ES2910832T3

ES2910832T3 - Inmunomoduladores

Info

Publication number: ES2910832T3
Application number: ES17809086T
Authority: ES
Inventors: Kevin Gillman; Jason Goodrich; David Langley; Paul Michael Scola
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2016-11-07
Filing date: 2017-11-06
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2037-11-06
Also published as: WO2018085750A3; EP3535280A2; US10988507B2; JP2020502049A; EP3535280B1; CN110267971B; WO2018085750A2; CN110267971A; KR102526034B1; US20190322704A1; KR20190075118A; JP7085545B2

Abstract

Un compuesto seleccionado entre: **(Ver fórmula)** , y **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunomoduladores

La presente divulgación proporciona nuevos péptidos macrocíclicos que inhiben la interacción proteína/proteína PD-1/PD-L1 y CD80/PD-L1, y por tanto son útiles para la mejora de diversas enfermedades, incluyendo el cáncer y las enfermedades infecciosas.

La proteína Muerte programada 1 (PD-1) es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28, que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en linfocitos B activados, linfocitos T, y células mieloides (Agata et al., véase anteriormente; Okazaki et al., Curr. Opin. Immunol., 14:779-782 (2002); Bennett et al., J. Immunol., 170:711-718 (2003)).

La proteína PD-1 es una proteína transmembrana de tipo I de 55 kDa que es parte de la superfamilia de genes Ig (Agata et al., Int. Immunol., 8:765-772 (1996)). PD-1 contiene un motivo inhibidor de tirosina del inmunorreceptor proximal de membrana (ITIM) y un motivo de interruptor basado en tirosina distal de membrana (ITSM) (Thomas, M.L., J. Exp. Med., 181:1953-1956 (1995); Vivier, E. et al., Immunol. Today, 18:286-291 (1997)). Aunque estructuralmente similar a CTLA-4, PD-1 carece del motivo MYPPY que es crítico para unión a CD80 CD86 (B7-2). Se han identificado dos ligandos para PD-1, PD-L1 (B7-H1) y PD-L2 (b7-DC). Se ha demostrado que la activación de linfocitos T que expresan PD-1 se regula a la baja tras interacción con células que expresan PD-L1 o PD-L2 (Freeman et al., J. Exp. Med., 192:1027-1034 (2000); Latchman et al., Nat. Immunol., 2:261-268 (2001); Carter et al., Eur. J. Immunol., 32:634-643 (2002)). Tanto PD-L1 como PD-L2 son miembros de la familia de proteínas B7 que se unen a PD-1, pero no se unen a otros miembros de la familia de CD28. El ligando PD-L1 es abundante en diversos cánceres humanos (Dong et al., Nat. Med., 8:787-789 (2002)). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución de linfocitos infiltrantes de tumores, una disminución en la proliferación mediada por receptores de linfocitos T, y evasión inmunitaria por las células cancerosas (Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287 (2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10:5094-5100 (2004)). La supresión inmunitaria puede invertirse inhibiendo la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando también se bloquea la interacción de PD-1 con PD-L2 (Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266 (2003)).

También se ha demostrado que PD-L1 interacciona con CD80 (Butte MJ et al., Immunity;27:111-122 (2007)). La interacción PD-L1/CD80 en expresión de células inmunitarias se ha demostrado que es inhibidora. Se ha demostrado que el bloqueo de esta interacción elimina esta interacción inhibidora (Paterson AM, et al., J Immunol., 187:1097-1105 (2011); Yang J, et al. J Immunol. 1 de agosto;187(3):1113-9 (2011)).

Cuando los linfocitos T que expresan PD-1, entran en contacto con células que expresan sus ligandos, las actividades funcionales en respuesta a estímulos antigénicos, incluyendo la proliferación, secreción de citoquinas, y citotoxicidad, se reducen. Las interacciones PD-1/PD-L1 o PD-L2 regulan a la baja las respuestas inmunitarias durante la resolución de una infección o tumor, o durante el desarrollo de autotolerancia (Keir, M.E. et al., Annu. Rev. Immunol., 26:Epub (2008)). La estimulación antigénica crónica, tal como la que se produce durante la enfermedad tumoral o infecciones crónicas, da como resultado linfocitos T que expresan niveles elevados de PD-1 y son disfuncionales con respecto a la actividad hacia el antígeno crónico (revisado en Kim et al., Curr. Opin. I mm. (2010)). Esto se denomina "agotamiento de linfocitos T". Los linfocitos B también muestran la supresión y el "agotamiento" de PD-1/PD-ligando.

Se ha demostrado que el bloqueo de la ligadura PD-1/PD-L1 con anticuerpos contra PD-L1 restaura y aumenta la activación de los linfocitos T en muchos sistemas. Los pacientes con cáncer avanzado se benefician de la terapia con un anticuerpo monoclonal contra PD-L1 (Brahmer et al., New Engl. J. Med. (2012)). Modelos animales preclínicos de tumores e infecciones crónicas han demostrado que el bloqueo de la ruta PD-1/PD-L1 mediante anticuerpos monoclonales puede mejorar la respuesta inmunitaria y dar como resultado el rechazo del tumor o el control de la infección. La inmunoterapia antitumoral a través del bloqueo de PD-1/PD-L1 puede aumentar la respuesta inmunitaria terapéutica a varios tumores histológicamente distintos (Dong, H. et al., "B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity", J. Mol. Med., 81(5):281-287 (2003); Dong, H. et al., "Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion", Nat. Med., 8(8):793-800 (2002)).

La interferencia con la interacción PD-1/PD-L1 provoca una mayor actividad de linfocitos T en sistemas con infección crónica. El bloqueo de PD-L1 causó un aclaramiento viral mejorado y una inmunidad restaurada en ratones con infección por virus de coriomeningitis linfocítica crónica (Barber, D.L. et al., "Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection", Nature, 439(7077):682-687 (2006)). Los ratones humanizados infectados con VIH-1 muestran una protección mejorada contra la viremia y el agotamiento viral de linfocitos T CD4+ (Palmer et al., J. Immunol. (2013)). El bloqueo de PD-1/PD-L1 a través de anticuerpos monoclonales contra PD-L1 puede restaurar la funcionalidad específica de antígeno in vitro en linfocitos T de pacientes con VIH (Day, Nature (2006); Petrovas, J. Exp. Med. (2006); Trautman, Nature Med. (2006); D'Souza, J. Immunol. (2007); Zhang, Blood (2007); Kaufmann, Nature Imm. (2007); Kasu, J. Immunol. (2010); Porichis, Blood (2011)), Pacientes con VHC (Golden-Mason, J. Virol. (2007); Jeung, J. Leuk. Biol. (2007); Urbani, J. Hepatol. (2008); Nakamoto, PLoSPath. (2009); Nakamoto, Gastroenterology (2008)) y pacientes con VHB (Boni, J. Virol. (2007); Fisicaro, Gastro. (2010); Fisicaro et al., Gastroenterology (2012); Boni et al., Gastro. (2012); Penna et al., J. Hep. (2012); Raziorrough, Hepatology (2009); Liang, World J. Gastro. (2010); Zhang, Gastro. (2008)).

También se ha demostrado que el bloqueo de la interacción PD-L1/CD80 estimula la inmunidad (Yang J., et al., J Immunol. agosto de 1; 187(3):1113-9 (2011)). Se ha demostrado que la estimulación inmunitaria resultante del bloqueo de la interacción PD-L1/CD80 mejora mediante un bloqueo combinado de otras interacciones PD-1/PD-L1 o PD-1/PD-L2.

Se supone que las alteraciones en los fenotipos de las células inmunitarias son un factor importante en el choque séptico (Hotchkiss, et al., Nat Rev Immunol (2013)). Estas incluyen niveles incrementados de p D-1 y PD-L1 (Guignant, et al, Crit. Care (2011)), Las células de pacientes con choque séptico con niveles incrementados de PD-1 y PD-L1 exhiben un nivel incrementado de apoptosis de linfocitos T. Anticuerpos dirigidos a PD-L1, pueden reducir el nivel de apoptosis de células inmunitarias (Zhang et al, Crit. Care (2011)). Además, los ratones que carecen de expresión de PD-1 son más resistentes a los síntomas de choque séptico que los ratones de tipo natural. Yang J., et al. J Immunol. agosto de 1; 187(3):1113-9 (2011)). Los estudios han revelado que el bloqueo de interacciones de PD-L1 usando anticuerpos puede suprimir las respuestas inmunitarias inapropiadas y mejorar los signos de la enfermedad.

Además de mejorar las respuestas inmunológicas a los antígenos crónicos, también se ha demostrado que el bloqueo de la ruta PD-1/PD-L1 mejora las respuestas a la vacunación, incluida la vacunación terapéutica en el contexto de la infección crónica (Ha, S.J. et al., "Enhancing therapeutic vaccination by blocking PD-1-mediated inhibitory signals during chronic infection", J. Exp. Med., 205(3):543-555 (2008); Finnefrock, A.C. et al., "PD-1 blockade in rhesus macaques: impact on chronic infection and prophylactic vaccination", J. Immunol., 182(2):980-987 (2009); Song, M.-Y. et al., "Enhancement of vaccine-induced primary and memory CD8+ t-cell responses by soluble PD-1", J. Immunother., 34(3):297-306 (2011)).

La ruta de PD-1 es una molécula inhibidora clave en el agotamiento de los linfocitos T que surge de la estimulación crónica del antígeno durante las infecciones crónicas y las enfermedades tumorales. Se ha demostrado que el bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 a través del direccionamiento a la proteína PD-L1 restaura las funciones inmunitarias de los linfocitos T específicos de antígeno in vitro e in vivo, incluyendo respuestas mejoradas a la vacunación en el establecimiento de una infección tumoral o crónica. Por tanto, se desean agentes que bloqueen la interacción de PD-L1 con PD-1 o CD80.

Los solicitantes han encontrado compuestos potentes que tienen actividad como inhibidores de la interacción de PD-L1 con PD-1 y CD80 y, por tanto, pueden ser útiles para la administración terapéutica para mejorar la inmunidad en cáncer o infecciones, incluida la vacuna terapéutica. Estos compuestos se proporcionan para ser útiles para la administración terapéutica para mejorar la inmunidad en cáncer o infecciones, incluida la vacuna terapéutica. Estos compuestos se proporcionan para ser útiles como productos farmacéuticos con valores de estabilidad, biodisponibilidad, índice terapéutico y toxicidad deseables que son importantes para su capacidad de tratamiento.

En su primer aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I)

y

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En un segundo aspecto la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso en mejorar, estimular, y/o aumentar la respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita. En una primera realización del segundo aspecto la realización comprende además administrar un agente adicional antes, después, o simultáneamente con el compuesto de fórmula (I) o una sal terapéuticamente aceptable del mismo. En una segunda realización, el agente adicional se selecciona entre un agente antimicrobiano, un agente antiviral, un agente citotóxico, un agonista de TLR7, un agonista de TLR8, un inhibidor de HDAC y un modificador de la respuesta inmunitaria.

En un tercer aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso en la inhibición del crecimiento, proliferación, o metástasis de células cancerosas en un sujeto que lo necesita. En una primera realización del tercer aspecto, el cáncer se selecciona entre melanoma, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón no microcítico escamoso (CPNM), CPNM no escamoso, cáncer colorrectal, cáncer de próstata resistente a la castración, cáncer de ovario, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, carcinoma de páncreas, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinomas del esófago, tracto gastrointestinal y mama, y tumores malignos hematológicos.

En un cuarto aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto que lo necesita. En una primera realización del cuarto aspecto, la enfermedad infecciosa está causada por un virus. En una segunda realización el virus se selecciona entre VIH, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, herpes virus, e influenza.

En un quinto aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento del choque séptico en un sujeto que lo necesite.

Según la presente divulgación, hemos descubierto péptidos que se unen específicamente a PD-L1 y son capaces de inhibir la interacción de PD-L1 con PD-1 y CD80. Estos péptidos macrocíclicos exhiben eficacia inmunomoduladora in vitro, lo que los convierte en candidatos terapéuticos para el tratamiento de diversas enfermedades, incluidas el cáncer y las enfermedades infecciosas.

Los términos "unión específica" o "se une específicamente" se refieren a la interacción entre una proteína y una molécula de unión, tales como un compuesto o ligando. La interacción depende de la presencia de una estructura particular (es decir, un sitio de unión a enzimas, un determinante antigénico o epítopo) de la proteína que se reconoce por la molécula de unión. Por ejemplo, si un compuesto tiene una unión específica para el sitio de unión a proteínas "A", la presencia del compuesto en una reacción que contiene una proteína que incluye el sitio de unión A, y un péptido marcado que se une específicamente al sitio de unión a la proteína A reducirá la cantidad de péptido marcado unido a la proteína. Por el contrario, la unión no específica de un compuesto a la proteína no da como resultado un desplazamiento dependiente de la concentración del péptido marcado de la proteína.

La presente divulgación pretende incluir todos los isótopos de átomos que se encuentran en los presentes compuestos.

Los isótopos incluyen aquellos átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números másicos. A modo de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen deuterio y tritio. Los isótopos de carbono incluyen 13C y 14C. Los compuestos de la invención marcados isotópicamente se pueden preparar generalmente por técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia o por procedimientos análogos a los descritos en este documento, usando un reactivo marcado isotópicamente apropiado en lugar del reactivo no marcado empleado de otro modo. Dichos compuestos pueden tener diversos usos potenciales, por ejemplo, como patrones y reactivos para determinar la actividad biológica. En el caso de los isótopos estables, dichos compuestos pueden tener el potencial de modificar favorablemente las propiedades biológicas, farmacológicas o farmacocinéticas.

Un aspecto adicional de la materia objeto descrita en este documento es el uso de los péptidos desvelados como ligandos radiomarcados para el desarrollo de ensayos de unión a ligandos o para el control de la adsorción in vivo, metabolismo, distribución, unión u ocupación de receptores, o disposición de compuesto. Por ejemplo, un péptido macrocíclico descrito en este documento puede prepararse usando el isótopo radiactivo 125I y el péptido radiomarcado resultante puede usarse para desarrollar un ensayo de unión o para estudios de metabolismo. Como alternativa, y para el mismo propósito, un péptido macrocíclico descrito en este documento puede convertirse en una forma radiomarcada mediante tritiación catalítica usando métodos conocidos por los expertos en la materia.

Los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación también se pueden usar como agentes de imagen de PET mediante la adición de un marcador radiactivo usando métodos conocidos por los expertos en la materia.

Los péptidos preferentes incluyen al menos uno de los péptidos macrocíclicos proporcionados en este documento y estos péptidos pueden incluirse en composiciones y combinaciones farmacéuticas.

Las definiciones proporcionadas en este documento se aplican, sin limitación, a los términos usados en la presente memoria descriptiva, a no ser que se limite de otra forma en los casos específicos.

Los expertos en la materia de la química de aminoácidos y péptidos son conscientes de que un aminoácido incluye un compuesto representado por la estructura general:

L- o S-a-aminoácido

(si R=H)

D- o R-a-aminoácido

(si R=H)

donde R y R' son como se analizan en este documento.

A menos que se indique otra cosa, el término "aminoácido" como se emplea en este documento, solo o como parte de otro grupo, incluye, sin limitación, un grupo amino y un grupo carboxilo unido al mismo carbono, denominado carbono "a", donde R y/o R' pueden ser una cadena lateral natural o no natural, incluyendo hidrógeno. La configuración absoluta "S" en el carbono "a" se conoce comúnmente como la configuración "L" o "natural". En el caso en que los sustituyentes "R" y "R'" (prima) sean iguales a hidrógeno, el aminoácido es glicina y no es quiral.

Los términos "cadena lateral de aminoácido natural" y "cadena lateral de aminoácido de origen natural", como se usa en este documento, se refieren a la cadena lateral de cualquiera de los aminoácidos naturales (es decir, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina,-histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, y valina) generalmente en la configuración S (es decir, el L-aminoácido).

Los términos "cadena lateral de aminoácido no natural" y "cadena lateral de aminoácido de origen no natural", como se usa en este documento, se refiere a una cadena lateral de cualquier aminoácido natural generalmente en la configuración R (es decir, el aminoácido D) o a un grupo distinto de una cadena lateral de aminoácido natural en la configuración R (es decir, el D-o L-aminoácido, respectivamente) seleccionado entre:

alquenilo C²-C⁷, alcoxi C-ⁱ-C^aalquilo C¹-C³, alcoxicarbonil C-ⁱ-C^aalquilo C¹-C³, alquilo C¹-C⁷, alquilsulfanil C¹-C^aalquilo C¹-C³, amidoalquilo C¹-C³, aminoalquilo C¹-C³, azaindolilalquilo C¹-C³, benzotiazolilalquilo C¹-C³, benzotienilalquilo C¹-C³, benciloxialquilo C¹-C³, carboxialquilo C¹-C³, cicloalquil C³-C¹⁴alquilo C¹-C³, difenilmetilo, furanilalquilo C¹-C³, imidazolilalquilo C¹-C³, naftilalquilo C¹-C³, piridinilalquilo C¹-C³, tiazolilalquilo C¹-C³, tienilalquilo C¹-C³;

bifenilalquilo C¹-C³, en donde el bifenilo está opcionalmente sustituido con un grupo metilo;

heterociclilo opcionalmente sustituido con uno, dos, tres, cuatro, o cinco grupos seleccionados independientemente entre alcoxi C¹-C⁴, alquilo C¹-C⁴, alquilsulfonilamino C¹-C³, amido, amino, aminoalquilo C¹-C³, aminosulfonilo, carboxi, ciano, halo, haloalquilo C¹-C³, hidroxi, -NC(NH²)², nitro, y -OP(O)(OH)²;

indolilalquilo C¹-C³, en donde la parte indolilo está opcionalmente sustituida con un grupo seleccionado entre alquilo C¹-C³, carboxialquilo C¹-C³, halo, hidroxi y fenilo, en donde el fenilo está además opcionalmente sustituido con uno, dos, o tres grupos seleccionados independientemente entre alcoxi C¹-C³, alquilo C¹-C³, y halo;

NR^xR^y(alquilo C¹-C⁷), en donde R^xy R^yse seleccionan independientemente entre hidrógeno, alqueniloxicarbonilo C²-C⁴, alquilo C¹-C³, alquilcarbonilo C¹-C³, cicloalquilcarbonilo C³-C¹⁴, furanilcarbonilo y fenilcarbonilo. Cuando el conector alquilo contiene más de un carbono un grupo adicional NR^xR^ypuede estar en la cadena.

NR^uR^vcarbonilalquilo C¹-C³, en donde R^uy R^vse seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C¹-C³, y trifenilmetilo;

fenilo opcionalmente sustituido con uno, dos, tres, cuatro, o cinco grupos seleccionados independientemente entre alcoxi C¹-C⁴, alquilo C¹-C⁴, alquilsulfonilamino C¹-C³, amido, amino, aminoalquilo C¹-C³, aminosulfonilo, carboxi, ciano, halo, haloalquilo C¹-C³, hidroxi, -NC(NH²)², nitro, y -OP(O)(OH)²;

fenilalquilo C¹-C³en donde la parte fenilo está opcionalmente sustituida con uno, dos, tres, cuatro, o cinco grupos seleccionados independientemente entre alcoxi C¹-C⁴, alquilo C¹-C⁴, alquilsulfonilamino C¹-C³, amido, amino, aminoalquilo C¹-C³, aminosulfonilo, carboxi, ciano, halo, haloalquilo C¹-C³, hidroxi, -NC(NH²)², nitro, y -OP(O)(OH)²; y

fenoxialquilo C¹-C³en donde el fenilo está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C¹-C³.

El término "alexa-5-SDP" como se usa en este documento, se refiere a

en donde W es O u NH.

El término "alquenilo C²-C⁴", como se usa en este documento, se refiere a un grupo de cadena lineal o ramificada de dos a cuatro átomos de carbono que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono.

El término "alquenilo C²-C⁷", como se usa en este documento, se refiere a un grupo de cadena lineal o ramificada de dos a siete átomos de carbono que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono.

El término "alqueniloxi C²-C⁴", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alquenilo C²-C⁴unido al resto molecular precursor a través de un átomo de oxígeno.

El término "alcoxi C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alquilo C¹-C³unido al resto molecular precursor a través de un átomo de oxígeno.

El término "alcoxi C¹-C⁴", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alquilo C¹-C⁴unido al resto molecular precursor a través de un átomo de oxígeno.

El término "alcoxi C¹-C^a", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alquilo C¹-C⁶unido al resto molecular precursor a través de un átomo de oxígeno.

El término "alcoxi C¹-C³alquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alcoxi C¹-C³unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³.

El término "alcoxicarbonilo C¹-C^a", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alcoxi C¹-C⁶unido al resto molecular precursor a través de un grupo carbonilo.

El término "alcoxicarbonil C ⁱ-C⁶alquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alcoxicarbonilo C¹-C⁶unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³.

El término "alquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo obtenido a partir de un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que contiene de uno a tres átomos de carbono.

El término "alquilo C¹-C⁴", como se usa en este documento, se refiere a un grupo obtenido a partir de un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que contiene de uno a cuatro átomos de carbono.

El término "alquilo C¹-C⁶", como se usa en este documento, se refiere a un grupo obtenido a partir de un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que contiene de uno a seis átomos de carbono.

El término "alquilcarbonilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alquilo C1-C3 unido al resto molecular precursor a través de un grupo carbonilo.

El término "alquilsulfanilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alquilo C¹-C³unido al resto molecular precursor a través de un átomo azufre.

El término "alquilsulfanil C¹-C³alquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alquilsulfanilo C¹-C³unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³.

El término "alquilsulfonilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alquilo C¹-C³unido al resto molecular precursor a través de un grupo sulfonilo.

El término "alquilsulfonilamino C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alquilsulfonilo C¹-C³unido al resto molecular precursor a través de un grupo amino.

El término "amido", como se usa en este documento, se refiere a -C(O)NH².

El término "amidoalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo amido unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³.

El término "amino", como se usa en este documento, se refiere a -NH².

El término "aminoalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo amino unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³.

El término "aminosulfonilo", como se usa en este documento, se refiere a un grupo amino unido al resto molecular precursor a través de un grupo sulfonilo.

El término "azaindolilalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo azaindolilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³. El grupo azaindolilo puede estar unido al resto alquilo a través de cualquier átomo sustituible en el grupo.

El término "benzotiazolilalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo benzotiazolilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³. El grupo benzotiazolilo puede estar unido al resto alquilo a través de cualquier átomo sustituible en el grupo.

El término "benzotienilalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo benzotienilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³. El grupo benzotienilo puede estar unido al resto alquilo a través de cualquier átomo sustituible en el grupo.

El término "benciloxi", como se usa en este documento, se refiere a un grupo bencilo unido al resto molecular precursor a través de un átomo de oxígeno.

El término "benciloxialquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo benciloxi unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³.

El té rmino "biotina" como se usa en este documento, se refiere a:

en donde W es O u NH

El término "bifenilalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo bifenilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³. El grupo bifenilo puede estar unido al resto alquilo a través de cualquier átomo sustituible en el grupo.

El término "carbonilo", como se usa en este documento, se refiere a -C(O)-.

El término "carboxi", como se usa en este documento, se refiere a -CO²H.

El término "carboxialquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo carboxi unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³.

El término "ciano", como se usa en este documento, se refiere a -CN.

El término "cicloalquilo C³-C¹⁴", como se usa en este documento, se refiere a un sistema de anillo hidrocarburo monocíclico, bicíclico o tricíclico saturado que tiene de tres a catorce átomos de carbono y cero heteroátomos. Los anillos bicíclicos y tricíclicos pueden ser fusionados, espirocíclicos o puenteados. Los ejemplos representativos de grupos cicloalquilo incluyen, pero sin limitación, ciclopropilo, ciclopentilo, biciclo[3.1.1]heptilo y adamantilo.

El término "cicloalquil C³-C¹⁴alquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo cicloalquilo C³-C¹⁴unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³.

El término "cicloalquilcarbonilo C³-C¹⁴", como se usa en este documento, se refiere a un grupo cicloalquilo C³-C¹⁴unido al resto molecular precursor a través de un grupo carbonilo.

El término "furanilalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo furanilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³. El grupo furanilo puede estar unido al resto alquilo a través de cualquier átomo sustituible en el grupo.

El término "furanilcarbonilo", como se usa en este documento, se refiere a un grupo furanilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo carbonilo.

Los términos "halo" y "halógeno", como se usa en este documento, se refieren a F, Cl, Br o I.

El término "haloalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alquilo C¹-C³sustituido con uno, dos o tres átomos de halógeno.

El término "halometilo", como se usa en este documento, se refiere a un grupo metilo sustituido con uno, dos o tres átomos de halógeno.

El término "heterociclilo", como se usa en este documento, se refiere a un anillo de cinco, seis o siete miembros que contiene uno, dos o tres heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno y azufre. El anillo de cinco miembros tiene cero dobles enlaces y los anillos de seis y siete miembros tienen de cero a tres dobles enlaces. El término "heterociclilo" también incluye grupos bicíclicos en los que el anillo heterociclilo se fusiona a un anillo carbocíclico aromático o no aromático de cuatro a seis miembros u otro grupo heterociclilo monocíclico. Los grupos heterociclilos de la presente divulgación pueden estar unidos al resto molecular precursor a través de un átomo de carbono en el grupo. Ejemplos de grupos heterociclilos incluyen, pero sin limitación, benzotienilo, furilo, imidazolilo, indolinilo, indolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo, oxazolilo, piperazinilo, piperidinilo, pirazolilo, piridinilo, pirrolidinilo, pirrolopiridinilo, pirrolilo, tiazolilo, tienilo y tiomorfolinilo.

El término "hidroxi", como se usa en este documento, se refiere a -OH.

El término "imidazolilalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo imidazolilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³. El grupo imidazolilo puede estar unido al resto alquilo a través de cualquier átomo sustituible en el grupo.

El término "indolilalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo indolilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³. El grupo indolilo puede estar unido al resto alquilo a través de cualquier átomo sustituible en el grupo.

El término "naftilalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo naftilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³. El grupo naftilo puede estar unido al resto alquilo a través de cualquier átomo sustituible en el grupo.

El término "nitro", como se usa en este documento, se refiere a -NO².

El término "NR^xR^y", como se usa en este documento, se refiere a dos grupos, R^ay R^b, que están unidos al resto molecular precursor a través de un átomo de nitrógeno. R^ay R^bse seleccionan independientemente entre hidrógeno, alqueniloxicarbonilo C²-C⁴, alquilcarbonilo C¹-C³, cicloalquilcarbonilo C³-C¹⁴, furanilcarbonilo y fenilcarbonilo.

El término "NR^xR^yalquilo (C¹-C³)", como se usa en este documento, se refiere a un grupo NR^xR^yunido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³.

El término "NR^uR^v", como se usa en este documento, se refiere a dos grupos, R^uy R^v, que están unidos al resto molecular precursor a través de un átomo de nitrógeno. R^uy R^vse seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C¹-C³, y trifenilmetilo.

El término "NR^uR^vcarbonilo", como se usa en este documento, se refiere a un grupo NR^uR^vunido al resto molecular precursor a través de un grupo carbonilo.

El término "NR^uR^vcarbonilalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo NR^uR^vcarbonilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³.

El término "PEG", como se usa en este documento, se refiere a polietilenglicol, un polímero de óxido de etileno representado por la fórmula

en donde n está entre 1 y 57. Se debe entender que el grupo PEG puede estar unido al resto molecular precursor a través del átomo de oxígeno o el átomo de carbono.

El término "fenoxi", como se usa en este documento, se refiere a un grupo fenilo unido al resto molecular precursor a través de un átomo de oxígeno.

El término "fenoxialquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo fenoxi unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³.

El término "fenilalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo fenilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³.

El término "fenilcarbonilo", como se usa en este documento, se refiere a un grupo fenilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo carbonilo.

El término "piridinilalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo piridinilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³. El grupo piridinilo puede estar unido al resto alquilo a través de cualquier átomo sustituible en el grupo.

El término "sulfanilo", como se usa en este documento, se refiere a -S-.

El término "sulfonilo", como se usa en este documento, se refiere a -SO²-.

El término "tiazolilalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo tiazolilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³. El grupo tiazolilo puede estar unido al resto alquilo a través de cualquier átomo sustituible en el grupo.

El término "tienilalquilo C¹-C³", como se usa en este documento, se refiere a un grupo tienilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo alquilo C¹-C³. El grupo tienilo puede estar unido al resto alquilo a través de cualquier átomo sustituible en el grupo.

El término "tratar" se refiere a: (i) prevenir que una enfermedad, trastorno, o afección ocurra en un paciente que puede estar predispuesto a la enfermedad, trastorno y/o afección, pero al que aún no se le ha diagnosticado que la tenga; (ii) inhibir la enfermedad, trastorno o afección, es decir, detener su desarrollo; y (iii) aliviar la enfermedad, trastorno o afección, es decir, provocar la regresión de la enfermedad, trastorno, y/o afección y/o síntomas asociados a la enfermedad, trastorno y/o afección.

El término "vitamina E", como se usa en este documento se refiere a:

La unión de péptidos macrocíclicos a PD-L1 puede medirse, por ejemplo, por métodos tales como fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF), Resonancia de plasmón superficial (SPR), calorimetría de titulación isotérmica (ITC), espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), y similares. Además, la unión de los péptidos macrocíclicos a PD-L1 expresada en la superficie de las células puede medirse como se describe en este documento en ensayos de unión celular.

La administración de un agente terapéutico descrito en este documento incluye, sin limitación, administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de agente terapéutico. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en este documento se refiere, sin limitación, a una cantidad de un agente terapéutico para tratar o prevenir una afección tratable mediante la administración de una composición de los inhibidores de unión a PD-1/PD-L1 descritos en este documento. Esta cantidad es la cantidad suficiente para presentar un efecto terapéutico o preventivo o mejorador. El efecto puede incluir, por ejemplo, y sin limitación, el tratamiento o la prevención de las afecciones relacionadas en este documento. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá del tamaño y la salud del sujeto, la naturaleza y la extensión de la afección que se está tratando, recomendaciones del médico tratante, y la terapéutica o combinación de la terapéutica seleccionada para la administración. Por tanto, no es útil especificar una cantidad efectiva exacta por adelantado.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación para su uso en la inhibición del crecimiento de células tumorales en un sujeto. Como se demuestra en este documento, los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación son capaces de unirse a PD-L1, interrumpiendo la interacción entre PD-L1 y PD-1, compitiendo con la unión de PD-L1 con anticuerpos monoclonales anti-PD-1 que se sabe que bloquean la interacción con PD-1, mejoran la secreción de IFNy de células T específicas de CMV, y mejoran la secreción de IFNg de células T específicas de VIH. Como resultado, los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación son útiles para modificar una respuesta inmunitaria, tratar enfermedades tales como cáncer o enfermedades infecciosas, estimulando una respuesta autoinmunitaria protectora para estimular respuestas inmunitarias específicas de antígeno (por ejemplo, mediante la administración conjunta de péptidos bloqueadores de PD-L1 con un antígeno de interés).

Con el fin de que se pueda entender más fácilmente la presente divulgación, se definen previamente determinados términos. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

Los términos "ligando de muerte programada 1", "ligando de muerte celular programada 1", "proteína PD-L1", "PD-L1", "PDL1", "PDCDL1", "hPD-L1", "hPD-LI", "CD274" y "B7-H1" se usan intercambiablemente, e incluyen variantes, isoformas, homólogos de especie de PD-L1 humana, y análogos que tienen al menos un epítopo común con PD-L1. La secuencia completa de PD-L1 se puede encontrar con el número de registro de GENBANk® NP_054862.

Los términos "muerte programada 1", "muerte celular programada 1", "proteína PD-1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", "hPD-1" y "hPD-I" se usan intercambiablemente e incluyen variantes, isoformas, homólogos de especie de PD-1 humana, y análogos que tienen al menos un epítopo común con PD-1. La secuencia completa de PD-1 se puede encontrar con el número de registro de GENBAn K® U64863.

Los términos "antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos", "CTLA-4", "CTLA4", "antígeno CTLA-4" y "CD152" (véase, por ejemplo, Murata, Am. J. Pathol., 155:453-460 (1999)) se usan intercambiablemente, e incluyen variantes, isoformas, homólogos de especie de CTLA-4 humano, y análogos que tienen al menos un epítopo común con CTLA-4 (véase, por ejemplo, Balzano, Int. J. Cancer Suppl., 7:28-32 (1992)). La secuencia de ácidos nucleicos completa de c TlA-4 se puede encontrar con el n.° de registro de GENBANK® L15006.

La expresión "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos, y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluidos péptidos macrocíclicos, citoquinas, y complemento) que da como resultado un daño selectivo sobre, la destrucción de o la eliminación en el cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados por patógenos, células cancerosas o, en los casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Un "evento adverso" (EA) como se usa en este documento es desfavorable y generalmente no intencionado, incluso indeseable, signo (incluido un hallazgo anormal de laboratorio), síntoma, enfermedad asociada al uso de un tratamiento médico. Por ejemplo, un evento adverso puede estar asociado a la activación del sistema inmunitario o la expansión de las células del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos T) en respuesta a un tratamiento. Un tratamiento médico puede tener uno o más EA asociados y cada EA puede tener el mismo nivel de gravedad o diferente. La referencia a métodos capaces de "alterar los eventos adversos" significa un régimen de tratamiento que disminuye la incidencia y/o gravedad de uno o más EA asociados al uso de un régimen de tratamiento diferente.

Como se usa en este documento, la "enfermedad hiperproliferativa" se refiere a condiciones en las que el crecimiento celular aumenta a niveles normales. Por ejemplo, enfermedades hiperproliferativas o trastornos incluyen enfermedades malignas (por ejemplo, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer biliar) y enfermedades no malignas (por ejemplo, ateroesclerosis, hiperplasia benigna e hipertrofia prostática benigna).

Como se usa en este documento, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" significa dentro de un rango de error aceptable para el valor particular determinado por un experto en la materia, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor, es decir, de las limitaciones del sistema de medida. Por ejemplo, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" puede significar dentro de una o más de una desviación estándar según la práctica en la técnica. Como alternativa, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" puede significar un intervalo de hasta 20 %. Además, particularmente con respecto a los sistemas o procesos biológicos, las expresiones pueden significar hasta un orden de magnitud o hasta 5 veces de un valor. Cuando se proporcionan valores particulares en la solicitud y reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, se debe suponer que el significado de "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" está dentro de un rango de error aceptable para ese valor particular.

Como se describe en este documento, cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relación o intervalo de número entero se entiende que incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo citado y, cuando sea adecuado, fracciones del mismo (tal como una décima y una centésima de un número entero), a menos que se indique otra cosa.

Ensayos competitivos

La presente divulgación también se refiere a péptidos macrocíclicos que son capaces de competir con la unión de un anticuerpo anti-PD-Ll de referencia (MDX-1105) en al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, y al menos aproximadamente 100 %. Dichos péptidos macrocíclicos pueden compartir homología estructural con uno o más péptidos macrocíclicos desvelados en este documento, incluyendo mutante, sustitución conservadora, sustitución funcional, y formas de deleción, siempre que se unan específicamente a PD-L1. Por ejemplo, si un péptido macrocíclico se une sustancialmente a la misma región de PD-L1 que un anticuerpo anti-PD-Ll de referencia, el péptido macrocíclico debe unirse a un epítopo de PD-L1 que al menos se superpone con el epítopo PD-L1 al que se une el anticuerpo monoclonal anti-PD-Ll. La región superpuesta puede variar desde un residuo de aminoácido hasta varios cientos de residuos de aminoácido. El péptido macrocíclico debe entonces competir con y/o bloquear la unión del anticuerpo monoclonal anti-PD-Ll a PD-L1 y así disminuir la unión del anticuerpo monoclonal anti-PD-Ll a PD-L1, preferentemente en al menos aproximadamente 50 % en un ensayo de competición.

Los anticuerpos anti-PD-Ll que pueden usarse como anticuerpos de referencia para fines de ensayos de competición se conocen en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse los siguientes anticuerpos representativos anti-PD-Ll: MDX-1105 (BMS); L01X-C (Serono), L1X3 (Serono), MSB-0010718C (Serono), y PD-L1 Probody (CytomX), y los anticuerpos PD-L1 desvelados en el documento del solicitante WO 2007/005874.

Los anticuerpos anti-PD-1 que pueden usarse como anticuerpos de referencia para fines de ensayos de competición se conocen en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse los siguientes anticuerpos representativos anti-PD-1: nivolumab (BMS); 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7 D3 y 5F4 desvelado cada uno en el documento de patente de Estados Unidos del solicitante n.° 8.008.449 (BMS), MK-3475 (Merck, desvelado en el documento de patente de Estados Unidos n.° 8.168.757), y los anticuerpos desvelados en la patente de Estados Unidos n.° 7.488.802.

Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de péptidos macrocíclicos de la presente divulgación, formulado junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir uno o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) péptidos macrocíclicos, inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la divulgación. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la divulgación puede comprender una combinación de péptidos macrocíclicos (inmunoconjugados o biespecíficos) que se unen a diferentes epítopos en el antígeno diana o que tienen actividades complementarias.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia combinada puede incluir un péptido macrocíclico combinado con al menos otro agente antiinflamatorio o inmunosupresor. Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en la terapia de combinación se describen en mayor detalle a continuación en la sección sobre usos de los péptidos macrocíclicos de la divulgación.

Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes retardantes de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, un péptido macrocíclico, inmunoconjugado o molécula biespecífica, se puede recubrir con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y de otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos de la divulgación pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" o "sal terapéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M. et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1977)). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácidos incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos, tales como ácidos alifáticos monocarboxílicos y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de bases incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, W-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Una composición farmacéutica de la divulgación también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la divulgación incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como agentes conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse mediante procedimientos de esterilización, véase anteriormente, y mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol de ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede llevar a cabo mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones estériles inyectables o dispersiones. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en el caso de que cualquier agente o medio convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la divulgación. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.

Normalmente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por microfiltración. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferentes son el secado al vacío y el secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir una solución del mismo previamente esterilizada por filtración.

La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material vehículo para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo del sujeto a tratar, y el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material vehículo para producir una sola forma de dosificación, en general, será la cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico. En general, de entre un cien por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente 0,01 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, preferentemente de aproximadamente 0,1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, lo más preferentemente de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento de ingrediente activo junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas con el tiempo o la dosis puede reducirse proporcionalmente o aumentarse según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma de unidad de dosificación usada en este documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación al vehículo farmacéutico requerido. La memoria descriptiva para las formas de unidad de dosificación de la divulgación está dictada por y dependiente directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Para la administración del péptido macrocíclico, la dosis varía entre aproximadamente 0,0001 y 100 mg/kg, y más generalmente entre 0,01 y 5 mg/kg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o en el intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento de ejemplo implica la administración una vez al día, dos veces al día, bisemanalmente, trisemanalmente, semanalmente, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferentes para un péptido macrocíclico de la divulgación incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración intravenosa, con el macrociclo que se administra usando uno de los siguientes horarios de dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosis, entonces cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

En algunas realizaciones, se administran simultáneamente dos o más péptidos macrocíclicos con diferentes especificidades de unión, en ese caso, la dosis de cada compuesto administrado cae dentro de los rangos indicados. Los compuestos generalmente se administran en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis individuales pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica midiendo los niveles sanguíneos de péptido macrocíclico para el antígeno diana en el paciente. En algunas realizaciones, la dosificación se ajusta para conseguir una concentración plasmática de aproximadamente 1-1000.mu.g/ ml y en algunas realizaciones aproximadamente 25-300.mu.g/ ml.

Como alternativa, el péptido macrocíclico puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o termine, y hasta que el paciente muestre una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de eso, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin que sean tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de varios factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente divulgación empleadas, el éster, la sal o la amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados junto con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, el peso, la afección, estado de salud general e historial médico previo del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Una "dosificación terapéuticamente eficaz" de un péptido macrocíclico de la divulgación puede resultar en una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad, o una prevención del empeoramiento o discapacidad debido a la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores, una "dosis terapéuticamente eficaz" inhibe el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente 40 %, incluso más preferentemente en al menos aproximadamente el 60 %, y aún más preferentemente en al menos aproximadamente el 80 % en relación con sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral y/o VIH se puede evaluar en un sistema modelo animal de eficacia predictiva en tumores humanos o eficacia viral. Como alternativa, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para inhibir, dicha inhibición in vitro mediante ensayos conocidos por el profesional experto. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, disminuir la carga viral, o de lo contrario mejorar los síntomas en un sujeto. Un experto en la materia sería capaz de determinar tales cantidades en función de factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto, y la composición particular de la vía de administración seleccionada.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un kit farmacéutico de partes que comprende un péptido macrocíclico y otro inmumodulador, como se describe en este documento. El kit también puede comprender además instrucciones para el uso en el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (cáncer tal como se describe en este documento) y/o enfermedad antiviral.

Una composición de la presente divulgación se puede administrar a través de una o más vías de administración utilizando uno o más de diversos métodos conocidos en la técnica. Como apreciarán lo expertos en la materia, la vía y/o el modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferentes para los péptidos macrocíclicos de la divulgación incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral" como se usa este documento significa modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, generalmente mediante inyección e incluyen, sin limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal e infusión.

Como alternativa, un péptido macrocíclico de la divulgación se puede administrar a través de una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasalmente, por vía oral, vaginal, por vía rectal, sublingualmente o tópicamente.

Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o se conocen generalmente por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Robinson, J.R., ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1978).

Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferente, una composición terapéutica de la divulgación se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tales como los dispositivos desvelados en patentes de Estados Unidos n.° 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824, o 4.596.556. Ejemplos de implantes bien conocidos y módulos útiles en la presente divulgación incluyen: patente de Estados Unidos n.° 4.487.603, que desvela una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicamento a una tasa controlada; patente de Estados Unidos n.° 4.486.194, que desvela un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; patente de Estados Unidos n.° 4.447.233, que desvela una bomba de infusión de medicamento para suministrar medicamento a una tasa de infusión precisa; patente de Estados Unidos n.° 4.447.224, que desvela un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármaco; patente de Estados Unidos n.° 4.439.196, que desvela un sistema de administración osmótica de fármaco que tiene compartimentos multicámara; y patente de Estados Unidos n.° 4.475.196, que desvela un sistema de administración osmótica de fármaco. Estas patentes se incorporan en este documento por referencia. Muchos otros de estos implantes, sistemas de administración y módulos son conocidos por los expertos en la materia.

En ciertas realizaciones, los péptidos macrocíclicos de la divulgación pueden formularse para asegurar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHM) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos de la divulgación crucen la BBB (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 4.522.811, 5.374.548, y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más grupos que se transportan de manera selectiva en células u órganos específicos, mejorando así la administración dirigida de fármaco (véase, por ejemplo, Ranade, V.V., J. Clin. Pharmacol., 29:685 (1989)). Los restos de direccionamiento de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 5.416.016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 153:1038 (1988)); péptidos macrocíclicos (Bloeman, P.G. et al., FEBS Lett., 357:140 (1995); Owais, M. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 39:180 (1995)); receptor A de proteína tensioactiva (Briscoe et al., Am. J. Physiol., 1233:134 (1995)); p120 (Schreier et al., J. Biol. Chem., 269:9090 (1994)); véase también Keinanen, K. et al., FEBS Lett., 346:123 (1994); Killion, J.J. et al., Immunomethods 4:273 (1994).

Usos y métodos de la divulgación

Los péptidos macrocíclicos, las composiciones y los usos de la presente divulgación tienen numerosas utilidades in vitro e in vivo que implican, por ejemplo, detección de PD-L1 o mejora de la respuesta inmunitaria por bloqueo de PD-L1. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para mejorar inmunidad en diversas situaciones. Por tanto, en un aspecto, la divulgación proporciona el péptido macrocíclico de la divulgación para su uso en la modificación de una respuesta inmunitaria en un sujeto. Preferentemente, la respuesta mejora, se estimula o se regula al alza. En otros aspectos, el péptido macrocíclico puede tener actividad de unión a anti macaco cynomolgus, anti ratón y/o anti marmota y terapéutica.

Como se usa en este documento, el término "sujeto" pretende incluir seres humanos y animales no humanos. Animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, marmota, anfibios y reptiles, aunque se prefieren los mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas y caballos. Sujetos preferentes incluyen pacientes humanos que necesitan mejora de una respuesta inmunitaria. Las realizaciones son particularmente adecuadas para tratar pacientes humanos que tienen un trastorno que puede tratarse aumentando la respuesta inmunitaria mediada por linfocito T. En una realización particular, las realizaciones son particularmente adecuadas para el tratamiento de células cancerosas in vivo. Para lograr la mejora específica a antígeno de la inmunidad, se pueden administrar los péptidos macrocíclicos junto con un antígeno de interés. Cuando los péptidos macrocíclicos se administran a PD-L1 junto con otro agente, los dos se pueden administrar en cualquier orden o simultáneamente.

La divulgación proporciona además métodos para detectar la presencia de antígeno PD-L1 humano, de marmota, macaco cynomolgus y/o ratón en una muestra, o medir la cantidad de antígeno PD-L1 humano, de marmota, macaco cynomolgus y/o ratón, que comprenden poner en contacto la muestra y una muestra de control, con un péptido macrocíclico de referencia que se une específicamente a PD-L1 humano, de marmota, macaco cynomolgus y/o ratón, en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el macrociclo y el PD-L1 humano, de marmota, macaco cynomolgus y/o ratón. A continuación, se detecta la formación de un complejo, en donde una diferencia en la formación del complejo entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativa de la presencia de antígeno PD-L1 humano, de marmota, macaco cynomolgus y/o ratón en la muestras.

Dada la unión específica de los péptidos macrocíclicos de la divulgación para PD-L1, en comparación con CD28, ICOS y CTLA-4, los péptidos macrocíclicos de la divulgación pueden usarse para detectar específicamente la expresión de PD-L1 sobre la superficie de las células y, además, pueden usarse para purificar PD-L1 mediante purificación por inmunoafinidad.

Cáncer

El bloqueo de PD-1 por péptidos macrocíclicos puede mejorar la respuesta inmunitaria a las células cancerosas en el paciente. El ligando para PD-1, PD-L1, no se expresa en células humanas normales, pero es abundante en diversos cánceres humanos (Dong et al., Nat. Med., 8:787-789 (2002)). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución de linfocitos infiltrantes de tumores, una disminución en la proliferación mediada por receptores de linfocitos T, y evasión inmunitaria por las células cancerosas (Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287 (2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10:5094-5100 (2004)). La supresión inmunitaria puede invertirse inhibiendo la interacción local de PD-1 a PD-L1 y el efecto es aditivo cuando la interacción de PD-1 a PD-L2 también se bloquea (Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266 (2003)). Si bien los estudios anteriores han demostrado que la proliferación de linfocitos T puede restaurarse inhibiendo la interacción de PD-1 a PD-L1, no ha habido informes de un efecto directo sobre el crecimiento tumoral del cáncer in vivo al bloquear la interacción PD-1/PD-L1. En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un péptido macrocíclico para su uso en el tratamiento de un sujeto in vivo de modo que se inhibe el crecimiento de los tumores cancerosos. Un péptido macrocíclico puede usarse solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Como alternativa, se puede usar un péptido macrocíclico junto con otros agentes inmunogénicos, tratamientos estándar contra el cáncer, u otros péptidos macrocíclicos, como se describe a continuación.

Por tanto, en una realización, la divulgación proporciona un péptido macrocíclico de acuerdo con la invención para su uso en la inhibición del crecimiento de células tumorales en un sujeto.

Los cánceres preferentes cuyo crecimiento puede inhibirse mediante los péptidos macrocíclicos de la divulgación incluyen normalmente cánceres sensibles a la inmunoterapia. Los ejemplos no limitativos de cánceres preferentes para el tratamiento incluyen melanoma (por ejemplo, melanoma metastásico maligno), carcinoma de células renales (por ejemplo, carcinoma de células claras), cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata refractarios a hormonas y cáncer de próstata resistente a la castración), cáncer de mama, cáncer colorrectal y cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón escamoso y no escamoso no microcítico). Adicionalmente, la divulgación incluye tumores malignos recurrentes o refractarios cuyo crecimiento puede inhibirse usando los péptidos macrocíclicos de la divulgación.

Los ejemplos de otros cánceres que pueden tratarse usando las realizaciones de la divulgación incluyen cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago/gástrico, cáncer de testículo, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemias crónicas o agudas, incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de linfocitos T, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo aquellos inducidos por amianto, y combinaciones de dichos cánceres. La presente divulgación también es útil para el tratamiento de cánceres metastásicos, especialmente cánceres metastásicos que expresan PD-L1 (Iwai et al., Int. Immunol., 17:133-144 (2005)).

Opcionalmente, péptidos macrocíclicos para PD-L1 pueden combinarse con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células, y células transfectadas con genes que codifican citoquinas estimulantes inmunitarias (He et al., J. Immunol., 173:4919-4928 (2004)). Los ejemplos no limitativos de vacunas tumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citoquina GM-CSF (analizado con más detalle más adelante).

En seres humanos, se ha demostrado que algunos tumores son inmunogénicos tales como melanomas. Se anticipa que al elevar el umbral de activación de linfocitos T por bloqueo de PD-L1, podemos esperar activar respuestas tumorales en el huésped.

El bloqueo de PD-L1 es probable que sea más eficaz cuando se combina con un protocolo de vacunación. Se han ideado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores (véase Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300 302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000); véase también Restifo, N. et al., Cancer Vaccines, Capítulo 61, pág. 3023-3043, en DeVita, V. et al., eds., Cancer: Principles and Practice of Oncology, quinta edición (1997)). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna usando células tumorales autólogas o alogénicas. Se ha demostrado que estas vacunas celulares son más eficaces cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que GM-CSF es un potente activador de la presentación de antígenos para la vacunación de tumores (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3539-3543 (1993)).

El estudio de la expresión génica y los patrones de expresión génica a gran escala en varios tumores ha conducido a la definición de los llamados antígenos específicos de tumor (Rosenberg, S.A., Immunity, 10:281-287 (1999)). En muchos casos, estos antígenos específicos de tumor son antígenos diferenciados expresados en los tumores y en la célula de donde surgió el tumor, por ejemplo, antígenos de melanocitos gp100, antígenos MAGE y Trp-2. Más importante aún, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son las dianas de linfocitos T específicos de tumor encontrados en el huésped. El bloqueo de PD-L1 se puede usar junto con una colección de proteínas recombinantes y péptidos expresados en un tumor para generar una respuesta inmunitaria a estas proteínas. Estas proteínas son normalmente vistas por el sistema inmunitario como antígenos propios y, por lo tanto, son tolerantes a ellos. El antígeno tumoral también puede incluir la proteína telomerasa, que se requiere para la síntesis de telómeros de cromosomas y que se expresa en más del 85 % de los cánceres humanos y solo en un número limitado de tejidos somáticos (Kim, N et al., Science, 266:2011-2013 (1994)). (Estos tejidos somáticos pueden protegerse del ataque inmunitario por diversos medios). El antígeno tumoral también puede ser "neoantígenos" expresados en células cancerosas debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia de proteínas o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-abl en el cromosoma Filadelfia), o idiotipo de tumores de linfocitos B.

Otras vacunas de tumores pueden incluir las proteínas de virus implicados en cánceres humanos tales como virus del papiloma humano (HPV), Virus de la hepatitis (VHB y VHC) y Virus del sarcoma de herpes de Kaposi (KHSV). Otra forma de antígeno específico de tumor que se puede usar junto con el bloqueo de PD-L1 es proteínas de choque térmico (HSP) purificadas aisladas del tejido tumoral. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas HSP son altamente eficaces en la administración a las células presentadoras de antígeno para inducir inmunidad tumoral (Suot, R. et al., Science, 269:1585-1588 (1995); Tamura, Y. et al., Science, 278:117-120 (1997)).

Las células dendríticas (DC) son potentes células presentadoras de antígeno que pueden usarse para preparar respuestas específicas de antígeno. Las DC pueden producirse ex vivo y cargarse con diversos antígenos de proteínas y péptidos, así como extractos de células tumorales (Nestle, F. et al., Nat. Med., 4:328-332 (1998)). Las DC también pueden ser transducidas por medios genéticos para expresar también estos antígenos tumorales. Las DC también se han fusionado directamente a las células tumorales para fines de inmunización (Kugler, A. et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000)). Como método de vacunación, La inmunización con DC puede combinarse eficazmente con el bloqueo de PD-L1 para activar respuestas antitumorales más potentes.

El bloqueo de PD-L1 también se puede combinar con tratamientos estándar contra el cáncer. El bloqueo de PD-L1 puede combinarse eficazmente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, puede ser posible reducir la dosis del reactivo quimioterapéutico administrado (Mokyr, M. et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)). Un ejemplo de tal combinación es un péptido macrocíclico junto con la descarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo de tal combinación es un péptido macrocíclico junto con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. El fundamento científico detrás del uso combinado de bloqueo de PD-L1 y quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería dar lugar a niveles aumentados de antígeno tumoral en la ruta de presentación del antígeno. Otras terapias combinadas que pueden dar como resultado una sinergia con el bloqueo de PD-L1 a través de la muerte celular son la radiación, cirugía y privación de hormonas. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el huésped. Los inhibidores de la angiogénesis también pueden combinarse con el bloqueo de PD-L1. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de células tumorales que pueden alimentar el antígeno tumoral en las rutas de presentación del antígeno huésped.

Los péptidos macrocíclicos que bloquean PD-L1 también pueden usarse junto con péptidos macrocíclicos biespecíficos que dirigen células efectoras que expresan receptores de Fc alfa o Fc gamma a células tumorales (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos. n.° 5.922.845 y 5.837.243). Se pueden usar péptidos macrocíclicos biespecíficos para dirigir dos antígenos separados. Por ejemplo, se han usado péptidos macrocíclicos biespecíficos del receptor anti-Fc/antígeno antitumoral (por ejemplo, Her-2/neu) para dirigir macrófagos a sitios de tumor. Este direccionamiento puede activar más eficazmente las respuestas tumorales específicas. El brazo de linfocitos T de estas respuestas se vería aumentado por el uso del bloqueo de PD-L1. Como alternativa, el antígeno puede administrarse directamente a las DC mediante el uso de péptidos macrocíclicos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y un marcador de superficie celular específico de células dendríticas.

Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del huésped por una gran diversidad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser superados por la inactivación de proteínas que son expresadas por los tumores y que son inmunosupresoras. Estos incluyen entre otros TGF-beta (Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163:1037-1050 (1986)), IL-10 (Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200 (1992)), y ligando Fas (Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996)). Los péptidos macrocíclicos para cada una de estas entidades pueden usarse junto con anti-PD-LI para contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y favorecer las respuestas inmunitarias tumorales por parte del huésped.

Se pueden usar otros péptidos macrocíclicos que pueden activar la respuesta inmunitaria del huésped junto con anti-PD-Ll. Estos incluyen moléculas en la superficie de las células dendríticas que activan la función DC y la presentación del antígeno. Los péptidos macrocíclicos anti-CD40 pueden sustituir eficazmente la actividad auxiliar de los linfocitos T (Ridge, J. et al., Nature, 393:474--478 (1998)) y pueden usarse junto con anticuerpos PD-1 (Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000)). Péptidos macrocíclicos activantes para moléculas coestimuladoras de linfocitos T tales como CTLA-4 (por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 5.811.097), OX-40 (Weinberg, A. et al., Immunol., 164:2160-2169 (2000)), 4-1BB (Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997), e ICOS (Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999)) pueden proporcionar también niveles aumentados de activación de linfocitos T.

El trasplante de médula ósea se utiliza actualmente para tratar diversos tumores de origen hematopoyético. Mientras que la enfermedad del injerto contra huésped es una consecuencia de este tratamiento, el beneficio terapéutico puede obtenerse a partir de respuestas de injerto frente a tumor. El bloqueo de PD-L1 se puede usar para aumentar la eficacia de los linfocitos T específicos de tumor injertados de donante.

También hay varios protocolos de tratamiento experimental que involucran activación y expansión ex vivo de linfocitos T específicos de antígeno y transferencia adoptiva de estas células en receptores para linfocitos T específicos de antígeno contra tumor (Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999)). Estos métodos también pueden usarse para activar las respuestas de los linfocitos T a agentes infecciosos tales como CMV. Se puede esperar que la activación ex vivo en presencia de péptidos macrocíclicos aumente la frecuencia y la actividad de los linfocitos T transferidos adoptivamente.

Enfermedades infecciosas

Otros métodos de la divulgación se usan para tratar pacientes que han sido expuestos a toxinas o agentes patógenos particulares. Por tanto, otro aspecto de la divulgación proporciona un péptido macrocíclico de la presente divulgación para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto.

Similar a su aplicación a los tumores como se ha analizado anteriormente, El bloqueo de PD-L1 se puede usar solo, o como adyuvante, en combinación con vacunas, para estimular la respuesta inmunitaria a patógenos, toxinas y autoantígenos. Los ejemplos de agentes patógenos para los que este enfoque terapéutico puede ser particularmente útil, incluyen patógenos para los que actualmente no existe una vacuna eficaz, o patógenos para los cuales las vacunas convencionales son menos que completamente eficaces. Estos incluyen, pero sin limitación, VIH, Hepatitis (A, B, y C), gripe, Herpes, Giardia, Malaria (Butler, N.S. et al., Nature Immunology 13, 188-195 (2012); Hafalla, J.C.R., et al. PLo S Pathogens; 2 de febrero, 2012)), Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. El bloqueo de PD-L1 es particularmente útil contra infecciones establecidas por agentes tales como VIH que presentan antígenos alterados durante el curso de las infecciones. Estos nuevos epítopos se reconocen como extraños en el momento de la administración de anti-PD-L1 humano, provocando así una fuerte respuesta de linfocitos T que no se ve atenuada por señales negativas a través de PD-L1.

Algunos ejemplos de virus patógenos que causan infecciones tratables mediante realizaciones de la divulgación incluyen VIH, hepatitis (A, B o C), virus del herpes (por ejemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, y CMV, virus Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, cornovirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus de molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arboviral.

Algunos ejemplos de bacterias patógenas que causan infecciones tratables mediante realizaciones de la divulgación incluyen clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos y conococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis, y bacterias de enfermedad de Lyme.

Algunos ejemplos de hongos patógenos que causan infecciones tratables mediante realizaciones de la divulgación incluyen Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.

Algunos ejemplos de parásitos patógenos que causan infecciones tratables mediante realizaciones de la divulgación incluyen Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi y Nippostrongylus brasiliensis.

En todas las realizaciones anteriores, el bloqueo de PD-L1 puede combinarse con otras formas de inmunoterapia tales como tratamiento con citoquinas (por ejemplo, interferones, agentes dirigidos a actividad de VEGF o receptores de VEGF, GM-CSF, G-CSF, IL-2) o terapia de anticuerpos biespecíficos, que proporciona una presentación de antígenos tumorales mejorada (véase, por ejemplo, Holliger, Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa , 90:6444-6448 (1993); Poljak, Structure, 2:1121-1123 (1994)).

Reacciones autoinmunitarias

Los péptidos macrocíclicos pueden provocar y amplificar respuestas autoinmunitarias. De hecho, la inducción de respuestas antitumorales usando vacunas de células tumorales y péptidos revela que muchas respuestas antitumorales implican anti-reactividades (despigmentación observada en el melanoma B16 modificado con anti-CTLA-4+GM-CSF en van Elsas et al., véase anteriormente; despigmentación en ratones vacunados con Trp-2 (Overwijk, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2982-2987 (1999)); prostatitis autoinmune provocada por vacunas de células tumorales TRAMP (Hurwitz, A., véase anteriormente (2000)), vacunación de antígeno de péptido de melanoma y vitíligo observado en ensayos clínicos en humanos (Rosenberg, S.A. et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol., 19(1):81-84 (1996)).

Por lo tanto, es posible considerar el uso del bloqueo anti-PD-Ll junto con varias proteínas propias para idear protocolos de vacunación para generar de manera eficaz respuestas inmunitarias contra estas proteínas propias para el tratamiento de la enfermedad. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer implica una acumulación inapropiada de péptido A.beta. en depósitos amiloides en el cerebro; las respuestas de anticuerpos contra el amiloide son capaces de eliminar estos depósitos amiloides (Schenk et al., Nature, 400:173-177 (1999)).

También se pueden usar otras proteínas propias como dianas tales como IgE para el tratamiento de alergia y asma, y TNF.alfa para artritis reumatoide. Finalmente, las respuestas de anticuerpos a diversas hormonas pueden ser inducidas mediante el uso de los macrociclos desvelados en este documento. Para la anticoncepción se pueden utilizar respuestas de anticuerpos neutralizantes a hormonas reproductivas. La respuesta de anticuerpos neutralizantes a hormonas y otros factores solubles que se requieren para el crecimiento de tumores particulares también pueden considerarse como posibles dianas de vacunación.

Las realizaciones análogas como se ha descrito previamente para el uso de macrociclos anti-PD-Ll pueden usarse para la inducción de respuestas autoinmunitarias terapéuticas para tratar pacientes que tienen una acumulación inapropiada de otros autoantígenos, tales como depósitos amiloides, incluyendo A-beta en la enfermedad de Alzheimer, citoquinas tales como TNF.alfa., e IgE.

Vacunas

Los péptidos macrocíclicos pueden usarse para estimular respuestas inmunitarias específicas de antígeno mediante la administración conjunta de un macrociclo anti-PD-1 con un antígeno de interés (por ejemplo, una vacuna). Por tanto, en otro aspecto, la divulgación proporciona (i) el antígeno; y (ii) un macrociclo anti-PD-1 para su uso en mejorar una respuesta inmunitaria a un antígeno en un sujeto. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno. Los ejemplos no limitativos de tales antígenos incluyen los analizados en las secciones anteriores, tales como los antígenos tumorales (o vacunas tumorales) analizados anteriormente, o antígenos de los virus, bacterias u otros patógenos descritos anteriormente.

Vías adecuadas para administrar las composiciones (por ejemplo, péptidos macrocíclicos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la divulgación in vivo e in vitro se conocen bien en la técnica y pueden seleccionarse por los expertos en la materia. Por ejemplo, las composiciones pueden administrarse por inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea). Las dosis adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y la concentración y/o formulación de la composición.

Como se describió previamente, los péptidos macrocíclicos de la divulgación pueden administrarse conjuntamente con otro agente terapéutico más, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. El péptido puede estar unido al agente (como un inmunocomplejo) o puede administrarse por separado del agente. En el último caso (administración separada), el péptido se puede administrar antes, después de o simultáneamente con el agente o puede administrarse conjuntamente con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia anticancerosa, por ejemplo, radiación. Dichos agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como doxorrubicina (adriamicina), cisplatino bleomicina sulfato, carmustina, clorambucilo, descarbazina y ciclofosfamida hidroxiurea que, por sí solos, son solamente eficaces a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino se administra por vía intravenosa como una dosis de 100 mg/dosis una vez cada cuatro semanas y la adriamicina se administra por vía intravenosa como una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La administración conjunta de los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticancerígenos que operan a través de diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxico para las células tumorales humanas. Dicha administración conjunta puede resolver problemas debido al desarrollo de resistencia a fármacos o un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que las haría no reactivas con los péptidos.

Dentro del alcance de la presente divulgación también se encuentran kits que comprenden las composiciones de la divulgación (por ejemplo, péptidos macrocíclicos, moléculas biespecíficas o multiespecíficas, o inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional, o uno o más péptidos macrocíclicos adicionales de la divulgación (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno PD-L1 distinto del macrociclo). Los kits incluyen normalmente una etiqueta que indica el uso pretendido del contenido del kit. El término etiqueta incluye cualquier material escrito o grabado suministrado en o con el kit, o que de otro modo acompaña al kit.

Terapia combinada

La combinación de los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación con otro antagonista de PD-L1 y otro inmunomodulador es útil para potenciar una respuesta inmunitaria contra una enfermedad hiperproliferativa. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para mejorar inmunidad en diversas situaciones.

El bloqueo de PD-L1 por péptidos macrocíclicos puede mejorar la respuesta inmunitaria a las células cancerosas en el paciente. Los cánceres cuyo crecimiento puede inhibirse usando los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación incluyen normalmente cánceres sensibles a la inmunoterapia. Los ejemplos representativos de cánceres para el tratamiento con la terapia combinada de la presente divulgación incluyen melanoma (por ejemplo, melanoma metastásico maligno), cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer pulmonar. Los ejemplos de otros cánceres que pueden tratarse usando las realizaciones de la presente divulgación incluyen cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemias crónicas o agudas, incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de linfocitos T, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo aquellos inducidos por amianto, y combinaciones de dichos cánceres. La presente divulgación también es útil para el tratamiento de cánceres metastásicos.

En ciertas realizaciones, la combinación de agentes terapéuticos que contienen al menos un péptido macrocíclico analizado en este documento puede administrarse simultáneamente como una composición única en un vehículo farmacéuticamente aceptable, o simultáneamente como composiciones separadas en donde cada agente puede administrarse secuencialmente. Por ejemplo, un segundo inmunomodulador y un péptido macrocíclico de la presente divulgación pueden administrarse secuencialmente, tal como el segundo inmunomodulador administrado primero y el péptido macrocíclico segundo, o el péptido macrocíclico administrado primero y el segundo inmunomodulador segundo. Además, si se administra secuencialmente más de una dosis de la terapia combinada, el orden de la administración secuencial se puede revertir o mantener en el mismo orden en cada momento de administración, las administraciones secuenciales pueden combinarse con administraciones concurrentes, o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, la primera administración de un segundo inmunomodulador y el péptido macrocíclico puede ser concurrente, la segunda administración puede ser secuencial con el segundo inmunomodulador primero y el péptido macrocíclico segundo, y la tercera administración puede ser secuencial con el péptido macrocíclico primero y el segundo inmunomodulador segundo, etc. Otro esquema de dosificación representativo puede implicar una primera administración que es secuencial con el péptido macrocíclico primero y el segundo inmunomodulador segundo, y las administraciones posteriores pueden ser concurrentes.

Opcionalmente, la combinación del péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador puede combinarse adicionalmente con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células, y células transfectadas con genes que codifican citoquinas estimulantes inmunitarias (He et al., J. Immunol., 173:4919-4928 (2004)). Los ejemplos no limitativos de vacunas tumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citoquina GM-CSF (analizado con más detalle más adelante).

Un péptido macrocíclico PD-L1 combinado y un segundo inmunomodulador pueden combinarse adicionalmente con un protocolo de vacunación. Se han ideado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores (véase Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000); véase también Restifo et al., Cancer Vaccines, Capítulo 61, pág. 3023-3043 en DeVita et al., eds., Cancer: Principles and Practice of Oncology, quinta edición (1997)). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna usando células tumorales autólogas o alogénicas. Se ha demostrado que estas vacunas celulares son más eficaces cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que GM-CSF es un potente activador de la presentación de antígenos para la vacunación de tumores (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3539-3543 (1993)).

El estudio de la expresión génica y los patrones de expresión génica a gran escala en varios tumores ha conducido a la definición de los llamados antígenos específicos de tumor (Rosenberg, Immunity, 10:281-287 (1999)). En muchos casos, estos antígenos específicos de tumor son antígenos de diferenciación expresados en los tumores y en la célula de la que se originó el tumor, por ejemplo, antígenos de melanocitos gp100, antígenos MAGE y Trp-2. Más importante aún, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son las dianas de linfocitos T específicos de tumor encontrados en el huésped. En ciertas realizaciones, se puede usar un péptido macrocíclico PD-L1 combinado y un segundo inmunomodulador junto con una colección de proteínas recombinantes y/o péptidos expresados en un tumor para generar una respuesta inmunitaria a estas proteínas. Estas proteínas son normalmente vistas por el sistema inmunitario como autoantígenos y son, por lo tanto, tolerantes a ello. El antígeno tumoral también puede incluir la proteína telomerasa, que se requiere para la síntesis de telómeros de cromosomas y que se expresa en más del 85 % de los cánceres humanos y solo en un número limitado de tejidos somáticos (Kim et al., Science, 266:2011-2013 (1994)). (Estos tejidos somáticos pueden protegerse del ataque inmunitario por diversos medios). El antígeno tumoral también puede ser "neoantígenos" expresados en células cancerosas debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia de proteínas o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-abl en el cromosoma Filadelfia), o idiotipo de tumores de linfocitos B.

Otras vacunas de tumores pueden incluir las proteínas de virus implicados en cánceres humanos tales como virus del papiloma humano (HPV), Virus de la hepatitis (VHB y VHC) y Virus del sarcoma de herpes de Kaposi (KHSV). Otra forma de antígeno específico de tumor que se puede usar junto con el bloqueo del péptido macrocíclico PD-L1 es proteínas de choque térmico (HSP) purificadas aisladas del tejido tumoral. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas HSP son altamente eficaces en la administración a las células presentadoras de antígeno para inducir inmunidad tumoral (Suot et al., Science, 269:1585-1588 (1995); Tamura et al., Science, 278:117-120 (1997)).

Las células dendríticas (DC) son potentes células presentadoras de antígeno que pueden usarse para preparar respuestas específicas de antígeno. Las DC pueden producirse ex vivo y cargarse con diversos antígenos de proteínas y péptidos, así como extractos de células tumorales (Nestle, et al., Nat. Med., 4:328-332 (1998)). Las DC también pueden ser transducidas por medios genéticos para expresar también estos antígenos tumorales. Las DC también se han fusionado directamente a las células tumorales para fines de inmunización (Kugler et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000)). Como método de vacunación, la inmunización con DC puede combinarse eficazmente con un péptido macrocíclico anti-PD-Ll combinado y un segundo inmunomodulador para activar respuestas antitumorales más potentes.

Un péptido macrocíclico anti-PD-Ll combinado y un inmunomodulador adicional también se pueden combinar con los tratamientos estándar contra el cáncer. Por ejemplo, una combinación de un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador puede combinarse eficazmente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, como se observa con la combinación de un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador, puede ser posible reducir la dosis de otro reactivo quimioterapéutico administrado con la combinación de la presente divulgación (Mokyr et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)). Un ejemplo de dicha combinación es una combinación de un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador además junto con la descarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo es una combinación de un péptido macrocíclico y un segundo agente inmunomodulador además junto con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. El fundamento científico detrás del uso combinado del péptido macrocíclico PD-L1 y otro inmunomodulador con quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería dar lugar a niveles aumentados de antígeno tumoral en la ruta de presentación del antígeno. Otras terapias combinadas que pueden dar como resultado una sinergia con un péptido macrocíclico combinado anti-PD-Ll y un inmunomodulador adicional a través de la muerte celular incluyen radiación, cirugía, o privación hormonal. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el huésped. Los inhibidores de la angiogénesis también se pueden combinar con un PD-L1 y segundo inmunomodulador combinados. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de las células tumorales, que también puede ser una fuente de antígeno tumoral para ser alimentado en las rutas de presentación del antígeno del huésped.

También se puede usar una combinación de PD-L1 y otro inmunomodulador junto con péptidos macrocíclicos biespecíficos que se dirigen a células efectoras que expresan receptores Fc.alfa. o Fc.gamma. a células tumorales (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos. n.° 5.922.845 y 5.837.243). Se pueden usar péptidos macrocíclicos biespecíficos para dirigir dos antígenos separados. Por ejemplo, se han usado péptidos macrocíclicos biespecíficos del receptor anti-Fc/antígeno antitumoral (por ejemplo, Her-2/neu) para dirigir macrófagos a sitios de tumor. Este direccionamiento puede activar más eficazmente las respuestas tumorales específicas. El brazo de linfocitos T de estas respuestas se aumentaría con el uso de un PD-L1 y un segundo inmunomodulador combinados. Como alternativa, el antígeno puede administrarse directamente a las DC mediante el uso de péptidos macrocíclicos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y un marcador de superficie celular específico de células dendríticas.

En otro ejemplo, se puede usar una combinación de un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador junto con agentes macrocíclicos antineoplásicos, tales como RITUXAN® (rituximab), HERCEPTIN® (trastuzumab), BEXXAR® (tositumomab), ZEVALIN® (ibritumomab), CAMPATH® (alemtuzumab), Linfocida (eprtuzumab), AVASTIN® (bevacizumab), y TARCEVA® (erlotinib), y similares. A modo de ejemplo y sin el deseo de quedar vinculados a teoría alguna, el tratamiento con un anticuerpo anticancerígeno o un anticuerpo anticancerígeno conjugado con una toxina puede conducir a la muerte de células cancerosas (por ejemplo, células tumorales), lo que potenciaría una respuesta inmunitaria mediada por la segunda diana de inmunomodulador o PD-L1. En una realización de ejemplo, un tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, un tumor canceroso) puede incluir un anticuerpo anticancerígeno junto con un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador simultáneamente o secuencialmente o cualquier combinación de los mismos, que puede potenciar una respuesta inmunitaria antitumoral por parte del huésped.

Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del huésped por una gran diversidad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser superados por la inactivación de proteínas, que se expresan por los tumores y que son inmunosupresoras. Estos incluyen, entre otros, TGF-.beta. (Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163:1037-1050 (1986)), IL-10 (Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200 (1992)), y ligando Fas (Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996)). En otro ejemplo, los anticuerpos para cada una de estas entidades pueden combinarse adicionalmente con un péptido macrocíclico y otro inmunomodulador para contrarrestar los efectos de los agentes inmunosupresores y favorecer las respuestas inmunitarias antitumorales por parte del huésped.

Otros agentes que pueden usarse para activar la respuesta inmunitaria del huésped pueden usarse además junto con un péptido macrocíclico de la presente divulgación. Estos incluyen moléculas en la superficie de las células dendríticas que activan la función DC y la presentación del antígeno. Los péptidos macrocíclicos anti-CD40 pueden sustituir eficazmente la actividad auxiliar de los linfocitos T (Ridge, J. et al., Nature, 393:474-478 (1998)) y pueden usarse junto con los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación, solos o junto con una combinación anti-CTLA-4 (Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000)). Péptidos macrocíclicos activantes para moléculas coestimuladoras de linfocitos T, tal como OX-40 (Weinberg, A. et al., Immunol., 164:2160-2169 (2000)), 4-1BB (Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997), e ICOS (Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999)) pueden proporcionar también niveles aumentados de activación de linfocitos T.

El trasplante de médula ósea se utiliza actualmente para tratar diversos tumores de origen hematopoyético. Mientras que la enfermedad del injerto contra huésped es una consecuencia de este tratamiento, el beneficio terapéutico puede obtenerse a partir de respuestas de injerto frente a tumor. Un péptido macrocíclico de la presente divulgación, ya sea solo o junto con otro inmunomodulador, se puede usar para aumentar la eficacia de los linfocitos T específicos de tumor injertados en el donante.

También hay varios protocolos de tratamiento experimental que involucran activación y expansión ex vivo de linfocitos T específicos de antígeno y transferencia adoptiva de estas células en receptores para linfocitos T específicos de antígeno contra tumor (Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999)). Estos métodos también pueden usarse para activar las respuestas de los linfocitos T a agentes infecciosos tales como CMV. Activación ex vivo en presencia de un péptido macrocíclico de la presente divulgación, ya sea solo o junto con otro inmunomodulador, cabe esperar que aumente la frecuencia y la actividad de los linfocitos T transferidos adoptivamente.

En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un péptido macrocíclico de la presente divulgación junto con una dosis subterapéutica de otro inmunomodulador para su uso en la alteración de un evento adverso asociado al tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador a un sujeto. Por ejemplo, las realizaciones de la presente divulgación proporcionan reducción de la incidencia de colitis o diarrea inducida por anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores mediante la administración de un esteroide no absorbible al paciente. Debido a que cualquier paciente que reciba un anticuerpo terapéutico inmunoestimulador está en riesgo de desarrollar colitis o diarrea inducida por dicho tratamiento, toda esta población de pacientes es adecuada para la terapia según las realizaciones de la presente divulgación. Aunque se han administrado esteroides para tratar la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) y prevenir las exacerbaciones de la IBD, no se han utilizado para prevenir (disminuir la incidencia de) IBD en pacientes que no han sido diagnosticados con IBD. Los efectos secundarios significativos asociados a esteroides, incluso esteroides no absorbibles, han desalentado el uso profiláctico.

En realizaciones adicionales, un péptido macrocíclico de la presente divulgación, ya sea solo o junto con otro inmunomodulador, se puede combinar además con el uso de cualquier esteroide no absorbible. Como se usa en este documento, un "esteroide no absorbible" es un glucocorticoide que exhibe un extenso metabolismo de primer paso tal que, después del metabolismo en el hígado, la biodisponibilidad del esteroide es baja, es decir, menos de aproximadamente 20 %. En una realización de la divulgación, el esteroide no absorbible es budesonida. La budesonida es un glucocorticosteroide de acción local, que se metaboliza ampliamente, principalmente por el hígado, después de la administración oral. ENTOCORT® EC (Astra-Zeneca) es una formulación oral de budesonida dependiente del tiempo y del pH desarrollada para optimizar la administración de fármacos al íleon y por todo el colon. ENTOCORT® EC está aprobado en los Estados Unidos para tratamiento de la enfermedad de Crohn leve a moderada que afecta al íleon y/o al colon ascendente. La dosis oral habitual de ENTOCORT® EC para el tratamiento de la enfermedad de Crohn es de 6 a 9 mg/día. ENTOCORT® EC se libera en los intestinos antes de ser absorbido y retenido en la mucosa intestinal. Una vez que pasa a través del tejido diana de la mucosa intestinal, ENTOCORT® Ec se metaboliza ampliamente por el sistema del citocromo P450 en el hígado a metabolitos con una actividad glucocorticoide insignificante. Por lo tanto, la biodisponibilidad es baja (alrededor del 10 %). La baja biodisponibilidad de budesonida da como resultado una proporción terapéutica mejorada en comparación con otros glucocorticoides con un metabolismo de primer paso menos extenso. Budesonida da como resultado menos efectos adversos, incluyendo menos supresión hipotalámicapituitaria, que los corticosteroides de acción sistémica. Sin embargo, la administración crónica de ENTOCORT® EC puede producir efectos glucocorticoides sistémicos tales como hipercorticismo y supresión suprarrenal. Véase Physicians' Desk Reference Supplement, 58a edición, 608-610 (2004).

En otras realizaciones adicionales, una combinación PD-L1 y otro inmunomodulador junto con un esteroide no absorbible pueden combinarse adicionalmente con un salicilato. Los salicilatos incluyen agentes 5-ASA tales como, por ejemplo: sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn); olsalazina (DIPENTUM®, Pharmacia & Upjohn); balsalazida (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); y mesalamina (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).

Dosificación y formulación

Un péptido adecuado de Fórmula I, o más específicamente un péptido macrocíclico descrito en este documento, puede administrarse a pacientes para tratar diabetes y otras enfermedades relacionadas, ya que el compuesto solo se mezcla con un vehículo aceptable en forma de formulaciones farmacéuticas. Los expertos en la materia de tratamiento de diabetes pueden determinar fácilmente la dosis y la vía de administración del compuesto a mamíferos, incluyendo seres humanos, que necesitan dicho tratamiento. La vía de administración puede incluir, pero sin limitación, administración oral, intraoral, rectal, transdérmica, bucal, intranasal, pulmonar, subcutánea, intramuscular, intradérmica, sublingual, intracolónica, intraocular, intravenosa, o intestinal. El compuesto se formula según la vía de administración basada en una práctica farmacéutica aceptable (Fingl et al., en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Capítulo 1, pág. 1 (1975); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)).

Las composiciones peptídicas farmacéuticamente aceptables descritas en este documento pueden administrarse en múltiples formas de dosificación tales como comprimidos, cápsulas (cada una de las cuales incluye formulaciones de liberación sostenida o de liberación programada), píldoras, polvos, gránulos, elixires, geles in situ, microesferas, complejos cristalinos, liposomas, microemulsiones, tinturas, suspensiones, jarabes, pulverizaciones de aerosol y emulsiones. Las composiciones descritas en este documento también se pueden administrar en forma oral, intravenosa (bolo o infusión), intraperitoneal, subcutánea, transdérmica o intramuscular, usando todas las formas de dosificación bien conocidas por los expertos en la técnica farmacéutica. Las composiciones pueden administrarse solas, pero generalmente se administrarán con un vehículo farmacéutico seleccionado dependiendo de la vía de administración escogida y de la práctica farmacéutica convencional.

El régimen de dosificación para las composiciones descritas en este documento, por supuesto, variará dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular y su modo y vía de administración; la especie, la edad, sexo, la salud, el estado médico y peso del receptor; la naturaleza y el alcance de los síntomas; la clase de tratamiento concurrente; la frecuencia del tratamiento; la vía de administración, la función renal y hepática del paciente y el efecto deseado. Un médico o un veterinario puede determinar y prescribir la cantidad eficaz del fármaco que es necesaria para prevenir, contrarrestar, o detener el progreso de la patología.

Como orientación general, la dosificación oral diaria del ingrediente activo, cuando se usa para los efectos indicados, variará entre aproximadamente 0,001 a 1.000 mg/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal por día, y lo más preferentemente entre aproximadamente 0,6 a 20 mg/kg/día. Por vía intravenosa, la dosis diaria del ingrediente activo cuando se usa para los efectos indicados oscilará entre 0,001 ng a 100,0 ng por minuto/por kg de peso corporal durante una infusión a velocidad constante. Dicha infusión intravenosa constante se puede administrar preferentemente a una velocidad de 0,01 ng a 50 ng por minuto por kg de peso corporal y lo más preferentemente de 0,01 ng a 10,0 mg por minuto por kg de peso corporal. Las composiciones descritas en este documento pueden administrarse en una dosis diaria única, o la dosis diaria total puede administrarse en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día. Las composiciones descritas en este documento también pueden administrarse mediante una formulación de depósito que permitirá la liberación sostenida del fármaco durante un período de días/semanas/meses, según se desee.

Las composiciones descritas en este documento pueden administrarse en forma intranasal mediante el uso tópico de vehículos intranasales adecuados, o mediante vías transdérmicas, usando parches cutáneos transdérmicos. Cuando se administra en forma de un sistema de administración transdérmica, la administración de la dosis será, por supuesto, continua en lugar de intermitente a lo largo del régimen de dosificación.

Las composiciones normalmente están administradas en una mezcla con diluyentes, excipientes o vehículos farmacéuticamente adecuados (denominados colectivamente en este documento como vehículos farmacéuticos) seleccionados adecuadamente con respecto a la forma de administración prevista, es decir, comprimidos orales, cápsulas, elixires, aerosoles generados con o sin propulsores y jarabes, y consistentes con las prácticas farmacéuticas convencionales.

Por ejemplo, para la administración oral en forma de un comprimido o una cápsula, el componente de fármaco activo puede combinarse con un vehículo inerte oral, vehículo inerte, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, tal como, sin limitación, lactosa, almidón, sacarosa, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, manitol y sorbitol; para la administración oral en forma líquida, los componentes de fármaco oral pueden combinarse con un vehículo inerte oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable tal como etanol, pero sin limitación, etanol, glicerol, y agua. Además, cuando se desee o sea necesario, se pueden incorporar también aglutinantes, lubricantes, agentes disgregantes y agentes colorantes adecuados en la mezcla. Los aglutinantes adecuados incluyen, pero sin limitación, almidón, gelatina, azúcares naturales tales como, pero sin limitación, glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como goma arábiga, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, y ceras. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen oleato sódico, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato sódico, y cloruro sódico. Los disgregantes incluyen, pero sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, y goma de xantano.

Las composiciones descritas en este documento también pueden administrarse en forma de sistemas mixtos de administración de micelas o liposomas, tales como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Los liposomas se pueden formar a partir de varios fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. Se pueden agregar potenciadores de permeación para mejorar la absorción del fármaco.

Dado que se sabe que los profármacos mejoran numerosas calidades deseables de los compuestos farmacéuticos (por ejemplo, solubilidad, biodisponibilidad, fabricación, etc.) los compuestos descritos en este documento se pueden administrar en forma de profármaco.

Las composiciones descritas en este documento también se pueden acoplar con polímeros solubles como vehículos de fármacos dirigibles. Dichos polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropilmetacrilamida-fenol, polihidroxietilaspartamidafenol u óxido de polietilen-polilisina sustituido con restos palmitoílo. Además, las composiciones descritas en este documento pueden combinarse con una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico y poliglicólico, poliépsilon caprolactona, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polihidropiranos, policianoacilatos y copolímeros de bloque de hidrogeles reticulados o anfipáticos.

Las formas de dosificación (composiciones farmacéuticas) adecuadas para la administración pueden contener de aproximadamente 0,01 miligramos a aproximadamente 500 miligramos de ingrediente activo por unidad de dosificación. En estas composiciones farmacéuticas el ingrediente activo estará habitualmente presente en una cantidad de aproximadamente el 0,5-95 % en peso basado en el peso total de la composición.

Las cápsulas de gelatina pueden contener el ingrediente activo y vehículos en polvo, tales como lactosa, almidón, derivado de celulosa, estearato de magnesio y ácido esteárico. Para elaborar comprimidos compactados pueden usarse diluyentes similares. Tanto los comprimidos como las cápsulas pueden fabricarse como productos de liberación sostenida para proporcionar la liberación continua de la medicación durante un periodo de horas. Los comprimidos pueden recubrirse con azúcar o con una película para ocultar cualquier sabor desagradable y proteger al comprimido de la atmósfera, o pueden tener un recubrimiento entérico para la disgregación selectiva en el tubo digestivo.

Las formas farmacéuticas líquidas para la administración oral pueden contener colorantes y saborizantes para aumentar la aceptación del paciente.

En general, agua, un aceite adecuado, solución salina, solución acuosa de dextrosa (glucosa) y soluciones de azúcares relacionados y glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicoles son vehículos adecuados para las soluciones parenterales. La solución para la administración parenteral contiene una sal soluble en agua del ingrediente activo, agentes estabilizantes adecuados y, si es necesario, tampones. Los agentes antioxidantes tales como, bisulfito de sodio, sulfito de sodio o ácido ascórbico, solos o combinados, son agentes estabilizantes adecuados. También se usan ácido cítrico y sus sales y EDTA sódico. Además, las soluciones parenterales pueden contener conservantes, tales como cloruro de benzalconio, metil- o propil-parabeno, y clorobutanol.

Se describen vehículos farmacéuticamente adecuados en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Decimonovena edición, Mack Publishing Company (1995), un texto de referencia en este campo.

Las formas farmacéuticas útiles representativas para la administración de los compuestos descritas en este documento pueden ilustrarse como sigue:

Cápsulas

Se puede preparar una gran cantidad de cápsulas unitarias llenando cápsulas de gelatina dura estándar de dos piezas con 100 miligramos de ingrediente activo en polvo, 150 miligramos de lactosa, 50 miligramos de celulosa, y 6 miligramos de estearato de magnesio.

Cápsulas de gelatina blanda

Una mezcla de ingrediente activo en un aceite digerible tal como aceite de soja, aceite de oliva o aceite de semilla de algodón puede prepararse e inyectarse por medio de una bomba de desplazamiento positivo en gelatina para formar cápsulas de gelatina blandas que contienen 100 miligramos del ingrediente activo. Las cápsulas deben lavarse y secarse.

Comprimidos

Pueden prepararse comprimidos mediante procedimientos convencionales para que la unidad de dosificación, por ejemplo, sea 100 miligramos de ingrediente activo, 0,2 miligramos de dióxido de silicio coloidal, 5 miligramos de estearato de magnesio, 275 miligramos de celulosa microcristalina, 11 miligramos de almidón y 98,8 miligramos de lactosa. Se pueden aplicar recubrimientos apropiados para aumentar la palatabilidad o retrasar la absorción.

Inyectable

Una formulación inyectable de una composición peptídica descrita en este documento puede no requerir el uso de excipientes tales como los que han sido aprobados por organismos reguladores. Estos excipientes incluyen, pero sin limitación, disolventes y codisolventes, solubilizante, agentes emulgentes o espesantes, agentes quelantes, antioxidantes y agentes reductores, conservantes antimicrobianos, tampones y agentes de ajuste de pH, agentes de carga, protectores y ajustadores de tonicidad y aditivos especiales. Una formulación inyectable tiene que ser estéril, libre de pirógenos, en el caso de soluciones, libre de material particulado.

Una composición parenteral adecuada para administración por inyección puede prepararse agitando, por ejemplo, 1,5 % en peso de ingrediente activo en un tampón farmacéuticamente aceptable que puede no contener un codisolvente u otro excipiente. La solución debe hacerse isotónica con cloruro sódico y esterilizada.

Las abreviaturas usadas en la presente solicitud, incluidas particularmente en los siguientes ejemplos ilustrativos, son bien conocidas por los expertos en la materia. Algunas de las abreviaturas usadas son las siguientes: HOBt para hidroxibenzotriazol; HOAt para 1-hidroxi-7-azabenzotriazol; DIC para N,N'-diisopropilcarbodiimida; HBTU para hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; BOP para hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitris-(dimetilamino)-fosfonio; PyBOP para hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tripirrolidinofosfonio; TIS o TIPS para triisopropilsilano; DMSO para dimetilsulfóxido; DCM para diclorometano; min para minutos; h para horas; TA para temperatura ambiente; TR para tiempo de retención; FMOC para 9-fluorenilmetiloxicarbonilo; TFA para ácido trifluoracético; Et para etilo; DIEA o DIPEA para diisopropiletilamina; DMF para N,N-dimetilformamida; HCTU para hexafluorofosfato de O-(6-clorobenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio; y HATU para hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio.

Suspensión

Se puede preparar una suspensión acuosa para administración oral y/o parenteral de modo que, por ejemplo, cada 5 ml contenga 100 mg de ingrediente activo finamente dividido, 20 mg de carboximetil celulosa de sodio, 5 mg de benzoato de sodio, 1,0 g de solución de sorbitol, U.S.P., y 0,025 ml de vainillina u otro saborizante agradable al paladar.

Micropartículas biodegradables

Se puede preparar una composición parenteral de liberación sostenida adecuada para la administración por inyección, por ejemplo, disolviendo un polímero biodegradable adecuado en un disolvente, añadiendo a la solución de polímero el agente activo a incorporar, y eliminando el disolvente de la matriz formando así la matriz del polímero con el agente activo distribuido por toda la matriz.

Síntesis de péptidos

Se debe entender que el grupo -C(O)NH- puede estar orientado dentro de los conectores X y X' en cualquiera de las dos posibles orientaciones (por ejemplo, como -C(O)NH- o como -NHC(O)-) a menos que se indique lo contrario.

La descripción de la presente divulgación en este documento debe interpretarse de manera coherente con las leyes y principios de la unión química. Debe entenderse que los compuestos abarcados por la presente divulgación son aquellos que son estables de forma adecuada para su uso como agente farmacéutico. Por ejemplo, en compuestos de fórmula (I) mientras X es una cadena de entre 1 y 172 átomos en donde los átomos se seleccionan del carbono y el oxígeno y en donde la cadena puede contener uno, dos, tres o cuatros grupos seleccionados entre -NHC(O)NH-, y -C(O)NH- incrustados en el mismo; y en donde la cadena está opcionalmente sustituida con uno o seis grupos seleccionados independientemente de -CO2H, -C(O)NH2, -CH2C(O)NH2 y -(CH2)CO2, se debe entender que esto no incluye los compuestos donde los heteroátomos múltiples están unidos entre sí (es decir, -O-O- u O-NHC(O)NH-) ya que estos no se considerarían moléculas estables. En otro ejemplo, X no debe incluir compuestos en donde dos heteroátomos están separados solo por un carbono ya que este no se consideraría estable. Un experto en la materia sabrá qué compuestos serían o no estables en función de los principios generales del enlace químico y la estabilidad.

Puede realizarse síntesis química de un péptido macrocíclico de la presente divulgación utilizando varios métodos reconocidos en la técnica, incluyendo síntesis en fase sólida por etapas, semi-síntesis a través de los fragmentos peptídicos de re-ligadura asistida conformacionalmente, ligadura enzimática clonada o segmentos de péptidos sintéticos, y ligadura química. Un método preferente para sintetizar los péptidos macrocíclicos y sus análogos descritos en este documento es la síntesis química usando diversas técnicas de fase sólida tales como las descritas en Chan, W.C. et al., eds., Fmoc Solid Phase Synthesis, Oxford University Press, Oxford (2000); Barany, G. et al., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2: "Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A", pág. 3-284, Gross, E. et al., eds., Academic Press, Nueva York (1980); y en Stewart, J.M. et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, 2a Edición, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984). La estrategia preferente se basa en el grupo Fmoc (9-fluorenilmetil metiloxicarbonil) para la protección temporal del grupo a-amino, junto con el grupo terc-butilo para la protección temporal de las cadenas laterales de aminoácidos (véase por ejemplo Atherton, E. et al., "The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group", en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 9: "Special Methods in Peptide Synthesis, Parte C", pág.

1-38, Undenfriend, S. et al., eds., Academic Press, San Diego (1987).

Los péptidos pueden sintetizarse de manera gradual en un soporte de polímero insoluble (también denominado "resina") partiendo del extremo C-terminal del péptido. Se inicia una síntesis añadiendo el aminoácido C-terminal del péptido a la resina a través de la formación de un enlace amida o éster. Esto permite la liberación eventual del péptido resultante como una amida o ácido carboxílico C-terminal, respectivamente.

Se requiere que el aminoácido C-terminal y todos los demás aminoácidos utilizados en la síntesis tengan sus grupos a-amino y las funcionalidades de la cadena lateral (si están presentes) protegidas diferencialmente de manera que el grupo protector de a-amino pueda eliminarse selectivamente durante la síntesis. El acoplamiento de un aminoácido se realiza mediante la activación de su grupo carboxilo como éster activo y reacción del mismo con el grupo a-amino no bloqueado del aminoácido N-terminal unido a la resina. La secuencia de desprotección y acoplamiento del grupo a-amino se repite hasta que se ensambla toda la secuencia peptídica. El péptido se libera luego de la resina con la desprotección concomitante de las funcionalidades de la cadena lateral, generalmente en presencia de secuestradores apropiados para limitar las reacciones secundarias. El péptido resultante finalmente se purificó por HPLC de fase inversa.

La síntesis de las resinas de peptidilo requeridas como precursores de los péptidos finales utiliza resinas de polímero de poliestireno reticulado disponibles comercialmente (Novabiochem, San Diego, CA; Applied Biosystems, Foster City, CA). Los soportes sólidos preferentes son: resina 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxiacetil-p-metil benzhidrilamina (resina Rink amida MBHA); resina 9-Fmoc-amino-xanten-3-iloxi-Merrifield (resina Sieber amida); resina 4-(9-Fmoc)aminometil-3,5-dimetoxifenoxi)valeril-aminometil-Merrifield (resina PAL), para carboxamidas C-terminales. El acoplamiento del primer y posteriores aminoácidos puede realizarse usando HOBt, 6-Cl-HOBt o HOAt ésteres activos producidos a partir de DIC/HOBt, HBTU/HOBt, BOP, PyBOP, o de DIC/6-Cl-HOBt, HCTU, DIC/HOAt o HATU, respectivamente. Los soportes sólidos preferentes son: resina cloruro de 2-clorotritilo y resina 9-Fmoc-aminoxanten-3-iloxi-Merrifield (resina Sieber amida) para fragmentos peptídicos protegidos. La carga del primer aminoácido en la resina de cloruro de 2-clorotritilo se logra mejor haciendo reaccionar el aminoácido protegido con Fmoc con la resina en diclorometano y DIEA. Si fuera necesario, se puede agregar una pequeña cantidad de DMF para facilitar la disolución del aminoácido.

Las síntesis de los análogos de péptidos descritos en este documento pueden realizarse utilizando un sintetizador de péptidos único o multicanal, tal como un sintetizador CEM Liberty Microwave, o Protein Technologies, Inc. Prelude (6 canales) o Sintetizador Symphony (12 canales).

Los precursores de resina de peptidilo para sus péptidos respectivos se pueden escindir y desproteger mediante cualquier procedimiento estándar (véase, por ejemplo, King, D.S. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 36:255-266 (1990)). Un método deseado es el uso de TFA en presencia de agua y TIS como secuestradores. Normalmente, la resina de peptidilo se agita en TFA/agua/TIS (94:3:3, v:v:v; 1 ml/100 mg de resina de peptidilo) durante 2-6 horas a temperatura ambiente. La resina gastada se retiró por filtración después y la solución de TFA se concentra o seca a presión reducida. El péptido crudo resultante precipita y se lava con Et2O o se redisuelve directamente en DMSO o ácido acético acuoso al 50 % para purificación por HPLC preparativa.

Los péptidos con la pureza deseada se pueden obtener mediante purificación mediante HPLC preparativa, por ejemplo, en un Waters Modelo 4000 o en un cromatógrafo líquido Shimadzu Modelo LC-8A. La solución de péptido crudo se inyecta en una columna YMC S5 ODS (20X100 mm) y eluye con un gradiente lineal de MeCN en agua, ambos tamponados con 0,1 % de TFA, usando un caudal de 14-20 ml/min con monitorización de efluente por absorbancia UV a 220 nm. Las estructuras de los péptidos purificados se pueden confirmar mediante análisis MS por electronebulización.

Datos analíticos:

Espectrometría de Masas: "ESI-MS(+)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización realizada en modo ion positivo; "ESI-MS(-)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización realizada en modo ion negativo; "ESI-HRMS(+)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización de alta resolución realizada en modo ion positivo; "ESI-HRMS(-)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización de alta resolución realizada en modo ion negativo. Las masas detectadas se informan siguiendo las designación de unidades "m/z". Los compuestos con masas exactas mayores de 1000 se detectaron a menudo como iones de doble carga o triple carga.

Los análisis por espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) se realizaron en un espectrómetro de masas Fourier Transform Orbitrap (Exactive, Thermo Fisher Scientific, San José, CA) usando ionización por electronebulización positiva o negativa que funciona a 25.000 de resolución (máximo de anchura completa a media altura, FWHM). El instrumento se calibraba diariamente de acuerdo con las especificaciones del fabricante dando como resultado errores de precisión de masa <5 ppm. El programa informático operativo, Xcalibur, se usó para calcular los valores teóricos de masa a carga y para procesar los datos obtenidos.

Se usaron los siguientes protocolos de análisis y métodos de síntesis para los ejemplos 11058 y 11059.

Procedimientos generales:

Método Symphony X A:

Todas las manipulaciones se realizaron con automatización en un sintetizador de péptidos Symphony X (Protein Technologies). Todos los procedimientos se realizaron en un tubo de polipropileno de 10 ml equipado con una frita inferior. El tubo conecta al sintetizador de péptidos Symphony X a través tanto del fondo como de la parte superior del tubo. Pueden añadirse DMF y DCM a través de la parte superior del tubo, que lavan los lados del tubo por igual. Los reactivos restantes se agregan a través del fondo del tubo y pasan a través de la frita para contactar con la resina. Todas las soluciones se retiran a través del fondo del tubo. "Agitación periódica" describe un breve pulso de gas N2 a través de la frita inferior; el pulso dura aproximadamente 5 segundos y ocurre cada 30 segundos. Se usaron soluciones de cloruro de cloroacetilo en DMF en 24h de preparación. Las soluciones de aminoácidos generalmente no se usaron más de tres semanas después de la preparación. Las soluciones HATU se utilizaron dentro de los 5 días de preparación. DMF = dimetilformamida; HATU = 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio; DIPEA = diisopropiletilamina; Rink = (2,4-dimetoxifenil)(4-alcoxifenil)metanamina, donde "4-alcoxi" describe la posición y el tipo de conectividad a la resina de poliestireno. La resina usada es polímero Merrifield (poliestireno) con un conector Rink (Fomc-protegido en nitrógeno); malla 100-200, 1 % DVB, 0,56 mmol/g de carga. Los aminoácidos comunes usados se enumeran a continuación con los grupos protectores de cadena lateral indicados entre paréntesis. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH

Los procedimientos del "Método Symphony X A" describen un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, donde la escala se determina por la cantidad de conector Rink unido a la resina. Esta escala corresponde a aproximadamente 178 mg de la resina Rink-Merrifield descrita anteriormente. Todos los procedimientos se pueden escalar más allá de la escala de 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Antes del acoplamiento de aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptido comienzan con un procedimiento de hinchamiento de resina, descrito a continuación como "procedimiento de hinchamiento de resina". El acoplamiento de aminoácidos a una amina primaria N-terminal utilizó el "procedimiento de acoplamiento individual" que se describe a continuación. El acoplamiento de aminoácidos a una amina secundaria N-terminal usó el "procedimiento de acoplamiento doble" que se describe a continuación. El acoplamiento de cloruro de cloroacetilo al N-terminal del péptido es descrito por el "procedimiento de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo" detallado a continuación.

Procedimiento de hinchamiento de resina A:

A un recipiente de reacción de fase sólida de polipropileno de 10 ml se añadió resina Merrifield:Rink (178 mg, 0,100 mmol). La resina se lavó (hinchó) tres veces como sigue: al recipiente de reacción se añadió DMF (2,0 ml), posteriormente la mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos antes de drenar el disolvente a través de la frita.

Procedimiento de acoplamiento individual A:

Al recipiente de reacción que contenía resina de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 equiv.), después HATU (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 equiv.), y finalmente DIPEA (0,4 M en DMF, 1.0 ml, 4 equiv.). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió anhídrido acético (2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento doble A:

Al recipiente de reacción que contenía resina de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 equiv.), después HATU (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 equiv.), y finalmente DIPEA (0,4 M en DMF, 1.0 ml, 4 equiv.). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó dos veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 equiv.), después HATU (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 equiv.), y finalmente DIPEA (0,4 M en DMF, 1,0 ml, 4 equiv.). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó dos veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió anhídrido acético (2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de parada de aminoácido N-terminal Symphony:

Al recipiente de reacción que contenía la resina Rink de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 equiv.), después HATU (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 equiv.), y finalmente DIPEA (0,4 M en DMF, 1,0 ml, 4 equiv.). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió anhídrido acético (2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: para cada lavado, DCM (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se puso bajo una corriente de nitrógeno durante 15 minutos.

Procedimiento de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo A:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió DIPEA (0,4 M en DMF, 4,0 ml, 16 equiv.), después cloruro de cloroacetilo (0,8 M en DMF, 1,50 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 30 minutos, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, CH2Ch (2,0 ml) se añadió a la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se puso bajo una corriente de N2 durante 15 minutos.

Procedimiento de acoplamiento de ácido cloroacético A:

Al recipiente de reacción que contenía resina de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió ácido cloroacético (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 equiv.), después HATU (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 equiv.), y finalmente DIPEA (0,4 M en DMF, 1,0 ml, 4 equiv.). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: para cada lavado, DMF (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, CH2Ch (2,0 ml) se añadió a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se secó durante 5 minutos.

Método de desprotección global A:

Todas las manipulaciones se realizaron manualmente a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del "método de desprotección global A" describe un experimento realizado en una escala de 0,100 mmol, donde la escala se determina por la cantidad de conector Rink unido a la resina. El procedimiento se puede escalar más allá de la escala de 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Una "solución de desprotección" se preparó combinando en un vial de vidrio de 40 ml ácido trifluoroacético (22 ml), fenol (1,325 g), agua (1,25 ml) y triisopropilsilano (0,5 ml). La resina se retiró del recipiente de reacción y se transfirió a un vial de vidrio de 4 ml. Al vial se añadió la "solución de desprotección" (2,0 ml). La mezcla se mezcló vigorosamente en un agitador (1.000 RPM durante 1 minuto, después, 500 RPM durante 90 minutos). La mezcla se filtró a través de un tubo de polipropileno de 10 ml equipado con una frita inferior permitiendo la adición gota a gota a un tubo de ensayo de 24 ml que contenía 15 ml de éter etílico dando como resultado un precipitado blanco. Los sólidos (resina) en el tubo se extrajeron una vez con la "solución de desprotección" (1,0 ml) que permite la adición gota a gota al éter. La mezcla se centrifugó durante 7 minutos, después la solución se decantó de los sólidos y descartó. Los sólidos se suspendieron en Et2O (20 ml); después la mezcla se centrifugó durante 5 minutos; y la solución se decantó de los sólidos y descartó. Por última vez, los sólidos se suspendieron en Et2O (20 ml); la mezcla se centrifugó durante 5 minutos; y la solución se decantó de los sólidos y descartó para proporcionar el péptido crudo como sólido blanco a blanquecino.

Método de cidización A:

Todas las manipulaciones se realizaron manualmente a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del "método de ciclización A" describe un experimento realizado en una escala de 0,100 mmol, donde la escala se determina por la cantidad de conector Rink unido a la resina que se usó para generar el péptido. Esta escala no se basa en una determinación directa de la cantidad de péptido usada en el procedimiento. El procedimiento se puede escalar más allá de la escala de 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Los sólidos peptídicos crudos se disolvieron en metanol (10 ml) y, después, la solución se ajustó con cuidado a pH = 9,0-11 usando N,N-diisopropilamina. A continuación, la solución se dejó agitar durante al menos 18-24 horas. La solución de reacción se concentró y el residuo, después, se disolvió en MeOH. Esta solución de reacción se sometió a purificación por HPLC de fase inversa para proporcionar el péptido cíclico deseado.

Condiciones de análisis A:

Columna: X-Bridge C18, 2,0 x 50 mm, partículas de 3,5 pm; Fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0 % B, 0 100 % B durante 8 minutos, después, un mantenimiento de 1,0 minutos en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm.

Preparación de ácido (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-6-tetradecanamidohexanoico

A un matraz de fondo redondo cargado con ácido (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-6-aminohexanoico (3,0 g, 8,14 mmol), cloruro de miristoilo (2,435 ml, 8,96 mmol) y diclorometano (41 ml) se añadió N-ethil-N-isopropilpropan-2-amina (4,25 ml, 24,43 mmol). La suspensión inicial inmediatamente se volvió amarilla y después clara. Después de 10 minutos un sólido comienza a precipitar. La reacción se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con 20 ml de diclorometano y se echó en una solución de cloruro de amonio saturado. Las capas se separaron y la capa acuosa se lavó con una solución de metanol/cloroformo al 20 %. Los compuestos orgánicos se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron para dar un sólido amarillo pegajoso. El resto resultante se sometió a cromatografía en gel de sílice (gradiente de metanol/diclorometano 0-5 %) para proporcionar ácido (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-6-tetradecanamidohexanoico (2,87 g, 4,97 mmol, rendimiento del 61 %) como espuma amarilla. 1H RMN (400MHz, DMSO-da) 87,88 (dd, J=7,2, 4,1 Hz, 2H), 7,77-7,69 (m, 2H), 7,44-7,37 (m, 2H), 7,35-7,28 (m, 2H), 4,29-4,17 (m, 2H), 3,95-3,84 (m, 1H), 3,63-3,52 (m, 1H), 3,10 (c, J=7,4 Hz, 1H), 3,05-2,94 (m, 2H), 2,01 (t, J=7,4 Hz, 2H), 1,46 (d, J=6,8 Hz, 3H), 1,34 (dd, J=13,1, 5,0 Hz, 3H), 1,24-1,20 (m, 22H), 0,86-0,82 (m, 3H)

El ácido (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-6-palmitamidohexanoico estaba disponible comercialmente.

Etapa A:

Secuencia: Cys-Gly-[Resina Rink]

El ejemplo 11058 se preparó siguiendo las secuencias de síntesis generales compuestas de los siguientes procedimientos: "Método Symphony A: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony A: "Procedimiento de acoplamiento convencional" y "Procedimiento de parada de aminoácido N-terminal Symphony".

Etapa B:

A un vial de 20 ml que contenía la resina de la etapa 1 se añadió 5 ml de DMF para hinchar la resina. Después de 10 minutos, Se añadieron ácido (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-6-palmitamidohexanoico (0,116 g, 0,2 mmol), hexafluorofosfato de 2-(3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-il)-1,1,3,3-tetrametilisouronio (V) 0,2M en DMF (1,0 ml, 0,20 mmol), y N-etil-N-isopropilpropan-2-amina 0,4M en DMF (1,0 ml, 0,40 mmol). El vial se agitó durante toda la noche en el miniagitador.

La resina se aisló transfiriendo los contenidos del vial a un tubo de reacción de polipropileno de 10 ml y filtrando mediante filtración en vacío. La resina se lavó con 20 ml de DMF, 20 ml de diclorometano y 5 ml de éter etílico. La resina resultante se secó en vacío y se usó como una carga de 0,56 mmol.

Etapa C:

El ejemplo 11058 se completó en la etapa C siguiendo las secuencias sintéticas generales compuestas de los siguientes procedimientos: "Método Symphony A: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional", "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria B", "Procedimiento de acoplamiento de ácido cloroacético A", "Método de desprotección global A" y "Método de ciclización A".

El material crudo se purificó a través de LCMS preparativa con las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 30 x 100 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 15-100 % B durante 25 minutos, después, un mantenimiento de 5 minutos en 100 % B; Flujo: 30 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 7,6 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 98 %. Condiciones del análisis LCMS A: Tiempo de retención = 6,42 min; ESI-MS(+) m/z 1061,8 (M+2H); ESI-HRMS(+) m/z: Calculado: 1061,0839 (M+2H) Encontrado: 1061,0833 (M+2H).

Preparación del ejemplo 11059

El ejemplo 11059 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 11058, compuesta de los siguientes procedimientos: "Método Symphony A: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional", "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria A", "Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida", "Procedimiento de parada de aminoácido N-terminal Symphony", "Procedimiento de acoplamiento de ácido cloroacético A", "Método de desprotección global A" y "Método de ciclización A".

El material crudo se purificó a través de LCMS preparativa con las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 30 x 100 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 15-100 % B durante 25 minutos, después, un mantenimiento de 5 minutos en 100 % B; Flujo: 30 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 6,4 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 98 %. Condiciones del análisis LCMS A: Tiempo de retención = 5,74 min; ESI-MS(+) m/z 1048,0 (M+2H).

MÉTODOS PARA ENSAYAR LA CAPACIDAD DE LOS PÉPTIDOS MACROCÍCLICOS PARA COMPETIR POR LA UNIÓN DE PD-1 A PD-L1 UTILIZANDO ENSAYOS DE UNIÓN DE FLUORESCENCIA HOMOGÉNEA RESUELTA EN TIEMPO (HTRF)

La capacidad de los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación para unirse a PD-L1 se investigó mediante un ensayo de unión de fluorescencia homogénea resuelta en tiempo de PD-1/PD-L1 (HTRF).

Métodos

Ensayos de fluorescencia homogénea resuelta en tiempo (HTRF) de unión de PD-1 soluble a PD-L1 soluble. PD-1 soluble y PD-L1 soluble se refieren a proteínas con truncamientos del extremo carboxilo que eliminan las regiones transmembrana y se fusionan con secuencias heterólogas, específicamente la porción Fc de la secuencia de inmunoglobulina humana G (Ig) o la etiqueta del epítopo de hexahistidina (His). Todos los estudios de unión se realizaron en un tampón de ensayo HTRF que consiste en dPBS suplementado con albúmina de suero bovino al 0,1 % (p/v) y Tween-20 al 0,05 % (v/v). Para el ensayo de unión de PD-1-Ig/PD-L1-His, los inhibidores se preincubaron con PD-L1-His (final 10 nM) durante 15 m en 4 pl de tampón de ensayo, seguido de la adición de PD-1 -Ig (final 20 nM) en 1 pl de tampón de ensayo y una incubación adicional durante 15 m. Se utilizaron proteínas de fusión de PD-L1 humana, macacos cynomolgus, ratón, u otras especies. La detección de HTRF se logró usando el anticuerpo monoclonal anti-Ig marcado con criptato de europio (1 nM final) y el anticuerpo monoclonal anti-His marcado con aloficocianina (APC) (20 nM final). Los anticuerpos se diluyeron en tampón de detección de HTRF y se dispensaron 5 pl por encima de la reacción de unión. La reacción se dejó equilibrar durante 30 minutos y la señal (relación 665 nm/620 nm) se comprobó utilizando un fluorómetro EnVision. Se establecieron ensayos de unión adicionales entre PD-1-Ig/PD-L2-His (20 y 5 nM, respectivamente), CD80-His/PD-L1-Ig (100 y 10 nM, respectivamente) y CD80

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto seleccionado entre:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Un compuesto de la reivindicación 1 o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso en mejorar, estimular y/o aumentar la respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita.

3. Un compuesto de la reivindicación 1 o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso en inhibir crecimiento, proliferación o metástasis de células cancerosas en un sujeto que lo necesita.

4. Un compuesto de la reivindicación 1 o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto que lo necesita.

5. El compuesto o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, estando causada la enfermedad infecciosa por un virus.

6. Un compuesto de la reivindicación 1 o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de choque séptico en un sujeto que lo necesita.