ES2909769T3

ES2909769T3 - Método de preparación de muestras para maldi y sistema automatizado para el mismo

Info

Publication number: ES2909769T3
Application number: ES15833985T
Authority: ES
Inventors: Timothy Wiles; John Mantlo
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2014-08-18
Filing date: 2015-08-17
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2035-08-17
Also published as: US20240085285A1; WO2016028684A1; CA2957928C; US12181392B2; US20200080919A1; JP6665163B2; AU2015305782B2; US11385145B2; US10458887B2; EP3183553A4; KR102480335B1; EP3183553B1; US20250076163A1; CN107076651A; AU2021202117B2; US11774332B2; JP2017525964A; US20170234780A1; EP3183553A1; AU2021202117A1

Abstract

Un método para preparar una muestra biológica para evaluación por espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz, el método que comprende: obtener una muestra biológica; diluir la muestra; medir la turbidez de la muestra diluida por nefelometría; a) si la turbidez de la muestra medida está entre McFarland de 2 y 6, aplicar 3 μl de la muestra a una superficie adaptada para suministrar la muestra aplicada a un dispositivo configurado para realizar espectrometría de masas, secar la muestra aplicada; b) si la turbidez de la muestra medida es superior a McFarland de 6, aplicar 1 μl de la muestra a la superficie, secar la muestra aplicada; c) si la turbidez de la muestra medida está en el intervalo de McFarland de 1 a 2, aplicar 3 μl de la muestra a la superficie, secar la muestra aplicada, aplicar, por segunda vez, 3 μl de la muestra sobre la muestra seca, secar la muestra aplicada; d) si la turbidez de la muestra medida está en el intervalo de McFarland de 0,5 a 1, aplicar 3 μl de la muestra a la superficie, secar la muestra aplicada, aplicar, por segunda vez, 3 μl de la muestra sobre la muestra seca, secar la muestra aplicada muestra, aplicar, por tercera vez, 3 μl de la muestra sobre la muestra seca, secar la muestra; e) si la turbidez de la muestra medida está en el intervalo de McFarland de 0,25 a 0,5, aplicar 3 μl de la muestra a la superficie, secar la muestra aplicada, aplicar, por segunda vez, 3 μl de la muestra sobre la muestra seca, secar la muestra aplicada muestra, aplicar, por tercera vez, 3 μl de la muestra sobre la muestra seca, secar la muestra aplicada, aplicar, por cuarta vez, 3 μl de la muestra sobre la muestra seca, secar la muestra aplicada; después de uno de a)-e), aplicar una matriz sobre la muestra seca, la matriz está adaptada para su uso en el espectrómetro de masas; y realizar espectrometría de masas en la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de preparación de muestras para maldi y sistema automatizado para el mismo

Referencia cruzada a la aplicación relacionada

La presente solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la Solicitud Provisional de Estados Unidos No. 62/038,509, presentada el 18 de agosto de 2014.

Antecedentes de la invención

Como una práctica habitual en el diagnóstico y tratamiento médico, se obtienen muestras biológicas tales como sangre u orina de un paciente y se analizan para la presencia de microorganismos. Si se determina la presencia de microorganismos, existe una justificación tanto médica como económica para identificar el microorganismo específico presente y, para facilitar el tratamiento, la resistencia/susceptibilidad a los antibióticos del microorganismo. A menudo, tales determinaciones deben hacerse rápidamente para garantizar que se inicie el tratamiento correcto lo antes posible.

Por ejemplo, la sepsis es una afección médica grave causada por una respuesta abrumadora del sistema inmunitario del huésped a la infección. Puede desencadenar una inflamación generalizada, lo que puede dar lugar a un deterioro del flujo sanguíneo. A medida que avanza la sepsis, los órganos del cuerpo pueden quedarse sin oxígeno y nutrientes, lo que provoca daños permanentes y fallas eventuales. Si no se diagnostica correctamente o no recibe tratamiento, el corazón se debilita y puede producirse un shock séptico, lo que lleva a una falla de múltiples órganos y a la muerte. Los hemocultivos son necesarios para detectar la presencia de bacterias o levaduras en la sangre de pacientes con sepsis, para identificar el(los) microorganismo(s) presente(s) y guiar el tratamiento. La separación convencional y la identificación de microorganismos a partir de hemocultivos tarda al menos 24-48 horas, lo que resulta en que muchos de los pacientes con septicemia sean tratados inicialmente con antibióticos inapropiados. Por lo tanto, es deseable separar e identificar rápidamente los microorganismos de un cultivo positivo (sangre, líquido cefalorraquídeo, etc.).

Recientemente, se ha demostrado que ciertas tecnologías/herramientas proteómicas, como la espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (“MALDI-TOF MS”) (“Maldi” en adelante), proporcionan una identificación rápida y precisa de bacterias y/u hongos de un hemocultivo positivo (“PBC”) o de una colonia bacteriana cultivada en un sustrato como una placa de agar.

En el proceso Maldi, pequeñas cantidades de microbios de una colonia cultivada de la forma habitual en un medio nutritivo se transfieren a una placa de soporte de muestras de espectrometría de masas conocida como placa de Maldi, y luego se someten directamente a un análisis espectrométrico de masas, generalmente por tiempo de vuelo (TOF). El análisis de espectro de masas muestra las diferentes proteínas, siempre que estén presentes en los microbios en concentración suficiente. Luego se determina la identidad del microbio a partir del perfil de proteína del microbio a través de una búsqueda computarizada de bibliotecas espectrales que contienen miles de espectros de referencia. Si no hay un espectro de masas de referencia en una biblioteca para la especie precisa de microbio que se está examinando, las búsquedas en bibliotecas computarizadas con requisitos de similitud más laxos pueden proporcionar al menos alguna indicación del orden, la familia o el género de los microbios, ya que los microbios relacionados frecuentemente contienen un número de tipos de proteínas idénticos. El proceso de Maldi se describe con más detalle en la publicación internacional núm. WO-2009/065580A1 de Ulrich Weller titulado “Identification of Pathogens in Bodily Fluids”. Puede usarse una variedad de instrumentos de espectrometría de masas para la identificación. Los métodos y aparatos para hacer una suspensión para usar en un proceso Maldi se describen en el documento WO 2013/147610A2 de Botma y otros publicado el 3 de octubre de 2013. En esta publicación, la concentración de la suspensión que contiene el analito se ajusta a un valor adecuado para la posterior medición de Maldi. No describe los intervalos específicos y las etapas de aplicación de muestra correspondientes definidos en las reivindicaciones independientes.

El microorganismo de la muestra de PBC se puede subcultivar antes de la identificación de Maldi, por ejemplo, en una placa de agar. Como alternativa, los microorganismos se pueden aislar de la muestra de PBC mediante el uso de varios métodos de preparación de muestras sin necesidad de subcultivo. Los aislamientos de microorganismos generalmente se extienden directamente en una placa de Maldi para obtener una precisión de identificación de aproximadamente 70-80 %. Para los aislamientos que no logran ninguna identificación, generalmente se usa un método de extracción líquida de seguimiento para extraer proteínas del microorganismo para mejorar la identificación mediante MALDI-TOF MS. Aunque estos métodos de extracción de proteínas líquidas generalmente producen una mejor precisión de identificación, tales métodos no solo requieren varias etapas de centrifugación, sino que también consumen mucho tiempo.

Schmidt, V. y otros “Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry”, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. Vol. 31(3), págs. 311-317 (marzo de 2012) (Epub del 23 de junio de 2011) describe un método para identificar bacterias a partir de hemocultivos positivos al colocar una muestra líquida de la bacteria aislada en una placa de Maldi y superponer ácido fórmico al 25 % directamente a la muestra líquida manchada. Por lo tanto, la concentración final de ácido fórmico en la muestra bacteriana es inferior al 25 %. El método Schmidt resulta en una precisión de identificación del 86,6 % para bacterias gramnegativas y una precisión de identificación del 60 % para bacterias grampositivas. Schmidt informó haber ensayado este método en Yeast.

Hyman, J. y otros (publicación de patente de Estados Unidos núm. 2010/0120085, publicada el 13 de mayo de 2010), describe un método similar al de Schmidt, en el que los microorganismos aislados intactos en solución se extienden directamente sobre una placa de Maldi. Luego, la muestra líquida se cubre con aproximadamente un volumen igual de ácido fórmico al 50 %. Por lo tanto, la concentración final de ácido fórmico añadido a la muestra es de aproximadamente 25 %. Este método fue ensayado en 14 especies diferentes de bacterias y levaduras. Aunque este método resultó en una identificación del 91,1 %, los datos no indican qué tan efectivo es este método con respecto a las bacterias grampositivas, las bacterias gramnegativas, o la levadura.

Haigh y otros “Improved Performance of Bacterium and Yeast Identification by a Commercial Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Flight Mass Spectrometry System in the Clinical Microbiology Laboratory”, J. Clin. Microbiol. Vol. 49(9) pág. 3441 (septiembre de 2011)) describe un método en el que se usa ácido fórmico puro para extraer proteínas microbianas extendidas directamente sobre una placa de Maldi. Este método, sin embargo, no pudo identificar con éxito todas las cepas de levadura y bacterias grampositivas.

Herendael y otros “Validation of a modified algorithm for the identification of yeast isolates using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)”, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. Vol 31(5), págs. 841-848 (mayo de 2012) (Epub, 23 de agosto de 2011) describe dos métodos para la identificación de la levadura. El método de extracción estándar descrito en Herendael y otros, es un método de extracción de líquido convencional. En el método de extracción corto descrito en Herendael y otros, se recogió una colonia de una placa de agar y se aplicó directamente a la placa de Maldi objetivo. Se añadió ácido fórmico (1 pL a una concentración del 70 %) a la muestra y se dejó secar la muestra. La muestra seca se cubrió con matriz Maldi, se dejó secar más y se analizó mediante MALDI-MS. El método de extracción corta proporcionó resultados idénticos a los del método de extracción estándar, aunque las puntuaciones de Maldi fueron más bajas con el método de extracción corta. Casi todos los aislamientos (97,6 %) pudieron identificarse con el método de extracción corta; sin embargo, el 17,1 % de estas identificaciones cayó por debajo del umbral fiable de 1,7.

Si bien el método de extracción proporciona resultados precisos, el tiempo de detección (TTD) es mucho menor que la detección por extensión directa. Por lo tanto, se buscan métodos que mejoren la precisión de la identificación mediante la extensión directa de Maldi.

Breve resumen de la invención

La invención es tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas. Varias modalidades del método descrito permiten la identificación directa de microorganismos a partir de hemocultivos positivos (“PBC”) o aislamientos puros de colonias bacterianas cultivadas en un sustrato mediante espectrometría de masas mediante el uso de Maldi. De acuerdo con la invención, se prepara una muestra para Maldi mediante el uso de un método de dispensación de solución/estratificación. En el método de dispensación de solución/estratificación descrito en la presente descripción, la suspensión bacteriana que se dispensará se evalúa primero para determinar su turbidez como indicación de la concentración de bacterias en la suspensión. Uno de estos métodos estándar para medir la turbidez es el estándar de turbidez de McFarland. El estándar de turbidez de McFarland es bien conocido por los expertos en la técnica y no se describe en detalle en la presente descripción. El estándar se describe en “McFarland Standard,” Núm. de Catálogo TM 50-TM60 (2002, revisado en octubre de 2014.)

La suspensión bacteriana se puede crear mediante el uso de un método tal como el método descrito en el documento WO2013147610 de Botma y otros, titulado “Automated Selection of Microorganisms and Identification Using Maldi” y Publicación de patente de Estados Unidos 2012/0009558 de Armstrong y otro titulado “Method and Apparatus for Identification of Bacteria”.

El método de dispensación de solución y estratificación requiere, como implica su nombre, la formación de dos o más capas de solución para Maldi. Se aplica un volumen seleccionado de muestra sobre la placa de Maldi y se seca. Subsecuentemente, se aplica al menos una segunda capa de muestra (preferentemente del mismo volumen) que la primera capa. La segunda capa se seca. Opcionalmente, se pueden depositar y secar más capas. Después de que se seque la última de las dos o más capas, la muestra se procesa para Maldi (por ejemplo, al agregar ácido fórmico y luego aplicar la matriz sobre la muestra como se describe en la presente descripción). Luego, la muestra se evalúa por Maldi. Se ha determinado que el método de dispensación/capa de solución proporciona resultados Maldi aceptables para muestras líquidas con valores de turbidez de McFarland significativamente inferiores a 2,0 para bacterias Grampositivas y Gramnegativas.

Por ejemplo, en una modalidad, si la suspensión bacteriana líquida (preparada a partir de una colonia bacteriana recogida de una placa de agar y suspendida en agua (grado de espectrometría de masas) como se mencionó anteriormente, tiene un valor de McFarland de 0,5, ese valor es significativamente inferior al valor de McFarland de 2,0, que es una indicación de que se debe usar la preparación de muestra de dispensación de solución/estratificación para preparar esta muestra para Maldi.

Después de determinar el uso de dispensación de solución/estratificación para preparar la muestra para Maldi, se selecciona la cantidad de muestra por capa. En el ejemplo anterior con una muestra que tiene un valor de McFarland de 0,5, se selecciona el volumen por capa de. El número de capas se rige por el valor de turbidez y el volumen de la muestra. Una vez seleccionado el volumen de la capa y depositado sobre la placa de Maldi, se procede al secado de la muestra. Las condiciones exactas de secado son una cuestión de elección de diseño y se seleccionan para proporcionar un secado rápido y preservar la integridad de la muestra para los ensayos de Maldi. Las condiciones de secado adecuadas las determina fácilmente un experto en la técnica. Por ejemplo, las etapas de secado pueden completarse a temperatura ambiente o con la ayuda de una placa caliente (ilustrativamente, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 45 °C). Después del secado, se deposita una segunda capa de muestra sobre la primera capa. La segunda capa tiene el mismo volumen que la primera capa. Si es necesario, se agregan capas adicionales y se secan. Dado que el método de estratificación requiere tiempo y recursos adicionales, la cantidad de capas se limita a la cantidad necesaria para obtener resultados precisos de Maldi.

Después de la deposición de la muestra de dispensación de solución/estratificación en capas, el pocillo objetivo de la muestra se procesa mediante el uso del procedimiento típico de Maldi (adición de 70 % de ácido fórmico y matriz). Se ha determinado que el proceso de preparación de muestras para Maldi depende de una variedad de factores, pero lo más importante: i) la concentración de los microorganismos en la muestra; ii) el volumen de la muestra; y iii) si aplica, el número de dispensaciones. La concentración microbiana se refleja en la turbidez de la muestra. Aproximadamente, cuanto mayor es la turbidez, mayor es la concentración microbiana. El método descrito en la presente descripción comienza con la medición de la turbidez de una muestra. La turbidez se mide mediante nefelometría estándar mediante el uso de técnicas y equipos bien conocidos por los expertos. La nefelometría no se describe en detalle en la presente descripción. Una vez que se evalúa la turbidez, se toma una decisión sobre cómo preparar la muestra para Maldi. Tal determinación se realiza al evaluar la información de turbidez y el volumen de la muestra. En aquellas modalidades de la presente invención donde se contempla una evaluación y determinación automatizadas, la información de la muestra se introduce en una base de datos. La base de datos (preprogramada con información sobre la preparación de la muestra que mejor se adapta a la muestra en particular) genera el método recomendado para la preparación de la muestra Maldi.

De acuerdo con la invención, se contempla un sistema para evaluar una muestra y determinar el protocolo de preparación de Maldi adecuado. El sistema está totalmente automatizado. Un procesador controla el protocolo de preparación de Maldi, en dependencia de la información que recibe el procesador con respecto a la muestra. La muestra se obtiene directamente de un PBC o se recoge de un cultivo en placa. En los sistemas automatizados, la muestra se obtiene mediante el uso de robótica. Los mecanismos robóticos que obtienen muestras biológicas para ensayos son bien conocidos por los expertos y no se describen en detalle en la presente descripción.

Después de obtener la muestra, se diluye. En el sistema automatizado, la dilución se controla mediante instrucciones del procesador. El sistema diluye la muestra a un volumen predeterminado (por ejemplo, 4,5 ml) mediante el uso de agua estéril como se describe anteriormente.

Una vez que se diluye la muestra, el sistema mide la turbidez de la muestra. El equipo automatizado para medir la turbidez de la muestra es conocido por un experto en la técnica y no se describe en detalle en la presente descripción.

El procesador del sistema compara la turbidez medida con un umbral de turbidez predeterminado. Si el procesador determina que la turbidez de la muestra está dentro de un intervalo predeterminado de valores de turbidez, entonces el procesador proporciona instrucciones para transferir un volumen predeterminado de la muestra diluida a la placa de Maldi. El sistema automatizado prepara la muestra para Maldi (es decir, la adición de ácido fórmico para romper la pared celular de los microorganismos, de esta manera libera sus proteínas seguido de la aplicación de solución de matriz de Maldi sobre la muestra antes de Maldi como se describe en otra parte en la presente descripción) en base a las instrucciones del procesador. Si el procesador determina que la turbidez está por encima del intervalo predeterminado, el procesador proporciona instrucciones para preparar una muestra de Maldi mediante el uso de menos del volumen típico (es decir, si normalmente se depositan 0,5 j l en la placa de Maldi, solo se depositan 0,25 |jl en la placa de Maldi en cambio para las muestras de alta turbidez). Si el procesador determina que la turbidez está por debajo del intervalo predeterminado, la muestra se deposita en capas en la placa de Maldi, con secado de la muestra entre depósitos. La deposición de múltiples capas de la muestra en una placa de Maldi se describe anteriormente. Como se indicó anteriormente, en las modalidades completamente automatizadas, el sistema tiene una automatización que deposita la muestra en la placa de Maldi en base a las instrucciones del procesador.

Breve descripción de los dibujos

Las FIGURAS 1A-1C son gráficos de respuesta de superficie de modelos estadísticos que ilustran qué parámetros de preparación de muestras de Maldi producen resultados de Maldi aceptables;

La FIGURA 2 es un diagrama de flujo para la modalidad de la presente invención donde la preparación de la muestra se basa en la turbidez de la muestra medida; y

La FIGURA 3 es un esquema de un sistema usado para practicar el método descrito en la presente descripción.

Descripción detallada

La presente invención contempla métodos para preparar muestras para Maldi mediante el uso de una técnica de dispensación de solución/estratificación en la que se dispensan múltiples capas de muestra en una placa de Maldi. La muestra dispensada se seca entre dispensaciones. Tal método se ilustra en la presente descripción para ofrecer una mejora en las puntuaciones de Maldi para una amplia gama de microorganismos.

Un experto en la técnica es consciente de que los resultados de la identificación de Maldi se ven afectados por la cantidad de células depositadas en la placa de Maldi. Una suspensión microbiana estandarizada proporciona una dispersión uniforme de las células, lo que genera resultados más precisos y reproducibles. En una modalidad, la suspensión microbiana se estandariza antes de la deposición sobre la superficie sólida adaptada para colocarse en un aparato configurado para determinar la identidad de los microorganismos mediante espectrometría de masas Maldi. La suspensión microbiana se puede ajustar opcionalmente a un determinado estándar de McFarland. La creación de la suspensión microbiana estandarizada se puede lograr mediante varios métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de un asa de inoculación, un microgotero, u otros métodos físicos. En una modalidad preferida, una suspensión microbiana se ajusta a un estándar McFarland de al menos 0,25 antes de su inoculación en una placa de Maldi. Las condiciones para la inoculación (es decir, el volumen de dispensación y el número de dispensaciones) se seleccionan para proporcionar una muestra que probablemente produzca una puntuación de Maldi aceptablemente alta, que es preferentemente de al menos aproximadamente 2 o superior.

En las modalidades descritas, se prepararon para Maldi muestras de los microorganismos enumerados en las Tablas 600 y 700. Más abajo se describen varios métodos diferentes que se usaron para preparar muestras para Maldi.

Método 1:

Primero, se preparó un McFarland de 2,0 para cada microorganismo enumerado en la Tabla 600 en un diluyente estéril (por ejemplo, BBL™ (Becton Dickinson)). Se formaron tres manchas en la placa objetivo de Maldi. Cada mancha tenía un volumen de 1 pl. Luego, las muestras se secaron mediante el uso de una placa caliente a una temperatura de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 45 °C. La placa objetivo de Maldi se obtuvo de Bruker. Después de secar las muestras, se aplicó 1 pl de ácido fórmico al 70 % en la mancha. Las muestras se secaron de nuevo. Luego, se colocó 1 pl de matriz de ácido d-ciano-hidroxicinánico (HCCA) sobre la mancha y la muestra se secó y analizó en Bruker Maldi mediante el uso de la configuración estándar del instrumento. Maldi identificó con éxito el género y la especie de 28 de los 29 microorganismos enumerados en la Tabla 600.

Método 2:

Primero, se preparó un McFarland de 1,0 para cada microorganismo enumerado en la Tabla 600 mediante el uso de un diluyente estéril para diluir la muestra. Se formaron tres manchas en la placa objetivo de Maldi.

Cada mancha tenía un volumen de 1 pl. Luego, las muestras se secaron mediante el uso de una placa caliente a una temperatura de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 45 °C. La placa objetivo de Maldi se obtuvo de Bruker. Después de secar las muestras, se aplicó 1 pl de ácido fórmico al 70 % en la mancha.

Las muestras se secaron de nuevo. Luego, se colocó 1 pl de matriz de HCCA sobre la mancha y la muestra se secó y analizó en Bruker Maldi mediante el uso de la configuración estándar del instrumento. Maldi identificó con éxito el género y la especie de 26 de los 29 microorganismos enumerados en la Tabla 600.

Método 3:

Primero, se preparó un McFarland de 1,0 para cada microorganismo enumerado en la Tabla 600 mediante el uso de un diluyente estéril para diluir la muestra. Se formaron tres manchas en la placa objetivo de Maldi. Cada mancha tenía un volumen de 1 pl. Luego, las muestras se secaron mediante el uso de una placa caliente a una temperatura de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 45 °C. Se formó otro 1 pl en cada una de las manchas secas. Luego se secaron esas manchas. La placa objetivo de Maldi se obtuvo de Bruker. Después de secar las muestras, se aplicó 1 pl de ácido fórmico al 70 % en la mancha. Las muestras se secaron de nuevo. Luego se colocó 1 pl de matriz de HCCA sobre la mancha y la muestra se secó y analizó en un Bruker Maldi mediante el uso de configuraciones estándar. Maldi identificó con éxito el género y la especie de 29 de los 29 microorganismos enumerados en la Tabla 600.

Ejemplo 1

Se prepararon muestras con un valor de McFarland de 0,5 y se evaluaron para determinar el número de microorganismos identificados correctamente por Maldi. Las primeras muestras de McFarland de 0,5 para cada microorganismo enumerado en la Tabla 600 se prepararon mediante el uso de un diluyente estéril. Las muestras se formaron en la placa de Maldi de acuerdo con la siguiente Tabla 1:

Tabla 1

Para crear el modelo estadístico, se seleccionaron cuatro valores para cada uno de los tres parámetros. Los cuatro valores y los parámetros asociados con esos valores se establecen en la Tabla 200. Luego, estos valores se cargaron en Minitab 16 mediante el uso del Diseño de Experimento (DOE) Taguchi Design (que está disponible comercialmente, bien conocido por los expertos en la técnica y no se describe en detalle en la presente descripción). Este diseño inicial creó una serie de 16 corridas experimentales mediante el uso de la matriz de parámetros como se establece en la Tabla 100.

DISEÑO MINITAB TAGUCHI

Tabla 100

La Tabla 100 enumera el entero asociado con los parámetros de la Tabla 200.

Tabla 200

La Tabla 300 enumera los parámetros reales para cada corrida.

Tabla 300

continuación

Las corridas se realizaron en las quince (15) bacterias más difíciles de detectar, mediante el uso de la identificación Maldi del conjunto de desafíos en la Tabla 700 (una variedad de microorganismos más desafiantes para detectar que los enumerados en la Tabla 600).

Tabla 600

Tabla 700

(continuación)

Los datos se compilaron y analizaron mediante el uso de Statistica versión 12 (software comercialmente disponible bien conocido por los expertos en la técnica). Los tres parámetros, McFarland, volúmenes de dispensación y número de dispensaciones fueron significativos para determinar si una muestra tenía o no una probabilidad aceptable de producir una puntuación de Maldi correcta.

Se crearon gráficas de respuesta de superficie y se estudiaron las interacciones. Estos gráficos de respuesta de superficie ilustran que los resultados aceptables de Maldi variarán en dependencia de los valores de McFarland, el número de dispensaciones y el volumen. Los gráficos ilustran que un McFarland más alto no siempre es la clave para una puntuación de Maldi deseable (2,0 o superior para la confirmación de género y especie). Por ejemplo, un McFarland de 2,0 y un McFarland inferior (por ejemplo 0,5) podrían dar el mismo resultado correcto de Maldi con un volumen de dosificación más alto (FIGURA 1B) y/o una mayor cantidad de ciclos de dispensación/secado (FIGURA 1C) a la placa objetivo.

Tabla 400

La Tabla 500 establece parámetros de muestra adicionales para la preparación de muestras de Maldi que se usaron para complementar el modelo.

*Condiciones adicionales añadidas el 10/4/2014

Tabla 500

Estas muestras tenían valores de McFarland significativamente más altos (~ 5,0) para determinar las interacciones del límite superior.

Los valores de Maldi para las muestras se obtuvieron mediante el uso de un Bruker MALDI Biotyper® LT. Todas las muestras se prepararon mediante el uso de los protocolos anteriores. Los valores para McFarland, el volumen de dispensación y el número de dispensaciones son los establecidos en las Tablas 100-500. Las corridas 1-22 establecidos en la Tabla 800 se realizaron para cada microorganismo enumerado en la Tabla 700.

Tabla 800

La Tabla 800 describe el número de identificaciones correctas (de las bacterias enumeradas en la Tabla 700) de Maldi (identificación de especies) para diferentes parámetros de preparación de muestras; Cuando se completaron los depósitos de la muestra, la muestra se secó y se fijó con 1 pl de ácido fórmico acuoso al 70 por ciento. La muestra se secó de nuevo y se selló con 1 pl de matriz de HCCA de Bruker.

Para preparar muestras para obtener el valor de McFarland deseado, la muestra se diluyó con 5 ml de diluyente de muestra estéril. Los valores de McFarland deseados se lograron mediante el uso de un nefelómetro BD Phoenix™ Spec y los métodos del kit de calibración BD Phoenix™ Spec.

Como se establece en la Tabla 200, las muestras se prepararon mediante el uso de los siguientes valores:

i. Valores de McFarland: 0,25, 0,5, 1,0, 2,0;

ii. Volumen de muestra: 0,5 pl, 1,0 pl, 2,0 pl, 4,0 pl; y

iii. Número de dispensaciones: 1, 2, 3, y 4.

Cuando se completaron los depósitos de la muestra, la muestra se secó y se fijó con 1 pl de ácido fórmico acuoso al 70 por ciento. La muestra se secó de nuevo y se selló con 1 pl de matriz de HCCA de Bruker. Las soluciones de matriz se prepararon mediante el uso de 50 % de acetonitrilo, 47,5 % de agua y 2,5 % de TFA. El disolvente se obtuvo de Sigma Aldrich.

Dado que se prepararon tres manchas en cada placa para cada microorganismo, se obtuvieron tres puntajes de Maldi para cada microorganismo. Entonces, para las 22 corridas enumeradas en las Tablas 300 y 500, se obtuvieron 66 puntajes de Maldi para cada microorganismo.

Como puede verse en la Tabla 800, los por cientos más altos de puntajes Maldi correctos (un resultado correcto fue un puntaje Maldi de 2,0 o superior) se obtuvieron para una variedad de parámetros diferentes. Generalmente, para una muestra de valor McFarland inferior, se requiere que el volumen y la cantidad de dispensaciones sean mayores para obtener un por ciento más alto de puntajes Maldi correctos. Por ejemplo, para una muestra de McFarland de 0,25, se requirió un volumen de dispensación de 4 pl y 4 dispensaciones con secado entre dispensaciones para lograr un 84 % de puntuaciones Maldi correctas.

Ejemplo 2

Se prepararon muestras (McFarland de 0,25) y se enriquecieron con los microorganismos enumerados en la Tabla 700. Las muestras se prepararon mediante el uso del procedimiento descrito en general anteriormente. Se formaron tres manchas en la placa objetivo de Maldi. Cada mancha tenía un volumen de 1 pl. Luego, las muestras se secaron en una placa caliente a una temperatura de 40 °C a 45 °C. Se prepararon dos placas objetivo para cada muestra. La placa objetivo de Maldi se obtuvo de Bruker. En la primera placa, se secó la muestra depositada, después de lo cual se colocó otra mancha de 1 pl de muestra en la primera mancha seca. En la segunda placa, la primera mancha no se secó antes de depositar la segunda mancha sobre ella. Una vez depositadas completamente las manchas, se secaron las manchas de ambas placas. Luego, se aplicó 1 pl de ácido fórmico al 70 % sobre las manchas secas en ambas placas. Las muestras se secaron de nuevo. Luego se colocó 1 pl de matriz de HCCA sobre la mancha y la muestra se secó y analizó en Bruker Maldi. Maldi identificó con éxito 39 de 45 puntos de muestras enriquecidas (a nivel de género) para aquellas muestras preparadas mediante el uso de una etapa de secado entre las deposiciones de las manchas en la placa de Maldi. Maldi identificó con éxito 29 de 45 puntos de muestras enriquecidas (a nivel de especie) para aquellas muestras preparadas mediante el uso de una etapa de secado entre las deposiciones de las manchas en la placa de Maldi. Dado que las muestras se enriquecieron con uno de los 15 microorganismos y había tres puntos para cada muestra enriquecida, Maldi evaluó un total de 45 puntos de muestra.

Maldi identificó con éxito 39 de 45 puntos de muestras enriquecidas (a nivel de género) para aquellas muestras preparadas sin una etapa de secado entre las deposiciones de las manchas en la placa de Maldi. Sin embargo, Maldi-TOF identificó con éxito solo 24 de 45 puntos de muestras enriquecidas (a nivel de especie) para aquellas muestras preparadas sin una etapa de secado entre las deposiciones de las manchas en la placa de Maldi. Un sumario de estos resultados se establece en la Tabla 2 más abajo. Los resultados se informan como los mejores de los tres, en lugar de la suma de los positivos. De esto se puede ver que se detectó un microorganismo más con una etapa de secado entre depósitos que sin una etapa de secado.

Tabla 2

Las puntuaciones de Maldi para cada microorganismo evaluado se enumeran en las Tablas 900-1000 que comparan la puntuación de Maldi para muestras de McFarland de 0,25 preparadas con múltiples dispensaciones con y sin secado, para una variedad de microorganismos diferentes.

continuación

Tabla 900

Tabla 1000

Tener en cuenta que las puntuaciones de Maldi por debajo de 1,7 se consideraron “sin identificación”. Las puntuaciones de Maldi entre 1,7 pero por debajo de 2 se consideraron identificaciones positivas a nivel de género, pero no a nivel de especie. Las puntuaciones de Maldi de 2 o más se consideraron identificaciones positivas tanto a nivel de género como de especie. Para las muestras que se secaron entre la primera y la segunda dispensación, el por ciento de identificaciones positivas a nivel de género y especie fue del 64 %, en comparación con el 53 % de tales identificaciones cuando la muestra no se secó entre las dispensaciones. Esto indica que el método de dispensación de solución/estratificación (con secado) descrito en la presente descripción proporciona una marcada ventaja sobre dispensaciones múltiples sin secado entre ellas para el ensayo de muestras de “bajo McFarland” mediante el uso de Maldi-TOF.

Ejemplo 3

Se prepararon muestras (McFarland de 0,25) y se enriquecieron con los microorganismos enumerados en la Tabla 700. Las muestras se prepararon mediante el uso del procedimiento descrito en general anteriormente. Se formaron tres manchas en cada placa objetivo de Maldi. Se prepararon tres placas objetivo para cada muestra. Las placas objetivo de Maldi se obtuvieron de Bruker. En la primera placa, se dispensaron tres manchas de 1 pl de muestra cada uno. En la segunda placa, se dispensaron tres manchas de 2 pl de muestra cada uno. En la tercera placa, se dispensaron tres manchas de 1 pl de muestra cada uno, se secaron y se formó otra mancha de muestra de 1 pl en cada mancha seca. Una vez depositadas completamente las manchas, se secaron las manchas de las placas. Luego, se aplicó 1 pl de ácido fórmico al 70 % sobre las manchas secas en ambas placas. Las muestras se secaron de nuevo. Luego se colocó 1 pl de matriz de HCCA sobre la mancha y la muestra se secó y analizó en Bruker Maldi. Maldi identificó con éxito 31 de 42 puntos de muestras enriquecidas (a nivel de género) para aquellas muestras preparadas con una sola dispensación de 1 pl de muestra de McFarland de 0,25. Maldi identificó con éxito 33 de 42 puntos de muestras enriquecidas (a nivel de género) para aquellas muestras preparadas con una sola dispensación de 2 pl de muestra de McFarland de 0,25. Maldi identificó con éxito 36 de 42 puntos de muestras enriquecidas (a nivel de género) para aquellas muestras preparadas con una dispensación de 1 |jl de muestra de McFarland de 0,25 seguida de secado y una segunda dispensación de 1 jl. Estos resultados se presentan en la Tabla 3 más abajo y en las Tablas 1100-1300, que comparan la puntuación de Maldi para muestras de McFarland de 0,25 preparadas con diferentes volúmenes de muestra/número de dispensaciones, para una variedad de microorganismos diferentes. Cuando los resultados se informan como “el mejor de tres”, está claro que el mejor resultado (identificadores correctos para la mayor cantidad de microorganismos diferentes) se obtuvo mediante el uso de McFarland de 0,25 con 1 jl/1 j l por estratificación.

Tabla 1100

Tabla 1200

(continuación)

Tabla 1300

Tabla 3

A nivel de especie, el método de dispensación de solución/estratificación mediante el uso de dos dispensaciones de 1 |jl con una etapa de secado intermedia proporcionó 24 identificaciones correctas a nivel de especie (en comparación con 18 para una dispensación única de 2 j l y 10 para una dispensación única de 1 jl). Estos datos muestran de nuevo que el método de dispensación de solución/estratificación proporciona puntuaciones de Maldi notablemente más precisas que las dispensaciones individuales para muestras que tienen valores de McFarland inferiores.

En una modalidad, que no forma parte del objeto reivindicado, el microorganismo de aislamientos puros o una muestra de PBC se identifica mediante: i) la obtención de la muestra sospechosa de contener al menos un microorganismo a partir de medios de cultivo (es decir, de PBC o de un sub-cultivo en placa de agar); ii) determinar los parámetros de inoculación de la muestra, incluidos dichos parámetros, para el valor de McFarland determinado del inóculo, el volumen de distribución y el número de aplicaciones; iii) depositar al menos una parte de la muestra sobre una superficie sólida adaptada para colocarse en un aparato configurado para determinar la identidad de microorganismos por espectrometría de masas Maldi mediante el uso de el volumen de dispensación prescrito y el número de dispensaciones); iv) tratar la muestra con al menos un reactivo; tales reactivos incluyen un ácido volátil, un disolvente orgánico y/o una combinación de disolvente orgánico y un ácido volátil; v) colocar una solución de matriz de Maldi sobre la muestra tratada; y vi) identificar el microorganismo por espectrometría de masas. En una modalidad, el ácido volátil es al menos un 70 % de ácido fórmico. En otra modalidad, el ácido volátil es al menos un 80 % de ácido fórmico. En otra modalidad, el ácido volátil es al menos 90 % de ácido fórmico. A menos que se especifique de cualquier otra manera en la presente descripción, las soluciones de ácido fórmico son soluciones acuosas. En otra modalidad, el ácido volátil es al menos 100 % de ácido fórmico (por ejemplo, puro). En otra modalidad, la muestra se trata con al menos un 70 % de ácido fórmico en un disolvente orgánico tal como acetonitrilo, metanol, etanol, acetona, o acetato de etilo antes de colocar una solución de matriz de Maldi sobre la muestra. En otra modalidad, la muestra se trata con al menos un 80 % de ácido fórmico en un disolvente orgánico tal como acetonitrilo, metanol, etanol, acetona, o acetato de etilo antes de colocar una solución de matriz de Maldi sobre la muestra. En otra modalidad, la muestra se trata con al menos un 90 % de ácido fórmico en un disolvente orgánico como acetonitrilo, metanol, etanol, acetona, o acetato de etilo antes de colocar una solución de matriz de Maldi sobre la muestra. En una modalidad, se deja secar la muestra depositada sobre la superficie sólida antes de añadir el ácido volátil, para evitar que la muestra diluya el ácido volátil. En otra modalidad, el ácido volátil se seca antes de colocar la solución de matriz de Maldi sobre la muestra. Los ejemplos de los ácidos volátiles que se pueden usar en las diversas modalidades incluyen, pero no se limitan a, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético y ácido clorhídrico.

Después de secar la muestra en la placa de Maldi y combinarla con el ácido volátil solo o en combinación con un disolvente orgánico, se seca la combinación de muestra y reactivos. El secado se define como permitir que el líquido se evapore lo suficiente como para no diluir ningún líquido que se agregue subsecuentemente. Si bien la muestra se puede secar al aire libre, se puede usar una fuente de calor, tal como un bloque calefactor, una placa calefactora, un horno calefactor o una lámpara calefactora infrarroja, para acelerar la evaporación de la porción líquida de la muestra y los reactivos combinados. Estos métodos de secado no cambian el espectro de la muestra tras la identificación por Maldi.

Después del secado, la matriz de Maldi se aplica sobre la muestra tratada con reactivo(s). Cualquier solución de matriz de Maldi conocida por los expertos en la técnica puede usarse en los métodos descritos. Estas soluciones de matriz incluyen, entre otras, ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA), ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB), ácido 3,5 dimetoxi-4-hidroxicinámico (SPA), ácido 3-hidroxipicolínico (HPA), ácido 3,4-dihidroxicinámico, ácido 2-(4-hidroxifenilazo)-benzoico, 2-amino-4-metil-5-nitropiridina, y 2,4,6-trihidroxiacetofenona (THAP).

En una modalidad, el microorganismo se identifica mediante: i) la preparación de una suspensión microbiana de una muestra sospechosa de contener al menos un microorganismo; ii) determinar la turbidez de la suspensión microbiana; iii) seleccionar el volumen y número de dispensaciones a usar para depositar, a partir de una suspensión microbiana, al menos una porción de la muestra sobre una superficie sólida adaptada para ser colocada en un aparato configurado para determinar la identidad de microorganismos por espectrometría de masas Maldi; iv) depositar la muestra sobre la placa de Maldi mediante el uso de los parámetros seleccionados; v) opcionalmente, fijar el microorganismo con un disolvente orgánico, por ejemplo, etanol, un fijador, por ejemplo, formaldehído, o aplicar calor, generalmente hasta aproximadamente 37 °C (es decir, aproximadamente la temperatura corporal); vi) cubrir la muestra con al menos un 70 % de ácido fórmico; v) secar la muestra; vi) colocar una solución de matriz de Maldi sobre la muestra tratada; vii) secar la muestra; y viii) identificar el microorganismo por espectrometría de masas. Los fijadores tales como el formaldehído son bien conocidos por los expertos en la técnica y no se describen en detalle en la presente descripción.

Al hacer referencia a la FIGURA 2, un ejemplo de la presente invención contempla la obtención de una muestra biológica. La muestra se combina con un diluyente adecuado para suministrar la muestra a una placa de Maldi. Se mide la turbidez de la mezcla de muestra/diluyente. Si la turbidez medida está dentro de un intervalo predeterminado, se deposita una alícuota con un volumen predeterminado en la placa de Maldi. Si la turbidez medida es superior a un intervalo predeterminado, se deposita un volumen menor de muestra en la placa de Maldi. Si la turbidez medida es menor que el intervalo predeterminado, entonces se usa el protocolo de preparación de muestras descrito anteriormente mediante el uso de múltiples dispensaciones con secado entre dispensaciones. En una modalidad ilustrativa, se obtiene una muestra y se prepara una suspensión. Se mide la turbidez. Si la turbidez (en McFarland) está entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6, se depositan aproximadamente 3 pl en la placa de Maldi. Si la turbidez de la muestra es superior a aproximadamente 6, entonces la cantidad de muestra depositada en la placa de Maldi se reduce a aproximadamente 1 pl. Si la turbidez de la muestra es inferior a aproximadamente 2 pero en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2, entonces se depositan aproximadamente 3 pl de muestra en la placa de Maldi, se secan y se depositan y se secan una segunda muestra de 3 pl. Si la turbidez de la muestra es de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1, entonces se depositan y se secan tres “capas” de muestra, cada una de aproximadamente 3 pl. Si la turbidez de la muestra es de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,5, entonces se depositan y se secan 4 “capas” de muestra (3 pl cada una).

Después de depositar y secar la muestra, las muestras se procesan para Maldi como se describe en la presente descripción.

También se contempla un sistema automatizado para preparar una muestra biológica para evaluación mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz. Tal sistema tiene un controlador programable (por ejemplo, un procesador) en comunicación con un dispositivo de preparación de muestras. El controlador programable comunica instrucciones al dispositivo de preparación de muestras para seleccionar una colonia de un cultivo en placa. Un ejemplo de dicho dispositivo es el InoqulA™ que se obtiene comercialmente de BD Kiestra™. El procesador proporciona instrucciones para agregar una cantidad de diluyente o reactivos de procesamiento de muestra, según corresponda, a la muestra para proporcionar una solución de muestra que tenga un volumen predeterminado. Los sistemas automatizados que diluyen muestras a un volumen predeterminado son bien conocidos por los expertos y no se describen en detalle en la presente descripción. Después de la dilución de la muestra, se mide la turbidez de la muestra. La turbidez se mide mediante una variedad de técnicas que incluyen absorbancia, transmitancia y métodos manuales. El sistema inventivo usa un nefelómetro para medir la turbidez.

Como se usa en la presente descripción, “nefelómetro” es un instrumento que es capaz de medir la cantidad de partículas sólidas en una suspensión. Como se usa en la presente descripción, “nefelometría” se refiere a un método por el cual se puede medir la cantidad de sólidos suspendidos en una suspensión. Los nefelómetros son bien conocidos por los expertos y no se describen en detalle en la presente descripción.

El procesador está en comunicación con el instrumento que mide la turbidez de la muestra. El procesador tiene una memoria que almacena un valor o intervalo de valor para una turbidez aceptable. El procesador compara el valor medido con los valores almacenados. Si la concentración de la muestra está dentro del intervalo predeterminado, el procesador proporciona instrucciones para aplicar un primer volumen predeterminado de muestra a un sustrato adaptado para suministrar una muestra a un dispositivo configurado para realizar espectrometría de masas como se describió anteriormente.

Si el procesador determina que una concentración de muestra medida es mayor que el intervalo predeterminado, el procesador proporciona instrucciones para aplicar un segundo volumen predeterminado de muestra al sustrato adaptado para suministrar la muestra al dispositivo configurado para realizar espectrometría de masas. El segundo volumen predeterminado es menor que el primer volumen predeterminado.

Si el procesador determina que la concentración de una muestra medida es inferior al intervalo predeterminado, el procesador proporciona instrucciones para: i) aplicar un tercer volumen predeterminado de la muestra a un sustrato adaptado para suministrar la muestra al dispositivo configurado para realizar espectrometría de masas; ii) secar la muestra; iii) aplicar una segunda aplicación del tercer volumen predeterminado de la muestra sobre la muestra seca sobre el sustrato; y iv) secar la muestra de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción.

Posteriormente, el procesador da instrucciones al sistema para que aplique una matriz sobre la muestra depositada, la matriz está adaptada para su uso en el espectrómetro de masas. El sistema también tiene un mecanismo de transporte para colocar la muestra preparada en un dispositivo de espectrometría de masas para su análisis.

La FIGURA 3 muestra esquemáticamente una modalidad de un sistema 1 para la preparación automática de una suspensión de una muestra de un microorganismo de acuerdo con la invención. Dicho sistema 1 comprende un escenario 2 para una placa de cultivo 3 que comprende un microorganismo 4 sobre una capa nutritiva 5, tal como una capa de gel de agar.

El sistema 1 tiene una primera herramienta de recolección 6 y otra herramienta de recolección 7. Un dispositivo de posicionamiento 8 comprende un portaherramientas de recogida 9 para, en la modalidad mostrada, sujetar de forma liberable una herramienta de recogida, en la modalidad mostrada en la FIGURA 3, el portaherramientas de recogida 9 sujeta la primera herramienta de recogida 6. El dispositivo de posicionamiento 8 está dispuesto para posicionar la primera herramienta de recogida 6 en una posición inicial (mostrada en líneas continuas en la FIGURA 3) por encima de la placa de cultivo 3 y está dispuesto para bajar y elevar automáticamente la primera herramienta de recogida 6 hacia y alejándose de la placa de cultivo 3, tal que la primera herramienta de recogida 6 pueda colocarse en una posición (indicada con líneas discontinuas 6') en la que entra en contacto con el microorganismo 4 y recoge una muestra del microorganismo. Después de que la primera herramienta de recogida 6 haya recogido una muestra, el dispositivo de posicionamiento 8 eleva y coloca la primera herramienta de recogida 6 en una posición de transferencia. En la modalidad mostrada en la FIGURA 3 la posición de transferencia es idéntica a la posición inicial. En otras modalidades, las posiciones de inicio y transferencia pueden ser diferentes entre sí.

El sistema 1 de acuerdo con la invención comprende además un soporte de tubo de suspensión 10 para sujetar un tubo de suspensión 11 que puede contener un medio de suspensión que se dispensa desde un dispensador automático de medio de suspensión 12, que en la modalidad mostrada tiene una boquilla dispensadora 13 para dispensar automáticamente un medio de suspensión 14 en el tubo de suspensión 11 sostenido en el soporte del tubo de suspensión 10. En la presente modalidad, el soporte del tubo de suspensión 10 es un soporte giratorio del tubo de suspensión para girar el tubo de suspensión 11 alrededor de un eje vertical A.

Un dispositivo de transferencia 15 está incorporado en el sistema 1 para transferir automáticamente una herramienta de recogida desde la posición de transferencia del dispositivo de posicionamiento 8 a una posición por encima del tubo de suspensión 11 sostenido en el soporte del tubo de suspensión 10. En la modalidad mostrada, el dispositivo de transferencia 15 comprende un soporte de transferencia 16 con una herramienta de agarre 17 para sujetar de forma liberable una herramienta de recogida. El dispositivo de transferencia 15 se ilustra desplegando una pista de transferencia 18, tal como un riel, para movimiento lineal sobre el mismo como lo indican las flechas. Sin embargo, se contemplan otros mecanismos de transferencia montados en plataforma. De esta manera, el dispositivo de transferencia 15 se puede mover al dispositivo de posicionamiento 8, de modo que la herramienta de agarre 17 puede tomar el lugar de la herramienta de toma del dispositivo de posicionamiento 8. Posteriormente, el portaherramientas de recogida 9 libera la herramienta de recogida después de que los medios de agarre 17 hayan agarrado la herramienta de recogida. En la modalidad mostrada en la FIGURA 3, la segunda u otra herramienta de recogida 7 que ha recogido previamente una muestra 19 del microorganismo 4 se coloca por encima del tubo de suspensión 11 mediante el dispositivo de transferencia 15 en una posición inicial indicada por líneas continuas. El dispositivo de transferencia 15 está dispuesto para bajar la segunda herramienta de recogida 7 en el medio de suspensión 14 contenido en el tubo de suspensión 11, en cuya posición la segunda herramienta de recogida 7' con la muestra 19 se sumerge en el medio de suspensión 14 como se indica mediante líneas discontinuas. en la FIGURA 3. Posteriormente, el dispositivo de transferencia 15 sitúa la segunda herramienta recogedora 7 en una posición de espera por encima del tubo de suspensión 11, posición de espera que se encuentra en la modalidad mostrada en la FIGURA 3 idéntica a la posición inicial. En otras modalidades, la posición de espera y la posición de inicio pueden ser diferentes entre sí.

El sistema además está provisto de un medidor de turbidez 20 para realizar mediciones de la turbidez del medio de suspensión 14 contenido en el tubo de suspensión 11 sostenido en el soporte del tubo de suspensión 10. Como se sabe generalmente en la técnica, un medidor de turbidez puede proporcionar valores de medición que son una medida de la concentración de material, en el presente caso, la concentración de un microorganismo suspendido en el medio de suspensión. En la modalidad mostrada en la FIGURA 3, el medidor de turbidez 20 comprende un láser 21 que transmite luz láser hacia y a través del medio de suspensión y un sensor 22 que detecta la cantidad de luz láser transmitida a través del medio de suspensión. Además, hay otro sensor (no indicado en el dibujo) que está dispuesto, por ejemplo, perpendicularmente a la trayectoria de la luz láser para detectar la cantidad de luz láser que ha sido dispersada por la suspensión.

El funcionamiento del dispositivo inventivo está controlado por un controlador 23, que comprende por ejemplo un microprocesador, que está conectado comunicativamente (como lo indican las líneas de señal) con el dispositivo de posicionamiento 8, el dispositivo de transferencia 15, el dispensador automático de medio de suspensión 12 y el medidor de turbidez 20 para controlar automáticamente el movimiento del dispositivo de posicionamiento 8, el movimiento del dispositivo de transferencia 15, el funcionamiento del dispensador automático de medio de suspensión 12 y el funcionamiento del medidor de turbidez 20, respectivamente. Además, el controlador 23 podría estar directamente conectado comunicativamente con otras partes del sistema 1, tal como, por ejemplo, el portaherramientas de recogida 9, el portaherramientas de transferencia 16, el láser 21 y el sensor 22.

En la modalidad mostrada en la FIGURA 3, el controlador 23 está dispuesto para controlar el medidor de turbidez 20 de manera que la medición de la turbidez del medio de suspensión 14 comience antes de que la segunda herramienta de recolección 7 se sumerja en el medio de suspensión 14. Además, el controlador 23 controla el soporte del tubo de suspensión giratorio 10 para iniciar la rotación del tubo de suspensión 11 sostenido en el soporte 10 antes de que la segunda herramienta de extracción 7 se sumerja en el medio de suspensión 14, y para mantener la rotación del tubo de suspensión 11 durante la medición de la turbidez del medio de suspensión 14. De esta manera, el medidor de turbidez 20 proporciona un valor de medición en línea al controlador 23 cuyo valor es indicativo de la turbidez medida y, por tanto, de la concentración del microorganismo.

El controlador 23 comprende una memoria, en la que se almacenan un primer y un segundo valor de umbral, en los que el primer valor de umbral es igual o mayor que el segundo valor de umbral. Si el valor de medición de turbidez proporcionado por el medidor de turbidez es igual o está entre el primer y el segundo valor de umbral, la concentración/cantidad de microorganismo en el medio de suspensión es suficiente para permitir que el tubo de suspensión con la suspensión se procese más. En ese caso, el controlador 23 proporciona una señal de que el tubo de suspensión puede procesarse más. Además, en esta situación, la segunda herramienta de recogida 7 se puede desechar, por ejemplo, al transferir el dispositivo de transferencia a una posición C en la que los medios de agarre 17 se activan para liberar la segunda herramienta de recogida 7.

En caso de que el valor de medición final del medidor de turbidez esté por encima del primer valor de umbral previamente almacenado en una memoria del controlador 23, entonces la concentración del microorganismo es demasiado alta para permitir que el tubo de suspensión se procese más. En esa situación, el controlador 23 controla el dispensador automático de medio de suspensión 12 para suministrar una cantidad adicional de medio de suspensión al tubo de suspensión 11. Esta cantidad adicional de medio de suspensión se basa en la cantidad inicial de medio de suspensión, el valor de medición final y el valor del primer y/o segundo valor umbral, de modo que la adición de la cantidad adicional de medio de suspensión al medio de suspensión ya presente en el tubo de suspensión 11 conducirá a una concentración de microorganismos en el medio de suspensión que satisfaga el requisito para un procesamiento posterior, como puede ser confirmado por una medición adicional o adicional de la turbidez por el medidor de turbidez 20.

En caso de que el valor de medición final del medidor de turbidez 20 esté por debajo del segundo valor umbral, lo que significa que la concentración de microorganismos en el medio de suspensión es demasiado baja, el controlador 23 controla el sistema 1 de manera que una muestra adicional de microorganismos sea recogida por la primera herramienta de recogida 6 (alternativamente, se puede usar la segunda u otra herramienta de recogida para recoger una muestra adicional). Se depositan varias dispensaciones de suspensión en el mismo lugar si la turbidez de la suspensión está por debajo de las especificaciones. Por tanto, el controlador 23 en este caso controla el posicionamiento del dispositivo de transferencia 15 de manera que la segunda herramienta de recogida 7 se deseche como se ha descrito anteriormente. Luego (o simultáneamente) la primera herramienta de recogida 6 en el portaherramientas de recogida 9 del dispositivo de posicionamiento 8 se baja desde la posición inicial por encima de la placa de cultivo 3 hacia la placa de cultivo y se pone en contacto con el microorganismo 4 para recoger una muestra adicional del microorganismo. Posteriormente, la primera herramienta de recogida 6 se eleva automáticamente con la muestra adicional del microorganismo fuera de la placa de cultivo hasta la posición de transferencia. Luego, el dispositivo de transferencia transfiere automáticamente la primera herramienta de recogida con la muestra adicional del microorganismo desde la posición de transferencia del dispositivo de posicionamiento 8 a una posición por encima del tubo de suspensión 11. La primera herramienta de recogida 6 con la muestra adicional del microorganismo se baja al medio de suspensión 14 y libera la muestra adicional del microorganismo en el medio de suspensión. De nuevo se mide la turbidez y el valor medido se compara con el primer y segundo valor umbral almacenado en la memoria del controlador 23. En este caso, el controlador 23 se puede configurar para controlar el movimiento del dispositivo de transferencia 15 tal que la primera herramienta de recolección 6 se eleve a la posición de espera si el valor de medición en línea de la turbidez realizada por el medidor de turbidez 20 es igual a o inferior al primer valor umbral e igual o superior al segundo valor umbral.

Los tubos de suspensión, o alternativamente, los viales o cubetas que son particularmente útiles en el sistema inventivo tienen una sección transversal con una dimensión máxima objetivo de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 mm, preferentemente de aproximadamente 3 mm. En estos tubos de suspensión relativamente pequeños, el controlador 23 puede controlar el dispensador automático de medio de suspensión 12 de modo que la cantidad inicial suministrada de medio de suspensión sea de aproximadamente 0,1 - 5 ml, preferentemente menos de aproximadamente 1 ml.

Después de preparar la suspensión, se pipetean automáticamente partes alícuotas de la suspensión del tubo de suspensión 11 y se depositan en la placa de Maldi 100. La placa de Maldi 100 se ilustra esquemáticamente al descansar sobre el soporte 105. Esta etapa se realiza en una estación de preparación de placas de Maldi identificada como ubicación C que está separada de la ubicación donde se prepara la suspensión. En ciertas modalidades, el tubo de suspensión 11 se mueve a la ubicación cerca de la placa de Maldi para la preparación de la placa de Maldi como se describe anteriormente. En otras modalidades, se extrae una alícuota de suspensión del tubo de suspensión 11 y esa alícuota se usa para la preparación de placas de Maldi. La pipeta robótica se ilustra esquemáticamente como 110 en la FIGURA 3. Las pipetas robóticas son bien conocidas y no se describen en detalle en la presente descripción. La placa de Maldi 100 está conectada a un aparato de secado ilustrado como calentador 120.

Aunque la invención en la presente descripción se ha descrito con referencia a modalidades particulares, debe entenderse que estas modalidades son meramente ilustrativas de las aplicaciones de la presente invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una muestra biológica para evaluación por espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz, el método que comprende:

obtener una muestra biológica;

diluir la muestra;

medir la turbidez de la muestra diluida por nefelometría;

a) si la turbidez de la muestra medida está entre McFarland de 2 y 6, aplicar 3 pl de la muestra a una superficie adaptada para suministrar la muestra aplicada a un dispositivo configurado para realizar espectrometría de masas, secar la muestra aplicada;

b) si la turbidez de la muestra medida es superior a McFarland de 6, aplicar 1 pl de la muestra a la superficie, secar la muestra aplicada;

c) si la turbidez de la muestra medida está en el intervalo de McFarland de 1 a 2, aplicar 3 pl de la muestra a la superficie, secar la muestra aplicada, aplicar, por segunda vez, 3 pl de la muestra sobre la muestra seca, secar la muestra aplicada;

d) si la turbidez de la muestra medida está en el intervalo de McFarland de 0,5 a 1, aplicar 3 pl de la muestra a la superficie, secar la muestra aplicada, aplicar, por segunda vez, 3 pl de la muestra sobre la muestra seca, secar la muestra aplicada muestra, aplicar, por tercera vez, 3 pl de la muestra sobre la muestra seca, secar la muestra;

e) si la turbidez de la muestra medida está en el intervalo de McFarland de 0,25 a 0,5, aplicar 3 pl de la muestra a la superficie, secar la muestra aplicada, aplicar, por segunda vez, 3 pl de la muestra sobre la muestra seca, secar la muestra aplicada muestra, aplicar, por tercera vez, 3 pl de la muestra sobre la muestra seca, secar la muestra aplicada, aplicar, por cuarta vez, 3 pl de la muestra sobre la muestra seca, secar la muestra aplicada;

después de uno de a)-e), aplicar una matriz sobre la muestra seca, la matriz está adaptada para su uso en el espectrómetro de masas; y

realizar espectrometría de masas en la muestra.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra biológica es una porción de una colonia de un microorganismo recogida de una placa de cultivo o recogida de un hemocultivo positivo.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la superficie es una placa adaptada para su uso en un espectrómetro de masas.

4. El método de la reivindicación 1 en donde la solución matriz se selecciona del grupo que consiste en ácido aciano-4-hidroxicinámico, HCCA, ácido 2,5-dihidroxibenzoico, DHB, ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico, SPA, ácido 3-hidroxipicolínico, HPA, ácido 3,4-dihidroxicinámico, ácido 2-(4-hidroxifenilazo)-benzoico, 2-amino-4-metil-5-nitropiridina y 2,4,6-trihidroxiacetofenona, THAP.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de secado se realiza a una temperatura de aproximadamente temperatura ambiente a 45 °C.

6. El método de la reivindicación 1, en donde después de la aplicación de la muestra a la superficie, la muestra se trata con un reactivo que comprende al menos uno de un ácido volátil, un disolvente orgánico y sus combinaciones.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el ácido volátil es al menos un 70 % de ácido fórmico.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el ácido fórmico se combina con un disolvente orgánico y el disolvente orgánico se selecciona del grupo que consiste en acetonitrilo, metanol, etanol, acetona o acetato de etilo.

9. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra se diluye al combinar la muestra con un diluyente estéril.

10. Un sistema automatizado para preparar una muestra biológica para evaluación por espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz de acuerdo con el método de la reivindicación 1, el sistema comprende:

un procesador (23) y un aparato automatizado en donde el procesador (23) está en comunicación con el aparato automatizado que prepara una muestra biológica para su evaluación mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz en donde el procesador (23) está configurado para:

i) .proporcionar instrucciones al aparato automatizado que está adaptado para obtener una muestra biológica de un medio de cultivo; y

ii) .proporcionar instrucciones al aparato automatizado que combina un volumen de un diluyente determinado por el procesador con la muestra biológica para proporcionar una muestra diluida;

el aparato automatizado comprende un nefelómetro (20) que mide la turbidez de la muestra diluida en donde el nefelómetro (20) se comunica con el procesador (23);

en donde el procesador (23) está configurado para recibir la turbidez medida;

en donde, si el procesador (23) determina que la turbidez de la muestra medida está entre McFarland de 2 y 6, el procesador (23) está configurado para proporcionar instrucciones al aparato automatizado para aplicar 3 |jl de la muestra a una superficie adaptada para suministrar la muestra aplicada a un dispositivo configurado para realizar espectrometría de masas y para secar la muestra aplicada;

en donde, si el procesador (23) determina que la turbidez de la muestra medida es superior a McFarland de 6, el procesador (23) está configurado para proporcionar instrucciones al aparato automatizado para aplicar 1 j l de la muestra a la superficie y secar la muestra aplicada;

en donde, si el procesador (23) determina que la turbidez medida de la muestra está en el intervalo de McFarland de 1 a 2, el procesador (23) está configurado para proporcionar instrucciones al aparato automatizado para aplicar 3 j l de la muestra a la superficie, y secar la muestra aplicada, aplicar, por segunda vez, 3 j l de la muestra sobre la muestra seca, y secar la muestra aplicada;

en donde, si el procesador (23) determina que la turbidez medida de la muestra está en el intervalo de McFarland de 0,5 a 1, el procesador (23) está configurado para proporcionar instrucciones al aparato automatizado para aplicar 3 j l de la muestra a la superficie, y secar la muestra aplicada, aplicar, por segunda vez, 3 j l de la muestra sobre la muestra seca, y secar la muestra aplicada y aplicar, por tercera vez, 3 j l de la muestra sobre la muestra seca, y secar la muestra aplicada; y

en donde, si el procesador (23) determina que la turbidez medida de la muestra está en el intervalo de McFarland de 0,25 a 0,5, el procesador (23) está configurado para proporcionar instrucciones al aparato automatizado para aplicar 3 j l de la muestra a la superficie, y secar la muestra aplicada, aplicar, por segunda vez, 3 j l de la muestra sobre la muestra seca, y secar la muestra aplicada y aplicar, por tercera vez, 3 j l de la muestra sobre la muestra seca, y secar la muestra aplicada y aplicar, por cuarta vez, 3 j l de la muestra sobre la muestra seca, y secar la muestra aplicada;

en donde el procesador (23) luego ordena al sistema automatizado que aplique una matriz sobre la muestra seca, la matriz está adaptada para su uso en el espectrómetro de masas; y

el sistema automatizado comprende además un mecanismo de transporte para colocar la muestra preparada en el dispositivo de espectrometría de masas para ensayo.

11. El sistema automatizado de la reivindicación 10 que comprende un calentador para secar la muestra aplicada.