ES2908736T3 - Separación acústica para bioprocesamiento - Google Patents

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Jason Fiering
Kenneth Kotz
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Charles Stark Draper Laboratory Inc
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Abstract

Un procedimiento in vitro para separar células diana (18) de células no diana (16, 20) en un biofluido, que comprende: (a) alterar al menos uno de los siguientes: el tamaño de las células diana (18), el tamaño de las células no diana (16, 20), la compresibilidad del biofluido, la compresibilidad de las células diana (18), la compresibilidad de las células no diana (16, 20) y el potencial de agregación de las células no diana (16, 20); y alterar al menos una de la densidad del biofluido, la densidad de las células diana y la densidad de las células no diana mediante la introducción de un volumen predeterminado de al menos un aditivo al biofluido para producir un biofluido pretratado, el volumen predeterminado del al menos un aditivo siendo seleccionado para alterar o regular el biofluido para que tenga una densidad deseada; (b) hacer fluir el biofluido pretratado en una entrada (10) de un canal de separación de microfluidos (28); (c) aplicar energía acústica al biofluido pretratado dentro del canal de separación de microfluidos (28) para separar las células diana (18) de las células no diana (16, 20), de modo que las células diana (18) se acumulen dentro al menos una corriente primaria (32) a lo largo del canal de separación (28) y las células no diana (16, 20) se acumulan dentro de al menos una corriente secundaria (30) a lo largo del canal de separación (28); (d) recolectar al menos una corriente primaria (32) que comprende las células diana (18); y (e) opcionalmente recolectar por separado la al menos una corriente secundaria (30) que comprende las células no diana (16, 20).

Description

DESCRIPCIÓN
Separación acústica para bioprocesamiento
CAMPO TECNOLÓGICO
La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para separar células diana de células no diana. En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para separar células diana de células no diana en un biofluido.
RESUMEN
La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para separar células diana de células no diana en un biofluido. El procedimiento puede comprender pretratar el biofluido, hacer fluir el biofluido pretratado en una entrada de un canal de separación de microfluidos y aplicar energía acústica al canal de separación de microfluidos para acumular células diana dentro de una corriente primaria a lo largo del canal de separación y acumular células no diana dentro de una corriente secundaria a lo largo del canal de separación. En algunas realizaciones, el pretratamiento del biofluido comprende introducir un volumen predeterminado de al menos un aditivo en el biofluido para alterar al menos uno de entre el tamaño de las células diana, el tamaño de las células no diana, la compresibilidad del biofluido, la compresibilidad de las células diana, la compresibilidad de las células no diana y el potencial de agregación de las células no diana; y alterar al menos uno de entre la densidad del biofluido, la densidad de las células diana y la densidad de las células no diana para producir un biofluido pretratado, el volumen predeterminado siendo seleccionado de entre al menos un aditivo para alterar o regular el biofluido para que tenga una densidad deseada. En algunas realizaciones, la energía acústica se puede aplicar al biofluido pretratado dentro del canal de separación de microfluidos para separar las células diana de las células no diana.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además seleccionar el biofluido de entre la capa leucocitaria de sangre, el producto de leucaféresis, la sangre periférica, la sangre total, el líquido linfático, el líquido sinovial, el líquido cefalorraquídeo, la médula ósea, el líquido de ascitis y combinaciones o subcomponentes de los mismos. Según algunas realizaciones, el procedimiento comprende además seleccionar las células diana de modo tal que sean leucocitos seleccionados de entre el grupo que consiste en células mononucleares, linfocitos, monocitos, granulocitos, agranulocitos, macrófagos, células T, células B, células NK, subclases de las mismas y combinaciones de las mismas. Por consiguiente, según una realización, se proporciona un procedimiento para separar leucocitos de células no diana. Según ciertas realizaciones, se proporciona un procedimiento para separar linfocitos de células no diana. El procedimiento puede comprender seleccionar las células diana de modo tal que sean células madre.
El biofluido se puede recolectar de un sujeto donante. La corriente primaria puede tratarse de manera posterior y entregarse a un sujeto receptor. El sujeto receptor puede ser el mismo que el sujeto donante. El procedimiento se puede realizar en línea, de manera que el biofluido se recolecte de un sujeto, las células diana se separen de las células no diana en el biofluido mediante un procedimiento como se describe en esta invención, un fluido enriquecido en células diana se puede tratar posteriormente, y el fluido postratado puede devolverse al sujeto. El sujeto donante y el sujeto receptor pueden no ser el mismo sujeto. El fluido enriquecido en células diana puede recolectarse y almacenarse para su entrega al sujeto receptor en un momento posterior.
El procedimiento puede comprender además hacer fluir el fluido que comprende las células diana a través de canales de separación de microfluidos dispuestos en serie y aplicar energía acústica a cada canal de separación. El biofluido que comprende células diana puede fluir a través de un primer canal de separación de microfluidos para producir una corriente primaria enriquecida en células diana. A continuación, la corriente primaria puede fluir a través de un segundo canal de separación de microfluidos para producir una segunda corriente primaria que tenga un mayor grado de enriquecimiento de células diana.
Por ejemplo, el procedimiento puede comprender además dosificar la al menos una corriente primaria con un reactivo para producir una suspensión dosificada. El reactivo puede seleccionarse de entre un antígeno o reactivo de activación configurado para inducir bioquímicamente la activación celular. La suspensión dosificada puede fluir a través de un segundo canal de separación de microfluidos para producir una corriente primaria enriquecida en células activadas.
Por ejemplo, en algunas realizaciones del procedimiento, las células diana en la corriente primaria pueden ser linfocitos y el procedimiento puede comprender además separar los linfocitos activados de los linfocitos no activados en la corriente primaria. El procedimiento puede comprender además dosificar la corriente primaria de linfocitos con un reactivo para producir la suspensión dosificada, hacer fluir la suspensión dosificada en una entrada de un segundo canal de separación de microfluidos y aplicar energía acústica al segundo canal de separación de microfluidos. Los linfocitos activados pueden acumularse dentro de al menos una corriente primaria a lo largo del segundo canal de separación y los linfocitos no activados pueden acumularse dentro de al menos una corriente secundaria a lo largo del segundo canal de separación.
Según ciertas realizaciones, el procedimiento comprende además hacer fluir un segundo fluido adyacente al biofluido hacia una entrada del canal de separación de microfluidos. El segundo fluido puede introducirse en el canal de separación de microfluidos a través de una entrada separada. El biofluido y el segundo fluido pueden fluir a través del canal de separación en forma sustancialmente paralela y sustancialmente laminar.
Al menos una de las células diana y las células no diana pueden ser células vivas, células congeladas, células conservadas o células cultivadas en un cultivo celular. El canal de separación de microfluidos puede estar formado por un material termoplástico. El canal de separación de microfluidos puede ser desechable.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los dibujos adjuntos no están previstos para ser dibujados a escala. En los dibujos, cada componente idéntico o casi idéntico que se ilustra en varias figuras está representado por un número similar. Para mayor claridad, no todos los componentes pueden estar etiquetados en todos los dibujos. En los dibujos:
la FIG. 1 es un dibujo esquemático de un canal de separación de microfluidos, según una realización;
la FIG. 2 es un dibujo esquemático de un canal de separación de microfluidos alternativo, según otra realización; la FIG. 3 es una micrografía de un canal de separación de microfluidos acoplado a un transductor acústico que está apagado;
la FIG. 4 es una micrografía de un canal de separación de microfluidos acopado a un transductor acústico que está encendido;
la FIG. 5 es un dibujo esquemático de un sistema para la separación celular de microfluidos;
la FIG. 6 es un dibujo esquemático de un sistema alternativo para la separación celular de microfluidos;
la FIG. 7 es un gráfico del porcentaje de recuperación de linfocitos y otros glóbulos blancos del fluido de leucaféresis, capa leucocitaria y sangre total después de la separación según una realización de un procedimiento para separar linfocitos y glóbulos blancos de otras células en un biofluido;
la FIG. 8 es un gráfico de la pureza linfocitaria como un porcentaje de todos los glóbulos blancos del fluido de leucaféresis, capa leucocitaria y sangre total después de la separación según una realización de un procedimiento para separar linfocitos de otras células en un biofluido;
la FIG. 9 es un gráfico de la población relativa de linfocitos entre todos los glóbulos blancos en una fracción recolectada después de la separación según una realización de un procedimiento para separar células en un biofluido;
la FIG. 10 es un gráfico de la relación de separación de linfocitos a eritrocitos, leucocitos o una corriente secundaria en una fracción recolectada después de la separación según una realización de un procedimiento de separación de células en un biofluido;
la FIG. 11 es un gráfico de la relación de separación de linfocitos a eritrocitos, leucocitos o una corriente secundaria en una fracción recolectada después de la separación según una realización de un procedimiento de separación de células en un biofluido;
la FIG. 12 es un gráfico que compara la relación de separación de linfocitos a monocitos en la fracción recolectada después de la separación, según una realización de un procedimiento de separación de células en un biofluido;
la FIG. 13 es un gráfico de comparación de la relación de separación de linfocitos y la eliminación de eritrocitos de muestras pretratadas con un agregador celular en comparación con muestras pretratadas con un medio de gradiente de densidad, según una realización de un procedimiento para separar células en un biofluido; y la FIG. 14 es un dibujo esquemático de un canal de separación de microfluidos alternativo, según otra realización.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En los campos de la terapia celular y el bioprocesamiento, las técnicas médicas emergentes pueden implicar la extracción de sangre o tejido de un paciente seguida de la purificación de un tipo de célula particular de una muestra. En algunas aplicaciones, el tipo de célula particular se prepara para el tratamiento o se manipula antes de volver a inyectarse en un paciente.
El documento WO2016/062975 se refiere a un procedimiento para tratar una muestra biológica, preferiblemente una muestra de sangre o fluidos corporales que probablemente contengan una o más especies de interés, y que comprende una etapa de descomplejificación por acustoféresis. El documento WO2016/062975 también se refiere a sistemas, dispositivos, sustratos y dispositivos de conexión asociados. Dykes y col. 2011 se refieren a una técnica de acustoforesis basada en microchip, que utiliza fuerzas de ondas estacionarias ultrasónicas para la eliminación de plaquetas de productos de células progenitoras de sangre periférica. Yi y col. 2013 se refieren a un dispositivo de microfluidos que se desarrolló para separar mezclas heterogéneas de partículas o células en un flujo continuo mediante acustoforesis.
Los aspectos y realizaciones descritos en esta invención se refieren a la separación de células diana de células no diana en un biofluido. En particular, una aplicación de ejemplo es la separación de leucocitos o una subclase de leucocitos de una muestra de sangre.
En esta invención, se describen procedimientos y sistemas para usar en el procesamiento de células para la terapia celular. También se podrían contemplar muchos otros usos, en particular donde se desea recolectar un tipo de célula particular de una suspensión celular o una muestra natural. Algunos ejemplos no limitantes incluyen los ensayos de diagnóstico o de control ambiental, ingeniería de tejidos, modelos in vitro y sistemas de biofabricación, como para aplicaciones energéticas.
Anteriormente, la selección de células para aplicaciones dentro del bioprocesamiento se realizaba mediante una o más centrifugaciones por lotes, centrifugaciones continuas, separación magnética o combinaciones de las mismas. La centrifugación solo puede separar partículas por densidad, lo que limita su capacidad para separar las subclases de leucocitos de otros tipos de leucocitos. La adición de un medio de densidad puede mejorar la estratificación de los leucocitos, pero solo en procedimientos de lotes pequeños que requieren operadores técnicamente capacitados. Además, ninguna forma de centrifugación es capaz de separar subclases de linfocitos como las células T de las células B.
La separación magnética puede ser altamente selectiva, pero depende de la unión de partículas de captura paramagnéticas a las células mediante el uso de ligandos de afinidad, como los anticuerpos. Las partículas pueden suponer un riesgo para la seguridad si se inyectan en un paciente. En consecuencia, las partículas magnéticas deben eliminarse de un producto terapéutico final. La eficiencia de la separación magnética varía con la carga de células que interfieren o con la concentración de proteínas de fondo contenidas en la muestra que pueden unirse de forma específica o no específica al ligando de afinidad. Además, la unión de ciertas partículas magnéticas a las células a través de ligandos de afinidad puede ser irreversible. En este caso, solo se puede hacer una separación usando una fuerza magnética general. Por estas razones, la separación magnética es un procedimiento complejo que suele ser insuficiente para el flujo de trabajo de bioprocesamiento.
Los aspectos y realizaciones descritos en esta invención pueden ser ventajosos sobre las tecnologías de separación celular anteriores porque, por ejemplo, la purificación de las células deseadas se puede realizar de forma continua; en algunas realizaciones, el procedimiento de la invención proporciona separación tanto por tamaño como por densidad para mejorar aún más la separación celular. Los procedimientos de separación se pueden escalar fácilmente a volúmenes de muestra pequeños o grandes, se puede lograr un alto grado de purificación sin el uso de anticuerpos, ligandos, inmunoquímica u otras partículas extrañas, y se puede lograr una mayor purificación con la adición de aditivos fisiológicamente aceptables que pueden inyectarse de manera segura.
Un ejemplo no limitante de terapia celular que se puede realizar utilizando el procedimiento descrito en esta invención es la terapia CAR-T para el tratamiento de cánceres de la sangre. La terapia puede implicar la ingeniería de receptores de antígenos quiméricos en células T mediante transducción viral u otros procedimientos de edición de genes conocidos por los expertos en la materia. En el tratamiento CAR-T, generalmente se extrae sangre de un paciente. La sangre puede ser sangre total o un producto de leucaféresis. El producto de leucaféresis es una colección de leucocitos y plaquetas principalmente, con una concentración reducida de eritrocitos, en comparación con la sangre total. A partir de esta muestra de sangre recolectada, se pueden seleccionar subclases específicas de leucocitos para su posterior procesamiento. En la terapia CAR-T, las clases deseadas de células pueden variar, pero generalmente incluyen células mononucleares, linfocitos, células T o subclases de células T, como CD4+ o CD8+. A continuación, las células seleccionadas pueden modificarse (transducirse) mediante ingeniería genética para mejorar su capacidad de atacar células malignas. La ingeniería genética puede incluir la incubación para aumentar su abundancia, el lavado o la purificación, las pruebas de control de calidad y, opcionalmente, la infusión en un paciente.
Los aspectos y realizaciones descritos en esta invención pueden mejorar los procedimientos para seleccionar las células deseadas y también pueden tener aplicaciones en otras etapas del procedimiento, como el lavado de las células o la purificación de muestras después de la transducción.
La separación acústica, también conocida como acustoforesis, se puede utilizar para aislar o enriquecer las células deseadas como parte de un flujo de trabajo de bioprocesamiento. La separación acústica de partículas en un biofluido se ha descrito, por ejemplo, en la Solicitud de patente de los EE. UU. No. 2016-0030660, 2016-0008532 y 2013-0048565, y en la Patente de los EE. UU. 9.504.780. Los aspectos y realizaciones descritos en esta invención proporcionan la separación de células diana de células no diana en un biofluido. Más específicamente, los aspectos y realizaciones descritos en esta invención proporcionan una separación selectiva entre tipos de células, sin requerir el uso de una partícula de captura basada en la afinidad.
En la separación acústica, una suspensión mixta puede fluir a través de un conducto que oscila a frecuencias ultrasónicas mediante un oscilador mecánico externo. El conducto puede formar una cavidad resonante, por ejemplo, de modo que se generen ondas de presión ultrasónicas y entren en contacto con el flujo a través del conducto. Por ejemplo, las ondas ultrasónicas pueden generarse con un ángulo relativo al flujo. Las ondas ultrasónicas pueden generarse en una dirección sustancialmente transversal al flujo. Las células u otras partículas en la suspensión pueden experimentar una fuerza de las ondas de presión y migrar a los nodos en el campo de presión resultante. La velocidad a la que migran las células generalmente depende del tamaño, la densidad y la compresibilidad de las partículas. La separación puede verse facilitada, por ejemplo, por células más grandes y más densas que migran a un nodo de presión, con células más pequeñas o de flotabilidad neutra que migran lentamente, no migran (permaneciendo sustancialmente en el eje) o migran a antinodos. Por ejemplo, en un procedimiento de separación de configuración típico, el nodo de presión se establece a lo largo del eje del conducto y ciertas partículas pueden moverse hacia este eje del nodo de presión y fluir en una corriente concentrada a lo largo de él, mientras que otras células pueden permanecer dispersas o moverse a un eje antinodo de presión.
En referencia nuevamente a la aplicación de ejemplo de la terapia CAR-T, los linfocitos pueden extraerse preferiblemente de muestras de sangre. La terapia puede implicar la alteración de una propiedad de la suspensión celular o de una cierta clase de células dentro de la suspensión, de modo que los linfocitos sean menos susceptibles a la energía acústica que, por ejemplo, los eritrocitos y otras clases de leucocitos. Por lo tanto, cuando una suspensión de células, por ejemplo, una muestra de sangre, pasa a través de un separador acústico, los linfocitos pueden permanecer en una corriente lateral con mayor abundancia que las células no deseadas. La corriente secundaria puede recolectarse para su procesamiento y la corriente central puede desecharse.
Según un aspecto, se proporciona un procedimiento para separar células diana de células no diana en un biofluido. Más específicamente, se proporciona un procedimiento para la separación diferencial selectiva de un tipo celular deseado de un biofluido que comprende una suspensión de tipos celulares mixtos. Las células diana que pueden separarse selectivamente de los tipos celulares mixtos en la suspensión incluyen leucocitos, células mononucleares, linfocitos, monocitos, granulocitos, agranulocitos, macrófagos, células T, células B, células NK, subclases de las mismas y combinaciones de las mismas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células diana son subclases de células T, incluidas, entre otras, células CD4+, CD8+, Th, Tcm y Tfh. En algunas realizaciones, las células diana se seleccionan de modo tal que sean células madre.
Las células no diana pueden comprender todas y cada una de las células no seleccionadas como célula diana. Las células no diana pueden comprender eritrocitos, plaquetas, granulocitos, monocitos, macrófagos, células leucémicas y leucocitos excluyendo los leucocitos seleccionados como células diana. En algunas realizaciones, las células no diana son plaquetas y eritrocitos. Los eritrocitos tienen aproximadamente el mismo tamaño que los linfocitos. Con el fin de separar los eritrocitos de los linfocitos en un biofluido, la eficiencia puede incrementarse mucho al incluir un aditivo para alterar o regular al menos un parámetro del biofluido. Por ejemplo, el aditivo puede alterar el potencial de agregación de células no diana y/o la densidad del biofluido. Según ciertas realizaciones, el aditivo se introduce en un volumen suficiente para regular la densidad del biofluido de modo tal que sea sustancialmente similar a la densidad de los linfocitos.
Según ciertas realizaciones, las células diana se separan de las células no diana para producir un fluido enriquecido en células diana. Las células diana y/o las células no diana pueden ser células vivas, células congeladas, células conservadas o células cultivadas en un cultivo celular. El fluido enriquecido en células diana puede comprender una mayor concentración de células diana, en comparación con el biofluido de entrada o el biofluido pretratado.
Por lo general, un biofluido, por ejemplo, sangre total, comprende una alta concentración de eritrocitos. Para producir un fluido enriquecido en células diana, puede ser deseable reducir selectivamente los eritrocitos.
El procedimiento para separar las células diana de las células no diana en un biofluido puede comprender además proporcionar un biofluido. El biofluido se puede obtener de un sujeto donante. El biofluido del sujeto donante puede someterse directamente a procedimientos posteriores, o puede recolectarse y almacenarse para un procesamiento posterior. Como se usa en esta invención, "directamente" se refiere al procesamiento del biofluido sin someter el biofluido a un período de almacenamiento a largo plazo. Por ejemplo, el biofluido puede procesarse inmediatamente en una disposición en línea, en cuestión de minutos o de horas. El biofluido puede almacenarse durante un día o más. El biofluido se recolecta de un sujeto donante a través de una línea intraluminal. En consecuencia, el procedimiento puede comprender además obtener el biofluido de un sujeto donante a través de una vía intraluminal. Como se usa en esta invención, una línea "intraluminal" se refiere a una línea de transfusión que puede conectarse a un lumen de un sujeto. Más específicamente, una vía intraluminal puede conectarse a una cavidad corporal, estructura tubular u órgano del cuerpo, como una vena, una arteria, la vejiga o el intestino. Por ejemplo, una línea de transfusión puede conectarse al sistema circulatorio o gastrointestinal del sujeto. La línea intraluminal incluye, por ejemplo, líneas intravenosas, líneas venosas centrales, líneas intravasculares, líneas intratejidas, catéteres y líneas de transfusión. El catéter de línea intraluminal puede ser, por ejemplo, un catéter permanente periférico, un catéter intravenoso o un catéter venoso central.
Como se usa en esta invención, el término "sujeto" pretende incluir animales humanos y no humanos, por ejemplo, vertebrados, animales grandes y primates. En determinadas realizaciones, el sujeto es un sujeto mamífero y, en determinadas realizaciones, el sujeto es un sujeto humano. Aunque se prevén claramente aplicaciones con seres humanos, en esta invención también se contemplan aplicaciones veterinarias, por ejemplo, con animales no humanos. El término "animales no humanos" de la invención incluye todos los vertebrados, por ejemplo, no mamíferos (como aves, por ejemplo, pollos, anfibios, reptiles) y mamíferos, como primates no humanos, domesticados y útiles para la agricultura. animales, por ejemplo, oveja, perro, gato, vaca, cerdo, rata, entre otros. El biofluido se puede obtener de un dispositivo estándar de procesamiento de sangre. Por ejemplo, el biofluido se puede obtener de una máquina de afaresis. El biofluido puede obtenerse directamente de un dispositivo estándar de procesamiento de sangre y procesarse inmediatamente, por ejemplo, en una disposición en línea. El biofluido puede obtenerse de un dispositivo estándar de procesamiento de sangre y almacenarse durante un día o más antes de introducirlo en la cámara de separación de microfluidos.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además seleccionar el biofluido de entre la capa leucocitaria de sangre, el producto de leucaféresis, la sangre periférica, la sangre total, el líquido linfático, el líquido sinovial, el líquido cefalorraquídeo, la médula ósea, el líquido de ascitis y combinaciones o subcomponentes de los mismos. El biofluido puede comprender un medio sintético que comprende una suspensión celular. Por ejemplo, el biofluido puede comprender un medio de cultivo celular. El biofluido puede comprender un subcomponente de un biofluido. Por ejemplo, el biofluido puede comprender biofluido enriquecido en células, biofluido empobrecido en células, biofluido diluido, biofluido concentrado, biofluido filtrado, biofluido purificado o biofluido tratado de otro modo.
Como se usa en esta invención, producto de leucaféresis se refiere a un producto sanguíneo que ha sufrido un procedimiento de separación por aféresis. El procedimiento de separación por aféresis puede haberse realizado para eliminar o enriquecer los leucocitos. Por consiguiente, el producto de leucaféresis puede comprender un producto de aféresis enriquecido en leucocitos o un producto de aféresis empobrecido en leucocitos. El producto de leucaféresis puede comprender un biofluido sintético. El producto de leucaféresis se puede comprar de un fabricante. En algunas realizaciones no limitantes, el producto de leucaféresis es el producto de leucaféresis LeukoPak™, distribuido por AllCells (Alameda, CA).
El procedimiento para separar las células diana de las células no diana en un biofluido puede comprender además pretratar el biofluido. En algunas realizaciones, el pretratamiento del biofluido comprende introducir un volumen predeterminado de al menos un aditivo en el biofluido para alterar al menos uno de entre el tamaño de las células diana, el tamaño de las células no diana, la compresibilidad del biofluido, la compresibilidad de las células diana, la compresibilidad de las células no diana y el potencial de agregación de las células no diana; y alterar al menos uno de entre la densidad del biofluido, la densidad de las células diana y la densidad de las células no diana. El aditivo puede ser inocuo para las células. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la concentración de aditivo introducida en el biofluido es generalmente segura para la inyección intraluminal en un sujeto. En algunas realizaciones, el aditivo seleccionado es fisiológicamente aceptable y generalmente seguro para la inyección intraluminal en un sujeto. En general, el procedimiento puede comprender la introducción de un aditivo para modificar el biofluido o la química celular, para mejorar la separación de las células diana de las células no diana. Por ejemplo, la concentración de electrolitos del biofluido (es decir, la salinidad o la tonicidad) se puede ajustar, de modo que un tipo de célula deseado se agrande, hinche, crene, se haga esfera o se endurezca como respuesta. El tipo de célula deseado puede ser la célula diana o la célula no diana. El cambio en una o más propiedades físicas del tipo de célula puede afectar la respuesta de la célula a la fuerza acústica aplicada dentro del canal de separación de microfluidos, lo que permite una separación diferencial entre el tipo de célula deseado y otros tipos de células dentro del biofluido. El procedimiento puede comprender seleccionar el aditivo de entre el grupo que consiste en un agregador celular, agua desionizada, un detergente, un tensoactivo, una solución para regular la salinidad del biofluido, una solución para regular la tonicidad del biofluido, una solución para regular la viscosidad del biofluido, una solución para regular la osmolaridad del biofluido, una solución para regular la concentración de iones del biofluido y combinaciones de los mismos.
El procedimiento puede comprender la introducción de un aditivo para alterar el tamaño o la forma de las células diana o las células no diana. Como se mencionó anteriormente, un tipo de célula deseado puede hincharse, crear una esfera o volverse rígido en respuesta a la introducción de un aditivo en el biofluido. El cambio de tamaño o forma puede facilitar la discriminación entre los tipos de células en el procedimiento de separación. También se puede introducir un aditivo para activar un tipo de célula deseado, por lo que una célula T activada puede ser más grande que una célula T no activada. Por consiguiente, los cambios morfológicos naturales debidos a la activación inducida bioquímicamente o al ciclo celular natural pueden aprovecharse para separar las células diana de las células no diana.
El procedimiento puede comprender la introducción de un aditivo para alterar la concentración de sodio o de iones del biofluido. Por ejemplo, se puede introducir una solución concentrada de cloruro de sodio para crenar y/o encoger los eritrocitos y otras células no diana por ósmosis. Sin desear limitarse a una teoría particular, se cree que la hemoglobina contenida dentro de los eritrocitos efectuará un aumento en la densidad simultáneamente con una disminución en el volumen de la célula. Por consiguiente, puede ser posible aumentar selectivamente la densidad de los eritrocitos al disminuir su tamaño, para promover una mayor separación de las células diana de los eritrocitos no diana.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la introducción de un aditivo para alterar la compresibilidad del biofluido, las células diana o las células no diana. Por ejemplo, se pueden adicionar detergentes y/o tensoactivos para alterar la mecánica de la membrana celular, de modo que los tipos de células deseados experimenten un cambio en la compresibilidad. En algunas realizaciones, los detergentes o tensoactivos alteran la membrana celular, de modo que los tipos de células deseados son más susceptibles a cambios en la concentración de iones en el biofluido. Por ejemplo, los detergentes no iónicos pueden comprender la familia de detergentes Tween™, los detergentes Brij-35™ o la familia de detergentes Pluronic™. Se sabe que estos detergentes afectan la permeabilidad de la membrana y la biomecánica celular en concentraciones muy bajas, inferiores a una fracción del 0,05 % de peso/volumen de detergente. Por consiguiente, al agregar ciertos detergentes, puede ser posible afectar diferencialmente las propiedades mecánicas celulares de densidad, forma, tamaño o contenido iónico celular para promover una separación mejorada de las células diana de las células no diana.
Se puede introducir un aditivo en el biofluido para alterar el potencial de agregación de las células diana o las células no diana. Como se usa en esta invención, "potencial de agregación" se refiere al mecanismo por el cual un tipo de célula deseado se agrega, aglutina, adhiere o forma un complejo con células similares. En algunas realizaciones, el potencial de agregación se refiere a la capacidad de un tipo celular deseado para agregarse con células de un tipo celular diferente. Por ejemplo, se puede introducir un aditivo para alterar o regular el potencial de agregación de eritrocitos o plaquetas. En general, muchos biofluidos contienen una alta concentración de eritrocitos y/o plaquetas Agregando los eritrocitos y/o plaquetas, se puede lograr una separación más eficiente de otras células.
En algunas realizaciones, el potencial de agregación se altera o regula mediante un aditivo que impide que un tipo de célula deseado se una, agregue, aglutine, adhiera o forme un complejo con un tipo de célula similar o diferente. Por ejemplo, el potencial de agregación puede verse alterado o reducido por un anticoagulante. En otras realizaciones, el potencial de agregación puede alterarse, potenciarse o regularse mediante un agregador celular. Como se usa en esta invención, un "agregador celular" se refiere a un aditivo que puede unirse, agregarse, adherirse, aglutinarse o formar un complejo con un tipo de célula deseado. Un "agregador celular" también puede referirse a un aditivo que puede hacer que un tipo de célula deseado se una, agregue, adhiera, aglutine o forme un complejo con tipos de células similares o diferentes. El agregador celular puede hacer que las células se agreguen activando vías bioquímicas naturales, alterando la mecánica celular o reduciendo o filtrando las barreras electrostáticas entre las células en el biofluido pretratado.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además seleccionar el agregador celular de modo tal que sea un polisacárido de cadena larga. Los polisacáridos de cadena larga incluyen, entre otros, dextrano, polisacarosa, almidón heta (hidroxietil almidón) y medios Ficoll™, distribuidos por GE Healthcare (Chicago, IL). El polisacárido de cadena larga puede tener un peso molecular entre alrededor de 100 kD y alrededor de 500 kD. En algunas realizaciones, el polisacárido de cadena larga tiene un peso molecular entre alrededor de 250 kD y alrededor de 500 kD, entre alrededor de 200 kD y alrededor de 400 kD, entre alrededor de 300 kD y alrededor de 400 kD. El polisacárido de cadena larga puede tener un peso molecular de alrededor de 100 kD, alrededor de 200 kD, alrededor de 250 kD, alrededor de 300 kD, alrededor de 400 kD y alrededor de 500 kD. En algunas realizaciones, el agregador celular comprende un polisacárido de cadena larga presente en una concentración de entre alrededor del 0,5 % (p/v) y alrededor del 25 % (p/v). En algunas realizaciones, el agregador celular comprende un polisacárido de cadena larga presente en una concentración de entre alrededor del 1,0 % (p/v) y alrededor del 20 % (p/v), entre alrededor del 5,0 % (p/v) y alrededor del 15 % (p/v), entre alrededor del 8,0 % (p/v) y alrededor del 12 % (p/v). Por ejemplo, el agregador celular puede comprender un polisacárido de cadena larga presente en aproximadamente un 0,5 % (p/v), alrededor del 1,0 % (p/v), alrededor del 2,0 % (p/v), alrededor del 5,0 % (p/v), alrededor del 8,0 % (p/v), como 10 % (p/v), alrededor del 12 % (p/v), alrededor del 15 % (p/v), alrededor del 20 % (p/v), alrededor del 24 % (p/v) y alrededor del 25 % (p/v).
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además seleccionar el agregador celular de modo tal que sea un agregador de plaquetas o una molécula de adhesión celular (CAM). La CAM puede liberarse u obtenerse a partir de un gránulo de plaquetas activado. Tales CAM agregan plaquetas mediante mecanismos naturales conocidos. La activación plaquetaria puede inducir a la plaqueta a liberar gránulos y exponer el contenido de los gránulos plaquetarios en el exterior de la célula. A continuación, las CAM pueden promover la agregación plaquetaria a través de la unión plaqueta-fibrina y plaqueta-plaqueta. Las CAM pueden liberarse de un gránulo de plaquetas activado induciendo bioquímicamente su liberación, por ejemplo, mediante la activación mediante la adición de trombina, colágeno tipo II o difosfato de adenosina, o introduciendo CAM naturales o sintéticas obtenidas de un distribuidor en el biofluido. Las CAM liberadas u obtenibles a partir de un gránulo de plaquetas activado pueden incluir, entre otros, selectina P y factor de von Willebrand. Los activadores de plaquetas incluyen, entre otros, difosfato de adenosina, trombina, colágeno tipo II y ristocetina.
Puede introducirse un aditivo en el biofluido para alterar la densidad del biofluido. En algunas realizaciones, el aditivo se selecciona de un medio de gradiente de densidad, un aditivo de densidad y combinaciones de los mismos. Los medios de gradiente de densidad son medios para el aislamiento celular, generalmente utilizados en la práctica de la separación centrífuga. Los medios de gradiente de densidad son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, medios ACCUSPIN™, medios Histodenz™, medios OptiPrep™ y mediosHistopaque® distribuidos por Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), medios Ficoll-Paque™ y Medios Percoll™ distribuidos por g E Healthcare (Chicago, IL), medios RosetteSep™ y medios Lymphoprep™ distribuidos por STEMCELL Technologies (Vancouver, Canadá). La lista de medios de gradiente de densidad es meramente ejemplar y no exhaustiva. Un aditivo de densidad puede comprender un reactivo que tiene una densidad diferente a la del biofluido, o está configurado para regular o alterar la densidad del biofluido. Por ejemplo, el aditivo de densidad puede comprender agua pura, agua desionizada, una sal, una solución tampón salina o un compuesto yodado no iónico. Los compuestos yodados no iónicos incluyen, entre otros, ácido diatrizoico, diatrizoato de meglumina y yodixanol. Según ciertas realizaciones, el aditivo de densidad se selecciona de modo tal que sea inocuo para las células, de modo que no aumente la osmolaridad del biofluido hasta un grado que sería perjudicial para las células. Por ejemplo, el aditivo de densidad puede seleccionarse para que no comprenda cloruro de cesio o sacarosa.
En algunas realizaciones, el aditivo se introduce para alterar o regular la densidad del biofluido para que esté dentro de un intervalo de densidad de las células diana o células no diana. Por ejemplo, la densidad puede regularse de modo que las células diana se acerquen a una flotabilidad acústica neutra en el biofluido, reduciendo la fuerza acústica que actúa sobre ellas, en comparación con la fuerza que actúa sobre las células no diana. La densidad del biofluido se puede regular a una densidad de entre aproximadamente 1,00 g/ml y alrededor de 1,15 g/ml. En algunas realizaciones, la densidad del biofluido se regula a una densidad de entre alrededor de 1,00 g/ml y alrededor de 1,10 g/ml, entre alrededor de 1,10 g/ml y alrededor de 1,15 g/ml, entre alrededor de 1,02 g/ml y alrededor de 1,09 g/ml, entre alrededor de 1,03 g/ml y alrededor de 1,08 g/ml, entre alrededor de 1,04 g/ml y alrededor de 1,07 g/ml, y entre alrededor de 1,045 g/ml y alrededor de 1,065 g/ml. Específicamente, la densidad del biofluido puede regularse o alterarse a una densidad de aproximadamente 1,00 g/ml, alrededor de 1,01 g/ml, alrededor de 1,02 g/ml, alrededor de 1,03 g/ml, alrededor de 1,04 g/ml, alrededor de 1,05 g/ml, alrededor de 1,06 g/ml, alrededor de 1,07 g/ml, alrededor de 1,08 g/ml, alrededor de 1,09 g/ml, alrededor de 1,10 g/ml, alrededor de 1,12 g/ml, y alrededor de 1,15 g/ml.
El pretratamiento del biofluido puede comprender además la introducción de un aditivo para alterar la densidad de las células diana o de las células no diana. El aditivo se puede introducir para alterar o regular la densidad del biofluido y las células para que estén dentro de un intervalo entre sí, por ejemplo, para hacer que las células se acerquen a una flotabilidad acústica neutra dentro del fluido. Puede introducirse una solución diluyente, sal o salina para alterar o regular la densidad de células diana o células no diana para provocar una determinada respuesta de un tipo de célula deseado o para tener una densidad dentro de un intervalo de la densidad del biofluido. Por ejemplo, la concentración de sodio o de un ion puede reducirse, por ejemplo, por dilución con agua desionizada, para hinchar los eritrocitos por ósmosis mientras los linfocitos usan mecanismos naturales conocidos para regular su tamaño, aumentando la discriminación de tamaño entre los dos tipos de células. En otro ejemplo no limitante, las células leucémicas se hinchan más fácilmente que los linfocitos sanos y el aditivo puede facilitar la eliminación de las células leucémicas.
El procedimiento puede comprender la introducción de un aditivo para alterar tanto la densidad del biofluido como el potencial de agregación de las células no diana. En algunas realizaciones, la combinación de un aditivo de densidad y un agregador celular produce un efecto sinérgico, por lo que el procedimiento produce una separación más eficiente de las células diana de las células no diana y una mayor concentración de células diana en el fluido enriquecido en células diana que la que podría esperarse de la combinación de ambos efectos. Por ejemplo, en un procedimiento para separar linfocitos de otros leucocitos y eritrocitos, se puede introducir un aditivo o una combinación de aditivos para alterar la densidad del biofluido y agregar eritrocitos. El aditivo de densidad puede mejorar la separación de la célula diana, o linfocitos en este ejemplo, de las células no diana (por ejemplo, leucocitos), mientras que el agregador celular puede aumentar efectivamente el radio de dispersión acústica de las células no diana para mejorar la separación de las células no diana sobre los linfocitos u otras células diana. Los aditivos individuales, cuando se usan por separado, pueden no proporcionar una separación suficiente de los linfocitos de las células no diana, pero la combinación puede promover una separación diferencial efectiva mejorada de las células diana de las células no diana.
El aditivo puede comprender además partículas de captura basadas en la afinidad. Generalmente, las partículas basadas en afinidad son seguras para la inyección intraluminal en un sujeto. Por ejemplo, el aditivo puede comprender restos bioquímicos, como anticuerpos, que se unen a células diana o a células no diana. El agregador celular puede comprender una solución que comprende anticuerpos que se unen y agregan células diana o células no diana. Los anticuerpos pueden unirse y agregar un tipo de célula deseado. El aditivo puede comprender gotitas de emulsión, partículas de gel o vesículas de aceite encapsuladas en lípidos. La partícula de captura basada en la afinidad es segura para la inyección intraluminal. La partícula de captura basada en la afinidad puede diseñarse de modo tal que sea "antienfocada" o "enfocada positivamente" diseñándola con baja densidad o alta densidad. La partícula de captura "antienfoque" de baja densidad puede experimentar fuerzas acustoforéticas en la dirección opuesta a las células diana o a las células no diana. La partícula de captura "antienfoque" de alta densidad puede experimentar migración al antinodo de presión, mientras que las células diana o las células no diana migran hacia el nodo de presión. Un análogo acústico a la separación magnética puede comprender partículas de captura de "enfoque positivo". Por ejemplo, se puede usar una partícula de captura de "enfoque positivo" para atrapar un tipo de célula deseado, de modo que las células seleccionadas permanezcan retenidas en el canal de separación, mientras que otras células fluyen a través del mismo. El tipo de célula retenida puede liberarse en un momento posterior. En algunas realizaciones, una molécula de partícula de captura grande puede unirse a muchos puntos en la superficie de un tipo de célula deseado y puede alterar la fuerza acustoforética exhibida en la partícula al cambiar su diámetro efectivo.
El procedimiento para separar las células diana de las células no diana puede comprender además el flujo de biofluido en una entrada de un canal de separación de microfluidos. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender hacer fluir el biofluido pretratado al canal de separación de microfluidos. El biofluido puede tener un caudal de entre aproximadamente 0,03 ml/min a alrededor de 0,5 ml/min. En algunas realizaciones, el biofluido puede tener un caudal a través del canal de separación de microfluidos de entre alrededor de 0,05 ml/min a alrededor de 0,4 ml/min, alrededor de 0,1 ml/min a alrededor de 0,3 ml/min. El biofluido puede tener un caudal a través del canal de separación de microfluidos de aproximadamente 0,03 ml/min, 0,05 ml/min, 0,08 ml/min, 0,1 ml/min, 0,2 ml/min, 0,3 ml/min, 0,4 ml/min, 0,5 ml/min o cualquier intervalo entre los mismos.
El procedimiento puede comprender además aplicar energía acústica al canal de separación de microfluidos. La energía acústica puede aplicarse en forma de onda acústica. La onda acústica se puede aplicar con un ángulo relativo al flujo de fluido a través del canal de separación. El ángulo y la magnitud de la onda acústica pueden diseñarse según el tamaño del dispositivo, el tamaño del canal o el caudal de fluido a través del canal. La energía acústica se puede aplicar en una dirección sustancialmente transversal al flujo de biofluido a través del canal de separación de microfluidos. La onda acústica puede ser una onda acústica estacionaria. La energía acústica se puede aplicar al canal de separación de microfluidos de forma continua. La aplicación continua de energía acústica puede permitir una mayor eficiencia de separación. La energía acústica se puede aplicar al canal de separación de microfluidos de manera intermitente o en un horario programado. La aplicación de energía intermitente puede permitir que las células se muevan libremente a través del canal si hay un bloqueo.
La energía acústica aplicada puede actuar sobre las células y partículas dentro del biofluido para impulsarlas según su tamaño, densidad y/o compresibilidad. En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender acumular células diana dentro de una corriente primaria a lo largo del canal de separación. En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender acumular células - no diana dentro de una corriente secundaria a lo largo del canal de separación. La acumulación de un tipo de célula dentro de una corriente deseada a lo largo del canal de separación puede diseñarse ajustando parámetros tales como longitud de onda, frecuencia, amplitud, nivel de potencia u otra modulación de la energía acústica aplicada.
Dependiendo de las células diana o las células no diana seleccionadas según el procedimiento, una clase de células puede acumularse en respuesta a un nodo o antinodo de presión generado por la energía acústica. Por ejemplo, las células diana pueden acumularse dentro de una corriente primaria en respuesta a un nodo de presión, y las células no diana pueden acumularse dentro de una corriente secundaria en respuesta a un antinodo de presión. Generalmente, las partículas, incluidas las células, serán impulsadas por la energía acústica en respuesta a su factor de contraste. Las partículas pueden migrar a una velocidad proporcional a la magnitud y el signo de sus factores de contraste. Las partículas con un factor de contraste positivo pueden ser impulsadas hacia los nodos de presión, mientras que las partículas con un factor de contraste negativo pueden ser impulsadas hacia los antinodos de presión. Las partículas con un factor de contraste de mayor magnitud generalmente son impulsadas a una velocidad más rápida que las partículas con un factor de contraste de menor magnitud.
La velocidad a la que se impulsan las células en respuesta a su energía acústica generalmente depende del tamaño, la densidad y la compresibilidad de las partículas. Brevemente, el factor de contraste se basa en el módulo de volumen (K) y la densidad (p) de una partícula, aquí de las células. Cuando están suspendidas en un fluido, el factor de contraste ($) para las células se calcula con la siguiente ecuación:
5p — 2 • 1.02 2.2
(O —-------------------- 1------
T 2p 1.02 K
En algunas realizaciones, el procedimiento para separar las células diana de las células no diana en un biofluido comprende recolectar al menos una corriente primaria que comprende las células diana. Generalmente, el biofluido que ingresa al canal de separación de microfluidos es una corriente primaria bien mezclada, que comprende células diana y no diana desegregadas. Al experimentar la energía acústica, las células diana y las células no diana generalmente pueden acumularse en fracciones de la corriente general de biofluido. La fracción o fracciones de biofluido que fluye a través del canal de separación de microfluidos selectivamente enriquecido en células diana se definen como la corriente primaria. Puede haber más de una fracción de biofluido dentro del canal de separación de microfluidos enriquecido en células diana. Por ejemplo, las células diana pueden ser impulsadas a un nodo de presión en el centro del canal en una realización, y las células diana pueden impulsarse a los antinodos de presión en la periferia del canal en una realización alternativa. La ubicación de los nodos y antinodos de presión dentro del canal puede diseñarse posicionando la energía acústica o seleccionando la frecuencia y la longitud de onda de las ondas acústicas. La corriente primaria que comprende células diana puede recolectarse para almacenamiento, uso inmediato, transfusión a un paciente o para investigación. Cuando el procedimiento está diseñado para crear un fluido empobrecido en células diana, la corriente primaria que comprende las células diana puede desecharse como desecho.
De manera similar, en algunas realizaciones, el procedimiento para separar las células diana de las células no diana comprende recolectar al menos una corriente secundaria que comprende células no diana. La fracción o fracciones dentro del biofluido empobrecidas selectivamente en células diana y enriquecidas selectivamente en células no diana se definen como la corriente secundaria. Las células diana y las células no diana pueden tener factores de contraste opuestos. Con factores de contraste opuestos, las células diana y las células no diana pueden impulsarse en direcciones opuestas, o una puede alejarse de la corriente general, por ejemplo, hacia el centro o la periferia del canal. Las células diana y las células no diana pueden tener factores de contraste de diferente magnitud, pero del mismo signo. Una clase de células puede alejarse a un ritmo más rápido que la otra, definiendo las corrientes primaria y secundaria. La corriente secundaria se puede recolectar para almacenamiento, para investigación adicional o para desecharla como desecho. Cuando el procedimiento está diseñado para agotar un biofluido de las células diana, la corriente secundaria puede recolectarse para su uso posterior o para la transfusión a un paciente. El procedimiento puede comprender recolectar la corriente primaria que comprende las células diana y comprender además recolectar por separado al menos una corriente secundaria que comprende las células no diana.
Un fluido enriquecido en células diana o empobrecido en células diana puede tratarse posteriormente y administrarse a un sujeto receptor. Por ejemplo, la corriente primaria puede tratarse de manera posterior y entregarse a un sujeto receptor. El postratamiento de un fluido puede comprender un procedimiento tal como lavado, separación, concentración, dilución, calentamiento, purificación o filtración capaz de eliminar toxinas, contaminantes o compuestos químicos nocivos del fluido. En general, un fluido se trata posteriormente para producir un fluido fisiológicamente aceptable que puede administrarse directamente a un sujeto receptor, por ejemplo, a través de una línea intraluminal como se describió anteriormente. El fluido postratado puede almacenarse para su entrega a un sujeto receptor en un momento posterior.
El fluido enriquecido o empobrecido en células diana se trata posteriormente para producir un fluido terapéutico. El postratamiento del fluido puede comprender la transducción viral, la transferencia de genes o la edición de genes de las células diana para producir un fluido terapéutico fisiológicamente aceptable para administrarlo a un sujeto receptor, como se describió anteriormente.
El sujeto receptor puede ser el mismo que el sujeto donante. El sujeto donante y el sujeto receptor pueden no ser el mismo sujeto. El sujeto donante y el sujeto receptor, en general pueden ser fisiológicamente compatibles.
El procedimiento se puede realizar en línea, de manera que el biofluido se recolecte de un sujeto y se trate directamente de manera previa, las células diana se separan de las células no diana en el biofluido mediante un procedimiento como se describe en esta invención, a fin de producir un fluido enriquecido en células diana, el fluido enriquecido en células diana se puede tratar posteriormente y el fluido postratado puede devolverse directamente al sujeto. En algunas realizaciones, el procedimiento se realiza esencialmente como se ha analizado anteriormente. Sin embargo, las células diana se separan de las células no diana para producir un fluido empobrecido en células diana, que puede tratarse posteriormente y devolverse al sujeto.
Según ciertas realizaciones, el procedimiento comprende además hacer fluir un segundo fluido adyacente al biofluido hacia una entrada del canal de separación de microfluidos. La entrada puede ser una entrada separada de la entrada de biofluido del canal de separación de microfluidos. El biofluido y el segundo fluido pueden fluir a través del canal de separación en forma sustancialmente paralela. Por ejemplo, ambos fluidos pueden fluir a través del canal de separación en periferias opuestas del canal, el segundo fluido puede fluir a través de ambas periferias del canal o el segundo fluido puede fluir en el centro del canal. El biofluido y el segundo fluido pueden fluir a través del canal de separación en forma sustancialmente laminar. Como se usa en esta invención, el flujo sustancialmente laminar incluye un flujo sustancialmente ordenado. El flujo laminar puede tener un número de Reynolds (Re) inferior a alrededor de 2100. El flujo laminar tiene un número de Reynolds (Re) inferior a alrededor de 4000.
El segundo fluido puede ser un fluido inerte que puede comprender agua, agua desionizada o solución salina tamponada con fosfato (PBS). El segundo fluido puede tener su densidad ajustada con un medio de gradiente de densidad o un aditivo de densidad, independientemente del biofluido pretratado. La energía acústica aplicada puede impulsar células diana o no diana desde el biofluido hacia el segundo fluido que fluye esencialmente en paralelo y que inicialmente no comprende células, de modo que el segundo fluido, que ahora comprende células selectivamente separadas, puede salir del canal de separación de microfluidos a través de una salida separada. Cuando las células diana son impulsadas al segundo fluido, el segundo fluido que comprende las células diana es esencialmente la corriente primaria. Por el contrario, cuando las células no diana son impulsadas al segundo fluido, el segundo fluido es esencialmente la corriente secundaria.
Los procedimientos descritos en esta invención se pueden realizar en una separación por etapas o en serie. Específicamente, un fluido enriquecido en células diana o un fluido empobrecido en células diana puede procesarse adicionalmente pretratándolo con un aditivo, fluyendo a través de un segundo canal de separación de microfluidos y aplicando energía acústica. El aditivo introducido en el fluido en la operación aguas abajo puede ser el mismo o diferente aditivo que el introducido en el biofluido en el procedimiento de separación del primer paso. Además, las células diana seleccionadas en el procedimiento de primer paso pueden ser iguales o diferentes a las seleccionadas en el procedimiento del segundo paso. Como ejemplo no limitante, un biofluido puede ser pretratado y fluir a través de un canal de separación de microfluidos para producir un fluido empobrecido en plaquetas. El fluido sin plaquetas de salida puede fluir además a través de un segundo canal de separación de microfluidos para eliminar los neutrófilos y/o monocitos Como otro ejemplo no limitante, se puede hacer fluir un biofluido a través de un canal de separación de microfluidos para producir un fluido enriquecido en linfocitos. El fluido enriquecido en linfocitos puede fluir a través de un segundo canal de separación de microfluidos para producir un fluido enriquecido en linfocitos adicional.
El fluido enriquecido en células diana o empobrecido en células diana del primer paso puede reciclarse y reintroducirse en el biofluido o en el biofluido pretratado para que fluya a través del canal de separación de microfluidos como una mezcla.
El procedimiento puede comprender además dosificar la al menos una corriente primaria con un reactivo para producir una suspensión dosificada. La al menos una corriente primaria puede ser un fluido enriquecido en células diana. El reactivo puede seleccionarse de entre un antígeno o reactivo de activación configurado para inducir bioquímicamente la activación celular. La activación inducida bioquímicamente puede permitir la selección de subclases de tipos de células, por ejemplo, linfocitos o células T, aprovechando los cambios morfológicos de las células activadas. En algunos casos, las células activadas pueden ser más grandes que las células no activadas y el tamaño de las células puede variar a lo largo del ciclo celular. La diferencia de tamaño puede permitir una separación diferencial con energía acústica.
El procedimiento puede comprender además hacer fluir el fluido enriquecido en células diana a través de un segundo canal de separación de microfluidos o a través de canales de separación de microfluidos dispuestos en serie y aplicar energía acústica a cada canal de separación. La suspensión dosificada puede permitir la selección de células diana en una determinada etapa del ciclo celular.
Por ejemplo, en algunas realizaciones del procedimiento, las células diana en la corriente primaria pueden ser linfocitos y el procedimiento puede comprender además separar los linfocitos activados de los linfocitos no activados en la corriente primaria. El procedimiento puede comprender además dosificar el fluido enriquecido con un reactivo para producir la suspensión dosificada, hacer fluir la suspensión dosificada en una entrada de un segundo canal de separación de microfluidos y aplicar energía acústica al segundo canal de separación de microfluidos. Los linfocitos activados pueden acumularse dentro de al menos una corriente primaria a lo largo del segundo canal de separación y los linfocitos no activados pueden acumularse dentro de al menos una corriente secundaria a lo largo del segundo canal de separación.
En ciertas realizaciones, el aditivo es capaz de alterar o regular al menos uno de la densidad del biofluido, la densidad de las células diana, la densidad de las células no diana, y el volumen predeterminado del aditivo se determina para alterar o regular el biofluido de manera tal que tenga una densidad o concentración deseada de células diana o células no diana. Por ejemplo, el volumen predeterminado del aditivo puede determinarse para permitir que las células diana o las células no diana se acerquen a una flotabilidad acústica neutra en el biofluido. En algunas realizaciones, el volumen predeterminado del aditivo se determina para alterar o regular la densidad del biofluido a una densidad de entre aproximadamente 1,00 g/ml y alrededor de 1,15 g/ml o en intervalos de densidad o valores dentro de este intervalo, como se analizó antes.
En algunas realizaciones, el aditivo es capaz de alterar o regular al menos uno de los siguientes: el % de HCT del biofluido, la concentración de las células diana o la concentración de las células no diana, y se determina que el volumen predeterminado del aditivo altera o regula el % de HCT del biofluido de modo tal que sea menor que alrededor del 10 %. Por ejemplo, se puede determinar el volumen predeterminado del aditivo para alterar o regular el % de HCT del biofluido de modo tal que sea menor que alrededor del 30 %, menor que alrededor del 25 %, menor que alrededor de 20 %, menor que alrededor del 15 %, menor que alrededor del 10 % o menor que alrededor del 5 %.
La función y las ventajas de la invención se pueden comprender mejor a partir de la descripción de las figuras siguientes, que ilustran mejor los beneficios y/o ventajas de uno o más sistemas y técnicas de la invención, pero no ejemplifican el alcance completo de la invención.
Como se muestra en el dibujo esquemático del concepto de ejemplo de la FIG. 1, un biofluido que comprende células diana 18 y células no diana 16 y 20 fluye a través del canal de separación de microfluidos 28, a través de la entrada 10. La energía acústica se aplica al canal de separación 28 dentro del rectángulo de línea de puntos ilustrado. Puede aplicarse energía acústica conectando un transductor piezoeléctrico (no mostrado) a una pared del canal de separación. Las células diana 18 se acumulan dentro de la corriente primaria 32 y salen del canal de separación 28 a través de la primera salida 14. El fluido enriquecido en células diana sale por la primera salida 14. Las células no diana 16 y 20 se acumulan dentro de la corriente secundaria 30 y salen del canal de separación a través de la segunda salida 12. Las células no diana 16 y 20 están contenidas en un fluido residual. En algunas realizaciones, se recolecta el fluido enriquecido con células diana dentro de la corriente primaria 32.
De manera similar, como se muestra en el dibujo esquemático del concepto de ejemplo de la FIG. 2, el biofluido que comprende células diana 18 y células no diana 16 y 20 fluye a través del canal de separación de microfluidos 28, a través de la entrada 10. En la realización ejemplificada en la FIG. 2, las células diana 18 se acumulan esencialmente dentro de dos corrientes primarias, 34 y 38, en la periferia del canal de separación 28, al someterse a la energía acústica. Las células no diana 16 y 20 se acumulan esencialmente dentro de la corriente secundaria central 36. Las corrientes primarias 34 y 38 (líquido enriquecido en células diana) salen del canal de separación 28 a través de las primeras salidas periféricas 22 y 26, mientras que la corriente secundaria 36 (líquido residual) sale del canal de separación 28 a través de la segunda salida 24. En esta realización ejemplar, las células no diana 16 y 20 son más susceptibles a la energía acústica, por lo que viajan rápidamente a la región central (corriente secundaria 36) del canal de separación 28, mientras que las células diana 18 experimentan una fuerza más débil desde la energía acústica y permanecen en la región periférica del canal de separación 28 (corrientes primarias 34 y 38).
Las FIG. 3 y 4 son imágenes microscópicas del extremo aguas abajo de un canal de separación de microfluidos. En la FIG. 3, el canal de separación de microfluidos no recibe ninguna energía acústica. Como se muestra en la imagen, una suspensión celular homogénea fluye a través del canal sin separación. En la FIG. 4, el canal de separación de microfluidos recibe energía acústica. Las células que no son diana, que se muestran en el tono más oscuro, se pueden ver viajando a través de la corriente central, mientras que las células diana (no visibles individualmente en las imágenes) viajan a través de las corrientes externas. La separación como se ve en la FIG. 4 es mucho mayor que la que se ve en la FIG. 3.
Como se muestra en la FIG. 5 (no según la presente invención), se proporciona un sistema para la separación de microfluidos de células diana y células no diana en un biofluido que puede comprender una fuente de un biofluido 110, una fuente de un aditivo 120 y un canal de separación de microfluidos 140 acoplado a un transductor acústico 240. El sistema puede comprender además un sensor 180 configurado para medir un parámetro de un biofluido de entrada y un sensor 360 configurado para medir un parámetro de una corriente primaria. Los sensores pueden conectarse eléctricamente a los módulos de control 340 y 160, de modo que el módulo de control 340 esté configurado para alterar o regular un parámetro de entrada del transductor acústico 240 y el módulo de control 160 esté configurado para introducir un volumen predeterminado del aditivo en el biofluido.
El sistema puede comprender además una línea intraluminal 260 conectada de forma fluida al sujeto donante 280 y una segunda línea intraluminal 300 conectada de forma fluida al sujeto receptor 320. El sujeto receptor 320 y el sujeto donante 280 pueden ser el mismo sujeto. El canal de separación de microfluidos 140 puede separar el biofluido pretratado en una corriente primaria y una corriente secundaria, de modo que la corriente primaria que comprende células diana (fluido enriquecido en células diana) se dirige al canal de recolección de corriente primaria 220 y la corriente secundaria que comprende células no diana (líquido empobrecido en la célula diana) se dirige al canal de recolección de corriente secundaria 220. La corriente primaria se puede reciclar de regreso a la fuente del biofluido 110 a través de la línea de reciclaje 380 o se puede tratar posteriormente en la cámara de postratamiento 400. En algunas realizaciones, la cámara de postratamiento 400 está conectada de manera fluida a la línea intraluminal 300. La corriente secundaria se puede recolectar en el recipiente de recolección 420. El sistema puede comprender además una fuente de un segundo fluido 460 conectado de manera fluida al canal de separación de microfluidos 140. Volviendo a la FIG. 6, el sistema para la separación de microfluidos de células diana y células no diana en un biofluido puede comprender además dos o más canales de separación de microfluidos 140. En la realización que se muestra, cada canal de separación de microfluidos 140 está acoplado a un transductor acústico 240, sin embargo, el sistema puede comprender un transductor acústico 240 acoplado a más de un canal de separación de microfluidos 140. Los dos o más canales de separación de microfluidos 140 pueden estar conectados de forma fluida a un colector 440, que puede estar conectado de manera fluida o eléctrica a un sensor 500. El colector 440 puede configurarse para distribuir el biofluido a los canales de separación de microfluidos 140 en respuesta a una medición recibida desde el sensor 500 de una carga de biofluido de entrada aguas arriba de la fuente de biofluido 110. En algunas realizaciones, el sistema comprende un canal de recolección 200 aguas abajo de los canales de separación de microfluidos 140 configurado para recolectar la corriente primaria de los canales de separación de microfluidos 140. El sistema puede comprender además un recipiente de recolección 480 aguas abajo del canal de recolección 200.
Como se muestra en el dibujo esquemático del concepto ejemplar de la FIG. 14, un segundo fluido 42 puede fluir a través del canal de separación de microfluidos 28 con biofluido pretratado 40, en un flujo esencialmente paralelo. El segundo fluido 42 ingresa al canal de separación de microfluidos 28 a través de la entrada central 46, mientras que el biofluido pretratado 40 ingresa al canal de separación de microfluidos 28 a través de las entradas periféricas 44 y 48. El segundo fluido 42 no comprende células cuando ingresa al canal de separación 28. Las células no diana 16 y 20 son impulsadas hacia la corriente central por la energía acústica aplicada y salen del canal de separación a través de la salida de desechos 24. Las células diana 18 son esencialmente flotantes dentro del canal de separación de microfluidos 28 y no son impulsadas a la corriente central. La recuperación estimada en el ejemplo de realización de la FIG. 14 se calcula que es aproximadamente 70 %. Comparativamente, la recuperación estimada en una realización sin introducir un segundo fluido, como el ejemplificado en la FIG. 2, es de alrededor del 65 %.
Ejemplo 1: Separación acústica para purificación de linfocitos
La separación de linfocitos del producto de la capa leucocitaria humana se realizó con un canal de separación de microfluidos. La capa leucocitaria se separó y se recolectó de sangre total humana. Se hizo fluir una capa leucocitaria a través de un canal de separación de microfluidos con un tiempo de residencia de alrededor de 1 segundo, y se aplicaron ondas ultrasónicas al canal para hacer oscilar una porción del canal que tenía una sección transversal en la escala de la longitud de onda ultrasónica (~1 mm). La energía acústica en el canal se aplicó para impulsar las células hacia una corriente central axial.
Los linfocitos experimentaron una fuerza más débil que los eritrocitos y otros leucocitos, debido a la diferencia entre el tamaño y la densidad de un linfocito en comparación con las células alternativas. A medida que la capa leucocitaria de sangre fluía a través del canal y se sometía a la energía acústica, la población de linfocitos se acumulaba a lo largo de las corrientes primarias en el exterior del canal, el líquido enriquecido en linfocitos se separaba mediante una ramificación en el canal, por ejemplo, como la que se muestra en la FIG. 4. Se recolectó y analizó el fluido enriquecido en linfocitos.
Los recuentos de células de salida iniciales se midieron con un analizador de hematología estándar. Los resultados se muestran en el gráfico de la FIG. 9. En la suspensión de producción enriquecida con linfocitos, la población de linfocitos, en comparación con otros leucocitos, se enriqueció del 34 % (población inicial) al 87 % (población de salida). Los linfocitos se enriquecieron 2,5 X mediante un único paso a través del canal de separación de microfluidos. La recuperación total de linfocitos fue del 21 %. La concentración de eritrocitos se redujo en un 50 %. La recuperación de linfocitos y la separación de los eritrocitos se puede aumentar con aditivos, ajustando el dispositivo (por ejemplo, ajustando la entrada y/o parámetros de salida del transductor acústico), y realizando pases repetidos a través del canal de separación.
Generalmente, sin desear estar ligado a una teoría particular, se cree que las células no diana se enfocan hacia la corriente central, mientras que los linfocitos se enfocan débilmente hacia la corriente central, lo que permite la retención en las corrientes periféricas.
En consecuencia, los linfocitos pueden separarse selectivamente de células similares (leucocitos) con los sistemas y procedimientos descritos en esta invención.
Ejemplo 2: Separación acústica con medio de gradiente de densidad
La capa leucocitaria de sangre que comprende linfocitos y células no diana se sometió a energía acústica, generalmente como se describió antes. Antes de hacer fluir la capa leucocitaria a través de un canal de separación de microfluidos, las muestras de la capa leucocitaria se pretrataron diluyéndolas con un medio de gradiente de densidad a densidades de diluyente que oscilan entre aproximadamente 1,00 y 1,15 (g/ml). Los resultados se miden en relación de separación, una medida cuantitativa de la relación de células en el producto (eficiencia de separación).
La relación de separación para cualquier subpoblación x, donde "lateral" es la corriente primaria y "central" es la corriente secundaria.
n
SRX = X , lateral
n'■ .X,latera il+ 1 n ' '- .X, centro
La fracción de la corriente que sale del canal lateral (corriente primaria), también conocida como la división de flujo:
f lateral
1 FR lateral = V,n
v„
Los resultados de la relación de separación del biofluido diluido con medio de gradiente de densidad se resumen en el gráfico que se muestra en la f Ig . 10. Como se muestra, el medio de gradiente de densidad proporciona una separación eficiente de los linfocitos de otros leucocitos, pero no afecta la separación de los linfocitos de los eritrocitos, que permanece constante alrededor de 1,0 para aumentar la densidad de la solución. Se efectúa una separación máxima de linfocitos de otros leucocitos cerca de la densidad de los linfocitos (aproximadamente 1,06 g/ml). Sin desear estar ligado a una teoría particular, se cree que el medio de gradiente de densidad no afecta eficazmente la separación de células de eritrocitos en este intervalo porque la densidad de los eritrocitos sigue siendo significativamente mayor que la del fluido de suspensión.
En consecuencia, la separación de linfocitos de leucocitos en un biofluido se puede realizar con mejores resultados pretratando el biofluido con un aditivo, como un medio de gradiente de densidad.
Sin querer estar ligado a una teoría en particular, se cree que la separación celular por pretratamiento con aditivos capaces de alterar la densidad del biofluido, la densidad de las células diana, la densidad de las células no diana, el tamaño de las células diana, el tamaño de la las células no diana, la compresibilidad del biofluido, la compresibilidad de las células diana, la compresibilidad de las células no diana, el potencial de agregación de las células diana y el potencial de agregación de las células no diana proporcionará resultados superiores sobre la ausencia del pretratamiento porque la velocidad a la que las células migran generalmente depende del tamaño de la célula, la densidad y la compresibilidad en relación con la densidad y la compresibilidad del biofluido en suspensión.
Ejemplo 3: Separación acústica con agregador celular
La capa leucocitaria de sangre que comprende linfocitos y células no diana se sometió a energía acústica, generalmente como se describió antes. Antes de hacer fluir la capa leucocitaria a través de un canal de separación de microfluidos, las muestras de la capa leucocitaria se pretrataron mediante la introducción de medios celulares Ficoll™ PM 300 (GE Healthcare, Chicago, IL), se introdujo un polisacárido de cadena larga en el biofluido. Las muestras pretratadas con Ficoll™ se compararon con muestras pretratadas con el medio Histopaque® (distribuido por Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Los resultados se resumen en el gráfico de la FIG. 13 Las muestras pretratadas con Ficoll™ exhibieron una mejor eliminación de eritrocitos que las muestras pretratadas con Histopaque®. Sin embargo, las muestras de Ficoll™ exhibieron una menor recuperación de linfocitos que las muestras de Histopaque®. No obstante, ambas muestras exhibieron una eliminación de eritrocitos y una recuperación de linfocitos mejoradas que la muestra de control pretratada solo con PBS.
En consecuencia, el pretratamiento del biofluido con Ficoll™ proporciona una eliminación de células no diana superior, pero una recuperación de células diana inferior, en comparación con el pretratamiento del biofluido con Histopaque®. Además, la separación de linfocitos de leucocitos en un biofluido se puede realizar con mejores resultados pretratando el biofluido con Ficoll™ o Histopaque® en comparación con el pretratamiento del biofluido con PBS solo.
En consecuencia, el pretratamiento del biofluido con un agregador celular proporciona una eliminación de células no diana superior, pero una recuperación de células diana inferior, en comparación con el pretratamiento del biofluido con un medio de gradiente de densidad. Además, se puede realizar la separación de linfocitos de leucocitos en un biofluido.
Ejemplo 4: Separación acústica con medio de gradiente de densidad y agregador celular
La capa leucocitaria de sangre que comprende linfocitos y células no diana se sometió a energía acústica, generalmente como se describió antes. Antes de hacer fluir la capa leucocitaria a través de un canal de separación de microfluidos, las muestras de la capa leucocitaria se pretrataron diluyéndolas con un aditivo que comprendía un medio de gradiente de densidad y un agregador celular para proporcionar una densidad de solución que oscilaba entre aproximadamente 1,00 y 1,10 (g/ml). Específicamente, las muestras fueron pretratadas con medios Histopaque® (Sigma-Aldrich, St. Louis, m O).
Los resultados se resumen en el gráfico de la FIG. 11. El gráfico muestra un enriquecimiento mucho mejor de linfocitos a partir de eritrocitos, en comparación con el medio de gradiente de densidad solo (FIG. 10). La línea de tendencia de linfocito/leucocito muestra que el aditivo que comprende un medio de gradiente de densidad y un agregador celular muestra una separación generalmente creciente de linfocitos de eritrocitos con una densidad de solución creciente. Por el contrario, la línea de tendencia del linfocito/leucocito muestra una separación generalmente decreciente de linfocitos de leucocitos con el aumento de la densidad de la solución. La densidad de solución óptima es el punto en el que se cruzan las líneas de tendencia, o cerca de 1,06 g/ml, que es la densidad aproximada de los linfocitos. En consecuencia, los linfocitos se pueden separar de los eritrocitos y leucocitos de manera más eficiente con un aditivo configurado para alterar la densidad de la solución a aproximadamente 1,06 g/ml.
Además, la separación de linfocitos de eritrocitos y leucocitos en un biofluido es más eficiente cuando el biofluido se trata previamente con un medio de gradiente de densidad y un agregador celular. Los datos muestran que hay un resultado sinérgico para la combinación de medios en comparación con la separación celular con cada medio solo.
Conclusión: resultados comparativos
En experimentos similares de separación de linfocitos, el biofluido diluido con un polisacárido de cadena larga (agregador celular) y PBS experimentó una mejor eliminación de eritrocitos, pero una menor recuperación de linfocitos que las muestras de biofluido diluidas en un medio de gradiente de densidad y un agregador celular. El biofluido diluido con PBS con alto contenido de sal (PBS de 400 mOsm) experimentó una mejor eliminación de eritrocitos, pero una menor recuperación de linfocitos en comparación con el biofluido diluido en el medio de gradiente de densidad y el agregador celular. Finalmente, el biofluido diluido en PBS isotónico experimentó una disminución del rendimiento en todas las métricas, en comparación con el biofluido diluido en el medio de gradiente de densidad y el agregador celular, y en general en comparación con las otras muestras experimentales.
En consecuencia, el pretratamiento del biofluido con un aditivo puede resultar en una mayor separación entre las células diana y las células no diana, en comparación con la separación acústica del biofluido solo.
Ejemplo 5: Comparación entre células diana: relación de separación de linfocitos y monocitos
El biofluido que comprende linfocitos y monocitos se hizo fluir a través de un canal de separación de microfluidos y se sometió a energía acústica. La relación de separación de linfocitos se calculó como se analizó antes. La relación de separación de monocitos se comparó con la relación de separación de linfocitos. Los resultados se muestran en el gráfico de la FIG. 12 Los datos sugieren que existe una separación diferencial entre monocitos y linfocitos. Los resultados son significativos porque otros procedimientos de separación, por ejemplo, la centrifugación, no separan los linfocitos de los monocitos. En consecuencia, los sistemas y procedimientos descritos en esta invención permiten la separación diferencial entre tipos de células, incluso entre diferentes clases de leucocitos.
Ejemplo 6: Comparación entre biofluidos: pureza de linfocitos y recuperación del producto de leucaféresis, capa leucocitaria y sangre total
Se realizó la separación acústica de linfocitos de muestras de biofluidos, generalmente como se describió antes. Las muestras de biofluidos incluyeron el producto de la leucaféresis, la capa leucocitaria de sangre y la sangre total. En general, el producto de la leucaféresis comprende la relación más alta de leucocitos a otras células, la capa leucocitaria de sangre comprende una relación de intervalo medio de leucocitos a otras células, y la sangre total comprende la relación más baja de leucocitos a otras células. En consecuencia, como se esperaba, la recuperación de linfocitos (porcentaje de linfocitos en el producto a linfocitos en la muestra de biofluido) y la pureza de los linfocitos (como una fracción de linfocitos a la concentración total de leucocitos) es mayor cuando el biofluido se selecciona como producto de leucoforesis, de los tres biofluidos de ejemplo.
Como se muestra en los resultados presentados en los gráficos de las FIG. 7 y 8, la recuperación de linfocitos del producto de leucoforesis, la capa leucocitaria y la sangre total es del 71 %, el 54 % y el 18 %, respectivamente. La pureza de los linfocitos en estas muestras fue alta, en el 93 %, el 83 % y el 39 %, respectivamente. Además, la separación proporcionó una reducción de eritrocitos (porcentaje de eritrocitos reducidos de la muestra de biofluido) de aproximadamente 94 %, dependiendo del objetivo de recuperación. En consecuencia, los sistemas y procedimientos para la separación de células, como se describe en esta invención, pueden recuperar y purificar eficazmente muestras de biofluidos de varias purezas con un procedimiento de separación acústica de primer paso. Los expertos en la materia deben apreciar que los parámetros y configuraciones descritos en esta invención son ejemplares y que los parámetros reales y/o las configuraciones dependerán de la aplicación específica en la que se utilicen los procedimientos y materiales descritos. Los expertos en la materia reconocerán, o podrán comprobar, solo con el uso de la experimentación de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en esta solicitud. Por ejemplo, los expertos en la materia pueden reconocer que el procedimiento, y los componentes del mismo, según la presente descripción pueden comprender además una red o sistemas o ser un componente de un sistema para la separación celular de microfluidos. Por lo tanto, debe entenderse que las realizaciones descritas en esta invención se presentan solo a modo de ejemplo y que, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y equivalentes a las mismas; las realizaciones descritas pueden practicarse de manera diferente a como se describe específicamente. Las etapas de los procedimientos descritos en esta invención pueden realizarse en el orden ilustrado o en órdenes alternativos y los procedimientos pueden incluir actos adicionales o alternativos o pueden realizarse omitiendo uno o más de los actos ilustrados.
Además, debe apreciarse que a los expertos en la materia se les ocurrirán fácilmente diversas alteraciones, modificaciones y mejoras. Se pretende que dichas alteraciones, modificaciones y mejoras sean parte de esta descripción. En otros casos, una instalación existente puede modificarse para utilizar o incorporar uno o más aspectos de los procedimientos y sistemas descritos en esta invención. Por consiguiente, en algunos casos, los sistemas pueden implicar la separación celular de microfluidos. En consecuencia, la descripción y las figuras anteriores son solo a modo de ejemplo. Además, las representaciones en las figuras no limitan las descripciones a las representaciones particularmente ilustradas.
La redacción y la terminología utilizadas en esta invención tienen fines descriptivos y no deberían ser interpretadas en forma taxativa. Como se usa en esta invención, el término "pluralidad" se refiere a dos o más elementos o componentes. Los términos "comprende", "incluye", "lleva", "tiene", "contiene" e "involucra", ya sea en la descripción escrita o en las reivindicaciones y similares, son términos abiertos, es decir, significan " incluyendo, pero no limitado a". Por consiguiente, el uso de dichos términos pretende abarcar los elementos enumerados a continuación y sus equivalentes, así como elementos adicionales. Únicamente las frases de transición "que consisten en" y "que consisten esencialmente en" son frases de transición cerradas o semicerradas, respectivamente, con respecto a las reivindicaciones. El uso de términos ordinales como "primero", "segundo", "tercero" y similares en las reivindicaciones para modificar un elemento de la reivindicación no implica en sí mismo ninguna prioridad, precedencia u orden de un elemento de la reivindicación sobre otro o el orden temporal en el que se realizan los actos de un procedimiento, pero se utilizan simplemente como etiquetas para distinguir un elemento de reivindicación que tiene un nombre determinado de otro elemento que tiene el mismo nombre (pero para el uso del término ordinal) a fin de distinguir los elementos de la reivindicación.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento in vitro para separar células diana (18) de células no diana (16, 20) en un biofluido, que comprende:
(a) alterar al menos uno de los siguientes: el tamaño de las células diana (18), el tamaño de las células no diana (16, 20), la compresibilidad del biofluido, la compresibilidad de las células diana (18), la compresibilidad de las células no diana (16, 20) y el potencial de agregación de las células no diana (16, 20); y alterar al menos una de la densidad del biofluido, la densidad de las células diana y la densidad de las células no diana mediante la introducción de un volumen predeterminado de al menos un aditivo al biofluido para producir un biofluido pretratado, el volumen predeterminado del al menos un aditivo siendo seleccionado para alterar o regular el biofluido para que tenga una densidad deseada;
(b) hacer fluir el biofluido pretratado en una entrada (10) de un canal de separación de microfluidos (28);
(c) aplicar energía acústica al biofluido pretratado dentro del canal de separación de microfluidos (28) para separar las células diana (18) de las células no diana (16, 20), de modo que las células diana (18) se acumulen dentro al menos una corriente primaria (32) a lo largo del canal de separación (28) y las células no diana (16, 20) se acumulan dentro de al menos una corriente secundaria (30) a lo largo del canal de separación (28);
(d) recolectar al menos una corriente primaria (32) que comprende las células diana (18); y
(e) opcionalmente recolectar por separado la al menos una corriente secundaria (30) que comprende las células no diana (16, 20).
2. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende seleccionar el al menos un aditivo de entre el grupo que consiste en un agregador celular, agua desionizada, un detergente, un tensoactivo, una solución para regular la salinidad del biofluido, una solución para regular la tonicidad del biofluido, una solución para regular la viscosidad del biofluido, una solución para regular la osmolaridad del biofluido, una solución para regular la concentración de iones del biofluido y combinaciones de los mismos.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, que comprende además:
(a) seleccionar el agregador celular de modo tal que sea un activador de plaquetas que comprenda trombina, colágeno de tipo II, adenosina difosfato o ristocetina;
(b) donde el agregador celular comprende un polisacárido de cadena larga, que opcionalmente tiene un peso molecular entre 100 y 500 kD; opcionalmente, un polisacárido de cadena larga está presente en una concentración de entre el 0,5 % (p/v) y el 25 % (p/v); o
(c) seleccionar el agregador celular de modo tal que sea una solución que comprenda anticuerpos que se unen y agregan células no diana (16, 20).
4. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende introducir al menos dos aditivos, que comprende un primer aditivo para alterar al menos uno de los siguientes: el tamaño de las células diana (18), el tamaño de las células no diana (16, 20), la compresibilidad del biofluido, la compresibilidad de las células diana (18), la compresibilidad de las células no diana (16, 20) y el potencial de agregación de las células no diana (16, 20); y un segundo aditivo para alterar al menos una de la densidad del biofluido, la densidad de las células diana (18) y la densidad de las células no diana (16, 20).
5. El procedimiento de la reivindicación 4, que comprende seleccionar el segundo aditivo de entre el grupo que consiste en un medio de gradiente de densidad, un aditivo de densidad y combinaciones de los mismos; que comprende opcionalmente seleccionar el aditivo de densidad de modo tal que sea un compuesto yodado no iónico e introducir el volumen predeterminado del aditivo de densidad para regular la densidad del biofluido a una densidad de entre 1,00 g/ml y 1,15 g/ml; opcionalmente para regular la densidad del biofluido a una densidad de entre 1,04 g/ml a 1,07 g/ml.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende:
(a) seleccionar el biofluido de entre la capa leucocitaria de sangre, el producto de leucaféresis, la sangre periférica, la sangre total, el líquido linfático, el líquido sinovial, el líquido cefalorraquídeo, la médula ósea, el líquido de ascitis y combinaciones o subcomponentes de los mismos; o
(b) seleccionar las células diana (18) de modo tal que sean leucocitos seleccionados de entre el grupo que consiste en células mononucleares, linfocitos, monocitos, granulocitos, agranulocitos, macrófagos, células T, células B, células NK, subclases de las mismas y combinaciones de las mismas.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además dosificar la al menos una corriente primaria (32) con un reactivo para producir una suspensión dosificada, el reactivo seleccionado de entre un antígeno o reactivo de activación configurado para inducir bioquímicamente la activación celular; y seleccionar las células diana (18) de modo tal que sean linfocitos y separar los linfocitos activados de los linfocitos no activados en la suspensión dosificada.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, donde seleccionar las células diana (18) de modo tal que sean linfocitos y separar los linfocitos activados de los linfocitos no activados en la suspensión dosificada comprende: (a) hacer fluir la suspensión dosificada en una entrada (10) de un segundo canal de separación de microfluidos (28); y
(b) aplicar energía acústica al segundo canal de separación de microfluidos (28), de modo que los linfocitos activados se acumulen dentro de al menos una corriente primaria (32) a lo largo del segundo canal de separación (28) y los linfocitos no activados se acumulen dentro de al menos una corriente secundaria (30) a lo largo del segundo canal de separación (28).
9. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende al menos una de los siguientes:
(a) hacer fluir un segundo fluido (42) adyacente al biofluido (40) hacia una entrada (46) del canal de separación de microfluidos (28), de manera que el biofluido (40) y el segundo fluido (42) fluyan en un flujo sustancialmente paralelo, sustancialmente laminar; o
(b) hacer fluir el biofluido pretratado (40) en la entrada (44, 48) del canal de separación de microfluidos (28) a un caudal de entre 0,03 ml/min a 0,5 ml/min.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende introducir al menos un aditivo para regular el potencial de agregación de las células no diana, comprendiendo las células no diana eritrocitos; o plaquetas.
11. El procedimiento de la reivindicación 1, donde al menos un aditivo es fisiológicamente aceptable, y el procedimiento comprende introducir una cantidad inyectable segura del aditivo fisiológicamente aceptable.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el volumen predeterminado del aditivo se selecciona para alterar o regular el biofluido para que tenga la densidad deseada, la concentración de células diana (18) o la concentración de células no diana (16, 20), opcionalmente, donde el volumen predeterminado del aditivo se selecciona para permitir que las células diana (18) o las células no diana (16, 20) se acerquen a una flotabilidad acústica neutra en el biofluido.
13. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el aditivo es además capaz de alterar o regular al menos uno de los siguientes: los hematocritos (% de HCT) del biofluido, la concentración de células diana (18) o la concentración de células no diana (16, 20), y opcionalmente donde se selecciona un volumen predeterminado del al menos un aditivo para alterar o regular el % de HCT del biofluido de modo tal que sea menor que alrededor del 10 %.
14. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además medir al menos uno de los siguientes: la densidad del biofluido, los hematocritos (% de HCT) del biofluido, la concentración de células diana (18) en el biofluido y la concentración de células no diana (16, 20) en el biofluido, y seleccionar de un volumen predeterminado del al menos un aditivo en respuesta a la medición.
15. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el biofluido es una muestra de sangre o un producto sanguíneo y las células diana son una clase de leucocitos seleccionados de entre el grupo que consiste en linfocitos, monocitos, granulocitos, agranulocitos y macrófagos; opcionalmente donde:
(a) las células diana son una clase de linfocitos seleccionados de entre células T, células B y células NK, opcionalmente una clase de células T seleccionadas de entre células CD4+, células CD8+, células Th, Tcm, Tfh; (b) las células diana son linfocitos o una subclase de los mismos, y las células no diana comprenden eritrocitos; o (c) el biofluido es un producto de leucaféresis.
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