ES2910048T3 - Disposición para el análisis de sangre individualizado de un paciente y su uso - Google Patents

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Abstract

Disposición para el análisis de sangre in vitro individualizado de un paciente, que comprende un módulo de holografía (1), un módulo de espectroscopia Raman (2), un módulo de biomarcadores (3) y un componente de control de flujo (4) integrado, que, con el fin de transmitir datos e información, están en contacto con una unidad central de control e informática (5), que está conectada a una base de datos (6) para transmitir información, donde - el módulo de holografía (1) consta de un cartucho de preparación de muestras de holografía (11) y una unidad de medición de muestras de holografía (12), que están conectados entre sí de manera microfluídica, - el módulo de espectroscopia Raman (2) consta de un cartucho de preparación de muestras de espectroscopia Raman (21) y una unidad de medición de muestras de espectroscopia Raman (22), que están conectados entre sí de manera microfluídica, - el módulo de biomarcadores (3) consta en un cartucho de preparación de muestras de biomarcadores (31) y una unidad de medición de muestras de biomarcadores (32), que están conectados entre sí de manera microfluídica, y los módulos (1, 2 y 3) están conectados de manera fluídica a un suministro de muestras de sangre común (73) y a otros suministros de material líquido (7) a través del componente de control de flujo (4), donde - el cartucho de preparación de muestras de holografía (11) consta de canales de lisis microfluídicos microestructurados o canales de dielectroforesis con microelectrodos, que están conectados de manera microfluídica al componente de control de flujo (4), y la unidad de medición de muestras de holografía (12) es una disposición para un microscopio de luz reflejada en línea sin lentes con una fuente de iluminación coherente y una matriz de detectores, - el cartucho de preparación de muestras de espectroscopia Raman (21) consta de canales de lisis microfluídicos microestructurados o canales de dielectroforesis con microelectrodos, que están conectados de manera microfluídica al componente de control de flujo (4), y la unidad de medición de muestras de espectroscopia Raman (22) es un sistema portátil de espectroscopia Raman para uso móvil, y - el cartucho de preparación de muestras de biomarcadores (31) consta de canales de dielectroforesis microfluídicos microestructurados con microelectrodos o microcanales estructurados con filtros mecánicos o cambios de sección transversal, que están conectados de manera microfluídica al componente de control de flujo, y la unidad de medición de muestras de biomarcadores (32) es una disposición de matriz de detectores de fotosensores con una fuente de iluminación coherente, donde - los módulos (1, 2 y 3), el suministro de muestras de sangre (73) y los suministros de material líquido (7) están combinados de manera fluídicamente integrada a través del componente de control de flujo (4), de modo que el flujo de datos (81, 82 y 83) para controlar las válvulas, para transferir los valores medidos de los módulos (1, 2 y 3) a la unidad central de control e informática (5) y para controlar los procesos de medición en los módulos (1, 2 y 3) puede ser realizado mediante la unidad central de control e informática (5) a través del componente de control de flujo (4).

Description

DESCRIPCIÓN
Disposición para el análisis de sangre individualizado de un paciente y su uso
[0001] La invención se refiere a una disposición para el análisis de sangre individualizado de un paciente, en particular para exámenes de sepsis.
[0002] Según el estado de la técnica actual, se extraen grandes cantidades de sangre de un paciente que se va a examinar en el diagnóstico clínico para luego someter la sangre a diferentes análisis, donde estos a menudo se realizan en diferentes lugares de trabajo de laboratorio o incluso en diferentes laboratorios.
[0003] Si se sospechan enfermedades infecciosas, en este caso se realizan, por ejemplo, hemogramas para detectar el número y la forma de los componentes celulares de la sangre, se realizan pruebas con varios biomarcadores específicos para calificar y cuantificar diferentes agentes infecciosos (donde, cada biomarcador generalmente debe medirse en una prueba separada) y se realizan análisis microbiológicos de cultivo y posterior caracterización de los agentes patógenos.
[0004] La desventaja de estos exámenes clínicos comunes es que se deben realizar varias pruebas individuales, que requieren varios mililitros de sangre del paciente, que a menudo también requieren mucho tiempo, (los resultados de las pruebas microbiológicas a menudo solo están disponibles después de 2 o más días) y que, en su mayoría, no proporcionan toda la información relevante (por ejemplo, actualmente no se registra información sobre el estado de activación de los leucocitos).
[0005] Aun no se ha elaborado una solución de sistema simple basada en biomarcadores que proporcione al médico toda la información deseada.
[0006] La WO 2008052221 A2 divulga el uso de métodos RAMAN coherentes con fines terapéuticos y de diagnóstico médico, en los que se proporcionan un sistema y un método para permitir la detección y cuantificación molecular no invasiva, in vivo y en tiempo real de especies moleculares en una muestra o un animal.
[0007] De esta manera se permite una detección no invasiva y cuantitativa de especie moleculares de forma continua y en tiempo real para seguir el progreso de una terapia, por ejemplo.
[0008] La US 2014/234949 A1 divulga un sistema para el análisis de sangre in vitro individual de un paciente que comprende una unidad de detección con una cámara que captura imágenes holográficas, un espectroscopio láser confocal RAMAN y un ensayo de fluorescencia, donde estos módulos están en contacto fluido con una unidad de recolección de muestras y el resto del sistema y los módulos están conectados a un controlador y a una base de datos.
[0009] Según la divulgación de la US 2014/234949 A1, el manejo de este sistema se realiza mediante componentes en un dispositivo de preparación de muestras con un dispositivo de manejo de fluidos, donde se proporciona el siguiente manejo:
- acoplar una punta de pipeta a una primera boquilla del dispositivo de manejo de fluidos, donde el dispositivo de manejo de fluidos presenta al menos esta primera boquilla y una segunda boquilla;
- separar la punta de la pipeta de la primera boquilla, donde, al mismo tiempo, una primera interfaz de recepción de una cubeta se acopla con la primera boquilla y una segunda interfaz de recepción de la cubeta se acopla con la segunda boquilla, donde la cubeta
• comprende la primera interfaz de recepción y la segunda interfaz de recepción y cada interfaz está configurada para acoplarse a una boquilla del dispositivo de manejo de fluidos, y
• presenta al menos una primera cavidad y una segunda cavidad, donde cada cavidad está configurada para alojar un fluido; y
y
- por último, soltar la cubeta de las boquillas primera y segunda. Para este fin, la US 2014/234949 A1 divulga una disposición para el análisis de sangre in vitro individualizado de un paciente, que comprende un módulo de holografía, un módulo de espectroscopia Raman, un módulo de biomarcadores y un módulo control de flujo integrado, que, con el fin de transmitir datos e información, están en contacto con una unidad central de control e informática, que está conectada a una base de datos para transmitir información, donde
• el módulo de holografía consta de un cartucho de preparación de muestras de holografía y una unidad de medición de muestras de holografía, que están conectados entre sí de manera microfluídica, • el módulo de espectroscopia Raman consta de un cartucho de preparación de muestras de espectroscopia Raman, una unidad de medición de muestras de espectroscopia Raman, que están conectados entre sí de manera microfluídica,
• el módulo de biomarcadores consta de un cartucho de preparación de muestras de biomarcadores y una unidad de medición de muestras de biomarcadores, que están conectados entre sí de manera microfluídica, y los módulos están conectados de manera fluídica a un suministro de muestras de sangre común y a otros suministros de material líquido a través del componente de control de flujo, donde
• el cartucho de preparación de biomarcadores consta de canales de dielectroforesis de microfluidos microestructurados con microelectrodos o microcanales con filtros mecánicos o cambios de sección transversal, que están conectados de manera microfluídica al componente de control de flujo y la unidad de medición de muestras de biomarcadores es una disposición de matriz de detectores de fotosensores con una fuente de iluminación coherente, donde
• los módulos, el suministro de muestras de sangre y los suministros de material líquido están combinados de manera fluídicamente integrada a través del componente de control de flujo.
[0010] La DE 102012 016 318 A1 divulga una disposición para un microscopio de luz reflejada en línea sin lentes, en el que se proporciona un portamuestras con una muestra en una disposición esencialmente plana y paralela entre sí, además, encima de él, a una primera distancia de la muestra, se proporciona un espejo semitransparente plano y paralelo y se proporciona una matriz de detectores digitales [CCD, CMOS] a una distancia mayor de su superficie parcialmente reflectante, donde se proporciona una fuente de iluminación puntiforme en el área efectiva de la matriz de detectores para emitir radiación coherente y la relación entre la longitud del borde del área efectiva de la matriz de detectores y la distancia entre esta y el portamuestras está seleccionada en un rango de 3/2 a 4/1.
[0011] La DE 102004 034 354 A1 divulga un espectrómetro Raman ultracompacto, que está destinado a ser utilizado para examinar estructuras químicas, etc. o también para la identificación casi simultánea de muchas biopartículas en sustratos. Un tal espectrómetro, que se puede utilizar como un aparato portátil real, se realiza porque la ubicación de la muestra que se va a examinar está situada directamente en el plano de imagen de la unidad espectral óptica, donde la excitación óptica de la muestra que se va a examinar tiene lugar por medio de la radiación enfocada del láser exactamente en el plano de la posición de la hendidura virtual de la unidad espectral de formación de imágenes y, en la trayectoria luminosa entre la muestra y la unidad espectral, solo está dispuesto un filtro que transmite la radiación Raman.
[0012] La US 2007/177458 A divulga un método para mezclar corrientes de fluido, un mezclador de microfluidos y un chip de microfluidos y el uso de estos para un esquema de mezcla topológica que aprovecha la laminaridad de la corriente para doblar repetidamente la corriente y aumentar exponencialmente los gradientes de concentración para obtener una mezcla rápida y eficiente por difusión. Esta solución técnica se basa en canales de corriente helicoidales con quiralidades opuestas que giran y recombinan la corriente de fluido en una topología. Esta geometría se realiza en una estructura elastomérica simple de dos etapas y dos capas con una base de 400 pM X 300 pM por etapa, que mezcla de manera eficiente dos soluciones con números de Reynolds entre 0,1 y 2.
[0013] La US 2009/194705 A1 divulga que un componente o una disposición de excitación puede proporcionar la excitación de un objeto en movimiento, de manera que la información se codifica en la variación temporal de la luz que sale del objeto. Los espectros no binarios generados de esta manera podrían ser de diferentes intensidades intermedias, como diferentes escalas de grises o diferentes intensidades de un color o diferentes colores. La excitación se puede proporcionar en un patrón con transiciones no similares a los fallos entre regiones y también se puede controlar el movimiento del objeto. En otro enfoque, una señal de disparo puede provocar una excitación variable en el tiempo en una región con transiciones no libres de fallos entre los intervalos de excitación, como blanco/negro, multicolor o escala de grises.
[0014] La US 2007/153268 A1 divulga un sistema y un método para distinguir las células normales de las células apoptóticas. Se selecciona un espacio vectorial predeterminado, donde el espacio vectorial describe matemáticamente una primera pluralidad de conjuntos de datos Raman de referencia para células normales y una segunda pluralidad de conjuntos de datos Raman de referencia para células apoptóticas. Una muestra se irradia con luz esencialmente monocromática que produce un conjunto de datos Raman objetivo basado en fotones dispersos. El conjunto de datos Raman objetivo se transforma en un espacio vectorial definido por el espacio vectorial predeterminado. Se analiza una distribución de datos transformados en el espacio vectorial especificado. Según el análisis, la muestra se clasifica como células normales, células apoptóticas y una combinación de células normales y apoptóticas. La muestra comprende el paso de tratar la muestra con un medio farmacéutico antes de irradiar la muestra. Según la clasificación, se evalúa la eficiencia terapéutica de los medicamentos.
[0015] Todas las soluciones técnicas anteriores tienen la desventaja de que no es posible un análisis de sangre multimodal y muy rápido y no se puede obtener un resultado de examen significativo en menos de 1 hora usando un volumen sanguíneo de solo 1 a 2 ml.
[0016] El objeto de la presente invención consiste en proporcionar una disposición para el análisis de sangre in vitro individualizado de un paciente, en particular para exámenes de sepsis, que permite un análisis de sangre multimodal y muy rápido y también un resultado de examen significativo en menos de 1 hora usando un volumen sanguíneo de solo 1 a 2 ml.
[0017] Según la invención, este objeto se logra mediante las características de la reivindicación 1. En la reivindicación 8 se describe un uso correspondiente para determinar una puntuación de sepsis. Otras posibilidades de configuración ventajosas de la invención se especifican en las reivindicaciones subordinadas.
[0018] La esencia de la invención consiste en que la disposición para el análisis de sangre individualizado de un paciente, en particular para los exámenes de sepsis, comprende simultáneamente un módulo de holografía, un módulo de espectroscopia Raman y un módulo de biomarcadores, que, con el fin de transmitir datos e información, están en contacto con una unidad central de control e informática, que está conectada a una base de datos para transmitir información, donde esta disposición permite un análisis de sangre multimodal y muy rápido.
[0019] Los tres módulos de la disposición están diseñados de manera microfluídica, cada uno consta de un cartucho de preparación de muestras y una unidad de medición de muestras, donde los cartuchos están conectados de manera fluídica a varios suministros de líquido (incluido un suministro central para muestras de sangre) a través de un componente de control de flujo de microfluidos integrado, que también está conectado a una unidad central de control e informática para transmitir datos e información.
[0020] El componente de control de flujo de microfluidos integrado permite que la muestra que se va a analizar se cargue en una sola posición de carga y luego se divida automáticamente para los cartuchos de preparación de muestras individuales y las unidades de medición de muestras.
[0021] Esta estructura modular de la disposición tiene las siguientes ventajas entre otras:
- Desacoplamiento de los módulos entre sí con respecto a alteraciones eléctricas y ópticas
- Distancia corta óptima dentro de los módulos
- Fácil reemplazo mediante módulos más desarrollados
- Facilidad de servicio
- Combinación de diferentes tecnologías con evaluación integrada
[0022] Debido a la estructura microfluídica modular, es posible un análisis multimodal de las cantidades más pequeñas de sangre del paciente (solo alrededor de 1-2 ml) para la estratificación de los pacientes (por ejemplo, pacientes con y sin infección y con y sin una respuesta inmunitaria hiperinflamatoria), donde los resultados finales, que proporcionan la disposición construida modular, están disponibles mucho más rápido que el estado de la técnica (menos de 1 hora) y al mismo tiempo brindan al médico una visión más profunda del cuadro clínico y las opciones de diferenciación.
[0023] La invención se explica con más detalle a continuación con referencia a los dibujos esquemáticos y al ejemplo de realización. En este caso se muestra:
Figura 1: una representación esquemática de una forma de realización de la disposición para el análisis de sangre individualizado de un paciente,
Figura 2: una representación esquemática de un bloque de válvulas de un componente de control de flujo de la disposición según la figura 1 con dos ejemplos de conmutación,
Figura 3: una representación esquemática de una forma de realización del dispositivo para la rotación de fluido en un componente de control de flujo de la disposición según la figura 1 para el enfoque hidrodinámico tridimensional,
Figura 4: una representación esquemática del sistema de chips de dos longitudes del dispositivo según la figura 3,
Figura 5: una representación esquemática de las secciones transversales de los canales de fluido en el sistema de chips de dos longitudes según la figura 4,
Figura 6: una representación esquemática de una forma de realización del dispositivo para la rotación de fluido como parte de un componente de control de flujo para la hidrodinámica tridimensional, Figura 7: una primera representación esquemática para la ilustración de la rotación de fluido en un componente de control de flujo y
Figura 8: una representación esquemática para ilustrar la rotación de fluido en un componente de control de flujo.
[0024] La disposición representada en la figura 1 para el análisis de sangre individualizado de un paciente comprende un módulo de holografía (1), un módulo de espectroscopia Raman (2), un módulo de biomarcadores (3) y un componente de control de flujo (4) integrado, que, con el fin de transmitir datos e información, están en contacto con una unidad central de control e informática (5), que está conectada a una base de datos (6) para transmitir información.
[0025] En este caso, el módulo de holografía (1), el módulo de espectroscopía Raman (2) y el módulo de biomarcadores (3) están conectados de manera microfluídica a un suministro de muestras de sangre común (73) y a otros suministros de material líquido (7) a través del componente de control de flujo (4), que consta preferiblemente de una unidad o más unidades acopladas de manera técnica y fluídica.
[0026] Estos otros suministros de material líquido (7) son un suministro de solución de tinción (71), un suministro de tampón (72), un suministro de muestras de sangre (73), un suministro de biomarcadores 1 (74), un suministro de biomarcadores 2 (75), un suministro de biomarcadores 3 (76), así como suministros para fluidos de servicio y limpieza (78).
[0027] Todas las soluciones técnicas anteriores tienen la desventaja de que el análisis de sangre multimodal y muy rápido no es posible y no se puede obtener un resultado de examen significativo en menos de 1 hora usando un volumen sanguíneo de solo 1 a 2 ml.
[0028] El objeto de la presente invención consiste en proporcionar un dispositivo para el análisis de sangre in vitro individualizado de un paciente, en particular para exámenes de sepsis, que permite un análisis de sangre multimodal y muy rápido y también un resultado de examen significativo en menos de 1 hora utilizando un volumen sanguíneo de solo 1 a 2 ml.
[0029] Según la invención, este objeto se logra mediante las características de la reivindicación 1. Otras opciones de configuración ventajosas de la invención se indican en las reivindicaciones subordinadas.
[0030] Se proporciona una disposición para el análisis de sangre individualizado de un paciente, en particular para exámenes de sepsis, que al mismo tiempo comprende un módulo de holografía, un módulo de espectroscopia Raman y un módulo de biomarcadores, que, con el fin de transmitir datos e información, están en contacto con una unidad central de control e información, que está conectada a una base de datos para transmitir información, donde esta disposición permite un análisis de sangre multimodal y muy rápido.
[0031] Los tres módulos de la disposición están diseñados de manera microfluídica, cada uno consta de un cartucho de preparación de muestras y una unidad de medición de muestras, donde los cartuchos están conectados de manera fluídica a varios suministros de líquido (incluido un suministro central para muestras de sangre) a través de un componente de control de flujo microfluídico integrado, que también está conectado a una unidad central de control e informática para transmitir datos e información.
[0032] En el componente de control de flujo (4) (no representado en la figura 1) se proporcionan opcionalmente funciones de supervisión útiles, como, por ejemplo, verificar que el fluido transportado esté libre de burbujas y evaluar los procesos de filtración y los procedimientos de tinción en el cartucho.
[0033] Para la fabricación del componente de control de flujo (4) se proporcionan, por ejemplo, métodos de formación de imágenes sin contacto, que, cuando se utilizan materiales ópticamente transparentes para la placa base, pueden integrarse como sensores sin contacto y unidades de supervisión para el control funcional. Para ello, debe integrarse un sistema de monitoreo óptico en el sistema debajo del cartucho de chips, de modo que se realice un espacio de instalación y una accesibilidad óptica correspondientes para la supervisión basada en imágenes de la función del sistema.
[0034] El sistema de chips de elastómero consiste en una placa base rígida, ópticamente transparente (por ejemplo, de vidrio o plástico), contra la cual está dispuesta una pieza moldeada de elastómero de manera hermética a los líquidos, que comprende los modelos de reactivos, los canales de conexión, los canales de transporte, los elementos de filtro, los elementos de válvula del bloque de válvulas y el bloque de conexión para los conectores de fluidos, así como elementos de filtro opcionales y estructuras auxiliares para la mezcla eficiente de fluidos. El tamaño del sistema de chips puede tener forma, por ejemplo, de cheque/tarjeta de crédito.
[0035] La placa base es una placa de material inelástico, ópticamente transparente, que sirve como soporte para la pieza moldeada de elastómero y está conectada a ella de forma permanente mediante encolado/unión.
[0036] Los materiales de la placa base pueden ser vidrio, silicio, metales, polímeros termoplásticos (policarbonato, COC, PVC, poliestireno), polímeros duroplásticos (por ejemplo, placas de circuitos electrónicos o soportes cerámicos (LTCC y placas de cerámica).
[0037] La pieza moldeada de elastómero se fabrica, por ejemplo, utilizando técnicas de replicación (moldeo por inyección, moldeo de un maestro hecho de PDMS, caucho de silicona o materiales de silicona = materiales elastoméricos con durezas Shore en el rango de 10 a 120).
[0038] La pieza moldeada de elastómero se une a la placa base mediante procesos adhesivos o de unión. Cuando se utiliza una pieza moldeada de elastómero hecha de PDMS y una placa base de vidrio, se recomienda la unión automática de las piezas moldeadas después de la activación de las superficies con plasma de oxígeno.
[0039] Los canales de transporte se configuran preferiblemente como canales lineales semicirculares, que se accionan según el principio de funcionamiento de las bombas peristálticas lineales. Para ello, se presiona un sello sobre el lado superior del chip por encima del canal de transporte que se va a accionar de tal manera que se estruje completamente en el punto de presión. Durante el movimiento del sello a lo largo de la dirección del canal, el fluido sigue al sello y, por lo tanto, es transportado.
[0040] El caudal Q surge de la velocidad de avance del sello U y la sección transversal del canal de transporte A a Q = A * u. El canal de transporte está conectado a un depósito de fluido en un lado y desemboca en el bloque de válvulas en el lado opuesto. En este caso, las dimensiones del canal están en la zona entre 0,3 y 6 mm (anchura) y 0,15-3 mm (altura).
[0041] Los canales de conexión están integrados en la pieza moldeada de elastómero y presentan secciones transversales de canales más pequeñas con anchuras de canal en el rango de 0,1 a 1,2 mm y alturas de canal en el rango de 0,05 a 0,8 mm en comparación con los canales de transporte.
[0042] El modelo de reactivos está diseñado como cavidades integradas en la parte de elastómero y opcionalmente equipadas con un tabique. En este caso, los volúmenes están comprendidos entre 5 |_il y 500 |_il (por ejemplo, para líquidos de servicio y limpieza).
[0043] El bloque de válvulas se realiza mediante una disposición de válvulas de presión. En cada posición de válvula se encuentra un sello de válvula, que se puede bajar, y, por lo tanto, presiona el canal de elastómero y lo cierra con un ajuste positivo.
[0044] En este caso, la disposición está diseñada de tal manera que los fluidos puedan dirigirse desde cualquier entrada hacia el bloque de válvulas hasta cualquier salida del bloque de válvulas. De esta manera, las entradas también pueden funcionar bidireccionalmente como salidas del bloque de válvulas.
[0045] El diagrama de circuito ejemplar correspondiente de un bloque de válvulas está representado en la figura 2.
[0046] De este modo, los fluidos de los canales de transporte, como se representa en la figura 2, ejemplo de circuito 1, pueden dirigirse a cualquier salida, o bien con transporte paralelo, como se representa en la figura 2, ejemplo de circuito 2, pueden combinarse entre sí a partir de varios canales de transporte o recogerse en un canal de transporte, o bien transportarse como una mezcla a través de una de las salidas del lado del chip a las estaciones de análisis.
[0047] Esta simplicidad de implementación hace posible combinar la administración de fluidos con pasos de preparación de muestras configurables de manera flexible.
[0048] El bloque de conexión consta de una disposición de salidas de fluido verticales integradas en el cartucho de chips, que están conectadas de manera fluídica al bloque de válvulas. El contacto fluídico se realiza rompiendo una placa de conexión que contiene los capilares de conexión y un elemento de sellado. La placa de conexión se puede bajar o subir automáticamente a la posición de conexión y, por lo tanto, permite una conexión fluídica liberable del componente de control de flujo 4 al sistema y los módulos de análisis (1,2 y 3).
[0049] Los elementos de filtro se realizan como matrices de columnas integradas en canales o mediante la integración de membranas de filtro en los canales de conexión o mediante la integración de elementos de filtro disponibles comercialmente en el espacio de instalación entre dos canales de transporte o conexión.
[0050] Además, se proporcionan estructuras de apoyo para la mezcla eficiente de fluidos. De esta manera se realiza una mezcla eficaz en los canales de transporte bombeando el fluido a los depósitos de fluido y volviendo a bombearlo a los canales de transporte.
[0051] Además, la agitación del fluido se puede realizar y usar para mezclar bajando periódicamente el sello al canal de transporte.
[0052] Además, en el cartucho pueden integrarse micromezcladores conocidos basados en el principio de multilaminación.
[0053] En el caso de la gestión de fluidos con caudales elevados y números de Reynolds, se pueden utilizar micromezcladores en sí conocidos y basados en los principios de advección caótica, como mezcladores en T o mezcladores de meandro. Estos sistemas actúan por encima de un número de Reynolds crítico como mezcladores (Re > 240 para mezcladores en T y Re > 80 para mezcladores en zigzag) y se pueden utilizar si los fluidos deben transportarse con velocidades de transporte y números de Reynolds elevados.
[0054] En el caso de la gestión de fluidos con caudales bajos y números de Reynolds bajos(Re < 10), se utiliza una unidad de rotación de fluido especial en el componente de control de flujo (4), que consta de dos o más segmentos de microcanales dispuestos unos detrás de otros y conectados entre sí en sus extremos, donde los dos segmentos de canales conectados respectivamente entre sí están dispuestos en un ángulo a entre sí, los dos segmentos de canales conectados respectivamente entre sí se encuentran en dos planos superpuestos, los extremos de los segmentos de canales están cerrados y la transición al siguiente segmento de canal se produce lateralmente en los extremos del segmento de canal. Los segmentos de canales dispuestos unos detrás de otros están introducidos en este caso alternativamente en las capas de chips superior e inferior.
[0055] También se puede introducir una unidad de enfoque hidrodinámica en este sistema de chips de dos longitudes antes y/o después de la disposición para la rotación de fluido.
[0056] Debido al hecho de que los segmentos de canales están dispuestos en ángulo entre sí, el medio que fluye a través está sujeto respectivamente a cambios de dirección, lo que en general provoca una rotación del medio alrededor del eje en la dirección de la corriente, de modo que esta unidad de rotación de fluido se utiliza cuando los fluidos van a ser transportados con velocidades de transporte bajas y números de Reynolds bajos.
[0057] La esencia de la unidad de rotación de fluido especial es que los segmentos de canales de corriente alineados en ángulo entre sí en forma de microcanales están dispuestos unos detrás de otros en un sistema de chips de dos longitudes, donde la corriente de fluido gira alrededor del eje de flujo respectivamente en un ángulo a a medida que fluye a través de las transiciones entre los canales, lo que depende de la geometría del canal y del ángulo p entre los segmentos de canales, donde este ángulo p indica la desviación de una disposición rectilínea o paralela de los segmentos de canales conectados.
[0058] Para la variedad de las geometrías de canales posibles, en particular la forma de las secciones transversales de canales, y las formas posibles de las transiciones entre los segmentos de canales, es posible calcular el ángulo resultante de la rotación de fluido con un método de CFD (dinámica de fluidos computacional). Esto se describe como un ejemplo utilizando una sección transversal de canal semicircular, un extremo de segmento de canal semiesférico y una transición congruente entre los segmentos de canales.
[0059] Los sistemas de software para llevar a cabo este modelado están disponibles para los expertos en la técnica como parte de sistemas CAD comerciales (por ejemplo, SolidWorks) y como sistemas independientes de proveedores comerciales (por ejemplo, Ansys, Fluent, COMSOL) o como kits de herramientas de código abierto (por ejemplo, OpenFoam). La aplicación del método de elementos finitos numéricos subyacente es parte de la educación universitaria en cursos de ingeniería y, por lo tanto, es familiar para el especialista capacitado.
[0060] El componente de control de flujo (4) con la unidad de rotación de fluido (50) comprende los siguientes cuatro conjuntos, como se muestra esquemáticamente en la figura 3:
- la primera unidad de enfoque hidrodinámica (20)
- la unidad de rotación de fluido (50) según la invención
- la segunda unidad de enfoque hidrodinámica (70)
- el canal de examen o la célula de medición de flujo (110), por ejemplo, para citometría de flujo basada en imágenes.
[0061] La unidad de rotación de fluido (50), como parte del compuesto de control de flujo (4), consta de dos o más segmentos de canales (60) dispuestos unos detrás de otros y conectados entre sí en sus extremos, donde los dos segmentos de canales conectados respectivamente entre sí están dispuestos en ángulo entre sí (y no en línea recta) (115), de modo que una corriente de fluido debe cambiar de dirección cuando fluye a través de las transiciones entre los segmentos de canales (60).
[0062] Los segmentos de canales se pueden introducir en cualquier substrato que sea adecuado para el transporte del fluido. El material es preferiblemente vidrio ópticamente translúcido o plástico ópticamente translúcido para integrar la célula de medición de flujo directamente en el sistema de chips de dos capas. El material de vidrio de borosilicato es particularmente ventajoso.
[0063] En un sistema de chips de dos capas, cuyo plano de chips debe alinearse horizontalmente con fines ilustrativos, los segmentos de canales (60) están introducidos alternativamente en el sustrato superior e inferior de tal manera que, después de conectar las dos capas de chips, los canales previamente abiertos se cierran mediante la superficie de la otra capa de chips respectiva y existe una conexión con el siguiente segmento de canal solo en los extremos de los canales (véase la figura 3).
[0064] La geometría de la sección transversal de los canales y la configuración de los extremos de canal y las transiciones surgen de las posibilidades de las tecnologías utilizadas para la fabricación de canales. En principio, se recomiendan secciones transversales de canales semicirculares en contacto con piezas de extremo diseñadas como segmentos esféricos o geometrías aproximadas a estos (véanse las figuras 7 y 8).
[0065] Además, se pueden utilizar canales con geometrías redondas o que se pueden describir mediante segmentos circulares o son aproximadas a estos (segmentos elípticos, combinaciones de segmentos circulares y trapezoides o áreas triangulares). Además, se pueden usar secciones transversales de canales trapezoidales o rectangulares en contacto con piezas de extremo, que se pueden representar mediante cuerpos de rotación de estas geometrías o geometrías compuestas por superficies parciales aproximadas a estas.
[0066] Si el fluido fluye a través de una tal transición, por ejemplo, de arriba hacia abajo (véanse las figuras 7 y 8), el fluido en el extremo del segmento de canal superior (220) primero se desvía hacia abajo (221). Al principio de este segmento de canal subsiguiente (224), la corriente de fluido se desvía inmediatamente de nuevo y se dirige hacia el segmento de canal inferior (223). Debido a la proximidad de los dos extremos de los segmentos de canales, los dos cambios de dirección se fusionan y solo se pueden ver en contexto. Esta es una clara diferencia con el estado de la técnica, que usa canales de transferencia en capas de chips medias intermediarias, por lo que se pueden distinguir dos cambios de dirección separados.
[0067] Debido a que los dos segmentos de canales conectados forman un ángulo entre sí (en lugar de estar en línea recta o paralelos entre sí) (115), se provoca la rotación del fluido alrededor del eje de corriente. Se pueden organizar varias transiciones una tras otra, donde se suman las rotaciones. En este caso una lámina de fluido sigue una trayectoria de corriente similar a una banda de Mobius. Es importante asegurarse de que se mantenga el sentido de dirección de las transiciones, de lo contrario, las rotaciones se restarán o anularán entre sí.
[0068] Para lograr una rotación total deseada del fluido de 90 grados, por ejemplo, en una sección transversal de canal semicircular con una altura de canal de 70 pM y una longitud de los segmentos de canales (15) de 600 pM, se pueden disponer seis transiciones con un ángulo de inclinación de p = 32 grados una tras otra, de manera que se logra una rotación de fluido total de 90 grados.
[0069] En las figuras 7 y 8, el ángulo de inclinación de los canales y el ángulo de rotación axial a se representan como ejemplos para ilustrar. En el caso concreto, la rotación de fluido deseada de 90 grados se logra después de pasar por seis transiciones de canal que se doblan en un ángulo de 32 grados entre sí. En este caso, el ángulo de rotación a de las láminas de fluido en las transiciones individuales no se utiliza si los fluidos deben transportarse con velocidades de transporte y números de Reynolds bajos.
[0070] Se proporciona una unidad de rotación de fluido especial, en la que los segmentos de canales de corriente alineados en ángulo entre sí en forma de microcanales están dispuestos unos detrás de otros en un sistema de chips de dos longitudes, donde la corriente de fluido gira alrededor del eje de flujo en un ángulo a a medida que fluye a través de las transiciones entre los canales, lo que depende de la geometría de canal y del ángulo p entre los segmentos de canales, donde este ángulo p indica la desviación de una disposición rectilínea o paralela de los segmentos de canales conectados.
[0071] Para la variedad de las geometrías de canales posibles, en particular la forma de las secciones transversales de canales, y las formas posibles de las transiciones entre los segmentos de canales, es posible un cálculo del ángulo resultante de la rotación de fluido con un método de CFD (dinámica de fluidos computacional). Esto se describe como un ejemplo utilizando una sección transversal de canal semicircular, un extremo de segmento de canal semiesférico y una transición congruente entre los segmentos de canales.
[0072] Los sistemas de software para llevar a cabo este modelado están disponibles para los expertos en la técnica como parte de sistemas CAD comerciales (por eejmplo, SolidWorks) y como sistemas separados de proveedores comerciales (por ejemplo, Ansys, Fluent, COMSOL) o como kits de herramientas de código abierto (por ejemplo, OpenFoam). La aplicación del método de elementos finitos numéricos subyacente es parte de la educación universitaria en cursos de ingeniería y, por lo tanto, es familiar para el especialista capacitado.
[0073] El componente de control de flujo (4) con la unidad de rotación de fluido (50) comprende los siguientes cuatro conjuntos, como se representa esquemáticamente en la figura 3:
- la primera unidad de enfoque hidrodinámica (20)
- la unidad de rotación de fluido (50) según la invención
- la segunda unidad de enfoque hidrodinámica (70)
- el canal de examen o la célula de medición de flujo (110), por ejemplo, para citometría de flujo basada en imágenes.
[0074] En la segunda unidad de enfoque hidrodinámica (70), el suministro de los líquidos auxiliares (80, 90) se realiza con una tal presión, de manera que la lámina de fluido alineada paralelamente al plano de chips se presiona ligeramente para obtener una lámina de fluido homogénea (117), que no está influenciada por las paredes del canal. De esta manera se cierra el enfoque hidrodinámico tridimensional. Las láminas de fluido (117) formadas de esta manera se pueden suministrar a un método de formación de imágenes en el canal de examen o en la célula de medición de flujo (110), por ejemplo, a una citometría de flujo basada en imágenes en el módulo de holografía (1), o el fluido se puede descargar en la salida de muestras (111) y se puede introducir en los respectivos módulos siguientes: módulo de espectroscopia (2) y módulo de biomarcadores (3).
[0075] La ventaja de la rotación de fluido en una gestión de fluido con caudales bajos es que se puede realizar un enfoque hidrodinámico tridimensional completo en un solo sistema de chips de dos longitudes del componente de control de flujo (4).
[0076] Otra ventaja de la rotación de fluido en una gestión de fluido con caudales bajos es que la rotación de fluido en el componente de control de flujo (4) se realiza a bajas velocidades de transporte en un régimen de transporte estrictamente laminar dominado por fuerzas viscosas y caracterizado por números de Reynolds bajos. Por lo tanto, el sistema se puede utilizar para caudales bajos y velocidades de transporte de unos pocos milímetros por segundo. A diferencia de los sistemas FACS establecidos con velocidades de transporte en el rango de 1 m/s, la reducción resultante del desenfoque de movimiento permite tiempos de exposición comparativamente largos de hasta 20 ms sin un desenfoque de movimiento reconocible.
[0077] Por lo tanto, el componente de control de flujo (4) ofrece condiciones óptimas para la citometría de flujo de imágenes de fluorescencia en el módulo de holografía (1) o el módulo de biomarcadores (3) y la detección basada en imágenes de señales ópticas de baja intensidad al tiempo que evita el desenfoque de movimiento durante los exámenes en el módulo de holografía (1), el módulo de espectroscopia (2) y el módulo de biomarcadores (3).
[0078] La compatibilidad con números de Reynolds bajos también es ventajosa para la rotación de fluido en el componente de control de flujo (4). Una pluralidad de métodos alternativos para el enfoque hidrodinámico usa los efectos de inercia de los fluidos en estructuras geométricas integradas en el canal. Debe mencionarse aquí la formación de chorros en las boquillas o el uso de efectos de flujo de Dean en canales curvados. Estos efectos ocurren con números de Reynolds en el rango entre 50 y 500 y la calidad de los efectos obtenidos muestra una dependencia pronunciada de la velocidad de transporte. Para fluidos de alta viscosidad, los números de Reynolds requeridos en microcanales a veces solo pueden representarse con sistemas de bombas de alta presión debido a la alta resistencia fluídica.
[0079] En contraste con esto, la rotación de fluido en el componente de control de flujo (4) con el ángulo de rotación a es independiente de la velocidad de transporte en todo el rango de caudal determinado por fuerzas viscosas con Re < 10.
[0080] A menudo es necesario adaptar la densidad de los fluidos de proceso a la densidad de las partículas biológicas que se van a examinar. Por ejemplo, para partículas biológicas con una densidad de aproximadamente 1,25 g/ccm, esto se puede lograr usando una solución al 50 por ciento de azúcar de caña. Para ajustar la densidad de las células con densidades en el rango entre 1,005 y 1,2 g/ccm a menudo se añaden polisacáridos, por ejemplo, Ficoll-400.
[0081] Todos estos aditivos provocan un aumento muy significativo de la viscosidad para un factor de hasta 20 (30 % de Ficoll). Incluso en estas condiciones, el correcto funcionamiento del componente de control de flujo (4) con respecto a la rotación de fluido lograda permanece inalterable.
[0082] Cuando se usa la rotación de fluido en el componente de control de flujo (4), se usan microcanales con un diámetro en el rango de 2 |_im a 0,75 mm. Estos pueden funcionar con caudales entre 1 |_il/s y 4 |_il/s en el área de la unidad de rotación de fluido (50). El caudal máximo para canales con un diámetro de 0,75 mm para agua con una viscosidad dinámica de 0,001 Pas dentro de la unidad de rotación de fluido (50) es de 4|_il/s con un número de Reynolds de 10. En casos excepcionales, los sistemas pueden funcionar con números de Reynolds de hasta 50 con pequeñas reducciones en la funcionalidad. El límite superior para los caudales que se van a utilizar se puede dar con 20|_il/s. La idoneidad concreta de los parámetros del proceso utilizados en el contexto de la densidad y la viscosidad de los fluidos portadores se puede comprobar mediante el número de Reynolds. Es aconsejable utilizar el respectivo diámetro hidráulico de los canales como dimensión característica D.
Re = rho * U_MEAN * D_H / mu
Con rho: densidad, U_MEAN: velocidad de transporte media, D_H: diámetro hidráulico y mu: viscosidad dinámica.
[0083] El caudal mínimo posible se define únicamente por las posibilidades técnicas de los sistemas de bombeo utilizados y se sitúa en el rango de un picolitro por segundo.
[0084] Otra posibilidad para la mezcla eficiente en el componente de control de flujo (4) forma la introducción de fluido conocida en sí mediante una boquilla en una cavidad. Esta disposición produce patrones de corriente circulares en la cavidad, lo que conduce a una mezcla eficiente y al mismo tiempo contrarresta la sedimentación de partículas y células contenidas en el fluido.
[0085] La unidad central de control e informática (5) tiene un software de control integrado, que se utiliza para controlar y regular todos los procesos.
[0086] El cartucho de preparación de muestras de holografía (11) comprende canales de lisis fluídicos microestructurados o canales de dielectroforesis con microelectrodos, que están conectados de manera microfluídica al componente de control de flujo (4).
[0087] Los parámetros ejemplares para el funcionamiento del componente de control de flujo (4) son:
• proporcionar caudales en el rango de 0,1 - 10nl/s durante la medición,
• proporcionar caudales hasta 10 |_il/s para operaciones de limpieza y servicio,
• proporcionar caudales y del orden de 1 |_il/s para el intercambio de fluido en los capilares de conexión, • aplicar una contrapresión definida a las salidas para capturar las células en las matrices de poros para la medición Raman.
[0088] El funcionamiento de los tres módulos [módulo de holografía (1), módulo de espectroscopia Raman (2) y módulo de biomarcadores (3)] se inicia simultáneamente por medio de la unidad de control central e informática (5) inmediatamente después de cargar la muestra en el suministro de muestras de sangre (73), de modo que las tres unidades de medición de muestras puedan funcionar en paralelo para mantener al mínimo el tiempo requerido para las pruebas de diagnóstico.
[0089] La unidad de medición de muestras de holografía (12) es una disposición para un microscopio de luz reflejada en línea sin lentes con una fuente de iluminación coherente y una matriz de detectores, como se conoce, por ejemplo, por la DE 102012016318 A1.
[0090] El cartucho de preparación de muestras de espectroscopia Raman (21) comprende canales de lisis fluídicos microestructurados o canales de dielectroforesis con microelectrodos, que están conectados de manera microfluídica al componente de control de flujo (4).
[0091] La integración de las estructuras de electrodos requeridas en el cartucho respectivo y el controlador electrónico del sistema se lleva a cabo mediante la producción de electrodos en el sustrato portador del cartucho mediante procesos de película delgada y fotolitografía/litografía por haz de electrones.
[0092] La unidad de medición de muestras de espectroscopia Raman (22) es, por ejemplo, un sistema portátil de espectroscopia Raman para uso móvil, como se conoce por la DE 102004034354 B3.
[0093] Para la separación de plasma de la sangre entera se utiliza una plataforma de laboratorio en un vial como cartucho de preparación de muestras. Este cartucho contiene un recipiente cilíndrico que se puede cerrar con un diámetro en el rango entre 5 y 25 mm con una punta inferior cónica o redondeada. Las paredes laterales del vaso están equipadas con estructuras de captura para las células sanguíneas.
[0094] Para la separación, el recipiente cilindriforme se rota alrededor de su eje. La velocidad angular requerida surge de las aceleraciones centrífugas mencionadas en la literatura especializada para la separación de células sanguíneas y el diámetro del recipiente. En este caso, las fuerzas centrífugas atraen las células sanguíneas hacia las estructuras de captura revestidas en las paredes laterales.
[0095] El plasma libre de células cubre las estructuras de captura como una película de fluido.
[0096] Después del final de la rotación, esta película se hunde bajo la influencia de la gravedad y se acumula en la parte superior del recipiente cilíndrico, desde donde se retira manualmente mediante pipeteo o automáticamente con un muestreador automático.
[0097] Mientras que, con la centrifugación convencional, el plasma tiene que ser pipeteado como sobrenadante de las células recogidas en la parte inferior del tubo, en el método descrito aquí se recoge una muestra de plasma puro en la punta del tubo, que se puede extraer de forma completa y totalmente automática, por ejemplo, con la aguja del muestreador automático. Por lo tanto, este enfoque ofrece condiciones óptimas para la separación de plasma automatizada.
[0098] Debido a los recorridos de sedimentación cortos (solo unos pocos milímetros, en comparación con varios centímetros en los vacutainers convencionales), el tiempo de proceso requerido se reduce a 4 minutos (incluida la carga del recipiente y la extracción del plasma).
[0099] Las estructuras de captura para la separación de células sanguíneas están diseñadas como estructuras superficiales tridimensionales con depresiones en las que se introducen las células sanguíneas durante la centrifugación y que impiden que las células sanguíneas fluyan bajo la influencia de la gravedad.
[0100] En el caso más simple, se pueden colocar en las paredes laterales del recipiente piezas de gasa de poliéster con una anchura de malla en el rango de 30 a 200 pm y un grosor de 200 pm. Durante la centrifugación se presionan automáticamente contra la pared y forman, de esta manera, las estructuras de captura previstas.
[0101] Alternativamente, se pueden hacer depresiones con una anchura de estructura entre 30 y 200 pm y profundidades de hasta 200 pm en las paredes laterales.
[0102] Otra posibilidad es la integración de estructuras de columna con un espacio entre 30 y 300 pM y una altura de 100-500 pM.
[0103] Para la separación de plasma ser utilizan recipientes de reacción desechables de 2 ml disponibles comercialmente con un fondo redondo y hechos de polipropileno. Una gasa sirve como ejemplo de una estructura de captura.
[0104] El cartucho de preparación de muestras de biomarcadores (31) comprende canales de dielectroforesis fluídicos microestructurados con microelectrodos o microcanales estructurados con filtros mecánicos o cambios de sección transversal, que están conectados de manera microfluídica al componente de control de flujo (4).
[0105] Todos los cartuchos en los módulos (1, 2 y 3) pueden diseñarse como cartuchos desechables y reutilizables, donde los cartuchos desechables están hechos de plástico (que es económico) y los cartuchos reutilizables con funciones ópticas están hechos de vidrio, en particular vidrio de cuarzo, y se pueden limpiar, de modo que estos cartuchos caros se regeneran mediante pasos de limpieza intermedios después de cada muestra.
[0106] La unidad de medición de muestras de biomarcadores (32) es una disposición de matriz de detectores de fotosensores con una fuente de iluminación coherente, como se usa, por ejemplo, para la detección de marcadores de diagnóstico y de pronóstico en la biomedicina.
[0107] En este caso se trata de una detección de biomarcadores basada en chips en base a un ensayo de inmunofluorescencia ligado a la superficie legible ópticamente. También se pueden utilizar otras alternativas de detección de biomarcadores que ya son conocidas per se.
[0108] La unidad central de control e informática (5) tiene un controlador de software integrado para controlar todos los procesos del componente de control de flujo (4) y todos los módulos (1, 2 y 3) y un software especial para el procesamiento de datos y la evaluación de los datos de medición registrados por los tres módulos (1, 2 y 3), como, por ejemplo, para la evaluación de los datos Raman.
[0109] Esta evaluación de los datos Raman con el objetivo de extraer información clínicamente relevante de los espectros Raman se lleva a cabo utilizando técnicas de análisis de datos multivariantes, tales como análisis de componentes principales, "redes" neuronales, análisis discriminante lineal o análisis de conglomerados.
[0110] Al mismo tiempo, el acceso de la unidad central de control e informática (5) a la base de datos (6) permite comparar los datos registrados y procesados desde los módulos (1, 2 y 3) con los datos de referencia almacenados en la base de datos (6) y la evaluación de datos complejos, que da como resultado un valor de puntuación específico. Aquí se utilizan métodos conocidos.
El procedimiento para hacer funcionar la disposición es el siguiente:
[0111] La muestra de sangre se inyecta manualmente a través del suministro de muestras de sangre (73) directamente desde la cánula con la que se extrajo al paciente hasta el sistema microfluídico del componente de control de flujo (4).
[0112] Alternativamente, también es posible que las muestras de sangre se suministren automáticamente, por ejemplo, por medio de un robot de pipeteo.
[0113] En este caso, el volumen sanguíneo de la cánula más pequeña actualmente disponible comercialmente de 2,7 ml es completamente suficiente, donde no es necesario ningún otro tratamiento previo después de la extracción de sangre del paciente, ya que la muestra de sangre es pretratada directamente en el respectivo elemento microfluídico de los tres diferentes cartuchos de preparación de muestras (11, 21 y 31) para el posterior análisis en las siguientes unidades de medición de muestras (12, 22 y 32).
[0114] El análisis de sangre se distribuye a los cartuchos de preparación de muestras (11,21 y 31) por medio del componente de control de flujo (4) de la siguiente manera:
Módulo de holografía (1)
[0115] La detección holográfica de los componentes sanguíneos se realiza, por un lado, con sangre entera y, por otro lado, con leucocitos enriquecidos.
[0116] Para la detección holográfica de los componentes sanguíneos, primero se diluye la muestra (aproximadamente en un factor de 1:500). Esto tiene lugar en el componente de control de flujo (4) mezclando el tampón del suministro de tampón (72) y la subsiguiente transferencia microfluídica de la sangre entera diluida al cartucho de preparación de muestras de holografía (11).
[0117] Se utiliza un máximo de 4 |_il de sangre entera, que se diluye a un máximo de 2 ml y se prepara y mide de la siguiente manera:
Módulo de espectroscopia Raman (2)
[0118] Para un análisis espectroscópico Raman de los glóbulos blancos (leucocitos), los glóbulos rojos (eritrocitos) se separan de la sangre entera en el cartucho de preparación de muestras de espectroscopia Raman (21). Esto se hace preferentemente mediante lisis de los eritrocitos, por ejemplo con N ^C l, pero alternativamente también se puede hacer mediante deflexión dielectroforética.
[0119] Esta sangre enriquecida con leucocitos (aproximadamente 4 |_il) se transfiere luego a la unidad de medición de muestras de espectroscopia Raman (22).
Módulo de biomarcadores (3)
[0120] Para el análisis de los biomarcadores en el plasma separado, se realiza una separación de los componentes celulares de la sangre en el cartucho de preparación de muestras de biomarcadores (31). Para ello se utilizan, por ejemplo, técnicas de filtración o, alternativamente, técnicas de desviación mediante campos eléctricos (dielectroforesis) o microcentrifugación.
[0121] En este paso, se usa aproximadamente 1 ml de la muestra de sangre total, donde se transfiere aproximadamente 500 |_il de plasma a la posterior unidad de medición de muestras de biomarcadores (32).
[0122] En la unidad de medición de muestras de holografía (12) se registra el número y la forma de los componentes celulares, con especial atención a los eritrocitos y leucocitos. Esto se hace con una configuración sin lentes en un sistema microfluídico de un solo canal. En este caso, la frecuencia de toma de imágenes debe adaptarse a la velocidad del flujo (o viceversa).
[0123] La toma de imágenes va seguida de una evaluación de imágenes, que también permite distinguir entre diferentes subtipos de leucocitos en función de la morfología nuclear. Para lograr resultados óptimos a este respecto, también es posible someter la muestra de sangre entera a un paso de pretratamiento adicional antes de analizar el número de subtipos de leucocitos, en el que los eritrocitos numéricamente muy superiores (aproximadamente 1000 eritrocitos por leucocito) se eliminan primero de la muestra mediante técnicas de lisis o desviación utilizando campos eléctricos (dielectroforesis) o microcentrifugación. Para lograr un mejor contraste de los subtipos, también es posible la tinción del núcleo celular (por ejemplo, con solución de tinción de Kimura).
[0124] En la unidad de medición de muestras de espectroscopia Raman (22), los leucocitos se disponen primero en una cuadrícula de medición regular para una caracterización espectroscópica eficaz.
[0125] Esto se hace, por ejemplo, mediante una estructura del chip de orificios microfluídicos integrada, en la que el líquido fluye a través de orificios con un tamaño de aproximadamente 4 |_im debido a una ligera presión negativa en la estructura del chip. Los leucocitos grandes se acumulan de manera precisa en estos orificios cuando solo hay una ligera presión negativa y, por lo tanto, están disponibles en ubicaciones bien definidas para una caracterización espectroscópica adicional. Las plaquetas no son retenidas por los orificios y, por lo tanto, no permanecen en la estructura del chip de orificios microfluídicos integrada.
[0126] Los espectros Raman se excitan con láseres disponibles comercialmente, por ejemplo, de 785 nm. Si se utiliza vidrio Borofloat para fabricar el sistema de microfluidos de chips de microorificios, se debe usar un láser en el rango verde (por ejemplo, 532 nm) para excitar los espectros Raman, ya que, de lo contrario, el fondo del vidrio cubrirá los espectros Raman de las células.
[0127] Los espectros se registran exactamente encima de los orificios con un diámetro de aproximadamente 1 a 5 |_im para evitar una contribución espectral de la membrana de chips de orificios. En este caso, es posible registrar un espectro con un rayo láser expandido o registrar varios espectros individuales en el área correspondiente. Se concede gran importancia a una caracterización rápida y paralela de varias células en el chip, ya que esto puede acortar el tiempo de análisis. En total se realiza un análisis de al menos 500 células.
[0128] Además de las células, siempre se registra un espectro de la membrana de orificios. Esto sirve como control interno para la evaluación automatizada. Se requiere aproximadamente 1 s para registrar un espectro individual. Los espectros se evalúan en el rango de huellas dactilares (aproximadamente 600 - 1860 cm-1). Si es necesario, también se puede incluir el rango CH (2750 - 3100 cm-1).
[0129] La evaluación automatizada comprende un pretratamiento del espectro (con corrección de fondo y normalización), así como una asignación del espectro al subtipo de leucocitos y al "estado de activación".
[0130] En análisis Raman, la atención se centra especialmente en los leucocitos comunes, como los granulocitos y los linfocitos neutrofílicos. Los posibles "estados de activación" que se pueden detectar con el módulo son: a) inactivo, es decir, el paciente no tiene infección ni inflamación, b) activado por inflamación estéril (como puede ocurrir después de una cirugía o un ataque al corazón), c) activado por infección. Una distinción adicional es útil para el último estado, que, por ejemplo, proporciona información sobre el agente patógeno (hongo, bacteria, virus) y la gravedad de la respuesta inmunitaria (adecuada frente a abundante, lo que conduce a la insuficiencia orgánica).
[0131] Para el subtipo de leucocitos y el "estado de activación" de los leucocitos, se utiliza un modelo de clasificación elaborado, que utiliza características espectrales específicas y cambios para caracterizar mejor la respuesta inmunitaria. En principio, también es posible identificar el subtipo de leucocitos mediante una tinción de fluorescencia específica con marcadores de superficie sobre la estructura del chip de orificio microfluídico integrada después de la medición Raman. A continuación, el módulo Raman debe equiparse con una lámpara de excitación adecuada y una cámara adecuada para la lectura.
[0132] Se lleva a cabo una medición de fluorescencia en la unidad de medición de muestras de biomarcadores (32) para determinar diferentes concentraciones de biomarcadores en el plasma analizando simultáneamente al menos 3 biomarcadores fluorescentes en un sistema de microfluidos. En este caso, la selección de los biomarcadores comprende tanto marcadores diagnósticos (por ejemplo, CRP, 6-IL, PCT) como marcadores pronósticos (por ejemplo, suPar).
[0133] Para el funcionamiento de la disposición también es importante el software central de control e informático (5) con el acceso a una base de datos (6).
[0134] Por un lado, permite que el flujo de datos (81) controle las válvulas (41), que el flujo de datos (82) transfiera los valores medidos desde los módulos (1, 2 y 3) al controlador y que el flujo de datos (83) controle los procesos de medición en los módulos (1, 2 y 3) y, por otro lado, se utiliza para la comparación interna de datos con la base de datos (6) y la emisión (100) de los resultados.
[0135] La base de datos (6) sirve en este caso para la evaluación externa y la devolución de los resultados (101), por ejemplo, el control por parte del médico, y para la entrada (102) de datos de fuentes externas (datos específicos del paciente).
[0136] El software de control e informático (5) conecta los componentes individuales de la disposición entre sí para permitir un control fácil desde una plataforma de usuario y también realiza un análisis integrado de datos multivariados, de modo que los resultados individuales de cada análisis contribuyan de manera óptima al resultado general, proporciona una interfaz de usuario que puede ser operada fácilmente por un médico o una enfermera.
[0137] La identificación del paciente de la muestra de sangre se lee a través de la entrada (102) de datos de fuentes externas, así como los datos clínicos del paciente del sistema hospitalario, que son necesarios para la evaluación estadística. La lectura e identificación de las muestras de sangre de individuales de un paciente se puede realizar mediante un escáner de código de barras. La finalización exitosa de los análisis de ejecución de los módulos individuales (1, 2 y 3) se documenta en la interfaz de usuario, o se muestra cualquier error que pueda haber ocurrido.
[0138] Como resultado, se muestran tanto los resultados de los módulos individuales (1, 2 y 3), es decir, las concentraciones de biomarcadores, los números de células y una puntuación Raman, como la correlación de estos resultados individuales, que son evaluados internamente por el software de control e informático (5) junto con los datos clínicos leídos y se muestran al médico como una "puntuación de sepsis".
[0139] Este valor de "puntuación de sepsis" proporciona información sobre la probabilidad de que el paciente tenga una infección y la probabilidad de que el paciente experimente un desarrollo crítico (por ejemplo, insuficiencia orgánica, shock séptico), es decir, que requiera atención médica especial.
[0140] El modelo de clasificación subyacente, que permite realizar estas declaraciones a partir de la gran cantidad de parámetros, se entrena y evalúa a través de la evaluación externa y la devolución (101) de los resultados a la base de datos con pacientes bien definidos, cuyo curso de la enfermedad es conocido, entrenado y evaluado.
[0141] Una ventaja del funcionamiento en paralelo de los tres módulos acoplados al componente de control de flujo (4) [módulo de holografía (1), módulo de espectroscopia Raman (2) y módulo de biomarcadores (3)] según la presente solución técnica es que, en comparación con las soluciones individuales conocidas anteriormente, que solo proporcionan las concentraciones de biomarcadores, los números de células o una puntuación Raman como resultado, todos los resultados individuales de los tres módulos están disponibles simultáneamente en un período de tiempo mucho más corto, donde la correlación de estos resultados individuales se muestra en el sentido de que son evaluados internamente por el software de control e informático (5) junto con los datos clínicos leídos y son evaluados y presentados para el médico como una "puntuación de sepsis".
[0142] Otra ventaja es que, mediante el funcionamiento en paralelo de los tres módulos (1,2 y 3), que es posible gracias a la funcionalidad especial del componente de control de flujo (4) y la unidad central de control e informática (5), provoca un efecto de sinergia, de modo que todo el análisis general [es decir, desde inyectar sangre con una pequeña cantidad de sangre de solo 1 a 2 ml hasta especificar la llamada "puntuación de sepsis" como un resultado final de examen significativo en la interfaz de usuario del software de control e informático (5)] dura como máximo una hora.
[0143] La ventaja aquí es que [en el caso de que el software de control e informático (5) no produzca un mensaje de error], no es necesario ningún acceso externo a la disposición durante este corto tiempo de medición de un máximo de una hora.
[0144] También es ventajoso que, en el caso de que las concentraciones de biomarcadores, los números de células y la puntuación Raman proporcionados por los módulos (1, 2 y 3) proporcionen resultados intermedios claros o contradictorios en el "camino" hacia el resultado final en forma de "puntuación de sepsis", el software de control e informático (5) proporcionan una devolución al componente de control de flujo (4) de tal manera que se efectúe un nuevo recorrido automatizado de la muestra relevante a través de los módulos (1,2 y 3).
[0145] La miniaturización del módulo de holografía (1), del módulo de espectroscopia Raman (2) y del módulo de biomarcadores (3), la unidad compacta de medición de muestras de biomarcadores (32) y la unidad portátil de medición de muestras de espectroscopia Raman (22) también permiten un análisis directamente muy cerca del paciente (en su mayoría pacientes de cuidados intensivos para la aplicación principal o la situación de la sala de emergencias), lo que representa una ventaja adicional de la presente solución técnica.
[0146] Todas las características representadas en la descripción, los ejemplos de realización y las siguientes reivindicaciones pueden ser esenciales para la invención tanto individualmente como en cualquier combinación entre sí.
Lista de referencias
[0147]
1 - módulo de holografía
11 - cartucho de preparación de muestras de holografía
12 - unidad de medición de muestras de holografía
2 - módulo de espectroscopia Raman
21 - cartucho de preparación de muestras de espectroscopia Raman
22 - unidad de medición de muestras de espectroscopia Raman
3 - módulo de biomarcadores
31 - cartucho de preparación de muestras de biomarcadores
32 - unidad de medición de muestras de biomarcadores
- componente de control de flujo
- válvula controlable
- unidad central de control e informática con controlador de software integrado
- base de datos
- suministros de material líquido
- suministro de solución de tinción
- suministro de tampón
- suministro de muestras de sangre
- suministro de biomarcadores 1
- suministro de biomarcadores 2
- suministro de biomarcadores 3
- flujo de datos para controlar las válvulas
- flujo de datos para transferir los valores medidos desde los módulos hasta el controlador - flujo de dato para controlar los procesos de medición en los módulos
- emisión de los resultados
- evaluación externa y devolución de los resultados a la base de datos
- entrada de datos de fuentes externas
- suministro de muestras
- primera unidad de enfoque hidrodinámica
- líquido auxiliar (fluido portador) para la primera unidad de enfoque
- líquido auxiliar (fluido portador) para la primera unidad de enfoque
- unidad de rotación de fluido
- segmentos de canales dispuestos en ángulo entre sí
- segunda unidad de enfoque hidrodinámica
- líquido auxiliar (fluido portador) para la segunda unidad de enfoque
- líquido auxiliar (fluido portador) para la segunda unidad de enfoque
- canal de examen, por ejemplo, para citometría de flujo basada en imágenes
- salida de muestras
- sustrato del sistema de chips de dos capas
- lámina de fluido según la primera unidad de enfoque hidrodinámica
- plano de chips
- ángulo p entre los segmentos de canales
- ángulo a de la rotación del fluido alrededor del eje de flujo
lámina de fluido homogénea (lámina de fluido después de la rotación de fluido) extremo de un segmento de canal
desviación de 90 grados al final del segmento de canal
transición entre las capas de chips
desviación de 90 grados al principio del siguiente segmento de canal principio del siguiente segmento de canal
plano entre ambas capas del sistema de chips de dos capas

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Disposición para el análisis de sangre in vitro individualizado de un paciente, que comprende un módulo de holografía (1), un módulo de espectroscopia Raman (2), un módulo de biomarcadores (3) y un componente de control de flujo (4) integrado, que, con el fin de transmitir datos e información, están en contacto con una unidad central de control e informática (5), que está conectada a una base de datos (6) para transmitir información, donde
• el módulo de holografía (1) consta de un cartucho de preparación de muestras de holografía (11) y una unidad de medición de muestras de holografía (12), que están conectados entre sí de manera microfluídica,
• el módulo de espectroscopia Raman (2) consta de un cartucho de preparación de muestras de espectroscopia Raman (21) y una unidad de medición de muestras de espectroscopia Raman (22), que están conectados entre sí de manera microfluídica,
• el módulo de biomarcadores (3) consta en un cartucho de preparación de muestras de biomarcadores (31) y una unidad de medición de muestras de biomarcadores (32), que están conectados entre sí de manera microfluídica, y los módulos (1, 2 y 3) están conectados de manera fluídica a un suministro de muestras de sangre común (73) y a otros suministros de material líquido (7) a través del componente de control de flujo (4), donde
• el cartucho de preparación de muestras de holografía (11) consta de canales de lisis microfluídicos microestructurados o canales de dielectroforesis con microelectrodos, que están conectados de manera microfluídica al componente de control de flujo (4), y la unidad de medición de muestras de holografía (12) es una disposición para un microscopio de luz reflejada en línea sin lentes con una fuente de iluminación coherente y una matriz de detectores,
• el cartucho de preparación de muestras de espectroscopia Raman (21) consta de canales de lisis microfluídicos microestructurados o canales de dielectroforesis con microelectrodos, que están conectados de manera microfluídica al componente de control de flujo (4), y la unidad de medición de muestras de espectroscopia Raman (22) es un sistema portátil de espectroscopia Raman para uso móvil, y
• el cartucho de preparación de muestras de biomarcadores (31) consta de canales de dielectroforesis microfluídicos microestructurados con microelectrodos o microcanales estructurados con filtros mecánicos o cambios de sección transversal, que están conectados de manera microfluídica al componente de control de flujo, y la unidad de medición de muestras de biomarcadores (32) es una disposición de matriz de detectores de fotosensores con una fuente de iluminación coherente, donde • los módulos (1, 2 y 3), el suministro de muestras de sangre (73) y los suministros de material líquido (7) están combinados de manera fluídicamente integrada a través del componente de control de flujo (4), de modo que el flujo de datos (81, 82 y 83) para controlar las válvulas, para transferir los valores medidos de los módulos (1, 2 y 3) a la unidad central de control e informática (5) y para controlar los procesos de medición en los módulos (1, 2 y 3) puede ser realizado mediante la unidad central de control e informática (5) a través del componente de control de flujo (4).
2. Disposición para el análisis de sangre in vitro individualizado de un paciente según la reivindicación 1, donde el componente de control de flujo (4) consta de un sustrato microestructurado con canales microfluídicos en los que están dispuestas válvulas controlables (41), de modo que se puedan generar recorridos de guía de líquido ordenados de tal manera que el recorrido de guía de líquido desde el suministro de muestras de sangre común (73) esté dividido en tres recorridos de guía de líquido, que conducen a los cartuchos (11, 21 y 31), donde los suministros de líquido (7) se pueden conectar selectivamente a través de las válvulas (41) controladas por la unidad de control e informática (5), y de tal manera que el componente de control de flujo (4) comprende una unidad de rotación de fluido (50), que consta de dos o más segmentos de canales (60) dispuestos unos detrás de otros y conectados entre sí en sus extremos, donde los dos segmentos de canales conectados entre sí respectivamente están dispuestos en ángulo entre sí, de modo que una corriente de fluido debe cambiar de dirección respectivamente cuando fluye a través de las transiciones entre los segmentos de canales (60).
3. Disposición para el análisis de sangre in vitro individualizado de un paciente según la reivindicación 2, donde los dos segmentos de canales (60) conectados respectivamente entre sí de un total de seis segmentos de canales (60) están dispuestos en un ángulo de 32 grados entre sí para efectuar una rotación total del fluido de 90 grados.
4. Disposición para el análisis de sangre in vitro individualizado de un paciente según la reivindicación 2, donde los segmentos de canales (60) están diseñados como microcanales en un sistema de chips de dos capas, donde los segmentos de canales (60) dispuestos unos detrás de otros están introducidos de manera alternativa en las capas de chips superior e inferior, de modo que, después de conectar las dos capas de chips, los microcanales previamente abiertos se cierran por la superficie de la otra capa de chips respectiva y hay una conexión con el siguiente segmento de canal solo en los extremos de los microcanales.
5. Disposición para el análisis de sangre in vitro individualizado de un paciente según la reivindicación 4, donde una unidad de enfoque hidrodinámica (20) está introducida en el sistema de chips de dos capas delante de la disposición para la rotación de fluido (50) y una segunda unidad de enfoque hidrodinámica (70) está introducida detrás de la disposición para la rotación de fluido (50), donde un canal de examen o una célula de medición de flujo se encuentra detrás de la segunda unidad de enfoque hidrodinámica (70).
6. Disposición para el análisis de sangre in vitro individualizado de un paciente según la reivindicación 1, donde la unidad central de control e informática (5) tiene un software de control integrado.
7. Disposición para el análisis de sangre in vitro individualizado de un paciente según las reivindicaciones 1 o 2, donde el componente de control de flujo (4) es un sistema de chips multicapa con modelos de reactivos integrados, canales de suministro, un bloque de válvulas y un bloque de conexión, que presenta canales microfluídicos en forma de unidad de rotación de fluido (50), que, para caudales bajos y números de Reynolds bajos (Re < 10) consta de dos o más segmentos de microcanales dispuestos unos detrás de otros y conectados entre sí en sus extremos, donde los dos segmentos de canales conectados respectivamente entre sí están dispuestos en un ángulo a entre sí, los dos segmentos de canales conectados respectivamente entre sí se encuentran en dos planos superpuestos, los extremos de los segmentos de canales están cerrados y la transición al siguiente segmento de canal se produce lateralmente en los extremos de los segmentos de canales, donde los segmentos de canales dispuestos unos tras otros están introducidos de manera alternativa en las capas de chips superior e inferior del sistema de chips multicapa.
8. Uso de una disposición según una o más de las reivindicaciones anteriores 1 a 7 para determinar una puntuación de sepsis.
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