ES2907620T3 - Protección de células de la degeneración inducida por ARN Alu e inhibidores para proteger células - Google Patents

Protección de células de la degeneración inducida por ARN Alu e inhibidores para proteger células Download PDF

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ES2907620T3 ES18156266T ES18156266T ES2907620T3 ES 2907620 T3 ES2907620 T3 ES 2907620T3 ES 18156266 T ES18156266 T ES 18156266T ES 18156266 T ES18156266 T ES 18156266T ES 2907620 T3 ES2907620 T3 ES 2907620T3
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Abstract

Inhibidor de MyD88 para la utilización in vivo en la protección de una célula del RPE contra la degeneración inducida por ARN Alu, en el que el inhibidor de MyD88 comprende una secuencia seleccionada entre las secuencias de SEQ ID NO: 1, 54 y 55, o en el que el inhibidor de MyD88 es una molécula de ARN de doble cadena que inhibe la expresión de MyD88, de la cual, como mínimo, una cadena comprende una secuencia seleccionada entre las secuencias de SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 y 56.

Description

DESCRIPCIÓN
Protección de células de la degeneración inducida por ARN Alu e inhibidores para proteger células
SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica la prioridad de la Patente US 61/508,867 presentada el 18 de julio de 2011 y la Patente US 61/543,038 presentada el 4 de octubre de 2011.
INTERÉS DEL GOBIERNO
La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno con R01EY018350, R01EY018836, R01EY020672, R01EY022238, R21EY019778, RC1EY020442 otorgados por el National Eye Institute de los National Institutes of Health. El gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención.
SECTOR TÉCNICO
El objeto dado a conocer en el presente documento se refiere a la inhibición de inflamasoma, MyD88, IL-18, VDAC1, VDAC2, caspasa-8 y NF k B; inhibidores de inflamasoma, MyD88, IL-18, VDAC1, VDAC2, caspasa-8 y NF k B, procedimientos para proteger una célula y procedimientos de cribado para identificar inhibidores.
INTRODUCCIÓN
La degeneración macular relacionada con la edad (AMD, age-related macular degeneration), que es tan prevalente como el cáncer en los países industrializados, es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo. A diferencia de la forma neovascular de AMD, para la que existen muchos tratamientos aprobados, la forma atrófica mucho más común de AMD sigue siendo poco conocida y sin una intervención clínica eficaz. La atrofia extensa del epitelio pigmentario de la retina (RPE, retinal pigmented epithelium) conduce a una pérdida severa de la visión y se denomina atrofia geográfica, cuya patogenia no está clara. La atrofia geográfica provoca ceguera en millones de personas en todo el mundo y actualmente no existe un tratamiento aprobado.
Los inventores de la presente invención han demostrado una reducción drástica de la ARNasa DICER1 en el epitelio pigmentado de la retina (RPE) de ojos humanos con atrofia geográfica (Kaneko et al. Nature 2011). Los inventores de la presente invención también han demostrado que la deficiencia de DICER1 conduce a una acumulación de transcritos de ARN Alu, lo cual también se observa en el RPE de ojos humanos con atrofia geográfica. Estos transcritos de ARN Alu inducen la muerte celular de las células del RPE humanas y la degeneración del RPE en ratones. Se desconocen los mecanismos precisos de citotoxicidad de los transcritos de Alu.
Tal como se describe en el presente documento, los inventores de la presente invención han descubierto ahora que la deficiencia de DICER1 o la exposición al ARN Alu activa el inflamasoma NLRP3 y desencadena la señalización de MyD88 independiente del receptor de tipo toll a través de IL-18 tanto en el RPE de ratones como en células del RPE humanas y de ratón.
CARACTERÍSTICAS
El objeto dado a conocer en el presente documento cumple algunas o todas las necesidades identificadas anteriormente, tal como será evidente para los expertos en la materia después de un estudio de la información dada a conocer en el presente documento.
El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de MyD88 y procedimientos y composiciones para inhibir MyD88 y utilizaciones de las mismas. El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de inflamasoma y procedimientos y composiciones para inhibir un inflamasoma y utilizaciones de las mismas. El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de componentes del inflamasoma, y procedimientos y composiciones para inhibir un componente del inflamasoma y utilizaciones de las mismas. Entre los componentes del inflamasoma se incluyen, por ejemplo, NLRP3, PYCARD y caspasa-1. El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de IL-18, y procedimientos y composiciones para inhibir IL-18 y utilizaciones de las mismas. El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de VDAC1 y VDAC2, y procedimientos y composiciones para inhibir VDAC1 y VDAC2 y utilizaciones de las mismas. El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de caspasa-8, y procedimientos y composiciones para inhibir la caspasa-8 y utilizaciones de las mismas. El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de NFkB, y procedimientos y composiciones para inhibir NFkB y utilizaciones de las mismas. También se dan a conocer procedimientos y composiciones para obtener imágenes de caspasa-1 activada en el ojo de un sujeto.
El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos que incluyen inhibir uno o más de un inflamasoma, MyD88 e IL-18 de una célula. En algunas realizaciones, el objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos que incluyen inhibir uno o más de MyD88, IL-18, VDAC1, VDAC2, NE k B, caspasa-8, caspasa-1, NLRP-3, PYCARD y un inflamasoma, que incluye un componente de un inflamasoma (por ejemplo, caspasa 1, NLRP-3, PYCARD) de una célula. En algunas realizaciones, el objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos que incluyen administrar uno o más inhibidores seleccionados entre los inhibidores de MyD88, IL-18, VDAC1, VDAC2, NE k B, caspasa-8, caspasa-1, NLRP-3, PYCARD y un inflamasoma, que incluye un componente de un inflamasoma (por ejemplo, caspasa 1, NLRP-3, PYCARD).
En algunas realizaciones del procedimiento, la célula se selecciona entre una célula del RPE, una célula fotorreceptora retiniana o una célula coroidea. En algunas realizaciones, la célula es una célula del RPE. En algunas realizaciones, la célula es la célula de un sujeto. En algunas realizaciones, la célula es una célula de un sujeto que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de tener una afección de interés. En algunas realizaciones, la célula es una célula de un sujeto que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de tener degeneración macular relacionada con la edad. En algunas realizaciones, la célula es una célula de un sujeto que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de tener atrofia geográfica. En algunas realizaciones, la célula es una célula de un sujeto que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de tener atrofia geográfica y la célula es una célula del RPE. En algunas realizaciones, un sujeto que tiene degeneración macular relacionada con la edad puede tratarse utilizando procedimientos y composiciones, tal como se dan a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones del procedimiento, la célula está protegida contra la degeneración inducida por ARN Alu.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
Figura 1. El ARN Alu no se activa ni funciona a través de los receptores de tipo toll (TLR). (A-E) pAlu, pero no pNull, induce la degeneración del RPE en ratones WT (A), Tlr3-/- (B), Tlr7-/- (C), Unc93b1 mt, que son funcionalmente deficientes en TLR-3,7,9 (D) y ratones Tlr4-/- (E). Se muestran imágenes representativas. n = 8-12. Fotografías del fondo de ojo, fila superior; portamuestras planos teñidos para zonula occludens-1 (ZO-1; rojo), fila inferior. La degeneración está delineada por puntas de flecha azules. Barras de escala, 20 pm. (F) La estimulación de líneas celulares HEK293 que expresan diversos TLR con cualquiera de dos secuencias de ARN Alu diferentes no provoca la activación de NF- k B. Controles positivos (+) que utilizan ligandos específicos de TLR activaron NF- k B. n = 3. Los datos se representan como media /- SEM. Véase también la figura 8.
Figura 2. El ARN Alu induce la degeneración del RPE a través de MyD88. (A) pAlu no induce la degeneración del RPE en ratones Myd88-/-. (B) La degeneración del RPE inducida por pAlu en ratones WT es inhibida por un inhibidor del péptido de homodimerización MyD88 (MyD88i), pero no por un péptido de control. (C) La degeneración del RPE inducida por pAlu en ratones WT es inhibida por el ARNip de Myd88 conjugado con colesterol, pero no por el ARNip de control. (D y E) El ARNip que reconoce MyD88 (siMyD88) reduce la abundancia de genes diana (D) y proteínas (E) en células del RPE de ratón en comparación con el ARNip de control. n = 3, *p < 0,05 mediante la prueba de la t de Student. (F) pAlu no induce la degeneración del RPE en ratones heterocigotos (het) de Myd88. (G) Transferencia Western de la fosforilación de IRAK1 e IRAK4 inducida por ARN Alu en células del RPE humanas. Imagen representativa de 3 experimentos. (H) pAlu reduce la viabilidad celular de las células del RPE de ratones WT, pero no de ratones Myd88-A. (I) La pérdida de viabilidad de las células del RPE humanas inducida por pAlu es rescatada por MyD88i. (J) AAV1-BEST1-Cre, pero no AAV1-BEST1-GFP, protegió a los ratones Myd88f/f de la degeneración del RPE inducida por pAlu. (K) pAlu induce la secreción de IL-18 desde células del RPE humanas medida mediante ELISA. La secreción de IL-1 p es apenas detectable. n = 3, *p < 0,05 mediante la prueba de la t de Student. (L) La IL-18 recombinante induce la degeneración del RPE en ratones WT, pero no en ratones Myd88-/-. (M y N) La degeneración del RPE inducida por pAlu en ratones WT es rescatada por el anticuerpo neutralizante de IL-18 (N), pero no por el anticuerpo neutralizante de IL-1 p (M). Se muestran imágenes representativas. n = 8-12. Fotografías del fondo de ojo, fila superior; portamuestras planos teñidos con ZO-1 (rojo), fila inferior. La degeneración está delineada por puntas de flecha azules. Barras de escala, 20 pm (A-C, F, J, L-N). n = 3, *p < 0,05 mediante la prueba de la t de Student. Los datos se representan como media /- SEM (D, E, H, I, K). Véase también la figura 9.
Figura 3. El ARN Alu induce la degeneración del RPE a través del inflamasoma NLRP3. (A) Transferencia Western de la activación de caspasa-1 (subunidad p20) por el ARN Alu en células del RPE humanas. (B) Transferencia Western de la maduración de IL-18 inducida por pAlu en lisados de células del RPE en ratones de tipo salvaje afectados por el inhibidor del péptido caspasa-1. (C) El inhibidor del péptido caspasa-1 protege a los ratones WT de la degeneración del RPE inducida por pAlu. (D y E) pAlu no induce la degeneración del RPE en ratones Casp1-/- ni (E) la citotoxicidad en células del RPE de ratones Casp1-/-. (F) El ARN Alu y LPS+ATP inducen la formación de grupos PYCARD en células del RPE humanas transfectadas con GFP-PYCARD. (G y H) pAlu no induce la degeneración del RPE en ratones Nlrp3-/- (G) o Pycard-/- (H). (I) Las células del RPE de ratones Nlrp3-/- o Pycard-/- están protegidas contra la pérdida de viabilidad celular inducida por pAlu. (J) Los ARNip que reconocen NLRP3 o PYCARD rescataron células del RPE humanas de la citotoxicidad inducida por pAlu, en comparación con el ARNip de control. n = 3-4, *p < 0,05 mediante la prueba de la t de Student (A, B, E, F, I, J). Las imágenes son representativas de 3 experimentos. Los valores de densitometría normalizados a vinculina se muestran entre paréntesis (A, B). Fotografías del fondo de ojo, fila superior; portamuestras planos teñidos con ZO-1 (rojo), fila inferior. La degeneración está delineada por puntas de flecha azules. n = 8-12. Barras de escala, 20 pm (C, D, G, H). Se muestran imágenes representativas. Véase también la figura 11.
Figura 4. El ARN Alu induce la producción de ROS mitocondrial y el cebado de NLRP3. (A) pAlu induce los ARNm de NLRP3 e IL18 en células del RPE de ratones WT y Myd88-/-. (B) pAlu induce la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS, reactive oxygen species) en células del RPE humanas, tal como se supervisa con la sonda fluorescente H2DCFDA (U.A., unidades arbitrarias). (C) DPI bloquea los ARNm de NLRP3 e IL18 inducidos por pAlu en células del RPE humanas. (D) DPI protege a los ratones WT de la degeneración del RPE inducida por pAlu. (E) pAlu induce la generación de especies reactivas de oxígeno mitocondriales en células del RPE humanas detectadas mediante la fluorescencia de MitoSOX Red (pseudocolor verde), colocalizadas con mitocondrias respirantes marcadas por MitoTracker Deep Red (rojo). (F) PMA, pero no pAlu, induce la generación de ROS fagosómicas, tal como se evalúa mediante el ensayo fluorescente Fc OXYBURST Green en células del RPE humanas. (U.A., unidades arbitrarias). (G) MitoTempo y MitoQ, pero no los controles de vehículo o dTPP, previenen la degeneración del RPE inducida por ARN Alu en ratones WT. (H) El inhibidor de la NADPH oxidasa gp91ds-tat o un péptido mixto no previenen la degeneración del RPE inducida por ARN Alu en ratones WT. (I) El ARN Alu induce la degeneración del RPE en ratones deficientes en Cybb (que codifica la subunidad gp91phox de NADPH oxidasa). (J y K) Los ARNip que reconocen VDAC1 y VDAC2, pero no VDAC3 o al control mixto, evitan la generación de mROS inducida por pAlu (J) y la regulación por incremento de los ARNm de NLRP3 e IL18 (K) en células del RPE humanas. mROS visualizó con colorante MitoSox Red y núcleos celulares con tinción de Hoechst. n = 3-4, *p < 0,05 mediante la prueba de la t de Student (A-C, K), Ns , no significativo mediante la prueba de la t de Student (F). Se muestran imágenes representativas. n = 8-12. Portamuestras planos teñidos con ZO-1 (rojo). Barras de escala, 20 pm (D, E, G-I), n = 3-4. Barra de escala, 100 pm (J). Véase también la figura 11.
Figura 5. La degeneración del RPE no se produce mediante piroptosis. (A y B) La glicina inhibe la muerte celular del RPE humano inducida por LPS+ATP (A), pero no por pAlu (B). (C) La IL-18 recombinante induce la degeneración del RPE en ratones Casp1-/-. n = 3-4 (A, B), *p < 0,05 mediante la prueba de la t de Student. Se muestran imágenes representativas. n = 8-12. Fotografías del fondo de ojo, fila superior; portamuestras planos teñidos con ZO-1 (rojo), fila inferior. La degeneración está delineada por puntas de flecha azules. Barras de escala, 20 pm (C).
Figura 6. La pérdida de DICER1 induce la muerte celular a través del inflamasoma. (A) Transferencia Western de la escisión de caspasa-1 inducida por ARN Alu (p20) inhibida por la sobreexpresión de DICER1 en células del RPE humanas. (B y C) La sobreexpresión de DICER1 reduce la activación de caspasa-1 inducida por ARN Alu en células del RPE humanas (medida por la escisión (panel izquierdo B, verde) del sustrato fluorescente Caspalux® 1). La cuantificación de fluorescencia se muestra en el panel derecho. (C) Transferencia Western del aumento de la activación de caspasa-1 (subunidad p20) en lisados de células del RPE de BEST1-Cre; ratones Dicer1f/f en comparación con ratones BEST1-Cre o Dicer1f/f. (D) Transferencia Western del aumento de la activación de caspasa-1 (subunidad p20) y la maduración de IL-18 en lisados de células del RPE de ratones Dicer1f/f tratados con AAV1-BEST1-Cre. (E y F) La degeneración del RPE inducida por AAV1-BEST1-Cre en ratones Dicer1f/f es rescatada por inhibidores peptídicos de caspasa-1 (E) o MyD88 (F). (G) El inhibidor de MyD88 rescata la pérdida de viabilidad de las células del RPE humanas inducida por el tratamiento antisentido (AS) con DICER1. (H) El tratamiento antisentido (AS) con DICER1 de células del RPE humanas reduce DICER1 y aumenta la fosforilación de IRAK1 e IRAK4. (I) El inhibidor de MyD88 rescata la pérdida de viabilidad celular en células del RPE de ratones Dicer1f/f tratados con el vector adenoviral que codifica la recombinasa Cre (Ad-Cre). (J) Deficiencias de la expresión de ARNmi global inducida por Ad-Cre en células del RPE de ratones Dicer1f/f en comparación con Ad-Null. No hubo diferencias significativas en la abundancia de ARNmi entre las células agotadas de Dicer1 tratadas con el inhibidor de MyD88 y el péptido de control. n = 3 (A, B, F, H). Los valores de densitometría normalizados a vinculina se muestran entre paréntesis (A, C). La degeneración está delineada por puntas de flecha azules. n = 8 (E, F). *p < 0,05 mediante la prueba de la t de Student (G, I). Las imágenes son representativas de 3 experimentos (A, B, C, D, H). Véase también la figura 12.
Figura 7. Activación del inflamasoma NLRP3 y MyD88 en GA humana. (A) La abundancia de NLRP3 e IL18 fue significativamente elevada en el RPE macular con GA (n = 13) en comparación con los controles normales de la misma edad (n = 12). *p < 0,05 mediante la prueba de la U de Mann-Whitney. No hubo diferencias significativas entre los grupos (p = 0,32 mediante la prueba de la U de Mann-Whitney) en la abundancia de IL1B. (B-D) Inmunolocalización aumentada de NLRP3 (B), PYCARD (C) y caspasa-1 (D) en el RPE macular con GA en comparación con controles normales de la misma edad. Barra de escala, 20 pm. (E) Las transferencias Western de lisados de RPE macular de ojos de donantes humanos individuales muestran que la abundancia de NLRP3, PYCARD e IRAK1/4 fosforilada, normalizada a los niveles de la proteína constitutiva vinculina, se reduce en la atrofia geográfica (GA, geographic atrophy) en comparación con controles normales de la misma edad. Los datos se representan como media /- SEM (A). Se muestran imágenes representativas. n = 6 (B-E). Véase también la figura 13.
Figura 8. El ARN Alu no activa varios sensores de ARN. (A y B) p7SL (un vector de expresión de 7SL) (A) y el ARN de 7SL sintetizado in vitro (B) no inducen la degeneración del r Pe en ratones de tipo salvaje. (C) La degeneración del RPE inducida mediante la inyección subretiniana de pAlu en ratones de tipo salvaje no es bloqueada por un antagonista de TLR4. (D-E) Los ratones deficientes en Mda5 (D) o Prkr (E) son susceptibles a la degeneración del RPE inducida por pAlu. (F) El ARN Alu desfosforilado (Dep) induce la degeneración del RPE en ratones de tipo salvaje tan bien como el ARN Alu. (G) Los ratones deficientes en Mavs son susceptibles a la degeneración del r Pe inducida por pAlu. pNull no induce la degeneración del RPE en ninguna estirpe de ratones. La degeneración está delineada por puntas de flecha azules. Fotografías del fondo de ojo, filas superiores; portamuestras planos con RPE teñidos con ZO-1 (rojo), filas inferiores. n = 8 (A-G). (H) Un esquema de las vías inmunitarias innatas que no son activadas por ARN Alu.
Figura 9. El ARN Alu induce la degeneración del RPE a través de MyD88, no TRIF ni IFNy. (A) La administración subretiniana de pAlu induce la degeneración del RPE en ratones Ticam1-/-. (B) El ARN Alu no induce la degeneración del RPE en ratones Myd88-/-. (C) La administración subretiniana de un plásmido de expresión de Alu diferente (pAlu(2)) también induce la degeneración del RPE en ratones de tipo salvaje, pero no en ratones Myd88~/-. (D) El a Rn Alu no induce la degeneración del RPE en ratones heterocigotos (het) Myd88-/-. (E) El péptido inhibidor de MyD88 reduce la fosforilación de IRAK1/4 inducida por ARN Alu, normalizada a la expresión de vinculina. (F) La inyección subretiniana de AAV1-BEST1-Cre, pero no de AAV1-BEST1-GFP, protege a los ratones Myd88f/f de la degeneración del RPE inducida por ARN Alu. (G) pAlu y el ARN Alu inducen la degeneración del RPE en ratones de tipo salvaje que reciben médula ósea de Myd88-/- (Myd88-/- ^ tipo salvaje), pero no lo hicieron en ratones Myd88-/- que recibieron médula ósea de tipo salvaje (tipo salvaje ^ Myd88-/-). (H-K) La administración subretiniana de pAlu induce la degeneración del RPE en ratones Ifng-/- (H), Ifngr1-/- (I) e Il1r/- (J), pero no en ratones Il18r1-/- (K). La administración de pNull no induce la degeneración del RPE en ninguna estirpe de ratones. La degeneración está delineada por puntas de flecha azules. Fotografías del fondo de ojo, filas superiores; portamuestras planos con RPE teñidos con ZO-1 (rojo), filas inferiores. n = 8 (A-D, F-K).
Figura 10. El ARN Alu induce la degeneración del RPE a través de la activación del inflamasoma NLRP3. (A) El ARN Alu o LPS+ATP inducen la activación de caspasa-1 en células del RPE humanas, tal como se evalúa mediante el aumento de la escisión de Caspalux®1 (verde, panel izquierdo), un sustrato de péptido unido a sustancia fluorescente en comparación con un tratamiento simulado. La cuantificación de la fluorescencia se muestra en el panel derecho. (B) Transferencia Western de la activación de caspasa-1 inducida por ARN Alu (subunidad p20) en células THP-1 y HeLa, normalizada a la expresión de vinculina. (C) El péptido inhibidor de caspasa-1 bloquea la escisión del sustrato inducida por ARN Alu en células del RPE humanas. n = 3. (D) La inyección subretiniana de ARN Alu no induce la degeneración del RPE en ratones Casp1'/_. (E) El ARN Alu o LPS+ATP inducen la aparición de un grupo fluorescente brillante de GFP-PYCARD visible en el citoplasma de las células del RPE humanas. El área en recuadros se muestra con mayor aumento. Las imágenes son representativas de 3 experimentos. (F y G) La inyección subretiniana de ARN Alu no induce la degeneración del RPE en ratones Nlrp3-/- (F) o Pycard-/- (G). (H) La abundancia de NLRP3 en células HEK293 transfectadas con un vector de expresión de NLRP3 y de PYCARD en células del RPE humanas se reduce mediante la transfección de ARNip que reconocen estos genes, en comparación con los ARNip de control (Ctrl). n = 3, *p < 0,05 en comparación con los ARNip de control mediante la prueba de la t de Student. (I) La activación de caspasa-1 inducida por ARN Alu (subunidad p20) en células del RPE humanas no se ve afectada por el péptido inhibidor de MyD88, normalizada a la expresión de vinculina. (J) El péptido inhibidor de MyD88 no reduce la actividad de escisión de caspasa-1 inducida por ARN Alu en células del RPE humanas (panel superior). La cuantificación de la fluorescencia (panel inferior). (K) La activación de la caspasa-1 (subunidad p20) en lisados de células del RPE de ratones de tipo salvaje tratados con administración subretiniana de pAlu no se ve afectada por la administración intravítrea de anticuerpos neutralizantes contra IL-18. (L) La fosforilación de IRAK1/4 inducida por ARN Alu se reduce mediante el péptido inhibidor de caspasa-1 en células del RPE humanas, normalizada a la expresión de vinculina. Las inyecciones de control de vehículo tampoco dañan el RPE. Fotografías del fondo de ojo, filas superiores; portamuestras planos con RPE teñidos con ZO-1 (rojo), filas inferiores. n = 8 (D, F, G). Las imágenes son representativas de 3 experimentos (A, B, I, J-L).
Figura 11. NLRP3 no interacciona físicamente con el ARN Alu y atenuación de v Da C por ARNip. (A) Ensayo de inmunoprecipitación de proteína de unión a ARN (RIP) en células del RPE humanas transfectadas con pAlu y pNLRP3-FLAG. La inmunoprecipitación de complejos de proteína-ARN con anticuerpos contra NLRP3 o FLAG no reveló interacción entre NLRP3 y ARN Alu. El a Rn aislado de una cantidad igual de lisado celular (no sometido a IP) se utilizó como entrada para la PCR de Alu. La abundancia relativa del ARN Alu en el inmunoprecipitado, evaluada mediante RT-PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos de Alu, se normalizó a los niveles obtenidos con inmunoprecipitación de IgG de control. N = 3. (B) La abundancia de ARNm de VDAC1, VDAC2 y VDAC3 en células del RPE humanas se reduce mediante la transfección de ARNip que reconocen estos genes en comparación con el ARNip de control (que reconoce Luc). N = 3. *p < 0,05 en comparación con el ARNip de control mediante la prueba de la t de Student.
Figura 12. DICER1 es un regulador negativo de la activación de caspasa-1 por ARN Alu. (A) La atenuación de DICER1 por oligonucleótidos antisentido (AS) en células del RPE humanas aumenta la actividad de escisión de la caspasa-1, tal como se supervisa mediante Caspalux, un indicador fluorescente (verde en superposición) de la escisión del sustrato en comparación con el tratamiento con AS de control. (B) La inhibición de a Rn Alu mediante el tratamiento con AS reduce la fluorescencia de Caspalux en células del RPE humanas tratadas con AS para DICER1. Los valores medios de la fluorescencia de Caspalux se muestran entre paréntesis. Las imágenes son representativas de 3 experimentos.
Figura 13. Representación esquemática del modelo propuesto de activación del inflamasoma NLRP3 por ARN Alu inducido por la deficiencia de DICER1 que conduce a la degeneración del RPE y a la atrofia geográfica. El ARN Alu induce el cebado de los ARNm de NLRP3 e IL18 a través de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). La activación del inflamasoma NLRP3 desencadena la escisión de pro-IL-18 por caspasa-1 activada para madurar IL-18. La IL-18 se señala a través de MyD88 para fosforilar IRAK1 e IRAK4, lo que conduce a la muerte celular del RPE.
Figura 14. La administración intravítrea del inhibidor de caspasa-8 protege a los ratones de tipo salvaje de la degeneración del RPE inducida por pAlu. Se muestran imágenes representativas. n = 8-12. Fotografías del fondo de ojo, fila superior; portamuestras planos teñidos con ZO-1 (rojo), fila inferior.
Figura 15. El inhibidor de caspasa-8 protege las células del RPE humanas de la citotoxicidad inducida por Alu. El péptido inhibidor de caspasa-8 Z-IETD-FMK (100 |iM), pero no el péptido de control Z-FA-FMK (100 |iM), protege a las células del RPE humanas de la citotoxicidad inducida por ARN Alu.
Figura 16. El inhibidor de caspasa-8 protege a las células del RPE humanas de la citotoxicidad inducida por pAlu. El péptido inhibidor de caspasa-8 Z-IETD-FMK (100 pM), pero no el péptido de control Z-FA-FMK (100 pM), protege las células del RPE humanas de la citotoxicidad inducida por pAlu.
Figura 17. Activación de caspasa-8 inducida por IL-18. La inyección subretiniana de IL-18 en ratones de tipo salvaje indujo la activación de caspasa-8, tal como se supervisó mediante un ensayo de placa fluorométrica.
Figura 18. pAlu no induce la degeneración del RPE en ratones CD95-/-. Se muestran imágenes representativas. n = 8-12. Fotografías del fondo de ojo, fila superior; portamuestras planos teñidos con ZO-1 (rojo), fila inferior.
Figura 19. El ARN Alu no induce la degeneración del RPE en ratones CD95-/-. Se muestran imágenes representativas. n = 8-12. Fotografías del fondo de ojo, fila superior; portamuestras planos teñidos con ZO-1 (rojo), fila inferior.
Figura 20. La IL-18 recombinante no induce la degeneración del RPE en ratones CD95-/-. Se muestran imágenes representativas. n = 8-12. Fotografías del fondo de ojo, fila superior; portamuestras planos teñidos con ZO-1 (rojo), fila inferior.
Figura 21. pAlu no induce la degeneración del RPE en ratones Faslg. Se muestran imágenes representativas. n = 8-12. Fotografías del fondo de ojo, fila superior; portamuestras planos teñidos con ZO-1 (rojo), fila inferior.
Figura 22. El ARN Alu no induce la degeneración del RPE en ratones Faslg. Se muestran imágenes representativas. n = 8-12. Fotografías del fondo de ojo, fila superior; portamuestras planos teñidos con ZO-1 (rojo), fila inferior.
Figura 23. La IL-18 recombinante no induce la degeneración del RPE en ratones Faslg. Se muestran imágenes representativas. n = 8-12. Fotografías del fondo de ojo, fila superior; portamuestras planos teñidos con ZO-1 (rojo), fila inferior.
Figura 24. El ARN Alu no induce la degeneración del RPE en ratones Nfkb1-/-. Se muestran imágenes representativas. n = 8-12. Fotografías del fondo de ojo, fila superior; portamuestras planos teñidos con ZO-1 (rojo), fila inferior.
Figura 25. Se inyectó ARN Alu o vehículo (PBS) en el espacio subretiniano de los ojos contralaterales de un ratón de tipo salvaje. 3 días después, se inyectó DyeLight782-VAD-FMK3 en el humor vítreo de ambos ojos. 24 horas más tarde, se visualizaron preparaciones en portamuestras planos con RPE bajo microscopía fluorescente para visualizar áreas de caspasa bioactiva (fluorescencia verde), que correspondían al área de inyección de ARN Alu.
Figura 26. Se inyectó ARN Alu o vehículo (PBS) en el espacio subretiniano de los ojos contralaterales de dos ratones de tipo salvaje (paneles izquierdo y derecho). 3 días después, se inyectó DyeLight782-VAD-FMK3 en el humor vítreo de ambos ojos. Desde el inicio (0 horas) hasta 8 horas después, se tomaron fotografías del fondo de ojo (retina) a través del filtro ICG de una cámara Topcon 50IX. En el ojo inyectado con ARN Alu, se observaron áreas fluorescentes blancas correspondientes a la generación de caspasa bioactiva en el área de inyección de ARN Alu. No se observaron dichas áreas extendidas en el ojo inyectado con vehículo.
Figura 27. Se inyectó IL-18 recombinante o vehículo (PBS) en el espacio subretiniano de los ojos contralaterales de un ratón de tipo salvaje. 2 días después, se inyectó DyeLight782-VAD-FMK3 en el humor vítreo de ambos ojos. Desde el inicio (0 horas) hasta 24 horas después, se tomaron fotografías del fondo de ojo (retina) a través del filtro ICG de una cámara Topcon 50IX. En el ojo inyectado con IL-18, se observaron áreas fluorescentes blancas correspondientes a la generación de caspasa bioactiva en el área de inyección de IL-18. No se observaron dichas áreas extendidas en el ojo inyectado con vehículo.
DESCRIPCIÓN BREVE DEL LISTADO DE SECUENCIAS
SEQ ID NO: 1: Secuencia peptídica de IMG-2005-1:
DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT, en la que los últimos 7 aminoácidos son necesarios para la inhibición de la homodimerización de MyD88, mientras que la secuencia de aminoácidos anterior es una secuencia de permeación celular de Antennopedia que permite que el péptido inhibidor entre en la célula, de manera que pueda bloquear MyD88.
SEQ ID NO: 2: Secuencia peptídica de control: DRQIKIWFQNRRMKWKK
SEQ ID NO: 3: ARNip de MyD88 n.°1, sentido: 5'-GAGAAGCCUUUACAGGUdTdT-3'
SEQ ID NO: 4: ARNip de MyD88 n.°1, antisentido: 5'-ACCUGUAAAGGCUUCUCdTdT-3'
SEQ ID NO: 5: ARNip de MyD88 n.°2 sentido: 5'-CAGAGCAAGGAAUGUGAdTdT-3'
SEQ ID NO: 6: ARNip de MyD88 n.°2, antisentido: 5'-UCACAUUCCUUGCUCUGdTdT-3'
SEQ ID NO: 7: ARNip de NLRP3 - 5'-GUUUGACUAUCUGUUCUdTdT-3'
SEQ ID NO: 8: ARNip de NLRP3 - 5'-GGAUCAAACUACUCUGUGA-3'
SEQ ID NO: 9: ARNip de NLRP3 - 5'-UGCAAGAUCUCUCAGCAAA-3'
SEQ ID NO: 10: ARNip de NLRP3 - 5'-GAAGUGGGGUUCAGAUAAU-3'
SEQ ID NO: 11: ARNip de NLRP3 - 5'-GCAAGACCAAGACGUGUGA-3'
SEQ ID NO: 12: ARNip de PYCARD - 5'-GAAGCUCUUCAGUUUCAdTdT-3'
SEQ ID NO: 13: ARNip de PYCARD - 5'-GGCUGCUGGAUGCUCUGUACGGGAA-3'
SEQ ID NO: 14: ARNip de PYCARD - 5'-UUCCCGUACAGAGCAUCCAGCAGCC-3'.
SEQ ID NO: 15: ARNip de la secuencia codificante de pirina humana:
GCTGGAGCAGGT GT ACTACTTC.
SEQ ID NO: 16: ARNip de la secuencia codificante de NLRP3 humano
CAGGTTTGACT ATCTGTTCT.
SEQ ID NO: 17: ARNip de la UTR 3' de la caspasa-1 humana
GTGAAGAGATCCTTCTGTA.
SEQ ID NO: 18: Cebador de oligonucleótidos para IL1B humana, directo 5'-TTAAAGCCCGCCTGACAGA-3'.
SEQ ID NO: 19: Cebador de oligonucleótidos para IL1B humana, inverso 5'-GCGAATGACAGAGGGTTTCTTAG-3'.
SEQ ID NO: 20: Cebador de oligonucleótidos para IL18 humana, directo 5'-ATCACTTGCACTCCGGAGGTA-3'. SEQ ID NO: 21: Cebador de oligonucleótidos para IL18 humana, inverso 5'-AGAGCGCAATGGTGCAATC-3'.
SEQ ID NO: 22: Cebador de oligonucleótidos para NLRP3 humano, directo 5'-GCACCTGTTGTGCAATCTGAA-3'.
SEQ ID NO: 23: Cebador de oligonucleótidos para NLRP3 humano, inverso 5'-TCCTGACAACATGCTGATGTGA-3'.
SEQ ID NO: 24: Cebador de oligonucleótidos para PYCARD humano, directo 5'-GCCAGGCCTGCACTTTATAGA-3'.
SEQ ID NO: 25: Cebador de oligonucleótidos para PYCARD humano, inverso 5'-GTTTGTGACCCTCGCGATAAG-3'.
SEQ ID NO: 26: Cebador de oligonucleótidos para VDAC1 humano, directo 5'-ACTGCAAAATCCCGAGTGAC-3'. SEQ ID NO: 27: Cebador de oligonucleótidos para VDAC1 humano, inverso 5'-CTGTCCAGGCAAGATTGACA-3'. SEQ ID NO: 28: Cebador de oligonucleótidos para VDAC2 humano, directo 5'-CAGTGCCAAATCAAAGCTGA-3'. SEQ ID NO: 29: Cebador de oligonucleótidos para VDAC2 humano, inverso 5'-CCTGATGTCCAAGCAAGGTT-3').
SEQ ID NO: 30: Cebador de oligonucleótidos para VDAC3 humano, directo 5'-TTGACACAGCCAAATCCAAA-3'. SEQ ID NO: 31: Cebador de oligonucleótidos para VDAC3 humano, inverso 5'-GCCAAAACGGGTGTTGTTAC-3'. SEQ ID NO: 32: Cebador de oligonucleótidos para ARNr 18S humano, directo
5'-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3'.
SEQ ID NO: 33: Cebador de oligonucleótidos para ARNr 18S humano, inverso 5'-GCCTCAGTTCCGAAAACCAA-3'.
SEQ ID NO: 34: Cebador de oligonucleótidos para Myd88 de ratón, directo 5'-CACCTGTGTCTGGTCCATTG-3'. SEQ ID NO: 35: Cebador de oligonucleótidos para Myd88 de ratón, inverso 5'-AGGCTGAGTGCAAACTTGGT-3'. SEQ ID NO: 36: Cebador de oligonucleótidos para Nlrp3 de ratón, directo 5'-ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3'. SEQ ID NO: 37: Cebador de oligonucleótidos para Nlrp3 de ratón, inverso 5'-AACCAATGCGAGATCCTGAC-3'. SEQ ID NO: 38: Cebador de oligonucleótidos para II18 de ratón, directo 5'-GACAGCCTGTGTTCGAGGAT-3'.
SEQ ID NO: 39: Cebador de oligonucleótidos para II18 de ratón, inverso 5'-TGGATCCATTTCCTCAAAGG-3'.
SEQ ID NO: 40: Cebador de oligonucleótidos para ARNr 18S de ratón, directo 5'-TTCGTATTGCGCCGCTAGA-3'.
SEQ ID NO: 41: Cebador de oligonucleótidos para ARNr 18S de ratón, inverso 5'-CTTTCGCTCTGGTCCGTCTT-3'.
SEQ ID NO: 42: miR-184 de ratón - 5'-T GGAC GGAGAACTGAT AAGGGT -3';
SEQ ID NO: 43: miR-221/222 de ratón - 5'-AGCT ACATCTGGCT ACTGGGT -3';
SEQ ID NO: 44: miR-320a de ratón - 5'-AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGA-3', y
SEQ ID NO: 45: miR-484 de ratón - 5'-TCAGGCTCAGTCCCCTCCCGAT-3'.
SEQ ID NO: 46: ARNsn U6 - 5'-AAATTCGTGAAGCGTTCC-3'.
SEQ ID NO: 47: ARNip de VDAC1, sentido - 5'- CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3'.
SEQ ID NO: 48: ARNip de VDAC2, sentido - 5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3'.
SEQ ID NO: 49: ARNip de VDAC3, sentido - 5'- GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3'.
SEQ ID NO: 50: Oligonucleótido antisentido (AS) de DICER1 - 5'-GCUGACCTTTTTGCTUCUCA-3'.
SEQ ID NO: 51: Control para AS de DICER1 - 5'-TT GGTAC GCATACGT GTT GACT GTGA-3'.
SEQ ID NO: 52: AS de Alu - 5 -CCCGGGTTC ACGCCATTCT CCTGCCTC AGCCTCACG AGT AGCTGGGACTACAGGC
GCCCG ACACCACTCCCGGCT AATTTTTTGTATTTTT-3
SEQ ID NO: 53: Control para AS de Alu - 5'-GCATGGCCAGTCCATTGATCTTGCACGCTTGCCTAGTACGCTCCTCAACCTATCCT
CCTAGCCCGTTACTTGGTGCCACCGGCG-31.
SEQ ID NO: 54: Oligopéptido para inhibir la homodimerización de MyD88: RDVLPGT.
SEQ ID NO: 55: Oligopéptido para inhibir la homodimerización de MyD88: RDVVPGG.
SEQ ID NO: 56: ARNip de MyD88: UUAUUUCCUAAWGGGUCdTdT.
SEQ ID NO: 57: ARNip de VDAC1, sentido (5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3').
SEQ ID NO: 58: ARNip de VDAC2, sentido (5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3').
SEQ ID NO: 59: ARNip de VDAC3, sentido (5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3').
DESCRIPCION DE REALIZACIONES DE EJEMPLO
El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de MyD88 y procedimientos y composiciones para inhibir MyD88 y utilizaciones de las mismas. El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de inflamasoma, y procedimientos y composiciones para inhibir un inflamasoma y utilizaciones de las mismas. El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de componentes del inflamasoma, y procedimientos y composiciones para inhibir un componente del inflamasoma y utilizaciones de las mismas. Entre los componentes del inflamasoma se incluyen, por ejemplo, NLRP3, PYCARD y caspasa-1. El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de IL-18, y procedimientos y composiciones para inhibir IL-18 y utilizaciones de las mismas. El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de VDAC1 y VDAC2, y procedimientos y composiciones para inhibir VDAC1 y VDAC2 y utilizaciones de las mismas. El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de caspasa-8, y procedimientos y composiciones para inhibir la caspasa-8 y utilizaciones de las mismas. El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos para identificar inhibidores de NFkB, y procedimientos y composiciones para inhibir NFkB y utilizaciones de las mismas. También se dan a conocer procedimientos y composiciones para obtener imágenes de caspasa-1 activada en el ojo de un sujeto.
El objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos que incluyen inhibir uno o más de un inflamasoma, MyD88 e IL-18 de una célula. En algunas realizaciones, el objeto dado a conocer en el presente documento incluye procedimientos que incluyen inhibir uno o más de MyD88, IL-18, VDAC1, VDAC2, NE k B, caspasa-8, caspasa-1, NLRP-3, PYCARD y un inflamasoma, que incluye un componente de un inflamasoma (por ejemplo, caspasa 1, NLRP-3, PYCARD) de una célula.
En algunas realizaciones del procedimiento, la célula se selecciona entre una célula del RPE, una célula fotorreceptora retiniana o una célula coroidea. En algunas realizaciones, la célula es una célula del RPE. En algunas realizaciones, la célula es la célula de un sujeto. En algunas realizaciones, la célula es una célula de un sujeto que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de tener una afección de interés. En algunas realizaciones, la célula es una célula de un sujeto que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de tener degeneración macular relacionada con la edad. En algunas realizaciones, la célula es una célula de un sujeto que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de tener atrofia geográfica. En algunas realizaciones, la célula es una célula de un sujeto que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de tener atrofia geográfica y la célula es una célula del RPE. En algunas realizaciones, un sujeto que tiene degeneración macular relacionada con la edad se puede tratar utilizando procedimientos y composiciones, tal como se dan a conocer en el presente documento.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a una diana de tratamiento. El sujeto de los procedimientos dados a conocer en el presente documento puede ser un vertebrado, tal como un mamífero, un pez, un ave, un reptil o un anfibio. Por tanto, el sujeto de los procedimientos dados a conocer en el presente documento puede ser un ser humano o no humano. Por tanto, se dan a conocer utilizaciones terapéuticas veterinarias según el objeto dado a conocer en el presente documento.
En algunas realizaciones, la inhibición de uno o más de un inflamasoma, MyD88, IL-18, VDAC1, VDAC2, NLRP3, PYCARD, caspasa-1, caspasa-8 y NF k B de una célula incluye administrar un inhibidor a la célula, o a un sujeto, en la que la célula es la célula de un sujeto. Dichos inhibidores se pueden administrar, por ejemplo, mediante inyección intraocular (por ejemplo, terapia interocular localizada); inyección intravítrea; inyección subretiniana; inyección epiescleral; inyección de sub-Tenon; inyección retrobulbar; inyección peribulbar; administración transescleral; administración tópica, por ejemplo, aplicación tópica de colirio; administración supracoroidea; liberación desde un dispositivo de administración de liberación sostenida que se sutura o se fija o se coloca sobre la esclerótica, o se inyecta en el humor vítreo, o se inyecta en la cámara anterior, o se implanta en la bolsa o cápsula del cristalino; administración oral; o administración intravenosa.
Tal como se utiliza en el presente documento, las expresiones “inhibir” o “que inhibe” se refieren a suprimir, reducir, disminuir o eliminar de manera sustancial la actividad biológica de un polipéptido, tal como MyD88, IL-18, VDAC1, VDAC2, caspasa-8, NE k B o un polipéptido de un inflamasoma (por ejemplo, NLRP3, PYCARD, caspasa-1). Tal como se utiliza en el presente documento con referencia a un polipéptido que se inhibe, “de una célula” se refiere a un polipéptido que está dentro de la célula (dentro de la membrana celular), sobre la célula (en la membrana celular, presentado en la membrana celular, en cualquiera caso, sobre la célula), o fuera de una célula, pero en la medida en que el polipéptido está fuera de la célula, está en el medio extracelular, de tal manera que un experto en la materia reconocería que el polipéptido está asociado con la célula. Por ejemplo, VDAC1, VDAC2, caspasa-8, NE k B o un polipéptido de un inflamasoma (por ejemplo, NLRP3, PYCARD, caspasa-1) de una célula podrían estar dentro de la célula. Para otro ejemplo, MyD88 podría estar dentro de la célula o sobre la célula. Para aún otro ejemplo, IL-18 podría estar fuera de la célula porque se secreta, pero sería reconocido por un experto en la materia que está asociada con la célula.
Tal como entenderán los expertos en la materia después de estudiar la presente solicitud, la inhibición de un inflamasoma, MyD88, IL-18, VDAC1, VDAC2, caspasa-1, caspasa-8 y NF k B de una célula se puede conseguir de varias maneras. En algunas realizaciones, la inhibición se puede conseguir afectando a la transcripción o traducción del polipéptido, degradando el polipéptido, secuestrando el polipéptido o, de cualquier modo, afectando a la actividad biológica del polipéptido. La inhibición comprende administrar un inhibidor. Un inhibidor es un compuesto que afecta a dicha inhibición de la actividad biológica de un polipéptido. Dichos compuestos pueden ser, por ejemplo, un polipéptido (que incluye un oligonucleótido y que incluye un polipéptido que se une al polipéptido de interés para afectar a la inhibición), una molécula pequeña (que incluye un compuesto químico pequeño), un compuesto para la interferencia de ARN (que incluye ARNip, ARNmi, ARNsh), un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo neutralizante contra el polipéptido de interés, un anticuerpo que bloquea la unión del polipéptido de interés a un receptor), un aptámero, un plásmido o vector negativo dominante o un inflamasoma codificado por virus.
Los términos “polipéptido”, “proteína” y “péptido”, que se utilizan indistintamente en el presente documento, se refieren a un polímero de los 20 aminoácidos de las proteínas, o análogos de aminoácidos, independientemente de su tamaño. Los términos “fragmento de polipéptido” o “fragmento”, cuando se utilizan en referencia a un polipéptido de referencia, se refieren a un polipéptido en el que los residuos de aminoácidos se eliminan en comparación con el propio polipéptido de referencia, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante suele ser idéntica a las posiciones correspondientes en el polipéptido de referencia. Dichas deleciones pueden tener lugar en el extremo amino terminal o carboxi terminal del polipéptido de referencia, de las partes internas del polipéptido de referencia o una combinación de los mismos. Un fragmento también puede ser también un “fragmento funcional”, en cuyo caso el fragmento conserva parte o toda la actividad del polipéptido de referencia, tal como se describe en el presente documento.
Los términos “aminoácido modificado”, “polipéptido modificado” y “variante” se refieren a una secuencia de aminoácidos que es diferente del polipéptido de referencia en uno o más aminoácidos, por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos. Una variante de un polipéptido de referencia también se refiere a una variante de un fragmento del polipéptido de referencia, por ejemplo, un fragmento en el que se han realizado una o más sustituciones de aminoácidos con respecto al polipéptido de referencia. Una variante también puede ser una “variante funcional”, en la que la variante conserva parte o toda la actividad de la proteína de referencia, tal como se describe en el presente documento. El término variante funcional incluye una variante funcional de un fragmento funcional de un polipéptido de referencia.
En algunas realizaciones, los procedimientos y las composiciones del objeto dado a conocer en el presente documento se pueden utilizar en un sujeto que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de tener una afección de interés. En algunas realizaciones, los procedimientos y las composiciones del objeto dado a conocer en el presente documento se pueden utilizar para tratar una afección de interés. Entre los ejemplos de afecciones de interés se incluyen, pero sin limitarse a los mismos: atrofia geográfica (Kaneko, Dridi et al. 2011); degeneración macular (Kaneko, Dridi et al. 2011); queratitis (Guo, Gao et al. 2011); gota (Chen, Shi et al. 2006); acné vulgar (Terhorst, Kalali et al. 2010); enfermedad de Crohn (Reuter y Pizarro 2004; Abreu, Fukata et al. 2005; Medvedev, Sabroe et al. 2006); colitis ulcerosa (Reuter y Pizarro 2004; Abreu, Fukata et al. 2005; Medvedev, Sabroe et al.
2006); enfermedad del intestino irritable/síndrome del intestino irritable (McKernan, Nolan et al. 2009); diabetes tipo I (Devaraj, Tobias et al. 2011; von Herrath, Filippi et al. 2011); diabetes tipo 2 (Hutton, Soukhatcheva et al. 2010; Nogueira-Machado, Volpe et al. 2011); resistencia a la insulina (Ghanim, Mohanty et al. 2008; Tilich y Arora 2011); obesidad (Fresno, Alvarez et al. 2011); síndrome hemolítico-urémico (Batsford, Duermueller et al.
2011); infección por el virus del polioma (Batsford, Duermueller et al. 2011); enfermedad renal por inmunocomplejos (Anders, Banas et al. 2004; Anders y Schlondorff 2007); lesión tubular aguda (Anders, Banas et al. 2004; Anders y Schlondorff 2007); nefritis lúpica (Anders, Banas et al. 2004; Anders y Schlondorff 2007); síndrome autoinflamatorio familiar por frío (Mariathasan, Weiss et al. 2006; Meng, Zhang et al. 2009); síndrome de Muckle-Wells y enfermedad inflamatoria multisistémica de aparición neonatal (Mariathasan, Weiss et al. 2006; Meng, Zhang et al.
2009); enfermedades autoinflamatorias cutáneas y articulares neurológicas infantiles crónicas, lesión por isquemia-perfusión renal (El-Achkar y Dagher 2006; Robson 2009); glomerulonefritis (El-Achkar y Dagher 2006; Robson 2009); crioglobulinemia (Banas, Banas et al. 2008); vasculitis sistémicas (Weyand, Ma-Krupa et al. 2005; Hurtado, Jeffs et al. 2008; Summers, Steinmetz et al. 2011); nefropatía por IgA (Lim, Lee et al. 2011); aterosclerosis (Curtiss y Tobias 2009); VIH/SIDA (Brichacek, Vanpouille et al. 2010); malaria (Franklin, Ishizaka et al.
2011); parásitos helmintos (Babu, Blauvelt et al. 2005; Venugopal, Nutman et al. 2009); Sepsis y choque séptico (Knuefermann, Nemoto et al. 2002; Opal y Huber 2002; Cristofaro y Opal 2003; Chen, Koustova et al. 2007); asma alérgica (Slater, Paupore et al. 1998; Park, Gold et al. 2001); fiebre del heno (Slater, Paupore et al. 1998; Park, Gold et al. 2001); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Geraghty, Dabo et al. 2011); inflamación pulmonar inducida por fármacos (Liu, Yang et al. 2010); dermatitis de contacto (Martin, Dudda et al. 2008; Yokoi, Niizeki et al.
2009); lepra (Krutzik, Tan et al. 2005; Terhorst, Kalali et al. 2010); infección por Burkholderia cenocepacia (Ventura, Balloy et al. 2009); infección por virus respiratorio sincitial (Aeffner, Traylor et al. 2011); psoriasis (Zuany-Amorim, Hastewell et al. 2002; Barrat y Coffman 2008; Li, Zhou et al. 2009); lupus eritematoso sistémico (Zuany-Amorim, Hastewell et al. 2002; Barrat y Coffman 2008; Li, Zhou et al. 2009); esclerodermia (Zuany-Amorim, Hastewell et al.
2002; Barrat y Coffman 2008; Li, Zhou et al. 2009); artritis reactiva (Zuany-Amorim, Hastewell et al. 2002; Barrat y Coffman 2008; Li, Zhou et al. 2009); fibrosis quística, sífilis, síndrome de Sjogren (Zuany-Amorim, Hastewell et al.
2002; Barrat y Coffman 2008; Li, Zhou et al. 2009); artritis reumatoide (Zuany-Amorim, Hastewell et al. 2002; Barrat y Coffman 2008; Li, Zhou et al. 2009); enfermedad inflamatoria de las articulaciones (O'Neill 2008); enfermedad de hígado graso no alcohólico (Tan, Fiel et al. 2009); cirugía cardiaca (inflamación perioperatoria/postoperatoria) (Cremer, Martin et al. 1996; Taylor 1996; Dybdahl, Wahba et al. 2002); rechazo agudo y crónico de trasplante de órganos (Alegre, Leemans et al. 2008; Miller, Rossini et al. 2008; Taylor, Ehrhardt et al. 2008; Krams, Wang et al.
2010; Wang, Schmaderer et al. 2010; Shin y Harris 2011; Testro, Visvanathan et al. 2011); rechazo agudo y crónico de trasplante de médula ósea (Alegre, Leemans et al. 2008; Miller, Rossini et al. 2008; Taylor, Ehrhardt et al. 2008; Krams, Wang et al. 2010; Wang, Schmaderer et al. 2010; Shin y Harris 2011, Testro, Visvanathan et al.
2011); enfermedad de Alzheimer; y angiogénesis tumoral (Frantz, Vincent et al. 2005; Schmid, Avraamides et al.
2011).
Tal como se utiliza en el presente documento, los términos “tratamiento” o “tratar” se refieren a cualquier tratamiento de una afección de interés, que incluyen, pero sin limitarse a los mismos, tratamiento profiláctico y tratamiento terapéutico. Por tanto, los términos “tratamiento” o “tratar” incluyen, pero sin limitarse a los mismos: prevenir una afección de interés o el desarrollo de una afección de interés; inhibir la progresión de una afección de interés; detener o prevenir el desarrollo de una afección de interés; reducir la gravedad de una afección de interés; mejorar o aliviar los síntomas asociados con una afección de interés; y provocar una regresión de la afección de interés o uno o más de los síntomas asociados con la afección de interés.
En algunas realizaciones, los procedimientos y las composiciones del objeto dado a conocer en el presente documento son útiles para proteger la célula contra la degeneración inducida por ARN Alu. Por tanto, en algunas realizaciones, un procedimiento incluye administrar un inhibidor, en el que la célula está protegida contra la degeneración inducida por ARN Alu.
Inhibición del inflamasoma
En algunas realizaciones, el objeto dado a conocer en el presente documento incluye un procedimiento para proteger una célula, que comprende: inhibir un inflamasoma de la célula. El procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el inflamasoma se selecciona entre inflamasoma NLRP3, inflamasoma NLRP1, inflamasoma NLRC4, inflamasoma AIM2 e inflamasoma IFI16. En algunas realizaciones, el inflamasoma es el inflamasoma NLRP3.
En algunas realizaciones, la inhibición del inflamasoma incluye inhibir un componente del inflamasoma. En algunas realizaciones, los componentes del inflamasoma pueden incluir un polipéptido codificado por PYCARD. En algunas realizaciones, los componentes del inflamasoma pueden incluir una caspasa. En algunas realizaciones, los componentes del inflamasoma pueden incluir PYCARD, NLRP3 y caspasa-1.
En algunas realizaciones, la inhibición del inflamasoma comprende administrar un inhibidor del inflamasoma. El inhibidor del inflamasoma puede ser un inhibidor de un componente del inflamasoma. En algunas realizaciones, el inflamasoma
Tal como se ha indicado anteriormente, en algunas realizaciones, la inhibición de un polipéptido de interés para el objeto dado a conocer en el presente documento comprende administrar un oligonucleótido o una molécula de ARN pequeña. Dicha molécula de ARN pequeña puede reconocer, por ejemplo, NLRP3 y/o PYCARD. Dichos nucleótidos pueden reconocer y degradar NLRP3 y/o PYCARD. A este respecto, el objeto dado a conocer en el presente documento incluye una molécula de ARN de doble cadena aislada que inhibe la expresión de NLRP3 y/o PYCARD, en el que una primera cadena del ARN de doble cadena comprende una secuencia, tal como se establece en la tabla A, e incluye aproximadamente de 14 a 25 nucleótidos. Tal como se ha indicado anteriormente, en algunas realizaciones, la inhibición comprende administrar un inhibidor del inflamasoma que es un vector negativo dominante. En algunas realizaciones, inhibir el inflamasoma comprende administrar un inhibidor de caspasa-1. En algunas realizaciones, el inhibidor de caspasa-1 es un inhibidor peptídico.
Entre los ejemplos de inhibidores de inflamasoma que se pueden utilizar, según el objeto dado a conocer en el presente documento, se incluyen, pero sin limitarse a los mismos, los establecidos en la tabla A. Por tanto, las realizaciones del objeto dado a conocer en el presente documento pueden incluir la administración de un inhibidor de inflamasoma establecido en la tabla A.
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
En la tabla B se uede encontrar más información sobre los inhibidores las sondas de cas asa-1.
Figure imgf000011_0002
Figure imgf000012_0001
El objeto dado a conocer en el presente documento incluye, además, composiciones útiles para inhibir un inflamasoma. Dichas composiciones incluyen un inhibidor. Tal como se ha indicado anteriormente, dichos inhibidores pueden ser, por ejemplo, un nucleótido, un polipéptido, una molécula (química) pequeña, etc. En algunas realizaciones, una composición puede incluir una molécula de ARN aislada.
El objeto dado a conocer en el presente documento incluye moléculas de ARN aisladas que inhiben la expresión de un componente del inflamasoma, por ejemplo, NLRP3, caspasa-l y/o PYCARD. En algunas realizaciones, una primera cadena del ARN de doble cadena comprende una secuencia seleccionada entre las siguientes, e incluye aproximadamente de 14 a 25 nucleótidos: 5'-GUUUGACUAUCUGUUCUdTdT-3' (SEQ ID NO: 7); 5'-GGAUCAAACUACUCUGUGA-3' (SEQ ID NO: 8); 5'-UGCAAGAUCUCUCAGCAAA-3' (SEQ ID NO: 9); 5'-GAAGUGGGGUUCAGAUAAU-3' (SEQ ID NO: 10); 5'-GCAAGACCAAGACGUGUGA-3' (SEQ ID NO: 11); 5'-GAAGCUCUUCAGUUUCAdTdT-3' (SEQ ID NO: 12); 5'-GGCUGCUGGAUGCUCUGUACGGGAA-3' (SEQ ID NO: 13); y 5'-UUCCCGUACAGAGCAUCCAGCAGCC-3' (SEQ ID NO: 14).
El objeto dado a conocer en el presente documento incluye moléculas de ARN aisladas que inhiben la expresión de un componente del inflamasoma. En algunas realizaciones, la molécula de ARN comprende una secuencia seleccionada entre las siguientes:
GCTGGAGCAGGTGTACTACTTC (SEQ ID NO: 15), CAGGTTTGACTATCTGTTCT (SEQ ID NO: 16) y GTGAAGAGATCCTTCTGTA (SEQ ID NO: 17).
El objeto dado a conocer en el presente documento incluye, además, procedimientos de cribado de inhibidores candidatos para identificar inhibidores del inflamasoma. En algunas realizaciones, un procedimiento para identificar un inhibidor del inflamasoma utiliza una célula cultivada, en la que se proporciona un sistema basado en células, que mide la agregación de PYCARD, la escisión de caspasa-1 o la escisión/secreción de IL-1 p o IL-18 en respuesta a un activador del inflamasoma (por ejemplo, ARN Alu, lipopolisacárido+ATP).
En algunas realizaciones, un procedimiento de cribado de inhibidores del inflamasoma incluye estimular células (por ejemplo, células del RPE) o una línea celular (por ejemplo, macrófagos THP-1 o RAW) que se ha transfectado con un plásmido que codifica un PYCARD etiquetado con una sustancia fluorescente con ARN Alu o LPS+ATP; supervisar la agregación de PYCARD fluorescente en una "mota" (“speck"), un foco de agregosoma utilizando microscopía fluorescente; y probar las moléculas candidatas para determinar el grado de inhibición de la formación de "motas" con PYCARD.
En algunas realizaciones, un procedimiento de cribado de inhibidores del inflamasoma incluye estimular células (por ejemplo, células del RPE) o una línea celular (por ejemplo, macrófagos THP-1 o RAW con ARN Alu o LPS+ATP; controlar la actividad de caspasa-1 utilizando el ensayo CaspaLux®1-E2D2 (Oncolmmunin, Inc.) y probar las moléculas candidatas para el grado de inhibición de la fluorescencia de Caspaslux.
En algunas realizaciones, un procedimiento de cribado de inhibidores del inflamasoma incluye estimular células (por ejemplo, células del RPE) o una línea celular (por ejemplo, macrófagos THP-1 o RAW con ARN Alu o LPS+a TP; supervisar la actividad de caspasa-1 midiendo la abundancia de caspasa-1 escindida (isoformas p10 o p20) mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo contra la caspasa-1; y probar las moléculas candidatas para determinar el grado de inhibición de fragmentos escindidos de caspasa-1 (p10 o p20).
En algunas realizaciones, un procedimiento de cribado de inhibidores del inflamasoma incluye estimular células IL-1 p HEK-Blue™ (Invivogen) con ARN Alu o LPS+ARP para detectar la formación de IL-1 p bioactiva utilizando QUANTI-Blue™ (Invivogen); y probar la molécula candidata para determinar el grado de inhibición de la señal colorimétrica.
Inhibición de MyD88
En algunas realizaciones, el objeto dado a conocer en el presente documento incluye un procedimiento para proteger una célula, que comprende: inhibir MyD88 de la célula. En algunas realizaciones, la inhibición de MyD88 comprende administrar un inhibidor de MyD88.
Tal como se ha indicado anteriormente, en algunas realizaciones, la inhibición de un polipéptido de interés para el objeto dado a conocer en el presente documento comprende administrar un oligonucleótido o una molécula de ARN pequeña. Dicha molécula de ARN pequeña puede reconocer MyD88. Dichos nucleótidos pueden reconocer y degradar MyD88. A este respecto, el objeto dado a conocer en el presente documento incluye una molécula de ARN de doble cadena aislada que inhibe la expresión de MyD88, en el que una primera cadena del ARN de doble cadena comprende una secuencia, tal como se establece en la tabla C, e incluye aproximadamente de 14 a 25 nucleótidos. Entre los ejemplos de inhibidores de MyD88 que se pueden utilizar, según el objeto dado a conocer en el presente documento, se incluyen, pero sin limitarse a los mismos, los establecidos en la tabla C. Por tanto, las realizaciones del objeto dado a conocer en el presente documento pueden incluir administrar un inhibidor de MyD88, tal como se establece en la tabla C.
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Tal como se ha indicado anteriormente, en algunas realizaciones, la inhibición de MyD88 comprende administrar un inhibidor de MyD88 que es un vector negativo dominante contra MyD88, por ejemplo, una forma inhibidora negativa dominante de MyD88 (pMyD88-dn) que contiene el AMyD88 truncado (aminoácidos 152-296) que carece del dominio de muerte de MyD88 (Muzio et al. IRAK (Pelle) Family Member IRAK-2 and MyD88 as Proximal Mediators of IL-1 Signaling. Science 1997; 278: 1612-1615).
Tal como se ha indicado anteriormente, en algunas realizaciones, la inhibición de MyD88 comprende administrar un inhibidor de MyD88 que es una molécula pequeña (por ejemplo, (1) hidroxicinamoíl-L-valil pirrolidona, denominado compuesto 4a en Bartfai et al. “A low molecular weight mimic of the Toll/IL-1 receptor/resistance domain inhibits IL-1 receptor-mediated responses.” PNAS 2003; 100: 7971-7976; o (2) ST2825, tal como se describe en Carminati, P., Gallo, G., Ruggiero, V., Sassano, M., Mastroianni, D. “MyD88 homodimerization inhibitors" Patente WO2006067091 y caracterizado en Loiarro et al. “ Inhibition of MyD88 dimerization and recruitment of IRAKI and IRAK4 by a novel peptidomimetic compound.” Journal of Leukocyte Biology. 2007; 82: 801-810; o (3) yoduro de 4-[(E)-2-(1-hexilpiridin-1-io-2-il)etenil]-N,N-dimetilanilina, también conocido como yoduro de 4-[(E)-2-(1-hexilpiridin-6-il)etenil]-N,N-dimetilanilina, también conocido como estructura química CID 5716367 en PubChem, que bloquea las interacciones de MyD88, o (4) los compuestos denominados 50-F12 y 26-J10 en Lee et al. “Application of p-Lactamase Enzyme Complementation to the High-Throughput Screening of Toll-Like Receptor Signaling Inhibitors”. Molecular Pharmacology 2007; 72: 868-875), o un producto natural (acetato de malingamida F, tal como se ha descrito en Villa et al. “Selective MyD88-dependent pathway inhibition by the cyanobacterial natural product malyngamide F acetate". European Journal of Pharmacology 2010; 629: 140-146), o un aptámero de ADN o ARN generado mediante SELEX u otra tecnología de cribado, que se une a o bloquea MyD88.
El objeto dado a conocer por el presente documento incluye, además, composiciones útiles para inhibir MyD88. Dichas composiciones incluyen un inhibidor. Tal como se ha indicado anteriormente, dichos inhibidores pueden ser, por ejemplo, un nucleótido, un polipéptido, una molécula (química) pequeña, etc. En algunas realizaciones, una composición puede incluir una molécula de ARN aislada.
El objeto dado a conocer por el presente documento incluye moléculas de ARN aisladas que inhiben la expresión de MyD88. En algunas realizaciones, una primera cadena del ARN de doble cadena comprende una secuencia seleccionada entre las siguientes e incluye aproximadamente de 14 a 25 nucleótidos: 5'-GAGAAGCCUU UACAGGUdT dT-3' (SEQ ID NO: 3); 5'-ACCUGUAAAGGCUUCUCdTdT-3' (SEQ ID NO: 4); 5'-CAGAGCAAGGAAUGUGAdTdT-3' (SEQ ID NO: 5); y 5'-UCACAUUCCUUGCUCUGdTdT-3' (SEQ ID NO: 6).
El objeto dado a conocer por el presente documento incluye moléculas polipeptídicas aisladas que inhiben la expresión de MyD88. En algunas realizaciones, la molécula polipeptídica comprende una secuencia seleccionada entre las siguientes:
DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT (SEQ ID NO: 1), que incluye aproximadamente de 29 a 100 aminoácidos. En algunas realizaciones, la molécula polipeptídica comprende una secuencia seleccionada entre las siguientes: RDVLPGT (SEQ ID NO: 54) y RDVVPGG (SEQ ID NO: 55).
En algunas realizaciones, un procedimiento para identificar un inhibidor de MyD88 utiliza una célula cultivada, en el que MyD88 está regulado por incremento. Los compuestos candidatos pueden cribarse utilizando la célula cultivada para determinar la eficacia en la modulación de MyD88. Entre los compuestos candidatos se incluyen, por ejemplo, moléculas pequeñas, productos biológicos y combinaciones de los mismos, tales como composiciones que incluyen múltiples compuestos. El término moléculas pequeñas incluye compuestos farmacéuticos tradicionales. El término productos biológicos incluye polipéptidos y nucleótidos, e incluye ARNip, anticuerpos, aptámeros y plásmidos o vectores negativos dominantes.
En algunas realizaciones, el procedimiento de cribado incluye proporcionar una célula en cultivo, en el que MyD88 está regulado por incremento; y poner en contacto un compuesto candidato con la célula. El procedimiento puede incluir, además, identificar un cambio en MyD88. Por ejemplo, un cambio medible en los niveles de MyD88 puede ser indicativo de la eficacia asociada con el compuesto candidato. En algunas realizaciones, en las que el cambio en el MyD88 es una disminución medible en MyD88, el cambio es una indicación de que el compuesto candidato es un inhibidor de MyD88. Dichos inhibidores de MyD88 pueden tener utilidad para aplicaciones terapéuticas, tal como se da a conocer en el presente documento.
En algunas realizaciones, el MyD88 puede regularse por incremento utilizando ARN Alu o lipopolisacárido (LPS), por ejemplo, mediante la estimulación de células (macrófagos o células del RPE) con ARN Alu o LPS. En algunas realizaciones, el MyD88 puede regularse por incremento utilizando nucleótidos CpG, por ejemplo, mediante la estimulación de células (macrófagos o células del RPE) con oligonucleótidos sintéticos que contienen dinucleótidos CpG no metilados, tales como 5'-tcg tcg ttt tgt cgt ttt gtc gtt-3' o 5'-ggG GGA CGA TCG TCg ggg gg-3'. En algunas realizaciones, el MyD88 puede regularse por incremento utilizando interleucina-1 beta o interleucina 18, por ejemplo, mediante la estimulación de células (macrófagos o células del RPE) con formas recombinantes de interleucina-1 beta o interleucina 18.
En algunas realizaciones del procedimiento para identificar un inhibidor de MyD88, se puede supervisar un cambio en MyD88 midiendo la viabilidad celular, midiendo la expresión de genes que se sabe que son inducidos por la señalización de MyD88 (por ejemplo, Cox-2, Socs3, TNF-alfa) o utilizando otros criterios que serían reconocidos por un experto en la materia, utilizando procedimientos conocidos por un experto en la materia. En algunas realizaciones, la célula cultivada es una célula del RPE. En algunas realizaciones, la célula es una célula fotorreceptora retiniana. En algunas realizaciones, la célula es una célula coroidea.
En algunas realizaciones, un procedimiento para identificar un inhibidor de MyD88 incluye proporcionar una célula cultivada, en la que el MyD88 está regulado por incremento o experimenta oligomerización o induce la fosforilación de IRAKI o de IRAK4; y poner en contacto la célula con un compuesto candidato; y determinar si el compuesto candidato da lugar a un cambio en los niveles de MyD88, o un cambio en la abundancia de MyD88 dimerizado u oligomerizado, o un cambio en la abundancia de IRAK1 fosforilada o de IRAK4 fosforilada. En algunas realizaciones, el MyD88 está regulado por incremento por: ARN Alu, lipopolisacárido, nucleótidos CpG, ARN de una sola cadena, interleucina-1 beta o interleucina 18. En algunas realizaciones, el MyD88 se supervisa midiendo la viabilidad celular o midiendo la expresión de un gen que se sabe que es inducido por la señalización de MyD88. En algunas realizaciones, el gen que se sabe que es inducido por la señalización de MyD88 se selecciona entre Cox-2, Socs3, TNF-a .
En algunas realizaciones de un procedimiento de cribado de inhibidores de MyD88, se pueden estimular células o líneas celulares con un activador conocido de MyD88, por ejemplo, ARN Alu o LPS. Los niveles de ARN de genes, tales como Cox2, Socs3 o TNF-a , se pueden medir utilizando RT-PCR cuantitativa en tiempo real. Las moléculas candidatas pueden probarse para determinar el grado de inhibición de estos transcritos de genes.
En algunas realizaciones de un procedimiento de cribado de inhibidores de MyD88, se pueden estimular células o líneas celulares con un activador conocido de MyD88, por ejemplo, ARN Alu o LPS. La abundancia de MyD88 dimerizado u oligomerizado se puede medir mediante transferencia Western en condiciones no reductoras utilizando un anticuerpo contra MyD88. La molécula candidata se puede probar para determinar el grado de inhibición de la dimerización u oligomerización de MyD88.
En algunas realizaciones de un procedimiento de cribado de inhibidores de MyD88, se pueden estimular células o líneas celulares que se han transfectado con plásmidos que codifican una proteína de fusión de MyD88 etiquetada con fragmentos de YFP (proteína fluorescente amarilla) con un activador conocido de MyD88, por ejemplo, ARN Alu o LPS. La señal fluorescente se puede medir utilizando técnicas de complementación de fluorescencia bimolecular. La molécula candidata se puede probar para determinar el grado de inhibición de la señal fluorescente. En algunas realizaciones de un procedimiento de cribado de inhibidores de MyD88, se pueden estimular células o líneas celulares con un activador conocido de MyD88, por ejemplo, ARN Alu o LPS. La abundancia de formas fosforiladas de IRAKI o IRAK4 puede medirse mediante transferencia Western en condiciones reductoras utilizando anticuerpos contra fosfoIRAKI o contra fosfoIRAK4. La molécula candidata se puede probar para determinar el grado de inhibición de la fosforilación de IRAKI o IRAK4.
Inhibición de IL-18
En algunas realizaciones, el objeto dado a conocer en el presente documento incluye un procedimiento para proteger una célula, que comprende: inhibir la IL-18 de la célula. En algunas realizaciones, la inhibición de IL-18 comprende administrar un inhibidor de IL-18.
Tal como se ha indicado anteriormente, en algunas realizaciones, la inhibición de un polipéptido de interés para el objeto dado a conocer en el presente documento comprende administrar una proteína de unión o un anticuerpo. Dichos anticuerpos pueden incluir un anticuerpo neutralizante contra IL-18 o un anticuerpo que bloquea la unión de IL-18 al receptor de IL-18. En algunas realizaciones, el inhibidor de IL-18 puede ser una proteína de unión a IL-18 (Novick, et al., 1999).
Entre los ejemplos de inhibidores de IL-18 que se pueden utilizar, según el objeto dado a conocer en el presente documento, se incluyen, pero sin limitarse a los mismos, los establecidos en la tabla D. Por tanto, las realizaciones del objeto dado a conocer en el presente documento pueden incluir la administración un inhibidor de IL-18 establecido en la tabla D.
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El objeto dado a conocer en el presente documento incluye, además, composiciones útiles para inhibir la IL-18. Dichas composiciones incluyen un inhibidor. Tal como se ha indicado anteriormente, dichos inhibidores pueden ser, por ejemplo, un nucleótido, un polipéptido, una molécula (química) pequeña, etc. En algunas realizaciones, una composición puede incluir una molécula de ARN aislada. En algunas realizaciones, una composición puede incluir un anticuerpo o una proteína de unión.
El objeto dado a conocer en el presente documento incluye, además, procedimientos de cribado de inhibidores candidatos para identificar inhibidores de IL-18. En algunas realizaciones, un procedimiento para identificar un inhibidor de IL-18 incluye sembrar IL-18R1 recombinante en una superficie en estado sólido adecuada para resonancia de plasmón superficial (SPR, surface plasmon resonance); exponer la IL-18R1 recombinante sembrada en placa a IL-18 recombinante marcada con fluorescencia; exponer adicionalmente el sistema a un posible inhibidor de IL-18 que desplazaría la unión IL-18:IL-18R1; y medir la fluorescencia para determinar el grado de inhibición. En algunas realizaciones, un procedimiento para identificar un inhibidor de IL-18 incluye estimular células (por ejemplo, células del RPE) o una línea celular (por ejemplo, macrófagos THP-1 o RAW) con IL-18 recombinante; medir la activación de MyD88, por ejemplo, midiendo el aumento de la dimerización de MyD88 (mediante transferencia Western) o midiendo el aumento de la fosforilación de IRAK1 o de IRAK4.
Inhibición de VDAC1 y/o VDAC2
En algunas realizaciones, el objeto dado a conocer en el presente documento incluye un procedimiento para proteger una célula, que comprende: inhibir VDAC1 y/o VDAC2 de la célula. En algunas realizaciones, la inhibición de VDAC1 y/o VDAc2 comprende administrar un inhibidor de VDAC1 y/o VDAC2.
Tal como se ha indicado anteriormente, en algunas realizaciones, la inhibición de un polipéptido de interés para el objeto dado a conocer en el presente documento comprende administrar un oligonucleótido o una molécula de ARN pequeña. Dicha molécula de ARN pequeña puede reconocer VDAC1 y/o VDAC2. Dichos nucleótidos pueden reconocer y degradar VDAC1 y/o VDAC2. A este respecto, el objeto dado a conocer en el presente documento incluye una molécula de ARN de doble cadena aislada que inhibe la expresión de VDAC1 y/o VDAC2, en el que una primera cadena del ARN de doble cadena comprende una secuencia, tal como se establece en la tabla E, e incluye aproximadamente de 14 a 25 nucleótidos. Entre los ejemplos de inhibidores de VDAC1 y/o VDAC2 que se pueden utilizar, según el objeto dado a conocer en el presente documento, se incluyen, pero sin limitarse a los mismos, los establecidos en la tabla E. Por tanto, las realizaciones del objeto dado a conocer en el presente documento pueden incluir administrar un inhibidor de VDAC1 y/o VDAC2, tal como se establece en la tabla E.
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El objeto dado a conocer en el presente documento incluye, además, composiciones útiles para inhibir VDAC1 y/o VDAC2. Dichas composiciones incluyen un inhibidor. Tal como se ha indicado anteriormente, dichos inhibidores pueden ser, por ejemplo, un nucleótido, un polipéptido, una molécula (química) pequeña, etc. En algunas realizaciones, una composición puede incluir una molécula de ARN aislada.
El objeto dado a conocer en el presente documento incluye moléculas de ARN aisladas que inhiben la expresión de VDAC1 y/o VDAC2. En algunas realizaciones, una primera cadena del ARN de doble cadena comprende una secuencia seleccionada entre las siguientes e incluye aproximadamente de 14 a 25 nucleótidos: 5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3' (SEQ ID NO: 47) y 5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3' (SEQ ID NO: 48). El objeto dado a conocer en el presente documento incluye, además, procedimientos de cribado de inhibidores candidatos para identificar inhibidores de VDAC1 y/o VDAC2. En algunas realizaciones, se utilizan procedimientos basados en células o líneas celulares.
Inhibición de caspasa-8
En algunas realizaciones, el objeto dado a conocer en el presente documento incluye un procedimiento para proteger una célula, que comprende: inhibir la caspasa-8 de la célula. En algunas realizaciones, la inhibición de la caspasa-8 comprende administrar un inhibidor de caspasa-8.
Entre los ejemplos de inhibidores de caspasa-8 que se pueden utilizar, según el objeto dado a conocer en el presente documento, se incluyen, pero sin limitación a los mismos, los establecidos en la tabla F. Por tanto, las realizaciones del objeto dado a conocer en el presente documento pueden incluir administrar un inhibidor de caspasa 8 establecido en la tabla F.
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El objeto dado a conocer en el presente documento incluye, además, composiciones útiles para inhibir la caspasa-8. Dichas composiciones incluyen un inhibidor. Tal como se ha indicado anteriormente, dichos inhibidores pueden ser, por ejemplo, un nucleótido, un polipéptido, una molécula (química) pequeña, etc. En algunas realizaciones, una composición puede incluir una molécula de ARN aislada.
El objeto dado a conocer en el presente documento incluye, además, procedimientos de cribado de inhibidores candidatos para identificar inhibidores de caspasa-8. En algunas realizaciones, se utilizan procedimientos basados en células o líneas celulares.
Inhibición de NFkB
En algunas realizaciones, el objeto dado a conocer en el presente documento incluye un procedimiento para proteger una célula, que comprende: inhibir el NF k B de la célula. En algunas realizaciones, la inhibición de NF k B comprende administrar un inhibidor de caspasa-8.
Entre los ejemplos de inhibidores de NF k B que se pueden utilizar, según el objeto dado a conocer en el presente documento, incluyen, pero sin limitación a los mismos, los establecidos en la tabla G. Por tanto, las realizaciones del objeto dado a conocer en el presente documento pueden incluir administrar un inhibidor de NF k B establecido en la tabla G.
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El objeto dado a conocer en el presente documento incluye, además, composiciones útiles para inhibir NF k B. Dichas composiciones incluyen un inhibidor. Tal como se ha indicado anteriormente, dichos inhibidores pueden ser, por ejemplo, un nucleótido, un polipéptido, una molécula (química) pequeña, etc. En algunas realizaciones, una composición puede incluir una molécula de ARN aislada.
El objeto dado a conocer en el presente documento incluye, además, procedimientos de cribado de inhibidores candidatos para identificar inhibidores de NF k B. En algunas realizaciones, se utilizan procedimientos basados en células o líneas celulares.
Obtención de imágenes de caspasa en un ojo de un sujeto
En algunas realizaciones, se da a conocer una composición de diagnóstico para obtener imágenes de caspasa activada en un ojo de un sujeto, que comprende una molécula fluorescente conjugada con un sustrato de caspasa-1 o una molécula que emite fluorescencia después de la escisión de caspasa-1. En algunas realizaciones, se da a conocer un procedimiento para obtener imágenes de caspasa-1 activada en un ojo de un sujeto, que incluye administrar la composición de diagnóstico (por ejemplo, por vía intraocular o intravenosa) a las células del RPE del sujeto, y supervisar de manera óptica la agrupación espacial de fluorescencia.
Algunas de las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas dadas a conocer en el presente documento tienen referencias cruzadas con los números de acceso de GENBANK®/GENPEPT®.
Aunque se cree que los términos utilizados en el presente documento son bien entendidos por un experto en la materia, se establecen definiciones para facilitar la explicación del objeto dado a conocer en el presente documento. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden habitualmente los expertos en la materia a la que pertenece el objeto dado a conocer en el presente documento. Aunque se puede utilizar cualquier procedimiento, dispositivo y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas del objeto dado a conocer en el presente documento, a continuación se describen procedimientos, dispositivos y materiales representativos. Siguiendo la convención bien establecida de la ley de patentes, los términos “un”, “una” y “el/la” se refieren a "uno o más" cuando se utilizan en esta solicitud, incluyendo las reivindicaciones. De este modo, por ejemplo, la referencia a “una célula” incluye una pluralidad de dichas células, y así sucesivamente.
A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades, tales como condiciones de reacción, y así sucesivamente, utilizados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, deben entenderse que son modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretende obtener con el objeto dado a conocer en el presente documento.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “aproximadamente”, cuando se refiere a un valor o a una cantidad de masa, peso, tiempo, volumen, concentración o porcentaje, pretende abarcar variaciones, en algunas realizaciones, de ± 20 %, en algunas realizaciones, de ± 10 %, en algunas realizaciones, de ± 5 %, en algunas realizaciones, de ± 1 %, en algunas realizaciones, de ± 0,5 % y, en algunas realizaciones, de ± 0,1 % de la cantidad especificada, ya que dichas variaciones son apropiadas para realizar el procedimiento dado a conocer.
Tal como se utiliza en el presente documento, los intervalos se pueden expresar desde “aproximadamente” un valor particular y/o hasta “aproximadamente” otro valor particular. También se entiende que hay una serie de valores dados a conocer en el presente documento y que cada valor también se da a conocer en el presente documento como “aproximadamente” ese valor particular, además del valor en sí mismo. Por ejemplo, si se da a conocer el valor “10”, entonces también se da a conocer “aproximadamente 10”. También se entiende que también se da a conocer cada unidad entre dos unidades particulares. Por ejemplo, si se dan a conocer 10 y 15, también se dan a conocer 11, 12, 13 y 14.
El objeto dado a conocer en el presente documento se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos específicos, pero no limitantes. Los siguientes ejemplos pueden incluir compilaciones de datos que son representativos de los datos recopilados en diversos momentos durante el transcurso del desarrollo y la experimentación relacionados con la presente invención.
EJEMPLOS EJEMPLO 1
La acumulación de ARN Alu debido a la deficiencia de DICER1 en el epitelio pigmentado de la retina (RPE) está implicada en la atrofia geográfica (GA), una forma avanzada de degeneración macular relacionada con la edad que causa ceguera en millones de personas. Se desconoce el mecanismo de la citotoxicidad inducida por ARN Alu. Aquí se muestra que la deficiencia de DICER1 o la exposición al ARN Alu activa el inflamasoma NLRP3 y desencadena la señalización de MyD88 independiente de TLR a través de IL-18 en el RPE. La inhibición genética o farmacológica de los componentes del inflamasoma (NLRP3, Pycard, caspasa-1), MyD88 o IL-18 previene la degeneración del RPE inducida por la pérdida de DICER1 o la exposición al a Rn Alu. Estos descubrimientos, junto con la observación de que el RPE con GA humano contiene cantidades elevadas de NLRP3, PYCARD e IL-18, y la evidencia de una mayor activación de caspasa-1 y MyD88, proporcionan una justificación para abordar esta vía en la GA. Los descubrimientos también revelan una nueva función del inflamasoma fuera del sistema inmunitario y una sorprendente acción inmunomoduladora de los elementos móviles.
La degeneración macular relacionada con la edad (AMD, age-related macular degeneration) afecta a la visión de millones de personas (Smith et al., 2001). La AMD se caracteriza por la degeneración del epitelio pigmentado de la retina (RPE, retinal pigmented epithelium), que se encuentra entre los fotorreceptores de la retina y los capilares coroideos (Ambati et al., 2003). La disfunción del RPE altera tanto los fotorreceptores como la vasculatura coroidea (Blaauwgeers et al., 1999; Lopez et al., 1996; McLeod et al., 2009; Vogt et al., 2011). Estas alteraciones tisulares conducen a fenotipos de enfermedades atróficas o neovasculares. Aunque existen terapias para la AMD neovascular, no existe un tratamiento eficaz para la forma atrófica más común. La GA, la etapa avanzada de la AMD atrófica, se caracteriza por la degeneración del RPE y es la principal causa de la pérdida de visión intratable.
Recientemente se demostró que una reducción drástica y específica de la ARNasa DICER1 conduce a la acumulación de transcritos de ARN Alu en el RPE de ojos humanos con GA (Kaneko et al., 2011). Estos transcritos de elementos repetitivos, que son ARN no codificantes expresados por el retrotransposón de Alu muy abundante (Batzer y Deininger, 2002), inducen la muerte de células del RPE humanas y la degeneración de RPE en ratones. La deficiencia de DICER1 en RPE con GA no fue una respuesta de muerte celular genérica porque la expresión de DICER1 no estaba desregulada en otras enfermedades de la retina. Del mismo modo, la acumulación de ARN Alu no representó una activación generalizada de retrotransposones debido a una respuesta de estrés en las células moribundas porque otros retrotransposones no se encontraban elevados en RPE con GA.
DICER1 es fundamental para la biogénesis de microARN maduro (Bernstein et al., 2001). Sin embargo, después de la deficiencia de DICER1, la acumulación de ARN Alu, y no la falta de microARN maduro, fue el determinante crítico de la viabilidad de las células del RPE (Kaneko et al., 2011). Además, el ARN 7SL, el ARN de transferencia y los microARN primarios no inducen la degeneración del RPE (Kaneko et al., 2011), lo que descarta una toxicidad inespecífica del exceso de ARN altamente estructurado. Aún así, se desconocen los mecanismos exactos de la citotoxicidad del ARN Alu.
Aunque la retina es excepcional por su privilegio inmunitario (Streilein, 2003), las agresiones mediadas por sensores inmunitarios innatos pueden dar lugar a una inflamación profunda. Las tres clases principales de receptores inmunitarios innatos incluyen los TLR, las helicasas de tipo RIG-I y las proteínas NLR (Akira et al., 2006). Numerosos receptores inmunitarios innatos se expresan en el RPE (Kumar et al., 2004) y varias sustancias exógenas pueden inducir inflamación retiniana (Allensworth et al., 2011; Kleinman et al., 2012). Sin embargo, no se sabe si esta maquinaria de vigilancia reconoce o responde a los ARN endógenos del huésped. Se exploró el concepto de que la maquinaria inmunitaria innata, cuya función canónica es la detección de patrones moleculares y otros restos de organismos extraños, asociados a patógenos, también podría reconocer el ARN Alu.
De hecho, se demostró que los transcritos de Alu pueden secuestrar la maquinaria de la inmunidad innata para inducir la muerte de las células del RPE. De manera sorprendente, los datos muestran que la deficiencia de DICER1 o ARN Alu activa el inflamasoma NLRP3 de una manera dependiente de MyD88, pero independiente de TLR. La activación del inflamasoma NLRP3 in vivo se ha restringido en gran medida a las células inmunitarias, aunque los datos abren la posibilidad de que la actividad de NLRP3 pueda estar más extendida, tal como reflejan los ejemplos en estudios de cultivo celular de queratinocitos (Feldmeyer et al., 2007; Keller et al., 2008). Los datos también amplían el alcance de la función de DICER1 más allá de la biogénesis de microARN y lo identifican como un guardián contra la acumulación aberrante de elementos retrotransposones tóxicos que comprenden aproximadamente el 50 % del genoma humano (Lander et al., 2001). En resumen, los descubrimientos presentan una nueva respuesta inmunitaria de autorreconocimiento, mediante la cual resulta la activación del inflamasoma NLRP3 inducida por ARN no codificante endógeno a partir de la deficiencia de DICER1 en una célula no inmunitaria.
RESULTADOS
El ARN Alu no activa una variedad de TLR o sensores de ARN
El ARN Alu tiene motivos de ARN de una sola cadena (ss, single-stranded) y de ARN de doble cadena (ds, double-stranded) (Sinnett et al., 1991). Por lo tanto, se probó si el ARN Alu inducía la degeneración del RPE en ratones deficientes en el receptor tipo toll-3 (TLR3), un sensor de ARNds (Alexopoulou et al., 2001), o TLR7, un sensor de ARNss (Diebold et al., 2004; Heil et al., 2004). La administración subretiniana de un plásmido que codifica ARN Alu (pAlu) indujo la degeneración del RPE en ratones en Tlr3-/- y Tlr7-/-, al igual que en ratones de tipo salvaje (WT) (figuras 1A-C). Anteriormente se demostró que los ARNip completamente complementarios de >21 nucleótidos activan TLR3 en las células del RPE (Kleinman et al., 2011). La falta de activación de TLR3 por ARN Alu probablemente se deba a su estructura compleja que contiene múltiples horquillas y protuberancias que podrían impedir la unión a TLR3. Ni el ARN 7SL, el precursor evolutivo del ARN Alu, ni p7SL, indujeron la degeneración del RPE en ratones WT (figuras 8A y 8B), lo que sugiere que la citotoxicidad del ARN Alu podría deberse a características estructurales aún no claras. pAlu indujo la degeneración del RPE en ratones Unc93b1 (figura 1D), que carecen de la señalización de TLR3, TLR7 y TLR9 (Tabeta et al., 2006), lo que indica que estos sensores de ácido nucleico no son activados por ARN Alu de manera redundante. pAlu indujo la degeneración del RPE en ratones Tlr4-/- (figura 1E) y el antagonista de TLR4 LPS de Rhodobacter sphaeroides (Qureshi et al., 1991) no inhibió la degeneración del RPE inducida por pAlu en ratones WT (figura 8C). Por tanto, la muerte celular del RPE observada no se debe a la contaminación por lipopolisacáridos. Además, dos ARN Alu transcritos in vitro diferentes (Kaneko et al., 2011) no activaron múltiples TLR (figura 1F).
A continuación, se probó si otros sensores de ARNds, tales como MDA5 (Kato et al., 2006) o PKR (codificado por Prkr, (Yang et al., 1995)) podrían mediar en la toxicidad del ARN Alu. Sin embargo, pAlu indujo la degeneración del RPE en ratones Mda5-/- y Prkr/- (figuras 8D y 8E). Se probó si el 5'-trifosfato en el ARN Alu transcrito in vitro, que podría activar RIG-I o iFiT-1 que son sensibles a este resto (Hornung et al., 2006; Pichlmair et al., 2011), era responsable de la degeneración del RPE. El ARN Alu desfosforilado indujo la degeneración del RPE en ratones WT al igual que el ARN Alu no sometido a desfosforilación (figura 8F), lo que indica que este grupo químico no es responsable de la muerte celular observada. De hecho, un ARNss con 5'-trifosfato que activa RIG-I no induce la degeneración del RPE en ratones (Kleinman et al., 2011). Además, pAlu indujo la degeneración del RPE en ratones deficientes en MAVS (figura 8G), a través de la cual RiG-I y MDA-5 señalan (Kumar et al., 2006; Sun et al., 2006). En conjunto, estos datos apuntan a un nuevo mecanismo de degeneración del RPE inducida por ARN Alu no mediada por una amplia gama de sensores de ARN canónicos.
La citotoxicidad del ARN Alu está mediada a través de MyD88 e IL-18
A continuación, se probó la implicación de TRIF (codificado por Ticaml), un adaptador para TLR3 y TLR4 (Hoebe et al., 2003; Yamamoto et al., 2003), y MyD88, un adaptador para todos los TLR, excepto TLR3 (Akira et al., 2006; Alexopoulou et al., 2001; Suzuki et al., 2003). El ARN Alu indujo la degeneración del RPE en ratones Ticam1~/- (figura 9A), en concordancia con los descubrimientos en ratones Tlr3'A y Tlr4'A. De manera inesperada, ni el ARN Alu ni dos plásmidos pAlu diferentes indujeron la degeneración del RPE en ratones Myd88rA (figuras 2A, 9B y 9C). La administración intravítrea de un inhibidor peptídico de la homodimerización de MyD88 (Loiarro et al., 2005) evitó la degeneración del RPE inducida por ARN Alu en ratones WT, mientras que un péptido de control no lo hizo (figura 2B). Un ARN de interferencia pequeño (ARNip) que reconoce MyD88, que tenía menos de 21 nucleótidos de longitud para evitar la activación de TLR3 y estaba conjugado con colesterol para permitir la permeación celular (Kleinman et al., 2008), pero no un ARNip de control, inhibió la degeneración del RPE inducida por pAlu en ratones WT (figuras 2C-2E). Los ratones heterocigotos Myd88+/~ estaban protegidos contra la degeneración del RPE inducida por ARN Alu (figuras 2F y 9D), lo que corrobora los estudios de ARNip de que la atenuación parcial de MyD88 es terapéuticamente suficiente.
La transducción de señales mediada por MyD88 inducida por interleucinas conduce al reclutamiento y la fosforilación de IRAKI e IRAK4 (Cao et al., 1996; Kanakaraj et al., 1999; Suzuki et al., 2003; Suzuki et al., 2002). El ARN Alu aumentó la fosforilación de IRAK1/4 en células del RPE humanas (figura 2G), lo que apoya el concepto de que el ARN Alu desencadena la señalización de MyD88. El péptido inhibidor de MyD88 redujo la fosforilación de IRAK1/4 inducida por ARN Alu en células del RPE humanas (figura 9E), lo que confirma su modo de acción.
A continuación, se evaluó si la activación de MyD88 media la muerte celular inducida por ARN Alu en sistemas de cultivo de células del RPE humanas y de ratón. De acuerdo con los datos in vivo, pAlu redujo la viabilidad celular en células del RPE de ratón WT, pero no en células del RPE de ratón Myd88-/- (figura 2H). El péptido inhibidor de MyD88, pero no un péptido de control, inhibió la muerte celular en células del RPE humanas transfectadas con pAlu (figura 21). De manera conjunta, estos datos indican que MyD88 es un mediador crítico de la degeneración del RPE inducida por ARN Alu.
MyD88, en general, se considera un adaptador de células inmunitarias (O'Neill y Bowie, 2007). Sin embargo, el ARN Alu indujo la muerte celular a través de MyD88 en monocultivo de RPE. Por lo tanto, se probó si la degeneración del RPE inducida por ARN Alu en ratones también dependía únicamente de la activación de MyD88 en las células del RPE. La ablación condicional de MyD88 en el RPE mediante inyección subretiniana de AAV1-BEST1-Cre en ratones Myd88f/f protegió contra la degeneración del RPE inducida por ARN Alu (figuras 2J y 9F). De acuerdo con este descubrimiento, el ARN Alu indujo la degeneración del RPE en ratones WT que recibieron médula ósea de Myd88-/-, pero no lo hizo en ratones Myd88-/- que recibieron médula ósea WT (figura 9G). En conjunto, estos resultados indican que la expresión de MyD88 en el RPE, y no en las células inmunitarias circulantes, es crítica para la degeneración del RPE inducida por ARN Alu. Estos descubrimientos concuerdan con estudios histopatológicos de tejido con GA humano que no muestran infiltración de células inmunitarias en el área de la patología (comunicación personal, C.A. Curcio, H.E. Grossniklaus, G.S. Hageman, L.V. Johnson).
Aunque MyD88 es crítico en la señalización de TLR (O'Neill y Bowie, 2007), la activación de MyD88 por ARN Alu era independiente de la activación de TLR. Por tanto, se examinaron otros mecanismos de implicación de MyD88. MyD88 puede regular la señalización de IFN-y al interaccionar con el receptor 1 de IFN-y (codificado por Ifngr1) (Sun y Ding, 2006). Sin embargo, pAlu indujo la degeneración del RPE en ratones Ifng~A y Ifngr1~A (figuras 9H y 9I). MyD88 también es esencial en la señalización de la interleucina-1 (Muzio et al., 1997). Por tanto, se probó si la IL-1 p y la citocina relacionada IL-18, que activan ambas MyD88 (Adachi et al., 1998), mediaban en la citotoxicidad del a Rn Alu. De manera destacada, mientras que la sobreexpresión de ARN Alu en células del RPE humanas aumentó la secreción de IL-18, la secreción de IL-1 p apenas fue detectable (figura 2K).
La IL-18 recombinante indujo la degeneración del RPE en ratones WT, pero no en ratones Myd88-A (figura 2L). La neutralización de IL-18 protegió contra la degeneración del RPE inducida por pAlu en ratones WT, pero la IL-1 p no lo hizo (figuras 2M y 2N). Además, pAlu indujo la degeneración del RPE en ratones ll1r1~A, pero no en ratones Il18r1~A (figuras 9J y 9K). Estos datos indican que IL-18 es un efector de la citotoxicidad inducida por ARN Alu.
El ARN Alu activa el inflamasoma NLRP3
Se exploró si la caspasa-1 (codificada por Casp1), una proteasa que induce la maduración de interleucinas en formas biológicamente activas (Ghayur et al., 1997; Gu et al., 1997; Thornberry et al., 1992), estaba implicada en la degeneración del RPE inducida por ARN Alu. El tratamiento con ARN Alu de células del RPE humanas condujo a la activación de caspasa-1, tal como se midió mediante transferencia Western y por un indicador fluorescente de escisión del sustrato (figuras 3A y 10A). De hecho, el ARN Alu indujo la activación de caspasa-1 en otros tipos de células, tales como las células monocíticas HeLa y THP-1 (figura 10B), lo que sugiere que la citotoxicidad de ARN Alu tiene implicaciones potencialmente amplias en muchos sistemas. La administración intravítrea del péptido inhibidor de caspasa-1 Z-WEHD-FMK, pero no de un péptido de control Z-FA-FMK, bloqueó la maduración de IL-18 y la degeneración del RPE inducida por pAlu en ratones WT (figuras 3B y 3C). El péptido inhibidor de caspasa-1 bloqueó la escisión del sustrato inducida por ARN Alu en células del RPE humanas (figura 10C), lo que confirma su modo de acción. De manera similar, los ratones Casp1-/- tratados con ARN Alu o pAlu no mostraron degeneración del RPE (figuras 3D y 10D). Además, pAlu no indujo la muerte celular en células del RPE de ratón Casp1-/- (figura 3E).
La caspasa-1 se puede activar dentro de un complejo inmunitario innato multiproteico denominado inflamasoma (Tschopp et al., 2003). La vía del inflamasoma mejor caracterizada es la que es activada mediante la unión de NLRP3 al adaptador ASC de caspasa-1 (codificado por PYCARD). Una marca característica del ensamblaje del inflamasoma es la agrupación espacial de PYCARD (Fernandes-Alnemri et al., 2007). En células del RPE humanas transfectadas con PYCARD etiquetado con fluorescencia (GFP-PYCARD), el ARN Alu indujo la aparición de un grupo citoplásmico brillantemente fluorescente similar al tratamiento con LPS y ATP, que activa el inflamasoma NlRp3 (figuras 3F y 10E) (Mariathasan et al., 2006).
A continuación, se probó la relevancia funcional de NLRP3 y PYCARD para la citotoxicidad del ARN Alu. Ni pAlu ni ARN Alu indujeron la degeneración del RPE en ratones Nlrp3-/- o Pycard-/- (figuras 3G, 3H, 10F y 10G), lo que demuestra la importancia crítica del inflamasoma en la citotoxicidad del ARN Alu. Además, pAlu no indujo la muerte celular en células del RPE de ratones Nlrp3-/- o Pycar&/- (figura 3I). Además, la atenuación de NLRP3 o PYCARD por ARNip rescató la muerte celular del RPE humano inducida por pAlu (figuras 3J y 10H). Estos descubrimientos proporcionan evidencia directa de que la activación de NLRP3 en respuesta a ARN Alu tiene lugar en las células del RPE y no requiere la presencia de otras células inmunitarias.
Se determinó que la activación de IL-18 y MyD88 de hecho se producía corriente abajo de la activación de caspasa-1 al mostrar (1) que mientras que la inhibición de MyD88 reducía la fosforilación de IRAK1/4 inducida por ARN Alu en células del RPE humanas (figura 9E), no redujo la escisión de caspasa-1 inducida por ARN Alu o la escisión del sustrato fluorescente (figuras 10I y 10J); (2) que la neutralización de IL-18 no inhibió la escisión de caspasa-1 inducida por ARN Alu (figura 10K); y (3) que la inhibición de caspasa-1 redujo la fosforilación de IRAK1/4 inducida por ARN Alu (figura 10L).
El ARN Alu induce ROS mitocondriales y el cebado de NLRP3
La función del inflamasoma NLRP3 requiere dos señales, la primera de las cuales se denomina cebado. pAlu indujo el cebado del inflamasoma, ya que regulaba por incremento los ARNm de NLRP3 e IL18. Este cebado tuvo lugar de manera equivalente en células del RPE tanto en ratones WT como en ratones Myd88-'- (figura 4A), lo que corrobora adicionalmente que MyD88 funciona corriente abajo de NLRP3 en este sistema. De manera similar a otros agonistas del inflamasoma que no interaccionan directamente con NLRP3 (Tschopp y Schroder, 2010), no se observó una interacción física entre ARN Alu y NLRP3 (figura 11A). Para determinar cómo el ARN Alu cebaba el inflamasoma, se estudió si inducía la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), una señal para el cebado (Bauernfeind et al., 2011; Nakahira et al., 2011). pAlu indujo la generación de ROS en células del RPE humanas (figura 4B) y el inhibidor de ROS difenilyodonio (DPI) bloqueó la regulación por incremento del ARNm de NLRP3 e IL18 inducida por pAlu y la degeneración del RPE inducida por ARN Alu en ratones WT (figuras 4C y 4D). Como el DPI bloquea las ROS mitocondriales y las ROS fagosómicas (Li y Trush, 1998), se probó qué vía se desencadenaba porque existe controversia con respecto a la fuente de ROS que contribuye a las respuestas de NLRP3 (Latz, 2010).
Se utilizó MitoSOX Red, que marca las mitocondrias que generan ROS, en combinación con MitoTracker Deep Red, que marca las mitocondrias que respiran. Para controlar la generación de ROS fagosómicas, se utilizó Fc OxyBURST Green, que mide la activación de la NADPH oxidasa dentro del fagosoma. Se observó un aumento destacado en las mitocondrias que generan ROS en células del RPE humanas transfectadas con pAlu (figura 4E). Por el contrario, mientras que el acetato de forbol miristato (PMA) indujo ROS fagosómicas, tal como se esperaba (Savina et al., 2006), pAlu no lo hizo (figura 4F). Estos datos son consistentes con los descubrimientos de que las respuestas de NLRP3 se ven afectadas por los inhibidores de ROS mitocondriales (Nakahira et al., 2011; Zhou et al., 2011), pero se conservan en células que portan mutaciones genéticas que afectan a la producción de ROS dependiente de NADPH oxidasa (Meissner et al., 2010; van Bruggen et al., 2010).
En concordancia con estos informes y la observación de que la principal fuente de ROS celular son las mitocondrias (Murphy, 2009), se descubrió que los antioxidantes Mito-TEMPO y MitoQ dirigidos a las mitocondrias (Murphy y Smith, 2007; Nakahira et al., 2011) bloqueaban la degeneración del RPE inducida por ARN Alu en ratones Wt , mientras que dTPP, un análogo estructural de MitoQ que no secuestra las ROS mitocondriales, no lo hizo (figura 4G). Por el contrario, gp91ds-tat, un péptido permeable a las células que inhibe la asociación de dos subunidades esenciales de NADPH oxidasa (gp91phoxy p47phox) (Rey et al., 2001), no lo hizo (figura 4H). Corroborando estos datos, el ARN Alu indujo la degeneración del RPE en ratones deficientes en Cybb (que codifica gp91phox), al igual que en ratones WT (figura 4I). A continuación, se estudiaron los canales de aniones dependientes de voltaje (VDAC, voltage-dependent anion channels) porque VDAC1 y VDAC2, pero no VDAC3, son importantes en las ROS mitocondriales producidas por los activadores NLRP3 en los macrófagos (Zhou et al., 2011). En concordancia con estas observaciones, la atenuación por ARNip de VDAC1 y VDAC2, pero no de VDAC3, afectó a las ROS mitocondriales inducidas por pAlu (figuras 4J y 11B) y a la inducción de ARNm de NLRP3 e IL18 en células del RPE humanas (figura 4K). En conjunto, estos datos implican a las ROS mitocondriales en la degeneración del RPE mediada por el inflamasoma NLRP3 inducida por a Rn Alu.
El ARN Alu no induce la degeneración del RPE a través de la piroptosis
El ARN Alu activa la caspasa-1, que puede desencadenar la piroptosis, una forma de muerte celular caracterizada por la formación de poros en la membrana y lisis osmótica (Fink y Cookson, 2006). El agente citoprotector, glicina, que atenúa la piroptosis (Fink et al., 2008; Fink y Cookson, 2006; Verhoef et al., 2005), inhibió la muerte de células del RPE humanas inducida por LPS+ATP, pero no por ARN Alu (figura 5A y 5B). La piroptosis requiere la caspasa-1, pero puede proceder independientemente de la IL-18 (Miao et al., 2010). Por tanto, el descubrimiento de que la IL-18 inducía la degeneración del RPE en ratones Casp1-/- (figura 5C), junto con la falta de rescate por parte de la glicina, sugiere que la degeneración del RPE inducida por ARN Alu no se produce a través de la piroptosis.
La pérdida de DICER1 induce la muerte celular a través del inflamasoma
Anteriormente se demostró el papel clave de DICER1 en el mantenimiento de la salud de las células del RPE (Kaneko et al., 2011): el ARN Alu escindido por DICER1 no indujo la degeneración del RPE in vivo; la sobreexpresión de DICER1 protegió contra la degeneración del RPE inducida por ARN Alu; y la degeneración del RPE inducida por la pérdida de DICER1 se bloqueó antagonizando el ARN Alu (Kaneko et al., 2011). Además, el rescate de la degeneración del RPE inducida por la atenuación de DICER1 mediante la inhibición del ARN Alu no estuvo acompañado por la restauración de los déficits de microARN (Kaneko et al., 2011). Por lo tanto, se probó si DICER1 también prevenía la activación del inflamasoma NLRP3 por ARN Alu. La sobreexpresión de DICER1 inhibió la activación de la caspasa-1 inducida por ARN Alu en células del RPE humanas (figuras 6A y 6B). En cambio, la escisión de la caspasa-1 inducida por la atenuación de DICER1 en células del RPE humanas fue inhibida por atenuación antisentido simultánea de ARN Alu (figuras 12A y 12B).
A continuación, se probó la relevancia de estas vías en el contexto de la pérdida de DICER1 in vivo. La escisión de caspasa-1 aumentó en el RPE de ratones BEST1 Cre;Dicer1f/f (figura 6C), que pierden la expresión de DICER1 en el RPE durante el desarrollo y muestran degeneración del RPE (Kaneko et al., 2011). La administración subretiniana de AAV1-BEST1-Cre en ratones Dicer1f/f indujo la activación de la caspasa-1 y la maduración de IL-18 en el RPE (figura 6D). Este tratamiento también indujo la degeneración del RPE, que fue bloqueada por la administración intravítrea del péptido inhibidor de caspasa-1, pero no del péptido de control (figura 6E). La degeneración del RPE inducida por AAV1-BEST1-Cre en ratones Dicer1f/f también se bloqueó mediante la administración intravítrea del péptido inhibidor de MyD88, pero no de un péptido de control (figura 6F). Además, la inhibición de MyD88 evitó la muerte celular en células del RPE humanas tratadas con oligonucleótidos antisentido que reconocen DICER1 (figura 6G). La atenuación de DICER1 en células del RPE humanas aumentó la fosforilación de IRAK1/4, proporcionando más evidencias de la activación de MyD88 tras la pérdida de DICER1 (figura 6H). La inhibición de MyD88 también evitó la muerte celular en células del RPE de ratón Dicer1f/f tratadas con un vector adenoviral que codifica la Cre recombinasa (figura 6I). La inhibición de MyD88 bloqueó la muerte de células del RPE sin restaurar los déficits de expresión de microARN inducidos por la atenuación de Dicer1 (figura 6J). Estos descubrimientos demuestran que DICER1 es un regulador negativo endógeno esencial de la activación del inflamasoma NLRP3 y que la deficiencia de DICER1 conduce a la degeneración del RPE independiente de microARN, dependiente de MyD88 y mediada por ARN Alu.
Activación del inflamasoma y MyD88 en GA humana
A continuación, se probó si los ojos humanos con GA, que muestran pérdida de DICER1 y acumulación de ARN Alu en su RPE (Kaneko et al., 2011), también presentan evidencias de activación del inflamasoma. La abundancia de ARNm de NLRP3 en el RPE de ojos humanos con GA aumentó notablemente en comparación con los ojos de control (figura 7A). La abundancia de ARNm de IL18 e IL1B también aumentó en RPE con GA; sin embargo, solo la disparidad en los niveles de IL18 alcanzó una significación estadística (figura 7A). Los estudios de inmunolocalización mostraron que la expresión de las proteínas NLRP3, PYCARD y caspasa-1 también aumentó en RPE con GA (figuras 7B-D). Los análisis por transferencia Western corroboraron el aumento de la abundancia de NLRP3 y PYCARD en RPE con GA y revelaron niveles mucho mayores de la subunidad p20 de caspasa-1 escindida enzimáticamente activa en RPE con GA (figura 7E). También hubo un aumento en la abundancia de IRAK1 e IRAK4 fosforiladas en RPE con GA, lo que es indicativo de una mayor transducción de señales de MyD88 (figura 7E). En conjunto, estos datos proporcionan evidencias de la activación del inflamasoma NLRP3 y MyD88 in situ en GA humana, lo que refleja los datos funcionales en un cultivo de células del RPE humanas y en ratones in vivo.
DISCUSIÓN
Los datos establecen un papel funcional para la subversión de las vías de sensibilización inmunitarias innatas por ARN Alu en la patogenia de GA. En conjunto, los descubrimientos demuestran que el inflamasoma NLRP3 es sensible a las señales de peligro de ARN Alu asociadas a GA, contribuye a la degeneración del RPE y, potencialmente, a la pérdida de la visión en la AMD (figura 13). Hasta la fecha, la función del inflamasoma NLRP3 se ha restringido en gran medida a las células inmunitarias in vivo. El descubrimiento de que desempeña una función crítica en la supervivencia de las células del RPE amplía el alcance celular de este inflamasoma y plantea la posibilidad de que otras células no inmunitarias puedan emplear esta plataforma.
El inflamasoma NLRP3 se reconoció originalmente como un sensor de señales de peligro externas, tales como toxinas microbianas (Kanneganti et al., 2006; Mariathasan et al., 2006; Muruve et al., 2008). Posteriormente, se informó de que cristales endógenos, polipéptidos y lípidos lo activan en enfermedades, tales como la gota, la aterogénesis, la enfermedad de Alzheimer y la diabetes tipo 2 (Halle et al., 2008; Masters et al., 2010; Muruve et al., 2008; Wen et al., 2011). Hasta donde se sabe, el ARN Alu es el primer ácido nucleico endógeno que se sabe que activa esta plataforma inmunitaria. Los descubrimientos amplían la diversidad de señales de peligro endógenas en enfermedades humanas crónicas y concuerdan con el concepto de que este inflamasoma es un sensor de peligro metabólico (Schroder et al., 2010).
La disminución de la activación del inflamasoma puede ser esencial para limitar la respuesta inflamatoria. Los patógenos han desarrollado muchas estrategias para inhibir la activación del inflamasoma (Martinon et al., 2009). Del mismo modo, las proteínas de autofagia del huésped (Nakahira et al., 2011), el interferón tipo I (Guarda et al., 2011) y el contacto de las células T con los macrófagos pueden inhibir este proceso (Guarda et al., 2009). El descubrimiento de que DICER1, a través de su escisión de ARN Alu, evita la activación de NLRP3 se suma al repertorio de capacidades de modulación del inflamasoma del huésped y revela una nueva faceta de cómo la desregulación de los mecanismos antiinflamatorios homeostáticos puede promover la AMD (Ambati et al., 2003; Takeda et al., 2009).
Además de sus funciones antiapoptóticas y relacionadas con tumores recientemente descritas, DICER1 emerge como una proteína multifacética. Queda por determinar cómo se canaliza esta versatilidad funcional en diversos estados. A medida que la desregulación de DICER1 es reconocida cada vez más en diversas enfermedades humanas, es razonable imaginar que el ARN Alu podría ser una señal de peligro que activa el inflamasoma también en esas condiciones. También es interesante que, como mínimo, en ratones adultos y en una variedad de células humanas y de ratón, la función de biogénesis de microARN de DICER1 no es crítica para la supervivencia celular, como mínimo, en un entorno deficiente en MyD88 (datos no mostrados).
Los datos de que la producción de ROS mitocondrial está implicada en la degeneración del RPE inducida por ARN Alu concuerdan con las observaciones del daño del ADN mitocondrial (Lin et al., 2011), la regulación por disminución de las proteínas implicadas en la producción y el tráfico de energía mitocondrial (Nordgaard et al., 2008) y la reducción en el número y tamaño de las mitocondrias (Feher et al., 2006) en el RPE de ojos humanos con AMD. En conjunto, estos descubrimientos sugieren un potencial beneficio terapéutico para interferir en la generación de ROS mitocondriales.
Los programas clínicos actuales dirigidos al inflamasoma se centran en gran medida en IL-1P; actualmente, no hay inhibidores de IL-18 en ensayos clínicos registrados. Sin embargo, los datos indican que la IL-18 es más importante que la IL-1 P en la mediación de la muerte celular del RPE en la GA (similar a la implicación selectiva de la IL-18 en un modelo de colitis (Zaki et al., 2010)), lo que apunta a la existencia de mecanismos reguladores mediante los cuales la activación del inflamasoma se bifurca al nivel de los efectores de interleucina o justo antes de los mismos. Aunque la inhibición de caspasa-1 podría ser una estrategia terapéutica local atractiva, los inhibidores de caspasa pueden promover vías alternativas de muerte celular, lo que posiblemente limita su utilidad (Vandenabeele et al., 2006).
MyD88 es mejor conocido por transducir la señalización de TLR iniciada por patrones moleculares asociados a patógenos (O'Neill y Bowie, 2007), aunque recientemente se ha implicado en cánceres humanos (Ngo et al., 2011; Puente et al., 2011). Los descubrimientos introducen una nueva función inesperada para MyD88 en la realización de señales de muerte a partir de transcritos de elementos móviles que pueden conducir a la degeneración de la retina y la ceguera, y plantean la posibilidad de que MyD88 podría ser un integrador central de señales de otros inflamasomas que no son NLRP3 que también emplean caspasa-1 (Schroder y Tschopp, 2010). Dado que la activación no canónica de MyD88 es un punto de control crítico en la degeneración del RPE en GA (figura 13), representa una diana terapéutica tentadora. Una preocupación potencial es su importante función antimicrobiana en ratones (O'Neill y Bowie, 2007). Sin embargo, a diferencia de los ratones Myd88-/-, se describe que los seres humanos adultos con deficiencia de MyD88 están, en general, sanos y son resistentes a una amplia variedad de patógenos microbianos (von Bernuth et al., 2008). Los seres humanos con deficiencia de MyD88 tienen un rango de susceptibilidad estrecho a las infecciones bacterianas piógenas, y eso también solo en la primera infancia y no en la vida adulta (Picard et al., 2010). Además, tal como es evidente a partir de los estudios con ARNip y Myd88+/~, la inhibición parcial de MyD88 es suficiente para proteger contra el ARN Alu. La terapia intraocular localizada, el tratamiento de referencia actual en la mayoría de las enfermedades de la retina, limitaría adicionalmente la probabilidad de desenlaces infecciosos adversos. Es razonable prever el desarrollo de inhibidores de MyD88 para la prevención o el tratamiento de la GA.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Inyección subretiniana y obtención de imágenes. Se realizaron inyecciones subretinianas (1 |il) utilizando un Pico-Inyector (PLI-100, Harvard Apparatus). Los plásmidos se transfectaron in vivo utilizando Neuroporter al 10 % (Genlantis). La obtención de imágenes del fondo de ojo se realizó con una cámara TRC-50 IX (Topcon) conectada a un sistema de obtención de imágenes digitales (Sony). Los portamuestras planos con RPE se inmunomarcaron utilizando anticuerpos contra zonula occludens-1 (Invitrogen).
Abundancia de ARNm. La abundancia de transcritos se cuantificó mediante RT-PCR en tiempo real utilizando un sistema de PCR en tiempo real rápido 7900 HT de Applied Bisystems mediante el procedimiento 2'AACt.
Abundancia y actividad de proteínas. La abundancia de proteínas se evaluó mediante análisis por transferencia Western utilizando anticuerpos contra la caspasa-1 (1:500; Invitrogen), pIRAK1 (1:500; Thermo Scientific), pIRAK4 (1:500, Abbomax), PYCARD (1:200, Santa Cruz Biotechnology), NLRP3 (1:500, Enzo Life Sciences) y vinculina (1:1.000; Sigma-Aldrich). La actividad de la caspasa-1 se visualizó utilizando Caspalux1 E1D2 (Oncolmmunin), según las instrucciones del fabricante.
Ratones. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por comités de revisión institucionales y según la Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Visual Research. Los ratones de tipo salvaje C57BL/6J, Cybb-/-, Tlr3-/-, Tlr4-/- (C57BL/10ScNJ), Trif/- (Ticam1Lps2), Ifng-/-, Ifngr1-, Il1r1-/-, Il18r1-/-, Myd88f/f y Dicer1f/f se adquirieron de The Jackson Laboratory. Los ratones Casp1-/-, Nlrp3-/- y Pycard-/- se han descrito previamente (Kanneganti et al., 2006). Los ratones mutantes Unc93b1 fueron proporcionados generosamente por B.A. Beutler a través de K. Fitzgerald. Los ratones Myd88-/- y Tlr7-/- fueron proporcionados generosamente por S. Akira a través de T. Hawn y D.T. Golenbock. Los ratones Mda5-/- fueron proporcionados generosamente por M. Colonna. Los ratones Prkr/- fueron proporcionados generosamente por B. R. Williams y R. L. Silverman. Los ratones Mavs-/- fueron proporcionados generosamente por Z. Chen a través de K. Fitzgerald. Para todos los procedimientos, la anestesia se consiguió mediante una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de clorhidrato de ketamina (Ft. Dodge Animal Health) y 10 mg/kg de xilazina (Phoenix Scientific), y las pupilas se dilataron con tropicamida tópica al 1 % (Alcon Laboratories).
Fotografía del fondo de ojo. Se tomaron fotografías de la retina de ojos de ratón dilatados con una cámara TRC-50 IX (Topcon) conectada a un sistema de obtención de imágenes digitales (Sony).
Tejido humano. Se obtuvieron ojos de donantes o tejidos oculares de pacientes con atrofia geográfica debido a AMD o pacientes de la misma edad sin AMD de diversos bancos de ojos. Estos diagnósticos se confirmaron mediante un examen oftálmico con dilatación antes de la adquisición de los tejidos o de los ojos o mediante el examen post mortem de los globos oculares. El estudio siguió las directrices de la Declaración de Helsinki. Las juntas de revisión institucionales otorgaron la aprobación para la asignación y el análisis histológico de las muestras.
Inmunomarcaje. Se prepararon ojos humanos fijados en paraformaldehído al 2-4 % como copas oculares, se crioprotegieron en sacarosa al 30 %, se incluyeron en un compuesto a temperatura de corte óptimo (Tissue-Tek OCT; Sakura Finetek) y se crioseccionaron en secciones de 10 |im. La despigmentación se consiguió utilizando permanganato potásico al 0,25 % y ácido oxálico al 0,1 %. La tinción inmunohistoquímica se realizó con el anticuerpo de conejo contra NLRP3 (1:100, Sigma Aldrich) o el anticuerpo de conejo contra caspasa-1 (prediluido, AbCam). El isotipo IgG se sustituyó por el anticuerpo primario para evaluar la especificidad de la tinción. El anticuerpo unido se detectó con anticuerpos secundarios conjugados con biotina, seguido de incubación con reactivo ABC y se visualizó mediante Vector Blue (Vector Laboratories). Se utilizó levamisol (Vector Laboratories) para bloquear la actividad de la fosfatasa alcalina endógena. Los portaobjetos se lavaron en PBS, se contratiñeron con rojo neutro (Fisher Scientific), se enjuagaron con agua desionizada, se secaron al aire y, a continuación, se montaron en Vectamount (Vector Laboratories). El marcaje fluorescente de tejido humano se realizó con el anticuerpo de conejo contra PYCARD (1:50, Clon N-15, Santa Cruz Biotechnology). El inmunomarcaje se visualizó mediante un anticuerpo secundario contra conejo conjugado con fluorescencia (Invitrogen). La autofluorescencia del tejido se extinguió incubando las secciones en negro de Sudán al 0,3 % (Fisher Scientific). Las secciones se montaron en Vectashield con DAPI (Vector Laboratories). Los portamuestras planos con RPE/coroides de ratón se fijaron con paraformaldehído al 4 % o metanol al 100 %, se tiñeron con anticuerpos de conejo contra la zonula occludens-1 humana (1:100, Invitrogen) y se visualizaron con Alexa594 (Invitrogen). Todas las imágenes se obtuvieron utilizando los microscopios Leica SP-5 o Zeiss Axio Observer Z1.
Inyección subretiniana. Se realizaron inyecciones subretinianas (1 |il) en ratones utilizando un Pico-Inyector (PLI-100, Harvard Apparatus). La transfección in vivo de plásmidos que codifican dos secuencias Alu diferentes (pAlu) o un vector de control vacío (pNull) (Bennett et al., 2008; Kaneko et al., 2011; Shaikh et al., 1997) se consiguió utilizando Neuroporter al 10 % (Genlantis). Se inyectaron AAV1-BEST1-Cre (Alexander y Hauswirth, 2008) o AAV1-BEST1-GFP a 1,0 x 1011 ufp/ml y se inyectó ARN Alu transcrito in vitro a 0,3 mg/ml.
Tratamientos farmacológicos. ARNip formulados en tampón de ARNip (KCL 20 mM, MgCb 0,2 mM en tampón HEPES a pH 7,5; Dharmacon) o solución salina tamponada con fosfato (PBS; Sigma-Aldrich); el antagonista de TLR4 LPS de Rhodobacter sphaeroides ultrapuro (LPS-RS, InvivoGen), un inhibidor peptídico de la homodimerización de MyD88 IMG-2005 (IMGENEX), inhibidor de control (IMGENEX), IL-18 recombinante (Medical & Biological Laboratories), anticuerpos de rata neutralizantes contra IL-1 p de ratón (IMGENEX), anticuerpos neutralizantes de rata contra IL-18 de ratón (Medical & Biological Laboratories), IgG de control de isotipo (R&D Systems o eBioscience, según corresponda), inhibidor de caspasa-1 Z-WEHD-FMK (R&D Systems), inhibidor de control de caspasa Z-FA-FMK (R&D Systems), DPI (Enzo Life Sciences), Mito-TEMPO (Enzo Life Sciences), MitoQ y dTPP (ambos adsorbidos a ciclodextrina y proporcionados por M.P. Murphy, MRC Mitochondrial Biology Unit) y gp91ds-tat y gp91 ds-tat mixtos (ambos de Anaspec), se disolvieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS; Sigma-Aldrich) o sulfóxido de dimetilo (DMSO; Sigma-Aldrich) y se inyectaron en el humor vítreo en un volumen total de 1 pl con una microjeringa Exmire de calibre 33 (Ito Corporation). Para evaluar el efecto del bloqueo de MyD88 en la degeneración del RPE inducida por pAlu, se inyectó por vía intravítrea 1 pl de ARNip de MyD88 conjugado con colesterol (col) (17+2 nt; 2 pg/pl) 1 día después de la inyección de pAlu. Como control, se utilizó ARNip de Luc-col (17+2 nt) con dosis idénticas.
Quimeras de médula ósea. Se utilizó un trasplante de médula ósea para crear ratones quimeras Myd88-/-, en el que la deficiencia genética de Myd88 se limitó a las células circulantes (Myd88-A ^ WT) o al tejido no hematopoyético (WT ^ Myd88-/-). De manera resumida, se recogieron médulas óseas de fémur y tibia de ratones donantes congénicos WT o Myd88~A mediante lavado con RPMI1640. Después de dos etapas de lavado, las células se resuspendieron en RPMI1640. Se inyectaron 1 x 107 células en 150 pl de RPMI1640 en la vena de la cola de ratones donantes irradiados. Se generaron dos grupos de quimeras: WT ^ Myd88'/' (células WT en ratones Myd88-/-) y Myd88~A ^ WT (células Myd88~A en ratones WT). 2 meses después de la transferencia de médula ósea, se inyectó a los ratones por vía subretiniana ARN Alu, vehículo, pAlu o pNull, y se supervisó la degeneración del RPE 7 días después.
PCR en tiempo real. Se extrajo el ARN total de tejidos o células utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen), según las recomendaciones del fabricante, se trató con ADNasa y se transcribió de forma inversa (QuantiTect, Qiagen). Los productos de RT (ADNc) se amplificaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (sistema de PCR en tiempo real rápido 7900 HT de Applied Biosystems) con una mezcla madre Power SYBR green. Cebadores de oligonucleótidos específicos para IL1B humana (directo 5'-TTAAAGCCCGCCTGACAGA-3' e inverso 5'-GCGAATGACAGAGGGTTTCTTAG-3'), IL18 humana (directo 5'-ATCACTTGCACTCCGGAGGTA-3' e inverso 5'-AGAGCGCAATGGTGCAATC-3'), NLRP3 humano (directo 5'-GCACCTGTTGTGCAATCTGAA-3' e inverso 5'-TCCTGACAACATGCTGATGTGA-3'), PYCARD humano (directo 5'-GCCAGGCCTGCACTTTATAGA-3' e inverso 5'-GTTTGTGACCCTCGCGATAAG-3'), VDAC1 humano (directo 5'-ACTGCAAAATCCCGAGTGAC-3' e inverso 5'-CTGTCCAGGCAAGATTGACA-3'), VDAC2 humano (directo 5'-CAGTGCCAAATCAAAGCTGA-3' e inverso 5'-CCTGATGTCCAAGCAAGGTT-3'), VDAC3 humano (directo 5'-TTGACACAGCCAAATCCAAA-3' e inverso 5'-GCCAAAACGGGTGTTGTTAC-3'), ARNr 18S humano (directo 5'-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3' e inverso 5'-GCCT CAGTTCCGAAAACCAA-3'),
Myd88 de ratón (directo 5'-CACCTGTGTCTGGTCCATTG-3' e inverso 5'-AGGCTGAGTGCAAACTTGGT-3'), Nlrp3 de ratón (directo 5'-ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3' e inverso 5'-AACCAATGCGAGATCCTGAC -3'), Il18 de ratón (directo 5'-GACAGCCTGTGTTCGAGGAT-3' e inverso 5'-TGGATCCATTTCCTCAAAGG-3') y ARNr 18S de ratón (directo 5'-TTCGTATTGCGCCGCTAGA-3' e inverso 5'-CTTTCGCTCTGGTCCGTCTT-3'). Las condiciones de ciclado de QPCR fueron 50 oC durante 2 minutos, 95 oC durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de un programa de amplificación de dos etapas (95 oC durante 15 segundos y 58 oC durante 1 minuto). Al final de la amplificación, se aplicó el análisis de la curva de fusión utilizando el protocolo de disociación del sistema de detección de secuencias para excluir la contaminación con productos de PCR inespecíficos. Los productos de PCR también fueron confirmados mediante gel de agarosa y mostraron solo una banda específica del tamaño predicho. Para los controles negativos, se utilizaron productos no RT como moldes en la QPCR y se verificó la ausencia de bandas detectadas en gel. Las expresiones relativas de los genes diana se determinaron mediante el procedimiento 2'AACt.
Cuantificación de ARNmi. Se poliadeniló el ARN total que contenía ARNmi y se transcribió de forma inversa utilizando un cebador universal utilizando el kit de detección de q-RT-PCT para ARNmi All-In-One (GeneCopoeia), según las especificaciones del fabricante utilizando un cebador inverso universal en combinación con los siguientes cebadores directos: miR-184 de ratón (5'-TGGACGGAGAACTGATAAGGGT-3'); miR-221/222 de ratón (5'-AGCTACATCTGGCTACTGGGT-3'); miR-320a de ratón (5'-AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGA-3') y miR-484 de ratón (5'-TCAGGCTCAGTCCCCTCCCGAT-3'). Los niveles de ARNmi se normalizaron a los niveles de ARNsn U6 (5'-AAATTCGTGAAGCGTTCC-3') utilizando el procedimiento 2'AACt. La detección se consiguió mediante qPCR SYBR green con las siguientes condiciones: 95 oC durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 oC durante 10 segundos, 60 oC durante 20 segundos y 72 oC durante 20 segundos. La especificidad del amplicón se evaluó mediante el análisis de la curva de fusión y las bandas únicas mediante electroforesis en gel de agarosa.
Transferencia Western. Se homogeneizaron los tejidos o las células en tampón de lisis (base Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Triton X-100 al 1 %, NP-40 al 0,5 %, cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa (Roche)). Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un kit de ensayo de Bradford (Bio-Rad) con albúmina de suero bovino como patrón. Las proteínas (40-100 pg) se procesaron en geles NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de PVDF Immun-Blot (Bio-Rad). Las células se rasparon en tampón Laemmli caliente (base Tris 62,5 mM, pH 6,8, SDS al 2 %, 2-mercaptoetanol al 5 %, glicerol al 10 %, azul de bromofenol al 0,01 %). Las muestras se hirvieron y se procesaron en geles NuPAGE Tris-Glicina al 4-20 % (Invitrogen). Las membranas transferidas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos contra caspasa-1 humana (1:500; Invitrogen), caspasa 1 de ratón (1:500; MBL), NLRP3 (1:1.000; Enzo Life Sciences), PYCARD (1:1.000, RayBiotech), fosfo-IRAKl (S376) (1:500, Thermo Scientific), fosfo-IRAK4 (T345) (1:500, AbboMax), DICER1 (1:2.000; Bethyl), MyD88 (1:1.000; Cell Signaling) e IL-18 de ratón (1:200; MBL) a 4 oC durante la noche. La carga de proteínas se evaluó mediante inmunotransferencia utilizando un anticuerpo contra vinculina (1:1.000; Sigma-Aldrich). Se utilizaron anticuerpos secundarios (1:5.000) durante 1 hora a temperatura ambiente. La señal se visualizó mediante quimioluminiscencia aumentada (ECL plus) y se capturó con el software de análisis y adquisición de imágenes VisionWorksLS (versión 6.7.2, UVP, LLC).
Cultivo celular. Todos los cultivos celulares se mantuvieron a 37 oC y CO2 al 5 %. Se aislaron células primarias del RPE de ratón, tal como se ha descrito anteriormente (Yang et al., 2009), y se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con FBS al 20 % y concentraciones de antibióticos estándar. Se aislaron células primarias del RPE humanas, tal como se ha descrito anteriormente (Yang et al., 2008), y se mantuvieron en DMEM complementado con FBS al 10 % y antibióticos. Se mantuvieron células HeLa en DMEM complementado con FBS al 20 % y concentraciones de antibióticos estándar. Se cultivaron células THP-1 en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10 % y antibióticos.
Transcripción in vitro de ARN Alu. Se sintetizaron dos ARN Alu: una secuencia Alu de 281 nucleótidos procedente del clon de ADNc TS 103 (Shaikh et al., 1997) y una secuencia Alu de 302 nucleótidos aislada del RPE de un ojo humano con atrofia geográfica. Los plásmidos linealizados que contenían estas secuencias Alu con un promotor T7 en 5' adyacente se sometieron al kit de transcripción AmpliScribe™ T7-Flash™ (Epicentre), según las instrucciones del fabricante. El ARN tratado con ADNasa se purificó utilizando MEGAclear™ (Ambion) y la integridad se supervisó mediante electroforesis en gel. Esto produce ARN de una sola cadena que se pliegan en una estructura secundaria definida idéntica a los transcritos derivados de Pol III. Cuando se indicó, el ARN transcrito se desfosforiló utilizando fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Invitrogen) y se volvió a purificar mediante precipitación con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico.
Transfección transitoria. Se transfectaron células del RPE humanas o de ratón con pUC19, pAlu, pCDNA3.1/Dicer-FLAG, pCDNA3.1, ARN Alu, ARNip de NLRP3 sentido (5'-GUUUGACUAUCUGUUCUdTdT-3'), ARNip de PYCARD sentido (5'-GAAGCUCUUCAGUUUCAdTdT-3'), ARNip de MyD88 sentido (sentido: 5'-CAGAGCAAGGAAUGUGAdTdT-3'), ARNip de VDAC1 sentido (5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3'), ARNip de VDAC2 sentido (5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3'), ARNip de VDAC3 sentido (5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3'), oligonucleótido antisentido (AS) DICER1 (5'-GCUGACCTTTTTGCTUCUCA-3'), AS de control (para DICER1) (5'-TTGGTACGCATACGTGTTGACTGTGA-3'), AS Alu (5'-CCCGGGTTCACGCCATT CTCCTGCCT CAGCCT CACGAGTAGCTGGGACT ACAGGC GCCCGACACCACTCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTT-3'), AS de control (para Alu) (5'-GCATGGCCAGTCCATT GAT CTT GCACGCTTGCCTAGTACGCTCCTCAACCT ATCCT CCTAGCCCGTTACTTGGTGCCACCGGCG-3') utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante.
Infección por adenovirus. Las células se sembraron en placas a una densidad de 15 x 103/cm2 y después de 16 horas, con una confluencia de aproximadamente el 50 %, se infectaron con AdCre o AdNull (Vector Laboratories) con una multiplicidad de infección de 1.000.
Viabilidad celular. Se realizaron ensayos MTS utilizando el ensayo de proliferación celular CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega), según las instrucciones del fabricante. Para examinar el efecto citoprotector de la glicina en la muerte celular inducida por ARN Alu, se transfectaron células del RPE humanas con pNull/pAlu. A las 6 horas después de la transfección, las células se incubaron con medio completo que contenía glicina (5 mM) o vehículo, y la viabilidad celular se evaluó después de 24 horas. De forma similar, las células del RPE humanas cebadas con LPS (5 pg/ml durante 6 horas) se trataron con ATP (25 pM) en presencia de un medio que contenía glicina (5 mM). 30 minutos después de ATP, se evaluó la viabilidad celular, tal como se ha descrito anteriormente.
Actividad de caspasa-1. La actividad de caspasa-1 se visualizó incubando células con el reactivo Caspalux1E1D2 (Oncolmmunin), según las instrucciones del fabricante. La señal de Caspalux1E1D2 se cuantificó leyendo la fluorescencia (excitación a 552 nm, emisión a 580 nm) utilizando un lector Synergy 4 (Biotek). La cuantificación de la fluorescencia a partir de las imágenes se realizó convirtiendo las imágenes a escala de grises en Adobe Photoshop CS5 y midiendo la densidad integrada de las imágenes en blanco y negro con el software ImageJ (NIH) (Bogdanovich et al., 2008).
Producción de ROS. La producción de ROS celulares se evaluó utilizando la sonda específica de ROS diacetato de 2'7'-diclorodihidrofluorescina (H2DCFDA, BioChemica, Fluka). La producción de ROS mitocondriales se evaluó utilizando MitoSOX™ Red (Invitrogen). Se transfectaron células del RPE humanas subconfluentes con pNull o pAlu. Después de 24 horas, las células se cargaron durante 10 minutos a 37 oC con H2DCFDA 10 pM o indicador de superóxido mitocondrial MitoSOX™ Red (Invitrogen) para obtener imágenes de células vivas y se lavaron dos veces con PBS. Para H2DCFDA, la fluorescencia se registró en una placa de 96 pocillos utilizando un lector Synergy 4 (Biotek) utilizando un filtro FITC (excitación a 485 nm, emisión a 538 nm). Para visualizar las mitocondrias que respiran para la colocalización con la señal de ROS mitocondriales, después del lavado con PBS, las células se incubaron con MitoTracker Deep Red™ (Invitrogen) durante 30 minutos a 37 oC y, a continuación, se lavaron dos veces con PBS. Las señales fluorescentes se detectaron utilizando microscopios Leica SP-5 o Zeiss Axio Observer Z1. La producción de ROS fagosómicas se evaluó utilizando el ensayo Fc-OXYBURST Green™ (Invitrogen). Se transfectaron células del RPE humanas subconfluentes con pNull o pAlu, o se trataron con PMA (0,5 pg/ml; Sigma-Aldrich). Las células se incubaron con PBS de Krebs-Ringer (KRP) a 37 oC durante 20 minutos antes de añadir Fc-OXYBURST Green™. La fluorescencia total de las células se midió inmediatamente después de añadir Fc-OXYBURST Green™ con un lector Synergy 4 (Biotek) utilizando un filtro FITC (excitación a 485 nm, emisión a 538 nm).
Inmunoprecipitación de proteína de unión a ARN (RIP): La interacción física entre NLRP3 y ARN Alu se examinó utilizando el kit RNA ChIP-IT siguiendo las instrucciones del fabricante (Active Motif). De manera resumida, se transfectaron células del RPE humanas con pAlu y pNLRP3-FLAG (proporcionado por G. Núñez) y los complejos proteína-ARN se inmunoprecipitaron con anticuerpos contra NLRP3 (Enzo Life Sciences), FLAG (Sigma-Aldrich) o IgG de control (Sigma-Aldrich). El ARN aislado de estos inmunoprecipitados se analizó mediante RT-PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos de Alu.
ELISA. El contenido de citocinas secretadas en medios de cultivo celular acondicionados se analizó utilizando los kits ELISA de IL-1 p e IL-18 humanas (R&D), según las instrucciones del fabricante.
Cribado de TLR. InvivoGen realizó un cribado personalizado de ligandos de TLR utilizando células HEK293 que sobreexpresaban miembros individuales de la familia de TLR acoplado a un sistema indicador AP-1/NF- k B. Las células se estimularon con cada uno de los dos ARN Alu sintetizados mediante transcripción in vitro o un ligando de control positivo específico de TLR.
Estadísticas. Los resultados se expresan como media ± SEM, con p < 0,05 considerado estadísticamente significativo. Las diferencias entre los grupos se compararon utilizando la prueba de la U de Mann-Whitney o la prueba de la t de Student, según corresponda, y se indican los valores de p con 2 colas.
EJEMPLO 2
Se demostró que tanto el ARN Alu transcrito in vitro como un plásmido que codifica Alu (pAlu) inducen la muerte de células del RPE mediante la inducción de la secreción de IL-18, lo que desencadena la señalización dependiente de MyD88 que conduce a la activación de caspasa-3. Se buscó la determinación de las etapas mecanicistas que intervienen en esta vía de muerte celular.
Se sabe que la caspasa-8 activa la caspasa-3 (Stennicke et al. 1998). Por lo tanto, se probó si la inhibición de la caspasa-8 inhibiría la muerte o degeneración de células del RPE inducida por ARN Alu o pAlu. Se descubrió que el péptido inhibidor de la caspasa-8 Z-IETD-FMK, pero no el péptido de control Z-FA-FMK, bloqueaba la degeneración del RPE inducida por pAlu en ratones de tipo salvaje (figura 14). Z-IETD-FMK también inhibió la muerte de células del RPE humanas inducida por ARN Alu (figura 15) o pAlu (figura 16). También se descubrió que la inyección subretiniana de IL-18 recombinante inducía la activación de la caspasa-8, tal como se supervisaba mediante un ensayo fluorométrico, en el RPE de ratones de tipo salvaje (figura 17). Estos datos indican que la IL-18 inducida por ARN Alu o pAlu conduce a la activación de caspasa-8 corriente arriba de la activación de caspasa-3.
Se sabe que MyD88 se une a la proteína del dominio de muerte asociado a Fas (FADD) e induce la apoptosis a través de caspasa 8 (Aliprantis et al. 2000). Por lo tanto, se probó si la ablación de Fas (codificado por CD95) o FasL (codificado por Faslg) inhibiría la muerte o degeneración de células del RPE inducida por ARN Alu, pAlu o IL-18. Se descubrió que ni pAlu (figura 18) ni ARN Alu (figura 19) inducían la degeneración del RPE en ratones CD95-/-(Faslpr). Además, la IL-18 recombinante tampoco indujo la degeneración del RPE en ratones CD95-/-(Faslpr) (figura 20). Asimismo, pAlu (figura 21), ARN Alu (figura 22) e IL-18 (figura 23) no indujeron la degeneración del RPE en ratones Faslg-/-(Faslgld).
Se ha demostrado que ARN Alu induce la degeneración del RPE a través del inflamasoma NLRP3. Debido a que se requiere la activación de NF- k B para la activación de NLRP3 (Bauernfeind et al. 2009; Qiao et al. 2012), se probó si ARN Alu requería NF- k B para inducir la degeneración del RPE. De hecho, se descubrió que ARN Alu no inducía la degeneración del RPE en ratones Nfkbl-/-, lo que confirma que la activación de NF- k B es una etapa crítica en esta vía de muerte celular.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Ratones. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por comités de revisión institucionales y según la Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Visual Research. Se adquirieron ratones de tipo salvaje C57BL/6J, Fas-/- (también conocidos como CD95 o Faslpr), Faslg~A (también conocidos como Fasgld) y Nfkb1~A de Jackson Laboratory. Para todos los procedimientos, la anestesia se consiguió mediante una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de clorhidrato de ketamina (Ft. Dodge Animal Health) y 10 mg/kg de xilazina (Phoenix Scientific), y las pupilas se dilataron con tropicamida tópica al 1 % (Alcon Laboratories).
Fotografía del fondo de ojo. Se tomaron fotografías de la retina de ojos de ratón dilatados con una cámara TRC-50 IX (Topcon) conectada a un sistema de obtención de imágenes digitales (Sony).
Inyección subretiniana. Las inyecciones subretinianas (1 pl) en ratones se realizaron utilizando un Pico-
Inyector (PLI-100, Harvard Apparatus). La transfección in vivo de plásmidos que codifican dos secuencias Alu diferentes (pAlu) o un vector de control vacío (pNull) (Bennett et al., 2008; Kaneko et al., 2011; Shaikh et al., 1997) se consiguió utilizando Neuroporter al 10 % (Genlantis). Se inyectó ARN Alu transcrito in vitro a 0,3 mg/ml.
Tratamientos farmacológicos. Se disolvieron IL-18 recombinante (Medical & Biological Laboratories), inhibidor de caspasa-8 Z-IETD-FMK (R&D Systems), inhibidor de control de caspasa Z-FA-FMK (R&D Systems), inhibidor de IRAK1/4 (Calbiochem), en solución salina tamponada con fosfato (PBS; Sigma-Aldrich) o sulfóxido de dimetilo (DMSO; Sigma-Aldrich), y se inyectaron en el humor vítreo en un volumen total de 1 pl con una microjeringa Exmire de calibre 33 (Ito Corporation).
Cultivo celular. Todos los cultivos celulares se mantuvieron a 37 oC y CO2 al 5 %. Se aislaron células primarias del RPE de ratón, tal como se ha descrito anteriormente (Yang et al., 2009), y se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con FBS al 20 % y concentraciones de antibióticos estándar. Se aislaron células primarias del RPE humanas, tal como se ha descrito anteriormente (Yang et al., 2008), y se mantuvieron en DMEM complementado con FBS al 10 % y antibióticos. Se mantuvieron células HeLa en DMEM complementado con FBS al 20 % y concentraciones de antibióticos estándar. Se cultivaron células THP-1 en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10 % y antibióticos.
Transcripción in vitro de ARN Alu. Se sintetizó una secuencia Alu de 302 nucleótidos aislada del RPE de un ojo humano con atrofia geográfica. Se sometió un plásmido linealizado que contenía esta secuencia Alu con un promotor T7 5' adyacente al kit de transcripción AmpliScribe™ T7-Flash™ (Epicentre), según las instrucciones del fabricante. El ARN tratado con ADNasa se purificó utilizando MEGAclear™ (Ambion) y se supervisó la integridad mediante electroforesis en gel. Esto produce ARN de una sola cadena que se pliegan en una estructura secundaria definida idéntica a los transcritos derivados de Pol III. Cuando se indicó, el ARN transcrito se desfosforiló utilizando fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Invitrogen) y se volvió a purificar mediante precipitación con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico.
Transfección transitoria. Las células del RPE humanas se transfectaron con pUC19, pAlu, ARN Alu, ARNip de VDAC1 sentido (5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3'), ARNip de VDAC2 sentido (5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3'), ARNip de VDAC3 sentido (5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3'), utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante.
Viabilidad celular. Se realizaron ensayos MTS utilizando el ensayo de proliferación celular CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega), según las instrucciones del fabricante.
Actividad de caspasa-8. Los tejidos del RPE se homogeneizaron en tampón de lisis (base Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Eg Ta 1 mM, Triton X-100 al 1 %, NP-40 al 0,5 %, cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa (Roche)). Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un kit de ensayo de Bradford (Bio-Rad) con albúmina de suero bovino como patrón. La actividad de caspasa-3 se midió utilizando el ensayo fluorimétrico de caspasa-8 (R&D), según las instrucciones del fabricante.
Estadísticas. Los resultados se expresan como media ±SEM, con p < 0,05 considerado estadísticamente significativo. Las diferencias entre los grupos se compararon utilizando la prueba de la U de Mann-Whitney o la prueba de la t de Student, según corresponda, y se indican los valores de p con 2 colas.
Procedimientos para la obtención de imágenes de caspasa
Se inyectó ARN Alu o IL-18 recombinante en el espacio subretiniano de ratones de tipo salvaje el día 0. Se inyectó DyeLight782-VAD-FMK3 (ThermoScientific), una sonda que emite fluorescencia en presencia de caspasas bioactivas, en el humor vítreo de ratones de tipo salvaje el día 2 o el día 3 después de la inyección.
Obtención de imágenes con portamuestras plano. A las 24 horas después de la inyección de DyeLight782-VAD-FMK3, se diseccionó el ocular de los ratones, se extrajo la retina neural y se preparó un portamuestras plano con RPE, y se observó bajo un microscopio fluorescente.
Obtención de bioimágenes in vivo en el ojo vivo. A intervalos de 0 a 24 horas después de la inyección de DyeLight782-VAD-FMK3, se tomaron fotografías del fondo de ojo con la cámara Topcon 50IX utilizando el filtro ICG.
A lo largo de este documento, se mencionan diversas referencias, que incluyen las referencias establecidas en la siguiente lista:
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200) Patente US61/432,110, presentada el 12 de enero de 2011.
201) Patente US61/432,948, presentada el 14 de enero de 2011.
202) Patente PCT/US 11/38753, presentada el 1 de junio de 2011.
203) Patente US61/508,867, presentada el 18 de julio de 2011.
204) Patente US61/543,038, presentada el 4 de octubre de 2011.
205) Patente US61/586,427, presentada el 13 de enero de 2012.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Inhibidor de MyD88 para la utilización in vivo en la protección de una célula del RPE contra la degeneración inducida por ARN Alu, en el que
el inhibidor de MyD88 comprende una secuencia seleccionada entre las secuencias de SEQ ID NO: 1, 54 y 55, o en el que el inhibidor de MyD88 es una molécula de ARN de doble cadena que inhibe la expresión de MyD88, de la cual, como mínimo, una cadena comprende una secuencia seleccionada entre las secuencias de SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 y 56.
2. Inhibidor de MyD88 para la utilización, según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de MyD88 es Pepinh-MYD o en el que el inhibidor de MyD88 es una variante dominante negativa o de corte y empalme de MyD88 que carece del exón 2.
3. Inhibidor de IL-18 para la utilización in vivo en la protección de una célula del RPE contra la degeneración inducida por ARN Alu, en el que el inhibidor de IL-18 es un anticuerpo neutralizante contra IL-18, o en el que el inhibidor de IL-18 es una proteína de unión a IL-18, o en el que el inhibidor de IL-18 se selecciona entre los establecidos en la tabla D.
4. Inhibidor de IL-18 para la utilización, según la reivindicación 3, en el que el inhibidor de IL-18 es un anticuerpo que bloquea la unión de IL-18 al receptor de IL-18.
5. Procedimiento para identificar un inhibidor de IL-18, que comprende:
proporcionar una célula transfectada con IL-18;
estimular la célula con ARN Alu o LPS+ATP; y
determinar el efecto de un compuesto de prueba sobre los niveles de MyD88.
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