ES2908275T3

ES2908275T3 - Composiciones en polvo para generar espumas de proteínas reticuladas y métodos de uso de las mismas

Info

Publication number: ES2908275T3
Application number: ES16771468T
Authority: ES
Original assignee: Biochange Ltd
Current assignee: Biochange Ltd
Priority date: 2015-04-03
Filing date: 2016-04-01
Publication date: 2022-04-28
Anticipated expiration: 2036-04-01
Also published as: WO2016156992A2; EP3277307A4; CN107921101A; US12268713B2; JP2018513760A; AU2016241383A1; US20250213612A1; WO2016156992A3; JP2021102054A; JP7472051B2; JP7442969B2; AU2016241383B2; US11439663B2; US20200222457A1; KR20180016975A; CN114470337A; CA2981587A1; CN114470337B; IL254605B; CN107921101B

Abstract

Una composición, donde la composición es un andamiaje poroso, donde los poros del andamiaje son de 2 a 500 micras, la composición comprendiendo: a. una proteína reticulable seleccionada del grupo que consiste en colágeno y gelatina; b. un agente de reticulamiento que induce el reticulamiento de la proteína reticulable; y c. un líquido, donde la proteína reticulable se introduce en la composición como un polvo de proteína micronizada, que tiene un perfil de tamaño de micras entre 2 y 100 micras.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones en polvo para generar espumas de proteínas reticuladas y métodos de uso de las mismas

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/142,715, presentada el 3 de abril de 2015, la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/142,725, presentada el 3 de abril de 2015, la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/142,732, presentada el 3 de abril de 2015, solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 62/142,738, presentada el 3 de abril de 2015, solicitud de patente provisional de EE. ^{U u .}No. 62/142,713, presentada el 3 de abril de 2015.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones reticuladas mejoradas que comprenden una proteína reticulable y un material no tóxico que induce la reticulación de la proteína reticulable.

Antecedentes de la invención

Los biomateriales que pueden formar geles in situ son útiles para una variedad de aplicaciones, como, por ejemplo, matrices inyectables para la administración controlada de fármacos, andamiajes inyectables para ingeniería de tejidos o adhesivos para unir tejidos o sellar fugas de gases o fluidos en un entorno fisiológico.

El documento US 2014/0314732 A1 se refiere a composiciones que comprenden una proteína o polipéptido reticulable y un material no tóxico que induce la reticulación de la proteína reticulable. Las composiciones se preparan opcional y preferentemente en un disolvente tampón no fosfato. Opcional y preferiblemente, la proteína reticulable incluye gelatina y cualquier variante de gelatina o proteína variante como se describe en este documento. Opcional y preferentemente, el material no tóxico comprende transglutaminasa (TG), que opcionalmente puede comprender cualquier tipo de transglutaminasa dependiente o independiente del calcio, que puede ser, por ejemplo, opcionalmente una transglutaminasa microbiana (mTG).

El documento US 2011/0112573 A1 se refiere a un sellador médico biocompatible para su uso en un sistema biológico, comprendiendo el sellador una solución de una proteína o polipéptido reticulable y una solución de un material reticulante no tóxico que induce la reticulación de dicha proteína reticulable, sellando así al menos una parte del sistema biológico.

Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere a una composición según la reivindicación independiente 1, donde se proporcionan desarrollos adicionales de la composición inventiva en las subreivindicaciones, respectivamente.

En una realización, el líquido es un tampón fisiológico.

En una realización, la composición es una espuma.

En una realización (que no forma parte de la invención reivindicada), la proteína reticulable se introduce en la composición como un polvo de proteína micronizada, que tiene un tamaño medio de partícula entre 5 y 200 micras.

En una realización, la proteína reticulable comprende gelatina de fuerza de gelificación de 200 a 300.

En una realización, la gelatina reticulable está presente en la composición en el intervalo de 0,5 % en peso

25 % en peso.

En una realización (que no forma parte de la invención reivindicada), se proporciona una composición que comprende: a) gelatina reticulable;

b) una transglutaminasa que induce la reticulación de la gelatina reticulable; y

c) un líquido,

donde la composición es un andamiaje poroso, que tiene un tamaño de poro de 2 a 500 micras,

donde la gelatina reticulable se introduce en la composición como un polvo de gelatina micronizada, que tiene un tamaño de partícula entre 5 y 200 micras,

donde la gelatina reticulable es de fuerza de gelificación de 200 a 300,

donde la gelatina reticulable está presente en la composición en el rango de 0,5% en onde la transglutaminasa está presente en la composición en el rango de 0,0001% en peso a 2% en peso.

En una realización, el líquido es un tampón fisiológico.

En una realización, la composición se forma in situ en un paciente en un sitio donde el paciente necesita el tratamiento de un defecto tisular.

En una realización, la composición se forma antes de introducir la composición en un paciente en un sitio donde el paciente necesita el tratamiento de un defecto tisular.

En una realización, la presente invención proporciona la composición inventiva para usar en un método, donde los métodos tratan un defecto tisular o una enfermedad en un paciente que lo necesita, que comprende:

a) introducir la composición en el paciente en el sitio del defecto del tejido, en una cantidad suficiente para tratar el defecto o la enfermedad del tejido;

donde la composición se adhiere al tejido en el sitio del defecto.

a) formar la composición en el paciente en el sitio del defecto del tejido, en una cantidad suficiente para tratar el defecto o la enfermedad del tejido;

donde la composición se adhiere al tejido en el sitio del defecto.

En una realización, el defecto tisular es una herida.

En una realización, el tejido está deteriorado y necesita regeneración.

En una realización, el defecto tisular es un defecto óseo.

En una realización, la composición induce la regeneración ósea en el paciente.

En una realización, la enfermedad es incontinencia fecal.

En una realización, la enfermedad es incontinencia urinaria.

En una realización, la enfermedad es enfisema.

En una realización, al menos un tipo de célula se infiltra y crece en la composición.

En una realización, el al menos un tipo celular es un tipo celular del grupo que consiste en: células madre pancreáticas, células enteroendocrinas, osteocitos, hepatocitos, tenocitos, miocitos, hematocitos, condrocitos, células epiteliales, células endoteliales, neuronas, células madre embrionarias, células madre mesenquimales, células madre mesenquimales autólogas derivadas de médula, células progenitoras, células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimales, células madre neurales, células madre del sistema óseo, células madre de la línea de condrocitos, células madre epiteliales y células madre hepáticas.

En una realización, la presente invención proporciona la composición inventiva para usar en un método, donde el método reduce el volumen pulmonar en un paciente, que comprende:

a) colapsar una región objetivo en el pulmón del paciente;

b) introducir la composición en el paciente en el sitio de la región colapsada en una cantidad suficiente para adherir una primera parte de la región colapsada a una segunda porción de la región colapsada;

donde adherir la primera parte de la región colapsada a la segunda parte de la región colapsada reduce el volumen pulmonar del paciente,

donde la composición está configurada para promover la unión de fibroblastos y la síntesis de colágeno,

donde la unión de fibroblastos y la síntesis de colágeno previenen la inflamación.

a) introducir la composición en el paciente en el sitio de la región pulmonar en una cantidad suficiente para reducir el volumen pulmonar;

a) colapsar una región objetivo en el pulmón del paciente;

b) formar la composición en el paciente en el sitio de la región colapsada en una cantidad suficiente para adherir una primera porción de la región colapsada a una segunda porción de la región colapsada;

a) formar la composición en el paciente en el sitio de la región pulmonar en una cantidad suficiente para reducir el volumen pulmonar;

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que muestra la distribución del tamaño de partícula de la proteína micronizada según algunas realizaciones de la presente invención.

La figura 2A es una imagen que muestra un dispositivo para administrar una composición según algunas realizaciones de la presente invención a la uretra de un paciente. La figura 2B es una imagen que muestra la formación de una composición según algunas realizaciones de la presente invención in situ en la uretra del paciente.

La figura 3 es una imagen de un dispositivo según algunas realizaciones de la presente invención para formar una composición de la presente invención.

La figura 4 es una imagen de una composición según algunas realizaciones de la presente invención adherida a un sitio de lesión intestinal.

La figura 5 es una imagen de una composición según algunas realizaciones de la presente invención inyectada en el esfínter anal de un cerdo.

La figura 6 es una imagen de una composición de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención que rellena defectos óseos mandibulares. La Figura 6 B muestra la mandíbula izquierda de un perro: A - premolar 2 del diente intacto; B - alvéolo vacío de control sin compuesto de prueba; C - MIS 4 HUESO solo; D Compuesto de ensayo mixto que contiene MIS 4 BOND y espuma de gelatina/GAG reticulada. En la Figura 6 C, se muestra la mandíbula derecha de un perro: A - premolar 2 de diente sano; B - alvéolo vacío; C - MIS 4 BOND solo; D - espuma de gelatina reticulada sola.

La figura 7 es una imagen de una composición según algunas realizaciones de la presente invención inyectada en la uretra de un cerdo.

La figura 8 es una micrografía de una composición según algunas realizaciones de la presente invención.

La figura 9 es una imagen de un aparato de molienda a chorro según algunas realizaciones de la presente invención. La figura 10 muestra la viabilidad de las células sembradas en una composición de andamiaje según algunas realizaciones de la presente invención.

La figura 11 es una imagen de una composición de andamiaje según algunas realizaciones de la presente invención. Descripción detallada de la invención

Para mayor claridad de la divulgación, y no como limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, realizaciones o aplicaciones de la presente invención.

A lo largo de la especificación y las reivindicaciones, los siguientes términos tienen los significados asociados explícitamente en este documento, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Las frases "en una realización" y "en algunas realizaciones" como se usan en el presente documento no se refieren necesariamente a la(s) misma(s) realización(es), aunque puede que sí. Además, las frases "en otra realización" y "en algunas otras realizaciones" tal como se utilizan en el presente documento no se refieren necesariamente a una realización diferente, aunque es posible que lo hagan. Así, como se describe a continuación, se pueden combinar fácilmente varias realizaciones de la invención.

Además, como se usa en este documento, el término "o" es un operador "o" inclusivo y es equivalente al término "y/o", a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "basado en" no es excluyente y permite estar basado en factores adicionales no descritos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, a lo largo de la especificación, el significado de "un", "una" y "el" incluyen referencias en plural. El significado de "en" incluye "en" y "sobre".

"Gelatina", como se usa en este documento, se obtiene por hidrólisis parcial de tejido animal o colágeno obtenido de tejido animal, donde el tejido animal se selecciona del grupo que consiste en piel animal, tejido conectivo, cornementa, cuernos, huesos, escamas de pescado y un compuesto recombinante. gelatina producida utilizando sistemas de bacterias, levaduras, animales, insectos o plantas o cualquier tipo de cultivo celular, o cualquier combinación de los mismos.

"Fuerza de gelificación", tal como se usa aquí, se define como el peso en gramos requerido para presionar un émbolo de media pulgada de diámetro y 4 mm en una solución de gelatina que contiene 6% de sólidos gelificados a 10 °C durante 17 horas.

"Vehículo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero, una proteína, un polisacárido o cualquier otro constituyente que se une a la enzima de reticulación de forma covalente o no covalente, ya sea antes o durante la reacción de reticulación.

"Copolímero", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un constituyente de la matriz que puede participar en la reacción de reticulación y normalmente no es el constituyente principal de la matriz. El copolímero normalmente no se une covalentemente a la enzima o al material de la matriz, como la base proteica de la matriz. Los ejemplos no limitativos de copolímeros son polisacáridos, como dextrano, y/o un polímero celulósico, como carboximetilcelulosa. "Enzima reticulante", como se usa en el presente documento, se refiere a al menos una enzima (por ejemplo, pero sin limitarse a, 1 enzima, 2 enzimas, 3 enzimas, 4 enzimas, 5 enzimas, etc.) que puede directamente (por ejemplo, pero no limitado a, transglutaminación) o indirectamente (por ejemplo, pero sin limitarse a, quinona o formación de radicales libres) reticular grupos de sustratos y hebras de polímero para formar una matriz, tal como, pero sin limitarse a, un hidrogel.

"Difusión" o "movilidad", como se usa en el presente documento, se refiere al movimiento molecular aleatorio de, por ejemplo, pero sin limitarse a, enzima(s) y/u otras moléculas, por ejemplo, pero sin limitarse a, cualquier proteína, hidrógeno o matriz, es decir, están en solución, lo que puede resultar del movimiento browniano.

"Coeficiente de difusión" o "difusividad" como se define en el presente documento se refiere a un término que cuantifica el grado de difusión para un único tipo de molécula en condiciones específicas. Específicamente, el coeficiente de difusión o difusividad es una proporcionalidad constante entre el flujo molar debido a la difusión molecular y el gradiente en la concentración de las especies (o la fuerza motriz para la difusión). El método de medición, es decir, la tasa y/o la cantidad total de enzima eluida por el hidrogel, se lleva a cabo midiendo la elución de enzima de un hidrogel.

"Volumen hidrodinámico", tal como se define en el presente documento, se refiere al peso molecular de una proteína o enzima que normalmente se puede medir usando cromatografía de exclusión por tamaño. El volumen hidrodinámico de un constituyente se refiere al diámetro y/o volumen que asume el constituyente cuando está en movimiento en forma líquida.

"Matriz", tal como se define en el presente documento, se refiere a una composición de materiales reticulados. Normalmente, cuando los materiales que forman la matriz se reticulan, la composición que incluye estos materiales pasa de un estado líquido a un estado de gel, formando así un "gel", un "hidrogel" o una "composición gelificada".

"Peso molecular", abreviado como "MW (por sus siglas en inglés)", como se usa en el presente documento, se refiere al peso absoluto en Daltons o kilodaltons de proteínas o polímeros. Por ejemplo, el MW de una proteína PEGilada (por ejemplo, pero sin limitarse a, proteína a la que se han acoplado una o más moléculas de PEG (polietilenglicol)) es la suma del MW de todos sus constituyentes.

"Paciente", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal que necesite tratamiento de acuerdo con los métodos de la presente invención.

"Volumen percibido" o "volumen efectivo", tal como se define en el presente documento, se refiere al volumen hidrodinámico efectivo de la enzima reticulante dentro de la matriz reticulada. El volumen percibido se puede aumentar mediante la unión covalente o no covalente de la enzima a otra molécula, vehículo, polímero, proteína, polisacárido y otros, antes de la reacción de reticulación o durante la reacción de reticulación.

"Polímero", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula natural, sintética o semisintética, que contiene una unidad repetible.

"Movilidad reducida", como se define en el presente documento, se refiere a un movimiento molecular más lento o un coeficiente de difusión más pequeño de una proteína o enzima en una solución o dentro de un hidrogel y puede medirse por la velocidad de elución.

"Tamaño", tal como se define aquí, se refiere al peso molecular o volumen hidrodinámico o volumen percibido de una molécula.

"Molienda", tal como se define en el presente documento, se refiere a moler el material mediante cualquiera de los siguientes métodos: molienda a chorro, molienda por torbellino/vórtice, molienda por bolas, homogeneización y microfluidización a alta presión, secado por aspersión, recristalización, extracción con emulsión-disolvente y métodos que utilizan fluidos supercríticos como la Expansión Rápida de Soluciones Supercríticas (RESS).

La "molienda a chorro" se refiere al método de micronización por molienda en torbellino o vórtice.

La proteína reticulable

De acuerdo con al menos algunas realizaciones para el método y/o la matriz, el al menos un polímero de sustrato comprende un polímero de sustrato seleccionado del grupo que consiste en un polímero reticulable de forma natural, un polímero parcialmente desnaturalizado que es reticulable por la enzima y un polímero que comprende un grupo funcional o un péptido que es reticulable por la enzima no modificada o modificada. Opcionalmente, el al menos un polímero de sustrato comprende gelatina, colágeno, caseína o albúmina, o un polímero modificado, y donde la molécula de enzima modificada comprende una transglutaminasa y/o una enzima oxidativa, una transglutaminasa modificada y/o una enzima oxidativa modificada. Opcionalmente, el al menos un polímero de sustrato comprende gelatina seleccionada del grupo que consiste en gelatina obtenida por hidrólisis parcial de tejido animal o colágeno obtenido a partir de tejido animal, donde el tejido animal se selecciona del grupo que consiste en piel animal, tejido conectivo, cornamenta, cuernos, huesos, escamas de pescado y una gelatina recombinante producida utilizando sistemas bacterianos, de levadura, animales, insectos o plantas o cualquier tipo de cultivo celular, o cualquier combinación de los mismos. Opcionalmente, la gelatina es de origen mamífero o pescado. Opcionalmente la gelatina es de tipo A (Tratada con Ácido) o de tipo B (Tratada con Alcalino). Opcionalmente la gelatina es de fuerza de gelificación de 250-300. En algunas realizaciones, la gelatina tiene un peso molecular promedio de 75 a 150 kDa.

En algunas realizaciones, los polímeros sintéticos o parcialmente sintéticos con uno o más grupos funcionales adecuados también podrían servir como sustratos reticulables para cualquiera de las enzimas descritas en el presente documento. En otra realización de la presente invención, se usa una combinación de enzimas. En otra realización de la presente invención, se usa una combinación de agentes de reticulamiento, no necesariamente solo una enzima.

En algunas realizaciones, el polímero reticulable contiene al menos un motivo RGD (Arg-Gly-Asp). En algunas realizaciones, el al menos un motivo RGD promueve la unión celular a la composición de la presente invención.

En algunas realizaciones, el polímero reticulable contiene una distribución desigual de motivos RGD que pueden actuar como andamiaje para las células, independientemente del tipo de célula o del estado de motilidad, lo que lo convierte en un andamiaje celular polivalente.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un polímero reticulable con unión celular mejorada y compatibilidad de motilidad a través de la presentación polivalente de motivos RGD.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un polipéptido reticulable no recombinante con unión celular mejorada y compatibilidad de motilidad a través de la presentación polivalente de motivos RGD.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una gelatina con unión celular mejorada y compatibilidad de motilidad a través de la presentación polivalente de motivos RGD.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una gelatina no recombinante con unión celular mejorada y compatibilidad de motilidad a través de la presentación polivalente de motivos RGD.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una gelatina micronizada con compatibilidad mejorada de unión celular y motilidad a través de la presentación polivalente de motivos RGD.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un andamiaje poroso, tal como una espuma de gelatina con compatibilidad mejorada de adhesión celular y motilidad a través de la exhibición polivalente de motivos RGD.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un andamiaje poroso reticulado, como una espuma de gelatina con al menos un 5 % p/p de gelatina, con compatibilidad de motilidad y unión celular mejorada a través de la presentación polivalente de motivos RGD.

La presente invención proporciona así un andamiaje poroso reticulado, tal como una espuma de gelatina con 10-25 % p/p de gelatina, con compatibilidad de motilidad y unión celular mejorada a través de la presentación polivalente de motivos RGD.

Por lo tanto, la presente invención proporciona cualquiera de las composiciones indicadas con adición de fibrina.

"Hebras de polímero" o "cadenas de polímero", como se define en el presente documento, se refiere al polímero sustrato para la reticulación enzimática, que, según al menos algunas realizaciones de la presente invención, pertenece a una de las siguientes categorías (solo como ejemplos no limitativos):

1) Cualquier polímero con grupos de sustrato que son reticulable de forma natural por la enzima y que es en sí mismo reticulable de forma natural por la enzima. Por ejemplo, en el caso de las transglutaminasas, esto incluiría proteínas o polipéptidos como la gelatina, el colágeno y la caseína, que son naturalmente reticulables por la enzima.

2) Polímeros que contienen grupos sustrato reticulables por la enzima pero que no son reticulables de forma natural por la enzima como resultado de su estructura. En tales casos, la estructura del polímero debe modificarse antes de la reticulación enzimática. Por ejemplo, en el caso de las transglutaminasas, esto incluiría proteínas, como la albúmina o la lactoglobulina, que no son sustratos naturales de la enzima porque tienen una estructura globular que dificulta el acceso de la enzima. Estos se pueden convertir en sustratos desnaturalizando parcialmente la proteína usando agentes reductores, agentes desnaturalizantes o calor.

3) Polímeros, naturales o sintéticos, que no son sustratos para la reticulación enzimática pero que han sido modificados con péptidos o grupos funcionales que son sustratos de la enzima, haciendo así que la enzima pueda reticular el polímero modificado. Los ejemplos no limitantes de dichos polímeros incluyen cualquier tipo adecuado de proteína, que puede, por ejemplo, comprender gelatina como se indicó anteriormente. La gelatina puede incluir cualquier tipo de gelatina que comprenda proteína conocida en la técnica, incluida, entre otras, gelatina obtenida por hidrólisis parcial de tejido animal y/o colágeno obtenido a partir de tejido animal, incluida, entre otras, piel animal, tejido conjuntivo (incluidos, entre otros, ligamentos, cartílagos y similares), cornamenta o cuernos y similares, y/o huesos, y/o escamas de pescado y/o huesos u otros componentes; y/o una gelatina recombinante producida utilizando sistemas de bacterias, levaduras, animales, insectos o plantas o cualquier tipo de cultivo celular, o cualquier combinación de los mismos.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la gelatina de origen animal puede incluir gelatina de origen mamífero, por ejemplo, pero sin limitarse a, uno o más de pieles de cerdo, huesos de cerdo y ganado, o pieles divididas de ganado, o cualquier otra fuente de piel de cerdo o bovino, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la gelatina puede incluir gelatina porcina ya que tiene una menor tasa de anafilaxia. La gelatina de origen animal puede ser opcionalmente de tipo A (Tratada con Ácido) o de tipo B (Tratada con Álcali), aunque puede ser de tipo A.

En algunas realizaciones, la gelatina de origen animal comprende gelatina obtenida durante una primera extracción, que generalmente se realiza a temperaturas más bajas (50-60 °C, aunque este rango de temperatura exacto no es necesariamente una limitación). La gelatina producida de esta manera estará en el rango de fuerza de gelificación de 250-300 y tiene un alto peso molecular de al menos alrededor de 95-100 kDa. En algunas realizaciones, se usa gelatina de fuerza de gelificación 275-300. Un ejemplo no limitativo de un productor de tales gelatinas es PB Gelatins (Tessenderlo Group, Bélgica).

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la gelatina de origen animal puede incluir gelatina de pescado. En algunas realizaciones, se puede usar cualquier tipo de pescado, por ejemplo, una variedad de pescado de agua fría como la carpa, el bacalao, el lucio o el atún. En algunas realizaciones, el pH de la gelatina de pescado (medido en una solución al 10 %) puede oscilar entre pH 4 y pH 6.

En algunas realizaciones, la gelatina de pescado de agua fría forma una solución en agua a 10°C. En algunas realizaciones, la fuerza de gelificación de la gelatina de pescado de agua fría es 0. En algunas realizaciones, se puede usar una gelatina de pescado de agua fría de alto peso molecular, que incluye un peso molecular promedio de al menos aproximadamente 95-115 kDa (donde la gelatina de pescado de agua fría puede ser comparable al peso molecular de una gelatina animal con fuerza de gelificación de 250-300). En algunas realizaciones, la gelatina de pescado de agua fría sufre una gelificación termorreversible a temperaturas más bajas que la gelatina animal debido a las cantidades reducidas de prolina e hidroxiprolina. Un ejemplo no limitativo de un productor de dicha gelatina es Norland Products (Cranbury, NJ).

En algunas realizaciones de la presente invención, se usa gelatina de baja endotoxicidad para formar el componente de solución de gelatina de la composición de matriz de gelatina. En algunas realizaciones, la gelatina de baja endotoxicidad está disponible comercialmente de proveedores como Gelita™ (Eberbach, Alemania). Como se usa aquí, la gelatina de baja endotoxicidad se define como gelatina con menos de 1000 unidades de endotoxicidad (EU) por gramo. En algunas realizaciones, se usa gelatina de endotoxicidad inferior a 500 UE/gramo.

En algunas realizaciones, cuando se generan materiales que entrarán en contacto con el cerco o el cerebro, se usa gelatina con endotoxicidad de menos de 100 UE/gramo (por ejemplo, entre 1-100 UE/gramo). En algunas realizaciones, se usa gelatina con menos de 50 EU/g. En algunas realizaciones, se puede usar gelatina con endotoxicidad inferior a 10 EU/g.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, el tipo I, el tipo II o cualquier otro tipo de colágeno hidrolizado o no hidrolizado reemplaza a la gelatina como materia proteica que se está reticulando. Varios tipos de colágeno han demostrado la capacidad de formar geles reticulados de mTG térmicamente estables. Tal como, por ejemplo, como se informa en la publicación "Caracterización de un andamiaje de colágeno de tipo II reticulado con transglutaminasa microbiana"; PMID:16846344.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, se usa una gelatina humana recombinante. En algunas realizaciones, una gelatina humana recombinante está disponible comercialmente de proveedores como Fibrogen™ (San Francisco, CA). En algunas realizaciones, la gelatina recombinante puede tener una pureza de al menos un 90 % (por ejemplo, 90,01 - 100 %). En algunas realizaciones, la gelatina recombinante puede tener una pureza de al menos aproximadamente el 95 % (por ejemplo, 95,01 - 100 %). En algunas realizaciones, las gelatinas recombinantes pueden no gelificarse a 10 °C y, por lo tanto, se considera que tienen una fuerza de gelificación de 0. Para algunas realizaciones de la presente invención, se puede usar una gelatina recombinante de alto peso molecular, por ejemplo, pero sin limitarse a, que incluye un peso molecular de al menos aproximadamente 95-100 kDa.

En algunas realizaciones, la proteína reticulable puede comprender gelatina pero también, adicional o alternativamente, puede comprender otro tipo de proteína. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la proteína también es un sustrato para la transglutaminasa. En algunas realizaciones, los sustratos para la transglutaminasa pueden incluir colágeno u otras secuencias de polímeros sintetizados que, de forma independiente, tienen las propiedades para formar un bioadhesivo o polímeros que han sido modificados con sustratos específicos de transglutaminasa que aumentan la capacidad del material para reticularse mediante transglutaminasa. La composición también puede incluir fibrina.

En realizaciones ejemplares, las secuencias polipeptídicas y poliméricas sintetizadas con un objetivo de transglutaminasa apropiado para la reticulación pueden tener puntos de transición de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 °C. En algunas realizaciones, las características físicas incluyen, pero no se limitan a, la capacidad de unir tejido y la capacidad de formar fibras. Los ejemplos no limitantes de dichos péptidos se describen en las patentes E.E.U.U. No. 5.428.014 y 5.939.385 que describen polipéptidos biocompatibles, bioadhesivos y reticulables con transglutaminasa donde la transglutaminasa cataliza una reacción de transferencia de acilo entre el grupo y -carboxamida de los residuos de glutaminilo unidos a proteína y el grupo £-amino de los residuos de Lys, lo que resulta en la formación de enlaces isopeptídicos de 8-(y-glutamil) lisina.

En algunas realizaciones, el compuesto de la presente invención es una gelatina sustancialmente seca configurada para hidratarse rápidamente con líquidos fríos o calientes (por ejemplo, pero sin limitarse a, líquidos entre 4 °C y 37 °C) para formar un andamiaje poroso, gel o espuma, donde el andamiaje poroso, el gel o la espuma se configura además para formarse y moldearse en cualquier cavidad, ex vivo o in vivo, cavidad corporal, en una herida, en un órgano o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la gelatina no reticulada se hace reaccionar/se mezcla con el reticulante después de que la gelatina no reticulada y el reticulante se hidratan/reconstituyen, donde la mezcla de la gelatina no reticulada y el reticulante da como resultado en la formación de un gel, espuma o andamiaje poroso estable, no soluble, no termorreversible.

Como se usa en este documento, el efecto del tamaño de partícula sobre la constante de solubilidad se puede cuantificar de la siguiente manera:

donde *K^aes la constante de solubilidad para las partículas de soluto con el área superficial molar A,

*Ka^ 0 es la constante de solubilidad de una sustancia con un área de superficie molar que tiende a cero (es decir, cuando las partículas son grandes),

y es la tensión superficial de la partícula de soluto en el solvente, Am es el área superficial molar del soluto (en m2/mol), R es la constante universal de los gases y T es la temperatura absoluta.

Una técnica típica para la preparación de partículas de tamaño micrométrico de fármacos y proteínas es la trituración mecánica (por ejemplo, machacando, triturando y moliendo) de partículas más grandes previamente formadas. En algunas realizaciones del método de la presente invención, la molienda se logra mediante mortero y en otra realización preferida en Molienda a chorro. La Figura 1 ilustra la distribución del tamaño de partículas después de la micronización por molienda a chorro.

En algunas realizaciones, el método de la presente invención incluye preparar una proteína seca de disolución rápida de proteína no reticulada (por ejemplo, gelatina, pero sin limitarse a ella). En algunas realizaciones (que no forman parte de la invención reivindicada), la gelatina se prepara mediante molienda a chorro para lograr un tamaño de partícula entre 2 y 250 micras. En algunas realizaciones (que no forman parte de la invención reivindicada), el tamaño de partícula está entre 5 y 130 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 10 y 80 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 10 y 70 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 10 y 60 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 10 y 50 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 10 y 40 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 10 y 30 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 10 y 20 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 2 y 10 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 10 y 100 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 20 y 100 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 30 y 100 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 40 y 100 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 50 y 100 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 60 y 100 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 70 y 100 micras. En

algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 80 y 100 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 90 y 100 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 5 y 50 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 10 y 20 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 10 y 15 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 15 y 20 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula está entre 12 y 18 micras.

En algunas realizaciones, el método de la presente invención incluye molienda a chorro, donde la molienda a chorro da como resultado la preparación de la superficie de cada partícula de gelatina (cristal) para una disolución rápida (por ejemplo, pero sin limitarse a, disolución en 0,01 segundo - 60 segundos) en líquidos (es decir, la partícula molida por chorro resultante muestra sorprendentemente características higroscópicas aumentadas en comparación con el material de partida no molido por chorro). En algunas realizaciones, la partícula molida por chorro se puede mezclar con un agente de reticulamiento para dar como resultado la formación de una espuma o hidrogel térmicamente estable y adherente al tejido. En algunas realizaciones, el andamiaje poroso, gel/espuma puede colocarse dentro de una cavidad corporal y/o entre capas de tejido de un ser humano o animal. En algunas realizaciones, la presente invención se puede utilizar para diversas aplicaciones médicas. En algunas realizaciones, la presente invención se puede utilizar como un andamiaje celular que presenta una exposición y accesibilidad mejoradas de los sitios de unión de la integrina (como los motivos RGD).

En algunas realizaciones (que no forman parte de la invención reivindicada), se prepara una gelatina moliéndola en un tamaño de partícula pequeño, para dar como resultado un perfil de reticulamiento aumentado, donde la gelatina preparada se caracteriza por tener un perfil de tamaño de micras entre 2 y 200 micras. En algunas realizaciones, se prepara una gelatina moliéndola en un tamaño de partícula pequeño, para dar como resultado un perfil de reticulación incrementado, donde la gelatina preparada se caracteriza por tener un perfil de tamaño de micras entre 2 y 100 micras.

En algunas realizaciones, se prepara una gelatina moliéndola en un tamaño de partícula pequeño, para dar como resultado un perfil de reticulación incrementado, donde la gelatina preparada se caracteriza por tener un perfil de tamaño de micras entre 2 y 50 micras. En algunas realizaciones (que no forman parte de la invención reivindicada), se prepara una gelatina moliéndola en un tamaño de partícula pequeño, para dar como resultado un perfil de reticulamiento aumentado, donde la gelatina preparada se caracteriza por tener un perfil de tamaño de micras entre 50 y 150 micras.

En algunas realizaciones (que no forman parte de la invención reivindicada), se prepara una gelatina moliéndola en un tamaño de partícula pequeño, para dar como resultado un perfil de reticulamiento aumentado, donde la gelatina preparada se caracteriza por tener un perfil de tamaño de micras entre 100 y 150 micras. En algunas realizaciones, se prepara una gelatina mediante molienda a chorro para dar como resultado un perfil de reticulamiento incrementado, donde la gelatina preparada se caracteriza por tener un perfil de tamaño de micras. En algunas realizaciones, la gelatina previamente reticulada puede (1) liofilizarse y luego (2) molerse por chorro para producir una gelatina en polvo seca (es decir, "gelatina de alta fuerza de gelificación"), donde la gelatina en polvo seca puede solubilizarse en una solución para generar una solución a una temperatura entre, por ejemplo, pero sin limitarse a, 5°C - 37°C, en un período de tiempo igual o inferior a 120 segundos (es decir, entre 0,01 segundos - 120 segundos).

En una realización, el aparato de molienda y el método son los descritos en la patente de EE. UU. No. 5.855.326. En otra realización, el aparato de molienda es como se describe en la patente de EE. UU. No. 6.789.756. Un ejemplo de un aparato de molienda de este tipo es el SuperFine Vortex Mill™ fabricado por SuperFine Ltd. de Yokneam, Israel (mostrado esquemáticamente en la FIG. 9). La patente de EE. UU. No. 5.855.326 de Beliaysky describe una cámara de molienda de torbellino para la trituración fina de un material sólido en partículas, la cámara se forma en un alojamiento que tiene una forma sustancialmente cilíndrica con dos caras de los extremos y una pared lateral provista de una o más boquillas tangenciales para la inyección de un fluido de trabajo en la cámara y creando un vórtice en ella, comprendiendo dicha cámara medios para la introducción allí en un material sólido en partículas para ser triturado, un pasaje de descarga dispuesto axialmente provisto en una o ambas caras extremas, y medios de control en forma de uno o más elementos mecánicos adaptados para interactuar, cuando se crea el vórtice, con sus capas moviéndose cerca de las paredes internas de la cámara, permitiendo así el control de la trituración. El funcionamiento de la cámara de torbellino se ejemplifica en la patente usando arena. La patente de EE. UU. No. 6.789.756 de Beliaysky describe un molino de vórtice mejorado para moler un material sólido sustancialmente en partículas, que incluye una o más cámaras de trabajo. El molino también incluye una o más entradas de fluido de trabajo y uno o más puertos de descarga. Una o más entradas de fluido de trabajo junto con uno o más puertos de descarga facilitan el flujo de vórtice dentro de una o más cámaras de trabajo. También hay una o más entradas de alimentación para proporcionar la molienda del material sólido, que se descarga desde uno o más puertos de descarga. Además, hay un aparato para inducir perturbaciones controladas en el flujo del fluido de trabajo en una o más cámaras de trabajo, para mejorar así la molienda del material sólido en el flujo de vórtice.

En algunas realizaciones, el método de la presente invención puede incluir el uso de energía de haz de plasma para aumentar la higroscopia superficial de las partículas de gelatina, donde la gelatina micronizada resultante tratada con energía de haz de plasma tiene sustancialmente las mismas características/propiedades que la gelatina sin tratamiento con haz de plasma. En algunas realizaciones, las sustancias/compuestos adicionales para mezclar con la gelatina, por ejemplo, pero sin limitarse a, transglutaminasa microbiana, sustancias de aumento óseo, proteína y copolímeros para mezclar en el producto final, o cualquier combinación de los mismos, pueden tratarse con energía del haz de plasma.

En algunas realizaciones, la composición de la presente invención se puede caracterizar como un polvo de gelatina en partículas higroscópicas, cuando se mezcla con un líquido durante un período de tiempo entre 0,01 y 120 segundos, se configura para solubilizarse en gel o espuma fluidos. En algunas realizaciones, se puede proporcionar un líquido como parte de la formulación del producto (es decir, un kit), cargado en una jeringa por un médico (por ejemplo, una enfermera, un médico, un asistente médico, etc.) en el punto de cuidado, antes de la mezcla. En algunas realizaciones, la gelatina seca, sola o mezclada con un agente de reticulamiento, o tanto la gelatina como el agente de reticulamiento junto con una malla quirúrgica, pueden aplicarse directamente al cuerpo y activarse mediante la aplicación de fluidos (es decir, solución salina) o por fluidos corporales (es decir, líquidos endógenos de un cuerpo) cuando están en contacto con tejido húmedo. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina molida puede hidratarse a temperaturas de entre 4 y 40 °C. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina molida puede hidratarse a temperaturas de entre 4 y 20 °C. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina molido puede hidratarse a temperaturas de entre 4 y 15 °C. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina molida puede hidratarse a temperaturas de entre 10 y 25 °C. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina molida puede hidratarse a temperaturas de entre 25 y 37 °C. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina molido puede hidratarse a temperaturas de entre 15 y 25 °C. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina molida puede hidratarse a temperaturas de entre 20 y 25 °C. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina molida puede hidratarse a temperaturas de entre 10 y 20 °C. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina molido puede hidratarse a temperaturas de entre 12 y 18 °C. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina molida puede hidratarse a temperaturas de entre 14 y 19 °C (que es el rango de temperatura de un quirófano). En algunas realizaciones, el polvo de gelatina molido puede hidratarse a temperaturas de aproximadamente 16 °C. En algunas realizaciones, la gelatina disuelta de la presente invención está configurada para mantener una forma fluida, incluso a temperaturas inferiores a 37 °C (es decir, la gelatina disuelta no cruzará inmediatamente su punto de transición de líquido a gel para convertirse en un sólido no trabajable).

En algunas realizaciones, la gelatina disuelta de la presente invención puede administrarse a través de una aguja larga, un catéter o un endoscopio. En algunas realizaciones, la gelatina disuelta de la presente invención cuando se espuma tiene una viscosidad menor que un hidrogel de gelatina confluente de la misma composición.

En algunas realizaciones, el método de la presente invención incluye preparar/esterilizar gelatina usando energía de radiación, donde la gelatina irradiada resultante tiene propiedades funcionales sustancialmente similares (por ejemplo, capacidad de reticulación) en comparación con la gelatina de partida no irradiada.

En algunas realizaciones, el método de la presente invención incluye preparar/esterilizar gelatina utilizando energía de radiación, donde la gelatina irradiada resultante tiene al menos el 25 % de las propiedades funcionales (por ejemplo, capacidad de reticulación) en comparación con la gelatina de partida no irradiada. En algunas realizaciones, el método de la presente invención incluye preparar/esterilizar gelatina utilizando energía de radiación, donde la gelatina irradiada resultante tiene entre 25 y 100 % de las propiedades funcionales (por ejemplo, capacidad para reticularse) en comparación con la gelatina de partida no irradiada.

En algunas realizaciones, el método de la presente invención incluye mezclar un polvo de gelatina con componentes activos adicionales, por ejemplo, pero sin limitarse a, estabilizantes (por ejemplo, pero sin limitarse a: EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida), NHS (N-hidroxisuccinimida), carbomiida, gluteradhyde, peroxidasa de rábano picante y/o transglutaminasa), donde la mezcla de gelatina y estabilizador forma un andamiaje, gel o espuma porosa estable, donde la forma del andamiaje, gel o espuma poroso no es reversible (es decir, debido a enlaces cruzados de enlace covalente entre moléculas de gelatina). En algunas realizaciones, la reticulación del andamiaje, gel o espuma porosos de gelatina (es decir, estabilización) puede ocurrir fuera o dentro del cuerpo del ser humano o animal.

En algunas realizaciones, el método de la presente invención incluye secar un polímero como una proteína y/o un polipéptido, donde la proteína y/o el polipéptido es un colágeno y/o gelatina y/o cualquier variante de gelatina, para dar como resultado un polímero seco que tiene un perfil de reconstitución sustancialmente más rápido (por ejemplo, entre 0,01 segundos y 60 segundos de reconstitución) en líquidos en comparación con la gelatina no pulverizada típica, incluso en entornos que son líquidos fríos o a temperatura ambiente (por ejemplo, entre otros, a, líquidos entre 5°C a 37°C). En algunas realizaciones ejemplares no limitantes, un polvo de gelatina se puede caracterizar por tener (1) una vida útil sustancialmente más larga (por ejemplo, entre 1 mes y 36 meses) y (2) una reconstitución/solubilidad sustancialmente más rápida. En algunas realizaciones, el polímero seco se esteriliza, y el polímero seco esterilizado exhibe una función biológica y características de disolución/reconstitución sustancialmente similares en comparación con un polímero seco no esterilizado sustancialmente similar. En algunas realizaciones, el polímero seco se esteriliza, y el polímero seco esterilizado presenta al menos un 25 % de la función biológica y las características de disolución/reconstitución en comparación con un polímero seco no esterilizado sustancialmente similar. En algunas realizaciones, el polímero seco se esteriliza, y el polímero seco esterilizado presenta entre el 50 % y el 100 % de la función biológica y las características de disolución/reconstitución en comparación con un polímero seco no esterilizado sustancialmente similar.

El reticulador

En realizaciones ejemplares, los ejemplos no limitantes de enzimas de reticulamiento directo, que reticulan directamente grupos de sustrato en hebras de polímero, incluyen transglutaminasas y enzimas oxidativas. Los ejemplos de transglutaminasas incluyen transglutaminasa microbiana (mTG), transglutaminasa tisular (tTG), transglutaminasa de queratinocitos, transglutaminasa epidérmica transglutaminasa prostática, transglutaminasa neuronal, transglutaminasa humana y Factor XIII. En algunas realizaciones, estas enzimas pueden ser de fuentes naturales o recombinantes. En algunas realizaciones, los aminoácidos de glutamina y lisina en las hebras de polímero son sustratos para la reticulación de transglutaminasa.

En realizaciones ejemplares, los ejemplos no limitantes de enzimas oxidativas son tirosinasa, lacasa, peroxidasa o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, las enzimas oxidativas reticulan los polímeros mediante la formación de quinonas (tirosinasa) o la formación de radicales libres (lacasa, peroxidasa). Las quinonas y los radicales libres luego interactúan entre sí o con otros aminoácidos o ácidos fenólicos para reticular los polímeros. En algunas realizaciones, los sustratos reticulables para las enzimas oxidativas pueden ser cualquier proteína que contenga tirosina u otros aminoácidos aromáticos. En algunas realizaciones, los sustratos pueden ser carbohidratos que contienen ácidos fenólicos, tales como, pero sin limitación, ácido fenólico. En algunas realizaciones, los carbohidratos pueden ser, entre otros, arabinoxilano o pectina.

De acuerdo con algunas realizaciones del método de la presente invención, las soluciones de transglutaminasa se someten a una purificación de una o múltiples etapas para realizar una o más de 1) eliminar el residuo de fermentación de la mezcla de transglutaminasa; 2) concentrar la cantidad de transglutaminasa activa en una solución de transglutaminasa; 3) purificar la solución de transglutaminasa de proteínas y/o carbohidratos transportadores; 4) reducir el nivel de endotoxinas de la solución de transglutaminasa; 5) eliminar todos los microbios de la solución de transglutaminasa, esterilizando efectivamente la solución; todo ello sin querer limitarse a una lista cerrada, o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la solución del material de reticulamiento se filtra antes de mezclarla con la proteína o polipéptido reticulable. En algunas realizaciones, el proceso de filtración primero usa filtración gruesa, a veces conocida como clarificación, para eliminar grandes bloques de residuos de fermentación que bloquearán rápidamente los pasos de filtración más finos. Los ejemplos no limitantes de dicha filtración gruesa son la filtración con un tamaño de poro de aproximadamente 0,45 |jm y la filtración con un tamaño de poro de aproximadamente 0,65 |jm. En algunas realizaciones, la solución de material reticulante se puede pasar a través de un filtro con un tamaño de poro inferior a 0,22 jm, por ejemplo, para reducir la carga biológica del material por debajo de 10 unidades formadoras de colonias (CFU por sus siglas en inglés) por gramo y hacerlo apropiado para uso médico. En algunas realizaciones, la carga biológica se reduce para lograr un nivel de garantía de esterilidad (SAL por sus siglas en inglés) de menos de aproximadamente 10-2. En algunas realizaciones, la carga biológica se reduce para lograr un nivel de garantía de esterilidad (SAL) de menos de aproximadamente 10-3, donde SAL es un término usado en microbiología para describir la probabilidad de que una sola unidad no esté estéril después de haber sido sometida a un proceso de esterilización.

De acuerdo con otra realización del método de la presente invención, se utilizan técnicas de ultrafiltración de flujo tangencial y/o fibra hueca, para purificar la solución de material reticulante mediante la eliminación de carbohidratos y proteínas transportadoras, y para concentrar la solución. Los tamaños de poro para usar con esta invención son aquellos con tamaños de poro más pequeños que el tamaño de los componentes de la composición reticulante. En algunas realizaciones, el material de reticulación es mTG y el tamaño de poro está en el rango de 10 a 50 kDa. En una realización, el material de reticulación es mTG y los tamaños de poro están en el rango de 10 a 30 kDa. En algunas realizaciones, ejemplos comerciales no vinculantes de los mismos son Uniflux (GE), AKTA Pilot (GE) o AKTA Flux 6 (GE).

En algunas realizaciones, se usan uno o más pasos de cromatografía de exclusión por tamaño para separar selectivamente el material de reticulación de las sustancias circundantes (por ejemplo, como, entre otras, la columna Phenyl Sepharose FF (2,6*10 cm, Pharmacia Biotech) o como columna Sephacryl (GE)). En algunas realizaciones, se usan uno o más pasos de cromatografía de interacción hidrófoba y/o hidrófila para separar selectivamente el material de reticulación de las sustancias circundantes. En algunas realizaciones, el material de reticulación es una proteína y se usan uno o más pasos de cromatografía de intercambio iónico para unir la proteína de reticulación, purificándola de los materiales circundantes.

En algunas realizaciones, la proteína de reticulamiento es mTG y se usan uno o más pasos de cromatografía de intercambio catiónico para purificar la mTG. En algunas realizaciones, la resina de intercambio catiónico es una resina de sefarosa.

En algunas realizaciones, la purificación reduce el nivel de endotoxina del material de reticulación a menos de 5 unidades de endotoxina (EU por sus siglas en inglés) por gramo. En algunas realizaciones, la purificación reduce el nivel de endotoxina del material de reticulación entre 0,001 y 5 unidades de endotoxina (EU) por gramo.

En algunas realizaciones, el agente de reticulación es mTG y la purificación da como resultado una composición de mTG donde la actividad específica es superior a 20 unidades de enzima por miligramo y superior a 25 unidades por miligramo. En algunas realizaciones, el material de reticulación es mTG y la purificación da como resultado una composición de mTG donde la actividad específica está entre 10 unidades de enzima por miligramo y 35 unidades por miligramo. En algunas realizaciones, el material de reticulación es mTG y la purificación da como resultado una pureza electroforética de entre el 95 % y el 99,9 %.

En algunas realizaciones, en el presente documento se describe un proceso de purificación de mTG, como ejemplo no limitante, que purifica un producto de mTG de calidad alimentaria para producir una composición de mTG con una actividad específica superior a 24 unidades enzimáticas por miligramo, una pureza electroforética superior al 95 % menos de 5 unidades de endotoxina por gramo y menos de 10 CFU/g. En el presente documento se describe un proceso de purificación de mTG, como ejemplo no limitativo, que purifica un producto de mTG de calidad alimentaria para producir una composición de mTG con actividad específica entre 25 y 35 unidades enzimáticas por miligramo, entre 95 y 99,9 % de pureza electroforética, entre 0,001 y 5 unidades de endotoxina por gramo, 0,001<10 CFU/g, o cualquier combinación de los mismos. En alguna realización, la enzima purificada de dichas especificaciones se liofiliza posteriormente con o sin carbohidratos o estabilizadores adicionales y, posteriormente, se somete a esterilización terminal mediante radiación gamma o haz de electrones. En algunas realizaciones, la actividad específica después de dicha esterilización terminal es de 5 a 30 unidades de enzima por miligramo. En algunas realizaciones, la actividad específica después de dicha esterilización terminal es de 20 a 30 unidades de enzima por miligramo. En algunas realizaciones, la actividad específica después de dicha esterilización terminal es de 20 a 25 unidades de enzima por miligramo.

En algunas realizaciones, un proceso de purificación de mTG, como un ejemplo no limitante, se describe en la publicación "Purification and Characterization of Novel Transglutaminase from Bacillus subtilis Spores"; IDPM: 11193401.

En algunas realizaciones, después de la purificación, la mTG puede secarse o liofilizarse y luego molerse mediante (cualquier tipo de) molienda en partículas higroscópicas de 5 a 50 micras, en un método similar al descrito en este documento. En algunas realizaciones, después de la purificación, la mTG se puede mezclar con éter de celulosa (HPMC) como hidrocoloide estabilizador o con trehalosa.

En algunas realizaciones, la transglutaminasa se puede mezclar con maltodextrina. En algunas realizaciones, la maltodextrina es un estabilizador.

En algunas realizaciones, una enzima enriquecida y/o purificada se puede estabilizar agregando micropartículas que incluyen mTG y un excipiente estabilizador, y que además comprende material aditivo, por ejemplo, un agente estabilizador que puede ayudar a estabilizar durante la radiación (por ejemplo, pero sin limitarse a, celulosa, azúcares, maltodextina, carotenoides, ascorbato, L - tirosina). En algunas realizaciones, un excipiente estabilizador es un poliol, manitol, sacarosa, glicerol, lactosa, glicina o trehalosa.

En algunas realizaciones, la transglutaminasa modificada comprende transglutaminasa microbiana modificada. En algunas realizaciones, el polímero se modifica para permitir la reticulación por la transglutaminasa microbiana modificada. En algunas realizaciones, la enzima oxidante modificada comprende una o más de tirosinasa, lacasa, peroxidasa o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la matriz comprende además un carbohidrato que comprende un ácido fenólico para ser reticulado por la enzima oxidante modificada como al menos un polímero de sustrato. En algunas realizaciones, el carbohidrato comprende uno o más de arabinoxilano o pectina. En algunas realizaciones, la molécula de enzima se modifica a través de PEGilación y en donde la PEGilación proporciona un enmascaramiento inmunogénico al enmascarar la molécula de enzima de un sistema inmunológico de un animal huésped que recibe la matriz. En algunas realizaciones, el animal huésped es un ser humano.

Composiciones según algunas realizaciones de la presente invención

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una composición

donde la composición es un andamiaje poroso,

donde los poros del andamiaje son de 2 a 500 mieras, comprendiendo la composición:

a) una proteína reticulable seleccionada del grupo que consiste en colágeno y gelatina;

b) un agente de reticulamiento que induce el reticulamiento de la proteína reticulable; y

c) un líquido.

Como se usa en el presente documento, el término "andamiaje" se refiere a materiales que se han diseñado para provocar interacciones celulares deseables para contribuir a la formación de nuevos tejidos funcionales para fines médicos. Las células se pueden "sembrar" en estas estructuras capaces de soportar la formación de tejido tridimensional. Los andamiajes pueden imitar la matriz extracelular nativa del tejido nativo, recapitulando el entorno in vivo y permitiendo que las células influyan en sus propios microambientes. Los andamiajes pueden servir para al menos uno de los siguientes propósitos:

1) Permitir la unión y migración de células;

2) Entregar y retener células y factores bioquímicos;

3) Permitir la difusión de nutrientes celulares vitales y productos expresados; o

4) Ejercen ciertas influencias mecánicas y biológicas para modificar el comportamiento de la fase celular.

En algunas realizaciones, el líquido es un tampón fisiológico.

En algunas realizaciones, la composición es una espuma.

En algunas realizaciones, la proteína reticulable se introduce en la composición como una proteína en polvo micronizada, que tiene un tamaño medio de partícula entre 5 y 200 micras.

En algunas realizaciones, la proteína reticulable comprende gelatina de fuerza de gelificación de 200 a 300.

En algunas realizaciones, la gelatina reticulable está presente en la composición en el rango de 0,5 % en peso a 25 % en peso.

En algunas realizaciones, el reticulante es transglutaminasa.

En algunas realizaciones, la transglutaminasa está presente en la composición en el rango de 0,0001 % en peso a 2 % en peso.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una composición que comprende:

a) gelatina reticulable;

c) un líquido,

donde la gelatina reticulable es de fuerza de gelificación de 200 a 300,

donde la gelatina reticulable está presente en la composición en el rango de 0,5% en peso a 25% en peso, y donde la transglutaminasa está presente en la composición en el rango de 0,0001% en peso a 2% en peso.

En algunas realizaciones, el líquido es un tampón fisiológico.

En algunas realizaciones, la composición se forma in situ en un paciente en un sitio donde el paciente necesita el tratamiento de un defecto tisular.

En algunas realizaciones, la composición se forma antes de introducir la composición en un paciente en un sitio donde el paciente necesita el tratamiento de un defecto tisular.

En algunas realizaciones, el reticulante seco es una enzima transglutaminasa. En algunas realizaciones, la composición de proteína seca es gelatina. En algunas realizaciones, la proteína en partículas secas no requiere un estabilizador. En algunas realizaciones, la composición de polvos se disuelve en una solución fluida en menos de 5 minutos. En algunas realizaciones, la composición de polvos se disuelve en una solución fluida en menos de 5 minutos. En algunas realizaciones, la composición de polvos se disuelve en una solución fluida en menos de 5 minutos a una temperatura inferior a 37C. En algunas realizaciones, la composición en polvo se disuelve en una solución fluida en menos de 1 minuto a una temperatura inferior a 27 C. En algunas realizaciones, la composición en polvo se disuelve en una solución fluida en menos de 1 minuto a una temperatura inferior a 20 C, que es la temperatura estándar de un quirófano. En algunas realizaciones, la composición de gelatina se almacena junto con el polvo de reticulante en un único compartimento. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina y el reticulante se mezclan con un líquido en una proporción de hasta 10 ml por 1 gramo de gelatina. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina y el reticulante se mezclan con un líquido en una proporción de hasta 8 ml por 1 gramo de gelatina. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina y el reticulante se mezclan con un líquido en una proporción de hasta 6 ml por 1 gramo de gelatina. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina y el reticulante se mezclan con un líquido en una proporción de hasta 4 ml por 1 gramo de gelatina. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina y el reticulante se mezclan con un líquido en una proporción de hasta 2 ml por 1 gramo de gelatina. En algunas realizaciones, la mezcla de polvos se presiona en una almohadilla absorbible o no absorbible para proporcionarle un refuerzo mecánico. En algunas realizaciones, la almohadilla es celulosa oxidada no tejida. En algunas realizaciones, la prensa está dentro de una malla quirúrgica, degradable o no. En algunas realizaciones, la concentración de la composición de gelatina está en el rango de 0,5 %-25 % p/p. En algunas realizaciones, la concentración de la composición de gelatina está en el rango de 10-20 % p/p. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina seca contiene menos de aproximadamente un 15 % de humedad. En algunas realizaciones, el polvo de gelatina seco contiene menos de aproximadamente un 8 % de humedad. En algunas realizaciones, la composición tiene un pH en un rango de aproximadamente 6 a aproximadamente 7. En algunas realizaciones, el polvo de reticulante seco contiene menos de aproximadamente un 15 % de humedad. En algunas realizaciones, el polvo de reticulante seco contiene menos de aproximadamente un 8 % de humedad. En algunas realizaciones, la transglutaminasa es independiente del calcio.

En algunas realizaciones, la transglutaminasa es una transglutaminasa microbiana. En algunas realizaciones, una concentración de proteína de la transglutaminasa está presente en una cantidad de aproximadamente 0,0001 % a aproximadamente 2 % p/p de la composición. En algunas realizaciones, la transglutaminasa está presente en una cantidad de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 1,35 % p/p de la composición. En algunas realizaciones, la concentración de transglutaminasa está en el rango de aproximadamente 1 a aproximadamente 180 unidades de enzima (U/mL) de la composición total.

En algunas realizaciones, la proporción de composición enzimática a composición de gelatina es de aproximadamente 1:1 a 1:5 v/v si la enzima y la gelatina estuvieran en solución. En algunas realizaciones, una proporción de composición enzimática purificada a composición de gelatina es de aproximadamente 1:100 a 1:500 p/p si la enzima y la gelatina estuvieran en forma seca sólida.

En algunas realizaciones, la gelatina se produce a partir de origen animal, origen recombinante o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el origen animal se selecciona del grupo que consiste en peces y mamíferos. En algunas realizaciones, la gelatina es de tipo A (tratada con ácido) o de tipo B (tratada con álcali). En algunas realizaciones, la gelatina comprende gelatina de alto peso molecular de al menos aproximadamente fuerza de gelificación 250, o su equivalente. En algunas realizaciones, la composición comprende además un tensioactivo. En algunas realizaciones, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20 (Tween.TM. 20), polioxietilenglicol dodecil éter (Brij.TM. 35), copolímero en bloque de polioxietileno-polioxipropileno (Pluronic.TM. F-68), laurilsulfato de sodio (SLS por sus siglas en inglés) o dodecilsulfato de sodio (SDS por sus siglas en inglés), laurilsulfato de sodio o lauriléter sulfato de sodio (SLES por sus siglas en inglés), poloxámeros o poloxaminas, alquilpoliglucósidos, alcoholes grasos, sales de ácidos grasos, cocamida monoetanolamina, cocamida dietanolamina, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la composición comprende además un plastificante. En algunas realizaciones, el plastificante se selecciona del grupo que consiste en sorbitol, ésteres de alquilo de ácido cítrico, glicerol, ésteres de glicerol, ésteres de alquilo de ácido ftálico, ésteres de alquilo de ácido sebácico, ésteres de sacarosa, ésteres de sorbitán, monoglicéridos acetilados, gliceroles, ésteres de ácidos grasos, glicoles, propilenglicol, ácido láurico, sacarosa, triacetato de glicerilo, poloxámeros, ftalato de dietilo, mono y diglicéridos de grasas o aceites comestibles, ftalato de dibutilo, sebacato de dibutilo, polisorbato, polietilenglicoles (PEG) 200 a 20000, polietilenglicoles Carbowax, alcohol polivinílico (PVA por sus siglas en inglés), goma arábiga, goma guar, goma xantana, Plasdone.RTM. (polivinilpirrolidona), manitol y cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición de la presente invención es una composición reticulable, que comprende una composición de gelatina liofilizada molida y una composición de transglutaminasa seca, donde la composición de transglutaminasa seca se dispersa completamente por toda la composición de gelatina liofilizada molida.

En algunas realizaciones, la composición de la presente invención es una composición reticulable, que comprende una gelatina y un reticulante, donde el reticulante reacciona con la gelatina una vez mezclada para formar un andamiaje poroso estabilizado biodegradable. En algunas realizaciones, el andamiajeporosopermanece flexible durante al menos dos semanas sobre un tejido. En algunas realizaciones, la transglutaminasa es una molécula enzimática modificada, teniendo la molécula enzimática modificada una modificación que altera el volumen percibido de las moléculas enzimáticas en la matriz reticulada a medida que se forma la matriz a través de la reticulación del polímero. En algunas realizaciones, la gelatina tiene un contenido de endotoxina de 1200 I.U./g o menos. En algunas realizaciones, la gelatina se molió por chorro usando menos de 10 bares (10,19 kg/cm2) de caída de presión. En algunas realizaciones, la molienda a chorro de gelatina se realiza utilizando una caída de presión de menos de 5 bar (5,1 kg/cm2). En algunas realizaciones, la molienda a chorro de gelatina se realiza utilizando menos de 5 mA3/min de flujo de aire requerido. En algunas realizaciones, la molienda a chorro de gelatina se realiza utilizando menos de 2 mA3/min de flujo de aire requerido. En algunas realizaciones, la composición comprende además bario, yodo, otras sustancias radioopacas o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el método de la presente invención incluye preparar/esterilizar la gelatina y la composición reticulante usando energía de radiación, donde la composición radiada resultante tiene al menos el 25 % de las propiedades funcionales (por ejemplo, capacidad de reticulación, actividad de enzima específica) en comparación con la composición de partida no irradiada. En algunas realizaciones, el método de la presente invención incluye preparar/esterilizar una composición reticulante de gelatina usando una energía de radiación, donde la gelatina radiada resultante tiene entre 25 % y 100 % de las propiedades funcionales (por ejemplo, capacidad de reticulación) en comparación con la composición de partida no irradiada.

En algunas realizaciones, el método de la presente invención incluye preparar/esterilizar gelatina y una composición reticulante usando un óxido de etileno, donde la composición tratada resultante tiene al menos el 25 % de las propiedades funcionales (por ejemplo, capacidad de reticulación) en comparación con la gelatina de partida no tratada, no estéril. En algunas realizaciones, el método de la presente invención incluye la preparación/esterilización de la composición usando un óxido de etileno, donde la composición tratada resultante tiene entre el 25 y el 100 % de las propiedades funcionales (por ejemplo, capacidad de reticulación) en comparación con la composición de partida no estéril no tratada.

En algunas realizaciones, la composición de la presente invención se usa para al menos un propósito seleccionado del grupo que consiste en: un andamiaje para células, un agente de remodelación de tejido, un agente de carga, un relleno dérmico, un adhesivo óseo, un relleno de tejido, una composición para reducir el volumen pulmonar, un sellador quirúrgico, un bioadhesivo, una composición reparadora de fistulas, un hemostato, una malla quirúrgica, una composición para liberación sostenida de agentes bioactivos.

En algunas realizaciones, al menos un tipo de célula se infiltra y crece en la composición.

En algunas realizaciones, el al menos un tipo celular es un tipo celular del grupo que consiste en: células madre pancreáticas, células enteroendocrinas, osteocitos, hepatocitos, tenocitos, miocitos, hematocitos, condrocitos, células epiteliales, células endoteliales, neuronas, células madre embrionarias, células madre mesenquimales, células madre mesenquimales autólogas derivadas de médula, células progenitoras, células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimales, células madre neurales, células madre del sistema óseo, células madre de la línea de condrocitos, células madre epiteliales y células madre hepáticas.

En algunas realizaciones, la composición aísla al menos un tipo celular infiltrado del sistema inmunitario del paciente. En algunas realizaciones, la composición es una espuma. Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, el andamiaje poroso, una vez reticulado (por ejemplo, por la mTG) puede permanecer estable in vivo e inducir el crecimiento y la regeneración del tejido. Alternativamente, el andamiaje poroso puede servir como andamiaje de soporte tridimensional para células. El andamiaje poroso reticulado tiene una unión celular mejorada y compatibilidad de motilidad.

En algunas realizaciones, la proteína reticulable se mezcla con un reticulante. En algunas realizaciones, la proteína reticulable y el reticulante son polvos secos, y los polvos secos se mezclan y luego se disuelven mediante un líquido fisiológico, un tampón o un medio de soporte celular. En algunas realizaciones, el agente de reticulamiento reticula la proteína solo cuando tanto la proteína reticulable como el reticulante se disuelven en el tampón fisiológico.

En algunas realizaciones, el material médico de la presente invención normalmente incluirá, además de los componentes descritos anteriormente, componentes del medio necesarios para el cultivo de células, sal (componentes tampón). Además, puede contener adicionalmente el tejido del agente de regeneración urgente (factor de crecimiento) en la unidad de trasplante cuando se implanta. Factores de crecimiento utilizables, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF (por sus siglas en inglés): factor de crecimiento de fibroblastos ácido (aFGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), etc. factor de crecimiento de queratinocitos (KGF por sus siglas en inglés)), factor de crecimiento de células epiteliales (EGF por sus siglas en inglés), factor de crecimiento nervioso (NGF por sus siglas en inglés), factor de crecimiento transformante (TGF por sus siglas en inglés), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF por sus siglas en inglés), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF por sus siglas en inglés), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF por sus siglas en inglés), proteína morfogenética ósea (BMP: BMP-2, BMP-3, BMP-7, etc.) se pueden ejemplificar. Estos factores de crecimiento pueden utilizarse mediante una selección apropiada dependiendo del tipo de tejido con fines de reproducción. Específicamente, por ejemplo, el factor de crecimiento epidérmico en el caso del propósito de regeneración de células epidérmicas y en el caso del propósito de regeneración de la dermis, es posible usar cada uno de los factores de crecimiento de fibroblastos. Específicamente, por ejemplo, proteína morfogenética ósea en el caso del propósito de regeneración de células óseas y en el caso del propósito de regeneración de la dermis es posible utilizar cada uno de los factores de crecimiento de fibroblastos. Si es preferible como se está considerando, puede usarse en combinación con factores de crecimiento de dos o más tipos.

En algunas realizaciones, los polvos secos se pueden envasar en una jeringa o en cualquier recipiente. En algunas realizaciones, los polvos secos se pueden esterilizar por radiación u óxido de etileno (ETO por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, la proteína reticulable se mezcla y el reticulante se combina con al menos otro agente seleccionado del grupo que consiste en: estabilizadores (por ejemplo, pero sin limitarse a: EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida), NHS (N-hidroxisuccinimida), carbomiida, gluteradhyde, peroxidasa de rábano picante, factores de crecimiento, agentes terapéuticos y hormonas.

En algunas realizaciones, los polvos secos tienen lixiviación y/o interacciones reducidas cuando se mezclan como polvos secos. Con referencia a la figura 3, en algunas realizaciones, los polvos secos se disuelven en tampón fisiológico por separado y se mezclan empujando los componentes disueltos de una jeringa interconectada a otra. Sin embargo, cualquier método de mezcla, como la agitación, puede ser suficiente.

Alternativamente, los polvos secos se mezclan y luego la mezcla se disuelve en el tampón fisiológico para la activación. En algunas realizaciones, la reticulación de la proteína da como resultado el andamiaje poroso. En algunas realizaciones, el andamiaje poroso es termoestable. En algunas realizaciones, el andamiaje poroso es adhesivo. Sin pretender estar limitado por ninguna teoría en particular, el reticulamiento es irreversible debido a los enlaces covalentes que forman los reticulamientos entre las moléculas de Proteína. En algunas realizaciones, el andamiaje poroso es estructuralmente similar a la matriz extracelular de tejidos de mamíferos, a menudo se puede procesar en condiciones suaves y se puede administrar de una manera mínimamente invasiva.

El reticulamiento puede ocurrir fuera o dentro del cuerpo del paciente. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el reticulamiento ocurre in situ en un sitio del paciente. Alternativamente, el andamiaje poroso se forma ex-vivo y luego se introduce en el paciente.

En algunas realizaciones, el hidrogel de la presente invención, aunque aún no está curado, puede pasar a través de la aguja, una vez que se administra en forma líquida al tejido; el adhesivo se estabiliza en una formación física estable y consolidada (es decir, una sola partícula unificada de al menos 0,05 ml de volumen).

Los resultados del Ejemplo 14 indican que al reducir el tamaño de las partículas por debajo de d(0,5) = 15 micrómetros, la gelatina se disuelve bien pero reacciona más lentamente con la enzima transglutaminasa microbiana. En algunas realizaciones de la invención, existe la necesidad de proporcionar polvos que se disuelvan rápidamente y que no se estabilicen rápidamente después de la hidratación. Deben pasar a través de una aguja larga y permitir un tiempo de trabajo suficientemente largo para el cirujano. En algunas realizaciones, dicha formulación se puede lograr controlando el tamaño de las partículas de gelatina entre 1 y 15 micrómetros. En algunas realizaciones, dicha formulación se puede lograr con un tamaño de partícula de gelatina entre 8 y 14 micras.

En algunas realizaciones, la composición comprende un andamiaje poroso configurado para (1) estabilizarse in situ o ex vivo y (2) adaptarse a una forma o cavidad corporal deseada, lo que da como resultado la formación de un andamiaje o sellador biocompatible, configurado para permitir el crecimiento interno de células y tejidos.

En algunas realizaciones, la estructura de andamiaje porosa estabilizada es conductora de tejidos y se puede usar para los siguientes usos médicos: agente de remodelación de tejidos, agente de carga, rellenos de tejidos o impresión de tejidos (como la impresión de tejidos en 3D). La pulverización de la gelatina y/o la reconstitución en andamiaje poroso reticulado (específicamente por transglutaminasa), mejora en gran medida la motilidad y la unión celular. La visualización desigual y abundante de motivos de reconocimiento de integrina (como RGD) y el andamiaje poroso de gelatina y la accesibilidad de las células a tales motivos, mejoran su función como andamiaje.

En la realización de la impresión de tejidos, los polvos secos se pueden aplicar a través de la impresora junto con células vivas para componer una estructura 2D o 3d precisa de células adheridas entre sí por el pegamento en polvo o reconstituido. Por ejemplo, a modo de ilustración, tales estructuras 3D pueden contener algunas células endoteliales para formar vasos sanguíneos, que pueden imprimirse en el andamiaje, con la intención de que proporcionen suministro de sangre a las células internas, una vez que se implanta el andamiaje.

En algunas realizaciones, el andamiaje poroso tiene una densidad, donde la densidad está directamente relacionada con una degradación del andamiaje poroso y/o la dinámica de crecimiento celular. En algunas realizaciones, las sustancias bioactivas adicionales también pueden influir en la dinámica del crecimiento interno de las células (es decir, aumentar la dinámica del crecimiento interno de las células), por ejemplo, pero sin limitarse a, un aumento del 10 % al 300 %. En algunas realizaciones, las sustancias bioactivas suspendidas y/o las células y/o el plasma rico en plaquetas (PRP) y/o los factores de crecimiento y/o las proteínas morfogenéticas óseas permanecen sustancialmente en el área objetivo del cuerpo (por ejemplo, pero sin limitarse a ello, sin que el paciente tenga que mantener inmovilizada la zona del cuerpo tratada durante un período injustificadamente largo o sin que se le inyecten múltiples factores, como se practica normalmente).

En algunas realizaciones, la espuma es inicialmente una espuma de celdas cerradas que tiene un módulo de elasticidad (de Young) de entre 0,1 y 11 KPa, donde el módulo de elasticidad puede variar cambiando las concentraciones de la proteína, el reticulante y/o el tampón fisiológico y/o cambiando la fuerza de gelificación de la gelatina utilizada en el mismo.

En algunas realizaciones, la espuma proteica tiene un módulo de elasticidad inicial (de Young) de entre 1 y 11 KPa. En algunas realizaciones, la espuma de proteína tiene un módulo de elasticidad inicial (de Young) de entre 2 y 10 KPa. En algunas realizaciones, la elongación inicial (es decir, aproximadamente 30 minutos después de la reticulación) de la espuma estabilizada es de 1,5 a 3 veces la longitud inicial original.

En las tablas del Ejemplo 16 se ilustra una realización que muestra la medición mecánica de una espuma que comprende gelatina como proteína y mTG como reticulante.

En algunas realizaciones, el tamaño de poro del andamiaje poroso tiene un diámetro de entre 2 y 500 micrómetros. En algunas realizaciones, el tamaño de poro del andamiaje poroso tiene un diámetro de entre 2 y 400 micrómetros. En algunas realizaciones, el tamaño de poro del andamiaje poroso tiene un diámetro de entre 2 y 300 micrómetros. En algunas realizaciones, el tamaño de poro del andamiaje poroso tiene un diámetro de entre 2 y 200 micrómetros.

En algunas realizaciones, el tamaño de poro del andamiaje poroso tiene un diámetro de entre 2 y 50 micrómetros. En algunas realizaciones, el tamaño de poro del andamiaje poroso tiene un diámetro de entre 2 y 10 micrómetros.

En algunas realizaciones, el tamaño de poro del andamiaje poroso tiene un diámetro de entre 10 y 500 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de poro del andamiaje poroso tiene un diámetro de entre 50 y 400 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de poro del andamiaje poroso tiene un diámetro de entre 100 y 400 micrómetros. En algunas realizaciones, el tamaño de poro del andamiaje poroso tiene un diámetro de entre 200 y 400 micrómetros. En algunas realizaciones, el tamaño de poro del andamiaje poroso tiene un diámetro de entre 300 y 400 micrómetros.

Haciendo referencia a la Figura 8, en algunas realizaciones, el tamaño de poro de la espuma es de entre 2 y 500 micras de diámetro. En algunas realizaciones, el tamaño de poro de la espuma tiene un diámetro de entre 2 y 400 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de poro de la espuma tiene un diámetro de entre 2 y 300 micrómetros. En algunas realizaciones, el tamaño de poro de la espuma es de 2 a 200 micras de diámetro.

En algunas realizaciones, el tamaño de poro de la espuma tiene un diámetro de entre 2 y 50 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de poro de la espuma tiene un diámetro de entre 2 y 10 micrómetros.

En algunas realizaciones, el tamaño de poro de la espuma tiene un diámetro de entre 10 y 500 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de poro de la espuma tiene un diámetro de entre 50 y 400 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de poro de la espuma tiene un diámetro de entre 100 y 400 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de poro de la espuma tiene un diámetro de entre 200 y 400 micras. En algunas realizaciones, el tamaño de poro de la espuma tiene un diámetro de entre 300 y 400 micras.

En algunas realizaciones, se puede agregar un agente antiespumante, como, por ejemplo, pero sin limitarse a, polidimetilsiloxano, polisorbato, etc., para lograr una espuma más densa, donde la espuma más densa puede tener un módulo de cizallamiento de entre 5 KPa y 15 KPa.

Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, en algunas realizaciones, agregar un detergente y/o tensioactivo biocompatible da como resultado roturas en la espuma, donde las roturas se introducen antes de que la espuma se estabilice y forma la espuma reconstituida como un gel fluido. En algunas realizaciones, el gel fluido se puede mezclar con una solución de reticulante (por ejemplo, manualmente, mecánicamente o empujando simultáneamente a través de un mezclador estático) para generar un gel estabilizado homogéneo. En algunas realizaciones, un gel estabilizado confluente (es decir, en oposición a la espuma) puede resistir la degradación durante un tiempo prolongado in vivo. En algunas realizaciones, la composición puede incluir al menos un tensioactivo. Como se usa en este documento, "tensioactivo" se refiere a un compuesto que reduce la tensión superficial del agua. En algunas realizaciones, el tensioactivo puede ser un tensioactivo iónico, como lauril sulfato de sodio y ácido octanoico; o un tensioactivo neutro, como polioxietilenéteres, polioxietilenésteres y polioxietilensorbitán.

En algunas realizaciones, se puede agregar dextrina (dextrano) a la composición para desacelerar la cinética de degradación in vivo.

En algunas realizaciones ejemplares no limitantes, el crecimiento interno de las células se puede mejorar aún más mediante la adición de un glicosaminoglicano (GAG) sulfatado, tal como, por ejemplo, sulfato de condroitina. En algunas realizaciones, el GAG se puede agregar a una formulación seca de polvos como polvo de copolímero, unido químicamente a la proteína/reticulador (es decir, mTG), cualquier otro componente antes de la fase de preparación de molienda a chorro, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la concentración de GAG puede estar entre el 0,5 % en peso y el 10 % en peso de la composición.

Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, las células dentro del andamiaje poroso pueden estar involucradas en interacciones de matriz en tres dimensiones, similar a su experiencia dentro del entorno fibroso de la matriz extracelular natural. En comparación con andamiajes 2D o con materiales de andamiaje que son menos adecuados, se logra una propagación celular más naturalista, que se produce en tres dimensiones.

Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, la forma de las células lograda en un andamiaje poroso tridimensional puede modificar la expresión génica, la traducción de proteínas y, a su vez, la función.

En algunas realizaciones, las células se mezclan en el andamiaje poroso en la preparación (se mezclan con el líquido hidratante) o ingresan al andamiaje poroso más tarde, donde retienen su arquitectura 3D natural. Por lo tanto, sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, en algunas realizaciones, el andamiaje no solo conserva la forma 3D nativa de las células individuales, sino que también actúa para unir las células de una manera más natural. Esto da como resultado la formación de estructuras similares a tejidos e interacciones de célula a célula que son más representativas de la función tisular normal.

En algunas realizaciones que utilizan gelatina, las propiedades elásticas de la gelatina reticulada, así como la abundancia de sitios de unión de integrina (sitios de unión celular en el polímero) permiten el crecimiento interno de células, la proliferación y dan como resultado la regeneración fisiológica de tejidos y permiten diversas aplicaciones de ingeniería de tejidos. En algunas realizaciones, la gelatina reticulada puede crear estructuras similares a tejidos in vitro con múltiples tipos de células. Las células de diferentes tipos se pueden reunir en modelos de cocultivo 3D, ya sea como poblaciones mixtas o como capas discretas de diferentes tipos de células. De acuerdo con algunas realizaciones, la gelatina y el reticulante, como mTG, se pueden mezclar con medio de cultivo celular; que contiene, pero no se limita a las siguientes sustancias: glucosa, glutamina estable (alanil-glutamina), penicilina, CaC12.2H2O, nitrato férrico (Fe(NO3)3-9H20), Cloruro de Potasio (KCl), MgSO4 7H20, Cloruro de Sodio (NaCl), Bicarbonato de Sodio (NaHCO3), Fosfato de sodio (NaH2PO4-H20), D-Glucosa, Rojo fenol, L-Alanil-L-Glutamina, L-Arginina-Hc1, L-Cistina, Glicina, L-Histidina HCl-H20, L-Isoleucina, L-Leucina, L-lisina-HCl, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, D-pantotenato de calcio, cloruro de colina, ácido fólico, i-inositol, niacinamida, piriclorhidrato de doxina, riboflavina, clorhidrato de tiamina y suero bovino fetal.

La mezcla con el medio de cultivo celular no perjudica la reticulación del andamiaje poroso.

De acuerdo con algunas realizaciones, los polvos secos de gelatina y mTG se pueden mezclar e hidratar con medio de cultivo celular (que contiene, entre otros, la siguiente sustancia:

_Glucosa, Glutamina estable (Alanil-Glutamina), Penicilina, CaCl2.2H20, Nitrato Férrico (Fe(NO3)3-9H2O), Cloruro de Potasio (KCl), MgSO4.7H20, Cloruro de Sodio (NaCl), Bicarbonato de Sodio (NaHCO3), fosfato de sodio (NaH2PO4-H2O), D-glucosa, rojo fenol, L-alanil-L-glutamina, L-arginina-Hcl, L-cistina, glicina, L-histidina HCl-H2O, L-isoleucina, L-Leucina, L-lisina-HCl, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, D-pantotenato de calcio, cloruro de colina, ácido fólico, i-inositol , Niacinamida, Piridoxina Hcl, Riboflavina, Tiamina HC1 y suero fetal bovino). En algunas realizaciones, esto permite una mejor supervivencia de las células en la matriz de células de gelatina inicial. Las células pueden mezclarse con el medio y mantenerse en una jeringa mientras que los polvos de gelatina y mTG están en otra jeringa. Luego, las jeringas se conectan entre sí con un mecanismo de bloqueo que permite el empuje manual para mezclar los ingredientes. Empujándolos varias veces de una jeringa a otra, las células, el medio, la gelatina, la mTG y el gas se mezclan para formar un andamiaje óptimo sembrado con células. Una realización ejemplar que muestra la viabilidad de las células en un andamiaje poroso de gelatina reticulada de la presente invención se detalla en el Ejemplo 19.

En algunas realizaciones, el método inventivo puede incluir la modificación del volumen percibido de las moléculas de enzima en la matriz reticulada que se está formando. En algunas realizaciones, el volumen percibido modificado se determina según el grado de reticulamiento de los polímeros para formar la matriz, de modo que el menor grado de reticulamiento, en comparación con el grado de reticulamiento con moléculas enzimáticas no modificadas, indica un mayor volumen percibido. En algunas realizaciones, un método para aumentar el volumen percibido de las moléculas de enzima es aumentar el tamaño y/o el volumen hidrodinámico de las moléculas mediante unión covalente o no covalente de al menos una molécula o fracción a las moléculas de enzima. En algunas realizaciones, el método de la presente invención incluye el uso de una enzima modificada.

En algunas realizaciones, un método para aumentar el volumen percibido es a través de la modificación de la carga electrostática de las moléculas de enzima de modo que su carga neta sea de polaridad opuesta a la carga neta en las cadenas de polímero o copolímero. En una realización, se puede lograr aumentar el volumen percibido cambiando el punto isoeléctrico (pi) de la enzima.

De acuerdo con algunas realizaciones de la composición de la presente invención, se proporciona un andamiaje poroso reticulado, que comprende un polímero de sustrato reticulado por una molécula de enzima modificada, donde la molécula de enzima modificada tiene una modificación que altera el volumen percibido de las moléculas de enzima en la matriz reticulada a medida que se forma la matriz a través de la reticulación del polímero. En algunas realizaciones, la molécula de enzima modificada tiene una modificación que aumenta el tamaño real de la molécula de enzima modificada. En algunas realizaciones, la molécula de enzima modificada tiene una modificación que aumenta el volumen hidrodinámico de la molécula de enzima modificada. En algunas realizaciones, la molécula de enzima modificada tiene una modificación que modifica la carga electrostática de la molécula de enzima modificada para que sea de signo opuesto a la carga neta del polímero sustrato al cambiar el punto isoeléctrico (pi) de la enzima modificada en comparación con la enzima no modificada. En algunas realizaciones, la modificación es del grupo c-amino de las lisinas de la enzima a través de un proceso seleccionado del grupo que consiste en succinilación (con anhídrido succínico), acetilación (con anhídrido acético), carbamilación (con cianato), alquilación reductora (aldehídos) y tratamiento con anhídrido maleico. En algunas realizaciones, la modificación es de una o más cadenas laterales que contienen ácidos carboxílicos de la enzima para disminuir el número de cargas negativas.

En algunas realizaciones, la modificación comprende la unión covalente o no covalente de al menos una molécula o resto a la molécula de enzima modificada. En algunas realizaciones, la modificación comprende la unión covalente de una molécula modificadora a la molécula de enzima modificada. En algunas realizaciones, la molécula de enzima modificada tiene una tasa de difusión reducida y una tasa de reticulación reducida en comparación con la enzima no modificada, pero tiene al menos una actividad enzimática medida similar en comparación con la enzima no modificada (por ejemplo, pero sin limitarse a, alrededor de 20% a 100% de actividad en comparación con la enzima no modificada). En algunas realizaciones, una tasa de reticulación reducida es al menos el 10 % de la tasa de reticulación de la enzima no modificada. En algunas realizaciones, una tasa de reticulación reducida está entre el 10 % y el 40 % de la tasa de reticulación de la enzima no modificada.

En algunas realizaciones, la molécula modificadora comprende un vehículo o polímero. En algunas realizaciones, el polímero comprende un polímero sintético, un polímero celulósico, una proteína, un polisacárido o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polímero celulósico comprende uno o más de carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilcelulosa o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polisacárido comprende uno o más de dextrano, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, sulfato de queratán, heparina, sulfato de heparán, ácido hialurónico, un derivado de almidón o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones de la composición de la presente invención, la molécula modificadora comprende PEG (polietilenglicol). En algunas realizaciones, PEG comprende un derivado de PEG. En algunas realizaciones, el derivado de PEG comprende PEG activado. En algunas realizaciones, el PEG activado comprende uno o más de metoxi PEG (mPEG), sus derivados, mPEG-NHS, succinimidil (NHS) ésteres de mPEG (mPEG-succinato-NHS), mPEG-glutarato, -NHS, mPEG-valerato-NHS, mPEG-carbonato-NHS, mPEG-carboximetil-NHS, mPEG-propionato-NHS, mPEG-carboxipentil- NHS), mPEG- nitrofenilcarbonato, mPEG-propilaldehído, mPEG-tosilato, mPEG-carbonilimidazol, mPEG-isocianato, mPEG -epóxido, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el PEG activado reacciona con grupos amino o grupos tiol en la enzima. En algunas realizaciones, la relación molar del PEG activado a los residuos de lisina de la enzima activada está en un rango de 0,5 a 25. En algunas realizaciones, el PEG activado es monofuncional, heterobifuncional, homobifuncional o multifuncional. En algunas realizaciones, los PEG activados son PEG ramificados o PEG de múltiples brazos. En algunas realizaciones, el PEG activado tiene un tamaño que oscila entre 1000 dalton y 40.000 dalton.

En algunas realizaciones, el andamiaje poroso comprende además un copolímero que no está unido covalentemente a la enzima o al polímero sustrato. En algunas realizaciones, el copolímero comprende un polisacárido o un polímero celulósico. En algunas realizaciones, el polisacárido comprende dextrano, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, sulfato de queratán, heparina, sulfato de heparán, ácido hialurónico, un derivado de almidón o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polímero celulósico comprende carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilcelulosa.

En algunas realizaciones, una molécula de enzima modificada se modifica reticulando la molécula de enzima modificada con una pluralidad de otras moléculas de enzima para formar un agregado de una pluralidad de moléculas de enzima reticuladas. En algunas realizaciones, una modificación de la molécula de enzima afecta al menos a una propiedad de la matriz. En algunas realizaciones, la al menos una propiedad se selecciona del grupo que consiste en resistencia a la tracción, rigidez, grado de reticulación del polímero del sustrato, viscosidad, elasticidad, flexibilidad, deformación para romper, tensión para romper, relación de Poisson, capacidad de hinchamiento y módulo de Young, o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el grado de modificación de la enzima modificada determina la movilidad de la enzima modificada en, o la difusión desde, el andamiaje poroso. En algunas realizaciones, la modificación de la enzima modificada reduce el coeficiente de difusión de la enzima modificada en una solución de la enzima modificada y la proteína o en un andamiaje poroso de la enzima modificada y la proteína, en comparación con una solución o andamiaje poroso de enzima no modificada y la proteína. En algunas realizaciones, el grado de modificación de la enzima modificada determina una o más propiedades mecánicas de la espuma. En algunas realizaciones, la molécula de enzima modificada muestra un mayor diferencial de velocidad de reticulación en el polímero reticulado que en solución en comparación con la molécula de enzima no modificada.

En algunas realizaciones, el reticulante en polvo puede ser una enzima y/o una enzima modificada para reaccionar con el polímero en polvo. En algunas realizaciones, el polímero en polvo puede ser una proteína, por ejemplo, pero sin limitarse a, una gelatina.

Según al menos algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para controlar la formación de una matriz ("matriz" se refiere al hidrogel o andamiaje poroso), que comprende modificar una molécula de enzima con una modificación que altera el volumen percibido de las moléculas de enzima en la matriz reticulada a medida que se forma la matriz; mezclar la molécula de enzima modificada con al menos un polímero de sustrato que es un sustrato de la molécula de enzima modificada; y formar la matriz a través de la reticulación del al menos un polímero sustrato por la molécula de enzima modificada, en donde la formación de la matriz está controlada al menos parcialmente por la modificación de la molécula de enzima. En algunas realizaciones, la modificación reduce la tasa de reticulamiento de la molécula de enzima modificada a medida que aumenta el grado de reticulamiento del al menos un polímero sustrato. En algunas realizaciones, la molécula de enzima modificada y el al menos un polímero sustrato se mezclan en forma de polvo micronizado, de modo que la modificación controla el grado de reticulación del al menos un polímero sustrato a medida que aumenta la viscosidad de la solución. En algunas realizaciones, la modificación comprende la PEGilación de la enzima a un pH en un rango de 7 a 9. En algunas realizaciones, el pH de la reacción de PEGilación es de 7,5 a 8,5.

Métodos para tratar a un paciente que lo necesita

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona la composición inventiva para usar en un método, donde el método reduce el volumen pulmonar en un paciente, que comprende:

a) colapsar una región objetivo en el pulmón del paciente;

De acuerdo con al menos algunas realizaciones, se proporciona la composición de la invención para usar en un método para sellar un tejido contra la fuga de un fluido corporal, que comprende aplicar un andamiaje poroso como se describe en el presente documento al tejido. En algunas realizaciones que comprenden una mayor concentración de reticulante, el fluido corporal comprende sangre, de modo que la matriz es un agente hemostático. De acuerdo con al menos algunas realizaciones, se proporciona un agente hemostático o sellador quirúrgico o agente de carga, que comprende una matriz como se describe en el presente documento. De acuerdo con al menos algunas realizaciones, se proporciona una composición para sellar una herida, que comprende una matriz como se describe en este documento. De acuerdo con al menos algunas realizaciones, se proporciona un uso de la composición para sellar suturas o líneas de grapas en un tejido. En algunas realizaciones, se proporciona un uso de la composición para adherir una malla quirúrgica, tal como una malla de reparación de hernia, al tejido. En algunas realizaciones, la malla se puede proporcionar impregnada con gelatina y enzimas en polvo.

De acuerdo con al menos algunas realizaciones, se proporciona una composición para un vehículo para la administración localizada de fármacos, que comprende un andamiaje poroso como se describe en el presente documento. De acuerdo con al menos algunas realizaciones, se proporciona una composición para la ingeniería de tejidos, que comprende una matriz como se describe en el presente documento, adaptada como un andamiaje poroso inyectable. De acuerdo con al menos algunas realizaciones, un método para modificar una composición incluye: proporcionar una enzima modificada que tiene un grupo funcional reticulable y una proteína que tiene al menos un resto reticulable por la enzima modificada; y mezclar la enzima modificada y la proteína, donde la enzima modificada se reticula con la proteína y también se reticula con la proteína a través del grupo funcional reticulable.

Según algunas realizaciones, la composición se usa como vehículo para la administración localizada de fármacos. De acuerdo con algunas realizaciones, la composición es un andamiaje inyectable o un agente de remodelación de tejidos para la ingeniería y reparación de tejidos. Según algunas realizaciones, la composición es una composición hemostática. De acuerdo con algunas realizaciones, la composición es una composición de sellado de fluidos corporales. Las composiciones de la presente invención pueden proporcionar hemostasia rápida, minimizando así la pérdida de sangre después de una lesión o cirugía.

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención incluyen un injerto óseo adhesivo configurado para permitir la estructuración física in situ de una formación de hueso nuevo estable, donde la composición es biocompatible; biodegradable dentro de 2 a 6 meses para permitir la sustitución por el hueso natural completamente formado; que tiene una porosidad configurada para permitir el crecimiento interno de hueso natural junto con la biodegradación del injerto.

En algunas realizaciones, la composición se puede aplicar con al menos una sustancia adicional, donde el hidrogel de gelatina o la espuma de gelatina pueden proporcionar un pegamento de andamiaje osteoconductor y/o osteoinductor, que tiene propiedades físicas mejoradas debido a la función de estabilización in situ de la matriz de gelatina transglutaminasa.

En algunas realizaciones, la composición se puede aplicar en forma de espuma, donde la espuma de gelatina estabilizada puede proporcionar suficiente crecimiento y soporte para los osteoblastos, para activar los sistemas de Havers (osteon), para proliferar y crear nuevas estructuras óseas trabeculares. Consulte el Ejemplo 3 y la Figura 6. Como se usa en el presente documento, los "agentes de carga" son sustancias inyectables que llenan espacios que se usan para aumentar la carga del tejido. Se pueden inyectar debajo de la piel para obtener mejores resultados estéticos, periuretralmente para tratar la incontinencia urinaria y perianalmente para tratar la incontinencia fecal. La Figura 5 es una realización de la presente invención, que muestra el agente de carga inyectado por vía submucosa en el ano de un cerdo. En algunas realizaciones, el agente de carga inventado también se puede inyectar en cualquier esfínter o vaso para crear un estrechamiento artificial y recuperar la continencia.

En una realización ejemplar, la Figura 2A muestra una aguja que avanza hacia la submucosa del cuello de la vejiga de un ser humano. La figura 2B muestra el agente de carga que se inyecta en la submucosa del cuello de la vejiga y la uretra proximal de un ser humano. El mismo concepto se puede aplicar a un animal. La figura 7 muestra una inyección en la uretra de un cerdo. Por tanto, en algunas realizaciones, la composición puede proporcionar una solución a los problemas de incontinencia urinaria en animales domésticos.

En algunas realizaciones, los agentes de carga uretral pueden incluir grasa autóloga, colágeno bovino reticulado con glutaraldehído, hidroxilapatita de calcio, perlas recubiertas de carbono pirolítico, polidimetilsiloxano, copolímero de etileno y alcohol vinílico, ácido hialurónico dextranómero y politetrafluoroetileno.

En algunas realizaciones, la composición de la presente invención es un agente de carga configurado para no migrar, ser duradero, degradable, está configurado para ser reemplazado por tejido conjuntivo blando durante un período de tiempo prolongado, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la migración es una función del tamaño y número de partículas. En algunas realizaciones, la composición proporciona un andamiaje para las células, endógenas o exógenas, que proliferan y mantienen el efecto volumétrico a lo largo del tiempo.

En algunas realizaciones, la composición es un gel reticulado in situ para dar como resultado una formación física consolidada única y estable. En algunas realizaciones, la composición es degradable, y los fibroblastos y las células inmunitarias pueden infiltrarla gradualmente sin riesgo de dislocación, y está configurada para ser reemplazada por tejido.

En algunas realizaciones, la composición del agente de carga puede ser un andamiaje, espuma o gel poroso de reticulación in situ para dar como resultado una formación física consolidada única y estable. En algunas realizaciones, la composición se compone de polvos micronizados secos de gelatina y reticulante. En algunas realizaciones, la composición se compone de gelatina en estado líquido y reticulante (en la realización preferida, el reticulante es una transglutaminasa). En algunas realizaciones, la composición se compone de gelatina en estado líquido y reticulador, donde se usan otros excipientes con la gelatina para reducir su punto de transición natural sólido-gel (como urea y calcio) para reducir su viscosidad, y donde el líquido transglutaminasa contiene excipientes para mejorar su estabilidad y aumentar su viscosidad.

En algunas realizaciones, la composición es un adhesivo quirúrgico. En algunas realizaciones, el adhesivo quirúrgico puede ser una transglutaminasa de gelatina. En algunas realizaciones, la gelatina puede ser gelatina micronizada en polvo. En algunas realizaciones, la gelatina puede estar en forma líquida. En algunas realizaciones, la gelatina puede estar en forma sólida pero termorreversible. En algunas realizaciones, la gelatina se reticula opcionalmente con transglutaminasa en polvo. En algunas realizaciones, la gelatina se reticula mediante transglutaminasa disuelta en líquido. En algunas realizaciones, la gelatina se reticula mediante transglutaminasa modificada. En algunas realizaciones, la gelatina y la transglutaminasa se mezclan directamente en forma seca de polvo o en forma líquida. En algunas realizaciones, la gelatina espumada se puede administrar a través de catéteres o agujas largos y delgados. En algunas realizaciones, el método de la presente invención es administrar la espuma estabilizadora in situ de gelatina a través de un tubo de administración hueco, que tiene al menos 10 cm de largo y como máximo 10 French de diámetro. En algunas realizaciones, el método de la presente invención es administrar la espuma estabilizadora in situ de gelatina a través de un tubo de administración hueco, que tiene al menos 15 cm de largo y como máximo 6 French de diámetro. En algunas realizaciones, el método de la presente invención es administrar la espuma estabilizadora in situ de gelatina a través de un tubo de administración hueco, que tiene al menos 25 cm de largo y como máximo 6 French de diámetro. En algunas realizaciones, el método de la presente invención es administrar la espuma estabilizadora in situ de gelatina a través de un tubo de administración hueco, que tiene al menos 30 cm de largo y como máximo 6 French de diámetro. En algunas realizaciones, se puede usar un aplicador, donde el aplicador está configurado para guiar el material inyectado en su lugar sin el uso de asistencia endoscópica. En algunas realizaciones, la administración del aplicador está estandarizada y se puede realizar en cualquier entorno clínico ambulatorio. En algunas realizaciones, una ubicación de inyección del polímero es dosis del esfínter en el segmento proximal de la uretra, dosis de la vejiga urinaria. En algunas realizaciones del dispositivo de la presente invención, el dispositivo es un cilindro configurado para permitir su posicionamiento en la uretra y alinearse con la abertura de la vejiga. En algunas realizaciones, una vez que el dispositivo está en su lugar, de dos a cuatro agujas de inyección saldrán del lumen principal del cilindro y sobresaldrán en la submucsa de la uretra en su segmento proximal (es decir, el más cercano a la abertura de la vejiga). En algunas realizaciones, las agujas se pueden colocar a una distancia de entre 1 mm y 25 mm de la abertura de la vejiga. En algunas realizaciones, una vez que el dispositivo cilíndrico y las agujas están en su lugar en un sujeto, la jeringa que contiene el polímero se puede conectar a un canal dentro del cilindro, este canal está configurado para administrar el polímero al tejido mientras aún está en forma líquida fluida, es decir, antes de que se reticule y solidifique. En una realización, habrá un mezclador estático o un mezclador activo entre la jeringa y el cilindro, donde el mezclador estático está configurado para usarse cuando el componente de polímero líquido del pegamento requiere mezclarse con la suspensión de reticulante.

En algunas realizaciones, la composición de la presente invención está configurada para administrar una solución mínimamente invasiva para tratar la incontinencia fecal en animales y humanos. En algunas realizaciones, se puede inyectar un agente de carga biocompatible en la capa submucosa del canal anal para proporcionar una expansión física del tejido, estrechando así el ano defectuoso.

En algunas realizaciones, el agente de carga de la presente invención se basa en una espuma o gel adhesivo estabilizador in situ. En algunas realizaciones, el agente de carga está configurado para resistir la migración y mantiene una integridad volumétrica. En algunas realizaciones, el agente de carga de la presente invención es significativamente más barato de fabricar que los productos de la competencia (ya que es posible la esterilización terminal). En algunas realizaciones, el agente de la presente invención está configurado para adherirse fuertemente al tejido mientras es biocompatible.

En algunas realizaciones, el agente de carga de la presente invención está configurado para eliminar o mejorar las cicatrices del acné y corregir las líneas de las arrugas, elevar las cicatrices existentes, renovar los contornos faciales o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el agente de carga de la presente invención es un material de relleno que tiene las siguientes cualidades: (i) Fisiológica - Se incorpora a los tejidos del cuerpo; (ii) Procedimiento simple - Inyectable; (iii) Sin riesgos: sin complicaciones ni efectos adversos; (iv) Semipermanente: se degrada con el tiempo; (v) servir como andamiaje para el crecimiento interno de células y agente de remodelación de tejidos o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición de la presente invención es un relleno, por ejemplo, un relleno intradérmico. En algunas realizaciones, el relleno puede estar compuesto de gelatina y estabilizador de transglutaminasa. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar mascotas domésticas, por ejemplo, pero sin limitarse a, gatos y perros.

En algunas realizaciones, se puede inyectar un relleno (por ejemplo, con un aplicador como se describe en el presente documento) debajo del revestimiento de la uretra justo más allá o justo antes de donde se conecta con la vejiga urinaria. En algunas realizaciones, el polímero aumenta el volumen del área aumentando la presión en esta parte de la uretra, lo que mejora la continencia urinaria. Además, dado que el polímero es gelatina reticulada, el polímero está configurado para estimular el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en el área y el aumento de tejido natural eventualmente reemplazará al polímero.

Otro uso más para una espuma selladora de tejido no tóxica es para la reducción del volumen del tejido, por ejemplo, la reducción del volumen pulmonar. Los pacientes con enfisema actualmente tienen opciones de tratamiento limitadas. Muchos pacientes son tratados con esteroides y medicamentos inhalados, que a menudo brindan poco o ningún beneficio. En los últimos años, la cirugía de reducción de volumen pulmonar (LVRS, por sus siglas en inglés) se ha convertido en una terapia aceptada para el enfisema avanzado. La LVRS implica la extirpación de las partes enfermas del pulmón para permitir que las partes sanas restantes del pulmón funcionen mejor (ver, por ejemplo, Cooper et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 109: 106-116, 1995). Sin embargo, la cirugía LVRS es mayor, invasiva y riesgosa. Reducir el volumen de tejido pulmonar enfisematoso no funcional por medios mínimamente invasivos, específicamente una espuma selladora, deja espacio para que el tejido pulmonar menos dañado se expanda y funcione con mayor eficacia. Mejora el desajuste ventilación-perfusión. Los resultados hasta ahora en RCT con sellador de albúmina indican una mejora significativa. Algunos experimentaron una mejora de más del 100% de aumento en FEV1. Sin embargo, los riesgos significativos (probablemente inflamatorios debido al uso de reticulantes tóxicos) limitan su utilidad actual. Si bien puede parecer contradictorio que la función respiratoria mejoraría eliminando parte del pulmón con sellador, la eliminación del tejido sobredistendido (como se ve en pacientes con enfisema heterogéneo) permite que las regiones adyacentes del pulmón que están sanas se expandan. A su vez, esta expansión permite mejorar el retroceso y el intercambio de gases. La espuma de gelatina no tóxica descrita en este documento puede administrarse a través de las vías respiratorias y/o los canales de trabajo del broncoscopio al pulmón. Inducirá la proliferación de fibroblastos y, en consecuencia, el segmento tratado del pulmón se volverá disfuncional y se colapsará. En algunas realizaciones, dicha región objetivo del pulmón se colapsa lavando la región objetivo con un antitensioactivo.

En algunas realizaciones, la presente invención es la composición inventiva para usar en un método para tratar una herida, donde la composición farmacéutica en polvo seco está en una formulación seleccionada de un recubrimiento adhesivo seco, aerosol, aerosol seco, bomba de pulverización, compresa médica, película, yeso recubierto, esponja medicada o parche quirúrgico, vellón hemostático, gasa, ungüento, semigel, gel, espuma, pasta, suspensión, ungüento, emulsión, forma moldeable, tapón nasal, vendaje quirúrgico, taponamiento de heridas, vendaje, hisopo, catéter , fibra óptica, jeringa, pesario, supositorio y una suspensión en un líquido o líquido no acuoso.

En algunas realizaciones, la presente invención es una composición reticulable que se puede usar sola o con otros materiales osteoconductores y proporciona resistencia cohesiva al material compuesto para permitir la preparación del injerto óseo. En algunas realizaciones, la composición es de gelatina y una transglutaminasa, ambas en forma líquida. En algunas realizaciones, la composición de gelatina se encuentra en forma líquida con aditivos destinados a disminuir su punto de transición (como, entre otros, urea y/o calcio). En algunas realizaciones, la composición es de gelatina y una transglutaminasa, ambas en forma de polvo seco. En algunas realizaciones, los materiales osteoconductores adecuados para usar con la presente invención incluyen, entre otros, hidroxapatita (HA), fosfato tricálcico (TCP por sus siglas en inglés), CCC, vidrio bioactivo, cerámica bioactiva y/o mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, los materiales osteoinductivos adecuados para su uso con la presente invención incluyen, entre otros, DBM y factores de crecimiento tales como proteína morfogénica ósea (BMP por sus siglas en inglés), TGF-beta, PDGF, Plasma Alcanzar Plaquetas (PRP) y/o o mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, la composición está configurada para permitir que un médico adapte la composición a una forma (por ejemplo, minutos u horas antes del uso en cirugía). En algunas realizaciones, la composición de la presente invención puede incluir glucosaminoglucano, donde la adición de glucosaminoglucano a la composición permite la absorción de agua y mejora ciertas propiedades del andamiaje.

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención de manera no limitativa.

Ejemplos

Ejemplo 1: Pruebas de extracción sobre las composiciones, según algunas realizaciones de la presente invención. Componentes

(i) 0,25gr de preparación enzimática ACTIVA WM (1% transglutaminasa microbiana de Streptoverticillium mobaraense, 99% maltodextrina) (Ajinomoto, Japón)

(ii) 0,25 g de Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un rango de tamaño de partícula: d(0,1)=4,24 um, d(0,5)=16,61 um, d(0,9) = 31,51 um

(iii) 1 ml de solución salina (+y aditivo líquido)

Los polvos se esterilizaron con un haz de electrones de 9,93 KiloGray fabricado por L-3 Communications. La esterilidad fue confirmada por AminoLab Ltd. (Rechovot, Israel), la prueba se realizó de acuerdo con el SOP no. 50.WI.110-Pruebas de esterilidad de productos para el cuidado de la salud. Los polvos se mezclaron manualmente empujando la mezcla de una jeringa a otra de 10 a 12 veces. Inmediatamente después, la mezcla se aplicó entre dos láminas de colágeno de manera que la superposición pegada fuera de aproximadamente 2 cm*2,5 cm y se dejó curar durante aproximadamente 10 minutos. La composición se probó para fuerza de tracción máxima (pura) con un dinamómetro Lutron FG-20KG.

Los resultados demuestran la capacidad de esterilizar terminalmente los polvos micronizados sin perder significativamente la actividad.

Ejemplo 2: Impregnación de polvos secos en gasas según algunas realizaciones de la presente invención.

La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un rango de tamaño de partícula: d(0,1)=4,24 um, d(0,5)=16,61 um, d(0,9)=31,51 um. mTG se refiere a la preparación de enzimas ACTIVA WM (1 % de transglutaminasa microbiana de Streptoverticillium mobaraense, 99 % de maltodextrina) (Ajinomoto, Japón)

A) Los polvos de gelatina y mTG se impregnaron con alcohol etílico al 70% (Hen Shmuel Chemicals) en una gasa quirúrgica estándar.

B) Los polvos de gelatina y mTG impregnados con HFE 7000 (3M Novec 7000 Engineered Fluid), solvente altamente vaporizable, en una gasa quirúrgica estándar.

Resultados: Los disolventes se evaporaron por completo y las partículas de polvo permanecieron adheridas a la gasa. Una vez hidratada con solución salina, la gelatina se reconstituyó y se mezcló con la mTG para formar una capa bioadhesiva adherida a la gasa.

Ejemplo 3: El efecto de la espuma de gelatina reticulada en el tratamiento de defectos óseos, con y sin material de aumento óseo adicional

La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un tamaño de partícula de rango: d(0,1)=4,24 |jm, d(0,5)=16,61 |jm, d(0,9)=31,51 |jm. El siguiente mTG se refiere a ACTIVA WM, polvo con un nivel de actividad de 100U/gm (Ajinomoto, Tokio). El mTG contiene 1% de enzima y 99% de maltodextrina. Los polvos micronizados de gelatina y mTG se esterilizaron con un haz de electrones de 9,93 KiloGray (Sorvan, Israel).

El propósito del estudio fue evaluar el rendimiento potencial de una espuma adhesiva a base de gelatina de reticulación in situ. El material servirá como andamiaje para conducir e inducir el crecimiento óseo y para adherir al sitio quirúrgico cualquier otro material de aumento óseo osteoinductivo o conductor. Permitirá a un médico inmovilizar partículas de aumento óseo (biológicas o sintéticas) en una ubicación deseada y mantener su ubicación pegándolas entre sí y al tejido. El efecto esperado es sinérgico para ambos materiales; sin embargo, el efecto de la espuma de gelatina reticulada puede ser suficiente para usarse solo para este propósito.

Se utilizó 4 BONE BCH (MIS, ISRAEL) como material de aumento óseo, que es un sustituto óseo completamente sintético hecho de hidroxiapatita (HA) y fosfato betatricálcico (TCP) (60/40).

Para este estudio se utilizó un Foxhound americano de aproximadamente un año de edad, con un peso aproximado de 14-15 kg. Se administró anestesia de infiltración dental convencional en los sitios quirúrgicos. Se realizaron extracciones premolar y molar mandibular (P2, P3, P4, M1) en las hemiarcadas. Se perforaron alvéolos de 6 mm de diámetro y aproximadamente 7 mm de profundidad y se aplicaron biomateriales en los alvéolos, como se presenta en la figura 6A. Finalmente, se suturó el tejido blando sobre los alvéolos.

Se probaron y controlaron tres composiciones de biomaterial:

Alvéolo tipo A: 4 BONE 1,25ml solución salina mezclada con 0,2 gr mTG 0,25 gr gelatina 0,0125 gr Condroitín sulfato A C (GAG).

Alvéolo tipo B: 4 bOn E solo

Alvéolo tipo C: 0,25 gr de mTG mezclados en espuma con 0,25 gr de gelatina.

Alvéolo tipo D: Dejado vacío para servir como control negativo

El animal se recuperó bien de la cirugía y no se registraron eventos adversos durante su hospitalización. Fueron sacrificados ocho semanas después del procedimiento de implante. Ambas mandíbulas se fijaron en formalina tamponada durante 7 días. Después de enjuagar con agua, las muestras se deshidrataron en concentraciones ascendentes de etanol (70%, 83%, 96% y dos veces 100%), aproximadamente 24 horas en cada una. después de la deshidratación, las muestras se fijaron en xileno durante 1 día, luego se sumergieron en una mezcla de 100 cm3 de metacrilato de metilo, 10 cm3 de polietilenglicol y 1 gramo de peróxido de benzoilo a temperatura ambiente. Se cortaron 3-4 cortes transversales de 200 |jm de espesor de los lados distal y proximal de ambas mandíbulas utilizando una sierra de precisión de diamante de baja velocidad refrigerada por agua (Isomet de Buehler, IL). Las rebanadas se pegaron, utilizando cola acrílica, sobre portaobjetos "lechosos" de metacrilato, luego se trituraron y pulieron con un molinillo de precisión (Buehler, IL) hasta un espesor de 50 um. Los portaobjetos se tiñeron con azul de toluidina o con hematoxilina y eosina para el análisis histopatológico bajo un microscopio óptico. Las mandíbulas también se analizaron con rayos X, tomografía computarizada y se tomaron para análisis histológico.

Resultados

El análisis radiológico reveló que la mejor regeneración ósea se produjo en los alveolos de los tipos A y C, que se sometieron a la espuma de gelatina inventada. En la Figura 6 B y C se presenta una sección representativa de TC de hueso intacto, alveolo de control vacío, alveolo 4Bone solo, 4Bone y espuma de gelatina juntos y espuma de gelatina sola. Se puede ver en esas tomografías computarizadas que la formación de hueso nuevo más intensa se produjo en las cavidades de los tipos A y C.

Análisis histológico

El implante 4 BONE solo: El material de aumento muestra una distribución granular desigual que se muestra por la presencia de cavidades vacías y sin estimulación aparente de la neoformación ósea (es decir, sin activación ósea y sin formación de crecimiento de nueva osteona) a pesar de su contacto directo con el hueso adyacente.

4 BONE 0,2 gr mTG mezclado en una espuma con 0,5 gr de gelatina 0,0125 gr Sulfato de condroitina A C: el material granular sintético 4 BONE se distribuye y adhiere al hueso adyacente claramente de manera más uniforme que cuando se aplica solo. La espuma de gelatina reticulada tiene un aspecto amorfo. Hay una clara penetración y presencia en cavidades preexistentes. No se detecta reacción inflamatoria como granuloma de cuerpo extraño o presencia de osteoclastos en todo el volumen alveolar. La formación masiva de tejido óseo nuevo con formación trabecular gruesa es claramente visible. Además, los nuevos sistemas Haversianos activados se detectan fácilmente y se llenan de biomaterial. La presencia del biomaterial en medio de todos los sistemas haversianos sugiere que la combinación se comporta como un material fuertemente osteoconductor y osteoinductivo.

0,25 gr de mTG mezclados en espuma con 0,25 gr de gelatina: El biomaterial se identifica fácilmente como el material amorfo descrito previamente en el alvéolo tipo A, con buena penetración en las cavidades. La formación de tejido óseo nuevo es claramente visible con el biomaterial claramente visible en medio de los sistemas Haversianos activados, que se forman firmemente alrededor del biomaterial. La presencia del biomaterial en el centro de cada osteona sugiere fuertemente que es altamente osteoinductor, como producto independiente. La imagen representativa de este resultado se puede ver claramente en la Figura 6D, que representa una sección transversal de un portaobjetos de histología del osteón con espuma de gelatina (marcada por la flecha) en el centro del cana1Haversiano.

Ejemplo 4: El efecto de GAG y el rendimiento de una composición según algunas realizaciones de la presente invención.

La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un rango de tamaño de partícula: d(0,1)=4,24 um, d(0,5)=16,61 um, d(0,9)=31,51 um.

Materiales

(i) 0,034 gr sal sódica de Condroitín sulfato A de tráquea bovina (Sigma)

(ii) 0,233 gr gelatina (Gelita AG)

(iii) 0,233 gr mTG (ACTIVA; 1% mTG; Ajinomoto)

(iv) 1 ml de agua

se mezclan los materiales anteriores mediante el método de jeringa a jeringa y se reticulan.

Resultados

El material compuesto era térmicamente estable (por ejemplo, al sumergirlo en un vaso de agua a 50oC). Se sumergió en agua a temperatura ambiente durante 2 horas, sin un cambio medible en la estructura física. El compuesto también pudo solidificarse y adherirse a dos láminas de colágeno.

Ejemplo 5: Una composición que comprende Suraiflow.

El siguiente experimento prueba la capacidad de otro producto comercializado basado en gránulos de gelatina para reconstituirse y reticularse con mTG

Materiales

(i) Se mezclaron 0,25 gramos de matriz hemostática Surgiflo seca (Ethicon Inc) con 0,25 gramos de mTG en polvo (ACTIVA WM; Ajinomoto) en una jeringa

(ii) en otra jeringa se cargó con 1 ml de solución salina

Resultados

El agente de reticulamiento Surgiflo y mTG se mezcló bien con la solución salina para formar una espuma uniforme y se les dio seguimiento durante una hora. La espuma no se estabilizó ni se volvió pegajosa en absoluto.

Ejemplo 6: Caracterización mecánica a largo plazo de una espuma según algunas realizaciones de la presente invención.

La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un rango de tamaño de partícula: d(0,1)=4,24 |jm, d(0,5)=16,61 |jm, d(0,9)=31,51 |jm. El siguiente mTG se refiere a ACTIVA (Ajinomoto, Tokio).

Materiales

0,25 gr de gelatina y 0,25 gr de mTG mezclados con 1 ml de agua y prueba de flexión de 180grados del parámetro de flexibilidad medido inmediatamente después de la reticulación a espuma, después de 7 días de incubación en agua, después de 25 días y después de 60 días de incubación.

Resultados

La espuma reticulada era muy flexible y superó la prueba de flexión de 180grdos, mientras que una unidad de espuma redonda (de aproximadamente 2 cm de diámetro) y 1 mm de espesor se dobló al máximo posible, es decir, con una deformación de flexión de 180 grados, sin romperse. Alcanzó el mismo nivel de flexibilidad después de 7 días, 25, 60 días como inicialmente inmediatamente después de la reticulación.

Ejemplo 7:

Se pulverizó gelatina (Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A) con bola de mortero triturador a 3600 oscilaciones por minuto durante 30 minutos. Se mezclaron 0,25 gr del polvo de gelatina resultante con 0,25 gr de ACTIVA (Ajinomoto, Japón). La mezcla de mTG gelatina se mezcló en una espuma con lml de agua a una temperatura de 19oC, de acuerdo con el método que se muestra en la Figura 3. La espuma-pegamento se usó para adherir dos láminas de colágeno y se probó su termoestabilidad.

Resultados

La gelatina molida se disolvió parcialmente. Era visible a simple vista que el tamaño de las partículas obtenidas de la molienda con mortero era muy variable y era evidente que las partículas más grandes no se disuelven bien.

La espuma resultante se estabilizó en una formación física unificada suave. La espuma se reticuló y permaneció termoestable después de la inmersión en agua a una temperatura de 50C. La espuma apenas cebada adhirió las láminas de colágeno entre sí.

Ejemplo 8: Microscopía.

La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un rango de tamaño de partícula: d(0,1)=4,24 um, d(0,5)=16,61 um, d(0,9)=31,51 um. El siguiente mTG se refiere a ACTIVA (Ajinomoto, Japón).

Se preparó espuma de gelatina-mTG y se visualizó en un microscopio óptico con aumentos de 10x y 40x para evaluar sus propiedades de espuma.

Resultados

Se detectó que las burbujas estaban bloqueadas de forma aleatoria en todo el elemento del cuerpo. Varían en tamaño entre 2-500 micras de diámetro. La Figura 8 muestra una realización de la presente invención, mostrando una imagen de las burbujas resultantes.

Ejemplo 9: Uso de una composición según algunas realizaciones de la presente invención como sellador gastrointestinal.

Prueba aguda: La mTG y el polvo de gelatina se mezclaron en una proporción de 1:1 con lml de agua para inyección. Aproximadamente 0,9 ml de la espuma se aplicaron al tracto gastrointestinal de un cerdo de 60Kg de LW, como lo haría un sellador quirúrgico y después de aproximadamente un minuto se probó la integridad.

Resultados: la espuma se estabilizó y se adhirió al tejido. Era muy flexible y compatible con el tejido. Una foto representativa presentada en la Figura 4.

Prueba crónica:

Método

Se mezclaron manualmente 0,25 g de gelatina esterilizada y 0,25 g de polvos de mTG con 1 ml de WFI en una espuma adhesiva conectando una jeringa a otra con un cierre especial, como se muestra en la Figura 3. La espuma sellante y se aplicó sobre una línea de sutura de 3 cm en el cuenco de un cerdo de 50 kg. El cerdo fue sacrificado después de 7 días. El sellador fue evaluado macroscópicamente, incluyendo prueba de elasticidad. La muestra fue extirpada y enviada para histopatología para evaluación microscópica.

Resultados

Seguridad: el cerdo se mantuvo saludable y se recuperó bien de la cirugía. No había signos de inflamación ni adherencias posquirúrgicas a la línea de sutura o al sellador que la rodeaba. En la evaluación microscópica (tinción H&E), el sellador estaba rodeado de una reacción histiocítica leve (grado 2), sin evidencia de necrosis o acumulación de células gigantes, lo que sugiere una buena tolerabilidad. Los histiocitos se asociaron con una presencia leve a moderada de células polimorfonucleares (grado 2-3). Se observó una reacción capsular (fibrosis con proliferación fibroblástica (grado 2, leve) en la interfaz de la superficie de la serosa.

Eficacia: Visualmente, el sellador permaneció adherido a la línea de sutura y era tan flexible como el tejido. Lo que significa que no se desprendió cuando el sellador de tejidos se dobló a unos 180 grados. En la evaluación microscópica (tinción H&E) se observó el material adherido a la superficie serosa. El material aún no se degradó durante una semana. Este punto de tiempo (7 días) es demasiado temprano para anticipar el perfil de degradación.

Ejemplo 10: Ensayo de diversas composiciones según algunas realizaciones de la presente invención.

La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un tamaño de partícula de rango: d(0,1)=4,24 jim d(0,5)=16,61 jim d(0,9)=31,51 jim

Ejemplo 11: Suministro de una composición según algunas realizaciones de la presente invención a través de una aguja.

La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un tamaño de partícula de rango: d(0,1)=4,24 |jm, d(0,5)=16,61 |jm, d(0,9)=31,51 |jm. El siguiente mTG se refiere a ACTIVA (Ajinomoto, Tokio).

El polvo de gelatina se mezcló con mTG en una proporción de 1:1. Se mezclaron manualmente 0,75 gramos de la mezcla en espuma con 2,63 ml de agua a 26C. La espuma se empujó a través de una aguja 18G (D=1,03 mm); 150 mm de largo.

Resultado: La espuma se suministró con éxito desde la jeringa a través de la aguja. La espuma se estabilizó después de unos 3 minutos y se mantuvo estable en agua a 50C (lo que significa que no es termorreversible).

Ejemplo 12: Uso de una composición según algunas realizaciones de la presente invención como tratamiento para la incontinencia fecal.

La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a c horro por Superfine Ltd hasta un rango de tamaño de partícula: d(0,1)=4,24 jim, d(0,5)=16,61 jim, d(0,9)=31,51 jim. El siguiente mTG se refiere a ACTIVA WM, polvo con un nivel de actividad de 100U/gm (Ajinomoto, Tokio). El mTG contiene 1% de enzima y 99% de maltodextrina. Los polvos micronizados de gelatina y mTG se esterilizaron con un haz de electrones de 9,93 KiloGray (Sorvan, Israel).

La mTG estéril y el polvo de gelatina se mezclaron en una proporción de 1:1 con 1ml de agua y se espumaron manualmente conectando una jeringa a otra con un cierre especial, como se muestra en la figura 3.

Se inyectó una inyección de espuma de gelatina de carga en el ano de 2 cerdos blancos (LW) grandes (65Kg) (N = 2). En la Figura 5 se presentan algunas fotos representativas.

Resultados: la espuma se estabilizó in situ en una carga flexible y se adhirió al tejido. El implante redujo el diámetro del paso del ano y provocó la coaptación artificial (estrechamiento) del tracto. Los sitios de inyección se recolectaron después de 100 días y 120 días. Los cerdos se sacrificaron y el tejido se fijó en formalina, se incrustó en bloques de parafina y se prepararon portaobjetos para el análisis histológico. Ninguno de los animales ha mostrado efectos adversos. El biomaterial presenta buena tolerabilidad y es degradable. No hubo necrosis ni formación de cavidades ni migraciones de biomaterial. El biomaterial atrajo células de fibroblastos al sitio de implantación, es decir, fibroblastos que proliferaron y crearon un tejido fibrótico. Después de la inyección en la fase aguda, el material provoca una respuesta inflamatoria de grado 2, después de lo cual, en la fase crónica, inflamación leve (grado 1-2) continúa mientras los fibroblastos actúan para reemplazar el volumen del biomaterial.

Ejemplo 14: Uso de una composición según algunas realizaciones de la presente invención como tratamiento para la incontinencia urinaria.

Los polvos estériles de 0,4 gr de mTG y 1 gr de gelatina se mezclaron con 8m1 de solución salina y se espumaron conectando jeringa con jeringa con un cierre especial como se muestra en la figura 3 y mezclando manualmente.

Estudio porcino crónico

Aproximadamente 0,3-0,5 m1 de la espuma se administraron a través de una aguja Jong de 4F/33 mm insertada en el canal de trabajo del cistoscopio. La espuma se suministró a la submucosa en la uretra proximal (a 2-3 cm del trígono) en un único punto. En la Figura 2 se presenta un dibujo esquemático del método y la ubicación anatómica de la implantación en un ser humano. En el caso de un paciente animal, la localización a tratar debe ser similar: en el extremo proximal de la uretra, próximo a la apertura de la vejiga. Las fotos representativas tomadas por el endoscopio se presentan en la Figura 7.

El tejido se recogió 22 días después de la inyección. El sitio de inyección se evaluó macroscópicamente y posteriormente se envió para evaluación histopatológica.

Resultados

La espuma se estabilizó in situ en una carga flexible y se adhirió al tejido. El implante redujo el diámetro del paso uretral y provocó una coaptación artificial (estrechamiento) del tracto. Se extrajo la uretra del animal mediante disección y se inspeccionó de cerca el implante.

El biomaterial presenta buena tolerabilidad y es degradable. No hubo necrosis ni formación de cavidades ni migraciones. El biomaterial atrajo células de fibroblastos al sitio de implantación, es decir, fibroblastos que proliferaron y crearon un tejido fibrótico.

Tratamiento de un perro con Incompetencia del Mecanismo del Esfínter Primario (PMSI por sus siglas en inglés) Se inscribió en el estudio una perra de raza mixta de 11 años de edad. Sufrió de PMSI durante aproximadamente dos años antes del tratamiento.

Se administraron alrededor de 0,3-0,5 ml de la espuma a través de una aguja de 4F/33 mm de largo insertada en el canal de trabajo del cistoscopio. La espuma se suministró a la submucosa en la uretra proximal (a 2-3 cm del trígono) en tres puntos circunferencialmente. Parte de la espuma se dispuso fuera del animal para verificar su capacidad de reticulación. La espuma se estabilizó y se mantuvo estable a 50 grados Celsius.

Resultados

No hubo eventos adversos. Después de una semana de seguimiento, el dueño del perro informó que las pérdidas de orina se habían resuelto.

Ejemplo 15: Ensayo de diversas composiciones según algunas realizaciones de la presente invención.

La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un tamaño de partícula de rango: (A) : d(0,1)=4,24 |jm, d(0,5)=16,61 |jm, d(0,9)=31,51 |jm

(B) : d(0,1) = 4,415 jim, d(0,5)=13,064 jim, d(0,9)= 29,621 jim.

(C) : d(0,1)= 13,451 jim, (C): d(0,5)= 94,66 jim, d(0,9)= 423,785 jim.

(C) es un ejemplo de referencia que no forma parte de la invención reivindicada.

Los polvos de gelatina se mezclaron con la enzima mTG: ACTIVA (Ajinomoto, Tokio).

e hidratado por mezcla manual (dos jeringas conectadas, una con polvos, una con agua). El resultado fue una espuma cuya capacidad para adherirse a dos láminas de colágeno se probó y se probó su termorreversibilidad sumergiendo el artículo en un baño de agua a 50C.

Ejemplo 16: Caracterización de las propiedades mecánicas y de unión de la espuma de gelatina reticulada con transglutaminasa.

La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un tamaño de partícula de rango: d(0,1)=4,24 |jm, d(0,5)=16,61 |jm, d(0,9)=31,51 |jm. El siguiente mTG se refiere al polvo AcTlVA con un nivel de actividad de 100U/gm (Ajinomoto, Tokio). El mTG contiene 1% de enzima y 99% de maltodextrina. Si se especifica Polvos esterilizados - Los polvos micronizados de gelatina y mTG se esterilizaron con radiación gamma 9,38 KGray (Sorvan, Israel)

Los parámetros reológicos de la espuma reticulada se midieron con la máquina Lloyd Materials Testing LS1 (Ametek Test & Calibration Instruments), una máquina de prueba de materiales de alta precisión de 1 kN, para probar las propiedades mecánicas del material biológico. El material biológico se preparó mezclando manualmente según las proporciones especificadas en la Tabla a continuación y se dejó pasar 40 minutos entre la mezcla y la prueba. Eso y se inyectó sobre una placa de vidrio cubierta de teflón, entre espaciadores y una cubierta de vidrio con una superficie de teflón, creando una forma rectangular de 3 mm de espesor una vez estabilizada. Se perforó una formación estándar de hueso de perro a partir del material biológico y se usó para pruebas mecánicas. Se realizó una prueba de tensión moviendo la mordaza superior hacia arriba, estirando el material biológico hasta la falla (rotura total). La carga máxima y el porcentaje de elongación total a la fuerza máxima se determinaron en función del ancho y el espesor de la muestra. El Módulo de Young se calculó eligiendo dos puntos, que representan la parte más lineal de la gráfica. La velocidad de prueba fue de 45 mm/minuto y se utilizó una celda de carga ION (No. de serie 10N0360).

La prueba de presión de estallido se realizó en base a la norma ASTM F2392-04, El método de prueba estándar para la resistencia al estallido de los selladores quirúrgicos. Para cada prueba de presión de estallido, se usó como sustrato tripa de salchicha de colágeno (Nitta Casings, N.J.). Se perforó un orificio de 3 mm de diámetro en cada muestra de la carcasa y cada muestra se sujetó en el colector de sujeción de muestras. La espuma se preparó mezclando manualmente los componentes, dejando un tiempo de curado de 40 minutos. Luego, el colector de tejido se llenó con agua bidestilada y se presurizó con una bomba de jeringa (KD Scientific Model 100 Series) activada a una velocidad de 120 mL/hora. El dispositivo de prueba se llenó de agua a través de tubos de silicona y se utilizó un manómetro para determinar la presión máxima (PSI) hasta la falla. El tipo de falla (cohesivo, adhesivo) se registró después de cada ensayo. Se probaron 3 repeticiones para cada grupo.

Los resultados representados en las tablas a continuación demuestran claramente la capacidad de fabricar un material biológico según la presente invención con propiedades mecánicas que son fáciles de controlar para adaptarse a diferentes necesidades en el campo de la ingeniería de tejidos o el sellado quirúrgico.

Ensa os mecánicos de aleación:

Pru r i n lli

Ejemplo 17: Caracterización de la penetración de nutrientes de una espuma de gelatina reticulada.

Este ejemplo demuestra la capacidad de una composición según la presente invención para permitir la circulación de nutrientes. Se prepararon espumas de la siguiente composición mezclando manualmente los componentes secos mediante un método de pasar PBS de una jeringa que contenía la composición de transglutaminasa/gelatina a la otra jeringa conectada 10 veces y se permitió la reticulación durante 15 minutos antes de agregar el medio coloreado. Se mezclaron 4 mL de PBS 1 gr de Gelatina y 1 gr de mTG. El material biológico tenía un diámetro de 21mm y un espesor de 26mm. El colorante líquido para alimentos de Red Maimon se diluyó en agua, el material biológico se sumergió en el líquido coloreado durante 24 horas antes de cortarlo por la mitad para medir la difusión del color.

La Figura 10 presenta fotos del material biológico cortado por la mitad, mostrando la capacidad del color para difundirse dentro del material biológico.

Ejemplo 18: Supervivencia celular después de mezclar con componente de gelatina.

La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un tamaño de partícula de rango: d(0,1)=4,24 |jm, d(0,5)=16,61 |jm, d(0,9)=31,51 |jm. Los polvos micronizados de gelatina se esterilizaron con 9,38 KGray de radiación gamma (Sorvan, Israel).

El siguiente ejemplo tiene como objetivo demostrar la capacidad de los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF por sus siglas en inglés) para resistir las fuerzas de cizallamiento exhibidas por la mezcla necesaria para producir la composición de acuerdo con la presente invención y evaluar el mejor método de incorporación celular dentro del material biológico, mediante mezclando directamente o utilizando una llave de paso de 3 vías. Dado que este método de mezcla, cuando se utiliza como andamiaje celular para fines de ingeniería de tejidos, asegura la distribución homogénea y la viabilidad de las células dentro del volumen del andamiaje.

Las células NHDF se separaron de placas de 100 mm al alcanzar una confluencia del 80% usando tripsina (solución B de EDTA de tripsina (0,25 %), EdTa (0,05 %), con rojo fenol, Biological Industries, 03-052-1A) tratamiento de 2 ml durante 3 -5 minutos después de contrarrestar la tripsina con 6 ml de medio que contiene suero (medio de eagle modificado de Dulbecco, glucosa alta, Biological industries, lote 1530279, suplementado con suero bovino fetal certificado al 10 %, catálogo #: 04-001-1A y solución de penicilina-estreptomicina al 1 %, Biological Industries, 03-031-1C). Las células se centrifugaron durante 5 min a 1500 RPM y se resuspendieron en 6ml de medio precalentado para dar una concentración madre de 360.000 células NHDF/ml.

Se realizaron 3 repeticiones de mezclar un polvo de gelatina con medios que contenían células como se describe en la tabla a continuación y se demostró la capacidad de supervivencia de las células usando azul de tripano (0,5 %) diluido 1:1 con medios que contenían células e inspección visual 4, 24 horas después de la siembra. En el pocillo 1, la gelatina y las células que contenían el medio se mezclaron directamente usando un sistema de 2 jeringas (luer lock macho conectado con luer lock hembra). Mientras que en los pocillos 2-3, la gelatina se solubilizó primero utilizando 2,5 ml de medio mezclado 8 veces e inmediatamente después, se añadió 1,5 m1 adicional de medio que contenía células utilizando una llave de paso de 3 vías (Elcam medical) y se realizaron 2 mezclas adicionales. Las células que contenían mezcla de gelatina se sembraron en una placa superior de 6 pocillos de plástico tratado con cultivo de tejidos (Corning Inc., Costar, Producto 4:3516).

La adherencia de las células se detectó fácilmente 4 horas después de la siembra, mientras que a las 24 horas después de la siembra, las células se ven completamente dispersas en la placa, lo que demuestra que las células son viables y capaces de soportar las tensiones de cizallamiento a las que están sujetas durante la mezcla.

Ensa o de su ervivencia celular debido al esfuerzo de cizallamiento

Ejemplo 19: Viabilidad celular dentro de una espuma de gelatina reticulada.

La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un tamaño de partícula de rango: d(0,1)=4,24 |jm, d(0,5)=16,61 |jm, d(0,9)=31,51 |jm. El siguiente mTG se refiere a ACTIVA WM, polvo con un nivel de actividad de 100U/gm (Ajinomoto, Tokio). El mTG contiene 1% de enzima y 99% de maltodextrina. Los polvos micronizados de gelatina y mTG se esterilizaron con radiación gamma 9,38 KGray (Sorvan, Israel). Los siguientes medios se refieren a los medios que contienen suero (medio de eagle modificado de Dulbecco, glucosa alta, Biological industries (Israel), suplementado con un 10 % de suero bovino fetal certificado, No. de catálogo: 04-001-1A y solución de penicilina-estreptomicina al 1 %, Biological Industries, 03-031-1C).

El siguiente ejemplo pretende demostrar que las células de fibroblastos son capaces de sobrevivir y desarrollarse incrustadas o sembradas en una composición según la presente invención, durante 7 días o más.

Las células NHDF se separaron de placas de 100 mm al alcanzar una confluencia del 80 % usando tratamiento con tripsina (solución B de EDTA de tripsina, Biological industries, 03-052-1A) de 2 ml durante 3-5 minutos y luego se contrarrestó la tripsina con medios que contenían suero. Las células se centrifugaron durante 5 min a 1500 RPM y se resuspendieron en medio para dar una concentración madre de 1.000.000 de células/ml.

Grupo A: Un material biológico de gelatina con una composición de 200 mg de gelatina esterilizada mezclada con 120 mg de mTG esterilizada, cargado en una jeringa luer lock macho y mezclado con 1 ml de medio madre de células (medio de eagle modificado de Dulbecco, alto contenido de glucosa, lote de Biological industries 1530279) durante 10 veces para fabricar el material biológico, y se inyecta en placas de 6 pocillos de plástico no tratado (Corning Inc., Costar, número de referencia: 3736, Lote#: 30015036).

Grupo B: El material biológico de la misma composición se mezcló con medios sin células, se permitió que se reticularan durante 40 min y se añadieron 1x10A6 células en un medio de 3 ml (medio de eagle modificado de Dulbecco, alto contenido de glucosa, Biological industries, lote 1530279, complementado con 10 % de suero bovino fetal certificado, No. de catálogo: 04-001-1A y solución de penicilina-estreptomicina al 1 %, Biological Industries, 03-031-1C) en un agitador durante 2 horas a 37 °C antes de pasar a una incubadora con CO2 al 5 % y 37 °C O/N. Este método permite que las células se adhieran al andamiaje de gelatina y crezcan en su periferia en lugar de incrustarse dentro de su volumen.

Grupo C: se usó como control y no contenía células pero tenía la misma composición del material biológico en los grupos A y B.

Los grupos A,B,C se incubaron en una incubadora con 5% de CO2 y 37 grados centígrados.

24 horas después de la siembra, todos los grupos se cortaron en cuartos con un bisturí, el material biológico del Grupo B se transfirió a placas de plástico nuevas de 6 pocillos no tratadas para cultivo celular para separar el artículo analizado de las células que no estaban adheridas al material biológico, y luego se añadió Alamarblue al 10 % v/v a todos los pocillos. La reducción de Alamarblue se midió 3 días y 6 días después de la siembra celular. Se permitieron aproximadamente 24 horas para la reacción de Alamarblue.

Los resultados representados en la Figura 10 demuestran claramente que las células dentro del material biológico (grupo A) y sobre el material biológico (grupo B) son viables y capaces de reducir el Alamarblue en los puntos de tiempo designados que se muestran por la diferente coloración del medio que contienen Alamarblue en comparación con el control (Grupo C). Esos resultados respaldan la afirmación de que el material biológico de espuma de gelatina reticulada puede actuar como un buen andamiaje para fines de ingeniería de tejidos.

Ejemplo 20: Realización de uso como sellador quirúrgico para el tratamiento de enfisema.

Este Ejemplo proporciona una demostración in vivo de una composición selladora médica biocompatible según la presente invención para lograr la reducción del volumen pulmonar. Como se describió anteriormente, la reducción del volumen pulmonar tiene muchas aplicaciones terapéuticas, particularmente para enfermedades o condiciones donde el tejido pulmonar se distiende crónicamente, como por ejemplo el enfisema.

La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un tamaño de partícula de rango: d(0,1)=4,24 ji|n, d(0,5)=16,61 ji|r|, d(0,9)=31,51 ji|r|. El siguiente mTG se refiere a ACTIVA WM, polvo con un nivel de actividad de IOoU/gm (Ajinomoto, Tokio).

Se utilizó un cerdo LW grande de 90 kg.

Se usó una espuma selladora médica según algunas realizaciones de la presente invención, que presentaba una mezcla de componente de gelatina y un componente enzimático. Se mezclaron 1,2 gr de polvo de gelatina con 0,4 gr de mTG y se mezclaron con 8 ml de solución salina. Se inyectaron alrededor de 12 ml de la espuma creada en los pulmones a través de un catéter extralargo de 200 cm de longitud y 7 F de diámetro.

Resultados

La espuma se inyectó con éxito a través del catéter largo. Se visualizó que la espuma alcanzaba el segmento pulmonar interno objetivo con un broncoscopio. Después de la operación, se etunizó al animal y se seccionó el pulmón. Los bronquiolos estaban expuestos y era visible que la espuma entraba en los bronquiolos y permanecía adherida en su sitio.

Ejemplo 21: Inyecciones subcutáneas de una composición según algunas realizaciones de la presente invención. La siguiente gelatina se refiere a Gelita fuerza de gelificación 275, gelatina porcina tipo A (Gelita, Sioux City) de grado médico con bajo contenido de endotoxinas, molida a chorro por Superfine Ltd hasta un rango de tamaño de partícula: d(0,1)=4,24 |jm, d(0,5)=16,61 |jm , d(0,9)=31,51 |jm.

El siguiente mTG se refiere a ACTIVA WM, polvo con un nivel de actividad de lOOU/gm (Ajinomoto, Tokio). El mTG contiene 1% de enzima y 99% de maltodextrina. Los polvos micronizados de gelatina y mTG se esterilizaron con un haz de electrones de 9,93 KiloGray (Sorvan, Israel). La composición ensayada comprendía: 0,25 g de polvo de gelatina 0,25 de polvo mTG en una jeringa se mezcló con 1 ml de solución salina estéril.

Para el estudio se utilizaron dos cerdos SW de 60 kg. Se anestesiaron los animales y se les inyectó la composición ensayada (0,3-0,5 ml de espuma) debajo de la piel utilizando una aguja en la pata delantera izquierda. Después de un período de seguimiento de 90 días, se sacrificó a los animales y se recogió tejido para análisis microscópico. Las muestras de tejido se fijaron en formalina y se enviaron para preparación de portaobjetos y tinción con H&E.

Resultados

Ninguno de los animales ha mostrado efectos adversos. El biomaterial presenta buena tolerabilidad y se degradó en su mayor parte. No se observaron necrosis ni formación de cavidades ni migraciones. La sustancia fue capaz de atraer las células de fibroblastos al objetivo inyectado, proliferaron y crearon un tejido fibrótico que reemplazó al biomaterial. La reacción granulomatosa crónica y los fibroblastos actúan para reemplazar el volumen del biomaterial. En ambos animales, la fibrosis se distribuye uniformemente a través del sitio de implantación (2-2,5 mm de diámetro en la sección transversal) con una presencia mínima de linfocitos que indica una respuesta inflamatoria mínima.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición,

donde la composición es un andamiaje poroso,

donde los poros del andamiaje son de 2 a 500 micras, la composición comprendiendo:

a. una proteína reticulable seleccionada del grupo que consiste en colágeno y gelatina;

b. un agente de reticulamiento que induce el reticulamiento de la proteína reticulable; y

c. un líquido,

donde la proteína reticulable se introduce en la composición como un polvo de proteína micronizada, que tiene un perfil de tamaño de micras entre 2 y 100 micras.

2. La composición según la reivindicación 1,

donde el líquido es un tampón fisiológico.

3. La composición según la reivindicación 1,

donde la proteína reticulable comprende gelatina de fuerza de gelificación de 200 a 300.

4. La composición según la reivindicación 1,

donde el reticulante es transglutaminasa, donde la transglutaminasa está presente en la composición preferiblemente en el rango de 0,0001% en peso a 2% en peso.

5. La composición según la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de un defecto tisular o enfermedad en un paciente que lo necesite, que comprende:

a. introducir la composición en el paciente en el sitio del defecto del tejido, en una cantidad suficiente para tratar el defecto o la enfermedad del tejido;

donde la composición se adhiere al tejido en el sitio del defecto, donde el defecto del tejido es una herida; o

donde el tejido está deteriorado y necesita regeneración; o

donde el defecto tisular es un defecto óseo, donde la composición induce preferiblemente la regeneración del hueso en el paciente; o

donde la enfermedad es incontinencia fecal; o

donde la enfermedad es incontinencia urinaria; o

donde la enfermedad es enfisema.

6. La composición según la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de un defecto tisular o enfermedad en un paciente que lo necesite, que comprende:

a. formar la composición en el paciente en el sitio del defecto del tejido, en una cantidad suficiente para tratar el defecto o la enfermedad del tejido;

donde el tejido está deteriorado y necesita regeneración; o

donde la enfermedad es incontinencia fecal; o

donde la enfermedad es incontinencia urinaria; o

donde la enfermedad es enfisema.

7. La composición según la reivindicación 1 para uso en el tratamiento del enfisema mediante la reducción del volumen pulmonar en un paciente.

8. La composición según la reivindicación 1 para uso como agente de remodelación de tejidos.

9. La composición según la reivindicación 1,

donde la gelatina reticulable está presente en la composición en el intervalo de 0,5 % en peso a 25 % en peso.