otro excipiente y/o uno o más de otros ingredientes auxiliares, y después, si es necesario y/o conveniente, dar forma y/o empacar el producto en una unidad deseada de dosis única o múltiple.

En la presente descripción se describe que una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo anti-4-1BB, un fragmento de unión a antígeno y/o una población celular de la presente descripción se puede incluir en un recipiente para almacenamiento o administración, por ejemplo, un vial, una jeringa (por ejemplo, una jeringa intravenosa) o una bolsa (por ejemplo, una bolsa intravenosa). Una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción puede prepararse, empaquetarse, y/o venderse a granel, como una dosis unitaria única, y/o como una pluralidad de dosis unitarias únicas. Como se usa en la presente descripción, una "dosis unitaria" es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo generalmente es igual a la dosificación del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de una dosificación de este tipo tal como, por ejemplo, una mitad o un tercio de dicha dosificación.

Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable, y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción variarán, en dependencia de la identidad, tamaño, y/o afección del sujeto tratado y además en dependencia de la vía por la cual se administra la composición. Los ejemplos siguientes describen, en parte, la dosificación de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo a un roedor. Se conocen métodos estándar en la técnica de cómo escalar la dosificación en sistemas animales. Ver, por ejemplo, J Basic Clin Pharm. Marzo de 2016-mayo de 2016; 7(2): 27-31. A manera de ejemplo, la composición puede comprender entre 0,1 % y 100 % (p/p) del ingrediente activo.

En la presente descripción se describe que una composición comprende o administra un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción a una dosis de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg. En la presente descripción se describe que una composición comprende o administra un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno a una dosis en una cantidad dentro de un intervalo delimitado por un límite inferior y un límite superior, siendo el límite superior mayor que el límite inferior. En la presente descripción se describe que el límite inferior puede ser de alrededor de 0,01 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg o 90 mg/kg. En la presente descripción se describe que el límite superior puede ser de alrededor de 0,025 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg o 100 mg/kg.

Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable, que, como se usa en la presente descripción, incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, diluyentes, u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensoactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y lo similar, según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada. Remington's The and Practice of Pharmacy, 21ra Edición, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) describe diversos excipientes usados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para la preparación de estas. Excepto en la medida en que cualquier medio excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como mediante la producción de cualquier efecto biológico no deseable o la interacción perjudicial de cualquier otra manera con cualquier otro(s) componente(s) de la composición farmacéutica, su uso se contempla dentro del alcance de esta descripción.

En la presente descripción se describe que un excipiente farmacéuticamente aceptable es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % puro. En la presente descripción se describe que un excipiente se aprueba para uso en seres humanos y para uso veterinario. En la presente descripción se describe que un excipiente está aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos. En la presente descripción se describe que un excipiente es de calidad farmacéutica. En la presente descripción se describe que un excipiente cumple los estándares de la Farmacopea de Estados Unidos (USP), la Farmacopea Europea (EP), la Farmacopea Británica y/o la Farmacopea internacional.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, agentes dispersantes y/o granulantes, agentes tensoactivos y/o emulsionantes, agentes desintegrantes, agentes de unión, conservantes, agentes tamponantes, agentes lubricantes, y/o aceites. Tales excipientes pueden incluirse opcionalmente en las formulaciones farmacéuticas. Los excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, saborizantes y/o perfumantes pueden estar presentes en la composición, de acuerdo con el criterio del formulador.

En la presente descripción se describe que las composiciones farmacéuticas proporcionadas comprenden uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, conservante, diluyente inerte, agente dispersante, agente tensoactivo y/o emulsionante, agente tamponante, etc.). En la presente descripción se describe que una composición farmacéutica comprende uno o más conservantes. En la presente descripción se describe que las composiciones farmacéuticas no comprenden conservante.

En la presente descripción se describe que se formula de forma estable una composición que incluye un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión al antígeno de la presente descripción. En la presente descripción se describe que una formulación estable de un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de unión a antígeno de la presente descripción puede comprender un tampón de fosfato con solución salina o una sal elegida, así como soluciones y formulaciones conservadas que contienen un conservante, así como formulaciones conservadas multiusos adecuadas para uso farmacéutico o veterinario. Las formulaciones conservadas contienen al menos un conservante conocido u opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en al menos un fenol, m-cresol, pcresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro de magnesio (por ejemplo, hexahidrato), alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. Se puede utilizar cualquier concentración o mezcla adecuada como se conoce en la técnica, como 0,001 5 %, o cualquier intervalo o valor en la misma, como, pero no limitado a 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 o cualquier intervalo o valor entre estos. Los ejemplos no limitantes incluyen, sin conservante, 0,1-2 % de m-cresol (por ejemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0 %), 0,1-3 % de alcohol bencílico (por ejemplo, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5 %), 0,001-0,5 % de timerosal (por ejemplo, 0,005, 0,01), 0,001-2,0 % de fenol (por ejemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0 %), 0,0005-1,0% de alquilparabeno (s) (por ejemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0 %) y similares.

En la presente descripción se describe que se proporciona una composición farmacéutica en una forma que se puede refrigerar y/o congelar. En la presente descripción se describe que una composición farmacéutica se proporciona en una forma que no se puede refrigerar y/o congelar. En la presente descripción se describe que las soluciones reconstituidas y/o las formas de dosificación líquidas pueden almacenarse durante un periodo de tiempo determinado después de la reconstitución (por ejemplo, 2 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 5 días, 7 días, 10 días, 2 semanas, un mes, dos meses o más). En la presente descripción se describe que el almacenamiento de las composiciones de anticuerpo por un tiempo mayor que el especificado tiempo da como resultado la degradación del anticuerpo.

Las formas de dosificación líquidas y/o las soluciones reconstituidas pueden comprender materia en forma de partículas y/o decoloración antes de la administración. En la presente descripción se describe que no debe usarse una solución si está decolorada o turbia y/o si la materia en forma de partículas persiste después de la filtración. Las consideraciones generales en la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos pueden encontrarse, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21ra ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

Kits

La presente descripción proporciona además un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con al menos un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de anticuerpo como se describe en la presente descripción. Los kits se pueden usar en cualquier método aplicable, incluidos, por ejemplo, métodos terapéuticos, métodos de diagnóstico, métodos de proliferación y/o aislamiento celular, etc. Opcionalmente asociada con tales recipiente(s) puede haber una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de agentes farmacéuticos o productos biológicos, dicha nota refleja (a) la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, el uso o la venta para administración a seres humanos, (b) instrucciones para su uso, o ambos.

En la presente descripción se describe que un kit puede incluir uno o más reactivos para la detección (por ejemplo, detección de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo anti-4-1BB humano). En la presente descripción se describe que un kit puede incluir un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de anticuerpo en una forma detectable (por ejemplo, asociado covalentemente con un resto o entidad detectable).

En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de anticuerpo como se proporciona en la presente descripción puede incluirse en un kit usado para el tratamiento de sujetos. En la presente descripción se describe que un anticuerpo anti-4-1BB humano o un fragmento de anticuerpo como se proporciona en la presente descripción puede incluirse en un kit utilizado para la proliferación y/o aislamiento de células T (por ejemplo, células T CD8+).

Otras características resultarán evidentes en el transcurso de las siguientes partes ilustrativas de la descripción. Sin embargo, los siguientes ejemplos se proporcionan simplemente para ilustrar la presente invención.

Ejemplos

La presente descripción proporciona, al menos en parte, anticuerpos humanizados anti-4-1BB y fragmentos de los mismos con propiedades mejoradas que contienen una o más características estructurales que no se encuentran en un anticuerpo anti 4-1BB humano humanizado de referencia, 94G1. 94G1 se generó por humanización del anticuerpo Bb K-4 murino anticuerpo anti-4-1BB humano. Los sitios de reconocimiento de antígenos (regiones CDR) se determinaron mediante asignación de lazos de las CDR (IMGT. Lefranc, 1997) y un modelo 3-D (Swiss-Pdb Viewer (www.expasy.org)). Se preparó una biblioteca de presentación de fagos con diversidad en un total de 10 sitios, que incluyen 4 sitios en la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y se construyeron 6 sitios de la cadena pesada. Después del cribado, se seleccionaron aproximadamente 14 clones de anticuerpos humanizados de 1000 clones (para un total de seis scFv humanizados), y entre los clones seleccionados, se obtuvo 94G1 (Son y otros J. Immunol. Métodos (2004) 286: 187-201). Estos anticuerpos humanizados, que incluyen 94G1, tuvieron afinidades por el antígeno 4-1BB humano inferiores a 1/10mo de la de BBK-4, pero estuvieron activos in vitro. La presente descripción abarcó el reconocimiento de que las variantes estructurales de 94G1 pueden tener propiedades mejoradas. La generación y caracterización de anticuerpos anti-4-1BB humanos humanizados variantes y fragmentos de los mismos se describe con más detalle en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 - Preparación de anticuerpos anti-4-1BB humanos humanizados

Este ejemplo describe la producción de unos anticuerpos anti-4-1BB humano ilustrativos con afinidad mejorada sobre un anticuerpo 94G1 de referencia. El 94G1 se generó por humanización de un anticuerpo murino anti 4-1BB humano (BBK 4) como se describe en Son y otros. J. Immunol. Methods (2004) 286: 187-201. También se usa en la presente descripción un antígeno H4-1BB (No. de acceso: KCTC 0952BP) que se aísla específicamente de células T activadas (por ejemplo, línea de células T activadas) y no se ha identificado a partir de células T no estimuladas. Por ejemplo, un antígeno H4-1BB puede aislarse de células T que han madurado con acetato de miristato de forbol (PMA), ionomicina, concanavalina A o anti CD3i. Este antígeno H4-1BB tiene un tamaño de 1,4 kb y 60 % de homología con el 4-1BB de ratón (Garni-Wagner y otros, Cellular Immunology (1996) 169: 91-98). En este ejemplo, 94G1 se dividió en vectores de la cadena ligera y de la cadena pesada, cada uno optimizado para generar anticuerpos humanizados mejorados.

La presente descripción abarca el reconocimiento de que un método adecuado para generar anticuerpos anti-4-1BB humano humanizados mejorados o un fragmento de los mismos es a través de sustituciones de aminoácidos únicas, escalonadas y/o combinaciones de los mismos. La presente descripción proporciona diversas variantes estructurales de anticuerpos anti-4-1BB humano humanizados y fragmentos de los mismos con una o más características estructurales (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos) que no se encuentran en un anticuerpo 94G1. La presente descripción abarca además un reconocimiento de que las características estructurales se pueden combinar para mejoras escalonadas en una o más propiedades del anticuerpo (por ejemplo, afinidad por el antígeno aumentada). Primero, se obtuvo un anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado con afinidad aumentada con relación al anticuerpo de referencia 94G1 al cambiar una región CDR de una cadena ligera, en lugar de una cadena pesada. Esta variante estructural de la cadena ligera se fijó y se combinó con variantes estructurales de cadenas pesadas del anticuerpo anti 4-1BB humano humanizado con, por ejemplo, mutaciones en la región CDR de 94G1. Se integraron características estructurales adicionales para generar anticuerpos anti-4-1BB humano humanizados con alta afinidad y/u otras características mejoradas.

1.1 Construcción de vectores

Los vectores con una cadena ligera de 94G1 y una cadena pesada de 94G1, respectivamente, se construyeron al cambiar pComb3H-HA para que se expresara en un tipo Fab para mejorar una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo humanizado en A. coli (J. Immunol Methods (2008) 329(1-2):176- 83; Virology (2004) 318: 598). Específicamente, se insertó una cadena ligera de 94G1 en un vector diseñado al cambiar una etiqueta AP2 (SEQ ID NO: 42 - NANNPDWDFNP) con una etiqueta flag (SEQ ID NO: 43 - DYKDDDDK), la etiqueta flag está diseñada para localizarse aguas abajo de la misma, y tiene una secuencia de la cadena pesada humana (No. de acceso AB019438) obtenida a partir de datos conocidos del NCBI GenBank que se colocó como un dominio constante en una posición de la cadena pesada. Además, después de clonar una secuencia de la cadena ligera de 94G1 en el vector, se transfirió a E. coli (por ejemplo, TGI) (F' [traD36 proAB+ladqlacZAM15] supE thi-1 A (lac-proAB) A (mcrB-hsdSM) 5, (rK-mK-) mediante transformación, seguido de la selección de un vector transformado llamado pCOM-Fab-94G1-L, que se usó como una cadena principal para inducir la maduración por afinidad de la cadena ligera (Tabla 1). El método descrito anteriormente se llevó a cabo de manera similar para la cadena pesada de 94G1, y un vector seleccionado se denominó pCOM-Fab-94G1-H. Se diseñó una cadena ligera mejorada, 94/w, como la cadena ligera de pCOM-Fab-94G1, que sirvió como cadena principal para la producción de variantes de la cadena pesada con afinidad mejorada.

Tabla 1 - Secuencias de aminoácidos de la LCDR de 94G1 y 94/w

1.2 Maduración por afinidad de la cadena ligera del anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado

En la presente descripción se describe el desarrollo de un anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado con una variante de la cadena ligera que tiene una afinidad de unión mejorada. Se obtuvo un anticuerpo con una alta afinidad al cambiar la LCDR3 (SEQ ID NO: 3) de una cadena ligera de 94G1 en el contexto del vector pCOM-Fab-94G1-L descrito anteriormente como sigue. Varias secuencias de ADN que codifican una cadena ligera se amplificaron mediante PCR mediante el uso de cebadores [mediante el uso de NNS (N: A, T, C, G; S: C, G)] diseñadas para insertar 19 aminoácidos diferentes en cada posición de aminoácidos de los 9 aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, que constituye la parte de la LCDR3 de la cadena ligera de 94G1. Los productos amplificados se ligaron a una posición de la cadena ligera del vector y luego se transformaron en el TG1 de E. coli. Todos los clones con variantes de estructura de la cadena ligera de la LCDR3 se sustituyeron en diferentes formas y se recolectaron para preparar mezclas de nueve posiciones. Para evaluar si cada posición de aminoácido se sustituyó por un aminoácido diferente, se eligieron al azar dos clones cambiados en las posiciones respectivas y se analizaron mediante secuenciación mediante el uso de un secuenciador ABI-3730xl, que mostró que los residuos de aminoácidos en las posiciones respectivas se sustituyeron en diversas posiciones.

Para ver si las variantes de Fab de 94G1 con mutaciones en diferentes posiciones de la LCDR3 tenían una mayor afinidad de anticuerpos, cada mezcla de posición se expresó mediante la adición de IPTG (a una concentración final de ImM) para el TG1 de E. coli y luego el anticuerpo Fab presente en un sobrenadante se sometió a ELISA. Específicamente, cada mezcla de posición se cultivó con agitación en un medio 2YT en una incubadora a 37 °C hasta que el cultivo tuvo una absorbancia a 600 nm de 0,8 o más, luego se cultivó durante toda la noche a 30 °C con IPTG (por ejemplo, a una concentración final de 1 mM). El ELISA se realizó al día siguiente en un sobrenadante obtenido por centrifugación a 12000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Se determinaron las afinidades de unión para los diversos Fab variantes de la LCDR3 de 94G1 al dividir las actividades de unión de cada uno de los clones con respecto al Fab de 4-1BB por los niveles de expresión para el clon mutante respectivo. Una variante de la LCDR3 de 94G1 con una posición de mutación 6 de la LCDR3 (LCDR3.6) mostró la mayor afinidad de unión.

Posteriormente, para determinar cómo varias mutaciones de 94G1 en la posición de la LCDR3.6 impactaban la afinidad del anticuerpo, se aislaron 25 anticuerpos monoclonales de la mezcla de la posición pCOM-Fab94Gl-LCDR3.6 y se expresaron mediante la adición de IPTG (por ejemplo, a una concentración final de 1 mM) a E. coli (por ejemplo, ^tG1), se cultivó y se realizó ELISA en un anticuerpo Fab presente en un sobrenadante. Se determinaron las afinidades de unión para los diversos clones de la LCDR3.6 de 94G1 al dividir las actividades de unión del Fab de 4-1BB de cada uno de los clones mediante los niveles de expresión de cada uno.

Una variante de la LCDR3.6 de 94G1 con fenilalanina en la posición de la LCDR3.6 sustituida con triptófano exhibió la mayor afinidad de unión. Un anticuerpo Fab preparado al sustituir la cadena pesada constante de pCOM-Fab94G1-L con la cadena pesada de la cadena principal de 94G1 en la cadena ligera mejorada de 94G1 se denominó 94/w. Por lo tanto, una variante de 94/w incluye una cadena ligera de 94G1 mejorada en la que el 6to aminoácido de la LCDR3 está sustituido con triptófano (W) (QDGHSWPPT - SEQ ID NO: 4) y una cadena pesada de 94G1. La expresión inducida por IPTG en E. coli y el ELISA de un Fab del 94/w se usaron para determinar la afinidad de unión como se describió anteriormente. Mediante el uso de este método, se determinó que un anticuerpo Fab de 94/w tiene una actividad de unión 3,5 veces mayor que la del 94G1 (anticuerpo Fab) (datos no mostrados).

1.3 Maduración por afinidad de la CDR de la cadena pesada del anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado En la presente descripción se describe el desarrollo de anticuerpos anti-4-1BB humano humanizados con variantes estructurales de la cadena pesada que tienen una afinidad de unión mejorada. Para lograr adicionalmente anticuerpos anti-4-1BB humanos mejorados, se usó una cadena ligera de 94/w como se describió anteriormente y la cadena pesada de 94G1 se maduró por afinidad. En la Tabla 2 a continuación se proporcionan las secuencias de aminoácidos de la HCDR para una cadena pesada del anticuerpo 94G1 de referencia.

Tabla 2 - Secuencias de aminoácidos de la HCDR de 94G1 y 94K

La mejora de una cadena pesada mediante el uso de 94/w como secuencia de partida se realizó mediante métodos similares a los descritos para la cadena ligera de 94G1 anteriormente. Particularmente, para mejorar una cadena pesada de 94G1, los residuos de aminoácidos se sustituyeron por diversos aminoácidos en las respectivas posiciones de aminoácidos de HDR2 y/o HCDR3. En el caso de la tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3, SEQ ID NO: 7), se produjeron clones con residuos de aminoácidos de sustitución aleatoria de la HCDR3 de 94/w por diferentes aminoácidos que se recolectaron para preparar mezclas de 12 posiciones. También se preparó un clon mutante que aumenta la longitud de la HCDR3. Cuando el 5to residuo de aminoácido de la HCDR3 se sustituyó con un aminoácido diferente, se observó un aumento de la afinidad. Posteriormente, para determinar cómo diversas mutaciones en la posición de la HCDR3.5 impactaban en la afinidad del anticuerpo 94/w, se aislaron 19 anticuerpos monoclonales de una mezcla de posiciones en la que la posición de la HCDR3.5 del anticuerpo 94/w se sustituyó aleatoriamente. Los Fab variantes de HCDR3.5 se expresaron en E. coli mediante la adición de IPTG (por ejemplo, a una concentración de 1 mM) y se realizó ELISA mediante el uso de un anticuerpo Fab presente en un sobrenadante. La secuenciación identificó que cuando la treonina se sustituyó con lisina en la posición de la HCDR3.5 (5ta posición) (SEQ ID NO: 8 - ARSFKTARAFAY), se mostró la mayor afinidad y el producto resultante se denominó 94^k/^w.

En el caso de la segunda CDR de la cadena pesada (HCDR2), se preparó una mezcla de posiciones mediante sustitución aleatoria de cada uno de los 9 aminoácidos de una HCDR2 de 94G1 (SEQ ID NO: 6) por ELISA. Los resultados del ELISA mostraron que cuando los residuos de aminoácidos en 2da, 5ta y 6ta posiciones se cambiaron, la afinidad aumentó. De cada una de las mezclas de posiciones de 94/w HCDR2.2, HCDR2.5 y HCDR2.6, se aislaron 22, 19 y 36 anticuerpos monoclonales, respectivamente, y se analizó la actividad de unión de cada clon con respecto a 4-1BB en dependencia de un nivel de expresión de Fab. En el caso de la HCDR2.5, un valor de ELISA fue relativamente más alto que cuando se sustituyó la asparagina con valina (V), glicina (G) o prolina (P). Además, de acuerdo con los datos de secuenciación para las cadenas pesadas de los anticuerpos, existía riesgo de desaminación en el 5to aminoácido, asparagina (N), de la HCDR2 (SEQ ID NO: 6) y las secuencias de la HCDR2 variantes se prepararon con sustituciones en este residuo con cada una de glutamina (Q), ácido glutámico (E) y serina (S).

Los ADN de las variantes estructurales de 94G1 con mutaciones en la HCDR3 y/o la HDR2 de la cadena pesada preparados como se describió anteriormente, se amplificaron mediante PCR mediante el uso de una secuencia de tres bases NNS, ligada a la posición de la cadena pesada de un vector que tiene un dominio constante de la cadena ligera de 94/w, y luego se transformaron en el TG1 de E. coli por el método usado en la mejora de la cadena ligera como se describe anteriormente.

1.4 Optimización de las regiones del marco de la cadena pesada del anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado También se produjeron variantes de la cadena pesada con secuencias del marco optimizadas. Por ejemplo, se produjeron regiones del marco 1 de la cadena pesada (FR1) en las que se modificó la cadena pesada FR1 (SEQ ID NO: 16) de modo que el 5to aminoácido glutamina (Q) se sustituyó con valina (V). Las regiones FR1 ilustrativas se proporcionan en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3 - FR1 de la cadena pesada de 94G1 y variaciones de la misma

Además, se produjeron regiones del marco 3 (FR3) donde la FR3 de la cadena pesada (SEQ ID NO: 18) se modificó como tal: el 10mo aminoácido, alanina (A) y/o el 33er aminoácido serina (S), que eran secuencias murinas, fueron sustituidos con valina (V) y treonina (T), respectivamente. Se proporcionan regiones FR3 ilustrativas en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4 - FR3 de la cadena pesada de 94G1 y variaciones de la misma

1.5 Preparación de las regiones variables del anti-4-1BB humano humanizado y anticuerpos de longitud completa Se produjeron regiones variables del anticuerpo anti-4-1BB humano que incluyen diversas combinaciones de las CDR de la cadena pesada y cadena ligera y regiones del marco descritas anteriormente. Por ejemplo, se produjo un anticuerpo 94KVT/w de tipo Fab con el 5to aminoácido treonina en la CDR3 de una cadena pesada que fue sustituido con lisina (K), y el 10mo aminoácido de la FR3 de la cadena pesada, alanina, y los 33 aminoácidos de la cadena pesada FR3, serina, se sustituyeron con valina (V) y treonina (T), respectivamente, para producir la secuencia de la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera que son o incluyen la SEQ ID NO: 30 y la SEQ ID NO: 34, respectivamente. Además, se produjeron variantes de la cadena pesada de 94KVT donde el 5to aminoácido de la HCDR2 (SEQ ID NO: 6), asparagina (N), se sustituyó con glutamina (Q), ácido glutámico (E) o serina (S). En la Tabla 5 a continuación se proporcionan ejemplos de secuencias de dominio variable de la cadena pesada y de la cadena ligera ilustrativos (secuencias de las CDR subrayadas).

Tabla 5 - Dominios variables del anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado ilustrativos

Para la conversión a unos anticuerpos anti-4-1BB humanos de longitud completa (tipo Ig completa), se conectó un dominio Fc al Fab respectivo. Por ejemplo, un Fab de 94 K/w compuesto por una cadena pesada en la que la treonina está sustituida con lisina en la HCDR3.5 y una cadena ligera con una variante de 94/w en la que el 6to aminoácido de la LCDR3 se sustituyó con triptófano (W), y las regiones respectivas extendidas desde los dominios CH2 y CH3 y una secuencia de IgG1 humana se amplificaron mediante PCR para superponerse y se sometieron a PCR de empalme para producir ADN de IgG completo, y luego se clonó el ADN resultante en un vector de expresión de mamífero. Los anticuerpos de longitud completa para otros anticuerpos anti-4-1BB humano humanizados descritos en la presente descripción se produjeron de una manera similar. Se proporcionan secuencias de la región constante de la inmunoglobulina ilustrativas en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6 - Dominios constantes de la inmunoglobulina ilustrativos

Como se usa en la presente descripción, un anticuerpo 94KVT/w de longitud completa incluye una secuencia de IgGl, tal como la de la SEQ ID NO: 22. Además, se produjo un anticuerpo de longitud completa, denominado en la presente descripción EU101, que incluye los dominios variables de 94KVT/w descritos anteriormente (SEQ ID NO: 10 y 14, para los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada, respectivamente), con un dominio constante de IgGl variante que incluye 3 mutaciones: L234, L235 y K322 (SEQ ID NO: 23). Por tanto, el ejemplo proporciona diversos anticuerpos anti-4-1BB humano humanizados y fragmentos de anticuerpos ilustrativos que han sido modificados genéticamente para potenciar potencialmente la afinidad de unión al antígeno. Estos anticuerpos y fragmentos ilustrativos se caracterizan en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 2 - Caracterización de la unión de anticuerpos anti-4-1BB humano humanizados

2.1 Determinación del epítopo de unión de los anticuerpos anti-4-1BB humanos

La presente descripción abarca el reconocimiento de que los anticuerpos anti-4-1BB humanos humanizados proporcionados en la presente descripción pueden ser útiles para la coestimulación de 4-1BB. Las aplicaciones terapéuticas de los anticuerpos de la presente descripción pueden incluir promover la inmunidad anticancerígena y/o la inmunidad antiviral. Sin embargo, para aplicaciones clínicas, es importante identificar qué parte del 4-1BB humano es reconocida y/o reacciona con un anticuerpo anti-4-1BB humanizado (es decir, un epítopo de unión). Se han identificado anticuerpos 4-1BB que reconocen diferentes epítopos de la molécula 4-1BB, y se puede haber demostrado que estos anticuerpos tienen diferentes efectos clínicos. (Ver, por ejemplo, Kwon y otros. Eur. J. Immunogenetics (2002) 29: 449-452). El mapeo de epítopos comprende métodos para identificar un determinante molecular del reconocimiento anticuerpo-antígeno. Este ejemplo describe el mapeo de epítopos de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo como se diseñó en el Ejemplo 1 anterior. Específicamente, este ejemplo evalúa el epítopo de unión de un anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado con dominios variables de 94KVT/w, EU101. Un antígeno 4-1BB humano para investigar un epítopo del anticuerpo 4-1BB humanizado se deriva de una biblioteca de ADNc fabricada a partir de linfocitos de sangre humana periférica que fue generada por al menos algunos de los inventores de la presente solicitud (Ver, por ejemplo, Kwon y otros. Cellular Immunology (1996) 169: 91-98; Immunol. Lett. (1995) 45: 67-73; y la Patente coreana No. 10-0500286). Se seleccionó el A^dN^cque codifica un dominio extracelular (ECD) del homólogo humano obtenido del ADNc de 4-1BB (en lo sucesivo, denominado H4-1BB), se fusionó con GST y luego se insertó en un vector (pGEX-6T) para expresarlo. Una línea celular que produce un polipéptido de fusión GST-4-1BB como se usa en la presente descripción, se depositó como parte de la descripción de la Patente Coreana No. 10-0500286, No. de Acceso: KCTC 0952BP. Se proporciona una secuencia de longitud completa del 4-1BB humano como la SEQ ID NO: 44, a continuación. El dominio extracelular del 4-1BB humano corresponde a los aminoácidos 1 a 167 de la secuencia del H4-1BB de longitud completa.

SEQ ID NO: 44 - Secuencia del 4-1BB humano de longitud completa

MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPN SFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSM CEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVN GTKERDWCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLF LLFFLTLRFSWKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGG CEL

Para determinar un epítopo de 4-1BB reconocido por los anticuerpos anti-4-1BB humanos humanizados de la presente descripción, se generaron construcciones con fragmentos de un dominio extracelular del 4-1BB de diversos tamaños (por ejemplo, R1, R2, R3), fusionado a GST y replicado. Se proporciona un esquema de los polipéptidos GST-4-1BB como se usa en el presente ejemplo en la Figura 1A. y en la Tabla 7 a continuación se proporcionan secuencias de cebadores ilustrativos usadas en la presente descripción para generar diferentes construcciones del dominio extracelular de 4-1BB. Se cultivaron construcciones de GST-H-4-1BB recombinantes individuales con IPTG 1 mM y se produjeron en las células BL21DX5a de E. coli y los polipéptidos de fusión se purificaron mediante el uso de una columna de glutatión-agarosa.

Tabla 7 - Cebadores ilustrativos usados para generar fragmentos del dominio extracelular de 4-1BB humanos útiles para el mapeo de epítopos

Se obtuvieron muestras de proteínas purificadas a partir de células bacterianas transformadas mediante un tampón de lisis (por ejemplo, Tris-HCl 10 mM - pH 7,4, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, NaF 30 mM, Na3VO4 0,1 mM, Triton X-100 al 1 %, Nonidet P-40 al 0,5 %, Pm Sf 1 mM y mezcla de inhibidores de proteasa). Aproximadamente 20 |jg de cada muestra de polipéptido de fusión se diluyeron en un tampón de muestra ^sD^s4X, se sometieron a electroforesis en geles s DS-PAGE y luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore, Bedford, MA). En las membranas de celulosa, se hizo reaccionar mAb anti-4-1BB humano con peróxido de rábano picante (HRP) anti-IgG de ratón. Los anticuerpos de unión se reconocieron mediante quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Reino Unido).

Como se describe arriba y se muestra en la Figura 1B, cuando cada uno de los tres polipéptidos de fusión del fragmento ECD-GST de H4-1BB no superpuestos, R1, R2 y R3, se trataron con unión a GST, respectivamente. Se determinó que un anticuerpo anti-4-1BB humanizado ilustrativo abarcado por la presente descripción (EU101) se une a una construcción de fusión de la construcción del fragmento N-terminal (R1) de aproximadamente 32 kDa (aminoácidos 1 a 55 de 4-1BB) mediante transferencia western. Además, esta unión fue específica, ya que no se observó unión con las construcciones de fusión R2 o R3. Ver la Figura 1B.

Además, para determinar el sitio de unión mínimo del anticuerpo anti-4-1BB humanizado, un fragmento del dominio extracelular R1 se dividió además en 6 fragmentos más pequeños: Los fragmentos de polipéptidos R1.1 (aminoácidos 1 a 45 de 4-1BB), R1.2 (aminoácidos 1 a 35 de 4-1BB), R1.3 (aminoácidos 11 a 55 de 4-1BB), R1.4 (amino ácidos 21 a 55 de 4-1BB), R1.5 (aminoácidos 1 a 25 de 4-1BB) y R1.6 (aminoácidos 1 a 30 de 4-1BB), como se muestra en la Figura 1A, y fusionados a GST (glutatión S-transferasa, 27 kDa). En la Tabla 7 anterior se proporcionan pares de cebadores ilustrativos usados para la generación de estas construcciones. Las construcciones de polipéptidos de fusión se produjeron en las células BL21 de E. coli con inducción de IPTG (por ejemplo, IPTG 1mM) y el extracto de células bacterianas completo se resolvió mediante SDS-PAGE al 12 %. Como se muestra en la Figura 2A, SDS-PAGE confirmó que los polipéptidos de fusión de 4-1BB individuales están bien expresados.

Se transfirió la SDS-PAGE a una membrana de nitrocelulosa y se realizó la inmunotransferencia mediante el uso de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo, EU101. Como se muestra en la Figura 2B, se confirmó que una secuencia de 10 a 30 aminoácidos del dominio extracelular de H4-1BB es significativa para unirse a un anticuerpo anti-4-1BB humanizado ilustrativo. Este análisis indica que un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo de la presente descripción (EU101) se une a un epítopo del 4-1BB humano cuya secuencia es o incluye CPAGTFCDNNRNQICSPCPP (SEQ ID NO: 15). También se confirmó que una secuencia que incluye los aminoácidos 35 a 50 del dominio extracelular de 4-1BB no es significativa para unirse a un anticuerpo humanizado ilustrativo descrito en la presente descripción (Figura 2B).

2.2 Evaluación de la afinidad de unión de anticuerpos anti-4-1BB humano humanizados ilustrativos al antígeno 4-1BB

Capacidad de unión de anticuerpos anti-4-1BB humano ilustrativos

Para examinar la capacidad de unión de anticuerpos anti-4-1BB humanos humanizados ilustrativos descritos en el Ejemplo 1 a un antígeno 4-1BB humano (H4-1BB), se realizó ELISA. 4-1BB humano recombinante expresado en E. coli se usó para el antígeno.

Un anticuerpo BBK-4 murino, un anticuerpo humanizado 94G1 de referencia y anticuerpos modificados genéticamente ilustrativos 94K, 94KV, 94KVT y EU101 como se describen en el Ejemplo 1 se trataron cada uno en placas de 96 pocillos recubiertas con proteína recombinante del dominio extracelular de 4-1BB marcada con histidina (H4-1BB). El análisis de afinidad del ELISA ilustrativo empleó un volumen total de 100 pL a una concentración de 1,0 pg/mL, y se dejó que la reacción prosiguiera a temperatura ambiente durante 1 hora. Se trataron anti-IgG humana y anti-mIgG-HRP marcados con peroxidasa de rábano picante (HRP), según fuera apropiado, un anticuerpo del mismo se trató y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 40 minutos. Después del lavado, el tratamiento con una solución de ABTS (Sigma-Aldrich), que es un sustrato para una reacción de coloración, y la reacción permite que transcurra a temperatura ambiente durante 30 minutos, y se detectó una absorbancia a 450 nm en la reacción de coloración mediante el uso de un lector de ELISA para analizar una actividad de unión de los anticuerpos. Los resultados se muestran en la Figura 3. Como se muestra en la Figura 3, a medida que aumenta la concentración de anticuerpos, se mejora la unión entre cada anticuerpo y el antígeno 4-1BB (H4-1BB). Estos datos confirman que los anticuerpos abarcados por la presente descripción se unen específicamente a 4-1BB.

Unión de anticuerpos anti-4-1BB humano ilustrativos al antígeno expresado en células

Se evaluó la capacidad de anticuerpos anti-4-1BB humanizados ilustrativos para unirse a un antígeno 4-1BB humano (H4-1BB) en un contexto celular. Las células Jurkat 8-1 se modificaron genéticamente para sobreexpresar 4-1BB. Los anticuerpos 94K, 94KV, 94KVT y EU101 modificados genéticamente ilustrativos como se describe en el Ejemplo 1, junto con el de un anticuerpo BBK-4 murino y un anticuerpo humanizado 94G1 de referencia, se evaluaron para determinar la unión a las células Jurkat 8-1 mediante el uso de un anticuerpo secundario anti-mlgG-HRP o anti-hlgG-HRP, según corresponda, y analizado por FACS. Como se muestra en la Figura 4, cada uno de los anticuerpos fue capaz de unirse efectivamente al 4-1BB expresado por las células Jurkat 8-1 y la afinidad de 94KVT y EU101 fue mayor que la de BBK-4 y 94G1.

Afinidad de unión in vitro de anticuerpos anti-4-1BB humano ilustrativos al antígeno

La afinidad de unión in vitro del anticuerpo EU101 modificado genéticamente ilustrativo como se describe en el Ejemplo 1, junto con la de un anticuerpo humanizado 94G1 de referencia, se determinó cada una mediante análisis Biacore. Se inmovilizó anti-IgG humana en un chip CM5 y se acopló a los anticuerpos Fab preparados anteriormente mediante flujo sobre el chip, y finalmente se hizo reaccionar con un antígeno 4-1BB humano (H4-1BB) para medir la actividad de unión entre el anticuerpo y el antígeno (Biacore3000, chip sensor CM5). Los resultados de la medición de la afinidad se muestran en la Figura 5. Los valores de Ka (1/Ms) y Kd (1/s) representan la rapidez con la que un anticuerpo se asocia y se disocia de un antígeno, respectivamente. Una constante de disociación (Kd) se obtiene dividiendo Kd por Ka (Kd/Ka = Kd).

A medida que disminuye una constante de disociación, se puede interpretar que la disociación se produce a una concentración más baja y que la afinidad aumenta. Como se muestra en la Figura 5, el anticuerpo anti-4-1BB humano modificado genéticamente ilustrativo tenía una afinidad de unión mejorada con relación a un 94G1 de referencia.

Los anticuerpos anti-4-1BB humano ilustrativos reconocen el 4-1BB expresado por las células T CD8+ activadas

Se aislaron células T CD8+ de PBMC humanas y se activaron con 1 pg/mL de anticuerpo anti- CD3 durante 2 días. La capacidad de los anticuerpos anti-4-1BB humanos humanizados ilustrativos (94K, 94KV, 94KVT y EU101) descritos en el Ejemplo 1 para detectar un 4-1BB en la superficie de las células T CD8+ activadas, se evaluó con relación a un anticuerpo anti-4-1BB disponible comercialmente ilustrativo (4-1BB-PE). También se muestra la detección con un BBK-4 un anticuerpo murino anti-4-1BB humano y un anticuerpo humanizado de referencia 94G1. El tratamiento con anticuerpos 4-1BB se realizó a una concentración de 25 ng/mL.

Se detectaron anticuerpos ilustrativos con un anti-mIgG-Dylight488 o anti-hlgG- Dylight488 según fuera apropiado, y se analizaron mediante FACS. Los resultados se muestran en la Figura 6. Mientras que un anticuerpo 94G1 de referencia detectó 4-1BB en el 17,93 % de las células T CD8+, cada una de un anticuerpo 94^kV^ty EU101 mostraron una detección robusta de 25,3 % y 28,33 %, respectivamente. Al demostrar que los anticuerpos ilustrativos 94KVT y EU101 tenían propiedades de unión mejoradas sobre BBK-4 y 94G1. Por tanto, los anticuerpos variantes humanizados de la presente descripción tienen una unión superior a las células T activadas in vitro.

Ejemplo 3 - Análisis de la eficacia in vitro de los anticuerpos anti-4-1BB humanos humanizados

Se ha demostrado previamente que los anticuerpos anti-4-1BB proporcionan estimulación de señal a una molécula de coestimulación expresada en las células T CD8 activadas, 4-1BB, para activar las células T CD8+, inducen la proliferación y aumentan la expresión de citocinas T^hde tipo l. En este ejemplo, se examinó la actividad de los anticuerpos anti-4-1BB humano humanizados ilustrativos descritos en el Ejemplo 1 para inducir la proliferación de las células T CD8+ y la expresión de citocinas de tipo Th1.

3.1 Los anticuerpos anti-4-1BB humanos ilustrativos inducen la proliferación celular de células T CD8+

Para evaluar la proliferación de las células T CD8+, las células se tiñeron con WST-1 (sal de tetrazolio soluble en agua) es un reactivo de proliferación celular. Las células T CD8 marcadas con WST-1 se prepararon y activaron con 0,5 pg/mL del anticuerpo anti-CD3. Las células T CD8+ activadas se trataron con 1,0 pg/mL del anticuerpo de control de tipo iso, anticuerpo BBK-4 murino, anticuerpo 94G1 de referencia y anticuerpos anti-4-1BB humano humanizados ilustrativos (94K, 94KV, 94KVT y EU101) descritos en el Ejemplo 1. Las células se analizaron mediante el uso de un sistema MACS y los resultados se muestran en la Figura 7. Con referencia a la Figura 7, se confirmó que los anticuerpos anti-4-1BB humano humanizados ilustrativos de la presente descripción inducen la proliferación celular de las células T CD8+. Además, un grado activación de las células T CD8+ aumenta en un orden de 94G1 < 94K/94KV < 94KVT / EU101.

3.2 Los anticuerpos anti-4-1BB humano ilustrativos estimulan la secreción de citocinas

El IFN-y es una citocina representativa secretada principalmente por un linfocito T o una célula asesina natural (célula NK) y que exhibe proliferación y actividades antivirales. Además, el IFN.y es un activador importante para un macrófago y, particularmente, una citocina importante que distingue células Th1 de otros tipos de células. La secreción de IFN.y juega un papel importante en la activación de las células T citotóxicas, fagocitos y células B. En consecuencia, la eficiencia de un agente anticancerígeno se puede evaluar con una cantidad aumentada de IFN-y que induce Th1. Por esta razón, la medición de la secreción de IFN-y mediante estimulación específica puede ser un estándar óptimo que puede usarse como un criterio cuantitativo para un cambio funcional de las células T.

Se aislaron células T CD8+ de PBMC humanas y se trataron con 0,5 pg/mL de un anticuerpo mAb anti-CD3 y luego se trataron sin anticuerpo o con 1,0 pg/mL de un anticuerpo anti-4-1BB: BBK-4, 94G1, 94K, 94KV, 94KVT y EU101. Se evaluó la secreción de IFNy los días 1,3 y 5. Los resultados se muestran en la Figura 8. Como puede observarse en la Figura 8, la secreción de IFNy aumentó en todas las muestras tratadas con anticuerpos anti-4-1BB, y este aumento se correlacionó con la duración del tratamiento con anticuerpos. El tratamiento con 94KVT y el anticuerpo EU101 alcanzó un nivel de secreción 13 veces mayor que el del grupo de control en el día 5. En consecuencia, los anticuerpos humanizados ilustrativos 94KVT y EU101 pueden inducir la secreción de IFNy de forma más eficientemente que el anticuerpo de referencia 94G1.

3.3 El aumento del nivel de IFN-y de acuerdo con el tratamiento de las células T CD4 o las células T CD8+ activadas con un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo

Se recogió sangre de tres donantes sanos, las PBMC obtenidas de ellos se aislaron mediante centrifugación en gradiente de placa con Ficoll y las células T activas presentes en las PBMC se dejaron en reposo en un medio RPMI-1640 FBS al 2 % durante 24 horas. Las PBMC en reposo se trataron con un anticuerpo anti-CD4 unido a perlas de hierro o un anticuerpo anti-CD8, y las células CD4+ o CD8+ se aislaron mediante el uso de un separador magnético MACS. Las células T CD4+ o las células T CD8+ aisladas se trataron con un activador de células T, antiCD3, para inducir la expresión de 4-1BB y se trataron con EU101 a diferentes concentraciones (0,5, 1,0, 2,5 y 5.0 jg/mL) durante 3 días. Después de 3 días, se obtuvo un medio de cultivo que excluía las células y se evaluó la fluorescencia del IFN.y humano en el medio de cultivo mediante ELISA (ebioscience), y el resultado se comparó con la curva estándar proporcionada en un kit de ELISA de IFN.y. (Figura 9).

Como se muestra en la Figura 9, los niveles de expresión de IFN.y en las células T CD4+ y las células T CD8+ aumentaron de forma dependiente de la dosis. Particularmente, cuando se trataron 5,0 jg/mL de EU101, en comparación con un aumento del 278 % en las células T CD4+, el nivel de expresión de IFN.y aumentó 612 % en las células T CD8+. De acuerdo con el patrón de expresión específico de células T de IFN.y implicado en la conversión de las células T en T^h1, un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo de la presente descripción, EU101, tiene suficiente actividad in vitro para sugerir que puede ser efectivo para la prevención y/o el tratamiento del cáncer.

3.4 Medición de las actividades de ADCC y CDC de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo

Un sistema inmunológico reconoce y ataca las células infectadas por virus o las células cancerígenas, y se pueden usar anticuerpos para inducir la apoptosis mediada por citotoxicidad. Para tal sistema inmunológico, se pueden usar dos tipos de mecanismos tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En ambos casos, la apoptosis puede estar mediada por un anticuerpo que se une a una diana en una superficie celular. Es decir, cuando un anticuerpo tiene una actividad ADCC, una célula reconocida por el anticuerpo da como resultado apoptosis mediada por una célula asesina natural (NK), y cuando un anticuerpo tiene una actividad CDC, la muerte está mediada por una proteína del complemento. Por lo tanto, en el caso del desarrollo de un anticuerpo terapéutico antagonista, se puede identificar un grado de muerte de células reconocido por un anticuerpo mediante análisis de las actividades ADCC y CDC. Sin embargo, una diana para el anticuerpo 4-1BB humanizado descrita en la presente descripción son las células T, no las células cancerígenas. Es decir, en consideración de un mecanismo para inducir la activación de las células T mediante la unión de un anticuerpo 4-1BB como un anticuerpo agonista, un anticuerpo que no tiene las actividades ADCC y CDC puede ser preferentemente para usos terapéuticos.

En la presente descripción, para un ensayo ADCC, se aislaron PBMC humanas mediante centrifugación con Ficoll mediante el uso de la misma diferencia de densidad. Las PBMC se incubaron en RPMI (Thermo Fisher Scientific) y FBS al 10 % con IL-2 (100 U/mL) para ser cultivadas durante toda la noche. Las células diana (líneas celulares que expresan 4-1BB) se recolectaron, se resuspendieron en un medio de cultivo a 1 mL y se marcaron con CFSE 5 uM a 37 °C durante 5 min. Las células efectoras/diana de la presente descripción se lavaron en una relación de 10:1, se contaron y luego se distribuyeron. Para el análisis, se preparó un anticuerpo de la presente descripción para una concentración final de 10 nM (1,5 jg/mL) y se cultivó en una placa a 37 °C durante 4 horas. Se añadieron 5 jL de 7-AAD a cada pocillo y se transfirieron a un tubo FACS, y luego la muestra se analizó mediante FACS fabricado por BDFACScan. Se midieron las frecuencias de células diana no viables (CFSE 7-AAD ) células diana viables (CFSE 7-AAD-). La ADCC se evaluó con una frecuencia de células viables de las células totales (Figura 10A).

Se realizó un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de manera similar al ensayo de ADCC descrito anteriormente mediante el uso de FACS como valor de lectura, con las células diana anteriores incubadas con anticuerpos anti-4-1BB en hielo durante 30 minutos y luego se añadió el suero suplementado humano a una concentración final del 20 % a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, las muestras resultantes se transfirieron a un tubo FACS y se evaluaron mediante FACS fabricado por BDFACScan (Figura 10B) Los resultados en la Figura 10A y en la Figura 10B confirman que un anticuerpo 4-1BB humanizado ilustrativo, EU101, casi no tiene efectos de ADCC y CDC. Por lo tanto, se puede decir que un anticuerpo EU101 ilustrativo de la presente descripción tiene propiedades ADCC y CDC beneficiosas para un anticuerpo agonista y es un buen candidato para el tratamiento anti cancerígeno in vivo.

Ejemplo 4 - Confirmación de la eficiencia in vivo de un anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado ilustrativo

El anticuerpo anti-4-1BB humano, EU101, de la presente descripción mostró un efecto dependiente de la dosis en un ejemplo in vitro, y mostró un efecto considerablemente superior a un anticuerpo convencional. Este ejemplo es para comprobar si el anticuerpo anti-4-1BB humano, EU101, se puede usar solo o en combinación con una composición diferente para diagnosticar, prevenir o tratar el cáncer o el tumor in vivo, e inhibir efectivamente el crecimiento del tumor.

4.1 El injerto NOD-scid IL2Rgammanul° de ratón de células mononucleares de sangre periférica humana y la actividad antitumoral del anticuerpo anti-4-1BB humano

La sangre venosa periférica recolectada de un donante sano de tipo HLA-A24 se trató con heparina y se sometió a centrifugación en gradiente de concentración en placa con Ficoll (GE Healthcare, Piscataway, Nj) para recolectar las PBMC. Las PBMC se lavaron con un medio RPMI-1640 y 3x106 de las células se inyectaron intraperitonealmente en ratones inmunodeficientes, es decir, ratones NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmlWjl/ SzJ- NOD-scid IL2rynul°, Laboratorio Jackson).

El análisis de ratones humanizados se realizó mediante citometría de flujo para comprobar si las células T humanas estaban presentes en la sangre de ratón recolectada mediante la recolección de sangre orbital de ratón después de 5 semanas del injerto de las PBMC humanas. Se criaron ratones NSG de 7 semanas de edad (Jackson Laboratory, Barharbor, ME) en un ambiente libre de patógenos específicos (SPF).

Se realizó citometría de flujo para verificar las relaciones de CD4 y CD8 después de teñir las células con marcadores de células sanguíneas humanas tales como un anticuerpo CD45 marcado con fluorescencia APC-cy7 y un anticuerpo CD4 marcado con fluorescencia FITC, y un anticuerpo CD8 marcado con fluorescencia BV510. Después de la recolección de sangre orbital de cada ratón, se observaron células T humanas de muestras de sangre de ratón para comprobar si un sistema inmunológico humano está injertado en el ratón. Se prepararon células tumorales humanas en un modelo de ratón humanizado de tipo HLA y se inyectaron subcutáneamente 1x107 células en el lomo de cada ratón. Cuando el tamaño del tumor alcanzó de 100 a 200 mm3, se administró por vía intravenosa una preparación de anticuerpo anti-4-1BB humano (EU101) ilustrativo a 1,0 mg, 5,0 mg o 10,0 mg por 1 kg de peso corporal una vez cada 5 días en total 3 veces. Como un control, se usó IgG humana. El volumen tumoral (mm3) de cada ratón se midió cada 3 días (Figura 11). Los resultados mostrados en la Figura 11 confirman que el tamaño del tumor en los ratones tratados con un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) se redujo con relación a los ratones tratados con IgG humana, y además que esta reducción fue proporcional a la concentración de anticuerpo. Particularmente, la regresión del tumor en un grupo al que se administró anticuerpo de 5 mg/kg se produjo rápidamente. Dentro de una semana después de la administración a una dosis de 5 mg/kg, el tamaño del tumor se asentó en un ratón humanizado y se erradicó el crecimiento del tumor. Por lo tanto, un anticuerpo ilustrativo EU101 de la presente descripción muestra un efecto anticancerígeno in vivo.

En consecuencia, los resultados anteriores muestran que un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) que reconoce específicamente un epítopo (SEQ ID NO: 15) de H4-1BB, pero debido a características mejoradas de este anticuerpo ilustrativo, tales como, por ejemplo, afinidad mejorada, este anticuerpo muestra efectos superiores en un modelo de ratón in vivo. Por tanto, el ejemplo sugiere que un anticuerpo abarcado por la presente descripción se puede usar como un agente anticancerígeno en una dosis menor que el anticuerpo de referencia.

4.2 Efectos de inhibir el crecimiento tumoral con un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo y un agente anti-PD-1 Comparación de los efectos causados por el tratamiento individual de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) y un agente anti-PD-1 ilustrativo después de la inyección tumoral en ratones humanizados

Se prepararon ratones humanizados mediante el mismo método descrito en el Ejemplo 4.1 anterior. Para realizar un experimento que confirme un aumento del efecto anticancerígeno de acuerdo con las dosis de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) y un agente anti-PD-1 ilustrativo (Keytruda) (adquirido de MSD, GER), 1 x 107 células de una línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano compatible con HLA-A, HT29, se inyectaron por vía subcutánea en los ratones humanizados previamente preparados. Cuando el volumen del tumor inyectado alcanzó de 100 a 150 mm3, los ratones se dividieron en un total de 5 grupos de tres ratones, y para comparar el efecto de EU101 sobre la inhibición del tumor, cada grupo de ratones se trató con cada una de las tres condiciones de administración (Control: IgG, Grupo tratado 1: 5 mg/kg, y Grupo tratado 2: 10 mg/kg) a intervalos de 5 días 5- 3 veces, y para anti-PD-1 se realizaron los mismos procedimientos (Figura 12). Como un resultado del experimento, en ambos casos de EU101 y keytruda (anti-PD1), los volúmenes tumorales se redujeron de forma dependiente de la dosis. Sin embargo, en la Figura 12, 5 mg/kg de EU101 no influyeron en el crecimiento tumoral, pero de acuerdo con el tratamiento con 5 mg/kg y 10 mg/kg de EU101, se exhibió una actividad antitumoral de forma dependiente de la dosis. Además, se confirmó que EU101 exhibió una mayor eficiencia a una dosis menor que keytruda (anti-PD-1), y el crecimiento tumoral fue bloqueado por completo, particularmente por el tratamiento con 5 mg/kg de EU101.

Tratamiento de ratones humanizados con una combinación de EU101 y un agente anti-PD-1 después de la inyección del tumor

Dado que las señales de los receptores coinhibidores (PD-1 y CTLA-4) y una señal de células T de coestimulación (CD 137) se diferencian con el mismo propósito de inhibir el crecimiento tumoral, la estimulación de los dos receptores puede esperar un efecto sinérgico (Chen y otros, Cancer Immunol. Res. (2015) 3:149-160; Bartkowiak y otros, Front. Oncol. (2015) 5: 117). Además, la inmunoterapia con PD1 mostró la posibilidad de un efecto de tratamiento anticancerígeno para algunas poblaciones de pacientes con cáncer, pero la administración de una dosis baja en terapia de combinación con un agente anticancerígeno diferente puede ser necesaria en una población de pacientes más extensa. Para investigar el efecto antitumoral causado por una terapia de combinación de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) y un agente anti-PD-1 ilustrativo (Keytruda), se trataron ratones humanizados portadores de tumores con la terapia de combinación de EU101 y Keytruda. La preparación de ratones humanizados se realizó mediante el mismo método que se describe en el Ejemplo 4.1

Se realizó una hemorragia ocular para identificar ratones humanizados. Entre los ratones humanizados, HT29, el carcinoma de colon se inyectó por vía subcutánea en ratones HLA-A24 y se mantuvo una condición normal a 1x107 células/ratones. Cuando el tamaño del tumor fue de 300 a 450 mm3, se realizó un experimento como sigue.

Como se sabe en este ejemplo, aunque el crecimiento tumoral no se retrasó con la inyección individual a la concentración mínima o menos (EU101: 2,5 mg/kg, Keytruda (fabricado a partir de MSD, GER): 2,5 mg/kg), el tumor retrocedió en gran medida con la terapia de combinación de EU101 y Keytruda. Este es el resultado que muestra que los anticuerpos anti-4-1BB humano ilustrativos proporcionados en la presente descripción (por ejemplo, EU101) son buenos candidatos para la terapia de combinación con diferentes agentes anticancerígenos, que incluyen en combinación con uno o más inhibidores de puntos de control inmunitarios (Figura 13).

Análisis de linfocitos infiltrantes de células T (TIL) en tejido normal y tejido de adenocarcinoma colorrectal humano después del tratamiento individual y combinado de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo y un agente anti-PD-1 ilustrativo

Después de la administración individual de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) y un agente anti-PD-1 ilustrativo (Keytruda) (adquirido de MSD, GER) y la administración combinada de EU101 y Keytruda a ratones humanizados implantados con HT29, en el día en que finaliza el análisis del efecto, todos los grupos se diseccionaron para separar el tumor y la sangre. Después de que el tumor separado se trató con colagenasa IV a 37 °C durante 30 minutos, las células en el tejido tumoral se disociaron mediante un método mecánico y luego se lavaron con IxPBS. Las PBMC se separaron de la sangre separada mediante centrifugación en gradiente de Ficoll, y las células tumorales separadas y las PBMC se sometieron al siguiente experimento. Los glóbulos rojos (RBC) se eliminaron de las células lavadas mediante el uso de un tampón de lisis de RBC y luego se lavaron con IxPBS. Los restos de células enredadas se eliminaron de las células lavadas mediante el uso de un colador de células de nailon de 40 |jm para crear un estado de célula única, y las células individuales se lavaron con IxPBS, seguido del recuento de células T separadas de cada grupo mediante el uso de un contador de células.

Las células T separadas se tiñeron con marcadores de células sanguíneas humanas tales como un anticuerpo CD45 (marcado con APC-cy7 fluorescente), un anticuerpo CD4 humano marcado con FITC fluorescente y un anticuerpo CD8 humano marcado con BV510 fluorescente, y luego se sometieron a ensayo FACS. El ensayo FACS se llevó a cabo basado en una relación (%) de grupos de células CD4 y CD8, que se obtuvieron del grupo CD45 (Figura 14A).

Particularmente, para identificar un grupo Treg entre las células T separadas, las superficies de las células se tiñeron con marcadores de células sanguíneas humanas tales como un anticuerpo CD45 (APC fluorescente marcado con cy7), un anticuerpo CD4 marcado con FITC fluorescente humano y un anticuerpo CD25 marcado con PE-cy5 fluorescente humano y la tinción intracelular e intranuclear con un factor de transcripción celular Foxp3 (anticuerpo Foxp3 marcado con APC fluorescente humano) se realizaron mediante el uso de un Foxp3/ kit de juego de tampón de tinción de factores de transcripción (ebioscience). En el ensayo FACS, se separó un grupo c D45 para obtener R1, un grupo CD4+CD25alt° se separó para obtener R2, y una relación (%) de un grupo Foxp3alto se midió en los grupos R1 y R2. Para identificar las células T IFN.y+ CD8+ en las células separadas, las superficies celulares se tiñeron con los marcadores de células sanguíneas tales como el anticuerpo CD45 humano marcado con APC-cy7 fluorescente y el anticuerpo CD8 humano marcado con BV510 fluorescente, se fijaron con PF A al 2% y se hicieron reaccionar con una solución de saponina al 0,5 % y un anticuerpo IFN.y humano marcado con PE-cy7 fluorescente. Posteriormente, las células a la citocina IFN.y+ en el grupo de células T CD8 se midieron mediante el ensayo FACS. Las células se identificaron en una relación por el mismo método como se describió anteriormente y se calculó una relación proporcional de la relación de CD8+IFN.y+ y la relación Treg, que se muestra en la Figura 14B.

De acuerdo con este resultado, además de la administración individual, la administración de combinación de EU101 y Keytruda aumentó en gran medida la infiltración de la combinación de tejido tumoral y un linfocito T. Los resultados más específicos adicionales del tratamiento de combinación son los siguientes. Cuando se realizó el tratamiento de combinación en PBMC en el ratón humanizado sano como un control, el número de linfocitos aumentó aproximadamente 3 veces y los linfocitos infiltrados por 1 g de tumor aumentaron 76 veces en el tejido tumoral. Esto significa que la mayoría de los linfocitos específicos de tumores se activaron y reclutaron en el tejido tumoral para matar las células diana. Particularmente, cuando se midieron las PBMC en el grupo de la terapia de combinación, como se muestra en la Figura 14A, las células T el CD4+ no aumentan mucho, pero las células T CD8 citotóxicas aumentaron aproximadamente 5 veces. Además, el grupo de terapia de combinación mostró un aumento de 100 veces en las células T CD8+contadas por 1 g de tejido tumoral. Además, como un resultado, una relación de células T CD8+ que secretan IFN.y y las células T regulatorias también aumentaron considerablemente (Figura 14B). Es decir, se puede decir que el tratamiento de combinación de EU101 y el agente anti-PD-1 produce un fuerte aumento de las células T efectoras y, por lo tanto, se realiza efectivamente la inhibición del tumor.

Análisis de IFN.y en suero o líquido tumoral obtenido de tejido de adenocarcinoma colorrectal humano después de un tratamiento individual y de combinación con un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU 101) y un agente anti-PD-1 ilustrativo (Keytruda)

Después de la administración individual y la administración de combinación de un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo (EU101) y un agente anti-PD-1 ilustrativo (Keytruda) a ratones humanizados implantados con HT29. El día en que terminaron los análisis de los efectos, se diseccionaron todos los grupos para separar el tumor y la sangre. En la disección del tumor para separar un líquido tumoral presente en el tumor separado, se inyectaron 300 jL de 1x PBS en la parte superior de una membrana tumoral mediante el uso de una jeringa 1cc, y se tomó una solución fluida de la parte inferior de la membrana tumoral mediante el uso de una jeringa de insulina. Además, en la disociación del tejido tumoral, se añadió la solución extraída para disociar el tejido tumoral y luego se almacenó. Además, como un suero, el suero se almacenó cuando las PBMC se separaron de la sangre mediante centrifugación en gradiente de Ficoll. El suero almacenado y un fluido tumoral se disolvieron y filtraron mediante el uso de una unidad de filtrado de 0,22 pm (fabricante: corning). Se usaron 10 pL de suero para cada grupo, y se usaron 100 pL del fluido tumoral para medir el IFN-y humano y el TGF-B humano mediante el uso de un kit ELISA Ready-SET-Go de IFN-y humano (eBioscience) y un kit ELISA Ready-SET-Go de TGF beta 1 humano (eBioscience). Los resultados se analizaron al comparar la curva estándar proporcionada en cada kit de ELISA.

Como un resultado, en comparación con la administración individual de EU101 y Keytruda, en la administración de combinación, la concentración de interferón en suero del grupo tumoral fue la más alta. Dado que un mecanismo de EU101 puede explicarse con una correlación entre IFN-y y un efecto antitumoral, fueron evaluados los niveles de expresión de IFN-y y TGF-p en suero de un donante sano y suero de un grupo tumoral, a los que la terapia de combinación se había aplicado. De acuerdo con el material del ejemplo sobre el suero del donante sano, en el grupo de la terapia de combinación que se muestra en la Figura 15A, el IFN-y aumentó aproximadamente 16 veces, pero una citocina secretada por las células Treg, TGF-p, disminuyó aproximadamente un 65 %. Adicionalmente, en la Figura 15B, la concentración de IFN-y causada por la administración de la combinación en el fluido tumoral fue considerablemente más alta (aproximadamente 213 veces) que la del control. Como un resultado de los ejemplos, debido a EU101, particularmente, en comparación con el grupo de control, el grupo de combinación mostró fuertes aumentos en la secreción de IFN-y. Por lo tanto, se puede confirmar que el efecto anti-cancerígeno causado por un anticuerpo anti-4-1BB humanizado mejorado de la presente descripción proporciona una infiltración tumoral efectiva de las células T efectoras directamente relacionadas con la apoptosis de las células cancerígenas, y un efecto considerablemente específico en el tejido tumoral, en comparación con el grupo no tratado. En otras palabras, en la presente descripción, se confirmó que EU101, como un agente anticancerígeno, tiene las condiciones óptimas para la apoptosis de las células cancerígenas. Convencionalmente, en pacientes con cáncer, las citocinas anti cancerígenas y la inmunidad celular anti-cancerígena se redujeron considerablemente, pero se puede esperar en la presente descripción que EU101 induce los aumentos en las citocinas anti-cancerígenas e inmunidad celular anti cancerígena, lo que resulta en un considerable efecto terapéutico.

Por tanto, un anticuerpo anti-4-1BB humano ilustrativo EU101 exhibe un efecto antitumoral mediado por la alta expresión de IFN-y, y tal efecto se exhibe de forma dependiente de la dosis, como tal, una concentración de IFN-y en un suero de un paciente con cáncer se puede usar como un biomarcador para diagnosticar y estimar el tumor. Por tanto, de acuerdo con el tratamiento efectivo del cáncer o tumor mediante el tratamiento de combinación de EU101 y anti-PD-1 y la prognosis mediante la medición de una concentración de IFN-y, se espera realizar un tratamiento más efectivo con respecto a cada paciente.

Ejemplo 5 - Separación y proliferación masiva de células T 4-1BB+ CD8+ ex vivo mediante el uso de un anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado ilustrativo

Los inventores usaron la expresión de 4-1BB en las células T CD8+ activadas específicamente por el antígeno en el aislamiento y purificación de las células T 4-1BB+CD8+ específicas para diversos antígenos mediante el uso de un anticuerpo anti-4-1BB (Patente coreana No. 10-1503341). Se realizó un experimento subsecuente para examinar si el anticuerpo EU101 desarrollado en la presente descripción también se usa para el aislamiento y la proliferación masiva de las células T CD8+ específicas del antígeno.

La construcción de PBMC a partir de sangre periférica de un paciente con cáncer se realizó como se describe en el Ejemplo 4.1. Sin embargo, en este ejemplo, las células T indiferenciadas específicas del antígeno del cáncer se pueden obtener mediante el método descrito en la Solicitud de Patente Coreana No. 10-2016- 0165224, presentada por los inventores. En este ejemplo, para una separación efectiva de las células T 4 lBB+CD8+ y la producción masiva de las células T 4-1BB+CD8+con alta pureza, se usó un método de cribado que usa un anticuerpo anti-4-1BB humano (EU101). Se añadieron 10 pg/mL del anticuerpo anti-4-1BB humano (EU101) diluido en PBS a un matraz de 10 mL, y luego se almacenaron a 4 °C durante 20 a 24 horas. Después del almacenamiento, se eliminó un sobrenadante que contenía el anticuerpo y, sin lavar, se añadió una solución de BSA disuelta al 2,5 % en PBS a los gránulos celulares en el matraz de 10 mL y luego se almacenó a 4 °C durante 20 a 24 horas. Posteriormente, se eliminó la solución de BSA y cada matraz se lavó dos veces con 15 mL de PBS. Las células preparadas previamente se suspendieron en un medio X-VIVO 10, se añadieron a un matraz recubierto del anticuerpo EU101 y luego se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO²durante 1 hora. Después de la incubación, se eliminó un sobrenadante y los sedimentos celulares se lavaron dos veces con 10 mL de medio RPMI1640 para eliminar las células que se unen de forma no específica. Se añadieron al matraz 1 % de suero propio y 1000 lU/mL de medio X-VIVO 10 que contenía IL-2, seguido de cultivo durante 14 días. En el ejemplo, se recolectaron algunas células y luego se tiñeron para medir la pureza y los fenotipos de las células aisladas. Como se muestra en las Figuras 16A y 16B, se confirmó que, antes del cribado con el anticuerpo 94 kvt, una relación de células T 4-lBB+CD8+ específicas del antígeno aumentaron un 43,2 % (Relación de células T CD8+: 58,6 %), y después del cribado con el anticuerpo EU101, una relación de células T pCMV+CD8+ específicas del antígeno aumentaron 60,0 % (Relación de células T CD8+: 79,3%). Esto significa que las células T 4-1BB+CD8+ específicas del antígeno se pueden aislar con alta pureza mediante el uso de un EU101. Las células T 4-1BB+CD8+ aisladas específicas del antígeno como se describió anteriormente pueden producirse en masa fácilmente mediante el método descrito en la Solicitud de Patente Coreana No. 10-2016-0165224 presentada por los inventores.

Los anticuerpos anti-4-1BB humano abarcados por la presente descripción demostraron un número de propiedades beneficiosas, tales como, por ejemplo, una afinidad superior por un anticuerpo de referencia, y/o pueden usarse solos o en combinación con otro agente anticancerígenos para diagnosticar, prevenir o tratar el cáncer o el tumor, o usarse para inhibir el crecimiento del cáncer.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:

un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 14; y y un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 10.

2. El anticuerpo anti-4-1BB o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1,

en donde el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno es un anticuerpo monoclonal, y/o

en donde el anticuerpo incluye un dominio constante de inmunoglobulina, en donde el dominio constante se selecciona de una IgG1, una IgG2, una IgG4, una IgA, una IgE, una IgM y una IgD.

3. El anticuerpo anti-4-1BB o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo es o comprende una IgGl humana, preferentemente en donde la IgG1 es o comprende una secuencia que es al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 22 o 23.

4. El anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento Fv unido por disulfuro, un fragmento scFv o un diacuerpo.

5. Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Una célula huésped que comprende el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 6 y/o la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la célula huésped se selecciona de una célula bacteriana, de levadura, de insecto o de mamífero, más preferentemente en donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste de E. coli, P. pastoris, S®, COS, HEK293, CHO y un linfocito de mamífero.

8. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) el anticuerpo anti-4-1BB o el fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 4, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 o el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 6; y

(b) un portador farmacéuticamente aceptable.

9. Una composición que comprende un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 o un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto, el método comprende administrar dicha composición al sujeto.

10. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el sujeto tiene cáncer, preferentemente en donde el cáncer se selecciona de un cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de trompas de Falopio, cáncer de vesícula biliar, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hematológico, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer peritoneal primario, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

11. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde al sujeto se le ha administrado o se le administrará una o más terapias anticancerígenas adicionales seleccionadas de radiación ionizante, un agente quimioterapéutico, un agente tipo anticuerpo y una terapia basada en células, de manera que el sujeto recibe tratamiento con ambos, preferentemente, en donde la una o más terapias anticancerígenas adicionales comprenden un inhibidor de punto de control inmunitario, IL-12, GM-CSF, un agente anti-CD4, cisplatino, fluorouracilo, doxorrubicina, irinotecán, paclitaxel o ciclofosfamida.

12. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde al sujeto se le ha administrado o se le administrará una composición que comprende un inhibidor de punto de control inmunitario, de manera que el sujeto reciba tratamiento con ambos.

13. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde el inhibidor de punto de control inmunitario es un agente que inhibe la señalización de PD-1, preferentemente en donde el agente que inhibe la señalización de PD-1 es un anticuerpo contra PD-1.

14. Un método para determinar una dosis de un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno del mismo para el tratamiento terapéutico de un sujeto que lo necesita, que comprende;

(a) proporcionar u obtener una medición del FN-gamma secretado en una muestra biológica del sujeto, en donde al sujeto se le ha administrado una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y

(b) comparar la medición del IFN-gamma secretado con un valor de referencia,

la muestra biológica es una muestra de sangre completa, plasma o suero; y/o

15. Un método para aumentar la secreción de IFN.y por una célula in vitro, el método comprende: poner en contacto la célula con un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

16. Un método para la proliferación o el aislamiento de las células T activadas ex vivo, el método comprende:

poner en contacto una población de células T con un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, lo que de esta manera aumenta la proliferación de las células T activadas.

17. Un método para aislar células T activadas específicas del antígeno, el método comprende:

(c) poner en contacto las células cultivadas con una superficie recubierta con un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde las células cultivadas que expresan 4-1BB se adhieren a la superficie recubierta; y

18. El método de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, en donde las células T activadas son células T CD8+.