ES2905891T3 - Combinación de oligonucleótidas inmunoestimuladores - Google Patents

Abstract

Una combinación que comprende los componentes de a. un anticuerpo que se une a al menos una de las moléculas PD y PD-L1; y b. un ácido desoxirribonucleico no codificante que comprende al menos un motivo de secuencia N1N2CGN3N4, en donde N es A, C, T o G, y C es desoxicitidina, G es desoxiguanosina, A es desoxiadenosina y T es desoxitimidina, en donde la secuencia no codificante de los ácidos desoxirribonucleicos son cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

Description

DESCRIPCIÓN

Combinación de oligonucleótidas inmunoestimuladores

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La invención se refiere a una combinación y su uso para el tratamiento de enfermedades.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA

[0002] El término "inmunoterapia" define el tratamiento de enfermedades estimulando, induciendo, potenciando o suprimiendo una respuesta inmunitaria. La estrategia de las inmunoterapias es combatir enfermedades como el cáncer, enfermedades infecciosas, alergias y asma.

[0003] Una variedad de agentes activos, llamados inmunomoduladores, que pueden ser utilizados en la inmunoterapia son conocidos. La mayoría de los inmunomoduladores establecidos pertenecen a moléculas pequeñas o ácidos nucleicos, muchos de los cuales interactúan con el sistema receptor tipo toll. Las secuencias de ADN cortas inmunomodificadoras más conocidas contienen un motivo citosina guanina no metilado (motivo CG), que ha sido descrito por Krieg et al. (Nature 1995 374: 6522 546-549). La aparición de motivos CG no metilados se suprime sustancialmente en el genoma de eucariotas en comparación con procariotas o virus. Por lo tanto, las moléculas de ADN que contienen tal motivo han evolucionado como una "señal de peligro" natural y activan el sistema inmunológico en la lucha contra patógenos procarióticos o virales. Esto puede aprovecharse terapéuticamente o profilácticamente usando tales secuencias para tratar o prevenir enfermedades infecciosas con inmunoterapia. En los últimos años se ha hecho especial hincapié en el uso de tales inmunomoduladores en la terapia del cáncer, con el objetivo de activar el sistema inmunológico del propio paciente para luchar contra los tumores.

[0004] Las construcciones de ADN que comprenden motivos CG no metilados son capaces de provocar un efecto fisiológico considerable mediante la estimulación fuerte de las células efectoras del sistema inmunitario innato que incluyen células dendríticas, macrófagos, asesinas naturales (NK) y las células NKT. Los motivos CG no metilados son detectados por el receptor (TLR) 9 de tipo Toll de receptor de reconocimiento de patrones inmunitarios innato. Si bien el mecanismo de reconocimiento exacto aún no se comprende por completo, se ha logrado un progreso significativo en desentrañar las vías subyacentes (A. Krieg, Nat. Rev. Drug Disc., 5:471-484, 2006).

[0005] Se supone que, después de la unión de construcciones de ADN que contienen CG no metilados en el receptor, se activan múltiples cascadas de señales en células respondedoras. Mediante la regulación positiva de las moléculas de superficie características y la secreción de citoquinas, se induce la inmunidad adaptativa con un patrón Th1 predominante. Tales construcciones se pueden usar en combinación con, p. ej., anticuerpos, quimioterapia o radioterapia, vacunas o citoquinas. Las enfermedades alérgicas y el asma son en su mayoría mediadas por Th2. Al aumentar la proporción de Th1/TH2, las respuestas mediadas por TH2 se atenúan y, por lo tanto, pueden tratarse o prevenirse estos tipos de enfermedades.

[0006] Moléculas de superficie, que son no reguladas por la vía de TLR-9, incluyen, p. ej., CD40, CD69, CD80, CD86 o CD169, dependiendo del tipo de célula. La secreción mejorada de citoquinas también es característica de distintos tipos de células; las citoquinas incluyen, p. ej., proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP)-1 alfa, MIP-1beta, interleucina (IL)-6, IL-8, interferón (IFN)-alfa, factor de necrosis tumoral (TNF)-alfa, IFN-gamma, proteína quimiotáctica de monocitos (MCP)-1 o proteína inducida por IFN-gamma de 10 kDa (IP-10).

[0007] Con el fin de prevenir o tratar las enfermedades, la vacunación ha demostrado ser un método muy eficaz. Para asegurar una respuesta inmunitaria fuerte y duradera, los adyuvantes capaces de estimular las células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas, se administran habitualmente junto con el antígeno y, para tal fin, se ha demostrado que los agonistas de TLR9 son potentes inmunoestimulantes.

[0008] Estudios preclínicos y clínicos en curso apoyan el uso de agonistas TLR-9 como inmunomoduladores y/o adyuvantes, y probar su efecto antitumoral mediante la mejora tanto de las respuestas humorales como celulares.

[0009] Independientemente de las explicaciones de los mecanismos subyacentes por los cuales motivos CG no metilados influencian o modulan una respuesta inmunitaria, muchos enfoques han sido desarrollados para la modulación del sistema inmunitario mediante el uso de tales motivos. El documento WO 1998/018810 describe que las secuencias inmunoestimuladoras que contienen motivos CG no metilados son incluso más eficaces cuando forman parte de una sola hebra. Sin embargo, la administración de una molécula de ADN monocatenario de cadena abierta no es factible debido a la rápida degradación de los ácidos nucleicos monocatenarios. En consecuencia, se desarrollaron diferentes métodos para la protección de construcciones de ADN mono o bicatenario que comprenden un motivo CG no metilado.

[0010] Para lograr la resistencia contra la degradación por nucleasas de ADN los enlaces fosfodiéster en el esqueleto de un ácido nucleico de polímero se modifican con frecuencia para fosforotioatos. Además de una actividad algo menos estimulante de tales ácidos nucleicos protegidos con fosforotioato, los ensayos clínicos realizados en los últimos años mostraron que la toxicidad de una protección con fosforotioato excluye o limita severamente dichos ácidos nucleicos de cualquier uso en composiciones farmacéuticas o medicamentos.

[0011] A partir de las cuatro clases de activadores conocidos con perfiles de inmunomodulación distinta todos los miembros excepto dos comprenden moléculas de ADN lineales. Una excepción se describe en el documento EP 1196 178. Este documento describe moléculas cortas de ácido desoxirribonucleico, que comprenden una secuencia parcialmente monocatenaria, en forma de mancuerna, secuencia covalentemente cerrada de residuos de nucleótidos que comprenden motivos CG ("dSLIM") que consisten enteramente en ADN natural. Según la divulgación del documento EP 1 196 178, los motivos CG están ubicados dentro de los bucles monocatenarios en ambos extremos del tallo bicatenario de la molécula descrita o dentro del tallo bicatenario. Los bucles en horquilla de una sola hebra protegen un tallo bicatenario de la degradación por las nucleasas de ADN dentro o fuera de la célula. El documento GB 1402847.6 describe una estructura de mancuernas algo similar que utiliza una secuencia diferente.

[0012] Otra excepción a partir de oligonucleótidos lineales se describe en el documento WO 2012/085291. Este documento enseña construcciones de ADN que comprenden nucleótidos en conformación L. Según los datos descritos en el documento WO 2012/085291, el número de nucleótidos en conformación L y su posición dentro de la construcción de ADN influye en la capacidad inmunoestimuladora de la construcción de ADN. Una construcción de ADN que comprende solo nucleótidos en conformación L, p. ej., no estimula de manera eficiente el sistema inmunológico.

[0013] El documento WO 2010/039137 describe oligonucleótidos reguladores inmunitarios como antagonistas de enfermedades mediadas por TLR que tienen una o más modificaciones químicas en la secuencia que flanquea un motivo estimulante inmunitario y/o en un motivo oligonucleotídico que sería estimulante inmunitario si no fuera por la modificación. Por tanto, la intención de los oligonucleótidos descritos en el documento WO 2010/039137 es suprimir una respuesta inmunitaria provocada por los TLR.

[0014] El documento WO 2005/042018 describe los nuevos oligonucleótidos CpG de clase C, en los que un oligonucleótido de clase c se caracteriza por secuencias CpG, generalmente colocadas en o cerca del extremo 5’ o el extremo 3' de la molécula, y un motivo palindrómico rico en GC, generalmente colocado en el otro extremo de la molécula 0 cerca del mismo. El documento describe variaciones de la secuencia palindrómica de un ADN de clase c.

[0015] El documento WO 2015/124614 describe un constructo de ADN cerrado covalentemente, una composición farmacéutica y una vacuna y su uso para la modulación del sistema inmunológico, en donde el constructo de ADN comprende secuencias de ADN específicas.

[0016] La fuerte estimulación de una respuesta inmunitaria celular hace posible influir en los circuitos de regulación, y sin tal intervención se produciría actividad inmunitaria no satisfactoria en el paciente. Esto incluye inducir una respuesta a antígenos "débiles", es decir, que no se activan dentro de la presentación del MHC-I, p. ej., péptidos de punto de ruptura de translocaciones cromosómicas u oncogenes mutados, que a menudo ocurren en enfermedades tumorales (Melief CJ, Kast WM; T-cell immunotherapy of cancer; Res Immunol 1991 junio-agosto; 142 (5-6): 425-9; también: Pasternak G, Hochhaus A, Schultheis B, Hehlmann R; Chronic myelogenous leukemia: molecular and cellular aspects; J Cancer Res Clin Oncol 1998; 124 (12): 643-60). También puede ser deseable romper la tolerancia a autoantígenos tales como la tirosinasa o tirosinhidroxilasa expresada en células tumorales de melanoma maligno y representada en MHC-I. (Weber LW, Bowne WB, Wolchok JD, Srinivasan R, Qin J, Moroi Y, Clynes R, Song P, Lewis J j, Houghton AN; Tumor immunity and autoimmunity induced by immunization with homologous DNA; J Clin Invest 1998 15 de septiembre; 102 (6): 1258­ 64; Surman DR, Irvine KR, Shulman EP, Allweis TM, Rosenberg SA, Restifo NJ; Generation of polyclonal rabbit antisera to mouse melanoma associated antigens using gene gun immunization; Immunol Methods; 1 de mayo de 1998; 214 (1­ 2): 51-62).

[0017] Otro aspecto extremadamente importante es el efecto adyuvante de ISS en las vacunas profilácticas, así como la posibilidad de re-polarizar la reacción de una infección existente de una respuesta tipo 2 a una respuesta tipo 1, lo que permite que el patógeno sea controlado (Kovarik J, et al. CpG oligodeoxynucleotides can circumvent the Th2 polarization of neonatal responses to vaccines but may fail to fully redirect Th2 responses established by neonatal priming; J Immunol.

1 de febrero de 1999; 162 (3): 1611-7). Se ha demostrado para un gran número de patógenos que el tipo de respuesta inmunitaria tiene una influencia decisiva en el curso de la infección o en la capacidad de supervivencia del paciente. En la medida en que las reacciones alérgicas representen una respuesta de sobreimpulso de tipo 2, se espera que ISS proporcione un efecto terapéutico también para indicaciones de este tipo.

[0018] Se ha observado que ciertas secuencias que contienen CpG poseen una característica que neutraliza la estimulación inducida por ISS, es decir, que las secuencias de este tipo son capaces de suprimir el efecto estimulador de ISS cuando se añade a ellos (Krieg AM, Wu T, Weeratna R, Efler SM, Love-Homan L, Yang L, Yi AK, Short D, Davis HL; Sequence motifs in adenoviral DNA block immune activation by stimulatory CpG motifs; Proc Natl Acad Sci EE. UU. 13 de octubre de 1998; 95 (21): 12631-6). Sin haber explicado completamente el mecanismo subyacente del efecto de estos motivos de secuencia descritos como motivos CpG neutralizantes ("CpG-N"), los autores de la publicación citada aquí implican que este efecto se limita a bloquear la estimulación por ISS. Mientras no se explique el mecanismo de inducción inmunitaria por ISS, no se puede descartar la posibilidad de que estos motivos CpG-N también posean otras propiedades inmunomodificadoras de importancia terapéutica.

[0019] Hay al menos una enfermedad humana, lupus eritematoso sistémico, que se caracteriza por la existencia confirmada de anticuerpos anti-ADN en el suero del paciente, y donde se sospecha que una reacción a ISS bacteriana tiene razones etiológicos (Krieg AM, CpG DNA: a pathogenic factor in systemic lupus erythematosus?, J Clin Immunol 1995 Nov; 15 (6): 284-92). En estos casos y en otras indicaciones, sería beneficioso bloquear los mecanismos subyacentes utilizando motivos CpG-N.

[0020] Independientemente de cualquier explicación de los mecanismos subyacentes, el potencial de las secuencias CpG para influir en la respuesta inmunitaria es considerable y ha generado interés científico repentino e generalizado en el fenómeno, así como en la exploración de las posibilidades de las aplicaciones terapéuticas y profilácticas en lo que se refiere a las infecciones, tumores e inmunodeficiencias.

[0021] La literatura relativa a ISS afirma (véase, por ejemplo WO09818810A1, p. 17, 11 de 29-30), y esto se confirma por la invención descrita (ver a continuación), que las secuencias inmunoestimuladoras que contienen CpG son más eficaces cuando se presentan como hebras simples. La administración de oligodesoxinucleótidos ISS de cadena corta, cadena abierta y monocatenaria con el objetivo de la modificación inmune es el siguiente paso lógico, y es objeto de numerosos enfoques experimentales para el tratamiento de enfermedades infecciosas, tumores y enfermedades autoinmunitarias. Sin embargo, los oligodesoxinucleótidos monocatenarios de cadena abierta se degradan muy rápidamente por exonucleasas extracelulares e intracelulares y, por lo tanto, son muy difíciles de usar en aplicaciones in vivo. Las nucleasas mencionadas muestran una actividad enzimática considerablemente reducida en comparación con los enlaces fosfoéster modificados en la cadena principal de los polímeros de ácidos nucleicos; esto ha llevado a que se utilicen tioésteres de fósforo ("tioatos") o enlaces de fósforo reducidos (fosfonatos) en forma quiral o aquiral en aplicaciones en las que se van a administrar al paciente moléculas de ácido nucleico monocatenario. Estos compuestos modificados pueden producirse mediante síntesis en fase sólida, pero hasta cierto punto sólo mediante métodos considerablemente más complicados en comparación con la síntesis clásica de amidita de ADN. Estos compuestos se conocen por la investigación antisentido; en estudios clínicos de estrategias antisentido, sin embargo, también se demostró que tienen efectos secundarios considerables, particularmente sobre el sistema de coagulación sanguínea y el sistema del complemento (ver, p. ej., Sheehan y Lan, Blood 92, 1617-1625 (1998)). En relación con el uso de derivados del ácido tiofosfórico para la protección de nucleasa de ISS, también se demostró que las secuencias muestran menos actividad estimulante cuando los residuos de citosina-guanosina que son realmente efectivos están ellos mismos protegidos por las secuencias flanqueantes requeridas para la actividad en sí (ver WO 98/18810).

[0022] La enseñanza sobre el uso y la producción de inmunoestimuladores CpG que contienen ISS se describe exhaustivamente en el documento WO 98/18810, así como en los documentos citados en el mismo. La necesidad de proteger oligodesoxinucleótidos de exonucleasas se describe en detalle en el documento WO 98/18810. Se presentan varias soluciones para resolver el problema de la insuficiente estabilidad in vivo, que sin embargo se limitan expresamente a los ODN lineales monocatenarios; se mencionan los ésteres de tiofosfato, ésteres de ditiofosfato o fosfonatos. La posibilidad de estabilizar el ODN creando estructuras secundarias, en particular un tallo-bucle, se indica en el documento WO 98/18810. La producción y el uso de oligómeros de fosforotioato en relación con secuencias inmunoestimuladoras se describen en los documentos US 5,663,153, US 5,723,335 así como en US 5,856,462.

[0023] Una estrategia diferente para la protección de secuencias de una sola hebra se describe en US 5,750,669. Aquí, los extremos de los oligómeros están unidos con residuos de nucleósidos conectados por enlaces 5'-5’ y 3'-3', que bloquean la degradación exonucleolítica.

[0024] Los ODN de doble tallo-bucle o cerrado covalentemente en forma de mancuerna se conocen a partir de enfoques experimentales en los que la competencia en los sitios de unión para las proteínas de unión al ADN, así como los factores de transcripción fueron el objeto de la investigación (Lim et al. 1997, Nuc. Acids Res. 25, 575-581; Blumenfeld y col., Nuc. Acids Res. 1993, 21,3405-3411).

[0025] La respuesta de células T del sistema inmunitario humano está regulada por múltiples moléculas reguladoras de células T para evitar el exceso de activación del sistema inmunitario en las células sanas (Pardoll DM Nat Rev Cancer 2012; 12 (4):. 252- 264; Sharma P, Wagner K, Wolchok JD, Allison JP. Nat Rev Cancer, 2011; 11 (11): 805-812). Tales moléculas reguladoras de células T se resumen como "regulador de células T" dentro del contexto de la presente divulgación y comprenden inhibidores de puntos de control y coestimulantes. Las células tumorales a menudo se aprovechan de estos sistemas reguladores para escapar de la detección por parte del sistema inmunológico. La inhibición de un punto de control del sistema inmunológico y la coestimulación del sistema de células T pueden mejorar la respuesta inmunitaria antitumoral. El bloqueo de los puntos de control inmunitarios y, por lo tanto, la liberación de células T específicas del tumor para que ejerzan su función efectora contra las células tumorales ha demostrado su eficacia en entornos de cáncer, y los ensayos clínicos están en curso (Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, et al. N Engl J Med, 2010; 363 (8): 711-723; Robert C, Thomas L, Bondarenko I, et al. N Engl J Med, 2011; 364 (26): 2517-2526; Wolchok JD, H. Kluger, MK Callahan y otros, N Engl J Med, 369 (2013), págs. 122-133).

[0026] El antígeno de linfocitos T citotóxicos (CTLA)-4 y la muerte celular programada (PD)-1 representan dos puntos de control, que se han estudiado más extensivamente como dianas para la terapia del cáncer hasta ahora. CTLA-4 es un potente co-inhibidor que se ha demostrado que se regula al alza de forma aberrante en la superficie de las células T en ciertos cánceres. Disminuye la activación de las células T en respuesta a las células tumorales y, por lo tanto, participa en la tolerancia temprana de los linfocitos T. Se ha descubierto que el PD-1 está regulado positivamente en ciertos tumores, inhibiendo la función de las células T y ayudando al tumor a evadir el sistema inmunológico al desempeñar un papel en el mantenimiento de la tolerancia de los linfocitos T periféricos (Keir ME, Butte MJ, Freeman GJ, Sharpe AH, et al. Annu Rev Immunol,2008; 26: 677-704; Mahoney KM, Freeman GJ, McDermott DF. Clinical Therapeutics 37 (4): 764­ 782, 2015).

[0027] El primer inhibidor de punto de control inmunitario aprobado por la Food and Drug Administration de Estados Unidos (FDA) en 2011 fue ipilimumab, un anticuerpo monoclonal que bloquea CTLA-4 para el tratamiento de melanoma metastásico. Se ha informado que el bloqueo de la interacción entre PD-1 y uno de sus ligandos, PD-L1 (también conocido en B7-H1 y CD274), genera respuestas antitumorales (Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012; 12 (4): 252-264).

[0028] Otra molécula inhibidora, la activación de linfocitos gen-3 (LAG-3), un homólogo de CD4 que se une a moléculas MHC de clase II, se expresa en células T activadas, células B, células NK y linfocitos infiltrantes de tumores, y se cree que regula negativamente la expansión de las células T al limitar la activación de las células T (Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012; 12 (4): 252-264; Goldberg MV, Drake CG. Curr Top Microbiol Immunol 2011; 344: 269-78). Su bloqueo aumenta la proliferación de células T y mejora las respuestas de las células T antitumorales (Nguyen LT, Nat Rev Immunol, 2015).

[0029] Además, la inmunoglobulina de células T mucina-3 (TIM-3), cuyo ligando es la galectina 9 (aumentado en diversos tipos de cáncer), se expresa por las células auxiliares T secretoras de IFN (TH 1), así como células dendríticas, monocitos y células T [Ngiow SF, Teng MW, Smyth MJ. Cancer Res. 2011; 71 (21): 6567-71]. Inhibe las respuestas de las células T auxiliares 1 y los anticuerpos TIM-3 mejoran la inmunidad antitumoral (Anderson AC. Curr Opin Immunol 2012; 24: 213­ 6). Cuando se une a su ligando, galectina-9, TIM-3 induce la muerte de las células TH1 (Zhu C, Anderson AC, Schubart A, et al. Nat Immunol. 2005; 6 (12): 1245-52). Los estudios de ratones deficientes en TIM-3 sugieren que la vía TIM-3 inhibe la expansión y las funciones efectoras de las células TH 1 y puede ser importante para la inducción de tolerancia de las células TH1 (Sabatos CA, Chakravarti S, Cha E, et al. Nat Immunol 2003; 4 (11): 1102-10). También se ha informado que TIM-3 se coexpresa con PD-1 en células T CD8+ específicas de tumor, y el bloqueo dual de ambas moléculas mejora significativamente la proliferación in vitro y la producción de citoquinas de células T humanas. En modelos animales, se informó que el bloqueo coordinado de PD-1 y TIM-3 mejora las respuestas inmunitarias antitumorales y el rechazo de tumores (Pardoll d M. Nat Rev Cancer. 2012; 12 (4): 252-264).

[0030] El atenuador de linfocitos B y T (BTLA/CD272) se identificó como un receptor inhibidor en las células T y se demostró que HVEM/TNFRSF14, que se expresa en células tumorales así como en células endoteliales asociadas a tumores, es el ligando BTLA. Los niveles de expresión de BTLA son altos en los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de pacientes con melanoma y las células T que expresan BTLA se inhiben en presencia de su ligando, HVEM. BTLA puede inhibir la función de células T CD8+ humanas específicas de tumores (Paulos CM, June CH. J Clin Invest 2010; 120: 76­ 80). Por tanto, BTLA también puede ser un receptor inhibidor relevante para las células T en el microambiente tumoral y un objetivo para las estrategias de inhibición de los puntos de control (Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012; 12 (4): 252­ 264).

[0031] OX40 (CD134/TNFRSF4) es un miembro de la super-familia TNFR y se expresa por células T CD4 y CD8 durante el cebado específico de antígeno. La ligadura de OX40 en células T CD8 y CD4 promueve su supervivencia y expansión. Además, la activación de OX40 estimula la generación de células T efectoras reactivas a tumores e inhibe la función de las células T. Los estudios preclínicos demostraron que el tratamiento de hospedadores con tumores con agonistas de OX40 dio como resultado la regresión del tumor en varios modelos preclínicos (Linch SN, McNamara MJ, Redmond WL. Front Oncol. 20155:34).

[0032] El receptor co-estimulador CD137 (41BB/Tnfsf9) posee una capacidad inigualable tanto para la activación como para la polarización pro-inflamatoria de los linfocitos anti-tumorales. La coestimulación a través del receptor CD137/4-1BB activa múltiples cascadas de señalización dentro de la célula T, lo que aumenta poderosamente la activación de la célula T. La estimulación de CD137 en linfocitos T activados por antígenos aumenta la inmunidad tumoral y la monoterapia con CD137 es capaz de mediar regresiones tumorales significativas e incluso curar numerosos tipos de tumores murinos establecidos (Bartkowiak T, Curran MA. Front Oncol. 20155: 117).

[0033] Duraiswamy et al. (Duraiswamy J, Freeman GJ, Coukos G. Cancer Res, 2013; 73 (23): 6900-12) describen un estudio sobre la interacción entre PD-1 expresado en células T y sus ligandos (PD-1: PD-L1, PD-1: PD-L2 y PD-L1: B7.1), expresada en otras células en el microambiente tumoral, utilizando un modelo de ratón ortotópico singénico de cáncer de ovario epitelial (ID8). Descubrieron que el bloqueo de PD-1/PD-L1 mejoraba la amplitud de la inmunidad tumoral al reprogramar las señales supresoras y estimulantes que producían un control del cáncer más potente. También se encontró eficaz una combinación de un anticuerpo a-PD-L1 con CpG 1668, un agonista de TLR9 protegido con fosforotioato.

[0034] La tesis doctoral con el título "Immunological Checkpoint Blockade and TLR Stimulation for Improved Cancer Therapy" (Sara Mangsbo, Universidad de Uppsala 2009), haciendo referencia a una publicación por el mismo autor, describe la combinación de CpG 1668 con un anticuerpo a-CTLA-4 o a-PD-1 que dio como resultado niveles elevados de células T CD8+ reactivas a tumores circulantes, así como esplenocitos CD4+ activados.

[0035] En base a este estado de la técnica, el objetivo de la presente divulgación es proporcionar una combinación eficaz que comprenda construcciones de ADN inmunoestimuladoras y su uso como medicamento.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0036] Con respecto a la técnica anterior, un objetivo de la presente descripción es proporcionar una combinación de una unión de anticuerpo a un regulador de células T y un constructo de ADN inmunomodulador en forma de una secuencia no codificante de desoxirribonucleótidos.

[0037] La presente descripción enseña una combinación que comprende los componentes de una unión a al menos una de las moléculas seleccionadas del grupo que comprende anticuerpo PD1, PD-L1, OX40, TIM-3, LAG3, CD137 (41BB) para afectar su función como inhibidores de puntos de control o coestimulantes; y una secuencia no codificante de ácidos desoxirribonucleicos que comprende al menos un motivo de secuencia N1N2CGN3N4, donde N es un nucleótido que comprende A, C, T o G, y C es desoxicitidina, G es desoxiguanosina, A es desoxiadenosina y T es desoxitimidina.

[0038] La molécula que se une a un regulador de células T es un anticuerpo, que se fabrica sintética o biológicamente.

[0039] La combinación de la presente descripción puede comprender, para N1N2, un elemento tomado del grupo de GT, GG, GA, AT y AA, y para N3N4 un elemento tomado del grupo de CT, TG y TT.

[0040] Según la descripción, la secuencia no codificante de ácidos desoxirribonucleicos puede o bien ser de cadena abierta lineal en ambos lados, de cadena abierta lineal en un lado de una parte de doble cadena con una sola horquilla de trenzado en el respectivo otro lado de la doble hebra o una cadena parcialmente monocatenaria covalentemente cerrada en forma de mancuerna de ácidos desoxirribonucleicos.

[0041] Según la descripción, la combinación puede comprender además al menos tres de dichos motivos de secuencia N1N2CGN3N4.

[0042] Se pretende que una secuencia no codificante de cadena abierta lineal de ácidos desoxirribonucleicos de acuerdo con la divulgación pueda comprender al menos un nucleótido en conformación L, en donde uno de los cinco nucleótidos terminales situados en el extremo 5’ y/o 3' de una hebra sencilla de ADN de la secuencia lineal no codificante de cadena abierta de ácidos desoxirribonucleicos puede estar en conformación L.

[0043] La combinación de la presente descripción puede comprender además al menos una de las siguientes secuencias no codificantes de desoxirribonucleótidos

a.

GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG

GAGAGAAC (SEQ ID NO: 1); o

b

ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT

TCATAACGTT GCCTAGATCA (SEQ ID NO:2), 0

c. AACGTTCTTCGGGG CGTT (SEQ ID NO: 3), o

d.

AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT

TGTCGTTTTG TCGTTCTT (SEQ ID NO:4).

[0044] Según la descripción, la combinación puede comprender además una secuencia no codificante de ácidos desoxirribonucleicos con una longitud de 40 a 200 nucleótidos o de 48 a 116 nucleótidos.

[0045] Se pretende adicionalmente de acuerdo con la revelación de que la secuencia de AACGTTCTTCGGGG CGTT (SEQ ID NO: 3) puede ser parte de la secuencia

CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG

CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG

TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC (SEQ ID NO:5).

[0046] La secuencia motivo N1N2CGN3N4 puede ser parte de una región de hebra única de una secuencia no codificante de desoxirribonucleótidos, que es parte de una combinación de acuerdo con la presente divulgación.

[0047] La combinación puede proporcionar los componentes de ambos grupos en una forma sólida, líquida o gaseosa que deben aplicarse con peso máximo de 15 mg/kg. Esto significa que la dosis se puede adaptar al peso del organismo al que se debe aplicar la combinación.

[0048] Un método que comprende el paso de proporcionar los componentes de una combinación de la presente descripción de forma simultánea, alternando o sucesivamente es otro objeto de la invención. La secuencia no codificante de ácidos desoxirribonucleicos puede proporcionarse antes del anticuerpo para afectar al regulador de células T o viceversa.

[0049] Un objeto adicional de la presente descripción es el uso de la combinación que se describe como un medicamento o para el tratamiento de enfermedades como el cáncer, enfermedades autoinmunitarias y la inflamación.

[0050] Los compuestos de la combinación descrita se pueden administrar simultáneamente, alterna o sucesivamente para el tratamiento de cáncer, enfermedades autoinmunitarias y la inflamación.

[0051] Un uso de la combinación descrita para la fabricación de una preparación farmacéutica, incluyendo vacunas, comprendiendo sales farmacéuticamente aceptables, es un objeto adicional de la presente invención. El producto farmacéutico puede liberar los compuestos de la combinación descrita de forma simultánea, alterna o sucesiva.

[0052] Por último, el uso de una combinación de la presente descripción como un adyuvante en la vacunación terapéutica o profiláctica es un objeto de la presente descripción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0053] La invención se describirá sobre la base de figuras. Se entenderá que las formas de realización y aspectos de la invención descritos en las figuras son solo ejemplos y no limitan el alcance protector de las reivindicaciones de ninguna manera. La invención está definida por las reivindicaciones y sus equivalentes. El experto en la materia entenderá que las características de un aspecto o forma de realización de la invención pueden combinarse con una característica de un aspecto o aspectos diferentes de otras formas de realización de la invención. Muestra:

FIG. 1A, B Actividad antitumoral de la combinación de SEQ ID NO: 5 con anti-PD-1.

FIG. 2 Estimulación in vitro de PBMC humanas con péptidos seleccionados de epítopos de células T restringidos por HLA de clase I de antígenos de recuperación.

FIG. 3A, B Actividad antitumoral de la combinación de SEQ ID NO: 5 con anti-PD-L1.

FIG. 4A, B Actividad antitumoral de la combinación de SEQ ID NO: 6 con anti-PD-1.

FIG. 5 Estimulación in vitro de PBMC humanas con péptidos seleccionados de epítopos de células T restringidos por HLA de clase I de antígenos de recuperación, SEQ ID NO: 6 y anti-PD-1.

FIG. 6A, B Actividad antitumoral de la combinación de SEQ ID NO: 7 con anti-CTLA-4.

FIG. 7A, B Actividad antitumoral de la combinación de SEQ ID NO: 7 con anti-PD-L1.

FIG. 8A-C Estimulación in vitro de PBMC humanas con péptidos seleccionados de epítopos de células T restringidos por HLA de clase I de antígenos de recuperación, SEQ ID NO: 9 y anti-PD-1.

FIG. 9A, B Actividad antitumoral de la combinación de SEQ ID NO: 10 con anti-PD-1.

FIG. 10A, B Actividad antitumoral de la combinación de SEQ ID NO: 10 con anti-CTLA-4.

FIG. 11 Estimulación in vitro de PBMC humanas con péptidos seleccionados de epítopos de células T restringidos por HLA de clase I de antígenos de recuperación, SEQ ID NO: 10 y anti-PD-1.

FIG. 12 Estimulación in vitro de PBMC humanas con péptidos seleccionados de epítopos de células T restringidos por HLA de clase I de antígenos de recuperación, SEQ ID NO: 11 y anti-PD-1.

FIG. 13 Estimulación in vitro de PBMC humanas con péptidos seleccionados de epítopos de células T restringidos por HLA de clase I de antígenos de recuperación, EnanDIM362 y anti-PD-1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0054] La invención instantánea proporciona una combinación de una unión a al menos una de las moléculas PD1 y PD-L1 y una secuencia de ácidos desoxirribonucleicos no codificante del anticuerpo.

[0055] En el sentido de la presente descripción una secuencia de ADN de cadena abierta lineal se designa como oligonucleótido, abreviado con ODN. Dicha secuencia de ADN puede ser monocatenaria o parcial o completamente bicatenaria. Los términos oligo, oligonucleótido y oligodesoxinucleótido se usan como sinónimos y no indican una limitación de la longitud de la secuencia de ADN correspondiente. Los componentes individuales de los oligonucleótidos son nucleótidos.

[0056] Un oligo puede fabricarse sintéticamente o ser parcial o completamente de origen biológico, en donde un origen biológico incluye métodos genéticos de fabricación de secuencias de ADN.

[0057] El L-ADN o los nucleótidos en conformación L se refieren a nucleótidos, que comprenden L-desoxirribosa como residuo de azúcar en lugar de la D-desoxirribosa de origen natural. La L-desoxirribosa es el enantiómero (imagen especular) de la D-desoxirribosa. Los oligonucleótidos que constan parcial o completamente de nucleótidos en conformación L pueden ser parcial o completamente monocatenarios o bicatenarios; sin embargo, los nucleótidos en conformación L no pueden hibridar con nucleótidos en conformación D (Hauser et al., Nucleic Acid Res. 2006 34: 5101­ 11). El L-ADN es igualmente soluble y selectivo que el D-ADN. Sin embargo, el L-ADN es resistente a la exoactividad enzimática de enzimas naturales, especialmente exonucleasas, por lo que el L-ADN está protegido contra la degradación intracelular (Urata et al., Nucleic Acids Res. 199220: 3325-32). Por lo tanto, el L-ADN tiene una aplicación muy amplia.

[0058] Un "tallo" de acuerdo con la presente descripción se entenderá como un ADN bicatenaria formado por emparejamiento de bases ya sea dentro del mismo oligonucleótido (que es entonces parcialmente autocomplementario) o dentro de diferentes oligonucleótidos (que son parcial o completamente complementarios). El emparejamiento de bases intramolecular designa el emparejamiento de bases dentro del mismo oligonucleótido y el emparejamiento de bases entre diferentes oligonucleótidos se denomina emparejamiento de bases intermolecular.

[0059] Un "bucle" en el sentido de la presente descripción se entenderá como una región no apareada, de una sola hebra, ya sea dentro o en el extremo de una estructura de tallo. Una "horquilla" es una combinación distinta de un tallo y un bucle, que se produce cuando dos regiones autocomplementarias del mismo oligonucleótido se hibridan para formar un tallo con un bucle no apareado en un extremo.

[0060] Una "fase sólida" a la que los nucleótidos están covalentemente o no covalentemente unidos se refiere a, pero no se limita a una columna, una matriz, cuentas, vidrio incluyendo vidrio modificado o funcionalizado, sílice o materiales a base de sílice que incluye silicio y silicio modificado, plásticos (que comprenden polipropileno, polietileno, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, acrílicos, polibutileno, poliuretanos, etc.), nailon o nitrocelulosa, resinas, polisacáridos, carbono, así como vidrios y plásticos inorgánicos. Por tanto, las placas de microvaloración también están dentro del alcance de una fase sólida según la presente divulgación.

[0061] La inmunomodulación según la presente divulgación se refiere a inmunoestimulación e inmunosupresión. La inmunoestimulación significa preferentemente que las células efectoras del sistema inmunológico son estimuladas para proliferar, migrar, diferenciarse o volverse activas en cualquier otra forma. La proliferación de células B, p. ej., puede inducirse sin señales coestimuladoras mediante oligonucleótidos inmunoestimuladores, que normalmente requieren una señal coestimuladora de los timocitos auxiliares.

[0062] Por otro lado, se entenderá que la inmunosupresión reduce la activación o eficacia del sistema inmunológico. La inmunosupresión generalmente se induce deliberadamente para prevenir, p. ej., el rechazo de un órgano trasplantado, para tratar la enfermedad de injerto contra huésped después de un trasplante de médula ósea o para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como, p. ej., artritis reumatoide o enfermedad de Crohn.

[0063] En este contexto, la inmunomodulación puede referirse también a la influencia de la naturaleza o el carácter de una reacción inmunitaria, ya sea al afectar o modificar una reacción inmunitaria, que aún está en desarrollo o maduración o modulando el carácter de una reacción inmunitaria establecida. Por tanto, en el contexto de los inhibidores de puntos de control, afectar significa suprimir su efecto inhibidor, y, en el contexto de moléculas coestimuladoras, significa activarlas.

[0064] El término "cáncer" comprende enfermedades cancerosas o un tumor que se está tratando o previniendo que se selecciona del grupo que comprende carcinoma de mama, melanoma, los tumores de la piel, tumores gastrointestinales, incluyendo carcinomas de colon, carcinomas de estómago, carcinomas de páncreas, cáncer de colon, cáncer del intestino delgado, carcinomas de ovario, carcinomas de cuello uterino, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, carcinomas de células renales y/o metástasis hepáticas.

[0065] Las enfermedades autoinmunitarias de acuerdo con la presente divulgación comprenden la artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, lupus sistémico (LES), tiroiditis autoinmune, tiroiditis de Hash-Imoto, esclerosis múltiple, enfermedad de Graves, miastenia grave, enfermedad celíaca y la enfermedad de Addison.

[0066] Un agonista en el sentido de la presente descripción y de acuerdo con su definición común representa un producto químico o molécula que se une a otra molécula, como un receptor o ligando y por lo tanto activa la molécula. A diferencia de un agonista que se activa, un antagonista debe entenderse como una sustancia química o molécula que bloquea la interacción de la molécula a la que se une el antagonista con un agonista respectivo. Dependiendo del contexto, un antagonista en el contexto de la presente invención también puede resultar en la activación de un proceso, porque el antagonista bloquea la interacción de otro antagonista con un receptor, por ejemplo.

[0067] El término "sales farmacéuticamente aplicables o aceptables" tal como se utiliza en este documento incluye sales de un compuesto de la combinación, que se preparan con ácidos relativamente no tóxicos (es decir, farmacéuticamente aceptables) o bases, dependiendo de los sustituyentes particulares encontrados en los compuestos de la presente invención. Si, p. ej., los compuestos de la presente invención contienen funcionalidades ácidas, se pueden obtener sales de adición de bases poniendo en contacto la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente de la base deseada, pura o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos no limitantes de sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables incluyen sal de sodio, potasio, calcio, amonio, amino orgánico o magnesio, o una sal similar. Si los compuestos de la presente invención contienen funcionalidades básicas, se pueden obtener sales de adición de ácido poniendo en contacto la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente del ácido deseado, puro o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos no limitantes de sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos como ácido clorhídrico, bromhídrico, nítrico, carbónico, fosfórico, ácido fosfórico parcialmente neutralizado, ácido sulfúrico, sulfúrico parcialmente neutralizado, yodhídrico o fosforoso y similares, así como las sales derivadas de ácidos orgánicos relativamente no tóxicos como acético, propiónico, isobutírico, maleico, malónico, benzoico, succínico, subérico, fumárico, mandélico, ftálico, bencenosulfónico, p-tolilsulfónico, cítrico, tartárico, metanosulfónico y similares. También se incluyen sales de aminoácidos tales como arginato y similares, y sales de ácidos orgánicos como ácidos glucurónico o galactunórico y similares. Ciertos compuestos específicos de la presente invención pueden contener funcionalidades tanto básicas como ácidas que permiten que los compuestos se conviertan en sales de adición de base o de ácido. Poner en contacto la sal con una base puede regenerar las formas neutras de los compuestos de la presente invención o el ácido y aislar el compuesto original de la manera convencional. La forma parental del compuesto difiere de las diversas formas de sal en ciertas propiedades físicas, como solubilidad en disolventes polares, pero por lo demás las sales son equivalentes a la forma parental del compuesto para los propósitos de la presente invención. Los compuestos de la presente invención pueden poseer átomos de carbono quirales o asimétricos (centros ópticos) y/o dobles enlaces. Los racematos, diastereómeros, isómeros geométricos e isómeros ópticos individuales están incluidos en la presente invención. Los compuestos de la presente invención pueden existir en formas no solvatadas así como en formas solvatadas, incluidas formas hidratadas. En general, las formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas y también están incluidas en la presente invención. Los compuestos de la presente invención pueden existir además en múltiples formas cristalinas o amorfas.

[0068] Según la descripción, las moléculas de ácido desoxirribonucleico, que consiste en una cadena covalentemente cerrada, parcialmente monocatenaria, en forma de mancuerna, de residuos de desoxirribonucleósidos, que contienen una o más secuencias de la secuencia de bases N1N2CGN3N4, en donde N1N2 es un elemento de grupo GT, GG, GA, AT o AA, N3N4 es un elemento del grupo CT o TT, así como C desoxicitosina, G desoxiguanosina, A desoxiadenosina y T desoxitimidina, se utilizan en combinación con sustancias químicas o moléculas capaces de unirse al regulador de células T del sistema inmunológico para la inmunoestimulación en humanos o animales superiores.

[0069] Las moléculas de ácido desoxirribonucleico relacionadas con la presente descripción pueden tener una longitud de hasta 200 nucleótidos. En particular, se pretenden secuencias con una longitud entre 48 y 116 nucleótidos de acuerdo con la divulgación.

[0070] Las secuencias no codificantes en forma de mancuerna de moléculas de ácido desoxirribonucleico de acuerdo con la invención pueden comprender la secuencia de bases N1N2CGN3N4 en sus regiones monocatenarias.

[0071] La inmunoestimulación puede tener lugar in vitro o in vivo.

[0072] La presente descripción proporciona también la secuencia de ADN de cadena abierta lineal que comprende al menos un motivo CpG y al menos un nucleótido en conformación L. Debido a la conformación L parcial/completa, la secuencia de ADN no tiene extremos 5’ o 3' que sean accesibles a las exonucleasas. En caso de que la construcción tenga en un extremo de una doble hebra un bucle monocatenario, el extremo también está protegido contra la degradación. Por lo tanto, los ODN están totalmente protegidos contra la degradación celular sin tener la necesidad de utilizar una cadena principal de fosforotioato, que se ha demostrado que es tóxico. Además, los ODN solo constan de un número mínimo de nucleótidos, lo que los hace pequeños y, por lo tanto, fáciles de transfectar en las células.

[0073] La secuencia no codificante de ácidos desoxirribonucleicos que comprende al menos un motivo de secuencia N1N2CGN3N4 puede ser monocatenaria o parcialmente o completamente bicatenaria. Esto incluye el emparejamiento de bases dentro de la misma molécula (intramolecular) o dentro de diferentes moléculas (intermoleculares) o cualquier combinación de las mismas. También es posible que la construcción comprenda al menos una región monocatenaria no apareada. Como forma de realización adicional, se incluyen estructuras de horquilla. Debido a la conformación L parcial o completa, se asegura una vida media más larga de la construcción ya que los nucleótidos en la conformación L no están sujetos a degradación.

[0074] También está dentro del alcance de la presente descripción que al menos dos moléculas, que son monocatenarias o parcialmente o completamente bicatenarias, pueden ligarse entre sí para formar constructos multiméricos. Por tanto, estas construcciones multiméricas incorporan al menos tantos motivos CpG como compañeros de ligación, empaquetados estrechamente dentro de una molécula y, por lo tanto, se espera que provoquen también una respuesta inmunitaria considerable como parte de la combinación con reguladores de células T. Las construcciones multiméricas monocatenarias o parcial o completamente bicatenarias resultantes pueden cerrarse covalentemente que comprenden nucleótidos en conformación L dentro de la molécula o construcciones multiméricas abiertas que comprenden nucleótidos en conformación L en el extremo 5’ y/o 3' para protección contra la degradación celular.

[0075] La divulgación comprende además modificaciones químicas de al menos un nucleótido en la secuencia no codificante de ácidos desoxirribonucleicos que comprenden al menos un motivo de secuencia N1N2CGN3N4 con un grupo funcional seleccionado del grupo que comprende carboxilo, amina, amida, aldimina, cetal, acetal, grupos éster, éter, disulfuro, tiol y aldehido. Esto permite el acoplamiento de la construcción de ADN a un compuesto seleccionado del grupo que comprende péptidos, proteínas, carbohidratos, anticuerpos, moléculas sintéticas, polímeros, microproyectiles, partículas metálicas o una fase sólida mediante, p. ej., adsorción, unión covalente o iónica.

[0076] La modificación se puede seleccionar específicamente para el propósito respectivo. Por tanto, la construcción puede usarse, p. ej., para transportar otras moléculas a la célula específica que responde al (a los) motivo(s) CpG incorporado. Además, mediante tales modificaciones, es posible acoplar la construcción a microproyectiles, que pueden usarse para transferir la construcción a la célula. La construcción también se puede acoplar a una fase sólida, p. ej., una placa de microvaloración.

[0077] Los experimentos descritos a continuación se realizaron para investigar la influencia de la combinación de secuencias no codificantes de los ácidos desoxirribonucleicos con los reguladores de células T. Los experimentos se realizaron utilizando la forma de mancuerna que comprende el motivo de secuencia N1N2CGN3N4, secuencia lineal no codificante de cadena abierta de ácidos desoxirribonucleicos que comprende N1N2CGN3N4, en donde esas construcciones comprenden nucleótidos en conformación L para evitar su degradación. Además, se investigó el efecto de combinar reguladores de células T con una secuencia no codificante de ácidos desoxirribonucleicos que comprende N1N2CGN3N4 y dos veces la secuencia de SEQ ID NO: 4.

[0078] Se utilizaron anticuerpos reguladores de células T que se unen a PD1, PD-L1, OX40, LAG-3, TIM3 y CD137 (41BB) en un modelo de ratón con tumores humanos inyectados. El efecto sobre la terapia después de una fase de crecimiento se describe con más detalle a continuación sobre el crecimiento de tumores en comparación con los grupos de control.

[0079] Los experimentos comparan el régimen de dosificación con aplicación simultánea, alterna o sucesiva de los componentes de la combinación de la presente descripción. Además de la aplicación cualitativa de los compuestos, se investigó si son necesarias cantidades reducidas de regulador de células T para lograr resultados comparables o incluso mejores al aplicar el inhibidor del punto de control sin una secuencia de ADN no codificante que comprenda un motivo de secuencia N1N2CGN3N4.

[0080] El análisis in vitro del potencial combinatorio de agonistas de TLR9 con moléculas de unión a reguladores de células T comprende el uso de cultivo in vitro de células del sistema de PBMC humano para la evaluación de sus respuestas de células T después de la estimulación. La estimulación de PBMC se logrará con una mezcla de péptidos inmunogénicos de CMV, EBV, influenza y tetanustoxina en presencia de anticuerpos contra reguladores inmunológicos de células T (p. ej., PD-1, PD-L1, etc.) y agonistas de TLR9 (es decir, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6).

[0081] Se determinó la cuantificación de citoquinas (IL-2 e IFN-gamma) en sobrenadantes de cultivo celular. Aunque este sistema de cultivo celular in vitro no puede reflejar las complejas interacciones de las células inmunitarias in vivo, proporciona evidencias de una ventaja de la combinación de esos agonistas de TLR9.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS

[0082] La combinación de la SEQ ID NO: 5 con anti-PD-1 mostró un efecto anti-tumor sorprendentemente aumentado en comparación con cualquiera de monoterapia anti-PD-1 o SEQ ID NO: 5 en un modelo de tumor A20 de ratón.

[0083] El crecimiento tumoral sorprendentemente se inhibió casi completamente por la combinación de SEQ ID NO: 5 y PD-1 (FIG. 1A, B). Se inocularon s.c. 9-12 ratones por grupo con células tumorales murinas A20 y se inyectaron con SEQ ID NO: 5 (250 pg/aplicación, i.tu. los días 14, 16, 19, 21,23, 26, 28, 30, 33 y 35), anti-PD-1 (100 pg/aplicación i.p. los días 8, 11, 16 y 19), o ambos. La inyección de vehículo (i.tu.) sirvió como control. La Figura 1A muestra el crecimiento tumoral medio - incrustación, inhibición media del crecimiento tumoral desde el día 18 al 32 (el día 29: 46,0% para SEQ ID NO: 5, 54,2% para anti-PD-1,99,9% para la combinación). La Figura 1B muestra un gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier.

[0084] El efecto combinatorio sinérgico de SEQ ID NO: 5 con anti-PD-1 que se muestra en la FIG. 1 A, B se confirmó in vitro cuando se incubaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) con péptidos antigénicos y una combinación de SEQ ID NO: 5 y anti-PD-1. Los péptidos se seleccionaron de epítopos de células T restringidos por HLA de clase I de antígenos de recuperación (CMV, EBV, Flu = CEF) y la combinación con SEQ ID NO: 5 aumentó claramente la secreción de INF-gamma por las PBMC en comparación con la inyección de SEQ ID NO: 5 o anti-PD-1 solo (FIG. 2). La concentración final de los péptidos fue de 1 gg/ml por péptido, SEQ ID NO: 5 se usó en una concentración de 3 gM y anti-PD-1 con 10 gg/ml (n=4). Se analizó la secreción de IFN-gamma como marcador de la respuesta inmunitaria; normalizado al nivel de IFN-gamma después de la estimulación de PBMC con péptidos CEF solos. Se utilizó IgG murina (10 gg/ml) como control para anti-PD-1.

[0085] Además, en un modelo de tumor de ratón CT26, los efectos beneficiosos sorprendentes de la terapia de combinación de anti-PD-Ll y SEQ ID NO: 5 también fue claramente superior a cualquiera de SEQ ID NO: 5 o monoterapia anti-PD-Ll. Se redujo el crecimiento del tumor (FIG. 3A) y se aumentó la supervivencia (FIG. 3B). Se inocularon 10 ratones por grupo s.c. con células tumorales murinas CT26 y se inyectaron con SEQ ID NO: 5 (250 gg/aplicación, s.c. los días 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19, 21,24 y 26), anti-PD-Ll (10 mg/kg por aplicación, i.p. los días 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17) o ambos. La inyección de vehículo (s.c.) sirvió como control. La FIG. 3A muestra crecimiento tumoral medio - incrustación, inhibición media del crecimiento tumoral desde el día 17 al 27 (en el día 20: 23,0% para lefitolimod, sin inhibición para anti-PD-Ll, 39,9% para la combinación). La FIG. 1B muestra un gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier.

[0086] También se investigó el efecto combinatorio de la aplicación de la SEQ ID NO:6 que tiene la secuencia de bucle TCATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTCTT.

[0087] La SEQ ID NO: 6 se administró junto con anti-PD-1 en un modelo de tumor CT26 de ratón. Esta combinación aumentó sorprendentemente profundamente el efecto antitumoral en comparación con la monoterapia con los agentes únicos, SEQ ID NO: 6 o anti-PD-1 (FIG. 4A, B). Nuevamente, se inocularon 10 ratones por grupo s.c. con células tumorales murinas CT26 y se inyectaron con SEQ ID NO: 6 (250 gg/aplicación, i.tu. el día 15, 17, 19, 22, 24, 26, 29, 31), anti-PD-1 (100 gg/aplicación, i.p. el día 3, 6, 10 y 13), o ambos. La inyección de vehículo (i.tu.) sirvió como control. La FIG. 4A muestra el crecimiento tumoral medio - incrustación, inhibición media del crecimiento tumoral desde el día 15 al 29 (en el día 23: 48,2% para SEQ ID NO: 6, sin inhibición para anti-PD-1,75,4 para la combinación). La FIG. 1B muestra una gráfica de supervivencia media de Kaplan-Meier.

[0088] Los resultados mostrados en la FIG. 4 están en línea con los datos de estimulación in vitro de PBMC humano con péptidos antigénicos, que también muestra sorprendentemente un beneficio de la combinación sobre el uso individual de los compuestos (FIG. 5). Péptidos seleccionados de epítopos de antígenos de recuperación de células T restringidos por HLA de clase I (CMV, EBV, Flu = CEF) con una concentración final de 1 gg/ml por péptido, SEQ ID NO: 6 en una concentración de 3 gM y anti-PD-1 con 10 gg/ml (n=4) se utilizó. La secreción de IFN-gamma se utilizó como marcador de la respuesta inmunitaria; normalizado al nivel de IFN-gamma después de la estimulación de PMBC con péptidos CEF solos. Se utilizó IgG murina (10 gg/ml) como control para anti-PD-1.

[0089] Se usaron oligonucleótidos que comprenden nucleótidos en conformación L en estudios adicionales. Esos oligos comprenden L-nucleótidos en las posiciones indicadas. Se utilizaron moléculas de ADN con la secuencia central [yTCATTxCGTGACGTGACGTTCzv] (y = 2 a 8 G, protegidas con 1 a 3 L-desoxirribosa o no; x = 3 a 4 A; z = 2 a 6 T protegidas con 1 a 3 L- desoxirribosa; v = A, G, C, T).

[0090] Estos L-nucleótidos que comprenden moléculas mostró un aumento de las propiedades inmunomoduladoras y anti-tumorales cuando se combinan con inhibidores de punto de control. Por ejemplo, la combinación de SEQ ID NO: 7 (GGGGTCATT AAAACGTGACGTGAC-GTTCTTTTT, bases que contienen L-desoxirribosa subrayadas) con anti-CTLA-4 en un modelo de tumor CT26 de ratón dio como resultado una disminución del crecimiento tumoral sorprendentemente eficiente en comparación con SEQ ID NO: 7 o monoterapia anti-CTLA-4 (FIG. 6). Se inocularon 10 ratones por grupo s.c. con células tumorales murinas CT26 y se inyectaron con SEQ ID NO: 7 (200 gg/aplicación, s.c. los días 3, 5, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 22, 14 y 26), anti-CTLA-4 (100 gg/aplicación el día 8; 50 gg/aplicación los días 11 y 14, i.p.), o ambos. La inyección de vehículo (s.c.) sirvió como control. La FIG. 6A muestra el crecimiento tumoral medio - incrustación, inhibición media del crecimiento tumoral desde el día 15 al 30 (en el día 22: 19,8% para SEQ ID NO: 7, 59,1% para anti-PD-1,65,3% para la combinación). La FIG. 6B muestra un gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier.

[0091] La combinación de la SEQ ID NO: 7 con anti-PD-Ll también mostró un efecto moderadamente aumentado anti­ tumor en comparación con el de los compuestos individuales SEQ ID NO: 7 o anti-PD-LL en el modelo de tumor de ratón CT26 (FIG. 7). Se inocularon 10 ratones por grupo s.c. con células tumorales murinas CT26 y se inyectaron con SEQ ID NO: 7 (s.c. el día 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19, 21,24 y 26), anti-PD-Ll (10 mg/kg por aplicación, i.p. el día 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17), o ambos. La inyección de vehículo (s.c.) sirvió como control. La FIG. 7A muestra el crecimiento tumoral medio -incrustación, inhibición media del crecimiento tumoral desde el día 13 al 27 (en el día 20: 16,3% para SEQ ID NO: 7, sin inhibición para anti-PD-Ll, 33,3% para la combinación). La FIG. 7B muestra un gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier.

[0092] En estudios in vitro el beneficio de la combinación de anti-PD-1 con la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 (GGGGGGGGTCATTAAAACGTGACGTGAC-GTTCTTTTT, bases que contienen L-desoxirribosa subrayado), y SEQ ID NO: 9 (GGGGTCATTAAACGTGACGTGA CGTTCTTTTT, bases que contienen L-desoxirribosa subrayadas) se observó con respecto a la secreción de IFN-gamma de PBMC estimuladas con péptidos antigénicos (FIG. 8). Los péptidos se seleccionaron de epítopos de células T restringidos por HLA de antígenos de recuperación (CMV, EBV, Flu = CEF; concentración final 1 |ug/ml por péptido), SEQ ID NO: 7 (A, n = 12), SEQ ID NO: 8 (B, n = 2), SEQ iD NO: 9 (C, n = 4), cada molécula de ADN a una concentración final de 3 |uM; y anti-PD-1 (10 Mg/ml). Análisis de la secreción de IFN-gamma como marcador de respuesta inmunitaria; normalizado al nivel de IFN-gamma después de la estimulación con péptidos CEF solo. Se usó IgG murina (10 |ug/ml) como control para anti-PD-1.

[0093] En otra serie de experimentos, se utilizaron moléculas de ADN con la secuencia central [yTCATTxCGTTCTTCGGGGCGTTCzv] (y = 2 a 8 G, protegidas con 1 a 3 L-desoxirribosa o no; x = 3 a 4 A; z = 2 a 6 T protegidas con 1 a 3 L-desoxirribosa; v = A, G, C, T).

[0094] El efecto combinatorio sobre el efecto de inmunomodulación y anti-tumor se estableció para este grupo también. Como ejemplo para este grupo, SEQ ID NO: 10 (GGGGTCATTAAACGTTCTTCGGGG CGTTCTTTTT, bases que contienen L-desoxirribosa subrayadas) se usó para investigar la combinación con anti-PD-1.

[0095] La combinación dio lugar a una profunda reducción del crecimiento tumoral en un modelo de tumor de ratón CT26 (FIG. 9). Se inocularon 10 ratones por grupo s.c. con células tumorales murinas CT26 y se inyectaron con SEQ ID NO: 10 (200 Mg/aplicación, s.c. los días 3, 5, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 22, 14 y 26), anti-PD-1 (200 Mg/aplicación, i.p. los días 3, 6, 10 y 14), o ambos. La inyección de vehículo (s.c.) sirvió como control. La Figura 9A muestra el crecimiento tumoral medio - incrustación, inhibición media del crecimiento tumoral desde el día 14 al 32 (en el día 25: 17,8% para SEQ ID NO: 10, 51,9% para anti-PD-1,74,6% para la combinación). La FIG. 9B muestra un gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier.

[0096] Además, una combinación de SEQ ID NO: 10 con anti-CTLA-4 condujo a una disminución del crecimiento del tumor en el modelo de tumor de ratón CT26 en comparación con el tratamiento con los agentes individuales, SEQ ID NO: 10 o anti-CTLA-4 (FIG. 10). Se inocularon 10 ratones por grupo s.c. con células tumorales murinas CT26 y se inyectaron con SEQ ID NO: 10 (200 Mg/aplicación, s.c. los días 3, 5, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 22, 14 y 26), anti-CTLA-4 (100 Mg/aplicación el día 8, 50 Mg/aplicación los días 11 y 14, i.p.), o ambos. La inyección de vehículo (s.c.) sirvió como control. La FIG. 10A muestra el crecimiento tumoral medio - incrustación, inhibición media del crecimiento tumoral desde el día 15 al 30 (en el día 22: 49,7% para SEQ ID NO: 10, 59,1% para anti-PD-1,70,3% para la combinación). La FIG. 10B muestra un gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier.

[0097] Además, una combinación de SEQ ID NO: 10 y anti-PD-1 se evaluó en los estudios in vitro de estimulación de PBMC y mostraron un aumento del efecto en relación con la secreción de IFN-gamma en comparación con la SEQ ID NO: 10 o anti-PD-1 solo (FIG. 11). Los péptidos se seleccionaron de epítopos de antígenos de recuperación de células T restringidos por HLA de clase I (CMV, EBV, Flu = CEF; concentración final 1 |ug/ml por péptido)), SEQ ID NO: 10 (3 |uM) y anti-PD-1 (10 |ug/ml) (n=5). El análisis de la secreción de IFN-gamma sirvió como marcador de una respuesta inmunitaria; normalizado al nivel de IFN-gamma después de la estimulación con péptidos CEF solo. Se utilizó IgG murina (10 |ug/ml) como control para anti-PD-1.

[0098] En un experimento adicional, una molécula de ADN con una secuencia de núcleo [yTCATTxTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGzv] (y = 2 a 8 G, protegido con 1 a 3 L-desoxirribosa o no; x = 3 a 4 A; z = 2 a 6 T protegido con 1 a 3 L-desoxirribosa; v = A, G, C, T) en los experimentos.

[0099] La SEQ ID NO: 11 (GGGGTCATTAAATCGTCGTTTTGTCGTTTT-GTCGTTTTT, bases que contienen L-desoxirribosa subrayadas) se usó como ejemplo para este grupo. Cuando SEQ ID NO: 11 se combinó con anti-PD-1 in vitro en estudios de PBMC, la secreción de -IFN-gamma aumentó sorprendentemente significativamente mostrando una mejora en comparación con SEQ ID NO: 11 o anti-PD-1 solo (FIG. 12). Péptidos seleccionados de epítopos de antígenos de recuperación de células T restringidos por HLA de clase I (CMV, EBV, Flu = CEF; concentración final 1 |ug/ml por péptido), SEQ ID NO: 11 (3 |uM) y anti-PD-1 (10 |ug/ml) (n=4). Análisis de la secreción de IFN-gamma como marcador de respuesta inmunitaria; normalizado al nivel de IFN-gamma después de la estimulación con péptidos CEF solos. Se utilizó IgG murina (10 |ug/ml) como control para aPD-1.

[0100] Por último, una molécula de ADN con la secuencia central [yACGATCGTCwT] (y = 2 a 8 G, protegida con 1 a 3 L-deoxiribosa o no; w = 4 a 12 G protegida con 1 a 3 L-deoxiribosa) se utilizó para probar los efectos de la aplicación combinatoria.

[0101] Un ejemplo de este grupo es la SEQ ID NO: 12 (GGGGGAC-GATCGTCGGGGGGT, bases que contienen L-desoxirribosa subrayadas). En estudios de estimulación in vitro con PBMC humanas, se evaluó su combinación con anti-PD-1, lo que condujo a una respuesta inmunitaria significativamente aumentada en comparación con los compuestos individuales (FIG. 13). Los péptidos se seleccionaron de epítopos de antígenos de recuperación de células T restringidos por HLA de clase I (CMV, EBV, Flu = CEF; concentración final 1 |ug/ml por péptido), s Eq ID NO: 12 (3 |uM) y anti-PD- 1 (10 Mg/ml) (n=4). Análisis de la secreción de IFN-gamma como marcador de respuesta inmunitaria; normalizado al nivel

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una combinación que comprende los componentes de

a. un anticuerpo que se une a al menos una de las moléculas PD y PD-L1; y

b. un ácido desoxirribonucleico no codificante que comprende al menos un motivo de secuencia N1N2CGN3N4, en donde N es A, C, T o G, y C es desoxicitidina, G es desoxiguanosina, A es desoxiadenosina y T es desoxitimidina, en donde la secuencia no codificante de los ácidos desoxirribonucleicos son cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

2. La combinación según la reivindicación 1, en donde la secuencia no codificante del ácido desoxirribonucleico es SEQ ID NO: 7.

3. La combinación de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia no codificante de ácido desoxirribonucleico es SEQ ID NO: 9.

4. La combinación según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los componentes a. y b. se proporcionan en forma sólida, líquida o gaseosa para ser aplicados con un máximo de 15 mg/kg de peso.

5. La combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso al proporcionar los componentes de la combinación de forma simultánea, alterna o sucesiva.

6. La combinación de la reivindicación 5, en donde el ácido desoxirribonucleico no codificante se proporciona antes de que el anticuerpo se una al menos a una de las moléculas PD1 y PD-L1.

7. La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso como medicamento.

8. La combinación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el tratamiento del cáncer, enfermedades autoinmunitarias e inflamación.

9. La combinación para su uso según la reivindicación 7 u 8, en donde los componentes de la combinación se administran de forma simultánea, alterna o sucesiva.

10. Una composición farmacéutica que comprende la combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. La composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la que el producto farmacéutico libera los componentes de la combinación de forma simultánea, alterna o sucesiva.

12. La combinación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso como adyuvante en vacunación terapéutica o profiláctica.

13. Un ácido desoxirribonucleico no codificante que consiste en una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11.

14. El ácido desoxirribonucleico no codificante de la reivindicación 13, que es la secuencia de SEQ ID NO: 7.

15. El ácido desoxirribonucleico no codificante de la reivindicación 13, que es la secuencia de SEQ ID NO: 9.