ES2907744T3

ES2907744T3 - Métodos para la eliminación potenciada de impurezas durante la cromatografía con proteína A

Info

Publication number: ES2907744T3
Application number: ES18842505T
Authority: ES
Inventors: Carl A Beigie
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: KR102753090B1; AU2025263876A1; DK3728288T3; WO2019126554A1; AU2018392697B2; CN118496346A; US20260116916A1; KR20250011233A; CN111712510B; JP7786876B2; US20190233468A1; JP2023145727A; ZA202003440B; CN111712510A; TW201936629A; JP2021506925A; RU2020123917A; US12528835B2; AU2018392697A1; TW202400623A

Abstract

Un método de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc, comprendiendo el método las etapas de: (a) poner en contacto una matriz de cromatografía con proteína A con una muestra que comprende (i) el polipéptido que comprende la región Fc, y (ii) una o más impurezas, en una condición en la que el polipéptido que comprende la región Fc se una a la proteína A; y (b) lavar la matriz con una disolución de lavado, comprendiendo la disolución de lavado uno o ambos de (i) una sal de benzoato a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M y (ii) alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 4% volumen/volumen (v/v), y teniendo la disolución de lavado un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la eliminación potenciada de impurezas durante la cromatografía con proteína A

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de la solicitud provisional estadounidense con n ° de serie 62/609.214, presentada el 21 de diciembre de 2017, y la solicitud provisional estadounidense con n ° de serie 62/694.387, presentada el 5, 2018.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación se refiere a métodos de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo) por medio de cromatografía con proteína A.

ANTECEDENTES

Los anticuerpos, y otras proteínas que contienen una región Fc (tal como las inmunoadhesinas), han encontrado un uso generalizado en aplicaciones farmacéuticas/terapéuticas. El uso de estas moléculas (por ejemplo, en pacientes humanos) necesita una purificación cuidadosa de cualquier contaminante/impureza que puede surgir durante la producción de proteínas. La purificación de proteínas terapéuticas se consigue a menudo utilizando una o más etapas de purificación cromatográfica; un tipo particularmente útil de purificación cromatográfica de proteínas que contienen una región Fc de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo) es la cromatografía con proteína A. Sin embargo, se ha mostrado que las proteínas de célula huésped (HCP) se eluyen conjuntamente con los anticuerpos durante la cromatografía de proteínas en modo de captura convencional (incluyendo la cromatografía con proteína A), lo que puede ser problemático para aplicaciones posteriores de estos anticuerpos. Normalmente se emplean una o más etapas de lavado tras la unión del producto (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc de inmunoglobulina) a la resina de cromatografía antes de la elución. Desafortunadamente, las formulaciones de lavado actuales compuestas de sal y una especie de tamponamiento pueden no ser suficientes para romper la interacción de las HCP y otras impurezas con diversos productos de anticuerpo monoclonal (Acm). El documento WO2011/073389 da a conocer tampones de lavado que comprenden arginina para la eliminación de proteínas de célula huésped.

Por consiguiente, existe una necesidad de métodos de purificación mejorados (por ejemplo, la implementación de nuevas formulaciones de lavado) que reduzcan la concentración/los números de impurezas (por ejemplo, HCP) que purifiquen conjuntamente con anticuerpos (por ejemplo, durante la cromatografía de afinidad con proteína A).

BREVE SUMARIO

Para cumplir las necesidades anteriores y otras, en el presente documento se dan a conocer métodos mejorados de purificación de polipéptidos que contienen una región Fc de una o más impurezas. Estos métodos comprenden poner en contacto una matriz de cromatografía con proteína A con una muestra (por ejemplo, un lisado celular) que comprende (i) un polipéptido que comprende una región Fc y (ii) una o más impurezas, y lavar la matriz con una disolución de lavado que tiene un pH de aproximadamente 4,0-10,0 y que comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico. La presente divulgación se basa, al menos en parte, en el hallazgo sorprendente de que el uso de sal de benzoato (por ejemplo, benzoato de sodio) y/o alcohol bencílico en una disolución de lavado a un pH de aproximadamente 4,0-10,0 durante la cromatografía con proteína A proporciona un aclaramiento superior de impurezas (por ejemplo, impurezas de célula huésped) con respecto a las formulaciones de lavado utilizadas actualmente (véase la figura 1, ejemplo 1). La presente divulgación se basa también, al menos en parte, en el hallazgo de que la inclusión de uno o más componentes adicionales seleccionados de bencenosulfonato (por ejemplo, bencenosulfonato de sodio), ácido caprílico, hexilenglicol y/o arginina puede mejorar adicionalmente el aclaramiento de impurezas cuando se incluyen en la disolución de lavado (véanse las figuras 2 y 3, ejemplo 1).

Por consiguiente, en un aspecto, en el presente documento se proporciona un método de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc, comprendiendo el método las etapas de: (a) poner en contacto una matriz de cromatografía con proteína A con una muestra que comprende (i) el polipéptido que comprende la región Fc y (ii) una o más impurezas, en una condición en la que el polipéptido que comprende la región Fc se una a la proteína A; y (b) lavar la matriz con una disolución de lavado, comprendiendo la disolución de lavado uno o ambos de (i) una sal de benzoato a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M y (ii) alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 4% volumen/volumen (v/v), y teniendo la disolución de lavado un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende: (1) sal de benzoato; (2) alcohol bencílico; o (3) sal de benzoato y alcohol bencílico. En algunas realizaciones, la sal de benzoato está a una concentración de desde aproximadamente 0,1 M hasta aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la sal de benzoato es una sal alcalina de benzoato. En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la sal de benzoato es benzoato de sodio. En algunas realizaciones, el benzoato de sodio está a una concentración de desde aproximadamente 0,1 M hasta aproximadamente 0,3 M. En algunas realizaciones, el benzoato de sodio está a una concentración de aproximadamente 0,3 M. En algunas realizaciones, el benzoato de sodio está a una concentración de aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el alcohol bencílico está a una concentración de desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 4% (v/v). En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el alcohol bencílico está a una concentración de desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 2% (v/v). En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el alcohol bencílico está a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v). En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el alcohol bencílico está a una concentración de aproximadamente el 4% (v/v).

En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la disolución de lavado comprende además un agente de tamponamiento. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento se selecciona de fosfato, tris, arginina, acetato y citrato. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento está a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento está a una concentración de aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento está a una concentración de aproximadamente 500 mM. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 5,0, aproximadamente 6,0, aproximadamente 7,0, aproximadamente 8,0, aproximadamente 9,0 o aproximadamente 10,0.

En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la disolución de lavado comprende además bencenosulfonato de sodio. En algunas realizaciones, el bencenosulfonato de sodio está a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la disolución de lavado comprende además ácido caprílico. En algunas realizaciones, el ácido caprílico está a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la disolución de lavado comprende además hexilenglicol. En algunas realizaciones, el hexilenglicol está a una concentración de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10% (v/v). En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la disolución de lavado comprende además creatina. En algunas realizaciones, la creatina está a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la disolución de lavado comprende además arginina. En algunas realizaciones, la arginina está a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M. En algunas realizaciones, la arginina está a una concentración de aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, la arginina es arginina-HCl. En algunas realizaciones, la disolución de lavado que comprende arginina tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado que comprende arginina tiene un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 10,0. En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la disolución de lavado comprende además una o más sales no de tamponamiento. En algunas realizaciones, la una o más sales no de tamponamiento se seleccionan de cloruro de sodio, bromuro de sodio, cloruro de potasio, bromuro de potasio, cloruro de magnesio, bromuro de magnesio, cloruro de calcio, bromuro de calcio y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la una o más sales no de tamponamiento son cloruro de sodio y/o cloruro de potasio. En algunas realizaciones, la una o más sales no de tamponamiento están a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M.

En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la disolución de lavado es una disolución seleccionada de: (i) una disolución que comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y bicarbonato de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM, que tiene un pH de aproximadamente 10,0; (ii) una disolución que comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2%, arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M y fosfato de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM, que tiene un pH de aproximadamente 9,0; (iii) una disolución que comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), que tiene un pH de aproximadamente 7,0; (iv) una disolución que comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, que tiene un pH de aproximadamente 7,0; (v) una disolución que comprende hexilenglicol a una concentración de aproximadamente el 10% (v/v), benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), que tiene un pH de aproximadamente 7,0; (vi) una disolución que comprende bencenosulfonato a una concentración de aproximadamente 0,5 M, benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), que tiene un pH de aproximadamente 7,0; (vii) una disolución que comprende ácido caprílico a una concentración de aproximadamente 50 mM, benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M y cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, que tiene un pH de aproximadamente 7,0; (viii) una disolución que comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M, que tiene un pH de aproximadamente 6,0; (ix) una disolución que comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M, que tiene un pH de aproximadamente 5,0; (x) una disolución que comprende alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 4% (v/v), que tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10; (xi) una disolución que comprende alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 4% (v/v), que tiene un pH de aproximadamente 9,0; y (xii) una disolución que comprende alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M, que tiene un pH de aproximadamente 5,0.

En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el método comprende además una etapa de lavado de la matriz con una primera disolución antes de lavar la matriz con la disolución de lavado tal como se describió anteriormente. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende un tampón seleccionado de un tampón fosfato, un tampón tris, un tampón acetato, un tampón carbonato, un tampón citrato y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende el tampón a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM. En algunas realizaciones, la primera disolución es un tampón fosfato.

En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el método comprende además una etapa de lavado de la matriz con una segunda disolución tras lavar la matriz con la disolución de lavado tal como se describió anteriormente. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende un tampón seleccionado de un tampón fosfato, un tampón tris, un tampón acetato, un tampón carbonato, un tampón citrato y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende el tampón a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM. En algunas realizaciones, la segunda disolución tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende sustancialmente poca sal o nada de sal.

En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el método comprende además una etapa de poner en contacto la matriz de cromatografía con proteína A con una disolución de elución tras una o más etapas de lavado. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de recoger un eluato que comprende el polipéptido que comprende la región Fc. En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de filtración del eluato por medio de filtración profunda. En algunas realizaciones, el eluato comprende menos de aproximadamente 500 partes por millón (ppm) de la una o más impurezas.

En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la aplicación de los métodos descritos en el presente documento da como resultado que el polipéptido que comprende la región Fc se purifique de la una o más impurezas en un grado mayor que un método correspondiente que carece de la etapa de lavar la matriz con la disolución de lavado. En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la una o más impurezas son proteínas de célula huésped (HCP). En algunas realizaciones, la una o más HCP se seleccionan de fosfolipasas (por ejemplo, fosfolipasa B de tipo 2 putativa), clusterina, serina proteasas, factores de elongación y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula huésped de mamífero. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de ovario de hámster chino (CHO).

En algunas realizaciones, la región Fc es una región Fc humana. En algunas realizaciones, la región Fc humana comprende una región Fc de IgG1, IgG2 o IgG4 humana. En algunas realizaciones, la región Fc es una región Fc de ratón. En algunas realizaciones, la región Fc de ratón comprende una región Fc de IgG1, IgG2 o IgG3 de ratón. En algunas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polipéptido que comprende la región Fc es un anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico.

En algunas realizaciones, uno cualquiera de los métodos anteriores comprende además, antes de poner en contacto la matriz de cromatografía con proteína A con una muestra que comprende (i) el polipéptido que comprende la región Fc y (ii) una o más impurezas, ajustar una recolección que comprende el polipéptido que comprende la región Fc para conseguir una concentración final de una sal de benzoato de entre aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 0,5 M y un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0, por ejemplo, para producir la muestra que comprende (i) el polipéptido que comprende la región Fc, y (ii) una o más impurezas. En algunas realizaciones, la sal de benzoato es una sal alcalina de benzoato. En algunas realizaciones, la sal de benzoato es benzoato de sodio. En algunas realizaciones, la concentración final de la sal de benzoato en la recolección es de entre aproximadamente 0,4 M y aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, el pH de la recolección tras el ajuste es de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 8,0. En algunas realizaciones, el pH de la recolección tras el ajuste es de entre aproximadamente 8,0 y aproximadamente 9,0. En algunas realizaciones, la recolección se genera a partir de un cultivo que comprende una célula huésped modificada mediante ingeniería para expresar el polipéptido. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula huésped eucariota. En algunas realizaciones, la célula huésped eucariota es una célula de ovario de hámster chino (CHO). En algunas realizaciones, la recolección se clarifica antes del ajuste. En algunas realizaciones, la recolección se clarifica tras el ajuste.

En un aspecto relacionado, se proporciona un método de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc, comprendiendo el método las etapas de: (A) ajustar una recolección que comprende el polipéptido que comprende la región Fc para conseguir una concentración final de una sal de benzoato de aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 0,5 M y un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0, por ejemplo, para producir una muestra que comprende (i) el polipéptido que comprende la región Fc, y (ii) una o más impurezas; y (B) poner en contacto la muestra con al menos una matriz de cromatografía. En algunas realizaciones, la al menos una matriz de cromatografía comprende una matriz de cromatografía de afinidad. En algunas realizaciones, la matriz de cromatografía de afinidad es una matriz de cromatografía con proteína A o una matriz de cromatografía con proteína G. En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de poner en contacto la al menos una matriz de cromatografía con al menos una disolución de lavado. En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de poner en contacto la al menos una matriz de cromatografía con una disolución de elución. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de recoger un eluato que comprende el polipéptido que comprende la región Fc. En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de filtración del eluato por medio de filtración profunda. En algunas realizaciones, el eluato comprende menos de aproximadamente 500 partes por millón (ppm) de la una o más impurezas.

En algunas realizaciones, la sal de benzoato es una sal alcalina de benzoato. En algunas realizaciones, la sal de benzoato es benzoato de sodio. En algunas realizaciones, la concentración final de la sal de benzoato en la recolección es de entre aproximadamente 0,4 M y aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, el pH de la recolección tras el ajuste es de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 8,0. En algunas realizaciones, el pH de la recolección tras el ajuste es de entre aproximadamente 8,0 y aproximadamente 9,0. En algunas realizaciones, la recolección se genera a partir de un cultivo que comprende una célula huésped modificada mediante ingeniería para expresar el polipéptido. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula huésped eucariota. En algunas realizaciones, la célula huésped eucariota es una célula de ovario de hámster chino (CHO). En algunas realizaciones, la recolección se clarifica antes del ajuste. En algunas realizaciones, la recolección se clarifica tras el ajuste. En algunas realizaciones, el método da como resultado que el polipéptido que comprende la región Fc se purifique de la una o más impurezas en un grado mayor que un método correspondiente que carece de la etapa de ajustar la recolección que comprende el polipéptido que comprende la región Fc para producir la muestra. En algunas realizaciones, la una o más impurezas son proteínas de célula huésped (HCP). En algunas realizaciones, la una o más HCP se seleccionan del grupo que consiste en fosfolipasas, clusterina, serina proteasas, factores de elongación y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la HCP es fosfolipasa B de tipo 2 putativa (PLBL2). En algunas realizaciones, la región Fc es una región Fc humana. En algunas realizaciones, la región Fc humana comprende una región Fc de IgG1, IgG2 o IgG4 humana. En algunas realizaciones, la región Fc es una región Fc de ratón. En algunas realizaciones, la región Fc de ratón comprende una región Fc de IgG1, IgG2 o IgG3 de ratón. En algunas realizaciones, el polipéptido que comprende la región Fc es un anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico.

Debe entenderse que una, algunas o todas las propiedades de las diversas realizaciones descritas anteriormente y en el presente documento pueden combinarse para formar otras realizaciones de la presente divulgación. Estos y otros aspectos de la presente divulgación resultarán evidentes para un experto en la técnica. Estas y otras realizaciones de la presente divulgación se describen adicionalmente mediante la descripción detallada que sigue.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 muestra la concentración de impurezas de proteína de célula huésped (HCP) de ovario de hámster chino (CHO) en muestras de anticuerpo eluidas de columnas de proteína A tras lavarse con las disoluciones de lavado de prueba o de control indicadas.

Las FIGS. 2A-B muestran las concentraciones de una HCP específica (HCP-A) en muestras de anticuerpo eluidas de columnas de proteína A. La FIG. 2A muestra la concentración de HCP-A en muestras de anticuerpo eluidas de columnas de proteína A tras lavarse con alcohol bencílico al 2% ± benzoato de sodio 0,5 M y/o arginina 0,5 M en comparación con un lavado de control, tal como se evalúa mediante ELISA. La FIG. 2B muestra la concentración de HCP-A en muestras de anticuerpo eluidas de columnas de proteína A tras lavarse con diversas disoluciones de lavado a pH de 9,0 o 10,0 en comparación con un lavado de control, tal como se evalúa mediante ELISA.

La FIG. 3 muestra la concentración de HCP-A en muestras de anticuerpo eluidas de columnas de proteína A tras lavarse con las disoluciones de lavado indicadas que contienen compuestos de prueba adicionales, tal como se evalúa mediante ELISA.

Las FIGS. 4A-B muestran las concentraciones de HCP y PLBL2 genéricas en muestras de anticuerpo eluidas de columnas de proteína A. La FIG. 4A muestra la concentración de HCP genérica en muestras de anticuerpo eluidas de columnas de proteína A tras lavarse con arginina 0,5 M, benzoato de sodio 0,5 M o alcohol bencílico al 4% en comparación con un lavado de control de proceso, tal como se evalúa mediante ELISA. La FIG. 4B muestra la concentración de PLBL2 genérica en muestras de anticuerpo eluidas de columnas de proteína A tras lavarse con arginina 0,5 M, benzoato de sodio 0,5 M o alcohol bencílico al 4% en comparación con un lavado de control de proceso, tal como se evalúa mediante ELISA.

La FIG. 5 muestra la mejora en la claridad visual de muestras de anticuerpo eluidas de columnas de proteína A lavadas con un lavado intermedio que comprende alcohol bencílico al 2% y benzoato de sodio 0,5 M.

Las FIGS. 6A-B muestran la disminución en el rendimiento fuera de la columna y la eliminación de PLBL2 cuando se cargan columnas de proteína A más allá de 40 g/l. La FIG. 6A muestra el porcentaje en el que el rendimiento fuera de la columna disminuye linealmente desde el 93,1% hasta el 78,1% a medida que la densidad de carga de columnas de proteína A aumenta desde 40 g/l hasta 60 g/l. La FIG. 6B muestra que el nivel de PLBL2 eliminada mediante lavado de la columna de proteína A disminuye desde 32,1 ppm hasta 17 ppm a medida que la densidad de carga de columnas de proteína A aumenta desde 40 g/l hasta 60 g/l.

La FIG. 7 muestra que el ajuste de recolección a benzoato de sodio 0,5 M y pH 7,2 o el ajuste de recolección a benzoato de sodio 0,5 M y pH 9 antes de la purificación de proteína A condujo a una eliminación mejorada de impurezas de PLBL2 y HCP. El ajuste de recolección a benzoato de sodio 0,5 M a pH 9,0 mostró el nivel más bajo de impurezas de PLBL2 y HCP y demostró un registro mayor de aclaramiento de PLBL2 en relación con un ajuste de pH solo.

La FIG. 8 muestra que la relación entre el contenido de PLBL2 y la concentración de benzoato de sodio es aproximadamente sigmoidal. Se observaron ganancias disminuidas en el aclaramiento de PLBL2 para concentraciones por encima de benzoato de sodio 0,4 M.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En el presente documento se describen métodos de reducción del número de impurezas (por ejemplo, impurezas de proteína de célula huésped) purificadas conjuntamente durante el aislamiento basado en proteína A de proteínas que contienen región Fc. Los métodos de la presente divulgación aplican una etapa de lavado intermedio que usa una disolución de lavado novedosa que contiene una sal de benzoato y/o alcohol bencílico que se ha mostrado que reduce significativamente los niveles de impurezas de proteína de célula huésped en los eluatos recogidos durante la cromatografía de afinidad con proteína A (véanse los ejemplos 1 y 2). La inclusión de uno o más aditivos (por ejemplo, bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, creatina y/o arginina) en esta disolución de lavado novedosa mejora adicionalmente el aclaramiento de impurezas de un eluato de proteína que contiene una proteína que contiene región Fc tras la captura y la elución de una matriz de proteína A.

I. Definiciones

Antes de describir la presente divulgación en detalle, debe entenderse que esta presente divulgación no está limitada a composiciones o sistemas biológicos particulares, que pueden, naturalmente, variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es con el propósito de describir solo realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa.

Tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una molécula” incluye opcionalmente una combinación de dos o más de tales moléculas, y similares.

El término “aproximadamente” tal como se usa en el presente documento se refiere al rango de error usual para el respectivo valor conocido fácilmente por el experto en la técnica en este campo técnico. La referencia a “aproximadamente” un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren a ese valor o parámetro en sí.

Se entiende que los aspectos y las realizaciones de la presente divulgación descritos en el presente documento incluyen “que comprenden”, “que consisten” y “que consiste esencialmente en” aspectos y realizaciones.

El término “y/o” tal como se usa en el presente documento una frase tal como “A y/o B” pretende incluir tanto A y B; A o B; A (solo); como B (solo). Igualmente, el término “y/o” tal como se usa en el presente documento una frase tal como “A, B y/o C” pretende abarcar cada una de las siguientes realizaciones: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

El término “polipéptido” o “proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento para hacer referencia a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de manera natural o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de etiquetado o toxina. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica.

El término “anticuerpo” se usa en el presente documento en el sentido más amplio, e incluye específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos triespecíficos, etc.), fragmentos de anticuerpo, o polipéptidos sintéticos que portan una o más CDR o secuencias derivadas de CDR siempre que los polipéptidos presenten la actividad deseada. Los anticuerpos (Ac) y las inmunoglobulinas (Ig) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Generalmente, los anticuerpos se consideran Ig con una especificidad definida o reconocida. Por tanto, mientras los anticuerpos presentan especificidad de unión a una diana específica, las inmunoglobulinas incluyen tantos anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad de diana. Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, etc.), o subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG2a, gG3, IgG4, IgA1, IgA2, etc.). El “tipo” y “clase” y “subtipo” y “subclase” se usan de manera intercambiable en el presente documento. Los anticuerpos y las inmunoglobulinas de tipo nativo o silvestre (obtenido de un miembro no manipulado artificialmente de una población) son habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante en el otro extremo. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de animales no humanos (por ejemplo, ratón, rata, hámster, conejo, camélido, etc.) o anticuerpos quiméricos.

El término “variable” en el contexto de un dominio variable de anticuerpos puede hacer referencia a ciertas porciones de la molécula pertinente que difieren extensamente en la secuencia entre y dentro de los anticuerpos, y se usan en el reconocimiento y la unión específicos o un anticuerpo particular para su diana particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente por los dominios variables de anticuerpos. La variabilidad se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables, en los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables se denominan secuencias o regiones de entramado (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, adoptando en gran parte una configuración de lámina p, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas a menudo en proximidad mediante las regiones FR y, con la CDR2 de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a diana (epítopo o determinante) de anticuerpos (véase Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Nation Institute of Health, Betesda, MD (1987)). Tal como se usa en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácido de inmunoglobulina se realiza según el sistema de numeración de residuos de aminoácido de inmunoglobulina de Kabat et al., a menos que se indique lo contrario. Una CDR puede portar la capacidad de unirse específicamente al epítopo semejante.

El término “bisagra” o “región bisagra” tal como se usa en el presente documento puede hacer referencia al polipéptido flexible que comprende el aminoácido entre los dominios constantes primero y segundo de un anticuerpo.

El término “anticuerpos biespecíficos” puede hacer referencia a moléculas que combinan los sitios de unión a antígeno de dos anticuerpos dentro de una única molécula. Por tanto, un anticuerpo biespecífico es capaz de unirse a dos antígenos diferentes simultáneamente.

El término “anticuerpo monoclonal” usado en el presente documento puede hacer referencia a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se produzcan de manera natural que puedan estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” en los que una porción de las cadenas pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, con el resto de la(s) cadena(s) idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que conserven la actividad deseada.

El término “anticuerpo multivalente” o “anticuerpo polivalente” tal como se usa en el presente documento puede hacer referencia a un anticuerpo que comprende dos o más sitios de unión a antígeno, siendo por tanto capaz de unirse a dos o más antígenos, que pueden la misma estructura o una diferente, simultáneamente. El término “bivalente” significa que el anticuerpo comprende dos sitios de unión a antígeno. El término “tetravalente” significa que el anticuerpo comprende cuatro sitios de unión a antígeno.

El término “sitio de unión a antígeno” tal como se usa en el presente documento puede hacer referencia a la porción del anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria a parte de o un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo puede solo unirse a una parte particular del antígeno, parte que de denomina epítopo. Un dominio de unión a antígeno puede proporcionarse por uno o más dominios variables de anticuerpo, y puede componerse de la asociación de un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH).

Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas que contienen secuencias derivadas de inmunoglobulina no humana, en comparación con un anticuerpo humano. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia molde de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender también al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, normalmente la del molde de inmunoglobulina humana elegido. En general, el propósito es tener una molécula de anticuerpo que sea mínimamente inmunogénica en un humano. Por tanto, es posible que uno o más aminoácidos en una o más CDR también puedan cambiarse por uno que sea menos inmunogénico para un huésped humano, sin minimizar sustancialmente la función de unión específica de la una o más CDR a la diana. Alternativamente, la FR puede ser no humana pero aquellos aminoácidos más inmunogénicos se reemplazan por unos menos inmunogénicos. No obstante, el injerto de c Dr (tal como se describió anteriormente) no es la única manera de obtener un anticuerpo humanizado. Por ejemplo, modificar solo las regiones CDR puede ser insuficiente, ya que no es poco común que residuos de entramado tengan un papel a la hora de determinar la estructura tridimensional de los bucles de CDR y la afinidad global del anticuerpo por su ligando. Por tanto, puede ponerse en práctica cualquier medio de modo que las moléculas de anticuerpo parental no humanas se modifiquen a una que sea menos inmunogénica para un humano, y la identidad de secuencia global con un anticuerpo humano no es siempre necesaria.

El término “impureza” puede hacer referencia a cualquier molécula extraña o no deseable que esté presente en una disolución (tal como una muestra que comprende un polipéptido que comprende una región Fc). Una impureza puede ser una (molécula) biológica (por ejemplo, una macromolécula) tal como ADN, ARN o proteína que está también presente en una muestra que contiene una proteína de interés. Las impurezas pueden incluir variantes de proteína no deseables (por ejemplo, proteínas agregadas, proteínas con plegado erróneo, proteínas con enlace disulfuro insuficiente, fragmentos, etc.), otras proteínas de células huésped, componentes de medio de cultivo celular, moléculas que forman parte de un absorbente usado para la cromatografía de afinidad (por ejemplo, proteína A), endotoxinas, ácidos nucleicos, virus, etc.

II. Métodos de aislamiento y/o de purificación de polipéptidos que contienen región FC

Resumen

Ciertos aspectos de la presente divulgación se refieren a un método de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo) por medio de cromatografía con proteína A. En algunas realizaciones, el método comprende las etapas de: poner en contacto una resina o matriz de cromatografía con proteína A con una muestra que comprende (1) un polipéptido que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo) y (2) una o más impurezas (por ejemplo, impurezas de célula huésped) en una condición en la que el polipéptido que comprende la región Fc (por ejemplo, el anticuerpo) se una a proteína A; y lavar la matriz con una disolución de lavado que comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende la sal de benzoato a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende el alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 4% volumen/volumen (v/v). En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende uno o más aditivos (por ejemplo, uno o más de bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento (tal como cloruro de sodio), creatina y/o arginina). En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende además un agente de tamponamiento. En algunas realizaciones, una recolección que comprende el polipéptido que comprende una región Fc se ajusta para conseguir una concentración final de una sal de benzoato de entre aproximadamente 0,1 M y 0,5 M y un pH de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 9 para producir la muestra que comprende (1) un polipéptido que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo) y (2) una o más impurezas (por ejemplo, impurezas de célula huésped).

Poner en contacto una muestra con una resina o matriz de proteína A

Ciertos aspectos de la presente divulgación se refieren a métodos de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo) por medio de cromatografía con proteína A. En algunas realizaciones, el método comprende una etapa de: poner en contacto una resina o matriz de cromatografía con proteína A con una muestra que comprende (1) un polipéptido que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo) y (2) una o más impurezas (por ejemplo, impurezas de célula huésped) en una condición en la que el polipéptido que comprende la región Fc (por ejemplo, el anticuerpo) se una a proteína A.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a métodos de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo, una inmunoadhesina, una proteína de fusión, etc.) de una muestra (por ejemplo, una muestra de lisado celular, una muestra de sobrenadante de cultivo celular, etc.). En algunas realizaciones, la muestra es un sobrenadante de cultivo celular (por ejemplo, un sobrenadante de células, tales como células CHO, modificadas mediante ingeniería para producir y secretar el polipéptido), o se deriva de un sobrenadante de cultivo celular (por ejemplo, una muestra de sobrenadante de cultivo celular parcialmente purificada). En algunas realizaciones, el polipéptido que comprende una región Fc es un polipéptido secretado. En algunas realizaciones, la región Fc es la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, y puede incluir regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de cadena pesada de IgG humana se define habitualmente como que se extiende desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo-terminal de la misma (la numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU tal como en Kabat). La región Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, CH2 y CH3, y comprende opcionalmente un dominio CH4. En algunas realizaciones, la región Fc es una región Fc obtenida de cualquier inmunoglobulina adecuada, tal como los subtipos IgG1 lgG2, lgG3 o lgG4, IgA, IgE, IgD o IgM. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una región Fc que tiene la secuencia de aminoácidos de una región Fc humana, una región Fc de animal no humano (por ejemplo, un ratón, rata, conejo, hámster, etc.), o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la región Fc es una región Fc de ratón. En algunas realizaciones, la región Fc de ratón comprende una región Fc de IgG 1, IgG2 o IgG3 de ratón. En algunas realizaciones, la región Fc es una región Fc humana. En algunas realizaciones, la región Fc humana comprende una región Fc de IgG 1, IgG2 y/o IgG4 humana.

En algunas realizaciones, el polipéptido que comprende una región Fc es un anticuerpo. En algunas realizaciones, “anticuerpo” se usa en el presente documento en el sentido más amplio, y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes (por ejemplo, bivalentes, trivalentes, tetravalentes, etc.), y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos, triespecíficos, etc.). Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen, incluyendo, por ejemplo, humanos, primates no humanos, roedores (por ejemplo, ratón, rata, hámster, etc.), conejos, camélidos, tiburones y/o producidos de manera recombinante. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y/o un anticuerpo quimérico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico y/o multivalente. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico.

En algunas realizaciones, la muestra (por ejemplo, una muestra de lisado celular, una muestra de sobrenadante de cultivo celular, etc.) que comprende el polipéptido que comprende una región Fc comprende además una de más impurezas. En algunas realizaciones, la una o más impurezas están presentes en la muestra debido al proceso empleado para producir el polipéptido que comprende la región Fc (por ejemplo, el proceso de producción de un anticuerpo secretado). En algunas realizaciones, la una o más impurezas son una o más impurezas derivadas de una célula huésped (por ejemplo, una o más proteínas de célula huésped, uno o más ácidos nucleicos de célula huésped, uno o más lípidos de célula huésped, etc.). La célula huésped puede ser cualquier célula huésped conocida en técnica adecuada para la producción de un polipéptido que comprende una región Fc, incluyendo, por ejemplo, células procariotas (tal como células de E. coli, células de A. niger, etc.), células eucariotas (tal como células de levadura, células vegetales, células de insecto (por ejemplo, células S1) y/o células de mamífero (ratón, rata, hámster, conejo, humano, primate no humano, etc.) (por ejemplo, hibridomas, células CHO, células T293, células PER.C6, células NS0, etc.). En algunas realizaciones, la una o más impurezas son una o más proteínas de célula huésped (HCP). En algunas realizaciones, una HCP se refiere a una proteína no de producto producida por una célula huésped durante el cultivo o la fermentación celulares. En algunas realizaciones, la una o más impurezas son una o más (por ejemplo, una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, etc.) proteínas de célula huésped (HCP) seleccionadas de fosfolipasas, clusterina, serina proteasas, factores de elongación y/o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula CHO. En algunas realizaciones, la una o más impurezas son una o más HCP de célula CHO. En algunas realizaciones, la una o más HCP de célula CHO son uno o más de fosfolipasas, clusterina, serina proteasas, factores de elongación y/o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a métodos de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc de una o más impurezas en una muestra por medio de cromatografía con proteína A. En algunas realizaciones, la muestra se pone en contacto con una resina o matriz de proteína A. En algunas realizaciones, la muestra se pone en contacto con la resina o matriz de proteína A en condiciones adecuadas para que el polipéptido que comprende la región Fc en la muestra se una a proteína A. Métodos y condiciones adecuadas para poner en contacto y unir un polipéptido que contiene región Fc a una resina o matriz de proteína A se entienden fácilmente por un experto habitual en la técnica (por ejemplo, métodos tal como se describen en el protocolo del fabricante de una resina o matriz de proteína A disponible comercialmente). Cualquier resina o matriz de proteína A adecuada conocida en la técnica puede usarse en los métodos de la presente divulgación, incluyendo, por ejemplo: MabSelect, MabSelect Xtra, MabSelect Sure, MabSelect Sure LX Protein A, MabSelect pcc, MabSelect PrismA, rProtein A Sepharose CL-4B y nProtein A Sepharose 4 FF (GE Healthcare); EshmunoA, ProSep A, ProSep-vA High Capacity, ProSep-vA Ultra y ProSep-vA UltraPlus (Millipore); Poros A y Mabcapture A (Poros); iPa -300, IPA-400 e IPA-500 (RepliGen Corp.); Affigel protein A y Affiprep protein A (Bio-Rad); MABsorbent A1PP y MABsorbent A2P (Affinity Chromatography Ltd.); Protein A Ceramic Hyper D F (Pall Corp.); Ultralink Immobilized protein A y Agarose Protein A (PIERCE); Protein A Cellthru 300 y Protein A Ultraflow (Bioseparation); Amsphere A3 (JSR); y/o Toyopearl AF-rProtein A HC-650F (Tosoh Biosciences). En algunas realizaciones, la resina o matriz de proteína A se usa en un formato de cromatografía en columna. En algunas realizaciones, uno o más parámetros de la resina o matriz de proteína A (tal como pH, fuerza iónica, temperatura, la adición de otras sustancias) se ajustan antes de poner en contacto la resina o matriz de proteína A con una muestra. En algunas realizaciones, la resina o matriz de proteína A se enjuaga, se lava, se equilibra, se somete a arrastre y/o se higieniza antes y/o después de poner en contacto la resina o matriz de proteína A con la muestra. En algunas realizaciones, la resina o matriz de proteína A se equilibra y/o se lava antes de poner en contacto la resina o matriz de proteína A con la muestra. Puede usarse cualquier tampón de equilibrado y/o de lavado adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, la resina o matriz de proteína A se higieniza, se somete a arrastre y/o se regenera entre usos.

Lavar la resina o matriz de proteína A con una disolución de lavado

Ciertos aspectos de la presente divulgación se refieren a métodos de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc por medio de cromatografía con proteína A lavando una resina o matriz de proteína A unida al polipéptido que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo) con una disolución de lavado que comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico. En algunas realizaciones, el método comprende una etapa de: poner en contacto una resina o matriz de cromatografía con proteína A con una muestra que comprende (1) un polipéptido que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo) y (2) una o más impurezas (por ejemplo, impurezas de célula huésped) en una condición en la que el polipéptido que comprende la región Fc (por ejemplo, el anticuerpo) se una a proteína A; y lavar la matriz o resina con una disolución de lavado que comprende una sal de benzoato a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M y/o alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 4% volumen/volumen (v/v), teniendo la disolución de lavado un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende alcohol bencílico. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato y alcohol bencílico.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a una disolución de lavado que comprende una sal de benzoato y/o ácido benzoico (por ejemplo, ajustado en cuanto al pH). Cualquier fuente o forma adecuada de una sal de benzoato (por ejemplo, una sal alcalina) y/o ácido benzoico conocida en la técnica puede usarse en las disoluciones de lavado de la presente divulgación, incluyendo, por ejemplo, benzoato de sodio, benzoato de potasio, benzoato de litio, benzoato de calcio, benzoato de magnesio, benzoato de berilio, benzoato de bario, benzoato de estroncio, benzoato de rubidio, benzoato de cesio y/o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la sal de benzoato es una sal alcalina de benzoato. En algunas realizaciones, la sal de benzoato es benzoato de sodio o benzoato de potasio. En algunas realizaciones, la sal de benzoato es benzoato de sodio.

En algunas realizaciones, la sal de benzoato (por ejemplo, benzoato de sodio) y/o ácido benzoico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M. Por ejemplo, la sal de benzoato (por ejemplo, benzoato de sodio) y/o ácido benzoico puede estar presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,9 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,7 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,6 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,5 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,4 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,3 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,2 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,9 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,7 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,6 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,5 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,4 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,3 M, de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,9 M, de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,7 M, de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,6 M, de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,5 M, de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,4 M, de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,9 M, de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,7 M, de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,6 M, de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,5 M, de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 0,9 M, de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 0,7 M, de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 0,6 M, de aproximadamente 0,6 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,6 M a aproximadamente 0,9 M, de aproximadamente 0,6 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,6 M a aproximadamente 0,7 M, de aproximadamente 0,7 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,7 M a aproximadamente 0,9 M, de aproximadamente 0,7 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,8 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,8 M a aproximadamente 0,9 M o de aproximadamente 0,9 M a aproximadamente 1,0 M. En algunas realizaciones, la sal de benzoato (por ejemplo, benzoato de sodio) y/o ácido benzoico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, la sal de benzoato (por ejemplo, benzoato de sodio) y/o ácido benzoico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,3 M.

En algunas realizaciones, la sal de benzoato (por ejemplo, benzoato de sodio) y/o ácido benzoico está presente en la disolución de lavado a una concentración de cualquiera de aproximadamente 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,55 M, 0,6 M, 0,65 M, 0,7 M, 0,75 M, 0,8 M, 0,85 M, 0,9 M, 0,95 M o 1,0 M. En algunas realizaciones, la sal de benzoato (por ejemplo, benzoato de sodio) y/o ácido benzoico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, la sal de benzoato (por ejemplo, benzoato de sodio) y/o ácido benzoico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M o menos de aproximadamente 0,1 M, aproximadamente 0,3 M o menos de aproximadamente 0,3 M, aproximadamente 0,5 M o menos de aproximadamente 0,5 M, aproximadamente 0,75 M o menos de aproximadamente 0,75 M, o aproximadamente 1,0 M o menos de aproximadamente 1,0 M. En algunas realizaciones, la sal de benzoato (por ejemplo, benzoato de sodio) y/o ácido benzoico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,5 M o menos de aproximadamente 0,5 M.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a una disolución de lavado que comprende alcohol bencílico. Cualquier fuente o forma adecuada de alcohol bencílico conocida en la técnica puede usarse en las disoluciones de lavado de la presente divulgación.

En algunas realizaciones, el alcohol bencílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 4,0% volumen/volumen (v/v). Por ejemplo, el alcohol bencílico puede estar presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 4%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 4%, de aproximadamente el 1,5% a aproximadamente el 4%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 4%, de aproximadamente el 2,5% a aproximadamente el 4%, de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 4%, de aproximadamente el 3,5% a aproximadamente el 4%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 3,5%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 3,5%, de aproximadamente el 1,5% a aproximadamente el 3,5%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 3,5%, de aproximadamente el 2,5% a aproximadamente el 3,5%, de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 3,5%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 3%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 3%, de aproximadamente el 1,5% a aproximadamente el 3%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 3%, de aproximadamente el 2,5% a aproximadamente el 3%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 2,5%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 2,5%, de aproximadamente el 1,5% a aproximadamente el 2,5%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 2,5%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 2%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 2%, de aproximadamente el 1,5% a aproximadamente el 2%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 1,5%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 1,5% o de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 1% (v/v). En algunas realizaciones, el alcohol bencílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 4% volumen/volumen (v/v). En algunas realizaciones, el alcohol bencílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 2% volumen/volumen (v/v).

En algunas realizaciones, el alcohol bencílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de cualquiera de aproximadamente el 0,5%, el 0,75%, el 1%, el 1,25%, el 1,5%, el 1,75%, el 2%, el 2,25%, el 2,5%, el 2,75%, el 3%, el 3,25%, el 3,5%, el 3,75% o aproximadamente el 4% (v/v). En algunas realizaciones, el alcohol bencílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v). En algunas realizaciones, el alcohol bencílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 1% o menos de aproximadamente el 1%, aproximadamente el 2% o menos de aproximadamente el 2%, aproximadamente el 3% o menos de aproximadamente el 3%, o aproximadamente el 4% o menos de aproximadamente el 4%. En algunas realizaciones, el alcohol bencílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 4% o menos de aproximadamente el 4% (v/v). En algunas realizaciones, el alcohol bencílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 4% o menos de aproximadamente el 2% (v/v).

Aditivos

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende además uno o más (por ejemplo, uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, o los cinco) de los siguientes aditivos: bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y/o creatina a cualquiera de las concentraciones descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, la disolución de lavado que comprende el uno o más aditivos tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0. En algunas realizaciones, la inclusión del uno o más aditivos en la disolución de lavado mejora adicionalmente la purificación de un polipéptido que comprende una región Fc de una o más impurezas (por ejemplo, impurezas de célula huésped) mediante los métodos descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico y uno de bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y/o creatina a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0. Por ejemplo, la disolución de lavado puede comprender: sal de benzoato y/o alcohol bencílico y bencenosulfonato; sal de benzoato y/o alcohol bencílico y ácido caprílico; sal de benzoato y/o alcohol bencílico y hexilenglicol; sal de benzoato y/o alcohol bencílico y una sal no de tamponamiento; o sal de benzoato y/o alcohol bencílico y creatina, a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0.

En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico y dos de bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y/o creatina a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0. Por ejemplo, la disolución de lavado puede comprender: sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato y ácido caprílico; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato y hexilenglicol; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, ácido caprílico y hexilenglicol; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, ácido caprílico y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, ácido caprílico y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, hexilenglicol y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, hexilenglicol y creatina; o sal de benzoato y/o alcohol bencílico, una sal no de tamponamiento y creatina, a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0.

En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico y tres de bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y/o creatina a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0. Por ejemplo, la disolución de lavado puede comprender: sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato, ácido caprílico y hexilenglicol; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato, ácido caprílico y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato, ácido caprílico y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato, hexilenglicol y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato, hexilenglicol y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato, una sal no de tamponamiento y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, ácido caprílico, hexilenglicol y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, ácido caprílico, hexilenglicol y creatina; o sal de benzoato y/o alcohol bencílico, ácido caprílico, una sal no de tamponamiento y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y creatina, a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0.

En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico y cuatro de bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y/o creatina a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0. Por ejemplo, la disolución de lavado puede comprender: sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato, ácido caprílico, una sal no de tamponamiento y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, bencenosulfonato, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y creatina; o sal de benzoato y/o alcohol bencílico, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y creatina, a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0.

En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico y los cinco de bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y creatina a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a una disolución de lavado que comprende bencenosulfonato. Cualquier forma o fuente adecuada de bencenosulfonato conocida en la técnica puede usarse en las disoluciones de lavado de la presente divulgación, incluyendo, por ejemplo, una sal de bencenosulfonato (por ejemplo, una sal alcalina) tal como bencenosulfonato de sodio o bencenosulfonato de potasio, ácido bencenosulfónico y/o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el bencenosulfonato es bencenosulfonato de sodio.

En algunas realizaciones, el bencenosulfonato (por ejemplo, bencenosulfonato de sodio) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,5 M. Por ejemplo, el bencenosulfonato de sodio puede estar presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,5 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,4 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,3 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,2 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,5 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,4 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,3 M, de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,5 M, de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,4 M o de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, el bencenosulfonato de sodio está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,3 M.

En algunas realizaciones, el bencenosulfonato de sodio está presente en la disolución de lavado a una concentración de cualquiera de aproximadamente 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M o 0,5 M. En algunas realizaciones, el bencenosulfonato de sodio está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, el bencenosulfonato de sodio está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M o menos de aproximadamente 0,1 M, aproximadamente 0,3 M o menos de aproximadamente 0,3 M, o aproximadamente 0,5 M o menos de aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, el bencenosulfonato de sodio está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,5 M o menos de aproximadamente 0,5 M.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a una disolución de lavado que comprende ácido caprílico. Cualquier forma o fuente adecuada de ácido caprílico conocida en la técnica puede usarse en las disoluciones de lavado de la presente divulgación.

En algunas realizaciones, el ácido caprílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM. Por ejemplo, el ácido caprílico puede estar presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM o de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM. En algunas realizaciones, el ácido caprílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM.

En algunas realizaciones, el ácido caprílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de cualquiera de aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM o 50 mM. En algunas realizaciones, el ácido caprílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, el ácido caprílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 10 mM o menos de aproximadamente 10 mM, aproximadamente 30 mM o menos de aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 50 mM o menos de aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, el ácido caprílico está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 50 mM o menos de aproximadamente 50 mM.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a una disolución de lavado que comprende hexilenglicol. Cualquier forma o fuente adecuada de hexilenglicol conocida en la técnica puede usarse en las disoluciones de lavado de la presente divulgación.

En algunas realizaciones, el hexilenglicol está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 10% (v/v). Por ejemplo, el hexileno puede estar presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 10%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 10%, de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 10%, de aproximadamente el 6% a aproximadamente el 10%, de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 10%, de aproximadamente el 9% a aproximadamente el 10%, del 0,5% a aproximadamente el 9%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 9%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 9%, de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 9%, de aproximadamente el 6% a aproximadamente el 9%, de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 9%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 8%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 8%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 8%, de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 8%, de aproximadamente el 6% a aproximadamente el 8%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 6%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 6%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 6%, de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 6%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 4%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 4%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 4%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 2%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 2% o de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 1% (v/v). En algunas realizaciones, el hexilenglicol está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10% (v/v).

En algunas realizaciones, el hexilenglicol está presente en la disolución de lavado a una concentración de cualquiera de aproximadamente el 0,5%, el 1%, el 1,5%, el 2%, el 2,5%, el 3%, el 3,5%, el 4%, el 4,5%, el 5%, el 5,5%, el 6%, el 6,5%, el 7%, el 7,5%, el 8%, el 8,5%, el 9%, el 9,5% o el 10% (v/v). En algunas realizaciones, el hexilenglicol está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 10% (v/v). En algunas realizaciones, el hexilenglicol está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 1% o menos de aproximadamente el 1%, aproximadamente el 2% o menos de aproximadamente el 2%, aproximadamente el 4% o menos de aproximadamente el 4%, aproximadamente el 6% o menos de aproximadamente el 6%, aproximadamente el 8% o menos de aproximadamente el 8%, o aproximadamente el 10% o menos de aproximadamente el 10% (v/v). En algunas realizaciones, el hexilenglicol está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente el 10% o menos de aproximadamente el 10% (v/v).

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a una disolución de lavado que comprende una o más (por ejemplo, una o, dos o más, tres o más, etc.,) sales no de tamponamiento. Cualquier forma o fuente adecuada de una sal no de tamponamiento conocida en la técnica puede usarse en las disoluciones de lavado de la presente divulgación. Las sales no de tamponamiento pueden incluir sales de halógeno (tales como aquellas que comprenden Cl o Br), en particular sales de halógeno que comprenden metales alcalinos (tales como Na o K) o metales alcalinotérreos (tales como Ca o Mg). En algunas realizaciones, la sal no de tamponamiento es cloruro de sodio o cloruro de potasio. En algunas realizaciones, la sal no de tamponamiento es cloruro de sodio.

En algunas realizaciones, la sal no de tamponamiento (por ejemplo, cloruro de sodio) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M. Por ejemplo, la sal no de tamponamiento (por ejemplo, cloruro de sodio) puede estar presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,6 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,5 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,4 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,2 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,6 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,5 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,4 M, de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,6 M, de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,5 M, de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 0,6 M, de aproximadamente 0,6 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,6 M a aproximadamente 0,8 M o de aproximadamente 0,8 M a aproximadamente 1,0 M. En algunas realizaciones, la sal no de tamponamiento (por ejemplo, cloruro de sodio) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, la sal no de tamponamiento (por ejemplo, cloruro de sodio) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,0 M.

En algunas realizaciones, la sal no de tamponamiento (por ejemplo, cloruro de sodio) está presente en la disolución de lavado a una concentración de cualquiera de aproximadamente 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,55 M, 0,6 M, 0,65 M, 0,7 M, 0,75 M, 0,8 M, 0,85 M, 0,9 M, 0,95 M o 1,0 M. En algunas realizaciones, la sal no de tamponamiento (por ejemplo, cloruro de sodio) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, la sal no de tamponamiento (por ejemplo, cloruro de sodio) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 1,0 M. En algunas realizaciones, la sal no de tamponamiento (por ejemplo, cloruro de sodio) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M o menos de aproximadamente 0,1 M, aproximadamente 0,2 M o menos de aproximadamente 0,2 M, aproximadamente 0,4 M o menos de aproximadamente 0,4 M, aproximadamente 0,5 M o menos de aproximadamente 0,5 M, aproximadamente 0,6 M o menos de aproximadamente 0,6 M, aproximadamente 0,8 M o menos de aproximadamente 0,8 M, o aproximadamente 1,0 M o menos de aproximadamente 1,0 M. En algunas realizaciones, la sal no de tamponamiento (por ejemplo, cloruro de sodio) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,5 M o menos de aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, la sal no de tamponamiento (por ejemplo, cloruro de sodio) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 1,0 M o menos de aproximadamente 1,0 M.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a una disolución de lavado que comprende creatina. Cualquier forma o fuente adecuada de creatina conocida en la técnica puede usarse en las disoluciones de lavado de la presente divulgación, incluyendo, por ejemplo, creatina-HCl, ésteres de creatina, piruvato de creatina, fosfato de creatina, alfa-cetoglutarato de creato, citrato de creatina y/o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la creatina es creatina-HCl.

En algunas realizaciones, la creatina está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM. Por ejemplo, la creatina puede estar presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 75 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 25 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 25 mM o de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM. En algunas realizaciones, la creatina está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, la creatina está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la creatina está presente en la disolución de lavado a una concentración de cualquiera de aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM o 100 mM. En algunas realizaciones, la creatina está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 50 mM.

Arginina

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a una disolución de lavado que comprende además arginina y/o un derivado de arginina. En algunas realizaciones, la inclusión de arginina y/o un derivado de arginina en la disolución de lavado mejora adicionalmente la purificación de un polipéptido que comprende una región Fc de una o más impurezas (por ejemplo, impurezas de célula huésped) mediante los métodos descritos en el presente documento. Cualquier forma o fuente adecuada de arginina y/o un derivado de arginina conocida en la técnica puede usarse en las disoluciones de lavado de la presente divulgación, incluyendo, por ejemplo, arginina, arginina-HCl, acetilarginina, agmatina, ácido argínico, N-alfa-butiroil-L-arginina, N-alfa-pivaloilarginina y/o cualquier combinación de los mismos. La arginina y/o el derivado de arginina puede ser L-arginina y/o D-arginina, y derivados de las mismas. En algunas realizaciones, la arginina y/o el derivado de arginina es arginina-HCl.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere al uso de arginina y/o un derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl) en una disolución de lavado que comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato y arginina y/o un derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl). En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende alcohol bencílico y arginina y/o un derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl). En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato, alcohol bencílico, y arginina y/o un derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl). En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende además uno o más (por ejemplo, uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, o los cinco) de bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y/o creatina a cualquiera de las concentraciones descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, una disolución de lavado que comprende arginina y/o un derivado de arginina tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0. En algunas realizaciones, una disolución de lavado que comprende arginina y/o un derivado de arginina tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,0. En algunas realizaciones, una disolución de lavado que comprende arginina y/o un derivado de arginina tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0. En algunas realizaciones, una disolución de lavado que comprende arginina y/o un derivado de arginina tiene un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 10,0. En algunas realizaciones, una disolución de lavado que comprende arginina y/o un derivado de arginina tiene un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 9,0.

En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina y/o un derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl), y uno de bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y/o creatina. Por ejemplo, la disolución de lavado puede comprender: sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina y bencenosulfonato; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina y ácido caprílico; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina y hexilenglicol; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina y una sal no de tamponamiento; o sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina y creatina.

En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina y/o un derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl), y dos de bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y/o creatina. Por ejemplo, la disolución de lavado puede comprender: sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato y ácido caprílico; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato y hexilenglicol; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, ácido caprílico y hexilenglicol; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, ácido caprílico y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, ácido caprílico y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, hexilenglicol y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, hexilenglicol y creatina; o sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, una sal no de tamponamiento y creatina.

En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina y/o un derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl), y tres de bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y/o creatina. Por ejemplo, la disolución de lavado puede comprender: sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato, ácido caprílico y hexilenglicol; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato, ácido caprílico y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato, ácido caprílico y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato, hexilenglicol y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato, hexilenglicol y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato, una sal no de tamponamiento y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, ácido caprílico, hexilenglicol y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, ácido caprílico, hexilenglicol y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, ácido caprílico, una sal no de tamponamiento y creatina; o sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y creatina.

En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina y/o un derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl), y cuatro de bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y/o creatina. Por ejemplo, la disolución de lavado puede comprender: sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol y una sal no de tamponamiento; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato, ácido caprílico, una sal no de tamponamiento y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, bencenosulfonato, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y creatina; sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y creatina.

En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico, arginina y/o un derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl), y los cinco de bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol, una sal no de tamponamiento y creatina.

En algunas realizaciones, la arginina y/o el derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M. Por ejemplo, la arginina y/o el derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl) puede estar presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,9 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,7 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,6 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,5 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,4 M de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,3 M, de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,2 M de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,9 M de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,7 M de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,6 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,5 M de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,4 M, de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,3 M de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,9 M de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,7 M de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,6 M, de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,5 M de aproximadamente 0,3 M a aproximadamente 0,4 M, de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 1,0 M de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,9 M, de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,8 M de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,7 M, de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,6 M de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,5 M, de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,0 M de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 0,9 M, de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 0,8 M de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 0,7 M, de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 0,6 M de aproximadamente 0,6 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,6 M a aproximadamente 0,9 M de aproximadamente 0,6 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,6 M a aproximadamente 0,7 M de aproximadamente 0,7 M a aproximadamente 1,0 M, de aproximadamente 0,7 M a aproximadamente 0,9 M de aproximadamente 0,7 M a aproximadamente 0,8 M, de aproximadamente 0,8 M a aproximadamente 1,0 M de aproximadamente 0,8 M a aproximadamente 0,9 M o de aproximadamente 0,9 M a aproximadamente 1,0 M. En algunas realizaciones, la arginina y/o el derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, la arginina y/o el derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,3 M.

En algunas realizaciones, la arginina y/o el derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl) está presente en la disolución de lavado a una concentración de cualquiera de aproximadamente 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,55 M, 0,6 M, 0,65 M, 0,7 M, 0,75 M, 0,8 M, 0,85 M, 0,9 M, 0,95 M o 1,0 M. En algunas realizaciones, la arginina y/o el derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, la arginina y/o el derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,1 M o menos de aproximadamente 0,1 M, aproximadamente 0,2 M o menos de aproximadamente 0,2 M, aproximadamente 0,3 M o menos de aproximadamente 0,3 M, aproximadamente 0,4 M o menos de aproximadamente 0,4 M, aproximadamente 0,5 M o menos de aproximadamente 0,5 M, aproximadamente 0,75 M o menos de aproximadamente 0,75 M, o aproximadamente 1,0 M o menos de aproximadamente 1,0 M. En algunas realizaciones, la arginina y/o el derivado de arginina (por ejemplo, arginina-HCl) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 0,5 M o menos de aproximadamente 0,5 M.

pH

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a una disolución de lavado que tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0. Por ejemplo, la disolución de lavado puede tener un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 10,0, de 4,0 a aproximadamente 9,0 , de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9.0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,0 de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9.0, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,0 de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 9.0, de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 9,0, de 4,0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0, de 4,0 a aproximadamente 7,5 de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7.5, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,5 de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7.5, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,5 de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7.0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0 de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7.0, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,0, de 4,0 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,5, de 4,0 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0 o de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 10,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 9,0.

En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de cualquiera de aproximadamente 4,0, 4,25, 4,5, 4,75, 5,0, 5,25, 5,5, 5,75, 6,0, 6,25, 6,5, 6,75, 7,0, 7,25, 7,5, 7,75, 8,0, 8,25, 8,5, 8,75, 9,0, 9,25, 9,5, 9,75 o 10,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 4,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 5,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 6,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 6,5. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 7,5. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 9,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado tiene un pH de aproximadamente 10,0.

Agente de tamponamiento

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende además uno o más (por ejemplo, uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, etc.,) agentes de tamponamiento. Cualquier agente de tamponamiento adecuado conocido en la técnica puede usarse en las disoluciones de lavado de la presente divulgación, incluyendo, por ejemplo, fosfato, tris (tris(hidroximetil)metilamina), bis-tris, bis-tris-propano, arginina, histidina, trietanolamina, dietanolamina, formiato, acetato, carbonato, MES (ácido 2-(N-mofolino)etanosulfónico), citrato, HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinetanosulfónico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), TAPS (ácido 3-{[tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfónico), bicina (N,N-bis(2-hidroxietil)glicina), tricina (N-tris(hidroximetil)metilglicina), TES (ácido 2-{[tris(hidroximetil)metil]amino}etanosulfónico), PIPES (ácido piperazin-N,N’-bis(2-etanosulfónico), cacodilao (ácido dimetilarsínico), SSC (citrato de sodio salino) y/o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento es uno o más de fosfato, tris, arginina, acetato y/o citrato.

En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento (por ejemplo, fosfato, tris, arginina, acetato y/o citrato) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM. Por ejemplo, el agente de tamponamiento (por ejemplo, fosfato, tris, arginina, acetato y/o citrato) puede estar presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM, de 10 mM a aproximadamente 500 mM, de 50 mM a aproximadamente 500 mM, de 100 mM a aproximadamente 500 mM, de 150 mM a aproximadamente 500 mM, de 200 mM a aproximadamente 500 mM, de 250 mM a aproximadamente 500 mM, de 300 mM a aproximadamente 500 mM, de 350 mM a aproximadamente 500 mM, de 400 mM a aproximadamente 500 mM, de 450 mM a aproximadamente 500 mM, de 1 mM a aproximadamente 450 mM, de 1 mM a aproximadamente 400 mM, de 1 mM a aproximadamente 350 mM, de 1 mM a aproximadamente 300 mM, de 1 mM a aproximadamente 250 mM, de 1 mM a aproximadamente 200 mM, de 1 mM a aproximadamente 150 mM, de 1 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 60 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 75 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 60 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 25 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 25 mM o de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento (por ejemplo, fosfato, tris, arginina, acetato y/o citrato) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM.

En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento (por ejemplo, fosfato, tris, arginina, acetato y/o citrato) está presente en la disolución de lavado a una concentración de cualquiera de aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM o 100 mM. Alternativamente, el agente de tamponamiento (por ejemplo, fosfato, tris, arginina, acetato y/o citrato) está presente en la disolución de lavado a una concentración de cualquiera de aproximadamente 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM o 500 mM. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento (por ejemplo, fosfato, tris, arginina, acetato y/o citrato) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 500 mM. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento (por ejemplo, fosfato, tris, arginina, acetato y/o citrato) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento (por ejemplo, fosfato, tris, arginina, acetato y/o citrato) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 10 mM o menos de aproximadamente 10 mM, aproximadamente 25 mM o menos de aproximadamente 25 mM, aproximadamente 50 mM o menos de aproximadamente 50 mM, aproximadamente 75 mM o menos de aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 100 mM o menos de aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 500 mM o menos de aproximadamente 500 mM. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento (por ejemplo, fosfato, tris, arginina, acetato y/o citrato) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 50 mM o menos de aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento (por ejemplo, fosfato, tris, arginina, acetato y/o citrato) está presente en la disolución de lavado a una concentración de aproximadamente 500 mM o menos de aproximadamente 500 mM.

Disoluciones de lavado a modo de ejemplo

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende benzoato de sodio y/o alcohol bencílico, y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y/o alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende además tampón fosfato (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 50 mM).

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende benzoato de sodio, alcohol bencílico y/o cloruro de sodio, y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y/o cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende además tampón fosfato (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 50 mM).

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende benzoato de sodio, alcohol bencílico, arginina y/o cloruro de sodio, y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M y/o cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M y cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende además tampón fosfato (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 50 mM).

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende benzoato de sodio, alcohol bencílico, tampón fosfato y/o arginina, y tiene un pH de aproximadamente 9,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), tampón fosfato a una concentración de aproximadamente 50 mM y/o arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M, y tiene un pH de aproximadamente 9,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), tampón fosfato a una concentración de aproximadamente 50 mM y arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M, y tiene un pH de aproximadamente 9,0.

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende benzoato de sodio, alcohol bencílico y/o arginina, y tiene un pH de aproximadamente 6,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y/o arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M, y tiene un pH de aproximadamente 6,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M, y tiene un pH de aproximadamente 6,0.

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende hexilenglicol, benzoato de sodio y/o alcohol bencílico, y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende hexilenglicol a una concentración de aproximadamente el 10% (v/v), benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y/o alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende hexilenglicol a una concentración de aproximadamente el 10% (v/v), benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), y tiene un pH de aproximadamente 7,0.

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende bencenosulfonato, benzoato de sodio y/o alcohol bencílico, y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende bencenosulfonato a una concentración de aproximadamente 0,5 M, benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y/o alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende bencenosulfonato a una concentración de aproximadamente 0,5 M, benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), y tiene un pH de aproximadamente 7,0.

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende benzoato de sodio, alcohol bencílico y/o arginina (por ejemplo, arginina-HCl), y tiene un pH de aproximadamente 5,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y/o arginina (por ejemplo, arginina-HCl) a una concentración de aproximadamente 0,5 M, tiene un pH de aproximadamente 5,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y arginina (por ejemplo, arginina-HCl) a una concentración de aproximadamente 0,5 M, tiene un pH de aproximadamente 5,0.

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende benzoato de sodio, alcohol bencílico y/o arginina (por ejemplo, arginina-HCl), y tiene un pH de aproximadamente 6,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y/o arginina (por ejemplo, arginina-HCl) a una concentración de aproximadamente 0,5 M, tiene un pH de aproximadamente 6,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y arginina (por ejemplo, arginina-HCl) a una concentración de aproximadamente 0,5 M, tiene un pH de aproximadamente 6,0.

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende alcohol bencílico y/o arginina (por ejemplo, arginina-HCl), y tiene un pH de aproximadamente 5,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y/o arginina (por ejemplo, arginina-HCl) a una concentración de aproximadamente 0,5 M, y tiene un pH de aproximadamente 5,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y arginina (por ejemplo, arginina-HCl) a una concentración de aproximadamente 0,5 M, y tiene un pH de aproximadamente 5,0.

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende benzoato de sodio, arginina (por ejemplo, arginina-HCl), ácido caprílico y/o cloruro de sodio, y tiene un pH de aproximadamente 9,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, arginina (por ejemplo, arginina-HCl) a una concentración de aproximadamente 0,5 M, ácido caprílico a una concentración de aproximadamente 50 mM y/o cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, teniendo un pH de aproximadamente 9,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, arginina (por ejemplo, arginina-HCl) a una concentración de aproximadamente 0,5 M, ácido caprílico a una concentración de aproximadamente 50 mM y cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, teniendo un pH de aproximadamente 9,0.

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende benzoato de sodio, arginina (por ejemplo, arginina-HCl), ácido caprílico y/o cloruro de sodio, y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, arginina (por ejemplo, arginina-HCl) a una concentración de aproximadamente 0,5 M, ácido caprílico a una concentración de aproximadamente 50 mM y/o cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, teniendo un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, arginina (por ejemplo, arginina-HCl) a una concentración de aproximadamente 0,5 M, ácido caprílico a una concentración de aproximadamente 50 mM y cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, teniendo un pH de aproximadamente 7,0.

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende benzoato de sodio y/o bicarbonato de sodio, y tiene un pH de aproximadamente 10,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y/o bicarbonato de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM, y tiene un pH de aproximadamente 10,0. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y bicarbonato de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM, y tiene un pH de aproximadamente 10,0.

En algunas realizaciones, una disolución de lavado de la presente divulgación comprende alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 4% (v/v), y tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10. En algunas realizaciones, la disolución de lavado comprende alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 4% (v/v), y tiene un pH de aproximadamente 9,0.

Ajustar una recolección que comprende un polipéptido que comprende una región Fc antes de la cromatografía

En un aspecto, se proporciona un método de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc, que comprende las etapas de: (A) ajustar (A) ajustar una recolección que comprende el polipéptido que comprende la región Fc para conseguir una concentración final de una sal de benzoato de aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 0,5 M y un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0 para producir una muestra que comprende (i) el polipéptido que comprende la región Fc, y (ii) una o más impurezas; y (B) poner en contacto la muestra con al menos una matriz de cromatografía. En algunas realizaciones, la al menos una matriz de cromatografía es una matriz de cromatografía de afinidad, por ejemplo, una matriz de cromatografía con proteína A y/o una matriz de cromatografía con proteína G. En algunas realizaciones, el método que comprende además una etapa de poner en contacto la al menos una matriz de cromatografía con al menos una disolución de lavado. En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de poner en contacto la al menos una matriz de cromatografía con una disolución de elución. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de recoger un eluato que comprende el polipéptido que comprende la región Fc.

En algunas realizaciones, el término “recolección” se refiere al fluido presente al final del cultivo celular o tras el cultivo celular, por ejemplo, una muestra de lisado celular, o una muestra de sobrenadante de cultivo celular (por ejemplo, un sobrenadante de células, tales como células CHO, modificadas mediante ingeniería para producir y secretar el polipéptido). En algunas realizaciones, la recolección comprende células huésped intactas y/o residuo celular. En algunas realizaciones, la recolección no comprende células huésped intactas y/o residuo celular. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el fluido presente al final del cultivo celular o tras el cultivo celular se somete a una o más etapas de centrifugación y/o de filtración antes del ajuste para conseguir una concentración final de una sal de benzoato de aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 0,5 M y un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0. En algunas realizaciones, la recolección se deriva del fluido presente al final del cultivo celular o tras el cultivo celular. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el fluido presente al final del cultivo celular o tras el cultivo celular se somete a una o más etapas de pretratamiento para optimizar la separación celular y/o la purificación del polipéptido que comprende una región Fc.

En un aspecto relacionado, una cualquiera de los métodos de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc descritos en el presente documento comprende además una etapa de ajustar una recolección que comprende un polipéptido que comprende una región Fc para conseguir una concentración final de una sal de benzoato de 0,1 M y aproximadamente 0,5 M y un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0 para producir la muestra que comprende (i) el polipéptido que comprende la región Fc, y (ii) una o más impurezas.

En algunas realizaciones, la sal de benzoato es una sal alcalina de benzoato. En algunas realizaciones, la sal de benzoato es benzoato de sodio. En algunas realizaciones, la recolección se ajusta para conseguir una concentración final de una sal de benzoato (por ejemplo, benzoato de sodio) de aproximadamente una cualquiera de 0,025 M, 0,05 M, 0,075 M, 0,1 M, 0,125 M, 0,15 M, 0,175 M, 0,2 M, 0,225 M, 0,25 M, 0,275 M, 0,3 M, 0,325 M, 0,35 M, 0,375 M, 0,4 M 0,425 M, 0,45 M, 0,475 M, 0,5 M, 0,525 M, 0,55 M 0,575 M, 0,6 M, 0,625 M, 0,65 M, 0,675 M, 0,7 M, 0,725 M, 0,75 M, 0,775 M o 0,8 M, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. En algunas realizaciones, el pH de la recolección se ajusta a aproximadamente uno cualquiera de 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1,8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1,9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 o 10,0, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. En algunas realizaciones, la recolección se clarifica antes del ajuste (por ejemplo, adición de benzoato de sodio y ajuste de pH). En algunas realizaciones, la recolección se clarifica tras el ajuste (por ejemplo, adición de benzoato de sodio y ajuste de pH).

En algunas realizaciones, el método comprende ajustar la recolección para conseguir una concentración de benzoato de sodio final de aproximadamente 0,5 M y un pH de aproximadamente 7. En algunas realizaciones, el método comprende ajustar la recolección para conseguir una concentración de benzoato de sodio final de aproximadamente 0,1 M y un pH de aproximadamente 9. En algunas realizaciones, el método comprende ajustar la recolección para conseguir una concentración de benzoato de sodio final de aproximadamente 0,2 M y un pH de 9. En algunas realizaciones, el método comprende ajustar la recolección para conseguir una concentración de benzoato de sodio final de aproximadamente 0,3 M y un pH de 9. En algunas realizaciones, el método comprende ajustar la recolección para conseguir una concentración de benzoato de sodio final de aproximadamente 0,4 M y un pH de 9. En algunas realizaciones, el método comprende ajustar la recolección para conseguir una concentración de benzoato de sodio final de aproximadamente 0,5 M y un pH de 9.

En algunas realizaciones, ajustar la recolección (por ejemplo, añadir benzoato de sodio y ajustar el pH) da como resultado que el polipéptido que comprende la región Fc se purifique de la una o más impurezas en un grado mayor que un método correspondiente que carece de la etapa de ajustar la recolección que comprende el polipéptido que comprende la región Fc para producir la muestra. En algunas realizaciones, una o más impurezas son proteínas de célula huésped (HCP), tales como fosfolipasas, clusterina, serina proteasas, factores de elongación y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la HCP es fosfolipasa B de tipo 2 putativa (PLBL2).

En algunas realizaciones, la recolección ajustada (por ejemplo, a la que se ha añadido benzoato de sodio para conseguir una concentración final descrita en el presente documento y cuyo pH se ha ajustado tal como se describe en el presente documento) comprende o es la muestra que comprende (i) el polipéptido que comprende la región Fc, y (ii) una o más impurezas. En algunas realizaciones, la muestra está en contacto con al menos una matriz de cromatografía (por ejemplo, la muestra se somete a al menos una etapa de cromatografía). En algunas realizaciones, la al menos una matriz de cromatografía comprende una cualquiera o más de: una matriz de cromatografía de afinidad, una matriz de cromatografía de modo mixto (por ejemplo, una matriz de cromatografía multimodal), una matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), una matriz de cromatografía de intercambio aniónico, una matriz de cromatografía de intercambio catiónico, una matriz de cromatografía de exclusión por tamaño, una matriz de cromatografía de hidroxiapatita cerámica (CHT) y/o una matriz de cromatografía de líquidos de interacción hidrofílica (HILIC), etc., en cualquier orden. En algunas realizaciones, la muestra se pone en contacto con una matriz de cromatografía de afinidad, por ejemplo, una matriz de proteína A o una matriz de proteína G. En algunas realizaciones, el método que comprende además una etapa de poner en contacto la al menos una matriz de cromatografía con al menos una disolución de lavado. En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de poner en contacto la al menos una matriz de cromatografía con una disolución de elución. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de recoger un eluato que comprende el polipéptido que comprende la región Fc.

Eliminación de impurezas

Ciertos aspectos de la presente divulgación se refieren a métodos de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc por medio de cromatografía con proteína A lavando una matriz de proteína A unida al polipéptido que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo) con una disolución de lavado que comprende una sal de benzoato y/o alcohol bencílico, con el fin de mejorar la purificación del polipéptido de una o más impurezas. En algunas realizaciones, el método comprende las etapas de: poner en contacto a cromatografía con matriz de proteína A con una muestra que comprende (1) un polipéptido que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo) y (2) una o más impurezas (por ejemplo, impurezas de célula huésped) en una condición en la que el polipéptido que comprende la región Fc (por ejemplo, el anticuerpo) se una a proteína A; y lavar la matriz con una disolución de lavado que comprende una sal de benzoato a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M y/o alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 4% volumen/volumen (v/v), teniendo la disolución de lavado un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0. En algunas realizaciones, lavar la matriz de proteína A con la disolución de lavado da como resultado que el polipéptido que comprende la región Fc se purifique de la una o más impurezas en un grado mayor que un método correspondiente (tal como se describió anteriormente) que carece de la etapa de lavar la matriz con la disolución de lavado.

Un proceso de proteína A estándar da normalmente como resultado una pureza de producto de aproximadamente el 95% sin el uso de una etapa de lavado tal como se describe en el presente documento. Las proporciones más grandes de las impurezas en el producto se deben a agregados de alto peso molecular (HMW) y/o fragmentos de bajo peso molecular (LMW) del producto. Estas variantes de producto se consideran impurezas debido a su capacidad de separarse del producto basándose en diversos parámetros (por ejemplo, carga, hidrofobicidad, diferencia de tamaño, etc.). Estas impurezas HMW y LMW representan aproximadamente el 4-5% del conjunto de proteína A. Además, un proceso de proteína A estándar que carece del uso de una etapa de lavado tal como se describe en el presente documento también da normalmente como resultado la inclusión de impurezas de proteína de célula huésped (HCP) del orden de 1000 ppm o ~0,1% del conjunto de producto. Sin embargo, debido al conjunto de especificaciones para productos de Acm inyectables (véanse, por ejemplo, las directrices de la FDA), una reducción y/o eliminación completa de este 0,1% de impurezas de HCP es de importancia considerable. La inclusión de una etapa que aplica una disolución de lavado descrita en el presente documento puede reducir la cantidad de HCP presentes en el conjunto hasta -100-10 ppm (una reducción de 10 a 100 veces en las HCP en relación con el mismo proceso de proteína A que carece de la etapa de lavado descrita en el presente documento), representando una mejora relativa del 90-99%. Métodos de medición de la pureza de proteína de una muestra y/o los niveles de impureza (por ejemplo, mediante ensayo ELISA) se conocen generalmente por un experto habitual en la técnica. Una purificación a modo de ejemplo de un anticuerpo monoclonal (Acm) de una o más proteínas de célula huésped usando un método estándar frente a cualquiera de los métodos descritos en el presente documento se muestra en la tabla A a continuación.

Tabla A: Proceso de purificación a modo de ejemplo

En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento producen un conjunto de proteína que contiene un polipéptido que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) tras la elución de proteína A que contiene menos de aproximadamente 500 ppm (partes por millón) de HCP (por ejemplo, una o más HCP de una célula CHO). Por ejemplo, un conjunto de proteína que contiene un polipéptido que comprende una región Fc producido mediante los métodos descritos en el presente documento puede contener menos de aproximadamente 500 ppm, menos de aproximadamente 450 ppm, menos de aproximadamente 400 ppm, menos de aproximadamente 350 ppm, menos de aproximadamente 300 ppm, menos de aproximadamente 250 ppm, menos de aproximadamente 200 ppm, menos de aproximadamente 150 ppm, menos de aproximadamente 100 ppm, menos de aproximadamente 75 ppm, menos de aproximadamente 50 ppm, menos de aproximadamente 25 ppm, menos de aproximadamente 10 ppm o menos de aproximadamente 1 ppm de HCP (por ejemplo, una o más HCP de una célula CHO). En algunas realizaciones, un conjunto de proteína que contiene un polipéptido que comprende una región Fc producido mediante los métodos descritos en el presente documento contiene menos de aproximadamente 100 ppm de HCP (por ejemplo, una o más HCP de una célula CHO). En algunas realizaciones, un conjunto de proteína que contiene un polipéptido que comprende una región Fc producido mediante los métodos descritos en el presente documento contiene menos de aproximadamente 10 ppm de HCP (por ejemplo, una o más HCP de una célula CHO).

En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento producen un conjunto de proteína que contiene un polipéptido que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) tras la elución de proteína A que contiene menos de aproximadamente el 0,1% de HCP (por ejemplo, una o más HCP de una célula CHO). Por ejemplo, un conjunto de proteína que contiene un polipéptido que comprende una región Fc producido mediante los métodos descritos en el presente documento puede contener menos de aproximadamente menos de aproximadamente el 0,1%, menos de aproximadamente el 0,09%, menos de aproximadamente el 0,08%, menos de aproximadamente el 0,07%, menos de aproximadamente el 0,06%, menos de aproximadamente el 0,05%, menos de aproximadamente el 0,04%, menos de aproximadamente el 0,03%, menos de aproximadamente el 0,02% o menos de aproximadamente el 0,01% de HCP (por ejemplo, una o más HCP de una célula CHO). En algunas realizaciones, un conjunto de proteína que contiene un polipéptido que comprende una región Fc producido mediante los métodos descritos en el presente documento contiene menos de aproximadamente el 0,05% de HCP (por ejemplo, una o más HCP de una célula CHO). En algunas realizaciones, un conjunto de proteína que contiene un polipéptido que comprende una región Fc producido mediante los métodos descritos en el presente documento contiene menos de aproximadamente el 0,01 % de HCP (por ejemplo, una o más HCP de una célula CHO).

En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento reducen la cantidad y/o concentración (por ejemplo, partes por millón) de una o más impurezas (por ejemplo, una o más HCP tales como una o más HCP de una célula CHO) purificadas conjuntamente con el polipéptido que comprende la región Fc en al menos aproximadamente el 10% en relación con la cantidad de la una o más impurezas purificadas conjuntamente con un polipéptido que comprende una región Fc purificado mediante un método correspondiente que carece de la etapa de lavado de la matriz de proteína A con la disolución de lavado. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento reducen la cantidad y/o concentración (por ejemplo, partes por millón) de una o más impurezas (por ejemplo, una o más HCP tales como una o más HCP de una célula CHO) purificadas conjuntamente con el polipéptido que comprende la región Fc en al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 15%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o al menos aproximadamente el 99% en relación con la cantidad de una o más impurezas purificadas conjuntamente con un polipéptido que comprende una región Fc purificado mediante un método correspondiente que carece de la etapa de lavado de la matriz de proteína A con la disolución de lavado. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento reducen la cantidad y/o concentración (por ejemplo, partes por millón) de una o más impurezas (por ejemplo, una o más HCP tales como una o más HCP de una célula CHO) purificadas conjuntamente con el polipéptido que comprende la región Fc en al menos aproximadamente 1,5 veces en relación con la cantidad de una o más impurezas purificadas conjuntamente con un polipéptido que comprende una región Fc purificado mediante un método correspondiente que carece de la etapa de lavado de la matriz de proteína A con la disolución de lavado. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento reducen la cantidad y/o concentración (por ejemplo, partes por millón) de una o más impurezas (por ejemplo, una o más HCP tales como una o más HCP de una célula CHO) purificadas conjuntamente con el polipéptido que comprende la región Fc en al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 4,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 5,5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 6,5 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 8,5 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 9,5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 50 veces o al menos aproximadamente 100 veces en relación con la cantidad de una o más impurezas purificadas conjuntamente con un polipéptido que comprende una región Fc purificado mediante un método correspondiente que carece de la etapa de lavado de la matriz de proteína A con la disolución de lavado.

Etapas adicionales

En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden además una o más etapas de lavado adicionales. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden además una o más etapas de elución. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden además una o más etapas de lavado y una o más etapas de elución.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a lavar la matriz de proteína A con una primera disolución antes de lavar la matriz con la disolución de lavado. En algunas realizaciones, la matriz se lava con la primera disolución una o más (por ejemplo, una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, etc.) veces antes de lavar la matriz con la disolución de lavado. En algunas realizaciones, la matriz se lava una vez con la primera disolución antes de lavar la matriz con la disolución de lavado. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende un tampón. Cualquier tampón adecuado conocido en la técnica puede usarse en la primera disolución, incluyendo, por ejemplo, fosfato, tris (tris(hidroximetil)metilamina), acetato, carbonato, citrato, bis-tris, bis-tris-propano, arginina, histidina, trietanolamina, dietanolamina, formiato, MES (ácido 2-(N-mofolino)etanosulfónico), HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinetanosulfónico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), TAPS (ácido 3-{[tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfónico), bicina (N,N-bis(2-hidroxietil)glicina), tricina (N-tris(hidroximetil)metilglicina), TES (ácido 2-{[tris(hidroximetil)metil]amino}etanosulfónico), PIPES (ácido piperazin-N,N’-bis(2-etanosulfónico), cacodilao (ácido dimetilarsínico), SSC (citrato de sodio salino) y/o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende tampón fosfato, tampón tris, tampón acetato, tampón carbonato y/o tampón citrato. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende tampón fosfato. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende uno o más componentes adicionales (por ejemplo, sal de benzoato, alcohol bencílico, uno o más aditivos descritos en el presente documento, etc.). En algunas realizaciones, la primera disolución tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,0 (por ejemplo, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,0, de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,0, de aproximadamente 8.0 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 9,0, de aproximadamente 9.0 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0 o de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0). En algunas realizaciones la primera disolución tiene un pH de aproximadamente 7,0.

En algunas realizaciones, la primera disolución comprende el tampón a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM. Por ejemplo, la primera disolución puede comprender el tampón a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 300 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 350 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 400 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 450 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 450 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 400 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 350 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 250 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 60 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 75 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 60 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 40 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 25 mM. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende el tampón a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM.

En algunas realizaciones, la primera disolución comprende el tampón a una concentración de cualquiera de aproximadamente 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM o 100 mM. Alternativamente, la primera disolución comprende el tampón a una concentración de cualquiera de aproximadamente 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM o 500 mM. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende el tampón a una concentración de aproximadamente 500 mM. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende el tampón a una concentración de aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende tampón fosfato a una concentración de aproximadamente 500 mM. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende tampón fosfato a una concentración de aproximadamente 50 mM.

En algunas realizaciones, la primera disolución comprende tampón fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) y cloruro de sodio. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende tampón fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) y cloruro de sodio, y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende tampón fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) a una concentración de aproximadamente 50 mM y cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, la primera disolución comprende tampón fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) a una concentración de aproximadamente 50 mM y cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, y tenía un pH de aproximadamente 7,0.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a lavar la matriz de proteína A con una segunda disolución tras lavar la matriz con la disolución de lavado. En algunas realizaciones, la matriz se lava con la segunda disolución una o más (por ejemplo, una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, etc.) veces tras lavar la matriz con la disolución de lavado. En algunas realizaciones, la matriz se lava una vez con la segunda disolución tras lavar la matriz con la disolución de lavado. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende un tampón. Cualquier tampón adecuado conocido en la técnica puede usarse en la segunda disolución, incluyendo, por ejemplo, fosfato, tris (tris(hidroximetil)metilamina), acetato, carbonato, citrato, bis-tris, bis-tris-propano, arginina, histidina, trietanolamina, dietanolamina, formiato, MES (ácido 2-(N-mofolino)etanosulfónico), HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinetanosulfónico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), TAPS (ácido 3-{[tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfónico), bicina (N,N-bis(2-hidroxietil)glicina), tricina (N-tris(hidroximetil)metilglicina), TES (ácido 2-{[tris(hidroximetil)metil]amino}etanosulfónico), PIPES (ácido piperazin-N,N’-bis(2-etanosulfónico), cacodilao (ácido dimetilarsínico), SSC (citrato de sodio salino) y/o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende tampón fosfato, tampón tris, tampón acetato, tampón carbonato y/o tampón citrato. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende tampón fosfato. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende sustancialmente poca sal o nada de sal. En algunas realizaciones, la segunda disolución tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,0 (por ejemplo, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0 o de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0). En algunas realizaciones, la segunda disolución tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la segunda disolución tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende sustancialmente poca sal. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende no sal.

En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende el tampón a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM. Por ejemplo, la segunda disolución puede comprender el tampón a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 300 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 350 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 400 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 450 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 450 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 400 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 350 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 250 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 60 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 75 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 60 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 40 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 25 mM. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende el tampón a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM.

En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende el tampón a una concentración de cualquiera de aproximadamente 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM o 100 mM. Alternativamente, la segunda disolución comprende el tampón a una concentración de cualquiera de aproximadamente 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM o 500 mM. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende el tampón a una concentración de aproximadamente 500 mM. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende el tampón a una concentración de aproximadamente 50 mM.

En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende tampón fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio). En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende tampón fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio), y tiene un pH de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende tampón fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) a una concentración de aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la segunda disolución comprende tampón fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) a una concentración de aproximadamente 50 mM, y tenía un pH de aproximadamente 7,0.

En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación se refieren a lavar una matriz de proteína A con una disolución de lavado, y no incluyen una etapa de lavado de la matriz con una primera disolución (antes de la disolución de lavado) o una segunda disolución (tras la disolución de lavado). En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación se refieren a lavar una matriz de proteína A con una primera disolución, entonces lavar la matriz con una disolución de lavado, y no incluyen una etapa de lavado de la matriz con una segunda disolución (tras la disolución de lavado). En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación se refieren a lavar una matriz de proteína A con una disolución de lavado y entonces lavar la matriz con una segunda disolución, y no incluyen una etapa de lavado de la matriz con una primera disolución (antes de la disolución de lavado). En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación se refieren a lavar una matriz de proteína A con una primera disolución, entonces lavar la matriz con una disolución de lavado y entonces lavar la matriz con una segunda disolución.

En algunas realizaciones, la matriz de proteína A se pone en contacto con una disolución de elución una o más (por ejemplo, una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, etc.) veces tras una o más etapas de lavado. En algunas realizaciones, la matriz se pone en contacto con la disolución de elución una vez. Cualquier disolución conocida en la técnica adecuada para eluir un polipéptido unido a una matriz de proteína A puede usarse como disolución de elución en los métodos de la presente divulgación (por ejemplo, una disolución de elución que comprende acetato de sodio 40 mM que tiene un pH de aproximadamente 3,1). En algunas realizaciones, la disolución de elución comprende además uno o más componentes adicionales (por ejemplo, arginina a cualquiera de las concentraciones descritas en el presente documento). En algunas realizaciones, un eluato que comprende el polipéptido que comprende la región Fc se recoge tras poner en contacto la matriz con la disolución de elución. En algunas realizaciones, dos o más eluatos que comprenden el polipéptido que comprende la región Fc se recogen tras poner en contacto la matriz dos o más veces con la disolución de elución. En algunas realizaciones, los dos o más eluatos se combinan tras la elución. En algunas realizaciones, el/los eluato(s) se filtra(n). Puede usarse cualquier método de filtración de un eluato adecuado conocido en la técnica incluyendo, por ejemplo, por medio de filtración profunda. En algunas realizaciones, el/los eluato(s) se filtra(n) por medio de filtración profunda.

En algunas realizaciones, los eluatos de una matriz de proteína A tal como se describe en el presente documento pueden procesarse y/o purificarse adicionalmente (por ejemplo, usando una etapa de cromatografía y/o filtración adicional (tal como mediante el uso de una o más de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de modo mixto, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad con metal inmovilizado, cromatografía de exclusión de tamaño, diafiltración, ultrafiltración y/o filtración por eliminación viral)), y/o formularse (por ejemplo, preparando una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto que la necesite (tal como un sujeto humano)).

Se considera que la descripción escrita anterior es suficiente para posibilitar que un experto en la técnica ponga en práctica la presente divulgación. Los siguientes ejemplos se ofrecen solo con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación de ninguna manera. De hecho, diversas modificaciones de la presente divulgación además de aquellas mostradas y descritas en el presente documento resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anteriores y caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Disoluciones de lavado para mejorar o potenciar la elim inación de impurezas durante la purificación de anticuerpo

El siguiente ejemplo describe el uso de diversas combinaciones de benzoato de sodio y alcohol bencílico en disoluciones de lavado intermedias para mejorar/potenciar la eliminación de impurezas durante la cromatografía con proteína A.

Materiales y métodos

Preparación de muestras

Se prepararon dos materiales de recolección de anticuerpo monoclonal humano independientes para cromatografía con proteína A tal como sigue: se generó una recolección en un cultivo en suspensión de células de ovario de hámster chino (CHO) recombinantes modificadas mediante ingeniería para expresar de manera constitutiva uno cualquiera de los anticuerpos. El producto recombinante se secretó al medio de cultivo que entonces se centrifugó y se clarificó mediante filtración profunda para su procesamiento posterior. El material de recolección clarificado se filtró con un filtro de 0,22 gm de polietersulfona (PES) antes de cargarlo en la columna de proteína A.

Cromatografía con proteína A

Se prepararon resina/columnas de proteína A tal como sigue: se intercambió la resina de cromatografía con proteína A MabSelect Sure LX (GE Healthcare Life Sciences; n ° de cat. 17-5474) por medio de deposición por gravedad con disolución de cloruro de sodio 0,5 M. Las columnas se empaquetaron usando AKTA Pure o AKTA Avant (GE Healthcare Life Sciences) usando o bien (A) una columna de 1,0 cm de diámetro (columna 10/250 Snap de Essential Life Solutions; n.° de cat. S10/250-PPSL-OE-FP10) o bien (B) una columna de 0,66 cm de diámetro (Omnifit™ 6,6/100; n ° de cat. 006BCC0610FF). La resina se empaquetó hasta una altura de lecho de 20 cm ± 10% para la columna (A), o hasta una altura de perla de 5 cm ± 10% para la columna (B). La calificación de la columna se realizó usando una inyección de un 1% de volumen de columna de disolución de cloruro de sodio 1,0 M sobre la columna equilibrada en disolución de cloruro de sodio 0,1 M, y se analizó la traza de conductividad usando el software de evaluación Unicorn. La eficiencia de la columna necesitaba ser de al menos 775 placas teóricas por metro y necesitaba demostrar una asimetría de 0,8-1,8.

Antes de cargar el material de recolección, las columnas se enjuagaron con agua de desionización por ósmosis inversa para eliminar el tampón de almacenamiento de etanol al 20%. Posteriormente, la columna se enjuagó con ácido acético 0,5 M para garantizar la eliminación de cualquier entidad unida antes del equilibrado. La columna se equilibró con tampón fosfato 50 mM con cloruro de sodio 0,5 M hasta que el pH de la columna era >6,5.

Las muestras preparadas se cargaron entonces sobre las columnas de proteína A. Las columnas se cargaron hasta un objetivo de 40 g/l de resina con o bien Acm A (subtipo IgG1) o bien Acm B (subtipo IgG4). Las columnas cargadas se lavaron tal como se describió anteriormente con una disolución de tampón fosfato que contenía fosfato 50 mM y cloruro de sodio 0,5 M. Después, las columnas se lavaron con la disolución de lavado de prueba, seguida de un lavado libre de sal con una disolución tamponada a pH 7. Finalmente, el anticuerpo se eluyó de la columna usando una disolución que contenía acetato de sodio 40 mM a un pH de 3,1. La tabla 1 a continuación proporciona un proceso de cromatografía a modo de ejemplo.

Tabla 1: Descripción del proceso de cromatografía en columna

Detección de proteína de célula huésped

Tras la elución, las muestras de anticuerpo se sometieron a prueba para la presencia de impurezas de proteína de célula huésped (HCP) usando el kit ELISA de HCP CHO de 3a generación (Cygnus Technologies) según el protocolo del fabricante. La ELISA de HCP se realizó a diluciones de entre 1:400 y 1:800, y la absorbancia se leyó a 450/600 nm usando un lector de placas Spectramax Plus 384.

Detección de “HCP-A" específica

La concentración de una HCP específica (HCP-A) se cuantificó en las muestras de anticuerpo eluidas usando un kit ELISA de hámster (CHO) disponible comercialmente (ICL Labs) según el protocolo del fabricante. La ELISA de HCP-A se realizó a diluciones de entre 1:100 y 1:800, y la absorbancia se leyó a 450 nm usando un lector de placas Spectramax Plus 384.

Resultados

Se ha mostrado que las proteínas de célula huésped (HCP) se eluyen conjuntamente con anticuerpos monoclonales (Acm), lo que puede ser problemático para aplicaciones posteriores de estos anticuerpos. Para identificar potenciales aditivos de lavado capaces de reducir la cantidad de HCP contaminantes que se eluyen conjuntamente con un Acm de interés, se cargó una columna de cromatografía con proteína A de 1,7 ml con una muestra que contenía un anticuerpo monoclonal humano de IgG1 secretado (Acm A) recogido de células CHO que se habían tanto centrifugado como clarificado mediante filtración profunda antes del procesamiento posterior (véase la tabla 1). Las columnas se lavaron en primer lugar con una disolución de tampón fosfato. Después, las columnas se lavaron con una de varias disoluciones de lavado de prueba que contenían fosfato 50 mM y un aditivo, o bien individualmente o bien como combinación con benzoato de sodio, alcohol bencílico y arginina, a pH 7,0 (FIG. 1). Las ejecuciones de control no incorporaron ningún lavado aditivo. Tras los lavados de prueba, las columnas se lavaron con fosfato 50 mM libre de sal, pH 7,0. Finalmente, el anticuerpo monoclonal se eluyó de la columna y se ajustó el pH a un pH de 6,0 usando base tris 2 M. Tras el ajuste, los conjuntos de eluato se filtraron usando un filtro PES de 0,22 pm, y se sometieron a prueba para la presencia de impurezas de HCP (FIG. 1). De manera interesante, los lavados que contenían alcohol bencílico al 2% y/o benzoato de sodio 0,5 M reducían de manera efectiva los niveles de HCP contaminantes en las muestras de anticuerpo eluidas. Se observó que la inclusión de arginina en el lavado también mejoraba el aclaramiento de HCP.

Después, se examinó la presencia específica de HCP-A en anticuerpos eluidos de las columnas de proteína A. Las disoluciones de lavado de prueba y de control usadas en este experimento se indican en la tabla 2 a continuación.

Tabla 2: Disoluciones de lavado de prueba

Habiendo demostrado la capacidad de la combinación de alcohol bencílico y benzoato de sodio para eliminar impurezas de HCP, se sometieron a prueba formulaciones adicionales para seleccionar como diana la eliminación de HCP-A. Se usó un anticuerpo de IgG4 (Acm B) con una alta expresión de HCP-A conocida para aumentar específicamente la carga de HCP-A en la columna. La tabla 1 proporciona un resumen de las etapas realizadas durante el proceso de purificación. Brevemente, tras el equilibrado hasta el pH y la conductividad de la carga, se cargó una columna de cromatografía con proteína A de 15,7 ml con una muestra que contenía el anticuerpo monoclonal humano secretado recogido de células CHO por medio de tanto centrifugación como clarificación mediante filtración profunda antes del procesamiento posterior. Una vez que se alcanzó una carga de 40 g/l (de resina), se reequilibró la columna usando la disolución de tampón fosfato. Uno de los lavados (disoluciones de prueba 1,2 y 7) representados en la tabla 2 se aplicó entonces como 2 volúmenes de columna (CV) y seguido inmediatamente por 3 CV de disolución de tampón fosfato libre de sal a pH 7,0. Tras la elución con acetato de sodio 40 mM, los conjuntos de eluato se ajustaron a pH 5,5 usando base Tris 2 M. Los conjuntos de eluato se filtraron entonces con o bien un filtro PES de 0,22 pm o bien un filtro de profundidad COHC de Millipore, y se sometieron a prueba para el contenido de HCP-A mediante ELISA (FIG. 2A). Las tres condiciones de lavado (disoluciones de prueba 1, 2 y 7) eran capaces de aclarar la HCP-A adicional en relación con el control (294 ppm). Los resultados sugerían también que el efecto de la eliminación de HCP-A era acumulativo, ya que la combinación de alcohol bencílico, benzoato de sodio y arginina eliminaba casi el 90% de la HCP-A en relación con el control. Además, la filtración profunda proporcionó una eliminación de HCP-A adicional del 15-25% posterior para los eluatos de condición de lavado.

Tras un procedimiento similar al descrito anteriormente, la efectividad de lavados de pH alto se sometió a prueba después lavando las columnas a un pH de 9,0 o 10,0. Se produjo un anticuerpo de IgG4 (Acm B) en una línea celular con alta expresión de HCP-A conocida para aumentar específicamente la carga de HCP-A en la columna de proteína A. La tabla 1 proporciona un resumen de las etapas realizadas durante el proceso de purificación. Brevemente, tras el equilibrado hasta el pH y la conductividad de la carga, se cargó una columna de cromatografía con proteína A de 15,7 ml con una muestra que contenía el anticuerpo monoclonal humano secretado recogido de células CHO recogidas por medio de tanto centrifugación como clarificación mediante filtración profunda antes del procesamiento posterior. Una vez que se alcanzó una carga de 60 g/l (de resina), se reequilibró la columna usando una disolución de tampón fosfato. Una de la disolución de prueba o bien 8 o bien 9 (tabla 2) se aplicó entonces para dos CV y seguida inmediatamente por tres CV de disolución de tampón fosfato libre de sal a pH 7,0. Tras la elución con acetato de sodio 40 mM, los conjuntos de eluato se ajustaron a pH 5,5 usando base tris 2 M. Los conjuntos de eluato se filtraron entonces con un filtro PES de 0,22 pm. Como se muestra en la FIG. 2B, el benzoato de sodio 0,5 M con una sal de tamponamiento a pH 10,0 era altamente efectivo a la hora de eliminar HCP-A (reducción del 92%) en relación con el control. Además, la adición de alcohol bencílico y arginina era de nuevo complementaria y aumentó el aclaramiento de HCP-A a pH 9,0. Tomados conjuntamente, los resultados representados en las FIGs . 2A-B muestran aquel intervalo robusto de pH que permitía el aclaramiento significativo de HCP-A.

Finalmente, se examinaron aditivos adicionales para potenciar adicionalmente un lavado de alcohol bencílico al 2% y benzoato de sodio 0,5 M. Se usó el mismo Acm de IgG4 (Acm B) en una columna de escala de 1,7 ml. La tabla 1 proporciona un resumen de las etapas realizadas durante el proceso de purificación. Brevemente, se cargó la columna hasta 40 g/l tras el equilibrado. Uno de cuatro de los lavados (disoluciones de prueba 3-6) representados en la tabla 2 se aplicó entonces a la columna. Después, las muestras de elución se ajustaron a pH 5,5 con base Tris 2 M y se filtraron usando un filtro PES de 0,22 pm. Entonces se midió el contenido de HCP-A usando un ELISA específico para HCP-A (FIG. 3). Los lavados con las disoluciones de prueba demostraron la respuesta acumulativa en la eliminación de HCP-A debido a la adición de arginina, ácido caprílico, bencenosulfonato y hexilenglicol en comparación con la combinación de alcohol bencílico al 2% y benzoato de sodio 0,5 M (201,3 ppm). Un lavado que contenía alcohol bencílico al 2%, benzoato de sodio 0,5 M y un componente seleccionado de hexilenglicol, bencenosulfonato de sodio, ácido caprílico o arginina era altamente efectivo a la hora de eliminar HCP-A.

Tomados conjuntamente, los datos proporcionados en este ejemplo muestran que una etapa de lavado intermedio que contenía benzoato de sodio y/o alcohol bencílico era capaz de proporcionar un aclaramiento superior de impurezas de proteína de célula huésped durante purificación de proteína A de un anticuerpo humano monoclonal. Además, la inclusión de uno o más aditivos seleccionados de bencenosulfonato, ácido caprílico, hexilenglicol y/o arginina en la disolución de lavado mejoró adicionalmente el aclaramiento de impurezas de proteína de célula huésped durante la purificación de proteína A del anticuerpo monoclonal objetivo.

Ejemplo 2: Identificación de proteínas de célula huésped específicas presentes tras cromatografía con proteína A, desarrollo de disoluciones de lavado para mejorar o potenciar la elim inación de impurezas durante la purificación de anticuerpo, y evaluación de la interacción de fosfolipasa B de tipo 2 putativa con anticuerpo monoclonal humano

El siguiente ejemplo describe la identificación de proteínas de célula huésped (HCP) específicas en el eluato de anticuerpo purificado tras cromatografía con proteína A. El ejemplo describe además el uso de benzoato de sodio y alcohol bencílico en disoluciones de lavado intermedias para mejorar/potenciar la eliminación de HCP incluyendo fosfolipasa B de tipo 2 putativa (PLBL2) durante la cromatografía con proteína A. Finalmente, el ejemplo describe el efecto de las condiciones de carga sobre la eficiencia de la cromatografía con proteína A.

Materiales y métodos

Preparación de muestras

Se prepararon materiales de recolección de anticuerpo monoclonal humano para cromatografía con proteína A tal como se describe en el ejemplo 1. Brevemente, se generó una recolección en un cultivo en suspensión de células CHO recombinantes modificadas mediante ingeniería para expresar de manera constitutiva uno cualquiera de los anticuerpos humanos monoclonales. El producto recombinante se secretó al medio de cultivo que entonces se centrifugó y se clarificó mediante filtración profunda para su procesamiento posterior. El material de recolección clarificado se filtró con un filtro de polietersulfona (PES) de 0,22 gm antes de cargarlo en la columna de proteína A.

Cromatografía con proteína A

Se prepararon resina/columnas de proteína A tal como se describe en el ejemplo 1. Brevemente, se intercambió resina de cromatografía con proteína A MabSelect Sure LX (GE Healthcare Life Sciences; n ° de cat. 17-5474) por medio de deposición por gravedad con disolución de cloruro de sodio 0,5 M. Las columnas se empaquetaron usando AKTA Pure o AKTA Avant (GE Healthcare Life Sciences) usando o bien (A) una columna de 1,0 cm de diámetro (columna 10/250 Snap de Essential Life Solutions; n.° de cat. S10/250-PPSL-OE-FP10) o bien (B) una columna de 0,66 cm de diámetro (Omnifit™ 6,6/100; mo de cat. 006BCC0610FF). La resina se empaquetó hasta una altura de lecho de 20 cm ± 10% para la columna (A), o hasta una altura de perla de 5 cm ± 10% para la columna (B). La calificación de la columna se realizó usando una inyección de un 1% de volumen de columna de disolución de cloruro de sodio 1,0 M sobre la columna equilibrada en disolución de cloruro de sodio 0,1 M, y se analizó la traza de conductividad usando el software de evaluación Unicorn. La eficiencia de la columna necesitaba ser de al menos 775 placas teóricas por metro y necesitaba demostrar una asimetría de 0,8-1,8.

Las muestras preparadas se cargaron entonces sobre las columnas de proteína A. Generalmente, las columnas se cargaron hasta un objetivo de 40 g/l de resina con o bien anticuerpo monoclonal humano A (subtipo IgG 1) o anticuerpo monoclonal humano B (subtipo IgG4). Las columnas cargadas se lavaron tal como se describió anteriormente con una disolución de tampón fosfato que contenía fosfato 50 mM y cloruro de sodio 0,5 M. Después, las columnas se lavaron con la disolución de lavado de prueba, seguida de un lavado libre de sal con una disolución tamponada a pH 7. Sin embargo, los tratamientos de control no se lavaron con una disolución de lavado de prueba. Finalmente, el anticuerpo se eluyó de la columna usando una disolución que contenía acetato de sodio 40 mM a un pH de 3,1. La tabla 1 proporciona un proceso de cromatografía a modo de ejemplo.

Detección de HCP mediante espectrometría de masas

Tras la purificación con columna de proteína A y la elución en condiciones estándar, los eluatos de anticuerpo monoclonal humano se analizaron mediante espectrometría de masas para determinar la cantidad relativa de cada HCP. Específicamente, se identificaron la cantidad relativa de clusterina y fosfolipasa B de tipo 2 putativa (PLBL2) en las muestras de anticuerpo monoclonal humano purificado con proteína A. La espectrometría de masas se realizó usando un Acquity H-Class Xevo G2-XS Q-Tof y una columna ACQUITY UPLC de 2,1 x 150 mm de 1,7 qm CSH C18. Las muestras se desnaturalizaron en primer lugar usando Rapigest al 0,05% en bicarbonato de amonio 50 mM y entonces se redujeron y alquilaron usando DTT (ditiotreitol) 20 mM e IAA (yodoacetamida) 40 mM. La digestión enzimática se realizó mediante LysC al 2% durante la noche seguido de 3 horas con tripsina al 4%. Se eliminó el Rapigest por medio de centrifugación y las muestras se acidificaron usando ácido fórmico. Entonces se añadió un patrón interno de adición conocida de 2,5 fmol/ul de ClpB de E. coli para comparar las cantidades relativas de HCP y PLBL2. Se realizó una calibración de masa de bloqueo alrededor de 785,8426 m/z. Se usó MSE para analizar los datos de iones e identificar las HCP.

Detección de HCP mediante ELISA

Tras la elución, se evaluó la presencia de HCP genéricas en muestras de anticuerpo monoclonal humano tal como se describe en el ejemplo 1. Brevemente, las muestras de anticuerpo se sometieron a prueba para la presencia de impurezas de HCP usando el kit ELISA de HCP CHO de 3a generación (Cygnus Technologies) según el protocolo del fabricante. La ELISA de HCP se realizó a diluciones de entre 1:400 y 1:800, y la absorbancia se leyó a 450/600 nm usando un lector de placas Spectramax Plus 384.

Detección de PLBL2 mediante ELISA

La concentración de una PLBL2 se cuantificó en las muestras de anticuerpo eluidas usando un kit ELISA de hámster (CHO) disponible comercialmente (ICL Labs , E-65PLB) según el protocolo del fabricante. El ELISA de PLBL2 se realizó a diluciones de entre 1:100 y 1:800, y la absorbancia se leyó a 450 nm usando un lector de placas Spectramax Plus 384.

Resultados

Detección de HCP mediante espectrometría de masas

Tras la purificación de proteína A, se ha mostrado que las HCP se eluyen conjuntamente con anticuerpo monoclonal humano, lo que puede ser problemático para aplicaciones posteriores de estos anticuerpos. Para identificar HCP específicas presentes en la disolución de anticuerpo monoclonal humano purificada tras la purificación de proteína A, se cargó una columna de cromatografía con proteína A de 1,7 ml con una muestra que contenía un anticuerpo monoclonal humano de IgG1 secretado (Acm A) recogido de células CHO que se habían tanto centrifugado como clarificado mediante filtración profunda antes del procesamiento posterior (véase la tabla 1). Las columnas se lavaron en primer lugar con una disolución de tampón fosfato. Después, las columnas se lavaron con fosfato 50 mM libre de sal, pH 7,0. Finalmente, el anticuerpo monoclonal se eluyó de la columna y se ajustó el pH a un pH de 6,0 usando base tris 2 M. Tras el ajuste, los conjuntos de eluato se filtraron usando un filtro PES de 0,22 qm, y se analizaron mediante espectrometría de masas para identificar las cantidades relativas de HCP. Notablemente, clusterina y PLBL2 eran las dos HCP más abundantes presentes en el eluato de anticuerpo monoclonal humano.

Identificación de condiciones de lavado intermedias para mejorar la eliminación de HCP/PLBL2.

El análisis de espectrometría de masas detallado anteriormente proporcionó evidencia adicional de que las HCP, incluyendo PLBL2, se eluyen conjuntamente con anticuerpos humanos monoclonales tras la purificación de proteína A. Después, se desarrollaron exámenes ELISA para identificar disoluciones de lavado intermedias que pudieron usarse para mejorar y potenciar adicionalmente la eliminación de HCP y PLBL2 (FIG.4A y 4B). De manera interesante, los lavados intermedios que comprendían alcohol bencílico al 4% o benzoato de sodio 0,5 M reducían de manera efectiva los niveles de HCP contaminantes y PLBL2 en las muestras de eluato de anticuerpo. Los lavados que contenían arginina 0,5 M sola no reducían el nivel de HCP genéricas, pero sí reducían el nivel de PLBL2 contaminante.

Exámenes ELISA de PLBL2 muestran adicionalmente que la filtración profunda combinada con lavados intermedios que comprenden: 1) alcohol bencílico al 2% y arginina 0,5 M pH 5,0, 2) alcohol bencílico al 2% y benzoato de sodio 0,5 M pH 7,0, o 3) alcohol bencílico al 2%, benzoato de sodio 0,5 M, arginina 0,5 M pH 6,0, eliminaba de manera efectiva PLBL2 durante la purificación de proteína A. Además, los lavados con niveles de pH elevados (benzoato de sodio 0,5 M y bicarbonato de sodio 50 mM pH 10,0 o alcohol bencílico al 2%, benzoato de sodio 0,5 M, arginina 0,5 M y fosfato de sodio 50 mM pH 9,0) eran altamente efectivos a la hora de eliminar PLBL2 durante la purificación de proteína A. De hecho, el lavado de benzoato de sodio con bicarbonato de sodio 50 mM pH 10,0 era capaz de eliminar más del 92% de PLBL2 en comparación con el tratamiento de control. Por último, los lavados que comprenden: 1) benzoato de sodio 0,5 M, alcohol bencílico al 2% y bencenosulfonato 0,5 M pH 7,0, 2) benzoato de sodio 0,5 M, ácido caprílico 50 mM, arginina 0,5 M y cloruro de sodio 0,5 M pH 7,0, 3) benzoato de sodio 0,5 M, alcohol bencílico al 2% y hexilenglicol al 10% pH 7,0, o 4) benzoato de sodio 0,5 M, alcohol bencílico al 2% y arginina 0,5 M pH 6,0, demostraron una capacidad robusta para eliminar PLBL2 en comparación con los lavados de control.

Además, la comparación visual de eluato de anticuerpo tras lavados tanto experimentales como de control reveló que las muestras lavadas con alcohol bencílico al 2% y benzoato de sodio 0,5 M tenían una claridad mejorada en relación con las muestras lavadas con control (FIG. 5).

Los ELISA de PLBL2, detallados anteriormente, demuestran que el lavado intermedio que contenía alcohol bencílico y benzoato de sodio puede reducir de manera efectiva el nivel de PLBL2 en eluato de anticuerpo purificado de proteína A. Después, este resultado se confirmó adicionalmente de manera ortogonal a través de espectrometría de masas. Los resultados de espectrometría de masas muestran que el lavado de prueba de benzoato de sodio 0,5 M, arginina 0,5 M, ácido caprílico 50 mM, NaCl 0,5 M pH 9,0 eliminaba casi el 93% de PLBL2 del eluato en relación con el tratamiento de control.

Evaluar el impacto de la carga de columna sobre el rendimiento y la eliminación de PLBL2

Los experimentos anteriores demuestran que la proteína de célula huésped PLBL2 está presente en eluato de anticuerpo purificado de proteína A y puede eliminarse de manera efectiva usando disoluciones de lavado intermedias que contienen alcohol bencílico y benzoato de sodio. Después, se evaluó el impacto del nivel de carga de la columna de proteína A sobre el rendimiento fuera de la columna y la eliminación de PLBL2. Para identificar las condiciones de carga ideales para maximizar tanto el rendimiento fuera de la columna como la eliminación de PLBL2, las columnas de proteína A se cargaron a intervalos de 40-60 g/l (FIG. 6A y 6B). Los resultados demuestran que aumentar la carga de columna más allá de 40 g/l disminuye tanto el rendimiento fuera de la columna como la eliminación de PLBL2.

Tomados conjuntamente, los datos proporcionados en este ejemplo muestran que PLBL2 está entre las proteínas de célula huésped que se eluyen conjuntamente con anticuerpo monoclonal humano tras la purificación de proteína A. Además, los datos demuestran que una etapa de lavado intermedio que contenía benzoato de sodio y/o alcohol bencílico era capaz de proporcionar un aclaramiento superior de impurezas de proteína de célula huésped y PLBL2 durante la purificación de proteína A de un anticuerpo humano monoclonal. Además, los datos muestran que sobrecargar la columna de resina de proteína A puede disminuir el rendimiento fuera de la columna y la eliminación de PLBL2.

Ejemplo 3: Evaluar los efectos del pH y la concentración de sal de benzoato en una recolección que comprende un anticuerpo sobre la eliminación de impurezas durante la purificación de anticuerpo.

El siguiente ejemplo describe experimentos que se realizaron para determinar si el ajuste de la concentración de benzoato de sodio y el pH de una recolección que comprende un anticuerpo monoclonal mejora o potencia la eliminación de impurezas durante la purificación del anticuerpo.

Se prepararon recolecciones de anticuerpo monoclonal humano tal como se describe en el ejemplo 1. La recolección clarificada y sometida a filtración profunda se ajustó a pH y concentraciones de aditivo variables para examinar los sobre el aclaramiento de HCP y PLBL2. Se añadió benzoato de sodio, que se había mostrado previamente que era efectivo para la eliminación de PLBL2 como parte de una etapa de lavado adicional, como sólido en cantidades suficientes para alcanzar una concentración final objetivo para un volumen dado de recolección. Tras la adición, el pH objetivo se alcanzó a través de la adición de base tris 2 M. Una primera recolección se suplementó con benzoato de sodio para conseguir una concentración final de benzoato de sodio 0,5 M y se ajustó a un pH de 7,2. Una segunda recolección se suplementó con benzoato de sodio para conseguir una concentración final de benzoato de sodio 0,5 M y se ajustó a un pH de 9. Una tercera recolección se ajustó a un pH de 9 (no se añadió nada de benzoato de sodio). Véase la tabla 3:

Tabla 3

Una vez que cada recolección se había ajustado y filtrado a 0,22 qm, tres columnas de proteína A se cargaron en cada caso hasta un objetivo de 50 g/l de resina con la recolección ajustada. Las columnas cargadas se lavaron con una disolución de tampón fosfato que contenía fosfato 50 mM y cloruro de sodio 0,5 M. Después, las columnas se lavaron con agua desionizada por ósmosis inversa (RODI). Finalmente, el anticuerpo se eluyó de la columna usando una disolución que contenía acetato de sodio 40 mM a un pH de 3,1. La tabla 4 a continuación proporciona un proceso de cromatografía a modo de ejemplo.

Tabla 4

Cada uno de los tres eluatos de proteína A se sometió entonces a prueba para la presencia de impurezas de proteína de célula huésped (HCP) por medio de ELISA tal como se describe en el ejemplo 1, y para la presencia de PLBL2 por medio de ELISA personalizado. Como se muestra en la FIG. 7 , el benzoato de sodio 0,5 M a pH 9,0 mostró el nivel más bajo de impurezas de PLBL2 y HCP y demostró un registro mayor de aclaramiento de PLBL2 en relación con un ajuste de pH solo. Cuando se añadió benzoato de sodio 0,5 M a la recolección a pH 7,2, solo se mejoró el aclaramiento de HCP. El ajuste tanto de pH como de benzoato de sodio para la recolección se requerían para un efecto sobre PLBL2. La h Mw no se veía afectada por los ajustes (no mostrados). En comparación con la recolección no ajustada con solo un lavado con RODI durante la etapa de proteína A, la HCP se redujo en un 65% mientras que la PLBL2 se redujo en aproximadamente un 79%.

Después, las recolecciones se suplementaron con benzoato de sodio para conseguir una concentración final de 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M o 0,5 M y se ajustaron a un pH de 9 antes de la purificación de proteína A, tal como se describió anteriormente. Véase la tabla 5.

Tabla 5

Cada eluato de proteína A se sometió entonces a prueba para la presencia de PLBL2 por medio de ELISA personalizado y se evaluó el rendimiento de anticuerpo en cada eluato. La FIG. 8 muestra que la relación entre el contenido de PLBL2 y la concentración de benzoato de sodio es aproximadamente sigmoidal. Se observaron ganancias disminuidas en el aclaramiento de PLBL2 para concentraciones por encima de benzoato de sodio 0,4 M. El rendimiento de anticuerpo disminuyó ligeramente con una concentración creciente de benzoato de sodio. Desde benzoato de sodio 0,1 M hasta 0,5 M, el rendimiento de anticuerpo disminuyó desde el 94,8% hasta el 89,4%. El máximo rendimiento y el máximo aclaramiento de PLBL2 se observaron cuando la recolección se ajustaba a benzoato de sodio 0,4 M y pH 9,0 antes de la purificación de proteína A. Aumentar la concentración de benzoato de sodio por encima de 0,4 M dio como resultado ganancias reducidas en el aclaramiento a costa de un rendimiento de anticuerpo ligeramente disminuido. Todas las muestras de benzoato de sodio 0,1 M tenían un aclaramiento de HCP comparable de alrededor de 250 ppm. A benzoato de sodio 0,1 M y por debajo, la HCP era de alrededor de 500 ppm. Una concentración de benzoato de sodio de entre 0,2 M y 0,5 M no afectada al perfil de varianza de carga y todos los eluatos estaban dentro de los límites especificados.

Tomados conjuntamente, estos datos sugieren que la presencia de benzoato de sodio en disolución convierte la asociación de impurezas de célula huésped con el Acm en altamente desfavorable a pH altos. Estas condiciones pueden conseguirse o bien a través de una etapa de lavado independiente después de que el Acm se haya unido a la resina de proteína A o bien en disolución antes de o durante la fase de carga de la columna. Esto proporciona una mayor flexibilidad en la operación de la etapa de purificación de proteína A y soporta adicionalmente las propiedades únicas del benzoato de sodio como aditivo de lavado.

Claims

REIVINDICACIONES

1 Un método de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc, comprendiendo el método las etapas de:

(a) poner en contacto una matriz de cromatografía con proteína A con una muestra que comprende (i) el polipéptido que comprende la región Fc, y (ii) una o más impurezas, en una condición en la que el polipéptido que comprende la región Fc se una a la proteína A; y

(b) lavar la matriz con una disolución de lavado, comprendiendo la disolución de lavado uno o ambos de (i) una sal de benzoato a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M y (ii) alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 4% volumen/volumen (v/v), y teniendo la disolución de lavado un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0.
2. - El método según la reivindicación 1, en el que la disolución de lavado comprende: 1) sal de benzoato; 2) alcohol bencílico; o 3) sal de benzoato y alcohol bencílico, opcionalmente en el que

(i) la sal de benzoato está a una concentración de desde aproximadamente 0,1 M hasta aproximadamente 0,5 M; y/o

(ii) la sal de benzoato es una sal alcalina de benzoato; y/o

(iii) la sal de benzoato es benzoato de sodio, estando opcionalmente el benzoato de sodio a una concentración de desde aproximadamente 0,1 M hasta aproximadamente 0,3 M, o a una concentración de aproximadamente 0,3 M o aproximadamente 0,5 M; y/o

(iv) el alcohol bencílico está a una concentración de desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 4% (v/v), o a una concentración de desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 2% (v/v) o a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) a aproximadamente el 4% (v/v).
3. - El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la disolución de lavado

(i) comprende además un agente de tamponamiento, seleccionándose opcionalmente el agente de tamponamiento del grupo que consiste en fosfato, tris, arginina, acetato y citrato; y/o estando el agente de tamponamiento a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, o a una concentración de aproximadamente 50 mM o 500 mM; y/o

(ii) tiene un pH (a) de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,0, o (b) de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9,0, o (c) de aproximadamente 5,0, aproximadamente 6,0, aproximadamente 7,0, aproximadamente 9,0 o aproximadamente 10,0; y/o

(iii) comprende además:

(a) bencenosulfonato de sodio, estando opcionalmente el bencenosulfonato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,5 M; y/o

(b) ácido caprílico, estando opcionalmente el ácido caprílico a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM; y/o

(c) hexilenglicol, estando opcionalmente el hexilenglicol a una concentración de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10% (v/v); y/o

(d) creatina, estando opcionalmente la creatina a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM; y/o

(e) arginina, estando opcionalmente la arginina a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M o estando la arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M, y/o siendo la arginina arginina-HCl, y/o teniendo la disolución de lavado que comprende arginina un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,0 o un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 10,0;

(iv) comprende además una o más sales no de tamponamiento, estando opcionalmente la una o más sales no de tamponamiento a una concentración de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,0 M, y/o seleccionándose la una o más sales no de tamponamiento del grupo que consiste en cloruro de sodio, bromuro de sodio, cloruro de potasio, bromuro de potasio, cloruro de magnesio, bromuro de magnesio, cloruro de calcio, bromuro de calcio y cualquier combinación de los mismos, o siendo la una o más sales no de tamponamiento cloruro de sodio y/o cloruro de potasio.
4. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la disolución de lavado es una disolución seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una disolución que comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y bicarbonato de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM, que tiene un pH de aproximadamente 10,0;

(ii) una disolución que comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2%, arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M y fosfato de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM, que tiene un pH de aproximadamente 9,0;

(iii) una disolución que comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), que tiene un pH de aproximadamente 7,0;

(iv) una disolución que comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, que tiene un pH de aproximadamente 7,0;

(v) una disolución que comprende hexilenglicol a una concentración de aproximadamente el 10% (v/v), benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), que tiene un pH de aproximadamente 7,0;

(vi) una disolución que comprende bencenosulfonato a una concentración de aproximadamente 0,5 M, benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M y alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v), que tiene un pH de aproximadamente 7,0;

(vii) una disolución que comprende ácido caprílico a una concentración de aproximadamente 50 mM, benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M y cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, que tiene un pH de aproximadamente 7,0;

(viii) una disolución que comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M, que tiene un pH de aproximadamente 6,0;

(ix) una disolución que comprende benzoato de sodio a una concentración de aproximadamente 0,5 M, alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M, que tiene un pH de aproximadamente 5,0; y

(x) una disolución que comprende alcohol bencílico a una concentración de aproximadamente el 2% (v/v) y arginina a una concentración de aproximadamente 0,5 M, que tiene un pH de aproximadamente 5,0.
5. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende, además:

(i) una etapa de lavado de la matriz con una primera disolución antes de lavar la matriz con la disolución de lavado de la etapa (b) en la reivindicación 1, comprendiendo opcionalmente la primera disolución un tampón seleccionado del grupo que consiste en un tampón fosfato, un tampón tris, un tampón acetato, un tampón carbonato, un tampón citrato y cualquier combinación de los mismos, comprendiendo opcionalmente la primera disolución el tampón a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, y/o siendo opcionalmente la primera disolución un tampón fosfato; y/o

(ii) una etapa de lavado de la matriz con una segunda disolución tras lavar la matriz con la disolución de lavado de la etapa (b) en la reivindicación 1, comprendiendo opcionalmente la segunda disolución un tampón seleccionado del grupo que consiste en un tampón fosfato, un tampón tris, un tampón acetato, un tampón carbonato, un tampón citrato y cualquier combinación de los mismos, comprendiendo opcionalmente la segunda disolución el tampón a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, y/o teniendo opcionalmente la segunda disolución un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, y/o comprendiendo opcionalmente la segunda disolución sustancialmente poca sal o nada de sal; y/o

(iii) una etapa de poner en contacto la matriz de cromatografía con proteína A con una disolución de elución tras una o más etapas de lavado, y comprendiendo opcionalmente además la etapa de recoger un eluato que comprende el polipéptido que comprende la región Fc, comprendiendo opcionalmente además una etapa de filtración del eluato por medio de filtración profunda, y/o comprendiendo el eluato menos de aproximadamente 500 partes por millón (ppm) de la una o más impurezas.
6. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en el que

(i) el método da como resultado que el polipéptido que comprende la región Fc se purifique de la una o más impurezas en un grado mayor que un método correspondiente que carece de la etapa de lavar la matriz con la disolución de lavado; y/o

(ii) siendo la una o más impurezas proteínas de célula huésped (HCP), seleccionándose opcionalmente la una o más HCP del grupo que consiste en fosfolipasas, clusterina, serina proteasas, factores de elongación y cualquier combinación de los mismos, y/o siendo la HCP fosfolipasa B de tipo 2 putativa (PLBL2), y/o siendo la célula huésped una célula huésped de mamífero, y/o siendo la célula huésped una célula de ovario de hámster chino (CHO).
7. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en el que

(i) la región Fc es una región Fc humana o una región Fc de ratón, opcionalmente comprendiendo la región Fc humana una región Fc de IgG1, IgG2 o IgG4 humana o comprendiendo la región Fc de ratón una región Fc de IgG1, IgG2 o IgG3 de ratón; y/o

(ii) el polipéptido que comprende la región Fc es un anticuerpo, siendo opcionalmente el anticuerpo un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico, y/o siendo el anticuerpo un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico.
8. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, que comprende además, antes de la etapa (a), ajustar una recolección que comprende el polipéptido que comprende la región Fc para conseguir una concentración final de una sal de benzoato de entre aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 0,5 M y un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0 para producir la muestra que comprende (i) el polipéptido que comprende la región Fc, y (ii) una o más impurezas.
9. - Un método de purificación de un polipéptido que comprende una región Fc, comprendiendo el método las etapas de: (A) ajustar una recolección que comprende el polipéptido que comprende la región Fc para conseguir una concentración final de una sal de benzoato de aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 0,5 M y un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0 para producir una muestra que comprende (i) el polipéptido que comprende la región Fc, y (ii) una o más impurezas; y

(B) poner en contacto la muestra con al menos una matriz de cromatografía.
10. - El método según la reivindicación 8 o 9, en el que

(i) la sal de benzoato es una sal alcalina de benzoato, siendo opcionalmente la sal de benzoato benzoato de sodio; y/o

(ii) la concentración final de la sal de benzoato en la recolección es de entre aproximadamente 0,4 M y aproximadamente 0,5 M; y/o

(iii) el pH de la recolección es de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 8,0 o de entre aproximadamente 8,0 y aproximadamente 9,0; y/o

(iv) la recolección se genera a partir de un cultivo que comprende una célula huésped modificada mediante ingeniería para expresar el polipéptido, siendo opcionalmente la célula huésped una célula huésped eucariota, siendo opcionalmente la célula huésped eucariota una célula de ovario de hámster chino (CHO); y/o

(v) la recolección se clarifica antes del ajuste y/o la recolección se clarifica tras el ajuste.
11. - El método según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que la al menos una matriz de cromatografía comprende una matriz de cromatografía de afinidad, siendo opcionalmente la matriz de cromatografía de afinidad una matriz de cromatografía con proteína A o una matriz de cromatografía con proteína G.
12. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, que comprende además una etapa de

(i) poner en contacto la al menos una matriz de cromatografía con al menos una disolución de lavado; y/o (ii) poner en contacto la al menos una matriz de cromatografía con una disolución de elución, comprendiendo opcionalmente además la etapa de recoger un eluato que comprende el polipéptido que comprende la región Fc, comprendiendo opcionalmente además una etapa de filtración del eluato por medio de filtración profunda, y/o comprendiendo el eluato menos de aproximadamente 500 partes por millón (ppm) de la una o más impurezas.
13. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en el que

(i) el método da como resultado que el polipéptido que comprende la región Fc se purifique de la una o más impurezas en un grado mayor que un método correspondiente que carece de la etapa de ajustar la recolección que comprende el polipéptido que comprende la región Fc para producir la muestra; y/o

(ii) la una o más impurezas son proteínas de célula huésped (HCP), seleccionándose opcionalmente la una o más HCP del grupo que consiste en fosfolipasas, clusterina, serina proteasas, factores de elongación y cualquier combinación de los mismos, y/o siendo la HCP fosfolipasa B de tipo 2 putativa (PLBL2).
14. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en el que

(i) la región Fc es una región Fc humana o una región Fc de ratón, opcionalmente comprendiendo la región Fc humana una región Fc de IgG1, IgG2 o IgG4 humana o comprendiendo la región Fc de ratón una región Fc de IgG1, IgG2 o IgG3 de ratón; y/o

(ii) el polipéptido que comprende la región Fc es un anticuerpo, siendo opcionalmente el anticuerpo un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico, y/o siendo el anticuerpo un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico.