ES2910923T3 - Dispositivo y método para la separación de fluidos por centrifugación en gradiente de densidad - Google Patents

Abstract

Un recipiente (1) de centrifugación que comprende un inserto (6), especialmente un tubo de ensayo, para la separación de líquidos en fracciones del rango de densidad deseado por centrifugación en gradiente de densidad, especialmente líquidos que constituyen suspensiones y/o fluidos biológicos, el inserto está equipado con una partición (7) adecuado para dividir el interior del recipiente (1) en al menos dos cámaras en disposición vertical - la cámara (2) superior y la cámara (3) inferior, caracterizada porque la partición (7) tiene una abertura (4) a la que se une una guía (12) por la que fluyen líquidos, especialmente fluido biológico, hacia la cámara (3) inferior del recipiente (1) de centrifugación, y dicha partición (7) está formado por dos superficies contiguas con aberturas, especialmente en forma de discos aplanados ajustados a la sección transversal del recipiente (1) con una sección transversal similar al círculo, las superficies están conectadas entre sí de forma móvil, pueden posicionarse libremente entre sí permitiendo el cierre del lumen de abertura (4).

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivo y método para la separación de fluidos por centrifugación en gradiente de densidad

La invención se refiere a un recipiente de centrifugación con un inserto ya un método de separación de fluidos que utiliza una centrifugación en gradiente de densidad. En particular, la invención se usa en la separación de fluidos corporales, por ejemplo, sangre de animales, incluidos los humanos, con fines de diagnóstico. La solución objeto de la invención pertenece al campo de los recipientes para laboratorio, y en especial de los tubos específicamente adaptados para la centrifugación. Otro aspecto de la invención se relaciona con el campo de la prueba o el análisis de materiales mediante la determinación de sus propiedades químicas, físicas o biológicas, e incluye particularmente el análisis de material biológico líquido, por ejemplo, sangre.

Estado de la técnica

La recolección, purificación, fraccionamiento y/o fijación de muestras de fluidos corporales, incluida la sangre, cumplen una función importante, por ejemplo, en diagnósticos médicos y ensayos clínicos. Para sistemas y métodos convencionales para recolectar muestras de sangre a gran escala, las muestras de sangre recolectadas del paciente pueden separarse en diferentes fracciones por centrifugación, filtración o elutriación, y luego almacenarse para uso posterior o pruebas adicionales. Los componentes sanguíneos separados normalmente contienen fracciones de glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas y plasma. La separación de la sangre en sus fracciones se puede realizar de forma continua, durante la extracción de sangre o en las etapas posteriores a su extracción. La separación de la sangre en diferentes componentes en condiciones altamente estériles es fundamental para muchas aplicaciones terapéuticas y para fines de investigación clínica.

Hay muchos métodos para separar la sangre en sus fracciones. Los métodos conocidos en el estado de la técnica requieren el uso de dispositivos médicos/de investigación especializados de última generación y personal altamente calificado para su correcto funcionamiento.

De la Solicitud de Patente Internacional No. WO8805331, existe una técnica conocida para la separación de glóbulos blancos (leucocitos) de glóbulos rojos (eritrocitos), que consiste en mezclar una muestra de sangre con una solución de trabajo que agrega glóbulos rojos y aumenta así su velocidad de sedimentación. La densidad de los fluidos de separación de trabajo se selecciona de modo que la sedimentación de los glóbulos blancos cambie mínimamente y que los glóbulos blancos no se sedimenten en el fondo y, como resultado, puedan tomarse de la parte superior del líquido separado después de los glóbulos rojos tienen sedimento en el fondo.

En otra técnica, en la que la solución de trabajo que agrega glóbulos rojos no se mezcla con sangre, la sangre se deposita en capas precisamente sobre las superficies de los fluidos de separación, después de lo cual los glóbulos rojos se aglutinan o agregan bajo el efecto del contacto superficial con los fluidos de separación de trabajo, como resultado de lo cual sedimentan en el fondo de ese tubo. Existen varios compuestos multipolímeros bien conocidos que aglutinan los glóbulos rojos, por ejemplo, FICOLL 400 (Pharmacia Fine Chemicals, Suecia). La separación de sangre puede ocurrir bajo la influencia de la gravedad o bajo la influencia de la centrifugación. La mayoría de los glóbulos blancos permanecen en la fase límite, pero estos sistemas desarrollados previamente no son efectivos para separar los glóbulos blancos en subpoblaciones, es decir, en poblaciones de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y leucocitos polimorfonucleares (PMN). En particular, existe una búsqueda en curso de un método de una sola etapa que utilice un medio de separación por densidad que permitiría la separación de células sanguíneas completas en subpoblaciones.

Para realizar la mencionada separación de glóbulos blancos en subpoblaciones, un método conocido es aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en base a un proceso de centrifugación, en el que la primera etapa utiliza la mezcla Isopaque-Ficoll (Nyegaard & Co., Noruega) que tiene el componente metrizoato de sodio, en la siguiente etapa, los neutrófilos polimorfonucleares se aíslan utilizando dextrano o gelatina, que provocan la sedimentación de los glóbulos rojos. Otro método utiliza gradientes de densidad discontinuos donde dos o más fluidos de separación de trabajo se vierten en capas uno encima del otro. Las densidades se seleccionan de modo que el gradiente (discontinuo) esté en el rango apropiado/requerido, ajustado a la densidad de las sustancias separadas.

Por otra parte, la solicitud de patente de EE.UU. No. US4824560 A divulga métodos y medios para centrifugar en un recipiente tubular que tiene al menos dos cámaras adyacentes que están conectadas entre sí por una estrecha abertura esencialmente capilar. Para el funcionamiento, el fluido de trabajo se coloca en la cámara inferior, mientras que el fluido a separar en fracciones se coloca en la cámara superior, y no es necesario tomar precauciones especiales para evitar que el líquido se mezcle antes de iniciar la centrifugación. Este método tiene varias ventajas sobre los métodos manuales descritos anteriormente, también tiene la desventaja debido a la estrecha conexión de ambas cámaras que constituye una barrera parcial, incluso durante la centrifugación. Esta barrera impide la etapa efectiva de células sanguíneas entre las cámaras e impide la separación de la sangre en fracciones.

La solicitud de patente US2014087360 A1 divulga un inserto para un tubo de centrífuga adecuado para su uso en la separación por gradiente de densidad. El inserto incluye un elemento dimensionado para encajar dentro del tubo para dividir el tubo en una parte superior y una parte inferior. Opcionalmente, el inserto tiene un soporte que se extiende o depende del miembro para posicionar el miembro dentro del tubo. Al menos dos aberturas están ubicadas en el miembro de modo que una primera abertura esté más cerca de un extremo inferior del tubo en relación con una segunda abertura cuando el inserto está colocado en el tubo centrífugo.

La patente US5314074 A divulga un inserto de capas dentro del recipiente que evita la retromezcla después de la centrifugación en gradiente de densidad. El inserto es capaz de soportar el cuerpo de dispersión líquida que se va a centrifugar en condiciones de gravedad normal y permite el flujo cruzado bidireccional durante la centrifugación.

La patente US5132232 A divulga un aparato para recoger muestras analíticas líquidas para su examen y separarlas de forma reproducible en dos o más fracciones. Un aparato utiliza un recipiente y un petter, dicho petter provisto de una parte superior que permite la unión al recipiente, una parte de retención inferior que incluye una abertura periférica, cuya parte sin orificios permite el ajuste de cuña en el recipiente, y una porción de cuerpo que conecta la porción superior de petter y la porción de retención inferior.

La patente US5648223 A divulga un tubo de centrifugación de trampa celular que contiene una solución de gradiente de densidad específica ajustada a una densidad específica para enriquecer las células tumorales de mama a partir de una mezcla de células. El tubo permite recolectar la población de células deseada por decantación después de la centrifugación para minimizar la pérdida de células y maximizar la eficiencia.

El problema que surge en los métodos de separación manual descritos anteriormente es la preparación de la muestra para este proceso y, en particular, en la estratificación de líquidos vertidos utilizados para la separación de diferente densidad y el material que se prueba, por ejemplo, sangre. Es importante que los fluidos no se mezclen entre sí y que se establezca una interfaz entre fluidos de diferentes densidades. Para lograr este estado, se han desarrollado varias técnicas y habilidades que permiten la estratificación adecuada de los fluidos de separación y la sangre, que en la mayoría de los casos se pipetean con cuidado en un recipiente para su posterior separación en fracciones mediante centrifugación en gradiente de densidad. Desafortunadamente, estos procedimientos son engorrosos, difíciles de realizar, introducen la posibilidad de errores humanos no controlados y, además, requieren personal altamente calificado, lo que está asociado con altos costes operativos, reduce la repetibilidad del procedimiento y evita la separación/división a gran escala.

El objetivo de la solución de acuerdo con la invención era obtener una herramienta para la separación rápida y parcialmente automatizada de fluidos en fracciones de diferentes densidades, por ejemplo, fluidos biológicos, incluida la sangre, que además permiten la purificación, el aislamiento y la fijación de muestras biológicas.

Definiciones

Dentro de la descripción de la invención y las reivindicaciones, los siguientes términos se entenderán de acuerdo con las siguientes definiciones:

el “recipiente” es cualquier recipiente de almacenamiento de líquidos que se adapta a la centrifugación, por ejemplo, tubos de centrífuga,

la “guía” es un elemento del inserto que dirige el flujo de líquido desde la cámara superior a la cámara inferior a través de la abertura en la partición, la guía debe tener un tamaño tal que permita que el líquido de prueba se acumule en el medio de separación en el fondo del recipiente. La guía, de acuerdo con la definición anterior, puede ser la pared del recipiente o una estructura diferente dentro del recipiente, por ejemplo, espiral, manga alargada, etc.

Descripción detallada de la invención

La esencia de la invención es un recipiente de centrifugación que comprende un inserto, especialmente un tubo de ensayo, para la separación de líquidos en fracciones del rango de densidad deseado por centrifugación en gradiente de densidad, especialmente líquidos que constituyen suspensiones y/o fluidos biológicos, el inserto está equipado con una partición adecuada para dividir el interior del recipiente en al menos dos cámaras en disposición vertical - la cámara superior y la cámara inferior, caracterizado porque la partición tiene una abertura a la que se une una guía, por la que fluyen líquidos, especialmente fluidos biológicos, hacia la cámara inferior del recipiente de centrifugación, y dicha partición está formada por dos superficies adyacentes con aberturas, especialmente en forma de discos aplanados encajados en la sección transversal del recipiente con una sección transversal similar al círculo, las superficies se conectan de forma móvil entre sí, se pueden colocar libremente entre sí permitiendo el cierre del lumen de abertura.

Preferiblemente, la guía es espiral, embudo o elementos vertical en la forma de un cilindro alargado.

Preferiblemente, la cámara superior del recipiente de centrifugación también tiene una partición o particiones verticales que la separan en subcámaras, teniendo cada una de las subcámaras una abertura.

La invención también incluye un método para separar una fracción con un rango de densidad deseado de una muestra que contiene fracciones de diferentes densidades, especialmente de una muestra biológica, que comprende: a) proporcionar un recipiente de centrifugación con un inserto para un recipiente de centrifugación, especialmente un tubo de ensayo, para la separación de líquidos en fracciones del rango de densidad deseado mediante centrifugación en gradiente de densidad, especialmente líquidos que constituyen suspensiones o fluidos biológicos,

b) llenar la cámara inferior del recipiente con un medio para la separación en un gradiente de densidad o llenar la cámara superior del recipiente con este medio, que luego fluye a través de la abertura en la partición a lo largo de la guía hasta la cámara inferior;

c) verter líquido para la separación que contenga fracciones de diferente densidad en la cámara inferior llenando la cámara superior o al menos una subcámara o uniendo la cámara superior al tabique, de modo que el líquido pueda fluir a través de la abertura en la partición en la guía y la capa en la superficie de los medios de separación en la cámara inferior;

d) centrifugación del recipiente hasta que la muestra de ensayo se separe en fracciones de diferentes densidades. Preferiblemente, la etapa (b) es seguido por una etapa o etapas adicionales b) que consisten en agregar un medio de separación de gradiente de densidad adicional, en el que la adición de medios posteriores es de mayor a menor densidad. Es igualmente ventajoso que, después de la etapa (d), fracciones seleccionadas de diferentes densidades del líquido que se está separando se sometan a pruebas y análisis, incluida la posibilidad de ser fijadas, especialmente por el método de congelación.

Preferiblemente, cuando la fracción se separa del líquido sanguíneo, las fracciones individuales del rango de densidad deseado contienen varios componentes sanguíneos, que incluyen: leucocitos (linfocitos y granulocitos), plaquetas, eritrocitos, células de la médula ósea (megacariocitos, eritroblastos), células suspendidas en homogeneizado que incluye células endoteliales, neuronas, hongos, virus, micropartículas que incluyen exosomas, fragmentos de células, orgánulos celulares que incluyen núcleos, mitocondrias, cloroplastos.

La invención también se refiere a un kit que comprende:

a) inserto (6) para el recipiente (1) para centrifugación, en particular el tubo, para la separación de líquidos en fracciones del rango de densidad deseado por centrifugación en gradiente de densidad, especialmente líquidos que constituyen suspensiones o fluidos biológicos, este dispositivo está equipado con una partición (7) que divide el interior del recipiente (1) en la cámara (2) superior y la cámara (3) inferior, la partición (7) tiene una abertura (4), y en la abertura hay una guía (12) sobre el cual fluyen fluidos, especialmente fluido separado, hacia la cámara (3) inferior del recipiente (1) para centrifugación,

b) al menos un medio de separación de gradiente de densidad.

Para una mejor comprensión, la invención se ilustra en la realización ilustrada en el dibujo que no es una limitación de la protección solicitada, en la que:

La Fig. 1 ilustra un recipiente en forma de tubo de centrifugación con un inserto, destinado a recoger líquidos, en particular material biológico, y luego para su separación, que - de acuerdo con la invención - permite la disposición en capas de líquidos colocados en el recipiente antes de la centrifugación;

Las figuras 2 y 3 ilustran una sección longitudinal y una vista lateral de un recipiente de tubos de centrifugación, respectivamente, en los que, para una mejor comprensión de la esencia de la invención, se separan el disco y la partición del inserto;

Las Fig. 4 y 5 ilustran la vista lateral y la sección longitudinal del recipiente en forma de tubo, respectivamente, con un lumen visible del tubo que se estrecha a medida que aumenta el espesor de la pared.

La Fig. 6 ilustra una sección transversal a través de un recipiente en forma de tubo en un ejemplo sin una partición vertical, pero con un canal de aire visible,

Las Fig. 7a y 7b ilustran una vista lateral y un corte transversal de la parte superior del inserto en forma de disco con una partición incompleta, respectivamente.

Las Fig. 8a y 8b ilustran una vista lateral y un corte transversal de la parte superior del inserto en forma de disco con tabique rectangular, respectivamente.

Las Fig. 9a y 9b ilustran una vista lateral y un corte transversal de la parte superior del inserto en forma de disco con una partición en forma de tres rectángulos, respectivamente.

Las Figs. 10a y 10b ilustran una vista lateral y una sección transversal de la parte superior del inserto en forma de disco con una partición en forma de dos rectángulos que se cruzan, respectivamente.

Las Figs. 11a y 11b ilustran una sección transversal y una vista lateral de una partición en forma de disco con muesca, respectivamente.

La Fig. 12 ilustra una realización de la solución de la invención en la que el inserto se coloca en un recipiente de centrifugación.

Las Fig. 13 y 13a ilustran el inserto, una sección transversal lateral y superior adaptada para conectar la cámara superior equipada con una guía en forma de cilindro alargado, respectivamente.

Las Fig. 14 y 14a ilustran el inserto, en sección transversal lateral y superior, equipado con una guía en forma de ocho cilindros alargados, respectivamente.

Las Fig. 15 y 15a ilustran el inserto, una sección transversal lateral y superior equipada con una guía en forma de espiral, respectivamente.

Las Fig. 16, 16a y 16b ilustran la sección transversal del inserto desde la vista lateral y superior, y la guía ampliada, equipada con una guía en forma de embudo, respectivamente.

Ejemplo 1

Como se muestra en la Fig. 1, en la primera realización, el inserto 6 de tubo para el recipiente de centrifugación consta de una partición 7 en forma de disco plano que se adhiere firmemente a las paredes internas del recipiente 1, y un disco 8 equipado con una partición 11 vertical completa. El inserto en este ejemplo se coloca dentro de un recipiente 1 que constituye un tubo de centrifugación de 0,23” de diámetro. El inserto 6 en este ejemplo está hecho de plástico, pero también podría estar hecho de otros materiales. Como se muestra en la Fig. 12, el inserto 6 también se puede colocar en un recipiente adicional que se puede unir al recipiente 1 de centrifugación, luego el inserto 6 está fuera del recipiente 1.

La pared del recipiente 1 en forma de tubo forma una guía 12 y se ensancha gradualmente en el recipiente 1 (figuras 4 y 5), al mismo tiempo que el lumen del tubo disminuye gradualmente hacia su parte inferior. En esta realización, la pared interna del recipiente 1 es una guía 12 que permite que los líquidos fluyan desde la cámara 2 superior a la cámara 3 inferior a través de la abertura 4. Los líquidos, especialmente los líquidos que son fluidos biológicos para la separación, fluyen hacia la parte inferior del recipiente 1 a lo largo de la guía 12, constituida por la pared del recipiente, y quedan dispuestas en capas en el fondo del recipiente 1. El flujo de líquido hacia abajo a lo largo de la guía 12 evita la agitación de los líquidos de separación, lo que podría causar errores en la separación de los líquidos probados.

En este ejemplo, la partición 7 tiene la forma de un disco plano con una sección transversal circular (Fig. 11a, Fig. 11 b) y su forma se ajusta a la forma de la sección transversal del recipiente 1, por lo que el diámetro en su cara superior es mayor que la cara inferior, y la sección longitudinal de la partición 7 es próxima a un trapezoide invertido aplanado. La partición 7 divide el recipiente 1 en una cámara 2 superior y una cámara 3 inferior. la partición del ejemplo tiene una abertura 4 que constituye una muesca en forma similar a un semicírculo.

Como se muestra en las Fig. 8a y 8b, la partición 11 vertical puede tener la forma de un rectángulo que se adhiere a la pared interior del recipiente 1, luego la partición 11 vertical ubicada en el disco 8 divide la cámara 2 superior del recipiente I en forma de tubo en dos subcámaras 10a, 10b. En cada una de las mitades del disco 8 formado por la partición 11, hay una abertura 5 en forma de muesca que se puede cerrar con el disco 8. En la realización, las aberturas 5 en forma de muesca en el disco 8 son semicirculares. En otras implementaciones de la solución de acuerdo con la invención, también es posible utilizar discos 8 con otras formas de aberturas 5. El caudal de líquido desde la cámara 2 superior a la cámara 3 inferior depende de la forma de las aberturas 4, 5 y su acuerdo mutuo con respecto a los demás.

En este ejemplo, las aberturas con forma de muesca 4, 5 con un radio de muesca de 0,115” tienen la misma forma. En otras versiones de la realización, las aberturas 4, 5 pueden tener diferentes formas y pueden diferir en forma, pero su diámetro debe ser superior a 0,1”. Con la partición 7 y el disco 8 dispuestos de tal manera que las aberturas 4, 5 no se superponen, el flujo de fluidos entre la cámara 2 superior y la cámara 3 inferior se bloquea y no puede tener lugar un flujo de fluido adecuado.

En esta realización, el recipiente 1 está provisto de una tapa 9. En una versión del ejemplo, la tapa 9 tiene un hueco en el que encaja la parte superior de la partición 11 vertical del inserto 6 y pasa a través. Tal posición de la partición I I vertical permite cambiar la posición del disco 8 con respecto a la partición 7 al girar la parte sobresaliente de la partición, y por lo tanto la parte móvil de la tapa 9. El recipiente 1 y la tapa 9 tienen una rosca y forman un tapón de rosca. Alternativamente, el uso de la tapa 91 sin hueco, donde la partición 11 vertical del inserto se adapta a la longitud del recipiente 1 de modo que, después de enroscar la tapa 9, la partición 11 vertical se adhiere firmemente a la superficie interior de la tapa 9. La tapa 9 puede estar hecha de plástico y puede tener una escala de giro/torsión calibrada. Se pretende marcar los recipientes de centrifugado 1 y grifo 9 para facilitar la correcta línea/disposición de las aberturas 4, 5 entre ellos.

Son posibles alternativas para diferentes formas y disposiciones de la partición 8 vertical en otras versiones de la realización. Como se muestra en las Fig. 7a y 7b, es posible que la partición 11 vertical no se adhiera a las paredes del recipiente 1, entonces la partición 11 vertical ubicada en el disco 8 divide el tubo en dos cámaras solamente: la cámara 2 superior y la cámara 3 inferior, y la cámara 2 superior no está dividida en subcámaras adicionales. En esta versión, el disco 8 está equipado con una abertura 4 en forma de muesca, por lo que la forma del disco 8 en otra versión del ejemplo podría limitarse a cerrar las aberturas 4 y la partición 7.

Como se muestra en las Fig. 9a y 9b, la partición 11 vertical puede constar de tres elementos rectangulares conectados entre sí por lados más largos, cuyos lados están muy cerca de la pared interior del recipiente 1, luego la partición 11 vertical ubicada en el disco 8 divide la cámara 2 superior del recipiente 1 en forma de tubo en tres subcámaras. En esta versión, el disco 8 está equipada con tres muescas 5, y en cada una de las subcámaras.

Como se muestra en las Fig. 10a y 10b, la partición 11 vertical puede consistir en cuatro rectángulos conectados entre sí, cuyos lados están muy cerca de la pared interior del recipiente 1, luego la partición 11 vertical ubicada en el disco 8 divide la parte de la cámara 2 superior del recipiente 1 en forma de tubo en cuatro subcámaras. En esta versión, el disco 8 está equipado con cuatro muescas 5, y en cada una de las subcámaras.

El inserto 6 también se puede usar en recipientes 1 con formas distintas al tubo de centrifugación que se muestra en la realización, pero estos recipientes deben ser adecuados para la centrifugación.

Ejemplo 2

Las Figs. 13 y 13a muestra otra realización de la solución de acuerdo con la invención, en la que el inserto 6 tiene una partición 7, que no tiene una cámara superior, pero permite la conexión, a través de un tubo 16, a la partición de la cámara superior en forma de un recipiente (por ejemplo, tubo de ensayo, bolsa) con un medio para la separación o con un líquido para la separación. A continuación, la partición está equipada con una guía 12 en forma de cilindro alargado, que se une a la partición 7 y se encuentra a una distancia tal de la abertura 4 que permite que el líquido fluya desde la cámara superior a través del tubo 16, luego a través de la abertura en la partición y a lo largo de la guía hasta la cámara 3 inferior. En esta realización, el cilindro alargado que constituye la guía 12 tiene una longitud tal que el material de prueba se deposita sobre la superficie del medio de gradiente sin causar perturbaciones significativas en el medio de separación.

Ejemplo 3

Las Figs. 14 y 14a muestra otra realización de la solución de acuerdo con la invención, en la que el inserto 6 tiene una partición 7, equipado con una guía 12 en forma de 8 cilindros alargados, que están unidos a la partición 7 y están a una distancia de la abertura 4 permite que el líquido fluya desde la cámara superior a través de la abertura en la partición siguiendo la guía hasta la cámara 3 inferior. En esta realización, los cilindros alargados que constituyen la guía 12 tienen una longitud tal que el material de prueba se deposita sobre la superficie del medio de centrifugación en gradiente sin causar perturbaciones significativas en el medio de separación.

Ejemplo 4

Por otro lado, las Fig. 15 y 15a muestran otro ejemplo más de la solución de acuerdo con la invención, en el que el inserto 6 tiene una partición 7 equipado con una guía 12 en forma de espiral. De forma similar al ejemplo 2, la longitud de la espiral debe ser tal que el material de prueba se deposite sobre la superficie del medio de centrifugación en gradiente sin causar perturbaciones significativas en el medio de separación.

Ejemplo 5

Las Figs. 16, 16a y 16b muestran otro ejemplo más de la solución de acuerdo con la invención, en el que el inserto 6 tiene una partición 7 equipada con una guía 12 en forma de embudo. Al mismo tiempo, las aberturas 4 en la partición 7 dirigen los líquidos desde la cámara superior para que fluyan hacia abajo a lo largo de la superficie exterior del embudo hasta el fondo de la cámara 3. De manera similar, en el ejemplo 2, la longitud de la espiral debe ser tal que el material de prueba se acumule en la superficie del medio de centrifugación en gradiente sin causar perturbaciones significativas en el medio de separación.

Ejemplo 6

El método de separación de la fracción con el rango de densidad deseado de una muestra que contiene fracciones de diferentes densidades de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo de tal manera que en diferentes subcámaras 10a, 10b de la cámara 2 superior, haya dos medios de separación diferentes colocados en un gradiente de densidad, el primer medio tiene una densidad de 1,119 g/ml, el segundo medio tiene una densidad de 1,077 g/ml (Histopaque 1,119 e Histopaque 1,077 de Sigma Aldrich, respectivamente), que constituye las aberturas 4, 5 muescas - de la partición 7 y del disco 8, respectivamente - que no se solapen cuando permanece en la posición cerrada. A continuación, cambiar la posición del disco 8 girándolo, las muescas 4, 5 se superponen lo suficiente como para permitir que el medio fluya desde la cámara 2 superior a la cámara 3 inferior. Los líquidos fluyen a lo largo de la pared interior del recipiente 1 que constituye la guía 12. La posición de las aberturas 4, 5 que constituyen una muesca en la partición 7 y el disco 8 del ejemplo es adyacente a la pared del recipiente 1 lo que constituye la guía 12. Los medios se agregan en orden desde de mayor a menor densidad, y se forma una interfase entre los medios de diferente densidad. A continuación, un líquido o una mezcla destinada a la separación en fracciones de diferentes densidades bajo la influencia de la centrifugación, por ejemplo, sangre nativa o diluida, se agrega a una de las subcámaras 10 vacías con un flujo cerrado entre la cámara 2 superior y la cámara 3 inferior.

El tamaño del espacio libre formado por las aberturas 4, 5 que son recortes de la partición 7 y el disco 8, respectivamente, puede controlarse ajustando la posición mutua de la partición 7 y el disco 8. Girando lentamente la parte superior del inserto 11, y por lo tanto el disco 8, aumenta gradualmente el caudal de fluido hasta que se alcanza la velocidad de flujo de líquido asumida entre las cámaras 2, 3. Al ajustar la cantidad de superposición mutua entre la abertura 4 y la abertura 5, el flujo de líquido se puede controlar para crear un flujo laminar continuo a lo largo de la pared 12 del recipiente 1 de centrifugación. La construcción de la partición 7 y el disco 8 de acuerdo con la invención asegura un flujo descendente muy suave de fluido desde la cámara 2 superior hacia la cámara 3 inferior del recipiente 1 de centrifugación de tal manera que la interfaz entre los líquidos está intacta y el líquido subsiguiente vertido desde la cámara 2 superior no se mezcla con el líquido presente en la cámara 3 inferior.

Después de verter dos medios de separación de gradiente de densidad de trabajo, estos fluidos se organizan en capas uno encima del otro debido a las diferentes densidades, luego se agrega la muestra de prueba en forma de sangre, también es posible usar diferentes tipos de fluidos para la separación, que incluye muestras biológicas nativas o diluidas. La sangre se colocó primero en la cámara 10a, y luego después de girar el disco 8 del inserto 6 de tal manera que la abertura 4 de la partición 7 coincida al menos en parte con la abertura 5 correspondiente del disco 8 del inserto 6, y permite que la sangre fluya a lo largo de la pared 12 del recipiente 1 desde la subcámara 10a hasta la cámara 3 inferior y se acumule en la superficie de los medios de separación colocados allí previamente. Debido a la estructura del inserto 6, no es necesario colocar la muestra biológica en el recipiente 1 con extrema precisión y cuidado.

A continuación, la sangre de la cámara 3 inferior del recipiente 1 se centrifuga de acuerdo con métodos generalmente conocidos en la técnica. Durante la centrifugación, se produce un flujo de fluido bidireccional dentro de diferentes compartimentos formados por la separación de fluidos de diferente densidad en la cámara 3 inferior, y se forma un gradiente continuo de densidad al final de la centrifugación, con glóbulos rojos que se depositan en el fondo que forma la capa localizada más baja, la capa superior es un líquido con una densidad de 1,119 g/ml, la siguiente capa ubicada arriba son glóbulos blancos con núcleos segmentados, arriba hay una capa formada por un líquido con una densidad de 1,077 g/ml, y una capa de células mononucleares blancas por encima de eso, finalmente el plasma se encuentra por encima de ellos como la capa más alta. Después de retirar el inserto, cada una de las capas de células/o líquidos se pueden eliminar mediante aspiración con una pipeta o decantación.

Ejemplo 7

El inserto y el método de la invención se utilizan, por ejemplo, para separar un subconjunto deseado de células sanguíneas. En una realización, se recogieron diez muestras de sangre de voluntarios sanos (20 ml de sangre venosa) en tubos de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) disponibles comercialmente (tubo EDTA, Becton Dickinson). En este experimento, el volumen del tubo 1 de centrifugación que constituye la invención fue de 50 ml, además se utilizaron dos medios de separación de diferente densidad (Histopaque 1,119 e Histopaque 1,077 Sigma Aldrich). Los medios de separación utilizados tenían un pH neutro, eran isotónicos a los fluidos corporales, el primer medio de separación tenía una densidad de 1,119 g/ml, mientras que el segundo tenía una densidad de 1,077 g/ml.

A continuación, se colocaron 10 ml de medio de separación con una densidad de 1,119 g/ml en la subcámara 10a de la cámara 2 superior del recipiente 1 de centrifugación equipado con el inserto 6 de acuerdo con la invención. Se colocó un segundo medio con una densidad de 1,077 g/ml con un volumen de 10 ml en la subcámara 10b de la cámara 2 superior y luego se colocó en capas sobre el primer medio utilizando el inserto 6 de acuerdo con la invención descrita anteriormente. En el experimento, la pared divisoria tenía un espesor de 0,08” y las muescas 4, 5 de la partición 7 y el disco 8 tenían un radio de 0,115”. A continuación, la sangre recogida con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) se colocó en la subcámara 10a de la cámara 2 superior. Cada muestra de sangre se colocó en capas sobre las superficies de los medios de separación con el inserto 6 de la invención descrita anteriormente.

En la siguiente etapa, todos los tubos se centrifugaron a 700 g (con aceleración mínima y sin frenado activo) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Como efecto de la centrifugación en gradiente de densidad, la sangre se separó en cuatro fracciones: plasma, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos polimorfonucleares (PMN) y glóbulos rojos. La pureza de las fracciones de PBMC y PMN se confirmó mediante citometría de flujo. La pureza de PBMC y PMN en sus fracciones fue del 95 % y 92 %, respectivamente. Las células PBMC y PMN no fueron detectables en la fracción de plasma. El plasma aislado, las PBMC y los PMN fueron adecuados para análisis adicionales, incluidos, entre otros: ARN, microARN, ADN mitocondrial, a Dn nuclear, fenotipado de proteínas y células.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un recipiente (1) de centrifugación que comprende un inserto (6), especialmente un tubo de ensayo, para la separación de líquidos en fracciones del rango de densidad deseado por centrifugación en gradiente de densidad, especialmente líquidos que constituyen suspensiones y/o fluidos biológicos, el inserto está equipado con una partición (7) adecuado para dividir el interior del recipiente (1) en al menos dos cámaras en disposición vertical - la cámara (2) superior y la cámara (3) inferior, caracterizada porque la partición (7) tiene una abertura (4) a la que se une una guía (12) por la que fluyen líquidos, especialmente fluido biológico, hacia la cámara (3) inferior del recipiente (1) de centrifugación, y dicha partición (7) está formado por dos superficies contiguas con aberturas, especialmente en forma de discos aplanados ajustados a la sección transversal del recipiente (1) con una sección transversal similar al círculo, las superficies están conectadas entre sí de forma móvil, pueden posicionarse libremente entre sí permitiendo el cierre del lumen de abertura (4).

2. El recipiente (1) de centrifugación que comprende el inserto (6) de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque la guía (12) es una espiral, un embudo o elementos verticales en forma de cilindro alargado.

3. El recipiente (1) de centrifugación que comprende el inserto (6) de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque la cámara (2) superior tiene adicionalmente una partición (11) vertical o particiones que la separan en subcámaras (10), cada una de las subcámaras (10) tiene una abertura (4, 5).

4. Un método para separar una fracción con un rango de densidad deseado de una muestra que contiene fracciones de diferentes densidades, especialmente de una muestra biológica, que comprende:

a) proporcionar un recipiente (1) de centrifugación de cualquier reivindicación de 1 a 3 para la separación de líquidos en fracciones del rango de densidad deseado por centrifugación en gradiente de densidad, especialmente líquidos que constituyen suspensiones o fluidos biológicos,

b) llenar la cámara (3) inferior del recipiente (1) con un medio para la separación en gradiente de densidad o llenar la cámara (2) superior del recipiente (1) con este medio, que luego fluye a través de la abertura en la partición a lo largo de la guía (12) hasta la cámara inferior;

c) verter líquido para separación que contiene fracciones de diferente densidad a la cámara (3) inferior al llenar la cámara (2) superior o al menos una subcámara (10a, 10b) o fijar la cámara superior a la partición, de modo que el líquido puede fluir a través de la abertura (4) en la partición en la guía (12) y derramarse sobre la superficie del medio de separación de la cámara (3) inferior;

d) centrifugar el recipiente (1) hasta que la muestra de prueba se separe en fracciones de diferentes densidades.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque después de la etapa (b) le sigue una etapa o etapas adicionales b) que consisten en agregar un medio de separación de gradiente de densidad adicional, en el que la adición de medios posteriores es de mayor a menor densidad.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque después de la etapa (d), fracciones seleccionadas de diferentes densidades del líquido que se está separando son sometidas a pruebas y análisis, que incluye la posibilidad de ser fijadas, especialmente por el método de congelación.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque cuando la fracción se separa del líquido sanguíneo, las fracciones individuales del rango de densidad deseado contienen varios componentes sanguíneos, entre ellos: leucocitos (linfocitos y granulocitos), plaquetas, eritrocitos, células de médula ósea (megacariocitos, eritroblastos) suspendidas en un homogeneizado celular que incluye células endoteliales, neuronas, hongos, virus, micropartículas que incluyen exosomas, fragmentos de células, orgánulos celulares que incluyen núcleos, mitocondrias, cloroplastos.