ES2910227T3 - Composición y métodos para la estimulación y expansión de células T - Google Patents

Abstract

Un método para expandir una población de células T, en el que el método comprende: electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica, la proteína de membrana quimérica comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en anti-CD3, anti-TCR, anti-CD28 y una combinación de los mismos, y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB, en el que el ARNm se introduce en al menos una de las células de la población y se expresa en la superficie de las células; y cultivar la población electroporada de células, en la que las células T contenidas en la misma se expanden al menos 10 veces.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición y métodos para la estimulación y expansión de células T

Antecedentes de la técnica

La transferencia celular adoptiva de células T modificadas genéticamente ha demostrado ser una alternativa atractiva para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, las células T generalmente deben expandirse antes de que pueda manipularse un número suficiente para el tratamiento. Existen múltiples formas que pueden utilizarse en el ámbito clínico para estimular y expandir las células T, incluyendo la estimulación con cuentas anti-CD3/CD28, la estimulación con anti-CD3 con o sin anticuerpos anti-CD28, y la estimulación artificial basada en células presentadoras de antígenos. Las células T generadas por estos diferentes métodos muestran diferentes fenotipos y funciones in vitro/in vivo.

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de mejorar los métodos para derivar poblaciones de células T con el fin de generar células T que puedan ejercer al máximo sus funciones efectoras in vivo para la inmunoterapia adoptiva basada en células T.

Sumario de la invención

El objeto de la invención es el que se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Como se describe en el presente documento, la presente invención se refiere a composiciones y métodos para estimular y expandir células T.

Un aspecto de la invención se refiere a un método para expandir una población de células T, en el que el método comprende:

electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica, la proteína de membrana quimérica comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en anti-CD3, anti-TCR, anti-CD28 y una combinación de los mismos, y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB, en el que el ARNm se introduce en al menos una de las células de la población y se expresa en la superficie de las células; y

cultivar la población electroporada de células, en la que las células T contenidas en la misma se expanden al menos 10 veces.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para expandir una población de células T electroporadas, el método comprende:

electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica, la proteína de membrana quimérica comprende un fragmento variable de cadena única (single chain variable fragment, scFv) dirigido contra CD3 y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB, en el que el ARNm se introduce en al menos una de las células de la población y se expresa en la superficie de las células; y

cultivar la población de células electroporadas, en la que las células T contenidas en ella se expanden al menos 10 veces.

Otro aspecto de la invención se refiere a una población de células T expandida, que comprende un ARNm electroporado que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende

un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3, o un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en anti-CD3, anti-TCR, anti-CD28, y una combinación de los mismos, y

un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB,

donde el ARNm se introduce en al menos una de las células de la población y es expresado en la superficie de las células, y en el que las células T contenidas en la población se expandieron al menos 10 veces.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula T que comprende un ARNm electroporado que codifica una proteína quimérica de membrana que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB.

Otro aspecto de la invención se refiere a una población de células T electroporadas que comprende un ARNm electroporado que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en anti-CD3, anti-TCR, antiCD28, y una combinación de los mismos, y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB.

Otro aspecto de la invención se refiere a una población expandida de células que comprende células T para su uso en un método de terapia de transferencia celular adoptiva, en el que dicho método comprende administrar dicha población de células a un sujeto que la necesita para prevenir o tratar una reacción inmunológica adversa para el sujeto, donde la población de células expandida se ha expandido según un método que comprende electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB, donde al menos una de las células de la población expresa la proteína de membrana quimérica; y cultivar la población celular, en la que las células T contenidas en ella se expanden al menos 10 veces. Otro aspecto de la invención se refiere a una población expandida de células que comprende células T para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o afección asociada a una inmunidad aumentada en un sujeto, en el que dicho método comprende administrar dicha población celular expandida a un sujeto que la necesita, donde la población celular expandida se ha expandido según un método que comprende electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1 Bb , donde al menos una de las células de la población expresa la proteína de membrana quimérica; y cultivar la población, en la que las células T contenidas en ella se expanden al menos 10 veces.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una célula T modificada, en la que la célula T modificada comprende un ARNm electroporado que codifica una proteína de membrana quimérica, la proteína de membrana quimérica comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en anti-CD3, anti-TCR, anti-CD28, y una combinación de los mismos, y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula T modificada que comprende un ARNm electroporado que codifica una proteína de membrana quimérica, la proteína de membrana quimérica comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en anti-CD3, anti-TCR, anti-CD28, y una combinación de los mismos, y un dominio intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB, para su uso en un método de tratamiento de una afección en un sujeto, en donde dicho método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición farmacéutica.

Un aspecto de la invención y la presente divulgación incluye un método para expandir una población de células T, el método comprende electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica, la proteína de membrana quimérica comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo a una molécula y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-1BB, en el que el ARNm se introduce en al menos una de las células de la población y se expresa en la superficie de las células, y se cultiva la población de células electroporada, en la que las células T contenidas en ella se expanden al menos 10 veces.

En otro aspecto, la invención y la presente divulgación incluye un método para expandir una población de células T electroporadas, comprendiendo el método electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica, la proteína de membrana quimérica comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-1BB, en el que el ARNm se introduce en al menos una de las células de la población y se expresa en la superficie de las células, y cultivar la población de células electroporadas en la que las células T contenidas en ella se expanden al menos 10 veces.

En otro aspecto más, la invención y la presente divulgación incluyen una célula T que comprende un ARNm electroporado que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-1 BB.

En otro aspecto, la invención y la presente divulgación incluye una población de células T electroporadas que comprenden un ARNm electroporado que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo a una molécula, y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-1 BB.

Otro aspecto de la invención y de la presente divulgación incluye un método para la terapia de transferencia celular adoptiva que comprende administrar una población expandida de células que comprende células T a un sujeto que lo necesita para prevenir o tratar una reacción inmunitaria adversa al sujeto, donde la población celular expandida se ha expandido según un método que comprende electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-1BB, donde al menos una de las células de la población expresa la proteína de membrana quimérica; y cultivar la población celular, en la que las células T contenidas en ella se expanden al menos 10 veces.

Todavía otro aspecto de la invención y de la presente divulgación incluye un método de tratamiento de una enfermedad o condición asociada con una inmunidad mejorada en un sujeto que comprende administrar una población expandida de células que comprende células T a un sujeto que lo necesita, donde la población expandida de células se ha expandido según un método que comprende electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-IBB, donde al menos una de las células de la población expresa la proteína de membrana quimérica; y cultivar la población, en la que las células T contenidas en ella se expanden al menos 10 veces.

En otro aspecto, la invención incluye una población de células T expandida hecha por los métodos descritos en el presente documento.

En otro aspecto, un método para tratar una condición en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende la célula T modificada generada en el método descrito en el presente documento.

En otro aspecto más, la invención incluye un uso de la célula T descrita en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita.

En varias realizaciones de los aspectos anteriores o de cualquier otro aspecto de la invención delineada en el presente documento, la población de células a electroporar se selecciona del grupo que consiste en células mononucleares de sangre periférica, células de sangre de cordón umbilical, una población purificada de células T y una línea de células T. En otra realización, la población de células a electroporar comprende células mononucleares de sangre periférica. En otra realización, la población de células a electroporar comprende células T purificadas. En una realización, el ARNm comprende ARN transcrito in vitro o ARN sintético. En otra realización, el ARNm que codifica la proteína de membrana quimérica comprende además un dominio transmembrana. En otra realización, el ARNm que codifica la proteína de membrana quimérica comprende además un dominio de bisagra.

En otra realización, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo sintético, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de dominio único, un fragmento variable de cadena única y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En otra realización, el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en anti-CD3, anti-TCR, anti-CD28, y una combinación de los mismos.

En otra realización, al menos una célula de la población de células expresa CD3. En otra realización, al menos una célula que expresa la proteína de membrana quimérica interactúa con otra célula que expresa CD3.

En otra realización, las células T se expanden en un rango de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces.

En una realización, el método descrito en el presente documento comprende además electroporar un ARNm que codifica un agente en la población expandida de células T. En otra realización, el ARNm del agente se coelectropora con el ARNm de la proteína de membrana quimérica. En otra realización, el método descrito en el presente documento comprende además estimular la población expandida de células T con al menos una molécula o citoquina seleccionada del grupo que consiste en CD27, Cd28, CD83, CD86, CD127, 4- 1BBL IL2, IL21, IL-15, IL-7, PD1-CD28 y PD1. En otra realización, el método descrito en el presente documento comprende además criopreservar las células T cultivadas.

En otra realización, la respuesta inmunitaria es una enfermedad autoinmune. En otra realización, la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Addison autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad autoinmune del oído interno (autoimmune inner ear disease, AIED), síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS por su siglas en inglés), púrpura trombocitopénica autoinmune (autoimmune thrombocytopenic purpura, ATP), enfermedad de Behcet, cardiomiopatía, dermatitis hepetiforme esprúes celíaca; síndrome de disfunción inmunitaria por fatiga crónica (chronic fatigue immune dysfunction syndrome, CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), penfigoide cicatricial, enfermedad de la aglutinina fría, síndrome de la cresta, enfermedad de Crohn, enfermedad de Degos, dermatomiositis juvenil, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), nefropatía IgA, diabetes mellitus insulinodependiente, artritis crónica juvenil (enfermedad de Still), artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, miastenia gravis, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia (esclerosis sistémica progresiva (progressive systemic sclerosis, PSS), también conocida como esclerosis sistémica (systemic sclerosis, SS)), síndrome de Sjogren, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vitíligo, granulomatosis de Wegener y cualquier combinación de las mismas.

En otra realización, la respuesta inmunitaria es un cáncer. En otra realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer cerebral, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y carcinoma de tiroides.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención se entenderá mejor cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar la invención, se muestran en los dibujos realizaciones que son actualmente preferidas. Debe entenderse, sin embargo, que la invención no se limita a los arreglos precisos e instrumentalidades de las de las realizaciones mostradas en los dibujos.

La Figura 1 es un panel de mapas vectoriales de anti-CD3-H5L1-28BB y antiCD3-OKT3-28BB. En ambas construcciones, scFv anti-CD3 se fusionaron con la región bisagra de CD8 seguida de las regiones transmembrana CD28, intracelular CD28 e intracelular 4-1 BB.

La figura 2 es un gráfico que muestra la expansión de las células T estimuladas por electroporación del ARN OKT-28BB.

La figura 3 es un panel de gráficos que muestra el análisis del fenotipo de las células T expandidas. El fenotipo de las células T expandidas mediante ARN OKT-28BB o H5L1-28BB se comparó con el fenotipo de las células T expandidas mediante la estimulación con OKT3 (OKT3) o con estimulación por perlas CD28/CD3 (Beads) 10 días después de la estimulación.

La Figura 4 es un panel de gráficos que destaca la función de las células T expandidas. Las células T se expandieron durante 10 días utilizando los diferentes métodos indicados. OKT3: adición del anticuerpo OKT3 directamente a las PBMC (OKT3); OKT-28BB: electroporación de las PBMC con OKT3-28BB; H5L1-28BB: electroporación de PBMC con H5L1-28BB; o Beads: se añadieron perlas CD3/CD28 directamente a las PBMC. Todos los grupos fueron electroporados con un receptor de antígeno quimérico (Chimeric Antigen Receptor, CAR) CD19 para probar la función de las células T mediante la estimulación con el tumor Nalm6 CD19 positivo. La expresión de CD19 CAR de las células T electroporadas con ARN CD19 CAR se determinó a las 18 horas posteriores a la electroporación del ARN.

La Figura 5, que comprende las Figuras 5A-B, representa además la función de las células T expandidas electroporadas con ARN CD19 CAR. Las células expandidas se estimularon con Nalm6 con diferentes proporciones de células T:células Nalm6 (Figura 5A). Se trazaron los porcentajes de células T CD107a positivas (Figura 5^b ). La Figura 6 es un panel de gráficos que muestra el análisis del fenotipo de las células T expandidas. Se comparó el fenotipo de las células T expandidas durante 10 días por OKT-28BB o combinadas con otras células T electroporadas por ARN con el fenotipo de las células T expandidas por estimulación de OKT3 (OKT3).

La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra los niveles de producción de interferón-gamma (IFN-y) de las células T expandidas por coelectroporación de OKT-28BB con ARN que codifica otras moléculas y electroporadas con ARN ^c D19 CAR, estimuladas con líneas celulares CD19 positivas durante 18 h. Los niveles de IFN- ^y se midieron por ELISA.

La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra los niveles de producción de IL-2 de las células T expandidas por co-electroporación de OKT-28BB con ARN que codifica otras moléculas (enumeradas en la Figura 10) y electroporadas con ARN de CD19 CAR, estimuladas con líneas celulares CD 19 positivas durante 18 horas. Los niveles de IL-2 se midieron por ELISA.

La Figura 9 es un panel de gráficos que ilustra la actividad lítica de las células T comprobada mediante un ensayo de linfocitos T citotóxicos (CTL) para las células T expandidas por co-electroporación de OKT-28BB con ARN que codifica otras moléculas, y electroporadas con ARN CD19 CAR, estimuladas con tumor CD19 positivo, Nalm6; Nalm6 expresado con PDL1 ; o Nalm6 con HVEM.

La Figura 10 es una tabla que detalla las co-electroporaciones de ARN. OKT-28BB-1: Células T expandidas por electroporación de PBMCs con sólo ARN OKT-28BB. OKT-28BB-2 a OKT-28BB-6: Células T expandidas por coelectroporación de PBMC con OKT-28BB y diferentes combinaciones de ARN que codifican otras moléculas mostradas.

La Figura 11 es un panel de imágenes que muestra ratones NSG inyectados con 1E6 Nalm6-ESO-CBG por vía intravenosa en el día 0. En el día 7, se inyectaron por vía intravenosa 1x106 células T ARN OKT3-28BB (RNA-T) electroporadas con ARN NY-ESO-T TCR (1G4 TCR) o células T con perlas CD3/CD28 (Beads). La carga tumoral se monitorizó mediante imágenes de bioluminiscencia. Los resultados mostraron un mejor control tumoral de las células RNA-T transferidas con TCR que de las células T estimuladas con Beads.

La figura 12 es un panel de gráficos que muestra la transducción lentiviral eficiente de las células RNA-T. Se cosecharon células T ARN del día 1 o del día 2 y se alicuotaron en una placa de 24 pocillos con 0,5ml, 1ml o 2ml/pocillo a concentraciones celulares de 1,5xl06/ml. Se añadió 0,1 ml de vector lentiviral 4D5.BBZ concentrado (a un título de 5x106/ml) a cada pocillo. Como controles, se añadió el vector lentiviral 4D5.BBZ el día 1 o el día 2 a las células T estimuladas con microesferas CD3/CD28 a un múltiplo de infección (multiple of infection, MOI) como se indica. El día 9 después de la estimulación, las células T expandidas se sometieron a tinción por citometría de flujo para la detección de la expresión de CAR transducido.

La Figura 13 es un gráfico que muestra la expansión de células T de ARN transducidas lentivirales. Los resultados indicaron que tanto las células T ARN transducidas lentiviralmente como las no transducidas se expandieron con la misma eficacia que las células T estimuladas con perlas CD3/CD28.

La Figura 14 es un panel de gráficos que muestra la regulación al alza de CD107a en las células T ARN transducidas lentivirales. Las células T ARN transducidas lentiviralmente, o las células T estimuladas con Beads fueron estimuladas con líneas celulares Her2 positivas, SK-OV3, MCF7 y MDA231, o una línea tumora1Her2 negativa, MDA468, durante 4h, la expresión de CD 107a se detectó con citometría de flujo.

La Figura 15 es un panel de gráficos que muestra la producción de citoquinas de las células T ARN transducidas lentivirales. Las células T de ARN transducidas lentiviralmente, o las células T estimuladas con Beads, se estimularon con líneas celulares Her2 positivas, SK-OV3, MCF7 y MDA231, o con una línea tumora1Her2 negativa, MDA468, y la producción de citoquinas se detectó mediante ELISA tras una noche de incubación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por alguien con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento puede ser utilizado en la práctica para probar la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en el presente documento. Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología.

También debe entenderse que la terminología empleada en el presente documento tiene por objeto describir formas de realización concretas y no pretende ser limitativa.

Los artículos "un/uno” y “una" se utilizan aquí para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

"Alrededor de", tal como se utiliza en este documento, cuando se refiere a un valor medible como una cantidad, una duración temporal, y similares, se entiende que abarca variaciones de ±20% o ±10%, más preferentemente ±5%, aún más preferentemente ±1%, y aún más preferentemente ±0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados.

El término "anticuerpo", tal como se utiliza aquí, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas obtenidas de fuentes naturales o recombinantes y pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos son típicamente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los tetrámeros pueden ser naturales o reconstruidos a partir de anticuerpos de cadena única o fragmentos de anticuerpos. Los anticuerpos también incluyen dímeros que pueden ser naturales o estar construidos a partir de anticuerpos de cadena única o fragmentos de anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden existir en una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab')2, así como anticuerpos de cadena única (scFv), anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos (Harlow et al., 1999, en: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow' et al., 1989, en: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).

El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una región de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables de determinación antigénica de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos scFv, anticuerpos de un solo dominio, como los anticuerpos de camélidos (Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38), compuestos por un dominio VL o VH que muestran suficiente afinidad por la diana, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. El fragmento de anticuerpo también incluye un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado o un fragmento de un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado del mismo.

Una "cadena pesada de anticuerpo", tal como se utiliza aquí, se refiere al mayor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en todas las moléculas de anticuerpos en sus conformaciones naturales.

Una "cadena ligera de anticuerpo", tal y como se utiliza aquí, se refiere al menor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en todas las moléculas de anticuerpo en sus conformaciones naturales, las cadenas ligeras a y p se refieren a los dos principales isotipos de cadena ligera de anticuerpo.

El término "anticuerpo sintético", tal y como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo que se genera utilizando la tecnología del ADN recombinante, como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago como se describe en el presente documento. El término también debe interpretarse como un anticuerpo que ha sido generado por la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, donde la secuencia de ADN o aminoácidos se ha obtenido utilizando la tecnología de secuencias de ADN sintético o tecnología de secuencias de aminoácidos que está disponible y es bien conocida en la técnica.

El término "antígeno" o "Ag", tal como se utiliza aquí, se define como una molécula que provoca una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células específicas inmunológicamente competentes, o ambas. El artesano experto entenderá que cualquier macromolécula, incluyendo prácticamente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígeno. Además, los antígenos pueden generarse a partir de ADN recombinante o genómico. Un artesano experto entenderá que cualquier ADN que comprenda una secuencia de nucleótidos o una secuencia parcial de nucleótidos que codifique una proteína que provoque una respuesta inmunitaria codifica, por tanto, un "antígeno" tal como se utiliza este término en el presente documento. Además, un experto en la materia comprenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos de longitud completa de un gen. Es fácilmente aparente que la presente invención incluye, pero no se limita a, el uso de secuencias de nucleótidos parciales de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos se disponen en diversas combinaciones para provocar la respuesta inmunitaria deseada. Además, un artesano experto entenderá que un antígeno no tiene por qué estar codificado por un "gen" en absoluto. Es evidente que un antígeno puede generarse, sintetizarse u originarse a partir de una muestra biológica. Dicha muestra biológica puede incluir, pero no se limita a una muestra de tejido, una muestra de tumor, una célula o un fluido biológico.

Tal y como se utiliza aquí, el término "autólogo" se refiere a cualquier material procedente del mismo individuo al que posteriormente se le va a reintroducir.

"Alogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal diferente de la misma especie.

"Xenogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.

El término "cáncer", tal y como se utiliza aquí, se define como una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido e incontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas pueden propagarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Los ejemplos de varios tipos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de tiroides y otros similares.

El término "receptor de antígeno quimérico" o "CAR” por su siglas en Inglés, tal como se utiliza en este documento, se refiere a un receptor artificial de células T diseñado para expresarse en una célula efectora inmunitaria y unirse específicamente a un antígeno. Los CAR pueden utilizarse como terapia mediante la transferencia celular adoptiva. Las células T se extraen de un paciente y se modifican para que expresen los receptores específicos de una forma particular de antígeno. En algunas realizaciones, los ^cAR^s se han expresado con especificidad hacia un antígeno asociado al tumor, por ejemplo. Los CARs pueden también comprenden un dominio de activación intracelular, un dominio transmembrana y un dominio extracelular que comprende una región de unión al antígeno asociada al tumor. En algunos aspectos, los CAR comprenden fusiones de anticuerpos monoclonales derivados de fragmentos variables de cadena única (scFv), fusionados con el dominio transmembrana e intracelular de CD3-zeta. La especificidad de los diseños de CAR puede derivarse de los ligandos de los receptores (por ejemplo, péptidos). En algunas realizaciones, un CAR puede dirigirse a los cánceres redirigiendo la especificidad de una célula T que expresa el CAR específico para los antígenos asociados al tumor.

El término "proteína de membrana quimérica" se refiere a una proteína de membrana diseñada que tiene un dominio extracelular y un dominio intracelular derivado de o capaz de activar una o más moléculas de señalización y/o receptoras. Por ejemplo, la proteína de membrana quimérica aquí descrita comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de C^d28 y 4-1BB.

Tal y como se utiliza aquí, el término "modificaciones conservadoras de secuencia " se refiere a las modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Estas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y supresiones de aminoácidos. Las modificaciones pueden introducirse en un anticuerpo de la invención mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son aquellas en las que el residuo de aminoácido es sustituido por un residuo de aminoácido que tenga una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos con cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invención pueden sustituirse por otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y el anticuerpo alterado puede ser probado para la capacidad de unirse al antígeno utilizando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

El término "ligando coestimulador" incluye una molécula en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una aAPC, una célula dendrítica, una célula B, etc.) que se une específicamente a una molécula coestimuladora afín en una célula T, proporcionando así una señal que, además de la señal primaria proporcionada por, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula MHC cargada con péptido, media una respuesta de las células T, incluyendo, pero sin limitarse a, la proliferación, la activación, la diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero no se limita a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando costimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MTCB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3,ILT4, Hv EM, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando T y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en una célula T, como, por ejemplo, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a la función de linfocitos-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, y un ligando que se une específicamente con CD83.

Una "molécula coestimuladora" se refiere a la pareja de unión afín en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimulante por parte de la célula T, como, por ejemplo, sin estar limitada a la proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, entre otras, una molécula MHC de clase I, BTLA y un receptor de ligando Toll.

El término "derivado de" se refiere a ser generado, sintetizado u originado a partir de una fuente en particular, de tal manera que la materia derivada está relacionada con la fuente. No es necesario que la materia derivada sea idéntica a la fuente en particular. En una realización, un antígeno se deriva de una proteína. En otra realización, un fragmento variable de cadena única se deriva de un anticuerpo monoclonal.

Los términos "electroporar", "electroporación", "electroporado" se refieren al proceso por el que se aplica un campo eléctrico a la membrana plasmática de una célula para aumentar su permeabilidad. Se aplica un pulso de duración y forma específicas a la membrana de una célula para introducir ácidos nucleicos en ella.

"Cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se utilizan indistintamente en este documento, y se refieren a una cantidad de un compuesto, formulación, material o composición, como se describe en el presente documento, capaz de lograr un resultado biológico particular. Dichos resultados pueden incluir, pero no se limitan a, la inhibición de la infección por virus según se determine por cualquier medio adecuado en la técnica.

"Codificando" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, como un gen, un ADNc o un ARNm, para servir como plantilla para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de ello. Así, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia del mRNA y que suele proporcionarse en listados de secuencias, como la cadena no codificante, utilizada como plantilla para la transcripción de un gen o ADNc, pueden denominarse como codificante de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

Tal como se utiliza aquí, "endógeno" se refiere a cualquier material procedente o producido dentro de un organismo, célula, tejido o sistema.

Tal y como se utiliza aquí, el término "exógeno" se refiere a cualquier material introducido desde o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema.

Tal y como se utilizan aquí, los términos "expandir" y "expansión" se refieren a la proliferación o multiplicación de células, como las células T.

El término "expresión", tal como se utiliza aquí, se define como la transcripción y/o la traducción de una secuencia de nucleótidos concreta impulsada por su promotor.

"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión enlazadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que debe expresarse. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción cis para la expresión; otros elementos de expresión pueden ser suministrados por la célula huésped o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

"Homólogo", tal y como se utiliza aquí, se refiere a la identidad de secuencia de subunidad entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, como dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas polipeptídicas. Cuando una posición de subunidad en ambas moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica; por ejemplo, si una posición en cada una de dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son 50% homólogas; si el 90% de las posiciones (por ejemplo, 9 de 10), son coincidentes u homólogas, las dos secuencias son homólogas en un 90%.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión al antígeno de los anticuerpos) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulinas no humanas. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante complementaria (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como el ratón, la rata o el conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos de la región marco no humana. Además, los anticuerpos humanizados pueden incluir residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o marco importadas. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o casi todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también, de manera óptima, al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al.. Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

"Totalmente humano" se refiere a una inmunoglobulina, como un anticuerpo, donde toda la molécula es de origen humano o consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica a una forma humana del anticuerpo.

Las frases "una cantidad inmunológicamente eficaz", "una cantidad eficaz para la respuesta inmunitaria", "una cantidad eficaz para la inhibición de la respuesta inmunitaria" o "cantidad terapéutica" se refieren a la cantidad de la composición de la presente invención que debe administrarse a un sujeto, cantidad que es determinada por un médico, opcionalmente en consulta con un científico, teniendo en cuenta las diferencias individuales de edad, peso, respuesta inmunitaria, tipo de enfermedad/condición y la salud del sujeto (paciente), de modo que se obtenga el resultado deseado en el sujeto.

Tal y como se utiliza aquí, un "material instructivo" incluye una publicación, una grabación, un diagrama o cualquier otro medio de expresión que pueda utilizarse para comunicar la utilidad de las composiciones y métodos de la invención. El material instructivo del kit de la invención puede, por ejemplo, fijarse a un contenedor que contiene el ácido nucleico, el péptido y/o la composición de la invención o enviarse junto con un contenedor que contiene el ácido nucleico, el péptido y/o la composición. Alternativamente, el material instructivo puede enviarse por separado del contenedor con la intención de que el material instructivo y el compuesto sean utilizados cooperativamente por el receptor.

"Aislado" significa alterado o retirado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido separado parcial o totalmente de los materiales coexistentes de su estado natural es "aislado". Un ácido nucleico o una proteína aislados pueden existir en forma sustancialmente purificada, o pueden existir en un entorno no nativo como, por ejemplo, una célula huésped.

El término "modificado", tal y como se utiliza en el presente documento, significa un cambio de estado o estructura de una molécula o célula de la invención. Las moléculas pueden ser modificadas de muchas maneras, incluyendo química, estructural y funcionalmente. Las células pueden modificarse mediante la introducción de ácidos nucleicos. Por el término "modulante", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende la mediación de un aumento o disminución detectable en el nivel de una respuesta en un sujeto en comparación con el nivel de una respuesta en el sujeto en ausencia de un tratamiento o compuesto, y/o en comparación con el nivel de una respuesta en un sujeto idéntico pero no tratado. El término abarca la perturbación y/o la afectación de una señal o respuesta nativa, mediando así una respuesta terapéutica beneficiosa en un sujeto, preferentemente un humano.

En el contexto de la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaturas para las bases de ácidos nucleicos más comunes. "A" se refiere a la adenosina, "C" a la citosina, "G" a la guanosina, "T" a la timidina y "U" a la uridina. A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas unas de otras y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN puede incluir también intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede contener en alguna versión un intrón o intrones.

El término "vinculado operativamente" se refiere a la vinculación funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que da lugar a la expresión de esta última. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico está operativamente vinculada con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Generalmente, las secuencias de ADN enlazadas operablemente son contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones codificadoras de proteínas, en el mismo marco de lectura.

La administración "parenteral" de una composición inmunogénica incluye, por ejemplo, inyección subcutánea (s.c. ), intravenosa (i.v. ), intramuscular (i.m.), o intraesternal, o técnicas de infusión.

El término "polinucleótido", tal como se utiliza aquí, se define como una cadena de nucleótidos. Además, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Por lo tanto, ácidos nucleicos y polinucleótidos, tal como se utilizan aquí, son intercambiables. Un experto en la materia tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que pueden ser hidrolizados a "nucleótidos" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos pueden hidrolizarse en nucleósidos. Tal como se utilizan en el presente documento, los polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, todas las secuencias de ácidos nucleicos que se obtienen por cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, sin limitación, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácidos nucleicos a partir de una biblioteca recombinante o un genoma celular, utilizando la tecnología de clonación ordinaria y PCR™, y similares, y por medios sintéticos.

En este documento, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente y se refieren a un compuesto formado por residuos de aminoácidos covalentemente unidos por enlaces peptídicos. Una proteína o un péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se establece ninguna limitación en cuanto al número máximo de aminoácidos que pueden componer la secuencia de una proteína o un péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término se refiere tanto a las cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a las cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica como proteínas, de las que hay muchos tipos. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de ellos.

El término "promotor", tal como se utiliza aquí, se define como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o la maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de una secuencia de polinucleótidos.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "secuencia promotora/reguladora" significa una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto génico unido de forma operativa a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora principal y en otros casos, esta secuencia puede incluir también una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede, por ejemplo, ser una que exprese el producto génico de manera específica para un tejido.

Un promotor "constitutivo" es una secuencia de nucleótidos que, cuando se une de forma operativa a un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula bajo la mayoría o todas las condiciones fisiológicas de la misma.

Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótidos que, cuando se une de forma operativa a un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente sólo cuando un inductor que corresponde al promotor está presente en la célula.

Un promotor "específico de tejido" es una secuencia de nucleótidos que, cuando es enlazado operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un gen, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente sólo si ésta es una célula del tipo de tejido correspondiente al promotor.

Una "vía de transducción de señales" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señales que desempeñan un papel en la transmisión de una señal de una región de una célula a otra región de una célula. La frase "receptor de superficie celular" incluye moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y transmitir la señal a través de la membrana plasmática de una célula. Un ejemplo de "receptor de superficie celular" es el CD3 o CD28 humano.

Los "anticuerpos de cadena única" se refieren a los anticuerpos formados por técnicas de ADN recombinante en las que los fragmentos de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas están unidos a la región Fv mediante un tramo de aminoácidos diseñado. Existen varios métodos para generar anticuerpos de cadena única, incluidos los descritos en U.S. Pat. No. 4,694,778; Bird (1988) Science 242:423-442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:58795883; Ward et al. (1989) Nature 334:54454; Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041.

Por el término "se une específicamente", tal y como se utiliza aquí, se entiende un anticuerpo, o un ligando, que reconoce y se une con una proteína compañera de unión correspondiente (por ejemplo, una molécula estimuladora y/o coestimuladora presente en una célula T) presente en una muestra, pero cuyo anticuerpo o ligando no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas de la muestra.

Por el término "estimulación" se entiende una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) con su ligando correspondiente, mediando así un evento de transducción de señales, como, pero no limitado a, la transducción de señales a través del complejo TCR/CD3. La estimulación puede mediar la expresión alterada de ciertas moléculas, como la regulación a la baja del TGF-p, y/o la reorganización de las estructuras citoesqueléticas, y similares.

Una "molécula estimuladora", tal y como se utiliza el término en el presente documento, significa una molécula en una célula T que se une específicamente con un ligando estimulador correspondiente presente en una célula presentadora de antígeno.

Un "ligando estimulante", tal como se utiliza en el presente documento, significa un ligando que, cuando está presente en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una aAPC, una célula dendrítica, una célula B, y similares) puede unirse específicamente con un compañero de unión correspondiente (denominado en el presente documento "molécula estimulante") en una célula T, mediando así una respuesta primaria de la célula T, incluyendo, pero sin limitarse a ello, la activación, el inicio de una respuesta inmunitaria, la proliferación, y similares. Los ligandos estimulantes son bien conocidos en la técnica y abarcan, entre otros, una molécula MHC de clase I cargada con un péptido, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo superagonista anti-CD28 y un anticuerpo superagonista anti-CD2. El término "sujeto" incluye a los organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, los mamíferos). Un "sujeto" o "paciente", tal y como se utiliza en este documento, puede ser un mamífero humano o no humano. Los mamíferos no humanos incluyen, por ejemplo, el ganado y las mascotas, como los mamíferos ovinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos y murinos. Preferiblemente, el sujeto es humano.

Tal como se utiliza en el presente documento, una célula "sustancialmente purificada" es una célula que está esencialmente libre de otros tipos de células. Una célula sustancialmente purificada también se refiere a una célula que ha sido separada de otros tipos celulares con los que normalmente está asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, este término se refiere simplemente a las células que han sido separadas de las células con las que están asociadas de forma natural en su estado natural. En algunas realizaciones, las células se cultivan in vitro. En otras realizaciones, las células no se cultivan in vitro.

Un "sitio diana" o "secuencia diana" se refiere a una secuencia genómica de ácido nucleico que define una región de un ácido nucleico a la que una molécula de unión puede unirse específicamente en condiciones suficientes para que se produzca la unión.

Tal y como se utiliza aquí, el término "receptor de células T" o "TCR" se refiere a un complejo de proteínas de membrana que participan en la activación de las células T en respuesta a la presentación del antígeno. El TCR es responsable de reconocer los antígenos unidos a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad. El TCR está compuesto por un heterodímero de una cadena alfa (a) y beta (p), aunque en algunas células el TCR está formado por cadenas gamma y delta (^y/6). Los TCR pueden existir en las formas alfa/beta y gamma/delta, que son estructuralmente similares pero tienen ubicaciones y funciones anatómicas distintas. Cada cadena se compone de dos dominios extracelulares, un dominio variable y otro constante. En algunas realizaciones, el TCR puede modificarse en cualquier célula que comprenda un t Cr , incluyendo, por ejemplo, una célula T ayudante, una célula T citotóxica, una célula T de memoria, una célula T reguladora, una célula T asesina natural y una célula T gamma delta.

El término "terapéutico", tal como se utiliza aquí, significa un tratamiento y/o profilaxis. Un efecto terapéutico se obtiene mediante la supresión, remisión o erradicación de un estado de enfermedad.

El término "transfectado" o "transformado" o "transducido", tal y como se utiliza aquí, se refiere a un proceso por el que se transfiere o introduce ácido nucleico exógeno en la célula huésped. Una célula "transfectada" o "transformada" o "transducida" es aquella que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula primaria del sujeto y su progenie.

La frase "bajo control transcripcional" o "vinculado operativamente", tal como se utiliza en el presente documento, significa que el promotor está en la ubicación y orientación correctas en relación con un polinucleótido para controlar el inicio de la transcripción por la ARN polimerasa y la expresión del polinucleótido.

Un "vector" es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que puede utilizarse para llevar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Se conocen numerosos vectores en la técnica que incluyen, entre otros, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados a compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por lo tanto, el término "vector" incluye un plásmido de replicación autónoma o un virus. El término también debe interpretarse para incluir compuestos no plásmidos y no virales que facilitan la transferencia de ácido nucleico a las células, como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas y similares. Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores de virus adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales y similares.

Rangos: a lo largo de esta divulgación, varios aspectos de la invención pueden presentarse en un formato de rango. Debe entenderse que la descripción en formato de rango es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. En consecuencia, debe considerarse que la descripción de un rango ha revelado específicamente todos los posibles subrangos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese rango. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un rango como el de 1 a 6 ha revelado específicamente sub-rangos como el de 1 a 3, el de 1 a 4, el de 1 a 5, el de 2 a 4, el de 2 a 6, el de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese rango, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del rango.

Descripción

La presente invención incluye un método para expandir una población de células T electroporadas. El método incluye electroporar una población de células, tales como mononucleares de sangre periférica, que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica, en la que el ARNm se introduce en al menos una de las células de la población y se expresa en la superficie de las células. En una realización, la proteína de membrana quimérica comprende un dominio de unión a antígeno que se une a una molécula, tal como TCR/CD3, y un dominio intracelular de una molécula coestimuladora En otra realización, la población electroporada se cultiva, en donde las células T contenidas en ella se expanden al menos 10 veces. Por consiguiente, la presente invención permite la expansión de células T a partir de una población de células y la preparación de las células para aplicaciones terapéuticas, como la transferencia celular adoptiva.

Métodos

En un aspecto, la invención y la presente divulgación incluye un método de expansión de una población de células T, donde el método comprende los pasos de electroporar una población de células, tales como células mononucleares de sangre periférica, que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica. La proteína de membrana quimérica comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a una molécula, tal como TCR/CD3, y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-1BB. El ARNm se introduce en al menos una de las células de la población y se expresa en la superficie de las células, y se cultiva la población electroporada de células, en la que las células T contenidas en ella se expanden al menos 10 veces. En otro aspecto, la invención y la presente divulgación incluye un método para expandir una población de células T electroporadas donde el método comprende los pasos de electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica. La proteína de membrana quimérica comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra c D3 y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-1BB. El ARNm se introduce en al menos una de las células de la población y se expresa en la superficie de las células. La población de células electroporadas se cultiva, y las células T contenidas en ella se expanden al menos 10 veces.

En una realización, las células se seleccionan del grupo que consiste en células mononucleares de sangre periférica, células de sangre de cordón umbilical, una población purificada de células T y una línea de células T.

En otra realización, el método descrito en el presente documento comprende además la electroporación de un ARNm que codifica un agente en la población expandida de células T, como la coelectroporación del ácido nucleico que codifica el agente con el ácido nucleico que codifica la proteína de membrana quimérica.

En otra realización, el método descrito en el presente documento comprende además estimular la población expandida de células T con al menos una molécula o citoquina seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BBL, IL21, IL 15, lL-7, PD1-CD28 y PD1.

En otra realización, el método descrito en el presente documento también comprende la criopreservación de las células T cultivadas.

Introducción de Ácidos Nucleicos

Métodos para introducir ácidos nucleicos en una célula incluyen métodos físicos, biológicos y químicos. Los métodos físicos para introducir un polinucleótido, como el ARN, en una célula huésped incluyen la precipitación de fosfato de calcio, la lipofección, el bombardeo de partículas, la microinyección, la electroporación y otros similares. El ARN puede introducirse en las células diana utilizando métodos comerciales que incluyen la electroporación (Amaxa Nucleofector-11 (Amaxa Biosystems, Colonia, Alemania)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) o el Gene Pulser 11 (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator (Eppendort, Hamburgo, Alemania). El ARN también puede introducirse en las células mediante la transfección mediada por liposomas catiónicos utilizando la lipofección, mediante la encapsulación de polímeros, mediante la transfección mediada por péptidos o mediante sistemas de suministro de partículas biolíticas como las "pistolas de genes" (véase, por ejemplo, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther.,12(8):861-70 (2001).

Métodos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula huésped incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores virales, y especialmente los vectores retrovirales, se han convertido en el método más utilizado para insertar genes en células de mamíferos, por ejemplo, humanas. Otros vectores virales pueden ser derivados de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple I, adenovirus y virus adeno-asociados, y similares. Véase, por ejemplo, U.S. Pat. Nos. 5,350,674 y 5,585,362.

Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen sistemas de dispersión coloidal, como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal ejemplar para su uso como vehículo de administración in vitro e in vivo es un liposoma (por ejemplo, una vesícula de membrana artificial).

Lípidos adecuados para su uso pueden obtenerse de fuentes comerciales. Por ejemplo, la fosfatidilcolina dimiristílica ("DMPC") puede obtenerse de Sigma, St. Louis, MO; el fosfato de dicotilo ("DCP") puede obtenerse de K & K Laboratories (Plainview, NY); el colesterol ("Choi") puede obtenerse de Calbiochem-Behring; el fosfatidilglicerol dimiristílico ("DMPG") y otros lípidos pueden obtenerse de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL). Las soluciones madre de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol pueden almacenarse a unos -20°C. El cloroformo se utiliza como único disolvente, ya que se evapora más fácilmente que el metanol. "Liposoma" es un término genérico que engloba una variedad de vehículos lipídicos mono y multilamelares formados por la generación de bicapas lipídicas cerradas o agregados. Los liposomas pueden caracterizarse por tener estructuras vesiculares con una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interior. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por un medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se autoorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Sin embargo, también se engloban las composiciones que tienen estructuras diferentes en solución a la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas lipídicas. También se contemplan los complejos lipofectamina-ácido nucleico. Independientemente del método utilizado para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula huésped o exponer de otro modo una célula al inhibidor de la presente invención, para confirmar la presencia de los ácidos nucleicos en la célula huésped, pueden realizarse diversos ensayos. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos "biológicos moleculares" bien conocidos por los expertos en la materia, como Southern y Northern blotting, RT-PCR y PCR; ensayos "bioquímicos", como la detección de la presencia o ausencia de un péptido particular, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISAs y Western blots) o por ensayos descritos en el presente documento para identificar agentes que entran en el ámbito de la invención.

ARN

En una realización, el ARN se introduce en las células objetivo. En otra realización, el ARN es ARNm que comprende ARN transcrito in vitro o ARN sintético. El ARN se produce por transcripción in vitro utilizando una plantilla generada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN de interés de cualquier fuente puede convertirse directamente por PCR en una plantilla para la síntesis in vitro de ARNm utilizando los cebadores apropiados y la ARN polimerasa. La fuente de ADN puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ADN de plásmido, ADN de fago, ADNc, una secuencia de ADN sintético o cualquier otra fuente de ADN apropiada.

La plantilla deseada para la transcripción in vitro es una proteína de membrana quimérica. A modo de ejemplo, la plantilla codifica un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo o una porción de un anticuerpo. A modo de otro ejemplo, la plantilla comprende un dominio extracelular que comprende un dominio variable de cadena única de un anticuerpo, como el anti-CD3, y un dominio intracelular de una molécula coestimuladora. En una realización, la plantilla para la proteína quimérica de membrana de ARN codifica una proteína quimérica de membrana que comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo a una molécula, y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-1BB.

La PCR puede utilizarse para generar una plantilla para la transcripción in vitro de ARNm que luego se introduce en las células. Los métodos para realizar la PCR son bien conocidos en la técnica. Los cebadores que se utilizan en la PCR están diseñados para tener regiones que son sustancialmente complementarias a las regiones del ADN que se utilizará como plantilla para la PCR.

El término "sustancialmente complementario", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a las secuencias de nucleótidos en las que la mayoría o todas las bases de la secuencia del cebador son complementarias, o una o más bases no son complementarias, o no coinciden. Las secuencias sustancialmente complementarias son capaces de recocer o hibridarse con la diana de ADN prevista en las condiciones de recocer utilizadas para la PCR. Los cebadores pueden diseñarse para que sean sustancialmente complementarios a cualquier porción de la plantilla de ADN. Por ejemplo, los cebadores pueden diseñarse para amplificar la porción de un gen que normalmente se transcribe en las células (el marco de lectura abierto), incluyendo los UTRs 5' y 3'. Los cebadores también pueden diseñarse para amplificar una porción de un gen que codifica un dominio particular de interés. En una realización, los cebadores están diseñados para amplificar la región codificante de un ADNc humano, incluyendo todas o parte de las UTRs 5' y 3'. Los cebadores útiles para la PCR se generan por métodos sintéticos bien conocidos en la técnica. Los "cebadores directos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a los nucleótidos de la plantilla de ADN que están aguas arriba de la secuencia de ADN que se va a amplificar. "Aguas arriba" se utiliza aquí para referirse a una ubicación 5, a la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación con la cadena codificante. Los "cebadores inversos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a una plantilla de ADN de doble cadena que se encuentra aguas abajo de la secuencia de ADN que se va a amplificar. "Corriente abajo" se utiliza aquí para referirse a una ubicación 3' de la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación con la cadena codificante.

También pueden utilizarse estructuras químicas que tengan la capacidad de promover la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN. El ARN tiene preferentemente estructuras 5' y 3' UTRs. En una realización, la UTR 5' tiene una longitud de entre cero y 3000 nucleótidos. La longitud de las secuencias 5' y 3' de la UTR que se añaden a la región codificante puede modificarse mediante diferentes métodos, incluyendo, pero sin limitarse a ello, el diseño de cebadores para la PCR que se acoplan a diferentes regiones de las UTR. Utilizando este enfoque, un experto en la materia puede modificar las longitudes de las UTRs 5' y 3' necesarias para lograr una eficiencia de traducción óptima tras la transfección del ARN transcrito.

Las UTRs 5' y 3' pueden ser las UTRs 5' y 3' endógenas y naturales del gen de interés. Alternativamente, las secuencias ^uT^r que no son endógenas al gen de interés pueden añadirse incorporando las secuencias UTR en los cebadores directos e inversos o mediante cualquier otra modificación de la plantilla. El uso de secuencias UTR que no son endógenas al gen de interés puede ser útil para modificar la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN. Por ejemplo, se sabe que los elementos ricos en AU en las secuencias 3' uTr pueden disminuir la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, las UTRs 3' pueden seleccionarse o diseñarse para aumentar la estabilidad del ARN transcrito basándose en propiedades de las UTRs bien conocidas en la técnica.

En una realización, la 5' UTR puede contener la secuencia Kozak del gen endógeno. Alternativamente, cuando se añade por PCR una UTR 5' que no es endógena al gen de interés, como se ha descrito anteriormente, se puede rediseñar una secuencia Kozak de consenso añadiendo la secuencia UTR 5'. Las secuencias Kozak pueden aumentar la eficiencia de la traducción de algunos transcritos de ARN, pero no parece que se requieran para todos los ARN para permitir una traducción eficiente. El requisito de las secuencias Kozak para muchos ARNm es conocido en la técnica. En otras realizaciones, la UTR 5' puede derivarse de un virus de ARN cuyo genoma de ARN es estable en las células. En otras realizaciones se pueden utilizar varios análogos de nucleótidos en la UTR 3' o 5' para impedir la degradación por exonucleasa del ARNm.

Para permitir la síntesis de ARN a partir de una plantilla de ADN sin necesidad de clonar el gen, se debe unir un promotor de la transcripción a la plantilla de ADN aguas arriba de la secuencia a transcribir. Cuando una secuencia que funciona como promotor de una ARN polimerasa se añade al extremo 5' del cebador directo, el promotor de la RNA polimerasa se incorpora al producto de la PCR aguas arriba del marco de lectura abierto que se va a transcribir. En una realización, el promotor es un promotor de la polimerasa T7, como se describe en este documento. Otros promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, los promotores de la ARN polimerasa T3 y SP6. Las secuencias de nucleótidos de consenso para los promotores T7, T3 y SP6 son conocidas en la técnica.

En una realización, el ARNm tiene un cap en el extremo 5' y una cola 3' de poli(A) que determinan la unión al ribosoma, el inicio de la traducción y la estabilidad del ARNm en la célula. En una plantilla de ADN circular, por ejemplo, el ADN plasmídico, la ARN polimerasa produce un producto concatérico largo que no es adecuado para la expresión en las células eucariotas. La transcripción del ADN plasmídico linealizado al final de la UTR 3' da lugar a un ARNm de tamaño normal que no es eficaz en la transfección eucariótica, incluso si se poliadenila después de la transcripción.

En una plantilla de ADN lineal, la ARN polimerasa del fago T7 puede extender el extremo 3' de la transcripción más allá de la última base de la plantilla (Schenborn y Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva y Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).

El método convencional de integración de tramos de poliA/T en una plantilla de ADN es clonación molecular. Sin embargo, la secuencia de poliA/T integrada en el ADN plasmídico puede causar inestabilidad en el plásmido, por lo que las plantillas de ADN plasmídico obtenidas de células bacterianas suelen estar muy contaminadas con deleciones y otras aberraciones. Esto hace que los procedimientos de clonación no sólo sean laboriosos y lleven mucho tiempo, sino que a menudo no sean fiables. Por ello, es muy deseable un método que permita la construcción de plantillas de ADN con el tramo 3' de poliA/T sin clonación.

El segmento poliA/T de la plantilla de ADN transcripcional puede producirse durante la PCR utilizando un cebador inverso que contenga una cola poliT, como la cola 100T (el tamaño puede ser de 50-5000 T), o después de la PCR mediante cualquier otro método, incluyendo, pero sin limitarse a ello, la ligadura de ADN o la recombinación in vitro. Las colas de poli(A) también proporcionan estabilidad a los ARN y reducen su degradación. Generalmente, la longitud de una cola de poli(A) se correlaciona positivamente con la estabilidad del ARN transcrito. En una realización, la cola de poli(A) tiene entre 100 y 5000 adenosinas.

Las colas de poli(A) de los ARN pueden ampliarse aún más tras la transcripción in vitro con el uso de una polimerasa de poli(A), como la polimerasa de E. coli (E-PAP). En una realización, el aumento de la longitud de una cola de poli(A) de 100 nucleótidos a entre 300 y 400 nucleótidos resulta en un aumento de aproximadamente dos veces en la eficiencia de traducción del ARN. Además, la unión de diferentes grupos químicos al extremo 3' puede aumentar la estabilidad del ARNm. Esta unión puede contener nucleótidos modificados/artificiales, aptámeros y otros compuestos. Por ejemplo, los análogos del ATP pueden incorporarse a la cola del poli(A) utilizando la poli(A) polimerasa. Los análogos del ATP pueden aumentar aún más la estabilidad del ARN.

Los cap 5' también proporcionan estabilidad a las moléculas de ARN. En una realización preferida, los ARN producidos por los métodos descritos en el presente documento incluyen una tapa 5'. El cap 5' se proporciona mediante técnicas conocidas en la técnica y descritas en el presente documento (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

Los ARN producidos por los métodos aquí divulgados también pueden contener una secuencia de sitio de entrada al ribosoma interno (internal ribosome entry site, IRES). La secuencia IRES puede ser cualquier secuencia viral, cromosómica o diseñada artificialmente que inicie la unión del ribosoma independiente de la tapa al ARNm y facilite el inicio de la traducción. Puede incluirse cualquier soluto apto para la electroporación celular, que puede contener factores que faciliten la permeabilidad y la viabilidad celular, como azúcares, péptidos, lípidos, proteínas, antioxidantes y tensioactivos.

En algunas realizaciones, el ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica se electropora en las células. En una realización, el ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica es un ARNm transcrito in vitro. Los métodos divulgados pueden aplicarse a la modulación de la actividad de las células T en la investigación básica y la terapia, en los campos del cáncer, las células madre, las infecciones agudas y crónicas, y las enfermedades autoinmunes, incluyendo la evaluación de la capacidad de la célula T genéticamente modificada para matar una célula cancerosa diana.

Los métodos también proporcionan la capacidad de controlar el nivel de expresión en un amplio rango cambiando, por ejemplo, el promotor o la cantidad de ARN de entrada, lo que permite regular individualmente el nivel de expresión. Además, la técnica de producción de ARNm basada en la PCR facilita enormemente el diseño de los ARNm de receptores quiméricos con diferentes estructuras y combinación de sus dominios. Por ejemplo, la variación de diferentes dominios intracelulares efectores/coestimuladores en múltiples receptores quiméricos en la misma célula permite determinar la estructura de las combinaciones de receptores que evalúan el mayor nivel de citotoxicidad contra las dianas multiantigénicas, y al mismo tiempo la menor citotoxicidad hacia las células normales. Una ventaja de los métodos de transfección de ARN de la invención es que la transfección de ARN es esencialmente transitoria y sin vectores. Un transgén de ARN puede entregarse a un linfocito y expresarse en él tras una breve activación celular in vitro, como un casete de expresión mínima sin necesidad de ninguna secuencia viral adicional. En estas condiciones, la integración del transgén en el genoma de la célula huésped es poco probable. La clonación de las células no es necesaria debido a la eficacia de la transfección del a Rn y a su capacidad para modificar uniformemente toda la población de linfocitos.

La modificación genética de las células T con ARN transcrito in vitro (ARN-IVT) hace uso de dos estrategias diferentes, ambas probadas sucesivamente en varios modelos animales. Las células se transfectan con ARN transcrito in vitro mediante lipofección o electroporación, es deseable estabilizar el ARN-IVT utilizando varios modificaciones para lograr una expresión prolongada del ARN-IVT transferido.

En la literatura se conocen algunos vectores de IVT que se utilizan de forma estandarizada como plantilla para la transcripción in vitro y que han sido modificados genéticamente de forma que se producen transcritos de ARN estabilizados. Actualmente, los protocolos utilizados en la técnica se basan en un vector plasmídico con la siguiente estructura: un promotor 5' de la ARN polimerasa que permite la transcripción del ARN, seguido de un gen de interés que está flanqueado 3' y/o 5' por regiones no traducidas (UTR), y un casete de poliadenilo 3' que contiene 50-70 nucleótidos A. Antes de la transcripción in vitro, el plásmido circular se linealiza aguas abajo del casete de poliadenilo mediante enzimas de restricción de tipo II (la secuencia de reconocimiento corresponde al sitio de corte). De este modo, el casete de poliadenilo se corresponde con la secuencia posterior de poli(A) en el transcrito. Como resultado de este procedimiento, algunos nucleótidos permanecen como parte del sitio de corte de la enzima después de la linealización y extienden o enmascaran la secuencia poli (A) en el extremo 3'. No está claro si esta protuberancia no fisiológica afecta a la cantidad de proteína producida intracelularmente a partir de dicha construcción.

El ARN tiene varias ventajas sobre los enfoques más tradicionales con plásmidos o virus. La expresión de genes a partir de una fuente de ARN no requiere transcripción y el producto proteico se produce rápidamente tras la transfección. Además, dado que el ARN sólo tiene que acceder al citoplasma, y no al núcleo, los métodos típicos de transfección dan como resultado una tasa de transfección extremadamente alta. Además, los enfoques basados en plásmidos requieren que el promotor que impulsa la expresión del gen de interés esté activo en las células en estudio.

En otro aspecto, la construcción de ARN puede introducirse en las células por electroporación. Véanse, por ejemplo, las formulaciones y la metodología de electroporación de construcciones de ácido nucleico en células de mamífero, tal como se enseña en los documentos US 2004/0014645, US 2005/0052630A1, US 2005/0070841A1, US 2004/0059285A1, US 2004/0092907A1.

Los diversos parámetros, incluida la intensidad del campo eléctrico, necesarios para la electroporación de cualquier tipo de célula conocida son generalmente conocidos en la literatura de investigación pertinente, así como en numerosas patentes y solicitudes en este campo. Véase, por ejemplo, U.S. Pat. No. 6,678,556, U.S. Pat. No.

7,171,264, y U.S. Pat. N° 7.173.116. Aparatos para la aplicación terapéutica de la electroporación están disponibles comercialmente, por ejemplo, el sistema de terapia de electroporación de ADN MedPulser™ (Inovio/Genetronics, San Diego, California), y se describen en patentes como la U.S. Pat. No. 6,567,694; U.S. Pat. No. 6,516,223, U.S. Pat. No. 5,993,434, U.S. Pat. No. 6.181.964, U.S. Pat. No. y 6,241,701, U.S. Pat. N° 6.233.482; la electroporación también puede utilizarse para la transfección de células in vitro, como se describe, por ejemplo, en el documento US20070128708A1. La electroporación también puede utilizarse para suministrar ácidos nucleicos a las células in vitro. En consecuencia, la administración mediada por electroporación en células de ácidos nucleicos que incluyen construcciones de expresión utilizando cualquiera de los muchos dispositivos disponibles y sistemas de electroporación conocidos por los expertos en la materia presenta un nuevo y emocionante medio para entregar un ARN de interés a una célula diana.

Fuentes de células T

Antes de la expansión, se obtiene una fuente de células T de un sujeto. Ejemplos no limitantes de sujetos incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. Preferiblemente, el sujeto es un humano. Las células T pueden obtenerse de diversas fuentes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, tejido de bazo, cordón umbilical y tumores. En ciertas realizaciones, puede utilizarse cualquier número de líneas de células T disponibles en la técnica. En ciertas realizaciones, las células T pueden obtenerse de una unidad de sangre recogida de un sujeto utilizando cualquier número de técnicas conocidas por el artesano experto, como la separación de Ficoll. En una realización, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen por aféresis o leucaféresis. El producto de aféresis suele contener linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. Las células recogidas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado, como la solución salina tamponada con fosfato (PBS) o la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos cationes divalentes, si no de todos, para los pasos de procesamiento posteriores. Tras el lavado, las células pueden resuspenderse en una variedad de tampones biocompatibles, como, por ejemplo, PBS sin Ca ni Mg. Alternativamente, los componentes indeseables de la muestra de aféresis pueden ser eliminados y las células resuspendidas directamente en medios de cultivo.

En otra realización, las células T se aíslan de la sangre periférica lisando los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente de PERCOLL™. Alternativamente, las células T pueden aislarse del cordón umbilical. En cualquier caso, una subpoblación específica de células T puede aislarse posteriormente mediante técnicas de selección positiva o negativa.

Las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical así aisladas pueden ser agotadas de las células que expresan ciertos antígenos, incluyendo, pero no limitado a, CD34, CD8, CD14, CD19 y CD56. El agotamiento de estas células puede realizarse utilizando un anticuerpo aislado, un muestra biológica que comprende un anticuerpo, como ascitis, un anticuerpo unido a un soporte físico y un anticuerpo unido a células.

El enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa puede llevarse a cabo utilizando una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas negativamente. Un método preferido es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer las células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales suele incluir anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8.

Para el aislamiento de una población deseada de células mediante selección positiva o negativa, la concentración de células y de superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas) puede variar. En ciertas realizaciones, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan las perlas y las células (es decir, aumentar la concentración de células), para asegurar el máximo contacto de las células y las perlas. Por ejemplo, en una realización, se utiliza una concentración de 2 mil millones de células/ml. En una realización, se utiliza una concentración de 1.000 millones de células/ml. En otra realización, se utilizan más de 100 millones de células/ml. En otra realización, se utiliza una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En otra realización, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En otras realizaciones, se pueden utilizar concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de concentraciones elevadas puede dar lugar a un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Las células T también pueden congelarse después de la etapa de lavado, lo que no requiere la etapa de eliminación de monocitos. Sin querer estar limitado por la teoría, el paso de congelación y posterior descongelación proporciona un producto más uniforme al eliminar los granulocitos y hasta cierto punto los monocitos de la población celular. Tras la etapa de lavado que elimina el plasma y las plaquetas, las células pueden suspenderse en una solución de congelación. Mientras que muchas soluciones y parámetros de congelación son conocidos en el arte y serán útiles en este contexto, en un ejemplo no limitante, un método implica el uso de PBS que contiene 20% de d Ms O y 8% de albúmina de suero humano, u otros medios adecuados para la congelación de células. A continuación las células son congeladas hasta -80°C a una velocidad de 1° por minuto y almacenada en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Pueden utilizarse otros métodos de congelación controlada, así como la congelación no controlada inmediatamente a -20°C o en nitrógeno líquido.

En una realización, la población de células puede incluir células mononucleares de sangre periférica, células de sangre de cordón umbilical, una población purificada de células T y una línea de células T, en otra realización, la población de células a electroporar comprende células mononucleares de sangre periférica. En otra realización, la población de células a electroporar comprende células T purificadas.

Proteína de membrana quimérica

La proteína de membrana quimérica de la invención comprende un dominio extracelular e intracelular. El dominio extracelular comprende un elemento de unión específico de la diana, como un anticuerpo. En una realización, el dominio extracelular de la proteína de membrana quimérica se dirige a una molécula de una célula T que incluye, pero no se limita a TCR, CD3, CD28 y similares.

Dominio extracelular

La presente invención incluye un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo dirigido contra una molécula de células T. La molécula puede incluir cualquier molécula que coestimule las células T, tales como, pero no limitadas a, TCR, CD3, CD28, o una combinación de las mismas. En una realización, el dominio extracelular puede incluir un dominio de unión a antígeno que comprende el dominio de unión a CD3 de un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-TCR, un anticuerpo anti-CD28, o una combinación de los mismos.

En otra realización, el dominio extracelular puede incluir cualquier fragmento de un anticuerpo que se une al antígeno, incluyendo, pero sin limitarse a, el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo sintético, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de dominio único, fragmentos variables de cadena única y fragmentos de los mismos. En algunos casos, es beneficioso que el dominio extracelular se derive de la misma especie en la que se utilizará finalmente la proteína de membrana quimérica. Por ejemplo, para su uso en humanos, puede ser beneficioso que el dominio extracelular de la proteína de membrana quimérica comprenda un anticuerpo humano o un fragmento del mismo. Así, en una realización, el dominio extracelular comprende un anticuerpo humano o un fragmento del mismo.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo sintético, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de dominio único, un fragmento variable de cadena única y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Dominio intracelular

El dominio intracelular o citoplasmático comprende una región de señalización costimuladora. La región de señalización costimuladora se refiere a un dominio intracelular de una molécula costimuladora. Las moléculas costimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígenos o sus ligandos que son necesarias para una respuesta eficaz de los linfocitos al antígeno.

El dominio citoplasmático o el dominio de señalización intracelular de la proteína quimérica de membrana es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras de la célula T. El término "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede ser la actividad citolítica o la actividad de ayuda, incluida la secreción de citoquinas. Por lo tanto, el término "dominio de señalización intracelular" se refiere a la parte de una proteína que transduce la señal de la función efectora y dirige a la célula para que realice una función especializada. Aunque normalmente se puede emplear todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario utilizar toda la cadena. En la medida en que se utilice una porción truncada del dominio de señalización intracelular, dicha porción truncada puede utilizarse en lugar de la cadena intacta siempre que transduzca la señal de la función efectora. El término dominio de señalización intracelular incluye, por tanto, cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de la función efectora.

Ejemplos no limitantes de dominios de señalización intracelular para su uso en la proteína de membrana quimérica incluyen cualquier fragmento del dominio intracelular de CD28, 4-1BB, receptor de células T (TCR), moléculas coestimuladoras, cualquier derivado o variante de estas secuencias, cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional y cualquier combinación de las mismas.

Otros dominios de la proteína de membrana quimérica

Entre el dominio extracelular y el dominio transmembrana de la proteína de membrana quimérica, o entre el dominio citoplasmático y el dominio transmembrana de la proteína de membrana quimérica, puede incorporarse un dominio espaciador. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "dominio espaciador" generalmente significa cualquier oligopéptido o polipéptido que funciona para unir el dominio transmembrana al dominio extracelular o al dominio citoplasmático en la cadena polipeptídica. Un dominio espaciador puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 100 aminoácidos y más preferiblemente de 25 a 50 aminoácidos.

En algunas realizaciones, la proteína de membrana quimérica comprende además un dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la proteína de membrana quimérica comprende además un dominio de bisagra. En una realización, el ARNm que codifica la proteína de membrana quimérica comprende además un dominio transmembrana y un dominio bisagra, como un dominio transmembrana CD28 y un dominio bisagra CD8-alfa.

Anticuerpos humanos

Para el uso in vivo de anticuerpos en humanos, puede ser preferible utilizar anticuerpos humanos. Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Los anticuerpos humanos pueden fabricarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo los métodos de presentación de fagos que utilizan bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas, incluyendo mejoras de estas técnicas. Véase también Pat. Nos. 4,444,887 y 4,716,111; y las publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741. Un anticuerpo humano también puede ser un anticuerpo en el que las cadenas pesada y ligera están codificadas por una secuencia de nucleótidos derivada de una o más fuentes de ADN humano.

También pueden producirse anticuerpos humanos utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulinas humanas. Por ejemplo, los complejos genéticos de inmunoglobulina humana de cadena pesada y ligera pueden introducirse al azar o por recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable, la región constante y la región de diversidad humanas pueden introducirse en las células madre embrionarias de ratón además de los genes de las cadenas pesadas y ligeras humanas. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón pueden dejar de ser funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de los loci de inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de unión de la cadena pesada de anticuerpos (JH) en ratones quiméricos y mutantes de la línea germinal da lugar a una inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y se microinyectan en blastocitos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos se crían para producir una descendencia homocigótica que exprese anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de forma normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, la totalidad o una parte de un polipéptido de la invención. Los anticuerpos dirigidos contra la diana elegida pueden obtenerse a partir de los ratones transgénicos inmunizados utilizando la tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reorganizan durante la diferenciación de las células B, y posteriormente sufren un cambio de clase y una mutación somática. Por lo tanto, utilizando esta técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles, incluyendo, entre otros, IgG1 (gamma 1) y IgG3. Para una visión general de esta tecnología de producción de anticuerpos humanos, véase, Lonberg y Huszar (Int. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos, véase, por ejemplo, la Publicación PCT Nos. WO 98/24893, WO 96/34096, y WO 96/33735; y U.S. Pat. Nos. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; y 5,939,598. Además, empresas como Abgenix, Inc. (Freemont, California) y Genpharm (San José, California) pueden ser contratadas para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando una tecnología similar a la descrita anteriormente. Para un análisis específico de la transferencia de un conjunto de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en ratones mutantes de la línea germinal que dará lugar a la producción de anticuerpos humanos tras la provocación del antígeno, véase, por ejemplo, Jakobovits et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al. Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); y Duchosal et al., Nature, 355:258 (1992).

Los anticuerpos humanos también pueden derivarse de bibliotecas de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech., 14:309 (1996)). La tecnología de presentación de fagos (McCafferty et al. Nature, 348:552-553 (1990)) puede utilizarse para producir in vitro anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. Según esta técnica, los genes del dominio V de los anticuerpos se clonan dentro del marco de un gen de la proteína de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, como M13 o fd, y se muestran como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula del fago. Dado que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan lugar a la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La presentación de fagos puede realizarse en una variedad de formatos; para su revisión véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S, y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Se pueden utilizar varias fuentes de segmentos de genes V para la presentación de fagos. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron una serie diversa de anticuerpos contra la oxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones no inmunizados.

Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos contra una serie diversa de antígenos (incluidos los autoantígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993). Véase también U.S. Pat. Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Los anticuerpos humanos también pueden ser generados por células B activadas in vitro (véase, Pat. de EE.UU. Nos. 5,567,610 y 5,229,275). Los anticuerpos humanos también pueden generarse in vitro utilizando técnicas de hibridoma como, por ejemplo, la descrita por Roder et al. (Methods Enzymol., 121:140-167 (1986)).

Anticuerpos humanizados

Alternativamente, en algunas realizaciones, un anticuerpo no humano se humaniza, donde secuencias o regiones específicas del anticuerpo se modifican para aumentar la similitud con un anticuerpo producido naturalmente en un humano. En una realización, el dominio de unión al antígeno está humanizado.

Un anticuerpo "humanizado" conserva una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original. Sin embargo, utilizando ciertos métodos de humanización, la afinidad y/o la especificidad de unión del anticuerpo al antígeno CD3 humano puede aumentarse utilizando métodos de "evolución dirigida", como describen Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151 (1999).

Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él desde una fuente no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos suelen denominarse residuos de "importación", que suelen tomarse de un dominio variable de "importación". Así, los anticuerpos humanizados comprenden uno o más CDRs de moléculas de inmunoglobulina no humanas y regiones marco humanas. La humanización de los anticuerpos es bien conocida en la técnica y puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al.. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias CDR o CDR de roedores por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano, es decir, el injerto CDR (EP 239.400; Publicación PCT n° WO 91/09967; y U.S. Pat. Nos.

4,816,567; 6,331,415; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 6,548,640). En tales anticuerpos quiméricos humanizados, se ha sustituido una cantidad sustancialmente menor de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La humanización de los anticuerpos también puede lograrse mediante el recubrimiento [veneering en inglés] o la resuperficialización [resurfacing en inglés] (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); y Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) o el barajado de cadenas (U.S. Pat. No. 5,565,332).

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se utilizarán en la fabricación de los anticuerpos humanizados es para reducir la antigenicidad. Según el método denominado "best-fit", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se compara con toda la biblioteca de secuencias de dominios variables humanos conocidos. La secuencia humana que más se acerca a la del roedor se acepta entonces como marco humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987). Otro método utiliza un marco particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993).

Los anticuerpos pueden ser humanizados con retención de alta afinidad por el antígeno diana y otras propiedades biológicas favorables. Según un aspecto de la invención, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos conceptuales humanizados utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la materia. Existen programas informáticos que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite analizar el papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse al antígeno diana. De este modo, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias receptoras e importadoras de modo que se consiga la característica deseada del anticuerpo, como una mayor afinidad por el antígeno diana. En general, los residuos CDR son los que más y mejor influyen en la unión al antígeno.

Expansión de células T

En una realización, la invención y la presente divulgación incluye una célula T que comprende un ARNm electroporado que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-1BB. La invención y la presente divulgación también incluye una población de células T electroporadas o expandidas que comprenden un ARNm electroporado que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo a una molécula, y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-1BB. En otra realización, el ARNm se introduce en al menos una de las poblaciones de células y se expresa en la superficie de las mismas.

En una realización, la fuente de las células T que se van a electroporar y expandir es células mononucleares de sangre periférica.

Generalmente, las células T se expanden por contacto con una superficie que tiene adherido un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de las células T. La presente invención comprende un método de expansión de una población de células T electroporadas que comprende cultivar la población electroporada, en la que las células T electroporadas contenidas en la población se expanden al menos 10 veces. En una realización, al menos una célula de la población de células expresa CD3. Sin estar sujeto a ninguna teoría particular, las células que expresan CD3 pueden entrar en contacto y unirse con la proteína de membrana quimérica que se expresa en la superficie de las células electroporadas. Al menos una célula que exprese la proteína quimérica de membrana puede interactuar con otra célula que exprese CD3. Esto podría estimular la expansión de las células T electroporadas.

Como se ha demostrado por los datos divulgados en el presente documento, la expansión de las células T electroporadas por los métodos divulgados en el presente documento puede multiplicarse por unas 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces, 2000 veces, 3000 veces, 4000 veces, 5000 veces, 6000 veces, 7000 veces, 8000 veces, 9000 veces, 10.000 veces, 100.000 veces, 1.000.000 de veces, 10.000.000 de veces, o más, y todos y cada uno de los intervalos totales o parciales entre ellos, en una realización, las células T se expanden en un rango de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces. Tras el cultivo, las células T pueden incubarse en medio celular en un aparato de cultivo durante un periodo de tiempo o hasta que las células alcancen la confluencia o una alta densidad celular para un paso óptimo antes de pasar las células a otro aparato de cultivo. El aparato de cultivo puede ser cualquier aparato de cultivo utilizado habitualmente para el cultivo de células in vitro. Un período de tiempo puede ser cualquier tiempo adecuado para el cultivo de células in vitro. El medio de las células T puede ser reemplazado durante el cultivo de las células T en cualquier momento. Preferiblemente, el medio de las células T se sustituye aproximadamente cada 2 o 3 días. A continuación, las células T se recogen del aparato de cultivo, tras lo cual las células T pueden utilizarse inmediatamente o criopreservarse para su uso en un momento posterior. En una realización, el método comprende además la criopreservación de las células T cultivadas.

Las células pueden expandirse aún más utilizando un método descrito en la Pat. No. 5,199,942. La expansión, tal como se describe en la U.S. Pat. No. 5,199,942 puede ser adicional a otros métodos de expansión descritos en el presente documento. Brevemente, el cultivo y la expansión ex vivo de células T comprende la adición a los factores de crecimiento celular, como los descritos en U.S. Pat. No. 5,199,942, u otros factores, como flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 y ligando c-kit, por ejemplo como los descritos en Dudley et al., J. Immunol., 26(4):332-342, 2003, para un Protocolo de Expansión Rápida (REP).

En un aspecto, el método de expansión de las células T puede comprender además el aislamiento de las células T y una posterior electroporación seguida de cultivo.

La etapa de cultivo descrita en el presente documento (contacto con los agentes descritos en el presente documento) puede ser muy corta, por ejemplo, menos de 24 horas, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 horas. El paso de cultivo como se describe más adelante (contacto con los agentes como se describe en el presente documento) puede ser más largo, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o más días.

Se utilizan varios términos para describir las células en cultivo. El cultivo celular se refiere generalmente a las células tomadas de un organismo vivo y cultivadas en condiciones controladas. Un cultivo celular primario es un cultivo de células, tejidos u órganos tomados directamente de un organismo y antes del primer subcultivo. Las células se expanden en cultivo cuando se colocan en un medio de crecimiento en condiciones que facilitan el crecimiento y/o la división celular, lo que da lugar a una mayor población de células. Cuando las células se expanden en cultivo, la tasa de proliferación celular suele medirse por el tiempo necesario para que las células se dupliquen en número, también conocido como tiempo de duplicación.

Cada ronda de subcultivo se denomina pasaje. Cuando las células se subcultivan, se dice que han sido pasadas. Una población específica de células, o una línea celular, a veces se denomina o se caracteriza por el número de veces que ha sido pasada. Por ejemplo, una población celular cultivada que ha sido pasada diez veces puede denominarse cultivo P10. El cultivo primario, es decir, el primer cultivo tras el aislamiento de las células del tejido, se denomina P0. Tras el primer subcultivo, las células se describen como un cultivo secundario (P1 o pasaje 1). Después del segundo subcultivo, las células se convierten en un cultivo terciario (P2 o pasaje 2), y así sucesivamente. Los expertos en la materia entenderán que puede haber muchas duplicaciones de la población durante el periodo de pasaje; por lo tanto, el número de duplicaciones de la población de un cultivo es mayor que el número de pasaje. La expansión de las células (es decir, el número de doblajes de la población) durante el periodo entre pases depende de muchos factores, incluyendo, pero no limitándose, a la densidad de siembra, el sustrato, el medio y el tiempo entre pases.

En una realización, las células pueden cultivarse durante varias horas (unas 3 horas) hasta unos 14 días o cualquier valor entero intermedio. Las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, Medio Esencial Mínimo o Medio RPMI 1640 o, X-vivo 15, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluyendo suero (por ejemplo, suero fetal bovino o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-^y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFp, y TNF-a. o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocido por el artesano experto. Otros aditivos para el crecimiento de las células incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos, plasmanato y agentes reductores como N-acetil-cisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, AIM- V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato sódico y vitaminas, ya sea sin suero o complementados con una cantidad adecuada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citoquina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de las células T. Los antibióticos, por ejemplo, la penicilina y la estreptomicina, se incluyen sólo en los cultivos experimentales, no en los cultivos de células que se van a infundir en un sujeto. Las células objetivo se mantienen en las condiciones necesarias para apoyar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura adecuada (por ejemplo, 37° C) y una atmósfera (por ejemplo, aire más 5% de CO2).

El medio utilizado para cultivar las células T puede incluir un agente que pueda coestimular las células T. Por ejemplo, un agente que puede estimular CD3 es un anticuerpo contra CD3, y un agente que puede estimular CD28 es un anticuerpo contra CD28. Esto se debe a que, como demuestran los datos divulgados en el presente documento, una célula aislada por los métodos divulgados en el presente documento puede expandirse aproximadamente 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces, 2000 veces, 3000 veces, 4000 veces, 5000 veces, 6000 veces, 7000 veces, 8000 veces, 9000 veces, 10.000 veces, 100.000 veces, 1.000.000 veces, 10.000.000 veces, o más. En una realización, las células T se expanden en un rango de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces, o más al cultivar la población electroporada. En otra realización, el método de expansión de las células T puede comprender además el aislamiento de las células T expandidas para otras aplicaciones. En otra realización, el método de expansión puede comprender además una electroporación posterior de las células T expandidas seguida de cultivo. La electroporación posterior puede incluir la electroporación de un mRNA que codifica un agente en la población expandida de células T, en la que el agente estimula aún más la célula T. El agente puede estimular la célula T, por ejemplo, estimulando una mayor expansión, una función efectora u otra función de la célula T. En una realización, el ARNm del agente se coelectropora con el ARNm de la proteína de membrana quimérica. En otra realización, el ARNm del agente se electropora después de cultivar la población electroporada.

En otra realización, el método comprende además estimular la población expandida de células T con al menos una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BBL y PD1.

Terapia

Las células T descritas en el presente documento pueden incluirse en una composición para terapia. La composición puede incluir una composición farmacéutica y además incluir un portador farmacéuticamente aceptable. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica que comprende las células T. En un aspecto, la invención incluye un método para estimular una respuesta inmunitaria mediada por una célula T a una célula o tejido diana en un sujeto que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula T que comprende con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-1BB, en el que al menos una de las células de la población expresa la proteína de membrana quimérica. Las células T pueden administrarse para inducir la lisis de la célula o tejido diana, como cuando la lisis inducida es citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (antibody-dependent cellmediated cytoxicity, ADCC).

En una realización, la invención y la presente divulgación incluyen un método para la terapia de transferencia celular adoptiva. El método comprende administrar una población expandida de células que comprende células T a un sujeto que lo necesita para prevenir o tratar una condición adversa para el sujeto. En esta realización, la población expandida de células se expande según un método que comprende electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-1BB, en el que al menos una de las células de la población expresa la proteína de membrana quimérica; y cultivar la población celular, en la que las células T contenidas en la misma se expanden al menos 10 veces.

En otra realización, se proporciona un método para tratar una enfermedad o afección asociada con una inmunidad mejorada en un sujeto que comprende administrar una población expandida de células que comprende células T a un sujeto que lo necesita. La población expandida de células se ha expandido según un método que comprende electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio intracelular que comprende un fragmento de un dominio intracelular de CD28 y 4-1BB, en el que al menos una de las células de la población expresa la proteína de membrana quimérica; y cultivar la población de células, en la que las células T contenidas en la misma se expanden al menos 10 veces.

Las células T expandidas generadas como se describe en el presente documento son uniformes y poseen función de células T. Además, las células T expandidas pueden administrarse a un mamífero, preferiblemente un humano, para suprimir una reacción inmunitaria, como las comunes a las enfermedades autoinmunes como la diabetes, la psoriasis, la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, la EICH [GVHD por la singlas en inglés], la mejora de la inducción de la tolerancia a los aloinjertos, el rechazo de los trasplantes, y similares. Además, las células de la presente invención pueden utilizarse para el tratamiento de cualquier enfermedad en la que sea deseable una respuesta inmunitaria disminuida o inhibida de otro modo, especialmente una respuesta inmunitaria mediada por células, para tratar o aliviar la enfermedad.

Las células T expandidas generadas como se describe en el presente documento también pueden utilizarse para tratar enfermedades autoinmunes. Los ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a. Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA, que es una enfermedad viral con un componente autoinmune), alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Addison autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad autoinmune del oído interno (AIED), síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), púrpura trombocitopénica autoinmune (ATP), enfermedad de Behcet, cardiomiopatía, esprúes-dermatitis herpetiforme celíaca; Síndrome de disfunción inmunitaria por fatiga crónica (chronic fatigue immune dysfunction syndrome, CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PIDC), penfigoide cicatricial, enfermedad de la aglutinina fría, síndrome de la cresta, enfermedad de Crohn, enfermedad de Degos, dermatomiositis-juvenil, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis. Enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), nefropatía IgA, diabetes mellitus insulinodependiente, artritis crónica juvenil (enfermedad de Still), artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, miastenia gravis, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia (esclerosis sistémica progresiva (ESP), también conocida como esclerosis sistémica (SS)), síndrome de Sjogren, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.

Las células T expandidas generadas como se describe en el presente documento también pueden utilizarse para tratar trastornos inflamatorios. Los ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, pero no se limitan a, trastornos inflamatorios crónicos y agudos. Los ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen la enfermedad de Alzheimer, el asma, la alergia atópica, la alergia, la aterosclerosis, el asma bronquial, el eczema, la glomerulonefritis, la enfermedad de injerto contra huésped, las anemias hemolíticas, la osteoartritis, la sepsis, la apoplejía, el trasplante de tejidos y órganos, la vasculitis, la retinopatía diabética y la lesión pulmonar inducida por ventilador.

En otra realización, las células T descritas en el presente documento pueden utilizarse para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesite.

Las células de la presente invención pueden administrarse a un animal, preferiblemente un mamífero, incluso más preferiblemente un humano, para tratar un cáncer. Además, las células de la presente invención pueden utilizarse para el tratamiento de cualquier condición relacionada con un cáncer, especialmente una respuesta inmune mediada por células contra una(s) célula(s) tumoral(es), donde es deseable tratar o aliviar la enfermedad. Los ejemplos de cánceres incluyen, entre otros, el cáncer de mama, el cáncer de próstata, el cáncer de ovarios, el cáncer de cuello de útero, el cáncer de piel, el cáncer de páncreas, el cáncer colorrectal, el cáncer de riñón, el cáncer de hígado, el cáncer de cerebro, el linfoma, la leucemia, el cáncer de pulmón, el cáncer de tiroides y otros similares.

Las células de la invención pueden administrarse en dosis y rutas y en tiempos que se determinen en experimentos y ensayos preclínicos y clínicos apropiados. Las composiciones celulares pueden administrarse múltiples veces a dosis dentro de estos rangos. La administración de las células de la invención puede combinarse con otros métodos útiles para tratar la enfermedad o afección deseada, según determinen los expertos en la materia.

Las células de la invención que se van a administrar pueden ser autólogas, alógenas o xenógenas con respecto al sujeto sometido a la terapia.

La administración de las células de la invención puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente conocida por los expertos en la materia. Las células de la presente invención pueden administrarse a un sujeto por inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones aquí descritas pueden administrarse a un paciente por vía transarterial, subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa (i.v.) o intraperitoneal. En otros casos, las células de la invención se inyectan directamente en un sitio de inflamación en el sujeto, un sitio de enfermedad local en el sujeto, un ganglio linfático, un órgano, un tumor, y similares.

Las células descritas en el presente documento también pueden administrarse utilizando cualquier número de matrices. La presente invención utiliza dichas matrices en el novedoso contexto de actuar como un órgano linfoide artificial para apoyar, mantener o modular el sistema inmunitario, típicamente a través de la modulación de las células T. En consecuencia, la presente invención puede utilizar aquellas composiciones y formulaciones de matriz que han demostrado utilidad en la ingeniería de tejidos. En consecuencia, el tipo de matriz que puede utilizarse en las composiciones, dispositivos y métodos de la invención es prácticamente ilimitado y puede incluir tanto matrices biológicas como sintéticas. En un ejemplo particular, se utilizan las composiciones y dispositivos establecidos por U.S. Pat. Nos. 5,980,889; 5,913,998; 5,902,745; 5,843,069; 5,787,900; o 5,626,561. Las matrices comprenden características comúnmente asociadas con ser biocompatibles cuando se administran a un huésped mamífero. Las matrices pueden estar formadas por materiales naturales y/o sintéticos. Las matrices pueden ser no biodegradables en los casos en que se desee dejar estructuras permanentes o removibles en el cuerpo de un animal, como un implante; o biodegradables. Las matrices pueden adoptar la forma de esponjas, implantes, tubos, apósitos Telfa, fibras, fibras huecas, componentes liofilizados, geles, polvos, composiciones porosas o nanopartículas; además, las matrices pueden diseñarse para permitir la liberación sostenida de las células sembradas o de la citocina producida u otro agente activo. En ciertas realizaciones, la matriz de la presente invención es flexible y elástica, y puede describirse como un andamio semisólido que es permeable a sustancias como sales inorgánicas, fluidos acuosos y agentes gaseosos disueltos, incluido el oxígeno.

En el presente documento se utiliza una matriz como ejemplo de sustancia biocompatible. Sin embargo, la presente invención no se limita a las matrices y, por lo tanto, dondequiera que aparezca el término matriz o matrices, estos términos deben interpretarse de manera que incluyan dispositivos y otras sustancias que permitan la retención celular o el atravesamiento celular, que sean biocompatibles y que sean capaces de permitir el atravesamiento de macromoléculas, ya sea directamente a través de la sustancia, de manera que la sustancia en sí misma sea una membrana semipermeable, o que se utilice junto con una sustancia semipermeable particular.

Composiciones farmacéuticas

Composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender una población expandida de células T como se describe en el presente documento, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender tampones como la solución salina neutra tamponada, la solución salina tamponada con fosfato y similares; carbohidratos como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos como glicina; antioxidantes; agentes quelantes como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente invención se formulan preferentemente para la administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de forma adecuada a la enfermedad que se desea tratar (o prevenir). La cantidad y la frecuencia de administración se determinarán en función de factores tales como el estado del paciente, y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque las dosis adecuadas pueden determinarse mediante ensayos clínicos.

En general, puede afirmarse que una composición farmacéutica que comprende las células T expandidas descritas en el presente documento puede administrarse a una dosis de 104 a 109 células/kg de peso corporal, preferiblemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros dentro de esos rangos. Las composiciones de células T también pueden administrarse varias veces a estas dosis. Las células pueden administrarse mediante el uso de técnicas de infusión comúnmente conocidas en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New Eng. J . of Med. 319:1676, 1988). La dosis y el régimen de tratamiento óptimos para un paciente concreto pueden determinarse fácilmente por un experto en el arte de la medicina mediante la supervisión del paciente para detectar signos de la enfermedad y ajustar el tratamiento en consecuencia.

En ciertas realizaciones, se puede desear administrar células T activadas a un sujeto y posteriormente volver a extraer sangre (o realizar una aféresis), activar las células T de la misma según la presente invención y reinfundir al paciente con estas células T activadas y expandidas. Este proceso puede llevarse a cabo varias veces cada pocas semanas. En ciertas realizaciones, las células T pueden activarse a partir de extracciones de sangre de entre 10 ml y 400 ml. En ciertas realizaciones, las células T se activan a partir de extracciones de sangre de 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml o 100 ml. Sin estar limitado por la teoría, el uso de este protocolo de múltiples extracciones de sangre/reinfusiones múltiples, puede seleccionar ciertas poblaciones de células T.

En ciertas realizaciones de la presente invención, las células activadas y expandidas mediante los métodos descritos en el presente documento, u otros métodos conocidos en la técnica en los que las células T se expanden a niveles terapéuticos, se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo pero sin limitarse al tratamiento con agentes como la terapia antiviral, el cidofovir y la interleucina-2, Citarabina (también conocida como ARA-C) o tratamiento con natalizumab para pacientes con EM o tratamiento con efalizumab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con LMP. En otras realizaciones, las células T de la invención pueden utilizarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos como CAM PATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citoquinas e irradiación. Estos fármacos o inhiben la fosfatasa dependiente del calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). En otra realización, las composiciones celulares de la presente invención se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) un trasplante de médula ósea, una terapia ablativa de células T utilizando agentes quimioterapéuticos como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida, o anticuerpos como OKT3 o CAMPATH. En otra realización, las composiciones celulares de la presente invención se administran tras una terapia ablativa de células B, como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los sujetos pueden someterse a un tratamiento estándar con altas dosis de quimioterapia seguido de un trasplante de células madre de sangre periférica. En ciertas realizaciones, tras el trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente invención. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

La dosificación de los tratamientos anteriores que se administrará a un paciente variará en función de la naturaleza precisa de la enfermedad que se trate y del receptor del tratamiento. El escalado de las dosis para la administración en humanos puede realizarse de acuerdo con las prácticas aceptadas en el ámbito técnico. La dosis de CAMPATH, por ejemplo, estará generalmente en el rango de 1 a unos 100 mg para un paciente adulto, generalmente administrado diariamente durante un período de entre 1 y 30 días. La dosis diaria preferida es de 1 a 10 mg al día, aunque en algunos casos pueden utilizarse dosis mayores, de hasta 40 mg al día (descritas en la patente US No.

6,120,766).

Debe entenderse que el método y las composiciones que serían útiles en la presente invención no se limitan a las formulaciones particulares expuestas en los ejemplos. Los siguientes ejemplos se exponen con el fin de proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completa de cómo hacer y utilizar las células, los métodos de expansión y cultivo y los métodos terapéuticos de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención.

La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas las técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están claramente al alcance del experto en la materia. Dichas técnicas se explican ampliamente en la literatura, como por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", cuarta edición (Sambrook, 2012); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Culture of Animal Cells" (Freshney, 2010); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1997); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Short Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 2002); "Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting", (Babar, 2011); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 2002). Estas técnicas son aplicables a la producción de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención, y, como tales, pueden ser consideradas al hacer y practicar la invención. Las técnicas particularmente útiles para determinadas realizaciones se discutirán en las secciones siguientes.

EJEMPLOS EXPERIMENTALES

La invención se describe con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos, a menos que se especifique lo contrario. Por lo tanto, la invención no debe interpretarse como limitada a los siguientes ejemplos, sino que debe interpretarse para abarcar todas las variaciones que se hagan evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en el presente documento.

Sin más descripción, se cree que una persona con conocimientos ordinarios en la materia puede, utilizando la descripción precedente y los siguientes ejemplos ilustrativos, hacer y utilizar los compuestos de la presente invención y practicar los métodos reivindicados. Por lo tanto, los siguientes ejemplos de trabajo señalan específicamente las realizaciones preferidas de la presente invención, y no deben interpretarse como limitantes de ninguna manera del resto de la divulgación.

A continuación se describen los materiales y métodos utilizados en la realización de los experimentos aquí divulgados.

Construcción de vectores de ARNm de transcripción in vitro (IVT). Todos los genes fueron sintetizados y/o amplificados y ensamblados por PCR utilizando información de secuencias disponible públicamente. Los productos de la PCR se subclonaron en un vector basado en pGEM.64A sustituyendo la GFP de pGEM-GFP.64A para producir un vector IVT basado en pGEM.64A con información de secuenciación disponible públicamente.

Transcripción in vitro de ARN (IVT). Un kit de transcripción in vitro, como mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra (Ambion, Inc), se utilizó para generar ARN IVT. Los productos de ARN IVT se purificaron utilizando un protocolo de purificación de ARN, como el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA). El ARN purificado se eluyó en agua libre de RNasa hasta aproximadamente 1-2 mg/mI.

Electroporación de ARN de células T. PBMC o células T expandidas fueron sometidas a electroporación se lavaron tres veces con OPTI-MEM (Invitrogen) y se resuspendieron en OPTI-MEM a una concentración final de 1-3x108/ml. Posteriormente, se mezclaron 0,1 ml de las células con 10 ug de IVT RNA (o como se indique) y se electroporaron en una cubeta de 2 mm utilizando un electroporador, como el BTX EM830 (Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, USA).

Estimulación y expansión de células T. Las PBMC se electroporaron con ARN que codifica scFv-28BB anti-CD3 y se cultivaron en medio R10 suplementado con 300 u/ml de IL-2. Se añadió medio fresco con IL-2 al cultivo cada dos días a partir del día 3 después de la electroporación. El fenotipo y la función de las células T se analizaron el día 9 después de la estimulación. Se utilizaron como controles células T estimuladas con microesferas CD3/CD28 o células T expandidas mediante la adición del anticuerpo OKT3 a PBMC.

Detección de CAR en células T electroporadas. Las células se lavaron y se suspendieron en tampón FACs (PBS más 0,1% de azida sódica y 0,4% de BSA). Se añadieron a las células anticuerpos policlonales F(ab)2 de cabra marcados con biotina (para scFv murinos) o anti-F(ab)2 humanos (para scFv humanos) (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y se incubaron a 4°C durante 25 minutos y luego se lavaron dos veces. A continuación se tiñeron las células con estreptavidina marcada con ficoeritrina (BD Pharmingen, San Diego, CA).

Ensayos ELISA y Luminex. Células diana, diferentes líneas celulares tumorales que expresan CD19, fueron lavadas y suspendidas a 106 células/mL en medio R10. Se añadieron cien mil células de cada tipo de célula diana en pocillos duplicados de una placa de fondo redondo de 96 pocillos (Corning). Cultivos de células T efectoras, poblaciones de células T electroporadas con ARN CD19 CAR, se lavaron y suspendieron a 106 células/mL en R10. Se combinaron cien mil células T efectoras con células diana en los pozos indicados de la placa de 96 pocillos. Además, se prepararon pozos que contenían células T solas. Las placas se incubaron a 37°C durante 18 a 20 horas. Tras la incubación, se recogió el sobrenadante y se sometió a un ensayo ELISA utilizando métodos estándar (Pierce, Rockford, IL).

Tinción de CD107a. Las células se sembraron en un E:T de 1:1 (105 efectores:105 diana) en 160 pl de medio RPMI completo en una placa de 96 pocillos. Se añadieron 20 pl de anticuerpo anti-CD107a marcado con ficoeritrina (BD Pharmingen, San Diego, CA) y las células se incubaron a 37°C durante 1 hora antes de añadir Golgi Stop y de incubar durante otras 2,5 horas. Después de 2,5 horas se añadieron 10 pl de FITC-anti-CD8 y APC-anti-CD3 y las células se incubaron a 37°C durante 30 min. Tras la incubación, las muestras se lavaron una vez con tampón FACS. La adquisición por citometría de flujo se realizó con un BD FacsCalibur (BD Biosciences), y el análisis se realizó con FlowJo (Treestar Inc, Ashland, OR).

Ensayo CTL basado en la luciferasa. Se generaron Nalm6-CBG (o Nalm6-CBG transducidas con PDL1 o HVEM) y se utilizaron en una versión modificada de un ensayo de linfocitos T citotóxicos basado en la luciferasa (CTL) de la siguiente manera. Las células Nalm6-CBG se lavaron y resuspendieron a 1 x 105 células /ml en medio R10, y 100 pl de células marcadas con CBG se incubaron con diferentes proporciones de células T (por ejemplo, 30:1, 15:1, etc.) durante la noche a 37°C. Se transfirió 100 pl de la mezcla a una placa luminométrica blanca de 96 pozos, se añadieron 100 pl de sustrato y se determinó inmediatamente la luminiscencia.

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A continuación se describen los resultados de los experimentos divulgados en este documento.

Expansión de células T con ARN CD3 scFv-28BB electroporado es tan eficiente como la de las células T estimuladas con anticuerpos anti-CD3 OKT3. Se sintetizaron y/o amplificaron por PCR los dominios de fragmentos variables de cadena única (scFv) de anticuerpos dirigidos contra CD3 (OKT3 o H5L1), se unieron a un dominio transmembrana CDS, a los dominios de señalización intracelular CD28 y 4-1BB, y se subclonaron en un vector basado en ARN pGEM.64A (Figura 1). Se sintetizó ARN a partir de las construcciones pGEM.64A modificadas (ARN OKT3-28BB o ARN H5L1) y se electroporó en células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Se evaluó la expansión de las células T en las poblaciones de PBMC obtenidas de dos donantes normales de PBMC. Las PBMC expandidas tras la electroporación del ARN OKT3-28BB se compararon con las PBMC incubadas con el anticuerpo anti-CD3 OKT3. Los resultados demostraron que las células T expandidas tras la electroporación de ARN OKT3-28BB fueron tan eficientes como la expansión de células T tras la estimulación con anticuerpos OKT3 (Figura 2).

Células T expandidas a partir de PBMC electroporadas con ARN CD3 scFv-28BB mostraron fenotipos similares a los de las células T estimuladas con el anticuerpo OKT3 y tuvieron una función efectora superior. Se evaluó el fenotipo de las células T expandidas por diferentes métodos, incluyendo la estimulación de PBMC con OKT3, células T purificadas con perlas recubiertas de anti-CD3/anti-CD28 (Beads), o electroporando PBMC con ARN OKT-28BB o ARN H5L1-28BB. Los resultados demostraron que el fenotipo de las células T obtenidas por electroporación de PBMC con ARN que codifica OKT-28BB o H5L1-28BB era similar al de las células T procedentes de PMBC estimuladas con el anticuerpo OKT3, que incluía un gran número de células T de memoria efectoras (CD45RO+/CD62L-), mientras que las células T estimuladas con perlas anti-CD3/anti-CD28 mostraban un fenotipo que era uniformemente fenotipo de memoria central (CD45RO+/Cd62L+) (Figura 3).

Además, se evaluó la funcionalidad de las células T tras la electroporación con ARN que codifica un CAR CD19. La expresión del ARN CD19 CAR electroporado fue similar en cada una de las poblaciones de células T (Figura 4) poblaciones de células T electroporadas con ARN CD19 CAR obtenidas de PBMC estimuladas con el anticuerpo OKT3, PBMCs electroporadas con el ARN OKT-28BB, PBMC electroporadas con el ARN H5L1-28BB y Pb Mc estimuladas con perla anti-CD3/anti-CD28, fueron evaluadas en cuanto a la regulación ascendente de C^d 107a después de coincubar las células T con una línea celular tumoral positiva para CD19, Nalm6 (Figuras 5A y 5B). Los resultados demostraron una mayor expresión de CD107a en las células T electroporadas con ARN OKT-28BB que en las células T estimuladas con anticuerpos OKT3 o perlas anti-CD3/anti-CD28. Las células T obtenidas a partir de PBMC electroporadas con ARN OKT-28BB tienen una funcionalidad más robusta, evaluada por la actividad antitumoral, que las células T estimuladas con anticuerpos OKT3 y perlas CD3/CD28.

Optimización adicional de las células T expandidas mediante la coelectroporacióncon ARNs que codifican moléculas costimuladoras, receptores de conmutación y citoquinas. Para comprobar si la adición de moléculas adicionales mediante la electroporación de ARN podría mejorar aún más las células T obtenidas mediante la expansión de PBMC electroporadas con ARN, se mezcló el ARN OKT-28BB con ARN que codifican moléculas costimuladoras, receptores de conmutación o citoquinas en diferentes combinaciones, como se indica en la Figura 10. El fenotipo y la funcionalidad de las células T obtenidas a partir de PBMC electroporadas con ARN se compararon con las células T obtenidas a partir de PBMCs estimuladas con anticuerpos OKT3. El análisis fenotípico se muestra en la Figura 6. Las células T obtenidas a partir de la electroporación de ARN de OKT-28BB (OKT-28bb-1) mostraron un fenotipo de célula T de memoria central en comparación con las células T obtenidas de estimulación por anticuerpo OKT3. Aproximadamente el 54,54% de las células T obtenidas por electroporación de RNA OKT-28BB frente a cerca del 25.08% de las células T obtenidas por estimulación con anticuerpos OKT3 fueron células CCR7/CD62L doblemente positivas.

Además, la electroporación de otros ARN, ARN que codifica para muerte celular programada 1 (PD1), CD83, CD86, 4-1BBL, PD1-CD28 o IL-21, con el ARN OKT-28BB aumentó la expansión de las células T. En OKT-28bb-2 y OKT-28bb-6, la expansión de las células T aumentó aún más, pasando de un 64,85% (OKT-28bb-5) a un 69,21% (OKT-28bb-3). PD1 fue significativamente regulada al alza en las células T obtenidas de PBMC electroporadas solo con ARN OKT-28BB, mientras que se detectó aproximadamente un 32,37% de células doblemente positivas a PD1/CD27 en las células T obtenidas de PBMC electroporadas con ARN OKT-28BB, frente a un 6,24% de células PD1/CD27 doblemente positivas detectadas en células T obtenidas de PBMC estimuladas con anticuerpos OKT3. La coelectroporación de otros ARN durante el paso de expansión de células T también disminuyó la expresión de PD1 en algunas de las poblaciones de células T expandidas, OKT-28bb-6 (9,30%) y OKT-28bb-2 (14,08%).

Se evaluó la producción de citoquinas, interferón-gamma (Figura 7) e IL-2 (Figura 8), en las células T expandidas que fueron electroporadas con ARN CD19 CAR (células T CD19 CAR) e incubadas con diferentes líneas celulares tumorales que expresaban CD19. La coelectroporación con otros ARNs dio lugar a niveles variables de IFN-gamma secretado por células T con ARN CD19 tras la incubación con las diferentes líneas celulares tumorales CD19. Las células T con ARN CD19 obtenidas a partir de PBMC electroporadas con ARN OKT-28BB secretaron mayores niveles de IL-2 que las células T con ARN CD19 obtenidas a partir de PBMCs estimuladas con anticuerpos OKT3.

También se determinó la capacidad lítica de las células T CAR CD19 RNA. Se incubaron células T de ARN CAR CD19 con líneas celulares CD19 positivas, Nalm6 y Nalm6 transducidas con PLL1 o HVEM. La actividad lítica se redujo en algunas células T de ^a Rⁿ CAR CD19, concretamente en OKT-288bb-2 y OKT-28bb-4 (Figura 9). Por el

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un método para expandir una población de células T, en el que el método comprende:

electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica, la proteína de membrana quimérica comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en anti-CD3, anti-TCR, anti-CD28 y una combinación de los mismos, y

un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB, en el que el ARNm se introduce en al menos una de las células de la población y se expresa en la superficie de las células; y

cultivar la población electroporada de células, en la que las células T contenidas en la misma se expanden al menos 10 veces.

2. El método de la reivindicación 1, en el que las células T contenidas en la población electroporada de células se expanden en un rango de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la población de células a electroporar se selecciona del grupo que consiste en células mononucleares de sangre periférica, células de sangre de cordón umbilical, una población purificada de células T, y una línea de células T, donde la población de células a ser electroporada comprende preferentemente células mononucleares de sangre periférica o células T purificadas.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el ARNm comprende ARN transcrito in vitro o ARN sintético.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo sintético, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de dominio único, un fragmento variable de cadena única y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el ARNm que codifica la proteína de membrana quimérica comprende además un dominio transmembrana, y preferiblemente comprende además un dominio bisagra.

7. El método de la reivindicación 1, en el que al menos una célula de la población de células expresa CD3.

8. El método de la reivindicación 3, en el que al menos una célula que expresa la proteína de membrana quimérica interactúa con otra célula que expresa CD3.

9. El método de la reivindicación 1 que además comprende

(a) electroporar un ARNm que codifica un agente en la población expandida de células T, donde el ARNm del agente se coelectropora preferentemente con el ARNm de la proteína de membrana quimérica;

(b) estimular la población expandida de células T con al menos una molécula o citoquina seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BBL, IL2, IL21, IL-15, IL-7, PD1-CD28 y PD1; o

(c) criopreservar las células T cultivadas.

10. Un método para expandir una población de células T electroporadas, en el que el método comprende:

electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica, la proteína de membrana quimérica comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB, en el que el ARNm se introduce en al menos una de las células de la población y se expresa en la superficie de las células; y

cultivar la población de células electroporadas, en la que las células T contenidas en ella se expanden al menos 10 veces.

11. Una población de células T expandida, que comprende un ARNm electroporado que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende

un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3, o un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en anti-CD3, anti-TCR, anti-CD28, y una combinación de los mismos, y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB,

donde el ARNm se introduce en al menos una de las células de la población y es expresado en la superficie de las células, y en el que las células T contenidas en la población se expandieron al menos 10 veces.

12. Una célula T que comprende un ARNm electroporado que codifica una proteína quimérica de membrana que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB.

13. Una población de células T electroporadas que comprende un ARNm electroporado que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en anti-CD3, anti-TCR, antiCD28, y una combinación de los mismos, y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB.

14. Una población expandida de células que comprende células T para su uso en un método de terapia de transferencia celular adoptiva, en el que dicho método comprende administrar dicha población de células a un sujeto que la necesita para prevenir o tratar una reacción inmunológica adversa para el sujeto, donde la población de células expandida se ha expandido según un método que comprende electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra CD3 y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB, donde al menos una de las células de la población expresa la proteína de membrana quimérica; y cultivar la población celular, en la que las células T contenidas en ella se expanden al menos 10 veces.

15. Una población expandida de células que comprende células T para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o afección asociada a una inmunidad aumentada en un sujeto, en el que dicho método comprende administrar dicha población celular expandida a un sujeto que la necesita, donde la población celular expandida se ha expandido según un método que comprende electroporar una población de células que comprende células T con ARNm que codifica una proteína de membrana quimérica que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido contra c D3 y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB, donde al menos una de las células de la población expresa la proteína de membrana quimérica; y cultivar la población, en la que las células T contenidas en ella se expanden al menos 10 veces.

16. Una composición farmacéutica que comprende una célula T modificada, en la que la célula T modificada comprende un ARNm electroporado que codifica una proteína de membrana quimérica, la proteína de membrana quimérica comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en anti-CD3, anti-TCR, anti-CD28, y una combinación de los mismos, y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB.

17. Una célula T modificada que comprende un ARNm electroporado que codifica una proteína de membrana quimérica, la proteína de membrana quimérica comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en anti-CD3, anti-TCR, anti-CD28, y una combinación de los mismos, y un dominio intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de 4-1BB, para su uso en un método de tratamiento de una afección en un sujeto, en donde dicho método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición farmacéutica.

18. La célula T modificada para su uso según la reivindicación 17, donde la respuesta inmunitaria

(a) es una enfermedad autoinmune, donde la enfermedad autoinmune se selecciona preferentemente del grupo que consiste en síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad autoinmune de Addison, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad autoinmune del oído interno (autoimmune inner ear disease, AIED), síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), púrpura trombocitopénica autoinmune (autoimmune thrombocytopenic purpura, ATP), enfermedad de Behcet, cardiomiopatía, esprúes-dermatitis herpetiforme celíaca; síndrome de disfunción inmunitaria por fatiga crónica (chronic fatigue immune dysfunction sydrome, CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), penfigoide cicatricial, enfermedad de la aglutinina fría, síndrome de la cresta, enfermedad de Crohn, enfermedad de Degos, dermatomiositis juvenil, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgiafibromiositis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), nefropatía IgA, diabetes mellitus insulinodependiente, artritis crónica juvenil (enfermedad de Still), artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, miastenia gravis, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia (esclerosis sistémica progresiva (progressive systemic sclerosis, PSS), también conocida como esclerosis sistémica (systemic sclerosis, SS)), síndrome de Sjogren, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vitíligo, granulomatosis de Wegener y cualquier combinación de las mismas; o

(b) es un cáncer, donde el cáncer se selecciona preferentemente del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer cerebral, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y carcinoma de tiroides.