ES2908978T3 - Nuevas entidades químicas simples y métodos para la administración de oligonucleótidos - Google Patents

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Anthony W Shaw
David M Tellers
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Abstract

Una composición modular que comprende 1) un siRNA; 2) uno o más conectores, que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de la Tabla 2, donde los conectores están unidos a la hebra guía del siRNA en la posición 2' de los anillos de ribosa excluyendo las posiciones terminales 3' y/o 5' de la hebra guía, o donde los conectores están unidos a la hebra retardada del siRNA en la posición 2' de los anillos de ribosa excluyendo las posiciones terminales 3' y/o 5' de la hebra retardada; y 3) uno o más péptidos, que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de SEQ ID NO: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los conectores.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevas entidades químicas simples y métodos para la administración de oligonucleótidos
La presente invención se refiere a composiciones modulares que comprenden un siRNA y uno o más péptidos que están unidos al siRNA a través de uno o más conectores.
Los esfuerzos científicos centrados en la administración sistémica de oligonucleótidos con fines terapéuticos son continuos. Tres enfoques destacados para la administración de oligonucleótidos incluyen 1) encapsulación en nanopartículas lipídicas (LNP), 2) conjugación con polímeros y 3) conjugación química simple. La conjugación química simple normalmente emplea un ligando direccionador o un lípido o un grupo solubilizante o un péptido endosomolítico o un péptido de penetración celular y/o una combinación de dos o los cuatro unidos a un oligonucleótido. Los conectores pueden estar presentes en el conjugado así como en otras funcionalidades. Se conocen conjugados químicos simples y la unión del oligonucleótido se produce en el extremo 5' o 3' del oligonucleótido, en ambos extremos, o internamente. Véase WO2005/041859; WO2008/036825, WO2009/126933, US2010/0076056 y WO2010/039548.
En este contexto, Gaglione y Messere (Gaglione, M. y Messere, A.; Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 10; 2010; págs. 578-595) describe siRNA modificados químicamente con perfiles de aplicación mejorados. Además, WO 2010/039548 A2 describe compuestos y procesos para conjugar ligandos con oligonucleótidos, así como conjugados respectivos y usos de los mismos. Es más, WO 2007/069068 A2 describe conjugados de péptido de penetración celular-ácido nucleico y usos de los mismos. Más aún, WO 2008/109105 A2 describe composiciones de RNA bicatenario conectado, modificado químicamente, y usos de las mismas. Finalmente, WO 2004/090105 A2 describe métodos y composiciones para realizar interferencia de RNA, usando siRNA estabilizados.
Una cantidad considerable de evidencia bibliográfica respalda la hipótesis de que los principales obstáculos para la administración de oligonucleótidos son la captación celular y el escape endosómico. Para mejorar la eficacia de la administración, pueden ser necesarios péptidos promotores de la captación y/o péptidos endosomolíticos y/o grupos protectores de carga en una topología muy condensada. En este sentido, las plataformas multifuncionales y las modificaciones internas ofrecen oportunidades únicas para cumplir con este requisito.
La presente invención se refiere a los siguientes apartados:
1. Una composición modular que comprende
1) un siRNA;
2) uno o más conectores, que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de la Tabla 2, donde los conectores están unidos a la hebra guía del siRNA en la posición 2' de los anillos de ribosa excluyendo las posiciones terminales 3' y/o 5 ' de la hebra guía, o donde los conectores están unidos a la hebra retardada del siRNA en la posición 2' de los anillos de ribosa excluyendo las posiciones terminales 3' y/o 5' de la hebra retardada; y 3) uno o más péptidos, que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de SEQ ID NO: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los conectores.
2. La composición modular según el apartado 1 que comprende además colesterol, en la que el colesterol está unido al siRNA en la posición 2' de los anillos de ribosa o en la posición 3' del siRNA.
3. La composición modular según el apartado 1 que comprende además colesterol, en la que el colesterol está unido al siRNA en la posición 2' de los anillos de ribosa y/o en las posiciones terminales 3' y/o 5' del siRNA. Las figuras muestran:
Fig. 1 Niveles de mRNA de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto C4-1.
Fig. 2 Niveles de mRNA de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto C4-5.
Fig. 3 Niveles de mRNA de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto C4-8.
Fig. 4 Niveles de mRNA de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto C4-10.
Fig. 5 Niveles de mRNA de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto C6-1.
Fig. 6 Niveles de mRNA de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto C6-2.
Fig. 7 Niveles de mRNA de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto C7-1.
Fig. 8 Niveles de mRNA de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto C8-1.
Fig. 9 Niveles de mRNA de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto C10-7.
Fig. 10 Niveles de mRNA de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto C10-8.
Fig. 11 Niveles de mRNA de SSB en retina de rata.
Para ilustrar la invención a través de representaciones gráficas, aquí se muestra una composición modular que comprende un oligonucleótido ([O1][O2][O3].....[On]), uno o más conectores (L), uno o más péptidos (P) y uno o más lípidos opcionales (X), uno o más ligandos direccionadores (X) y/o uno o más grupos solubilizantes (X).
En una realización, la composición modular puede tener la fórmula:
P-L-[O1][O2][O3]......[On] -L-P.
En otra realización, la composición modular puede tener la fórmula:
P-L-[O1][O2][O3].... [On] -X.
Ejemplos de composiciones modulares son:
Hebra retardada
Figure imgf000003_0001
Hebra guía
Hebra retardada
Figure imgf000003_0002
Hebra guía
Hebra retardada
Figure imgf000003_0003
Hebra guía
Hebra retardada
Figure imgf000003_0004
Hebra guía
Otra representación de una composición modular es:
Hebra retardada
Figure imgf000004_0001
Hebra guía
Estos ejemplos son orientativos. Un experto en la técnica reconocerá que existe una variedad de permutaciones para colocar los componentes deseados en la hebra guía y la hebra retardada.
Se puede unir al oligonucleótido cualquier número de conectores y, por lo tanto, cualquier número de péptidos. Un intervalo preferido de número de conectores es de 1 a 8. Un intervalo más preferido de número de conectores es de 1 a 4. Un intervalo preferido de número de péptidos es de 1 a 8. Un intervalo más preferido de número de péptidos es de 1 a 4.
Las dos hebras contienen n y n' nucleótidos respectivamente. Los números n y n' pueden ser iguales o diferentes. Los números son números enteros que van del 8 al 50. Preferiblemente, los números son números enteros que van del 12 al 28. Más preferiblemente, los números son números enteros que van del 19 al 21.
Como ejemplo, cada nucleótido [On] o [On], que contiene un conector (L-P y/o L-X) tiene estructuras genéricas que se muestran en la siguiente representación gráfica:
Figure imgf000004_0002
Para cada nucleótido, 1) E = oxígeno (O) o azufre (S); 2) Base = A, U, G o C, que puede estar modificada o no modificada; 3) D es el punto de conexión entre el anillo de ribosa y el conector L, D = oxígeno (O), azufre (S, S(O) o S(O)2), nitrógeno (N-R, donde R = H, alquilo, L-P o L-X), carbono (CH-R, donde R = H, alquilo, L-P o L-X), o fósforo (P(O)R o P(O)(OR), donde R = alquilo, L-P o L-X). Preferiblemente, D = oxígeno (O).
Los dos nucleótidos [On-1] y [On] o [On-1] y [On] están conectados a través de enlaces fosfodiéster o tio-fosfodiéster.
Cuando el oligonucleótido es un oligonucleótido bicatenario, el "P-L" y el lípido, el ligando direccionador y/o el grupo solubilizante pueden ubicarse en la misma hebra o en hebras diferentes.
En algunas realizaciones, el "P-L" y el lípido, el ligando direccionador y/o el grupo solubilizante están en la misma hebra.
En algunas realizaciones, el "P-L" y el lípido, el ligando direccionador y/o el grupo solubilizante están en la hebra retardada.
En algunas realizaciones, el "P-L" y el lípido, el ligando direccionador y/o el grupo solubilizante están en la hebra guía.
En algunas realizaciones, el "P-L" y el lípido, el ligando direccionador y/o el grupo solubilizante están ubicados en hebras diferentes.
En algunas realizaciones, el "P-L" está en la hebra retardada mientras que el lípido, el ligando direccionador y/o el grupo solubilizante están en la hebra guía.
En algunas realizaciones, el "P-L" y el lípido, el ligando direccionador y/o el grupo solubilizante están en hebras diferentes pero en el mismo extremo terminal del oligonucleótido bicatenario.
En algunas realizaciones, el "P-L" y el lípido, el ligando direccionador y/o el grupo solubilizante están en hebras diferentes y en los extremos terminales opuestos del oligonucleótido bicatenario.
En algunas realizaciones, se puede usar un "P-L" adicional de naturaleza idéntica o diferente en lugar del lípido, el ligando direccionador y/o el grupo solubilizante indicado en las realizaciones anteriores.
En algunas realizaciones, el "P-L" se puede ubicar en múltiples extremos terminales de la hebra retardada o de la hebra guía y el lípido, el ligando de direccionamiento y/o el grupo solubilizante se pueden ubicar en los extremos terminales restantes de las hebras retardada y guía.
En algunas realizaciones, un "P-L" y dos o más lípidos, ligandos direccionadores y/o grupos solubilizantes están presentes en el oligonucleótido.
En algunas realizaciones, dos o más "P-L" y dos o más lípidos, ligandos direccionadores y/o grupos solubilizantes están presentes en el oligonucleótido.
En algunas realizaciones, cuando el oligonucleótido es un oligonucleótido bicatenario y están presentes una pluralidad de componentes "P-L" y/o lípidos, ligandos direccionadores y/o grupos solubilizantes, tal pluralidad de componentes "P-L" y/o lípidos, ligandos direccionadores y/o grupos solubilizantes pueden estar todos presentes en una hebra o en ambas hebras del oligonucleótido bicatenario.
Cuando están presentes una pluralidad de componentes "P-L" y/o lípidos, ligandos direccionadores y/o grupos solubilizantes, todos pueden ser iguales o diferentes.
En algunas realizaciones, los "P-L" están solo en los nucleótidos internos (es decir, excluyendo los extremos 3' y 5' terminales del oligonucleótido).
En el presente documento se describe un método para administrar un oligonucleótido a una célula. El método incluye (a) proporcionar u obtener una composición modular de la invención; (b) poner en contacto una célula con la composición modular; y (c) permitir que la célula incorpore la composición modular.
El método se puede realizar in vitro, ex vivo o in vivo, por ejemplo, para tratar a un sujeto identificado como necesitado de un oligonucleótido, por ejemplo, un ser humano, que necesita tener la expresión de uno o más genes, por ejemplo, un gen relacionado con un trastorno, regulada a la baja o silenciada.
En un aspecto, aquí se describe un método para inhibir la expresión de uno o más genes. El método comprende poner en contacto una o más células con una cantidad eficaz de un oligonucleótido, en el que la cantidad eficaz es una cantidad que suprime la expresión del uno o más genes. El método se puede realizar in vitro, ex vivo o in vivo.
Los métodos y composiciones descritos en este documento, por ejemplo, la composición modular descrita en este documento, se pueden usar con cualesquier oligonucleótidos conocidos en la técnica. Además, los métodos y composiciones descritos en el presente documento se pueden usar para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno conocido en la técnica y para el tratamiento de cualquier sujeto, por ejemplo, cualquier animal, cualquier mamífero, como un ser humano. Un experto normal en la técnica también reconocerá que los métodos y composiciones descritos en el presente documento pueden usarse para el tratamiento de cualquier enfermedad que se beneficiaría de la regulación a la baja o silenciamiento de uno o más genes.
Los métodos y composiciones descritos en el presente documento, por ejemplo, la composición modular descrita en el presente documento, se pueden usar con cualquier dosificación y/o formulación descrita en el presente documento, o cualquier dosificación o formulación conocida en la técnica. Además de las vías de administración descritas en el presente documento, un experto en la técnica también apreciará que se pueden usar otras vías de administración para administrar la composición modular de la invención.
Oligonucleótido
Un "oligonucleótido", como se usa en el presente documento, es un RNA, PNA o DNA policatenario, bicatenario o monocatenario, no modificado o modificado. Los ejemplos de RNA modificados incluyen aquellos que tienen mayor resistencia a la degradación por nucleasas que los RNA no modificados. Otros ejemplos incluyen aquellos que tienen una modificación de azúcar en 2', una modificación de base, una modificación en un saliente monocatenario, por ejemplo, un saliente monocatenario en 3' o, particularmente si es monocatenario, una modificación en 5' que incluye uno o más fosfatos. grupos o uno o más análogos de un grupo fosfato. Se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de los oligonucleótidos en WO2009/126933.
En una realización, un oligonucleótido es un miRNA o siRNA antisentido. El oligonucleótido preferido es un siRNA. Otro oligonucleótido preferido es la hebra retardada de un siRNA. Otro oligonucleótido preferido es la hebra guía de un siRNA. siRNA
siRNA dirige el silenciamiento específico de secuencia de mRNA a través de un proceso conocido como interferencia por RNA (RNAi). El proceso ocurre en una amplia variedad de organismos, incluidos los mamíferos y otros vertebrados. Se conocen métodos para preparar y administrar siRNA y su uso para inactivar específicamente la función génica. siRNA incluye siRNA modificado y no modificado. Se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de siRNA en WO2009/126933.
Se conocen varios ejemplos de rutas de administración que pueden usarse para administrar siRNA a un sujeto. Además, el siRNA se puede formular de acuerdo con cualquier ejemplo de método conocido en la técnica. Se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de la formulación y administración de siRNA en WO2009/126933.
Péptidos
Para los fármacos macromoleculares y las moléculas de fármacos hidrofílicos, que no pueden cruzar fácilmente las membranas de la bicapa, se cree que el atrapamiento en los compartimentos endosómicos/lisosómicos de la célula es el mayor obstáculo para la entrega eficaz en su sitio de acción. Sin desear limitarse a ninguna teoría, se cree que el uso de péptidos facilitará el escape de oligonucleótidos de estos compartimentos endosómicos/lisosómicos o la traslocación de oligonucleótidos a través de una membrana celular y su liberación en el compartimento citosólico. En ciertas realizaciones, los péptidos pueden ser péptidos policatiónicos, anfifílicos o polianiónicos o peptidomiméticos que muestran actividad de membrana y/o fusogenicidad dependiente del pH. Un peptidomimético puede ser una pequeña cadena similar a una proteína diseñada para mimetizar un péptido.
En algunas realizaciones, el péptido es un agente de penetración celular, preferiblemente un agente de penetración celular helicoidal. Estos péptidos se denominan comúnmente péptidos de penetración celular. Véase, por ejemplo, "Handbook of Cell Penetrating Peptides" Ed. Langel, U.; 2007, CRC Press, Boca Raton, Florida. Preferiblemente, el componente es anfipático. El agente helicoidal es preferiblemente un agente alfa-helicoidal, que preferiblemente tiene una fase lipófila y otra lipófoba. Un agente de penetración celular puede ser, por ejemplo, un péptido de penetración celular, un péptido catiónico, un péptido anfipático o un péptido hidrofóbico, p.ej. que consiste principalmente en Tyr, Trp y Phe, un péptido dendrímero, un péptido restringido o un péptido reticulado. Los ejemplos de péptidos de penetración celular incluyen Tat, Penetratin y MPG. Para la presente invención, se cree que los péptidos que penetran en las células pueden ser un péptido de "entrega", que puede transportar moléculas polares grandes que incluyen péptidos, oligonucleótidos y proteínas a través de las membranas celulares. Los péptidos de penetración celular pueden ser lineales o cíclicos, e incluyen D-aminoácidos, secuencias "retro-inversas", enlaces no peptídicos o pseudopeptídicos, miméticos de peptidilo. Además, los péptidos y los miméticos de péptidos pueden estar modificados, p.ej. glicosilados, pegilados o metilados. Se pueden encontrar ejemplos y una descripción más detallada de los péptidos en WO2009/126933.
Los péptidos pueden conjugarse en cualquiera de los extremos o en ambos extremos mediante la adición de una cisteína u otro resto que contiene tiol al extremo C- o N-terminal. Cuando no están funcionalizados en el extremo N-terminal, los péptidos pueden rematarse con un grupo acetilo o pueden rematarse con un lípido, un PEG o un resto direccionador. Cuando el extremo C-terminal de los péptidos no está conjugado o funcionalizado, se puede rematar como una amida o se puede rematar con un lípido, un PEG o un resto direccionador.
Los péptidos descritos en este documento son:
HFHHFFHHFFHFFHHFFHHF (SEQ ID NO: 1);
WHHWWWHWWHHWWHHW (SEQ ID NO: 2);
HWHHLLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 3);
HLHHWLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 4);
HLHHLWHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 5);
HLHHLLHHLWHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 6);
HLHHLLHHLLHWLHHLLHHL (SEQ ID NO: 7);
HLHHLLHHLLHLLHHWLHHL (SEQ ID NO: 8);
HLHHLLHHLLHLLHHLWHHL (SEQ ID NO: 9);
HPHHLLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 10);
HLHHPLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 11);
HLHHLPHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 12);
HLHHLLHHLPHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 13);
HLHHLLHHLLHLLHHLPHHL (SEQ ID NO: 14);
HLHHLLHHLLHLLHHLLHHP (SEQ ID NO: 15);
ELEELLEELLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 16);
ELHHLLHELLHLLHELLHHL (SEQ ID NO: 17);
GLWRALWRLLRSLWRLLWRAC (SEQ ID NO: 18);
GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 19);
HLHHLLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 20);
HWHHWWHHWWWHWWHHWWHHW (SEQ ID NO: 21);
HLHHLLHHWLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 22);
HLHHLLHHLLHLWHHLLHHL (SEQ ID NO: 23);
HLHHLLHHLLHLLHHLLHHW (SEQ ID NO: 24);
HHHHHHHHHHLLLLLLLLLLLL (SEQ ID NO: 25);
HHHHHHHLLLLLLL (SEQ ID NO: 26);
LTTLLTLLTTLLTTL (SEQ ID NO: 27);
KLLKLLKLWLKLLKLLLKLL (SEQ ID NO: 28);
LHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 29);
FLGGIISFFKRLF (SEQ ID NO: 30);
FIGGIISFIKKLF (SEQ ID NO: 31);
FIGGIISLIKKLF (SEQ ID NO: 32);
HLLHLLLHLWLHLLHLLLHLL (SEQ ID NO: 33);
GIGGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (SEQ ID NO: 34);
RQIKIWFQNRRMKWKKGG (SEQ ID NO: 35);
RKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 36);
GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV (SEQ ID NO: 37);
GGGARKKAAKAARKKAAKAARKKAAKAARKKAAKAAK (SEQ ID NO: 38); GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 39);
RRRRRRRRR (SEQ ID NO: 40);
WEAKLAKALAKALAKHILAKALAKALKACEA (SEQ ID NO: 41); WEAALAEALAEALAEHLAEALAEAEALEALAA (SEQ ID NO: 42);
D(NHC12H25)NleKNleKNleHNleKNleHNle (SEQ ID NO: 43);
KLLKLLLKLWLKLLKLLLKLL (SEQ ID NO: 44);
GLFEAIAGFIENGWEGMIDGWYG (SEQ ID NO: 45);
GLFHAIAAHFIHGGWHGLIHGWYG (SEQ ID NO: 46);
GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGWYG (SEQ ID NO: 47);
GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG (SEQ ID NO: 48);
GLFKAIAKFIKGGWKGLIKGWYG (SEQ ID NO: 49);
GLFEAIAGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 50);
GLFEAIAGFIENGWEGMIDGWYGRQIKIWFQNRRMKWKKGG (SEQ ID NO: 51);
GLFHAIAAHFIHGGWHGLIHGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 52);
GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 53);
GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 54);
GLFKAIAKFIKGGWKGLIKGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 55);
GFFALIPKIISSPLFKTLLSAVGSALSSSGEQE (SEQ ID NO: 56);
LHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHLGGGRKKRRQRRRRPPQ (SEQ ID NO: 57);
RKKRRQRRRPPQGGGLHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 58); y
LIRLWSHIHIWFQWRRLKWKKK (SEQ ID NO: 59);
donde los péptidos se conjugan opcionalmente en cualquiera de los extremos mediante la adición de una cisteína u otro resto que contiene tiol al extremo C- o N-terminal; o cuando no están funcionalizados en el extremo N-terminal, los péptidos opcionalmente se rematan con un grupo acetilo, lípido, peg o un resto direccionador; o cuando no están funcionalizados en el extremo C-terminal, los péptidos opcionalmente se rematan con una amida, lípido, peg o un resto direccionador.
Los péptidos (P) preferidos son:
GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 19);
KLLKLLLKLWLKLLKLLLKLL (SEQ ID NO: 28);
LHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 29);
HLLHLLLHLWLHLLHLLLHLL (SEQ ID NO: 33);
RKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 36);
RQIKIWFQNRRMKWKKGG (SEQ ID NO: 40);
GLFEAIAGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 50);
GLFEAIAGFIENGWEGMIDGWYGRQIKIWFQNRRMKWKKGG (SEQ ID NO: 51);
GLFHAIAAHFIHGGWHGLIHGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 52);
GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 53);
GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 54);
GLFKAIAKFIKGGWKGLIKGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 55);
GFFALIPKIISSPLFKTLLSAVGSALSSSGEQE (SEQ ID NO: 56);
LHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHLGGGRKKRRQRRRRPPQ (SEQ ID NO: 57);
RKKRRQRRRPPQGGGLHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 58); y
LIRLWSHIHIWFQWRRLKWKKK (SEQ ID NO: 59);
donde los péptidos se conjugan opcionalmente en cualquiera de los extremos mediante la adición de una cisteína u otro resto que contiene tiol al extremo C- o N-terminal; o cuando no están funcionalizados en el extremo N-terminal, los péptidos opcionalmente se rematan con un grupo acetilo, lípido, peg o un resto direccionador; o cuando no están funcionalizados en el extremo C-terminal, los péptidos opcionalmente se rematan con una amida, lípido, peg o un resto direccionador.
Conectores
Los enlaces covalentes entre el péptido y el oligonucleótido de la composición modular descrita en el presente documento están mediados por un conector. Este conector puede ser escindible o no escindible, según la aplicación. En ciertas realizaciones, se puede usar un conector escindible para liberar el oligonucleótido después del transporte desde el endosoma al citoplasma. La naturaleza prevista de la interacción por conjugación o acoplamiento, o el efecto biológico deseado, determinará la elección del grupo conector. Los grupos conectores pueden combinarse o ramificarse para proporcionar arquitecturas más complejas. Se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de los conectores en WO2009/126933.
Los conectores descritos en este documento se muestran en la Tabla 1: Tabla 1
Figure imgf000010_0001
n = O a 750
Los conectores comerciales están disponibles a partir de varios proveedores tales como Pierce o Quanta Biodesign que incluyen combinaciones de dichos conectores. Los conectores también se pueden combinar para producir arquitecturas ramificadas más complejas que acomodan de 1 a 8 péptidos, como se ilustra en uno de estos ejemplos a continuación:
Figure imgf000011_0001
Ligandos direccionadores
Las composiciones modulares descritas en el presente documento pueden comprender un ligando direccionador. En algunas realizaciones, este ligando direccionador puede dirigir la composición modular a una célula particular. Por ejemplo, el ligando direccionador puede unirse de forma específica o no específica con una molécula en la superficie de una célula objetivo. El resto direccionador puede ser una molécula con una afinidad específica por una célula objetivo. Los restos direccionadores pueden incluir anticuerpos dirigidos contra una proteína que se encuentra en la superficie de una célula diana, o el ligando o una porción de unión al receptor de un ligando para una molécula que se encuentra en la superficie de una célula diana. Se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de ligandos direccionadores en WO2009/126933.
Los ligandos direccionadores se seleccionan del grupo que consiste en un anticuerpo, una porción de unión a ligando de un receptor, un ligando para un receptor, un aptámero, D-galactosa, N-acetil-D-galactosa (GalNAc), N-acitil-D-galactosa multivalente, D-manosa, colesterol, un ácido graso, una lipoproteína, folato, tirotropina, melanotropina, proteína surfactante A, mucina, carbohidrato, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, manosa multivalente, fructosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, transferina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, una fracción lipófila que mejora la unión a proteínas plasmáticas, un esteroide, ácido biliar, vitamina B12, biotina, un péptido RGD, un mimético del péptido RGD, ibuprofeno, naproxeno, aspirina, folato y análogos y derivados de los mismos.
Los ligandos direccionadores preferidos se seleccionan del grupo que consiste en un péptido RGD, un mimético del péptido RGD, D-galactosa, N-acetil-D-galactosamina (GalNAc), GalNAc2 y GalNAc3, colesterol, folato, y análogos y derivados de los mismos.
Lípidos
Los restos lipófilos, como el colesterol o los ácidos grasos, cuando se unen a moléculas altamente hidrófilas, como los ácidos nucleicos, pueden mejorar sustancialmente la unión a proteínas plasmáticas y, en consecuencia, la semivida en circulación. Además, los grupos lipofílicos pueden aumentar la captación celular. Por ejemplo, los lípidos pueden unirse a ciertas proteínas plasmáticas, como las lipoproteínas, que, en consecuencia, se ha demostrado que aumentan la captación en tejidos específicos que expresan los receptores de lipoproteínas correspondientes (p. ej., el receptor de LDL o el receptor eliminador SR-B1). Los conjugados lipofílicos también se pueden considerar como un enfoque de administración dirigida y su tráfico intracelular podría mejorarse potencialmente mediante la combinación con agentes endosomolíticos.
Ejemplos de restos lipofílicos que mejoran la unión a proteínas plasmáticas incluyen, entre otros, esteróles, colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocolico, dialquilglicéridos, diacilglicérido, fosfolípidos, esfingolípidos, ácido adamantano acético, ácido 1-pirenobutírico, dihidrotestosterona, 1,3-bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo, fenoxazina, aspirina, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E y biotina, etc. Se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de los lípidos en WO2009/126933.
Ejemplos de lípidos incluyen:
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El lípido preferido es el colesterol.
Agentes Solubilizantes
La composición modular puede comprender uno o más restos/ligandos que pueden mejorar la solubilidad acuosa, la semivida en circulación y/o la captación celular. Estos pueden incluir sustancias naturales, como una proteína (p. ej., albúmina sérica humana (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL) o globulina); o un carbohidrato (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico). Estos restos también pueden ser una molécula recombinante o sintética, como un polímero sintético o poliaminoácidos sintéticos. Los ejemplos incluyen polilisina (PLL), poli(ácido L-aspártico), poli(ácido L-glutámico), copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactida-co-glicolida), copolímero de divinil éter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (p Eg , por ejemplo, PEG-0.5K, PEG-2K, PEG-5K, PEG-10K, PEG-12K, PEG-15K, PEG-20K, PEG-40K), metil-PEG (mPEG), [mPEG]2 , poli(alcohol vinílico) (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida, o polifosfazina. Se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de los agentes solubilizantes en WO2009/126933.
El grupo solubilizante preferido es PEG de 0,5K a 30K.
Método de tratamiento
En el presente documento se describe un método para tratar a un sujeto en riesgo o afectado por una enfermedad que puede beneficiarse de la administración de la composición modular de la invención. El método comprende administrar la composición modular de la invención a un sujeto que lo necesita, tratando así al sujeto. El oligonucleótido que se administra dependerá de la enfermedad que se ha de tratar. Por ejemplo, los conjugados de la presente invención son útiles para el tratamiento del cáncer. Véase WO2009/126933 para obtener detalles adicionales sobre los métodos de tratamiento para indicaciones específicas.
Formulación
Existen numerosos métodos para preparar conjugados de compuestos de oligonucleótidos. Los expertos en la materia estarán familiarizados con esas técnicas. Una referencia útil para tales reacciones es Bioconjugate Techniques, Hermanson, G.T., Academic Press, San Diego, CA, 1996. Otras referencias incluyen WO2005/041859; WO2008/036825 y WO2009/126933.
Ejemplos
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como una limitación adicional. Los siRNA descritos en el presente documento se diseñaron para dirigirse al gen SSB expresado de forma ubicua (antígeno B del síndrome de Sjogren; NM_009278.4).
La síntesis de oligonucleótidos es bien conocida en la técnica. (Véanse las solicitudes de patentes de EE. UU.: US 2006/0083780, US 2006/0240554, US 2008/0020058, US 2009/0263407 y US 2009/0285881 y solicitudes de patente PCT: WO 2009/086558, WO2009/127060, WO2009/132131, WO2010/042877, WO2010/054384, WO2010/054401, WO2010/054405 y WO2010/054406). Los siRNA descritos y utilizados en los Ejemplos se sintetizaron mediante procedimientos estándar en fase sólida.
Los grupos conectores pueden estar conectados a la(s) hebra(s) de oligonucleótidos en un punto de unión de enlace (LAP, por sus siglas en inglés) y pueden incluir cualquier resto que contiene carbono, en algunas realizaciones que tienen al menos un átomo de oxígeno, al menos un átomo de fósforo y/o al menos un átomo de nitrógeno. En algunas realizaciones, el átomo de fósforo forma parte de un grupo fosfato o fosforotioato terminal en el grupo conector, que puede servir como punto de conexión para la hebra de oligonucleótidos. En determinadas realizaciones, el átomo de nitrógeno forma parte de un grupo terminal éter, éster, amino o amido (NHC(O)-) en el grupo conector, que puede servir como punto de conexión para los conectores de interés, la unidad endosomolítica, el péptido de penetración celular, el grupo solubilizante, el lípido, el grupo direccionador o conectores adicionales de interés. Estos grupos de conectores terminales incluyen, pero no se limitan a, un resto hexilo C6, hidroxi secundario C5, tiol C3 o resto tiol C6. Un ejemplo de las secuencias de RNA descritas a continuación es hexilo C6: [(CH2)6 NH2].
Ejemplo 1
A una solución de éster de NHS L-2 (100,0 mg, 0,320 mmol) en 0,5 ml de DCE anhidro se añadió azidoamina L-1 (253,0 mg, 0,480 mmol) en 0,5 ml de DCE anhidro, seguido de la adición de 1,5 eq. de trietilamina. La solución resultante se agitó durante 1 h a temperatura ambiente y la mezcla de reacción se cargó en una columna de sílice, que se eluyó con MeOH/DCM = 0/100 a 10/90 durante 25 min. La fracción recolectada de L-3 se sometió a análisis LC-MS y el resultado indicó que el producto tenía una pureza >95 %.
Siguiendo procedimientos análogos, se prepararon azido disulfuros L-4 a L-6 con una pureza por HPLC >95%, L-7 se preparó a partir de éster de SPDP-PEG-NHS polidisperso.
Ejemplo 2
El oligonucleótido bruto R-1, 15 mg, se trató con azido-peg9-SPDP L-3 (25,3 mg, 0,035 mmol) y CuBrMe2S (0,760 mg, 3,70 gmol) en 3 mL de DMA/Agua=3/1. La mezcla de reacción resultante se agitó durante 48 h a temperatura ambiente, seguido de la adición de 2,0 ml de NH4 F al 40 %/agua =1/1. La mezcla bifásica se agitó a 65 °C durante 1 h, luego se purificó con cartuchos C18 para dar un sólido blanco bruto R-2 ~ 5 mg.
Siguiendo procedimientos análogos, se prepararon los disulfuros de RNA R-3 - R-11 respectivamente.
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Figure imgf000016_0002
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Ejemplo 3
El oligonucleótido bruto R-12, 50 mg, se trató con azido-peg9-SPDP L-3 (40,0 mg, 0,055 mmol) y CuBr-Me2S (2,50 mg, 12 gmol) en 4 mL de DMA/Agua=3/1. La mezcla de reacción resultante se agitó durante 48 h a temperatura ambiente, seguido de la adición de 2,0 ml de NH4 F al 40 %/agua=1/1. La mezcla bifásica se agitó a 65 °C durante 1 h, luego se purificó con cartuchos C18 para dar un sólido blanco bruto R-13 ~ 15 mg.
Siguiendo procedimientos análogos, se prepararon los disulfuros de RNA R-14 - R-18 respectivamente.
Figure imgf000019_0001
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Figure imgf000020_0002
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Ejemplo 4
El compuesto R-2 (1,50 mg, 0,211 pmol) en 400 pl de formamida/tampón Tris de pH=6,8 =3/1 se trató con el péptido SEQ ID NO: 19 (1,724 mg, 0,423 pmol) en 400 pl del mismo tampón y la mezcla de reacción resultante se agitó durante 1 h. La reacción se diluyó mediante la adición de formamida/tampón Tris de pH=6,8=3/1 hasta un volumen total de 2,5 ml y se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico fuerte en una columna Resource Q (25-75% B en A, A: formamida/H2O=1/1, 20 mmol Tris-HCl, pH=7,4, B: formamida/H2O=1/1, 20 mmol Tris-HCl, 400 mmol NaClO4, pH=7,4). Las fracciones de producto combinadas se diluyeron con agua y se dializaron por centrifugación 4 veces frente a agua con una membrana de corte de peso molecular 10.000. El dialito se liofilizó para proporcionar R-19 como un sólido blanco, masa = 11063.
Se mezcló una cantidad equimolar de la hebra guía G1 con el compuesto R-19 para producir el correspondiente dúplex C4-1 bicatenario. La integridad del dúplex se comprobó mediante análisis CE y el conjugado se sometió a evaluaciones biológicas.
Siguiendo procedimientos análogos, se prepararon los conjugados de disulfuro de RNA C4-2 a C4-14 respectivamente y se sometieron a evaluaciones biológicas.
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0002
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Ejemplo 5
El péptido SEQ ID NO: 19 (10,0 mg, 2,45 pmol) se disolvió en 500 pl de tampón TEAA pH=6,5 y se añadió gota a gota al conector L-8 (38,4 mg, 0,074 mmol) en 500 pl de tampón TEAA pH=6,5. La reacción se agitó durante 2 h y se purificó mediante RP HPLC 10-90 % MeCN/agua durante 20 min. Las fracciones recogidas se liofilizaron para dar un sólido blanco SEQ ID NO: 19-1 que tenía una pureza >95 % mediante análisis LC-MS.
El agente reaccionante R-3 (2,00 mg, 0,282 pmol) y TCEP (0,808 mg, 2,82 pmol) se disolvieron en 0,5 ml de tampón Tris de pH=6,8 y se agitaron durante 2 h. El rastro de LC-MS indicó la escisión del enlace disulfuro R-3, luego la mezcla de reacción se cargó en una columna de desalinización PD-10. Las fracciones recolectadas se liofilizaron para dar un sólido blanco R-20 y se usaron para la siguiente reacción sin purificación adicional.
El compuesto R-20 (2,00 mg, 0,286 pmol) en 300 pl de formamida/tampón Tris de pH=6,8 = 3/1 se trató con el péptido SEQ ID NO: 19-1 (3,95 mg, 0,859 pmol) en 300 pl del mismo tampón y la mezcla de reacción resultante se agitó durante 1 h. La reacción se diluyó mediante la adición de formamida/tampón Tris de pH=6,8 = 3/1 hasta un volumen total de 2,5 ml y se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico fuerte en una columna Resource Q (25­ 75 % B en A, A: formamida/H2O=1/1,20 mmol Tris-HCl, pH=7,4, B: formamida/H2O=1/1,20 mmol Tris-HCl, 400 mmol NaClO4, pH=7,4). Las fracciones de producto combinadas se diluyeron con agua y se dializaron por centrifugación 4 veces frente a agua con una membrana de corte de peso molecular 10.000. El dialito se liofilizó para proporcionar R-21 (0,71 mg, 21,4%, >95 % de pureza) como un sólido blanco.
Se mezcló una cantidad equimolar de la hebra guía G1 con el compuesto R-21 para producir el correspondiente dúplex C5-1 bicatenario. La integridad del dúplex se comprobó mediante análisis CE y el conjugado se sometió a evaluaciones biológicas.
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El compuesto R-13 (3,00 mg, 0,382 pmol) en 300 pl de formamida/tampón T ris de pH=6,8 = 3/1 se trató con el péptido SEQ ID NO: 19 (4,98 mg, 1,222 pmol) en 300 pl del mismo tampón y la mezcla de reacción resultante se agitó durante 1 h. La reacción se diluyó mediante la adición de formamida/tampón Tris de pH=6,8 = 3/1 hasta un volumen total de 2,5 ml y se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico fuerte en una columna Resource Q (25-75 % B en A, A: formamida/H2O=1/1,20 mmol Tris-HCl, pH=7,4, B: formamida/H2O=1/1,20 mmol Tris-HCl, 400 mmol NaClO4, pH=7,4). Las fracciones de producto combinadas se diluyeron con agua y se dializaron por centrifugación 4 veces frente a agua con una membrana de corte de peso molecular 10.000. El dialito se liofilizó para proporcionar R-22 (>90 % de pureza) como un sólido blanco.
Se mezcló una cantidad equimolar de la hebra guía G1 con el compuesto R-22 para producir el correspondiente dúplex C6-1 bicatenario. La integridad del dúplex se comprobó mediante análisis CE y el conjugado se envió para evaluaciones biológicas.
Siguiendo procedimientos análogos, se prepararon conjugados de disulfuro de RNA C6-2 a C6-6 y se sometieron a evaluaciones biológicas.
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
Ejemplo 7
Se disolvieron cistamina (1,13 g, 5,02 mmol) y cloroformiato de colesterol (4,96 g, 11,04 mmol) en 20 ml de DCM, seguido de la adición de TEA (3,50 ml, 25,09 mmol) a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 1 h. Se separó el disolvente y el residuo se purificó mediante columna de sílice (EtOAc/hexanos = 0/100 a 50/50 durante 25 min) para proporcionar L-9 como un sólido blanco (2,44 g, 50%).
L-9 (440 mg, 0,450 mmol) y DTT (174 mg, 1,125 mmol) se disolvieron en THF/agua = 20/1 y se agitaron durante la noche. Se eliminó el disolvente y el residuo se purificó mediante columna de sílice para proporcionar tiol L-10 (300 mg, 68%) como un sólido blanco.
R-3 (3,00 mg, 0,423 pmol) y L-10 (2,071 mg, 4,23 pmol) se disolvieron en THF/tampón Tris pH=6,8 = 10/1 600 pL y se agitó durante 3 h. La mezcla de reacción se purificó por C4 RP HPLC con TEAA como aditivo. Las fracciones recogidas se dializaron 3 veces frente a una membrana 3k y se liofilizaron para dar un sólido blanco R-23 (0,61 mg, 19 %, >95 % de pureza).
Se mezcló una cantidad equimolar de la hebra guía G1 con el compuesto R-23 para producir el correspondiente dúplex C7-1 bicatenario. La integridad del dúplex se comprobó mediante análisis CE y el conjugado se envió para evaluaciones biológicas.
Figure imgf000032_0001
Ejemplo 8
Una solución de R-2 (5,00 mg, 0,705 pmol) en 0,3 ml de tampón Tris de pH=8 se enfrió a 0 °C y se trató con una solución de L-11 (2,76 mg, 4,93 pmol) en 0,3 ml de MeCN. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 0,5 h. La reacción bruta se diluyó con 18 ml de agua y se dializó por centrifugación cuatro veces contra agua usando una membrana de diálisis MW 3K. El dialito se liofilizó para proporcionar el producto deseado R-24 como un polvo amorfo blanco esponjoso, masa medida = 7540.
Una solución de R-24 (1,0 mg, 0,133 pmol) en 400 pL de formamida/tampón Tris de pH=6,8 = 3/1 se trató con una solución de SEQ ID NO: 19 (2,164 mg, 0,530 pmol) en 400 pL de formamida/tampón Tris de pH=6,8 = 3/1 y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1,0 h. La reacción bruta se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico preparatoria en un aparato Gilson utilizando una columna ResourceQ de 6 ml y un gradiente lineal de A sobre B al 25-70 % (A = TrisHCl 20 mM, formamida al 50 %, pH = 7,4; B = TrisHCl 20 mM, NaClO4400 mM, formamida al 50%, pH=7,4). El pico del producto se diluyó con agua y se dializó por centrifugación cuatro veces frente a agua usando una membrana de diálisis de PM 10K. El dialito se liofilizó para proporcionar 0,32 mg del conjugado R-25 deseado como un polvo amorfo blanco esponjoso.
Se mezcló una cantidad equimolar de la hebra guía G1 con el compuesto R-25 para producir el correspondiente dúplex bicatenario C8-1 . La integridad del dúplex se comprobó mediante análisis CE y el conjugado se sometió a evaluaciones biológicas.
Siguiendo procedimientos análogos, se prepararon los conjugados de disulfuro de RNA C8-2 a C8-6 y se sometieron a evaluaciones biológicas.
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Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
Ejemplo 9
El oligonucleótido G3 bruto, 50 mg, se trató con azido-peg9-SPDP L-3 (38,6 mg, 0,053 mmol) y CuBrMe2S (2,74 mg, 0,013 mmol) en 3 mL de DMA/Agua=3/1. La mezcla de reacción resultante se agitó durante 48 h a temperatura ambiente, seguido de la adición de 2,0 ml de NH4F al 40 %/agua=1/1. La mezcla bifásica se agitó a 65 °C durante 1 h, luego se purificó utilizando cartuchos C18 para dar un sólido blanco bruto G4.
Siguiendo procedimientos análogos, se prepararon los disulfuros de RNA G5 y G6 respectivamente.
Figure imgf000037_0001
Ejemplo 10
El compuesto G4 (3,00 mg, 0,391 pmol) en 300 pl de formamida/tampón Tris de pH=6,8 = 3/1 se trató con el péptido SEQ ID NO: 19 (3,19 mg, 0,782 pmol) en 300 pl del mismo tampón y la mezcla de reacción resultante se agitó durante 0,5 h. La reacción se diluyó mediante la adición de formamida/tampón Tris de pH=6,8 = 3/1 hasta un volumen total de 2,5 ml y se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico fuerte en una columna Resource Q (25-75 % B en A, A: formamida/ H2O=1/1,20 mmol Tris-HCl, pH=7,4, B: formamida/H2O=1/1,20 mmol Tris-HCl, 400 mmol NaClO4, pH=7,4). Las fracciones de producto combinadas se diluyeron con agua y se dializaron por centrifugación 4 veces frente a agua con una membrana de corte de peso molecular de 10.000. El dialito se liofilizó para proporcionar 3,5 mg de G7 como un sólido blanco, masa = 11640.
Se mezcló una cantidad equimolar de la hebra guía G7 con la hebra retardada R-28 para producir el correspondiente dúplex C10-1 de doble hebra. La integridad del dúplex se comprobó mediante análisis CE y el conjugado se sometió a evaluaciones biológicas.
Siguiendo procedimientos análogos, se prepararon los conjugados de disulfuro de RNA C10-2 a C10-8 respectivamente y se sometieron a evaluaciones biológicas.
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
Ensayos
Protocolo general de ensayo de siRNA
Los siRNA descritos en el presente documento se diseñaron para dirigirse al gen SSB expresado de forma ubicua (antígeno B del síndrome de Sjogren; NM_009278.4). La secuencia del siRNA utilizada es homóloga en transcritos humanos, de ratón y de rata. Para probar la actividad silenciadora de los conjugados de siRNA, se sembraron células

Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Una composición modular que comprende
1) un siRNA;
2) uno o más conectores, que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de la Tabla 2, donde los conectores están unidos a la hebra guía del siRNA en la posición 2' de los anillos de ribosa excluyendo las posiciones terminales 3' y/o 5' de la hebra guía, o donde los conectores están unidos a la hebra retardada del siRNA en la posición 2' de los anillos de ribosa excluyendo las posiciones terminales 3' y/o 5' de la hebra retardada; y 3) uno o más péptidos, que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de SEQ ID NO: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los conectores.
2. La composición modular según la reivindicación 1, que comprende además colesterol, en la que el colesterol está unido al siRNA en la posición 2' de los anillos de ribosa o en la posición 3' del siRNA.
3. La composición modular según la reivindicación 1, que comprende además colesterol, en la que el colesterol está unido al siRNA en la posición 2' de los anillos de ribosa y/o en las posiciones terminales 3' y/o 5' del siRNA.
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