ES2908467T3

ES2908467T3 - Evasión de anticuerpos neutralizantes por un virus adenoasociado recombinante

Info

Publication number: ES2908467T3
Application number: ES17790633T
Authority: ES
Inventors: Annahita Keravala; Thomas W Chalberg
Original assignee: Adverum Biotechnologies Inc
Current assignee: Adverum Biotechnologies Inc
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2017-05-01
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2037-05-01
Also published as: AU2021236481A1; EP3448437A1; US20190142975A1; EP3448437B1; WO2017190125A1; CA3022600A1; EP4049683A1; AU2017257169B2; AU2017257169A1; EP3448437A4

Abstract

Un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico para su uso en un método para tratar una enfermedad o un trastorno ocular en un sujeto primate que lo necesite, teniendo dicho sujeto anticuerpos neutralizantes en una concentración de entre aproximadamente 0,46 mg /mL a aproximadamente 1,85 mg/mL en el fluido vítreo del ojo; comprendiendo dicho método administrar por vía intravítrea al ojo del sujeto al menos 1x1011 vg de un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico, en el que el sujeto comprende anticuerpos neutralizantes que se unen específicamente al rAAV, y en el que las células oculares transducidas expresan el producto génico terapéutico en una concentración suficiente para tratar el enfermedad o trastorno.

Description

DESCRIPCIÓN

Evasión de anticuerpos neutralizantes por un virus adenoasociado recombinante

Referencia cruzada a aplicaciones relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. n.° 62/330.002 presentada el 29 de abril de 2016.

Antecedentes de la invención

La terapia génica mediada por AAV administrada por vía subretiniana (SR) ha sido eficaz para algunas enfermedades oculares. La administración intravítrea (IVT) es menos invasiva y puede ser beneficiosa para una retina enferma y frágil. La administración IVT de vectores de AAV también puede ser ventajosa para una expresión génica retiniana más generalizada.

El documento WO 2013/170078 A1 describe vectores y plásmidos de virus adenoasociados. Kotterman et al. (2015), Gene Ther., 22(2): 116-126, revelan que la neutralización de anticuerpos plantea una barrera para la administración intravítrea de genes de vectores virales adenoasociados a primates no humanos.

Los datos disponibles sugieren que los anticuerpos neutralizantes (“neutralizing antibodies”, nAb) no bloquean la transducción por vectores de a Av después de la administración SR debido al privilegio inmunitario ocular. Sin embargo, los nAb preexistentes pueden tener un impacto negativo en la transducción y la expresión génica después de la administración IVT. En consecuencia, existe una necesidad en la técnica de métodos para la administración IVT de vectores de AAV que eviten los nAb y transduzcan con éxito las células oculares.

Sumario de la invención

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas y las siguientes realizaciones.

La presente invención se refiere a un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico para su uso en un método para tratar una enfermedad o un trastorno ocular en un sujeto primate que lo necesita, y dicho sujeto que tiene anticuerpos a una concentración de entre aproximadamente 0,46 mg/ml y aproximadamente 1,85 mg/ml en el fluido vitreo del ojo; comprendiendo dicho método administrar por vía intravítrea al ojo del sujeto al menos 1x10” vg de un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico, en el que el sujeto comprende anticuerpos neutralizantes que se unen específicamente al rAAV, y en el que las células oculares transducidas expresan el producto génico terapéutico en una concentración suficiente para tratar el enfermedad o el trastorno.

El rAAV puede ser un AAV2.7m8.

La cantidad eficaz puede ser de al menos aproximadamente 5x10” vg, preferiblemente de al menos aproximadamente 1x1013 vg.

Las células oculares pueden ser células retinianas.

La enfermedad o el trastorno ocular puede ser glaucoma, retinitis pigmentosa, degeneración macular, retinosquisis, amaurosis congénita de Leber, retinopatía diabética, acromotopsia o daltonismo. La enfermedad ocular puede ser degeneración macular, preferiblemente degeneración macular húmeda o degeneración macular seca.

El producto génico puede ser un polipéptido antiangiogénico, una proteína de unión al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o una proteína opsina.

En un aspecto, la presente descripción proporciona un método para proporcionar un transgén que codifica un producto génico a una célula ocular en un sujeto, que comprende administrar a uno o más sitios dentro del ojo del sujeto una cantidad eficaz de un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende dicho transgén, en el que el sujeto comprende anticuerpos neutralizantes que se unen específicamente al rAAV, en el que la cantidad eficaz es una cantidad suficiente para evadir al menos parcialmente los nAb en el sujeto y transducir la célula ocular, y en el que la célula ocular transducida expresa el producto génico. En realizaciones concretas, las células comprenden células retinianas. El rAAV se administra IVT.

En un aspecto relacionado, la presente descripción proporciona un método para tratar una enfermedad o un trastorno ocular en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a uno o más sitios dentro del ojo del sujeto una cantidad eficaz de un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico, en el que el sujeto comprende anticuerpos neutralizantes que se unen específicamente al rAAV, en el que la cantidad eficaz es una cantidad suficiente para evadir al menos parcialmente los nAb en el sujeto y transducir células oculares dentro del sujeto, y en el que las células oculares transducidas expresan el producto génico terapéutico. En realizaciones concretas, las células comprenden células retinianas. El rAAV se administra IVT.

En otro aspecto relacionado, la presente descripción proporciona un método para tratar una enfermedad o un trastorno ocular en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el método: (a) administrar a un primer ojo del sujeto una primera cantidad eficaz de un primer virus adenoasociado (rAAV) que comprende un primer transgén que codifica un primer producto génico; (b) esperar por un período de tiempo; y (c) administrar a un segundo ojo del sujeto una segunda cantidad eficaz de un segundo rAAV que comprende un segundo transgén que codifica un segundo producto génico, en el que la primera y la segunda cantidad eficaz son cantidades suficientes para transducir células del ojo, y en el que el las células transducidas expresan el primer y el segundo génico. En realizaciones concretas, las células comprenden células retinianas. El rAAV se administra IVT.

También se indica en el presente documento que el primer rAAV y el segundo rAAV son del mismo serotipo, el primer rAAV y el segundo rAAV comprenden las mismas proteínas de la cápside y/o el primer rAAV y el segundo rAAV son AAV2.7m8. En realizaciones concretas de cualquier aspecto, el primer rAAV y el segundo rAAV son de serotipos diferentes, y el primer rAAV y el segundo rAAV comprenden diferentes serotipos.

También se indica en el presente documento que el período de tiempo se selecciona de lo siguiente: al menos una semana, al menos un mes, al menos tres meses, al menos seis meses, al menos un año, al menos 18 meses, al menos dos años, al menos tres años, o más de tres años. También se indica en el presente documento que al sujeto no se le administra un rAAV recombinante durante el período de tiempo.

También se indica en el presente documento que el primer y el segundo producto génico son iguales. También se indica en el presente documento que el primer y segundo producto génico son diferentes. También se indica en el presente documento que el primer y/o segundo producto génico son un producto génico terapéutico. También se indica en el presente documento que el primer producto génico y el segundo producto génico se seleccionan independientemente de: un polipéptido antiangiogénico, una proteína de unión al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un agente anti-VEGF o una proteína anti-VEGF, o una proteína opsina.

En realizaciones concretas, la enfermedad o el trastorno ocular es glaucoma, retinitis pigmentosa, degeneración macular, retinosquisis, amaurosis congénita de Leber, retinopatía diabética, acromotopsia o daltonismo. En ciertas realizaciones, la enfermedad ocular es la degeneración macular, por ejemplo, degeneración macular húmeda o degeneración macular seca.

La cantidad eficaz o primera cantidad eficaz es al menos 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg. También se indica en el presente documento que la cantidad eficaz o primera cantidad eficaz comprende hasta aproximadamente 1X1011 genomas de vector del primer rAAV. En alguna realización, la cantidad eficaz o primera cantidad eficaz comprende entre 1x10” y 5x10” genomas de vector del primer rAAV.

En realizaciones concretas, la cantidad eficaz o segunda cantidad eficaz es al menos 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, o al menos aproximadamente 1x1013 vg.

También se indica en el presente documento que la primera cantidad eficaz comprende hasta aproximadamente 1x10” genomas de vector del primer rAAV, y la segunda cantidad eficaz comprende al menos aproximadamente 1x10” genomas de vector del segundo rAAV.

En ciertas realizaciones de cualquiera de los aspectos, al sujeto no se le administra un inmunosupresor antes, al mismo tiempo o después de la administración del rAAV o el primer rAAV, mientras que, en otras realizaciones, al sujeto se le administra un inmunosupresor antes, al mismo tiempo o después de la administración del rAAV o el primer rAAV.

También se indica en el presente documento que la administración se realiza mediante administración ocular, administración retiniana, administración subretiniana y/o administración intravítrea. También se indica en el presente documento que la administración se realiza mediante inyección ocular, inyección retiniana, inyección subretiniana y/o inyección intravítrea.

En realizaciones concretas, el rAAV tiene una replicación defectuosa.

En el presente documento se describen métodos para transducir vectores de AAV2 en presencia de anticuerpos neutralizantes (nAb) en un sujeto que comprende administrar al sujeto un virión de virus adenoasociado recombinante (rAAV) en una cantidad capaz de evadir al menos parcialmente los nAb en el sujeto. En algunas realizaciones, el virión de rAAV es AAV2.7m8. También se indica en el presente documento que el sujeto es un sujeto mamífero. La cantidad de virión de rAAV administrada es de al menos 1x10” vg. En algunas realizaciones, la cantidad de virión de rAAV administrada es de al menos aproximadamente 5x10” vg. En algunas realizaciones, la cantidad de virión de rAAV administrada es al menos aproximadamente 1x1013 vg. La administración es una inyección intravítrea.

Breve descripción de los dibujos

Las características novedosas de la invención se exponen en concreto en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención con referencia a la siguiente descripción detallada que muestra realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y sus dibujos adjuntos:

Figura 1: El aumento de las dosis de vector puede superar la inhibición por nAb in vitro. Para detectar el efecto de aumentar los títulos de AAV2.7m8 sobre la neutralización, se realizó un ensayo de IgIV (inmunoglobulina intravenosa) in vitro. El virus (MOI en incrementos semilogarítmicos de 1E5 a 5E6) se mezcló en una proporción de 1:1 con una serie de diluciones en 3 veces de 1:3 a 1:1000 de IgIV durante 1 hora y se añadió a células 293T. Estas se incubaron durante 72 horas, seguido de la evaluación del porcentaje de inhibición de GFP.

Figura 2: Resumen del diseño del estudio in vivo. Se utilizaron monos verdes africanos (“African green monkey”, AGM) para modelar condiciones clínicas potencialmente pertinentes de anticuerpos neutralizantes (nAb). Se ensayaron diferentes niveles de dosis de IgIV y AAV2.7m8 para simular el efecto de nAb preexistentes en AAV2.7m8 inyectado por IVT.

Figuras 3A-3H: Imágenes espectrales de Heidelberg de retina de AGM a las 4 semanas. Se realizaron imágenes de fluorescencia en la semana 4 para evaluar la expresión de GFP, como una medición de la evasión de nAb. La figura 3A muestra un AGM que recibe una inyección de IgIV intravítrea (1,85 mg/mL) con una dosis de 7m8.CMV-GFP de 1x10” vg TIV. La figura 3B muestra un AGM que recibe una inyección intravítrea de a-AAV2 monoclonal de ratón (5 pg/mL) con una dosis de 7m8.CMV-GFP de 1x10” vg TIV. La figura 3C representa un AGM que recibe una inyección intravítrea de vehículo (50 pL) con una dosis de 7m8.CMV-GFP de 1x10” vg TIV. La figura 3D representa un AGM que recibe una inyección intravítrea de IgIV (0,46 mg/mL) con una dosis de 7m8.CMV-GFP de 1x10” vg TIV. La figura 3E muestra un AGM que recibe una inyección intravítrea de IgIV (1,85 mg/mL) con una dosis de 7m8.CMV-GFP de 5x10” vg TIV. La figura 3F muestra un AGM que recibe una inyección intravítrea de a-AAV2 monoclonal de ratón (5 pg/mL) con una dosis de 7m8.CMV-GFP de 5x10” vg TIV. La figura 3G representa un AGM que recibe una inyección intravítrea de vehículo (50 pL) con una dosis de 7m8.CMV-GFP de 5x10” vg TIV. La figura 3H representa un AGM que recibe una inyección intravítrea de IgIV (1,85 mg/mL) con una dosis de 7m8.CMV-GFP de 1x1013 vg TIV.

Descripción detallada de la invención

La presente descripción proporciona métodos para transducir células oculares utilizando un AAV recombinante. La presente descripción también proporciona métodos para estimular la expresión de un transgén en células oculares, por ejemplo, células retinianas, en un individuo, por ejemplo, para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad o un trastorno ocular.

Definiciones

Un "vector", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una macromolécula o asociación de macromoléculas que comprende o se asocia con un polinucleótido y que se puede usar para mediar en la administración del polinucleótido a una célula. Los vectores ilustrativos incluyen, por ejemplo, plásmidos, vectores virales, liposomas y otros vehículos de administración de genes.

El término "AAV" es una abreviatura de virus adenoasociado, y puede usarse para referirse al propio virus o a derivados del mismo. El término incluye todos los subtipos y formas tanto naturales como recombinantes, excepto cuando se requiera lo contrario. El término "AAV" incluye AAV de tipo 1 (AAV-1), AAV de tipo 2 (AAV-2), AAV de tipo 3 (AAV-3), AAV de tipo 4 (AAV-4), AAV de tipo 5 (AAV-5), AAV de tipo 6 (AAV-6), AAV de tipo 7 (AAV-7), AAV de tipo 8 (AAV-8), AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AaV equino, AAV de primate, aAv no de primate y AAV ovino. "aAv de primate" se refiere a AAV que infecta a primates, "AAV no de primate" se refiere a AAV que infecta a mamíferos que no son primates, "AAV bovino" se refiere a AAV que infecta a mamíferos bovinos, etc.

Las secuencias genómicas de diversos serotipos de AAV, así como las secuencias de las repeticiones terminales nativas (TR), las proteínas Rep y las subunidades de la cápside son conocidas en la técnica. Tales secuencias se pueden encontrar en la bibliografía o en bases de datos públicas, tal como GenBank. Véanse, por ejemplo, los números de registro de GenBank NC_002077 (AAV-1), AF063497 (AAV-1), NC_001401 (AAV-2), AF043303 (AAV-2), NC_001729 (AAV-3), NC_-001829 (AAV-4), U89790 (AAV-4), NC_006152 (AAV-5), AF028704 y AAB95450 (AAV-6), AF513851 (AaV-7), AF513852 (AAV-8) y NC_006261 (AaV-8), cuyas descripciones se incorporan en el presente documento como referencia para mostrar secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de AAV. Véase también, por ejemplo, Srivistava et al. (1983), J. Virology, 45:555; Chiorini et al. (1998), J. Virology, 71:6823; Chiorini et al. (1999), J. Virology, 73:1309; Bantel-Schaal et al. (1999), J. Virology, 73:939; Xiao et al. (1999), J. Virology, 73:3994; Muramatsu et al. (1996), Virology, 221:208; Shade et al. (1986), J. Virol., 58:921; Gao et al. (2002), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 99:11854; Morris et al. (2004), Virology, 33:375-383; publicaciones de patente internacional WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; y patente de EE. uU. n.° 6.156.303. Además, las secuencias polinucleotídicas que codifican cualquiera de las proteínas de la cápside se pueden generar fácilmente basándose en la secuencia de aminoácidos y el código genético conocido, incluidas las secuencias con codones optimizados.

Un "virus AAV" o "partícula viral de AAV" o "partícula de vector de rAAV" o “rAAV" se refieren a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside de AAV (por ejemplo, por todas las proteínas de la cápside de un AAV de tipo salvaje) y un vector polinucleótido encapsulado rAAV Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido que no sea un genoma de AAV de tipo salvaje, tal como un transgén que se va a administrar a una célula de mamífero), normalmente se denomina "partícula de vector de rAAV" o simplemente un "vector de rAAV" o "rAAV". La producción de una partícula rAAV incluye necesariamente la producción de un vector de rAAV, ya que dicho vector está contenido dentro de una partícula rAAV.

La expresión "replicación defectuosa", tal como se usa en el presente documento en relación con un vector viral AAV para usar de acuerdo con la invención, significa que el vector de AAV no puede replicar y encapsular su genoma de forma independiente. Por ejemplo, cuando una célula de un sujeto se infecta con viriones de rAAV, el gen heterólogo se expresa en las células infectadas; sin embargo, debido al hecho de que las células infectadas carecen de genes rep y cap de AAV y de genes de función auxiliares, el rAAV no es capaz de replicarse.

Una "variante de AAV" o "mutante de AAV", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una partícula viral compuesta por: a) una proteína variante de la cápside de AAV, en la que la proteína variante de la cápside de AAV comprende al menos una diferencia de aminoácido (por ejemplo, una sustitución de aminoácido, una inserción de aminoácido, una deleción de aminoácido) en relación con una correspondiente proteína de la cápside de AAV originaria, en la que la proteína de la cápside de AAV no corresponde a la secuencia de aminoácidos presente de una proteína de la cápside de AAV que se produce de forma natural; y, opcionalmente, b) un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico heterólogo, en el que la proteína variante de la cápside de AAV confiere una mayor unión a heparano o a un proteoglicano de sulfato de heparano en comparación con la unión por un virión de AAV que comprende la correspondiente proteína de la cápside AAV originaria. En determinadas realizaciones, la proteína variante de la cápside confiere: a) mayor infectividad de una célula de la retina en comparación con la infectividad de la célula de la retina por un virión de AAV que comprende la correspondiente proteína de la cápside de AAV originaria; b) un tropismo celular alterado en comparación con el tropismo de un virión de AAV que comprende la correspondiente proteína de la cápside de AAV originaria; y/o c) una mayor capacidad para unirse y/o cruzar la ILM en comparación con un virión de AAV que comprende la correspondiente proteína de la cápside de AAV originaria.

La abreviatura "rAAV" se refiere al virus recombinante adenoasociado, también denominado vector de AAV recombinante (o "vector de rAAV"). Un "vector de rAAV", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un vector de AAV que comprende una secuencia polinucleotídica que no se origina de AAV (es decir, un polinucleótido heterólogo a AAV), típicamente una secuencia de interés para la transformación genética de una célula. En general, el polinucleótido heterólogo está flanqueado por al menos una, y generalmente por dos secuencias repetidas terminales invertidas (ITR) de AAV. La expresión vector de rAAV incluye tanto partículas de vectores de rAAV como plásmidos de vectores de rAAV.

“Encapsulación” se refiere a una serie de acontecimientos intracelulares que dan como resultado el ensamblaje y la encapsidación de una partícula de AAV.

Los genes "rep" y "cap" de AAV se refieren a secuencias polinucleotídicas que codifican proteínas de replicación y encapsidación de virus adenoasociados. Los genes rep y cap de AAV se denominan en el presente documento "genes de encapsulación" de AAV.

Un "virus auxiliar" para AAV se refiere a un virus que permite que el AAV (por ejemplo, un AAV de tipo salvaje) sea replicado y encapsulado por una célula de mamífero. Se conocen en la técnica una diversidad de tales virus auxiliares para AAV, incluidos adenovirus, herpes virus y poxvirus, tales como virus de vaccinia. Los adenovirus abarcan varios subgrupos diferentes, aunque el adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el más utilizado. Numerosos adenovirus de origen humano, de mamíferos no humanos y de aves son conocidos y están disponibles en depósitos, tales como ATCC. Los virus de la familia del herpes incluyen, por ejemplo, virus del herpes simplex (HSV) y virus de Epstein-Barr (EBV), así como citomegalovirus (CMV) y virus de la pseudorrabia (PRV), que también están disponibles en depósitos, tales como ATCC.

"Función o funciones de virus auxiliar" se refiere a una o más funciones codificadas en un genoma de virus auxiliar que permiten la replicación y la encapsulación de AAV (junto con otros requisitos para la replicación y la encapsulación descritos en el presente documento). Tal como se describe en el presente documento, la "función del virus auxiliar" se puede proporcionar de varias formas, incluso proporcionando virus auxiliares o proporcionando, por ejemplo, secuencias polinucleotídicas que codifican la función o funciones requeridas para una célula productora en trans. Por ejemplo, un plásmido u otro vector de expresión que comprende secuencias de nucleótidos que codifican una o más proteínas adenovirales se transfecta a una célula productora junto con un vector de rAAV.

Un virus o partícula viral "infecciosa" es un virus o partícula que comprende una cápside viral ensamblada competentemente y que es capaz de transportar un componente de polinucleótido hacia el interior de una célula para la cual la especie viral es trópica. El término no implica necesariamente ninguna capacidad de replicación del virus. Los ensayos para contar partículas virales infecciosas se describen en otra parte de esta descripción y en la técnica. La infectividad viral se puede expresar como la proporción de partículas virales infecciosas a partículas virales totales. Los métodos para determinar la proporción de partículas virales infecciosas a partículas virales totales son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Grainger et al. (2005), Mol. Ther., 11:S337 (que describe un ensayo de título infeccioso TCID50); y Zolotukhin et al. (1999), Gene Ther., 6:973. Ver también los ejemplos.

Un virus "con capacidad de replicación" (por ejemplo, un AAV con capacidad de replicación) se refiere a un virus fenotípicamente salvaje que es infeccioso y también es capaz de replicarse en una célula infectada (es decir, en presencia de un virus auxiliar o de funciones de un virus auxiliar). En el caso de AAV, la capacidad de replicación generalmente requiere la presencia de genes de encapsulación de AAV funcionales. En general, los vectores de rAAV, tal como se describen en el presente documento, no tienen capacidad de replicación en células de mamífero (especialmente en células humanas) en virtud de la falta de uno o más genes de encapsulación de AAV. Típicamente, tales vectores de rAAV carecen de secuencias de genes de encapsulación de AAV para minimizar la posibilidad de que se generen AAV con capacidad de replicación mediante la recombinación entre los genes de encapsulación de AAV y un vector de rAAV entrante. En muchas realizaciones, las preparaciones de vectores de rAAV como se describen en el presente documento son aquellas que contienen pocos o ningún AAV con capacidad de replicación (rcAAV, también denominado RCA) (por ejemplo, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 102 partículas de rAAV, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 104 partículas rAAV, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 108 partículas rAAV, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 1012 partículas rAAV, o sin rcAAV).

El término ''polinucleótido'' se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, incluidos desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, y puede estar interrumpido por componentes que no son nucleótidos. Si están presentes, las modificaciones en la estructura de nucleótidos pueden impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. El término polinucleótido, como se usa en el presente documento, se refiere indistintamente a moléculas monocatenarias y bicatenarias. A menos que se especifique o requiera lo contrario, cualquier realización de la invención descrita en el presente documento que sea un polinucleótido incluye tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas monocatenarias complementarias conocidas o previstas para formar la forma bicatenaria.

Un polinucleótido o un polipéptido tiene un cierto porcentaje de "identidad de secuencia" con otro polinucleótido o polipéptido, lo que significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases o aminoácidos es el mismo cuando se comparan las dos secuencias. La similitud de secuencia se puede determinar de varias maneras diferentes. Para determinar la identidad de la secuencia, las secuencias se pueden alinear utilizando métodos y programas informáticos, incluido BLAST, disponible en la red mundial en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Otro algoritmo de alineamiento es FASTA, disponible en el paquete Genetics Computing Group (GCG), de Madison, Wis., EE. UU., una subsidiaria de propiedad total de Oxford Molecular Group, Inc. Otras técnicas de alineamiento se describen en Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., una división de Harcourt Brace & Co., San Diego, California, EE. UU. De particular interés son los programas de alineamiento que permiten huecos en la secuencia. El algoritmo de Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite huecos en los alineamientos de secuencias. Véase Meth. Mol. Biol., 70: 173-187 (1997). Además, se puede usar el programa GAP que utiliza el método de alineamiento de Needleman y Wunsch para alinear secuencias. Véase J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970).

De interés es el programa BestFit que utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics, 2: 482-489 (1981)) para determinar la identidad de secuencia. La penalización de generación de huecos oscilará generalmente de 1 a 5, normalmente de 2 a 4 y en muchas realizaciones será de 3. La penalización de extensión de huecos oscilará generalmente de aproximadamente 0,01 a 0,20 y en muchos casos será de 0,10. El programa tiene parámetros predeterminados determinados por las secuencias ingresadas para ser comparadas. Preferiblemente, la identidad de secuencia se determina utilizando los parámetros predeterminados determinados por el programa. Este programa también está disponible en el paquete Genetics Computing Group (GCG), de Madison, Wis., EE. UU.

Otro programa de interés es el algoritmo FastDB. FastDB se describe en Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1988, Alan R. Liss, Inc. FastDB calcula el porcentaje de identidad de secuencia en función de los siguientes parámetros: penalización por desapareamiento: 1,00; penalización por hueco: 1,00; penalización por tamaño del hueco: 0,33; y penalización por unión: 30,0.

Un "gen" se refiere a un polinucleótido que contiene al menos un marco de lectura abierto que es capaz de codificar un producto génico concreto después de ser transcrito y, a veces, también traducido. El término "gen" o "secuencia codificante" se refiere a una secuencia de nucleótidos in vitro o in vivo que codifica un producto génico. En algunos casos, el gen consiste o consiste fundamentalmente en una secuencia codificante, es decir, una secuencia que codifica el producto génico. En otros casos, el gen comprende una secuencia no codificante adicional. Por ejemplo, el gen puede o no incluir regiones que preceden y que siguen a la región codificante, por ejemplo, 5' no traducidas (5' UTR) o secuencias "líder" y 3' UTR o secuencias "remolcadas", así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).

Un "producto génico" es una molécula resultante de la expresión de un gen concreto. Los productos génicos incluyen, por ejemplo, un polipéptido, un aptámero, un ARN de interferencia, un ARNm y similares. En realizaciones concretas, un "producto génico" es un polipéptido, un péptido, una proteína o un ARN de interferencia que incluye ARN de interferencia corto o pequeño (ARNip), miARN o ARN de horquilla pequeña o corta (ARNhc). En realizaciones concretas, un producto génico es un producto génico terapéutico, por ejemplo, una proteína terapéutica.

Tal como se usa en el presente documento, un “gen terapéutico” se refiere a un gen que, cuando se expresa, produce un producto génico terapéutico que confiere un efecto beneficioso a la célula o tejido en el que está presente, o a un mamífero en el que se expresa el gen. Los ejemplos de efectos beneficiosos incluyen la mejora de un signo o síntoma de una afección o una enfermedad, la prevención o la inhibición de una afección o una enfermedad, o el otorgamiento de una característica deseada. Los genes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a genes que corrigen una deficiencia genética en una célula o mamífero.

Tal como se usa en el presente documento, un "transgén" es un gen que se administra a una célula mediante un vector. El gen puede comprender o consistir en una secuencia que codifica un producto génico.

"Recombinante", tal como se aplica a un polinucleótido, significa que el polinucleótido es el producto de varias combinaciones de etapas de clonación, restricción o acoplamiento, y otros procedimientos que tienen como resultado una construcción que es distinta de un polinucleótido que se encuentra en la naturaleza. Un virus recombinante es una partícula viral que comprende un polinucleótido recombinante. Los términos incluyen, respectivamente, réplicas de la construcción polinucleotídica original y la progenie de la construcción de virus original.

Un "elemento de control" o "secuencia de control" es una secuencia de nucleótidos implicada en una interacción de moléculas que contribuye a la regulación funcional de un polinucleótido, incluida la replicación, la duplicación, la transcripción, el corte y empalme, la traducción o la degradación del polinucleótido. La regulación puede afectar la frecuencia, la velocidad o la especificidad del proceso, y puede ser de naturaleza potenciadora o inhibidora. Los elementos de control conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, secuencias reguladoras de la transcripción tales como promotores y potenciadores. Un promotor es una región de ADN capaz, en determinadas condiciones, de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una región codificante normalmente situada cadena abajo (en la dirección 3') del promotor.

"Unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición de elementos genéticos, en la que los elementos están en una relación que les permite funcionar de la manera esperada. Por ejemplo, un promotor se une operativamente a una región codificante si el promotor ayuda a iniciar la transcripción de la secuencia codificante. Puede haber restos intermedios entre el promotor y la región codificante siempre que se mantenga esta relación funcional.

Un "vector de expresión" es un vector que comprende una región que codifica un producto génico de interés y se usa para llevar a cabo la expresión del producto génico en una célula diana deseada. Un vector de expresión también comprende elementos de control unidos operativamente a la región codificante para facilitar la expresión del producto génico en la diana. La combinación de elementos de control y un gen o genes a los que están unidos operativamente para la expresión se denomina a veces "módulo de expresión", un gran número de los cuales son conocidos y están disponibles en la técnica o pueden construirse fácilmente a partir de componentes que están disponible en la técnica.

"Heterólogo" significa derivado de una entidad genotípicamente distinta del resto de la entidad con la que se compara. Por ejemplo, un polinucleótido introducido mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una especie diferente es un polinucleótido heterólogo. Un promotor extraído de su secuencia codificante nativa y unido operativamente a una secuencia codificante con la que no se encuentra unido de forma natural es un promotor heterólogo. Por lo tanto, por ejemplo, un rAAV que incluye un ácido nucleico heterólogo que codifica un producto génico heterólogo es un rAAV que incluye un ácido nucleico que normalmente no se incluye en un AAV de tipo salvaje de origen natural, y el producto génico heterólogo codificado es un producto génico que normalmente no es codificado por un AAV natural de origen natural.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se refieren a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Los términos también incluyen un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, fosforilación o conjugación con un componente marcador.

Por "que comprende" se entiende que los elementos enumerados son necesarios, por ejemplo, en la composición, el método, el kit, etc., pero se pueden incluir otros elementos para formar, por ejemplo, la composición, el método, el kit, etc., dentro del alcance de la reivindicación. Por ejemplo, un módulo de expresión que "comprende" un gen que codifica un polipéptido terapéutico unido operativamente a un promotor es un módulo de expresión que puede incluir otros elementos además del gen y el promotor, por ejemplo, una secuencia de poliadenilación, elementos potenciadores, otros genes, dominios de conectores, etc.

Por "que consiste fundamentalmente en" se entiende una limitación del alcance, por ejemplo, de la composición, el método, el kit, etc., descrito con respecto a los materiales o etapas especificados que no afecta materialmente a las características básicas y novedosas, por ejemplo, de la composición, el método, el kit, etc. Por ejemplo, un módulo de expresión "que consiste fundamentalmente en" un gen que codifica un polipéptido terapéutico unido operativamente a un promotor y una secuencia de poliadenilación puede incluir secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias de conectores, siempre que no afecte materialmente a la transcripción o traducción del gen. Como otro ejemplo, un fragmento polipeptídico variante o mutante "que consiste fundamentalmente en" una secuencia citada tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia citada más o menos aproximadamente 10 restos aminoácidos en los límites de la secuencia en función del polipéptido no modificado de longitud completa del que se derivó, por ejemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos menos que el resto aminoácido del límite mencionado, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos más que el resto aminoácido del límite mencionado.

Por "que consiste en" se entiende la exclusión en la composición, el método o el kit de cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en la reivindicación. Por ejemplo, un módulo de expresión "que consiste en" un gen que codifica un polipéptido terapéutico unido operativamente a un promotor y una secuencia de poliadenilación consiste únicamente del promotor, la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido terapéutico y la secuencia de poliadenilación. Como otro ejemplo, un polipéptido "que consiste en" una secuencia citada contiene solo la secuencia citada.

Un "promotor", tal como se usa en el presente documento, incluye una secuencia de ADN que dirige la unión de la ARN polimerasa y, por lo tanto, estimula la síntesis de ARN, es decir, una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. Los promotores y la expresión de la correspondiente proteína o polipéptido pueden ser ubicuos, lo que significa que son fuertemente activos en una amplia gama de células, tejidos y especies o son específicos de célula, específicos de tejido o específicos de especie. Los promotores pueden ser "constitutivos", es decir, continuamente activos, o "inducibles", lo que significa que el promotor puede activarse o desactivarse por la presencia o ausencia de factores bióticos o abióticos. En las construcciones o vectores de ácido nucleico de la descripción también se incluyen secuencias de potenciadores que pueden o no ser contiguas a la secuencia de promotor. Las secuencias de potenciadoras influyen en la expresión génica dependiente de promotor y pueden ubicarse en las regiones 5' o 3' del gen nativo.

Un "potenciador", tal como se usa en el presente documento, incluye un elemento que actúa en cis que estimula o inhibe la transcripción de genes adyacentes. Un potenciador que inhibe la transcripción también se denomina "silenciador". Los potenciadores pueden actuar (es decir, pueden asociarse con una secuencia codificante) en cualquier orientación, a distancias de hasta varios pares de kilobases (kb) desde la secuencia codificante y desde una posición cadena abajo de una región transcrita.

Una "secuencia señal de terminación", tal como se usa en el presente documento, incluye cualquier elemento genético que haga que la ARN polimerasa termine la transcripción, tal como, por ejemplo, una secuencia señal de poliadenilación.

Una "secuencia señal de poliadenilación", tal como se usa en el presente documento, incluye una región de reconocimiento necesaria para la ruptura por endonucleasa de un transcrito de ARN seguido de la secuencia consenso de poliadenilación AATAAA. Una secuencia señal de poliadenilación proporciona un "sitio de poliA", es decir, un sitio en un transcrito de ARN al que se añadirán restos adenina mediante una poliadenilación postranscripcional.

El término "endógeno", tal como se usa en el presente documento con referencia a una molécula de nucleótido o un producto génico, se refiere a una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, un gen o un elemento genético, o un producto génico, por ejemplo, ARN, proteína, que se encuentra de forma natural en un virus o célula huésped o está asociada con ellos.

El término "nativo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, un gen, o un producto génico, por ejemplo, ARN, una proteína, que está presente en un virus o célula de tipo salvaje. El término "variante", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un mutante de una secuencia polinucleotídica o polipeptídica de referencia, por ejemplo, una secuencia polinucleotídica o polipeptídica nativa, es decir, que tiene menos del 100 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotídica o polipeptídica de referencia. Dicho de otra manera, una variante comprende al menos una diferencia de aminoácidos (por ejemplo, sustitución de aminoácidos, inserción de aminoácidos, deleción de aminoácidos) con respecto a una secuencia polinucleotídica de referencia, por ejemplo, una secuencia polinucleotídica o polipeptídica nativa. Por ejemplo, una variante puede ser un polinucleótido que tenga una identidad de secuencia del 70 % o más con una secuencia polinucleotídica nativa de longitud completa, por ejemplo, una identidad de 75 % u 80 % o más, tal como 85 %, 90 % o 95 % o más, por ejemplo, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia polinucleotídica nativa de longitud completa. Como otro ejemplo, una variante puede ser un polipéptido que tenga una identidad de secuencia del 70 % o más con una secuencia polipeptídica nativa de longitud completa, por ejemplo, una identidad de 75 % u 80 % o más, tal como 85 %, 90 % o 95 % o más, por ejemplo, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia polipeptídica nativa de longitud completa. Las variantes también pueden incluir fragmentos de variantes de una secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia nativa que comparte una identidad de secuencia del 70 % o más con un fragmento de la secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia nativa, por ejemplo, una identidad de 75 % u 80 % o más, tal como 85 %, 90 % o 95 % o más, por ejemplo, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia nativa.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones “actividad biológica” y “biológicamente activo” se refieren a la actividad atribuida a un elemento biológico concreto en una célula. Por ejemplo, la “actividad biológica” de una “inmunoglobulina”, “anticuerpo” o fragmento o variante de los mismos se refiere a la capacidad para unirse a un determinante antigénico y, por lo tanto, facilitar la función inmunológica. Como otro ejemplo, la actividad biológica de un polipéptido o fragmento funcional o variante del mismo se refiere a la capacidad del polipéptido o fragmento funcional o variante del mismo para llevar a cabo sus funciones nativas, por ejemplo, de unión, actividad enzimática, etc. Como tercer ejemplo, la actividad biológica de un elemento regulador de genes, por ejemplo, promotor, potenciador, secuencia kozak y similares, se refiere a la capacidad del elemento regulador o fragmento funcional o variante del mismo para regular, es decir, estimular, potenciar o activar la traducción, respectivamente, de la expresión del gen al que está unido operativamente.

Los términos "administrar" o "introducir", tal como se usan en el presente documento, se refieren a la administración de un vector para la expresión de genes o proteínas recombinantes a una célula, a células y/u órganos de un sujeto, o a un sujeto. Dicha administración o introducción puede tener lugar in vivo, in vitro o ex vivo. Un vector para la expresión de un producto génico puede introducirse en una célula mediante transfección, lo que normalmente significa la inserción de ADN heterólogo en una célula por medios físicos (por ejemplo, transfección con fosfato de calcio, electroporación, microinyección o lipofección); infección, que normalmente se refiere a la introducción a través de un agente infeccioso, es decir, un virus; o transducción, que generalmente significa la infección estable de una célula con un virus o la transferencia de material genético de un microorganismo a otro por medio de un agente viral (por ejemplo, un bacteriófago).

Normalmente, una célula se denomina "transducida", "infectada"; "transfectada" o "transformada" dependiendo del medio utilizado para la administración, introducción o inserción de ADN heterólogo (es decir, el vector) en la célula. Los términos "transducido", "transfectado" y "transformado" se pueden utilizar en el presente documento indistintamente con independencia del método de introducción del ADN heterólogo.

La expresión "célula huésped", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que ha sido transducida, infectada, transfectada o transformada con un vector. El vector puede ser un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las que se usaron previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para los expertos en la técnica. Se apreciará que la expresión “célula huésped” se refiere a la célula original transducida, infectada, transfectada o transformada y a su progenie.

Los términos "tratamiento", "tratar" y similares se usan en el presente documento para referirse generalmente a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de la prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma, por ejemplo, reducir la probabilidad de que la enfermedad o síntoma de la misma aparezcan en el sujeto y/o pueda ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se usa en el presente documento, incluye cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad aparezca en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero que aún no ha sido diagnosticado de tenerla; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad. El agente terapéutico puede administrarse antes, durante o después del inicio de la enfermedad o lesión. El tratamiento de una enfermedad en curso, en el que el tratamiento estabiliza o reduce los síntomas clínicos indeseables del paciente, es de particular interés. Dicho tratamiento se realiza deseablemente antes de la pérdida completa de la función en los tejidos afectados. La terapia en cuestión se administrará deseablemente durante la etapa sintomática de la enfermedad y, en algunos casos, después de la etapa sintomática de la enfermedad.

Los términos "individuo", "huésped", "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un mamífero, incluidos, entre otros, primates humanos y no humanos, incluidos simios y seres humanos; animales mamíferos deportivos (por ejemplo, caballos); animales de granja mamíferos (por ejemplo, ovejas, cabras, etc.); mascotas mamíferos (perros, gatos, etc.); y roedores (por ejemplo, ratones, ratas, etc.).

Por "anticuerpo neutralizante" o "nAb" se entiende un anticuerpo que reconoce un antígeno específico e inhibe el efectos o efectos del antígeno en el huésped (por ejemplo, un ser humano). Tal como se usa en el presente documento, el anticuerpo puede ser un solo anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos. En ciertas realizaciones, un anticuerpo neutralizante puede inhibir el efecto o efectos del antígeno de al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más cepas diferentes de AAV. Por ejemplo, el anticuerpo neutralizante puede inhibir la infectividad de (por ejemplo, la entrada en la célula) o la expresión génica dirigida por un AAV. Los anticuerpos neutralizantes que se unen a un virus, por ejemplo, un AAV, pueden, por ejemplo, ejercer un efecto perjudicial sustancial sobre la infectividad, la transducción, la expresión génica dirigida por u otra propiedad o actividad del virus.

Las diversas composiciones y métodos de la descripción se describen a continuación. También se entenderá que se puede llevar a cabo una evaluación de las construcciones de expresión y los métodos de la descripción usando procedimientos convencionales en la técnica.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, bioquímica e inmunología, que están dentro del alcance de los expertos en la técnica. Tales técnicas se explican exhaustivamente en la bibliografía, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis et al., eds., 1994); y "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991).

Varios aspectos de la invención se describen a continuación con referencia a ejemplos de aplicaciones como ilustración. Debe entenderse que se exponen numerosos detalles, relaciones y métodos específicos para proporcionar una comprensión completa de la invención.

Tal como se usa en el presente documento, las formas en singular "un/una” y "el/la" también incluyen las formas en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, en la medida en que los términos "incluido", "incluye", "tener", "tiene", "con", o variantes de los mismos, se utilicen en la descripción detallada y/o en las reivindicaciones, dichos términos están destinados a ser inclusivos de una manera similar al término "que comprende".

El término "aproximadamente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor concreto determinado por los expertos en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar, según la práctica de la técnica. Como alternativa, "aproximadamente" puede significar un intervalo de hasta el 20 %, preferiblemente hasta el 10 %, más preferiblemente hasta el 5 % y aún más preferiblemente hasta el 1 % de un valor dado. Como alternativa, en concreto con respecto a sistemas o procesos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro de 5 veces, y más preferiblemente dentro de 2 veces de un valor. Cuando se describen valores concretos en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, debe asumirse que el término "aproximadamente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor concreto.

Las publicaciones analizadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo contenido en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden diferir de las fechas de publicación reales, por lo que es posible que sea necesario confirmarlas de forma independiente.

A menos que se indique lo contrario, todos los términos y expresiones utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que tendrían para los expertos en la técnica, y la práctica de la presente invención empleará técnicas convencionales de microbiología y tecnología de ADN recombinante que están dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

Si bien en el presente documento se han mostrado y descrito realizaciones preferidas de la presente invención, será obvio para los expertos en la técnica que dichas realizaciones se proporcionan únicamente a modo de ejemplo.

Virus

También se indica en el presente documento que los métodos descritos en el presente documento se practican utilizando un virus o virión recombinante que comprende un transgén que codifica un producto génico. El virus recombinante se puede usar para transducir una célula, en la que el transgén expresa el producto génico, para administrar el producto génico a la célula o a un sujeto que comprende la célula.

También se indica en el presente documento que el virus o virión es un vector viral derivado de un virus, por ejemplo, un adenovirus, un virus adenoasociado (AAV), un lentivirus, un virus del herpes, un virus alfa o un retrovirus, por ejemplo, virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV), virus del sarcoma murino de Moloney (MoMSV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV), virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), virus de la leucemia felina (FLV), spumavirus, virus de la leucemia murina de Friend, virus de células madre murinas (MSCV) y virus del sarcoma de Rous (RSV)) o lentivirus. Véase, por ejemplo, el análisis de los vectores retrovirales, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.585.676 y la patente de Ee . UU. n.° 8.900.858, y el análisis de vectores adenovirales, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.858.367. En ciertas realizaciones, el virus o virión recombinante es infeccioso. En ciertas realizaciones, el virión o virus recombinante tiene capacidad de replicación. En ciertas realizaciones, el virus o virión recombinante no tiene capacidad de replicación.

El virus es un virus adenoasociado (rAAV). En realizaciones concretas, el virus es un AAV de tipo 1 (AAV-1), AAV de tipo 2 (AAV-2), AAV de tipo 3 (AAV-3), AAV de tipo 4 (AAV-4), AAV de tipo 5 (AAV- 5), AAV de tipo 6 (AAV-6), AAV de tipo 7 (AAV-7), AAV de tipo 8 (AAV-8), AAV aviar, AaV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV de primates, AAV no de primates, o AAV ovino.

En cierta realización, el virus es una variante de AAV. En realizaciones concretas, el AAV comprende una proteína variante de la cápside de AAV, por ejemplo, la proteína de la cápside de AAV puede comprender una inserción dentro de una proteína de la cápside, por ejemplo, VP1, de AAV de tipo 1 (AAV-1), AAV de tipo 2 (AAV-2), AAV de tipo 3 (AAV-3), AAV de tipo 4 (AAV-4), AAV de tipo 5 (AAV-5), AAV de tipo 6 (AAV-6), AAV de tipo 7 (AAV-7), AAV de tipo 8 (AAV-8), AAV de tipo 9 (AAV-9), AAV de tipo 10 (AaV-10), AAV rh.10, AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV de primates, AAV no de primates, AAV bovino, AAV2/7m8, AAVShH10, AAV2.5T, AAV2.5T/7m8, AAV9/7m8 y AAV5/7m8. Las proteínas de la cápside y los viriones de AAV2.5T se describen en la patente de EE. UU. n.° 9.233.131, en la que las secuencias de aminoácidos que codifican VP1 de AAV2.5T se proporcionan como SEQ ID NO:42 y Figuras 10A-B. Las proteínas de la cápside de AAV7m8 se describen en la patente de EE. UU. n.° 9.193.956. AAV7m8 incluye un inserto 7m8 entre los aminoácidos 587 y 588 del genoma de AAV2 de tipo salvaje. Las proteínas de la cápside de AAV2.5T/7m8 corresponden a las proteínas de la cápside de AAV2.5T que comprenden además un inserto 7m8.

En realizaciones concretas, los viriones y vectores virales que tienen una o más proteínas de la cápside modificadas o alteradas muestran: 1) mayor infectividad de una célula retiniana; 2) mayor especificidad tisular para una célula retiniana en comparación con una o más células o tejidos diferentes; 3) un aumento de la unión a proteoglicanos de heparano o sulfato de heparano y/o la membrana limitante interna (“inner limiting membrane”, ILM); 4) una mayor capacidad para infectar y/o administrar un producto génico a través de la ILM cuando se administra por vía intravítrea, en comparación con un virión correspondiente que comprende su proteína de la cápside nativa o de tipo salvaje en lugar de la proteína de la cápside modificada. En alguna realización, la célula retiniana es una célula de fotorreceptor (por ejemplo, bastones o conos). En otros casos, la célula retiniana es un RGC. En otros casos, la célula retiniana es una célula RPE. En otros casos, la célula retiniana es una célula de Muller. En otras realizaciones, la célula retiniana es una célula amacrina, una célula bipolar o una célula horizontal.

En ciertas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside, por ejemplo, VP1, incluye una inserción de un péptido de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos de longitud. En realizaciones concretas, el péptido de inserción tiene una longitud de 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, 8 aminoácidos, 9 aminoácidos, 10 aminoácidos u 11 aminoácidos. Estas inserciones se denominan colectivamente "inserciones 7m8". En ciertas realizaciones, la proteína variante de la cápside comprende una "inserción 7m8". En ciertas realizaciones, el péptido de inserción 7m8 comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las fórmulas establecidas en el presente documento. Por ejemplo, un péptido de inserción 7m8 puede ser un péptido de 5 a 11 aminoácidos de longitud, en el que el péptido de inserción tiene la fórmula I:

Y¹Y²X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷Y³Y⁴

en la que:

cada uno de Y¹-Y⁴está independientemente presente o ausente y, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr;

X¹está ausente o presente y, si está presente, se selecciona de Leu, Asn y Lys;

X²se selecciona de Gly, Glu, Ala y Asp;

X³se selecciona de Glu, Thr, Gly y Pro;

X⁴se selecciona de Thr, Ile, Gln y Lys;

X5 se selecciona de Thr y Ala;

X6 se selecciona de Arg, Asn y Thr; y

X7 está ausente o presente y, si está presente, se selecciona entre Pro y Asn.

Como otro ejemplo, un péptido de inserción 7m8 puede ser un péptido de 5 a 11 aminoácidos de longitud, en el que el péptido de inserción tiene la fórmula IIa:

Y¹Y²X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷Y³Y⁴

en la que:

cada uno de Y¹-Y⁴está independientemente ausente o presente y, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr;

cada uno de X¹-X⁴es cualquier aminoácido;

X5 es Thr;

X6 es Arg; y

y X⁷es Pro.

Como otro ejemplo, un péptido de inserción 7m8 puede ser un péptido de 5 a 11 aminoácidos de longitud, en el que el péptido de inserción tiene la fórmula IIb:

Y¹Y²X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷Y³Y⁴

en la que:

Xi está ausente o presente y, si está presente, se selecciona de Leu y Asn;

X²está ausente o presente y, si está presente, se selecciona de Gly y Glu;

X³se selecciona de Glu y Thr;

X⁴se selecciona de Thr e Ile;

X⁵es Thr;

X6 es Arg; y

X⁷es Pro.

Como otro ejemplo, un péptido de inserción 7m8 puede ser un péptido de 5 a 11 aminoácidos de longitud, en el que el péptido de inserción tiene la fórmula III:

Y¹Y²X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷Y³Y⁴

en la que:

X¹está ausente o presente y, si está presente, es Lys;

X²se selecciona de Ala y Asp;

X³se selecciona de Gly y Pro;

X⁴se selecciona de Gln y Lys;

X⁵se selecciona de Thr y Ala;

X6 se selecciona de Asn y Thr; y

X7 está ausente o presente y, si está presente, es Asn.

Como otro ejemplo, un péptido de inserción 7m8 puede ser un péptido de 5 a 11 aminoácidos de longitud, en el que el péptido de inserción tiene la fórmula IV:

Y¹Y²X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷Y³Y⁴

en la que:

X¹está ausente o presente y, si está presente, es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido sin carga; o se selecciona de Leu, Asn, Arg, Ala, Ser y Lys;

X²es un aminoácido con carga negativa o un aminoácido sin carga; o se selecciona de Gly, Glu, Ala, Val, Thr y Asp;

X³es un aminoácido con carga negativa o un aminoácido sin carga; o se selecciona de Glu, Thr, Gly, Asp o Pro; X⁴se selecciona de Thr, Ile, Gly, Lys, Asp y Gln;

X⁵es un aminoácido polar, un alcohol (un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo libre) o un aminoácido hidrofóbico; o se selecciona de Thr, Ser, Val y Ala;

X6 es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido sin carga; o se selecciona de Arg, Val, Lys, Pro, Thr y Asn; y

X7 está ausente o presente y, si está presente, es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido sin carga; o se selecciona de Pro, Gly, Phe, Asn y Arg.

Como ejemplos no limitantes, el péptido de inserción 7m8 puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos seleccionada de LGETTRP, NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF y STGKVPN.

En algunos casos, el péptido de inserción 7m8 tiene de 1 a 4 aminoácidos espaciadores (Y¹-Y⁴) en el extremo amino terminal y/o en el extremo carboxilo terminal de cualquiera de LGETTRP, NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF y STGKVPN. Los aminoácidos espaciadores adecuados incluyen, pero no se limitan a leucina, alanina, glicina y serina.

Por ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción 7m8 tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: LALGETTRPA; LANETITRPA, LAKAGQANNA, LAKDPKTTNA, LAKDTDTTRA, LARAGGSVGA, LAAVDTTKFA y LASTGKVPNA. Como otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción 7m8 tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: Aa Lg EtTRPA; AANETIt RpA, aAkAGQANNA y AAKDPKTTNA. Como otro ejemplo más, en algunos casos, un péptido de inserción 7m8 tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: GLGETTRPA; GNETITRPA, GkAGQANNA y GKDPKTTNA. Como otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción comprende uno de KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF y STGKVPN, flanqueado en el extremo C-terminal por AA y en el extremo N-terminal por A; o comprende uno de KDTDTTR, RAGGSVG), AVDTTKF y STGKVPN flanqueado en el extremo C-terminal por G y en el extremo N-terminal por A. En ciertas realizaciones, 7m8 es una secuencia aleatoria de cinco a 12 restos aminoácidos.

En cierta realización, el inserto de aminoácidos 7m8 comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos: LGETTRP. En realizaciones concretas, el inserto 7m8 comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: LALGETTRPA, o un fragmento que comprende al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho o al menos nueve aminoácidos consecutivos de la misma. En realizaciones concretas, el inserto 7m8 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 % o al menos un 90 % de homología con la secuencia de aminoácidos: LALGETTRPA, o un fragmento que comprende al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho o al menos nueve aminoácidos consecutivos de la misma. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside incluye una inserción m78 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada de LGETTRP y LALGETTRPA.

En algunas realizaciones, un polipéptido variante de la cápside de AAV es una cápside quimérica, por ejemplo, la cápside comprende una porción de la cápside de un AAV de un primer serotipo de AAV y una porción de la cápside de un AAV de un segundo serotipo; y en algunas realizaciones, comprende además una inserción de 7m8 con respecto a una correspondiente proteína originaria de la cápside de AAV.

En algunas realizaciones, una proteína variante de la cápside de la presente comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos. a una proteína de la cápside de tipo salvaje u originaria, por ejemplo, VP1, y una inserción de 7m8 con respecto a la proteína de la cápside de AAV de tipo salvaje u originaria correspondiente.

En algunas realizaciones, el virus o virión recombinante, por ejemplo, un AAV, comprende un módulo polinucleotídico que comprende una secuencia transgénica que codifica un producto génico, por ejemplo, un producto génico terapéutico. En ciertas realizaciones, la secuencia transgénica que codifica el producto génico está unida operativamente a una secuencia de promotor. En ciertas realizaciones, el módulo polinucleotídico está flanqueado en los extremos 5' y 3' por secuencias funcionales de repetición terminal invertida (ITR) de AAV. Por "secuencias ITR de AAV funcionales" se entiende que las secuencias ITR actúan según lo previsto para el rescate, la replicación y la encapsulación del virión de AAV. Por lo tanto, las ITR de AAV para su uso en los vectores virales utilizados en el contexto de la invención no necesitan tener una secuencia de nucleótidos de tipo salvaje y pueden alterarse mediante la inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos, o las ITR de AAV pueden derivar de cualquiera de varios serotipos de AAV, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10. Ciertos vectores de AAV tienen los genes REP y CAP de tipo salvaje delecionados en su totalidad o en parte, pero conservan las secuencias las ITR flanqueantes funcionales.

Los virus o viriones recombinantes descritos en el presente documento dentro del contexto de la invención comprenden un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un transgén) que codifica un producto génico terapéutico. En algunas realizaciones, el producto génico es un ARN de interferencia. En algunas realizaciones, el producto génico es un aptámero. En algunas realizaciones, el producto génico es un polipéptido. En algunas realizaciones, el producto génico es una nucleasa específica de sitio que proporciona la inactivación específica de sitio de la función del gen.

Cuando el producto génico es un ARN de interferencia (ARNi), los ARNi adecuados incluyen, entre otros, ARNi que disminuyen el nivel de un factor apoptótico o angiogénico en una célula. Por ejemplo, un ARNi puede ser un ARNhc o ARNip que reduce el nivel de un producto génico que induce o estimula la apoptosis en una célula. Los genes cuyos productos génicos inducen o estimulan la apoptosis se denominan en el presente documento, "genes proapoptóticos", y los productos de esos genes (ARNm; proteína) se denominan "productos génicos proapoptóticos". Los productos génicos proapoptóticos incluyen, por ejemplo, los productos génicos Bax, Bid, Bak y Bad. Véase, por ejemplo, la patente de eE. UU. n.° 7.846.730.

Los ARN de interferencia también pueden producirse contra de un producto angiogénico, por ejemplo, VEGF (por ejemplo, Cand5; véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. n.° 2011/0143400; publicación de patente de EE. Uu . n.° 2008/0188437; y Reich et al. (2003), Mol. Vis., 9:210), VEGFR1 (por ejemplo, Sirna-027; véase, por ejemplo, Kaiser et al. (2010), Am. J. Ophtalmol., 150:33; y Shen et al. (2006), Gene Ther., 13:225), o VEGFR2 (Kou et al. (2005), Biochem., 44:15064). Véanse también las patentes de Ee . UU. n.os 6.649.596, 6.399.586, 5.661.135, 5.639.872, y 5.639.736; y patentes de EE. UU. n os 7.947.659 y 7.919.473.

Cuando el producto génico es un aptámero, los ejemplos de aptámeros de interés incluyen un aptámero contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Véase, por ejemplo, Ng et al. (2006), Nat. Rev. Drug Discovery, 5:123; y Lee et al. (2005), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:18902. Por ejemplo, un aptámero de VEGF puede comprender la secuencia de nucleótidos 5'-cgcaaucagugaaugcuuauacauccg-3' (SEQ ID NO:17). También es adecuado para su uso un aptámero específico de PDGF, por ejemplo, E10030; véase, por ejemplo, Ni y Hui (2009), Ophtalmologica, 223:401; y Akyama et al. (2006), J. Cell Physiol., 207:407).

Cuando el producto génico es un polipéptido, en determinadas realizaciones, el polipéptido puede potenciar la función de una célula retiniana, por ejemplo, la función de una célula de fotorreceptor de cono o bastón, una célula ganglionar retiniana, una célula de Muller, una célula bipolar, una célula amacrina, una célula horizontal o una célula epitelial pigmentada retiniana. Los polipéptidos ilustrativos incluyen polipéptidos neuroprotectores (por ejemplo, GDNF, CNTF, NT4, NGF y NTN); polipéptidos antiangiogénicos (por ejemplo, un receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) soluble; un anticuerpo de unión a VEGF; un fragmento de anticuerpo de unión a VEGF (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF monocatenario); endostatina; tumstatina; angiostatina; un polipéptido Flt soluble (Lai et al. (2005), Mol. Ther., 12:659); una proteína de fusión de Fc que comprende un polipéptido Flt soluble (véase, por ejemplo, Pechan et al. (2009), Gene Ther., 16:10); el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF); un receptor Tie-2 soluble; etc.); el inhibidor tisular de metaloproteinasas-3 (TIMP-3); una opsina sensible a la luz, por ejemplo, una rodopsina; polipéptidos antiapoptóticos (por ejemplo, Bcl-2, Bcl-Xl); y similares. Los polipéptidos adecuados incluyen, pero no se limitan al factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF); factor de crecimiento de fibroblastos 2; neurturina (NTN); factor neurotrófico ciliar (CNTF); factor de crecimiento nervioso (NGF); neurotrofina-4 (NT4); factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); factor de crecimiento epidérmico; rodopsina; inhibidor de la apoptosis ligado al cromosoma X; y Sonic hedgehog, así como variantes funcionales y fragmentos de cualquiera de estos, incluidas variantes que tienen al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia con cualquiera de estos polipéptidos, y fragmentos que comprenden al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % de cualquiera de estos polipéptidos o variantes de los mismos.

Las opsinas sensibles a la luz adecuadas incluyen, por ejemplo, una opsina sensible a la luz como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2007/0261127 (por ejemplo, ChR2; Chop2); publicación de patente de EE. UU. n.° 2001/0086421; publicación de patente de EE. UU. n.° 2010/0015095; y Diester et al. (2011), Nat. Neurosci., 14:387.

En determinadas realizaciones, el producto génico es un polipéptido antiangiogénico, una proteína de unión al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un agente anti-VEGF o una proteína opsina.

El factor de crecimiento endotelial vascular (en el presente documento denominado "VEGF" o "ligando de VEGF") es un potente mitógeno específico de células endoteliales que desempeña un papel clave en la formación fisiológica de vasos sanguíneos. En algunos casos, la actividad de VEGF resulta de la unión del ligando de VEGF a uno o más receptores de VEGF en una célula. La unión del ligando de VEGF al receptor de VEGF puede tener numerosos efectos bioquímicos y celulares posteriores, que incluyen, entre otros, la angiogénesis en los tejidos. El VEGF se ha implicado en prácticamente todos los tipos de trastornos angiogénicos o neovasculares, incluidos los asociados con el cáncer, la isquemia y la inflamación. Además, el VEGF se ha implicado en enfermedades oculares, incluidas, entre otras, la retinopatía isquémica, la neovascularización intraocular, la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la DMAE húmeda, la DMAE seca, la neovascularización retiniana, el edema macular diabético, la isquemia retiniana diabética, el edema retiniano diabético, la retinopatía diabética proliferativa, la oclusión de la vena retiniana, la oclusión de la vena central retiniana, la oclusión de la vena retiniana ramificada. Además, los tratamientos anti-VEGF, que incluyen las composiciones y los métodos de esta descripción como se describe en el presente documento, pueden usarse en el tratamiento de una o más de estas enfermedades descritas en el presente documento. Datos recientes sugieren que VEGF es el principal factor de crecimiento angiogénico en la patogénesis de la forma húmeda de DMAE.

El VEGF, un glucopéptido homodimérico de 46 kDa, se expresa en varios tipos de células oculares diferentes, incluidas, entre otras, células del epitelio pigmentario, pericitos, células endoteliales vasculares, neuroglía y células ganglionares. En algunos casos, VEGF se expresa en patrones espaciales y temporales específicos durante el desarrollo de la retina. En algunos casos, las isoformas humanas de VEGF pueden incluir proteínas de 206, 189, 183, 165, 148, 145 y 121 aminoácidos por monómero; sin embargo, las isoformas predominantes de VEGF humano incluyen, entre otras, VEGF121, VEGF 165, VEGF 189 y VEGF206. Estas proteínas se producen mediante corte y empalme alternativo del ARNm de VEGF y difieren en su capacidad para unirse a la heparina y a los receptores o correceptores específicos de VEGF (neuropilinas). El dominio codificado por los exones 1-5 del gen VEGF contiene información requerida para el reconocimiento de los receptores KDR/FLK-1 y FLT-1 de VEGF conocidos. Este dominio está presente en todas las isoformas de VEGF. El VEGF actúa a través de estos receptores, que son receptores tirosina quinasa de alta afinidad, lo que conduce a la proliferación y migración de las células endoteliales y al aumento de la vasopermeabilidad.

El VEGF es uno de los varios factores implicados en el complejo proceso de la angiogénesis y tiene una especificidad muy alta por las células endoteliales vasculares. El VEGF es un regulador de la angiogénesis fisiológica durante procesos como la génesis del embrión, el crecimiento esquelético y la función reproductiva, pero también se ha implicado en la angiogénesis patológica asociada con enfermedades, tales como el cáncer, los trastornos de la placenta y otras afecciones. Los efectos biológicos potenciales de VEGF pueden estar mediados por receptores que abarcan la membrana similares a fms específicos, FLT-1 y FLK-1/KDR. En algunos casos, estos compañeros de unión de VEGF naturales pueden afectar a la unión de VEGF a los receptores de VEGF, modulando así la activación del receptor de VEGF y las posteriores vías corriente abajo.

En relación con el cáncer, varios inhibidores de VEGF, incluido un anticuerpo monoclonal humanizado contra VEGF (rhuMab VEGF), un anticuerpo anti-VEGFR-2, moléculas pequeñas que inhiben la transducción de señales de VEGFR-2 y un receptor soluble de VEGF, han mostrado algunas propiedades terapéuticas.

En relación con las enfermedades neovasculares intraoculares, tales como la retinopatía diabética, las oclusiones de las venas retinianas o la degeneración macular relacionada con la edad, algunos antagonistas del VEGF han mostrado efectos terapéuticos, a pesar de la necesidad de una administración frecuente.

Los métodos descritos en el presente documento se utilizan para administrar un agente anti-VEGF al ojo. En realizaciones concretas, el virus recombinante de la presente descripción comprende una secuencia que codifica una proteína anti-VEGF, incluidas, entre otras, las proteínas de unión a VEGF o fragmentos funcionales de las mismas descritas en las patentes de Ee . UU. n.os 5.712.380, 5.861.484 y 7.071.159 y proteínas de fusión de unión a VEGF descritas en la patente de EE. UU. n.° 7.635.474. En una realización, un agente anti-VEGF es aflibercept o una variante 0 fragmento funcional del mismo. Una proteína anti-VEGF también puede incluir la proteína sFLT-1 como se describe en el presente documento.

Los virus o plásmidos recombinantes de la presente descripción pueden comprender la secuencia que codifica una proteína anti-VEGF, incluida la proteína natural sFlt-1, tal como se describe en la patente de EE. UU. 5.861.484 y la secuencia descrita por SEQ ID NO:109. También incluye, entre otros, fragmentos funcionales de la misma, incluidas secuencias del dominio 2 de sFlt-1 o las indicadas en SEQ ID NO:121, así como construcciones relacionadas, tales como las proteínas de fusión de unión a VEGF descritas en la patente de EE. UU. n.° 7.635.474. Una proteína anti-VEGF también puede incluir la proteína sFLT-1 tal como se describe en el presente documento. Estas secuencias se pueden expresar a partir del ADN que codifica tales secuencias usando el código genético, una técnica convencional que entienden los expertos en la técnica. Como pueden apreciar los expertos en la técnica, debido a la degeneración del código genético, las secuencias de proteína anti-VEGF pueden expresarse fácilmente a partir de varias secuencias de ADN diferentes.

"Proteína sFlt-1" en el presente documento se refiere a una secuencia polipeptídica, o fragmento funcional de la misma, con al menos un 90 % o más de homología con la secuencia de sFLT-1 humana natural, de modo que la proteína o polipéptido sFlt-1 se une a VEGF y/o al receptor de VEGF. La homología se refiere al porcentaje de conservación de restos de un alineamiento entre dos secuencias, por ejemplo, como la proteína sFLT-1 humana natural, que puede incluir cualquier variante adecuada de sFLT-1, incluidos, entre otros, fragmentos funcionales, secuencias que comprenden inserciones, deleciones, sustituciones, seudofragmentos, seudogenes, variantes de corte y empalme o secuencias optimizadas artificialmente En algunos casos, la "proteína sFLT-1" puede ser al menos aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 % o 100 % homóloga a la secuencia de la proteína sFLT-1 humana natural, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 % o 100 % homóloga a la secuencia de la proteína sFLT-1 humana natural. En algunos casos, la "proteína sFLT-1" puede ser al menos aproximadamente el 90 %>, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 % o 100 % espacialmente homóloga a la conformación de la proteína sFLT-1 humana natural. En algunos casos, la "sFLT-1 "proteína" puede ser como máximo aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 % o 100 % espacialmente homóloga a la conformación de la proteína sFLT-1 humana natural.

Además, la forma truncada soluble del receptor FLT-1 de VEGF, sFLT-1, es el único inhibidor específico endógeno conocido de VEGF. En la naturaleza, se genera mediante un corte y empalme alternativo del ARNm y carece del dominio similar a inmunoglobulina proximal a la membrana, la región transmembrana y el dominio tirosina-quinasa intracelular. Desde el punto de vista estructural, la proteína FLT-1 y sFLT-1 pueden comprender múltiples dominios funcionales. En algunas variantes, las proteínas FLT y sFLT habitualmente comparten 6 dominios interconectados; 3 dominios implicados en la dimerización de la proteína y 3 dominios implicados en la unión de un ligando, tal como VEGF.

sFLT-1 es el único inhibidor específico endógeno conocido de VEGF. Esta interacción es específica y puede eliminarse compitiendo con un exceso de 100 veces de VEGF no marcado. En algunos casos, la actividad angiostática de sFLT-1 puede resultar de la inhibición de VEGF por dos mecanismos: i) secuestro de VEGF, al que se une con alta afinidad, y ii) formación de heterodímeros inactivos con isoformas que se extienden por la membrana de los receptores FLTT-1 y FLK-l/KDR de VEGF. Tal como se sabe en la técnica, los ensayos de unión in vitro han indicado que sFLT-1 se une a VEGF con alta afinidad y también puede inhibir la proliferación dirigida por VEGF de células endoteliales de vena umbilical humana. En modelos animales de cáncer, sFLT-1 inhibe el crecimiento tumoral. En algunos casos, sFLT-1 puede actuar de manera negativa subestequiométrica o dominante, ya que se puede evitar que el exceso de VEGF en el espacio extracelular se una y, posteriormente, active el receptor de VEGF. Estas propiedades de sFLT-1 se han descrito en Kendall y Thomas, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 10705-10709. Tal como se sabe en la técnica, pueden usarse fragmentos funcionales de sFLT-1 en lugar de la proteína de longitud completa. Más específicamente, el dominio de unión a VEGF (dominio 2) o, como alternativa, el dominio 2 de sFLT-1 más el dominio 3 de sFLT1, KDR u otro miembro de la familia, puede usarse para unir e inactivar VEGF. Tales fragmentos funcionales se describen en Wiesmann et al., 1997, Cell, 91: 695-704. El término "sFLT-1" y la expresión "un fragmento funcional de sFLT-1" son equivalentes y se usan en el presente documento indistintamente.

Los polipéptidos de productos génicos adecuados que pueden administrarse de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento también incluyen, por ejemplo, retinosquisina, proteína 1 que interactúa con el regulador de GTPasa de retinisis pigmentosa (RGPR) (véase, por ejemplo, GenBank n.os de registro Q96KN7, Q9EPQ2 y Q9GLM3); periferina-2 (Prph2) (véase, por ejemplo, GenBank n.° de registro NP.sub.--000313; periferina; una proteína específica del epitelio pigmentario de la retina (RPE65) (véase, por ejemplo, GenBank AAC39660; y Morimura et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3088); CHM (coroidermia (proteína 1 de acompañamiento de Rab)), un polipéptido que, cuando es defectuoso o falta, causa coroideremia (véase, por ejemplo, Donnelly et al. (1994), Hum. Mol. Genet., 3:1017; y van Bojoven et al. (1994), Hum. Mol. Genet., 3:1041); y el homólogo 1 de Crumbs (CRB1), un polipéptido que, cuando es defectuoso o falta, causa amaurosis congénita de Leber y retinitis pigmentosa (véase, por ejemplo, den Hollander et al. (1999), Nat. Genet., 23:217; y de GenBank n.° de registro CAM23328).

Los polipéptidos adecuados también incluyen polipéptidos que, cuando son defectuosos o faltan, conducen a la acromotopsia, y tales polipéptidos incluyen, por ejemplo, la subunidad alfa del canal activado por GMPc de fotorreceptores de conos (CNGA3) (véase, por ejemplo, GenBank n.° de registro NP.sub.--001289; y Booij et al. (2011), Ophtalmology, 118:160-167); subunidad beta del canal catiónico activado por GMPc de fotorreceptores de conos (CNGB3) (véase, por ejemplo, Kohl et al. (2005), Eur. J. Hum. Genet., 13(3):302); proteína de unión a nucleótidos de guanina (proteína G), polipéptido 2 de actividad de transducción alfa (GNAT2) (ACHM4); y ACHM5; y polipéptidos que, cuando son defectuosos o faltan, conducen a diversas formas de daltonismo (por ejemplo, L-opsina, M-opsina y S-opsina). Véase Mancuso et al. (2009), Nature, 461(7265): 784-787.

En algunos casos, un producto génico de interés es una endonucleasa específica de sitio que proporciona la inactivación específica de sitio de la función del gen, por ejemplo, cuando la endonucleasa elimina un alelo asociado con una enfermedad de la retina. Por ejemplo, cuando un alelo dominante codifica una copia defectuosa de un gen que, cuando es de tipo salvaje, es una proteína estructural de la retina y/o proporciona una función retiniana normal, una endonucleasa específica de sitio puede dirigirse al alelo defectuoso e inactivar el alelo defectuoso.

Además de inactivar un alelo defectuoso, también se puede usar una nucleasa específica de sitio para estimular la recombinación homóloga con un ADN donante que codifica una copia funcional de la proteína codificada por el alelo defectuoso. Por lo tanto, por ejemplo, un virión de rAAV del presente documento se puede usar para administrar una endonucleasa específica de sitio que inactiva un alelo defectuoso, y se puede usar para administrar una copia funcional del alelo defectuoso, lo que resulta en la reparación del alelo defectuoso, proporcionando así la producción de una proteína retiniana funcional (por ejemplo, retinosquisina funcional, RPE65 funcional, periferina funcional, etc.). Véase, por ejemplo, Li et al. (2011), Nature, 475:217. En algunas realizaciones, un virión de rAAV de la presente descripción comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una endonucleasa específica de sitio; y una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una copia funcional de un alelo defectuoso, en el que la copia funcional codifica una proteína retiniana funcional. Las proteínas retinianas funcionales incluyen, por ejemplo, retinosquisina, RPE65, proteína 1 que interactúa con el regulador de GTPasa de la retinitis pigmentosa (RGPR), periferina, periferina-2 y similares.

Las endonucleasas específicas de sitio que son adecuadas para su uso incluyen, por ejemplo, nucleasas de dedos de zinc (ZFN); y nucleasas efectoras similares al activador de la transcripción (TALEN), en las que dichas endonucleasas específicas de sitio no se producen de forma natural y se modifican para dirigirse a un gen específico. Dichas nucleasas específicas de sitio pueden diseñarse para cortar ubicaciones específicas dentro de un genoma, y la unión de extremos no homólogos puede reparar la ruptura mientras se insertan o eliminan varios nucleótidos. Dichas endonucleasas específicas de sitio (también denominadas "INDEL") luego arrojan la proteína fuera de marco e inactivan de modo eficaz el gen. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. n.° 2011/0301073.

En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico se une operativamente a un promotor constitutivo. En otras realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés se une operativamente a un promotor inducible. En algunos casos, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés se une operativamente a un elemento regulador específico de tejido o específico de tipo de célula. En ciertas realizaciones, el promotor se selecciona del promotor de citomegalovirus (CMV), promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotor de MMT, promotor de EF-1 alfa, promotor de UB6, promotor de betaactina de pollo, promotor de CAG, promotor de RPE65 y promotor de opsina.

Por ejemplo, en algunos casos, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés se une operativamente a un elemento regulador específico de fotorreceptores (por ejemplo, un promotor específico de fotorreceptores), por ejemplo, un elemento regulador que confiere la expresión selectiva del gen unido operativamente en una célula de fotorreceptor. Los elementos reguladores específicos de fotorreceptores adecuados incluyen, por ejemplo, un promotor de rodopsina; un promotor de la rodopsina quinasa (Young et al. (2003), Ophtalmol. Vis. Sci., 44:4076); un promotor del gen de la beta fosfodiesterasa (Nicoud et al. (2007), J. Gene Med., 9:1015); un promotor del gen de la retinitis pigmentosa (Nicoud et al. (2007), supra); un potenciador del gen de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores (IRBP) (Nicoud et al. (2007), supra); un promotor del gen IRBP (Yokoyama et al. (1992), Exp. Eye Res., 55:225).

Pueden producirse vectores virales recombinantes (por ejemplo, viriones de rAAV) descritos en el presente documento y, opcionalmente, los módulos de polinucleótidos encapsulantes de la presente descripción, usando una metodología convencional. Por ejemplo, en el caso de viriones de rAAV, se puede introducir un vector de expresión de AAV que comprende un módulo polinucleotídico en una célula productora, seguido de la introducción de una construcción auxiliar de AAV que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína variante de la cápside descrita en el presente documento, y en la que la construcción auxiliar incluye regiones codificantes de AAV capaces de expresarse en la célula productora y que complementan las funciones auxiliares de AAV ausentes en el vector de AAV. A esto le sigue la introducción de virus auxiliares y/o vectores adicionales en la célula productora, en el que el virus auxiliar y/o los vectores adicionales proporcionan funciones auxiliares capaces de apoyar la producción eficaz de virus rAAV. A continuación, las células productoras se cultivan para producir rAAV. Estas etapas se llevan a cabo utilizando una metodología convencional. Los viriones de AAV con replicación defectuosa que comprenden proteínas variantes de la cápside descritas en el presente documento se fabrican mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica utilizando células de encapsulación de AAV y una tecnología de encapsulación. Se pueden encontrar ejemplos de estos métodos, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os 5.436.146, 5.753.500, 6.040.183, 6.093.570 y 6.548.286. Otras composiciones y métodos para la encapsulación se describen en Wang et al. (documento US 2002/0168342).

Métodos

La presente descripción también proporciona métodos para administrar un producto génico a una célula o tejido, que comprenden administrar un virus o vector viral descrito en el presente documento a la célula o el tejido. También se describen en el presente documento métodos para transducir vectores de AAV, seguido de la expresión de un transgén en presencia de anticuerpos neutralizantes (nAb) en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto un virión de virus adenoasociado recombinante (rAAV) en una cantidad capaz de evadir al menos parcialmente los nAb en el sujeto.

En realizaciones concretas, el rAAV puede ser cualquiera de los descritos en el presente documento. En algunos casos, el rAAV puede ser un AAV nativo de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9. En algunos casos, el rAAV puede ser un AAV quimérico que comprende proteínas de al menos dos serotipos. En algunos casos, el rAAV puede comprender una variante de la proteína de la cápside. En algunos casos, el rAAV puede comprender inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en relación con la secuencia de un AAV natural original. En algunas realizaciones, el rAAV puede comprender una inserción de aminoácidos en un bucle de GH de una proteína de la cápside. Se describen ejemplos de tales inserciones en los documentos US 9.193.956 y US 8.663.624.

En el presente documento se describe el desarrollo de nuevos vectores de AAV para indicaciones clínicas con la administración IVT que pueden superar las limitaciones actuales. AAV2.7m8 (descrito en el documento US 9.193.956) es una nueva variante de AAV2 que puede transducir de modo eficaz múltiples capas de la retina de primates no humanos (“non-human primate”, NHP) después de la inyección IVT. Sin embargo, los nAb preexistentes podrían limitar la eficacia de AAV2.7m8 después de la administración IVT.

La presente descripción proporciona nuevos métodos de administración de vectores virales, por ejemplo, vectores de AAV, que, en el presente documento, se demuestra que pueden transducir con éxito células oculares en presencia de anticuerpos neutralizantes que se unen al vector de AAV. También se indica en el presente documento que la administración se realiza mediante administración ocular, administración retiniana, administración subretiniana y/o administración intravítrea. También se indica en el presente documento que la administración se realiza mediante inyección ocular, inyección retiniana, inyección subretiniana y/o inyección intravítrea. El sujeto al que se le administra el vector viral tiene nAb, por ejemplo, nAb que se unen y neutralizan los vectores de AAV, debido a una exposición previa a AAV. En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra el vector viral tiene nAb contra el vector viral debido a una administración previa del vector viral al sujeto. Por ejemplo, a un sujeto se le puede haber administrado previamente un rAAV por IVT, lo que provocó una respuesta inmunitaria y la producción de nAb que se unen y neutralizan el rAAV, lo que potencialmente limita la capacidad de administrar con éxito rAAV adicionales para tratar una enfermedad o un trastorno ocular.

La descripción incluye un método de transducción de AAV para la expresión de un transgén en presencia de anticuerpos neutralizantes (nAb) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un virión de virus adenoasociado recombinante (rAAV) en una cantidad capaz de evadir al menos parcialmente los nAb en el sujeto, en el que el rAAV puede superar a los nAb y transducir una célula retiniana en presencia de una cantidad de nAb. En realizaciones concretas, el virión de rAAV es AAV2.7m8. También se indica en el presente documento que el sujeto es un sujeto mamífero. El virión de rAAV administrado es al menos 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1014 vg, al menos aproximadamente 1 x1015 vg, al menos aproximadamente 5x1015 vg, o al menos aproximadamente 1x1016 vg. En determinadas realizaciones, la cantidad de anticuerpos neutralizantes está entre aproximadamente 0,46 mg/ml y aproximadamente 1,85 mg/ml. También se indica en el presente documento que la administración se realiza mediante administración ocular, administración retiniana, administración subretiniana y/o administración intravítrea. También se indica en el presente documento que la administración se realiza mediante inyección ocular, inyección retiniana, inyección subretiniana y/o inyección intravítrea. La administración es una inyección intravítrea. También se indica en el presente documento que al sujeto se le administra una primera dosis y una segunda dosis del virión de rAAV, comprendiendo cada dosis administrada una cantidad de virión de rAAV capaz de al menos evadir parcialmente los nAb en el sujeto y transducir una célula retiniana en presencia de una cantidad de los nAb.

La descripción incluye un método para administrar un transgén que codifica un producto génico a una célula ocular en un sujeto, que comprende administrar a uno o más sitios dentro del ojo del sujeto una cantidad eficaz de un rAAV que comprende el transgén. En determinadas realizaciones, el transgén se expresa en presencia de nAb en el sujeto que se unen específicamente al rAAV, y la cantidad eficaz de rAAV administrada es suficiente para evadir al menos parcialmente los nAb en el sujeto y transducir la célula ocular, en la que la célula ocular transducida con rAAV expresa el producto génico. En realizaciones concretas, el virión de rAAV es AAV2.7m8. También se indica en el presente documento que el sujeto es un sujeto mamífero. También se indica en el presente documento que la administración se realiza mediante administración ocular, administración retiniana, administración subretiniana y/o administración intravítrea. También se indica en el presente documento que la administración se realiza mediante inyección ocular, inyección retiniana, inyección subretiniana y/o inyección intravítrea. La administración es una inyección intravítrea.

La cantidad eficaz de rAAV administrada es de al menos 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1014 vg, al menos aproximadamente 1x1015 vg, al menos aproximadamente 5x1015 vg, o al menos aproximadamente 1x1016 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada es de 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de 1x10” vg a aproximadamente 1x1014 vg.

También se indica en el presente documento que una cantidad eficaz de rAAV administrada a un sujeto que no comprende nAb, o una primera cantidad eficaz, es al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, o al menos aproximadamente 1x1013 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada es de 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de 1x10” vg a aproximadamente 1x1013 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada es al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1014 vg, al menos aproximadamente 1x1015 vg, al menos aproximadamente 5x1015 vg, o al menos aproximadamente 1x1016 vg.

En realizaciones concretas, una cantidad eficaz de rAAV administrada a un sujeto que comprende nAb, o una segunda cantidad eficaz, es al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1 x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1014 vg, o al menos aproximadamente 1x1015 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada es de aproximadamente 1x1012 vg a aproximadamente 5x1014 vg, o de aproximadamente 5x1012 vg a aproximadamente 1x1014 vg.

En determinadas realizaciones, la concentración de nAb en el sujeto es de aproximadamente 0,46 mg/ml hasta aproximadamente 0,92 mg/ml, o de aproximadamente 0,46 mg/ml hasta aproximadamente 1,38 mg/ml, o de aproximadamente 0,46 mg/ml hasta aproximadamente 1,85 mg. /mL. También se indica en el presente documento que la concentración de nAb en el sujeto es de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 2,31 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 5 mg/mL, o de aproximadamente 0,2 mg/mL a aproximadamente 4 mg/mL, o de aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 3 mg/mL en uno o más de uno o más sitios de administración.

En ciertos aspectos de la descripción, el rAAV se administra por vía retiniana, subretiniana y/o intravítrea.

La descripción incluye un método para administrar un transgén que codifica un producto génico a una célula ocular en un mamífero, por ejemplo, un ser humano, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un rAAV que el transgén por IVT, en el que el sujeto comprende nAb que se unen específicamente al rAAV, y la cantidad eficaz del rAAV administrada es suficiente para evadir al menos parcialmente los nAb en el sujeto y transducir la célula ocular. En realizaciones concretas, el virión de rAAV es AAV2.7m8. En realizaciones concretas, la cantidad eficaz de rAAV es al menos al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1014 vg, o al menos aproximadamente 1x1015 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada es de aproximadamente 1x1012vg a aproximadamente 5x1014 vg, o de aproximadamente 5x1012 vg a aproximadamente 1x1014 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada es al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1014 vg, al menos aproximadamente 1x1015 vg, al menos aproximadamente 5x1015 vg, o al menos aproximadamente 1 x1016 vg. También se indica en el presente documento que la administración se realiza mediante administración ocular, administración retiniana, administración subretiniana y/o administración intravítrea. También se indica en el presente documento que la administración se realiza mediante inyección ocular, inyección retiniana, inyección subretiniana y/o inyección intravítrea. La administración es una inyección intravítrea.

La descripción incluye un método para tratar una enfermedad o un trastorno ocular en un sujeto, que comprende administrar a uno o más sitios dentro del ojo del sujeto una cantidad eficaz de un rAAV que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico. En determinadas realizaciones, el transgén se expresa en presencia de nAb que se unen específicamente al rAAV, y la cantidad eficaz del rAAV administrada es una cantidad suficiente para evadir al menos parcialmente los nAb en el sujeto y transducir células oculares dentro del sujeto, y en el que las células oculares transducidas expresan el producto génico terapéutico. En realizaciones concretas, el virión de rAAV es AAV2.7m8. En realizaciones concretas, el sujeto es un sujeto mamífero. La cantidad eficaz de rAAV administrada es de al menos 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada es de 1x10” vg da aproximadamente 5x1012 vg, o de 1x10” vg a aproximadamente 1x1014 vg. También se indica en el presente documento que una cantidad eficaz de rAAV administrada a un sujeto que no comprende nAb, o una primera cantidad eficaz, es al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, o al menos aproximadamente 1x1013 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada es de 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de 1x10” vg a aproximadamente 1x1013 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada es al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1014 vg, al menos aproximadamente 1x1015 vg, al menos aproximadamente 5x1015 vg, o al menos aproximadamente 1x1016 vg.

En realizaciones concretas, una cantidad eficaz de rAAV administrada a un sujeto que comprende nAb, o una segunda cantidad eficaz, es al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1014 vg, al menos aproximadamente 1x1015 vg, al menos aproximadamente 5x1015 vg, o al menos aproximadamente 1x1016 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada es de aproximadamente 1x1012vg a aproximadamente 5x1014 vg, o de aproximadamente 5x1012 vg a aproximadamente 1x1014 vg. En determinadas realizaciones, la concentración de nAb en el sujeto es de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 0,92 mg/ml, o de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 1,38 mg/ml, o de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 1,85 mg. /mL. También se indica en el presente documento que la concentración de los nAb en el sujeto es de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 2,31 mg/ml, o de aproximadamente. 1 mg/mL a aproximadamente 5 mg/mL, o e aproximadamente 0,2 mg/mL a aproximadamente 4 mg/mL, o de aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 3 mg.mL en uno o más de uno o más sitios de administración. También se indica en el presente documento que el rAAV se administra por vía ocular, retiniana, subretiniana y/o intravítrea.

En ciertas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la enfermedad o trastorno ocular es el glaucoma, la retinisis pigmentosa, la degeneración macular, la retinosquisis, la amaurosis congénita de Leber, la retinopatía diabética, la acromotopsia o el daltonismo. En algunas realizaciones, la enfermedad ocular es la degeneración macular. En realizaciones específicas, la degeneración macular es la degeneración macular húmeda. En otras realizaciones, la degeneración macular es la degeneración macular seca.

También se indica en el presente documento que el producto génico administrado mediante los métodos de la presente descripción puede ser cualquier producto génico terapéutico, incluidos, entre otros, los productos génicos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el producto génico es un polipéptido antiangiogénico. En otras realizaciones, el producto génico es una proteína de unión al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En determinadas realizaciones, el producto génico es un agente anti-VEGF o una proteína anti-VEGF. En ciertas realizaciones, el producto génico es una proteína opsina.

En realizaciones concretas, los métodos se utilizan para administrar un producto génico que es un agente anti-VEGF para el tratamiento de un trastorno angiogénico o neovascular, incluidos los asociados con el cáncer, la isquemia y la inflamación. En realizaciones concretas, a un sujeto se le administra un virus que codifica un agente anti-VEGF para tratar una enfermedad o un trastorno ocular, que incluye, entre otros: retinopatía isquémica, neovascularización intraocular, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), DMAE húmeda, DMAE seca, neovascularización retiniana, edema macular diabético, isquemia retiniana diabética, edema retiniano diabético, retinopatía diabética proliferativa, oclusión de vena retiniana, oclusión de vena retiniana central, oclusión de vena retiniana ramificada.

Los polipéptidos de productos génicos adecuados que pueden administrarse según los métodos descritos en el presente documento y las enfermedades o los trastornos relacionados que también pueden usarse para tratar incluyen, por ejemplo, retinosquisina, retinitis pigmentosa, proteína 1 que interactúa con el regulador de GTPasa (RGPR) (véase, por ejemplo, GenBank n.os de registro Q96KN7, Q9EPQ2 y Q9GLM3); periferina-2 (Prph2) (véase, por ejemplo, GenBank n.° de registro NP.sub.--000313; periferina; una proteína específica del epitelio pigmentario de la retina (RPE65) (véase, por ejemplo, GenBank AAC39660; y Morimura et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3088); CHM (coroidermia (proteína 1 de acompañamiento de Rab)), un polipéptido que, cuando es defectuoso o falta, causa coroideremia (véase, por ejemplo, Donnelly et al. (1994), Hum. Mol. Genet., 3:1017; y van Bojoven et al. (1994), Hum. Mol. Genet., 3:1041); y el homólogo 1 de Crumbs (CRB1), un polipéptido que, cuando es defectuoso o falta, causa amaurosis congénita de Leber y retinitis pigmentosa (véase, por ejemplo, den Hollander et al. (1999), Nat. Genet., 23:217; y GenBank n.° de registro CAM23328).

Los polipéptidos adecuados también incluyen polipéptidos que, cuando son defectuosos o faltan, conducen a la acromotopsia, en los que tales polipéptidos incluyen, por ejemplo, la subunidad alfa del canal activado por GMPc de fotorreceptores de conos (CNGA3) (véase, por ejemplo, GenBank n.° de registro NP.sub.--001289; y Booij etal. (2011), Ophtalmology, 118:160-167); subunidad beta del canal catiónico activado por GMPc de fotorreceptores de conos (CNGB3) (véase, por ejemplo, Kohl et al. (2005), Eur. J. Hum. Genet., 13(3):302); la proteína de unión a nucleótidos de guanina (proteína G), el polipéptido 2 de actividad de transducción alfa (GNAT2) (ACHM4); y ACHM5; y polipéptidos que, cuando son defectuosos o faltan, conducen a diversas formas de daltonismo (por ejemplo, L-opsina, M-opsina y S-opsina). Ver Mancuso et al. (2009), Nature, 461(7265): 784-787.

En algunos casos, un producto génico de interés es una endonucleasa específica de sitio que proporciona la inactivación específica de sitio de la función del gen, por ejemplo, cuando la endonucleasa inactiva un alelo asociado con una enfermedad de la retina. Por ejemplo, en el caso de que un alelo dominante codifique una copia defectuosa de un gen que, cuando es de tipo salvaje, es una proteína estructural de la retina y/o proporcione una función retiniana normal, una endonucleasa específica de sitio puede dirigirse al alelo defectuoso e inactivar el alelo defectuoso.

Además de inactivar un alelo defectuoso, también se puede usar una nucleasa específica de sitio para estimular la recombinación homóloga con un ADN donante que codifica una copia funcional de la proteína codificada por el alelo defectuoso. Por lo tanto, por ejemplo, un virión de rAAV del presente documento se puede usar para administrar una endonucleasa específica de sitio que inactiva un alelo defectuoso y también se puede usar para administrar una copia funcional del alelo defectuoso, lo que resulta en la reparación del alelo defectuoso, proporcionando así la producción de una proteína retiniana funcional (por ejemplo, retinosquisina funcional, RPE65 funcional, periferina funcional, etc.). Véase, por ejemplo, Li et al. (2011), Nature, 475:217. En algunas realizaciones, un virión de rAAV del presente documento comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una endonucleasa específica de sitio; y una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una copia funcional de un alelo defectuoso, en la que la copia funcional codifica una proteína retiniana funcional. Las proteínas retinianas funcionales incluyen, por ejemplo, retinosquisina, RPE65, proteína 1 que interactúa con el regulador GTPasa de la retinitis pigmentosa (RGPR), periferina, periferina-2 y similares.

Las endonucleasas específicas de sitio que son adecuadas para su uso incluyen, por ejemplo, nucleasas de dedos de zinc (ZFN); y nucleasas efectoras similares al activador de la transcripción (TALEN), en las que dichas endonucleasas específicas de sitio no se producen de forma natural y se modifican para dirigirse a un gen específico. Dichas nucleasas específicas de sitio pueden diseñarse para cortar ubicaciones específicas dentro de un genoma, y la unión de extremos no homólogos puede reparar la ruptura mientras se insertan o eliminan varios nucleótidos. Dichas endonucleasas específicas de sitio (también denominadas “INDEL”) luego arrojan la proteína fuera de marco e inactivan de modo eficaz el gen. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. n.° 2011/0301073.

También se indica en el presente documento que los métodos descritos en el presente documento se utilizan para proporcionar administraciones múltiples de un vector viral, por ejemplo, rAAV, a un sujeto, por ejemplo, mediante IVT. Tal como se demuestra en el presente documento, los presentes métodos pueden transducir con éxito células oculares mediante IVT en presencia de nAb. En consecuencia, los métodos pueden emplearse para administrar con éxito un producto génico mediante IVT a las células oculares dentro de un sujeto que tiene dichos nAb.

La descripción incluye un método para tratar una enfermedad o un trastorno ocular en un sujeto que comprende: primero, administrar a un primer ojo del sujeto una primera cantidad eficaz de un primer vector viral (por ejemplo, rAAV) que comprende un primer transgén que codifica un primer producto génico (es decir, una primera dosis), luego esperar un período de tiempo y luego administrar a un segundo ojo del sujeto una segunda cantidad eficaz de un segundo vector viral (por ejemplo, rAAV) que comprende un segundo transgén que codifica un segundo gen producto (es decir, una segunda dosis), en el que la primera y la segunda cantidad eficaz de vector viral (por ejemplo, rAAV) son cantidades suficientes para transducir células del ojo, en el que las células transducidas expresan el primer y segundo producto génico. En ciertas realizaciones, el método puede comprender además administraciones posteriores de un vector viral después de períodos de tiempo adicionales. En realizaciones concretas, los métodos pueden comprender dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más administraciones de un vector viral con períodos de tiempo entre cada administración. También se indica en el presente documento que la administración se realiza mediante administración ocular, administración retiniana, administración subretiniana y/o administración intravítrea. También se indica en el presente documento que cada administración se realiza de forma independiente mediante inyección ocular, inyección retiniana, inyección subretiniana y/o inyección intravítrea. La administración es una inyección intravítrea.

En realizaciones específicas, el primer vector viral (por ejemplo, rAAV) y el segundo vector viral (por ejemplo, rAAV) son del mismo serotipo. En otras realizaciones, el primer y el segundo vector viral (por ejemplo, rAAV) comprenden las mismas proteínas de la cápside. En ciertas realizaciones, el primer rAAV y el segundo rAAV son ambos AAV, por ejemplo, AAV2.7m8. En algunas realizaciones, el primer y el segundo vector viral (por ejemplo, rAAV) son serotipos diferentes.

En ciertas realizaciones, el período de tiempo entre la administración del primer vector viral (por ejemplo, rAAV) y la administración del segundo vector viral (por ejemplo, rAAV) es de al menos aproximadamente una semana, al menos aproximadamente un mes, al menos aproximadamente tres meses, al menos al menos aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente un año, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente tres años, o más de aproximadamente tres años. En algunas realizaciones, al sujeto no se le administra un rAAV durante el período de tiempo entre la administración del primer rAAV y la administración del segundo rAAV. En ciertas realizaciones, el sujeto puede recibir una, dos, tres, cuatro o más cantidades eficaces de rAAV en uno o ambos ojos, después de la segunda administración de rAAV. En otras realizaciones, el sujeto no recibe ninguna administración adicional de rAAV después de la segunda administración de rAAV.

En determinadas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento que comprenden la administración de una primera dosis (es decir, una primera cantidad eficaz) y una segunda dosis (es decir, una segunda cantidad eficaz) del rAAV, la primera dosis y la segunda dosis se administran al mismo ojo En ciertas realizaciones, la primera dosis y la segunda dosis se administran a ojos diferentes. En realizaciones concretas, la primera y la segunda dosis se administran para tratar la misma enfermedad ocular. En ciertas realizaciones, la primera y la segunda dosis se administran para tratar diferentes enfermedades oculares. En ciertas realizaciones, la primera dosis y la segunda dosis comprenden rAAV que comprende el mismo polinucleótido heterólogo que codifica un producto génico. En realizaciones concretas, la primera dosis y la segunda dosis comprenden rAAV que comprende diferentes polinucleótidos heterólogos, por ejemplo, que codifican diferentes productos génicos.

En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, que comprenden la administración de una primera dosis y una segunda dosis de rAAV, la cantidad eficaz de rAAV administrada en la primera dosis eficaz es al menos 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1015 vg, al menos aproximadamente 1x1015 vg, al menos aproximadamente 5x1015 vg, o al menos aproximadamente 1x1016 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada en la primera dosis eficaz es de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 1x1014 vg. En ciertas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada en la segunda dosis eficaz es al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada en la segunda dosis eficaz es de 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de 1x10” vg a aproximadamente 1x1014 vg. También se describe en el presente documento que una cantidad eficaz de rAAV administrada a un sujeto que no comprende nAb, o una primera cantidad eficaz, es al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, o al menos aproximadamente 1x1013 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada es de 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de 1x10” vg a aproximadamente 1x1013 vg. En realizaciones concretas, una cantidad eficaz de rAAV administrada a un sujeto que comprende nAb, o una segunda cantidad eficaz, es al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1014 vg, o al menos aproximadamente 1x1015 vg. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de rAAV administrada es de aproximadamente 1x1012vg a aproximadamente 5x1014 vg, o de aproximadamente 5x1012 vg a aproximadamente 1x1014 vg. En determinadas realizaciones, la concentración de nAb en el sujeto es de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 0,92 mg/ml, o de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 1,38 mg/ml, o de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 1,85 mg. /mL. También se indica en el presente documento que la concentración de los nAb en el sujeto es de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 2,31 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 5 mg/mL, o de aproximadamente 0,2 mg/mL a aproximadamente 4 mg/mL, o de aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 3 mg.mL en uno o más de uno o más sitios de administración. También se indica en el presente documento que el rAAV se administra por vía retiniana, subretiniana y/o intravítrea. Se administra mediante IVT.

En realizaciones específicas, la primera cantidad eficaz de rAAV administrada es la misma que la segunda cantidad eficaz de rAAV administrada. En otras realizaciones, la primera cantidad eficaz de rAAV administrada es mayor que la segunda cantidad eficaz de rAAV administrada. En algunas realizaciones, la primera cantidad eficaz de rAAV administrada es menor que la segunda cantidad eficaz de rAAV administrada. En ciertas realizaciones, se contempla que se use una dosis más baja para la primera administración, en concreto si el sujeto que se está tratando no comprende nAb, mientras que se usa una dosis más alta para la segunda o cualquier administración posterior, en concreto si el sujeto ha desarrollado nAb después de la administración de la primera dosis.

También se describe en el presente documento un método para tratar una enfermedad o un trastorno ocular, por ejemplo, una enfermedad asociada con una angiogénesis aberrante, en un sujeto que lo necesite, que comprende lo siguiente:

(1) administrar a uno o ambos ojos del sujeto mediante inyección ocular (por ejemplo, inyección retiniana, subretiniana y/o intravítrea) una cantidad eficaz de un rAAV que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico, en el que al menos una pluralidad de células oculares (por ejemplo, células retinianas) de uno o ambos ojos se transducen y expresan el producto génico terapéutico;

(2) esperar durante un período de tiempo; y

(3) administrar a uno o ambos ojos del sujeto mediante inyección ocular (por ejemplo, inyección retiniana, subretiniana y/o intravítrea) una cantidad eficaz de un rAAV que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico, en el que al menos una pluralidad de células oculares (por ejemplo, células retinianas) de uno o ambos ojos se transducen y expresan el producto génico terapéutico. En ciertas realizaciones, la etapa (1) y/o la etapa (3) se realizan mediante IVT.

También se indica en el presente documento que el producto génico terapéutico administrado en la etapa (1) y/o la etapa (3) es un agente o proteína anti-VEGF, por ejemplo, sFlt o aflibercept. También se indica en el presente documento que el producto génico terapéutico administrado en la etapa (1) es el mismo que el producto génico terapéutico administrado en la etapa (3). También se indica en el presente documento que la enfermedad o el trastorno que se está tratando está asociado con una angiogénesis aberrante en el ojo. También se indica en el presente documento que la enfermedad o el trastorno es la degeneración macular, por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE). También se indica en el presente documento que es la degeneración macular húmeda o la degeneración macular seca.

También se indica en el presente documento que los métodos se practican para administrar cualquiera de los productos génicos descritos en el presente documento.

También se indica en el presente documento que el rAAV administrado en la etapa (1) y/o la etapa (3) es rAA V2.7m8.

También se indica en el presente documento que el período de tiempo de la etapa (b) es de al menos una semana, al menos un mes, al menos tres meses, al menos seis meses, al menos un año, al menos 18 meses, al menos dos años, al menos tres años, o más de tres años.

También se indica en el presente documento que la cantidad eficaz administrada en la etapa (1) es al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg. al menos aproximadamente 5x1015 vg, o al menos aproximadamente 1x1016 vg. También se describe en el presente documento que la cantidad eficaz de rAAV administrada en la primera dosis eficaz es de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 1x1014 vg.

También se indica en el presente documento que la cantidad eficaz administrada en la etapa (3) es al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1015 vg, al menos aproximadamente 1x1015 vg, al menos aproximadamente 5x1015 vg, o al menos aproximadamente 1x1016 vg. También se indica en el presente documento que la cantidad eficaz de rAAV administrada en la segunda dosis eficaz es al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg. También se indica en el presente documento que la cantidad eficaz de rAAV administrada en la segunda dosis eficaz es de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 1x1014 vg.

También se describe en el presente documento que una cantidad eficaz de rAAV administrada a un sujeto que no comprende nAb, o una primera cantidad eficaz, es al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, o al menos aproximadamente 1x1013 vg. También se describe en el presente documento que la cantidad eficaz de rAAV administrada es de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 1x1013 vg. También se describe en el presente documento que una cantidad eficaz de rAAV administrada a un sujeto que comprende nAb, o una segunda cantidad eficaz, es al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1014 vg, o al menos aproximadamente 1x1015 vg. En algunos aspectos de la descripción, la cantidad eficaz de rAAV administrada es de aproximadamente 1x1012 vg a aproximadamente 5x1014 vg, o de aproximadamente 5x1012 vg a aproximadamente 1x1014 vg.

También se indica en el presente documento que el sujeto comprende nAb que se unen y son capaces de neutralizar el rAAV antes de la etapa (a) y/o antes de la etapa (c). También se indica en el presente documento que la concentración de nAb en el sujeto es de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 0,92 mg/ml, o de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 1,38 mg/ml, o de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 1,85 mg/ml. mg/mL, o de aproximadamente 0,46 mg/mL a aproximadamente 2,31 mg/mL, o de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 5 mg/mL, o de aproximadamente 0,2 mg/mL a aproximadamente 4 mg/mL, o de aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 3 mg/mL en uno o más de uno o más sitios de administración.

En algunos aspectos de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, que comprenden la administración de una primera dosis y una segunda dosis de rAAV, la cantidad eficaz de rAAV administrada en la primera dosis eficaz es de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 1x1014 vg. También se indica en el presente documento que la cantidad eficaz de rAAV administrada en la segunda dosis eficaz es al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg. También se indica en el presente documento que la cantidad eficaz de rAAV administrada en la segunda dosis eficaz es de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 1x1014 vg. También se describe en el presente documento que una cantidad eficaz de rAAV administrada a un sujeto que no comprende nAb, o una primera cantidad eficaz, es al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, o al menos aproximadamente 1x1013 vg. También se describe en el presente documento que la cantidad eficaz de rAAV administrada es de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 1x1013 vg. También se describe en el presente documento que una cantidad eficaz de rAAV administrada a un sujeto que comprende nAb, o una segunda cantidad eficaz, es al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1014 vg, o al menos aproximadamente 1x1015 vg. También se describe en el presente documento que la cantidad eficaz de rAAV administrada es de aproximadamente 1x1012vg a aproximadamente 5x1014 vg, o de aproximadamente 5x1012 vg a aproximadamente 1x1014 vg. También se indica en el presente documento que la concentración de nAb en el sujeto es de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 0,92 mg/ml, o de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 1,38 mg/ml, o de aproximadamente 0,46 mg/ml a aproximadamente 1,85 mg/ml. mg/mL, o de aproximadamente 0,46 mg/mL a aproximadamente 2,31 mg/mL, o de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 5 mg/mL, o de aproximadamente 0,2 mg/mL a aproximadamente 4 mg/mL, o de aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 3 mg.mL en uno o más de uno o más sitios de administración.

En ciertas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el producto génico terapéutico es un agente o proteína anti-VEGF.

En ciertas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la enfermedad o el trastorno que se está tratando está asociado con una angiogénesis aberrante en el ojo. En realizaciones concretas, la enfermedad o el trastorno es la degeneración macular, por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE). En realizaciones concretas, es la degeneración macular húmeda o la degeneración macular seca.

También se indica en el presente documento que de los métodos descritos en el presente documento, que comprenden administrar una primera dosis y una segunda dosis de rAAV, la primera cantidad eficaz y la segunda cantidad eficaz de rAAV administradas son una cantidad suficiente para evadir al menos parcialmente los nAb en el sujeto y transducir la célula ocular, y la célula ocular transducida expresa el producto génico.

En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, al sujeto no se le administra un inmunosupresor antes, simultáneamente o después de la administración del primer rAAV. En otras realizaciones, al sujeto se le administra un inmunosupresor antes, simultáneamente o después de la administración del primer rAAV. En realizaciones específicas, al sujeto no se le administra un inmunosupresor después de la administración del primer rAAV. En ciertas realizaciones, se administra un inmunosupresor al sujeto después de la administración del primer rAAV y antes o al mismo tiempo que la administración del segundo rAAV. En algunas realizaciones, el inmunosupresor se administra al sujeto después de la administración del segundo rAAV.

En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, que comprenden la administración de una primera dosis y una segunda dosis de rAAV, la administración de la primera cantidad eficaz y la administración de la segunda cantidad eficaz es mediante inyección intraocular o inyección intravítrea. En otras realizaciones, la administración de la segunda cantidad eficaz del segundo rAAV proporciona un efecto terapéutico en el ojo del sujeto. En determinadas realizaciones, la administración de la primera cantidad eficaz y la segunda cantidad eficaz se realizan en el mismo ojo del sujeto. En otras realizaciones, la administración de la primera cantidad eficaz y la segunda cantidad eficaz se realizan a ojos diferentes del sujeto. En realizaciones específicas, la primera cantidad eficaz y la segunda cantidad eficaz tratan la misma enfermedad o trastorno ocular. En algunas realizaciones, la primera cantidad eficaz y la segunda cantidad eficaz tratan diferentes enfermedades o trastornos oculares. En ciertas realizaciones, el primer producto génico y el segundo producto génico son iguales. En otras realizaciones, el primer producto génico y el segundo producto génico son diferentes.

En ciertas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para tratar una enfermedad o un trastorno ocular, la primera cantidad eficaz de vector viral y la segunda cantidad eficaz de vectores virales son cantidades suficientes para transducir al menos una pluralidad de células oculares, lo que da como resultado la expresión de una cantidad terapéuticamente eficaz del producto génico, es decir, una cantidad suficiente para tratar la enfermedad o el trastorno.

En ciertas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el método comprende además determinar si el sujeto comprende nAb que se unen y son capaces de neutralizar el vector viral que se va a administrar al sujeto antes de dicha administración. Los métodos para determinar si un sujeto comprende nAb son habituales y conocidos en la técnica. Cuando se determina que el sujeto comprende dichos nAb, se le puede administrar al sujeto una dosis más alta del vector viral, por ejemplo, al menos 1x1012, al menos 5x1012, al menos 1x1013, al menos 5x1013 o al menos 1x1014 genomas virales (vg).

Cualquiera de los virus o vectores virales descritos en el presente documento puede presentarse en una composición farmacéutica y/o administrarse a un sujeto mientras está en una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica es una formulación que contiene uno o más ingredientes activos, así como uno o más excipientes, vehículos, estabilizantes o agentes de carga, que es adecuada para administrar a un paciente humano para lograr un resultado de diagnóstico o un efecto terapéutico o profiláctico deseados. Para conseguir estabilidad durante el almacenamiento y comodidad en la manipulación, una composición farmacéutica se puede formular como un polvo liofilizado o secado al vacío que se puede reconstituir con disolución salina o agua antes de la administración a un paciente.

El vector o virus recombinantes (viriones) pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas para la administración a pacientes mamíferos, en concreto seres humanos. El vector o los viriones se pueden formular en vehículos acuosos farmacéuticamente aceptables, inertes y no tóxicos, preferiblemente a un pH que oscila entre 3 y 8, más preferiblemente entre 6 y 8. Tales composiciones estériles comprenderán el vector o virión que contiene el ácido nucleico que codifica la molécula terapéutica disuelta en un tampón acuoso que tiene un pH aceptable tras la reconstitución.

En algunos aspectos, la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector o virión mezclado con un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato, fosfato y aminoácidos, polímeros, polioles, azúcar, tampones, conservantes y otras proteínas. Los ejemplos de aminoácidos, polímeros y azúcares y similares son compuestos de octilfenoxipolietoxietanol, compuestos de monoestearato de polietilenglicol, ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán, sacarosa, fructosa, dextrosa, maltosa, glucosa, manitol, dextrano, sorbitol, inositol, galactitol, xilitol, lactosa, trehalosa, albúmina de suero bovina o humana, citrato, acetato, disoluciones de Ringer y de Hank, cisteína, arginina, carnitina, alanina, glicina, lisina, valina, leucina, polivinilpirrolidona, polietileno y glicol. Preferiblemente, esta formulación es estable durante al menos seis meses a 4 °C.

En algunos aspectos, la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento comprende un tampón, tal como disolución salina tamponada con fosfato (PBS) o fosfato de sodio/sulfato de sodio, tampón tris, tampón glicina, agua estéril y otros tampones conocidos por los expertos en la técnica, tales como los descritos por Good etal. (1966), Biochemistry, 5:467. El pH del tampón en el que se encuentra la composición farmacéutica que comprende el anti-VEGF contenido en el sistema de administración de vector adenoviral puede estar en el intervalo de 6,5 a 7,75, de 7 a 7,5 o de 7,2 a 7,4. El pH de la formulación puede oscilar entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 12,0. El pH de la composición inmunogénica puede ser de al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 unidades de pH. El pH de la composición inmunogénica puede ser como máximo de aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 unidades de pH.

La presente descripción proporciona además formas de dosificación unitaria de un vector viral o virus descrito en el presente documento. En realizaciones concretas, la cantidad del virus o vector viral puede medirse como genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es de 1x1010 a 3x1012 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es 1x109 a 3x1013 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es de 1x1010 a 1x1011 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es de 1x108 a 3x1014 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es de al menos aproximadamente 1x101, 1x102, 1x1031x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 y 1x1018 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es de 1x108 a 3x1014 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es como máximo de aproximadamente 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 y 1x1018 genomas de vector. También se indica en el presente documento que la dosis unitaria de la composición farmacéutica comprende al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x1011 vg, al menos aproximadamente 5x1011 vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg. También se describe en el presente documento que la dosis unitaria es de aproximadamente 1x1011 vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de aproximadamente 1x1011 vg a aproximadamente 1x1014 vg. En determinadas realizaciones, la dosis unitaria es al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x1011 vg, al menos aproximadamente 5x1011 vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg. También se describe en el presente documento que la dosis unitaria es de aproximadamente 1x1011 vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de aproximadamente 1x1011 vg a aproximadamente 1x1014 vg. En realizaciones concretas, la dosis unitaria es de al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x1011vg, al menos aproximadamente 5x1011 vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, o al menos aproximadamente 1x1013 vg. También se describe en el presente documento que la dosis unitaria es de aproximadamente 1x1011 vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de aproximadamente 1x1011 vg a aproximadamente 1x1013 vg. En realizaciones concretas, la dosis unitaria es al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1014 vg, o al menos aproximadamente 1x1015 vg. También se describe en el presente documento que la dosis unitaria es de aproximadamente 1x1012vg a aproximadamente 5x1014 vg, o de aproximadamente 5x1012 vg a aproximadamente 1x1014 vg.

En algunos aspectos, siguiendo un método de tratamiento descrito en el presente documento, la mejor agudeza visual corregida (“best corrected visual acuity”, BCVA) de un sujeto mejora en 1,2, 3, 4, 5 o más líneas.

En algunos aspectos, siguiendo un método de tratamiento descrito en el presente documento, se produce una reducción en la neovascularización evaluada mediante angiografía con fluoresceína (FA).

En algunos casos, se puede medir el espesor de la retina para examinar los efectos del tratamiento. En algunos casos, siguiendo un método de tratamiento descrito en el presente documento, el espesor de la retina central del sujeto humano no aumenta más de 50 micrómetros, 100 micrómetros o 250 micrómetros dentro de los 12 meses siguientes al tratamiento con la composición farmacéutica de la descripción. En algunos casos, siguiendo un método de tratamiento descrito en el presente documento, el espesor de la retina central del sujeto humano disminuye en al menos 50 micrómetros, 100 micrómetros, 200 micrómetros, 250 micrómetros, 300 micrómetros, 400 micrómetros, 500 micrómetros, 600 micrómetros en 3 meses, 6 meses o 9 meses, 12 meses después del tratamiento con la composición farmacéutica de la descripción. La disminución en el espesor central de la retina del sujeto humano puede medirse comparando el espesor central de la retina en un momento dado con una medición de referencia tomada en los 1,3, 7 o 10 días, o dentro de estos días, de la administración de la composición farmacéutica de la descripción.

Las composiciones y los reactivos útiles para la presente descripción pueden envasarse en kits para facilitar la aplicación de la presente descripción. En algunos aspectos, el presente método proporciona un kit que comprende un virus o un vector viral descrito en el presente documento, por ejemplo, un virus recombinante de la descripción. También se indica en el presente documento que el kit comprende instrucciones para usar el virus o vector viral, por ejemplo, instrucciones sobre cómo administrar el virus o vector viral a un sujeto para tratar una enfermedad o un trastorno ocular. Las instrucciones pueden tener cualquier forma deseada, incluidas, entre otras, impresas en un inserto del kit, impresas en uno o más recipientes, así como instrucciones almacenadas electrónicamente proporcionadas en un medio de almacenamiento electrónico, tal como un medio de almacenamiento legible por ordenador. También se incluye opcionalmente un paquete de software en un medio de almacenamiento legible por ordenador que permite al usuario integrar la información y calcular una dosis de control.

En un aspecto, un kit comprende uno o más recipientes, comprendiendo cada recipiente: (a) una dosis unitaria de una composición farmacéutica descrita en el presente documento, que comprende un virus recombinante proporcionado en el presente documento (por ejemplo, un rAAV), y (b) instrucciones sobre cómo administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del virus recombinante.

También se indica en el presente documento que el kit comprende dos recipientes, en el que cada recipiente comprende una dosis unitaria de una composición farmacéutica descrita en el presente documento. También se indica en el presente documento que la dosis unitaria en cada uno de los dos recipientes es la misma, mientras que también se indica en el presente documento que la dosis unitaria en cada uno de los dos recipientes es diferente. También se indica en el presente documento que ambos recipientes comprenden una dosis unitaria de al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, o al menos aproximadamente 1x1014 vg. También se describe en el presente documento que un recipiente para la primera dosis comprende de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de aproximadamente 1x1010 vg a aproximadamente 1x1014 vg, o de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 1x1014 vg. También se describe en el presente documento que el segundo recipiente para la segunda dosis comprende de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 5x1012 vg, o de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 1x1014 vg, o de aproximadamente 1x10” vg a aproximadamente 1x1014 vg. También se indica en el presente documento que el primer recipiente comprende al menos aproximadamente 1x1010 vg, al menos aproximadamente 1x10” vg, al menos aproximadamente 5x10” vg, al menos aproximadamente 1x1012 vg, al menos aproximadamente 5x1012 vg, o al menos aproximadamente 1x1013 vg. También se indica en el presente documento que el segundo recipiente comprende al menos aproximadamente 5x1012 vg, al menos aproximadamente 1x1013 vg, al menos aproximadamente 5x1013 vg, al menos aproximadamente 1x1014 vg, al menos aproximadamente 5x1014 vg, o al menos aproximadamente 1x1015 vg. También se indica en el presente documento que cualquier dosis unitaria comprende de aproximadamente 1x1012vg a aproximadamente 5x1014 vg, o de aproximadamente 5x1012 vg a aproximadamente 1x1015 vg.

En algunos aspectos, el kit puede comprender disoluciones o sales farmacéuticamente aceptables para administrar el virus recombinante. Opcionalmente, el kit puede comprender además instrucciones para parámetros de funcionamiento adecuados en forma de una etiqueta o un inserto separado. Por ejemplo, el kit puede presentar instrucciones convencionales que informen a un médico o técnico de laboratorio sobre cómo preparar una dosis de virus recombinante.

Opcionalmente, el kit podría comprender además dispositivos para la administración, tales como una jeringa, una aguja de filtro, un tubo de extensión, una cánula y un inyector subretiniano.

Ejemplos

Ejemplo 1: Evaluación del efecto de nAb en la transducción del transgén AAV2.7m8 in vitro

En el presente documento se describe como ejemplo un ensayo in vitro para la determinación del efecto de nAb sobre la expresión del transgén AAV2.7m8.

Para detectar el efecto de aumentar los títulos de AAV2.7m8 sobre la neutralización, se realizó un ensayo de IgIV (inmunoglobulina intravenosa) in vitro. Se mezclaron virus con multiplicidades de infecciones (MOI) en incrementos semilogarítmicos desde 1x105 a 5x106 en una proporción de 1:1 con una dilución en serie en 3 veces de 1:3 a 1: 1000 de IgIV durante 1 hora y se añadieron a las células 293T.

Estas se incubaron durante 72 horas, seguido de la evaluación del porcentaje de inhibición de GFP como medición de la evasión de nAb. La figura 1 representa un gráfico de porcentaje de inhibición de GFP en función de la dilución de nAb y en función de la cantidad de MOI viral. Este gráfico se usó para calcular los valores de CI50. La tabla 1 muestra los valores de CI50.

Tabla 1: Valores de CI50 de nAb frente a la transducción de AAV2.7m8-GFP

El título de nAb (valores de CI50) se redujo a medida que aumentaba la cantidad de virus.

Ejemplo 2: Evaluación del efecto de nAb sobre la transducción del transgén AAV2.7m8 in vivo

En el presente documento se describe como ejemplo un estudio en NHP para evaluar la respuesta inmunitaria al vector de AAV2.7m8 por etapas. La figura 2 describe el diseño general del estudio.

Los NHP se utilizaron para modelar condiciones clínicas potencialmente pertinentes. Se ensayaron diferentes niveles de dosis de IgIV y AAV2.7m8 para simular el efecto de nAb preexistentes sobre AAV2.7m8 inyectado por IVT. Los monos verdes africanos (“African green monkeys”, AGM) fueron preseleccionados para nAb contra AAV2.7m8 antes del reclutamiento en el estudio.

Se realizaron imágenes de fluorescencia en las semanas 2, 4, 8, 12 para evaluar la expresión de GFP como una medición de la evasión de nAb.

Las figuras 3A-3H representan ejemplos de imágenes de espectros de Heidelberg de retina de AGM a las 4 semanas. La figura 3A muestra un AGM que recibe una inyección de IgIV intravítrea (IVT) (1,85 mg/mL), seguida de una dosis IVT de 7m8.CMV-GFP a 1x10” vg 24 horas después (grupo 1). La figura 3B muestra un AGM que recibe una inyección intravítrea de a-AAV2 monoclonal de ratón (5 pg/mL), seguida de una dosis IVT de 7m8.CMV-GFP a 1x10” vg 24 horas después (grupo 2). La figura 3C representa un AGM que recibe una inyección intravítrea de vehículo (50 pL) con una dosis IVT de 7m8.CMV-GFP a 1x10” vg (grupo 3). La figura 3D representa un AGM que recibe una inyección intravítrea de IgIV (0,46 mg/ml), seguida de una dosis de 7m8.CMV-GFP a 1x10” vg 24 horas después (grupo 4). La figura 3E muestra un AGM que recibe una inyección intravítrea de IgIV (1,85 mg/mL), seguida de una dosis IVT de 7m8.CMV-GFP a 5x10” vg 24 horas después (grupo 5). La figura 3F muestra un AGM que recibe una inyección intravítrea de a-AAV2 monoclonal de ratón (5 pg/mL), seguida de una dosis IVT de 7m8.CMV-GFP a 5x10” vg 24 horas después (grupo 6). La figura 3G representa un AGM que recibe una inyección intravítrea de vehículo (50 pL), seguida de una dosis IVT de 7m8.CMV-GFP a 5x10” vg 24 horas después (grupo 7). La figura 3H representa un AGM que recibe una inyección intravítrea de IgIV (1,85 mg/mL), seguida de una dosis IVT de 7m8.CMV-GFP a 1x1013 vg 24 horas después (grupo 8).

En presencia de IgIV elevada (1,85 mg/mL), fueron neutralizados 1x10” vg de AAV2.7m8 y no se observó expresión de GFP (grupo 1).

Cuando la cantidad de IgIV era 4 veces menor (0,46 mg/mL) en el ojo, AAV2.7m8 a la dosis de 1x10” vg mostró una buena expresión de GFP, lo que sugirió la evasión de nAb (grupo 4).

En presencia de IgIV alta, una dosis de vector 5 veces mayor (5x10” vg) no mostró transducción de GFP (grupo 5).

A una dosis de 1x1013 vg de AAV2.7m8, GFP se expresó en presencia de una dosis alta de IgIV (1,85 mg/ml). Esto sugirió que esta cantidad de vector puede superar la neutralización y puede transducir células (grupo 8).

El anticuerpo monoclonal contra AAV2 neutralizó AAV2.7m8 a 1x10” vg, así como 5x10” vg (grupos 2 y 6).

Se recogieron muestras de suero, humor acuoso y vítreo para evaluar si había una correlación entre los niveles de nAb en suero frente al humor acuoso y vítreo. Para determinar los niveles de nAb en el suero, el humor acuoso y el humor vitreo de los NHP del estudio, se realizó un ensayo de nAb in vitro. El vector de AAV2.7m8 se mezcló con muestras diluidas en serie y se incubó durante una hora. Esta mezcla se añadió a células 293T a una MOI de 1x105 y las células transducidas se cultivaron durante 72 horas. La expresión de GFP se evaluó en un lector de placas para evaluar el porcentaje de inhibición de GFP y calcular los valores de CI50. La tabla 2 representa un ejemplo de una tabla de valores de CI50.

Tabla 2: Ejemplos de valores ejemplares de CI50 in vitro

Claims

REIVINDICACIONES

1 Un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico para su uso en un método para tratar una enfermedad o un trastorno ocular en un sujeto primate que lo necesite, teniendo dicho sujeto anticuerpos neutralizantes en una concentración de entre aproximadamente 0,46 mg /mL a aproximadamente 1,85 mg/mL en el fluido vítreo del ojo; comprendiendo dicho método administrar por vía intravítrea al ojo del sujeto al menos 1x10101 *vg de un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico, en el que el sujeto comprende anticuerpos neutralizantes que se unen específicamente al rAAV, y en el que las células oculares transducidas expresan el producto génico terapéutico en una concentración suficiente para tratar el enfermedad o trastorno.
2. - El virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico para el uso de la reivindicación 1, en el que el rAAV es un AAV2.7m8.
3. - El virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico para el uso de la reivindicación 1, en el que la cantidad eficaz es al menos aproximadamente 5x10” vg.
4. - El virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico para el uso de la reivindicación 3, en el que la cantidad eficaz es al menos aproximadamente 1x1013 vg.
5. - El virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico para el uso de la reivindicación 1, en el que las células oculares son células retinianas.
6. - El virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico para el uso de la reivindicación 1, en el que la enfermedad o el trastorno ocular es glaucoma, retinisis pigmentosa, degeneración macular, retinosquisis, amaurosis congénita de Leber, retinopatía diabética, acromotopsia o daltonismo.
7. - El virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico para el uso de la reivindicación 1, en el que la enfermedad ocular es la degeneración macular.
8. - El virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico para el uso de la reivindicación 7, en el que la degeneración macular es la degeneración macular húmeda.
9. - El virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico para el uso de la reivindicación 7, en el que la degeneración macular es la degeneración macular seca.
10. - El virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un transgén que codifica un producto génico terapéutico para el uso de la reivindicación 1, en el que el producto génico es un polipéptido antiangiogénico, una proteína de unión al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o una proteína opsina.