ES2909701T3 - Inhibidores de Cd73 - Google Patents

Abstract

Un compuesto de la fórmula: **(Ver fórmula)** en la que n es 0 a 3; R1 es -H, -F, -gem-difluoro, -gem-dimetilo, -alquilo C1-4, -CHF2, -CF2CH3 o -CH2CH2F; y R2 se selecciona entre -H, -CH3, -F, -Cl, -CN, o -OCH3; o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de Cd73

La presente invención se refiere a compuestos de 5-[5]-[2-cidoalquil]-6-piridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o sales aceptables para uso farmacéutico de los mismos, y a composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos, que inhiben la actividad de CD73 y son útiles para tratar el cáncer.

CD73, también conocida como 5'-nucleotidasa o ecto-5'nucleotidasa (EC 3.1.3.5), es una enzima que convierte los mononucleótidos 5' en nucleósidos. CD73 se expresa en muchos tejidos, y se regula al alza en los tejidos cancerosos, y la vía de CD73 promueve el crecimiento del tumor al limitar la inmunidad de las células T antitumorales a través de la señalización del receptor de adenosina (Zhang B, Cáncer Research 2010; 70: 6407 a 6411 Antonioli L, et al., Drug Discovery Today 2017; 22: 1686 a 1696).

Los ratones deficientes en CD73 tienen una mayor inmunidad antitumoral y son resistentes a la metástasis experimental (Stagg J, et al., Cáncer Research 2011; 71: 2892 a 2900). La adenosina extracelular generada por el CD73 tumoral se acumula en el microambiente tumoral y perjudica la inmunidad de las células T antitumorales (Zhang B, Cancer Research 2010; 70: 6407 a 6411 Antonioli L, et al., Drug Discovery Today 2017; 22: 1686 a 1696), y está relacionado con el escape inmunológico de los tumores, la proliferación, la migración, la neovascularización, la metástasis y la quimiorresistencia de las células tumorales (Inoue Y, et al., Oncotarget 2017; 8: 8738 a 8751). También se ha informado de que la expresión elevada de CD73 está asociada a una mayor supresión inmunitaria (Jin D, et al., Cancer Res. 70: 2245 a 2255 (2010) Beavis PA, et al., Trends Immunol 33: 231 a 237 (2012) Beavis, PA, et al., Cancer Immunol Res. 3: 506 a 517 (2015) Loi S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110: 11091 a 11096 (2013)).

Así pues, la vía de CD73 ejerce un efecto inmunosupresor, y se ha sugerido que el bloqueo de la vía de CD73 puede ser útil en el tratamiento del cáncer (Antonioli L, et al., Oncoimmunol. 2016; 5: e1216292, doi: 10.1080/2162402X.2016.1216292 Antonioli L, et al., Trends in Cancer 2016; 2: 95 a 109 Allard D, et al., Immunotherapy 2016; 8: 145 a 163). Los inhibidores de CD73 se encuentran en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer (Hay CM, et al., Oncoimmunol. 2016; 5(8): e1208875 Allard D, et al., Immunotherapy 2016; 8: 145 a 163). Los inhibidores de moléculas pequeñas de CD73 se conocen porWO 2017/120508 YA-PING GONG ET AL: “Evaluation of WO2017098421: GSK's benzothiazine compounds as CD73 inhibitor filings”, EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC PATENTS, vol. 28, núm. 2, 2017, páginas 167 a 171 y RAHILA RAHIMOVA ET AL.: “Identification of allosteric inhibitors of the ecto-5-nucleotidase (C^d 73) targeting the dimer interface”, PLOS COMPUTATIONAL BIOLOGY, vol. 14, Núm. 1,2018, página e1005943.

Sigue existiendo la necesidad de proporcionar inhibidores alternativos de CD73, más en particular, para el tratamiento del cáncer. En particular, sigue siendo necesario contar con inhibidores de CD73 de molécula pequeña disponibles por vía oral, y que presenten una inhibición más completa de la diana en el microambiente tumoral. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano (o animal) por terapia (o para el diagnóstico).

En consecuencia, la presente invención proporciona compuestos inhibidores de CD73 que pueden ser útiles para tratar el cáncer. La presente invención proporciona el compuesto de

Fórmula I:

en la que n es 0 a 3;

en la que R¹ es -H, -F, -gem-difluoro, -gem-dimetilo, -alquilo C^1-4, -CHF², -CHF²CH³ o -CH²CH²F;

y

R² se selecciona entre -H, -CH³, -F, -Cl, -CN, o -OCH³;

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización, la presente invención proporciona el compuesto de Fórmula I, en el que n es 0, R1 es -alquilo C^1-4, y R2 es -CH3, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización, el compuesto es

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización, el compuesto es

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización, el compuesto es

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización, el compuesto es

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización, el compuesto es

o

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización, el compuesto es

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización, el compuesto de Fórmula I es de la Fórmula:

en la que R1 es -CH2CH3 o -CH(CH3)2, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización, R1 es -CH2CH3, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización, R1 es -CH(CH3)2, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización, el compuesto de Fórmula I es de la Fórmula:

o

en la que R1 es CH2CH3 o CH(CH3)2, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización, el compuesto de Fórmula I es de la Fórmula:

en la que R1 es -CH2CH3 o -CH(CH3)2, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización, la presente invención proporciona el compuesto:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización, la presente invención proporciona el compuesto:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización, la presente invención proporciona el compuesto:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización, la presente invención proporciona el compuesto:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

[En una realización, la presente invención proporciona un compuesto que es 5-[5-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización, la presente invención proporciona un compuesto que es 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende 5-[5-[(1S,2S)-2- etilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma, y uno o más portadores, diluyentes o excipientes aceptables para uso farmacéutico.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, y uno o más portadores, diluyentes o excipientes aceptables para uso farmacéutico.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar el cáncer que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de 5-[5-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar el cáncer que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3- il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma.

En una realización, la presente invención proporciona 5-[5-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma, para su uso en terapia.

En otra realización, la presente invención proporciona 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma, para su uso en terapia.

En una realización, la presente invención proporciona 5-[5-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma, para su uso en el tratamiento del cáncer.

En otra realización, la presente invención proporciona 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma, para su uso en el tratamiento del cáncer.

En una realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, la composición farmacéutica comprende 5-[5-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, la composición farmacéutica que comprende 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma.

En una realización, la presente invención proporciona el uso de 5-[5-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

En otra realización, la presente invención proporciona el uso de 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

En una realización, la presente invención proporciona la preparación y el uso de 4-cloro-6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metilpiridazina, que se puede representar estructuralmente como:

que es útil en la fabricación de un compuesto o un medicamento para el tratamiento del cáncer. En otra realización, la presente invención proporciona 4-cloro-6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metil-piridazina para su uso en la fabricación de un compuesto o un medicamento.

En una realización, la presente invención proporciona la preparación y el uso de 4,4,5,5-tetrametil-2-(2-sustituidociclopropil)-1,3,2-dioxaborolano, que se puede representar estructuralmente como:

en el que R¹ = CH²CH³ o CH(CH³)², que es útil en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En una realización, R = CH²CH³. En otra realización, R = CH(CH³)². En otra realización, la presente invención proporciona 4,4,5,5-tetrametil-2-(2-sustituido-ciclopropil)-1,3,2-dioxaborolano, para su uso en la fabricación de un compuesto o un medicamento.

En una realización, la presente invención proporciona la preparación y el uso de 2-[(1S,2S)-2-etil-ciclopropil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano, que se puede representar estructuralmente como:

que es útil en la fabricación de un compuesto o un medicamento para el tratamiento del cáncer. En otra realización, la presente invención proporciona 2-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano para su uso en la fabricación de un compuesto o un medicamento.

En una realización, la presente invención proporciona la preparación y el uso de 2-[(IS,2S)-2-isopropilciclopropil] 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano, que se puede representar estructuralmente como:

que es útil en la fabricación de un compuesto o un medicamento para el tratamiento del cáncer. En otra realización, la presente invención proporciona 2-[(1S,2S)-2-isopropilciclopropil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano para su uso en la fabricación de un compuesto o un medicamento.

En una realización, la presente invención proporciona la síntesis quiral de 2-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano, mediante el uso de carboxilato de (1,3-dioxoisoindolin-2-il) (1S,2S)-2-etilciclopropano, que se puede representar estructuralmente como:

en el que R1 = CH2CH3 o CH(CH3)2, que es útil en la fabricación de un compuesto o un medicamento para el tratamiento del cáncer. En otra realización, la presente invención proporciona (1,3-dioxoisoindolin-2-il) (1S,2S)-2-etilciclopropano carboxilato para su uso en la fabricación de un compuesto o un medicamento.

En una realización, la presente invención proporciona la síntesis quiral de 2-[(1S,2S)-2-isopropilciclopropil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano, mediante el uso de (1,3-dioxoisoindolin-2-il) (1S,2R)-2-isopropilciclopropanocarboxilato, que se puede representar estructuralmente como:

que es útil en la fabricación de un compuesto o un medicamento para el tratamiento del cáncer. En otra realización, la presente invención proporciona (1,3-dioxoisoindolin-2-il) (1S,2R)-2-isopropilciclopropanocarboxilato para su uso en la fabricación de un compuesto o un medicamento.

La proteína CD73 se expresa en muchos tejidos, que incluyen el cerebro, la glándula tiroidea, la glándula suprarrenal, la médula ósea, el ganglio linfático, la amígdala, el bazo, el músculo cardíaco, el músculo liso, el pulmón, la nasofaringe, el hígado, la vesícula biliar, el páncreas, la glándula salival mucosa oral, esófago, estómago, duodeno, intestino delgado, colon, recto, riñón, vejiga urinaria, testículos, próstata, trompa de Falopio, vagina, mama, cuello uterino, útero, endometrio, ovario, tejidos blandos y piel (proteinatlas.org/ENSG00000135318-NT5E/tissue). CD73 se sobreexpresa en múltiples tipos de tumores (Antonioli L, et al., Nat. Rev. Cáncer 13, 842 a 857 (2013) Antonioli L, et al., Trends Cáncer 2: 95 a 109 (2016). CD73 también se expresa en tejidos hepatobiliopancreáticos humanos normales y patológicos, incluidos los hepatocitos, el adenocarcinoma ductal pancreático y el carcinoma colangiocelular extrahepático (Sciarra, A., et al., Cáncer Immunol. Immunother. 2019; doi.org/10.1007/s00262-018-2290-1).

La expresión y la actividad elevadas de CD73 se asocian con la invasividad y la metástasis de los tumores, y con un menor tiempo de supervivencia de los pacientes (Jin D, et al., Cancer Research 2010; 70: 2245 a 2255). El aumento de la expresión de CD73 se ha asociado a un mal pronóstico (Inoue K, et al., Oncotarget 8: 8738 a 8751 (2017) Turcotte K, et al., Cancer Res. 5: 4494 a 4503 (2015) Lu YT, et al., World J. Gastroenterol. 19: 1912 a 1918 (2013) Wu XR, et al., J. Surg. Oncol. 106: 130 a 137 (2012) Buisseret S, et al., Ann. Oncol. 29: 1056 a 1062 (2017) Leclerc R, et al., Clin. Cancer Res. 22: 158 a 66 (2016)).

La expresión de CD73 en el cáncer de mama triple negativo se asocia a peores resultados clínicos y a una mayor resistencia a la quimioterapia con antraciclinas (Allard B, et al., Expert Opin. Ther. Targets 2014; 18: 863 a 881). CD73 se asocia con un mal pronóstico en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (Ren Z-H, et al., Oncotargets 2016; 7: 61690 a 61702). La expresión de CD73 también está asociada a la progresión del carcinoma de células renales (Yu Y, et al., Oncol. Lett. 2015; 9: 2485 a 2494).

CD73 se sobreexpresa en los tumores de endometrio (Aliagas E, et al., Mediators of Inflammation 2014; doi: 10.1155/2014/509027), tejido tumoral de próstata (Leclerc BG, et al., Clin. Cancer Res. 2016; 22: 158 a 166), tejido de cáncer de pulmón de células no pequeñas (Inoue Y, et al., Oncotarget 2017; 8: 8738 a 8751). Se ha informado de que CD73 se sobreexpresa en tumores, que incluyen el cáncer de mama, el cáncer colorrectal, el cáncer de ovario, el cáncer gástrico y el cáncer de vesícula biliar (Gao Z-W y Zhang H-Z, Biomed Res. Int. 2014; doi: 10.1155/2014/460654). Se ha informado de que CD73 se sobreexpresa en líneas celulares de cáncer, que incluyen líneas celulares de glioblastoma, melanoma, mama, ovario, meduloblastoma y cáncer de vejiga (Gao Z-W y Zhang H-Z, Biomed Res. Int. 2014; doi: 10.1155/2014/460654).

Se ha informado de que la CD73-adenosina reduce las respuestas inmunitarias y la supervivencia en pacientes con cáncer de ovario (Gaudreau P-O, et al., Oncoimmunology 2016; 5(5): e1127496).

Se ha notificado que el bloqueo de CD73 in vivo con un inhibidor selectivo de CD73 a,p-metilenadenosina 5'-difosfato reduce el crecimiento tumoral en ratones singénicos inyectados por vía subcutánea con células tumorales EG7 (linfoma), MC38 (colon), AT-3 (mama) y B16F10 (melanoma) (Stagg J, et al., Cáncer Research 2011; 71: 2892 a 2900 Forte G, et al., J. Immunol. 2012; 189: 2226 a 2233). Se ha informado de que la terapia con anticuerpos anti-CD73 inhibe el crecimiento y la metástasis de los tumores de mama (Stagg J, et al., PNAS 2010; 107: 1547 a 1552 Terp MG, J. Immunol. 2013; 191: 4165 a 4173).

Además, se ha informado de que la actividad enzimática de la adenosina y la CD73 está aumentada en pacientes con cáncer (Huang N, et al., Cancer Res. 75:1538 (2015), y se ha informado que los pacientes que no responden a los inhibidores del punto de control inmunitario tienen un nivel de adenosina más alto que los que responden (Giannakis HX, et al., J. Clin. Oncol. 35: 15 Suppl. 3036 a 3036 (2017)).

Se ha informado que la activación oncogénica y la pérdida de receptores de estrógeno se asocian con una mayor expresión de CD73 (Reinhardt J, et al., Cancer Res. 77: 4697 a 4709 (2017) Spychala J, et al., Clin. Cancer Res.

10:708 a 717 (2004) Ascierto y McArthur J., Transl. Med. 15: 173 (2017) Young A, et al., Cancer Res. 77:4684 a 4696 (2017)).

Entre los sujetos que se pueden beneficiar del tratamiento con inhibidores de CD73 se encuentran aquellos con tumores resistentes o refractarios a los inhibidores anti-PD1/PDL-1, tales como el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer de vejiga y el melanoma; aquellos con cánceres con mutaciones EGFR/BRAF/Kras, tales como el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer de vejiga, el melanoma, el colon y el páncreas; aquellos con cánceres con receptores de estrógeno (-), tales como el cáncer de mama triple negativo; sujetos con un alto nivel de expresión de CD73, tales como el cáncer de páncreas y el cáncer colorrectal. Si se desea, dicho sujeto se puede seleccionar para la terapia con un compuesto desvelado en la presente memoria, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, basándose en la presencia de niveles elevados de expresión de CD73 en sus tumores, de acuerdo con lo medido por un ensayo de IHC; o en base a la presencia de mutaciones EGFR y BRAF en sus tumores, detectadas por ensayos rT-PCR; o en base a la pérdida del receptor de estrógeno en sus tumores, detectada por un ensayo IHC o RT-PCR; o en base a la presencia de altos niveles de adenosina y AMP en sus tumores o plasma, detectados por un ensayo LC-MS. Para la evaluación farmacodinámica, se puede utilizar un ensayo ex vivo basado en LC-MS descrito en la presente memoria para medir el efecto de un inhibidor de CD73 en la conversión de AMP a adenosina en la sangre.

La presente invención también proporciona un procedimiento para tratar el cáncer en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

La presente invención también proporciona un procedimiento para tratar el cáncer, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I de la presente memoria, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en el que el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de mama, colangiocarcinoma, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de vesícula biliar, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, meduloblastoma, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata o cáncer renal. En una realización, el cáncer de mama es un cáncer de mama triple negativo. En otra realización, el cáncer de pulmón es un cáncer de pulmón de células no pequeñas. En una realización preferida, el compuesto es 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona.

En una realización, el paciente es uno en el que se ha determinado la actividad de CD73 en suero. En una realización preferida, “determinar la actividad de CD73” significa determinar si la actividad de CD73 está presente. Los procedimientos para determinar el nivel de expresión de CD73 o la actividad de CD73 son conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, véase S Morello, et al., J. Trans. Med. 2017; 15:244. En otra realización preferida, “determinar la actividad de CD73” significa cuantificar el nivel de conversión de AMP en adenosina por parte de CD73, y en la presente memoria se proporciona un ensayo basado en LC-MS que facilita la cuantificación del nivel de actividad de CD73.

En otra realización, el paciente es uno en el que se ha determinado la expresión de CD73 en el tejido. En otra realización, el tejido es un tejido tumoral. Los procedimientos para determinar el nivel de expresión de CD73 en el tejido son conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de la técnica de western blot o la inmunohistoquímica (X-R Wu, et al., J. Surg. Oncol. 2012; 106: 130 a 137).

La presente invención también proporciona un procedimiento, que comprende la determinación de la expresión de CD73 en el tejido de un paciente al que se le ha administrado el compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En una realización preferida, el tejido es un tejido tumoral.

La presente invención también proporciona un procedimiento, que comprende la determinación de la actividad de CD73 en el suero de un paciente al que se le ha administrado el compuesto de acuerdo con un compuesto de Fórmula I de la presente memoria, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. Este procedimiento es sensible, no requiere biopsias tumorales, no implica anticuerpos o inmunohistoquímica, facilita la cuantificación de la actividad de CD73 (por ejemplo, al facilitar el cálculo de una CE⁵⁰). En una realización preferida, el compuesto es 5-[5-[(1S,2R)-2-Isopropilcicíopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona. En otra realización preferida, el procedimiento además comprende el ensayo de la actividad de CD73 mediante el uso de monofosfato de adenosina (AMP) radiomarcado y la determinación de la concentración de AMP radiomarcado por medio de espectrometría de masas. En otra realización preferida, el AMP radiomarcado es 13C5_15N5-AMP.

En otra realización preferida, el procedimiento comprende (a) proporcionar suero del paciente en cada uno de una pluralidad de recipientes (por ejemplo, una placa de microtitulación) que están configurados para contener varias concentraciones del compuesto que se administró al paciente, (b) proporcionar el 13C10_15N5_AMP en cada recipiente de la pluralidad de recipientes, (c) incubar la pluralidad de recipientes en condiciones que faciliten la mezcla (por ejemplo, agitación), (d) centrifugar la pluralidad de recipientes, (e) transferir el sobrenadante de cada recipiente a un nuevo recipiente respectivo, (f) proporcionar una solución de extracción que contenga el estándar interno en cada uno de los nuevos recipientes respectivos, (g) centrifugar los nuevos recipientes respectivos, (h) transferir el sobrenadante de cada nuevo recipiente respectivo a un recipiente de análisis respectivo, (i) analizar el sobrenadante en cada recipiente de análisis respectivo para 13C10_15N5_adenosina, 13C10_15N4_inosina y 15N4 hipoxantina por LC/MS, como se describe en la presente memoria (“Espectroscopia de masas para la purificación de adenosina y adenosina”), y (j) calcular la CE⁵⁰. En una realización preferida, el compuesto es 5-[5-[(1S,2R)-2-Isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona. En una realización preferida, el estándar interno es 13C5-AMP, 13C5-Adenosina, 15N4-inosina y 13C5-Hipoxantina.

La presente invención también proporciona el uso de un compuesto de Fórmula I de la presente memoria, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en la terapia. En una realización, la terapia es el tratamiento del cáncer. En otra realización, el cáncer es un cáncer de vejiga, un cáncer de mama, un colangiocarcinoma, un cáncer colorrectal, un cáncer de colon, un cáncer gástrico, un cáncer de vesícula biliar, un glioblastoma, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de hígado, un cáncer de pulmón, un linfoma, un meduloblastoma, un melanoma, un cáncer de ovario, un cáncer de páncreas, un cáncer de próstata o un cáncer renal. En una realización, el cáncer de mama es un cáncer de mama triple negativo. En otra realización, el cáncer de pulmón es un cáncer de pulmón de células no pequeñas. En una realización preferida, el compuesto es 5-[5-[(1S,2R)-2-Isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona.

La presente invención también proporciona el uso de un compuesto de Fórmula I de la presente memoria, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En una realización, el cáncer es un cáncer de vejiga, un cáncer de mama, un colangiocarcinoma, un cáncer colorrectal, un cáncer de colon, un cáncer gástrico, un cáncer de vesícula biliar, un glioblastoma, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de hígado, un cáncer de pulmón, un linfoma, un meduloblastoma, un melanoma, un cáncer de ovario, un cáncer de páncreas, un cáncer de próstata o un cáncer renal. En una realización, el cáncer de mama es un cáncer de mama triple negativo. En otra realización, el cáncer de pulmón es un cáncer de pulmón de células no pequeñas. En una realización preferida, el compuesto es 5-[5-[(1S,2R)-2-Isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar el cáncer, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I de la presente memoria, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes antitumorales. Los ejemplos no limitantes de agentes antitumorales incluyen ramucirumab, necitumumab, olaratumab, gemcitabina, pemetrexed, galunisertib, abemaciclib, gefitinib, vemurafenib dabrafenib, trametinib, cisplatino, carboplatino, dacarbazina, doxorrubicina liposomal, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteínas de paclitaxel para suspensión inyectable, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo e irinotecán), cetuximab, un inhibidor del EGFR, un inhibidor de Raf, un inhibidor de B-Raf, un inhibidor de ERK, un inhibidor de CDK4/6, un inhibidor de la idoleamina 2,3-dioxigenasa, un inhibidor del TGFp y un inhibidor del receptor del TGFp. En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar el cáncer, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I de la presente memoria, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes inmuno-oncológicos. En una realización preferida, el agente inmuno-oncológico es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1, un anticuerpo agonista anti-CD137 o un anticuerpo anti-CTLA4. Los ejemplos no limitantes de agentes inmuno-oncológicos incluyen nivolumab, ipilimumab, pidilizumab, pembrolizumab, tremelimumab, urelumab, lirilumab, atezolizumab, durvalumab, y el anticuerpo anti-PD-LI LY3300054 (cuyas secuencias de cadena pesada y ligera se exponen en elWO 2017/034916 y US 2017/0058033 como las SEC. ID Núms.: 10 y 11, respectivamente). En una realización preferida, el agente inmunológico-oncológico es un anticuerpo anti-PD-1. En otra realización preferida, el agente inmunológico-oncológico es un anticuerpo anti-PD-L1. En otra realización preferida, el compuesto es 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, y el agente inmuno-oncológico es LY3300054.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar el cáncer de pulmón de células no pequeñas, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I de la presente memoria, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en combinación simultánea, separada o secuencial con otro agente. En una realización preferida, el otro agente es osimertinib, cetuximab o abemaciclib. En otra realización preferida, el otro agente es osimertinib. En otra realización preferida, el otro agente es cetuximab. En otra realización preferida, el otro agente es abemaciclib.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar el melanoma, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I de la presente memoria, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en combinación simultánea, separada o secuencial con otro agente. En una realización preferida, el otro agente es un inhibidor de BRAF, un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1. En otra realización preferida, el otro agente es un inhibidor de BRAF. En otra realización preferida, el otro agente es un anticuerpo anti-PD-1. En otra realización preferida, el otro agente es un anticuerpo anti-PD-L1. En otra realización preferida, el anticuerpo anti-PD-L1 es el LY3300054. En otra realización preferida, el compuesto es 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona y el otro agente es el anticuerpo anti-PD-L1 es LY3300054.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar el cáncer colorrectal, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I de la presente memoria, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en combinación simultánea, separada o secuencial con otro agente. En una realización preferida, el otro agente es abemaciclib. En otra realización preferida, el compuesto es 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, y el otro agente es abemaciclib.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar el cáncer de páncreas, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I de la presente memoria, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en combinación simultánea, separada o secuencial con otro agente. En una realización preferida, el otro agente es abemaciclib. En otra realización preferida, el compuesto es 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, y el otro agente es abemaciclib.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar el cáncer de mama triple negativo, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I de la presente memoria, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en combinación simultánea, separada o secuencial con otro agente. En una realización preferida, el compuesto es 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona.

La presente invención también proporciona un procedimiento para inhibir la actividad enzimática de CD73 en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. La presente invención también proporciona un procedimiento para inhibir la conversión de AMP en adenosina en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar el cáncer, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de la Forma I de la presente memoria, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes que modulan la adenosina. Los ejemplos no limitantes de agentes que modulan la adenosina incluyen un anticuerpo anti-CD73 y un antagonista del receptor de adenosina.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de Fórmula I, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, con uno o más portadores, diluyentes o excipientes aceptables para uso farmacéutico. La invención proporciona además un proceso para preparar una composición farmacéutica, que comprende mezclar un compuesto de Fórmula I, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, con uno o más portadores, diluyentes o excipientes aceptables para uso farmacéutico. Esta invención también abarca nuevos intermedios y procesos para la síntesis de los compuestos de Fórmula I.

Como se ha utilizado anteriormente, y a lo largo de la descripción de la invención, los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, se entenderán con los siguientes significados:

Un “portador, diluyente o excipiente aceptable para uso farmacéutico” es un medio generalmente aceptado en la técnica para la administración de agentes biológicamente activos a los mamíferos, por ejemplo, los seres humanos.

Los términos “tratamiento”, “tratar”, “tratar” y similares, se refieren a la ralentización o inversión de la progresión de un trastorno. Estos términos también incluyen el alivio, la mejora, la atenuación, la eliminación o la reducción de uno o más síntomas de un trastorno o afección, incluso si el trastorno o la afección no se eliminan realmente e incluso si la progresión del trastorno o la afección no se ralentiza o invierte.

El término “cantidad efectiva” significa la cantidad del compuesto, o sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, de la presente invención o composición farmacéutica que contiene un compuesto, o sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, de la presente invención que provocará la respuesta biológica o médica o el efecto terapéutico deseado en un paciente por un clínico tratante. En una realización, el compuesto, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, inhibe la conversión de AMP en adenosina en un ensayo enzimático CD73 in vitro o ex vivo . En otra realización, el compuesto, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, inhibe la conversión de AMP en adenosina en la sangre total de ratón de animales tratados con diferentes dosis del compuesto.

“Gem-difluoro” se refiere a dos átomos de flúor unidos al mismo carbono.

“Gem-dimetilo” se refiere a dos grupos metilo unidos al mismo carbono.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “paciente” se refiere a un ser humano.

Una cantidad efectiva puede ser fácilmente determinada por el diagnosticador que asiste, como los expertos en la técnica, mediante el uso de técnicas conocidas y la observación de los resultados obtenidos en circunstancias análogas. A la hora de determinar la cantidad efectiva para un paciente, el diagnosticador que lo atiende tiene en cuenta una serie de factores, entre los que se incluyen: la especie del paciente; su tamaño, edad y estado de salud general; la enfermedad o el trastorno específico de que se trate; el grado de afectación o la gravedad de la enfermedad o el trastorno; la respuesta del paciente individual; el compuesto concreto administrado; el modo de administración; las características de biodisponibilidad del preparado administrado; el régimen de dosis seleccionado; el uso de medicación concomitante; y otras circunstancias relevantes.

Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar en una amplia gama de dosis. Por ejemplo, las dosis por día normalmente están dentro del intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal.

Los compuestos de la presente invención se formulan preferentemente como composiciones farmacéuticas administradas por cualquier vía que haga que el compuesto sea biodisponible, incluidas las vías oral, intravenosa y transdérmica. Lo más preferente es que dichas composiciones sean para administración oral. Dichas composiciones farmacéuticas y los procesos para prepararlas son muy conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, editor, 21ra edición, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

Se entenderá por los expertos que los compuestos de la presente invención son capaces de formar sales. Los compuestos de la presente invención contienen heterociclos básicos y, en consecuencia, reaccionan con cualquiera de un número de ácidos inorgánicos y orgánicos para formar sales de adición de ácido aceptables para uso farmacéutico. Tales sales de adición de ácido aceptables para uso farmacéutico y la metodología común para prepararlas son muy conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008)

La frase “sales aceptables para uso farmacéutico” o “una sal aceptable para uso farmacéutico” se refiere a la sal o sales relativamente no tóxicas, inorgánicas y orgánicas del compuesto de la presente invención (S.M. Berge, et al., “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, Núm. 1, enero de 1977).

La designación de “isómero 1” en el nombre de un compuesto significa que el intermedio o compuesto correspondiente de la presente invención es el primero de los dos enantiómeros que eluyen cuando se separa una mezcla de un par de enantiómeros por cromatografía quiral en las condiciones descritas en las “Preparaciones y Ejemplos” a continuación. La designación de “isómero 2” en el nombre de un compuesto representa que el correspondiente intermedio o compuesto de la presente invención es el segundo de los dos enantiómeros que eluyen cuando la mezcla de un par de enantiómeros se separa por cromatografía quiral en las condiciones descritas en las “Preparaciones y Ejemplos” a continuación.

Los compuestos de la presente invención se pueden preparar de acuerdo con procedimientos sintéticos muy conocidos y apreciados en la técnica. Las condiciones de reacción adecuadas para los pasos de estas reacciones son muy conocidas en la técnica y las sustituciones apropiadas de disolventes y co-reactivos están dentro de la habilidad de la técnica. Del mismo modo, los expertos en la técnica apreciarán que los intermedios sintéticos se pueden aislar y/o purificar por medio de diversas técnicas muy conocidas, de acuerdo con lo necesario o deseado, y que, con frecuencia, será posible utilizar varios intermedios directamente en pasos sintéticos posteriores con poca o ninguna purificación. Además, los expertos apreciarán que en algunas circunstancias, el orden en el que se introducen las moléculas no es crítico. El orden particular de los pasos requeridos para producir los compuestos de la presente invención depende del compuesto particular que se está sintetizando, del compuesto de partida y de la responsabilidad relativa de los motivos sustituidos, como bien aprecia el químico experto. Todos los sustituyentes, a menos que se indique lo contrario, son los definidos anteriormente, y todos los reactivos son muy conocidos y apreciados en la técnica.

Como se utilizan en la presente memoria, los siguientes términos tienen el significado indicado: “ACN” es acetonitrilo; “DAST” es trifluoruro de dietilaminosulfuro; “DCM” es diclorometano; “DMAP” es 4-dimetilaminopiridina; “dmso” o “DMSO” es dimetilsulfóxido; “ee” es exceso enantiomérico; “ES/MS” es espectrometría de masas por electrospray; “EtOAc” es acetato de etilo; “Et2O” se refiere al éter dietílico; “FBS” se refiere al suero bovino fetal; “GC-MS” se refiere a la Cromatografía de Gases-Espectometría de Masas; “HBSS” se refiere a la Solución Salina Equilibrada de Hank; “CI50” se refiere a la mitad de la concentración máxima inhibitoria; “LAH” se refiere al hidruro de aluminio y litio; “LC-ES/MS” se refiere a la Espectometría de Masas de Cromatografía Líquida Electrospray; “MS” se refiere a la Espectrometría de Masas; “MeOH” se refiere al metanol; “MTBE” se refiere al metil terc-butil éter; “nBuLi” se refiere al n-butil-litio; “nm” se refiere al nanómetro o nanómetros; “NMR” se refiere a la resonancia magnética nuclear; “OAc” se refiere al acetato; “psi” se refiere a las libras por pulgada cuadrada; “RT” se refiere a la temperatura ambiente; “SCX” se refiere al intercambio de cationes fuertes; “SFC” se refiere a la cromatografía de fluidos supercríticos; “SNAr” se refiere a la sustitución aromática nucleófila; “TEA” se refiere a la trietilamina; “THF” se refiere al tetrahidrofurano; “tR” se refiere al tiempo de retención; y “p/p” se refiere a las proporciones peso/peso en la solución.

Los compuestos de la presente invención se pueden sintetizar como se ilustra en los siguientes esquemas Esquema 1

El Esquema 1 representa la preparación de los compuestos de la Fórmula Ia. Mediante el uso de condiciones conocidas de tipo Suzuki, el ácido (2,4-dimetoxipirimidin-5-il)borónico 1, disponible en el mercado, se puede acoplar a la 4,6-dicloro-3-metilpiridazina. Posteriormente se puede llevar a cabo el acoplamiento Suzuki de la fracción de cloro de 3 con un trans-ciclopropilboronato adecuadamente sustituido para obtener 4. Los expertos reconocerán que los enantiómeros del compuesto 4 se pueden separar mediante el uso de técnicas de separación quiral muy conocidas en la técnica. Los compuestos de Fórmula Ia se pueden preparar por desprotección de los grupos metoxi en 4 bajo una serie de condiciones de desmetilación bien descritas en la técnica.

Esquema 2

El Esquema 2 representa los ésteres borónicos de ciclopropilo necesarios para preparar los compuestos de la Fórmula II. Los expertos reconocerán que la hidroboración del alquino 5 apropiadamente sustituido se puede efectuar bajo una serie de condiciones, especialmente en presencia de un catalizador de metal de transición tales como Cu o Zr, para obtener el boronato de alquenilo 6. El boronato de alquenilo puede ser ciclopropanado en condiciones de tipo carbenoide estabilizado muy conocidas en la técnica, tales como la ciclopropanación de Simmons-Smith, la reacción de Corey-Chaykovsky y el procedimiento de ciclopropanación con diazometano (o compuestos diazo) tanto con (por ejemplo, Cu, Pd o Ni) como sin (por ejemplo, térmica o fotoquímicamente) catalizadores de metales de transición, para obtener el trans-ciclopropilboronato 7 apropiadamente sustituido. Los expertos reconocerán que el producto de ciclopropanación favorecido termodinámicamente será una mezcla de enantiómeros trans en 7

Esquema 3

^ ^

R1 = CH,CH,.

CH(CH3),. CHXH(CH.)2

El Esquema 3 representa la síntesis quiral de los compuestos de Fórmula Ib. La diazotización del aminoácido 8 adecuadamente sustituido en condiciones de Sandmeyer modificadas (radical SNAr) para dar 9 es muy conocida en la técnica. La reducción posterior al alcohol 10 se puede llevar a cabo mediante el uso de una serie de agentes reductores muy conocidos en la técnica, incluidos los hidruros de aluminio y el diborano como agentes reductores. La ciclización al epóxido quiral 11 en condiciones básicas está bien descrita en la técnica. Se puede utilizar una reacción de Horner-Wadsworth-Emmons estereoselectiva por medio del tratamiento del epóxido quiral 11 con un éster de fosfonato adecuado (por ejemplo, 2-dietoxifosforilacetato de etilo o trietilfosfonoacetato) y una base adecuada (por ejemplo, alquilitio, alcóxidos metálicos o hidruros metálicos) para obtener el derivado transciclopropano 12 (Véase, por ejemplo, L. Delhaye; A. Merschaert; P. Delbeke; W. Brione. Org. Proc. Res. & Dev.

2007, 11, 689 a 692.) La hidrólisis del compuesto 12 al correspondiente ácido 13 se puede llevar a cabo bajo una amplia gama de condiciones básicas bien descritas en la técnica. El acoplamiento posterior del ácido 13 con una N-hidroxi-ftalimida apropiadamente sustituida está bien descrito en la técnica, mediante el uso de un agente activador de ácido adecuado, por ejemplo, carbonildiimidazol, en presencia de una base no nucleofílica suave, para preparar el compuesto 14. La biorilación descarboxilativa del éster de N-hidroxiptalimida 14 se puede llevar a cabo en muchas condiciones conocidas en la técnica, que incluyen en presencia de un catalizador de metales de transición (por ejemplo, la reacción de Suzuki-Miyaura), en condiciones fotolíticas, o por medio de reacciones de transferencia de un solo electrón, que incluyen, por ejemplo, la complejación del éster de N-hidroxiftalimida con diboro en un acoplamiento radical facilitado por un radical piridin-boro, para obtener el boronato de trans-ciclopropano 15. (Véase, por ejemplo,W.-M. Cheng; S. Rui; B. Zhao; W.-L. Xing; Y. Fu. Org. Lett. 2017, 19, 4291 a 4294.) El acoplamiento del boronato 15 con el cloruro de arilo 4 y la posterior desmetilación se pueden llevar a cabo de forma similar a la descrita en el Esquema 1 para obtener los tipos de compuestos quirales de Fórmula lb

Esquema 4

21 Fórmula Ic

n - 0 , l o -2

R1 = H, CH(CH3),,F„CHF2,

CHF,CH,. (CH,),

El Esquema 4 representa la síntesis de los compuestos de la Fórmula Ic. La sustitución nucleofílica de la diclorpiridazina 17 se puede llevar a cabo en condiciones radicales (por ejemplo, la reacción de Minisci) muy conocidas en la técnica para obtener la piridazina sustituida 19. El acoplamiento del boronato 20 con el cloruro de arilo 19 y la posterior desmetilación se pueden llevar a cabo de forma similar a la descrita en el Esquema 1 para obtener los tipos de compuestos de Fórmula Ic.

Esquema 5

21 22 Fórmula Id

n= 0. l , 2 o ' 3

R1 =H, F,,(CH,)2,

El Esquema 5 representa la síntesis de los compuestos de la Fórmula Id. El desplazamiento de la 2-cloro-piridazina 21 se puede llevar a cabo en condiciones nucleófilas comúnmente conocidas en la técnica para proporcionar la metoxipiridazina 22. La desmetilación posterior de 22 se puede llevar a cabo de forma similar a la descrita en el Esquema 1 para obtener los tipos de compuestos de la Fórmula Id.

Esquema 6

íormula Ic Fórmula Ic

n=0, 1,2

R1 = H ,F n,CHFr

CH,CH, CHfC'H ),.

El Esquema 6 representa la síntesis de los compuestos de la fórmula le. La cianación de la Fórmula Ic se puede llevar a cabo bajo una variedad de condiciones conocidas en la técnica, que incluyen metales de transición (por ejemplo, Pd, Cu, Rh) para proporcionar los compuestos de Fórmula Ie

Esquema 7

El Esquema 7 representa la síntesis de los compuestos de la Fórmula If. El boronato de alquenilo puede ser ciclopropanado de forma similar a la descrita en el Esquema 2. El acoplamiento del boronato 25 con el cloruro de arilo 3 se puede llevar a cabo de forma similar a la descrita en el Esquema 1 para obtener el compuesto quiral 26. El desenmascaramiento del dietilacetal 26 a aldehído 27 se puede lograr por medio del tratamiento con el ácido apropiado. El tratamiento del aldehído 27 con una variedad de reactivos fluorantes (por ejemplo, DAST, XtalFluor®, Fluolead™ o Deoxo-Fluor®) pueden proporcionar difluorometilo 28. La desmetilación posterior de 28 se puede llevar a cabo de forma similar a la descrita en el Esquema 1 para obtener los tipos de compuestos de la Fórmula If

El Esquema 8 representa la síntesis de los compuestos de la Fórmula Ig. El metanosulfonato 29 se puede convertir en fluoruro 30 por medio de técnicas de sustitución conocidas por los expertos con reactivos tales como el fluoruro de potasio o el fluoruro de tercbutilamonio. La desmetilación posterior se puede llevar a cabo de forma similar a la descrita en el Esquema 1 para obtener el compuesto quiral de Fórmula Ig.

Preparativos y ejemplos

Las siguientes Preparaciones y Ejemplos ilustran aún más la invención y representan la síntesis típica de los compuestos de la invención, pero no se deben interpretar para limitar el alcance de la invención de ninguna manera. Los reactivos y materiales de partida están fácilmente disponibles o pueden ser fácilmente sintetizados por los expertos en la técnica. Se debe entender que los Preparados y los Ejemplos se exponen a modo de ilustración y no de limitación, y que los expertos en la técnica pueden llevar a cabo diversas modificaciones.

La LC-ES/MS se lleva a cabo en un sistema de cromatografía líquida Agilent HP1100. Las mediciones de espectrometría de masas por electrospray (adquiridas en modo positivo y/o negativo) se llevan a cabo en un espectrómetro de masas cuadrupolar con detector selectivo de masas interconectado a1HPLC HP1100. Condiciones LC-MS (pH bajo): columna: PHENOMENEX® GEMINI® NX C-182,1 * 50 mm 3,0 pm; gradiente: de 5 a 100% B en 3 min, luego 100% B durante 0,75 min temperatura de la columna: 50 °C /-10 °C; caudal: 1,2 mL/min; Disolvente A: agua desionizada con 0,1% de HCOOH; Disolvente B: ACN con 0,1% de ácido fórmico; longitud de onda 214 nm. Condiciones alternativas de LC-MS (pH alto): columna: Columnas WATERS™ XTERRA® MS C-18 de 2,1 * 50 mm, 3,5 pm; gradiente: 5% de disolvente A durante 0,25 min, gradiente de 5% a 100% de disolvente B en 3 min y 100% de disolvente B durante 0,5 min o 10% a 100% de disolvente B en 3 min y al 100% de disolvente B durante 0,75 min; temperatura de la columna: 50 °C /-10 °C; caudal: 1,2 mL/min; Disolvente A: 10 mM NH⁴HCO³ pH 9; Disolvente B: Ac N; longitud de onda: 214 nm.

La cromatografía preparativa en fase inversa se lleva a cabo en un LC-ES/MS Agilent 1200 equipado con un espectrómetro de masas con detector selectivo de masas y un automuestreador/colector de fracciones Leap. Los procedimientos de alto pH se ejecutan en una columna PHENOMENEX® GEMINI®-NX de 75 * 30 mm, con un tamaño de partícula de 5 pm y un protector de 10 * 20 mm. Flujo de 85 mL/min. El eluyente es bicarbonato de amonio 10 mM (pH 10) en A^c N.

Los espectros de RMN se llevan a cabo en un espectrómetro de RMN Bruker AVII1HD de 400 MHz, obtenidos como soluciones de CDCh o (CD³)²SO informadas en ppm, mediante el uso del disolvente residual [CDCh, 7,26 ppm; (CD³)²SO, 2,50 ppm] como un estándar de referencia. Cuando se indican las multiplicidades de los picos, se pueden utilizar las siguientes abreviaturas: s (singlete), d (doblete), t (triplete), q (cuarteto), m (multiplete), br-s (singlete amplio), dd (doblete de dobletes), dt (doblete de tripletes). Las constantes de acoplamiento (J), cuando se indican, se expresan en hercios (Hz).

Preparación 1

Rac-trans-2-(2-etilciclopropil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano

A una solución de 2-[('E)-but-1-enil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (1,65 g, 9,06 mmol) en Et²O (45,30 mL) añadir Pd(OAc)² (0,20 g, 0,90 mmol). Sonicar durante 5 minutos y enfriar a -5 °C.

En un matraz Erlenmeyer de 250 mL, añadir una solución acuosa de KOH al 40% (162 mL) seguida por Et²O (245 mL). Enfriar la mezcla bifásica a -5 °C en un baño de hielo/saturación de NaCl acuoso. Añadir N-nitroso-N-metilurea (36,1 g, 350 mmol) en porciones durante 10 minutos. Revolver durante 15 minutos y colocar en un baño de hielo seco/acetona. Decantar la capa de éter en una probeta graduada y añadir la mezcla de Et²O (71 mL, ~ 10 equivalentes de CH²N²) a la solución descrita anteriormente a -5 °C. Después de 2 horas, filtrar el contenido de la reacción a través de tierra de diatomeas, secar sobre MgSO⁴ y concentrar in vacuo para obtener el compuesto del título (1,08 g, 58%). RMN de ¹ H (d⁶-DMSO) 8: -0,51 (dt, J = 9,3, 5,7 Hz, 1H), 0,33 a 0,37 (m, 1H), 0,50 a 0,54 (m, 1H), 0,76 a 0,84 (m, 1H), 0,91 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,14 (s, 12H), 1,21 a 1,30 (m, 2H).

Procedimiento alternativo para la preparación 1

Añadir una solución 1M de trietilborohidruro de litio en THF (41,3 mL, 41,3 mmol) a una solución de dicloruro de bis(pentametilciclopentadienil)circonio (11,1 g, 25,5 mmol) en THF (3,4 L) bajo nitrógeno enfriado a 0 °C . Calentar a RT y revolver durante 1 hora mientras se protege el matraz de la luz con papel de aluminio.

En otro matraz enfriado con nitrógeno a -78 °C, condensar 1 -but-1 -ino (50,6 g, 936 mmol) y añadir pinacolborano (55,0 g, 425 mmol). Revolver la mezcla resultante a -78 °C durante 30 minutos y añadir el contenido del primer matraz por medio de una cánula. Añadir TEA (5,93 mL, 42,6 mmol) y revolver la mezcla de reacción mientras se calienta a RT durante 20 horas. Enfriar la reacción por medio de la adición de una mezcla de hielo/agua (1,5 L) por medio de una cánula, añadir EtOAc (300 mL) y revolver a RT durante 30 minutos. Separar las capas resultantes y volver a extraer la fase acuosa con EtOAc (2 * 200 mL). Combinar los extractos orgánicos, secarlos sobre Na2SO4, filtrar y concentrar in vacuo para obtener 2-[(E)-but-1-enil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (53 g, 65%) como un aceite amarillo. GC-MS (m/z): 182 (M+).

Añadir una solución de dietilcinc en tolueno (15% p/p, 550 mL, 611 mmol) al cloroiodometano (55 mL, 755 mmol) a -20 °C durante 10 minutos, y revolver durante 35 minutos. Añadir gota a gota una solución de 2-[(E)-but-1-enil]-4.4.5.5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (53 g, 277 mmol) en tolueno (100 mL) durante 20 minutos mientras mantiene la temperatura interna de la reacción a -20 °C. Revolver la mezcla durante 2 horas mientras se calienta a 0 °C. Enfriar la reacción por medio de una adición lenta de solución acuosa saturada de NH4Cl (750 mL). Separar la capa orgánica y volver a extraer la fase acuosa con EtOAc (2 * 250 mL). Combinar los extractos orgánicos, secarlos sobre MgSO4, filtrar y evaporar para obtener el compuesto del título (48 g, 84%) en forma de aceite, adecuado para su uso sin purificación adicional. GC-MS (m/z): 180 (M-16).

Preparación 2

4.4.5.5- Tetrametil-2-[(E)-3-metilbut-1-enil]-1,3,2-dioxaborolano

Añadir pinacol borano (9,5 ml, 64 mmol) gota a gota durante 5 minutos al 3-metilbut-1-ino frío (4,91 g, 72,0 mmol). Sellar el recipiente a presión, calentar a RT y revolver 18 horas. Añadir hidruro de cloruro de bis(ciclopentadienil) circonio (IV) (2,0 g, 7,4 mmol) y TEA (1,1 mL, 7,9 mmol). Sellar el recipiente a presión, colocarlo en un baño de aceite a 60 °C y revolver durante 10 minutos. Enfriar la solución roja resultante a RT durante 2,5 horas. Diluir la mezcla de reacción con DCM (200 mL), lavar con NaHCO3 acuoso saturado (100 mL), NaCl acuoso saturado (50 mL), secar sobre MgSO4, filtrar a través de una almohadilla de gel de sílice (150 mL), se enjuaga el gel de sílice con DCM (700 mL) y concentrar in vacuo para obtener el compuesto del título (11,5 g, 82%). ES/MS (m/z): 196 (M+H). RMN de 1H (CDCh) 8: 1,03 (d, J= 6,7 Hz, 6H), 1,29 (s, 12H), 2,37 (m, 1H), 5,40 (dd, 1H), 6,64 (dd, 1H).

Preparación 3

Rac-trans-2-[2-isopropilciclopropil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano

Añadir en porciones N-nitroso-N-metilurea a una mezcla bifásica helada de Et2O (70 mL) y KOH acuoso (30,5 g, 435 mmol, 70 mL de H2O). Revolver hasta que los sólidos se disuelvan (< 5 minutos). Pipetear la solución de diazometano resultante en una suspensión fría y rápidamente agitada de Pd(OAC)2 (237 mg, 1,05 mmol) y 4,4,5,5-tetrametil-2-[(E)-3-metilbut-1-enil]-1,3,2-dioxaborolano (4,00 g, 20,4 mmol) en Et2O (70 mL). Después de la adición completa, calentar la mezcla de reacción a RT, filtrar a través de tierra de diatomeas, y concentrar el filtrado in vacuo. Disolver el residuo resultante en DCM, filtrar a través de un tapón de gel de sílice (25 g) y concentrar in vacuo para obtener el compuesto del título (4,32 g, >99%). ES/MS (m/z): 210 (M+H). RMN de 1H (CDCla) 8: -0,35 (m, 1H), 0,45 (m, 1H), 0,65 (m, 1H), 0,78 (m, 1H), 0,98 (m, 7H), 1,23 (s, 12H).

Preparación 4

4-Cloro-6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metilpiridazina

En un vial a presión, combinar ácido 2,4-dimetoxi-5-pirimidinilborónico (6,75 g, 36,7 mmol), 4,6-dicloro-3-metilpiridazina (5,98 g, 36,7 mmol), [1,1'-bis (difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio (II) (0,55 g, 0,73 mmol), Cs2CO3 (29,9 g, 91,8 mmol) en una mezcla 4:1 de 1,4-dioxano/H2O (151 mL). Evacuar el aire y rellenar con N2. Sellar el recipiente y calentar a 70 °C durante 3 horas. Filtrar el residuo sobre tierra de diatomeas y enjuagar con EtOAc. Lavar la mezcla orgánica con agua seguida por NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 y evaporar hasta sequedad. Purificar el residuo negro resultante por medio de cromatografía sobre gel de sílice, mediante el uso de una columna REDISEP® de 330 g con un gradiente de 0 a 30% de DCM/(33% de MeOH en DCM) durante 15 minutos a un caudal de 200 mL/minuto, para obtener el compuesto del título (6,2 g, 63%) tras la evaporación de las fracciones cromatográficas. ES/MS (m/z)<35 *Cl/37 *40Cl) 267/269 [M+1]+ RMN de 1H (da-DMSO) 8: 2,74 (s, 3H), 4,00 (s, 3H), 4,03 (s, 3H), 8,20 (s, 1H), 8,87 (s, 1H).

Procedimiento alternativo para la preparación 4

Hacer pasar una corriente de nitrógeno a través de una mezcla de ácido (2,4-dimetoxipirimidin-5-il)borónico (85 g, 439 mmol), 4,6-dicloro-3-metilpiridazina (75 g, 437 mmol) y Cs2CO3 (358 g, 1099 mmol) en 1,4-dioxano (1175 mL) y H2O (340 mL) durante 5 minutos. Añadir [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio(II) (6,6 g, 8,7 mmol,) y revolver la mezcla resultante a 75 °C durante 16 horas. Enfriar la reacción a RT, filtrar la mezcla a través de tierra de diatomeas y enjuagar la torta de filtrado con EtOAc. Separar las capas resultantes y lavar la fase orgánica dos veces con NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4, filtrar y concentrar in vacuo. Añadir agua (500 mL) al residuo resultante, revolver durante 16 horas a RT y filtrar el sólido resultante. Lavar los sólidos recolectados con H2O y secarlos al vacío durante 16 horas para obtener el compuesto deseado (70 g, 54%) como un sólido marrón. ES/m S (m/z)(35Cl/37Cl) 267/269 [M+1]+

Los siguientes ejemplos se pueden preparar esencialmente como se describe en la Preparación 4.

Preparación 6

trans-5-[2-etilcidopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-2,4-dimetoxipirimidina

En un vial a presión de 20 mL, añadir 4-cloro-6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metilpiridazina (0,6 g, 2,0 mmol), bis(diterc-butil(4-dimetilaminofenil)fosfina)dicloropaladio (II) (114 mg, 0,16 mmol), K²CO³ (0,69 g, 4,9 mmol), H²O (2,25 mL) y trans-2-[2-etilciclopropil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano racémico (0,66 g, 3,37 mmol). Evacuar el matraz y rellenar con N². Sellar el recipiente y calentar a 90 °C durante la noche. Filtrar la mezcla de reacción sobre tierra de diatomeas, lavar la capa orgánica con agua seguida por NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO⁴ y concentrar in vacuo. Purificar el residuo resultante por medio de cromatografía de fase inversa, mediante el uso de una columna REDISEP® Gold C18 de 275 g, por medio de la elución con un gradiente de 30 a 50% de NH⁴HCO³/ACN 10mM durante 20 minutos a un caudal de 150 mL/minuto, para obtener el compuesto del título, una mezcla esencialmente racémica de isómeros (475 mg, 70%), como un sólido blanco, tras la evaporación de las fracciones cromatográficas.

Los isómeros resultantes se someten a purificación por SFC (Columna: PHENOMENEX® LUX® Cellulose-4, 4,6 * 150 mm; 40% de MeOH /CO ² isocrático; caudal: 5 mL/minuto, UV 250 nm) para obtener 0,197 g de isómero 1: t^R = 2,71 minutos (UV); y 0,195 g de isómero 2: t^R 3,55 minutos (UV), ambos en >98% ee. ES/MS (m/z): 301 (M+H). Preparación 7

trans-5-[2-Isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-2,4-dimetoxipirimidina

Combinar 4-cloro-6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metilpiridazina (1,97 g, 7,39 mmol), rac-trans-2-[2-isopropilciclopropil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (3,32 g, 15,8 mmol), bis(di-terc-butil(4-dimetilaminofenil)fosfina) dicloropaladio (II) (1,35 g, 1,85 mmol), 1,4-dioxano (37 mL) y Na2CO3 acuoso 1M (18 mL, 18 mmol). Purgar el recipiente de reacción con N2 y calentar a 90 °C durante 18 horas. Enfriar hasta RT, diluir con EtOAc (150 mL) y separar las capas. Lavar la capa orgánica secuencialmente con Na2CO3 acuoso 1M, NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4, filtrar y concentrar el filtrado in vacuo. Purificar el residuo resultante por medio de cromatografía sobre sílice, por medio de la elución con un gradiente de 60 a 100% de EtOAc/DCM, para obtener el compuesto del título como una mezcla esencialmente racémica de isómeros (1,48 g, 64%), tras la evaporación de las fracciones cromatográficas.

Los isómeros se someten a purificación por SFC (Columna: PHENOMENEX® LUX® Cellulose-4, 4,6 * 150 mm; 40% de MeOH/CO2 isocrático; caudal: 5 mL/minutos, UV 250 nm) para obtener 647 mg de isómero 1: tR = 2,56 min y 647 mg de isómero 2: tR = 3,75 min. ES/MS (m/z): 315 (M+H).

Preparación 8

(1S,2S)-2-ciclopropanocarboxilato de etilo

A una solución de 2-dietoxifosforilacetato de etilo (62,2 g, 277 mmol) en 1,4-dioxano (400 mL) enfriada en un baño de hielo/agua (temperatura interior: 8 °C) añadir una solución 2,5M de nBuLi en hexanos (110 mL, 280 mmol) gota a gota durante 10 minutos. Remover el baño de enfriamiento y revolver durante 30 minutos a RT. Transferir la solución por medio de una cánula a un recipiente a presión de 1 L y añadir (2R)-2-etiloxirano (20 g, 280 mmol). Revolver la mezcla resultante a 150 °C (50 psi de presión) durante 17 horas. Enfriar la reacción a RT y añadir agua (250 mL). Separar la fase orgánica y volver a extraer la fase acuosa con MTBE (2 * 200 mL). Combinar los extractos orgánicos, lavar con NaCl acuoso saturado (2 * 150 mL), secarlos sobre MgSO4 y concentrar in vacuo para dar el compuesto del título en bruto (49,1 g, cuantitativo) como un aceite amarillo, adecuado para su uso sin purificación adicional. GC-MS (m/z): 142 (M+), 97 (M-45).

Preparación 9

Ácido (1S,2S)-2-etilciclopropanocarboxílico

Revolver una mezcla de (1S,2S)-2-etilciclopropanocarboxilato de etilo (39,44 g, 277,4 mmol), 1,4-dioxano (315 mL) y una solución acuosa al 25% de hidróxido de sodio (315 mL) a 100 °C durante 16 horas. Enfriar la mezcla hasta RT, extraer con MTBE (2 * 300 mL) y desechar la fase orgánica. Acidificar la fase acuosa con una solución acuosa de HCl al 37% hasta un pH ~ 1-2, extraer con MTBE (3 * 300 ml), se separan las capas, lavar la capa orgánica con NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 y concentrar in vacuo para obtener el compuesto del título (25,1 g, 75%) como un aceite ámbar. RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 8: 0,79 a 0,85 (m, 1H), 1,00 (t, J=7,5 Hz, 3H), 1,22 a 1,26 (m, 1H), 1,32 a 1,42 (m, 3 H), 1,43 a 1,48 (m, 1H), 9,0 a 12,0 (br-s, 1H).

Preparación 10

(1,3-Dioxoisoindolin-2-il) (1S,2S)-2-ciclopropanocarboxilato de etilo

Revolver una suspensión de ácido (1S,2S)-2-etilciclopropanocarboxílico (25,1 g, 209 mmol), 2-hidroxiisoindolina-1,3-diona (34,8 g, 209 mmol) y DMAP (2,58 g, 20,9 mmol) en DCM (360 mL) a 0 °C y añadir N,N'-diisopropilcarbodiimida (29,3 g, 230 mmol) gota a gota. Remover el baño de enfriamiento y revolver la reacción durante 2 horas a RT. Filtrar la suspensión a través de un tapón de gel de sílice, por medio de la elución con DCM. Evaporar el disolvente y purificar el residuo resultante por medio de cromatografía sobre gel de sílice, por medio de la elución con hexano/acetona al 15%, para obtener el compuesto del título (51,56 g, 84%) como un sólido amarillo pálido, tras la remoción del disolvente de las fracciones cromatográficas. ES/MS (m/z): 260 (M+1).

Preparaci n 11

2-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano

Hacer pasar una corriente de N2 a través de una solución de (1,3-dioxoisoindolin-2-il) (1S,2S)-2-ciclopropanocarboxilato de etilo (51 g, 173,1 mmol) y bis(pinacolato)diboro (87,9 g, 346 mmol) en EtOAc (1 L) durante 5 minutos. Añadir isonicotinato de etilo (5,34 g, 35 mmol) y revolver la mezcla a 85 °C durante 24 horas. Enfriar la suspensión resultante, filtrar y desechar los sólidos, y concentrar el filtrado marrón a presión reducida. Filtrar el residuo crudo resultante sobre un tapón de gel de sílice, por medio de la elución con EtOAc/hexanos al 2%. Remover el disolvente del filtrado y repurificar el residuo resultante por medio de cromatografía sobre gel de sílice, por medio de la elución con EtOAc/hexanos al 3%, para obtener el compuesto del título (17,1 g, 49%) como un aceite incoloro, tras la remoción del disolvente de las fracciones cromatográficas. GC-MS (m/z): 180 (M-16).

Preparación 12

Ácido (2S)-2-cloro-3-metil-butanoico

Enfriar una solución de L-valina (286 g, 2,44 mol) y una solución acuosa 5M de HCl (3,25 L, 16,3 mol) a 0 °C. Añadir gota a gota una solución acuosa 4M de NaNO2 (1 L, 4 mol) durante 2 horas, mientras se mantiene la temperatura interna por debajo de 5 °C. Revolver la reacción durante 2 horas mientras se calienta a RT, y revolver otras 16 horas a RT. A lo largo de 30 minutos, añadir porciones de Na2CO3 (242 g, 2,28 mol). Extraer la solución resultante con MTBE (3 x 1000 mL), lavar los extractos orgánicos combinados con NaCl acuoso saturado (500 mL), secar los extractos orgánicos sobre MgSO4 y concentrar in vacuo. Purificar el residuo resultante por destilación al vacío (15 mbar/140 °C) para obtener el compuesto del título (248 g, 68%) como un aceite. RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8: 1,1 (dt, J=6,6, 2,6 Hz, 6H), 2,34 a 2,42 (m, 1H), 4,19 a 4,23 (m, 1H), 10,0 a 12,0 (br-s, 1H).

Preparación 13

(2S)-2-Cloro-3-metil-butan-1-ol

Enfriar una solución de ácido (2S)-2-cloro-3-metil-butanoico (137 g, 1 mol) en 2-metiltetrahidrofurano (500 mL) hasta 0 °C. Añadir una solución 2,3M de LAH en metiltetrahidrofurano (480 mL, 1,1 mol) gota a gota durante 2,5 horas, mientras se mantiene la temperatura interna por debajo de 10 °C. Calentar a RT y revolver la mezcla durante 1 hora a RT y 1 hora a 50 °C. Enfriar la reacción a 0 °C y añadir secuencialmente y lentamente H2O (1,48 mL), solución acuosa de NaOH al 15% (1,48 mL) y H2O (4,46 mL). Permitir que la mezcla se caliente hasta RT, filtrar a través de un lecho de tierra de diatomeas y evaporar el disolvente in vacuo para obtener el compuesto del título (110 g, 81%) como un aceite incoloro. RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8: 0,97 a 1,1 (m, 6H), 1,94 a 2,18 (m, 1H), 2,60 a 3,09 (br-s, 1H), 3,71 a 3,78 (m, 1H), 3,80 a 3,85 (m, 1H), 3,90 a 3,96 (m, 1H).

Preparación 14

(2R)-2-Isopropiloxirano

Enfriar una solución de KOH (195 g, 3,48 mol) en H2O (195 mL) hasta 0 °C y añadir (2S)-2-cloro-3-metil-butano-1-ol puro (110 g, 801 mmol) durante 20 minutos mientras se mantiene la temperatura interna por debajo de 5 °C. Dejar que la mezcla de reacción se caliente hasta RT. Purificar la mezcla de reacción por destilación al vacío a 100 mbar, calentando de 23 °C a 50 °C, para obtener el compuesto del título (47 g, 64%) como un aceite incoloro. RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 8: 0,98 (d, J=6,9 Hz, 3H), 1,05 (d, J=6,9 Hz, 3H), 1,51 (o, J=6,9 Hz, 1H), 2,52 a 2,54 (m, 1H), 2,70 a 2,75 (m, 2H).

Preparación 15

(1S,2R)-2-isopropMcidopropanocarboxMato de etilo

Añadir una solución 2,5M de nBuLi en hexanos (310 mL, 780 mmol) a una solución de 2-dietoxifosforilacetato de etilo (153 mL, 772 mmol) en 1,4-dioxano (870 mL) enfriada en un baño de hielo/agua (temperatura interior: 8 °C) gota a gota durante 25 minutos. Calentar a RT y revolver durante 40 minutos. Transferir la solución por medio de una cánula a un recipiente a presión de 3 L y añadir (2R)-2-isopropiloxirano (70 g, 772 mmol) en 1,4-dioxano (180 mL). Revolver la mezcla de reacción a 150 °C a 50 psi de presión durante 14 horas. Enfriar la mezcla de reacción a RT y añadir H2O (700 mL). Separar las capas y volver a extraer la fase acuosa con MTBE (2 * 500 mL). Combinar las fases orgánicas, lavarlas con NaCl acuoso saturado (2 * 350 mL), secarlas sobre MgSO4 y concentrar in vacuo para obtener el compuesto del título en bruto (107,7 g, >99%) como un aceite amarillo, apto para su uso posterior sin más purificación. GC-MS (m/z): 156 (M+).

Preparación 16

Ácido (1S,2R)-2-Isopropilciclopropanocarboxílico

Revolver una mezcla de (1S,2R)-2-isopropilciclopropanocarboxilato de etilo (107,7 g, 482,6 mmol) en 1,4-dioxano (800 mL) que contiene una solución acuosa al 25% de NaOH (800 mL) a 100 °C durante 7 horas. Enfriar la mezcla hasta RT, añadir agua (300 mL), extraer con MTBE (2 * 500 mL) y desechar la fase orgánica. Acidificar la fase acuosa con una solución acuosa de HCl al 37% (aproximadamente 500 mL) hasta un pH ~ 1-2.

Extraer la mezcla acuosa acidificada con MTBE (2 * 600 mL), lavar la capa orgánica con NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 y concentrar in vacuo, para obtener el compuesto del título (54,2 g, 75%) como un aceite ámbar. RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 8: 0,81 a 0,86 (m, 1H), 1,01 (dd, J=5,9, 3,7 Hz, 6H), 1,04 a 1,13 (m, 1H), 1,20 a 1,24 (m, 1H), 1,28 a 1,37 (m, 1H), 1,39 a 1,44 (m, 1H).

Preparación 17

(1,3-Dioxoisoindolin-2-il) (1S,2R)-2-isopropilciclopropanocarboxilato

Revolver una suspensión de ácido (1S,2R)-2-isopropilciclopropanocarboxílico (54,2 g, 359 mmol), 2-hidroxiisoindolina-1,3-diona (59,8 g, 359 mmol) y DmAP (4,44 g, 35,9 mmol) en DCM (690 mL) a 0 °C. Añadir N,N'-diisopropilcarbodiimida (50,4 g, 395 mmol) gota a gota, calentar a RT y revolver la mezcla de reacción resultante durante 2 horas a RT. Añadir H2O (600 mL) y separar las fases. Extraer la fase acuosa con DCM (2 * 300 mL), combinar las fases orgánicas, secar sobre MgSO4, filtrar y evaporar. Purificar el residuo sólido resultante por medio de cromatografía sobre sílice, por medio de la elución con DCM al 100%, para obtener el compuesto del título (96 g, 88%) como un sólido amarillo pálido, tras la evaporación de las fracciones cromatográficas. ES/MS (m/z): 274 (M+1).

Preparación 18

2-[(1S,2S)-2-isopropilciclopropil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano

Hacer pasar una corriente de nitrógeno a través de una solución de (1,3-dioxoisoindolin-2-il) (1S,2S)-2-isopropilciclopropanocarboxilato (96 g, 316 mmol) y bis(pinacolato)diborón (160 g, 630 mmol) en EtOAc (480 mL) durante 15 minutos. Revolver la mezcla a 85 °C y añadir isonicotinato de etilo (24,38 g, 157 mmol) gota a gota durante 10 minutos. Revolver la mezcla resultante a 85 °C durante 16 horas. Enfriar la suspensión resultante, filtrar y desechar los sólidos, y evaporar el filtrado marrón a presión reducida. Filtrar el residuo crudo sobre un tapón de gel de sílice, por medio de la elución con EtOAc/hexanos al 2%. Remover el disolvente del filtrado y repurificar el residuo resultante por medio de cromatografía sobre gel de sílice, por medio de la elución con EtOAc/hexanos al 3%, para obtener el compuesto del título (25,3 g, 38%) como un aceite incoloro, tras la remoción del disolvente de las fracciones cromatografías. RMN de 1H (400 MHz, CDCI3): -0,33 a -0,38 (m, 1H), 0,42 a 0,47 (m, 1H), 0,63 a 0,67 (m, 1H), 0,75 a 0,82 (m, 1H), 0,89 a 1,02 (m, 1H), 0,98 (m, 6H), 1,24 (s, 12H).

Preparación 19

4,4,5,5-Tetrametil-2-[(E)-4-metilpent-1-enil]-1,3,2-dioxaborolano

Disolver ácido [(E)-4-metilpent-1-enil]borónico (0,975 g, 7,62 mmol) y pinacol (1,11 g, 9,14 mmol) en DCM seco (9,7mL). Añadir MgSO4 (0,7313 g, 6,05 mmol) y revolver a temperatura ambiente durante 3 días. Filtrar los sólidos insolubles y remover el disolvente a presión reducida para obtener el compuesto del título como un aceite claro (1,6g, 100%). RMN de 1H (400,13 MHz, DMSO): 0,86 (d, J=6,6 Hz, 6H), 1,08 (s, 6H), 1,19 (s, 12H), 1,62 a 1,72 (m, 1H), 2,01 (td, J=6,9, 1,4 Hz, 2H), 3,92 (s, 1H), 5,31 (dt, J=17,9, 1,3 Hz, 1H), 6,47 (dt, J=17,9, 6,9 Hz, 1H).

Preparación 20

terc-Butil-[(2S)-oxiran-2-il]metoxi]-difenil-silano

A una solución helada de [(2R)-oxiran-2-il]metanol (15,0 g, 202,6 mmol) en DMF (135 mL) añadir imidazol (33,34 g, 489,8 mmol) y revolver durante 15 minutos. Añadir terc-butil-cloro-difenil-silano (77 mL, 302,5 mmol,) gota a gota durante 30 min y revolver durante toda la noche a temperatura ambiente. Diluir con hexanos (1L), éter (500 ml) y agua (1L). Separar las capas y extraer la capa acuosa con éter (2 * 1 L). Combinar los orgánicos y lavar con agua (3 x 750 mL), NaHCO3 sat., NaCl acuoso saturado y secar sobre MgSO4. Evaporar el disolvente a presión reducida. Purificar por cromatografía en gel de sílice: eluyente de 0 a 10% EtOAc en hexanos para obtener el compuesto del título (11,77 g, 18%) como un aceite, tras la remoción del disolvente de la fracción cromatográfica. RMN de 1H (400,13 MHz, CDCh): 1,08 (s, 9H), 2,64 (dd, J=2,6, 5,1 Hz, 1H), 2,77 (t, J=4,6 Hz, 1H), 3,15 (quinteto, J=3,5 Hz, 1H), 3,73 (dd, J=4,7, 11,8 Hz, 1H), 3,88 (dd, J=3,2, 11,9 Hz, 1H), 7,40 a 7,48 (m, 6H), 7,71 (m, 4H).

Preparación 21

(1S,2S)-2-(hidroximetil)ciclopropanocarboxilato de etilo

Añadir lentamente fosfonoacetato de trietilo (7,5 mL, 38 mmol) a una suspensión de terc-butóxido de sodio (3,67 g, 37,82 mmol) en 1,4-dioxano (40 mL) a temperatura ambiente. Después de 1 hora añadir terc-butil-[(2S)-oxiran-2-il]metoxi]-difenil-silano (11,77 g, 33,76 mmol) y calentar a 140 °C durante la noche en un recipiente a presión cerrado. Añadir más fosfonoacetato de trietilo (2 mL) y calentar a 160 °C durante una hora. Dejar enfriar la mezcla y diluir con DCM (300 ml) y agua (150 mL). Separar las capas, extraer la capa acuosa con DCM (3 * 150 mL). Combinar los orgánicos y lavar con NaHCO3 acuoso saturado, NaCl acuoso saturado y secar sobre MgSO4. Filtrar a través de tierra de diatomeas y evaporar el disolvente a presión reducida para obtener ciclopropanocarboxilato de etilo (1S,2S)-2-[[terc-butil(difenil)silil]oximetilo] (18,45 g) como un aceite. Disolver en THF (75 mL) y añadir fluoruro de tetrabutilamonio (1 M THF, 67 mL, 67 mmol, 1,0 M) a temperatura ambiente. Revolver durante 48 horas y eliminar el disolvente a 130 mbar y 30 °C. Purificar por cromatografía en gel de sílice, eluyente: 0 a 50% EtOAc en hexanos para aislar el compuesto del título (3,35 g, 62%) como un aceite, tras la remoción del disolvente de la fracción cromatográfica. ES/MS (m/z): 142 (M+1). RMN de 1H (400,13 MHz, CDCh): 0,90 a 0,86 (m, 1H), 1,23 (dd, J=4,5, 8,9 Hz, 1H), 1,28 (t, J=7,2 Hz, 4H), 1,56 a 1,60 (m, 1H), 1,69 a 1,77 (m, 2H), 2,06 (s, 2H), 3,50 (dd, J=6,9, 11,5 Hz, 1H), 3,64 (dd, J=6,0, 11,4 Hz, 1H), 4,14 (qd, J=7,1,2,9 Hz, 3H).

Preparaci n 22

(1S,2S)-2-formilciclopropanocarboxilato de etilo

A una solución enfriada con hielo de (1S,2S)-2-(hidroximetN)ddopropanocarboxNato de etilo (12,25 g, 84,9 mmol,) en DCM (425 mL), añadir dorocromato de piridinio (26,09 g, 118,6 mmol) en una porción. Después de 30 minutos, remover el baño de hielo y revolver a temperatura ambiente durante 4 horas. Añadir agua (200 mL) y filtrar a través de tierra de diatomeas. Aclarar con más agua (100 mL) y DCM (800 mL). Suspender la torta de tierra de diatomeas en DCM y filtrar. Repetir esta operación dos veces. Combinar los orgánicos, separar la capa de agua y filtrar los orgánicos a través de una almohadilla de sílice. Enjuagar con DCM adicional y evaporar el disolvente a presión reducida para obtener el compuesto del título (11,0 g, 91%) en forma de aceite. RMN de 1H (400,13 MHz, CDCh): 1,30 (t, J=7,3 Hz, 3H), 1,57 a 1,50 (m, 1H), 1,60 a 1,65 (m, 2H), 2,26 a 2,30 (m, 1H), 2,45 (td, J=9,0, 4,2 Hz, 1H), 4,13 a 4,22 (m, 3H), 9,32 (d, J=4,2 Hz, 1H).

Preparación 23

(1S,2S)-2-(difluorometil)ciclopropanocarboxilato de etilo

Añadir trifluoruro de dietilaminosulfuro (24 mL, 172,3 mmol) a una solución helada de (1S,2S)-2-formilciclopropanocarboxilato de etilo (11,00 g, 77,38 mmol) en DCM (220 mL) durante 3 minutos. Después de 1 hora, remover del baño de hielo y revolver a temperatura ambiente durante 2 horas. Añadir trifluoruro de dietilaminosulfuro (3,5 mL) y revolver durante una hora más. Enfriar la mezcla en un baño de hielo y verterla cuidadosamente en NaHCO3 acuoso saturado. Separar las capas y extraer la capa acuosa con DCM (2 * 50 mL). Combinar los orgánicos y secar sobre MgSO4. Filtrar la muestra a través de una pequeña almohadilla de sílice y evaporar el disolvente a presión reducida (250 mbar y 30 °C) para proporcionar el compuesto del título (11,10 g, 87%) como un aceite. RMN de 1H (400,13 MHz, CDCh): 1,14 a 1,19 (m, 1H), 1,29 (m, 1H), 1,30 (t, J=7,2 Hz, 3H), 1,97 a 1,89 (m, 2H), 4,22 (q, J=7,2 Hz, 3H), 5,79 (td, JH-F=56,8 Hz, J=3,6 Hz, 1H).

Preparación 24

Ácido (1S,2S)-2-(Difluorometil)ciclopropanocarboxílico

Añadir NaOH 1N (75 mL) a una solución de (1S,2S)-2-(difluorometil) ciclopropanocarboxilato de etilo (11,10 g, 67,62 mmol) en MeOH (75 mL) y revolver a temperatura ambiente durante la noche. Añadir DCM (70 mL) y separar las capas. Extraer la capa acuosa con DCM (70 mL). Enfriar la capa acuosa en un baño de hielo y ajustar el pH a 1 por medio de la adición de HCl al 35%. Añadir DCM (50 mL) y separar las dos capas. Extraer la capa acuosa con DCM. Combinar los orgánicos, secar sobre MgSO4 y evaporar el disolvente a presión reducida (200 mbar, 30 °C) para obtener el compuesto del título (6,25 g, 68%) en forma de aceite. RMN de 1H (400,13 MHz, CDCla): 1,26 (dt, J= 8,4, 5,9 Hz, 1H), 1,34 a 1,39 (m, 1H), 1,92 a 1,96 (m, 1H), 2,01 a 2,07 (m, 1H), 5,82 (td, JH-F=59Hz, J=3,2 Hz, 1H). Preparación 25

7rans-bencN-2-acetNcidopropanocarboxNato

Añadir K²CO³ (36,2 g, 261,93 mmol) a una mezcla de bencilbromoacetato (40 g, 174,618 mmol), metil vinil cetona (43 mL, 523,85 mmol), 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (2,3 g, 20,9 mmol) en acetonitrilo (400 mL). Revolver bajo N² a 80 °C durante la noche. Dejar enfriar, filtrar y evaporar el disolvente a presión reducida. Purificar por cromatografía en gel de sílice, eluyente 0 a 50% EtOAc/hexano para obtener el compuesto del título (13,4 g, 35%), tras la remoción del disolvente de las fracciones cromatográficas. RMN de 1H (400,13 MHz, d⁶-DMSO): 1,33-1,39 (m, 2H), 2,08 a 2,13 (m, 1H), 2,24 (s, 3H), 2,54 a 2,59 (m, 2H), 5,13 (s, 2H), 7,39 a 7,37(m, 6H).

Preparación 26

Ciclopropanocarboxilato de trans-bencil-2-(1,1-difluoroetilo)

Añadir EtOH (0,05 eq) a una mezcla de frans-bencil-2-acetilciclopropanocarboxilato (2,76 g, 12,6 mmol) y trifluoruro de bis(2-metoxietil)aminosulfuro (23,2 mL, 126 mmol) a 0 °C. Dejar que se caliente a temperatura ambiente y calentar a 50 °C durante 40 horas. Diluir con DCM y enfriar la mezcla en un baño de hielo para añadir lentamente la solución acuosa saturada de NaHCO³. Separar las capas y extraer la capa acuosa con DCM (2 * 100 mL). Combinar los orgánicos y secar sobre Na²SO⁴ anhidro. Evaporar el disolvente a presión reducida. Purificar por cromatografía en gel de sílice, eluyente: 10% de MTBE/hexano para obtener el compuesto del título (2,30 g, 76%) como un aceite incoloro, tras la remoción del disolvente de las fracciones cromatográficas. RMN de 1H (400,13 MHz, d⁶-DMSO): 1,19 (t, J=7,5 Hz, 2H), 1,67 (t, J H-F=16 Hz, 3H), 1,93 a 1,98 (m, 1H), 2,00 a 2,08 (m, 1H), 5,13 (s, 2H), 7,38 a 7,40 (m, 5H).

Preparación 27

Ácido trans-2-(1,1-difluoroetil)ciclopropanocarboxílico

Añadir un 10% de Pd/C (1,53 g, 14,4 mmol) a una solución de frans-bencil-2-(1,1-difluoroetil)ciclopropanocarboxilato (6,56 g, 27,3 mmol) en EtOAc (136 mL, 0,2 M). Revolver a RT bajo H² mediante el uso de un globo durante 3 horas. Filtrar a través de tierra de diatomeas y enjuagar con EtOAc. Evaporar el disolvente a presión reducida para obtener el compuesto del título (4,03 g, 98%) como un aceite incoloro. RMN de 1H (400,13 MHz, d⁶-DMSO): 1,10 (t, J=7,4 Hz, 2H), 1,66 (t, J H-F= 18,4 Hz, 3H), 1,72 a 1,77 (m, 1H), 1,96 a 1,99 (m, 1H), 12,49 (s, 1H).

Preparación 28

5-[5-[(1S,2S)-2-Etilciclopropil]-6-metil-piridazin-3-il]-2,4-dimetoxi-pirimidina

Desgasificar una mezcla de 4-cloro-6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metilpiridazina (16 g, 54,0 mmol), 2-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (17 g, 83,22 mmol), una solución acuosa 2 M de Na2CO3 (70 mL, 140 mmol) y 1,4-dioxano (290 mL) por medio del burbujeo de N2 a través de la mezcla durante 10 minutos. Añadir bis(di-terc-butil(4-dimetilaminofenil)fosfina)dicloropaladio (II) (2,0 g, 2,74 mmol) y revolver la mezcla resultante a 90 °C durante 16 horas. Enfriar la mezcla de reacción hasta RT, diluir con H2O y extraer con EtOAc. Separar las fases resultantes, secar la fase orgánica sobre MgSO4 anhidro y concentrar in vacuo. Purificar el residuo resultante por cromatografía sobre sílice, por medio de la elución con un gradiente de 60 a 100% de hexanos/EtOAc, para obtener el compuesto del título (12,95 g, 77%) como un aceite ámbar, tras la remoción del disolvente de las fracciones cromatográficas. El aceite se solidifica al permanecer a temperatura ambiente y se convierte en un sólido blanquecino. ES/MS (m/z): 301 (M+1).

Preparación 29

5-[5-[(1S,2R)-2-Isopropilciclopropil]-6-metil-piridazin-3-il]-2,4-dimetoxi-pirimidina

Mezclar 4-cloro-6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metilpiridazina (19,1 g, 70,6 mmol), K³PO⁴ (45,9 g, 212 mmol), 1,4-dioxano (300 mL) y H²O (75 mL) y desgasificar la mezcla con N² durante 10 minutos. Añadir [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloro paladio(II) (7,98 g 10,6 mmol). Burbujear con nitrógeno durante 2 minutos más y añadir 2-[(1S,2S)-2-isopropilcidopropil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (22,2 g, 106 mmol) en una porción. Revolver la mezcla resultante a 80 °C durante 16 horas. Enfriar la reacción a RT, añadir H2O y extraer con EtOAc. Separar la capa orgánica, secar sobre MgSO4 anhidro y concentrar a presión reducida. Purificar el residuo resultante por cromatografía sobre sílice, por medio de la elución con 85% de hexanos/EtOAc, para aislar el compuesto del título (21,5 g, 92%) como un aceite ámbar, tras la remoción del disolvente de la fracción cromatográfica. El aceite se solidifica en reposo a temperatura ambiente hasta convertirse en un sólido blanquecino.. ES/MS (m/z): 315 (M+1).

Preparación 30

4-[(1S,2S)-2-(Difluorometil)cidopropil]-6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metilpiridazina

Añadir dimetilcinc (2 M en tolueno, 1,5 mL, 3,0 mmol) a una suspensión desgasificada de 3-cloro-4-[(1S,2S)-2-(difluorometil)ciclopropil]-6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)piridazina (502 mg, 1,46 mmol) y dicloruro de 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno-paladio (II) (53 mg, 0,07 mmol) en THF (6 mL). Calentar a 60 °C en un vial cerrado durante 2 horas. Dejar enfriar a temperatura ambiente. Añadir una solución acuosa saturada de NH4Cl y extraer con DCM (3x). Combinar los orgánicos, secar sobre MgSO4 anhidro y eliminar el disolvente a presión reducida. Purificar por cromatografía en gel de sílice, eluyente: EtOAc, para obtener el compuesto del título como residuo amarillo (433 mg, 91,8%), tras la remoción del disolvente de las fracciones cromatográficas. ES/MS (m/z): 323 (M+1).

Preparación 31

3,6-Dicloro-4-ciclopropil-piridazina

A una suspensión de 3,6-dicloropiridazina (10,00 g, 67,12 mmol) en agua (300 mL) añadir 10 mL de H²SO⁴ concentrado y ácido ciclopropanocarboxílico (5,85 mL, 73,7 mmol), calentar a 70 °C y desgasificar con N². Añadir una solución de AgNO³ (2,28 g, 13,4 mmol) en 10 mL de H²O durante 30 segundos, seguida por la adición gota a gota de una solución de (NH⁴)²S²O⁸(46 g, 201,577 mmol) en 150 mL de H²O durante 30 minutos. Después de una hora, dejar que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente y vertirla en hielo, ajustar el pH a 9 por medio de la adición de NH⁴OH concentrado. Diluir con EtOAc y separar la capa orgánica. Extraer la capa acuosa con EtOAc adicional. Combinar los orgánicos, secar sobre Na²SO⁴ anhidro y evaporar el disolvente a presión reducida. Purificar por cromatografía de fase inversa (C18 Gold 415 g, gradiente 25 a 100% ACN en 10 mM de bicarbonato de amonio; 150 mL/min, durante 30 min) para aislar el compuesto del título (6,83 g, 54%) como un sólido blanco, tras la remoción del disolvente de las fracciones cromatográficas. ES/MS (m/z): (³⁵Cl/³⁷Cl) 189/191.

Los siguientes ejemplos se pueden preparar esencialmente como se describe en la Preparación 22.

Preparación 43

3-Cloro-4-cidopropM-6-(2,4-dimetoxipirimidm-5-M)piridazma

Mezclar ácido (2,4-dimetoxipirimidin-5-il)borónico (4,60 g, 25,0 mmol), la 3,6-dicloro-4-ciclopropilpiridazina (5,2 g, 28 mmol) y K2CO3 (4,4 g, 32 mmol), 1,4-dioxano (125 mL) y H2O (42 mL) y desgasificar la mezcla con N2 durante 10 minutos. Añadir el complejo de [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloro paladio (II) diclorometano (1,5 g, 1,8 mmol) y desgasificar más con N2. Revolver la mezcla resultante a 60 °C durante 1 hora. Enfriar la reacción a RT, añadir H2O y extraer con EtOAc. Separar la capa orgánica. Extraer la capa acuosa con EtOAc adicional. Combinar los orgánicos, secar sobre Na2SO4 anhidro y evaporar el disolvente a presión reducida. Purificar el residuo resultante por cromatografía sobre sílice, por medio de la elución con hexanos/(3:2 Acetona:DCM) al 70%, para aislar el compuesto del título (2,4 g, 33%) como un sólido amarillo claro, tras la remoción del disolvente de las fracciones cromatográficas. ES/MS (m/z): (35Cl/37Cl) 293/295 [M+1]+

Los siguientes ejemplos se pueden preparar esencialmente como se describe en la Preparación 6.

Preparación 52

4-Ciclobutil-6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metoxi-piridazina

3-Cloro-4-cidobutil-6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)piridazina obtenida de acuerdo con las preparaciones 21 y 33 a partir del ácido ciclobutílico.

Añadir 3-cloro-4-ciclobutil-6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)piridazina (0,42 g, 1,4 mmol) a una solución de NaOMe preparada por medio de la disolución de Na (0,16 g, 6,8 mmol) en MeOH (12 mL). Calentar la mezcla en un vial tapado a 60 °C durante la noche. Dejar que la mezcla se enfríe hasta RT, añadir NaCl acuoso saturado al 50% y extraer con DCM (3x). Combinar los orgánicos y secar sobre MgSO4 anhidro. Eliminar el disolvente a presión reducida para obtener el compuesto del título (0,38 g, 93%) como un sólido blanco. ES/MS (m/z): 303 (M+1).

Los siguientes ejemplos se pueden preparar esencialmente como se describe en la Preparación 52.

Preparación 59

Trans-terc-butM-dimetM-[2-[2-(4,4,5,5-tetrametiM,3,2-dioxaborolan-2-M)cidopropM]etoxi]sMano

Se puede preparar esencialmente como se describe en la Preparación 3 a partir de terc-butil-dimetil-[(E)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)but-3-enoxi]silano disponible en el mercado. RMN de 1H (400,13 MHz, CdCI3): 3,70 a 3,66 (m, 2H), 1,51 a 1,38 (m, 2H), 1,23 (s, 12H), 1,04 a 0,96 (m, 1H), 0,91 (s, 9H), 0,71 a 0,67 (m, 1H), 0,46 a 0,41 (m, 1H), 0,07 (s, 6H), -0,38 (dt, J= 9,3, 5,8 Hz, 1H).

Preparación 60

Trans-terc-butN-dimetN-[2-[6-(2,4-dimetoxipirimidm-5-M)-3-metN-piridazm-4-N]cidopropM]etoxi]sMano

Se puede preparar esencialmente como se describe en la Preparación 4. ES/MS (m/z): 417 (M+1).

Preparación 61

Trans-2-[2-[6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metilpiridazin-4-il]ciclopropil]etanol

Añadir fluoruro de tetrabutilamonio (5 mL, 5 mmol, 1 M en THF) y trans-terc-butil-dimetil-[2-[6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metil-piridazin-4-il]cidopropil]etoxi]silano (1,15 g, 8,9 mmol) en DCM (3 mL) y revolver a 60 °C durante 1 hora. Enfriar a temperatura ambiente. Diluir con DCM (80 mL) y lavar con NH4Cl saturado (3x30 mL). Combinar los orgánicos, secar sobre Na2SO4 anhidro y eliminar el disolvente a presión reducida. Purificar por cromatografía en gel de sílice, eluyente de 0 a 30% de MeOH/EtOAc para obtener el compuesto del título (0,53 g, 53%) como un sólido blanco, tras la remoción del disolvente de las fracciones cromatográficas. ES/MS (m/z): 317 (M+1). RMN de 1H (399,80 MHz, CDCh): 8,92 (s, 1H), 7,29 (m, 1H), 4,03 (s, 3H), 4,02 (s, 3H), 3,81 (t, J= 6,2 Hz, 2H), 2,76 (s, 3H), 1,73 (m, 3H), 1,26 (m, 2H), 1,03 (m, 2H).

Preparación 62

Metanosulfonato de trans-2-[2-[6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metilpiridazin-4-il]ciclopropil]etilo

Añadir cloruro de metanosulfonilo (0,2 mL, 3 mmol) a una solución de trans-2-[2-[6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metilpiridazin-4-il]ciclopropil]etanol (0,390 g, 1,22 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (0,4 mL, 2 mmol) en DCM (8 mL) a 0 °C bajo N2. Revolver a 0 °C durante 40 minutos. Diluir con 50 mL de DCM y lavar con NaHCO3 al 5% (2 * 30 mL) y agua (30 mL). Combinar los orgánicos, secar sobre Na2SO4 anhidro y evaporar el disolvente a presión reducida. Purificar por cromatografía en gel de sílice, eluyente: 0 a 20% de MeOH/EtOAc, para obtener el compuesto del título como un sólido marrón (0,280 g, 58%), tras la remoción del disolvente de las fracciones cromatográficas. ES/MS (m/z): 395 (M+1). RMN de 1H (399,80 MHz, CDCla): 8,98 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 4,37 (t, J= 6,2 Hz, 2H), 4,07 (s, 3H), 4,05 (s, 3H), 3,01 (s, 3H), 2,81 (s, 3H), 2,04 (m, 1H), 1,90 a 1,78 (m, 2H), 1,27 (m, 1H), 1,06 (t, J= 7,1 Hz, 2H).

Preparación 63

Trans-2,4-dimetoxi-5-[6-metil-5-[2-(2-fluoroetil)ciclopropil]piridazin-3-il]pirimidina

Añadir fluoruro de tetrabutilamonio hidratado (3 mL, 3 mmol, 1 M en THF) a una solución de metanosulfonato de trans-2-[2-[6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metilpiridazin-4-il]cidopropil]etilo (0,280 g, 0,71 mmol) en THF (3 mL). Calentar a 70 °C durante 2 horas. Enfriar hasta RT. Diluir con EtOAc, lavar con NaCI acuoso saturado, secar sobre Na²SO⁴ anhidro y eliminar el disolvente a presión reducida. Purificar por cromatografía en gel de sílice, eluyente: 0 a 20% de MeOH/EtOAc, para obtener el compuesto del título como un aceite amarillo pálido (0,170g, 71%), tras la remoción del disolvente de las fracciones cromatográficas. ES/MS (m/z): 319 (M+1). RMN de 1H (399,80 MHz, CDCl^a): 9,01 (m, 1H), 7,39 (s, 1H), 4,67 a 4,52 (dt, J H-F 48 Hz, J= 6,7 Hz, 2H), 4,08 (s, 3H), 4,07 (s, 3H), 2,83 (s, 3H), 2,00 a 1,94 (m, 3H), 1,27 (m, 1H), 1,06 (m, 2H).

Separación quiral: columna Lux Cellulose-4, 250 * 21 mm, caudal 70g/min, eluyente: 40% de MeOH/CO².

Enantiómero 1 >99% ee, rt 2,59 min (Lux Cellulose-4, 4,6 * 150 mm, 40% de MeOH/CO², 5 mL/min, 225 nm). Enantiómero 2 > 99% ee. rt 3,34 min (Lux Cellulose-4, 4,6 x 150 mm, 40% de MeOH/CO², 5 mL/min, 225 nm). Ejemplo 1

5-[5-[(1S,2S)-2-etMcidopropM]-6-metN-piridazm-3-M]-1H-pirimidm-2,4-diona

Disolver el isómero 1 de la 5-[5-[(-2-etilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-2,4-dimetoxipirimidina (197 mg, 0,66 mmol) en una solución acuosa 1 M de HCl (4 mL) y calentar la mezcla resultante a 70 °C durante la noche. Se enfría la mezcla de reacción a temperatura ambiente, se congela en un baño de acetona/hielo seco a -78 °C y remover el disolvente por liofilización para obtener el compuesto del título (0,176 g, 97%) como un sólido amarillo pálido. ES/MS (m/z): 273 (M+H). RMN de ¹ H (d⁶-DMSO) 8: 1,00 (t, J= 7,3 Hz, 3H), 1,11 a 1,16 (m, 1H), 1,27-1,33 (m, 2H), 1,47 a 1,52 (m, 2H), 1,92 a 1,96 (m, 1H), 2,80 (s, 3H), 8,00 (s, 1H), 8,41 (d, J= 5,5 Hz, 1H), 11,73 (s, 1H), 11,99 a 11,91 (m, 1H).

Procedimiento alternativo para los Ejemplos 1 a 5

Revolver una suspensión de 5-[5-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-2,4-dimetoxipirimidina (16,2 g, 51,5 mmol) y una solución acuosa 1 M de HCl (135 mL, 135 mmol) a 45 °C durante 16 horas. Enfriar hasta RT, añadir una solución acuosa 2 M de K²HPO⁴ a pH ~ 6 (aproximadamente 150 mL), y revolver a RT durante 16 horas. Filtrar y recolectar el sólido resultante, lavar con agua y secar en estufa de vacío a 45 °C durante 16 horas para obtener el compuesto del título (13,8 g, 93%) como un sólido blanco. ES/MS (m/z): 273 (M+1). Cristalización de 5-[5-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona

Disolver 5-[5-[(1S,2S)-2-ciclopropil]-6-metil-piridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona en metanol, agitar a 50 °C durante 1 hora y dejar enfriar a temperatura ambiente, en la que se cristaliza de la solución. Aislar los sólidos por filtración al vacío y secarlos brevemente al vacío a 70 °C.

Ejemplo 2

5-[5-[(1S,2R)-2-Isopropilciclopropil]-6-metil-piridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona

Disolver el isómero trans-5-[5-[2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-2,4-dimetoxipirimidina 1 (628 mg, 2,00 mmol) en MeOH (3 mL). Añadir una solución acuosa 1 M de HCl (5 mL) y calentar a 70 °C durante 3 horas. Enfriar hasta RT, cargar la mezcla de reacción en la columna SCX lavada con MeOH (20 g, Silicicle SILIABOND Tosic Acid), lavar la columna SCX con MeOH (140 mL) y eluir el producto deseado con 2 M NH³/MeOH (140 ml). Concentrar las fracciones de NH³/MeOH para obtener el compuesto del título como un sólido de color crema (546 mg, 95%). ES/MS (m/z): 287 (M+H). RMN de 1H (d6-DMSO) 8: 0,99 (m, 9H), 1,24 (m, 1H), 1,81 (m, 1H), 2,72 (s, 3H), 7,67 (s, 1H), 8,23 (s, 1H), 11,43 (bs, 2H).

Procedimiento alternativo para los Ejemplos 1 a 5

Revolver una suspensión de 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-2,4-dimetoxipirimidina (21,5 g, 65,6 mmol) y una solución acuosa de HCl 1 M (165 mL, 135 mmol) a 45 °C durante 16 horas. Enfriar hasta RT y extraer con MTBE. Descartar la fase orgánica y añadir a la fase acuosa una solución acuosa 2 M de K²HPO⁴ hasta p H ~ 6 ( a p r o x i m a d a m e n t e 150 m L ) . R e v o l v e r la m e z c l a r e s u l t a n t e a R T d u r a n t e 16 h o r a s . F i l t r a r y r e c o l e c t a r e l s ó l i d o r e s u l t a n t e , l a v a r c o n a g u a y s e c a r e n u n a e s t u f a d e v a c í o a 45 ° C d u r a n t e 16 h o r a s p a r a o b t e n e r e l c o m p u e s t o d e l t í t u l o ( 14 , 3 g , 76 % ) c o m o u n s ó l i d o b l a n c o . E S / M S (m / z ) : 287 ( M 1 ) .

Ejemplo 3

-[5-[2-(DifluorometM)ddopropM]-6-metM-pmdazm-3-M]-1H-pirimidm-2,4-diona

5 -[ 5 -[ 2 -( D i f l u o r o m e t i l ) c i c l o p r o p i l ] - 6 - m e t i l - p i r i d a z i n - 3 - i l ] - 1 H - p i r i m i d i n - 2 , 4 - d i o n a s e p u e d e p r e p a r a r e s e n c i a l m e n t e c o m o s e d e s c r i b e e n e l E j e m p l o 1.

L o s s i g u i e n t e s e j e m p l o s s e p u e d e n p r e p a r a r e s e n c i a l m e n t e c o m o s e d e s c r i b e e n e l E j e m p l o 1.

Ejemplo 7

5-(6-d oro-5-d d opropM-pÍNdazm -3-M)-1H-pirimidm -2,4-diona

A ñ a d i r H C l 1 M ( 14 m L , 14 m m o l ) a u n a s o l u c i ó n d e 3 - c l o r o - 4 - c i c l o p r o p i l - 6 -( 2 , 4 - d i m e t o x i p i r i m i d i n - 5 - i l ) p i r i d a z i n a ( 1, 0 g , 3 , 4 m m o l ) e n M e O H ( 17 m L ) y r e v o l v e r a 50 ° C d u r a n t e la n o c h e . E l i m i n a r e l d i s o l v e n t e a p r e s i ó n r e d u c i d a p a r a o b t e n e r e l c o m p u e s t o d e l t í t u l o ( 0 , 9 g , 100 % ) c o m o u n s ó l i d o b l a n c o . E S / M S (m / z ) : (35C l/ 37C l ) 265 / 267

L o s s i g u i e n t e s e j e m p l o s s e p u e d e n p r e p a r a r e s e n c i a l m e n t e c o m o s e d e s c r i b e e n e l E j e m p l o 7.

Ejemplo 16

4-cidopropM-6-(2,4-dioxo-1H-pirimidm-5-M)piridazm-3-carbomtrMo Desgasificar una solución de 5-(6-doro-5-cidopropil-piridazin-3-il)-1H-pirimidin-2,4-diona (A, 57 mg, 0,22 mmol, 100 % en masa) en DMF (1 mL, 12,9 mmol) con N2. Añadir Zn(CN)2 (20 mg, 0,22 mmol), tris(dibencilideneacetona)dipaladio (0) (5 mg, 0,0054 mmol) y 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno (6 mg, 0,011 mmol) y desgasificar más con N2. Tapar bien y calentar a 120 °C durante la noche. Enfriar hasta RT y filtrar a través de tierra de diatomeas. Purificar por cromatografía en fase revertida (C18 Gold 15,5 g, gradiente de 5 a 20% ACN en 10 mM de bicarbonato de amonio; 20 CV) para aislar el compuesto del título (0,032 g, 58%) como un sólido amarillo pálido. ES/MS (m/z): 256 (M+1).

Los siguientes ejemplos se pueden preparar esencialmente como se describe en el Ejemplo 16.

Ejemplo 23

5-(5-cidobutil-6-metoxi-piridazin-3-il)-1H-pirimidin-2,4-diona

Añadir HCl 1 M (5,2 mL, 5,2 mmol) a 4-ciclobutil-6-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-metoxipiridazina (0,39 g, 1,3 mmol) y revolver a 50 °C durante 6 horas y luego a RT durante la noche. Eliminar el disolvente a presión reducida. Purificar a través de un cartucho SCX (10 g, eluyentes 60 mL de DCM, 60 mL de MeOH al 50% en DCM y 120 mL de NH37 M a l 50 % e n M e O H e n D C M ) p a r a o b t e n e r e l c o m p u e s t o d e l t í t u l o ( 0 , 337 g , 96 % ) c o m o u n s ó l i d o b l a n c o . E S / M S (m / z ) : 275 ( M 1 ) .

L o s s i g u i e n t e s e j e m p l o s s e p u e d e n p r e p a r a r e s e n c i a l m e n t e c o m o s e d e s c r i b e e n e l E j e m p l o 23.

Ejemplo 30

5-[5-[(1S,2R)-2-(2-Fluoroetil)cidopropil]-6-metil-piridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona

A ñ a d i r H C l (1 M e n H ² O , 2 m L , 2 m m o l ) a l E n a n t i ó m e r o 1 d e t r a n s 2 , 4 - d i m e t o x i - 5 - [ 6 - m e t i l - 5 - [ 2 - ( 2 -f l u o r o e t i l ) c i c l o p r o p i l ] p i r i d a z i n - 3 - i l ] p i r i m i d i n a ( 0 , 043 g , 0 , 14 m m o l ) y c a l e n t a r a 50 ° C d u r a n t e la n o c h e . E l i m i n a r e l d i s o l v e n t e a p r e s i ó n r e d u c i d a . P u r i f i c a r a t r a v é s d e u n c a r t u c h o s C x ( 12 g , e l u y e n t e s 70 m L M e O H , 70 m L 2 M N H ³ e n M e O H ) p a r a o b t e n e r e l c o m p u e s t o d e l t í t u l o ( 0 , 037 g , 89 % ) c o m o u n s ó l i d o b l a n c o E S / M S (m /z): 291 ( M 1 ) .

Ensayos biológicos

Los siguientes ensayos demuestran que los compuestos ejemplificados de la presente invención son inhibidores de la actividad de CD73, y son útiles en el tratamiento del cáncer.

Expresión y purificación de la proteína CD73

El CD73 humano marcado con 6-HIS C-terminal (aminoácidos 1 a 547) se expresa en células de mamífero HEK293F por medio de transfección transitoria de las células con el gen CD73 y se purifica mediante el uso de afinidad por Ni²⁺ y cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200. El CD73 de ratón marcado con 6-HIS C-terminal (aminoácidos 1 a 549) se expresa y purifica como se ha descrito anteriormente. El CD73 de rata marcado con 6-HIS C-terminal (aminoácidos 1 a 549) se expresa y purifica como se ha descrito previamente.

Espectroscopia de masas para la purificación de adenosina y adenosina

Se utiliza un sistema de extracción automatizado Agilent 300 RapidFire (Agilent, Santa Clara, CA) con tres bombas cuaternarias de HPLC, acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Sciex 6500 (AB Sciex, Framingham, MA) con una fuente de interfaz de ionización por electrospray (ESI). Cargar un sistema RapidFire Mass Spec con un cartucho de extracción en fase sólida (SPE) RapidFire HILIC (H1) reutilizable (G9203-80109). El disolvente A, utilizado para la carga y el lavado de la muestra, es formiato de amonio 50 mM, pH 4,0 que contiene 5% (v/v) de ACN. El disolvente B, utilizado para la elución de la muestra, es ácido fórmico al 0,3% hidróxido de amonio al 2% en ACN al 70%/30% de MeOH. Las muestras se analizan secuencialmente por medio de la aspiración de 10 |jl en el bucle de recolección al vacío directamente desde las placas multipocillo. Cargar 10 jL de muestra en el cartucho HILIC y lavar, por medio de la bomba cuaternaria 1, con el disolvente A a un caudal de 1,25 mL/minuto durante 3000 ms. Los analitos retenidos eluyen hacia el espectrómetro de masas por medio de la bomba cuaternaria 3, mediante el uso del disolvente B a un caudal de 1,25 mL/minuto durante 3000 ms. El sistema se reequilibra por medio de la bomba cuaternaria 1, mediante el uso del disolvente A a un caudal de 1,25 mL/min durante 3000 ms. Equipar el espectrómetro de masas de triple cuadrupolo con una fuente de ionización por electrospray (ESI) y monitorizar los analitos mediante el uso de la monitorización de reacción seleccionada (SRM) en modo positivo (M H)+. Monitorizar la adenosina a m/z 268,05/136,0 y el monofosfato de adenosina a m/z 348,1/136,0. Calcular los valores de la relación de área para la adenosina y el monofosfato de adenosina mediante el uso de 13C5 Adenosina y 15N5 AMP como estándares internos, respectivamente.

Ensayo bioquímico de CD73 humano

El propósito de este ensayo es identificar y caracterizar los inhibidores de la actividad de la enzima CD73. Añadir las mezclas de reacción (20 jL ) que contienen 2 jM de monofosfato de adenonsina (Sigma Núm. 01930), 10 mM de Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,01% de BSA, 0,2 mM de octilglucósido y 50 pM de proteína CD73 a una placa de 384 pocillos (Nunc Núm. 264573). Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, terminar la reacción por medio de la adición de 20 j l de solución de parada que contenga ácido fórmico al 2% y 10 jM de ¹³C5-adenosina (ribosa marcada con ¹³C5) (Cambridge Isotope Laboratories - Núm. CLM-3678-0), seguido por la adición de 40 j l de dH²O. Los niveles de adenosina y adenosina ribosa-¹³C5 (patrón interno) se determinan por medio de espectrometría de masas, como se ha descrito anteriormente. Utilizar la relación de la señal (integración del pico de adenosina / integración del pico del estándar interno de adenosina) para cuantificar cada reacción. Calcular el porcentaje de inhibición mediante el uso de la ecuación {% de inhibición = 100 * [1-(X-MÍN)/(MÁX-MÍN)]} en el que X es la relación de la señal del pozo, MÁX es la relación de la señal mediana del control de DMSO y MÍN es la relación de la señal de la actividad enzimática en presencia de >10X CI50 de un inhibidor competitivo conocido. Para el cribado, probar cada compuesto a 50 jM en DMSO al 1%. Determinar la CI⁵⁰ de cada compuesto por medio de la prueba de cada compuesto a 10 concentraciones de 0,0025 a 50 jM (mediante el uso de un esquema de dilución 1:3).

La CI50 para la 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona es de 0,028 jM. La CI50 para la 5-[5-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona es de 0,043 jM.

Todos los compuestos de los Ejemplos desvelados en la presente memoria exhiben un CI50 de menos de 0,062 jM.

Ensayo del mecanismo de CD73 humano

El propósito de este ensayo es determinar el mecanismo de acción del compuesto de interés. El ensayo se lleva a cabo como se ha indicado anteriormente para el ensayo bioquímico de CD73 humano. Cada compuesto se ensaya a 8 concentraciones diferentes de 0,023 a 50 jM mediante el uso de un esquema de dilución 1:3, pero a 8 concentraciones diferentes de AMP de 0,023 a 50 jM mediante el uso de un esquema de dilución triple. Las relaciones de área para las concentraciones variables de inhibidor y sustrato se trazan mediante el uso de GraphPad Prism 7.00 y se ajustan mediante el uso de la inhibición de modelo mixto dedicado para determinar los valores de V m á x , K m , Ki y a l f a p a r a la i n h i b i c i ó n { ( V m á x a p p = V m á x / ( 1 [ I ] / ( A l p h a * K i ) ) ; K m app = K m * ( 1 [I] / Ki) / (1 [I] / ( A l p h a * K i ) ) ; Y = V m a x a p p * X / (K m ap p X ) , e n e l q u e A l p h a , V m a x , K m y Ki s e c o m p a r t e n p a r a c a d a c o m p u e s t o } .

C a d a u n a d e 5 -[ 5 -[ ( 1 S , 2 S ) - 2 - e t i l c i c l o p r o p i l ] - 6 - m e t i l p i r i d a z i n - 3 - i l ] - 1 H - p i r i m i d i n - 2 , 4 - d i o n a y 5 -[ 5 -[ ( 1 S , 2 R ) - 2 -i s o p r o p i l c i c l o p r o p i l ] - 6 - m e t i í p i r i d a z i n - 3 - i l ] - 1 H - p i r i m i d i n - 2 , 4 - d i o n a e s u n i n h i b i d o r n o c o m p e t i t i v o q u e s e u n e a l c o m p l e j o e n z i m a - f o s f a t o , p e r o n o a la p r o p i a a p o e n z i m a .

Ensayo del mecanismo de CD73 en ratón

E l p r o p ó s i t o d e e s t e e n s a y o e s e v a l u a r l o s i n h i b i d o r e s c o n r e s p e c t o a s u i n h i b i c i ó n d e la a c t i v i d a d d e la e n z i m a C D 73 d e r a t ó n . E s t e e n s a y o s e l l e v a a c a b o c o m o s e h a d e s c r i t o a n t e r i o r m e n t e p a r a e l e n s a y o b i o q u í m i c o d e l C D 73 h u m a n o , e x c e p t o q u e s e u t i l i z a n 3 p M d e A M P y 50 p M d e e n z i m a C D 73 d e r a t ó n .

L a C I 50 p a r a la 5 -[ 5 -[ ( 1 S , 2 R ) - 2 - i s o p r o p i l c i c l o p r o p i l ] - 6 - m e t i l p i r i d a z i n - 3 - i l ] - 1 H - p i r i m i d i n - 2 , 4 - d i o n a e s d e 0 , 175 p M . Ensayo de células humanas Calu6

E l p r o p ó s i t o d e e s t e e n s a y o e s p r o b a r c o m p u e s t o s c o n t r a C D 73 e n u n e n s a y o b a s a d o e n c é l u l a s . L a s c é l u l a s C a l u 6 ( 1500 c é l u l a s / p o c i l l o ) s e c u l t i v a n e n u n a p l a c a d e 96 p o c i l l o s r e c u b i e r t a d e p o l i - D - l i s i n a ( B D N ú m . 356640 ) q u e c o n t i e n e 100 pl d e m e d i o ( M E M ( G i b c o N ú m . 11095 - 072 ) 1 % d e p i r u v a t o s ó d i c o ( G i b c o N ú m . 11360 - 070 ) 1 % d e N E A A ( G i b c o N ú m . 11140 - 050 ) 10 % d e F B S ( H y c l o n e N ú m . S H 30071 ) . L a s p l a c a s s e i n c u b a n a R T d u r a n t e 30 m i n u t o s , s e g u i d a s p o r u n a i n c u b a c i ó n d u r a n t e la n o c h e a 37 ° C / 5 % d e C O ². L a s c é l u l a s s e l a v a n d o s v e c e s c o n t a m p ó n d e e n s a y o ( 10 m M T r i s - H C l p H 7 , 2 , 10 m M D - G l u c o s a , 1 m M K C l , 125 m M N a C l , 2 m M M g C h ) ( 90 p l / p o c i l l o ) . A c o n t i n u a c i ó n , s e a ñ a d e n 90 pl d e t a m p ó n d e e n s a y o a c a d a p o c i l l o , s e g u i d o s p o r la a d i c i ó n d e 10 pl p o r p o c i l l o d e p r e m e z c l a d e A M P y c o m p u e s t o ( 50 p M d e A M P , c o n c e n t r a c i o n e s v a r i a b l e s d e c o m p u e s t o e n D M S O al 1 % ) . L a s p l a c a s s e i n c u b a n a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e d u r a n t e 60 m i n u t o s . A c o n t i n u a c i ó n , s e r e t i r a n 10 pl d e s o b r e n a d a n t e p o r p o c i l l o y s e a ñ a d e n a u n a n u e v a p l a c a , s e g u i d a p o r la a d i c i ó n d e 20 pl d e s o l u c i ó n d e p a r a d a ( á c i d o f ó r m i c o a l 2 % , 1, 2 p M d e a d e n o s i n a - r i b o s a 13c 5 ( C a m b r i d g e I s o t o p e L a b o r a t o r i e s - N ú m . C L M - 3678 - 0 ) y 90 pl d e d d H ² O p a r a e l a n á l i s i s p o r e s p e c t r o s c o p i a d e m a s a s . L o s n i v e l e s d e A d e n o s i n a y A d e n o s i n a R i b o s a 13C 5 ( e s t á n d a r i n t e r n o ) s e d e t e r m i n a n m e d i a n t e e l u s o d e la e s p e c t r o m e t r í a d e m a s a s ( A g i l e n t R a p i d F i r e ) c o m o s e h a d e s c r i t o a n t e r i o r m e n t e p a r a e l e n s a y o b i o q u í m i c o d e C D 73 h u m a n o . E l p o r c e n t a j e d e i n h i b i c i ó n t a m b i é n s e c a l c u l a c o m o s e h a d e s c r i t o a n t e r i o r m e n t e .

L a C I 50 p a r a 5 -[ 5 -[ ( 1 S , 2 S ) - 2 - e t i l c i c l o p r o p i l ] - 6 - m e t i l p i r i d a z i n - 3 - i l ] - 1 H - p i r i m i d i n - 2 , 4 - d i o n a e s d e 0 , 028 u M .

Ensayo de inh ib ición de la diana ex vivo

^{E l p r o p ó s i t o d e e s t e e n s a y o e s p r o b a r l o s c o m p u e s t o s c o n t r a e l C D 7 3 m u r i n o e n la s a n g r e d e l r a t ó n e n u n e n s a y o} ex vivo ^{. L o s a n i m a l e s ( 6 / g r u p o ) s o n d o s i f i c a d o s o r a l m e n t e c o n c a d a c o m p u e s t o f o r m u l a d o e n 2 0 % H P B C D ( 2 -}h i d r o x i p r o p i l - p - c i c l o d e x t r i n a ) , p H 2 d e s p u é s d e q u e l o s t u m o r e s a l c a n c e n a p r o x i m a d a m e n t e 400 m m 3. D e s p u é s d e l ^{t r a t a m i e n t o , la s a n g r e s e r e c o l e c t a e n t u b o s d e h e p a r i n a y s e u t i l i z a p a r a e l a n á l i s i s} ex vivo ^{d e la c o n v e r s i ó n d e 13C 1 0 ' 15N 5 - A M P e n a d e n o s i n a , i n o s i n a e h i p o x a n t i n a m a r c a d a s , c o m o s e h a d e s c r i t o p a r a e l e n s a y o} ex vivo m e d i a n t e e l u s o d e la s a n g r e t o t a l r e c o l e c t a d a d e l o s a n i m a l e s s o m e t i d o s a l t r a t a m i e n t o c o n e l c o m p u e s t o p o r v í a o r a l .

La 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilcidopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona inhibe la conversión de AMP en adenosina, inosina e hipoxantina en la sangre total de los ratones tratados con diferentes dosis del compuesto, como se muestra en la Tabla 2.

*: significación estadística.

La CI50 para 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona es de 0,0073 uM.

Ensayo de inhibición in vivo de la diana Calu6 para CD73 humano

El propósito de este ensayo es probar compuestos contra el CD73 humano en tumores de xenoinjerto derivados de células Calu6 de cáncer humano en un ensayo de inhibición de objetivos in vivo. Las células Calu6 (ATCC) se cultivan en medio HBSS complementado con un 10% de suero bovino fetal. Recolectar las células subconfluentes con tripsina y enjuagar dos veces con medio de crecimiento sin suero. Iniciar el crecimiento de los tumores subcutáneos por medio de la inyección de 5 *10⁶ en una mezcla 1:1 de HBSS y MATRIGEL® (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) en el flanco posterior de ratones desnudos (The Harlon Laboratory). Cuando el volumen medio del tumor alcanza aproximadamente de 400 a 500 mm³, asignar al azar los animales de acuerdo con el tamaño del tumor y el peso corporal y colocarlos en sus respectivos grupos de tratamiento como se indica. Después del tratamiento, se recolectan muestras de tumores (de 50 a 80 mg cada una) y se procesan en 1 mL de tampón de extracción helado que contiene estándares internos como se describe a continuación.

Se añade una tira de lámina y N² líquido al mortero para preenfriarlo. El tejido tumoral se deja caer sobre la tira de papel de aluminio y se añade N² líquido. Se coloca otra tira de papel de aluminio sobre el tejido tumoral y se martillea con el mortero hasta que los tumores estén bien triturados. Se colocan de 50 a 100 mg de tejido tumoral en tubos (Fishers Scientific, Núm. de Cat. 02-681-302) y se colocan en hielo seco. Una perla metálica (Qiagen Núm. de Cat. 69989) y 1 ml de metanol al 80% que contiene los estándares internos de ¹³C⁵-Adenosina, ¹³C⁵ -AMP, ¹⁵N⁵-GTP, ¹⁵N⁴-inosina 5'-monofosfato y ¹³C^-15N-Hipoxantina (Cambridge Isotope Lab y Cayman Chemical) se añaden a los tubos, y las muestras se almacenan a -80 °C hasta su uso para el análisis LC/M^s .

La sangre también se recolecta en tubos de heparina y se utiliza para el análisis ex vivo de la conversión de ¹³C^{5 -15}N5-AMPen adenosina, inosina e hipoxantina marcadas, como se describe para el ensayo ex vivo mediante el uso de sangre entera recolectada de animales sometidos al tratamiento con el compuesto por medio de una dosis oral. Como se muestra en la Tabla 3, 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona inhibe la conversión de AMP en adenosina en tumores Calu6 tratados con diferentes dosis del compuesto.

Ensayo de supresión de células T

El éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) se utiliza como agente de etiquetado Las PBMC humanas o las células CD4 aisladas (0,5 * 10⁶ - 1 * 10⁸ células) se lavan con un tampón de etiquetado (RPMI 1640 con glutamina, GIBCO Núm. de Cat. 11875) que contiene 5% de FBS HI (Gibco Núm. 10082), y se suspenden en 1 ml del tampón de etiquetado. Las células se mezclan con 110 pl de PBS que contienen 50 pM de CFSE (Biolegend, Núm. de Cat. 423801), y se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las células etiquetadas se lavan una vez con PBS que contiene 5% de FBS HI (Gibco Núm. 10082) y una vez con medio de crecimiento normal de células T (X-Vivo 15, Lonza, Núm. de Cat. 04-744Q) que contiene 1x penicilina/estreptomicina), y se suspenden en los medios de crecimiento utilizados para las PMBC y las células CD4.

Activación y tratamiento de las células T

Las PBMC humanas marcadas con CFSE (600.000 células/mL) o las células CD4 (500.000 células/mL) se mezclan con Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 (Gibco, Núm. de Cat. 11131D) en una proporción de 1:1 de célula/perlas e IL-2 humana (60 lU/ml, Roche, Núm. de Cat.: 11011456001). Las células se colocan en un baño de agua a 37 °C durante 10 minutos para preactivar las células T. Las PBMC (125 pl/pozo) o las células CD4 (100 pl/pozo) se transfieren a una placa de 96 pocillos (Costar 3799, Corning Inc.). Para probar los compuestos mediante el uso de PBMC, se preparan los compuestos de prueba a varias concentraciones en medios de crecimiento celular normal (125 pL) que contienen 400-600 pM de AMP. Para probar los compuestos mediante el uso de células CD4, se preparan los compuestos de prueba a varias concentraciones en medios de crecimiento celular normal (100 pl) que contienen de 200 a 250 pM de AMP. Las células tratadas se cultivan a 37 °C, 5% de CO² durante 68 a 70 horas. El medio (160 pl) que contiene las PBMC tratadas se transfiere a una placa y el medio restante utilizado para el ensayo de citoquinas se transfiere a placas AcroPrep 96 (placa AcroPrep 96 Filter, Omega 3K NTRL 350ul well, Pall Life Science Núm. de Cat. 8033) para la preparación de muestras para el análisis LC-MS de metabolitos.

El medio (100 pl) que contiene células CD4 se transfiere y se filtra a través de las placas AcroPrep a otra placa por medio de centrifugación a 1500 g durante 2 hs. El medio filtrado (50 pl/pocillo) se mezcla con el mismo volumen de metanol al 80%, NH⁴OH al 1% y estándares internos (250 ng/mL de ^{1 3} C5-AMP y 250 ng/mL de ^{1 3} C5-Adensoina) para el análisis LC-MS de los metabolitos.

Las PBMC tratadas o las células CD4 se recolectan y se tiñen para la citometría de flujo para cuantificar la proliferación de células T.

Citometría de flujo

Las PBMC o las células CD4 se tiñen con Zombie Aqua (Biolegend, Núm. de Cat. 423102, Núm. de Lote B195875) a una dilución de 1:200 en DPBS durante 15 minutos y, a continuación, se bloquean con Human Fc Receptor Binding Inhibitor (eBioscience Núm. de Cat. 14-9161-73) a una dilución de 1:5 durante 15 minutos en tampón de tinción de flujo (DPBS-2% de HIFBS-0,5% de BSA) en hielo. Las PBMC se tiñen con un cóctel de APC/Cy7 anti CD3 humano (Biolegend Núm. de Cat. 300426, 1: 20), APC anti CD4 humano (Biolegend, Núm. de Cat. 317416, dilución 1:20), y Pacific Blue anti CD8a humano (Biolegend, Núm. de Cat. 300927, 1: 20), y las células CD4 se tiñen con APC anti CD4 humano (Biolegend, Núm. de Cat. 317416, dilución 1:20) en tampón de tinción de flujo durante 30 minutos en hielo.

Los datos de flujo son adquiridos por BD FACS Verse. Cada canal de fluorescencia está debidamente compensado. Los datos se procesan en FloJo ver. 7.6.5 con la siguiente estrategia de gating: linfocitos gated en FSC vs SSC dot plot; células viables de linfocitos gated en SSC vs Zombie Aqua dot plot; células CD3 de linfocitos viables gated en APC-Cy7 vs Zombie Aqua dot plotl; células CD4 y células CD8 de células CD3 gated en APC vs Pacific Blue dot plot; células CD4 y CD8 gated en APC vs CFSE(FITC) y Pacific Blue vs CFSE(FITC) dot plot. La proliferación de las células CD4 y CD8 se analiza por medio de una herramienta de proliferación. El índice de proliferación (PI) se define como el número total de células/número de células iniciales, y el % de rescate del compuesto se calcula como (PI^{w/o AMP c/ocpd-} PI^muestra)/(PI^w/oAMP c/o cpd - PI ^{w AMP} c/o ^cpd)^* 10°.

Como se muestra en la Tabla 4, la inhibición de CD73 por 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona rescata la inhibición de la proliferación de células T mediada por adenosina, que se correlaciona con una reducción dependiente de la dosis de los niveles de adenosina en el medio de crecimiento.

C o m o s e m u e s t r a e n la T a b l a 5 , la i n h i b i c i ó n d e C D 73 p o r 5 - [ 5 - [ ( 1 S , 2 R ) - 2 - i s o p r o p i l c i c l o p r o p i l ] - 6 - m e t i l p i r i d a z i n - 3 - i l ] -1 H - p i r i m i d i n - 2 , 4 - d i o n a a u m e n t a l o s n i v e l e s d e T N F - a e n l a s c é l u l a s T C D 4 .

C o m o s e m u e s t r a e n la T a b l a 6 , la i n h i b i c i ó n d e C D 73 p o r 5 - [ 5 - [ ( 1 S , 2 R ) - 2 - i s o p r o p i l c i c l o p r o p i l ] - 6 - m e t i l p i r i d a z i n - 3 - i l ] -1 H - p i r i m i d i n - 2 , 4 - d i o n a a u m e n t a l o s n i v e l e s d e T N F - a e n l a s c é l u l a s T C D 4 .

Modelos in vivo

S i s e d e s e a , la m o d e l i z a c i ó n p r e c l í n i c a d e l e f e c t o i n h i b i d o r d e C D 73 d e u n c o m p u e s t o d e la p r e s e n t e i n v e n c i ó n , o d e una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, se puede llevar a cabo, por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos establecidos en la técnica, por ejemplo, en Rongvaux A, et al., Annual Rev. Immunology 2013; 31: 635 a 674y en la bibliografía citada Sanmamed MF, et al., Annals of Oncology 2016; 27: 1190 a 1198y en la bibliografía citada.

Ensayo basado en LC/MS para medir la actividad de CD73 en suero humano

Se centrifuga la sangre humana fresca y normal a 1.500g durante 15 minutos a temperatura ambiente, y se recolecta la fracción superior que contiene suero. El suero (25ul/pozo) recolectado se transfiere a una placa de 96 pozos profundos (DWP, Analytical Sales & Services Inc. Núm. de Cat. 968820) que contiene varias concentraciones del compuesto del Ejemplo 2 y una concentración fija de levamisol (1.500 uM). Después de la incubación en hielo durante 60 minutos, se añade 13C5-15N5-AMP(50 uM) a cada pocillo de la placa, y la placa se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, se coloca la placa en hielo seco y se añaden 200 uL/pocillo de 17,3 TCA, seguido por una agitación a 26 fps durante 3 min con una máquina de agitación de placas (Qiagen). A continuación, la placa se centrifuga a 2940 g durante 20 minutos a 4 °C. Tras la centrifugación, se transfieren 100ul/pocillo del sobrenadante de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos profundos y se mezclan con 18,4ul/pocillo de Na2CO32,5M en hielo, seguido por la adición de 200 ul de solución de extracción que contiene un estándar interno (IS:13C5-AMP, 13C5-adenosina, 13C5-hipoxantina y 15N4-inosina). Tras una nueva centrifugación a 2940 g durante 20 minutos a 4 °C, se utilizan 200 ul/pocillo del sobrenadante para el análisis de 13C10-15N5-adenosina, 13C10-15N5-inosina y 15N5-hipoxantina por LC/MS como se ha descrito anteriormente. Para los cálculos de la CE50, las concentraciones del inhibidor de CD73 en el suero se corrigen con la fracción no unida (%) derivada de los modelos in silico o experimentalmente.

La Tabla 7 contiene datos para la inhibición de la actividad de CD73 en suero humano por 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona (el compuesto del Ejemplo 2).

La Tabla 8 contiene datos para la inhibición de la actividad de CD73 en suero humano por ciertos compuestos desvelados en la presente memoria.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la fórmula:

en la que n es 0 a 3;

R¹ es -H, -F, -gem-difluoro, -gem-dimetilo,

-alquilo C^{1 - 4} , -CHF² , -CF² CH³ o -CH² CH² F; y R² se selecciona entre -H, -CH³ , -F, -Cl, -CN, o -OCH³ ;

o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que es:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

5. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

6. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que n es 0, R¹ es -alquilo C^{1 - 4} y R² es -CH³ , o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 6, en el que R¹ es isopropilo, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que es

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

9. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 6 o 7 que es:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

10. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que es 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma.

11. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 6 que es:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

12. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8 u 11, que es 5-[5-[(1S,2S)-2-etilciclopropil]-6-metilpiridazin-3-il]-1H-pirimidin-2,4-diona, o una sal aceptable para uso farmacéutico de la misma.

13. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, y uno o más portadores, diluyentes o excipientes aceptables para uso farmacéutico.

14. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso en terapia.

15. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso en el tratamiento del cáncer.

16. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de mama, colangiocarcinoma, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de vesícula biliar, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, meduloblastoma, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata o cáncer renal.